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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】乳様生成物の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20241024BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20241024BHJP
C12M 3/02 20060101ALI20241024BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20241024BHJP
A61P 3/02 20060101ALI20241024BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241024BHJP
C07K 14/78 20060101ALN20241024BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20241024BHJP
C07K 14/50 20060101ALN20241024BHJP
C07K 14/62 20060101ALN20241024BHJP
C07K 14/79 20060101ALN20241024BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N5/10
C12Q1/6876 Z
C12M3/02
A61K35/545
A61P3/02
A61P43/00
C07K14/78
C07K14/47
C07K14/50
C07K14/62
C07K14/79
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024524421
(86)(22)【出願日】2022-10-27
(85)【翻訳文提出日】2024-06-20
(86)【国際出願番号】 EP2022080088
(87)【国際公開番号】W WO2023073107
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】21205064.5
(32)【優先日】2021-10-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】590002013
【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100140453
【弁理士】
【氏名又は名称】戸津 洋介
(72)【発明者】
【氏名】マルケス ド リマ， マリア
(72)【発明者】
【氏名】バッハマン， ヴィルジニー
(72)【発明者】
【氏名】ビアンキ， アリアナ
(72)【発明者】
【氏名】マシンチアン， オミッド
(72)【発明者】
【氏名】クラウス， マリン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA01
4B029AA21
4B029BB11
4B029CC01
4B029GA08
4B029GB09
4B063QA01
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QR77
4B063QS25
4B063QS34
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065BB23
4B065BC41
4B065BC46
4B065CA44
4B065CA46
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB39
4C087BB65
4C087NA14
4C087ZC51
4C087ZC80
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA61
4H045CA40
4H045DA37
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA72
(57)【要約】
乳腺細胞の製造方法、及び哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物の製造方法であって、哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）に由来する、例えば、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来するラクトサイトを生成するステップ、及び哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物をラクトサイトから発現させるステップを含む、方法。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
乳腺細胞集団の製造方法であって、ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップ、及び
ｉｉ）前記ＥＢを成長させて、乳腺細胞集団を生成するステップ、
を含む、方法。
【請求項2】
前記培養ステップｉ）が、前記ｍｉＰＳＣを、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによって前記ｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させることを、任意に少なくとも１２日間行うステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記成長ステップｉｉ）が、前記形成されたＥＢを、三次元包埋系中で、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間にわたって、成長させて、ラクトサイトを生成するステップを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記乳腺細胞が、ヒト乳腺細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ＢＭＰ４が、０日目～１０日目の間、好ましくは０日目～３日目の間に前記培養培地に添加され、０日目は、前記ｉＰＳＣが前記培養培地に初めて添加される時点である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
ＢＭＰ４が、３日間にわたって前記培養培地に添加される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
ＢＭＰ４が、５～２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又は２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記培養培地に添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ＥＢが、任意にＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１、及びＧＡＴＡ３から選択される、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記ＥＢでは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける前記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して増加している、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上が、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意にＥＢの少なくとも５０％が、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意にＥＢの少なくとも１５％が、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意にＥＢの少なくとも２０％が、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、及び／又は任意にＥＢの少なくとも１５％が、ＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記ＥＢが、任意にＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２Ｃから選択される、１つ以上の非神経性外胚葉マーカーを発現する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記ＥＢでは、１つ以上の非神経性外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける前記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも２倍増加しており、任意に少なくとも３～１５倍増加している、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ＥＢでは、１つ以上の神経性外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける前記神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも０．５倍に減少しており、任意に、前記神経性外胚葉マーカーが、ＰＡＸ６、ＯＸＴ２、及びＳＯＸ１１から選択される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記ＥＢが、１つ以上の乳特異的生物活性マーカー、任意にオステオポンチン（ＯＰＮ）を発現する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記ＥＢでは、ＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおけるＯＰＮの発現レベルと比較して少なくとも２倍増加しており、任意に少なくとも４～１８倍増加している、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記乳腺細胞が、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記乳腺細胞が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して乳特異的生物活性マーカーの発現の増加を生じ、任意に、前記乳腺細胞が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して乳特異的生物活性マーカーの発現の少なくとも２倍の増加を生じ、任意に、前記マーカーが、エストロゲン関連受容体アルファ（ＥＳＲＲＡ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）、及びＭＵＣ１から選択される、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
分化プロトコルにおいて哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるためのＢＭＰ４の使用。
【請求項19】
哺乳動物乳様生成物の製造方法であって、Ｃ）哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）由来のラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｄ）前記ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップ、
を含み、ステップＡ）が、ＢＭＰ４を含む培養培地中で前記ｍｉＰＳＣを培養するステップを含む、方法。
【請求項20】
ヒト乳様生成物を製造するための方法であって、ステップＡ）が、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地中、例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、適切な三次元培養系において、例えば三次元懸濁条件において、少なくとも１２日間にわたって培養することによって、前記ｈｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）前記形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、適切な三次元包埋系中で、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間にわたって成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
ステップＡ）ｉ）が、以下：ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で、２日間にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、前記基礎培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４、ヘパリン、及びヒドロコルチゾンが添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で１０日間にわたってＥＢをインキュベートすることによる、非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップとして定義され、並びに
ステップＡ）ｉｉ）が、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で５日間にわたってインキュベートするステップ、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることにより分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることにより乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
ステップＡ）ｉ）が、以下：ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で２日間にわたってインキュベートすることによる、ｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、ＥＢを、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間にわたってインキュベートすることによる非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップとして定義され、並びにステップＡ）ｉｉ）が、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間にわたって包埋するステップ、
ｉｉｉ）包埋されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間にわたってインキュベートすることにより分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間にわたってインキュベートすることにより乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項23】
ステップＡ）が、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項１９～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
ステップＡ）が、三次元懸濁培養条件で行われる、請求項１９又は２３に記載の方法。
【請求項25】
請求項１９～２４のいずれか一項に記載の方法に従って得ることができるヒト乳様生成物。
【請求項26】
治療に使用するための、請求項２５に記載のヒト乳様生成物。
【請求項27】
請求項２５に記載のヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物としての、任意に母乳代替物としての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、乳腺細胞の製造方法に関する。本発明はまた、哺乳動物乳様生成物、例えば、ヒト乳様生成物（ｐｒｏｄｕｃｔ）のインビトロでの製造方法であって、哺乳動物人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する、例えば、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来するラクトサイトを培養及び分化によって生成すること、及び／又はかかるラクトサイトを含む乳腺様腺オルガノイドを生成すること、並びに哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物をかかるラクトサイト及び／又は乳腺様腺オルガノイドから発現させることを含む、方法に関する。本発明はまた、哺乳動物乳様生成物、例えば、かかる方法から得ることができるヒト乳様生成物に関する。
【0002】
［背景技術］
哺乳動物の乳、特にヒトの乳は、多数の成分を含む複雑な体液であり、その成分のそれぞれは、乳児及びおそらく母体の健康に実質的に寄与し得る。少なくとも６ヶ月齢まではヒト母乳が最も適切な栄養源であることが次第に明らかになってきている。ヒト乳の多くの成分は、乳児用フォーミュラの製造の基礎となる牛乳中には全く見られないか、ほとんど見られないか、又は活性が低い。このような成分には、例えばタンパク質ラクトフェリン、増殖／成長因子、長鎖多価不飽和脂肪酸又はオリゴ糖が含まれる。ヒト乳組成物は、現在の乳児用フォーミュラを開発するためのゴールドスタンダードとして使用されているが、乳児用フォーミュラ組成物における最近の主要な開発にもかかわらず、現在の製造プロセスでヒト乳の複製物が達成されると考えることは非現実的である。
哺乳動物の乳、特にヒトの乳は、多数の成分を含む複雑な体液であり、その成分のそれぞれは、乳児及びおそらく母体の健康に実質的に寄与し得る。少なくとも６ヶ月齢まではヒト母乳が最も適切な栄養源であることが次第に明らかになってきている。ヒト乳の多くの成分は、乳児用フォーミュラの製造の基礎となる牛乳中には全く見られないか、ほとんど見られないか、又は活性が低い。このような成分には、例えばタンパク質ラクトフェリン、増殖／成長因子、長鎖多価不飽和脂肪酸又はオリゴ糖が含まれる。ヒト乳組成物は、現在の乳児用フォーミュラを開発するためのゴールドスタンダードとして使用されているが、乳児用フォーミュラ組成物における最近の主要な開発にもかかわらず、現在の製造プロセスでヒト乳の複製物が達成されると考えることは非現実的である。
【0003】
今日、ヒト乳の唯一の供給源は、ヒトドナー（授乳中の母親）である。献乳は、非商業的使用（ヒト乳バイオバンク）及び商業的使用について報告されている。しかしながら、献乳は限られており、強い規制、安全性、及び時には倫理的又は宗教的制約を伴う。
【0004】
哺乳動物の乳、特にヒト乳中には幹細胞が見出されており、ヒト母乳幹細胞（ＨＢｓＣ）と呼ばれている。ｈＢＳＣは、高度に可塑性であり、培養において複数の細胞種に分化し、より重要なことには、ヒト乳腺の小葉－腺房（ｌｏｂｕｌｏ－ａｌｖｅｏｌａｒ）構造を形成するのに必要な３つの系統に分化することが示されている（Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２）。しかしながら、ヒト母乳を生産させるためのｈＢＳＣの使用は、ヒトドナーを必要とするため、実用的でもなく、持続可能でもない。
【0005】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれる、幹細胞機能を有する細胞株をベースとした技術が知られている。ヒトｉＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）からヒト乳腺様オルガノイド（ｍａｍｍａｒｙ ｌｉｋｅ ｏｒｇａｎｏｉｄｓ）を生成するための信頼できる２ステッププロトコルが開発されている（Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｖｏｌ ８，２０５－２１５，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４ｔｈ，２０１７）。
【0006】
したがって、本発明の目的は、乳腺細胞の製造方法を改善すること、及び培養細胞において、哺乳動物乳、例えばヒト乳の発現を再現することである。本発明の目的はまた、レシピエントの特定のニーズに適合させることができる培養細胞において、カスタマイズされた哺乳動物乳様生成物、例えばヒト乳様生成物を製造すること、及び／又は乳幼児期栄養のための既存のウシベースの解決策を補完するためのヒト乳生物活性物質を製造することである。
【0007】
［発明の概要］
本発明は、上記の技術的課題を解決する。
本明細書では、乳腺細胞集団の製造方法が提供され、該方法は、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップ、及び
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップ、
を含む。
本発明は、上記の技術的課題を解決する。
本明細書では、乳腺細胞集団の製造方法が提供され、該方法は、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップ、及び
