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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】核酸セグメントの送達用の新規の脂質
(51)【国際特許分類】
C07D 498/08 20060101AFI20241024BHJP
A61K 9/51 20060101ALI20241024BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20241024BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20241024BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20241024BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20241024BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241024BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20241024BHJP
A61K 31/7115 20060101ALI20241024BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241024BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20241024BHJP
A61K 31/7125 20060101ALI20241024BHJP
A61K 31/711 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C07D498/08 CSP
A61K9/51
A61K47/22
A61K47/24
A61K47/28
A61K47/34
A61K31/7088
A61K31/7105
A61K31/7115
A61P43/00 111
A61K31/712
A61K31/7125
A61K31/711
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024524671
(86)(22)【出願日】2022-10-24
(85)【翻訳文提出日】2024-06-21
(86)【国際出願番号】 IB2022060200
(87)【国際公開番号】W WO2023073534
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/271,960
(32)【優先日】2021-10-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】391008951
【氏名又は名称】アストラゼネカ・アクチエボラーグ
【氏名又は名称原語表記】ＡＳＴＲＡＺＥＮＥＣＡ ＡＫＴＩＥＢＯＬＡＧ
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100156144
【弁理士】
【氏名又は名称】落合 康
(72)【発明者】
【氏名】リンドフォーシュ，レンナルト
(72)【発明者】
【氏名】ウルコスキ，デイビッド
(72)【発明者】
【氏名】クリシュナムルティ，ベンカタ アール
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA65
4C076BB13
4C076BB15
4C076BB16
4C076BB21
4C076BB22
4C076CC29
4C076DD60
4C076DD63
4C076DD70
4C076EE23
4C076FF31
4C076FF68
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086CB22
4C086EA16
4C086MA03
4C086MA05
4C086MA41
4C086NA10
4C086NA13
4C086ZC02
(57)【要約】
本明細書中で開示されるのは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２、Ｙ２、ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、及びｆは、本明細書中で定義される通りである。また、開示されるのは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む脂質ナノ粒子；式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び核酸セグメントを含む複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物；並びに核酸セグメントを送達する方法であって、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び核酸セグメントを含む複数の脂質ナノ粒子を投与することを含む方法である。
【化１】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（Ｉ）：【化1】
ａ及びｂは、各々独立して、３、４、又は５であり；
ｃ及びｄは、各々独立して、１、２、又は３であり；
ｅ及びｆは、各々独立して、０、１、又は２であり；
Ｘ１は、メチレン又は
【化2】
Ｘ２は、メチレン又は
【化3】
ｇ及びｈは、各々独立して、１、２、又は３であり；
ｉ及びｊは、各々独立して、０、１、又は２であり；
Ｙ１及びＹ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
【化4】
Ｚ１及びＺ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
【化5】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルであり；
Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである、
化合物。
【請求項2】
Ｘ１及びＸ２は双方ともメチレンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項3】
ａ及びｂは双方とも４であり；ｃ及びｄは双方とも２である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項4】
ｅ及びｆは双方とも０である、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項5】
Ｙ１は、直鎖Ｃ７～１０アルキル又は直鎖Ｃ７～１０アルケニルであり；Ｙ２は
【化6】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項6】
Ｙ１及びＹ２は、各々独立して、【化7】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである、請求項１～４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項7】
ｅ及びｆは、各々独立して、１又は２である、請求項１～３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項8】
Ｙ１及びＹ２は、各々独立して、【化8】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである、請求項７に記載の化合物。
【請求項9】
式（ＩＩ）：【化9】
ｋは、０、１、又は２であり；
Ｙ１は、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
【化10】
Ｙ２は
【化11】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである、
請求項１～６又は８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項10】
Ｘ１は【化12】
Ｘ２は
【化13】
【請求項11】
ａ及びｂは双方とも４であり；ｃ及びｄは双方とも２である、請求項１０に記載の化合物。
【請求項12】
ｅ及びｆは、各々独立して、１又は２である、請求項１０又は１１に記載の化合物。
【請求項13】
ｇ及びｈは双方とも２である、請求項１０～１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項14】
ｉ及びｊは双方とも１である、請求項１０～１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項15】
Ｙ１及びＹ２は、各々独立して、【化14】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである、
請求項１０～１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項16】
ヘプタデカン－９－イル８－（７－（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアート；ヘプタデカン－９－イル（Ｚ）－８－（７－（８－（ノナ－２－エン－１－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアート；
３－ヘプチルドデシル８－（７－（８－（（３－オクチルウンデシル）オキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアート；
ジ（ヘプタデカン－９－イル）８，８’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ジオクタノアート；及び
テトラキス（２－オクチルデシル）３，３’，３’’，３’’’－（（（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザネトリイル））テトラプロピオナート；
又はその薬学的に許容可能な塩から選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項17】
請求項１～１６のいずれか一項に記載の化合物、又はその薬学的に許容可能な塩を含む脂質ナノ粒子。
【請求項18】
少なくとも１つの中性脂質、少なくとも１つのステロール、及び少なくとも１つのポリマーコンジュゲート脂質をさらに含む、請求項１７に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項19】
前記中性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、又はそれらの組合せから選択される、請求項１８に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項20】
前記ステロールはコレステロールである、請求項１８又は１９に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項21】
