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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】乳様生成物の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20241024BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP
C12M 3/02 20060101ALI20241024BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20241024BHJP
C07K 14/50 20060101ALI20241024BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20241024BHJP
A61P 3/02 20060101ALI20241024BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241024BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20241024BHJP
C07K 14/62 20060101ALN20241024BHJP
C07K 14/78 20060101ALN20241024BHJP
C07K 14/79 20060101ALN20241024BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N5/10
C12M3/02
C12Q1/6876 Z
C07K14/50
A61K35/545
A61P3/02
A61P43/00
C07K14/47
C07K14/62
C07K14/78
C07K14/79
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024523889
(86)(22)【出願日】2022-10-27
(85)【翻訳文提出日】2024-06-20
(86)【国際出願番号】 EP2022080118
(87)【国際公開番号】W WO2023073121
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】21205065.2
(32)【優先日】2021-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】590002013
【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100140453
【弁理士】
【氏名又は名称】戸津 洋介
(72)【発明者】
【氏名】マルケス デ リマ， マリア
(72)【発明者】
【氏名】バッハマン， ヴィルジニー
(72)【発明者】
【氏名】マシンチアン， オミッド
(72)【発明者】
【氏名】ビアンキ， アリアナ
(72)【発明者】
【氏名】クラウス， マリン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA21
4B029BB11
4B029CC01
4B029GA08
4B063QA01
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR77
4B063QS25
4B063QS34
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB20
4B065BB23
4B065BC46
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB39
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZC51
4C087ZC80
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA61
4H045CA40
4H045DA37
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
乳腺細胞を製造するための方法、及び哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物を製造するための方法であって、哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）、例えばヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来するラクトサイトを生成することと、哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物をラクトサイトから発現させることとを含む方法。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳腺細胞の集団を製造する方法であって、ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）前記ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、を含む方法。
【請求項2】
前記培養ステップｉ）が、前記ｍｉＰＳＣを、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、三次元懸濁培養系、例えば三次元懸濁条件で培養して、それによって前記ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを、任意選択で少なくとも１２日間行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記培養ステップｉ）が、前記ｍｉＰＳＣを、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、三次元懸濁培養系、例えば三次元懸濁条件で培養して、それによって前記ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを、任意選択で８日間以下行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系中で、例えばマトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間、成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系中で、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項6】
ステップｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、及びｉｉｉ）：ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
ステップｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、及びｉｉｉ）：ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）、及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記乳腺細胞が、ヒト乳腺細胞である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
ＢＭＰ４が、０日目～１０日目の間、好ましくは０日目～３日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｉＰＳＣが初めて前記培養培地に添加される時点である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
ＢＭＰ４が、前記培養培地に３日間添加される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
ＲＡが、１０日目～１５日目の間、任意選択で６日目～１１日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｉＰＳＣが初めて前記培養培地に添加される時点である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ＲＡが、前記培養培地に５日間添加される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
ＢＭＰ４が、５～２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ又は２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記培養培地に添加される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ＲＡが、１μＭの濃度で前記培養培地に添加される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ＥＢが、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から任意に選択される、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおける前記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上が、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意に、ＥＢの少なくとも３５％が、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意に、ＥＢの少なくとも１５％が、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、かつ／又は任意に、ＥＢの少なくとも２０％が、ＥｐＣＡＭ及びＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記ＥＢが、１つ以上の乳汁特異的生物活性マーカー、任意にオステオポンチン（ＯＰＮ）を発現する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記ＥＢが、１つ以上の乳汁特異的生物活性マーカーの発現が増加しており、任意にオステオポンチン（ＯＰＮ）の発現が増加している、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ＥＢが、１つ以上の乳汁特異的生物活性マーカーの分泌が増加しており、任意にオステオポンチン（ＯＰＮ）の分泌が増加している、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記乳腺細胞が、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
分化プロトコルにおける哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を向上させるための、ＢＭＰ４及びＲＡの使用。
【請求項23】
哺乳動物乳様生成物を製造するための方法であって、Ｃ）哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、
Ｄ）前記ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップと、を含み、
ステップＡ）が、ＢＭＰ４及びＲＡを含む培養培地中で前記ｍｉＰＳＣを培養することを含む、方法。
【請求項24】
ステップＡ）が、３０日～４５日のプロセス、任意に４５日未満のプロセス、任意に４４日未満のプロセス、任意に３５日未満のプロセス、任意に３１日未満のプロセスである、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
ヒト乳様生成物を製造するための方法であって、ステップＡ）が更に、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系、例えば、三次元懸濁条件で、少なくとも１２日間培養することによって、前記ｈｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、並びに
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質とＲＡとから構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項26】
ヒト乳代替生成物を製造するための方法であって、ステップＡ）が更に、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系、例えば、三次元懸濁条件で、８日間以下培養することによって、前記ｈｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることと、
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質とＲＡとから構成される混合浮遊ゲル中で、２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成することと、を含む、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項27】
ステップＡ）ｉ）が次のように定義され：ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１もしくはＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で、又はｍＴｅＳＲ（商標）培地中で、２日間インキュベーションすることによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに前記基本培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４、ヘパリン、及びヒドロコルチゾンが添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中でＥＢを１０日間インキュベーションすることによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク質発現の誘導、を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項28】
ステップＡ）ｉ）が次のように定義され：ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１もしくはＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で、又はｍＴｅＳＲ（商標）培地中で、２日間インキュベーションすることによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基本培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４、ヘパリン、及びヒドロコルチゾンが添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中でＥＢを６日間インキュベーションすることによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる乳タンパク質発現の誘導、を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
ステップＡ）ｉ）が次のように定義され：ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で２日間インキュベーションすることによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中でＥＢを１０日間インキュベーションすることによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク質発現の誘導、を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項30】
ステップＡ）ｉ）が次のように定義され：ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で２日間インキュベーションすることによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中でＥＢを６日間インキュベーションすることによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる乳タンパク質発現の誘導、を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項31】
ステップＡ）が、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項２３～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
ステップＡ）が、三次元懸濁培養条件で行われる、請求項２３、２４又は３１に記載の方法。
【請求項33】
請求項２３～３２のいずれか一項に記載の方法によって得ることができるヒト乳様生成物。
【請求項34】
治療に使用するための、請求項３３に記載のヒト乳様生成物。
【請求項35】
請求項３３に記載のヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物としての、任意選択で母乳代替物としての、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、乳腺細胞の生産方法に関する。本発明はまた、哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物をインビトロで製造するための方法であって、哺乳動物人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、例えばヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来するラクトサイトを、培養及び分化によって生成すること、及び／又はかかるラクトサイトを含む乳腺様腺オルガノイドを生成すること、並びに哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物をかかるラクトサイト及び／又は乳腺様腺オルガノイドから発現させること、を含む方法に関する。本発明はまた、哺乳動物乳様生成物、例えば、かかる方法から得ることができるヒト乳様生成物に関する。
【0002】
［背景技術］
哺乳動物の乳、特にヒトの乳は、多数の成分を含む複雑な体液であり、その成分のそれぞれは、乳児及びおそらく母体の健康に実質的に寄与し得る。少なくとも６ヶ月齢まではヒト母乳が最も適切な栄養源であることが明らかになってきている。ヒト乳の多くの成分は、乳児用フォーミュラの製造の基礎となる牛乳中には全く見られないか、ほとんど見られないか、又は活性が低い。このような成分には、例えばタンパク質ラクトフェリン、成長／成長因子、長鎖多価不飽和脂肪酸又はオリゴ糖が含まれる。ヒト乳組成物は、現在の乳児用フォーミュラを開発するためのゴールドスタンダードとして使用されているが、乳児用フォーミュラ組成物における最近の主要な開発にもかかわらず、現在の製造プロセスでヒト乳の複製物が達成されると考えることは非現実的である。
哺乳動物の乳、特にヒトの乳は、多数の成分を含む複雑な体液であり、その成分のそれぞれは、乳児及びおそらく母体の健康に実質的に寄与し得る。少なくとも６ヶ月齢まではヒト母乳が最も適切な栄養源であることが明らかになってきている。ヒト乳の多くの成分は、乳児用フォーミュラの製造の基礎となる牛乳中には全く見られないか、ほとんど見られないか、又は活性が低い。このような成分には、例えばタンパク質ラクトフェリン、成長／成長因子、長鎖多価不飽和脂肪酸又はオリゴ糖が含まれる。ヒト乳組成物は、現在の乳児用フォーミュラを開発するためのゴールドスタンダードとして使用されているが、乳児用フォーミュラ組成物における最近の主要な開発にもかかわらず、現在の製造プロセスでヒト乳の複製物が達成されると考えることは非現実的である。
【0003】
今日、ヒト乳の唯一の供給源は、ヒトドナー（授乳中の母親）である。献乳は、非商業的使用（ヒト乳バイオバンク）及び商業的使用について報告されている。しかしながら、献乳は限られており、強い規制、安全性からの制約、及び時には倫理的又は宗教的制約を伴う。
【0004】
哺乳動物の乳、特にヒト乳中には幹細胞が見出されており、ヒト母乳幹細胞（ＨＢｓＣ）と呼ばれている。ｈＢＳＣは、高度に可塑性であり、培養において複数の細胞種へと分化し、より重要なことには、ヒト乳腺の小葉－腺房（ｌｏｂｕｌｏ－ａｌｖｅｏｌａｒ）構造を形成するのに必要な３つの系統へと分化することが示されている（Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２）。しかしながら、ヒト母乳を生産させるためのｈＢＳＣの使用は、ヒトドナーを必要とするため、実用的でもなく、持続可能でもない。
【0005】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれる、幹細胞機能を有する細胞株をベースとした技術が知られている。ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）からヒト乳腺様オルガノイド（ｍａｍｍａｒｙ ｌｉｋｅ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ）を生成するための信頼できる２ステッププロトコルが開発されている（Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｖｏｌ ８，２０５－２１５，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４ｔｈ，２０１７）。
【0006】
したがって、本発明の目的は、乳腺細胞を生産するための改善された方法を提供すること、及び培養細胞において哺乳動物乳（例えば、ヒト乳）の発現を再現することである。また、本発明の目的は、レシピエントの特定のニーズに適合させることができる培養細胞において、カスタマイズされた哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物を調製すること、及び／又は乳幼児期栄養のための既存のウシベースの溶液を補完するためにヒト乳生物活性物質を製造することである。