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップ、
を含む。
【0008】
また、本明細書では、分化プロトコルにおいて哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるためのＢＭＰ４の使用も提供される。
【0009】
本明細書では更に、哺乳動物乳様生成物の製造方法が提供され、該方法は、
Ａ）哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）由来のラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｂ）上記ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップ、
を含み、ステップＡ）は、ＢＭＰ４を含む培養培地中でｍｉＰＳＣを培養するステップを含む。
Ａ）哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）由来のラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、
Ｂ）上記ラクトサイトから哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップ、
を含み、ステップＡ）は、ＢＭＰ４を含む培養培地中でｍｉＰＳＣを培養するステップを含む。
【0010】
本明細書中に記載される方法に従って得ることができるヒト乳様生成物も、本明細書において更に提供される。
【0011】
本明細書では更に、治療に使用するためのヒト乳様生成物も提供される。
【0012】
最後に、本明細書中に記載されるヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物としての使用、任意に母乳栄養代替物としての使用が、本明細書において提供される。
【0013】
［発明を実施するための形態］
定義
本発明の文脈において、「インビトロ」という用語は、試験管、培養皿、バイオリアクター又は生きている生物の体外の任意の場所で行われるか又は生じることを意味する。
定義
本発明の文脈において、「インビトロ」という用語は、試験管、培養皿、バイオリアクター又は生きている生物の体外の任意の場所で行われるか又は生じることを意味する。
【0014】
本発明の文脈において、「哺乳動物」という用語は、哺乳動物種、例えばヒト、ウシ、サル、ラクダ、ヒツジ、ヤギなどに属する動物を指す。
【0015】
本発明の文脈において、「ラクトサイト」又は「乳腺様細胞」という用語は、ＣＫ１８細胞マーカーを発現し、かつ哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）に由来する、特にヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する、分泌上皮細胞を指す。本明細書で使用されるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、市販されており、任意の適切なｈｉＰＳＣ株から選択されてよい。本発明の文脈における適切なヒト人工多能性幹細胞株は、例えば、本発明に従って使用される、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から市販されているｈｉＰＳＣ株６０３である。更に、適切なｈｉＰＳＣは、例えば、Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，（２０１７，上記）に記載されているように選択されてもよい。本発明の一実施形態では、ｈｉＰＳＣは、改変されていない（ｎｏｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）。一実施形態では、ｈｉＰＳＣは、外因性核酸を含むように及び／又は外因性核酸を含む誘導性遺伝子発現系を含むようには改変されていない。ここでいう誘導性遺伝子発現系は、ホルモン又はシグナル伝達因子を発現するように構成されている。一実施形態では、外因性核酸及び／又は外因性核酸を含む誘導性遺伝子発現系が、ラクトサイトへの細胞分化を促進している。
【0016】
本発明の文脈において、「乳腺様（ｍａｍｍａｒｙ ｇｌａｎｄ ｌｉｋｅ）オルガノイド」又は「乳腺様（ｍａｍｍａｒｙ ｌｉｋｅ）オルガノイド」という用語は、二次元又は三次元（２Ｄ／３Ｄ）で発達し、上記で定義されたようなラクトサイトを含む、乳腺のミニチュア化及び単純化されたバージョンを意味する。
【0017】
本発明の文脈において、「ヒト乳様生成物」という用語は、細胞培養した乳生成物である。かかる生成物は、本発明の方法に従って生成されたラクトサイト及び／又は乳腺様オルガノイドによって発現される食用生成物である。
【0018】
本発明による「ヒト乳様生成物」は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳と同じ成分（例えば、生物活性物質、多量栄養素及び微量栄養素並びにそれらのレベルの観点による）を有することができる。これを本明細書では「標準ヒト乳生成物」と称する。別の選択肢として、本発明による「ヒト乳様生成物」は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然に見出される成分の比率及び濃度とは変えることができる。これを本明細書では「非標準乳様生成物」と称する。本発明による「ヒト乳様生成物」は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然には見出されない成分を含むように調整することができる（「調整（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）乳様生成物」）。ヒト乳様生成物の非限定的な例は、サプリメント、強化剤、ヒト母乳代替物（又は代用物）、ならびに生物活性物質の１つ及び／又は一部のみが富化された原材料、栄養状態の良好な母親のヒト母乳に典型的に見出すことができる多量栄養素及び微量栄養素からなる群から選択される。
【0019】
「ヒト乳様生成物」は、天然に分泌される乳を摂取する代わりに使用することができる（「ヒト乳代替物」）。乳代替生成物は、天然に分泌された乳と組み合わせて摂取されるサプリメント（「ヒト乳サプリメント」）又は強化剤（「ヒト乳強化剤」）として使用することができる。
【0020】
一実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物は、少なくとも、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に典型的に見出すことができる多量栄養素及び微量栄養素を含む。一実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物は、タンパク質、ペプチド、脂質（リノール酸及びα－リノレン酸を含む）、炭水化物、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸、葉酸、ビタミンＣ、及びビオチンを含む）、ミネラル（鉄、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、マンガン、ヨウ素、セレン、銅、及び亜鉛を含む）、コリン、ミオイノシトール、及びＬ－カルニチンを含む。一実施形態では、本発明による標準ヒト乳様生成物は、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）、及び分泌型ＩｇＡからなる群から選択される少なくとも１つの生物活性物質も含む。本発明による標準ヒト乳様生成物は、自然に発生するヒト母乳生成物ではない。
【0021】
別の実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、該生成物を摂取する乳児の具体的なニーズに適合させることができる。本発明によるヒト乳様生成物は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に典型的に見出され得る、生物活性物質、多量栄養素及び微量栄養素のうちの１つのみ及び／又は一部を含み得る。かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、「非標準ヒト乳様生成物」という用語で称されることもある。一実施形態では、本発明による非標準ヒト乳様生成物は、タンパク質、ペプチド、脂質（リノール酸及びα－リノレン酸を含む）、炭水化物（ヒト乳オリゴ糖を含む）、ビタミン類（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸、葉酸、ビタミンＣ及びビオチンを含む）、ミネラル（鉄、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、マンガン、ヨウ素、セレン、銅及び亜鉛を含む）、コリン、ミオイノシトール、Ｌ－カルニチン、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡからなる群から選択される栄養素又は生物活性物質のうち１つ以上を含む。
【0022】
本発明の文脈において、「無調整ヒト乳様生成物」という用語は、ラクトサイトによって、及び／又は本発明の方法のステップＡ）及びステップＢ）に従って生成された乳腺様オルガノイドによって発現され、本発明の方法の任意のステップＣ）によるさらなる処理に供されていない、ヒト乳様生成物を示す。無調整ヒト乳様生成物は、標準及び非標準ヒト乳様生成物の両方を含み得る。非標準ヒト乳様生成物の非限定的な例は、サプリメント、強化剤、ならびに栄養状態の良好な母親のヒト母乳に典型的に見出され得る、生物活性物質、多量栄養素及び微量栄養素のうちの１つのみ及び／又は一部に富んだ原材料からなる群から選択される。
【0023】
本発明の文脈において、「調整ヒト乳様生成物」という用語は、ラクトサイトによって、及び／又は本発明の方法のステップＡ）及びステップＢ）に従って生成された乳腺様オルガノイドによって発現され、本発明の方法の任意のステップＣ）によるさらなる処理に供されている、ヒト乳様生成物を示す。
【0024】
調整ヒト乳様生成物は、標準及び非標準ヒト乳様生成物の両方を含み得る。
【0025】
本発明の文脈において、「ＥＢ」という用語は、「胚様体」を意味する。
【0026】
本発明の文脈において、「ｍＥＢ」という用語は、「ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地で培養された胚様体」を意味する。
【0027】
ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地は、基礎培地、少なくとも１種類の増殖サプリメント、ヘパリン及びヒドロコルチゾンを含む、無血清培養培地を指す。
【0028】
本発明の文脈において、「胚様体（ＥＢ）」、「ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地で培養された胚様体（ｍＥＢ）」、「マンモスフェア」、及び／又は「スフェロイド」という用語は、本発明の方法のステップＡ）下で多能性幹細胞（ＰＳＣ）によって懸濁状態で形成された三次元凝集体を指す。
【0029】
本発明の文脈における「乳児」という用語は、１２ヶ月齢未満、例えば９ヶ月齢未満、特に６ヶ月齢未満の小児を指す。
【0030】
本発明の文脈において、乳児は、正期産児又は早期産児のいずれかであり得る。本発明の一実施形態では、乳児は、早期産児及び正期産児の群から選択される。
【0031】
用語「正期産児」は、正期産又は３７週以上の在胎齢で生まれた乳児を指す。
【0032】
用語「早期産児」は、３７週未満の在胎齢で生まれた乳児を指す。
【0033】
本発明の文脈において、「出生時体重」という用語は、出生後に胎児又は新生児が獲得していた最初の体重を意味する。
【0034】
本発明の文脈において、「低出生体重」という用語は、２５００ｇ未満（２４９９ｇ以下）の出生時体重を意味する。
【0035】
本発明の文脈において、「極低出生時体重」という用語は、１５００ｇ未満（１４９９ｇ以下）の出生時体重を意味する。
【0036】
本発明の文脈において、「超低出生時体重」という用語は、１０００ｇ未満（９９９ｇ以下）の出生時体重を意味する。
【0037】
用語「在胎不当過小児」は、在胎期間別成長チャート（ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｒｔ）の出生時体重に対する平均基準よりも２標準偏差を超えて低い出生時体重を有する乳児、又は同じ在胎齢の乳児から得られた集団ベースの体重データの１０ｔｈパーセンタイル未満の出生時体重を有する乳児を指す。「在胎不当過小児」という用語には、構成的もしくは遺伝的起源のいずれかから、又は子宮内発育遅延の結果として、出生時に小さい乳児が含まれる。
【0038】
本発明の文脈において、「幼児（ｙｏｕｎｇ ｃｈｉｌｄｒｅｎ）」又は「低年齢の小児（ｔｏｄｄｌｅｒ）」という用語は、１～３歳の小児を示す。
【0039】
本明細書で使用される「乳児用フォーミュラ」という用語は、乳児を対象とし、Ｃｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、（Ｃｏｄｅｘ ＳＴＡＮ ７２－１９８１）、及びＣｏｄｅｘ Ａｌｉｍｅｎｔａｒｉｕｓ、（Ｃｏｄｅｘ ＳＴＡＮ ７２－１９８１）に定義されている乳児用特別用途食品（特別医療目的用食品を含む）に定義されている栄養組成物を指す。乳児用フォーミュラはまた、出生後１ケ月の間の乳児の特定の栄養補給用途を意図する食品であって、当該フォーミュラそのものによって、このカテゴリーに該当する乳児の栄養要件（乳児用フォーミュラ及びフォローオンフォーミュラに対する、Ａｒｔｉｃｌｅ ２（ｃ）ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ ９１／３２１／ＥＥＣ ２００６／１４１／ＥＣ ｏｆ ２２ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００６）を満たす、食品を指す。乳児用フォーミュラは、スターター乳児用フォーミュラ及びフォローアップフォーミュラ又はフォローオンフォーミュラを包含する。一般に、スターターフォーミュラは、出生時からの乳児のための母乳代替物であり、フォローアップフォーミュラ又はフォローオンフォーミュラは６ヶ月以降である。
【0040】
「グローイングアップミルク」（又はＧＵＭ）は、１年目以降から与えられる。このミルクは、概して、特に小児の栄養必要量に合わせて調整された乳系飲料である。かかる飲料は、他の食品と組み合わせて１２ヶ月から２～３歳の小児に与えるために使用される栄養組成物である。
【0041】
本発明の文脈において、「強化剤」という用語は、乳児又は幼児に対して栄養上の利益を有する１つ以上の栄養素を含む組成物を指す。
【0042】
「乳強化剤」という用語は、ヒト母乳、乳児用フォーミュラ、グローイングアップミルク、又は他の栄養素で強化されたヒト母乳のいずれかを強化又は補充するために使用される任意の組成物を意味する。したがって、本発明のヒト乳強化剤は、ヒト母乳、乳児用フォーミュラ、グローイングアップミルク、又は他の栄養素で強化されたヒト母乳に溶解させた後に投与することができ、あるいは独立した組成物として投与することができる。
【0043】
独立した組成物として投与される場合、本発明のヒト乳強化剤は、「サプリメント」であると特定することもできる。一実施形態では、本発明の乳強化剤はサプリメントである。
【0044】
「ヒト乳強化剤」という用語は、ヒト母乳、又は他の栄養素で強化されたヒト母乳を強化又は補充するために使用される任意の組成物を意味する。本発明による「ヒト乳強化剤」は、極低出生時体重（ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ、ＶＬＢＷ）又は超低出生時体重（ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｌｏｗ ｂｉｒｔｈ ｗｅｉｇｈｔ、ＥＬＢＷ）を有する早産で生まれた乳児に投与されることが意図され得る。
【0045】
本発明による乳強化剤は、液体形態の粉末であってもよい。
【0046】
液体形態を有する乳強化剤組成物は、いくつかの特定の利点を示す。例えば、液体製剤は、特定の重量又は体積の較正された液滴を送達する包装と組み合わせられる場合、より便利であり得る。
【0047】
更に、液体製剤は強化される組成物と混合するのがより容易であるが、粉末製剤は場合によっては塊を形成することがある。
【0048】
本発明の文脈において、「哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率及び成熟を増加させる」という用語は、分化プロトコルを経たｍｉＰＳＣの出発集団から生成された非乳腺前駆細胞と比較して乳腺前駆細胞の割合を増加させることを意味する。本発明において、上記分化プロトコルは、ＢＭＰ４の使用を含む。したがって、乳腺前駆細胞の割合の上記増加は、ＢＭＰ４の使用を含まないがそれ以外の点では同じである分化プロトコルを経たｍｉＰＳＣの出発集団から生成された、非乳腺前駆細胞に対する乳腺前駆細胞の割合と比較され得る。
【0049】
本発明の文脈において、「乳腺前駆細胞」という用語又は類似の用語は、少なくとも２つの乳腺前駆細胞マーカーを発現する細胞を意味する。上記マーカーとしては、ＣＤ４９ｆ、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、及びＧＡＴＡ３が挙げられるが、これらに限定されない。逆に、本発明の文脈において、「非乳腺前駆細胞」という用語又は類似の用語は、少なくとも２つの乳腺前駆細胞マーカーを発現しない細胞を意味する。
【0050】
本明細書におけるＥｐｉＣｕｌｔ培地又はＥｐｉＣｕｌｔＢ培地への言及は、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０及びＨＧＦを含む無血清培養培地を指す。
【0051】
本明細書中に開示される培養培地は、微生物の成長及び分化を支援するように設計された、必須栄養素を含む固体、半固体又は液体を指す。ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地は、本発明において使用され得る培養培地の一例である。
【0052】
本発明による方法及び使用
哺乳動物乳腺細胞の製造
本発明は、特定の条件下で培養され、分化したｉＰＳＣを用いた、乳腺細胞の製造方法に関する。
哺乳動物乳腺細胞の製造
本発明は、特定の条件下で培養され、分化したｉＰＳＣを用いた、乳腺細胞の製造方法に関する。
【0053】
驚くべきことに、本明細書中に記載される方法における骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の添加は、非神経性外胚葉前駆細胞の割合を増加させ、かつ神経性外胚葉前駆細胞の割合を減少させることによって、非神経性外胚葉前駆細胞のより均質な混合物を提供することが、本発明において実証された。
【0054】
また、本明細書中に記載される方法におけるＢＭＰ４の添加は、ｉＰＳＣの乳腺前駆細胞への分化効率を増加させ、したがって、本明細書中に記載される方法によって製造された乳腺前駆細胞の数を増加させることも本発明において実証された。この利点としては、乳腺細胞の収率がより高いことが挙げられる。
【0055】
したがって、本発明は、乳腺細胞集団の製造方法を提供し、該方法は、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップ、及び
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップ、
を含む。
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップ、及び
ｉｉ）ＥＢを成長させて、乳腺細胞の集団を生成するステップ、
を含む。
【0056】
本発明はまた、分化プロトコルにおいて哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるためのＢＭＰ４の使用も提供する。
【0057】
いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ヒト乳腺細胞である。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する。上記ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドは、泌乳性である、すなわち、乳を産生することができる。
【0058】
ＢＭＰ４は、本明細書中に記載される分化方法の初期段階において培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～１０日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に培養培地に添加される。０日目は、ｉＰＳＣが培養培地に初めて添加される時点、すなわち、ｉＰＳＣが初めて分化誘導される時点である。
【0059】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、３日間にわたって培養培地に添加される。
【0060】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。
【0061】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。
【0062】
本明細書中に記載される方法で生成されたＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１、及びＧＡＴＡ３から選択される。