前記ポリマーコンジュゲート脂質は、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２０００－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＰＧ、又はそれらの組合せから選択される、請求項１８、１９、又は２０のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項22】
前記脂質ナノ粒子はさらに、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００を含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項23】
治療剤をさらに含む、請求項１７～２２のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項24】
前記治療剤は核酸セグメントである、請求項２３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項25】
前記核酸セグメントはＲＮＡである、請求項２４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項26】
前記ＲＮＡは修飾ｍＲＮＡである、請求項２５に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項27】
請求項２３～２６のいずれか一項に記載の複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物。
【請求項28】
対象において疾患又は障害を処置する方法であって、前記対象に、治療有効量の、請求項２７に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項29】
疾患又は障害を処置するための、請求項２８に記載の医薬組成物の使用。
【請求項30】
疾患又は障害の処置に使用される、請求項２７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月２６日出願の米国仮特許出願第６３／２７１，９６０号明細書の優先権の利益を主張する。この出願は、全ての目的についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１０月２６日出願の米国仮特許出願第６３／２７１，９６０号明細書の優先権の利益を主張する。この出願は、全ての目的についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
オリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、例えば、メッセンジャＲＮＡ［ｍＲＮＡ］及び低分子干渉ＲＮＡ［ｓｉＲＮＡ］、アンチセンスオリゴヌクレオチド［ＡＳＯ］、並びにＤＮＡ）等の核酸セグメントは、種々の疾患及び障害のための新しい治療処置として、幅広い潜在性を有する。しかしながら、オリゴヌクレオチド治療薬の投与に課題が残っている。典型的な製剤は、オリゴヌクレオチドを脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中にカプセル化することを含む。ＬＮＰ製剤は、通常、（ａ）ポリアニオン性ｍＲＮＡをカプセル化する、第三級又は第四級アミンを有するイオン化可能又はカチオン性脂質又はポリマー材料；（ｂ）細胞膜内の脂質に似ている双性イオン性脂質；（ｃ）ＬＮＰの脂質二重層を安定させるコレステロール；及び（ｄ）ナノ粒子に水和層を与え、コロイド安定性を向上させ、且つタンパク質吸収を引き下げるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－脂質を含む（非特許文献１参照）。
【0003】
２０１８年に、ＦＤＡは、遺伝性トランスチレチン媒介アミロイド症を患う人々における多発性神経炎の処置のために、最初のＲＮＡ干渉療法、パチシランを承認した。これは、イオン化可能脂質（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、［ＭＣ３］）を組み込むＬＮＰを用いて、静脈内に送達される。しかしながら、標的器官、意図される送達経路、及び必要とされる治療ウィンドウに応じて、ＭＣ３は、全ての送達システムに最も適しているわけではなかろう。用量を制限する毒性が、２つの毒物学関連試験種、ラット及びサルにおける研究から報告された。これは、送達されるカーゴではなく、ＭＣ３ベースのＬＮＰ製剤に関連した（非特許文献２参照）。また、最近、脂質ナノ粒子技術は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ウイルスに対する予防的ワクチン接種のための最初の承認されたｍＲＮＡ製品を生成するのに首尾よく応用された（例えば、非特許文献３参照）。しかしながら、オリゴヌクレオチド治療薬の送達用の脂質ナノ粒子製剤に用いられる新しいイオン化可能脂質を開発する必要が依然としてある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｋｏｗａｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２７（４），（２０１９），７１０－７２８
【非特許文献2】Ｓｅｄｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｐａｔｈｏｌ．５５（２），（２０１８），３４１－３５４
【非特許文献3】Ｌ．Ｓｃｈｏｅｎｍａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，６０１，（２０２１），Ｍａｙ １２０５８６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
一部の実施形態において、開示されるのは、式（Ｉ）：
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、
ａ及びｂは、各々独立して、３、４、又は５であり；
ｃ及びｄは、各々独立して、１、２、又は３であり；
ｅ及びｆは、各々独立して、０、１、又は２であり；
Ｘ１は、メチレン又は
であり、
Ｘ２は、メチレン又は
であり、
ｇ及びｈは、各々独立して、１、２、又は３であり；
ｉ及びｊは、各々独立して、０、１、又は２であり；
Ｙ１及びＹ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
であり、
Ｚ１及びＺ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
であり、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルであり；
Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【化1】
ａ及びｂは、各々独立して、３、４、又は５であり；
ｃ及びｄは、各々独立して、１、２、又は３であり；
ｅ及びｆは、各々独立して、０、１、又は２であり；
Ｘ１は、メチレン又は
【化2】
Ｘ２は、メチレン又は
【化3】
ｇ及びｈは、各々独立して、１、２、又は３であり；
ｉ及びｊは、各々独立して、０、１、又は２であり；
Ｙ１及びＹ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
【化4】
Ｚ１及びＺ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
【化5】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルであり；
Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【0006】
一部の実施形態において、開示されるのは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む脂質ナノ粒子である。
【0007】
一部の実施形態において、開示されるのは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び核酸セグメントを含む複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物である。
【0008】
一部の実施形態において、開示されるのは、対象において疾患又は障害を処置する方法であって、対象に、治療有効量の、本明細書中に記載される医薬組成物を投与することを含む方法である。
【0009】
一部の実施形態において、開示されるのは、疾患又は障害の処置に使用される、本明細書中に記載される医薬組成物である。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】ＭＣ３、ＭＯＤ５、化合物４、及び化合物２を含むＬＮＰ製剤の気管内投与後の２４時間目のラット肺におけるｅＧＦＰの発現を示す。
【図2】ＭＣ３、ＭＯＤ５、化合物４、及び化合物２を含むＬＮＰ製剤の気管内投与後の２４時間目のラットＢＡＬＦにおけるＢＡＬＦ好中球濃度を示す。
【図3】ＭＣ３及び化合物１を含むＬＮＰ製剤の気管内投与後の２４時間目のラット肺におけるｅＧＦＰの発現を示す。
【図4】ＭＣ３及び化合物１を含むＬＮＰ製剤の気管内投与後の２４時間目のラットＢＡＬＦにおけるＢＡＬＦ好中球濃度を示す。
【図5A-B】化合物１を含むＬＮＰ製剤の気管内投与後のマクロファージ及び１型上皮細胞の双方における、ＩＨＣによって示されるｅＧＦＰの発現を示す。
【図6】化合物１を含むＬＮＰ製剤の吸入投与後の５及び２４時間目のラット肺におけるｅＧＦＰのレベルを示す。
【図7】化合物１を含むＬＮＰ製剤の吸入投与後の２４時間目のラットＢＡＬＦにおけるＢＡＬＦ好中球濃度を示す。
【図8】ＭＣ３、化合物２、及び化合物３を含むＬＮＰ製剤の静脈内投与後の２４時間目のマウス肝臓におけるｅＧＦＰの発現を示す。
【図9】ＭＣ３、化合物２、及び化合物３を含むＬＮＰ製剤の静脈内投与後の２４時間目のマウス脾臓におけるｅＧＦＰの発現を示す。
【図10】ＭＣ３、化合物２、及び化合物３を含むＬＮＰ製剤の静脈内投与後の２４時間目のマウス肺におけるｅＧＦＰの発現を示す。
【図11】ＭＣ３、化合物２、及び化合物３を含むＬＮＰ製剤の静脈内投与後の２４時間目のマウス腎臓におけるｅＧＦＰの発現を示す。
【図12】ＭＣ３、化合物２、及び化合物３を含むＬＮＰ製剤の静脈内投与後の２４時間目のマウス心臓におけるｅＧＦＰの発現を示す。
【図13】ＭＣ３、化合物２、及び化合物３を含むＬＮＰ製剤の静脈内投与後の２４時間目のマウス肝臓におけるルシフェラーゼタンパク質の発現を示す。
【図14】ＭＣ３、化合物２、化合物３を含むＬＮＰ製剤の静脈内投与後の２４時間目のマウス心臓、肺、脾臓、及び肝臓のＩＶＩＳ画像を示す。
【図15】ＭＣ３、化合物２、及び化合物３を含むＬＮＰ製剤の静脈内投与後の６時間目のマウス血漿におけるｈＥＰＯタンパク質濃度を示す。
【図16】ＭＯＤ５及び化合物５を含むＬＮＰ製剤の線条体内投与後のＬｏｘＰ Ｌｕｃリポーターマウスにおける皮質及び線条体平均Ｌｕｃ発現を示す。
【発明を実施するための形態】
【0011】
一部の実施形態において、開示されるのは、式（Ｉ）：
の化合物又はその薬学的に許容可能な塩であり、式中、
ａ及びｂは、各々独立して、３、４、又は５であり；
ｃ及びｄは、各々独立して、１、２、又は３であり；
ｅ及びｆは、各々独立して、０、１、又は２であり；
Ｘ１は、メチレン又は
であり、
Ｘ２は、メチレン又は
であり、
ｇ及びｈは、各々独立して、１、２、又は３であり；