【0007】
［発明の概要］
本発明は、上記の技術的課題を解決する。
本明細書で提供されるのは、乳腺細胞集団を製造する方法であって、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、を含む方法である。
本発明は、上記の技術的課題を解決する。
本明細書で提供されるのは、乳腺細胞集団を製造する方法であって、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、を含む方法である。
【0008】
分化プロトコルにおける哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を向上させるための、ＢＭＰ４及びＲＡの使用も、本明細書において提供される。
【0009】
本明細書において更に提供されるのは、哺乳動物乳様生成物を製造する方法であって、
Ａ）哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、
Ｂ）哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）に由来する該ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップと、を含み、
ステップＡ）が、ＢＭＰ４及びＲＡを含む培養培地中で該ｍｉＰＳＣを培養することを含む、方法である。
Ａ）哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）に由来するラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、
Ｂ）哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）に由来する該ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップと、を含み、
ステップＡ）が、ＢＭＰ４及びＲＡを含む培養培地中で該ｍｉＰＳＣを培養することを含む、方法である。
【0010】
本明細書で更に提供されるのは、本明細書中に記載の方法に従って得ることができるヒト乳様生成物である。
【0011】
治療における使用のための、本明細書中に記載のヒト乳様生成物も、本明細書において更に提供される。
【0012】
最後に、本明細書中に記載のヒト母乳様生成物の、ヒト乳代替物、必要に応じて母乳代替物としての、使用が本明細書中に提供される。
【0013】
［発明を実施するための形態］
定義
本発明の文脈において、「インビトロ」という用語は、試験管、培養皿、バイオリアクター又は生きている生物の体外の任意の場所で行われるか又は生じることを意味する。
定義
本発明の文脈において、「インビトロ」という用語は、試験管、培養皿、バイオリアクター又は生きている生物の体外の任意の場所で行われるか又は生じることを意味する。
【0014】
本発明の文脈において、「哺乳動物」という用語は、哺乳動物種、例えばヒト、ウシ、サル、ラクダ、ヒツジ、ヤギなどに属する動物を指す。
【0015】
本発明の文脈において、用語「ラクトサイト」又は「乳腺様細胞」は、ＣＫ１８細胞マーカーを発現し、かつ哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）、特にヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する、分泌上皮細胞を特定する。本明細書で使用されるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、市販されており、任意の適切なｈｉＰＳＣ株から選択することができる。本発明の文脈における好適なヒト人工多能性幹細胞株は、例えば、本発明に従って使用される、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から市販されているｈｉＰＳＣ株６０３である。更に適切なｈｉＰＳＣは、例えば、Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１７，ｓｕｐｒａ）に記載されているように選択することができる。本発明の一実施形態では、ｈｉＰＳＣは、改変を受けていない（ｎｏｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。一実施形態では、ｈｉＰＳＣは、外因性核酸及び／又は外因性核酸を含む誘導性遺伝子発現系を含むように改変されていない。ここでいう誘導性遺伝子発現系は、ホルモン又はシグナル伝達因子を発現するように構成されている。一実施形態では、外因性核酸及び／又は外因性核酸を含む誘導性遺伝子発現系は、ラクトサイトへの細胞分化を促進する。
【0016】
本発明の文脈において、「乳腺様（ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｌｉｋｅ）オルガノイド」又は「乳腺様（ｍａｍｍａｒｙ ｌｉｋｅ）オルガノイド」という用語は、二次元又は三次元（２Ｄ／３Ｄ）で発達し、上記で定義されたようなラクトサイトを含む、乳腺のミニチュア化及び単純化されたバージョンを意味する。
【0017】
本発明の文脈において、「ヒト乳様生成物」という用語は、細胞培養した乳生成物である。かかる生成物は、本発明の方法に従って生成されたラクトサイト及び／又は乳腺様オルガノイドによって発現される食用生成物である。
【0018】
本発明による「ヒト乳様生成物」は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳と同じ成分（例えば、生物活性物質、多量栄養素及び微量栄養素並びにそれらのレベルの観点による）を有することができる。これを本明細書では「標準ヒト乳生成物」と称する。あるいは、本発明による「ヒト乳様生成物」は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然に見出される成分の比率及び濃度に変化のあるものであり得る。これを本明細書では「非標準乳様生成物」と称する。本発明による「ヒト乳様生成物」は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然には見出されない成分を含むように調整することができる（「調整（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）乳様生成物」）。ヒト乳様生成物の非限定的な例は、サプリメント、強化剤、ヒト母乳代替物（又は代用物）、ならびに生物活性物質の１つのみ及び／又は一部に富んだ原材料、栄養状態の良好な母親のヒト母乳に典型的に見出すことができる多量栄養素及び微量栄養素からなる群から選択される。
【0019】
「ヒト乳様生成物」は、自然に分泌される乳を摂取する代わりとして使用することができる（「ヒト乳代替物」）。乳代替生成物は、天然に分泌された乳と組み合わせて摂取されるサプリメント（「ヒト乳サプリメント」）又は強化剤（「ヒト乳強化剤」）として使用することができる。
【0020】
一実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物は、少なくとも、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に典型的に見出すことができる多量栄養素及び微量栄養素を含む。一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、タンパク質、ペプチド、脂質（リノール酸及びα－リノレン酸を含む）、炭水化物、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸、葉酸、ビタミンＣ及びビオチンを含む）、ミネラル（鉄、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、マンガン、ヨウ素、セレン、銅及び亜鉛を含む）、コリン、ミオイノシトール及びＬ－カルニチンを含む。一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡからなる群から選択される、少なくとも１つの生物活性物質も含む。本発明による標準ヒト乳様生成物は、天然に生じるヒト母乳分泌物ではない。
【0021】
別の実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、かかる製品を摂取する乳児の具体的なニーズに適合させることができる。本発明によるヒト乳様生成物は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に典型的に見出され得る、生物活性物質、多量栄養素及び微量栄養素のうちの１つのみ及び／又は一部を含み得る。かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、「非標準ヒト乳様生成物」という用語で称されることもある。一実施形態では、本発明による非標準ヒト乳様生成物は、タンパク質、ペプチド、脂質（リノール酸及びα－リノレン酸を含む）、炭水化物（ヒト乳オリゴ糖を含む）、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸、葉酸、ビタミンＣ及びビオチンを含む）、ミネラル（鉄、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、マンガン、ヨウ素、セレン、銅及び亜鉛を含む）、コリン、ミオイノシトール、Ｌ－カルニチン、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡからなる群から選択される、１つ以上の栄養素又は生物活性物質を含む。
【0022】
本発明の文脈において、「無調整ヒト乳様生成物」という用語は、ラクトサイトによって、及び／又は本発明の方法のステップＡ）及びステップＢ）に従って生成された乳腺様オルガノイドによって発現され、本発明の方法の任意のステップＣ）によるさらなる処理に供されていない、ヒト乳様生成物を示す。無調整ヒト乳様生成物は、標準及び非標準ヒト乳様生成物の両方を含み得る。非標準ヒト乳様生成物の非限定的な例は、サプリメント、強化剤、ならびに栄養状態の良好な母親のヒト母乳に典型的に見出され得る、生物活性物質、多量栄養素及び微量栄養素のうちの１つのみ及び／又は一部に富んだ原材料からなる群から選択される。
【0023】
本発明の文脈において、「調整ヒト乳様生成物」という用語は、ラクトサイトによって、及び／又は本発明の方法のステップＡ）及びステップＢ）に従って生成された乳腺様オルガノイドによって発現され、本発明の方法の任意のステップＣ）によるさらなる処理に供される、ヒト乳様生成物を示す。
【0024】
調整ヒト乳様生成物は、標準及び非標準ヒト乳様生成物の両方を含み得る。
【0025】
本発明の文脈において、「ＥＢ」という用語は、「胚様体」を意味する。
【0026】
本発明の文脈において、「ｍＥＢ」という用語は、「ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地で培養された胚様体」を意味する。
【0027】
ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地は、基礎培地、少なくとも１種類の増殖サプリメント、ヘパリン及びヒドロコルチゾンを含む、無血清培養培地を指す。
【0028】
本発明の文脈において、「胚様体（ｅＢＳ）」、「ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地で培養された胚様体（ｍＥＢｓ）」、「マンモスフェア」及び／又は「スフェロイド」という用語は、本発明の方法のステップＡ）下で多能性幹細胞（ＰＳＣ）によって懸濁液中に形成された三次元凝集体を指す。
【0029】
本発明の文脈における「乳児」という用語は、１２ヶ月齢未満、例えば９ヶ月齢未満、特に６ヶ月齢未満の小児を指す。
【0030】
本発明の文脈において、乳児は、正期産児又は早期産児のいずれかであり得る。本発明の一実施形態では、乳児は、早期産児及び正期産児の群から選択される。
【0031】
用語「正期産児」は、正期産又は３７週以上の在胎齢で生まれた乳児を指す。
【0032】
用語「早期産児」は、３７週未満の在胎齢で生まれた乳児を指す。
【0033】
本発明の文脈において、「出生時体重」という用語は、出生後に胎児又は新生児が獲得していた最初の体重を意味する。
【0034】
本発明の文脈において、「低出生体重」という用語は、２５００ｇ未満（２４９９ｇ以下）の出生時体重を意味する。
【0035】
本発明の文脈において、「極低出生時体重」という用語は、１５００ｇ未満（１４９９ｇ以下）の出生時体重を意味する。
【0036】
本発明の文脈において、「超低出生時体重」という用語は、１０００ｇ未満（９９９ｇ以下）の出生時体重を意味する。
【0037】
用語「在胎不当過小児」は、在胎期間別成長チャート（ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｒｔ）の出生時体重に対する平均基準よりも２標準偏差を超えて低い出生時体重を有する乳児、又は同じ在胎齢の乳児から得られた集団ベースの体重データの１０ｔｈパーセンタイル未満の出生時体重を有する乳児を指す。「在胎不当過小児」という用語には、構造的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）もしくは遺伝的起源のいずれかから、又は子宮内発育遅延の結果として、出生時に小さい乳児が含まれる。
【0038】
本発明の文脈において、「幼児（ｙｏｕｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ）」又は「低年齢の小児（ｔｏｄｄｌｅｒ）」という用語は、１～３歳の小児を示す。
【0039】
本明細書で使用される「乳児用フォーミュラ」という用語は、乳児を対象とし、Ｃｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、（Ｃｏｄｅｘ ＳＴＡＮ ７２－１９８１）、及びＣｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、（Ｃｏｄｅｘ ＳＴＡＮ ７２－１９８１）に定義されている乳児用特別用途食品（特別医療目的用食品を含む）に定義されている栄養組成物を指す。乳児用フォーミュラはまた、出生後１ケ月の間の乳児の特定の栄養補給用途を意図する食品であって、当該フォーミュラそのものによって、このカテゴリーに該当する乳児の栄養要件（乳児用フォーミュラ及びフォローオンフォーミュラに対する、Ａｒｔｉｃｌｅ ２（ｃ）ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ９１／３２１／ＥＥＣ ２００６／１４１／ＥＣ ｏｆ ２２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００６）を満たす、食品を指す。乳児用フォーミュラは、スターター乳児用フォーミュラ及びフォローアップフォーミュラ又はフォローオンフォーミュラを包含する。一般に、スターターフォーミュラは、出生時からの乳児のための母乳代替物であり、フォローアップフォーミュラ又はフォローオンフォーミュラは６ヶ月以降である。
【0040】
「グローイングアップミルク」（又はＧＵＭ）は、１年目以降から与えられる。このミルクは、概して、特に小児の栄養必要量に合わせて調整された乳系飲料である。かかる飲料は、他の食品と組み合わせて１２ヶ月から２～３歳の小児に与えるために使用される栄養組成物である。
【0041】
本発明の文脈において、「強化剤」という用語は、乳児又は幼児に対して栄養上の利益を有する１つ以上の栄養素を含む組成物を指す。
【0042】
「乳強化剤」という用語は、ヒト母乳、乳児用フォーミュラ、グローイングアップミルク、又は他の栄養素で強化されたヒト母乳の、いずれかを強化又は補充するために使用される任意の組成物を意味する。したがって、本発明のヒト乳強化剤は、ヒト母乳、乳児用フォーミュラ、グローイングアップミルク、又は他の栄養素で強化されたヒト母乳に溶解させた後に投与することができ、あるいは独立した組成物として投与することができる。
【0043】
独立した組成物として投与される場合、本発明のヒト乳強化剤は、「サプリメント」であると特定することもできる。一実施形態では、本発明の乳強化剤はサプリメントである。
【0044】
「ヒト乳強化剤」という用語は、ヒト母乳、又は他の栄養素で強化されたヒト母乳を強化又は補充するために使用される任意の組成物を意味する。本発明による「ヒト乳強化剤」は、極低出生時体重（ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ、ＶＬＢＷ）又は超低出生時体重（ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ、ＥＬＢＷ）を有する早産で生まれた乳児に投与されることが意図され得る。
【0045】
本発明による乳強化剤は、液体形態の粉末であってもよい。
【0046】
液体形態を有する乳強化剤組成物は、いくつかの特定の利点を示す。例えば、液体製剤は、特定の重量又は体積の較正された液滴を送達する包装と組み合わせられる場合、より便利であり得る。
【0047】
更に、液体製剤は強化される組成物と混合するのがより容易であるが、粉末製剤は場合によっては塊を形成することがある。
【0048】
本発明の文脈において、「哺乳類人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率及び成熟を向上させる」という用語は、分化プロトコルを経てｍｉＰＳＣの出発集団から生成された非乳腺前駆細胞と比較して乳腺前駆細胞の割合を増加させることを意味する。本発明において、該分化プロトコルは、ＢＭＰ４及びＲＡの使用を含む。したがって、乳腺前駆細胞の割合の該増加は、ＢＭＰ４及びＲＡの使用を含まないが他の点では同じである分化プロトコルを経たｈｉＰＳＣの出発集団から生成された、非乳腺前駆細胞に対する乳腺前駆細胞の割合と比較され得る。
【0049】
本発明の文脈において、「生存率を向上させる」という用語は、生きていて健康である細胞の数を増加させることを意味する。該細胞には、更なる分化ステップが可能であり、例えば、本発明の文脈において、乳腺オルガノイドへと分化することが可能である。
【0050】
本発明の文脈において、用語「乳腺前駆細胞」又は類似の用語は、少なくとも２つの乳腺前駆体マーカーを発現する細胞を意味する。該マーカーとしては、ＣＤ４９ｆ、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３が挙げられるが、これらに限定されない。逆に、本発明の文脈において、用語「非乳腺前駆細胞」又は類似のものは、乳腺前駆体マーカーのうち少なくとも２つを発現しない細胞を意味する。
【0051】
本明細書におけるＥｐｉＣｕｌｔ培地又はＥｐｉＣｕｌｔＢ培地への言及は、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを含む無血清培養培地を指す。
【0052】
本明細書中に開示される培養培地は、微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）の成長及び分化を支援するように設計された、必須栄養素を含む固体、半固体又は液体を指す。ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地は、本発明において使用され得る培養培地の一例である。
【0053】
本発明による方法及び使用
本発明は、特定の条件下で培養及び分化させたｉＰＳＣを使用して乳腺細胞を製造する方法、並びに哺乳動物乳様生成物をインビトロで製造するための方法において該乳腺細胞を使用する方法に関する。
本発明は、特定の条件下で培養及び分化させたｉＰＳＣを使用して乳腺細胞を製造する方法、並びに哺乳動物乳様生成物をインビトロで製造するための方法において該乳腺細胞を使用する方法に関する。
【0054】
驚くべきことに、本明細書中に記載される方法における骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）の添加は、分化プロトコルの有効性を増加させ、最終乳様生成物の収率及び質を改善することが本発明において実証された。より具体的には、ＢＭＰ４及びＲＡは、ｉＰＳＣの乳腺前駆細胞への分化効率を向上させ、したがって、本明細書中に記載の方法によって製造される乳腺前駆細胞の数を増加させることが実証されている。この利点には、乳腺細胞のより高い収率が含まれる。ＢＭＰ４及びＲＡは、オステオポンチン（ＯＰＮ）などの乳特異的生物活性マーカーの発現及び分泌レベルを改善することが実証されている。ＢＭＰ４及びＲＡの組合せによる分化効率の向上のために、全体的な分化プロトコルの長さを短縮することができることも実証されている。この短縮は、細胞死の減少、乳様物質のより高い収率、及び費用節約を含む有意な利点を有する。
【0055】
哺乳動物乳腺細胞の製造
一態様において、本発明は、特定の条件下で培養及び分化させたｉＰＳＣを使用して乳腺細胞を製造する方法に関する。
一態様において、本発明は、特定の条件下で培養及び分化させたｉＰＳＣを使用して乳腺細胞を製造する方法に関する。
【0056】
したがって、本発明は、乳腺細胞の集団を製造する方法であって、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成させるステップと、
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成させるステップと、を含む方法である。
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成させるステップと、
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成させるステップと、を含む方法である。
【0057】
本発明はまた、分化プロトコルにおける哺乳類人工多能性幹細胞（ｍｈｉＰＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を向上させるためのＢＭＰ４及びＲＡの使用を提供する。いくつかの実施形態では、本発明はまた、哺乳動物乳様生成物の製造効率を向上させるための、ＢＭＰ４及びＲＡの使用を提供する。
【0058】
いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ヒト乳腺細胞である。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する。該ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドは、乳分泌性である、すなわち、乳汁を生産することができる。
