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特表2024-539893感染性障害を治療する方法で使用するためのブチロフィリン（ＢＴＮ）３Ａ活性化抗体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】感染性障害を治療する方法で使用するためのブチロフィリン（ＢＴＮ）３Ａ活性化抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241024BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241024BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241024BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
A61K39/395 N
A61K45/00
A61P31/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024523568
(86)(22)【出願日】2022-10-27
(85)【翻訳文提出日】2024-06-07
(86)【国際出願番号】 EP2022080048
(87)【国際公開番号】W WO2023073084
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】21306505.5
(32)【優先日】2021-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520098187
【氏名又は名称】イムチェック セラピューティクス エスエーエス
【氏名又は名称原語表記】ＩＭＣＨＥＣＫ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＳＡＳ
(71)【出願人】
【識別番号】511074305
【氏名又は名称】インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】515267792
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ エクス－マルセイユ
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＡＩＸ－ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ
【住所又は居所原語表記】５８ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ Ｃｈａｒｌｅｓ Ｌｉｖｏｎ Ｆ－１３２８４ Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ Ｃｅｄｅｘ ０７ Ｆｒａｎｃｅ
(71)【出願人】
【識別番号】509016944
【氏名又は名称】セントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック（シー．エヌ．アール．エス．）
(71)【出願人】
【識別番号】520098202
【氏名又は名称】インスティテュート ジャン パオリ アンド イレーヌ カルメット
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴ ＪＥＡＮ ＰＡＯＬＩ ＆ ＩＲＥＮＥ ＣＡＬＭＥＴＴＥＳ
(71)【出願人】
【識別番号】520271517
【氏名又は名称】アシスタンス パブリック－オピトークス デ マルセイユ（エーピー‐エイチエム）
(71)【出願人】
【識別番号】524146561
【氏名又は名称】インスティテュート デ ルシェルシュ プア レ デヴロップマン（アイアールディー）
【氏名又は名称原語表記】Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｐｏｕｒ ｌｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｐｅｍｅｎｔ （ＩＲＤ）
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】オリーヴ， ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】メズアル， ソラヤ
(72)【発明者】
【氏名】メージュ， ジャン‐ルイ
(72)【発明者】
【氏名】フローナ， ポール
(72)【発明者】
【氏名】トルーネ， アレムセゲド
(72)【発明者】
【氏名】ゲイ， レティシア
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA19
4C084NA05
4C084ZB112
4C084ZB33
4C084ZB332
4C084ZB352
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB36
4C085BB42
4C085EE03
4C085GG02
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA29
4H045EA53
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、感染性障害を治療する方法に関する。特に、本開示は、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体、および、感染性障害の治療を必要とするヒト対象における、例えば、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２またはＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる感染性障害の治療におけるＢＴＮ３Ａ活性化抗体の使用を提供する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
感染性障害の治療を必要とするヒト対象における、好ましくは、（ｉ）ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染によって引き起こされる障害、典型的にはＣＯＶＩＤ－１９、および（ｉｉ）Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害、典型的にはＱ熱からなる群から選択される感染性障害の治療における使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項2】
以下の特性のうちの１つまたは複数を有する、請求項１に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体：（ｉ）前記ＢＴＮ３Ａ活性化抗体が、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合する；
（ｉｉ）前記ＢＴＮ３Ａ活性化抗体が、脱顆粒アッセイで測定した場合に、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、ＢＴＮ３を発現する細胞との共培養において、γδ－Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化をインビトロで誘導する；
（ｉｉｉ）前記ＢＴＮ３Ａ活性化抗体が、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の存在下での単球の共培養物を用いてインビトロで測定した場合に、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ細菌量の減少をインビトロで増強する；
（ｉｖ）前記ＢＴＮ３Ａ活性化抗体が、典型的には４時間の共培養後、感染した単球の共培養物を用いてインビトロで測定した場合に、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉｄに対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害活性を増加させる；および／または
（ｖ）前記ＢＴＮ３Ａ活性化抗体が、感染した細胞とＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞との共培養物においてインビトロで測定した場合に、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２に感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害活性を増加させる。
【請求項3】
配列番号５～７のＨＣＤＲ１～３および配列番号８～１０のＬＣＤＲ１～３を含む、請求項１または請求項２に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項4】
前記ＢＴＮ３Ａ活性化抗体が、（ｉ）配列番号１１～１３のＨＣＤＲ１～３および配列番号１４～１６のＬＣＤＲ１～３を含むか；
（ｉｉ）配列番号１７～１９のＨＣＤＲ１～３および配列番号２０～２２のＬＣＤＲ１～３を含むか；
（ｉｉｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および配列番号２と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含むか；
（ｉｖ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および配列番号４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含むか；
（ｖ）寄託番号Ｉ－４４０１の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって産生されるｍＡｂ２０．１と、結合について競合するか；または
（ｖｉ）寄託番号Ｉ－４４０２の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって産生されるｍＡｂ７．２と、結合について競合する、
のいずれかである、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項5】
配列番号１の可変重鎖ＶＨおよび配列番号２の軽鎖ＶＬを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体であって、前記ＢＴＮ３Ａ活性化抗体が、変異体または化学的に改変されたＩｇＧ１定常領域を含み、前記変異体または化学的に改変されたＩｇＧ１定常領域が、野生型ＩｇＧ１アイソタイプ定常領域を有する対応する抗体と比較した場合に、Ｆｃγ受容体への結合を有しないかまたは減少した結合を付与し、好ましくは、前記ＢＴＮ３Ａ活性化抗体が、変異Ｌ２４７Ｆ Ｌ２４８ＥおよびＰ３５０Ｓを有するＩｇＧ１三重変異Ｆｃである変異体ＩｇＧ１定常領域を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項7】
前記活性化ＢＴＮ３Ａ抗体が、配列番号２３の重鎖および配列番号２４の軽鎖を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項8】
好ましくはレムデシビル、バリシチニブ、バムラニビマブ、バムラニビマブ／エテセビマブ、カシリビマブ／イムデビマブ、デキサメタゾン、ブデソニドおよびトシリズマブからなる群から選択される、抗ウイルスまたは抗炎症治療と組み合わせて、同時にまたは別個に投与される、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染によって引き起こされる障害を治療するための請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項9】
前記対象が、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２陽性であると診断されているヒト対象である、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染によって引き起こされる障害を治療するための請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項10】
前記対象が、軽度または中程度のＣＯＶＩＤ－１９を有するか、または重度のＣＯＶＩＤ－１９に進行する高いリスクがあるヒト対象である、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染によって引き起こされる障害を治療するための請求項１～９のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項11】
前記対象が重度ＣＯＶＩＤ－１９を有する、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染によって引き起こされる障害を治療するための請求項１～１０のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項12】
好ましくはドキシサイクリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、オフロキサシン、およびヒドロキシクロロキンから選択される抗生物質から選択される抗菌治療と組み合わせて、同時にまたは別個に投与される、Ｃｏｘｉｅｌｌａ Ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害を治療するための請求項１～１１のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項13】
前記対象がＣｏｘｉｅｌｌａ Ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染に陽性であると診断されている、Ｃｏｘｉｅｌｌａ Ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害を治療するための請求項１～８および１２のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項14】
前記対象がＱ熱を有する、Ｃｏｘｉｅｌｌａ Ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害を治療するための請求項１～８および１２～１３のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【請求項15】
静脈内注入によって、好ましくは１ｍｇ～１ｇ含まれる用量で、例えば１ｍｇ～２００ｍｇ含まれる用量で、それを必要とする対象に投与される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、感染性障害を治療する方法に関する。特に、本開示は、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体、および、感染性障害の治療を必要とするヒト対象における感染性障害、例えば、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２またはＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害の治療におけるＢＴＮ３Ａ活性化抗体の使用を提供する。
【背景】
【0002】
新興の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされたコロナウイルス疾患２０１９の世界的なパンデミックは、今日までに世界中で２億２０００万超の症例をもたらし、４８０万超が死亡している。一部の感染者は無症候性のままであり、一部の感染者は医学的注意なしにまたはほとんど医学的注意なしに消散する軽度の呼吸器疾患を発症するが、他の感染者（症候性の人の１０～２０％）は、呼吸不全および患者の死亡につながる可能性がある多臓器合併症に関連する（Ｇｕｐｔａ ｅｔ ａｌ．，２０２０、Ｓｃｈｕｌｔｚｅ ａｎｄ Ａｓｃｈｅｎｂｒｅｎｎｅｒ，２０２１）、最初の症候の発症から約１１日後の突然の悪化（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０２０）がしばしば生じる重度の疾患を経験する。ワクチン接種は、疾患を予防するためのウイルスおよびウイルスのバリアントに対するアセットのままであるが、現在は対症的な治療のみが提供されている。この文脈において、薬物治療を開発する必要性のある疾患との戦いでは、努力を続けなければならない。別の文脈において、Ｑ熱の場合には、免疫療法が考えられ得る。この世界的な人獣共通感染症は、細菌Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉによって引き起こされ、ヒトでは症例の４０％において症候性である一次感染症（急性Ｑ熱）を引き起こす。限局性持続感染への進行も症例の１～５％で観察され、主に心血管症状および骨関節症状を伴う。現在、急性Ｑ熱の主な治療はドキシサイクリンである。心内膜炎などのいくつかの場合では、ドキシサイクリンおよびヒドロキシクロロキンを用いた数ヶ月間の長期治療が処方される。
【0003】
ＣＯＶＩＤ－１９の現在の臨床的管理は、予防、社会的距離などの制御手段、ならびに指示された場合には酸素補給および機械的換気補助を含む支持療法からなる。これまでに、ＦＤＡは、少なくとも体重４０ｋｇの１２歳以上の入院患者におけるＣＯＶＩＤ－１９の治療のために、１つの薬物レムデシビル（ベクルリー）を承認している。
【0004】
末梢血Ｔ細胞の２～５％を占めるヒトＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞は、マイコバクテリア疾患、リステリア症、サルモネラ症、ブルセラ症、野兎病、レジオネラ症およびＱ熱の患者について報告されているように（Ｍｏｒｉｔａ ｅｔ ａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２００７；２１５：５９－７６；Ｂａｌｂｉ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ １９９３；１４８：１６８５－９０；Ｊｏｕｅｎ－Ｂｅａｄｅｓ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９７；６５：４２６７－７２；Ｈａｒａ Ｔ，Ｍｉｚｕｎｏ Ｙ，Ｔａｋａｋｉ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １９９２；９０：２０４－１０；Ｂｅｒｔｏｔｔｏ Ａ，Ｇｅｒｌｉ Ｒ，Ｓｐｉｎｏｚｚｉ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９３；２３：１１７７－８０；Ｐｏｑｕｅｔ Ｙ，Ｋｒｏｃａ Ｍ，Ｈａｌａｒｙ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９８；６６：２１０７－１４；Ｋｒｏｃａ Ｍ，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ Ａ，Ｓｊｏｓｔｅｄｔ Ａ，Ｔａｒｎｖｉｋ Ａ．Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００１；８：９４９－５４；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｔ，Ｊａｈｎ Ｈ－Ｕ，Ｌｉｅｓｅｎｆｅｌｄ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９９７；２４：２６１－４）、感染中に広範囲の微生物エージェントによって増殖し、循環Ｔ細胞プールの５０％超を占めること（Ｃｈｅｎ ＺＷ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ２０１１；６８：２４０９－１）が見出されている。さらに、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の局所的な増殖は、活動性肺結核患者からの気管支肺胞洗浄液および細菌性髄膜炎患者からの脳脊髄液においても報告されている（Ｃｈｅｎ ＺＷ，Ｌｅｔｖｉｎ ＮＬ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ２００３；５：４９１－８；Ｄｉｅｌｉ Ｆ，Ｓｉｒｅｃｉ Ｇ，Ｄｉ Ｓａｎｏ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｍｅｄ １９９９；５：３０１－１２；Ｃａｃｃａｍｏ Ｎ，Ｌａ Ｍｅｎｄｏｌａ Ｃ，Ｏｒｌａｎｄｏ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ２０１１；１１８：１２９－３８）。
【0005】
病原体感染細胞に対する細胞傷害活性およびサイトカイン産生に基づく細胞媒介性非細胞溶解活性を含む、様々なウイルス、原虫および細菌に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の２つの直接的な抗菌作用が報告された（Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ Ｍ，Ｓｃｏｔｅｔ Ｅ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００６；１８：５３９－４６；Ｃｈｅｎ ＺＷ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１３；１０：５８－６４；Ｐｏｃｃｉａ Ｆ，Ａｇｒａｔｉ Ｃ，Ｍａｒｔｉｎｉ Ｆ，Ｃａｐｏｂｉａｎｃｈｉ ＭＲ，Ｗａｌｌａｃｅ Ｍ，Ｍａｌｋｏｖｓｋｙ Ｍ．Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｉｎｆｅｃｔ ２００５；７：５１８－２８；Ｄｏｎｇ Ｐ，Ｊｕ Ｘ，Ｙａｎ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１８；９．ＤＯＩ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０２８１２）。インビトロ研究により、γＴ細胞が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、およびＢｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓなどの細胞内病原体を効果的に死滅させることができることが示されている。Ｒｙａｎ－Ｐａｙｓｅｕｒ Ｂ，Ｆｒｅｎｃｈｅｒ Ｊ，Ｓｈｅｎ Ｌ，Ｃｈｅｎ ＣＹ，Ｈｕａｎｇ Ｄ，Ｃｈｅｎ ＺＷ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１２；１８９：１２８５－９３；Ｓｐｅｎｃｅｒ ＣＴ，Ａｂａｔｅ Ｇ，Ｓａｋａｌａ ＩＧ，ｅｔ ａｌ．ＰＬＯＳ Ｐａｔｈｏｇ ２０１３；９：ｅ１００３１１９；Ｄｉｅｌｉ Ｆ，Ｔｒｏｙｅ－Ｂｌｏｍｂｅｒｇ Ｍ，Ｉｖａｎｙｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ ２００１；１８４：１０８２－５；Ｍａｒｔｉｎｏ Ａ，Ｃａｓｅｔｔｉ Ｒ，Ｓａｃｃｈｉ Ａ，Ｐｏｃｃｉａ Ｆ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｂａｌｔｉｍ Ｍｄ １９５０ ２００７；１７９：３０５７－６４；Ｏｌｉａｒｏ Ｊ，Ｄｕｄａｌ Ｓ，Ｌｉａｕｔａｒｄ Ｊ，Ａｎｄｒａｕｌｔ Ｊ－Ｂ，Ｌｉａｕｔａｒｄ Ｊ－Ｐ，Ｌａｆｏｎｔ Ｖ．Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ ２００５；７７：６５２－６０。
【0006】
いくつかのエビデンスは、細胞内寄生細菌Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉによって引き起こされる感染性疾患であるＱ熱におけるＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の鍵となる役割を強調している。（１）疾患の急性期中に、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の数および割合が増加し、（２）活性化マーカーＨＬＡ－ＤＲは有意に発現しているがＣＤ２５は発現していないことが見出された。Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｔ，Ｊａｈｎ Ｈ－Ｕ，Ｌｉｅｓｅｎｆｅｌｄ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９９７；２４：２６１－４。
【0007】
国際公開第２０１２／０８０３５１号は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン分泌を誘導する能力を有する、マウスｍＡｂ７．２またはｍＡｂ２０．１などのＢＴＮ３Ａ活性化抗体を報告している。
【0008】
国際公開第２０２０／０２５７０３号は、特にがん障害の治療におけるヒト化ＢＴＮ３Ａ活性化抗体の使用のための、特定のヒト化ＢＴＮ３Ａ活性化抗体をさらに報告している。
【0009】
国際公開第２０２０／１３６２１８号はまた、抗ＢＴＮ３Ａ抗体ｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片に由来する断片、ならびにＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の増殖およびサイトカイン分泌を誘導するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体としての該Ｆａｂ断片に由来する断片の使用を開示している。
【0010】
しかしながら、本発明者らの知る限りでは、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉまたはＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２によって引き起こされる感染性障害を治療するための、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化化合物、特にＢＴＮ３Ａ活性化抗体の説得力のある使用のエビデンスはない。
【0011】
本発明者らは、驚くべきことに、ｍＡｂ２０．１を用いた治療などのＢＴＮ３Ａ活性化抗体を用いた治療が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびＣｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞応答を増強して、特にウイルスおよび細菌量をそれぞれ減らすことを見出した。
【概要】
【0012】
本開示の第１の態様は、感染性障害の治療を必要とするヒト対象における感染性障害の治療で使用するための、特に、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染またはＣｏｘｉｅｌｌａ Ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害を治療するための、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体に関する。
【0013】
特定の実施形態では、前記ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、ｍＡｂ２０．１またはｍＡｂ２０．１のヒト化形態である。
【0014】
本開示の別の態様は、ｍＡｂ２０．１の新規なヒト化形態または該新規なヒト化形態の医薬組成物、特に、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染またはＣｏｘｉｅｌｌａ Ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害の治療での該新規なヒト化形態および該医薬組成物の使用に関する。
【0015】
他の特定の態様および特定の実施形態は、以下に開示されている。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1A】単球、ＭＤＭおよび肺上皮細胞株におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－感染に応答したＢＴＮ２ＡおよびＢＴＮ３Ａの発現
【図1B】単球、ＭＤＭおよび肺上皮細胞株におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－感染に応答したＢＴＮ２ＡおよびＢＴＮ３Ａの発現 （Ａ、Ｂ）単球、ＭＤＭ、ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩＨＵ－ＭＩ６株（１ ＭＯＩ）で２４時間刺激した。ＢＴＮ２Ａ（Ａ）およびＢＴＮ３Ａ（Ｂ）発現の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、健康なドナー単球およびＭＤＭ、ならびに肺上皮細胞株ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５（ｎ＝３）に対して調べた。２つのＢＴＮ２Ａアイソフォーム（Ａ１、Ａ２）（Ａ）および３つのＢＴＮ３Ａアイソフォーム（Ａ１、Ａ２、Ａ）（Ｂ）の遺伝子発現を、ハウスキーピング遺伝子を内在性対照として用いて正規化した後、ｑＲＴ－ＰＣＲによって調べた。２４時間の刺激での調査した遺伝子の相対発現を、単球およびＭＤＭ（ｎ＝６）、ならびにＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５細胞（ｎ＝３）について評価した。
【図2】Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の生存率に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の影響。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（３人の健康なボランティアから単離した）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩＨＵ－ＭＩ６株（０．２５、０．５または１ ＭＯＩ）で刺激した。２４時間後、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の生存率を、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞集団における生細胞のパーセンテージとしてフローサイトメトリーによって評価した。値は、平均±平均の標準誤差を表す。
【図3A】Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２応答の評価。
【図3B】Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２応答の評価。（Ａ、Ｂ）単球、ＭＤＭ、ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５細胞（ｎ＝６）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩＨＵ－ＭＩ６株（１ ＭＯＩ）で刺激し、抗ＢＴＮ３Ａ ２０．１ Ａｂ（０、０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と１：１のエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で２４時間共培養した。（Ａ）２４時間後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス量を、ＲＴ－ＰＣＲによって定量した。データを、以下の式２＾－（Ｃｔ ａｎｔｉ－ＢＴＮ３Ａ ＩＣＴ０１－Ｃｔ ｄｉｌｕｅｎｔ）によって分析し、ウイルスコピー％で表した。細胞傷害性を、標的細胞集団におけるカスパーゼ３／７＋細胞のパーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価した。（Ｂ）共培養物からの培養上清を、ＩＦＮ－γの存在について、ＥＬＩＳＡによって分析した。値は平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図4A】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現を調節する。
【図4B】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現を調節する。
【図4C】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現を調節する。
【図4D】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現を調節する。
【図4E】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現を調節する。
【図4F】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現を調節する。健康なドナー（ｎ＝４）から単離した単球を、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ株（５０ ＭＯＩ）で２４時間感染させた。（Ａ）ＢＴＮ３Ａアイソフォーム（Ａ１、Ａ２、Ａ３）の相対遺伝子発現および（Ｂ）ＢＴＮ３Ａのタンパク質発現を、それぞれｑＲＴ－ＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって調べた。（Ｄ）ＢＴＮ２Ａアイソフォーム（Ａ１、Ａ２）の相対遺伝子発現および（Ｅ）ＢＴＮ２Ａのタンパク質発現を、それぞれｑＲＴ－ＰＣＲおよびフローサイトメトリーによって調べた。（Ｃ）ＢＴＮ３Ａおよび（Ｆ）ＢＴＮ２Ａのタンパク質発現を、Ｑ熱患者（ｎ＝６）または健康なドナー（ｎ＝３）由来のＰＢＭＣについて調べた。値は平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図5A】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染におけるＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの関与。
【図5B】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染におけるＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの関与。ＢＴＮ３ＡまたはＢＴＮ２ＡのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性不活性化を、ＴＨＰ－１細胞株において行った。すべてのＢＴＮ２Ａアイソフォーム（ＢＴＮ２ＡＫＯ）もしくはすべてのＢＴＮ３Ａアイソフォーム（ＢＴＮ３ＡＫＯ）を標的とするガイド、または対照細胞のための無関係なＣＲＩＳＰＲガイド（モック）を形質導入したＴＨＰ－１細胞を、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１（５０ ＭＯＩ）で感染させた（ｎ＝３）。（Ａ）感染の４時間後および２４時間後、ＴＨＰ－１細胞内の細菌ＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって評価した。（Ｂ）ＴＨＰ－１細胞をＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉと共に４時間（０日目）インキュベートし、次いで洗浄して遊離細菌を除去し、４日間インキュベートした。毎日、細菌のＤＮＡコピー数をｑＰＣＲによって評価した。
【図6A】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染に対する炎症応答におけるＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの関与。
【図6B】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染に対する炎症応答におけるＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの関与。無関係なＣＲＩＳＰＲガイド（モック）またはすべてのＢＴＮ２Ａアイソフォーム（ＢＴＮ２ＡＫＯ）もしくはすべてのＢＴＮ３Ａアイソフォーム（ＢＴＮ３ＡＫＯ）を標的とするガイドを形質導入したＴＨＰ－１細胞を、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１（１００ ＭＯＩ）で感染させた（ｎ＝３）。２４時間の感染後、炎症性（ＴＮＦ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ６、ＩＦＮＧ、ＣＸＣＬ１０）または免疫調節性（ＩＬ１０、ＴＧＦＢ１、ＩＬ１ＲＡ、ＣＤ１６３）応答に関与する遺伝子の発現を、ハウスキーピングアクチン遺伝子を内在性対照として用いて正規化した後、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって調べた。データを、（Ａ）調査した遺伝子の相対発現（ＲＱ）として示す。（Ｂ）２４時間の感染後、培養上清におけるＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、およびＴＧＦ－βの放出を、ＥＬＩＳＡアッセイによって評価した。値は平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
【図7A】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉによる感染は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球のＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２依存的活性化をもたらす。
【図7B】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉによる感染は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球のＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２依存的活性化をもたらす。
【図7C】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉによる感染は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球のＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２依存的活性化をもたらす。
【図7D】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉによる感染は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球のＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２依存的活性化をもたらす。
【図7E】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉによる感染は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球のＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２依存的活性化をもたらす。