ｉ及びｊは、各々独立して、０、１、又は２であり；
Ｙ１及びＹ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
であり、
Ｚ１及びＺ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
であり、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルであり；
Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【化6】
ａ及びｂは、各々独立して、３、４、又は５であり；
ｃ及びｄは、各々独立して、１、２、又は３であり；
ｅ及びｆは、各々独立して、０、１、又は２であり；
Ｘ１は、メチレン又は
【化7】
Ｘ２は、メチレン又は
【化8】
ｇ及びｈは、各々独立して、１、２、又は３であり；
ｉ及びｊは、各々独立して、０、１、又は２であり；
Ｙ１及びＹ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
【化9】
Ｚ１及びＺ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
【化10】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルであり；
Ｒ３及びＲ４は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【0012】
式（Ｉ）の一部の実施形態において、Ｘ１及びＸ２は双方ともメチレンである。
【0013】
式（Ｉ）の一部の実施形態において、ａ及びｂは双方とも４であり；ｃ及びｄは双方とも２である。
【0014】
式（Ｉ）の一部の実施形態において、ｅ及びｆは双方とも０である。
【0015】
式Ｉ及びＩＩの一部の実施形態において：
Ｙ１は、直鎖Ｃ７～１０アルキル又は直鎖Ｃ７～１０アルケニルであり；
Ｙ２は
であり；
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
Ｙ１は、直鎖Ｃ７～１０アルキル又は直鎖Ｃ７～１０アルケニルであり；
Ｙ２は
【化11】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【0016】
式（Ｉ）の一部の実施形態において、Ｙ１及びＹ２は、各々独立して、
であり；
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【化12】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【0017】
式（Ｉ）の一部の実施形態において、ｅ及びｆは、各々独立して、１又は２である。式（Ｉ）の一部の更なる実施形態において、Ｙ１及びＹ２は、各々独立して、
であり、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【化13】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【0018】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、式（ＩＩ）：
の化合物であり、式中、
ｋは、０、１、又は２であり；
Ｙ１は、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
であり、
Ｙ２は
であり、
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【化14】
ｋは、０、１、又は２であり；
Ｙ１は、直鎖Ｃ７～１０アルキル、直鎖Ｃ７～１０アルケニル、又は
【化15】
Ｙ２は
【化16】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【0019】
式（Ｉ）の一部の実施形態において、
Ｘ１は
であり；
Ｘ２は
である。
Ｘ１は
【化17】
Ｘ２は
【化18】
【0020】
式（Ｉ）の一部の実施形態において、ａ及びｂは双方とも４であり；ｃ及びｄは双方とも２である。
【0021】
式（Ｉ）の一部の実施形態において、ｅ及びｆは、各々独立して、１又は２である。
【0022】
式（Ｉ）の一部の実施形態において、ｇ及びｈは双方とも２である。
【0023】
式（Ｉ）の一部の実施形態において、ｉ及びｊは双方とも１である。
【0024】
式（Ｉ）の一部の実施形態において、Ｙ１及びＹ２は、各々独立して、
であり；
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【化19】
Ｒ１及びＲ２は、各々独立して、直鎖Ｃ７～１０アルキルである。
【0025】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ヘプタデカン－９－イル８－（７－（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアート又はその薬学的に許容可能な塩である。
【0026】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ヘプタデカン－９－イル（Ｚ）－８－（７－（８－（ノナ－２－エン－１－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアート又はその薬学的に許容可能な塩である。
【0027】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、３－ヘプチルドデシル８－（７－（８－（（３－オクチルウンデシル）オキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアート又はその薬学的に許容可能な塩である。
【0028】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ジ（ヘプタデカン－９－イル）８，８’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ジオクタノアート又はその薬学的に許容可能な塩である。
【0029】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、テトラキス（２－オクチルデシル）３，３’，３’’，３’’’－（（（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザネトリイル））テトラプロピオナート又はその薬学的に許容可能な塩である。
【0030】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ヘプタデカン－９－イル８－（７－（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートである。
【0031】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ヘプタデカン－９－イル（Ｚ）－８－（７－（８－（ノナ－２－エン－１－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートである。
【0032】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、３－ヘプチルドデシル８－（７－（８－（（３－オクチルウンデシル）オキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートである。
【0033】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ジ（ヘプタデカン－９－イル）８，８’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ジオクタノアートである。
【0034】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、テトラキス（２－オクチルデシル）３，３’，３’’，３’’’－（（（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザネトリイル））テトラプロピオナートである。
【0035】
本明細書中で用いられる用語「Ｃｉ～ｊ」は、ある範囲の炭素原子数を示し、ｉ及びｊは、整数であり、炭素原子数の範囲は、終点（即ち、ｉ及びｊ）並びにそれらの間の各整数点を含み、ｊはｉよりも大きい。例えば、Ｃ７～１０は、７つの炭素原子、８つの炭素原子、９つの炭素原子、及び１０個の炭素原子を含む、７～１０個の炭素原子の範囲を示す。
【0036】
本明細書中で用いられる用語「アルキル」は、別の用語の一部として用いられるか、独立して用いられるかに拘わらず、飽和炭化水素鎖を指す。一実施形態において、先で言及される飽和炭化水素鎖は、炭素原子が分岐なしに連続する一本の鎖で連結されている直鎖アルキルである。用語「Ｃｉ～ｊアルキル」は、ｉ～ｊ個の炭素原子を有するアルキルを指す。例えば、「Ｃ７～１０アルキル」は、７～１０個の炭素原子を有するアルキルを指す。
【0037】
本明細書中で用いられる用語「アルケニル」は、別の用語の一部として用いられるか、独立して用いられるかに拘わらず、少なくとも１つの二重結合を含有する不飽和炭化水素鎖を指す。一実施形態において、先で言及される不飽和炭化水素鎖は、炭素原子が分岐なしに連続する一本の鎖で連結されている直鎖アルケニルである。用語「Ｃｉ～ｊアルケニル」は、ｉ～ｊ個の炭素原子を有するアルケニルを指す。例えば、Ｃ７～１０アルケニルは、７～１０個の炭素原子を有するアルケニルを指す。一実施形態において、Ｃ７～１０アルケニル基は、１つの二重結合を含有する。
【0038】
一部の実施形態において、開示されるのは、式（Ｉ）の化合物である。一部の実施形態において、開示されるのは、式（Ｉ）の化合物の薬学的に許容可能な塩である。用語「薬学的に許容可能な塩」は、式（Ｉ）の化合物の生物学的な有効性及び特性を保持し、且つ典型的には、生物学的にも他の面でも望ましくないということがない酸付加塩又は塩基塩を含む。薬学的に許容可能な酸付加塩は、無機酸及び有機酸により形成され得、例えば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物／臭化水素酸塩、炭酸水素塩／炭酸塩、硫酸水素塩／硫酸塩、カンファースルホン酸塩、塩化物／塩酸塩、クロルテオフィロン酸塩（ｃｈｌｏｒｔｈｅｏｐｈｙｌｌｏｎａｔｅ）、クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、馬尿酸塩、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフトエ酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パルモ酸塩（ｐａｌｍｏａｔｅ）、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、次サリチル酸塩、硫酸塩／硫酸水素塩、酒石酸塩、トシル酸塩、及びトリフルオロ酢酸塩がある。塩が誘導され得る無機酸として、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等が挙げられる。塩が誘導され得る有機酸として、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、スルホサリチル酸等が挙げられる。