【0059】
ＢＭＰ４は、本明細書中に記載される分化方法の初期段階において培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～１０日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～６日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に培養培地に添加される。０日目は、ｉＰＳＣが初めて培養培地に添加される時点、すなわち、ｉＰＳＣが初めて分化を誘導される時点である。
【0060】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、培養培地に３日間添加される。
【0061】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。
【0062】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目から３日目に、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。
【0063】
ＲＡは、本明細書中に記載される分化方法の初期段階において培養条件に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、乳腺系統の運命決定（ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）段階の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、１０日目～１５日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、６日目～１１日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、１１日目以降に培養培地に添加されない。いくつかの実施形態では、ＲＡは、１１日目の前に培養培地に添加される。０日目は、ｉＰＳＣが初めて培養培地に添加される時点、すなわち、ｉＰＳＣが初めて分化誘導される時点である。
【0064】
いくつかの実施形態では、ＲＡは、培養培地に５日間添加される。
【0065】
いくつかの実施形態では、ＲＡは、１ｕＭの濃度で培養培地に添加される。
【0066】
いくつかの実施形態では、ＲＡは、１０日目～１５日目の間に、１μＭの間の濃度で培養条件に添加される。
【0067】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に培養培地に添加され、ＲＡは、１０日目～１５日目の間に培養培地に添加される。
【0068】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に培養培地に添加され、ＲＡは、６日目～１１日目の間に培養培地に添加される。
【0069】
本明細書中に記載される方法において生成されるＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、該１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される。
【0070】
いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける該乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している。
【0071】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上は、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上は、２つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態は、該乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される。
【0072】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも３５％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも６０％は、中間分化の段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも３５％は、誘導前の段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態、ＥＢの少なくとも１５％は、誘導後の段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも４０％は、誘導後の段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0073】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、中間分化の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、誘導前の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも５％は、誘導後の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、誘導後の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0074】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、ＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも５０％は、中間分化の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２５％は、誘導前の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％が、誘導後の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも４０％は、誘導後の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0075】
いくつかの実施形態では、中間分化の段階は２５日目であり、誘導前の段階は３５日目であり、誘導後の段階は４２日目である。いくつかの実施形態では、中間分化の段階は２０日目の間である。誘導前の段階は２６日目であり、誘導後の段階は３１日目である。
【0076】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳汁特異的生物活性マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、該乳汁特異的生物活性マーカーはオステオポンチン（ＯＰＮ）である。
【0077】
いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳汁特異的生物活性マーカーの発現は、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおける該マーカーの発現レベルと比較して、増加している。いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳汁特異的生物活性マーカーの分泌は、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおける該マーカーの発現レベルと比較して、増加している。いくつかの実施形態では、ＥＢのＯＰＮの分泌は、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおけるＯＰＮの発現レベルと比較して、増加している。いくつかの実施形態では、ＥＢのＯＰＮの分泌は、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおけるＯＰＮの発現レベルと比較して、４０％以上増加している。
【0078】
本明細書中に記載されるような乳腺細胞の集団を製造する方法は、本明細書中に記載されるような哺乳動物乳様生成物を製造するための方法において、特に本明細書中に記載されるようなステップＡ）の一部として、組み合わせられてもよく、及び／又は利用されてもよい。
【0079】
例えば、本明細書中に記載される乳腺細胞の集団を製造する方法のいくつかの実施形態では、培養ステップｉ）は、ｍｉＰＳＣを、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、三次元懸濁培養系、例えば、三次元懸濁条件で培養して、それによって、ｉＰＳＣの非神経外胚葉細胞への分化を誘導すること、を含む。いくつかの実施形態では、ステップＡｉ）は、少なくとも１２日間である。いくつかの実施形態では、ステップＡｉ）は、８日間以下である。
【0080】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される乳腺細胞の集団を製造する方法のいくつかの実施形態では、成長ステップｉｉは、ＲＡを含む三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中でＥＢを成長させることを含む。いくつかの実施形態では、ステップＡｉｉ）は、少なくとも３０日間、例えば３２日間である。いくつかの実施形態では、ステップＡｉｉ）は、少なくとも２３日間、例えば２５日間以下である。
【0081】
哺乳動物乳様生成物の製造
別の態様では、本発明は、本明細書で定義されるステップＡ）及びＢ）のいずれか、並びに本明細書で定義される任意のステップＣ）を含む、本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物を製造するための方法に関する。本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物を製造するための該方法は、ステップＡ）の一部として、哺乳動物乳腺細胞を製造する方法も含み得る。特に、ＢＭＰ４及びＲＡは、特にステップＡ）の一部として、本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物を製造するための方法のいずれかに添加され得る。該方法はまた、哺乳動物乳様生成物を製造するための異なる長さの時間を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書で定義されるステップＡ）及びＢ）のいずれか、並びに本明細書で定義される任意のステップＣ）を含む、本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物を製造するための方法に関する。本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物を製造するための該方法は、ステップＡ）の一部として、哺乳動物乳腺細胞を製造する方法も含み得る。特に、ＢＭＰ４及びＲＡは、特にステップＡ）の一部として、本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物を製造するための方法のいずれかに添加され得る。該方法はまた、哺乳動物乳様生成物を製造するための異なる長さの時間を含む。
【0082】
ステップＡ－ｈｉＰＳＣからのラクトサイト及び／又は乳腺様オルガノイドの生成
本発明の方法によれば、乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、ステップＡ）下で生成される。
本発明の方法によれば、乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、ステップＡ）下で生成される。
【0083】
かかる乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、ｉＰＳＣを利用する任意の報告された方法に従って作製することができる。
【0084】
一実施形態では、このような乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．８，２０５－２１５（その全体が本明細書に組み込まれる）に記載の手順に従って作製することができる。
【0085】
より正確には、上記の科学刊行物（以下、「Ｙｉｎｇ Ｑｕの刊行物」又はＹｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）とも称する）に記載されている方法論は、ｉＰＳＣからヒト乳腺様細胞及び／又はオルガノイドを作製するための２ステッププロトコルを表す。
【0086】
そのプロトコルは、好ましくは、第１のステップ（ステップ１）として、ｉＰＳＣからの非神経外胚葉細胞含有スフェア（ｍＥＢｓ／マンモスフェア）の分化及び富化、並びに第２のステップ（ステップ２）として、マトリゲル及びコラーゲンＩの三次元浮遊混合ゲル培養を使用した１０日目のｍＥＢｓ（マンモスフェア）からの乳腺様オルガノイドの生成、を含む。
【0087】
より具体的には、ステップＡは、好ましくは、
胚様体の形成、
乳腺系統運命決定、
分枝及び腺房分化、及び
乳生物活性物質の誘導、を含む。
胚様体の形成、
乳腺系統運命決定、
分枝及び腺房分化、及び
乳生物活性物質の誘導、を含む。
【0088】
これらの各段階は、特定の培養培地を用いて、特定の時間にわたって行われ得る。
【0089】
いくつかの実施形態では、ステップＡは、合計４０～４５日間、好ましくは４２日間行われる。
【0090】
いくつかの実施形態では、ステップＡは短縮され、４２日未満、任意選択で４０日未満、任意選択で３１日未満行われる。好ましくは、ステップＡは、３１日間行われる。
【0091】
いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は０日目～１０日目の間である。いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は１０日間である。
【0092】
いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は短縮され、０日目～６日目の間である。いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は６日間である。いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は１０日間以下である。
【0093】
いくつかの実施形態では、乳腺系統運命決定段階は、１０日目～１５日目の間である。いくつかの実施形態では、乳腺系統運命決定段階は、６日目～１１日目の間である。いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は５日間である。いくつかの実施形態では、胚様体形成段階は５日間以下である。
【0094】
いくつかの実施形態では、分枝及び腺房分化段階は、１５日目～３５日目の間である。いくつかの実施形態では、分枝及び腺房分化段階は、２０日間である。
【0095】
いくつかの実施形態では、分枝及び腺房分化段階は短縮され、１１日目～２６日目の間である。いくつかの実施形態では、分枝及び腺房分化段階は１５日間である。いくつかの実施形態では、分枝及び腺房分化段階は、１５日間以下である。
【0096】
いくつかの実施形態では、乳生物活性物質誘導段階は、３５日目～４２日目の間である。いくつかの実施形態では、乳生物活性物質誘導段階は７日間である。
【0097】
いくつかの実施形態では、乳生物活性物質誘導段階は短縮され、２６日目～３１日目の間である。いくつかの実施形態では、乳生物活性物質誘導段階は５日間である。いくつかの実施形態では、乳生物活性物質誘導段階は、５日間以下である。
【0098】
したがって、いくつかの実施形態では、ステップＡは合計４２日間行われ、ここで、胚様体形成段階は０日目～１０日目の間であり、乳腺系統の運命決定段階は１０日目～１５日目の間であり、分枝及び腺房分化段階は１５日目～３５日目の間であり、乳生物活性物質誘導段階は３５日目～４２日目の間である。
【0099】
他の実施形態では、ステップＡが合計３１日間行われ、ここで、胚様体形成段階が０日目～６日目の間であり、乳腺系統の運命決定段階が６日目～１１日目の間であり、分枝及び腺房分化段階が１１日目～２６日目の間であり、乳生物活性誘導段階が２６日目～３１日目の間であるように、プロセスが短縮される。
【0100】
本明細書中に記載される方法における使用のための期間及び培養培地の更なる詳細は、以下に提供される。
【0101】
ステップ１では、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でｈｉＰＳＣを培養することによって、ｈｉＰＳＣからの非神経外胚葉細胞含有スフェア（ｍＥＢｓ／マンモスフェア）の分化及び富化を行う。完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地は、好ましくは、基礎培地、増殖サプリメント、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）、及びヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）から構成される。培地は通常３日毎に交換される。次いで、前記ステップで得られたｍＥＢ（マンモスフェア）を非神経外胚葉細胞について富化する。
【0102】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、ステップ１において培養培地に添加される。
【0103】
ＢＭＰ４は、本明細書中に記載されるように、培養培地に添加される。
【0104】
ＢＭＰ４は、本明細書中に記載されるように、分化方法の初期段階において培養条件に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～１０日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～６日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に培養培地に添加される。０日目は、ｉＰＳＣが培養培地に初めて添加される時点、すなわち、ｉＰＳＣが初めて分化誘導される時点である。
【0105】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、培養培地に３日間添加される。
【0106】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。
【0107】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。
【0108】
ステップ２では、Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７）のプロトコルに従って、浮遊混合ゲル（例えば、マトリゲル及びコラーゲンＩ）に基づいて三次元培養物を最初に調製して、乳腺様オルガノイドを作製する。次に、１０日目のｍＥＢ（マンモスフェア）を、上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させた混合ゲル中で５日間成長させる。次いで、乳腺様オルガノイド／ラクトサイトの調製のための分枝及び腺房分化の誘導のために、細胞を、ヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で培養する。乳タンパク質発現は、典型的には３５日目に、ＢＳＡ（乳分泌培地）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地にプロラクチン、ヒドロコルチゾン及びインスリンを添加して５日間培養することによって誘導される。Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７年）のプロセスは、典型的には４０日目に完了する。
【0109】
いくつかの実施形態では、ＲＡは、ステップ２において培養培地に添加される。
【0110】
ＲＡは、本明細書中に記載されるように、培養培地に添加される。
【0111】
ＲＡは、本明細書中に記載される分化方法の初期段階において培養条件に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、乳腺系統の運命決定段階の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、１０日目～１５日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、６日目～１１日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＡは、１１日目以降に培養培地に添加されない。０日目は、ｉＰＳＣが培養培地に初めて添加される時点、すなわち、ｉＰＳＣが分化のために初めて誘導される時点である。
【0112】
いくつかの実施形態では、ＲＡは、培養培地に５日間添加される。
【0113】
いくつかの実施形態では、ＲＡは、１μＭの濃度で培養培地に添加される。
【0114】
いくつかの実施形態では、ＲＡは、１０日目～１５日目の間に、１μＭの間の濃度で培養培地に添加される。
【0115】
本発明の一実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造するための方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中でｉＰＳＣを培養することによって、ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、及び、１０日後に、該細胞から形成されたマンモスフェアを回収すること、並びに、
ｉｉ）本明細書中に記載されているＲＡを含む適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）において、かかるマンモスフェアを少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む。
ｉ）本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中でｉＰＳＣを培養することによって、ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、及び、１０日後に、該細胞から形成されたマンモスフェアを回収すること、並びに、