【図7F】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉによる感染は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球のＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２依存的活性化をもたらす。
【図7G】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉによる感染は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球のＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２依存的活性化をもたらす。
【図7H】Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉによる感染は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球のＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２依存的活性化をもたらす。（Ａ）Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１（５０または１００ ＭＯＩ）で予め２４時間感染させた、健康なドナー（ｎ＝３）から単離した単球を、健康なドナー由来の増殖させたＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と共培養した（Ｅ：Ｔ比１：１）。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒（ＣＤ１０７ａｂ＋細胞％）を、共培養の４時間後にフローサイトメトリーによって評価した。（Ｂ、Ｃ、Ｆ）Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ株（５０ ＭＯＩ）で予め２４時間感染させた、健康なドナー（ｎ＝４）から単離した単球を、（Ｂ）抗ＢＴＮ２Ａ抗体（クローン７．４８）、（Ｃ）抗ＢＴＮ３Ａ抗体（クローン１０３．２）または（Ｆ）抗ＢＴＮ３Ａ抗体（クローン２０．１）（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、健康なドナー由来の増殖させたＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と共培養した（Ｅ：Ｔ比１：１）。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒（ＣＤ１０７ａｂ＋細胞％）を、共培養の４時間後にフローサイトメトリーによって評価した。（Ｇ）細胞傷害性を、参照抗ＢＴＮ３Ａ ２０．１抗体（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で４時間共培養した後の標的細胞集団におけるカスパーゼ３／７＋細胞のパーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価した。（Ｄ、Ｅ、Ｈ）健康なドナー由来の増殖させたＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を、（Ｄ）抗ＢＴＮ２Ａ抗体（クローン７．４８）、（Ｅ）抗ＢＴＮ３Ａ抗体（クローン１０３．２）または（Ｆ）抗ＢＴＮ３Ａ抗体（クローン２０．１）（１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｑ熱患者（ｎ＝６）または健康なドナー（ｎ＝３）由来のＰＢＭＣと共培養した（Ｅ：Ｔ比１：１）。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒（ＣＤ１０７ａｂ＋細胞％）を、共培養の４時間後にフローサイトメトリーによって評価した。値は平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図8A】参照２０．１ ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の抗菌活性を増加させる。
【図8B】参照２０．１ ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の抗菌活性を増加させる。（Ａ、Ｂ）Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１（５０ ＭＯＩ）で予め２４時間感染させた、健康なドナー（ｎ＝４）から単離した単球を、抗ＢＴＮ３Ａ ２０．１抗体（０～１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、健康なドナー由来の増殖させたＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と共培養した（Ｅ：Ｔ比１：１）。４時間の共培養後、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ量を、（Ａ）フローサイトメトリーおよび（Ｂ）ｑＰＣＲによって測定した。値は平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図9A】参照２０．１ ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞／感染した単球の共培養物において、サイトカインおよび細胞傷害性分子の分泌を増加させる。
【図9B】参照２０．１ ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞／感染した単球の共培養物において、サイトカインおよび細胞傷害性分子の分泌を増加させる。Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１（５０ ＭＯＩ）で予め２４時間感染させた、健康なドナー（ｎ＝４）から単離した単球を、抗ＢＴＮ３Ａ抗体（クローン２０．１）（０～１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、健康なドナー由来の増殖させたＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と共培養した（Ｅ：Ｔ比１：１）。４時間の共培養後、培養上清を、ＥＬＩＳＡアッセイによってサイトカイン（Ａ、左パネル）および細胞傷害性分子（Ｂ、右パネル）の存在について分析した。値は平均±標準誤差を表す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１および＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【詳細な説明】
【0017】
定義
本開示がより容易に理解され得るように、ある特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、詳細な説明を通して記載されている。
本開示がより容易に理解され得るように、ある特定の用語を最初に定義する。追加の定義は、詳細な説明を通して記載されている。
【0018】
「アゴニスト」という用語は、本明細書では、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を生じる分子（例えば、小さい有機分子またはポリペプチド、例えば抗体）に使用される。選択的アゴニストは、特定の種類の受容体に対して選択的である。受容体への結合は、例えば、生物学的に関連のある濃度での表面プラズモン共鳴によって求められる特異的結合であり得る。
【0019】
本明細書で使用される「ポリペプチド」、「タンパク質」または「ペプチド」という用語は、「ポリペプチド」、「タンパク質」または「ペプチド」の長さまたは翻訳後修飾（グリコシル化など）にかかわらず、アミノ酸残基の任意の鎖を指す。
【0020】
本明細書で使用される場合、「ＢＴＮ３Ａ」という用語は、当技術分野における「ＢＴＮ３Ａ」の一般的な意味を有する。特定の実施形態では、「ＢＴＮ３Ａ」は、配列番号３２のＢＴＮ３Ａ１、配列番号３３のＢＴＮ３Ａ２または配列番号３４のＢＴＮ３Ａ３のいずれかを含むヒトＢＴＮ３Ａポリペプチドを指す。
【0021】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は同じ意味を有し、本開示では等しく使用される。したがって、抗体という用語は、抗体分子の全体だけではなく、抗体断片および抗体のバリアント（誘導体を含む）も包含する。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、二重特異性または多重特異性分子も含む。抗体は、誘導体化または別の機能性分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば、受容体に対する別の抗体またはリガンド）に連結されて、少なくとも２つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を生成することができる。抗体は、実際には、誘導体化または２つ以上の他の機能性分子に連結されて、２つを超える異なる結合部位および／または標的分子に結合する多重特異性分子を生成することができる。そのような多重特異性分子はまた、本明細書で使用される「二重特異性分子」という用語に包含されることが意図される。二重特異性分子を作出するために、本開示の抗体は、二重特異性分子が生じるように、１つまたは複数の他の結合分子、例えば別の抗体、抗体断片、ペプチドまたは結合模倣物に、（例えば、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合的会合または他の方法によって）機能的に連結され得る。加えて、二重特異性分子が多重特異性である実施形態の場合、分子は、第１および第２の標的エピトープに加えて、第３の結合特異性をさらに含み得る。
【0022】
げっ歯類および霊長類の天然抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに連結されており、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。軽鎖には、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）の２種類がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。各鎖は、異なる配列ドメインを含む。典型的なＩｇＧ抗体では、軽鎖は２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、集合的にＣＨと称される）を含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などの重要な生物学的特性を付与する。
【0023】
Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１本の軽鎖および１本の重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、主に超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基で構成される。時折、非超可変またはフレームワーク領域（ＦＲ）由来の残基が、抗体結合部位に関与し得るか、または全体のドメイン構造、したがって結合部位に影響を及ぼし得る。相補性決定領域またはＣＤＲとは、天然の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の各々は、Ｌ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３およびＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３とそれぞれ指定される３つのＣＤＲを有する。したがって、抗原結合部位は、典型的には、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々に由来するＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）とは、ＣＤＲ間に介在するアミノ酸配列を指す。したがって、軽鎖および重鎖の可変領域は、典型的には、以下の配列：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の４つのフレームワーク領域および３つのＣＤＲを含む。
【0024】
抗体可変ドメインの残基は、従来、Ｋａｂａｔらによって考案されたシステムに従ってナンバリングされる。このシステムは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２、以下“Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．”）に記載されている。このナンバリングシステムは、本明細書で使用される。Ｋａｂａｔの残基表記は、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ）の配列のアミノ酸残基の線状ナンバリングと必ずしも直接対応しない。実際の線状アミノ酸配列は、基本の可変ドメイン構造のフレームワークまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）にかかわらず、構造構成成分の短縮または構造構成成分への挿入に対応して、厳密なＫａｂａｔナンバリングよりも少ないまたは追加のアミノ酸を含み得る。残基の正しいＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列における相同性の残基と「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリングされた配列とのアラインメントによって、所与の抗体に対して決定され得る。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基３１～３５Ｈ－ＣＤＲ１）、残基５０～６５（Ｈ－ＣＤＲ２）および残基９５～１０２（Ｈ－ＣＤＲ３）に位置する。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基２４～３４（Ｌ－ＣＤＲ１）、残基５０～５６（Ｌ－ＣＤＲ２）および残基８９～９７（Ｌ－ＣＤＲ３）に位置する。
【0025】
哺乳動物抗体の非ＣＤＲ領域は、通常は元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、同種特異性または異種特異性抗体の類似の領域で置き換えられ得る。このことは、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域に共有結合的に連結されて機能性抗体を生じる「ヒト化」抗体の開発および使用において最も明確に示されている。
【0026】
本明細書で使用される場合、「ヒト化」は、ヒト対象における免疫原性を低下させるために、ＣＤＲ領域外のアミノ酸のいくつか、大部分またはすべてが、ヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置き換えられている抗体を記述する。ヒト化の方法には、限定されないが、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８１６，５６７号明細書、同第５，２２５，５３９号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書および同第５，８５９，２０５号明細書に記載されているものが含まれる。上記の米国特許第５，５８５，０８９号明細書および同第５，６９３，７６１号明細書、ならびに国際公開第９０／０７８６１号はまた、ヒト化抗体を設計する際に使用され得る４つの可能な基準も提案している。第１の提案は、アクセプターについて、ヒト化されるドナー免疫グロブリンと異常に相同な特定のヒト免疫グロブリン由来のフレームワークを使用すること、または多くのヒト抗体由来のコンセンサスフレームワークを使用することであった。第２の提案は、ヒト免疫グロブリンのフレームワークのアミノ酸が異常であり、その位置のドナーアミノ酸がヒト配列に典型的である場合、アクセプターではなくドナーアミノ酸を選択することができるということであった。第３の提案は、ヒト化免疫グロブリン鎖の３つのＣＤＲに直接隣接する位置において、アクセプターアミノ酸ではなくドナーアミノ酸を選択することができるということであった。第４の提案は、抗体の三次元モデルにおいてＣＤＲの３Å以内に側鎖原子を有すると予測され、ＣＤＲと相互作用することができると予測される、フレームワーク位置にあるドナーアミノ酸を使用することであった。上記の方法は、当業者がヒト化抗体を作製するために用いることができる方法のいくつかの単なる例示である。当業者は、抗体のヒト化のための他の方法に精通しているであろう。いくつかのヒト化形態の抗体では、ＣＤＲ領域外のアミノ酸のいくつか、大部分またはすべてをヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置き換えることができるが、１つまたは複数のＣＤＲ領域内のアミノ酸のいくつか、大部分またはすべては変化しない。アミノ酸のいくつかの付加、欠失、挿入、置換または改変は、所与の抗原に結合する抗体の能力を無効にしない限り、許容可能である。適したヒト免疫グロブリン分子には、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＭ分子が含まれる。「ヒト化」抗体は、通常、元の抗体と類似の抗原特異性を保持する。しかしながら、ヒト化のある特定の方法を使用すると、抗体の結合の親和性および／または特異性は、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１，１９９９（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような「指向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）」の方法を使用して増加し得る。
【0027】
完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座の大部分についてトランスジェニックのマウスを免疫化することによって調製され得る。例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５９１，６６９号明細書、同第５，５９８，３６９号明細書、同第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５４５，８０７号明細書、同第６，１５０，５８４号明細書、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。これらの動物は、内因性（例えば、マウスの）抗体の産生において機能的欠失が存在するように遺伝的に改変されている。動物は、これらの動物の免疫化が目的の抗原に対する完全ヒト抗体の産生をもたらすように、ヒト生殖系列の免疫グロブリン遺伝子座のすべてまたは一部を含むようにさらに改変されている。これらのマウス（例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＨｕＭＡｂマウス（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＧｅｎＰｈａｒｍ））の免疫化後、モノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技術に従って調製され得る。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有することになり、したがって、ヒトに投与された場合、ヒトの抗マウス抗体（ＫＡＭＡ）応答を引き起こさないことになる。
【0028】
ヒト抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するためのインビトロ方法も存在する。これらには、ファージディスプレイ技術（米国特許第５，５６５，３３２号明細書および同第５，５７３，９０５号明細書）またはヒトＢ細胞のインビトロ刺激（米国特許第５，２２９，２７５号明細書および同第５，５６７，６１０号明細書）が含まれる。これらの特許の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0029】
抗体の「抗原結合断片」（または単に「抗体断片」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原（例えば、上で定義されたようなＢＴＮ３Ａタンパク質）に特異的に結合する能力および抗体のＢＴＮ３Ａ活性化特性を保持する、抗体の全長または１つもしくは複数の断片を指す。特定の実施形態では、本明細書に開示されているような感染性障害の治療で使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、抗体断片、より具体的には本明細書に開示されているようなＢＴＮ３Ａ活性化抗体の抗原結合ドメインを含む任意のタンパク質である。周知の抗体断片には、以下が含まれる：Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片；Ｆ（ａｂ）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）、またはそのような抗原結合断片を含む任意の融合タンパク質；２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指すダイアボディ、この断片は、同じポリペプチド鎖で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（ＶＨ－ＶＬ）を含む。同じ鎖の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成し、２つの抗原結合部位を作出することを強いられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別個の遺伝子によってコードされるが、該２つのドメインは、組換え法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する一本鎖タンパク質として作製することを可能にする合成リンカーによって連結され得る（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。そのような一本鎖抗体はまた、抗体の「抗原結合断片」（本明細書では抗体断片とも略称される）という用語内に包含されることが意図される。より一般的には、本明細書において意図されるような抗体断片は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部を含む抗体断片である単一ドメイン抗体も包含する。ある特定の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６号明細書を参照されたい）。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来の技法を使用して得られ、断片は、インタクトな抗体と同じ様式で、有用性についてスクリーニングされる。よく適した抗体断片には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２およびダイアボディが含まれる。抗体断片は、限定されないが、インタクトな抗体のタンパク質消化、および本明細書に記載されているような組換え宿主細胞による産生を含む様々な技法によって作製され得る。
【0030】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一特異性の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来するもしくはヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に基づく、または完全な合成配列に由来する可変領域および定常領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。モノクローナル抗体を調製する方法は、結合特異性に関係しない。
【0031】
「組換え抗体」は、組換え手段によって産生、発現、生成、または単離される抗体、例えば宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現される抗体；組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体；ヒト免疫グロブリン遺伝子に起因するトランスジェニックである動物（例えば、マウス）から単離される抗体；または、特定の免疫グロブリン遺伝子配列（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列）が他のＤＮＡ配列とアセンブルされている、任意の他の様式で産生、発現、生成、または単離される抗体である。組換え抗体には、例えば、キメラおよびヒト化抗体が含まれる。いくつかの実施形態では、本開示に従って使用するための組換えヒト抗体は、対応する天然に存在するヒト抗体と同じアミノ酸配列を有するが、前記天然に存在するヒト抗体とは構造的に異なる。例えば、いくつかの実施形態では、グリコシル化パターンは、組換えヒト抗体の組換え産生の結果として異なる。いくつかの実施形態では、組換えヒト抗体は、ヒトにおいて天然に生じるヒト抗体の構造に対して、少なくとも１つの共有化学結合の付加または削除によって化学的に改変される。
【0032】
「単離された抗体」とは、本明細書で使用される場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない（例えば、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合する単離された抗体は、ＢＴＮ３Ａ以外の他の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）抗体を指す。しかしながら、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合する単離された抗体は、他の種由来の関連するＢＴＮ３Ａ分子などの他の抗原に対する交差反応性を有してもよい。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【0033】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に対して特異性を有する抗体」という語句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。「抗ＢＴＮ３Ａ抗体」または「ＢＴＮ３Ａ抗体」という用語はまた、本明細書では「ＢＴＮ３Ａを認識する抗体」の意味で簡単に使用される。
【0034】
本明細書で使用される場合、「活性化抗体」という用語は、エフェクター細胞の免疫機能を直接的または間接的に誘導することができる抗体を指す。特に、本明細書で使用される場合、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、脱顆粒アッセイ（そのような脱顆粒アッセイは、以下の実施例に記載されている）で測定した場合に、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導する能力を少なくとも有する。
【0035】
本明細書で使用される場合、所定の抗原またはエピトープ、特にＢＴＮ３Ａへの抗体の結合の文脈における「結合」という用語は、典型的にはリガンドとして抗原の可溶性形態および分析物として抗体を使用するＢＩＡｃｏｒｅ機器で、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定される場合に、約１０－７Ｍ以下、例えば約１０－８Ｍ以下、例えば約１０－９Ｍ以下、約１０－１０Ｍ以下、または約１０－１１Ｍ以下のＫＤに対応する親和性での結合を典型的には意味する。ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａａｔａｗａｙ、ＮＪ）は、モノクローナル抗体のパネルをエピトープビニングするために日常的に使用されている様々な表面プラズモン共鳴アッセイ形式のうちの１つである。典型的には、抗体は、所定の抗原に、同一にも密接にも関連していない非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するＫＤよりも少なくとも１０分の１低い、例えば少なくとも１００分の１低い、例えば少なくとも１，０００分の１低い、例えば少なくとも１０，０００分の１低い、例えば少なくとも１００，０００分の１低いＫＤに対応する親和性で結合する。抗体のＫＤが非常に低い（すなわち、抗体は高い親和性を有する）場合、抗体が抗原に結合するＫＤは、典型的には、非特異的抗原に対するＫＤよりも少なくとも１０，０００分の１低い。抗体は、そのような結合が検出できない（リガンドとして抗原の可溶性形態および分析物として抗体を使用するＢＩＡｃｏｒｅ ３０００機器で、例えばプラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して）か、またはその抗体および異なる化学構造もしくはアミノ酸配列を有する抗原もしくはエピトープによって検出される結合よりも１００分の１、５００分の１、１０００分の１もしくは１０００分の１超低い、のいずれかの場合、抗原またはエピトープに本質的に結合しないと言われる。
【0036】
「親和性」という用語は、抗体の文脈において本明細書で使用される場合、エピトープへの抗体の結合の強度を意味する。
【0037】
「Ｋｏｎ」または「Ｋａｓｓ」（Ｋａ）という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を指すことが意図される一方、「Ｋｄｉｓ」（Ｋｄ）または「Ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書で使用される場合、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指すことが意図される。
【0038】
「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、ｋｏｆｆとｋｏｎの比（すなわち、ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される平衡解離定数を指すことが意図される。ＫＤ値は抗体の濃度（特定の実験に必要な抗体の量）に関連するので、ＫＤ値がより低い（より低い濃度）ほど、抗体の親和性はより高い。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。ｍＡｂのＫＤ値を求めるための好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗ，ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８８）、Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９－６０１（１９８３）に見出すことができ、これらの参考文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。抗体のＫＤを求める方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによるか、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）（親和性評価に関する詳細情報については、Ｒｉｃｈ ＲＬ，Ｄａｙ ＹＳ，Ｍｏｒｔｏｎ ＴＡ，Ｍｙｓｚｋａ ＤＧ．Ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｄｒｕｇ／ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００１ Ｓｅｐ １５；２９６（２）：１９７－２０７も参照されたい）もしくはＯｃｔｅｔ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを使用することによるものである。Ｏｃｔｅｔ（登録商標）プラットフォームは、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）技術に基づいている。ＢＬＩ技術の原理は、２つの表面（固定化されたタンパク質の層および内部参照層）から反射された白色光の光学的干渉パターンに基づく。バイオセンサチップ表面に固定化されたリガンドと溶液中の分析物との間の結合は、バイオセンサチップでの光学的厚さの増加を生じ、ナノメートル単位で測定される干渉パターンのシフトをもたらす。波長シフト（Δλ）は、生物学的層の光学的厚さの変化の直接的な尺度であり、このシフトをある期間にわたって測定し、該シフトの大きさを時間の関数としてプロットすると、古典的な会合／解離曲線が得られる。この相互作用はリアルタイムで測定され、結合特異性、会合速度および解離速度、および濃度をモニタリングすることを可能にする。（Ａｂｄｉｃｈｅ ｅｔ ａｌ．２００８を参照されたい）。親和性の測定は、典型的には２５℃で行われる。
【0039】
本明細書で使用される場合、「特異性」という用語は、ＢＴＮ３Ａなどの抗原に提示されたエピトープに、検出可能に結合する抗体の能力を指す。いくつかの実施形態では、実施例に記載されているように、フローサイトメトリーによって求めた場合に、好ましくは５０μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１０μｇ／ｍｌ未満のＥＣ５０で、末梢血髄細胞（ＰＢＭＣ）に発現するヒトＢＴＮ３Ａに結合する抗体を指すことが意図される。他の実施形態では、抗体は、実施例に記載されているように、）ＳＰＲ測定によって測定した場合に、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、１００ｐＭ以下、または１０ｐＭ以下のＫＤで抗原組換えポリペプチドに結合する。
【0040】
「ＢＴＮ３Ａ以外の抗原と交差反応する」抗体とは、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または１００ｐＭ以下のＫＤでＢＴＮ３Ａ以外の抗原に結合する抗体を指すことが意図される。「特定の抗原と交差反応しない」抗体とは、１μＭ以上のＫＤ、または１０μＭ以上のＫＤでその抗原に結合する抗体を指すことが意図される。ある特定の実施形態では、抗原と交差反応しないそのような抗体は、標準的な結合アッセイにおいて、これらのタンパク質に対する本質的に検出不能な結合を示す。
【0041】
特異性はさらに、例えば、特異的抗原への結合（この場合、特異的抗原はＢＴＮ３Ａポリペプチドである）対他の無関係な分子への非特異的結合における親和性／結合活性の約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０．０００：１またはそれを超える比によって示され得る。
【0042】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【0043】
本明細書で使用される場合、「最適化される」という用語は、ヌクレオチド配列が、産生細胞または生物、一般に真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはヒト細胞における好ましいコドンを使用してアミノ酸配列をコードするように変更されていることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、出発ヌクレオチド配列によって元々コードされたアミノ酸配列を完全にまたは可能な限り多く保持するように操作されている。最適化されたヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列はまた、最適化されたとも称される。
【0044】
ポリペプチド配列に関して本明細書で使用される「同一性」という用語は、２つの分子間のアミノ酸配列の同一性を指す。両方の分子のアミノ酸位置が同じアミノ酸によって占められている場合、分子はその位置で同一である。２つのポリペプチド間の同一性は、同一の位置の数の直接的な関数である。一般に、配列は、（必要に応じてギャップを含めて）最も高い一致が得られるように整列される。２つの配列間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一の位置の数（すなわち、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）の関数である。２つの配列間の配列の比較および同一性パーセントの決定は、以下に記載されているように、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【0045】
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティおよび４のギャップペナルティを使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１－１７，１９８８）を使用して求めることができる。あるいは、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、公開されている技法および広く利用可能なコンピュータプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）、またはＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４、通常はｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで利用可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３，１９７０）アルゴリズムで入手可能であり、Ｂｌｏｓｓｏｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重みおよび１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用することによって求めることができる。
【0046】
一般に、必ずしもそうとは限らないが、ＣＤＲ領域などの参照ポリペプチドに関するアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であることが好ましい。