【0039】
一部の実施形態において、開示されるのは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。一部の実施形態において、開示されるのは、式（Ｉ）の化合物を含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）である。用語「脂質ナノ粒子」は、エタノール中の脂質含有溶液の、水溶液とのマイクロフルイディック混合によって生成される高電子密度ナノ構造コアを含む。本明細書中で開示される脂質ナノ粒子は、ナノ粒子の正味荷電が約０である場合には、通常のナノ粒子技術において用いられるあらゆる材料、例えば、イオン化可能脂質、中性脂質、ステロール、及びポリマーコンジュゲート脂質から構築され得る。
【0040】
一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、脂質ナノ粒子に適したイオン化可能脂質である。脂質ナノ粒子中で式（Ｉ）の化合物と組み合わされ得るイオン化可能脂質の他の非限定的な例として、例えば生理学的ｐＨ範囲の酸性スケールにて正電荷を含有する脂質、例えば、１，２－ジリノレイロキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＭＡ）、ジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチラート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（例えば、米国特許第８，１５８，６０１号明細書参照）、２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）、Ｍｅｒｃｋ－３２（例えば、国際公開第２０１２／０１８７５４号パンフレット参照）、Ａｃｕｉｔａｓ－５（例えば、国際公開第２０１５／１９９９５２号パンフレット参照）、ＫＬ－１０（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０２９５８３２号明細書参照）、Ｃ１２－２００（例えば、Ｌｏｖｅ，ＫＴ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０７：１８６４（２００９）参照）等が挙げられる。イオン化可能脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質に対して、約５％～約９０％、例えば約１０％～約８０％、例えば約２５％～約７５％、例えば約４０％～約６０％、約４０％～約５０％の範囲、例えば約４５％又は約５０％のモルパーセント量で存在し得る。
【0041】
用語「中性脂質」は、生理学的ｐＨにて正味荷電がゼロの脂質、例えば、生理学的ｐＨにて荷電してない形態で、又は中性の双性イオン性形態で存在する脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）等、及びそれらの組合せを含む。中性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質に対して、約１％～約５０％、例えば約５％～約２０％、例えば７．５％～約１２．５％に及ぶ、例えば約１０％のモルパーセント量で存在し得る。一部の実施形態において、中性脂質はＤＳＰＣである。一部の実施形態において、中性脂質はＤＯＰＥである。一部の実施形態において、中性脂質はＤＰＰＣである。一部の実施形態において、中性脂質はＤＭＰＣである。
【0042】
用語「ステロール」は、コレステロール等を含む。ステロールは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質に対して、約１０％～約９０％、例えば約２０％～約５０％、例えば約３５％～４５％に及ぶ、例えば約３８．５％のモルパーセント量で存在し得る。一部の実施形態において、ステロールはコレステロールである。
【0043】
用語「ポリマーコンジュゲート脂質」は、脂質部分及びポリマー部分を含む脂質、例えば脂質部分及びポリエチレングリコール部分の双方を含むＰＥＧ化脂質を含む。非限定的な例として、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）２０００（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００）、ＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００、ＤＰＧ－ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２０００－ｃ－ＤＯＭＧ、ＰＥＧ２０００－ｃ－ＤＯＰＧ等が挙げられる。使用可能なポリ（エチレングリコール）の分子量は、約５００～約１０，０００Ｄａ、又は約１，０００～約５，０００Ｄａに及び得る。一部の実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質はＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００である。一部の実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質はＤＰＰＥ－ＰＥＧ２０００である。一部の実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質はＤＭＧ－ＰＥＧ２０００である。一部の実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質はＤＰＧ－ＰＥＧ２０００である。一部の実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質はＰＥＧ２０００－ｃ－ＤＯＭＧである。一部の実施形態において、ポリマーコンジュゲート脂質はＰＥＧ２０００－ｃ－ＤＯＰＧである。ポリマーコンジュゲート脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質に対して、約０％～約２０％、例えば約０．５％～約５％、例えば約１％～約２％に及ぶ、例えば約１．５％のモルパーセント量で存在し得る。
【0044】
本開示の少なくとも１つの実施形態において、脂質ナノ粒子は、複数の脂質成分を組み合わせることによって調製され得る。例えば、脂質ナノ粒子は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、ステロール、中性脂質、及びポリマーコンジュゲート脂質を、存在する総脂質に対して５０：４０－ｘ：１０：ｘのモル比にて組み合わせて調製され得る。例えば、脂質ナノ粒子は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、ステロール、中性脂質、及びポリマーコンジュゲート脂質を、５０：３７：１０：３（モル／モル）のモル比、又は例えば５０：３８．５：１０：１．５（モル／モル）、又は例えば５０：３９．５：１０：０．５（モル／モル）、又は５０：３９．７５：１０：０．２５（モル／モル）のモル比にて組み合わせて調製され得る。
【0045】
別の実施形態において、脂質ナノ粒子は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、ステロール（コレステロール等）、中性脂質（ＤＳＰＣ等）、及びポリマーコンジュゲート脂質（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００等）を、存在する総脂質に対して約５０：３８．５：１０：１．５（モル／モル）のモル比にて用いて調製され得る。さらに別の非限定的な例が、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、ステロール（コレステロール等）、中性脂質（ＤＳＰＣ等）、及びポリマーコンジュゲート脂質（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００等）を、存在する総脂質に対して約４７．７：３６．８：１２．５：３（モル／モル）のモル比にて含む脂質ナノ粒子である。別の非限定的な例が、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、ステロール（コレステロール等）、中性脂質（ＤＳＰＣ等）、及びポリマーコンジュゲート脂質（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００等）を、存在する総脂質に対して約５２．４：４０．４：６．４：０．８（モル／モル）のモル比にて含む脂質ナノ粒子である。別の実施形態において、非限定的な例が、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、ステロール（コレステロール等）、中性脂質（ＤＳＰＣ等）、及びポリマーコンジュゲート脂質（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００等）を、存在する総脂質に対して約５３．５：４１．２：４．６：０．７（モル／モル）のモル比にて含む脂質ナノ粒子である。別の非限定的な例が、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、ステロール（コレステロール等）、中性脂質（ＤＳＰＣ等）、及びポリマーコンジュゲート脂質（ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００等）を、存在する総脂質に対して約３０：５０：１９：１（モル／モル）のモル比にて含む脂質ナノ粒子である。
【0046】
脂質ナノ粒子を構成する中性脂質、ステロール、及び／又はポリマーコンジュゲート脂質の選択、並びに当該脂質の互いに対する相対モル比は、選択される脂質の特徴、意図される標的細胞の性質、及び送達されることとなる核酸セグメントの特徴によって決定され得る。例えば、特定の実施形態において、脂質ナノ粒子中の式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩のモルパーセントは、存在する総脂質に対して約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、又は約７０％超であり得る。脂質ナノ粒子中の中性脂質のモルパーセントは、存在する総脂質に対して約５％超、約１０％超、約２０％超、約３０％超、又は約４０％超であり得る。脂質ナノ粒子中のステロールのモルパーセントは、存在する総脂質に対して約１０％超、約２０％超、約３０％超、又は約４０％超であり得る。脂質ナノ粒子中のポリマーコンジュゲート脂質のモルパーセントは、存在する総脂質に対して約０．２５％超、例えば、約１％超、約１．５％超、約２％超、約５％超、又は約１０％超であり得る。
【0047】