ｉｉ）本明細書中に記載されているＲＡを含む適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）において、かかるマンモスフェアを少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む。
【0116】
本発明の一実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造するための方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中でｉＰＳＣを培養することによって、ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、及び、本明細書中に記載のＢＭＰ４６日後に、形成されたマンモスフェアを回収すること、並びに、
ｉｉ）本明細書中に記載されているＲＡを含む適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）において、かかるマンモスフェアを１０日間未満成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む。
ｉ）適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中でｉＰＳＣを培養することによって、ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、及び、本明細書中に記載のＢＭＰ４６日後に、形成されたマンモスフェアを回収すること、並びに、
ｉｉ）本明細書中に記載されているＲＡを含む適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）において、かかるマンモスフェアを１０日間未満成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む。
【0117】
別の実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造するための方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中で、マンモスフェア形成のための非接着条件においてｉＰＳＣを培養することによって、ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、並びに、
ｉｉ）本明細書中のいずれかに記載されるＲＡを含む三次元の適切な系（例えば、マトリゲル及び／もしくはコラーゲンなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル、又は非接着性プレート中の懸濁培養物）中で、かかるマンモスフェアを少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む。
ｉ）本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中で、マンモスフェア形成のための非接着条件においてｉＰＳＣを培養することによって、ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、並びに、
ｉｉ）本明細書中のいずれかに記載されるＲＡを含む三次元の適切な系（例えば、マトリゲル及び／もしくはコラーゲンなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル、又は非接着性プレート中の懸濁培養物）中で、かかるマンモスフェアを少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む。
【0118】
別の実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造するための方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中で、マンモスフェア形成のための非接着条件においてｉＰＳＣを培養することによって、ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、並びに、
ｉｉ）本明細書中のいずれかに記載されるＲＡを含む三次元の適切な系（例えば、マトリゲル及び／もしくはコラーゲンなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル、又は非接着性プレート中の懸濁培養物）中で、かかるマンモスフェアを１０日間未満成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む。
ｉ）本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中で、マンモスフェア形成のための非接着条件においてｉＰＳＣを培養することによって、ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、並びに、
ｉｉ）本明細書中のいずれかに記載されるＲＡを含む三次元の適切な系（例えば、マトリゲル及び／もしくはコラーゲンなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル、又は非接着性プレート中の懸濁培養物）中で、かかるマンモスフェアを１０日間未満成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む。
【0119】
一実施形態では、ステップＡ）下での乳腺運命決定は、特定の因子（例えば、上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦ）及びＲＡを添加した馴化培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）を適用することによって得られる。
【0120】
本発明の一実施形態では、本方法は、ステップＡ）下で乳腺様オルガノイドを生成することを含む。
【0121】
本発明の一実施形態では、ステップＡ）下で乳腺様オルガノイドを生成する方法は、細胞の２次元単層、ＥＢを付着させた２次元（２Ｄ ｗｉｔｈ ａｔｔａｃｈｅｄ ＥＢ）、非接着性プレート中の懸濁液、及び混合浮遊ゲルからなる群から選択される条件下で細胞を培養することを含む。
【0122】
好ましい実施形態では、混合浮遊ゲルは、マトリゲル及びコラーゲンＩを含む。
【0123】
別の好ましい実施形態では、ステップＡ）におけるマンモスフェア（ｍＥＢ）は、適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）において少なくとも１５日間成長される。
【0124】
別のより好ましい実施形態では、ステップＡ）におけるマンモスフェア（ｍＥＢ）は、適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）において２０日間成長される。
【0125】
一実施形態では、本発明による方法は、ステップＡ）［例えば、ステップＡ）ｉ）及び／又はｉｉ）］に従う培養条件を提供する。
【0126】
この培養条件は、ヒト乳様生成物を分泌することができるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来するラクトサイトを生成するように調整されている。
【0127】
好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物の製造方法が提供され、かかるステップＡ）は、本明細書中に記載のＢＭＰ４及びＲＡを含む適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において、ｈｉＰＳＣを乳腺細胞（例えば、乳腺細胞）へと分化誘導することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも４２日間。いくつかの実施形態では、３１日以下である。いくつかの実施形態では、少なくとも３１日間。
【0128】
別の好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造するための方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及び本明細書中に記載されるＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において少なくとも１２日間（－２日目～１０日目）培養することによって、ｈｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、本明細書中に記載されるＲＡを含む適切な三次元包埋系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル）中で少なくとも３０日間、好ましくは３２日間成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む。
ｉ）ｈｉＰＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及び本明細書中に記載されるＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において少なくとも１２日間（－２日目～１０日目）培養することによって、ｈｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、本明細書中に記載されるＲＡを含む適切な三次元包埋系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル）中で少なくとも３０日間、好ましくは３２日間成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む。
【0129】
別の好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造するための方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及び本明細書中に記載されるＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において８日間以下（－２日目～６日目）培養することによって、ｈｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、本明細書中に記載されるＲＡを含む適切な三次元包埋系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル）中で２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む。
ｉ）ｈｉＰＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及び本明細書中に記載されるＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において８日間以下（－２日目～６日目）培養することによって、ｈｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、本明細書中に記載されるＲＡを含む適切な三次元包埋系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル）中で２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含む。
【0130】
本発明の特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、次のように定義され：
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載される、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１もしくはＮＯＤＡＬを含む）又はｍＴｅＳＲ（商標）中での２日間（－２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに、本明細書中に記載される、基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）及びＢＭＰ４が添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中での１０日間（０日目～１０日目）のＥＢのインキュベーションによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）は、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間（１０日目～１５日目）のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間（１５日目～３５日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間（３５日目～４２日目）インキュベーションすることによる、乳タンパク発現の誘導、を含む。
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載される、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１もしくはＮＯＤＡＬを含む）又はｍＴｅＳＲ（商標）中での２日間（－２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに、本明細書中に記載される、基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）及びＢＭＰ４が添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中での１０日間（０日目～１０日目）のＥＢのインキュベーションによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）は、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間（１０日目～１５日目）のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間（１５日目～３５日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間（３５日目～４２日目）インキュベーションすることによる、乳タンパク発現の誘導、を含む。
【0131】
本発明の特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、以下のように定義され：
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載される、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１もしくはＮＯＤＡＬを含む）又はｍＴｅＳＲ（商標）中での２日間（－２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに、本明細書中に記載される、基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）及びＢＭＰ４が添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中での６日間（０日目～６日目）のＥＢのインキュベーションによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間（６日目～１１日目）のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を１５日間（１１日目～２６日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間（２６日目～３１日目）インキュベーションすることによる、乳タンパク発現の誘導、を含む。
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載される、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１もしくはＮＯＤＡＬを含む）又はｍＴｅＳＲ（商標）中での２日間（－２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに、本明細書中に記載される、基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）及びＢＭＰ４が添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中での６日間（０日目～６日目）のＥＢのインキュベーションによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、ここで、
ステップＡ）ｉｉ）は、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間（６日目～１１日目）のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を１５日間（１１日目～２６日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間（２６日目～３１日目）インキュベーションすることによる、乳タンパク発現の誘導、を含む。
【0132】
ステップｉｖ）は、好ましくは、乳タンパク質発現細胞、特にラクトサイト、及び／又は乳腺様腺オルガノイドへの分化をもたらす。
【0133】
本発明の更に特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、次のように定義され：
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載されるような、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）又はｍＴｅＳＲ（商標）での２日間（２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成）、並びに、本明細書中に記載される、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中での１０日間（０日目～１０日目）のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間（１０日目～１５日目）包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間（１５日目～３５日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間（３５日目～４２日目）インキュベーションすることによる、乳タンパク発現の誘導、を含む。
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載されるような、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）又はｍＴｅＳＲ（商標）での２日間（２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成）、並びに、本明細書中に記載される、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中での１０日間（０日目～１０日目）のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間（１０日目～１５日目）包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間（１５日目～３５日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間（３５日目～４２日目）インキュベーションすることによる、乳タンパク発現の誘導、を含む。
【0134】
本発明の更に特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造する方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、以下のように定義され：
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載されるような、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）中ｍＴｅＳＲＴＭでの２日間（２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成）、並びに、本明細書中に記載される、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中での６日間（０日目～６日目）のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間（６日目～１１日目）包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間（１１日目～２６日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間（２６日目～３１日目）インキュベーションすることによる、乳タンパク発現の誘導、を含む。
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載されるような、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）中ｍＴｅＳＲＴＭでの２日間（２日目～０日目）のインキュベーションによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成）、並びに、本明細書中に記載される、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中での６日間（０日目～６日目）のＥＢのインキュベーションによって、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、ここで、ステップＡ）ｉｉ）は、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間（６日目～１１日目）包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間（１１日目～２６日目）インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間（２６日目～３１日目）インキュベーションすることによる、乳タンパク発現の誘導、を含む。