【0047】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」とは、所与のアミノ酸が、類似の物理化学的特徴を有する残基、例えばある脂肪族残基を別の脂肪族残基に置換すること（例えば、互いに、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＡｌａ）、またはある極性残基を別の極性残基に置換すること（例えば、ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；またはＧｌｎとＡｓｎとの間）によって置き換えられ得ることを意味する。他のそのような保存的置換、例えば、類似の疎水性の特徴を有する領域全体の置換が既知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、本明細書に記載のアッセイのいずれか１つで試験して、天然型または参照ポリペプチドの所望の活性、例えば抗原結合活性および特異性が保持されていることを確認することができる。アミノ酸は、アミノ酸の側鎖の特性の類似性に従って、以下のようにグループ分けされ得る（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．，ｐｐ．７３－７５，Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７５））：（１）非極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非電荷極性：Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。代替的に、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下のようなグループに分けられ得る：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。特定の保存的置換には、例えば、ＡｌａからＧｌｙもしくはＳｅｒへ；ＡｒｇからＬｙｓへ；ＡｓｎからＧｌｎもしくはＨｉｓへ；ＡｓｐからＧｌｕへ；ＣｙｓからＳｅｒへ；ＧｌｎからＡｓｎへ；ＧｌｕからＡｓｐへ；ＧｌｙからＡｌａもしくはＰｒｏへ；ＨｉｓからＡｓｎもしくはＧｌｎへ；ＩｌｅからＬｅｕもしくはＶａｌへ；ＬｅｕからＩｌｅもしくはＶａｌへ；ＬｙｓからＡｒｇ、ＧｌｎもしくはＧｌｕへ；ＭｅｔからＬｅｕ、ＴｙｒもしくはＩｌｅへ；ＰｈｅからＭｅｔ、ＬｅｕもしくはＴｙｒへ；ＳｅｒからＴｈｒへ；ＴｈｒからＳｅｒへ；ＴｒｐからＴｙｒへ；ＴｙｒからＴｒｐへ；および／またはＰｈｅからＶａｌ、ＩｌｅもしくはＬｅｕへ、が含まれる。
【0048】
２つのヌクレオチドアミノ酸配列間の同一性パーセントはまた、例えば、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を使用する核酸配列のためのＢＬＡＳＴＮプログラムなどのアルゴリズムを使用して求めることができる。
【0049】
本開示の使用のための活性化ＢＴＮ３Ａ抗体
本開示は、感染性障害の治療を必要とする対象における感染性障害、より具体的には、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害、例えばＱ熱、またはＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２によって引き起こされる障害、例えばＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法におけるＢＴＮ３Ａ活性化抗体の使用に関する。
本開示は、感染性障害の治療を必要とする対象における感染性障害、より具体的には、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害、例えばＱ熱、またはＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２によって引き起こされる障害、例えばＣＯＶＩＤ－１９を治療する方法におけるＢＴＮ３Ａ活性化抗体の使用に関する。
【0050】
特定の実施形態では、本開示に従って使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、以下の特性を呈する：
（ｉ）活性化抗体は、例えば実施例に記載されているように、ＳＰＲによって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤで、好ましくは１ｎＭ以下のＫＤでＢＴＮ３Ａに結合する；
（ｉｉ）活性化抗体は、例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合する；および、
（ｉｉｉ）活性化抗体は、例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、ＢＴＮ３を発現する細胞との共培養において、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導する。
（ｉ）活性化抗体は、例えば実施例に記載されているように、ＳＰＲによって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤで、好ましくは１ｎＭ以下のＫＤでＢＴＮ３Ａに結合する；
（ｉｉ）活性化抗体は、例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合する；および、
（ｉｉｉ）活性化抗体は、例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、ＢＴＮ３を発現する細胞との共培養において、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導する。
【0051】
以下の特定の実施形態と組み合わせることができるある特定の実施形態では、本開示の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、以下に開示されているような特定の抗体の抗体断片である。抗体断片には、限定されないが、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ユニボディ、およびｓｃＦｖ断片、ダイアボディ、単一ドメインまたはナノボディおよび他の断片が含まれる。好ましくは、活性化抗体は、ｓｃＦｖ断片のＦａｂなどの一価抗体である。特に、活性化抗体は、ｍＡｂ１０３．２の６つすべてのＣＤＲを有するＦａｂ断片などの一価ＢＴＮ３Ａ活性化抗体である。
【0052】
いくつかの実施形態では、本開示の使用のための抗体は、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体である。本開示の好ましい実施形態では、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体と少なくとも同じ親和性（または優れた親和性）を有しながら、ヒトに対する免疫原性を低下させるようにヒト化されている。より具体的には、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、国際公開第２０１２０８０３５１号に開示されている抗体２０．１または７．２のヒト化形態である。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、非ヒト抗体、例えばマウスｍＡｂ２０．１または７．２の６つすべてのＣＤＲ、および免疫原性を低下させるための１つ以上の変異を有するマウス抗体配列に由来するＦＲ（またはその一部）を含む。他の特定の実施形態では、活性化抗体は、ｍＡｂ１０３．２の６つすべてのＣＤＲを有するヒト化Ｆａｂ断片などの一価ヒト化ＢＴＮ３Ａ活性化抗体である。
【0053】
ヒト化抗体は、場合により、ヒト定常領域の少なくとも一部も含む。好ましくは、本開示による組換え抗体は、ヒト化サイレント抗体、典型的にはヒト化サイレントＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。
【0054】
本明細書で使用される場合、「サイレント」抗体という用語は、国際公開第２０２０／０２５７０３号に記載されているものなどの、結合アッセイで測定した場合に、ＦｃγＲ結合および／もしくはＣ１ｑ結合を示さないか、または低いＦｃγＲ結合および／もしくはＣ１ｑ結合を示す抗体を指す。一実施形態では、「ＦｃγＲおよび／もしくはＣ１ｑ結合がないかまたは低い」という用語は、サイレント抗体が、野生型ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプを有する対応する抗体で観察されるＦｃγＲおよび／またはＣ１ｑ結合の少なくとも５０％未満、例えば８０％未満のＦｃγＲおよび／またはＣ１ｑ結合を示すことを意味する。
【0055】
ＢＴＮ３Ａ活性化抗体の例は、以下の段落に記載されている。いくつかの実施形態では、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、国際特許出願第２０１２／０８０７６９号、同第２０１２／０８０３５１号、および同第２０２０／０２５７０３号および同第２０２０／１３６２１８号に記載されているものなどのＢＴＮ３Ａ活性化抗体からなる群から選択される。
【0056】
いくつかの特定の実施形態では、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、国際公開第２０２００２５７０３号に記載されているヒト化抗体から選択されるか、または国際公開第２０１２／０８０７６９号、同第２０１２／０８０３５１号および同第２０２０／１３６２１８号に記載されているＢＴＮ３Ａ活性化抗体のヒト化バージョンである。
【0057】
いくつかの実施形態では、ＢＴＮ３Ａ抗体は、国際公開第２０１２０８０７６９号および同第２０１２０８０３５１号に記載されているようなＣＮＣＭ寄託番号Ｉ－４４０１およびＩ－４４０２の下でアクセス可能なハイブリドーマまたはそれらのヒト化バージョンのうちの１つから得ることができるｍＡｂ２０．１およびｍＡｂ７．２から選択され得る。
【0058】
いくつかの実施形態では、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、国際公開第２０１２０８０７６９号および同第２０１２０８０３５１号に記載されている抗体２０．１もしくは７．２、または国際公開第２０２００２５７０３号に記載されているようなｍＡｂ１～５のいずれか、国際公開第２０２０／１３６２１８号に記載されているようなｍＡｂ１０３．２の一価断片の６つのＣＤＲ（ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１とも呼ばれる）、ＶＨ ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２とも呼ばれる）、ＶＨ ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ１とも呼ばれる）、ＶＬ ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１とも呼ばれる）、ＶＬ ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２とも呼ばれる）、ＶＬ ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３とも呼ばれる））を含む。
【0059】
特定の実施形態では、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、以下の表１に示されるようなＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む。
【0060】
【表1】
【0061】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているように使用するための抗体は、表１に記載されているようなｍＡｂ２０．１、ｍＡｂ７．２またはヒト化ｍＡｂ１０３．２、特にｍＡｂ２０．１の６つのＣＤＲ領域とそれぞれ１００％同一である６つのＣＤＲ領域を含む。
【0062】
本明細書に開示されているような他の抗体には、アミノ酸の欠失、挿入または置換によって変異されているが、国際公開第２０１２０８０７６９号および同２０１２０８０３５１号に記載されている抗体２０．１もしくは７．２、または国際公開第２０２０／１３６２１８号に記載されているヒト化ｍＡｂ１０３．２の６つのＣＤＲ領域と比較して、特に表１に定義されている６つのＣＤＲ領域と比較して、ＣＤＲ領域において少なくとも６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００パーセントの同一性を有するアミノ酸を有するものが含まれる。
【0063】
本開示の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体には、表２に定義されているＶＨおよびＶＬ領域と少なくとも９０％、特に少なくとも９５、９６、９７、９８、９９または１００％の同一性を有するものも含まれる。より具体的には、本開示の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体には、以下の表２に記載されているようなそれらの可変重鎖および軽鎖アミノ酸配列ならびにヒト定常領域（アイソタイプ）により構造的に特徴付けられている、選択されたヒト化組換え抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５およびｍＡｂ６が含まれる。
【0064】
【表2】
【0065】
ｍＡｂ１～ｍＡｂ６を生成するために使用されるＩｇＧ１、ＩｇＧ４ならびにそれらの変異バージョンＩｇＧ１ Ｌ２４７Ｆ／Ｌ２４８Ｅ／Ｐ３５０ＳおよびＩｇＧ４ Ｓ２４１Ｐ／Ｌ２４８Ｅの定常アイソタイプ領域の対応するアミノ酸およびヌクレオチドコード配列は、当技術分野で周知である（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【0066】
ＩｇＧに見出されるＣ末端リジンは天然に切断されてもよく、この改変は抗体の特性に影響を及ぼさない。したがって、この残基は、ｍＡｂ１～ｍＡｂ６の構築物において追加的に欠失されてもよい。
【0067】
本開示の使用のための好ましいヒト化抗体ｍＡｂ１およびｍＡｂ３を作製するための全長軽鎖および重鎖ならびにコード配列を以下の表３に示す。
【0068】
【表3】
【0069】
本開示に従って使用するための、ｍＡｂ２０．１、ｍＡｂ７．２またはｍＡｂ１０３．２のＢＴＮ３Ａ活性化断片の機能的バリアント
エピトープマッピングの分析は、参照ｍＡｂ２０．１が配列番号３２のヒトＢＴＮ３Ａ１の７９、８３および８８位の残基に結合することを示す。したがって、本開示は、配列番号３２の７９～８８位に位置するアミノ酸残基を含むエピトープに結合し、先に定義され、さらに以下で再認識されるような機能的特性のうちの１つまたは複数を有する、特に参照ｍＡｂ２０．１または参照ｍＡｂ２０．１のヒト化形態ｍＡｂ３の機能的特性のうちの１つまたは複数を有するＢＴＮ３Ａ抗体の使用を包含する。
エピトープマッピングの分析は、参照ｍＡｂ２０．１が配列番号３２のヒトＢＴＮ３Ａ１の７９、８３および８８位の残基に結合することを示す。したがって、本開示は、配列番号３２の７９～８８位に位置するアミノ酸残基を含むエピトープに結合し、先に定義され、さらに以下で再認識されるような機能的特性のうちの１つまたは複数を有する、特に参照ｍＡｂ２０．１または参照ｍＡｂ２０．１のヒト化形態ｍＡｂ３の機能的特性のうちの１つまたは複数を有するＢＴＮ３Ａ抗体の使用を包含する。
【0070】
またエピトープマッピング分析によって示されるように、参照ｍＡｂ７．２は、配列番号３２のヒトＢＴＮ３Ａ１の７３、７９、８３、８８、９０、９３位の残基に結合する。したがって、本開示は、配列番号３２の７３～９３位に位置するアミノ酸残基を含むエピトープ、最も具体的には、配列番号３２の７３、７９、８３、８８、９０および９３位のアミノ酸残基を含むエピトープに結合し、先に定義され、さらに以下で再認識されるような機能的特性のうちの１つまたは複数を有する、特に参照ｍＡｂ７．２または参照ｍＡｂ７．２のヒト化形態ｍＡｂ１の機能的特性のうちの１つまたは複数を有するＢＴＮ３Ａ抗体の使用を包含する。
【0071】
さらに他の実施形態では、本開示の機能的バリアント抗体は、全長の重鎖および軽鎖アミノ酸配列、あるいは可変領域重鎖および軽鎖アミノ酸配列、あるいは上記の参照抗体ｍＡｂ２０．１もしくはｍＡｂ７．２またはｍＡｂ２０．１もしくはｍＡｂ７．２のヒト化形態（それぞれｍＡｂ３またはｍＡｂ１）のいずれか１つの対応するアミノ酸配列と相同であるか、またはより具体的には同一である６つすべてのＣＤＲ領域アミノ酸配列を有し、そのような機能的バリアント抗体は、前記参照抗体の所望の機能的特性を保持する。
【0072】
さらに他の実施形態では、本開示の機能的バリアント抗体は、可変領域重鎖および軽鎖アミノ酸配列、あるいは上記の任意の参照抗体ｍＡｂ１０３．２もしくはｍＡｂ１０３．２のヒト化形態の対応するアミノ酸配列と相同であるか、またはより具体的には同一である６つすべてのＣＤＲ領域アミノ酸配列を有するＦａｂ断片などのｍＡｂ１０３．２のＢＴＮ３Ａ活性化断片であり、そのような機能的バリアント抗体は、前記参照抗体の所望の機能的特性を保持する。
【0073】
参照ｍＡｂ２０．１抗体もしくはｍＡｂ２０．１抗体のヒト化形態ｍＡｂ３、または参照抗体ｍＡｂ７．２、もしくはｍＡｂ７．２のヒト化形態ｍＡｂ１、またはｍＡｂ１０３．２の参照活性化断片もしくは該活性化断片のヒト化形態の機能的バリアント、特にＶＨおよびＶＬ、または本開示のモノクローナル抗体の文脈で使用される６つすべてのＣＤＲを有する機能的バリアントは、親抗体（例えば、ｍＡｂ３またはｍＡｂ１）の親和性（典型的には表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるＫＤによって評価される）の少なくともかなりの割合（少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％）を抗体が保持することを依然として可能にし、いくつかの場合では、そのような機能的バリアントは、参照抗体（例えば、ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片）よりも高い親和性、選択性および／または特異性で会合し得る。
典型的には参照抗体がｍＡｂ３もしくはｍＡｂ１もしくはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片である場合の参照抗体の、または本明細書に開示されている任意の例示的な参照抗体の所望の機能的特性は、以下からなる群から選択され得る：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって測定した場合のヒトＢＴＮ３Ａ１への結合特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化のインビトロでの誘導；
（ｉｉｉ）Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の存在下での単球のＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ細菌量の減少；
（ｉｖ）４時間の共培養後、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞傷害活性のインビトロでの増加、
（ｖ）Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染患者由来の末梢血単核細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒のインビトロでの増加；および／または、
（ｖｉ）例えば、感染した細胞とＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞との共培養物においてインビトロで測定した場合に、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２に感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞傷害活性のインビトロでの増加。
典型的には参照抗体がｍＡｂ３もしくはｍＡｂ１もしくはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片である場合の参照抗体の、または本明細書に開示されている任意の例示的な参照抗体の所望の機能的特性は、以下からなる群から選択され得る：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって測定した場合のヒトＢＴＮ３Ａ１への結合特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化のインビトロでの誘導；
（ｉｉｉ）Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の存在下での単球のＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ細菌量の減少；
（ｉｖ）４時間の共培養後、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞傷害活性のインビトロでの増加、
（ｖ）Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染患者由来の末梢血単核細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒のインビトロでの増加；および／または、
（ｖｉ）例えば、感染した細胞とＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞との共培養物においてインビトロで測定した場合に、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２に感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞傷害活性のインビトロでの増加。
【0074】
典型的には、参照ｍＡｂ３もしくは１またはｍＡｂ１０３．２の活性化断片の機能的バリアントの上記の点（ｉ）～（ｖｉ）による機能的特性は、上記の対応する参照抗体ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２の活性化断片の対応する機能的特性と実質的に等しいかまたはそれよりも優れている。実質的に等しいとは、本明細書では、機能的バリアントが、参照ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２の活性化断片の対応する機能的特性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を保持することが意図される。
【0075】
特定の実施形態では、本開示に従って使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、それぞれ抗体２０．１もしくは７．２またはｍＡｂ１０３．２の活性化断片のＣＤＲ配列と比較して、あるいはより具体的にはｍＡｂ２０．１のＣＤＲ配列と比較して、１つまたは複数のＣＤＲにおいて１、２、３または４つ以下のアミノ酸変化（欠失、挿入、または置換を含む）を有する、ｍＡｂ２０．１もしくはｍＡｂ３のヒト化形態、またはｍＡｂ７．２もしくはｍＡｂ１のヒト化形態、またはｍＡｂ１０３．２の活性化断片もしくはそのヒト化形態の機能的バリアントである。
例えば、本開示は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、参照ｍＡｂ２０．１またはｍＡｂ２０．１のヒト化形態ｍＡｂ３の機能的バリアント抗体に関し、ここで、ＣＤＲ配列、すなわち６つのＣＤＲ領域；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は、配列番号５～１０で定義されるように、ｍＡｂ２０．１またはｍＡｂ２０．１のヒト化形態ｍＡｂ３参照抗体の対応するＣＤＲ配列と少なくとも６０、７０、９０、９５または１００パーセントの配列同一性を共有し、前記機能的バリアント抗体はＢＴＮ３Ａに特異的に結合し、抗体は以下の機能的特性ｉ）～ｉｉｉ）のうちの少なくとも１つを呈する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合すること；
（ｉｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導すること。
例えば、本開示は、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、参照ｍＡｂ２０．１またはｍＡｂ２０．１のヒト化形態ｍＡｂ３の機能的バリアント抗体に関し、ここで、ＣＤＲ配列、すなわち６つのＣＤＲ領域；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は、配列番号５～１０で定義されるように、ｍＡｂ２０．１またはｍＡｂ２０．１のヒト化形態ｍＡｂ３参照抗体の対応するＣＤＲ配列と少なくとも６０、７０、９０、９５または１００パーセントの配列同一性を共有し、前記機能的バリアント抗体はＢＴＮ３Ａに特異的に結合し、抗体は以下の機能的特性ｉ）～ｉｉｉ）のうちの少なくとも１つを呈する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合すること；
（ｉｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導すること。
【0076】
最も好ましくは、機能的バリアント抗体は、特性ｉ）～ｉｉｉ）を呈する。
本開示はまた、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、参照ｍＡｂ７．２またはｍＡｂ７．２のヒト化形態ｍＡｂ１の機能的バリアント抗体に関し、ここで、ＣＤＲ配列、すなわち６つのＣＤＲ領域；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は、配列番号１１～１６で定義されるように、ｍＡｂ７．２またはｍＡｂ１参照抗体の対応するＣＤＲ配列と少なくとも６０、７０、９０、９５または１００パーセントの配列同一性を共有し、前記機能的バリアント抗体はＢＴＮ３Ａ１に特異的に結合し、抗体は以下の機能的特性のうちの少なくとも１つを呈する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合すること；
（ｉｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導すること。
本開示はまた、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、参照ｍＡｂ７．２またはｍＡｂ７．２のヒト化形態ｍＡｂ１の機能的バリアント抗体に関し、ここで、ＣＤＲ配列、すなわち６つのＣＤＲ領域；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は、配列番号１１～１６で定義されるように、ｍＡｂ７．２またはｍＡｂ１参照抗体の対応するＣＤＲ配列と少なくとも６０、７０、９０、９５または１００パーセントの配列同一性を共有し、前記機能的バリアント抗体はＢＴＮ３Ａ１に特異的に結合し、抗体は以下の機能的特性のうちの少なくとも１つを呈する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合すること；
（ｉｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導すること。
【0077】
好ましくは、前記機能的バリアントは、すべての機能的活性ｉ）～ｉｉｉ）を呈する。
本開示はまた、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、参照Ｆａｂ断片ｍＡｂ１０３．２またはＦａｂ断片ｍＡｂ１０３．２のヒト化形態の機能的バリアント抗体に関し、ここで、ＣＤＲ配列、すなわち６つのＣＤＲ領域；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は、配列番号１７～２２で定義されるように、ｍＡｂ１０３．２の参照Ｆａｂ断片の対応するＣＤＲ配列と少なくとも６０、７０、９０、９５または１００パーセントの配列同一性を共有し、前記機能的バリアント抗体はＢＴＮ３Ａ１に特異的に結合し、抗体は以下の機能的特性のうちの少なくとも１つを呈する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合すること；
（ｉｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導すること。
本開示はまた、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、参照Ｆａｂ断片ｍＡｂ１０３．２またはＦａｂ断片ｍＡｂ１０３．２のヒト化形態の機能的バリアント抗体に関し、ここで、ＣＤＲ配列、すなわち６つのＣＤＲ領域；ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３は、配列番号１７～２２で定義されるように、ｍＡｂ１０３．２の参照Ｆａｂ断片の対応するＣＤＲ配列と少なくとも６０、７０、９０、９５または１００パーセントの配列同一性を共有し、前記機能的バリアント抗体はＢＴＮ３Ａ１に特異的に結合し、抗体は以下の機能的特性のうちの少なくとも１つを呈する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合すること；
（ｉｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導すること。
【0078】
好ましくは、前記機能的バリアントは、すべての機能的活性ｉ）～ｉｉｉ）を呈する。
本発明はさらに、配列番号１および２にそれぞれ定義されるような前記ｍＡｂ３参照抗体の対応する重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも８０％、９０％、または少なくとも９５、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、ｍＡｂ３参照抗体の機能的バリアント抗体に関し、機能的バリアント抗体は、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合し、以下の機能的特性のうちの少なくとも１つを呈する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合すること；
（ｉｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導すること。
本発明はさらに、配列番号１および２にそれぞれ定義されるような前記ｍＡｂ３参照抗体の対応する重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも８０％、９０％、または少なくとも９５、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、ｍＡｂ３参照抗体の機能的バリアント抗体に関し、機能的バリアント抗体は、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合し、以下の機能的特性のうちの少なくとも１つを呈する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合すること；
（ｉｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導すること。
【0079】
好ましくは、機能的バリアント抗体は、特性ｉ）～ｉｉｉ）を呈する。
本発明はさらに、配列番号３および４にそれぞれ定義されるような前記ｍＡｂ１参照抗体の対応する重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも８０％、９０％、または少なくとも９５、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、ｍＡｂ１参照抗体の機能的バリアント抗体に関し、機能的バリアント抗体は、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合し、以下の機能的特性のうちの少なくとも１つを呈する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合すること；
（ｉｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導すること。
本発明はさらに、配列番号３および４にそれぞれ定義されるような前記ｍＡｂ１参照抗体の対応する重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも８０％、９０％、または少なくとも９５、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、ｍＡｂ１参照抗体の機能的バリアント抗体に関し、機能的バリアント抗体は、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合し、以下の機能的特性のうちの少なくとも１つを呈する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合すること；
（ｉｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導すること。
【0080】
いくつかの実施形態では、前記機能的バリアントは、すべての機能的活性ｉ）～ｉｉｉ）を呈する。
本発明はさらに、配列番号６３および６４にそれぞれ定義されるようなｍＡｂ１０３．２の前記Ｆａｂ断片の対応する重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも８０％、９０％、または少なくとも９５、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、ｍＡｂ１０３．２の参照Ｆａｂ断片の機能的バリアント抗体に関し、機能的バリアント抗体は、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合し、以下の機能的特性のうちの少なくとも１つを呈する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合すること；
（ｉｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導すること。
本発明はさらに、配列番号６３および６４にそれぞれ定義されるようなｍＡｂ１０３．２の前記Ｆａｂ断片の対応する重鎖および軽鎖可変領域と少なくとも８０％、９０％、または少なくとも９５、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、ｍＡｂ１０３．２の参照Ｆａｂ断片の機能的バリアント抗体に関し、機能的バリアント抗体は、ＢＴＮ３Ａに特異的に結合し、以下の機能的特性のうちの少なくとも１つを呈する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合すること；
（ｉｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導すること。
【0081】
いくつかの実施形態では、前記機能的バリアントは、すべての機能的活性ｉ）～ｉｉｉ）を呈する。
【0082】
典型的には、参照ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片の機能的バリアントの上記の点（ｉ）～（ｉｉｉ）による機能的特性は、上記の対応する参照抗体ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片の対応する機能的特性と実質的に等しいかまたはそれよりも優れている。実質的に等しいとは、本明細書では、機能的バリアントが、参照ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片の対応する機能的特性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を保持することが意図される。
【0083】
ＣＤＲバリアントの配列は、大抵は保存的置換により親抗体配列のＣＤＲの配列と異なり得る。例えば、バリアントにおける置換の少なくとも１０個、例えば、少なくとも９、８、７、６、５、４、３、２または１個が保存的アミノ酸残基の置換えである。
【0084】
変異アミノ酸配列を有する機能的バリアント抗体は、コード核酸分子の変異誘発（例えば、部位特異的またはＰＣＲ媒介性変異誘発）、続いて本明細書に記載の機能アッセイを使用して、保持された機能（すなわち、上記の機能）についてコードされた変化した抗体を試験することによって得ることができる。
参照ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片と交差競合する抗体．
本明細書に開示されているような参照ｍＡｂ３または参照ｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片と同様の有利な特性を有する追加の抗体は、標準的なＢＴＮ３Ａ１結合アッセイにおいて、統計学的に有意な様式で、上記の前記参照ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片と交差競合する（例えば、前記参照ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片の結合を競争的に阻害する）能力に基づいて同定することができる。
参照ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片と交差競合する抗体．
本明細書に開示されているような参照ｍＡｂ３または参照ｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片と同様の有利な特性を有する追加の抗体は、標準的なＢＴＮ３Ａ１結合アッセイにおいて、統計学的に有意な様式で、上記の前記参照ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片と交差競合する（例えば、前記参照ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片の結合を競争的に阻害する）能力に基づいて同定することができる。
【0085】
試験抗体は、最初に、例えば、ヒト組換え抗体ライブラリーから、例えば、ファージディスプレイ技術を使用して、または実施例において典型的に評価されるようにＢＴＮ３Ａ１抗原で免疫化されたヒト可変領域抗体を発現するトランスジェニックマウスから、ＢＴＮ３Ａ１に対するそれらの結合親和性についてスクリーニングされ得る（材料および方法の節を参照されたい）。
【0086】
別の実施形態では、本開示に従って使用するための抗体は、少なくとも上記の参照ｍＡｂ３または参照ｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片と同じエピトープに結合する抗体を含む。
【0087】
ヒトＢＴＮ３Ａ１に対する本開示の抗体の結合と交差競合するかまたは該結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体がヒトＢＴＮ３Ａ１への結合についてその抗体と競合することができることを実証する。そのような抗体は、非限定的な理論によれば、該試験抗体が競合する抗体と同じまたは関連する（例えば、構造的に類似または空間的に近位）ヒトＢＴＮ３Ａ１のエピトープに結合し得る。
【0088】
例えば、以下の試験を使用して、ｍＡｂ３参照抗体と交差競合する能力についてＢＴＮ３Ａ１抗体をスクリーニングすること、および／または前記参照抗体と同じエピトープに結合する能力について抗ＢＴＮ３Ａ１抗体をスクリーニングすることができる。ヒトＢＴＮ３Ａ１でトランスフェクトしたＢＴＮ３ＫＯ細胞（典型的にはＨＥＫ２９３Ｔ）を飽和濃度（例えば、１０μｇ／ｍＬ）の参照抗体ｍＡｂ３で染色することができる。次いで、異なる用量の試験ＢＴＮ３Ａ１ ｍＡｂが、ｍＡｂ３参照抗体との競合的可能性について試験され得る。参照抗体と競合するｍＡｂは、そのような参照抗体の存在下ではＢＴＮ３Ａ１を認識することができない。データは、平均蛍光強度として表すことができる。代替的に、競合アッセイを、実施例の節に記載されるようなビニングアッセイで行うことができる。典型的には、ビニング実験は、組換えヒトＢＴＮ３Ａ１をバイオセンサに固定化し、参照抗体、続いて競合抗体を提示することによって行うことができる。