【0063】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルが、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現と比較して増加している。
【0064】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上が、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上が、２つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１、及びＧＡＴＡ３から選択される。
【0065】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも５０％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも５０％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも７５％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも７５％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0066】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0067】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも３５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも３５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0068】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも１５％は、ＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0069】
ＥＢはまた、非神経性外胚葉マーカーも発現し、それによって、非神経系統への富化を示す。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の非神経性外胚葉マーカーは、ＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２Ｃから選択される。
【0070】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の非神経性外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも２倍増加している。
【0071】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の非神経性外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも３～１５倍増加している。
【0072】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、非神経性外胚葉マーカーＴＦＡＰ２Ａの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、ＥＢは、非神経性外胚葉マーカーＴＦＡＰ２Ｃの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも２倍増加している。
【0073】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の神経性外胚葉マーカーの発現が減少している。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の神経性外胚葉マーカーは、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、及びＳＯＸ１１から選択される。
【0074】
したがって、本明細書中に記載される方法は、細胞集団中に存在する細胞のタイプに関して、より均質な細胞集団を提供し、すなわち細胞集団は、非神経性外胚葉系統細胞の、より均質な集団を含む。
【0075】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の神経性外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも０．５倍に減少しており、すなわち、これらのマーカーの発現レベルは、半分に低減される。いくつかの実施形態では、上記神経性外胚葉マーカーは、ＰＡＸ６、ＯＸＴ２、及びＳＯＸ１１から選択される。
【0076】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳特異的生物活性マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳特異的生物活性マーカーは、オステオポンチン（ＯＰＮ）である。
【0077】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現の発現レベルと比較して、１つ以上の乳特異的生物活性マーカーが増加している。
【0078】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも２倍増加している。
【0079】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、ＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢは、ＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも２倍増加している。
【0080】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、ＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも４倍増加している。
【0081】
いくつかの実施形態において、ＥＢは、ＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも１８倍増加している。
【0082】
いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、乳特異的生物活性マーカーの発現の増加を生じる。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、乳特異的生物活性マーカーの発現における少なくとも２倍の増加を生じる。いくつかの実施形態では、上記マーカーは、エストロゲン関連受容体α（ＥＳＲＲＡ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）、及びＭＵＣ１から選択される。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、ＥＳＲＲＡの発現における少なくとも２倍の増加を生じる。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、ＫＲＴ１４の発現における少なくとも２倍の増加を生じる。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、ＭＵＣ１の発現における少なくとも２倍の増加を生じる。
【0083】
本明細書中に記載される乳腺細胞集団の製造方法は、本明細書中に記載される哺乳動物乳様生成物の製造方法に、特に本明細書中に記載されるステップＡ）の一部として、組み合わされ得る及び／又は用いられ得る。
【0084】
例えば、本明細書中に記載される乳腺細胞集団の製造方法のいくつかの実施形態では、培養ステップｉ）は、ｍｉＰＳＣを、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによってｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させることを、任意に少なくとも１２日間行うステップを含む。
【0085】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される乳腺細胞集団の製造方法のいくつかの実施形態では、成長ステップｉｉ）は、形成されたＥＢを、三次元包埋系中で、例えばマトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間にわたって、成長させて、ラクトサイトを生成するステップを含む。
【0086】
本明細書中に記載される乳腺細胞集団の製造方法のいくつかの実施形態では、培養ステップｉ）は、ｍｉＰＳＣを、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において培養して、それによってｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させることを、任意に少なくとも１２日間行うステップを含み、並びに成長ステップｉｉ）は、形成されたＥＢを、三次元包埋系中で、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間にわたって、成長させて、ラクトサイトを生成するステップを含む。
【0087】
哺乳動物乳様生成物の製造
本発明はまた、本明細書で定義されるステップＡ）及びＢ）のいずれか、並びに本明細書で定義される任意に行われるステップＣ）を含む、本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物の製造方法にも関する。本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物の上記製造方法はまた、ステップＡ）の一部として、哺乳動物乳腺細胞の製造方法も含み得る。特に、ＢＭＰ４は、本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物の製造方法のいずれかに、特にステップＡ）の一部として添加され得る。
本発明はまた、本明細書で定義されるステップＡ）及びＢ）のいずれか、並びに本明細書で定義される任意に行われるステップＣ）を含む、本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物の製造方法にも関する。本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物の上記製造方法はまた、ステップＡ）の一部として、哺乳動物乳腺細胞の製造方法も含み得る。特に、ＢＭＰ４は、本明細書で定義される哺乳動物乳様生成物の製造方法のいずれかに、特にステップＡ）の一部として添加され得る。
【0088】
ステップＡ ｈｉＰＳＣからのラクトサイト及び／又は乳腺様オルガノイドの生成
本発明の方法によれば、乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、ステップＡ）下で生成される。
本発明の方法によれば、乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、ステップＡ）下で生成される。
【0089】
このような乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、ｉＰＳＣを利用する、報告された方法のいずれに従って生成されてもよい。
【0090】
一実施形態では、このような乳腺様細胞及び／又はオルガノイド構造は、その全体が本明細書に援用されるＹｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｖｏｌ．８，２０５－２１５に記載の手順に従って生成され得る。
【0091】
より正確には、上述の科学刊行物（以下、「Ｙｉｎｇ Ｑｕ刊行物」又はＹｉｎｇ Ｑｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）とも称する）に記載されている方法は、ｉＰＳＣからヒト乳腺様細胞及び／又はオルガノイドを生成するための２ステップのプロトコルを表す。
【0092】
かかるプロトコルは、好ましくは、第１のステップ（ステップ１）として、ｉＰＳＣからの非神経性外胚葉細胞含有スフェア（ｍＥＢ／マンモスフェア）の分化及び富化、並びに第２のステップ（ステップ２）として、マトリゲル及びコラーゲンＩの三次元浮遊混合ゲル培養を使用した１０日目のｍＥＢ（マンモスフェア）からの乳腺様オルガノイドの生成を含む。
【0093】
ステップ１では、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中でｈｉＰＳＣを培養することによって、ｈｉＰＳＣからの非神経性外胚葉細胞含有スフェア（ｍＥＢ／マンモスフェア）の分化及び富化が行われる。完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地は、好ましくは、基礎培地、増殖サプリメント、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）、及びヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）から構成される。培地は通常３日毎に交換される。次いで、前記ステップで得られたｍＥＢ（マンモスフェア）を非神経外胚葉細胞について富化する。
【0094】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、ステップ１において培養培地に添加される。この添加は、本明細書に記載されるように乳腺前駆細胞の割合を増加させるためである。
【0095】
ＢＭＰ４は、本明細書中に記載される培養培地に添加される。
【0096】
ＢＭＰ４は、本明細書中に記載される分化方法の初期段階において培養条件に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～１０日目の間に培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に培養培地に添加される。０日目は、ｉＰＳＣが培養培地に初めて添加される時点、すなわち、ｉＰＳＣが初めて分化誘導される時点である。
【0097】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、３日間にわたって培養培地に添加される。
【0098】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、１０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。
【0099】
いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、０日目～３日目の間に、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加される。
【0100】
ステップ２では、Ｙｉｎｇ Ｑｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１７）のプロトコルに従って、浮遊混合ゲル（例えば、マトリゲル及びコラーゲンＩ）に基づいた三次元培養物を最初に調製することによって、乳腺様オルガノイドが生成される。次に、１０日目のｍＥＢ（マンモスフェア）を、上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させた混合ゲル中で５日間成長させる。次いで、乳腺様オルガノイド／ラクトサイトの調製のための分枝及び腺房分化の誘導のために、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地で細胞を培養する。乳タンパク質発現は、典型的には、３５日目に、ＢＳＡを添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地にプロラクチン、ヒドロコルチゾン、及びインスリンを添加し（乳分泌培地）、５日間培養することにより誘導する。Ｙｉｎｇ Ｑｕ，ｅｔ ａｌ．（２０１７年）のプロセスは、典型的には４０日目に完了する。
【0101】
本発明の一実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物の製造方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）ｉＰＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中でｉＰＳＣを培養し、１０日後にかかるｉＰＳＣから形成されたマンモスフェアを回収することによって、ｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
ｉ）ｉＰＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中でｉＰＳＣを培養し、１０日後にかかるｉＰＳＣから形成されたマンモスフェアを回収することによって、ｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
【0102】
本発明の一実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物の製造方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中でＰＳＣを培養し、かかるｉＰＳＣから形成されたマンモスフェアを１０日後に回収することによって、ＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
ｉ）本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中でＰＳＣを培養し、かかるｉＰＳＣから形成されたマンモスフェアを１０日後に回収することによって、ＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
【0103】
別の実施形態では、ステップＡ）下で、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物の製造方法が提供され、かかるステップＡ）は
ｉ）ｉＰＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中、マンモスフェア形成のための非接着条件において培養することによって、ｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを三次元の適切な系（例えば、マトリゲル及び／若しくはコラーゲンなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル、又は非接着性プレート中の懸濁培養物）中で少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
ｉ）ｉＰＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中、マンモスフェア形成のための非接着条件において培養することによって、ｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを三次元の適切な系（例えば、マトリゲル及び／若しくはコラーゲンなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル、又は非接着性プレート中の懸濁培養物）中で少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
【0104】
別の実施形態では、ステップＡ）下で、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成することを含む、ヒト乳様生成物の製造方法が提供され、かかるステップＡ）は
ｉ）ｉＰＳＣを、本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中、マンモスフェア形成のための非接着条件において培養することによって、ｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを三次元の適切な系（例えば、マトリゲル及び／若しくはコラーゲンなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル、又は非接着性プレート中の懸濁培養物）中で少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
ｉ）ｉＰＳＣを、本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中、マンモスフェア形成のための非接着条件において培養することによって、ｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを三次元の適切な系（例えば、マトリゲル及び／若しくはコラーゲンなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル、又は非接着性プレート中の懸濁培養物）中で少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
【0105】
一実施形態では、ステップＡ）下での乳腺細胞の運命決定（ｍａｍｍａｒｙ ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）は、特定の因子（例えば、上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦ）を添加した条件培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）を適用することによって得られる。