【0135】
ステップｉｖ）は、好ましくは、乳タンパク質発現細胞、特にラクトサイト、及び／又は乳腺様オルガノイドへの分化をもたらす。
【0136】
本明細書で言及される標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載される、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）は、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからの「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地」、カタログ番号Ａ１５１７００１として市販されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ａ１５１７００１＃／Ａ１５１７００１も参照されたい）。
【0137】
ｍＴｅＳＲ（商標）培地は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号８５８５０から市販されている（また、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｍｔｅｓｒ１．ｈｔｍｌも参照されたい）。Ｓｕｃｈｃ培地は、「Ｄｅｆｉｎｅｄ，ＦｅｅｄｅｒＩｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｉｓｓｕｅ １，Ｓｅｐｔ ２００７にも記載されている。
【0138】
一実施形態では、特に好ましい実施形態について上で定義されたステップｉｉｉ）及び／又はｉｖ）は、好ましくは、少なくとも乳腺（ｂｒｅａｓｔ）細胞、管腔細胞、及び基底細胞への形成／分化をもたらす。これに関連して、乳腺細胞は、好ましくは、β－カゼイン、乳タンパク質、及びホルモン受容体からなる群から選択されるマーカーの１つ以上、好ましくはすべてを発現する。更に、管腔細胞は、好ましくは、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、及びＣＫ１８からなる群から選択されるマーカーの１つ以上、好ましくはすべてを発現する。更に、基底細胞は、好ましくは、ＣＫ１４、α－平滑筋アクチン及びＰ６３からなる群から選択される、１つ以上のマーカーを発現する。
【0139】
更なる一実施形態では、特に好ましい実施形態について上で定義したステップｉｉ）及び／又はｉｖ）におけるｍＥＢ（マンモスフェア）の誘導後に、β－カゼイン、乳タンパク質及びホルモン受容体からなる群から選択される１つ又は複数のマーカーを発現する乳腺様オルガノイド、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、ＣＫ１８からなる群から選択される１つ又は複数のマーカーを発現する管腔細胞、並びにＣＫ１４、α－平滑筋アクチン及びＰ６３からなる群から選択される１つ又は複数のマーカーを発現する基底細胞を得ることができる。
【0140】
本発明の一実施形態では、上記の方法は、ヒト乳様生成物を製造するために提供される。
【0141】
（ステップＡの）一実施形態では、栄養素及び生体模倣刺激の送達は、細胞成長、分化、及び組織形成に影響を及ぼすように制御される。（ステップＡの）一実施形態では、かかる制御は、バイオリアクター内で行われる。
【0142】
本明細書中に記載される哺乳動物乳様生成物を製造するための方法において、ＢＭＰ４及びＲＡが培養培地に添加される場合、本明細書中に記載される方法において生成されるＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆体細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態は、該１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される。
【0143】
いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける該乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している。
【0144】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上は、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又はそれ以上は、２つ又はそれ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態は、該乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から選択される。
【0145】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも３５％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも６０％が、中間分化の段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも３５％は、誘導前の段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも４０％は、誘導後の段階でＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0146】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、中間分化の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、誘導前の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも５％は、誘導後の段階でＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0147】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、ＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも５０％は、中間分化の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２５％は、誘導前の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、誘導後の段階でＧＡＴＡ３及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0148】
いくつかの実施形態では、中間分化の段階は２５日目である。誘導前の段階は３５日目であり、誘導後の段階は４２日目である。いくつかの実施形態では、中間分化の段階は２０日目の間である。誘導前の段階は２６日目であり、誘導後の段階は３１日目である。
【0149】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳汁特異的生物活性マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、該乳汁特異的生物活性マーカーはオステオポンチン（ＯＰＮ）である。
【0150】
いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳汁特異的生物活性マーカーの発現は、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおける該非ニューロン外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、増加している。
【0151】
したがって、一例として、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造するための方法が本明細書において提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中でｉＰＳＣを培養することによって、ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、及び、本明細書中に記載のＢＭＰ４１０日後に、形成されたマンモスフェアを回収すること、並びに、
ｉｉ）適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）においてかかるマンモスフェアを少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含み、
ここで、該マンモスフェア（ＥＢ）の１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないマンモスフェア（ＥＢ）における該乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している、
ｉ）適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中でｉＰＳＣを培養することによって、ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、及び、本明細書中に記載のＢＭＰ４１０日後に、形成されたマンモスフェアを回収すること、並びに、
ｉｉ）適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）においてかかるマンモスフェアを少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含み、
ここで、該マンモスフェア（ＥＢ）の１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないマンモスフェア（ＥＢ）における該乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している、
【0152】
したがって、一例として、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物を製造するための方法が本明細書において提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中でｉＰＳＣを培養することによって、ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、及び、本明細書中に記載のＢＭＰ４６日後に、形成されたマンモスフェアを回収すること、並びに、
ｉｉ）ＲＡを含む適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）においてかかるマンモスフェアを１０日間未満成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含み、
ここで、該マンモスフェア（ＥＢ）の１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現は、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないマンモスフェア（ＥＢ）における該乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している。
ｉ）適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中でｉＰＳＣを培養することによって、ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させること、及び、本明細書中に記載のＢＭＰ４６日後に、形成されたマンモスフェアを回収すること、並びに、
ｉｉ）ＲＡを含む適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）においてかかるマンモスフェアを１０日間未満成長させて、ラクトサイトを生成すること、を含み、
ここで、該マンモスフェア（ＥＢ）の１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現は、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないマンモスフェア（ＥＢ）における該乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している。
【0153】
本明細書に開示される任意の方法又は方法ステップは、支持体として膜マトリックスを使用するのではなく、三次元懸濁培養において行われ得ることが理解されるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、全ての分化手順の間、細胞は懸濁培養で維持される。
【0154】
ステップＢ ヒト母乳様生成物の発現
本発明の一実施形態では、本方法は、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから、ヒト乳様生成物を発現させることを含む。ヒト乳様生成物の発現は、好ましくは、かかるラクトサイト及び／又は乳腺様腺オルガノイドからのヒト乳様生成物の発現の誘導時に生じる。
本発明の一実施形態では、本方法は、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから、ヒト乳様生成物を発現させることを含む。ヒト乳様生成物の発現は、好ましくは、かかるラクトサイト及び／又は乳腺様腺オルガノイドからのヒト乳様生成物の発現の誘導時に生じる。
【0155】
一実施形態では、泌乳期のラクトサイトは、催乳（ｌａｃｔｇｅｎｉｃ）因子（例えば、プロラクチン、ヒドロコルチゾン、及びインスリン）を添加した特定の培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）を適用することによって誘導される。
【0156】
特に、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから得られたヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質又はオリゴ糖、好ましくはヒト乳オリゴ糖などを含むか又はそれらからなる群から選択される、ヒト乳の生物活性物質を含有する。本発明者らは、特に、上記で実施されたステップＡのｉ）～ｉｖ）による特に好ましいプロトコルを用いて、とりわけ、オリゴ糖（ラクトース及びいくつかのＨＭＯを含む）、脂質（４つの脂肪酸を含む）、タンパク質（カゼインを含む７つが検出）、及びｍｉＲＮＡ（ＨＢＭにおいて典型的に検出される１１を含む、７５が検出）を同定することに成功した。
【0157】
一実施形態では、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから得られるヒト乳様生成物は、オリゴ糖、脂質、タンパク質、エキソソーム及びｍｉＲＮＡを含むか又はそれらからなる群から選択されるヒト乳の生物活性物質を含有する。
【0158】
別の実施形態では、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから得られるヒト乳様生成物は、ラクトース、６’ＳＬ、Ｃ－４：０脂肪酸、Ｃ－８：０脂肪酸、Ｃ－１０：０脂肪酸、Ｃ－１４：０脂肪酸、Ｃ－１５：０脂肪酸、Ｃ－１６：０脂肪酸、Ｃ－１６：１ｎ７脂肪酸、Ｃ－１７：０脂肪酸、Ｃ－１８：０脂肪酸、Ｃ－１８：１ ｎ９脂肪酸、Ｃ－１８：１脂肪酸、Ｃ－１８：２ ｎ６脂肪酸、Ｃ－２０：０脂肪酸、Ｃ－２０：１ ｎ９脂肪酸、Ｃ－１８：３ ｎ３脂肪酸、Ｃ－２２：０脂肪酸、ラクトフェリン、アルブミン、プロラクチン、アルファＳ１－カゼイン、ヘモグロビンサブユニットベータ、ヘモグロビンサブユニットアルファ、α－ラクトアルブミン、アルファ－２－マクログロブリン、β－カゼイン、胆汁酸塩活性化リパーゼ、κ－カゼイン、ラクトアドヘリン、ＣＤ１４、脂肪酸シンターゼ、ＩｇＡ、ｐＩｇＲ、血清アルブミン、キサンチンデヒドロゲナーゼ、エキソソーム、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２２－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ及びｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐを含むか又はそれらからなる群から選択される、ヒト乳の生物活性物質を含有する。
【0159】
本発明の一実施形態では、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから得られるヒト乳様生成物は、標準ヒト乳生成物である。本発明の別の実施形態では、ヒト人工多能性幹細胞ｈｉＰＳＣに由来する乳腺様オルガノイドから得られるヒト乳様生成物は、非標準ヒト乳生成物である。
【0160】
ステップＣ 調整ヒト母乳様生成物を製造するためのさらなる処理
本発明の任意の一実施形態では、本明細書に記載の方法は、ステップＢ）から得ることができるヒト乳様生成物に対して行われ、かかる生成物に対して追加の処理を行って調整ヒト乳様生成物を提供することを含む追加のステップＣ）を含む。
本発明の任意の一実施形態では、本明細書に記載の方法は、ステップＢ）から得ることができるヒト乳様生成物に対して行われ、かかる生成物に対して追加の処理を行って調整ヒト乳様生成物を提供することを含む追加のステップＣ）を含む。
【0161】
特定の一実施形態では、本発明のヒト母乳様生成物に対して行われる追加の処理ステップＣ）は、精製ステップ、単離プロセス、抽出プロセス、分画ステップ、富化プロセス、酵素処理、さらなる成分（例えば、ヒト乳腺オルガノイドによって発現され得ないもの（例えば、免疫グロブリン、プロバイオティクス及び／又はミネラルなど））の添加又はそれらの組合せからなる群から選択され得る。
【0162】
ヒト乳様生成物
「標準」ヒト母乳様生成物
本発明の一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、「標準」ヒト母乳様生成物であり、すなわち、栄養状態の良好な母親のヒト母乳と同じ成分を含む。
「標準」ヒト母乳様生成物
本発明の一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、「標準」ヒト母乳様生成物であり、すなわち、栄養状態の良好な母親のヒト母乳と同じ成分を含む。
【0163】
母乳育児の利点は科学文献において周知であり、ヒト母乳様生成物へのアクセスが可能になることで、かかる生成物を多くの同様に周知の健康上の利点のために使用可能になる。
【0164】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、実際の授乳が不可能な状況下で、母乳代替物として使用することができる。
【0165】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、例えば、泌乳が少ない女性、又は出産の６ヶ月後に泌乳しなくなった女性の授乳経験がより長期間になるよう支援するために使用されることが意図される。
【0166】
同様に、ヒト母乳様生成物は、例えば、病気により母親からの実際の授乳が損なわれる状況下であっても、授乳を可能にするために使用されることが意図される。
【0167】
別の実施形態では、ヒト母乳様生成物は、母乳の生産が自然に開始されない状況、例えば乳児を養子とした場合に使用されることが意図される。
【0168】
一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、天然に生じるとおりのヒト母乳授乳期の生成物ではない。
【0169】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、乳児に最適な栄養を提供する際に使用するためのものである。
【0170】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、乳児に健康な発育を提供する際に使用するためのものである。
【0171】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、幼児における感染、肥満の予防及び免疫発達の促進に使用するためのものである。
【0172】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、無調整ヒト母乳様生成物である。
【0173】
別の実施形態では、ヒト母乳様生成物は、調整ヒト母乳様生成物である。
【0174】
一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン及びミネラルを含む。
【0175】
別の実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル及び生物活性物質を含む。
【0176】
一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質（リノール酸及びα－リノレン酸を含む）、炭水化物、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸、葉酸、ビタミンＣ及びビオチンを含む）、ミネラル（鉄、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、マンガン、ヨウ素、セレン、銅及び亜鉛を含む）、コリン、ミオイノシトール及びＬ－カルニチンを含む。
【0177】
さらなる実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物はまた、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡからなる群において選択される、少なくとも１つの生物活性物質を含む。
【0178】
かかるヒト母乳様生成物は、例えば、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡを添加するステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製され得る。
【0179】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、プロバイオティクスを含有する。
【0180】
かかるヒト母乳様生成物は、例えば、いくつかの商業的に入手可能な供給源から得ることができるプロバイオティクス（例えば、Ｂ．ラクティス（Ｂ．Ｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．Ｒａｍｎｈｏｓｕｓ））を含有させることにより、本発明の方法に従い調製され得る。