【0089】
選択された抗体は、特に前に詳述したように、ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片と比較して、有利なＢＴＮ３Ａ活性化特性について、さらに試験および選択され得る。
【0090】
いくつかの実施形態では、本開示の使用のための抗体は、上記のＢＴＮ３Ａ抗体への結合について競合し、特に本開示の使用のための抗体は、国際公開第２０１２／０８０７６９号および同第２０１２／０８０３５１号に記載されているようなＣＮＣＭ寄託番号Ｉ－４４０１およびＩ－４４０２の下でアクセス可能なハイブリドーマのうちの１つから、ならびに国際公開第２０２００２５７０３号に記載されているｍＡｂ１～６から得ることができる、ｍＡｂ２０．１およびｍＡｂ７．２から選択される抗体との結合について競合する。より具体的な実施形態では、本開示の使用のための抗体は、寄託番号Ｉ－４４０１の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって産生されるｍＡｂ２０．１、ならびに配列番号２３の重鎖および配列番号２４の軽鎖を有する抗体から選択される抗体との結合について競合する。
したがって、一実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているような感染性障害の治療で使用するための単離された抗体を提供し、前記単離された抗体は、ＢＴＮ３Ａ１への結合から参照ｍＡｂ３または参照ｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片と競合し、前記抗体は、以下の特性のうちの１つまたは複数を有する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって測定した場合のヒトＢＴＮ３Ａ１への結合特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化のインビトロでの誘導；
（ｉｉｉ）Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の存在下での単球のＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ細菌量の減少；
（ｉｖ）４時間の共培養後、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞傷害活性のインビトロでの増加、
（ｖ）Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染患者由来の末梢血単核細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒のインビトロでの増加；および／または、
（ｖｉ）例えば、感染した細胞とＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞との共培養物においてインビトロで測定した場合に、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２に感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞傷害活性のインビトロでの増加。
したがって、一実施形態では、本開示は、本明細書に開示されているような感染性障害の治療で使用するための単離された抗体を提供し、前記単離された抗体は、ＢＴＮ３Ａ１への結合から参照ｍＡｂ３または参照ｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片と競合し、前記抗体は、以下の特性のうちの１つまたは複数を有する：
（ｉ）ＢＴＮ３Ａ１に対する特異性、特に、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイによって測定した場合のヒトＢＴＮ３Ａ１への結合特性；
（ｉｉ）例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化のインビトロでの誘導；
（ｉｉｉ）Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の存在下での単球のＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ細菌量の減少；
（ｉｖ）４時間の共培養後、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞傷害活性のインビトロでの増加、
（ｖ）Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染患者由来の末梢血単核細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒のインビトロでの増加；および／または、
（ｖｉ）例えば、感染した細胞とＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞との共培養物においてインビトロで測定した場合に、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２に感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞傷害活性のインビトロでの増加。
【0091】
特定の実施形態では、参照ｍＡｂ３またはｍＡｂ１またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片とＢＴＮ３Ａ１への結合について競合する抗体の上記の点（ｉ）～（ｖｉ）による機能的特性は、上記のように、それぞれ参照抗体ｍＡｂ１またはｍＡｂ３またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片の対応する機能的特性と実質的に等しいかまたはそれよりも優れている。実質的に等しいとは、本明細書では、機能的バリアントが、参照ｍＡｂ１またはｍＡｂ３またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片の対応する機能的特性の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％を保持することが意図される。
【0092】
ある特定の実施形態では、クロスブロッキング抗体または参照ｍＡｂ１もしくはｍＡｂ３もしくはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片とＢＴＮ３Ａ１への結合について競合する抗体は、キメラ、ヒト化またはヒト組換え抗体である。
【0093】
フレームワークまたはＦｃ工学
本開示の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、該活性化抗体の免疫原性を低下させるために、ＶＨおよびＶＬ内のフレームワーク残基に行われた改変を含み得る。
本開示の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、該活性化抗体の免疫原性を低下させるために、ＶＨおよびＶＬ内のフレームワーク残基に行われた改変を含み得る。
【0094】
いくつかの具体的な実施形態では、本開示の使用のための抗体は、親マウス抗体ｍＡｂ２０．１のヒト化モノクローナル抗体であり、ＶＨフレームワーク領域に（ＶＨ親フレームワーク領域と比較して）少なくとも以下のアミノ酸変異：Ｖ５Ｑ；Ｖ１１Ｌ；Ｋ１２Ｖ；Ｖ２０Ｌ；Ｒ６６Ｋ；Ｍ６９Ｌ；Ｔ７５Ｓ；Ｍ８０Ｉ；Ｅ８１Ｑ；Ｒ８３Ｔ；Ｔ８７Ｓ；Ｌ１０８Ａ；およびＶκフレームワーク領域に少なくとも以下のアミノ酸変異（Ｖκフレームワーク領域と比較して）：Ｔ５Ｎ；Ｖ１５Ｌ；Ｒ１８Ｔ；Ｖ１９Ｉ；Ｋ３９Ｒ；Ｋ４２Ｎ；Ａ４３Ｉ；Ｄ７０Ｇ；Ｆ７３Ｌ；Ｖ１０４Ｌを含む。
【0095】
フレームワーク領域内で行われる改変に加えて、本開示の抗体は、典型的には、血清中の半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合および／または抗原依存性細胞傷害などの、抗体の１つまたは複数の機能的特性を変化させるために、Ｆｃ領域内に改変を含むように操作され得る。
【0096】
さらに、本開示の使用のための抗体は、化学的に改変（例えば、１つまたは複数の化学的部分は、抗体に付着され得る）されてもよく、または該抗体のグリコシル化を変化するように改変されてもよく、ここでも抗体の１つまたは複数の機能的特性を変化する。これらの実施形態の各々を、以下でさらに詳細に説明する。
【0097】
本明細書で使用される場合、「アイソタイプ定常領域」または「Ｆｃ領域」という用語は、天然型配列のＦｃ領域およびバリアントのＦｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を明示するために互換的に使用される。ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、一般に、Ｃ２２６位またはＰ２３０位からＩｇＧ抗体のカルボキシル末端までのアミノ酸残基を含むものとして定義され、ナンバリングはＥＵナンバリングシステムに従う。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（残基Ｋ４４７）は、例えば、抗体の産生または精製中に、除去され得るか、または組換え構築物において該リジンに対応するコドンが欠失させる。したがって、本開示の抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、ならびにＫ４４７残基を有するおよび有しない抗体の混合物を有する抗体集団を含み得る。
【0098】
他の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を低下させるように、および／または１つもしくは複数のアミノ酸を改変することによってＦｃγ受容体に対する抗体の親和性を低下させるように改変される。エフェクター機能が低下した、特にＡＤＣＣが低下したそのような抗体には、サイレント抗体が含まれる。
【0099】
ある特定の実施形態では、ＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインが使用される。いくつかの具体的な実施形態では、ＩｇＧ１ Ｆｃ断片の変異バリアント、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するおよび／またはＦｃγ受容体に結合する融合ポリペプチドの能力を低下または排除するサイレントＩｇＧ１ Ｆｃが使用される。
【0100】
ある特定の実施形態では、ＩｇＧ４アイソタイプのＦｃドメインが使用される。いくつかの具体的な実施形態では、ＩｇＧ４ Ｆｃ断片の変異バリアント、例えば、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するおよび／またはＦｃγ受容体に結合する融合ポリペプチドの能力を低下または排除するサイレントＩｇＧ４ Ｆｃが使用される。
【0101】
サイレンシングされたエフェクター機能は、抗体のＦｃ定常部分の変異によって得ることができ、当技術分野において記載されている（Ｂａｕｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，２００８；Ｓｔｒｏｈｌ，２００９）。サイレントＩｇＧ１抗体の例としては、三重変異バリアントＩｇＧ１ Ｌ２４７Ｆ Ｌ２４８Ｅ Ｐ３５０Ｓが挙げられる。サイレントＩｇＧ４抗体の例としては、二重変異バリアントＩｇＧ４ Ｓ２４１Ｐ Ｌ２４８Ｅが挙げられる。
【0102】
ある特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの３１４位でのグリコシル化を防止するサイレントＦｃ変異体である。例えば、Ｆｃドメインは、３１４位でのアスパラギンのアミノ酸置換を含む。そのようなアミノ酸置換の例は、グリシンまたはアラニンによるＮ３１４の置換えである。
【0103】
さらに他の実施形態では、抗体のグリコシル化が改変される。例えば、非グリコシル化抗体が作製され得る（すなわち、抗体はグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変更され得る。そのような糖質の改変は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を変化させることによって達成することができる。例えば、１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらす１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことにより、その部位でのグリコシル化を排除することができる。そのような非グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。そのようなアプローチは、Ｃｏらによる米国特許第５，７１４，３５０号明細書および同第６，３５０，８６１号明細書にさらに詳細に記載されている。
【0104】
本開示に従って使用するために企図される本明細書の抗体の別の改変は、ペグ化またはヘシル化または関連技術である。抗体をペグ化して、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清中）半減期を延長することができる。抗体をペグ化するために、抗体、抗体またはその断片は、典型的には、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付着するようになる条件下で、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体などのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と反応する。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応によって行うことができる。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１～Ｃ１０）アルコキシ－もしくはアリールオキシ－ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール－マレイミドなどの、他のタンパク質を誘導体化するために使用されている任意の形態のＰＥＧを包含することが意図される。ある特定の実施形態では、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当技術分野で公知であり、本開示の抗体に適用することができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａらによる欧州特許第０１５４３１６号明細書およびＩｓｈｉｋａｗａらによる欧州特許第０４０１３８４号明細書を参照されたい。
【0105】
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖定常ドメインに一般的に存在するＣ末端リジンは、製造または貯蔵中に一般的に観察されるこの低減の切断による不均一性を低減するように操作される。そのような改変は、これらの分子に安定性の利益を与えながら、これらの抗体の望ましい機能を知覚可能には変化させない。
本開示の抗体をコードする核酸分子
本開示に従って使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体をコードする核酸分子も本明細書に開示する。可変軽鎖および重鎖ヌクレオチド配列の例は、上に開示された例示的なＢＴＮ３Ａ活性化抗体、特にｍＡｂ７．２、ｍＡｂ２０．１およびｍＡｂ７．２、ｍＡｂ２０．１のヒト化形態、例えばｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、およびｍＡｂ６のいずれか１つの可変軽鎖および重鎖アミノ酸配列をコードするものであり、ｍＡｂ７．２、ｍＡｂ２０．１およびｍＡｂ７．２、ｍＡｂ２０．１のヒト化形態のいくつかは表１および表２から容易に誘導され、遺伝暗号を使用し、場合により宿主細胞種に応じてコドンの偏りを考慮する。
本開示の抗体をコードする核酸分子
本開示に従って使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体をコードする核酸分子も本明細書に開示する。可変軽鎖および重鎖ヌクレオチド配列の例は、上に開示された例示的なＢＴＮ３Ａ活性化抗体、特にｍＡｂ７．２、ｍＡｂ２０．１およびｍＡｂ７．２、ｍＡｂ２０．１のヒト化形態、例えばｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、ｍＡｂ４、ｍＡｂ５、およびｍＡｂ６のいずれか１つの可変軽鎖および重鎖アミノ酸配列をコードするものであり、ｍＡｂ７．２、ｍＡｂ２０．１およびｍＡｂ７．２、ｍＡｂ２０．１のヒト化形態のいくつかは表１および表２から容易に誘導され、遺伝暗号を使用し、場合により宿主細胞種に応じてコドンの偏りを考慮する。
【0106】
本開示はまた、哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞株におけるタンパク質発現に対して最適化された後者の配列に由来する核酸分子に関する。
【0107】
配列番号２３のｍＡｂ２０．１のヒト化形態の重鎖および配列番号２４のｍＡｂ２０．１のヒト化形態の軽鎖をそれぞれコードする核酸分子を、本明細書にさらに開示する。
【0108】
特定の実施形態では、本開示の使用のための抗体は、配列番号２８によってコードされるＶＨおよび配列番号２９によってコードされるＶＬを有するｍＡｂ２０．１のヒト化形態である。
【0109】
ｍＡｂ２０．１のヒト化形態のＶＨおよびＶＬをそれぞれコードする配列番号２８および配列番号２９の核酸分子を、本明細書にさらに開示する。
【0110】
核酸は、全細胞中、細胞溶解物中に存在してもよく、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態の核酸であってもよい。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当技術分野で周知の他のもの（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８８）を含む標準的な技法によって、他の細胞構成成分または他の夾雑物、例えば他の細胞核酸またはタンパク質から精製された場合、「単離される」または「実質的に純粋にされる」である。本開示の核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。一実施形態では、核酸は、ファージディスプレイベクターなどのベクター中、または組換えプラスミドベクター中に存在し得る。
【0111】
本開示の核酸は、標準的な分子生物学技法を使用して得ることができる。例えば、ＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られると、これらのＤＮＡ断片は、標準的な組換えＤＮＡ技法によってさらに操作されて、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片（例えば、表２に定義されるＶＬおよびＶＨ）は、別のＤＮＡ分子、または抗体の定常領域もしくはフレキシブルリンカーなどの別のタンパク質をコードする断片に作動可能に連結される。「作動可能に連結される」という用語は、この文脈において使用される場合、例えば、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように、またはタンパク質が所望のプロモーターの制御下で発現されるように、２つのＤＮＡ断片が機能的様式で連結されることを意味することが意図される。
【0112】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換され得る。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤの定常領域であり得る。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１アイソタイプ、例えばヒトＩｇＧ１アイソタイプの中から選択される。他の実施形態では、重鎖定常領域は、ＩｇＧ４アイソタイプ、例えばヒトＩｇＧ４アイソタイプの中から選択される。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結され得る。
【0113】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換され得る。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野で公知であり（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得る。
【0114】
ｓｃＦｖ遺伝子を作出するために、ＶＨ－およびＶＬ－をコードするＤＮＡ断片は、フレキシブルリンカーをコードする、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）３をコードする別の断片に作動可能に連結されて、ＶＨおよびＶＬ配列が、ＶＬおよびＶＨ領域がフレキシブルリンカーによって連結された連続した一本鎖タンパク質として発現され得るようにする（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。
【0115】
本開示に従って使用するための組換え抗体を産生する方法
本開示の抗体は、例えば、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技法と遺伝子トランスフェクション方法との組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５）。
本開示の抗体は、例えば、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技法と遺伝子トランスフェクション方法との組合せを使用して、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて産生され得る（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５）。
【0116】
例えば、抗体またはその抗体断片を発現させるために、部分的または全長の軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学または生化学の技法（例えば、ＤＮＡ化学合成、ＰＣＲ増幅または目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用するｃＤＮＡクローニング）によって得ることができ、ＤＮＡを、遺伝子が転写および翻訳制御配列に作動可能に連結されるように、発現ベクターに挿入することができる。この文脈において、「作動可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味することが意図される。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選定される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入され得るか、またはより典型的には、両方の遺伝子は同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または制限部位が存在しない場合は平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。本明細書に記載の抗体の軽鎖および重鎖可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント（１つまたは複数）に作動可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常および軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクターに該軽鎖および重鎖可変領域を挿入することによって、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作出するために使用され得る。追加的または代替的に、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードし得る。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングされ得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【0117】
抗体鎖遺伝子に加えて、本明細書に開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御するプロモーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌの刊行物（Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０）に記載されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選定、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得ることが当業者には理解されよう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、およびポリオーマ由来のプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメントが含まれる。代替的に、ユビキチンプロモーターまたはＰ－グロビンプロモーターなどの非ウイルス調節配列を使用してもよい。なおさらに、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型のＳＶ４０初期プロモーターおよび長い末端反復からの配列を含む、ＳＲａプロモーター系などの異なる供給源からの配列で構成される調節エレメント（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．，１９８８）。
【0118】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択可能マーカー遺伝子などの追加の配列を有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、すべてＡｘｅｌらによる米国特許第４，３９９，２１６号明細書、同第４，６３４，６６５号明細書および同第５，１７９，０１７号明細書を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞での使用のため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）が含まれる。
【0119】
軽鎖および重鎖の発現のために、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は、標準的な技法によって宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、原核生物または真核生物の宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入に一般的に使用される多種多様な技法、例えばエレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。本開示の抗体を、原核生物または真核生物の宿主細胞のいずれかにおいて発現させることが理論的に可能である。真核細胞、例えば哺乳動物の宿主細胞、酵母または糸状真菌における抗体の発現は、そのような真核細胞、特に哺乳動物細胞が、適切に折り畳まれて免疫学的に活性な抗体を集合させ分泌する可能性について、原核細胞よりも高いためと考えられている。
【0120】
１つの具体的な実施形態では、本開示によるクローニングまたは発現ベクターは、適したプロモーター配列に作動可能に連結されたｍＡｂ１またはｍＡｂ３のいずれか１つの重鎖および軽鎖のコード配列のうちの１つを含む。
【0121】
本開示の組換え抗体を発現するための哺乳動物の宿主細胞には、ＤＨＦＲ選択可能マーカー（Ｋａｕｆｍａｎ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，１９８２に記載されているように）と共に使用されるｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，１９８０に記載）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、ＣＨＯＫ１ ｄｈｆｒ＋細胞株、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞およびＳＰ２細胞、例えばＧＳ Ｘｃｅｅｄ（商標）遺伝子発現系（Ｌｏｎｚａ）と一緒のＧＳ ＣＨＯ細胞株が含まれる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物の宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、および場合により、宿主細胞が増殖される培養培地への抗体の分泌に十分な期間にわたって宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、例えば、標準的なタンパク質精製方法を使用して、該抗体の分泌後の培養培地から回収および精製することができる（Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，２００７）。
【0122】
１つの具体的な実施形態では、本開示の宿主細胞は、適したプロモーター配列に作動可能に連結された、ｍＡｂ１またはｍＡｂ３またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片の発現にそれぞれ適したコード配列を有する発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞である。
【0123】
例えば、本開示は、ｍＡｂ３のＶＨおよびＶＬをそれぞれコードする配列番号２８および２９の核酸を少なくとも含む宿主細胞に関する。
【0124】
次いで、後者の宿主細胞は、それぞれｍＡｂ１、またはｍＡｂ３、またはｍＡｂ１０３．２のＦａｂ断片からなる群から選択される本開示の抗体の発現および産生のための適した条件下でさらに培養されてもよい。
【0125】
代替的に、無細胞発現系を、ｍＡｂ３またはｍＡｂ１のいずれかの産生のために使用することができる。典型的には、タンパク質または抗体の無細胞発現の方法は既に記載されている（Ｓｔｅｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【0126】
医薬組成物
別の態様では、本開示は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体、特に、ｍＡｂ２０．１、配列番号５～１０のｍＡｂ２０．１の６つのＣＤＲを有するＢＴＮ３Ａ活性化抗体、配列番号１のＶＨおよび配列番号２のＶＬを有するＢＴＮ３Ａ活性化抗体、ｍＡｂ２０．１のヒト化形態であるＢＴＮ３Ａ活性化抗体、ならびに配列番号２３の重鎖および配列番号２４の軽鎖を有するｍＡｂ３、ならびにそれらの抗原結合部分からなる群から選択されるＢＴＮ３Ａ活性化抗体を含む、以下に開示されているような感染性障害の治療で使用するための組成物、例えば医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容される担体と一緒に製剤化された、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体、特に、ｍＡｂ２０．１、配列番号５～１０のｍＡｂ２０．１の６つのＣＤＲを有するＢＴＮ３Ａ活性化抗体、配列番号１のＶＨおよび配列番号２のＶＬを有するＢＴＮ３Ａ活性化抗体、ｍＡｂ２０．１のヒト化形態であるＢＴＮ３Ａ活性化抗体、ならびに配列番号２３の重鎖および配列番号２４の軽鎖を有するｍＡｂ３、ならびにそれらの抗原結合部分からなる群から選択されるＢＴＮ３Ａ活性化抗体を含む、以下に開示されているような感染性障害の治療で使用するための組成物、例えば医薬組成物を提供する。
【0127】
そのような組成物は、上記のように、１つまたは組合せの（例えば、２つ以上の異なる）ＢＴＮ３Ａ活性化抗体を含み得る。
【0128】
本明細書に開示の医薬組成物はまた、追加の活性な治療剤を含み得る。例えば、医薬組成物は、本開示の抗ＢＴＮ３Ａ抗体、例えば、ｍＡｂ２０．１、配列番号５～１０のｍＡｂ２０．１の６つのＣＤＲを有するＢＴＮ３Ａ活性化抗体、配列番号１のＶＨおよび配列番号２のＶＬを有するＢＴＮ３Ａ活性化抗体、ｍＡｂ２０．１のヒト化形態であるＢＴＮ３Ａ活性化抗体、ならびに配列番号２３の重鎖および配列番号２４の軽鎖を有するｍＡｂ３、またはそれらの抗原結合部分からなる群から選択される１つの抗体を、少なくとも１つの抗ウイルス剤、抗炎症剤または抗菌剤と組み合わせて含み得る。使用することができるそのような他の活性な治療剤の例は、本開示の抗体の使用に関する節において以下でより詳細に記載されている。
【0129】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、生理学的に適合性のあるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与（例えば、注射または注入によって）に適しているべきである。一実施形態では、担体は、皮下経路または静脈内経路に適しているべきである。投与経路に応じて、活性化合物、すなわちＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、化合物を不活性化し得る酸の作用および他の自然条件から化合物を保護するための材料でコーティングされてもよい。
【0130】
滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、薬学的に許容される担体の一例である。他の適した担体は当業者に周知である。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｎａｒｏ，１９９５）製剤は、１種または複数の賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、バイアル表面でのタンパク質損失を防ぐためのアルブミンなどをさらに含み得る。
【0131】
医薬組成物の形態、投与経路、投与量およびレジメンは、治療される状態、病気の重症度、患者の年齢、体重、および性別などに必然的に依存する。
【0132】
本開示による使用のための医薬組成物は、局所、経口、非経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または眼内投与などのために製剤化され得る。
【0133】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤に対して薬学的に許容されるビヒクルを含む。医薬組成物は、特に等張性の滅菌生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウムなど、またはそれらの塩の混合物）、または場合に応じて、滅菌水もしくは生理食塩水を添加すると注射可能な溶液の構成を可能にする乾燥組成物、特にフリーズドライ組成物であり得る。
【0134】
投与に使用される用量は、様々なパラメータの関数として、特に使用される投与様式、関連する病態、または代替的に所望の治療期間の関数として適合され得る。
【0135】
医薬組成物を調製するために、有効量のＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散され得る。
【0136】
注射使用に適した医薬形態には、滅菌水溶液または分散液；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末または凍結乾燥物が含まれる。すべての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。医薬組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。
【0137】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中ならびに油中で調製され得る。貯蔵および使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含む。
【0138】
本開示に従って使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、中性または塩形態で組成物に製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を用いて形成される）が含まれ、無機酸、例えば塩酸もしくはリン酸、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などを用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩はまた、無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄、および有機塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどから誘導することもできる。
【0139】
微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によってもたらされ得る。
【0140】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒に取り込み、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および上に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分＋任意の追加の所望の成分の粉末を、その前もって滅菌濾過された溶液から得る真空乾燥およびフリーズドライ技法である。
【0141】
直接注射のための、より多くのまたは高濃度の溶液の調製物も企図され、溶媒としてのＤＭＳＯの使用は、極めて迅速な浸透をもたらし、高濃度の活性薬剤を小さな腫瘍領域に送達させることが想定される。
【0142】
製剤の場合、溶液は、投与製剤と適合する様式で、治療上有効な量で投与される。製剤は、様々な剤形、例えば上記の注射用溶液の種類で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどが用いられてもよい。
【0143】
水溶液での非経口投与の場合、例えば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝されるべきであり、液体希釈剤は、まず十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に特に適している。これに関連して、用いることができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、１回の投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され、１０００ｍｌの皮下注入液に添加されるか、または提案された注入部位で注射され得る（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐａｇｅｓ １０３５－１０３８ ａｎｄ １５７０－１５８０を参照されたい）。治療される対象の状態に応じて、投与量のいくらかの変動が必然的に生じるであろう。投与の責任者が、いずれにしても、個々の対象に対する適切な用量を決定する。