【0106】
本発明の一実施形態では、本方法は、ステップＡ）下で乳腺様オルガノイドを生成するステップを含む。
【0107】
本発明の一実施形態では、ステップＡ）下で乳腺様オルガノイドを生成する方法は、細胞の二次元単層、ＥＢを付着させた二次元（２Ｄ ｗｉｔｈ ａｔｔａｃｈｅｄ ＥＢ）、非接着性プレート中の懸濁液、及び混合浮遊ゲルからなる群から選択される条件下で細胞を培養することを含む。
【0108】
好ましい実施形態では、混合浮遊ゲルは、マトリゲル及びコラーゲンＩを含む。
【0109】
別の好ましい実施形態では、ステップＡ）におけるマンモスフェア（ｍＥＢ）は、適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で少なくとも１５日間にわたって成長させる。
【0110】
より好ましい実施形態では、ステップＡ）におけるマンモスフェア（ｍＥＢ）は、適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で２０日間にわたって成長させる。
【0111】
一実施形態では、本発明による方法は、ステップＡ）［例えば、ステップＡ）ｉ）下及び／又はステップＡ）ｉｉ）下］に従う培養条件を提供し、培養条件は、ヒト乳様生成物を分泌することができるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来するラクトサイトを生成するように調整されている。
【0112】
好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成するステップを含むヒト乳様生成物の製造方法が提供され、そのようなステップＡ）は、ｈｉＰＳＣを、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において少なくとも４２日間にわたって乳腺細胞（例えば、ラクトサイト）へと分化させるステップを含む。
【0113】
好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成するステップを含むヒト乳様生成物の製造方法が提供され、かかるステップＡ）は、ｈｉＰＳＣを、本明細書中に記載されるＢＭＰ４を含む適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において少なくとも４２日間にわたって乳腺細胞（例えば、ラクトサイト）へと分化させるステップを含む。
【0114】
別の好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成するステップを含む、ヒト乳様生成物の製造方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）で少なくとも１２日間にわたって（－２日目～１０日目）培養することによって、ｈｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、適切な三次元包埋系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル）中で少なくとも３０日間、好ましくは３２日間にわたって、成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
ｉ）ｈｉＰＳＣを、適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）中、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）で少なくとも１２日間にわたって（－２日目～１０日目）培養することによって、ｈｉＰＳＣを非神経外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、適切な三次元包埋系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル）中で少なくとも３０日間、好ましくは３２日間にわたって、成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
【0115】
別の好ましい実施形態では、ステップＡ）下でヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成するステップを含む、ヒト乳様生成物の製造方法が提供され、かかるステップＡ）は、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において少なくとも１２日間にわたって（－２日目～１０日目）培養することによって、ｈｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、適切な三次元包埋系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル）中で少なくとも３０日間、好ましくは３２日間にわたって、成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
ｉ）ｈｉＰＳＣを、本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中、適切な三次元培養系（例えば、三次元懸濁条件）において少なくとも１２日間にわたって（－２日目～１０日目）培養することによって、ｈｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、適切な三次元包埋系（例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル）中で少なくとも３０日間、好ましくは３２日間にわたって、成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含む。
【0116】
本発明の特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下で、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成するステップを含む、ヒト乳様生成物の製造方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、以下：
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のとおり、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン（ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）中、又はｍＴｅＳＲ（商標）中で、２日間（－２日目～０日目）にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）及びヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）が添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１０日間（０日目～１０日目）にわたってＥＢをインキュベートすることによる非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップとして定義され、並びに
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で５日間（１０日目～１５日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートするステップ、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間（１５日目～３５日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることによる分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間（３５日目～４２日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることによる乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む。
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のとおり、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン（ｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｕｍ）、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）中、又はｍＴｅＳＲ（商標）中で、２日間（－２日目～０日目）にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）及びヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）が添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１０日間（０日目～１０日目）にわたってＥＢをインキュベートすることによる非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップとして定義され、並びに
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で５日間（１０日目～１５日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートするステップ、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間（１５日目～３５日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることによる分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間（３５日目～４２日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることによる乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む。
【0117】
本発明の特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下で、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成するステップを含む、ヒト乳様生成物の製造方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、以下：
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のとおり）中、又はｍＴｅＳＲ（商標）中で、２日間（－２日目～０日目）にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）、及び本明細書中に記載のＢＭＰ４が添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１０日間（０日目～１０日目）にわたってＥＢをインキュベートすることによる、非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップとして定義され、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で５日間（１０日目～１５日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートするステップ、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間（１５日目～３５日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることによる分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間（３５日目～４２日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることによる乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む。
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のとおり）中、又はｍＴｅＳＲ（商標）中で、２日間（－２日目～０日目）にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、基礎培地、増殖サプリメントを含み、ヘパリン（典型的には４μｇ／ｍＬ）、ヒドロコルチゾン（典型的には０．４８μｇ／ｍＬ）、及び本明細書中に記載のＢＭＰ４が添加された、完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で１０日間（０日目～１０日目）にわたってＥＢをインキュベートすることによる、非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップとして定義され、
ステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で５日間（１０日目～１５日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートするステップ、
ｉｉｉ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間（１５日目～３５日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることによる分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間（３５日目～４２日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることによる乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む。
【0118】
ステップｉｖ）は、好ましくは、乳タンパク質発現細胞、特にラクトサイト、及び／又は乳腺様腺オルガノイドへの分化をもたらす。
【0119】
本発明の更に特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下で、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成するステップを含む、ヒト乳様生成物の製造方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、以下：
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のとおり、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）中、又はｍＴｅＳＲ（商標）中で、２日間（－２日目～０日目）にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、及びヘパリンを添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間（０日目～１０日目）にわたってＥＢをインキュベートすることによる非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップとして定義され、並びにステップＡ）のｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、以下のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間（１０日目～１５日目）にわたって包埋するステップ、
ｉｉｉ）包埋されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間（１５日目～３５日目）にわたってインキュベートすることによる分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間（３５日目～４２日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることによる乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む。
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のとおり、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）中、又はｍＴｅＳＲ（商標）中で、２日間（－２日目～０日目）にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、及びヘパリンを添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間（０日目～１０日目）にわたってＥＢをインキュベートすることによる非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップとして定義され、並びにステップＡ）のｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、以下のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間（１０日目～１５日目）にわたって包埋するステップ、
ｉｉｉ）包埋されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間（１５日目～３５日目）にわたってインキュベートすることによる分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間（３５日目～４２日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることによる乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む。
【0120】
本発明の更に特に好ましい実施形態では、ステップＡ）下で、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からラクトサイトを生成するステップを含む、ヒト乳様生成物の製造方法が提供され、ステップＡ）ｉ）は、以下：
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のとおり）中、又はｍＴｅＳＲ（商標）中で、２日間（－２日目～０日目）にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、及び本明細書中に記載のＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間（０日目～１０日目）にわたってＥＢをインキュベートすることによる非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップ、として定義され、並びにステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間（１０日目～１５日目）にわたって包埋するステップ、
ｉｉｉ）包埋されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間（１５日目～３５日目）にわたってインキュベートすることによる分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間（３５日目～４２日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることによる乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む。
ｉ）標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のとおり）中、又はｍＴｅＳＲ（商標）中で、２日間（－２日目～０日目）にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、及び本明細書中に記載のＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間（０日目～１０日目）にわたってＥＢをインキュベートすることによる非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップ、として定義され、並びにステップＡ）ｉｉ）は、さらなるサブステップに区別され、かつ次のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間（１０日目～１５日目）にわたって包埋するステップ、
ｉｉｉ）包埋されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間（１５日目～３５日目）にわたってインキュベートすることによる分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間（３５日目～４２日目）にわたってｍＥＢ（マンモスフェア）をインキュベートすることによる乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む。
【0121】