【0181】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、胃腸機能を最適化するため、及び／又は免疫を促進するために使用され得る。
【0182】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、分泌型ＩｇＡ及びプロバイオティクスを含有する。
【0183】
かかるヒト母乳様生成物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１５６３０１号及び国際公開第２００９／１５６３６７号に記載されているように調製することができるプロバイオティクスと分泌型ＩｇＡとの組合せを添加するステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製することができる。かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、免疫グロブリン欠乏を予防するために、及び／又は乳児及び幼児における再発感染の予防において使用され得る。
【0184】
「非標準」ヒト母乳様生成物
本発明の一実施形態では、ヒト乳様生成物は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然に見出される成分比及び成分濃度とは変更させることができる。これを本明細書では「非標準乳様生成物」と称する。
本発明の一実施形態では、ヒト乳様生成物は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然に見出される成分比及び成分濃度とは変更させることができる。これを本明細書では「非標準乳様生成物」と称する。
【0185】
一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、乳強化剤、サプリメント、及び／又は特別な目的に適合させたヒト母乳代用物からなる群から選択され得る。
【0186】
ヒト乳強化剤及びヒト乳生物活性サプリメント
一実施形態では、本発明の方法は、授乳中の母親から自然に得られるヒト母乳を強化するために、又は乳児用フォーミュラを強化するために使用することができるヒト母乳様生成物を提供する。
一実施形態では、本発明の方法は、授乳中の母親から自然に得られるヒト母乳を強化するために、又は乳児用フォーミュラを強化するために使用することができるヒト母乳様生成物を提供する。
【0187】
別の実施形態では、本発明の方法は、必要に応じて乳児又は幼児のためのサプリメントとして使用され得るヒト母乳様生成物を提供する。
【0188】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、健康な発育を提供するために、及び／又は、乳児又は幼児における特定の状態（例えば、ぜんそく、アレルギー、認知変化など）に典型的に関連する病気を発症するリスクを低減するために、及び／又は、発育、免疫の発達、感染からの保護を促進するために、使用され得る。
【0189】
注目すべきことに、かかる強化剤又はサプリメント中の成分（特に生物活性成分）がヒト起源であることは、それらが本発明の方法によるものであるという事実と相まって、かかる成分にそのままの（ｉｎｔａｃｔ）又はより高い機能性を提供すると考えられる。
【0190】
ヒト母乳様生成物は、好ましくは強化剤としての使用が意図される。かかるヒト母乳様生成物は、強化剤としての使用が意図され、例えば、ステップＢ）から得ることができるヒト母乳様生成物からの（特定の）生物活性物質の単離及び／又は富化のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製され得る。かかる単離ステップは、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の古典的な分画、富化及び／又は精製を介して行われてもよい。
【0191】
サプリメントとしての使用が意図されるヒト母乳様生成物は、ヒト乳オリゴ糖（例えば、２ＦＬ、３ＦＬ、ＬＮＴ、ＬｎＮＴ、ＤｉＦｌ、６ＳＬ及び／又は３ＳＬ）、脂質、増殖／成長因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮増殖因子）、サイトカイン（例えば、形質転換増殖因子－β２（ＴＧＦβ－２）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ－γ）、ＴＮＦ－α）、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、マイクロＲＮＡを含むエキソソーム、及び抗菌／保護の生物活性物質（例えば、ＩｇＡ、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトアドヘリン）からなる群から選択される、１つ以上の生物活性物質を含み得る。サプリメントとしての使用が意図されるかかるヒト母乳様生成物は、例えば、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物から生物活性物質を単離するステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製されてもよい。かかる単離ステップは、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の古典的な分画、富化及び／又は精製を介して行われてもよい。
【0192】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フコシル化ヒト乳オリゴ糖、例えば２ＦＬ及び／又は３ＦＬを含有するサプリメント又は乳強化剤である。かかるサプリメント又は乳強化剤は、ＦＵＴ２遺伝子が不活性であることに起因してフコシル化オリゴ糖を分泌しない女性のヒト母乳のプロファイルを充足させる際に使用するためのものである。
【0193】
強化剤又はサプリメントとしての使用が意図されるかかるヒト母乳様生成物は、例えば、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物からフコシル化オリゴ糖（例えば、２ＦＬ及び／又は３ＦＬ）を単離及び／又は富化するステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製されてもよい。
【0194】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、胃腸機能を最適化するため、及び／又は免疫を促進するために使用され得る。
【0195】
遺伝的疾患を有する乳児のためのヒト母乳様生成物
一実施形態では、本発明によるヒト母乳様生成物は、遺伝的疾患を有して生まれた乳児の特異的なニーズに対処するように適合され得る。
一実施形態では、本発明によるヒト母乳様生成物は、遺伝的疾患を有して生まれた乳児の特異的なニーズに対処するように適合され得る。
【0196】
ガラクトース血症
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ガラクトース血症に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ガラクトース血症は、乳児のガラクトース代謝能に影響を及ぼす稀な遺伝子疾患である。
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ガラクトース血症に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ガラクトース血症は、乳児のガラクトース代謝能に影響を及ぼす稀な遺伝子疾患である。
【0197】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ラクトース及び／又はラクトース含有サッカリドを除去されるべきである。かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ガラクトース血症に罹患した乳児に健康な発育を提供するために使用され得る。
【0198】
一実施形態では、ラクトース及び／又はラクトース含有サッカリドが除去されたヒト母乳様生成物は、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の、酵素処理（ラクターゼ処理）のステップＣ）、又は膜分画及び限外濾過のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って得られ得る。
【0199】
別の実施形態では、ラクトース及び／又はラクトース含有サッカリドが除去されたヒト母乳様生成物は、本発明の方法に従って、ステップＡ）においてＧＭＯα－ラクトアルブミン欠損ヒト細胞を使用してｈｉＰＳＣを生成することによって得ることができる。
【0200】
フェニルケトン尿症
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ＰＫＵは、フェニルアラニンをチロシンに変換するフェニルアラニンヒドロキシラーゼが存在しないこと又は機能不全であることに起因する。未処置では、脳毒性により重度の精神遅滞がもたらされる。
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ＰＫＵは、フェニルアラニンをチロシンに変換するフェニルアラニンヒドロキシラーゼが存在しないこと又は機能不全であることに起因する。未処置では、脳毒性により重度の精神遅滞がもたらされる。
【0201】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フェニルアラニンを除かれるか（ｄｅｐｒｉｖｅｄ）又は枯渇されるべきである。
【0202】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ＰＫＵに罹患した乳児に健康な発育を提供するために使用され得る。
【0203】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フェニルアラニン含量がかかる生成物を受ける対象の体重１ｋｇ当たり２０ｍｇ未満に維持されるようにフェニルアラニンが枯渇している。
【0204】
一実施形態では、フェニルアラニンが枯渇又は除去されたヒト母乳様生成物は、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の、酵素処理（タンパク質加水分解）又は濾過のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って得ることができる。
【0205】
一実施形態では、フェニルアラニンが枯渇したヒト母乳様生成物は、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の酵素処理（タンパク質加水分解）又は濾過のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って得ることができる。
【0206】
別の実施形態では、フェニルアラニンが枯渇したヒト母乳様生成物は、ステップＢ）において、限定量又はゼロ量のフェニルアラニンを提供する培養培地（例えば、乳清由来のグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）を含有する培養培地など）を提供することによって、本発明の方法に従って得ることができる。
【0207】
本発明の追加的な実施形態
本発明は、以下の付番したステートメントに従う態様を提供する：
本発明は、以下の付番したステートメントに従う態様を提供する：
【0208】
１．乳腺細胞の集団を製造する方法であって、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）前記ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、を含む方法。
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップと、
ｉｉ）前記ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップと、を含む方法。
【0209】
２．前記培養ステップｉ）が、前記ｍｉＰＳＣを、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、三次元懸濁培養系、例えば三次元懸濁条件で培養して、それによって前記ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを、任意選択で少なくとも１２日間行うことを含む、ステートメント１に記載の方法。
【0210】
３．前記培養ステップｉ）が、前記ｍｉＰＳＣを、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、三次元懸濁培養系、例えば三次元懸濁条件で培養して、それによって前記ｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることを、任意選択で８日間以下行うことを含む、ステートメント１に記載の方法。
【0211】
４．前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、ステートメント１又は２に記載の方法。
【0212】
５．前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、ＲＡを含む三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成することを含む、ステートメント１又は３に記載の方法。
【0213】
６．ステップｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、を含む、ステートメント４に記載の方法。
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、を含む、ステートメント４に記載の方法。
【0214】
７．ステップｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）及びｉｉｉ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）、及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、を含む、ステートメント５に記載の方法。
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）、及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、を含む、ステートメント５に記載の方法。
【0215】
８．前記乳腺細胞が、ヒト乳腺細胞である、ステートメント１～７のいずれか１つに記載の方法。
【0216】
９．ＢＭＰ４が、０日目～１０日目の間、好ましくは０日目～３日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｉＰＳＣが初めて前記培養培地に添加される時点である、ステートメント１～８のいずれか１つに記載の方法。
【0217】
１０．ＢＭＰ４が、前記培養培地に３日間添加される、ステートメント１～９のいずれか１つに記載の方法。
【0218】
１１．ＲＡが、１０日目～１５日目の間、任意選択で６日目～１１日目の間に前記培養培地に添加され、０日目が、前記ｉＰＳＣが初めて前記培養培地に添加される時点である、ステートメント１～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0219】
１２．ＲＡが、前記培養培地に５日間添加される、ステートメント１～１１のいずれか１つに記載の方法。
【0220】
１３．ＢＭＰ４が、５～２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ又は２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記培養培地に添加される、ステートメント１～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0221】
１４．ＲＡが、１μＭの濃度で前記培養培地に添加される、ステートメント１～１３のいずれか１つに記載の方法。
【0222】
１５．前記ＥＢが、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３から任意選択で選択される、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、ステートメント１～１４のいずれか１つに記載の方法。
【0223】
１６．前記ＥＢの１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４及びＲＡで処理されていないＥＢにおける前記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している、ステートメント１～１５のいずれか１つに記載の方法。
【0224】
１７．前記ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上が、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意にＥＢの少なくとも３５％が、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意にＥＢの少なくとも１５％が、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、かつ／又は任意にＥＢの少なくとも２０％が、ＥｐＣＡＭ及びＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、ステートメント１～１６のいずれか１つに記載の方法。
【0225】
１８．前記ＥＢが、１つ以上の乳汁特異的生物活性マーカー、任意にオステオポンチン（ＯＰＮ）を発現する、ステートメント１～１７のいずれか１つに記載の方法。
【0226】
１９．前記ＥＢが、１つ以上の乳汁特異的生物活性マーカーの発現を増加させ、任意にオステオポンチン（ＯＰＮ）の発現を増加させる、ステートメント１～１８のいずれか１つに記載の方法。
【0227】
２０．前記ＥＢが、１つ以上の乳汁特異的生物活性マーカーの分泌を増加させ、任意にオステオポンチン（ＯＰＮ）の分泌を増加させる、ステートメント１～１９のいずれか１つに記載の方法。
【0228】
２１．前記乳腺細胞がラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する、ステートメント１～２０のいずれか１つに記載の方法。
【0229】
２２．分化プロトコルにおける哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を向上させるための、ＢＭＰ４及びＲＡの使用。
【0230】
２３．哺乳動物乳様生成物を製造するための方法であって、
Ａ）ラクトサイト哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）に由来する乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、
Ｂ）前記ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップと、を含み、
ステップＡ）が、ＢＭＰ４及びＲＡを含む培養培地中で前記ｍｉＰＳＣを培養することを含む、方法。
Ａ）ラクトサイト哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）に由来する乳腺様腺オルガノイドを生成するステップと、
Ｂ）前記ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップと、を含み、
ステップＡ）が、ＢＭＰ４及びＲＡを含む培養培地中で前記ｍｉＰＳＣを培養することを含む、方法。
【0231】
２４．ステップＡ）が、３０日～４５日のプロセス、任意に４５日未満のプロセス、任意に４４日未満のプロセス、任意に３５日未満のプロセス、任意に３１日未満のプロセスである、ステートメント２３に記載の方法。
【0232】
２５．ヒト乳様生成物を製造するためのものである、ステートメント２３又は２４に記載の方法であって、
前記ステップＡ）が更に、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系、例えば、三次元懸濁条件で、少なくとも１２日間培養することによって、前記ｈｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることと、
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質とＲＡとから構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成することと、を含む、方法。
前記ステップＡ）が更に、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系、例えば、三次元懸濁条件で、少なくとも１２日間培養することによって、前記ｈｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることと、
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質とＲＡとから構成される混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間成長させて、ラクトサイトを生成することと、を含む、方法。
【0233】
２６．ヒト乳代替生成物を製造するためのものである、ステートメント２３又は２４に記載の方法であって、
前記ステップＡ）が更に、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系、例えば、三次元懸濁条件で、８日間以下培養することによって、前記ｈｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることと、
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩ及びＲＡなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成することと、を含む、方法。