【0144】
本開示に従って使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、約０．００１～１グラム／投与、または約１～４００ミリグラム／投与、または約１～２００ミリグラム／投与を含むように治療用混合物内に製剤化され得る。複数回投与することもできる。
【0145】
抗体の注入または皮下注射のための溶液に適した製剤は当技術分野で記載されており、例えばＣｕｉら（Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｉｎｄ Ｐｈａｒｍ ２０１７，４３（４）：５１９－５３０を参照されたい）に概説されている。
【0146】
本開示に従って使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体、それらの医薬組成物およびそれらを調製する方法の好ましい実施形態
＃１．配列番号１の可変重鎖ポリペプチドＶＨおよび配列番号２の可変軽鎖ポリペプチドＶＬを含む単離されたＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
＃１．配列番号１の可変重鎖ポリペプチドＶＨおよび配列番号２の可変軽鎖ポリペプチドＶＬを含む単離されたＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0147】
＃２．配列番号５～１０の６つのＣＤＲ、および配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する可変重鎖ポリペプチドＶＨ、および配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する可変軽鎖ポリペプチドＶＬを含む単離されたＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0148】
＃３．場合により、ヒトＩｇＧ１定常領域は、変異または化学的に改変され、前記変異体または化学的に改変されたＩｇＧ１定常領域が、野生型ヒトＩｇＧ１アイソタイプの定常領域を有する対応する抗体と比較した場合に、Ｆｃγ受容体への結合を有しないかまたは減少した結合を付与するように、変異されるかまたは化学的に改変されているヒトＩｇＧ１定常領域を含む、＃１または＃２に記載の単離されたＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
＃４．前記抗体が、以下の特性のうちの１つまたは複数を呈する、＃１～＃３のいずれかに記載の単離されたＢＴＮ３Ａ活性化抗体：
（ｉ）抗体が、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する；
（ｉｉ）抗体が、例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合する；
（ｉｉｉ）抗体が、例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化をインビトロで誘導する。
＃４．前記抗体が、以下の特性のうちの１つまたは複数を呈する、＃１～＃３のいずれかに記載の単離されたＢＴＮ３Ａ活性化抗体：
（ｉ）抗体が、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤ、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤ、または５ｎＭ以下のＫＤでヒトＢＴＮ３Ａ１に結合する；
（ｉｉ）抗体が、例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合する；
（ｉｉｉ）抗体が、例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化をインビトロで誘導する。
【0149】
＃５．配列番号２３の重鎖ポリペプチドおよび配列番号２４の軽鎖ポリペプチドを含む、＃１～＃４のいずれかに記載の単離されたＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0150】
＃６．例えば、配列番号２８および配列番号２９のヌクレオチド配列を含む、＃１～＃５のいずれかに記載のＢＴＮ３Ａ活性化抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸。
【0151】
＃７．宿主細胞における＃１に記載のＢＴＮ３Ａ活性化抗体の組換え産生のための発現ベクターであって、前記ＢＴＮ３Ａ活性化抗体をコードする少なくとも１つの核酸を含む、発現ベクター。
【0152】
＃８．請求項７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【0153】
＃９．＃１～＃５のいずれか１つに定義される抗ＢＴＮ３Ａ抗体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体のうちの１つまたは複数と組み合わせて含み、場合により他の活性成分、例えばＩＬ－２もしくはＩＬ－１５などのサイトカイン、または該サイトカインの機能的誘導体およびペグ化バージョンを含む医薬組成物。
【0154】
＃１０．凍結乾燥製剤、事前充填されたシリンジ中の溶液またはバイアル中の溶液である、請求項＃９に記載の医薬組成物。
【0155】
＃１１．治療薬としての使用のための、＃１～＃５のいずれか１つに記載の単離されたＢＴＮ３Ａ活性化抗体、または請求項＃９もしくは＃１０に記載の医薬組成物。
【0156】
＃１２．＃１～＃５のいずれか１つに記載のＢＴＮ３Ａ抗体の産生のための方法であって、（ｉ）宿主細胞による前記抗体の発現のために＃８に記載の宿主細胞を培養するステップ、場合により（ｉｉ）前記抗体を精製するステップ；および（ｉｉｉ）前記抗体を回収するステップを含む、方法。
【0157】
感染性障害の治療におけるＢＴＮ３Ａ活性化抗体の使用
本発明者らは、以下の能力を有する、ｍＡｂ２０．１などのＢＴＮ３Ａ活性化抗体を見出した：
（ｉ）Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の存在下で単球のＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ細菌量の減少をインビトロで増強する、
（ｉｉ）典型的には４時間の共培養後、感染した単球の共培養物を用いてインビトロで測定した場合に、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害活性を増加させる、および／または
本発明者らは、以下の能力を有する、ｍＡｂ２０．１などのＢＴＮ３Ａ活性化抗体を見出した：
（ｉ）Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の存在下で単球のＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ細菌量の減少をインビトロで増強する、
（ｉｉ）典型的には４時間の共培養後、感染した単球の共培養物を用いてインビトロで測定した場合に、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害活性を増加させる、および／または
【0158】
本発明者らはまた、例えば、感染した細胞とＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞との共培養物においてインビトロで測定した場合に、ｍＡｂ２０．１などのＢＴＮ３Ａ活性化抗体が、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２複製の阻害を増強する能力を有することを見出した。
【0159】
したがって、本開示は、感染性障害、より具体的にはウイルス性または細菌性感染性障害から選択される感染性障害の治療で使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体、特に上記のような特定のＢＴＮ３Ａ活性化抗体に関する。
【0160】
本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、（１）疾患を阻害すること、例えば、疾患、状態または障害の病態または症候を経験または示している個体における疾患、状態または障害を阻害すること（すなわち、病状および／または症候のさらなる進展を阻止すること）；ならびに（２）疾患を緩和すること、例えば、疾患、状態または障害の病態または症候を経験または示している個体における疾患、状態または障害を緩和すること（すなわち、病態および／または症候を逆転させること）、例えば、疾患の重症度を低下させること、または疾患の１つもしくは複数の症候を軽減または低減することのうちの１つまたは複数を指す。特に、感染性障害の治療に関して、「治療」という用語は、感染因子による感染の予防、感染因子の複製の阻害、感染に関連する１つもしくは複数の症候の重症度の低下、または感染因子の根絶を指し得る。
【0161】
好ましい実施形態では、対象はヒト対象である。
【0162】
上記で開示されるような使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、唯一の活性成分として、または例えばアジュバントとして併せて、または上記の疾患の治療もしくは予防のための他の薬物、例えばサイトカイン、抗ウイルス剤、抗炎症剤と組み合わせて投与され得る。
【0163】
例えば、上記で開示されるような使用のための抗体は、サイトカイン、抗ウイルス剤、抗菌剤、または抗炎症剤と組み合わせて使用され得る。
【0164】
サイトカインの例としては、限定されないが、インターロイキン２（ＩＬ－２）（Ｃｈｏｕｄｈｒｙ Ｈ ｅｔ ａｌ，２０１８，Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ．２０１８ Ｍａｙ ６）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）（Ｐａｔｉｄａｒ Ｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｖ．２０１６ Ｏｃｔ；３１：４９－５９）、またはそれらの誘導体を含む、インビボでＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を増殖および／または活性化するためのサイトカインが挙げられる。誘導体という用語は、ペグ化（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖へのコンジュゲーション）、アミノ酸の欠失、置換もしくは挿入などの変異、または増強剤（例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃに融合したＩＬ１５／ＩＬ１５Ｒａ複合体、ここでは、ＩＬ－１５が追加で変異しており（ａｓｎ７２ａｓｐ）、生物学的活性をさらに増加させ、この複合体をＩＬ－２およびＩＬ－１５Ｒβγスーパーアゴニストにする（Ｒｈｏｄｅ ＰＲ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１６；４（１）：４９－６０））との会合に依り得る任意のサイトカイン改変に使用される（Ｂａｒｒｏｓｏ－Ｓｏｕｓａ Ｒ ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒ Ｏｎｃｏｌ Ｒｅｐ．２０１８ Ｎｏｖ １５；２１（１）：１）。
【0165】
「ＩＬ－２」という用語は、ＩＬ－２の一般的な意味を有し、ヒトインターロイキン－２を指す。ＩＬ－２は、身体の自然免疫応答の一部である。ＩＬ－２は、主に、ＩＬ－２受容体に結合することによってリンパ球活性を調節する。
【0166】
「ＩＬ－１５」という用語は、ＩＬ－１５の一般的な意味を有し、ヒトインターロイキン－１５を指す。ＩＬ－２と同様に、ＩＬ－１５は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２）および共通ガンマ鎖（ガンマ－Ｃ、ＣＤ１３２）から構成される複合体に結合し、それを介してシグナル伝達する。ＩＬ－１５は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化および増殖を調節する。
【0167】
したがって、本明細書で定義される使用方法は、治療有効量のＢＴＮ３Ａ活性化抗体と、少なくとも１つの第２の薬物物質との共投与、例えば同時または逐次投与を含み得、前記第２の薬物物質は、抗ウイルス性もしくは抗細菌性、抗炎症性もしくはサイトカイン、例えばＩＬ－２もしくはＩＬ－１５、または例えば上に示されるような細胞療法製品（γδ Ｔ細胞など）である。
【0168】
ＳＡＲＳ Ｃｏｖ２感染によって引き起こされる障害の治療におけるＢＴＮ３Ａ活性化抗体の使用
特定の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染によって引き起こされる障害の治療を必要とする対象、典型的にはＣｏｖｉｄ－１９において、その治療で使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体、特に上記のような特定のＢＴＮ３Ａ活性化抗体に関する。
特定の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染によって引き起こされる障害の治療を必要とする対象、典型的にはＣｏｖｉｄ－１９において、その治療で使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体、特に上記のような特定のＢＴＮ３Ａ活性化抗体に関する。
【0169】
特定の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染によって引き起こされる障害の治療を必要とする対象、典型的にはＣｏｖｉｄ－１９において、それを治療する方法に関し、前記方法は、前記対象に治療有効量の抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体を投与するステップを含む。
【0170】
特定の実施形態では、本開示は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染、典型的にはＣｏｖｉｄ－１９によって引き起こされる障害の治療を必要とする対象において、その障害を治療するための医薬の調製におけるＢＴＮ３Ａ活性化抗体の使用に関する。
【0171】
特定の実施形態では、そのような治療に適格な対象は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２に感染していると診断されている。
【0172】
特定の実施形態では、対象は、軽度または中程度のＣＯＶＩＤ－１９を有する対象の中から選択される。
【0173】
特定の実施形態では、対象は、重度のＣＯＶＩＤ－１９に進行する高いリスクがある対象の中から選択される。リスク因子には、限定されないが、リスク因子には、（アルファベット順に列挙）年齢（５０歳以降の各年代でのリスク増加）、がん、心血管疾患、慢性腎臓疾患、慢性肺疾患、糖尿病、免疫障害状態または免疫抑制薬の投与、肥満（ボディマス指数≧３０）、妊娠、および鎌状赤血球症が含まれる。
【0174】
特定の実施形態では、抗ウイルス薬または抗炎症薬は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２によって引き起こされる前記障害を治療するために、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体と組み合わせて使用され得る。ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２の治療に有用なそのような抗ウイルス薬または抗炎症薬の例としては、限定されないが、レムデシビル、バリシチニブ、バムラニビマブ、バムラニビマブ／エテセビマブ、カシリビマブ／イムデビマブ、デキサメタゾン、ブデソニドおよびトシリズマブが挙げられる。
【0175】
Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉによって引き起こされる障害の治療におけるＢＴＮ３Ａ活性化抗体の使用
特定の実施形態では、本開示は、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害の治療を必要とする対象、典型的にはＱ熱において、その治療で使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体、特に上記のような特定のＢＴＮ３Ａ活性化抗体に関する。
特定の実施形態では、本開示は、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害の治療を必要とする対象、典型的にはＱ熱において、その治療で使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体、特に上記のような特定のＢＴＮ３Ａ活性化抗体に関する。
【0176】
特定の実施形態では、本開示は、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害の治療を必要とする対象、典型的にはＱ熱において、それを治療する方法に関し、前記方法は、前記対象に治療有効量のＢＴＮ３Ａ活性化抗体を投与するステップを含む。
【0177】
特定の実施形態では、本開示は、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染、典型的にはＱ熱によって引き起こされる障害の治療を必要とする対象において、その障害を治療するための医薬の調製におけるＢＴＮ３Ａ活性化抗体の使用に関する。
【0178】
特定の実施形態では、そのような治療に適格な対象は、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染していると診断されている。
【0179】
特定の実施形態では、ドキシサイクリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、オフロキサシン、およびヒドロキシクロロキンを含むがこれらに限定されない抗菌薬（抗生物質など）または抗炎症薬は、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉによって引き起こされる前記障害を治療するために、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体と組み合わせて使用され得る。
【0180】
ＢＴＮ３Ａ活性化抗体の使用のための他の特定の実施形態は、限定されないが以下に開示されている。
【0181】
ＢＴＮ３Ａ活性化抗体の使用のための具体的な実施形態
＃１．感染性障害の治療を必要とするヒト対象における感染性障害の治療における使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
＃１．感染性障害の治療を必要とするヒト対象における感染性障害の治療における使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0182】
＃２．前記感染性障害が、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害、典型的にはＱ熱である、＃１に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0183】
＃３．前記感染性障害が、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２によって引き起こされる障害、典型的にはＣＯＶＩＤ－１９である、＃１に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0184】
＃４．例えば実施例に記載されているように、ＳＰＲによって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤで、好ましくは１ｎＭ以下のＫＤでＢＴＮ３Ａに結合する、＃１～＃３のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0185】
＃５．以下の特性のうちの１つまたは複数を有する、＃１～＃４のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体：
（ｉ）抗体が、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤで、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤで、または１ｎＭ以下のＫＤでＢＴＮ３Ａ１に結合する；
（ｉｉ）抗体が、例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合する；および、
（ｉｉｉ）抗体が、例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導する。
（ｉ）抗体が、例えば実施例に記載されているように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合に、１０ｎＭ以下のＫＤで、好ましくは５ｎＭ以下のＫＤで、または１ｎＭ以下のＫＤでＢＴＮ３Ａ１に結合する；
（ｉｉ）抗体が、例えば実施例に記載されているように、フローサイトメトリーアッセイで測定した場合に、５０μｇ／ｍｌ以下、好ましくは１０μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０でヒトＰＢＭＣに結合する；および、
（ｉｉｉ）抗体が、例えば実施例に記載されているように、脱顆粒アッセイで測定した場合に、ＢＴＮ３Ａを発現する細胞との共培養において、５μｇ／ｍｌ未満、好ましくは１μｇ／ｍｌ以下のＥＣ５０で、γδ Ｔ細胞、典型的にはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導する。
【0186】
＃６．以下の特性のうちの１つまたは複数を有する、＃１～＃５のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体：
（ｉ）抗体が、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の存在下で単球のＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ細菌量の減少をインビトロで増強する、
（ｉｉ）抗体が、典型的には４時間の共培養後、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害活性を増加させる。
（ｉ）抗体が、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の存在下で単球のＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ細菌量の減少をインビトロで増強する、
（ｉｉ）抗体が、典型的には４時間の共培養後、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害活性を増加させる。
【0187】
＃７．例えば、感染した細胞とＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞との共培養物においてインビトロで測定した場合に、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２に感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のインビトロ細胞傷害活性を増加させる、＃１～＃５のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0188】
＃８．配列番号５～７のＨＣＤＲ１～３および配列番号８～１０のＬＣＤＲ１～３を含む、＃１～＃７のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0189】
＃９．配列番号１１～１３のＨＣＤＲ１～３および配列番号１４～１６のＬＣＤＲ１～３を含む、＃１～＃７のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0190】
＃１０．配列番号１７～１９のＨＣＤＲ１～３および配列番号２０～２２のＬＣＤＲ１～３を含む、＃１～＃７のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0191】
＃１１．（ａ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および（ｂ）配列番号２と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含むか；
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および（ｂ）配列番号４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含むか；
（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および（ｂ）配列番号６４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含むか；
－寄託番号Ｉ－４４０１の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって産生されるｍＡｂ２０．１と、ＢＴＮ３Ａ１への結合について競合するか；または、
－寄託番号Ｉ－４４０２の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって産生されるｍＡｂ７．２と、ＢＴＮ３Ａ１への結合について競合する
のいずれかである、請求項＃１～＃１０のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および（ｂ）配列番号４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含むか；
（ａ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ポリペプチド、および（ｂ）配列番号６４と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ポリペプチドを含むか；
－寄託番号Ｉ－４４０１の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって産生されるｍＡｂ２０．１と、ＢＴＮ３Ａ１への結合について競合するか；または、
－寄託番号Ｉ－４４０２の下でＣＮＣＭに寄託されたハイブリドーマによって産生されるｍＡｂ７．２と、ＢＴＮ３Ａ１への結合について競合する
のいずれかである、請求項＃１～＃１０のいずれか一項に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0192】
＃１２．配列番号１の可変重鎖ＶＨおよび配列番号２の軽鎖ＶＬを含む、＃１～＃１１のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0193】
＃１３．前記ＢＴＮ３Ａ活性化抗体が、変異体または化学的に改変されたＩｇＧ１定常領域を含み、前記変異体または化学的に改変されたＩｇＧ１定常領域が、野生型ＩｇＧ１アイソタイプ定常領域を有する対応する抗体と比較した場合に、Ｆｃγ受容体への結合を有しないかまたは減少した結合を付与する、＃１～＃１２のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0194】
＃１４．前記変異ＩｇＧ１定常領域が、ＩｇＧ１三重変異Ｌ２４７Ｆ Ｌ２４８ＥおよびＰ３５０Ｓである、＃１３に記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0195】
＃１５．配列番号２３の重鎖および配列番号２４の軽鎖を含む、＃１～＃８および＃１１～＃１４のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0196】
＃１６．インビボでのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞増殖のためのサイトカイン、例えば、ＩＬ２もしくはＩＬ１５サイトカインまたはそれらのペグ化誘導体と組み合わせて、同時に、順次または別個に投与される、＃１～＃１５のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0197】
＃１７．前記抗ＢＴＮ３Ａ抗体が、好ましくはレムデシビル、バリシチニブ、バムラニビマブ、バムラニビマブ／エテセビマブ、カシリビマブ／イムデビマブ、デキサメタゾン、ブデソニドおよびトシリズマブからなる群から選択される抗ウイルスまたは抗炎症治療と組み合わせて、同時にまたは別個に投与される、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２のウイルス性感染性障害を治療するための＃１～＃１６のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0198】
＃１８．前記対象が、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２陽性であると診断されているヒト対象である、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２のウイルス性感染性障害を治療するための＃１～＃１７のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0199】
＃１９．前記対象が、軽度または中程度のＣＯＶＩＤ－１９を有するヒト対象である、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２のウイルス性感染性障害を治療するための＃１～＃１８のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0200】
＃２０．前記対象が、重度のＣＯＶＩＤ－１９に進行する高いリスクがある、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２のウイルス性感染性障害を治療するために使用するための＃１～＃１８のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0201】
＃２１．前記対象が、重度のＣＯＶＩＤ－１９を有する、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２のウイルス性感染性障害を治療するための＃１～＃１８のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0202】
＃２２．好ましくはドキシサイクリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、オフロキサシン、およびヒドロキシクロロキンから選択される抗生物質から選択される抗菌治療と組み合わせて、同時にまたは別個に投与される、Ｃｏｘｉｅｌｌａ Ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害を治療するための＃１～＃１５のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0203】
＃２３．前記対象がＣｏｘｉｅｌｌａ Ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染に陽性であると診断されている、Ｃｏｘｉｅｌｌａ Ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害を治療するための＃１～＃１５および＃２２のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0204】
＃２４．前記対象がＱ熱を有する、Ｃｏｘｉｅｌｌａ Ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染によって引き起こされる障害を治療するための＃１～＃１５および＃２２～＃２３のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【0205】
＃２５．静脈内注入によって、例えば１ｍｇ～１ｇ、例えば１ｍｇ～２００ｍｇ含まれる用量で、それを必要とする対象に投与される、＃１～２４のいずれか１つに記載の使用のためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体。
【実施例】
【0206】
抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体の機能的特性を試験するためのアッセイ
１．ＢＴＮ３Ａ活性化抗体のＳＰＲによる結合親和性を求めるためのアッセイ
マルチサイクルキネティクス解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアＶ２．０．１（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実行するＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（シリアル番号１９０９９１３）機器を使用して、任意のＢＴＮ３Ａ抗体候補を行い得る。
１．ＢＴＮ３Ａ活性化抗体のＳＰＲによる結合親和性を求めるためのアッセイ
マルチサイクルキネティクス解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェアＶ２．０．１（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を実行するＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（シリアル番号１９０９９１３）機器を使用して、任意のＢＴＮ３Ａ抗体候補を行い得る。
【0207】
精製した抗体を、２％ＢＳＡ／ＰＢＳで２μｇ／ｍｌの濃度に希釈する。各サイクルの開始時に、各抗体を約１４６．５ＲＵ（約５０ＲＵのＲＭａｘを得るための理論値）の密度（ＲＬ）でプロテインＡ上に捕捉する。捕捉後、ＢＴＮ３Ａ１抗原（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌカタログ番号１５９７３－Ｈ０８Ｈ）の注射前に表面を安定化させる。ＢＴＮ３Ａ１を、２５～０．７８ｎＭの二倍希釈範囲で０．１％ＢＳＡ／ＨＢＳ－Ｐ＋（ランニング緩衝液）中で滴定する。会合段階を４００秒間、解離段階を３５分間（２１００秒間）モニタリングする。潜在的な物質移動効果を最小限に抑えるために、キネティクスデータは、流速５０μｌ／分を使用して得る。プロテインＡ表面の再生は、各サイクルの終了時に１０ｍＭグリシン－ＨＣＬ ｐＨ１．５の２回の注入を用いて実施する。２つのブランク（ＢＴＮ３Ａ１なし）および単一濃度の分析物の反復を各試験抗体について行い、キネティクスサイクルにわたって表面および分析物の安定性を確認した。参照チャネルＦｃ１からのシグナルをＦｃ２、Ｆｃ３およびＦｃ４のシグナルから差し引いて、参照表面に対する非特異的結合の差を補正する。加えて、ドリフトなどのあらゆる抗原非依存性シグナル変動を補正するために、各Ｆｃに対してブランクランが差し引かれる。センサーグラムを、グローバルＲＭａｘパラメータおよびバルクシグナルなし（定数ＲＩ＝０ＲＵ）の１対１結合数学モデルを使用してフィッティングした。
【0208】
２．ＢＴＮ３Ａ活性化抗体のヒトＰＢＭＣについて、フローサイトメトリーによって結合を求めるためのアッセイ
本開示に従って使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、健康なドナーの血液から単離されたヒトＰＢＭＣで発現されるＢＴＮ３Ａへのそれらの結合について特徴付けられ得る。ＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ－ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、ＵＫ）密度遠心分離を使用して、バフィーコートから単離する。次いで、ＰＢＭＣを凍結し、必要になるまで－８０℃または液体窒素中で貯蔵する。
本開示に従って使用するためのＢＴＮ３Ａ活性化抗体は、健康なドナーの血液から単離されたヒトＰＢＭＣで発現されるＢＴＮ３Ａへのそれらの結合について特徴付けられ得る。ＰＢＭＣを、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ－ｓｈｉｅｌｄ、Ｄｕｎｄｅｅ、ＵＫ）密度遠心分離を使用して、バフィーコートから単離する。次いで、ＰＢＭＣを凍結し、必要になるまで－８０℃または液体窒素中で貯蔵する。
【0209】
１×１０６細胞／ｍｌの１００μｌ細胞を、新鮮なＵ字形底部９６ウェルプレートの各ウェルに移し、次いで、プレートを遠心分離し、上清を廃棄する。
【0210】
０．００１μｇ／ｍｌ～１５０μｇ／ｍｌの抗体の段階希釈液を、ＰＢＳ ２ｍＭ ＥＤＴＡで調製する。ヒトＰＢＭＣを、調製した５０μｌの希釈試験抗体滴定シリーズに再懸濁する。
【0211】
４℃、暗所で３０分間のインキュベーション後、プレートを遠心分離し、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ ２ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗浄し、その後、ウェルを、５０μｌのＰＢＳ ２ｍＭ ＥＤＴＡで１／１００希釈したヤギ抗ヒト抗体（ＰＥ標識）および１／５００希釈したライブ／デッドニートＩＲで構成される混合物に再懸濁する。
【0212】
４℃、暗所で１５分間のインキュベーション後、プレートを遠心分離し、１５０μｌ／ウェルのＰＢＳ ２ｍＭ ＥＤＴＡで１回洗浄し、その後、ウェルを、２００μｌのＰＢＳ ２ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁する。細胞を、ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒで分析する。データを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０、ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＵＳＡ）を使用して分析する（データは示さず）。
【0213】
カニクイザルＰＢＭＣおよびＤａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞株から発現したカニクイザルＢＴＮ３Ａに対する結合を試験するために、同じプロトコルを実施することができる。
【0214】
３．インビトロでの機能的有効性：γδ－Ｔ細胞の脱顆粒アッセイ