本開示に従えば、脂質ナノ粒子は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、中性脂質、ステロール、及び／又はポリマーコンジュゲート脂質の各々を、所望される有用なあらゆる配向性で含み得る。例えば、ナノ粒子のコアは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩を単独で、又は別のイオン化可能脂質、ステロールと組み合わせて含み得、その後、中性脂質及び／又はポリマーコンジュゲート脂質を含む１つ以上の層が、コアを囲み得る。例えば、一実施形態に従えば、脂質ナノ粒子のコアは、特定のあらゆる厚みの中性脂質単層（例えばＤＳＰＣ）によって囲まれ、さらに特定のあらゆる厚みの外側のポリマーコンジュゲート脂質単層によって囲まれた、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及びステロール（例えばコレステロール）を、特定のあらゆる比にて含むコアを含み得る。そのような例において、核酸セグメントは、意図される標的細胞の性質、及び送達されることとなる核酸セグメントの特徴に応じて、コア又はそれに続く層のいずれか１つの中に組み込まれ得る。コア及び外層は、典型的には当該技術において知られている脂質ナノ粒子中に組み込まれる他の成分をさらに含んでもよい。さらに、リポソームが、本明細書中で開示される脂質ナノ粒子とは異なった小胞性の構造を有する送達ビヒクルであることが、当業者によって理解される。リポソームベシクルは、水性相を包含する中空の球体の形状で形成される脂質二重層で構成される。例えば、リポソームはラメラ相を含有する一方、脂質ナノ粒子は非ラメラ構造を有する。
【0048】
加えて、脂質ナノ粒子を構成する脂質ナノ粒子の成分（例えば、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、中性脂質、ステロール、及び／又はポリマーコンジュゲート脂質）のモルパーセントは、脂質ナノ粒子全体の特定の物理パラメータ、例えば１つ以上の脂質の表面積を提供するように選択されてもよい。例えば、脂質ナノ粒子を構成する式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、中性脂質、ステロール、及び／又はポリマーコンジュゲート脂質のモルパーセントは、中性脂質、例えばＤＳＰＣあたりの表面積が得られるように選択されてもよい。非限定的な例として、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、中性脂質、ステロール、及び／又はポリマーコンジュゲート脂質のモルパーセントは、約１．０ｎｍ２～約２．０ｎｍ２、例えば約１．２ｎｍ２のＤＳＰＣあたりの表面積が得られるように決定されてもよい。
【0049】
本開示に従えば、脂質ナノ粒子はさらに、脂質ナノ粒子の表面上で会合され得、且つ／又は同じ脂質ナノ粒子内にカプセル化され得る核酸セグメントを含み得る。
【0050】
用語「核酸セグメント」は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ複合体、又はそれらの組合せから選択される１つ以上のあらゆる核酸セグメントを意味すると理解される。本明細書中の核酸セグメントは、野生型であっても修飾型であってもよい。少なくとも１つの実施形態において、性脂質ナノ粒子は、複数の異なる核酸セグメントを含み得る。さらに別の実施形態において、野生型又は修飾型の核酸セグメントは、目的のポリペプチドをコードする。修飾核酸セグメントは、核酸セグメントが天然に存在しないように、構造のあらゆる部分に化学修飾を有する核酸セグメントを含む。一部の実施形態において、核酸セグメントはＲＮＡである。一部の実施形態において、核酸セグメントはｍＲＮＡである。一部の実施形態において、核酸セグメントは修飾ｍＲＮＡである。
【0051】
本明細書中で用いられる用語「治療有効量」は、標的組織及び／又は細胞型におけるタンパク質発現を調節するのに十分な核酸セグメントの量を指す。一部の実施形態において、核酸セグメントの治療有効量は、核酸セグメントによって発現されるタンパク質と関連した疾患又は障害を処置するのに十分な量である。
【0052】
少なくとも１つの実施形態において、総脂質相の、核酸セグメントに対する重量比は、約４０：１～約１：１に及び、例えば約１０：１である。これは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の、核酸モノマーに対するおよそのモル比約３：１に対応する。さらに別の例において、総脂質相の、核酸セグメントに対する重量比は、約３０：１～約１：１に及び、例えば約２０：１であり、これは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の、核酸単量体に対するおよそのモル比約６：１に対応する。しかしながら、脂質相及び／又は脂質相成分の、核酸単量体に対する相対モル比は、意図される標的細胞の性質、及び核酸セグメントの特徴によって決定され得るので、先で特定された実施形態の範囲内に限定されない。一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の、核酸モノマーに対するモル比は、約２．７５：１～６：１である。一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の、核酸モノマーに対するモル比は、約２．７５：１である。一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の、核酸モノマーに対するおよそのモル比は、約３：１である。一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の、核酸モノマーに対するモル比は、約５．５：１である。一部の実施形態において、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩の、核酸モノマーに対するおよそのモル比は、約６：１である。
【0053】
一部の実施形態において、脂質ナノ粒子は、ｚ－平均粒径（＜ｄ＞Ｚ）が約２００ｎｍ以下、例えば約１００ｎｍ以下、又は例えば約７５ｎｍ以下である。本開示の少なくとも１つの実施形態において、脂質ナノ粒子は、ｚ－平均粒径が約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、例えば約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０、例えば約７５ｎｍに及ぶ。
【0054】
特定の実施形態において、脂質ナノ粒子は、核酸セグメントのカプセル化効率（％ＥＥ）が約８０％以上、例えば約９０％超であり、例えば約９５％～１００％に及ぶ。本明細書で用いられる用語「カプセル化効率」は、洗剤、例えばトリトンＸ－１００を用いる脂質ナノ粒子の溶解によって測定される、脂質ナノ粒子中のカプセル化核酸セグメントの、脂質ナノ粒子組成物中の総核酸セグメント含量に対する比を指す。
【0055】
本開示の医薬組成物はさらに、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含み得る。本明細書中で用いられる用語「薬学的に許容可能な担体」は、合理的なリスク／ベネフィット比に見合う、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応、又は他の課題若しくは合併症を伴わない、健全な医学的判断の範囲内での、ヒト及び動物の組織との接触における使用に適した化合物、材料、組成物、及び／又は剤形を含む。
【0056】
医薬組成物は、非経口投与に適した形態であり得る。例えば、適切な非経口投与として、皮下投与、筋肉内投与、及び静脈内投与が挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物は、気管内注入、気管支注入、及び／又は吸入に適した形態であり得る。医薬液体組成物は、吸入用の不活性気体の使用によって霧化され得る。霧化された懸濁液は、霧化装置から直接的に吸い込まれてもよいし、霧化装置は、フェイステントマスク、又は間欠的陽圧呼吸装置に取り付けられてもよい。
【0057】
単一の剤形を生成するための１つ以上の薬学的に許容可能な担体と組み合わされる核酸セグメントの量は、処置される対象及び特定の投与経路に応じて必然的に変動することとなる。投与経路及び投与計画に関する更なる情報について、読者は、Ｃｈａｐｔｅｒ ２５．３ ｉｎ Ｖｏｌｕｍｅ ５ ｏｆ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｃｏｒｗｉｎ Ｈａｎｓｃｈ；Ｃｈａｉｒｍａｎ ｏｆ Ｅｄｉｔｏｒｉａｌ Ｂｏａｒｄ），Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ １９９０を参照のこと。
【0058】
一実施形態において、本開示は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び治療有効量の核酸セグメントを含む複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物を、これを必要とする対象に投与する方法を提供する。
【0059】
用語「対象」は、恒温哺乳動物、例えば、霊長類、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、及びマウスを含む。一部の実施形態において、対象は、霊長類、例えばヒトである。一部の実施形態において、対象は、処置が必要である（例えば、対象は、処置から生物学的に、又は医学的に利益を得ることとなる）。
【0060】
本明細書中で開示される脂質ナノ粒子はさらに、標的細胞及び組織への核酸セグメント、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、Ｃａｓ９－ガイドＲＮＡ複合体の選択的な送達のための薬物送達ビヒクルの役目を果たし得る。ゆえに、一実施形態において、核酸セグメントを細胞に送達する方法であって、細胞を、インビトロで、又はインビボで、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び治療有効量の核酸セグメントを含む複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物と接触させることを含む方法である。一部の実施形態において、核酸セグメントは、ポリペプチドの発現を、例えば発現を増大若しくは低下させることによって、又は発現を上方制御又は下方制御することによって、調節する。
【0061】
別の実施形態は、治療有効量の核酸セグメントを、これを必要とする対象に送達する方法であって、対象に、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び治療有効量の核酸セグメントを含む複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。
【0062】
本明細書中で開示される式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び核酸セグメントを含む複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物は、対象におけるポリペプチドの過小発現、対象におけるポリペプチドの過剰発現、及び／又は対象におけるポリペプチドの不在／存在によって特徴付けられる多種多様な障害及び疾患を処置するのに用いられ得る。したがって、開示されるのは、疾患又は障害に苦しむ対象を処置する方法であって、対象に、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び治療有効量の核酸セグメントを含む複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物を投与することを含む方法である。