前記ステップＡ）が更に、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地、例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中で、適切な三次元培養系、例えば、三次元懸濁条件で、８日間以下培養することによって、前記ｈｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させることと、
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＲＡを含む適切な三次元包埋系、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩ及びＲＡなどのマトリックスタンパク質から構成される混合浮遊ゲル中で、２５日間以下成長させて、ラクトサイトを生成することと、を含む、方法。
【0234】
２７．前記ステップＡ）ｉ）が、次のように定義され：
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１もしくはＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で、又はｍＴｅＳＲ（商標）培地中で、２日間インキュベーションすることによる、前記ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基本培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４、ヘパリン、及びヒドロコルチゾンが添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中でＥＢを１０日間インキュベーションすることによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク質発現の誘導、を含む、ステートメント２５に記載の方法。
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１もしくはＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で、又はｍＴｅＳＲ（商標）培地中で、２日間インキュベーションすることによる、前記ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基本培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４、ヘパリン、及びヒドロコルチゾンが添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中でＥＢを１０日間インキュベーションすることによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及びヒドロコルチゾン及びインスリン及びＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク質発現の誘導、を含む、ステートメント２５に記載の方法。
【0235】
２８．ステップＡ）ｉ）が、次のように定義され：
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１もしくはＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で、又はｍＴｅＳＲ（商標）培地中で、２日間インキュベーションすることによる、前記ｈｉＰＳＣからの前記胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基本培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４、ヘパリン、及びヒドロコルチゾンが添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中でＥＢを６日間インキュベーションすることによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる、乳タンパク質発現の誘導、を含む、ステートメント２６に記載の方法。
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１もしくはＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で、又はｍＴｅＳＲ（商標）培地中で、２日間インキュベーションすることによる、前記ｈｉＰＳＣからの前記胚様体（ＥＢ）の生成、並びに基本培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４、ヘパリン、及びヒドロコルチゾンが添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中でＥＢを６日間インキュベーションすることによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）及びＲＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でのｍＥＢ（マンモスフェア）の５日間のインキュベーション、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる、乳タンパク質発現の誘導、を含む、ステートメント２６に記載の方法。
【0236】
２９．ステップＡ）ｉ）が、次のように定義され：
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で２日間インキュベーションすることによる、前記ｈｉＰＳＣからの前記胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中でＥＢを１０日間インキュベーションすることによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）、及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク質発現の誘導、を含む、ステートメント２５に記載の方法。
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で２日間インキュベーションすることによる、前記ｈｉＰＳＣからの前記胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中でＥＢを１０日間インキュベーションすることによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）、及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を７日間インキュベーションすることによる乳タンパク質発現の誘導、を含む、ステートメント２５に記載の方法。
【0237】
３０．ステップＡ）ｉ）が、次のように定義され：
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で２日間インキュベーションすることによる、前記ｈｉＰＳＣからの前記胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中でＥＢを６日間インキュベーションすることによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）、及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる乳タンパク質発現の誘導、を含む、ステートメント２６に記載の方法。
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、セレンナトリウム、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で２日間インキュベーションすることによる、前記ｈｉＰＳＣからの前記胚様体（ＥＢ）の生成、並びにＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中でＥＢを６日間インキュベーションすることによる、非神経外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の生成、
ステップＡ）ｉｉ）が、更なるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）、及びＲＡを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間包埋すること、
ｉｉｉ）包埋したｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で１５日間インキュベーションすることによる、分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化の促進、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中でｍＥＢ（マンモスフェア）を５日間インキュベーションすることによる乳タンパク質発現の誘導、を含む、ステートメント２６に記載の方法。
【0238】
３１．ステップＡ）が、ステートメント１～２１のいずれか１つに記載の方法を含む、ステートメント２３～３０のいずれか１つに記載の方法。
【0239】
３２．ステップＡ）が、三次元懸濁培養条件で行われる、ステートメント２３、２４又は３１に記載の方法。
【0240】
３３．ステートメント２３～３２のいずれか１つに記載の方法により得られるヒト乳様生成物。
【0241】
３４．治療に使用するためのステートメント３３に記載のヒト乳様生成物。
【0242】
３５．ステートメント３３に記載のヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物、任意選択で母乳代替物としての、使用。
【0243】
本明細書に開示するとおりの詳細な説明の様々な態様及び実施形態は、本発明を作製及び使用する特定の方法を例示するものであり、請求項及び詳細な説明と共に考慮するにあたり、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。本発明の態様及び実施形態に由来する特徴を、本発明の同じ又は異なる態様及び実施形態に由来する更なる特徴と組み合わせてもよいことも理解されたい。
【0244】
発明を実施するための形態及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「１つの」（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）には、別段の指示が文脈上明確にない限り、複数の参照物も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0245】
【図1】Ｙｉｎｇ Ｑｕに概説され、本発明の方法のステップＡ）における１つの代替法に適用されるプロトコルによるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の分化を示す。
【図2】ステップＡ）によるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の分化を示す。
【図3】本発明の方法のステップＡ）に好ましい実施形態及び特に好ましい実施形態によるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の分化を示す。
【図4】図２の方法に従って製造されたｈｉＰＳＣの三次元器官型培養が、乳腺特異化に対して高度に許容的であることを示す。三次元分化（４２日）プロトコルにおける、Ｎａｎｏｇ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＡ２、ＴＰ６３、ＫＲ－１４、ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８及びＣＳＮ２のｍＲＮＡ発現を示す。マーカーは、左から右へ、多能性（Ｎａｎｏｇ）、系統（外胚葉及び内胚葉）（ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＡ２）、基底細胞／筋上皮マーカー（ＴＰ６３、ＫＲ－１４）、管腔上皮マーカー（ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８）、及び乳タンパク質（ＣＳＮ２（カゼインベータ））、の段階を示す。
【図5】比較例として製造された、ｈｉＰＳＣの二次元器官培養を示す。二次元分化（３１日）プロトコルにおける、Ｎａｎｏｇ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＡ２、ＴＰ６３、ＫＲ－１４、ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８及びＣＳＮ２のｍＲＮＡ発現を示す。マーカーは、左から右へ、多能性（Ｎａｎｏｇ）、系統（外胚葉及び内胚葉）（ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＡ２）、基底細胞／筋上皮マーカー（ＴＰ６３、ＫＲ－１４）、管腔上皮マーカー（ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８）、及び乳タンパク質（ＣＳＮ２（カゼインベータ））、の段階を示す。
【図6】様々な乳腺分化プロトコルの概略図を示す。概略図は、４２日間（ａ）での乳腺前駆細胞の生成について、骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）（ｂ）、レチノイン酸（ＲＡ）（ｃ）、ＢＭＰ４とＲＡの組合せ（ｄ）、並びに短縮された時間経過（３１日）におけるそれらの組合せ（ｅ）を使用した、様々な手順を要約する。赤色の枠は、ＢＭＰ４及び／又はＲＡの添加期間を示す。
【図7】３Ｄオルガノイドモデルを使用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の乳腺分化に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）の組合せ効果。ａ～ｃは、分化の時間経過（２５日目（対照プロトコルの場合）及び２０日目（短縮された時間経過プロトコルの場合））及び誘導前の段階（３５日目（ＢＭＰ４及びＲＡを含む対照プロトコルの場合）、及び２６日目（短縮された時間経過プロトコルの場合））中のいくつかの同定されたマーカー：ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１及びＧＡＴＡ３を使用する乳腺陽性前駆細胞の数のフローサイトメトリーによる定量を示し、並びにｄ～ｆは、誘導後の期間（４２日目（ＢＭＰ４及びＲＡを含む対照プロトコルについて）及び３１日目（短縮された時間経過プロトコルについて））を示す。＊は、ＢＭＰ４とＲＡとの組合せを含む短縮した改変プロトコル（３１日間）を記載する。
【図8】正常な長さの及び短縮されたプロトコル（ａ～ｈ）におけるｉＰＳＣ由来のラクトサイトにおける様々な乳腺上皮マーカーの発現を示す。
【図9】オステオポンチンタンパク質分泌の液体クロマトグラフィー・質量解析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）ベースの標的化プロテオミクス解析を示す。オステオポンチンタンパク質分泌は、対照の分化方法を使用して、又は骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）、レチノイン酸（ＲＡ）を用いて、及び２つの因子の組合せで、ｉＰＳ由来乳腺細胞の培養物の培地において検出された。
【0246】
実験項
実施例１
ｈｉＰＳＣの培養及びラクトサイトへの分化による、ヒト乳様生成物の取得
Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｖｏｌ ８，２０５－２１５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４ｔｈ２０１７に記載されている手順に従って、ｉｈＰＳＣから出発してラクトサイトを培養して、それによって分泌されたヒト乳様生成物を回収し、本発明による治療において及び／又は母乳代替物として使用することができる。
実施例１
ｈｉＰＳＣの培養及びラクトサイトへの分化による、ヒト乳様生成物の取得
Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｖｏｌ ８，２０５－２１５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４ｔｈ２０１７に記載されている手順に従って、ｉｈＰＳＣから出発してラクトサイトを培養して、それによって分泌されたヒト乳様生成物を回収し、本発明による治療において及び／又は母乳代替物として使用することができる。
【0247】
実施例２
ｈｉＰＳＣの培養及び三次元ラクトサイトへの分化による、ヒト乳様生成物の取得
本発明の方法に従ってｈｉＰＳＣから出発して、上記のステップＡ）及びステップＢ）に従ってラクトサイトを培養して、それによって分泌されたヒト乳様生成物を回収して、治療において、及び／又は本発明による母乳代替物として使用することができる。
ｈｉＰＳＣの培養及び三次元ラクトサイトへの分化による、ヒト乳様生成物の取得
本発明の方法に従ってｈｉＰＳＣから出発して、上記のステップＡ）及びステップＢ）に従ってラクトサイトを培養して、それによって分泌されたヒト乳様生成物を回収して、治療において、及び／又は本発明による母乳代替物として使用することができる。
【0248】
実施例３
ｈｉＰＳＣの培養及びラクトサイトへの分化の代替的方法による、ヒト乳様生成物の取得
ｈｉＰＳＣからの効率的なラクトサイト分化は、以下に記載される条件１～４を含む代替的な培養条件から得ることができる。
１．ＥＢに由来する細胞の単層としてビトロネクチン被覆プレート上で二次元培養し、Ｌ－グルタミン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン：抗生物質－抗真菌剤溶液）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中で少なくとも２８日間培養する。
２．ＥＢに由来する細胞の付着凝集体（ＥＢ）のビトロネクチン被覆プレート上で二次元培養し、Ｌ－グルタミン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（抗生物質－抗真菌剤溶液）を添加したＲＰＭＩ １６４０を含有する培地中で少なくとも２８日間培養する。
３．少なくとも１０日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中懸濁液において三次元培養し、次いで、上皮小体ホルモンの存在下で、特定の培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）中で更に５日間、続いてインスリン、ＨＧＦ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ１０の存在下で２５日間、混合浮遊ゲル（例えば、マトリゲル及びコラーゲン１）中で培養する。
４．ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中懸濁液（超低接着性プレート）において少なくとも１０日間、次いで上皮小体ホルモンの存在下で特定の培地（例えばＥｐｉＣｕｌｔＢ）中で更に５日間、続いてインスリン、ＨＧＦ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ１０の存在下で２５日間、ＥＢを三次元培養する。
ｈｉＰＳＣの培養及びラクトサイトへの分化の代替的方法による、ヒト乳様生成物の取得
ｈｉＰＳＣからの効率的なラクトサイト分化は、以下に記載される条件１～４を含む代替的な培養条件から得ることができる。
１．ＥＢに由来する細胞の単層としてビトロネクチン被覆プレート上で二次元培養し、Ｌ－グルタミン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン：抗生物質－抗真菌剤溶液）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中で少なくとも２８日間培養する。
２．ＥＢに由来する細胞の付着凝集体（ＥＢ）のビトロネクチン被覆プレート上で二次元培養し、Ｌ－グルタミン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（抗生物質－抗真菌剤溶液）を添加したＲＰＭＩ １６４０を含有する培地中で少なくとも２８日間培養する。
３．少なくとも１０日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中懸濁液において三次元培養し、次いで、上皮小体ホルモンの存在下で、特定の培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）中で更に５日間、続いてインスリン、ＨＧＦ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ１０の存在下で２５日間、混合浮遊ゲル（例えば、マトリゲル及びコラーゲン１）中で培養する。
４．ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中懸濁液（超低接着性プレート）において少なくとも１０日間、次いで上皮小体ホルモンの存在下で特定の培地（例えばＥｐｉＣｕｌｔＢ）中で更に５日間、続いてインスリン、ＨＧＦ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ１０の存在下で２５日間、ＥＢを三次元培養する。
【0249】
実施例４
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの二次元分化及び三次元分化
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの三次元分化：
ラクトサイトの三次元分化には、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を使用した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入した。
（ｉ）三次元分化プロトコル（本発明による）のために、ｈｉＰＳＣの単一細胞を、１０ｕＭ ｒｏｃｋ阻害剤を含むＥ８培地中、３７℃、５％ＣＯ２で、９５ｒｐｍで回転させながら一晩インキュベーションすることによって、ＥＢ（スフェロイド）を形成させた。
２日目に、培地をＥ８で交換した（－２日目～０日目）。