ステップｉｖ）は、好ましくは、乳タンパク質発現細胞、特にラクトサイト、及び／又は乳腺様腺オルガノイドへの分化をもたらす。
【0122】
本明細書で言及される標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１１に記載のとおり、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む）は、例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからカタログ番号Ａ１５１７００１の「Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地」として市販されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｏｒｄｅｒ／ｃａｔａｌｏｇ／ｐｒｏｄｕｃｔ／Ａ１５１７００１＃／Ａ１５１７００１も参照されたい）。
【0123】
ｍＴｅＳＲ（商標）培地は、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから、カタログ番号８５８５０で市販されている（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｍｔｅｓｒ１．ｈｔｍｌも参照されたい）。Ｓｕｃｈｃ培地は、「Ｄｅｆｉｎｅｄ，Ｆｅｅｄｅｒ－Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｈｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｉｓｓｕｅ １，Ｓｅｐｔ ２００７にも記載されている。
【0124】
一実施形態では、特に好ましい実施形態について上記で定義されたステップｉｉｉ）及び／又はｉｖ）は、好ましくは、少なくとも乳房細胞、管腔細胞、及び基底細胞への形成／分化をもたらす。これに関連して、乳房細胞は、好ましくは、β－カゼイン、乳タンパク質、及びホルモン受容体からなる群から選択されるマーカーの１つ又は複数、好ましくはすべてを発現する。更に、管腔細胞は、好ましくは、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、及びＣＫ１８からなる群から選択されるマーカーの１つ又は複数、好ましくはすべてを発現する。更に、基底細胞は、好ましくは、ＣＫ１４、α－平滑筋アクチン及びＰ６３からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する。
【0125】
さらなる一実施形態では、特に好ましい実施形態について上記で定義されたステップｉｉ）及び／又はｉｖ）におけるｍＥＢ（マンモスフェア）の誘導後に、β－カゼイン、乳タンパク質、及びホルモン受容体からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する乳腺様腺オルガノイド、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、ＣＫ１８からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する管腔細胞、並びにＣＫ１４、α－平滑筋アクチン、及びＰ６３からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する基底細胞を得ることができる。
【0126】
本発明の一実施形態では、上記の方法は、ヒト乳様生成物を製造するために提供される。
【0127】
（ステップＡの）一実施形態では、栄養素及び生体模倣刺激の送達は、細胞成長、分化、及び組織形成に影響を及ぼすように制御される。（ステップＡの）一実施形態では、かかる制御は、バイオリアクター内で行われる。
【0128】
本明細書中に記載される哺乳動物乳様生成物の製造方法においてＢＭＰ４が培養培地に添加される場合、本明細書中に記載される方法において生成されるＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態は、上記１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１、及びＧＡＴＡ３から選択される。
【0129】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して増加している。
【0130】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又はそれ以上が、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又はそれ以上が、２つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳腺陽性前駆細胞マーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１、及びＧＡＴＡ３から選択される。
【0131】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも５０％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも５０％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも７５％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも７５％は、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0132】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも１５％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0133】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも５ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも２０％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも３５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも３５％は、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0134】
いくつかの実施形態では、ＥＢの少なくとも１５％は、ＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、少なくとも２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢの少なくとも１５％は、ＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する。
【0135】
ＥＢはまた、非神経性外胚葉マーカーも発現し、それによって、非神経性系統への富化を示す。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の非神経性外胚葉マーカーは、ＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２Ｃから選択される。
【0136】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の非神経性外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して少なくとも２倍増加している。
【0137】
いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の非神経性外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも３～１５倍増加している。
【0138】
いくつかの実施形態では、ＥＢの非神経性外胚葉マーカーＴＦＡＰ２Ａの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、ＥＢの非神経性外胚葉マーカーＴＦＡＰ２Ｃの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。
【0139】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の神経性外胚葉マーカーの発現が減少している。いくつかの実施形態では、上記１つ以上の神経性外胚葉マーカーは、ＰＡＸ６、ＯＴＸ２、及びＳＯＸ１１から選択される。
【0140】
したがって、本明細書中に記載される方法は、細胞集団中に存在する細胞のタイプに関して、より均質な細胞集団を提供し、すなわち細胞集団は、非神経性外胚葉系統細胞の、より均質な集団を含む。
【0141】
いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の神経性外胚葉マーカーの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍に減少しており、すなわち、これらのマーカーの発現レベルは、半分に減少される。いくつかの実施形態では、上記神経性外胚葉マーカーは、ＰＡＸ６、ＯＸＴ２、及びＳＯＸ１１から選択される。
【0142】
いくつかの実施形態では、ＥＢは、１つ以上の乳特異的生物活性マーカーを発現する。いくつかの実施形態では、上記乳特異的生物活性マーカーは、オステオポンチン（ＯＰＮ）である。
【0143】
いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して増加している。
【0144】
いくつかの実施形態では、ＥＢの１つ以上の乳特異的生物活性マーカーの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。
【0145】
いくつかの実施形態では、ＥＢのＯＰＮの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。いくつかの実施形態では、ＢＭＰ４は、５～２０ｎｇ／ｍＬの濃度で培養培地に添加され、ＥＢのＯＰＮの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加している。
【0146】
いくつかの実施形態では、ＥＢのＯＰＮの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも４倍増加している。
【0147】
いくつかの実施形態において、ＥＢのＯＰＮの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける上記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも１８倍増加している。
【0148】
いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、乳特異的生物活性マーカーの発現の増加を生じる。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、乳特異的生物活性マーカーの少なくとも２倍の発現の増加を生じる。いくつかの実施形態では、上記マーカーは、エストロゲン関連受容体アルファ（ＥＳＲＲＡ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）、及びＭＵＣ１から選択される。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、ＥＳＲＲＡの少なくとも２倍の発現の増加を生じる。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、ＫＲＴ１４の少なくとも２倍の発現の増加を生じる。いくつかの実施形態では、乳腺細胞は、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して、ＭＵＣ１の少なくとも２倍の発現の増加を生じる。
【0149】
したがって、一例として、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）からステップＡ）下でラクトサイトを生成するステップを含む、ヒト乳様生成物の製造方法が本明細書において提供され、そのようなステップＡ）は、
ｉ）ｉＰＳＣを、本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中で培養し、１０日後に、かかるｉＰＳＣから形成されたマンモスフェアを回収することによって、ｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含み、マンモスフェア（ＥＢ）の１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないマンモスフェア（ＥＢ）における上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している。
ｉ）ｉＰＳＣを、本明細書中に記載される適切な培養培地（例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）及びＢＭＰ４中で培養し、１０日後に、かかるｉＰＳＣから形成されたマンモスフェアを回収することによって、ｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）かかるマンモスフェアを適切な系（例えば、Ｈａｓｓｉｏｔｏｕ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２０１２に記載の浮遊混合ゲル培養系）中で少なくとも１０日間成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を含み、マンモスフェア（ＥＢ）の１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現は、ＢＭＰ４で処理されていないマンモスフェア（ＥＢ）における上記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して、増加している。
【0150】
本明細書に開示される任意の方法又は方法ステップは、支持体として膜マトリックスを使用するのではなく、三次元懸濁培養において行われ得ることが理解されるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、全ての分化手順の間、細胞は懸濁培養で維持される。
【0151】
ステップＢ ヒト母乳様生成物の発現
本発明の一実施形態では、本方法は、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから、ヒト乳様生成物を発現させるステップを含む。ヒト乳様生成物の発現は、好ましくは、かかるラクトサイト及び／又は乳腺様腺オルガノイドからのヒト乳様生成物の発現の誘導時に生じる。
本発明の一実施形態では、本方法は、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから、ヒト乳様生成物を発現させるステップを含む。ヒト乳様生成物の発現は、好ましくは、かかるラクトサイト及び／又は乳腺様腺オルガノイドからのヒト乳様生成物の発現の誘導時に生じる。
【0152】
一実施形態では、泌乳期のラクトサイトは、催乳因子（例えば、プロラクチン、ヒドロコルチゾン、及びインスリン）を添加した特定の培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）を適用することによって誘導される。
【0153】
特に、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから得られたヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質又はオリゴ糖、好ましくはヒト乳オリゴ糖などを含む又はそれらからなる群から選択されるヒト乳の生物活性物質を含有する。本発明者らは、特に、上記で実施されたステップＡｉ）～ｉｖ）に従う特に好ましいプロトコルを用いて、とりわけ、オリゴ糖（ラクトース及びいくつかのＨＭＯを含む）、脂質（４つの脂肪酸を含む）、タンパク質（カゼインを含めて検出された７つ）、及びｍｉＲＮＡ（ＨＢＭにおいて典型的に検出される１１を含めて検出された７５）を同定することができた。
【0154】
一実施形態では、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから得られるヒト乳様生成物は、オリゴ糖、脂質、タンパク質、エキソソーム、及びｍｉＲＮＡを含む又はそれらからなる群から選択されるヒト乳の生物活性物質を含有する。
【0155】
別の実施形態では、好ましくはステップＡ）に従って調製された、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に由来する乳腺様オルガノイドから得られるヒト乳様生成物は、ラクトース、６’ＳＬ、Ｃ－４：０脂肪酸、Ｃ－８：０脂肪酸、Ｃ－１０：０脂肪酸、Ｃ－１４：０脂肪酸、Ｃ－１５：０脂肪酸、Ｃ－１６：０脂肪酸、Ｃ－１６：１ｎ７脂肪酸、Ｃ－１７：０脂肪酸、Ｃ－１８：０脂肪酸、Ｃ－１８：１ ｎ９脂肪酸、Ｃ－１８：１脂肪酸、Ｃ－１８：２ ｎ６脂肪酸、Ｃ－２０：０脂肪酸、Ｃ－２０：１ ｎ９脂肪酸、Ｃ－１８：３ ｎ３脂肪酸、Ｃ－２２：０脂肪酸、ラクトフェリン、アルブミン、プロラクチン、アルファＳ１－カゼイン、ヘモグロビンサブユニットベータ、ヘモグロビンサブユニットアルファ、α－ラクトアルブミン、アルファ－２－マクログロブリン、β－カゼイン、胆汁酸塩活性化リパーゼ、κ－カゼイン、ラクトアドヘリン、ＣＤ１４、脂肪酸シンターゼ、ＩｇＡ、ｐＩｇＲ、血清アルブミン、キサンチンデヒドロゲナーゼ、エキソソーム、ｍｉＲ－２１－５ｐ、ｍｉＲ－１８１ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｄ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｂ－５ｐ、ｍｉＲ－２２－３ｐ、ｍｉＲ－１４６ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－３０ｃ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ａ－５ｐ、ｍｉＲ－３０ｅ－５ｐ、及びｍｉＲ－１４８ｂ－３ｐを含む又はそれらからなる群から選択されるヒト乳の生物活性物質を含有する。
【0156】
ステップＣ 調整ヒト母乳様生成物を製造するためのさらなる処理
本発明の任意の一実施形態では、本明細書に記載の方法は、ステップＢ）から得ることができるヒト乳様生成物に対して行われ、かかる生成物に対して追加の処理を行って調整ヒト乳様生成物を提供することを含む追加のステップＣ）を含む。
本発明の任意の一実施形態では、本明細書に記載の方法は、ステップＢ）から得ることができるヒト乳様生成物に対して行われ、かかる生成物に対して追加の処理を行って調整ヒト乳様生成物を提供することを含む追加のステップＣ）を含む。
【0157】
特定の一実施形態では、本発明のヒト母乳様生成物に対して行われる追加の処理ステップＣ）は、精製ステップ、単離プロセス、抽出プロセス、分画ステップ、富化プロセス、酵素処理、さらなる成分（例えば、ヒト乳腺オルガノイドによって発現され得ないもの（例えば、免疫グロブリン、プロバイオティクス及び／又はミネラルなど））の添加又はそれらの組合せからなる群から選択され得る。
【0158】
ヒト乳様生成物
「標準」ヒト母乳様生成物
本発明の一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、「標準」ヒト母乳様生成物であり、すなわち、栄養状態の良好な母親のヒト母乳と同じ成分を含む。
「標準」ヒト母乳様生成物
本発明の一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、「標準」ヒト母乳様生成物であり、すなわち、栄養状態の良好な母親のヒト母乳と同じ成分を含む。
【0159】
母乳育児の利点は科学文献において周知であり、ヒト母乳様生成物へのアクセスが可能になることで、かかる生成物を多くの同様に周知の健康上の利点のために使用可能になる。
【0160】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、実際の授乳が不可能な状況下で、母乳代替物として使用することができる。
【0161】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、例えば、泌乳が少ない女性、又は出産から６ヶ月後に泌乳しなくなった女性の授乳経験がより長期間になるよう支援するために使用されることが意図される。
【0162】
同様に、ヒト母乳様生成物は、例えば、病気により母親からの実際の授乳が損なわれる状況下であっても、授乳を可能にするために使用されることが意図される。
【0163】
別の実施形態では、ヒト母乳様生成物は、母乳の生産が自然に開始されない状況、例えば乳児を養子とした場合に使用されることが意図される。
【0164】
一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、天然に生じるとおりのヒト母乳授乳期の生成物ではない。
【0165】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、乳児に最適な栄養を提供する際に使用するためのものである。
【0166】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、乳児に健康な発育を提供する際に使用するためのものである。