【0063】
さらに、開示されるのは、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び治療有効量の核酸セグメントを含む複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物の、疾患又は障害を処置するための使用である。
【0064】
さらに、開示されるのは、疾患又は障害の処置に用いられる医薬組成物であり、医薬組成物は、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び治療有効量の核酸セグメントを含む複数の脂質ナノ粒子を含む。
【0065】
さらに、開示されるのは、細胞におけるタンパク質発現を調節する方法であって、式（Ｉ）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩、及び核酸セグメントを含む複数の脂質ナノ粒子を含む医薬組成物を、これを必要とする対象に投与することを含む方法である。少なくとも１つの実施形態において、タンパク質発現は、２４時間まで約２の倍率で増大し得る。別の実施形態において、タンパク質発現は、７２時間まで約３の倍率で増大し得る。
【実施例】
【0066】
一般的方法
１Ｈ ＮＭＲ：３００ＭＨｚ；プローブ：ＡＴＭ＋Ｚ ＰＡＢＢＯ ＢＢ－１Ｈ／Ｄによる５ｍｍブロードバンド液体プローブＢＢＦＯ；マグネット：ＵＬＴＲＡＳＨＩＥＬＤ（商標）３００；クレート：ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ３００；オートサンプラー：ＳａｍｐｌｅＸｐｒｅｓｓ（商標）６０；ソフトウェア：Ｔｏｐｓｐｉｎ ３。４００ＭＨｚ；プローブ：ＡＴＭ＋Ｚ ＰＡＢＢＯ ＢＢ－１Ｈ／Ｄによる５ｍｍブロードバンド液体プローブＢＢＦＯ；マグネットＡＳＣＥＮＤ（商標）４００；クレートＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ３００；オートサンプラーＳａｍｐｌｅＸｐｒｅｓｓ（商標）６０；ソフトウェア：Ｔｏｐｓｐｉｎ ３。全てのスペクトルを、内部基準としてのＴＭＳにより較正した。
１Ｈ ＮＭＲ：３００ＭＨｚ；プローブ：ＡＴＭ＋Ｚ ＰＡＢＢＯ ＢＢ－１Ｈ／Ｄによる５ｍｍブロードバンド液体プローブＢＢＦＯ；マグネット：ＵＬＴＲＡＳＨＩＥＬＤ（商標）３００；クレート：ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ３００；オートサンプラー：ＳａｍｐｌｅＸｐｒｅｓｓ（商標）６０；ソフトウェア：Ｔｏｐｓｐｉｎ ３。４００ＭＨｚ；プローブ：ＡＴＭ＋Ｚ ＰＡＢＢＯ ＢＢ－１Ｈ／Ｄによる５ｍｍブロードバンド液体プローブＢＢＦＯ；マグネットＡＳＣＥＮＤ（商標）４００；クレートＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ３００；オートサンプラーＳａｍｐｌｅＸｐｒｅｓｓ（商標）６０；ソフトウェア：Ｔｏｐｓｐｉｎ ３。全てのスペクトルを、内部基準としてのＴＭＳにより較正した。
【0067】
１Ｈ ＮＭＲ：５００ＭＨｚ；プローブ：ＡＴＭ＋Ｚ ＰＡＢＢＯ ５００Ｓ１－ＢＢＦ－Ｈ－Ｄによる５ｍｍ Ｂｒｕｋｅｒ Ｓｍａｒｔプローブ；マグネット：ＡＳＣＥＮＤ（商標）５００；コンソール：ＡＶＡＮＣＥ Ｎｅｏ ５００；オートサンプラー：ＳａｍｐｌｅＸｐｒｅｓｓ（商標）６０；ソフトウェア：Ｔｏｐｓｐｉｎ ４。プロトン化学シフトは、１００万分の１（ｐｐｍ、δスケール）で表され、ＮＭＲ溶媒（クロロホルム－ｄ：δ７．２６、メタノール－ｄ４：δ３．３１、ＤＭＳＯ－ｄ６：δ２．５０）中の残留プロチウムを基準とする。
データを、以下のように表す：化学シフト、多重度（ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｄｄ＝ダブレットのダブレット、ｄｔ＝トリプレットのダブレット、ｍ＝マルチプレット、ｂｒ＝ブロード、ａｐｐ＝見掛け）、積分、及びカップリング定数（Ｊ）（ヘルツ（Ｈｚ））。
データを、以下のように表す：化学シフト、多重度（ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｑ＝カルテット、ｄｄ＝ダブレットのダブレット、ｄｔ＝トリプレットのダブレット、ｍ＝マルチプレット、ｂｒ＝ブロード、ａｐｐ＝見掛け）、積分、及びカップリング定数（Ｊ）（ヘルツ（Ｈｚ））。
【0068】
ＬＣＭＳ：ＤＡＤディテクタ、ＥＬＳＤディテクタ、及び２０２０ＥＶ ＭＳと連結した機器Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ－２０２０；カラムＳｈｉｍ－ｐａｃｋ ＸＲ－ＯＤＳ Ｃ１８（５０×３．０ｍｍ、２．２μｍ）；溶離液Ａ 水（０．０５％ＴＦＡ）、溶離液Ｂ ＭｅＣＮ（０．０５％ＴＦＡ）；勾配５～９５％ Ｂ ２．００分、保持０．７０分（方法Ａ）又は６０～９５％ Ｂ １．００分、保持１．７０分（方法Ｂ）；流量１．２０ｍＬ／分；ＰＤＡ検出（ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ）１９０～４００ｎｍ。ＥＳＩモードの質量分析計。
【0069】
ＵＰＬＣ－ＭＳを、１ｍＬ／分の流量にて、１．５分にわたって２から９８％ Ｂの溶媒勾配を用いる（平衡が出発条件に戻る総ランタイム２分）Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ及びＷａｔｅｒｓ ＳＱＤ質量分析計（カラム温度３０℃、ＵＶ検出＝２１０～４００ｎｍ、質量分析＝ポジティブ／ネガティブスイッチングを備えるＥＳＩ）を用いて実行した。ここで、Ａ＝水中０．１％ギ酸、Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ギ酸（酸ワーク用）、又はＡ＝水中０．１％水酸化アンモニウム、Ｂ＝アセトニトリル（塩基ワーク用）であった。酸の分析に用いたカラムは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＨＳＳ Ｔ３（１．８ｍｍ、２．１×３０ｍｍ）であり、塩基の分析に用いたカラムは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ Ｃ１８（１．７ｍｍ、２．１×３０ｍｍ）であった。
【0070】
ＨＰＬＣ：ＤＡＤディテクタ、ＣＡＤディテクタと連結した機器Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ－２０２０；カラムＡｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃ１８（１００×４．６ｍｍ）、２．７μｍ；移動相Ａ 水（０．０５％ＴＦＡ）、移動相Ｂ ＭｅＣＮ；勾配１０～９５％ Ｂ ４．００分、保持８分、又は示されるように、流量１．５０ｍＬ／分；面積としての純度％。
【0071】
分取ＨＰＬＣ 機器Ｗａｔｅｒｓ ２５４５ Ｂｉｎａｒｙ Ｇｒａｄｉｅｎｔモジュール、Ｗａｔｅｒｓ ２７６７ Ｓａｍｐｌｅ Ｍａｎａｇｅｒ、Ｗａｔｅｒｓ ２４８９ ＵＶ／Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、Ｗａｔｅｒｓ ＳＱ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ２。方法ＡカラムＸＳｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ Ｃｏｌｕｍｎ、１９×２５０ｍｍ、５μｍ；移動相Ａ 水（０．０５％ＴＦＡ）、移動相Ｂ ＭｅＣＮ；流量２５ｍＬ／分、示される勾配。方法ＢカラムＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８ ＯＢＤ、１９×２５０ｍｍ、５μｍ；移動相Ａ 水（０．０５％ＴＦＡ）、移動相Ｂ ＭｅＣＮ；流量６０ｍＬ／分、示される勾配。
【0072】
略語
１，２－ＤＣＥ １，２－ジクロロエタン
ＡＣＮ アセトニトリル
ＣＰＭＥ シクロペンチルメチルエーテル
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＩＥＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン
＜ｄ＞Ｎ 数平均粒径
＜ｄ＞Ｚ ｚ－平均粒径
ＥＤＣ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＤＣＩ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＥ％ カプセル化有効性
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィ
ＫＩ ヨウ化カリウム
ＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコント－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノアート
ＮＭＰ Ｎ－メチル－２－ピロリドン
ＰＤＩ 多分散指数
ＰＥ 石油エーテル（３０～５０）
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ｒｔ 室温
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＵＰＬＣ 超高速液体クロマトグラフィ
Ｚ－ｐｏｔ ゼータ電位。
１，２－ＤＣＥ １，２－ジクロロエタン
ＡＣＮ アセトニトリル
ＣＰＭＥ シクロペンチルメチルエーテル
ＤＣＭ ジクロロメタン
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＩＥＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＩＰＥＡ Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン
＜ｄ＞Ｎ 数平均粒径
＜ｄ＞Ｚ ｚ－平均粒径
ＥＤＣ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＤＣＩ １－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
ＥＥ％ カプセル化有効性
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィ
ＫＩ ヨウ化カリウム
ＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコント－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノアート
ＮＭＰ Ｎ－メチル－２－ピロリドン
ＰＤＩ 多分散指数
ＰＥ 石油エーテル（３０～５０）
ＰＢＳ リン酸緩衝生理食塩水
ｒｔ 室温
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＵＰＬＣ 超高速液体クロマトグラフィ
Ｚ－ｐｏｔ ゼータ電位。
【0073】
実施例１．化合物１の合成
試薬．ａ）ＥＤＣ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＡＰ、ＤＣＭ；ｂ）Ｋ２ＣＯ３、ＫＩ、ＡＣＮ；ｃ）４Ｍ ＨＣｌ、ジオキサン；ｄ）ＥＤＣ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＡＰ、ＤＣＭ；ｅ）ＤＩＰＥＡ、ＫＩ、ＡＣＮ