アッセイは、Ｄａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞株（Ｈａｒｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２）に対するγδ－Ｔ細胞の脱顆粒に関するＢＴＮ３Ａ抗体の活性化効果を測定することからなる。健康なドナーのＰＢＭＣ由来のγδ－Ｔ細胞を、ゾレドロン酸（１μＭ）およびＩＬ２（２００Ｕｉ／ｍｌ）を用いて１１～１３日間培養することによって増殖させる。ＩＬ２を、５日目、８日目およびその後２日ごとに添加する。γδ－Ｔ細胞のパーセンテージを培養の開始時に求め、少なくとも８０％に達するまでフローサイトメトリーによって培養時間に関して評価する。次いで、凍結または新鮮なγδ－Ｔ細胞をＤａｕｄｉ細胞株（Ｅ：Ｔ比１：１）に対する脱顆粒アッセイで使用し、それにより細胞を１０μｇ／ｍｌの７．２および２０．１のヒト化バリアント、ならびに７．２および２０．１のキメラバージョンの存在下、３７℃で４時間共培養する。ＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）＋イオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）による活性化が、γδ－Ｔ細胞の脱顆粒の陽性対照として機能し、培地単独が陰性対照として機能した。４時間の共インキュベーションの終了時に、細胞をフローサイトメトリーによって分析して、ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ－１、リソソーム関連膜タンパク質－１）＋ＣＤ１０７ｂ（ＬＡＭＰ－２）について陽性のγδ－Ｔ細胞のパーセンテージを評価する。ＣＤ１０７は、活性化誘導の顆粒エキソサイトーシスに続いて細胞表面に動員されるので、表面ＣＤ１０７の測定は、脱顆粒したばかりの細胞溶解性Ｔ細胞を同定するための感受性マーカーである。
アッセイは、Ｄａｕｄｉバーキットリンパ腫細胞株（Ｈａｒｌｙ ｅｔ ａｌ．，２０１２）に対するγδ－Ｔ細胞の脱顆粒に関するＢＴＮ３Ａ抗体の活性化効果を測定することからなる。健康なドナーのＰＢＭＣ由来のγδ－Ｔ細胞を、ゾレドロン酸（１μＭ）およびＩＬ２（２００Ｕｉ／ｍｌ）を用いて１１～１３日間培養することによって増殖させる。ＩＬ２を、５日目、８日目およびその後２日ごとに添加する。γδ－Ｔ細胞のパーセンテージを培養の開始時に求め、少なくとも８０％に達するまでフローサイトメトリーによって培養時間に関して評価する。次いで、凍結または新鮮なγδ－Ｔ細胞をＤａｕｄｉ細胞株（Ｅ：Ｔ比１：１）に対する脱顆粒アッセイで使用し、それにより細胞を１０μｇ／ｍｌの７．２および２０．１のヒト化バリアント、ならびに７．２および２０．１のキメラバージョンの存在下、３７℃で４時間共培養する。ＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）＋イオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）による活性化が、γδ－Ｔ細胞の脱顆粒の陽性対照として機能し、培地単独が陰性対照として機能した。４時間の共インキュベーションの終了時に、細胞をフローサイトメトリーによって分析して、ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ－１、リソソーム関連膜タンパク質－１）＋ＣＤ１０７ｂ（ＬＡＭＰ－２）について陽性のγδ－Ｔ細胞のパーセンテージを評価する。ＣＤ１０７は、活性化誘導の顆粒エキソサイトーシスに続いて細胞表面に動員されるので、表面ＣＤ１０７の測定は、脱顆粒したばかりの細胞溶解性Ｔ細胞を同定するための感受性マーカーである。
【0215】
４．ＢＴＮ３Ａ活性化抗体の存在下、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２に感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞傷害活性を求めるためのアッセイ
単球、ＭＤＭ、ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５を、１０μＭの細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、次いでウイルスで刺激する。標的細胞を、候補抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体または対照ｍＡｂ２０．１（０、０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（エフェクター）と共培養する。２４時間後、細胞を、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔカスパーゼ－３／７グリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して、死細胞を同定する。細胞傷害性を、標的細胞集団におけるカスパーゼ３／７＋細胞のパーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価する。データをＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析する。
単球、ＭＤＭ、ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５を、１０μＭの細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、次いでウイルスで刺激する。標的細胞を、候補抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体または対照ｍＡｂ２０．１（０、０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（エフェクター）と共培養する。２４時間後、細胞を、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔカスパーゼ－３／７グリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して、死細胞を同定する。細胞傷害性を、標的細胞集団におけるカスパーゼ３／７＋細胞のパーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価する。データをＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析する。
【0216】
５．ＢＴＮ３Ａ活性化抗体の存在下、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２に感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のＩＦＮ－γ分泌を求めるためのアッセイ
単球、ＭＤＭ、ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５をウイルスで刺激し、候補抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体または対照ｍＡｂ２０．１（０、０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（エフェクター）と共培養する。２４時間後、共培養物から培養上清を回収し、ＩＦＮ－γの分泌を、製造業者の説明書に従って、ヒトＩＦＮ－γイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出する。
単球、ＭＤＭ、ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５をウイルスで刺激し、候補抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体または対照ｍＡｂ２０．１（０、０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（エフェクター）と共培養する。２４時間後、共培養物から培養上清を回収し、ＩＦＮ－γの分泌を、製造業者の説明書に従って、ヒトＩＦＮ－γイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出する。
【0217】
６．ＢＴＮ３Ａ活性化抗体の存在下、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒を求めるためのアッセイ
Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球を、候補抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体または対照ｍＡｂ２０．１ならびに蛍光色素標識したＣＤ１０７ａおよびＣＤ１０７ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と共培養する。４時間後、細胞を回収し、蛍光色素標識したＴＣＲ特異的ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）および生存マーカー（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色する。脱顆粒を、γδ Ｔ細胞集団におけるＣＤ１０７ａ／ｂ＋細胞パーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価する。データをＮａｖｉｏｓ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析する。
Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球を、候補抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体または対照ｍＡｂ２０．１ならびに蛍光色素標識したＣＤ１０７ａおよびＣＤ１０７ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と共培養する。４時間後、細胞を回収し、蛍光色素標識したＴＣＲ特異的ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）および生存マーカー（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色する。脱顆粒を、γδ Ｔ細胞集団におけるＣＤ１０７ａ／ｂ＋細胞パーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価する。データをＮａｖｉｏｓ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析する。
【0218】
７．ＢＴＮ３Ａ活性化抗体の存在下、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞傷害活性を求めるためのアッセイ
Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球を１０μＭの細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、次いで、候補抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体または対照ｍＡｂ２０．１の存在下で、Ｅ：Ｔ比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と共培養する。４時間後、細胞を、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔカスパーゼ－３／７グリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して、死細胞を同定する。細胞傷害性を、標的細胞集団におけるカスパーゼ３／７＋細胞のパーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価した。データをＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析した。
Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球を１０μＭの細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、次いで、候補抗ＢＴＮ３Ａ活性化抗体または対照ｍＡｂ２０．１の存在下で、Ｅ：Ｔ比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と共培養する。４時間後、細胞を、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔカスパーゼ－３／７グリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して、死細胞を同定する。細胞傷害性を、標的細胞集団におけるカスパーゼ３／７＋細胞のパーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価した。データをＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析した。
【0219】
実施例１：ｍＡｂ２０．１のヒト化および特徴付け
１．ヒト化戦略の説明
ａ．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）可変領域配列の設計
マウス７．２および２０．１抗体のＶ領域の構造モデルを、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢを使用して作製し、抗体の結合特性に必須である可能性が高いＶ領域の重要な「拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｉｎｇ）」アミノ酸を同定するために分析した。ＣＤＲ内に含まれる大部分の残基（ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の定義を使用）は、いくつかのフレームワーク残基と共に重要であると考えられた。上記の分析から、７．２および２０．１抗体のＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ配列を作製した。
１．ヒト化戦略の説明
ａ．Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）可変領域配列の設計
マウス７．２および２０．１抗体のＶ領域の構造モデルを、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢを使用して作製し、抗体の結合特性に必須である可能性が高いＶ領域の重要な「拘束（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｉｎｇ）」アミノ酸を同定するために分析した。ＣＤＲ内に含まれる大部分の残基（ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方の定義を使用）は、いくつかのフレームワーク残基と共に重要であると考えられた。上記の分析から、７．２および２０．１抗体のＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ配列を作製した。
【0220】
ｂ．ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープの回避
構造解析に基づいて、７．２および２０．１のヒト化バリアントを作出するために使用することができる配列セグメントの大きな予備的セットを、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子へのペプチド結合のインシリコ分析のためのｉＴｏｐｅ（商標）技術を使用して（Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００８）、および既知の抗体配列関連Ｔ細胞エピトープのＴＣＥＤ（商標）を使用して（Ｂｒｙｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、選択し、分析した。ヒトＭＨＣクラスＩＩに対する有意な非ヒト生殖細胞系バインダーとして同定された、またはＴＣＥＤ（商標）に対する有意なヒットを記録した配列セグメントを破棄した。これにより、セグメントのセットが減少し、これらの組合せを上記のように再び分析して、セグメント間の接合部が潜在的なＴ細胞エピトープを含まないことを確実にした。選択された配列セグメントを、有意なＴ細胞エピトープを欠くと予測される完全なＶ領域配列にアセンブルした。次いで、いくつかの重鎖および軽鎖配列を、ｍＡｂ７．２および２０．１について哺乳動物細胞における遺伝子合成および発現のために選定した。
構造解析に基づいて、７．２および２０．１のヒト化バリアントを作出するために使用することができる配列セグメントの大きな予備的セットを、ヒトＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子へのペプチド結合のインシリコ分析のためのｉＴｏｐｅ（商標）技術を使用して（Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，２００８）、および既知の抗体配列関連Ｔ細胞エピトープのＴＣＥＤ（商標）を使用して（Ｂｒｙｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０）、選択し、分析した。ヒトＭＨＣクラスＩＩに対する有意な非ヒト生殖細胞系バインダーとして同定された、またはＴＣＥＤ（商標）に対する有意なヒットを記録した配列セグメントを破棄した。これにより、セグメントのセットが減少し、これらの組合せを上記のように再び分析して、セグメント間の接合部が潜在的なＴ細胞エピトープを含まないことを確実にした。選択された配列セグメントを、有意なＴ細胞エピトープを欠くと予測される完全なＶ領域配列にアセンブルした。次いで、いくつかの重鎖および軽鎖配列を、ｍＡｂ７．２および２０．１について哺乳動物細胞における遺伝子合成および発現のために選定した。
【0221】
２．ヒト化バリアントの作製および予備的特徴付け
ａ．ヒト化バリアントプラスミドの構築
７．２および２０．１のヒト化バリアントを、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ、Ｌ２４８Ｅ）重鎖およびカッパ軽鎖について、発現ベクター系にクローニングするために、フランキング制限酵素部位を用いて合成した。すべての構築物を配列決定によって確認した。
ａ．ヒト化バリアントプラスミドの構築
７．２および２０．１のヒト化バリアントを、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ、Ｌ２４８Ｅ）重鎖およびカッパ軽鎖について、発現ベクター系にクローニングするために、フランキング制限酵素部位を用いて合成した。すべての構築物を配列決定によって確認した。
【0222】
ｂ．抗体の発現
キメラ７．２および２０．１（ＶＨ０／Ｖκ０）、２つの対照の組合せ（ＶＨ０／Ｖκ１、ＶＨ１／Ｖκ０）ならびにヒト化重鎖および軽鎖の組合せを、対応するエンドトキシン不含ＤＮＡからのＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ（登録商標）エレクトロポレーションシステム（ＭａｘＣｙｔｅ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＵＳＡ）を使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）に一過性にトランスフェクトした。ＯＣ－４００プロセシングアセンブリを使用して、各抗体についてトランスフェクションを行った。細胞回収後、細胞を、８ｍＭのＬ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）および１ｘのヒポキサンチン－チミジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）を含有するＣＤ Ｏｐｔｉ－ＣＨＯ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）に３ｘ１０６細胞／ｍＬまで希釈した。トランスフェクションの２４時間後、培養温度を３２℃に下げ、１ｍＭの酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を添加した。培養物に、（出発体積の）３．６％のフィード（２．５％ＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）、０．５％Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）、０．２５ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）および２ｇ／Ｌのグルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ））を毎日添加してフィードした。ＩｇＧ上清の力価をＩｇＧ ＥＬＩＳＡによってモニタリングし、上清を回収する前にトランスフェクションを最長１４日間培養した。
キメラ７．２および２０．１（ＶＨ０／Ｖκ０）、２つの対照の組合せ（ＶＨ０／Ｖκ１、ＶＨ１／Ｖκ０）ならびにヒト化重鎖および軽鎖の組合せを、対応するエンドトキシン不含ＤＮＡからのＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ（登録商標）エレクトロポレーションシステム（ＭａｘＣｙｔｅ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＵＳＡ）を使用してＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）に一過性にトランスフェクトした。ＯＣ－４００プロセシングアセンブリを使用して、各抗体についてトランスフェクションを行った。細胞回収後、細胞を、８ｍＭのＬ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）および１ｘのヒポキサンチン－チミジン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）を含有するＣＤ Ｏｐｔｉ－ＣＨＯ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）に３ｘ１０６細胞／ｍＬまで希釈した。トランスフェクションの２４時間後、培養温度を３２℃に下げ、１ｍＭの酪酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ）を添加した。培養物に、（出発体積の）３．６％のフィード（２．５％ＣＨＯ ＣＤ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｆｅｅｄ Ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）、０．５％Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）、０．２５ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）および２ｇ／Ｌのグルコース（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫ））を毎日添加してフィードした。ＩｇＧ上清の力価をＩｇＧ ＥＬＩＳＡによってモニタリングし、上清を回収する前にトランスフェクションを最長１４日間培養した。
【0223】
ｃ．ｍＡｂ３（ｍＡｂ２０．１のヒト化形態）の選択
ｍＡｂ２０．１の２つのヒト化バリアントを、さらなる特徴付けのために、２０種のヒト化候補から選択した。
ｍＡｂ２０．１の２つのヒト化バリアントを、さらなる特徴付けのために、２０種のヒト化候補から選択した。
【0224】
以下の表４は、マウス親抗体ｍＡｂ７．２、ｍＡｂ２０．１、ならびに配列番号１のＶＨおよび配列番号２のＶＬを有するｍＡｂ２０．１のヒト化バージョンとの間の比較データを要約している。
【0225】
【表4】
【0226】
実施例２：ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２感染症を治療するための活性化ＢＴＮ３Ａ抗体の使用のエビデンス
材料および方法
細胞の単離および細胞株の培養
１５人の健康なボランティアからの血液サンプルは、地元の血液バンク（合意Ｎ°７８２８、「Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ」、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、バフィーコートからの密度勾配遠心分離によって（Ｆｉｃｏｌｌ（Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用する密度勾配遠心分離によって単離した。
材料および方法
細胞の単離および細胞株の培養
１５人の健康なボランティアからの血液サンプルは、地元の血液バンク（合意Ｎ°７８２８、「Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ」、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、バフィーコートからの密度勾配遠心分離によって（Ｆｉｃｏｌｌ（Ｅｕｒｏｂｉｏ、Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用する密度勾配遠心分離によって単離した。
【0227】
単球を、ＭＡＣＳ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＣＤ１４選択によってＰＢＭＣから精製し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ－１６４０培地（ＲＰＭＩ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で培養した。単球に由来するマクロファージ（ＭＤＭ）については、細胞を、１０％不活化ヒトＡＢ血清（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）、２ｍＭのグルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ－１６４０中で培養した。３日後、培地を、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭのグルタミンを含有するＲＰＭＩ－１６４０に置き換え、細胞をさらに４日間マクロファージに分化させた。
【0228】
Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を、新鮮なＰＢＭＣから増殖させた。簡潔には、ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳ、インターロイキン－２（ＩＬ－２、最終濃度２００ＵＩ／ｍｌまで）およびゾレドロン酸一水和物（最終濃度１μＭ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で増殖させた。ＩＬ－２を、５日目に開始して２日ごとに添加した。１２日間培養した後、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリー分析によって評価し、次いで凍結させた。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞をさらに精製し、ＴＣＲγ／δ＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して最大９８％の純度まで濃縮した。
【0229】
正常ヒト気管支上皮細胞（ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－９６０９（商標））をＬＨＣ－９培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で培養し、正常ヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ－５細胞、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１７１（商標））を、４％ＦＢＳおよび２ｍＭのＬ－グルタミンを補充した最小必須培地（ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気で培養した。
【0230】
ウイルス産生および細胞感染
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ＩＨＵ－ＭＩ６を、以前記載されたように（Ｂｏｕｍａｚａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、４％ＦＢＳを補充したＭＥＭでのＶｅｒｏ Ｅ６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５８６（商標））感染後に得た。健康なドナーのＰＢＭＣから単離した単球およびＭＤＭ、ならびにＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５細胞を、加湿インキュベータ内で５％ＣＯ２および９５％空気の存在下、３７℃で２４時間、感染多重度（ＭＯＩ）１でのウイルス懸濁液で感染させた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株ＩＨＵ－ＭＩ６を、以前記載されたように（Ｂｏｕｍａｚａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）、４％ＦＢＳを補充したＭＥＭでのＶｅｒｏ Ｅ６細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５８６（商標））感染後に得た。健康なドナーのＰＢＭＣから単離した単球およびＭＤＭ、ならびにＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５細胞を、加湿インキュベータ内で５％ＣＯ２および９５％空気の存在下、３７℃で２４時間、感染多重度（ＭＯＩ）１でのウイルス懸濁液で感染させた。
【0231】
ＲＮＡの単離およびｑＲＴ－ＰＣＲ
全ＲＮＡを、以前記載されたように（Ｍｅｚｏｕａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９ｃ）、ＤＮＡ夾雑物を排除するためにＤＮａｓｅ Ｉ処理を伴うＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して細胞（２．１０６細胞／ウェル）から抽出した。抽出されたＲＮＡの品質および量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）を使用して評価した。単離されたＲＮＡの逆転写を、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して行った。ＢＴＮ３Ａの発現レベルを定量するために、リアルタイムｑ－ＰＣＲを、Ｓｍａｒｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｆａｓｔ Ｍａｓｔｅｒキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）および特異的プライマーを使用して行った（表５）。ＢＴＮ２Ａの発現レベルを定量するために、リアルタイムｑ－ＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および特異的プローブを使用して行った（表５）。すべてのｑ－ＰＣＲは、ＣＦＸ ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して行った。結果を、以前記載されたように（Ｍｅｚｏｕａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９ａ）、ＡＣＴＢまたはＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子を使用して正規化し、調査した遺伝子の相対発現、ΔＣｔ＝Ｃｔ標的－Ｃｔハウスキーピング遺伝子で表す。閾値サイクル（Ｃｔ）は、蛍光シグナルを検出するために必要なサイクル数と定義した。
全ＲＮＡを、以前記載されたように（Ｍｅｚｏｕａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９ｃ）、ＤＮＡ夾雑物を排除するためにＤＮａｓｅ Ｉ処理を伴うＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して細胞（２．１０６細胞／ウェル）から抽出した。抽出されたＲＮＡの品質および量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）を使用して評価した。単離されたＲＮＡの逆転写を、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して行った。ＢＴＮ３Ａの発現レベルを定量するために、リアルタイムｑ－ＰＣＲを、Ｓｍａｒｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｆａｓｔ Ｍａｓｔｅｒキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）および特異的プライマーを使用して行った（表５）。ＢＴＮ２Ａの発現レベルを定量するために、リアルタイムｑ－ＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および特異的プローブを使用して行った（表５）。すべてのｑ－ＰＣＲは、ＣＦＸ ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して行った。結果を、以前記載されたように（Ｍｅｚｏｕａｒ ｅｔ ａｌ．，２０１９ａ）、ＡＣＴＢまたはＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子を使用して正規化し、調査した遺伝子の相対発現、ΔＣｔ＝Ｃｔ標的－Ｃｔハウスキーピング遺伝子で表す。閾値サイクル（Ｃｔ）は、蛍光シグナルを検出するために必要なサイクル数と定義した。
【0232】
【表5】
【0233】
フローサイトメトリー染色およびデータ取得および分析
インビトロでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞の分析のために、細胞を、１％ＦＢＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁した。細胞を、抗ＢＴＮ３Ａ（１０３．２）もしくは抗ＢＴＮ２Ａ（７．４８）ｍＡｂを用いてまたはアイソタイプ対照（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて生存色素（ＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。３０分のインキュベーション後、一次抗体の結合をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出した。データをＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて分析した。
インビトロでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞の分析のために、細胞を、１％ＦＢＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に懸濁した。細胞を、抗ＢＴＮ３Ａ（１０３．２）もしくは抗ＢＴＮ２Ａ（７．４８）ｍＡｂを用いてまたはアイソタイプ対照（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて生存色素（ＬＩＶＥ／Ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。３０分のインキュベーション後、一次抗体の結合をＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗マウス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出した。データをＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて分析した。
【0234】
ウイルスＲＮＡの抽出およびｑＲＴ－ＰＣＲ
ウイルスＲＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ウイルスＲＮＡ単離キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｈｏｅｒｄｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を製造業者の推奨に従って使用して、感染細胞から抽出した。ウイルス検出は、Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。熱サイクルは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、逆転写のために５５℃で１０分間、続いて９５℃で３分間、次いで９５℃で１５秒間および５８℃で３０秒間の４５サイクルで達成した。プライマーおよびプローブは、Ｅ遺伝子に対して設計した（Ｂｏｕｍａｚａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
ウイルスＲＮＡは、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ウイルスＲＮＡ単離キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｈｏｅｒｄｔ、Ｆｒａｎｃｅ）を製造業者の推奨に従って使用して、感染細胞から抽出した。ウイルス検出は、Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ Ｐｌａｔｉｎｕｍ（商標）キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。熱サイクルは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ、Ｒｏｔｋｒｅｕｚ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、逆転写のために５５℃で１０分間、続いて９５℃で３分間、次いで９５℃で１５秒間および５８℃で３０秒間の４５サイクルで達成した。プライマーおよびプローブは、Ｅ遺伝子に対して設計した（Ｂｏｕｍａｚａ ｅｔ ａｌ．，２０２０）。
【0235】
細胞傷害性アッセイ
単球、ＭＤＭ、ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５を、１０μＭの細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、次いでウイルスで刺激した。標的細胞を、抗ＢＴＮ３Ａ ２０．１ ｍＡｂ（０、０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（エフェクター）と共培養した。２４時間後、細胞を、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔカスパーゼ－３／７グリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して、死細胞を同定した。細胞傷害性を、標的細胞集団におけるカスパーゼ３／７＋細胞のパーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価した。データをＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析した。