【0167】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、幼児における感染、肥満の予防及び免疫発達の促進に使用するためのものである。
【0168】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、無調整ヒト母乳様生成物である。
【0169】
別の実施形態では、ヒト母乳様生成物は、調整ヒト母乳様生成物である。
【0170】
一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン及びミネラルを含む。
【0171】
別の実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質、炭水化物、ビタミン、ミネラル及び生物活性物質を含む。
【0172】
一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、タンパク質、脂質（リノール酸及びα－リノレン酸を含む）、炭水化物、ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、パントテン酸、葉酸、ビタミンＣ及びビオチンを含む）、ミネラル（鉄、カルシウム、リン、マグネシウム、ナトリウム、塩化物、カリウム、マンガン、ヨウ素、セレン、銅及び亜鉛を含む）、コリン、ミオイノシトール及びＬ－カルニチンを含む。
【0173】
さらなる実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物はまた、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡからなる群において選択される少なくとも１つの生物活性物質を含む。
【0174】
かかるヒト母乳様生成物は、例えば、増殖／成長因子、サイトカイン、プロバイオティクス、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、エキソソーム由来の生物活性物質（例えば、ｍｉＲＮＡ）及び分泌型ＩｇＡを添加するステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製され得る。
【0175】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、プロバイオティクスを含有する。
【0176】
かかるヒト母乳様生成物は、例えば、いくつかの商業的に入手可能な供給源から得ることができるプロバイオティクス（例えば、Ｂ．ラクティス（Ｂ．Ｌａｃｔｉｓ）、Ｂ．インファンティス（Ｂ．Ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｌ．ラムノサス（Ｌ．Ｒａｍｎｈｏｓｕｓ））を含有させることにより、本発明の方法に従い調製され得る。
【0177】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、胃腸機能を最適化するため、及び／又は免疫を促進するために使用され得る。
【0178】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、分泌型ＩｇＡ及びプロバイオティクスを含有する。
【0179】
かかるヒト母乳様生成物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９／１５６３０１号及び国際公開第２００９／１５６３６７号に記載されているように調製することができるプロバイオティクスと分泌型ＩｇＡとの組合せを添加するステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製することができる。かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、免疫グロブリンの欠乏を予防するために、及び／又は乳児及び幼児における再発感染の予防において使用され得る。
【0180】
「非標準」ヒト母乳様生成物
本発明の一実施形態では、ヒト乳様生成物は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然に見出される成分比及び成分濃度とは変更することができる。このような生成物を、本明細書では「非標準乳様生成物」と称する。
本発明の一実施形態では、ヒト乳様生成物は、栄養状態の良好な母親のヒト母乳中に天然に見出される成分比及び成分濃度とは変更することができる。このような生成物を、本明細書では「非標準乳様生成物」と称する。
【0181】
一実施形態では、本発明によるヒト乳様生成物は、乳強化剤、サプリメント、及び／又は特別な目的に適合させたヒト母乳代用物からなる群から選択され得る。
【0182】
ヒト乳強化剤及びヒト乳生物活性サプリメント
一実施形態では、本発明の方法は、授乳中の母親から自然に得られるヒト母乳を強化するために、又は乳児用フォーミュラを強化するために使用することができるヒト母乳様生成物を提供する。
一実施形態では、本発明の方法は、授乳中の母親から自然に得られるヒト母乳を強化するために、又は乳児用フォーミュラを強化するために使用することができるヒト母乳様生成物を提供する。
【0183】
別の実施形態では、本発明の方法は、必要に応じて乳児又は幼児のためのサプリメントとして使用され得るヒト母乳様生成物を提供する。
【0184】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、健康な発育を提供するために、及び／又は、乳児又は幼児における特定の状態（例えば、ぜんそく、アレルギー、認知変化など）に典型的に関連する病気を発症するリスクを低減するために、及び／又は、発育、免疫の発達、感染からの保護を促進するために、使用され得る。
【0185】
注目すべきことに、かかる強化剤又はサプリメント中の成分（特に生物活性成分）がヒト起源であることは、それらが本発明の方法によるものであるという事実と相まって、かかる成分にそのままの（ｉｎｔａｃｔ）又はより高い機能性を提供すると考えられる。
【0186】
ヒト母乳様生成物は、好ましくは強化剤としての使用が意図される。かかるヒト母乳様生成物は、強化剤としての使用が意図され、例えば、ステップＢ）から得ることができるヒト母乳様生成物からの（特定の）生物活性物質の単離及び／又は富化のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製され得る。かかる単離ステップは、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の古典的な分画、富化及び／又は精製を介して行われてもよい。
【0187】
サプリメントとしての使用が意図されるヒト母乳様生成物は、ヒト乳オリゴ糖（例えば、２ＦＬ、３ＦＬ、ＬＮＴ、ＬｎＮＴ、ＤｉＦｌ、６ＳＬ及び／又は３ＳＬ）、脂質、増殖／成長因子（例えば、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン結合上皮増殖因子）、サイトカイン（例えば、形質転換増殖因子－β２（ＴＧＦβ－２）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１８、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ－γ）、ＴＮＦ－α）、細胞外小胞（例えば、乳脂肪球及び／又はエキソソーム）、マイクロＲＮＡを含むエキソソーム、及び抗菌／保護の生物活性物質（例えば、ＩｇＡ、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトアドヘリン）からなる群から選択される１つ以上の生物活性物質を含み得る。サプリメントとしての使用が意図されるかかるヒト母乳様生成物は、例えば、ステップＢ）から得られる無調整ヒト母乳様生成物から生物活性物質を単離するステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製されてもよい。かかる単離ステップは、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の古典的な分画、富化及び／又は精製を介して行われてもよい。
【0188】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フコシル化ヒト乳オリゴ糖、例えば２ＦＬ及び／又は３ＦＬを含有するサプリメント又は乳強化剤である。かかるサプリメント又は乳強化剤は、ＦＵＴ２遺伝子が不活性であることに起因してフコシル化オリゴ糖を分泌しない女性のヒト母乳のプロファイルを充足させる際に使用するためのものである。
【0189】
強化剤又はサプリメントとしての使用が意図されるかかるヒト母乳様生成物は、例えば、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物からフコシル化オリゴ糖（例えば、２ＦＬ及び／又は３ＦＬ）を単離及び／又は富化するステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って調製されてもよい。
【0190】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、胃腸機能を最適化するため、及び／又は免疫を促進するために使用され得る。
【0191】
遺伝的疾患を有する乳児のためのヒト母乳様生成物
一実施形態では、本発明によるヒト母乳様生成物は、遺伝的疾患を有して生まれた乳児の特異的なニーズに対処するように適合され得る。
一実施形態では、本発明によるヒト母乳様生成物は、遺伝的疾患を有して生まれた乳児の特異的なニーズに対処するように適合され得る。
【0192】
ガラクトース血症
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ガラクトース血症に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ガラクトース血症は、乳児のガラクトース代謝能に影響を及ぼす稀な遺伝子疾患である。
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ガラクトース血症に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ガラクトース血症は、乳児のガラクトース代謝能に影響を及ぼす稀な遺伝子疾患である。
【0193】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ラクトース及び／又はラクトース含有サッカリドを除去されるべきである。かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ガラクトース血症に罹患した乳児に健康な発育を提供するために使用され得る。
【0194】
一実施形態では、ラクトース及び／又はラクトース含有サッカリドが除去されたヒト母乳様生成物は、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の、酵素処理（ラクターゼ処理）のステップＣ）、又は膜分画及び限外濾過のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って得られ得る。
【0195】
別の実施形態では、ラクトース及び／又はラクトース含有サッカリドが除去されたヒト母乳様生成物は、本発明の方法に従って、ステップＡ）下でＧＭＯα－ラクトアルブミン欠損ヒト細胞を使用してｈｉＰＳＣを生成することによって得ることができる。
【0196】
フェニルケトン尿症
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ＰＫＵは、フェニルアラニンをチロシンに変換するフェニルアラニンヒドロキシラーゼが存在しないこと又は機能不全であることに起因する。未処置では、脳毒性により重度の精神遅滞がもたらされる。
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）に罹患している乳児のニーズに適合させることができる。ＰＫＵは、フェニルアラニンをチロシンに変換するフェニルアラニンヒドロキシラーゼが存在しないこと又は機能不全であることに起因する。未処置では、脳毒性により重度の精神遅滞がもたらされる。
【0197】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フェニルアラニンを除かれる（ｄｅｐｒｉｖｅｄ）か又は枯渇されるべきである。
【0198】
かかる実施形態では、ヒト母乳様生成物は、ＰＫＵに罹患した乳児に健康な発育を提供するために使用され得る。
【0199】
一実施形態では、ヒト母乳様生成物は、フェニルアラニン含量がかかる生成物を摂取する対象の体重１ｋｇ当たり２０ｍｇ未満に維持されるようにフェニルアラニンが枯渇している。
【0200】
一実施形態では、フェニルアラニンが枯渇又は除去されたヒト母乳様生成物は、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の、酵素処理（タンパク質加水分解）又は濾過のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って得ることができる。
【0201】
一実施形態では、フェニルアラニンが枯渇したヒト母乳様生成物は、ステップＢ）から得ることができる無調整ヒト母乳様生成物の酵素処理（タンパク質加水分解）又は濾過のステップＣ）を含めることによって、本発明の方法に従って得ることができる。
【0202】
別の実施形態では、フェニルアラニンが枯渇したヒト母乳様生成物は、ステップＢ）において、限定量又はゼロ量のフェニルアラニンを提供する培養培地（例えば、乳清由来のグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）を含有する培養培地など）を提供することによって、本発明の方法に従って得ることができる。
【0203】
本発明の追加的な実施形態
以下が提供される：
以下が提供される：
【0204】
Ｓ１．乳腺細胞集団の製造方法であって、
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップ、及び
ｉｉ）前記ＥＢを成長させて、乳腺細胞集団を生成するステップ、
を含む、方法。
ｉ）骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）を含む培養培地中で哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）を培養して、胚様体（ＥＢ）を生成するステップ、及び
ｉｉ）前記ＥＢを成長させて、乳腺細胞集団を生成するステップ、
を含む、方法。
【0205】
Ｓ２．前記培養ステップｉ）が、前記ｍｉＰＳＣを、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４中、三次元懸濁培養系において、例えば三次元懸濁条件において、培養して、それによって前記ｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させることを、任意に少なくとも１２日間行うステップを含む、ステートメント１に記載の方法。
【0206】
Ｓ３．前記成長ステップｉｉ）が、形成された前記ＥＢを、三次元包埋系中、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間にわたって、成長させて、ラクトサイトを生成するステップを含む、ステートメント１又は２に記載の方法。
【0207】
Ｓ４．前記乳腺細胞が、ヒト乳腺細胞である、ステートメント１～３のいずれか１つに記載の方法。
【0208】
Ｓ５．ＢＭＰ４が、０日目～１０日目の間、好ましくは０日目～３日目の間に培養培地に添加され、０日目は、前記ｉＰＳＣが前記培養培地に初めて添加される時点である、ステートメント１～４のいずれか１つに記載の方法。
【0209】
Ｓ６．ＢＭＰ４が、３日間にわたって前記培養培地に添加される、ステートメント１～５のいずれか１つに記載の方法。
【0210】
Ｓ７．ＢＭＰ４が、５～２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、又は２０ｎｇ／ｍＬの濃度で前記培養培地に添加される、ステートメント１～６のいずれか１つに記載の方法。
【0211】
Ｓ８．前記ＥＢが、任意にＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１、及びＧＡＴＡ３から選択される、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、ステートメント１～７のいずれか１つに記載の方法。
【0212】
Ｓ９．前記ＥＢでは、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける前記乳腺陽性前駆細胞マーカーの発現レベルと比較して増加している、ステートメント１～８のいずれか１つに記載の方法。
【0213】
Ｓ１０．前記ＥＢの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％以上が、１つ以上の乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意にＥＢの少なくとも５０％が、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意にＥＢの少なくとも１５％が、ＭＵＣ１及びＣＤ４９ｆ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、任意にＥＢの少なくとも２０％が、ＭＵＣ１及びＥｐＣＡＭ乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現し、及び／又は任意にＥＢの少なくとも１５％が、ＧＡＴＡ３乳腺陽性前駆細胞マーカーを発現する、ステートメント１～９のいずれか１つに記載の方法。
【0214】
Ｓ１１．前記ＥＢが、任意にＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２Ｃから選択される、１つ以上の非神経性外胚葉マーカーを発現する、ステートメント１～１０のいずれか１つに記載の方法。
【0215】
Ｓ１２．前記ＥＢの１つ以上の非神経性外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける前記非神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加しており、任意に少なくとも３～１５倍増加している、ステートメント１～１１のいずれか１つに記載の方法。
【0216】
Ｓ１３．前記ＥＢの１つ以上の神経性外胚葉マーカーの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおける前記神経性外胚葉マーカーの発現レベルと比較して、少なくとも０．５倍に減少しており、任意に、前記神経性外胚葉マーカーは、ＰＡＸ６、ＯＸＴ２、及びＳＯＸ１１から選択される、ステートメント１～１２のいずれか１つに記載の方法。
【0217】
Ｓ１４．前記ＥＢが、１つ以上の乳特異的生物活性マーカー、任意にオステオポンチン（ＯＰＮ）を発現する、ステートメント１～１３のいずれか１つに記載の方法。
【0218】
Ｓ１５．前記ＥＢがのＯＰＮの発現が、ＢＭＰ４で処理されていないＥＢにおけるＯＰＮの発現レベルと比較して、少なくとも２倍増加しており、任意に少なくとも４～１８倍増加している、ステートメント１～１４のいずれか１つに記載の方法。
【0219】
Ｓ１６．前記乳腺細胞が、ラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを形成する、ステートメント１～１５のいずれか１つに記載の方法。
【0220】
Ｓ１７．前記乳腺細胞が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して乳特異的生物活性マーカーの発現の増加を生じ、任意に、前記乳腺細胞が、ＢＭＰ４で処理されていない乳腺細胞と比較して乳特異的生物活性マーカーの発現の少なくとも２倍の増加を生じ、任意に、上記マーカーが、エストロゲン関連受容体アルファ（ＥＳＲＲＡ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）、及びＭＵＣ１から選択される、ステートメント１～１６のいずれか１つに記載の方法。
【0221】
Ｓ１８．分化プロトコルにおいて哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）の乳腺前駆細胞への分化効率を増加させるためのＢＭＰ４の使用。
【0222】
Ｓ１９．哺乳動物乳様生成物の製造方法であって、
Ａ）哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）由来のラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、及び
Ｂ）前記ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップ、
を含み、ステップＡ）が、ＢＭＰ４を含む培養培地中で前記ｍｉＰＳＣを培養するステップを含む、方法。
Ａ）哺乳動物人工多能性幹細胞（ｍｉＰＳＣ）由来のラクトサイト乳腺様腺オルガノイドを生成するステップ、及び
Ｂ）前記ラクトサイトから前記哺乳動物乳様生成物を分泌させるステップ、
を含み、ステップＡ）が、ＢＭＰ４を含む培養培地中で前記ｍｉＰＳＣを培養するステップを含む、方法。
【0223】
Ｓ２０．ヒト乳様生成物を製造するための方法であって、