【化20】
【0074】
中間体１：ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート
工程ａ：
ＥＤＣ（０．７８５ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）を、一度に、アルゴン下で、８－ブロモオクタン酸（０．５２２ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）、ヘプタデカン－９－オール（０．５ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０４８ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（１．３９６ｍｌ、７．９９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ撹拌混合液（１５ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中で再溶解させてから、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から２０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（０．７１４ｇ、７９％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．２７－１．７０（３６Ｈ，ｍ），１．７７－１．９４（２Ｈ，ｍ），２．２１－２．３７（２Ｈ，ｔ），３．４１（２Ｈ，ｔ），４．７８－４．９５（１Ｈ，ｍ）．
【化21】
ＥＤＣ（０．７８５ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）を、一度に、アルゴン下で、８－ブロモオクタン酸（０．５２２ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）、ヘプタデカン－９－オール（０．５ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０４８ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（１．３９６ｍｌ、７．９９ｍｍｏｌ）のＤＣＭ撹拌混合液（１５ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中で再溶解させてから、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から２０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（０．７１４ｇ、７９％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．２７－１．７０（３６Ｈ，ｍ），１．７７－１．９４（２Ｈ，ｍ），２．２１－２．３７（２Ｈ，ｔ），３．４１（２Ｈ，ｔ），４．７８－４．９５（１Ｈ，ｍ）．
【0075】
中間体２：ｔｅｒｔ－ブチル７－（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラート
工程ｂ：
ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（０．８０８ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）（中間体１）を、アルゴン下で、ｔｅｒｔ－ブチル９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラートヒドロクロリド（０．３８６ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．４２３ｇ、３．０６ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（０．０４８ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の撹拌アセトニトリル混合液（１０ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を、８０℃にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中で再溶解させて、飽和水性Ｎａ２ＣＯ３（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０～１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ｔｅｒｔ－ブチル７－（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラート（０．７４７ｇ、８４％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２２°Ｃ）０．８８（６Ｈ，ｔ），１．２０－１．６７（４７Ｈ，ｍ），２．０２－２．１９（２Ｈ，ｍ），２．２２－２．３１（２Ｈ，ｔ），２．３５－２．４９（２Ｈ，ｍ），２．７７－２．９６（２Ｈ，ｍ），３．１８－３．３８（２Ｈ，ｍ），３．６８－３．８３（２Ｈ，ｍ），３．９２－４．１７（２Ｈ，ｍ），４．８７（１Ｈ，ｍ）．
【化22】
ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（０．８０８ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）（中間体１）を、アルゴン下で、ｔｅｒｔ－ブチル９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラートヒドロクロリド（０．３８６ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．４２３ｇ、３．０６ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（０．０４８ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の撹拌アセトニトリル混合液（１０ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を、８０℃にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中で再溶解させて、飽和水性Ｎａ２ＣＯ３（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０～１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ｔｅｒｔ－ブチル７－（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラート（０．７４７ｇ、８４％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２２°Ｃ）０．８８（６Ｈ，ｔ），１．２０－１．６７（４７Ｈ，ｍ），２．０２－２．１９（２Ｈ，ｍ），２．２２－２．３１（２Ｈ，ｔ），２．３５－２．４９（２Ｈ，ｍ），２．７７－２．９６（２Ｈ，ｍ），３．１８－３．３８（２Ｈ，ｍ），３．６８－３．８３（２Ｈ，ｍ），３．９２－４．１７（２Ｈ，ｍ），４．８７（１Ｈ，ｍ）．
【0076】
中間体３：ヘプタデカン－９－イル８－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートジヒドロクロリド
工程ｃ：
ジオキサン中ＨＣｌ（２．２５０ｍｌ、９．００ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で０℃にて、ｔｅｒｔ－ブチル７－（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラート（０．５４８ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）（中間体２）の撹拌ジオキサン混合液（１０ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を温めて、室温にて４時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮乾固させて、ジオキサン（３×５０ｍＬ）により洗浄して、ヘプタデカン－９－イル８－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートジヒドロクロリド（０．４７２ｇ、９６％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４，２７°Ｃ）０．９０（６Ｈ，ｔ），１．２９（３８Ｈ，ｍ），２．２４－２．３９（２Ｈ，ｔ），３．４９－３．５９（３Ｈ，ｔ），４．８５－４．９１（１Ｈ，ｍ）．
【化23】
ジオキサン中ＨＣｌ（２．２５０ｍｌ、９．００ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で０℃にて、ｔｅｒｔ－ブチル７－（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラート（０．５４８ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）（中間体２）の撹拌ジオキサン混合液（１０ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を温めて、室温にて４時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮乾固させて、ジオキサン（３×５０ｍＬ）により洗浄して、ヘプタデカン－９－イル８－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートジヒドロクロリド（０．４７２ｇ、９６％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４，２７°Ｃ）０．９０（６Ｈ，ｔ），１．２９（３８Ｈ，ｍ），２．２４－２．３９（２Ｈ，ｔ），３．４９－３．５９（３Ｈ，ｔ），４．８５－４．９１（１Ｈ，ｍ）．
【0077】
中間体４：ノニル８－ブロモオクタノアート
工程ｄ：
ＥＤＣ（２．７９ｇ、１４．５６ｍｍｏｌ）を、一度に、８－ブロモオクタン酸（２．３２０ｇ、１０．４０ｍｍｏｌ）、ノナン－１－オール（１．２０５ｍｌ、６．９３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．１６９ｇ、１．３９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（２．５４ｍｌ、１４．５６ｍｍｏｌ）の撹拌ＤＣＭ溶液（１５ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中で再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離液勾配０～２０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ノニル８－ブロモオクタノアート（１．５８０ｇ、６５．２％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，０００１クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８２－０．９５（３Ｈ，ｔ），１．２３－１．５１（１８Ｈ，ｍ），１．５６－１．６９（４Ｈ，ｍ），１．８０－１．９２（２Ｈ，ｍ），２．３０（２Ｈ，ｔ），３．３３－３．４８（２Ｈ，ｔ），４．０７（２Ｈ，ｔ）．