単球、ＭＤＭ、ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５を、１０μＭの細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、次いでウイルスで刺激した。標的細胞を、抗ＢＴＮ３Ａ ２０．１ ｍＡｂ（０、０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（エフェクター）と共培養した。２４時間後、細胞を、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔカスパーゼ－３／７グリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して、死細胞を同定した。細胞傷害性を、標的細胞集団におけるカスパーゼ３／７＋細胞のパーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価した。データをＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析した。
【0236】
ＩＦＮ－γ分泌アッセイ
単球、ＭＤＭ、ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５をウイルスで刺激し、抗ＢＴＮ３Ａ ２０．１ ｍＡｂ（０、０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（エフェクター）と共培養した。２４時間後、共培養物から培養上清を回収し、ＩＦＮ－γの分泌を、製造業者の説明書に従って、ヒトＩＦＮ－γイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出した。
単球、ＭＤＭ、ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５をウイルスで刺激し、抗ＢＴＮ３Ａ ２０．１ ｍＡｂ（０、０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞（エフェクター）と共培養した。２４時間後、共培養物から培養上清を回収し、ＩＦＮ－γの分泌を、製造業者の説明書に従って、ヒトＩＦＮ－γイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出した。
【0237】
統計分析
統計分析は、スチューデントのｔ検定またはノンパラメトリックマンホイットニーのＵ検定を使用した転写分析、およびクラスカルワリス検定を使用したスペクトル型サイトメトリーに対して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行い、続いてダンの多重比較およびマンホイットニー検定を行った（有意差の境界：ｐ＜０．０５）。
統計分析は、スチューデントのｔ検定またはノンパラメトリックマンホイットニーのＵ検定を使用した転写分析、およびクラスカルワリス検定を使用したスペクトル型サイトメトリーに対して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８．０、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行い、続いてダンの多重比較およびマンホイットニー検定を行った（有意差の境界：ｐ＜０．０５）。
【0238】
結果
ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の影響
最初に、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が、骨髄由来の細胞（単球または単球由来のマクロファージ（ＭＤＭ）の初代細胞培養物）または肺起源の細胞（正常な上皮肺細胞株：ＢＥＡＳ－２ＢまたはＭＲＣ－５）のＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現に影響を及ぼすかどうかを評価した。ＢＴＮ２Ａの転写（アイソフォーム遺伝子２Ａ１、２Ａ２）またはタンパク質発現に対する影響は観察されなかった（図１Ａ）。対照的に、ＢＴＮ３Ａの３つのアイソフォーム（３Ａ１、３Ａ２、３Ａ３）の遺伝子発現は、ウイルスを含まない培養物と比較して、ＭＤＭ培養物中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在で有意に増加した。実際、ＢＴＮ３Ａの３つのアイソフォームの相対発現は、非刺激ＭＤＭと比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２刺激ＭＤＭで約５倍増加した（３Ａ１ ｐ＝０．０１２、３Ａ２ ｐ＝０．００６、３Ａ３ ｐ＝０．０２８）（図１Ｂ）。単球または肺細胞培養物において、ＢＴＮ３Ａ転写産物の統計学的に有意な差は観察されなかった。しかしながら、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２刺激により、ＭＤＭ、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ＭＲＣ－５のＢＴＮ３Ａタンパク質発現の有意な増加を観察した（図１Ｂ）。ＢＴＮ３Ａのタンパク質発現は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で刺激した後、ＭＤＭでは３．５倍、ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５細胞では約２倍増加した（それぞれｐ＝０．０４８、ｐ＝０．０１２およびｐ＝０．００２）。
ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の影響
最初に、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染が、骨髄由来の細胞（単球または単球由来のマクロファージ（ＭＤＭ）の初代細胞培養物）または肺起源の細胞（正常な上皮肺細胞株：ＢＥＡＳ－２ＢまたはＭＲＣ－５）のＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現に影響を及ぼすかどうかを評価した。ＢＴＮ２Ａの転写（アイソフォーム遺伝子２Ａ１、２Ａ２）またはタンパク質発現に対する影響は観察されなかった（図１Ａ）。対照的に、ＢＴＮ３Ａの３つのアイソフォーム（３Ａ１、３Ａ２、３Ａ３）の遺伝子発現は、ウイルスを含まない培養物と比較して、ＭＤＭ培養物中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の存在で有意に増加した。実際、ＢＴＮ３Ａの３つのアイソフォームの相対発現は、非刺激ＭＤＭと比較して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２刺激ＭＤＭで約５倍増加した（３Ａ１ ｐ＝０．０１２、３Ａ２ ｐ＝０．００６、３Ａ３ ｐ＝０．０２８）（図１Ｂ）。単球または肺細胞培養物において、ＢＴＮ３Ａ転写産物の統計学的に有意な差は観察されなかった。しかしながら、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２刺激により、ＭＤＭ、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ＭＲＣ－５のＢＴＮ３Ａタンパク質発現の有意な増加を観察した（図１Ｂ）。ＢＴＮ３Ａのタンパク質発現は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で刺激した後、ＭＤＭでは３．５倍、ＢＥＡＳ－２ＢおよびＭＲＣ－５細胞では約２倍増加した（それぞれｐ＝０．０４８、ｐ＝０．０１２およびｐ＝０．００２）。
【0239】
インビトロでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞応答の特徴付け
次いで、本発明者らは、参照抗ＢＴＮ３Ａモノクローナル抗体２０．１で活性化した場合の、インビトロでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の能力を研究した。ウイルス感染がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の生存率に影響を及ぼさないことを確認した後（図２）、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩＨＵ－ＭＩ６株および漸増濃度の参照２０．１ ｍＡｂの存在下で、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を骨髄または肺細胞と共培養した。参照抗ＢＴＮ３Ａ ２０．１は、ウイルス複製の用量依存的阻害をもたらした（１０μｇ／ｍｌで、単球培養物において２８．４％、ＭＤＭにおいて４２．４％、ＭＲＣ－５において３３．７％およびＢＥＡＳ－２Ｂ培養物において５３．０％）（図３Ａ）。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の細胞傷害性（カスパーゼ３／７）は、骨髄細胞に対してよりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した肺細胞に対して高いようであり、参照抗ＢＴＮ３Ａ ２０．１抗体の濃度と共に増加した。差異は、４つの標的細胞培養物のそれぞれにおいて０．１および１０μｇ／ｍｌの用量間で統計学的に有意であった（表６）。
次いで、本発明者らは、参照抗ＢＴＮ３Ａモノクローナル抗体２０．１で活性化した場合の、インビトロでのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の能力を研究した。ウイルス感染がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の生存率に影響を及ぼさないことを確認した後（図２）、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＩＨＵ－ＭＩ６株および漸増濃度の参照２０．１ ｍＡｂの存在下で、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を骨髄または肺細胞と共培養した。参照抗ＢＴＮ３Ａ ２０．１は、ウイルス複製の用量依存的阻害をもたらした（１０μｇ／ｍｌで、単球培養物において２８．４％、ＭＤＭにおいて４２．４％、ＭＲＣ－５において３３．７％およびＢＥＡＳ－２Ｂ培養物において５３．０％）（図３Ａ）。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の細胞傷害性（カスパーゼ３／７）は、骨髄細胞に対してよりもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染した肺細胞に対して高いようであり、参照抗ＢＴＮ３Ａ ２０．１抗体の濃度と共に増加した。差異は、４つの標的細胞培養物のそれぞれにおいて０．１および１０μｇ／ｍｌの用量間で統計学的に有意であった（表６）。
【0240】
最後に、本発明者らは、参照抗ＢＴＮ３Ａ ２０．１で活性化されたＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞が、ＩＦＮ－γ媒介性非細胞溶解性抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を発揮したかどうかを調べた。抗ＢＴＮ３Ａの濃度の増加は、４つの細胞培養物の上清中のＩＦＮ－γの有意かつ用量依存的な増加と関連した（図３Ｂおよび表６）。
【0241】
【表6】
【0242】
実施例３：Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染症を治療するための活性化抗ＢＴＮ３Ａ抗体の使用のエビデンス
材料および方法
細胞の単離
本発明者らの研究で使用した血液サンプル（ロイコパック）は、ドナー受入れ、インフォームドコンセント、およびサンプル採取を行うフランス血液機関（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ ｓａｎｇ、ＥＦＳ）からのものである。本発明者らの研究室とＥＦＳ（Ｎ°７８２８）との間で確立された協定により、バフィーコートを得て、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を以前記載されたように単離した。
材料および方法
細胞の単離
本発明者らの研究で使用した血液サンプル（ロイコパック）は、ドナー受入れ、インフォームドコンセント、およびサンプル採取を行うフランス血液機関（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ ｓａｎｇ、ＥＦＳ）からのものである。本発明者らの研究室とＥＦＳ（Ｎ°７８２８）との間で確立された協定により、バフィーコートを得て、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を以前記載されたように単離した。
【0243】
単球を、ＭＡＣＳ磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＣＤ１４選択によってＰＢＭＣから精製し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭのＬ－グルタミン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ－１６４０培地（ＲＰＭＩ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で培養した。
【0244】
Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞を、以前記載されたように、新鮮なＰＢＭＣから増殖させた。簡潔には、ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳ、インターロイキン－２（ＩＬ－２、最終濃度２００ＵＩ／ｍｌまで）およびゾレドロン酸一水和物（Ｚｏｍｅｔａ、最終濃度１μＭまで）を補充したＲＰＭＩ－１６４０培地中で増殖させた。ＩＬ－２を、５日目に開始して１２日間にわたって２日ごとに添加し、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の純度をフローサイトメトリー分析によって評価（＞８５％）し、次いで、１０％ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ－Ｑｕｅｎｔｉｎ－Ｆａｌｌａｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅ）および９０％ＦＢＳ中、－８０℃で凍結させた。
【0245】
細菌産生
Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ細菌フェーズＩ（Ｎｉｎｅ Ｍｉｌｅ株、ＲＳＡ４９３およびギアナ株、ＭＳＴ１７）を、Ｌ９２９細胞中で１０日間培養した。簡潔には、感染した細胞を超音波処理し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、次いで洗浄し、－８０℃で貯蔵した。細菌の濃度は、ヒメネス染色を使用して求め、細菌生存率は、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ＢａｃＬｉｇｈｔ細菌生存率キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）を、製造業者の説明書に従って使用して評価した。
Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ細菌フェーズＩ（Ｎｉｎｅ Ｍｉｌｅ株、ＲＳＡ４９３およびギアナ株、ＭＳＴ１７）を、Ｌ９２９細胞中で１０日間培養した。簡潔には、感染した細胞を超音波処理し、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、次いで洗浄し、－８０℃で貯蔵した。細菌の濃度は、ヒメネス染色を使用して求め、細菌生存率は、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ＢａｃＬｉｇｈｔ細菌生存率キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）を、製造業者の説明書に従って使用して評価した。
【0246】
細菌検出
ＤＮＡを、ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した細胞から抽出した。感染は、以前記載されたように、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＣＯＭ－１遺伝子を標的とする特異的プライマーＦ（５’－ＧＣＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＧＣＣＧ－ＧＡＡＣＣＴＴ－３’ ［配列番号４３］）およびＲ（５’－ＴＴＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＧＧＡＴＴＧＡＧＡ－３’ ［配列番号４４］）を用いて行ったリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって定量した。
ＤＮＡを、ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した細胞から抽出した。感染は、以前記載されたように、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＣＯＭ－１遺伝子を標的とする特異的プライマーＦ（５’－ＧＣＡＣＴＡＴＴＴＴＴＡＧＣＣＧ－ＧＡＡＣＣＴＴ－３’ ［配列番号４３］）およびＲ（５’－ＴＴＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＴＧＧＡＴＴＧＡＧＡ－３’ ［配列番号４４］）を用いて行ったリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって定量した。
【0247】
細胞内のＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉの存在もフローサイトメトリーによって評価した。簡潔には、感染した細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で透過処理した。洗浄後、細胞をＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに対し指向する抗ウサギと共に３０分間インキュベートし、次いでＡｌｅｘａ６４７抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。データをＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅ Ｐｏｎｔ－ｄｅ－Ｃｌａｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて分析した。
【0248】
ＲＮＡの単離およびｑＲＴ－ＰＣＲ
全ＲＮＡを、以前記載されたように、ＤＮＡ夾雑物を排除するためにＤｎａｓｅ Ｉ処理を伴うＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞（２．１０６細胞／ウェル）から抽出した。抽出されたＲＮＡの品質および量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）を使用して評価した。単離されたＲＮＡの逆転写を、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して行った。Ｍ１／Ｍ２応答に関与する遺伝子、ならびにＢＴＮ３Ａアイソフォーム遺伝子の発現レベルを、リアルタイムｑＰＣＲ、Ｓｍａｒｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｆａｓｔ Ｍａｓｔｅｒキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）および特異的プライマーを使用して評価した（表７）。ＢＴＮ２Ａの発現レベルを、リアルタイムｑＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および特異的プローブを使用して評価した（表７）。すべてのｑＰＣＲは、ＣＦＸ ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｍａｒｎｅｓ－ｌａ－Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して行った。結果を、以前記載されたように、ＡＣＴＢまたはＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子を使用して正規化し、ΔＣｔ＝Ｃｔｔａｒｇｅｔ－Ｃｔｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅである２－ΔＣｔを用いて調査した遺伝子の相対発現として表す。閾値サイクル（Ｃｔ）は、蛍光シグナルを検出するために必要なサイクル数と定義した。
全ＲＮＡを、以前記載されたように、ＤＮＡ夾雑物を排除するためにＤｎａｓｅ Ｉ処理を伴うＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して細胞（２．１０６細胞／ウェル）から抽出した。抽出されたＲＮＡの品質および量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）を使用して評価した。単離されたＲＮＡの逆転写を、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素キット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して行った。Ｍ１／Ｍ２応答に関与する遺伝子、ならびにＢＴＮ３Ａアイソフォーム遺伝子の発現レベルを、リアルタイムｑＰＣＲ、Ｓｍａｒｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｆａｓｔ Ｍａｓｔｅｒキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｅｙｌａｎ、Ｆｒａｎｃｅ）および特異的プライマーを使用して評価した（表７）。ＢＴＮ２Ａの発現レベルを、リアルタイムｑＰＣＲ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および特異的プローブを使用して評価した（表７）。すべてのｑＰＣＲは、ＣＦＸ ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｍａｒｎｅｓ－ｌａ－Ｃｏｑｕｅｔｔｅ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して行った。結果を、以前記載されたように、ＡＣＴＢまたはＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子を使用して正規化し、ΔＣｔ＝Ｃｔｔａｒｇｅｔ－Ｃｔｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅである２－ΔＣｔを用いて調査した遺伝子の相対発現として表す。閾値サイクル（Ｃｔ）は、蛍光シグナルを検出するために必要なサイクル数と定義した。
【0249】
【表7】
【0250】
ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａのタンパク質発現
細胞を、１％ＦＢＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に収集し、生存色素（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＢＴＮ３Ａ（クローン１０３．２）もしくは抗ＢＴＮ２Ａ（クローン７．４８）ｍＡｂまたは適切なアイソタイプ対照（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で標識した。３０分のインキュベーション後、一次抗体の結合をＰＥ抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出し、データをＮａｖｉｏｓ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析した。
細胞を、１％ＦＢＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に収集し、生存色素（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＢＴＮ３Ａ（クローン１０３．２）もしくは抗ＢＴＮ２Ａ（クローン７．４８）ｍＡｂまたは適切なアイソタイプ対照（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で標識した。３０分のインキュベーション後、一次抗体の結合をＰＥ抗マウス抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で検出し、データをＮａｖｉｏｓ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析した。
【0251】
脱顆粒アッセイ
単球を、抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ（クローン７．４８）または抗ＢＴＮ３Ａ ｍＡｂ（クローン２０．１または１０３．２）ならびに蛍光色素標識したＣＤ１０７ａおよびＣＤ１０７ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と共培養した。４時間後、細胞を回収し、蛍光色素標識したＴＣＲ特異的ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）および生存マーカー（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。脱顆粒を、γδ Ｔ細胞集団におけるＣＤ１０７ａ／ｂ＋細胞パーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価した。データをＮａｖｉｏｓ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析した。
単球を、抗ＢＴＮ２Ａ ｍＡｂ（クローン７．４８）または抗ＢＴＮ３Ａ ｍＡｂ（クローン２０．１または１０３．２）ならびに蛍光色素標識したＣＤ１０７ａおよびＣＤ１０７ｂ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と共培養した。４時間後、細胞を回収し、蛍光色素標識したＴＣＲ特異的ｍＡｂ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）および生存マーカー（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｎｅａｒ ＩＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。脱顆粒を、γδ Ｔ細胞集団におけるＣＤ１０７ａ／ｂ＋細胞パーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価した。データをＮａｖｉｏｓ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析した。
【0252】
細胞傷害性アッセイ
単球を、１０μＭの細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、次いで、抗ＢＴＮ３Ａ ｍＡｂ（クローン２０．１）の存在下で、Ｅ：Ｔ比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と共培養した。４時間後、細胞を、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔカスパーゼ－３／７グリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して、死細胞を同定する。細胞傷害性を、標的細胞集団におけるカスパーゼ３／７＋細胞のパーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価した。データをＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析した。
単球を、１０μＭの細胞増殖色素ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）６７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、次いで、抗ＢＴＮ３Ａ ｍＡｂ（クローン２０．１）の存在下で、Ｅ：Ｔ比１：１でＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と共培養した。４時間後、細胞を、ＣｅｌｌＥｖｅｎｔカスパーゼ－３／７グリーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色して、死細胞を同定する。細胞傷害性を、標的細胞集団におけるカスパーゼ３／７＋細胞のパーセンテージとして、フローサイトメトリーによって評価した。データをＢＤ Ｃａｎｔｏ ＩＩ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ ｖ１０．６．２）を用いて分析した。
【0253】
イムノアッセイ
腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、グランザイムＢ、パーフォリンおよびグラニュライシン（Ａｂｃａｍ）のレベルを、特異的イムノアッセイキットを使用して単球／Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞共培養物の上清で定量した。ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、インターロイキン（ＩＬ）－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のレベルを、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染後のＢＴＮＫＯ細胞の上清で定量した。アッセイの感度は、ＴＮＦ－αについては６．２ｐｇ／ｍＬ、ＩＦＮ－γについては５．７ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ－１βについては１．０ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ－６については０．７ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ－１０については３．９ｐｇ／ｍＬ、ＴＧＦ－βについては１５．４ｐｇ／ｍＬ、ＧＭ－ＣＳＦについては３．０ｐｇ／ｍＬ、グランザイムＢについては２０ｐｇ／ｍＬ、パーフォリンについては４０ｐｇ／ｍＬ、およびグラニュライシンについては１０ｐｇ／ｍＬであった。
腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、グランザイムＢ、パーフォリンおよびグラニュライシン（Ａｂｃａｍ）のレベルを、特異的イムノアッセイキットを使用して単球／Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞共培養物の上清で定量した。ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、インターロイキン（ＩＬ）－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１０およびトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のレベルを、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染後のＢＴＮＫＯ細胞の上清で定量した。アッセイの感度は、ＴＮＦ－αについては６．２ｐｇ／ｍＬ、ＩＦＮ－γについては５．７ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ－１βについては１．０ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ－６については０．７ｐｇ／ｍＬ、ＩＬ－１０については３．９ｐｇ／ｍＬ、ＴＧＦ－βについては１５．４ｐｇ／ｍＬ、ＧＭ－ＣＳＦについては３．０ｐｇ／ｍＬ、グランザイムＢについては２０ｐｇ／ｍＬ、パーフォリンについては４０ｐｇ／ｍＬ、およびグラニュライシンについては１０ｐｇ／ｍＬであった。
【0254】
統計分析
統計分析は、転写分析に対してマンホイットニーのＵ検定、ならびにフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡの結果に対してｔ検定を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．０、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行った。遺伝子発現の階層的クラスタリングを、ＣｌｕｓｔＶｉｓウェブツールを使用して分析した。有意性の境界を、ｐ＜０．０５に設定した。
統計分析は、転写分析に対してマンホイットニーのＵ検定、ならびにフローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡの結果に対してｔ検定を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（８．０、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて行った。遺伝子発現の階層的クラスタリングを、ＣｌｕｓｔＶｉｓウェブツールを使用して分析した。有意性の境界を、ｐ＜０．０５に設定した。
【0255】
結果
Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現を調節する
Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染がＢＴＮの発現に影響を及ぼすかどうかを評価するために、健康なドナーからの単球を単離し、参照株ＮＭ１またはより毒性が強いと記載されているギアナ株に感染させた。Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１株感染の２４時間後、ＢＴＮ３Ａ３ではなく、ＢＴＮ３Ａ１およびＢＴＮ３Ａ２アイソフォームの両方の転写発現の増加が見出された。ギアナ株感染は、３つのアイソフォームを誘導した（図４Ａ）。興味深いことに、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１感染とこの株の熱不活化型との間に有意差が観察され（ｐ＝０．０３７４）、毒性因子がＢＴＮ３Ａ１の発現に関与していることが示唆された。ＢＴＮ３Ａタンパク質発現の有意な増加が、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１およびギアナ株に感染した単球において見出された（それぞれｐ＝０．００２１およびｐ＝０．００９６）（図４Ｂ）。最後に、ＢＴＮ３Ａの発現を、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染を有するＱ熱患者由来のＰＢＭＣにおいて、ＢＴＮ３Ａの活性または持続形態で評価した。ＢＴＮ３Ａのタンパク質発現は、健康なドナーと比較して、Ｑ熱を有する患者において有意に高く（ｐ＝０．０１８５）、疾患形態に従って同様の発現を有した（図４Ｃ）。
Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現を調節する
Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染がＢＴＮの発現に影響を及ぼすかどうかを評価するために、健康なドナーからの単球を単離し、参照株ＮＭ１またはより毒性が強いと記載されているギアナ株に感染させた。Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１株感染の２４時間後、ＢＴＮ３Ａ３ではなく、ＢＴＮ３Ａ１およびＢＴＮ３Ａ２アイソフォームの両方の転写発現の増加が見出された。ギアナ株感染は、３つのアイソフォームを誘導した（図４Ａ）。興味深いことに、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１感染とこの株の熱不活化型との間に有意差が観察され（ｐ＝０．０３７４）、毒性因子がＢＴＮ３Ａ１の発現に関与していることが示唆された。ＢＴＮ３Ａタンパク質発現の有意な増加が、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１およびギアナ株に感染した単球において見出された（それぞれｐ＝０．００２１およびｐ＝０．００９６）（図４Ｂ）。最後に、ＢＴＮ３Ａの発現を、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染を有するＱ熱患者由来のＰＢＭＣにおいて、ＢＴＮ３Ａの活性または持続形態で評価した。ＢＴＮ３Ａのタンパク質発現は、健康なドナーと比較して、Ｑ熱を有する患者において有意に高く（ｐ＝０．０１８５）、疾患形態に従って同様の発現を有した（図４Ｃ）。
【0256】
ＢＴＮ２ＡはＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化に関与しているので、本発明者らはまた、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染がＢＴＮ２Ａの発現に影響を及ぼすかどうかを調べた。感染の２４時間後、両アイソフォーム（２Ａ１および２Ａ２）のＢＴＮ２Ａ転写発現は、非感染細胞と比較して、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１およびギアナ感染後に有意に増加し（２Ａ１、それぞれｐ＝０．０１７０およびｐ＝０．００２１；ならびに２Ａ２、それぞれｐ＝０．００５４およびｐ＝０．０４６３）、熱不活化型との比較では有意な調節はなかった（図４Ｄ）。ＢＴＮ２Ａのタンパク質発現に関して、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球では、非感染細胞と比較して、有意な増加（ＮＭ１株、ｐ＝０．０１６０、およびギアナ株、ｐ＝０．００１８）が観察された（図４Ｅ）。ＢＴＮ３Ａと同様に、Ｑ熱患者由来のＰＢＭＣは、疾患の臨床形態による調節なしで、健康なドナーと比較して、有意に高いＢＴＮ２Ａの発現を示した（ｐ＝０．０１２５）（図４Ｆ）。
【0257】
全体として、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、インビトロ感染後の宿主、ならびに感染患者由来のサンプル中のＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの発現の増加をもたらす。
【0258】
Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染におけるＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの関与