ステップＡ）が、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地中、例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４を含む培地中、適切な三次元培養系において、例えば三次元懸濁条件において、少なくとも１２日間にわたって培養することによって、ｈｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、適切な三次元包埋系中で、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間にわたって、成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、ステートメント１９に記載の方法。
ステップＡ）が、
ｉ）ｈｉＰＳＣを、ＢＭＰ４を含む適切な培養培地中、例えば、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地及びＢＭＰ４を含む培地中、適切な三次元培養系において、例えば三次元懸濁条件において、少なくとも１２日間にわたって培養することによって、ｈｉＰＳＣを非神経性外胚葉細胞へと分化させるステップ、及び
ｉｉ）形成された前記ｍＥＢ（マンモスフェア）を、適切な三次元包埋系中で、例えば、マトリゲル及び／又はコラーゲンＩなどのマトリックスタンパク質から構成された混合浮遊ゲル中で、少なくとも３０日間、例えば３２日間にわたって、成長させて、ラクトサイトを生成するステップ、
を更に含む、ステートメント１９に記載の方法。
【0224】
Ｓ２１．ステップＡ）ｉ）が、以下：
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で、２日間にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、前記基礎培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４、ヘパリン、及びヒドロコルチゾンが添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で１０日間にわたってＥＢをインキュベートすることによる非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップとして定義され、並びに
ステップＡ）ｉｉ）が、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で５日間にわたってインキュベートするステップ、
ｉｉｉ）ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間にわたってインキュベートすることによる分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間にわたってインキュベートすることによる乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む、ステートメント２０に記載の方法。
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中、又は培地ｍＴｅＳＲ（商標）中で、２日間にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、前記基礎培地、増殖サプリメントを含み、ＢＭＰ４、ヘパリン、及びヒドロコルチゾンが添加された完全ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中で１０日間にわたってＥＢをインキュベートすることによる非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップとして定義され、並びに
ステップＡ）ｉｉ）が、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加した完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で５日間にわたってインキュベートするステップ、
ｉｉｉ）ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間にわたってインキュベートすることによる分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間にわたってインキュベートすることによる乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む、ステートメント２０に記載の方法。
【0225】
Ｓ２２．ステップＡ）ｉ）が、以下：
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で、２日間にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、ＥＢを、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間にわたってＥＢをインキュベートすることによる非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップ、として定義され、並びにステップＡ）のｉｉ）が、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間にわたって包埋するステップ、
ｉｉｉ）包埋されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間にわたってインキュベートすることによる分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間にわたってインキュベートすることによる乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む、ステートメント２０に記載の方法。
ｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸マグネシウム、ナトリウムセレン、ＦＧＦ２、インスリン、ＮａＨＣＯ３及びトランスフェリン、ＴＧＦβ１又はＮＯＤＡＬを含む標準ｉＰＳＣ培地Ｅ８中で、２日間にわたってインキュベートすることによるｈｉＰＳＣからの胚様体（ＥＢ）の生成と、ＥＢを、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、及びＢＭＰ４を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔＢ培地中で１０日間にわたってＥＢをインキュベートすることによる非神経性外胚葉細胞に非常に富んだｍＥＢ（マンモスフェア）の製造と、のステップ、として定義され、並びにステップＡ）のｉｉ）が、さらなるサブステップに区別され、かつ以下のステップ：ｉｉ）、ｉｉｉ）、及びｉｖ）：
ｉｉ）形成されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント及び上皮小体ホルモン（ｐＴＨｒＰ）を添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中に浮遊させたマトリゲル及びコラーゲンＩの混合物中に５日間にわたって包埋するステップ、
ｉｉｉ）包埋されたｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＧＦ１０、及びＨＧＦを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で２０日間にわたってインキュベートすることによる分枝及び腺房分化並びに乳腺細胞特異化を促進するステップ、並びに
ｉｖ）ｍＥＢ（マンモスフェア）を、ＥｐｉＣｕｌｔ増殖サプリメント、ヒドロコルチゾン、インスリン、ＦＢＳ、プロラクチン、プロゲステロン、及びβ－エストラジオールを添加したＥｐｉＣｕｌｔＢ培地中で７日間にわたってインキュベートすることによる乳タンパク質発現を誘導するステップ、
を含む、ステートメント２０に記載の方法。
【0226】
Ｓ２３．ステップＡ）が、ステートメント１～１７のいずれか１つに記載の方法を含む、ステートメント１９～２２のいずれか１つに記載の方法。
【0227】
Ｓ２４．ステップＡ）が、三次元懸濁培養条件で行われる、ステートメント１９又は２３に記載の方法。
【0228】
Ｓ２５．ステートメント１９～２４のいずれか１つに記載の方法に従って得ることができるヒト乳様生成物。
【0229】
Ｓ２６．治療に使用するための、ステートメント２５に記載のヒト乳様生成物。
【0230】
Ｓ２７．ステートメント２５に記載のヒト乳様生成物の、ヒト乳代替物、任意に母乳代替物としての使用。
【0231】
本明細書に開示するとおりの詳細な説明の様々な態様及び実施形態は、本発明を作製及び使用する特定の方法を例示するものであり、請求項及び詳細な説明と共に考慮するにあたり、本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。本発明の態様及び実施形態に由来する特徴を、本発明の同じ又は異なる態様及び実施形態に由来する更なる特徴と組み合わせてもよいことも理解されたい。
【0232】
発明を実施するための形態及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「１つの」（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）には、別段の指示が文脈上明確にない限り、複数の参照物も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【0233】
【図1】Ｙｉｎｇ Ｑｕに概説され、本発明の方法のステップＡ）における１つの代替法に適用されるプロトコルによるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の分化を示す。
【図2】ステップＡ）によるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の分化を示す。
【図3】本発明の方法のステップＡ）のための好ましい実施形態及び特に好ましい実施形態によるヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）の分化を示す。
【図4】図２の方法に従って生産されたｈｉＰＳＣの三次元器官型培養が、乳腺特異化に対して高度に許容的であることを示す。三次元分化（４２日）プロトコルにおける、Ｎａｎｏｇ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＡ２、ＴＰ６３、ＫＲ－１４、ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８及びＣＳＮ２のｍＲＮＡ発現を示す。マーカーは、左から右へ、多能性（Ｎａｎｏｇ）、系統（外胚葉及び内胚葉）（ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＡ２）、基底細胞／筋上皮マーカー（ＴＰ６３、ＫＲ－１４）、管腔上皮マーカー（ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８）、及び乳タンパク質（ＣＳＮ２（カゼインベータ））、の段階を示す。
【図5】比較例として製造された、ｈｉＰＳＣの二次元器官培養を示す。二次元分化（３１日）プロトコルにおける、Ｎａｎｏｇ、ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＡ２、ＴＰ６３、ＫＲ－１４、ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８及びＣＳＮ２のｍＲＮＡ発現を示す。マーカーは、左から右へ、多能性（Ｎａｎｏｇ）、系統（外胚葉及び内胚葉）（ＴＵＢＢ３、ＦＯＸＡ２）、基底細胞／筋上皮マーカー（ＴＰ６３、ＫＲ－１４）、管腔上皮マーカー（ＥｐＣＡＭ、ＫＲＴ８）、及び乳タンパク質（ＣＳＮ２（カゼインベータ））、の段階を示す。
【図6-1】三次元オルガノイド設定を使用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の非神経性外胚葉系統分化に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の効果を示す。ａ．乳腺前駆細胞の生成及び０日目～３日目の間のＢＭＰ４処理の手順の概要を示すスキーム。ｂ．異なる濃度のＢＭＰ４への曝露後の形態変化の顕微鏡観察。ｃ～ｆ．同定された様々なマーカー：ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１、及びＧＡＴＡ３を使用した、乳腺陽性前駆細胞数のフローサイトメトリーによる定量。ｇ～ｈ．主要な非神経性外胚葉マーカーとしてのヒトＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２ＣのＲＮＡ発現レベル。ｉ～ｋ．神経性外胚葉マーカーとしてのヒトＰＡＸ６、ＯＴＸ２、及びＳＯＸ１１。ｌ．管腔マーカーとしてのヒトＫＲＴ１８。ｍ．分泌型リン酸化乳糖タンパク質としてのヒトＯＰＮ。
【図6-2】三次元オルガノイド設定を使用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の非神経性外胚葉系統分化に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の効果を示す。ａ．乳腺前駆細胞の生成及び０日目～３日目の間のＢＭＰ４処理の手順の概要を示すスキーム。ｂ．異なる濃度のＢＭＰ４への曝露後の形態変化の顕微鏡観察。ｃ～ｆ．同定された様々なマーカー：ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１、及びＧＡＴＡ３を使用した、乳腺陽性前駆細胞数のフローサイトメトリーによる定量。ｇ～ｈ．主要な非神経性外胚葉マーカーとしてのヒトＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２ＣのＲＮＡ発現レベル。ｉ～ｋ．神経性外胚葉マーカーとしてのヒトＰＡＸ６、ＯＴＸ２、及びＳＯＸ１１。ｌ．管腔マーカーとしてのヒトＫＲＴ１８。ｍ．分泌型リン酸化乳糖タンパク質としてのヒトＯＰＮ。
【図7】ＢＭＰ４処理サンプルの効果を示す。ａ．対照試料と比較して、二重乳腺マーカーＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４９ｆ＋及び二重成熟管腔ラクトサイトマーカーＭＵＣ１＋／ＥｐＣＡＭ＋のより高い発現を示した。ｂ．乳腺三次元分化の３０日目～３５日目の間のエストロゲン関連受容体アルファ（ＥＳＲＲＡ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）、及びＭＵＣ１のＲＮＡ発現レベルに対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の効果。
【0234】
実験
実施例１
ｈｉＰＳＣの培養及びラクトサイトへの分化による、ヒト乳様生成物の取得
Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｖｏｌ ８，２０５－２１５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４ｔｈ２０１７に記載されている手順に従って、ｉｈＰＳＣから出発してラクトサイトを培養し、それによって分泌されたヒト乳様生成物を回収し、本発明による治療において及び／又は母乳代替物として使用することができる。
実施例１
ｈｉＰＳＣの培養及びラクトサイトへの分化による、ヒト乳様生成物の取得
Ｙｉｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ ｖｏｌ ８，２０５－２１５ Ｆｅｂｒｕａｒｙ １４ｔｈ２０１７に記載されている手順に従って、ｉｈＰＳＣから出発してラクトサイトを培養し、それによって分泌されたヒト乳様生成物を回収し、本発明による治療において及び／又は母乳代替物として使用することができる。
【0235】
実施例２
ｈｉＰＳＣの培養及び三次元ラクトサイトへの分化による、ヒト乳様生成物の取得
本発明の方法に従ってｈｉＰＳＣから出発して、上記のステップＡ）及びステップＢ）に従ってラクトサイトを培養し、それによって分泌されたヒト乳様生成物を回収して、治療において、及び／又は本発明による母乳代替物として使用することができる。
ｈｉＰＳＣの培養及び三次元ラクトサイトへの分化による、ヒト乳様生成物の取得
本発明の方法に従ってｈｉＰＳＣから出発して、上記のステップＡ）及びステップＢ）に従ってラクトサイトを培養し、それによって分泌されたヒト乳様生成物を回収して、治療において、及び／又は本発明による母乳代替物として使用することができる。
【0236】
実施例３
ｈｉＰＳＣの培養及びラクトサイトへの分化の代替的方法による、ヒト乳様生成物の取得
ｈｉＰＳＣからの効率的なラクトサイト分化は、以下に記載される条件１～４を含む代替的な培養条件から得ることができる。
１．ＥＢに由来する細胞の単層としてビトロネクチン被覆プレート上で二次元培養し、Ｌ－グルタミン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン：抗生物質－抗真菌剤溶液）。
ｈｉＰＳＣの培養及びラクトサイトへの分化の代替的方法による、ヒト乳様生成物の取得
ｈｉＰＳＣからの効率的なラクトサイト分化は、以下に記載される条件１～４を含む代替的な培養条件から得ることができる。
１．ＥＢに由来する細胞の単層としてビトロネクチン被覆プレート上で二次元培養し、Ｌ－グルタミン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン：抗生物質－抗真菌剤溶液）。
【0237】
２．ＥＢに由来する細胞の付着凝集体（ＥＢ）のビトロネクチン被覆プレート上で二次元培養し、Ｌ－グルタミン、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、インスリン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、Ｐｅｎ－Ｓｔｒｅｐ（抗生物質－抗真菌剤溶液）を添加したＲＰＭＩ １６４０を含有する培地中で少なくとも２８日間培養する。
３．少なくとも１０日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中懸濁液において三次元培養し、次いで、上皮小体ホルモンの存在下で、特定の培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）中で更に５日間、続いてインスリン、ＨＧＦ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ１０の存在下で２５日間、混合浮遊ゲル（例えば、マトリゲル及びコラーゲン１）中で培養する。
４．ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中懸濁液（超低接着性プレート）において少なくとも１０日間、次いで上皮小体ホルモンの存在下で特定の培地（例えばＥｐｉＣｕｌｔＢ）中で更に５日間、続いてインスリン、ＨＧＦ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ１０の存在下で２５日間、ＥＢを三次元培養する。
３．少なくとも１０日間、ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中懸濁液において三次元培養し、次いで、上皮小体ホルモンの存在下で、特定の培地（例えば、ＥｐｉＣｕｌｔＢ）中で更に５日間、続いてインスリン、ＨＧＦ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ１０の存在下で２５日間、混合浮遊ゲル（例えば、マトリゲル及びコラーゲン１）中で培養する。
４．ＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地中懸濁液（超低接着性プレート）において少なくとも１０日間、次いで上皮小体ホルモンの存在下で特定の培地（例えばＥｐｉＣｕｌｔＢ）中で更に５日間、続いてインスリン、ＨＧＦ、ヒドロコルチゾン及びＦＧＦ１０の存在下で２５日間、ＥＢを三次元培養する。
【0238】
実施例４
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの二次元分化及び三次元分化
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの三次元分化：
ラクトサイトの三次元分化には、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を使用した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入した。
ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの二次元分化及び三次元分化
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの三次元分化：
ラクトサイトの三次元分化には、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を使用した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入した。
【0239】
（ｉ）三次元分化プロトコル（本発明による）のために、ｈｉＰＳＣの単一細胞を、１０ ｕＭ ｒｏｃｋ阻害剤を含むＥ８培地中、３７℃、５％ＣＯ２で、９５ｒｐｍで回転させながら一晩インキュベートすることによって、ＥＢ（スフェロイド）を形成させた。
２日目に、培地をＥ８で交換した（－２日目～０日目）。