翌日、培地をＭａｍｍｏ１培地（ペニシリン／ストレプトマイシンを添加し、増殖サプリメント、ヘパリン（４μｇ／ｍＬ）、及びヒドロコルチゾン（０．４８μｇ／ｍＬ）を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）で１０日間（０日目～１０日目）交換した。培地を２日毎に交換した。
（ｉｉ）分化後、Ｍａｍｍｏ２培地（ＥｐｉＣｕｌｔＢ＋サプリメント、ＰＴＨｒＰ １００ｎｇ／ｍＬ＋ペニシリン／ストレプトマイシン）中で５日間培養した。培養培地を３日毎（１０日目～１５日目）に交換した。
（ｉｉｉ）上皮構造の枝分かれ、腺房分化及び乳腺特異化を誘導するために、ｍＥＢ（スフェロイド／マンモスフェア）にＭａｍｍｏ３培地（完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ、ヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍＬ）、インスリン（１０μｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）及びペニシリン／ストレプトマイシン）を２０日間フィードした。培地を３日毎に交換した（１５日目～３５日目）。
（ｉｖ）最後に、乳生物活性物質の生産（三次元）を誘導するために、Ｍａｍｍｏ４培地（完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ、１０％ＦＢＳ、プロラクチン（１０μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍＬ）、インスリン（１０μｇ／ｍＬ）、プロゲステロン、β－エストラジオール及びペニシリン／ストレプトマイシン）を７日間使用し、培地を３日毎に交換した（３５日目～４２日目）。全ての分化手順の間、スフェロイドを懸濁培養で維持した（９５ｒｐｍで回転）。分化手順は４２日目に終了した。結果を図４に表す。
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの二次元分化及び三次元分化
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの三次元分化：
ラクトサイトの三次元分化には、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を使用した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入した。
（ｉ）三次元分化プロトコル（本発明による）のために、ｈｉＰＳＣの単一細胞を、１０ｕＭ ｒｏｃｋ阻害剤を含むＥ８培地中、３７℃、５％ＣＯ２で、９５ｒｐｍで回転させながら一晩インキュベーションすることによって、ＥＢ（スフェロイド）を形成させた。
２日目に、培地をＥ８で交換した（－２日目～０日目）。
翌日、培地をＭａｍｍｏ１培地（ペニシリン／ストレプトマイシンを添加し、増殖サプリメント、ヘパリン（４μｇ／ｍＬ）、及びヒドロコルチゾン（０．４８μｇ／ｍＬ）を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）で１０日間（０日目～１０日目）交換した。培地を２日毎に交換した。
（ｉｉ）分化後、Ｍａｍｍｏ２培地（ＥｐｉＣｕｌｔＢ＋サプリメント、ＰＴＨｒＰ １００ｎｇ／ｍＬ＋ペニシリン／ストレプトマイシン）中で５日間培養した。培養培地を３日毎（１０日目～１５日目）に交換した。
（ｉｉｉ）上皮構造の枝分かれ、腺房分化及び乳腺特異化を誘導するために、ｍＥＢ（スフェロイド／マンモスフェア）にＭａｍｍｏ３培地（完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ、ヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍＬ）、インスリン（１０μｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）及びペニシリン／ストレプトマイシン）を２０日間フィードした。培地を３日毎に交換した（１５日目～３５日目）。
（ｉｖ）最後に、乳生物活性物質の生産（三次元）を誘導するために、Ｍａｍｍｏ４培地（完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ、１０％ＦＢＳ、プロラクチン（１０μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍＬ）、インスリン（１０μｇ／ｍＬ）、プロゲステロン、β－エストラジオール及びペニシリン／ストレプトマイシン）を７日間使用し、培地を３日毎に交換した（３５日目～４２日目）。全ての分化手順の間、スフェロイドを懸濁培養で維持した（９５ｒｐｍで回転）。分化手順は４２日目に終了した。結果を図４に表す。
【0250】
（ｂ）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの二次元分化：
ラクトサイトの二次元分化にも、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を使用した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入した。
ラクトサイトの二次元分化にも、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を使用した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入した。
【0251】
二次元分化プロトコル（比較のために使用）では、本発明者らは、全ての分化段階中にラクト（Ｌａｃｔｏ）培地（ＲＰＭＩ １６４０、２０％ＦＢＳ、１ｍＭグルタミン、４μｇ／ｍＬインスリン、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、０．５μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、ペニシリン／ストレプトマイシン添加）を使用した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。培地を２日毎に交換した。結果を図５に表す。
【0252】
（ｃ）結果
定量的ＲＴ－ＰＣＲを使用して、ラクトサイト誘導中の分化の各段階を捕捉した（図４は三次元分化、図５は二次元分化）。二次元及び三次元の設定のいずれでも、多能性のマーカーとしてのＮａｎｏＧ発現は、細胞が成熟及び分化するのに従い減少する。神経外胚葉マーカー及び内胚葉マーカー、ＴＵＢＢ３（チューブリンベータ３クラスＩＩＩ）及びフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）は、三次元フォーマットにおいて有意に発現されず、ＴＵＢＢ３の上昇は二次元の設定でのみ捕捉される。これは、ｈｉＰＳＣが非神経外胚葉系統へとパターン化され、したがって、三次元フォーマットで乳腺前駆体に富んでいることを実証する。本発明者らは、ｐ６３（ｐ５３と相同性のある核タンパク質）及びサイトケラチン１４（ＫＲＴ－１４）などの一般的に使用される基底細胞／筋上皮マーカーの発現パターンを試験した。両方のマーカーは、両方の系において有意に検出可能である。更に、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）及びサイトケラチン８（ＫＲＴ８）は三次元システムでのみ追跡され、ＫＲＴ８は、二次元フォーマットではごく部分的に発現された。その結果、器官タイプの設定における三次元プレートは、乳腺（ｂｒｅａｓｔ）組織マーカー、管腔マーカー、及び基底マーカーのいずれも発現した。かかる乳腺様オルガノイドは、ＣＳＮ２（カゼインベータ）、乳タンパク質ペプチド、及びホルモン受容体を含むヒト乳腺（ｂｒｅａｓｔ）特異的タンパク質を発現する。管腔細胞は、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、及びＣＫ１８を特異的に発現するが、基底細胞は、ＣＫ１４、α－平滑筋アクチン、及びＰ６３を特異的に発現する。最終的に、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９Ｆ二重陽性細胞は、Ｄ１０とＤ３５との間の初期前駆細胞の段階で検出することができる。興味深いことに、ＣＳＮ２発現は、三次元器官系の最後の時点（Ｄ４２）でのみ捕捉され、二次元の分化プラットフォームでは捕捉されない。
定量的ＲＴ－ＰＣＲを使用して、ラクトサイト誘導中の分化の各段階を捕捉した（図４は三次元分化、図５は二次元分化）。二次元及び三次元の設定のいずれでも、多能性のマーカーとしてのＮａｎｏＧ発現は、細胞が成熟及び分化するのに従い減少する。神経外胚葉マーカー及び内胚葉マーカー、ＴＵＢＢ３（チューブリンベータ３クラスＩＩＩ）及びフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）は、三次元フォーマットにおいて有意に発現されず、ＴＵＢＢ３の上昇は二次元の設定でのみ捕捉される。これは、ｈｉＰＳＣが非神経外胚葉系統へとパターン化され、したがって、三次元フォーマットで乳腺前駆体に富んでいることを実証する。本発明者らは、ｐ６３（ｐ５３と相同性のある核タンパク質）及びサイトケラチン１４（ＫＲＴ－１４）などの一般的に使用される基底細胞／筋上皮マーカーの発現パターンを試験した。両方のマーカーは、両方の系において有意に検出可能である。更に、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）及びサイトケラチン８（ＫＲＴ８）は三次元システムでのみ追跡され、ＫＲＴ８は、二次元フォーマットではごく部分的に発現された。その結果、器官タイプの設定における三次元プレートは、乳腺（ｂｒｅａｓｔ）組織マーカー、管腔マーカー、及び基底マーカーのいずれも発現した。かかる乳腺様オルガノイドは、ＣＳＮ２（カゼインベータ）、乳タンパク質ペプチド、及びホルモン受容体を含むヒト乳腺（ｂｒｅａｓｔ）特異的タンパク質を発現する。管腔細胞は、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、及びＣＫ１８を特異的に発現するが、基底細胞は、ＣＫ１４、α－平滑筋アクチン、及びＰ６３を特異的に発現する。最終的に、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９Ｆ二重陽性細胞は、Ｄ１０とＤ３５との間の初期前駆細胞の段階で検出することができる。興味深いことに、ＣＳＮ２発現は、三次元器官系の最後の時点（Ｄ４２）でのみ捕捉され、二次元の分化プラットフォームでは捕捉されない。
【0253】
乳腺様オルガノイドのセクレトームの解析は、以下に記載されるように、オリゴ糖（ラクトース及びいくつかのＨＭＯを含む）、脂質（４つの脂肪酸を含む）、タンパク質（カゼインを含む７つが検出）、及びｍｉＲＮＡ（ＨＢＭにおいて典型的に検出される１１を含む７５が検出）を含むヒト乳特異的生物活性物質の分泌を示した。
【0254】
初代細胞の上清を、「Ａｕｓｔｉｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｔ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｌａｃｔｏｓｅ ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２０１８，１０１０，８６－９６」に記載される手順に従って、わずかな変更を加えて、ラクトース又はヒト乳オリゴ糖の存在について解析した。試料をＵＨＰＬＣで解析し、検出されたラクトース又はヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を、ラクトース及び７種類のＨＭＯ（２’ＦＬ、３’ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、３’ＳＬ及び６’ＳＬ）の混合物の検量線に対して定量した。この方法は０．１ｍｇ／Ｌの限界を有していると推定された。初代細胞の上清では、４２日目にラクトース（０．２２ｍｇ／Ｌ）及び６’ＳＬ（０．３２ｍｇ／Ｌ）が検出された。
【0255】
培地及び細胞上清中の脂肪酸を、水素炎イオン化検出器と連結したガスクロマトグラフィーによって解析した。簡単に説明すると、４２日目に得られた上清を解析して、いくつかの脂質クラスに含まれる脂肪酸の存在を調査する。溶融シリカＣＰ－Ｓｉｌ ８８キャピラリーカラム（１００％シアノプロピルポリシロキサン、１００ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚０．２５ｍｍ）を備えた分取ステーションモジュールを有する７６９３オートサンプラーを備えた７８９０Ａガスクロマトグラフを、２５０℃で加熱されたスプリットインジェクター（１：２５比）、及び３００℃で操作される水素炎イオン化検出器と共に使用する。ＦＡＭＥ（脂肪酸メチルエステル）の調製は、メタノール性クロリド酸（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄｒｉｃ ａｃｉｄ）による試料の直接エステル交換によって行われる。ＦＡＭＥの分離は、キャピラリーガスクロマトグラフィー－ＦＩＤ（ＧＣ）を使用して行われる。ＦＡＭＥの同定は、保持時間（ＲＴ）及び外部標準との比較によって行われる。脂肪酸の定量は、内部標準としてメチルＣ１１：０を使用する計算によって行われる。本方法のエステル交換性能は、第２の内部標準としてＴＡＧ Ｃ１３：０を用いて制御される。内部標準の添加後、溶液を２ｍＬのメタノール、２ｍＬのメタノール／ＨＣｌ（３Ｎ）及び１ｍＬのヘキサンと混合した。１００℃／６０分で加熱した後、試料を室温まで冷却し（約１５分）、２ｍＬの水を添加することによって反応を停止させる。遠心分離後、有機相をＧＣに直接注入する。
【0256】
４２日目における実施例４ａのプロトコルからの脂肪酸の結果（培地と上清との間で観察された差）を表１に示す。
【0257】
以下の表１は、細胞上清サンプル中の発現された脂肪酸を列挙する。
【0258】
【表1】
【0259】
細胞上清中のタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイリング、次いでＬＣ－ＭＳＭＳによる同一性確認のためのバンド単離を使用して解析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析のために、調製した試料の全量をゲルにロードした。ヒト乳サンプルを対照とし、比較のために添加した。選択されたゲル領域（バンド）を切断して、ＬＣ－ＭＳＭＳによってヒトタンパク質を探索した。最終的に、バンドをゲル内トリプシン消化に供し、ＬＣ－ＭＳＭＳによって解析した。ＬＣ－ＭＳＭＳデータをＰｅａｋｓ Ｓｔｕｄｉｏで解析し、ヒトタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔデータベースに対して照合した。
【0260】
以下の表２には、切り出された全てのバンドについての最良の候補を掲載する。
【0261】
【表2】
【0262】
ＥｘｏＱｕｉｃｋポリマーネットを使用して、エキソソーム単離及びｍｉＲＮＡプロファイリングを行った。ＥｘｏＱｕｉｃｋポリマーは、ネットワークを形成することによってエキソソームを沈殿させるように作用し、ある程度のサイズのエキソソームを全て回収する。ＥｘｏＱｕｉｃｋメッシュが形成されると、エキソソームは、単純な低速遠心分離によって容易にペレットとして沈殿する。エキソソームは損なわれておらず、タンパク質又はＲＮＡ解析が可能な状態であり、機能試験にあたり生物活性を有する。沈殿緩衝液を０．２５倍の割合で試料に添加し、次いでボルテックスした。混合物を４℃で一晩インキュベーションした。インキュベーション後、試料を１５００×ｇで３０分間遠心分離した。エキソソームペレットを、ＱＣ用のＢｕｆｆｅｒ ＸＥ（ＱＩＡＧＥＮ）又はｍｉＲＮＡプロファイリング用のＨＴＧ ＥｄｇｅＳｅｑ ｍｉＲＮＡ Ｗｈｏｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＡｓｓａｙからのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを用いて初期容量でボルテックスすることによって再懸濁した。細胞外小胞（ＥＶ）の単離を評価するために、まず上清を３０００ｇで１５分間遠心分離して、細胞ペレット及び破片を除去した。次いで、１００マイクロリットルの培地を使用し、ＥｘｏＱｕｉｃｋ緩衝液（０．２５×比）により４℃で一晩沈殿させた。ＥＶ沈殿物を１５００ｇで３０分間の遠心分離によって回収した。各試料に対して２回の沈殿を行い、１回目のＥＶ沈殿は、実施する可能性のあるさらなる解析のために緩衝液ＸＥ（ＱＩＡＧＥＮ）に再懸濁し、２回目の沈殿では、１０倍濃縮するために５０ｕｌのＨＴＧ溶解緩衝液のみに再懸濁し、その後ＨＴＧによるｍｉＲＮＡプロファイリングに供した。
【0263】
ｍｉＲＮＡプロファイリングのために、試料を第１の溶解ステップにおいて直接使用した。したがって、全試料を直接使用し、血漿溶解緩衝液で１：１の比で溶解した。次に、プロテイナーゼＫ（１／１０）を添加し、試料をＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ上で５０℃、６００ｒｐｍで３時間インキュベーションした。ＥＶを溶解緩衝液に再懸濁し、同じ条件で溶解し、溶解インキュベーションの前には９５℃で１０分間のインキュベーションステップを加えた。２６μＬの溶解物を、ＨＴＧ ＥｄｇｅＳｅｑ ｍｉＲＮＡ全トランスクリプトームアッセイＶ２手順に従って、ＨＴＧプロセッサ上で７０μＬの油で処理した。インデックス付け及び増幅ライブラリーのために、試料をＩｌｌｕｍｉｎａアダプターでタグ付けし、ＯｎｅＴａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ（９５℃で４分；１６サイクル：９５℃で１５秒、５６℃で４５秒、６８℃で４５秒；６８℃１０分；４℃で保持）でＰＣＲし、ロボット液体ハンドラーＳｃｉＣｌｏｎｅ ＮＧＳ ＷｏｒｋＳｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上でＡＭＰｕｒｅ洗浄した（２．５比）。Ｈａｍｉｌｔｏｎロボット上で本発明者らのカスタムプーリングプログラムを用いてプールを得た。サンプルを、ＧＸタッチチップＨＳ定量に基づいてプールした。２回目には、ＡＭＰｕｒｅ Ｂｅａｄ（１．８比）を用いて手動でプールを精製して、残っている可能性のある微量のプライマー二量体を除去し、Ｑｕｂｉｔを用いて定量して、最終濃度を２ｎＭに調整した。最後のステップとして、ＭｉＳｅｑ配列決定のために、５％ＰｈｉＸを添加してＭｉＳｅｑ上に２０ｐＭのプールをロードし、１５０Ｖ３キットを用いて５０塩基シングルリードについてＭｉＳｅｑ上で配列決定した。
【0264】
簡潔には、細胞上清中には９７４とおりのｍｉＲＮＡが検出され、そのうちの７５とおりを超えるｍｉＲＮＡが、乳試料において高度に発現されるｍｉＲＮＡである。
【0265】
以下の表３には、上位１０とおりの高度に発現されたｍｉＲＮＡを掲載する。
【0266】
【表3】
【0267】
本発明者らの知見は、正常な乳腺細胞の運命及び機能と、母乳生物活性物質生産との調節及び発達を研究するための新規のｉＰＳＣベースの三次元器官型モデルを提供する。
【0268】
実施例５
ヒト母乳中に見出されるものに非常に似ている乳汁生物活性物質を生成させるために、経過時間短縮プロトコルとして４２日間及び３１日間で骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を使用する、異なる方法を、ヒト乳腺の生体模倣モデルとしてｉＰＳＣ由来乳腺オルガノイドを使用する三次元プラットフォームにおいて確立した（図６）。
ヒト母乳中に見出されるものに非常に似ている乳汁生物活性物質を生成させるために、経過時間短縮プロトコルとして４２日間及び３１日間で骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）及びレチノイン酸（ＲＡ）を使用する、異なる方法を、ヒト乳腺の生体模倣モデルとしてｉＰＳＣ由来乳腺オルガノイドを使用する三次元プラットフォームにおいて確立した（図６）。
【0269】
２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４及び１μＭのＲＡを単一フォーマット又は組み合わせフォーマットで使用した４２日間プロトコル及び経過時間短縮プロトコル（３１日間－－＊は、ＢＭＰ４及びＲＡの組み合わせを含む短縮改された変プロトコル（３１日間）を示す）における三次元ｉＰＳＣ細胞は、フローサイトメトリーによる定量を用い対照条件と比較したときに、ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１（ＣＤ２２７）及びＧＡＴＡ３などの乳腺前駆細胞マーカーの発現を誘導することができ、又は分化の時間経過及び／又は誘導前の段階（図７のａ～ｃ）及び誘導後期間（図の７ｄ～ｆ）の間、それらの発現プロファイルを維持することができる。
【0270】
本発明者らは、正常な長さの及び短縮されたプロトコルにおいて、ｉＰＳＣに由来するラクトサイトにおける様々な乳腺上皮マーカーの発現を評価した（図８）。この短縮プロトコルは、ｉＰＳＣ分化中に乳腺上皮細胞の系統を決定するための特異的遺伝子としてＲＥＬＡを誘導する（図８のａ）。ＧＡＴＡ３などの成熟管腔マーカーに加えて、ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８／１８などの特異的なラクトサイトマーカーも短縮プロトコルにおいて誘導される（図８のｂ～ｅ）。加えて、本発明者らが３１日プロトコルに切り替えると、ＥＳＲＲＡレベルが誘導される（図８のｆ）。同様に、分化の進行の短縮は、ＣＤ２４及びＩＴＧＡ６（ＣＤ４９ｆ）などの乳腺の前駆体マーカーのレベルの上昇と関連する（図８のｇ～ｈ）。
【0271】
ヒトオステオポンチンペプチド－ＧＤＳＶＶＹＧＬＲ及び－ＹＰＤＡＶＡＴＷＬＮＰＤＰＳＱＫは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって細胞培養上清中に特異的に検出された（図９）。
【0272】
本明細書で述べる現在の好ましい実施形態に対する様々な変更及び修正が、当業者には明らかとなる点を理解されたい。このような変更及び修正は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、並びに本発明の付随する利点を減らすことなく、なされてもよい。したがって、このような変更及び修正は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】