次に、本発明者らは、ＢＴＮがＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉの取込みまたは複製に関与し得るかどうかを調べた。この目的のために、本発明者らは、ＴＨＰ－１細胞株において３つのＢＴＮ３Ａ遺伝子または２つのＢＴＮ２Ａ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウトを行った。細胞に、ＢＴＮ２Ａ１およびＢＴＮ２Ａ２（ＢＴＮ２ＡＫＯ）またはＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２およびＢＴＮ３Ａ３（ＢＴＮ３ＡＫＯ）アイソフォームのいずれかを標的とするガイド、または無関係のＣＲＩＳＰＲガイド（モック）を形質導入した。ＢＴＮ３Ａ－またはＢＴＮ２Ａで無効化した（ＫＯ）細胞をＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１に感染させ、細菌量をｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ＢＴＮ３ＡＫＯまたはＢＴＮ２ＡＫＯとモック細胞（図５Ａ）との間の細菌取込み（図５Ａ）または複製（図５Ｂ）に差異は観察されず、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａが、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉの細胞感染のプロセスに直接関与しないことを示唆した。
次に、本発明者らは、ＢＴＮがＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉの取込みまたは複製に関与し得るかどうかを調べた。この目的のために、本発明者らは、ＴＨＰ－１細胞株において３つのＢＴＮ３Ａ遺伝子または２つのＢＴＮ２Ａ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ノックアウトを行った。細胞に、ＢＴＮ２Ａ１およびＢＴＮ２Ａ２（ＢＴＮ２ＡＫＯ）またはＢＴＮ３Ａ１、ＢＴＮ３Ａ２およびＢＴＮ３Ａ３（ＢＴＮ３ＡＫＯ）アイソフォームのいずれかを標的とするガイド、または無関係のＣＲＩＳＰＲガイド（モック）を形質導入した。ＢＴＮ３Ａ－またはＢＴＮ２Ａで無効化した（ＫＯ）細胞をＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１に感染させ、細菌量をｑＲＴ－ＰＣＲによって評価した。ＢＴＮ３ＡＫＯまたはＢＴＮ２ＡＫＯとモック細胞（図５Ａ）との間の細菌取込み（図５Ａ）または複製（図５Ｂ）に差異は観察されず、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａが、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉの細胞感染のプロセスに直接関与しないことを示唆した。
【0259】
Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染に対する炎症応答におけるＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの関与
次いで、本発明者らは、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染後の宿主免疫応答におけるＢＴＮの関与を調べた。図３で観察されるように、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＴＨＰ－１細胞における炎症促進性および抗炎症性遺伝子の両方の調節をもたらす。Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した場合、階層的クラスタリングは、細胞型に依存するクラスタリングを明らかにした。ＢＴＮ３ＡＫＯおよびＢＴＮ２ＫＯ細胞は、モック細胞から離れてクラスタリングされた（図６Ａ）。ＢＴＮ３ＡＫＯおよびＢＴＮ２ＫＯ細胞は、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染後に炎症応答の抑制を示した。実際、炎症性遺伝子ＴＮＦおよびＩＬ１Ｂの発現は、モック細胞と比較して、それぞれＢＴＮ３ＡＫＯおよびＢＴＮ２ＡＫＯ細胞で３分の１および２分の１に有意に減少した（図６Ｂ）。さらに、減少した免疫調節応答は、ＢＴＮ３ＡＫＯ細胞においてのみ、感染後に観察された。実際、ＩＬ１０遺伝子の転写発現は、モック細胞と比較して、２分の１に有意に減少した（ｐ＝０．０４３５）（図６Ｂ）。タンパク質レベルに関して、ＢＴＮ３ＡＫＯおよびＢＴＮ２ＡＫＯ細胞は、モック細胞と比較して、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染後のＴＮＦ－ａ（それぞれ５０％および３０％）およびＩＬ－１β（最大２０％）放出に有意な減少を示した（図６Ｃ）。ＩＬ－１０などの抗炎症性サイトカインのレベルに有意差は観察されなかった。
次いで、本発明者らは、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染後の宿主免疫応答におけるＢＴＮの関与を調べた。図３で観察されるように、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＴＨＰ－１細胞における炎症促進性および抗炎症性遺伝子の両方の調節をもたらす。Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した場合、階層的クラスタリングは、細胞型に依存するクラスタリングを明らかにした。ＢＴＮ３ＡＫＯおよびＢＴＮ２ＫＯ細胞は、モック細胞から離れてクラスタリングされた（図６Ａ）。ＢＴＮ３ＡＫＯおよびＢＴＮ２ＫＯ細胞は、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染後に炎症応答の抑制を示した。実際、炎症性遺伝子ＴＮＦおよびＩＬ１Ｂの発現は、モック細胞と比較して、それぞれＢＴＮ３ＡＫＯおよびＢＴＮ２ＡＫＯ細胞で３分の１および２分の１に有意に減少した（図６Ｂ）。さらに、減少した免疫調節応答は、ＢＴＮ３ＡＫＯ細胞においてのみ、感染後に観察された。実際、ＩＬ１０遺伝子の転写発現は、モック細胞と比較して、２分の１に有意に減少した（ｐ＝０．０４３５）（図６Ｂ）。タンパク質レベルに関して、ＢＴＮ３ＡＫＯおよびＢＴＮ２ＡＫＯ細胞は、モック細胞と比較して、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染後のＴＮＦ－ａ（それぞれ５０％および３０％）およびＩＬ－１β（最大２０％）放出に有意な減少を示した（図６Ｃ）。ＩＬ－１０などの抗炎症性サイトカインのレベルに有意差は観察されなかった。
【0260】
まとめると、これらのデータにより、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａの両方がＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染に対する炎症応答に関与することを報告した。炎症応答がＢＴＮ３ＡのみまたはＢＴＮ２Ａのみの存在下で抑制されるという事実は、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａが独立して作用し得ることを示唆する。
【0261】
Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａに依存的な様式で、Ｖγ９Ｖδ２細胞の活性化をもたらす
本発明者らは、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染後にＢＴＮが単球において過剰発現されることを示したので、本発明者らは、このプロセスがＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化を増強し得ると仮定した。４時間の共培養後、単球のＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、細菌：標的細胞の比に応じた用量応答で、ＣＤ１０７の原形質膜発現の増加によって示されるように、脱顆粒の増加（最大５倍）をもたらす（図７Ａ）。次いで、本発明者らは、抗ＢＴＮ３Ａアンタゴニスト（クローン１０３．２）および抗ＢＴＮ２Ａアンタゴニスト（クローン７．４８）を含む特異的アンタゴニスト抗体を使用して、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化がＢＴＮに依存するかどうかを調べた。両方の抗体は、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染後のＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞脱顆粒の抑止をもたらし、両方のＢＴＮがＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染時のＶγ９Ｖδ Ｔ細胞活性化に関与することを示す（図７Ｂおよび図７Ｃ）。興味深いことに、抗体処理なしの健康なドナーと比較して、Ｑ熱を有する患者由来のＰＢＭＣの共培養物において、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のより高い脱顆粒の傾向（１０％対３％、ｐ＝０．１７３）が見出された。この脱顆粒はまた、抗ＢＴＮ３Ａ １０３．２および抗ＢＴＮ２Ａ ７．４８アンタゴニスト抗体の存在下で阻害された（図７Ｄおよび図７Ｅ）。まとめると、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａに依存的な様式で、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化をもたらす。
本発明者らは、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染後にＢＴＮが単球において過剰発現されることを示したので、本発明者らは、このプロセスがＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化を増強し得ると仮定した。４時間の共培養後、単球のＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、細菌：標的細胞の比に応じた用量応答で、ＣＤ１０７の原形質膜発現の増加によって示されるように、脱顆粒の増加（最大５倍）をもたらす（図７Ａ）。次いで、本発明者らは、抗ＢＴＮ３Ａアンタゴニスト（クローン１０３．２）および抗ＢＴＮ２Ａアンタゴニスト（クローン７．４８）を含む特異的アンタゴニスト抗体を使用して、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化がＢＴＮに依存するかどうかを調べた。両方の抗体は、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染後のＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞脱顆粒の抑止をもたらし、両方のＢＴＮがＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染時のＶγ９Ｖδ Ｔ細胞活性化に関与することを示す（図７Ｂおよび図７Ｃ）。興味深いことに、抗体処理なしの健康なドナーと比較して、Ｑ熱を有する患者由来のＰＢＭＣの共培養物において、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のより高い脱顆粒の傾向（１０％対３％、ｐ＝０．１７３）が見出された。この脱顆粒はまた、抗ＢＴＮ３Ａ １０３．２および抗ＢＴＮ２Ａ ７．４８アンタゴニスト抗体の存在下で阻害された（図７Ｄおよび図７Ｅ）。まとめると、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ感染は、ＢＴＮ３ＡおよびＢＴＮ２Ａに依存的な様式で、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化をもたらす。
【0262】
次に、本発明者らは、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した細胞に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化が、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体（クローン２０．１）によって増強され得、ｐＡｇ誘導性Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化を模倣すると仮定した。図７Ｆおよび表８に示すように、本発明者らは、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体が、４時間の共培養後、ＣＤ１０７の発現（図７Ｆ）およびＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の細胞傷害活性（図７Ｇ）の増加をもたらすことを観察した。同様の効果が、すべてのＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ株に対して観察され、参照２０．１抗体がより毒性の高い細菌に対してさえもＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の活性化を誘導できることを示唆した。最後に、参照２０．１抗体の使用はまた、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ患者および健康なドナー由来のＰＢＭＣからのＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の脱顆粒を増加させることができた（それぞれ平均２４．１３％および３．２４３％、ｐ＝０．０００２、それぞれｎ＝３）（図７Ｈ）。これらのデータは、ＢＴＮ３Ａ活性化抗体を用いてＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞を標的化することが、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞のエフェクター機能の活性化をもたらすことを示す。
【0263】
【表8】
【0264】
ＢＴＮ３Ａ ２０．１活性化抗体は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の抗菌活性を増加させる
参照ＢＴＮ３Ａ活性化２０．１抗体はＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化を増加させるので、本発明者らは、参照ＢＴＮ３Ａ活性化２０．１抗体がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の抗菌活性をブーストすることができるのではないかと考えた。この目的のために、単球をＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１に２４時間感染させ、次いで、２０．１抗体（０、０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と４時間共培養し、細菌量をフローサイトメトリーおよびｑＰＣＲによって測定した。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の共インキュベーションは、感染した単球およびＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の共培養物におけるＣ．ｂｕｒｎｅｔｔｉ染色に関連するＭＦＩの有意な減少（図８Ａ）および感染した単球およびＶγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の共培養物における５．１０７から６．１０６コピーへの減少（ｐ＝０．００２１）（図８Ｂ）によって示されるように、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ量の有意な減少をもたらした。参照ＢＴＮ３Ａ活性化２０．１抗体は、単球におけるＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ量の用量依存的減少をもたらし、６．１０６から４．２．１０６コピーに達した（それぞれ０対１０μｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０５０１）（図８Ｂ）。全体として、参照ＢＴＮ３Ａ ２０．１活性化抗体は、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の抗菌活性を増加させる。
参照ＢＴＮ３Ａ活性化２０．１抗体はＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞活性化を増加させるので、本発明者らは、参照ＢＴＮ３Ａ活性化２０．１抗体がＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の抗菌活性をブーストすることができるのではないかと考えた。この目的のために、単球をＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１に２４時間感染させ、次いで、２０．１抗体（０、０．１、１または１０μｇ／ｍｌ）の存在下で、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞と４時間共培養し、細菌量をフローサイトメトリーおよびｑＰＣＲによって測定した。Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の共インキュベーションは、感染した単球およびＶγ９Ｖδ２ Ｔ細胞の共培養物におけるＣ．ｂｕｒｎｅｔｔｉ染色に関連するＭＦＩの有意な減少（図８Ａ）および感染した単球およびＶγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の共培養物における５．１０７から６．１０６コピーへの減少（ｐ＝０．００２１）（図８Ｂ）によって示されるように、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ量の有意な減少をもたらした。参照ＢＴＮ３Ａ活性化２０．１抗体は、単球におけるＣ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ量の用量依存的減少をもたらし、６．１０６から４．２．１０６コピーに達した（それぞれ０対１０μｇ／ｍｌ、ｐ＝０．０５０１）（図８Ｂ）。全体として、参照ＢＴＮ３Ａ ２０．１活性化抗体は、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球に対するＶγ９Ｖδ２ Ｔリンパ球の抗菌活性を増加させる。
【0265】
参照ＢＴＮ３Ａ ２０．１抗体は、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞によるサイトカインおよび細胞傷害性分子の分泌を増加させる
ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は細菌量の抑制を可能にするので、本発明者らは、このことが活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞によって強く産生されるサイトカインおよび細胞傷害性分子の分泌に関連し得るかどうかを調べた。実際、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞／Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球の共培養物の参照２０．１抗体による処理は、ＴＦＮ－α、ＩＦＮ－γおよびＧＭ－ＣＳＦの分泌を用量依存的な様式で増加させた（図９Ａ、左パネル）。さらに、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉギアナによる感染の場合、ＩＦＮ－γ、ＴＦＮ－αおよびＧＭ－ＣＳＦ分泌について０．１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ用量間に有意差が観察された（それぞれｐ＝０．０２６０、ｐ＝０．０４４３およびｐ＝０．０２６５）。細胞傷害性分子に関して、グランザイムＢおよびパーフォリンの分泌は、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１およびギナに感染した単球の場合、ならびにまた非感染単球の場合、１０μｇ／ｍｌの２０．１抗体の存在下で有意に高かった（図９Ｂ、右パネル）。全体として、参照２０．１抗体の存在は、活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞によって両方とも産生されるサイトカインおよび細胞傷害性分子の分泌増加を可能にする（表９）。
ＢＴＮ３Ａ活性化抗体は細菌量の抑制を可能にするので、本発明者らは、このことが活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞によって強く産生されるサイトカインおよび細胞傷害性分子の分泌に関連し得るかどうかを調べた。実際、Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞／Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉに感染した単球の共培養物の参照２０．１抗体による処理は、ＴＦＮ－α、ＩＦＮ－γおよびＧＭ－ＣＳＦの分泌を用量依存的な様式で増加させた（図９Ａ、左パネル）。さらに、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉギアナによる感染の場合、ＩＦＮ－γ、ＴＦＮ－αおよびＧＭ－ＣＳＦ分泌について０．１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌ用量間に有意差が観察された（それぞれｐ＝０．０２６０、ｐ＝０．０４４３およびｐ＝０．０２６５）。細胞傷害性分子に関して、グランザイムＢおよびパーフォリンの分泌は、Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ ＮＭ１およびギナに感染した単球の場合、ならびにまた非感染単球の場合、１０μｇ／ｍｌの２０．１抗体の存在下で有意に高かった（図９Ｂ、右パネル）。全体として、参照２０．１抗体の存在は、活性化Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ細胞によって両方とも産生されるサイトカインおよび細胞傷害性分子の分泌増加を可能にする（表９）。
【0266】
【表9】
【0267】
【表10】
参考文献
Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Seidman,J.G.,andStruhl,K.(1988).Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons).
Baldwin,C.L.,andJ.C.Telfer.2015.Mol.Immunol.66:35-47.doi:10.1016/j.molimm.2014.10.024.
Baudino,L.,Shinohara,Y.,Nimmerjahn,F.,Furukawa,J.-I.,Nakata,M.,Martinez-Soria,E.,Petry,F.,Ravetch,J.V.,Nishimura,S.-I.,andIzui,S.(2008).J.Immunol.181,6664-6669.
Bird,R.E.,Hardman,K.D.,Jacobson,J.W.,Johnson,S.,Kaufman,B.M.,Lee,S.M.,Lee,T.,Pope,S.H.,Riordan,G.S.,andWhitlow,M.(1988).Science 242,423-426.
Blazquez,J.-L.,A.Benyamine,C.Pasero,andD.Olive.2018.Front.Immunol.9.doi:10.3389/fimmu.2018.01601.
Bryson,C.J.,Jones,T.D.,andBaker,M.P.(2010).Prediction of Immunogenicity of Therapeutic Proteins.BioDrugs24,1-8.
Chen,S.,H.Feng,H.Xu,S.Huang,J.Sun,L.Zhou,J.He,W.Song,R.Wang,X.Li,andM.Fang.2020.Front.Med.0.doi:10.3389/fmed.2020.567296.
Dong,P.,X.Ju,Y.Yan,S.Zhang,M.Cai,H.Wang,H.Chen,Y.Hu,L.Cui,J.Zhang,andW.He.2018.Front.Immunol.9.doi:10.3389/fimmu.2018.02812.
Goeddel,D.V.(1990).[1]Systems for heterologous gene expression.In Methods in Enzymology,(AcademicPress),pp.3-7.
Harly,C.,Y.Guillaume,S.Nedellec,C.-M.Peigne,H.Monkkonen,J.Monkkonen,J.Li,J.Kuball,E.J.Adams,S.Netzer,J.Dechanet-Merville,A.Leger,T.Herrmann,R.Breathnach,D.Olive,M.Bonneville,andE.Scotet.2012.Blood.120:2269-2279.doi:10.1182/blood-2012-05-430470.
Huston,J.S.,Levinson,D.,Mudgett-Hunter,M.,Tai,M.S.,Novotny,J.,Margolies,M.N.,Ridge,R.J.,Bruccoleri,R.E.,Haber,E.,andCrea,R.(1988).Proc.Natl.Acad.Sci.85,5879-5883.
Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Foeller,C.,Perry,H.M.,andGottesman,K.S.(1992).Sequences of Proteins of Immunological Interest(DIANEPublishing).
Kaufman,R.J.,andSharp,P.A.(1982).Mol.Cell.Biol.2,1304-1319.
Lei,L.,H.Qian,X.Yang,X.Zhang,D.Zhang,T.Dai,R.Guo,L.Shi,Y.Cheng,B.Zhang,X.Zhou,J.Hu,andY.Guo.2020.J.Cell.Mol.Med.24:11603-11606.doi:https://doi.org/10.1111/jcmm.15620.
McCafferty,J.,Griffiths,A.D.,Winter,G.,andChiswell,D.J.(1990).Nature 348,552-554.
Morrison,S.L.(1985).Science229,1202-1207.
Oganesyan,V.,Gao,C.,Shirinian,L.,Wu,H.,andDall’Acqua,W.F.(2008).Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.64,700-704.
Perry,L.C.A.,Jones,T.D.,andBaker,M.P.(2008).Drugs RD 9,385-396.
Poccia,F.,C.Agrati,C.Castilletti,L.Bordi,C.Gioia,D.Horejsh,G.Ippolito,P.K.S.Chan,D.S.C.Hui,J.J.Y.Sung,M.R.Capobianchi,andM.Malkovsky.2006.J.Infect.Dis.193:1244-1249.doi:10.1086/502975.
Poccia,F.,C.Agrati,F.Martini,G.Mejia,M.Wallace,andM.Malkovsky.2005.Immunol.Lett.100:14-20.doi:10.1016/j.imlet.2005.06.025.
Qin,G.,H.Mao,J.Zheng,S.F.Sia,Y.Liu,P.-L.Chan,K.-T.Lam,J.S.M.Peiris,Y.-L.Lau,andW.Tu.2009.J.Infect.Dis.200:858-865.doi:10.1086/605413.
Reddy,M.P.,Kinney,C.A.S.,Chaikin,M.A.,Payne,A.,Fishman-Lobell,J.,Tsui,P.,Monte,P.R.D.,Doyle,M.L.,Brigham-Burke,M.R.,Anderson,D.,etal.(2000).J.Immunol.164,1925-1933.
Remington,J.P.,andGennaro,A.R.(1995).Remington:the science and practice of pharmacy(Easton,PA:MackPublishing).
Rijkers,G.,T.Vervenne,andP.van der Pol.2020.Cell.Mol.Immunol.17:771-772.doi:10.1038/s41423-020-0473-0.
Alegre,M.-L.,Frauwirth,K.A.,andThompson,C.B.(2001).Nat.Rev.Immunol.1,220-228.
Ausubel,F.M.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Seidman,J.G.,andStruhl,K.(1988).Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons).
Baudino,L.,Shinohara,Y.,Nimmerjahn,F.,Furukawa,J.-I.,Nakata,M.,Martinez-Soria,E.,Petry,F.,Ravetch,J.V.,Nishimura,S.-I.,andIzui,S.(2008).J.Immunol.181,6664-6669.
Bensussan,A.,andOlive,D.(2005).T-cell:Section report.Cell.Immunol.236,3-5.
Bird,R.E.,Hardman,K.D.,Jacobson,J.W.,Johnson,S.,Kaufman,B.M.,Lee,S.M.,Lee,T.,Pope,S.H.,Riordan,G.S.,andWhitlow,M.(1988).Science 242,423-426.
Brennan,M.,Davison,P.F.,andPaulus,H.(1985).Science 229,81-83.
Bryson,C.J.,Jones,T.D.,andBaker,M.P.(2010).BioDrugs 24,1-8.
Chapoval,A.I.,Ni,J.,Lau,J.S.,Wilcox,R.A.,Flies,D.B.,Liu,D.,Dong,H.,Sica,G.L.,Zhu,G.,Tamada,K.,etal.(2001).Nat.Immunol.2,269-274.
Collins,M.,Ling,V.,andCarreno,B.M.(2005).Genome Biol.6,223.
Coyle,A.J.,andGutierrez-Ramos,J.C.(2001).Nat.Immunol.2,203-209.
Dong,H.,Zhu,G.,Tamada,K.,andChen,L.(1999).Nat.Med.5,1365-1369.
Freeman,G.J.,Long,A.J.,Iwai,Y.,Bourque,K.,Chernova,T.,Nishimura,H.,Fitz,L.J.,Malenkovich,N.,Okazaki,T.,Byrne,M.C.,etal.(2000).J.Exp.Med.192,1027-1034.
Glennie,M.J.,McBride,H.M.,Worth,A.T.,andStevenson,G.T.(1987).J.Immunol.139,2367-2375.
Goeddel,D.V.(1990).[1]Systems for heterologous gene expression.In Methods in Enzymology,(AcademicPress),pp.3-7.
Gu,S.,Nawrocka,W.,andAdams,E.J.(2015).Front.Immunol.5.
Harly,C.,Guillaume,Y.,Nedellec,S.,Peigne,C.-M.,Monkkonen,H.,Monkkonen,J.,Li,J.,Kuball,J.,Adams,E.J.,Netzer,S.,etal.(2012).Blood 120,2269-2279.
Huston,J.S.,Levinson,D.,Mudgett-Hunter,M.,Tai,M.S.,Novotny,J.,Margolies,M.N.,Ridge,R.J.,Bruccoleri,R.E.,Haber,E.,andCrea,R.(1988).Proc.Natl.Acad.Sci.85,5879-5883.
Kabat,E.A.,Wu,T.T.,Foeller,C.,Perry,H.M.,andGottesman,K.S.(1992).Sequences of Proteins of Immunological Interest(DIANEPublishing).
Karpovsky,B.,Titus,J.A.,Stephany,D.A.,andSegal,D.M.(1984).J.Exp.Med.160,1686-1701.
Kaufman,R.J.,andSharp,P.A.(1982).Mol.Cell.Biol.2,1304-1319.
Khattri,R.,Auger,J.A.,Griffin,M.D.,Sharpe,A.H.,andBluestone,J.A.(1999).J.Immunol.162,5784-5791.
Klocke,K.,Sakaguchi,S.,Holmdahl,R.,andWing,K.(2016).Proc.Natl.Acad.Sci.113,E2383-E2392.
Latchman,Y.,Wood,C.R.,Chernova,T.,Chaudhary,D.,Borde,M.,Chernova,I.,Iwai,Y.,Long,A.J.,Brown,J.A.,Nunes,R.,etal.(2001).Nat.Immunol.2,261-268.
Linsley,P.S.,Greene,J.L.,Tan,P.,Bradshaw,J.,Ledbetter,J.A.,Anasetti,C.,andDamle,N.K.(1992).J.Exp.Med.176,1595-1604.
Liu,M.A.,Kranz,D.M.,Kurnick,J.T.,Boyle,L.A.,Levy,R.,andEisen,H.N.(1985).Proc.Natl.Acad.Sci.82,8648-8652.
McCafferty,J.,Griffiths,A.D.,Winter,G.,andChiswell,D.J.(1990).Nature 348,552-554.
Morrison,S.L.(1985).Science229,1202-1207.
Ni,L.,andDong,C.(2017).Mol.Cancer Ther.16,1203-1211.
Oganesyan,V.,Gao,C.,Shirinian,L.,Wu,H.,andDall’Acqua,W.F.(2008).Acta Crystallogr.D Biol.Crystallogr.64,700-704.
Panowski,S.,Bhakta,S.,Raab,H.,Polakis,P.,andJunutula,J.R.(2013).MAbs 6,34-45.
Paulus,H.(1985).BehringInst.Mitt.118-132.
Perry,L.C.A.,Jones,T.D.,andBaker,M.P.(2008).Drugs RD 9,385-396.
Reddy,M.P.,Kinney,C.A.S.,Chaikin,M.A.,Payne,A.,Fishman-Lobell,J.,Tsui,P.,Monte,P.R.D.,Doyle,M.L.,Brigham-Burke,M.R.,Anderson,D.,etal.(2000).J.Immunol.164,1925-1933.
Remington,J.P.,andGennaro,A.R.(1995).Remington:the science and practice of pharmacy(Easton,PA:MackPublishing).
Rhodes,D.A.,Stammers,M.,Malcherek,G.,Beck,S.,andTrowsdale,J.(2001).Genomics 71,351-362.
Ruddy,D.A.,Kronmal,G.S.,Lee,V.K.,Mintier,G.A.,Quintana,L.,Domingo,R.,Meyer,N.C.,Irrinki,A.,McClelland,E.E.,Fullan,A.,etal.(1997).Genome Res.7,441-456.
Saverino,D.,Tenca,C.,Zarcone,D.,Merlo,A.,Megiovanni,A.M.,Valle,M.T.,Manca,F.,Grossi,C.E.,andCiccone,E.(1999).J.Immunol.162,651-658.
SchneiderT,Jahn H-U,Liesenfeld O,et al.Clin Infect Dis 1997;24:261-4.
Sharpe,A.H.,andFreeman,G.J.(2002).Nat.Rev.Immunol.2,116-126.
Sharpe,A.H.,andPauken,K.E.(2018).Nat.Rev.Immunol.18,153-167.
Shukla,A.A.,Hubbard,B.,Tressel,T.,Guhan,S.,andLow,D.(2007).J.Chromatogr.B 848,28-39.
Stech,M.,Nikolaeva,O.,Thoring,L.,Stocklein,W.F.M.,Wustenhagen,D.A.,Hust,M.,Dubel,S.,andKubick,S.(2017).Sci.Rep.7,12030.
Strohl,W.R.(2009).Curr.Opin.Biotechnol.20,685-691.
Takebe,Y.,Seiki,M.,Fujisawa,J.,Hoy,P.,Yokota,K.,Arai,K.,Yoshida,M.,andArai,N.(1988).Mol.Cell.Biol.8,466-472.
Urlaub,G.,andChasin,L.A.(1980).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77,4216-4220.
Yazdanifar,M.,N.Mashkour,andA.Bertaina.2020.Crit.Rev.Microbiol.46:689-702.doi:10.1080/1040841X.2020.1822279.
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図7G】
【図7H】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【配列表】
【国際調査報告】