翌日、培地をＭａｍｍｏ１培地（ペニシリン／ストレプトマイシンを添加し、増殖サプリメント、ヘパリン（４μｇ／ｍＬ）、及びヒドロコルチゾン（０．４８μｇ／ｍＬ）を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）で１０日間（０日目～１０日目）交換した。培地を２日毎に交換した。
２日目に、培地をＥ８で交換した（－２日目～０日目）。
翌日、培地をＭａｍｍｏ１培地（ペニシリン／ストレプトマイシンを添加し、増殖サプリメント、ヘパリン（４μｇ／ｍＬ）、及びヒドロコルチゾン（０．４８μｇ／ｍＬ）を添加したＭａｍｍｏＣｕｌｔ培地）で１０日間（０日目～１０日目）交換した。培地を２日毎に交換した。
【0240】
（ｉｉ）分化後、Ｍａｍｍｏ２培地（ＥｐｉＣｕｌｔＢ＋サプリメント、ＰＴＨｒＰ １００ｎｇ／ｍｌ＋ペニシリン／ストレプトマイシン）中で５日間培養した。培養培地を３日毎（１０日目～１５日目）に交換した。
【0241】
（ｉｉｉ）上皮構造の枝分かれ、腺房分化及び乳腺特異化を誘導するために、ｍＥＢｓ（スフェロイド／マンモスフェア）にＭａｍｍｏ３培地（完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ、ヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍｌ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＨＧＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びペニシリン／ストレプトマイシン）を２０日間フィードした。培地を３日毎に交換した（１５日目～３５日目）。
【0242】
（ｉｖ）最後に、乳生物活性物質生産（三次元）を誘導するために、Ｍａｍｍｏ４培地（完全ＥｐｉＣｕｌｔＢ、１０％ＦＢＳ、プロラクチン（１０μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（１μｇ／ｍｌ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン、β－エストラジオール及びペニシリン／ストレプトマイシン）を７日間使用し、培地を３日毎に交換した（３５日目～４２日目）。全ての分化手順の間、スフェロイドを懸濁培養で維持した（９５ｒｐｍで回転）。分化手順は４２日目に終了した。結果を図４に表す。
【0243】
（ｂ）ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３をベースとするラクトサイトの二次元分化：
ラクトサイトの二次元分化にも、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を使用した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入した。
ラクトサイトの二次元分化にも、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を使用した。ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３は、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入した。
【0244】
二次元分化プロトコル（比較のために使用）では、本発明者らは、全ての分化段階中にラクト（Ｌａｃｔｏ）培地（ＲＰＭＩ １６４０、２０％ＦＢＳ、１ｍＭグルタミン、４μｇ／ｍｌインスリン、２０ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ、０．５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、ペニシリン／ストレプトマイシン添加）を使用した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。培地を２日毎に交換した。結果を図５に表す。
【0245】
（ｃ）結果
定量的ＲＴ－ＰＣＲを使用して、ラクトサイト誘導中の分化の各段階を捕捉した（図４は三次元分化、図５は二次元分化）。二次元及び三次元の設定のいずれでも、多能性のマーカーとしてのＮａｎｏＧ発現は、細胞が成熟及び分化するのに従い減少する。神経外胚葉マーカー及び内胚葉マーカー、ＴＵＢＢ３（チューブリンベータ３クラスＩＩＩ）及びフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）は、三次元フォーマットにおいて有意に発現されず、ＴＵＢＢ３の上昇は二次元の設定でのみ捕捉される。これは、ｈｉＰＳＣが非神経外胚葉系統へとパターン化され、したがって、三次元フォーマットで乳腺前駆体が富化されることを実証する。本発明者らは、ｐ６３（ｐ５３と相同性のある核タンパク質）及びサイトケラチン１４（ＫＲＴ－１４）などの一般的に使用される基底細胞／筋上皮マーカーの発現パターンを試験した。いずれのマーカーも、両方の系において有意に検出可能である。更に、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）及びサイトケラチン８（ＫＲＴ８）は三次元システムでのみ追跡され、ＫＲＴ８は、二次元フォーマットではごく部分的に発現された。その結果、器官タイプの設定における三次元プレートは、乳房組織マーカー、管腔マーカー、及び基底マーカーのいずれも発現した。かかる乳腺様オルガノイドは、ＣＳＮ２（カゼインベータ）、乳タンパク質ペプチド、及びホルモン受容体を含むヒト乳房特異的タンパク質を発現する。管腔細胞は、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、及びＣＫ１８を特異的に発現するが、基底細胞は、ＣＫ１４、α－平滑筋アクチン、及びＰ６３を特異的に発現する。最終的に、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９Ｆ二重陽性細胞は、Ｄ１０とＤ３５との間の初期前駆細胞の段階で検出することができる。興味深いことに、ＣＳＮ２発現は、三次元器官系の最後の時点（Ｄ４２）でのみ捕捉され、二次元の分化プラットフォームでは捕捉されない。
定量的ＲＴ－ＰＣＲを使用して、ラクトサイト誘導中の分化の各段階を捕捉した（図４は三次元分化、図５は二次元分化）。二次元及び三次元の設定のいずれでも、多能性のマーカーとしてのＮａｎｏＧ発現は、細胞が成熟及び分化するのに従い減少する。神経外胚葉マーカー及び内胚葉マーカー、ＴＵＢＢ３（チューブリンベータ３クラスＩＩＩ）及びフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）は、三次元フォーマットにおいて有意に発現されず、ＴＵＢＢ３の上昇は二次元の設定でのみ捕捉される。これは、ｈｉＰＳＣが非神経外胚葉系統へとパターン化され、したがって、三次元フォーマットで乳腺前駆体が富化されることを実証する。本発明者らは、ｐ６３（ｐ５３と相同性のある核タンパク質）及びサイトケラチン１４（ＫＲＴ－１４）などの一般的に使用される基底細胞／筋上皮マーカーの発現パターンを試験した。いずれのマーカーも、両方の系において有意に検出可能である。更に、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）及びサイトケラチン８（ＫＲＴ８）は三次元システムでのみ追跡され、ＫＲＴ８は、二次元フォーマットではごく部分的に発現された。その結果、器官タイプの設定における三次元プレートは、乳房組織マーカー、管腔マーカー、及び基底マーカーのいずれも発現した。かかる乳腺様オルガノイドは、ＣＳＮ２（カゼインベータ）、乳タンパク質ペプチド、及びホルモン受容体を含むヒト乳房特異的タンパク質を発現する。管腔細胞は、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＣＤ４９Ｆ、ＧＡＴＡ３、ＣＫ８、及びＣＫ１８を特異的に発現するが、基底細胞は、ＣＫ１４、α－平滑筋アクチン、及びＰ６３を特異的に発現する。最終的に、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ４９Ｆ二重陽性細胞は、Ｄ１０とＤ３５との間の初期前駆細胞の段階で検出することができる。興味深いことに、ＣＳＮ２発現は、三次元器官系の最後の時点（Ｄ４２）でのみ捕捉され、二次元の分化プラットフォームでは捕捉されない。
【0246】
乳腺様オルガノイドのセクレトームの解析は、以下に記載されるように、オリゴ糖（ラクトース及びいくつかのＨＭＯを含む）、脂質（４つの脂肪酸を含む）、タンパク質（カゼインを含む７つが検出）、及びｍｉＲＮＡ（ＨＢＭにおいて典型的に検出される１１を含む７５が検出）を含むヒト乳特異的生物活性物質の分泌を示した。
【0247】
初代細胞の上清を、「Ａｕｓｔｉｎ ａｎｄ Ｂｅｎｅｔ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ｌａｃｔｏｓｅ ｍｉｌｋ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２０１８，１０１０，８６－９６」に記載される手順に従って、わずかな変更を加えて、ラクトース又はヒト乳オリゴ糖の存在について解析した。試料をＵＨＰＬＣで解析し、検出されたラクトース又はヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）を、ラクトース及び７種類のＨＭＯ（２’ＦＬ、３’ＦＬ、ＤＦＬ、ＬＮＴ、ＬＮｎＴ、３’ＳＬ及び６’ＳＬ）の混合物の検量線に対して定量した。この方法は０．１ｍｇ／Ｌの限界を有していると推定された。初代細胞の上清では、４２日目にラクトース（０．２２ｍｇ／Ｌ）及び６’ＳＬ（０．３２ｍｇ／Ｌ）が検出された。
【0248】
培地及び細胞上清中の脂肪酸を、水素炎イオン化検出器と連結したガスクロマトグラフィーによって分析した。簡単に説明すると、４２日目に得られた上清を分析して、いくつかの脂質クラスに含まれる脂肪酸の存在を調査する。溶融シリカＣＰ－Ｓｉｌ ８８キャピラリーカラム（１００％シアノプロピルポリシロキサン、１００ｍ、内径０．２５ｍｍ、フィルム厚０．２５ｍｍ）を備えた分取ステーションモジュールを有する７６９３オートサンプラーを備えた７８９０Ａガスクロマトグラフを、２５０℃で加熱されたスプリットインジェクター（１：２５比）、及び３００℃で操作される水素炎イオン化検出器と共に使用する。ＦＡＭＥ（脂肪酸メチルエステル）の調製は、メタノール性塩酸（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ ｃｈｌｏｒｉｄｒｉｃ ａｃｉｄ）による試料の直接エステル交換によって行われる。ＦＡＭＥの分離は、キャピラリーガスクロマトグラフィー－ＦＩＤ（ＧＣ）を使用して行われる。ＦＡＭＥの同定は、保持時間（ＲＴ）及び外部標準との比較によって行われる。脂肪酸の定量は、内部標準としてメチルＣ１１：０を使用する計算によって行われる。本方法のエステル交換性能は、第２の内部標準としてＴＡＧ Ｃ１３：０を用いて制御される。内部標準の添加後、溶液を２ｍＬのメタノール、２ｍＬのメタノール／ＨＣｌ（３Ｎ）及び１ｍＬのヘキサンと混合した。１００℃／６０分で加熱した後、試料を室温まで冷却し（約１５分）、２ｍＬの水を添加することによって反応を停止させる。遠心分離後、有機相をＧＣに直接注入する。
【0249】
４２日目における実施例４ａのプロトコルからの脂肪酸の結果（培地と上清との間で観察された差）を表１に示す。
【0250】
以下の表１には、細胞上清サンプル中に発現された脂肪酸を掲載する。
【0251】
【表1】
【0252】
細胞上清中のタンパク質を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥプロファイリング、次いでＬＣ－ＭＳＭＳによる同一性確認のためのバンド単離を使用して解析した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析のために、調製した試料の全量をゲルにロードした。ヒト乳サンプルを対照として比較のために添加した。選択されたゲル領域（バンド）を切断して、ＬＣ－ＭＳＭＳによってヒトタンパク質を探索した。最終的に、バンドをゲル内トリプシン消化に供し、ＬＣ－ＭＳＭＳによって解析した。ＬＣ－ＭＳＭＳデータをＰｅａｋｓ Ｓｔｕｄｉｏで分析し、ヒトタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔデータベースに対して照合した。
【0253】
以下の表２には、切り出された全てのバンドについての最良の候補を掲載する。
【0254】
【表2】
【0255】
ＥｘｏＱｕｉｃｋポリマーネットを使用して、エキソソーム単離及びｍｉＲＮＡプロファイリングを行った。ＥｘｏＱｕｉｃｋポリマーは、ネットワークを形成することによってエキソソームを沈殿させるように作用し、ある程度のサイズのエキソソームを全て回収する。ＥｘｏＱｕｉｃｋメッシュが形成されると、エキソソームは、単純な低速遠心分離によって容易にペレットとして沈殿する。エキソソームは損なわれておらず、タンパク質又はＲＮＡ分析が可能な状態であり、機能試験にあたり生物活性を有する。沈殿緩衝液を０．２５倍の割合で試料に添加し、次いでボルテックスした。混合物を４℃で一晩インキュベートした。インキュベート後、試料を１５００×ｇで３０分間遠心分離した。エキソソームペレットを、ＱＣ用のＢｕｆｆｅｒ ＸＥ（ＱＩＡＧＥＮ）又はｍｉＲＮＡプロファイリング用のＨＴＧ ＥｄｇｅＳｅｑ ｍｉＲＮＡ Ｗｈｏｌｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ＡｓｓａｙからのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを用いて初期容量でボルテックスすることによって再懸濁した。細胞外小胞（ＥＶ）の単離を評価するために、まず上清を３０００ｇで１５分間遠心分離して、細胞ペレット及び破片を除去した。次いで、１００マイクロリットルの培地を使用し、ＥｘｏＱｕｉｃｋ緩衝液（０．２５×比）により４℃で一晩沈殿させた。ＥＶ沈殿物を１５００ｇで３０分間の遠心分離によって回収した。各試料に対して２回の沈殿を行い、１回目のＥＶ沈殿は、実施する可能性のあるさらなる分析のために緩衝液ＸＥ（ＱＩＡＧＥＮ）に再懸濁し、２回目の沈殿では、１０倍濃縮するために５０ｕＬのＨＴＧ溶解緩衝液のみに再懸濁し、その後ＨＴＧによるｍｉＲＮＡプロファイリングに供した。
【0256】
ｍｉＲＮＡプロファイリングのために、試料を第１の溶解ステップにおいて直接使用した。したがって、全試料を直接使用し、血漿溶解緩衝液で１：１の比で溶解した。次に、プロテイナーゼＫ（１／１０）を添加し、試料をＴｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ上で５０℃、６００ｒｐｍで３時間インキュベートした。ＥＶを溶解緩衝液に再懸濁し、同じ条件で溶解し、溶解インキュベートの前には９５℃で１０分間のインキュベートステップを加えた。２６μＬの溶解物を、ＨＴＧ ＥｄｇｅＳｅｑ ｍｉＲＮＡ全トランスクリプトームアッセイＶ２手順に従って、ＨＴＧプロセッサ上で７０μＬの油で処理した。インデックス付け及び増幅ライブラリーのために、試料をＩｌｌｕｍｉｎａアダプターでタグ付けし、ＯｎｅＴａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＧＣ Ｂｕｆｆｅｒ（９５℃で４分；１６サイクル：９５℃で１５秒、５６℃で４５秒、６８℃で４５秒；６８℃１０分；４℃で保持）でＰＣＲし、ロボット液体ハンドラーＳｃｉＣｌｏｎｅ ＮＧＳ ＷｏｒｋＳｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）上でＡＭＰｕｒｅ洗浄した（２．５比）。Ｈａｍｉｌｔｏｎロボット上で本発明者らのカスタムプーリングプログラムを用いてプールを得た。サンプルを、ＧＸタッチチップＨＳ定量に基づいてプールした。２回目には、ＡＭＰｕｒｅ Ｂｅａｄ（１．８比）を用いて手動でプールを精製して、残っている可能性のある微量のプライマー二量体を除去し、Ｑｕｂｉｔを用いて定量して、最終濃度を２ｎＭに調整した。最後のステップとして、ＭｉＳｅｑ配列決定のために、５％ＰｈｉＸを添加してＭｉＳｅｑ上に２０ｐＭのプールをロードし、１５０Ｖ３キットを用いて５０塩基シングルリードについてＭｉＳｅｑ上で配列決定した。
【0257】
簡潔には、細胞上清中には９７４のｍｉＲＮＡが検出され、そのうちの７５個を超えるｍｉＲＮＡが、乳試料において高度に発現されるｍｉＲＮＡである。
【0258】
以下の表３には、上位１０個の高度に発現されたｍｉＲＮＡを掲載する。
【0259】
【表3】
【0260】
本発明者らの知見は、正常な乳腺細胞の運命及び機能と、母乳生物活性物質生産との調節及び発達を研究するための新規のｉＰＳＣベースの三次元器官型モデルを提供する。
【0261】
実施例５
三次元オルガノイド設定を使用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の非神経性外胚葉系統分化に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の効果
方法：ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入し、乳腺前駆細胞の三次元分化のために使用した。簡潔に述べると、５５０万個の解離したｉＰＳＣを、４．５ｍＬの凝集培地を含有する６ウェルプレート（超低接着）に、平面シェーカープラットフォーム（９５ＲＰＭに設定）を使用して播種した。異なる濃度のＢＭＰ４（３１４－ＢＰ－０５０、Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ ＡＧ）を、０日目～３日目の間に培養培地に添加した。
三次元オルガノイド設定を使用した人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の非神経性外胚葉系統分化に対する骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）の効果
方法：ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）株６０３を、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ（ＦＣＤＩ）から購入し、乳腺前駆細胞の三次元分化のために使用した。簡潔に述べると、５５０万個の解離したｉＰＳＣを、４．５ｍＬの凝集培地を含有する６ウェルプレート（超低接着）に、平面シェーカープラットフォーム（９５ＲＰＭに設定）を使用して播種した。異なる濃度のＢＭＰ４（３１４－ＢＰ－０５０、Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈｎｅ ＡＧ）を、０日目～３日目の間に培養培地に添加した。
【0262】
結果：ｉＰＳＣ細胞を様々な濃度のＢＭＰ４で試験して、非神経性外胚葉分化を誘導した（図６のａ、ｂ）。２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４は、フローサイトメトリー定量化を使用して、ＥｐＣＡＭ（ＣＤ３２６）、ＣＤ４９ｆ、ＭＵＣ１（ＣＤ２２７）、及びＧＡＴＡ３などの乳腺前駆細胞マーカーの発現を有意に誘導した（図６のｃ～ｆ）。主要な非神経性外胚葉マーカーとしてのヒトＴＦＡＰ２Ａ及びＴＦＡＰ２Ｃ（ＡＰ２ガンマ）の発現は、対照試料と比較して、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ分析を使用して分化の１０日目に増加した（図６のｇ～ｈ）。更に、ペアードボックス遺伝子６（ＰＡＸ６）、オルソデンティクルホメオボックス２（ＯＴＸ２）、及びＳＲＹボックス転写因子１１（ＳＯＸ１１）などのヒト特異的神経性外胚葉マーカーの発現レベルは、分化中に減少した（図６のｉ～ｋ）。最後に、ＢＭＰ４は、ヒト管腔特異的マーカーのサイトケラチン１８（ＫＲＴ１８）及び分泌型リン酸化乳糖タンパク質オステオポンチン（ＯＰＮ）の発現を誘導することができる（図６のｌ～ｍ）。
【0263】
これらの結果は、ＢＭＰ４がｉＰＳＣの非神経性外胚葉系統へ向かうコミットメントを誘導し、驚くべきことに、乳腺前駆細胞特異化を有意に増加させることを実証するものである。
【0264】
実施例６
ＢＭＰ４処理試料は、対照試料と比較して、二重乳腺マーカーＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４９ｆ＋及び二重成熟管腔ラクトサイトマーカーＭＵＣ１＋／ＥｐＣＡＭ＋のより高い発現を示した（図７ａ）。
ＢＭＰ４処理試料は、対照試料と比較して、二重乳腺マーカーＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４９ｆ＋及び二重成熟管腔ラクトサイトマーカーＭＵＣ１＋／ＥｐＣＡＭ＋のより高い発現を示した（図７ａ）。
【0265】
更に、エストロゲン関連受容体アルファ（ＥＳＲＲＡ）、ケラチン１４（ＫＲＴ１４）、及びＭＵＣ１の発現プロファイルを使用して、ｉＰＳＣ細胞の三次元乳腺分化の最終段階におけるＢＭＰ４の効果を評価した。驚くべきことに、ＢＭＰ４は、対照試料と比較して、３０日目、３３日目、及び３５日目に全ての遺伝子のＲＮＡ発現レベルを増加させた（図７ｂ）。
【0266】
本明細書で述べる現在の好ましい実施形態に対する様々な変更及び修正が、当業者には明らかとなる点を理解されたい。このような変更及び修正は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、並びに本発明の付随する利点を減らすことなく、なされてもよい。したがって、このような変更及び修正は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【国際調査報告】