【化24】
ＥＤＣ（２．７９ｇ、１４．５６ｍｍｏｌ）を、一度に、８－ブロモオクタン酸（２．３２０ｇ、１０．４０ｍｍｏｌ）、ノナン－１－オール（１．２０５ｍｌ、６．９３ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．１６９ｇ、１．３９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（２．５４ｍｌ、１４．５６ｍｍｏｌ）の撹拌ＤＣＭ溶液（１５ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中で再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離液勾配０～２０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ノニル８－ブロモオクタノアート（１．５８０ｇ、６５．２％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，０００１クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８２－０．９５（３Ｈ，ｔ），１．２３－１．５１（１８Ｈ，ｍ），１．５６－１．６９（４Ｈ，ｍ），１．８０－１．９２（２Ｈ，ｍ），２．３０（２Ｈ，ｔ），３．３３－３．４８（２Ｈ，ｔ），４．０７（２Ｈ，ｔ）．
【0078】
化合物１：ヘプタデカン－９－イル８－（７－（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアート
工程ｅ：
ノニル８－ブロモオクタノアート（０．１４４ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）（中間体４）を、アルゴン下で、ヘプタデカン－９－イル８－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートジヒドロクロリド（０．２ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）（中間体３）及びＤＩＰＥＡ（０．４８６ｍｌ、２．７８ｍｍｏｌ）の撹拌アセトニトリル混合液（５ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を、８０℃にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０～１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ ＮＨ４ＯＨ）によって２回精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ヘプタデカン－９－イル８－（７－（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアート（０．１１９ｇ、４４．５％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４，２７°Ｃ）０．９０（９Ｈ，ｔ），１．２３－１．４３（４８Ｈ，ｍ），１．４８－１．６８（１４Ｈ，ｍ），２．２４－２．３４（８Ｈ，ｍ），２．４１－２．５２（４Ｈ，ｂｒ ｄ），２．８７（４Ｈ，ｂｒ ｄ），３．８３－３．９２（２Ｈ，ｍ），４．０７（２Ｈ，ｓ），４．８８（１Ｈ，ｍ）．ＵＰＬＣ，ｍｓ検出（ＥＳ＋）（［Ｍ＋Ｈ］＋）＝７７７．８ Ｄａ；ＲＴ ＥＬＳＤ＝１．９１分。
【化25】
ノニル８－ブロモオクタノアート（０．１４４ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）（中間体４）を、アルゴン下で、ヘプタデカン－９－イル８－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートジヒドロクロリド（０．２ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）（中間体３）及びＤＩＰＥＡ（０．４８６ｍｌ、２．７８ｍｍｏｌ）の撹拌アセトニトリル混合液（５ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を、８０℃にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０～１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ ＮＨ４ＯＨ）によって２回精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ヘプタデカン－９－イル８－（７－（８－（ノニルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアート（０．１１９ｇ、４４．５％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４，２７°Ｃ）０．９０（９Ｈ，ｔ），１．２３－１．４３（４８Ｈ，ｍ），１．４８－１．６８（１４Ｈ，ｍ），２．２４－２．３４（８Ｈ，ｍ），２．４１－２．５２（４Ｈ，ｂｒ ｄ），２．８７（４Ｈ，ｂｒ ｄ），３．８３－３．９２（２Ｈ，ｍ），４．０７（２Ｈ，ｓ），４．８８（１Ｈ，ｍ）．ＵＰＬＣ，ｍｓ検出（ＥＳ＋）（［Ｍ＋Ｈ］＋）＝７７７．８ Ｄａ；ＲＴ ＥＬＳＤ＝１．９１分。
【0079】
実施例２．化合物２の合成
試薬．ａ）４Ｍ ＨＣｌ、ジオキサン；ｂ）ＥＤＣ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＡＰ、ＤＣＭ；ｃ）ＤＩＰＥＡ、ＫＩ、ＡＣＮ
【化26】
【0080】
中間体１：９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナンジヒドロクロリド
工程ａ：
ＨＣｌ（２ｍｌ、６５．８３ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で、ｔｅｒｔ－ブチル９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラートヒドロクロリド（０．３ｇ、１．１３ｍｍｏｌ）の撹拌１，４－ジオキサン混合液（８ｍＬ）に滴加した。反応液を、沈殿物が形成されるまで、室温にて一晩撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン（０．２２０ｇ、９７％）を白色の粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４，２７°Ｃ）３．５１（８Ｈ，ｍ），４．４１（２Ｈ，ｂｒ ｔ）．
【化27】
ＨＣｌ（２ｍｌ、６５．８３ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で、ｔｅｒｔ－ブチル９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラートヒドロクロリド（０．３ｇ、１．１３ｍｍｏｌ）の撹拌１，４－ジオキサン混合液（８ｍＬ）に滴加した。反応液を、沈殿物が形成されるまで、室温にて一晩撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン（０．２２０ｇ、９７％）を白色の粉末として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４，２７°Ｃ）３．５１（８Ｈ，ｍ），４．４１（２Ｈ，ｂｒ ｔ）．
【0081】
中間体２：ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート
工程ｂ：
ＥＤＣ（０．７８５ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）を、一度に、アルゴン下で、８－ブロモオクタン酸（０．５２２ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）、ヘプタデカン－９－オール（０．５ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０４８ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（１．３９６ｍｌ、７．９９ｍｍｏｌ）の撹拌ＤＣＭ混合液（１５ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０～２０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（０．７１４ｇ、７９％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．２７－１．７０（３６Ｈ，ｍ），１．７７－１．９４（２Ｈ，ｍ），２．２１－２．３７（２Ｈ，ｔ），３．４１（２Ｈ，ｔ），４．７８－４．９５（１Ｈ，ｍ）．
【化28】
ＥＤＣ（０．７８５ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）を、一度に、アルゴン下で、８－ブロモオクタン酸（０．５２２ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）、ヘプタデカン－９－オール（０．５ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０４８ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（１．３９６ｍｌ、７．９９ｍｍｏｌ）の撹拌ＤＣＭ混合液（１５ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０～２０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（０．７１４ｇ、７９％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．２７－１．７０（３６Ｈ，ｍ），１．７７－１．９４（２Ｈ，ｍ），２．２１－２．３７（２Ｈ，ｔ），３．４１（２Ｈ，ｔ），４．７８－４．９５（１Ｈ，ｍ）．
【0082】
化合物２：ジ（ヘプタデカン－９－イル）８，８’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ジオクタノアート
工程ｃ：
ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（０．２８５ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）（中間体２）を、アルゴン下で２５℃にて、９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナンジヒドロクロリド（０．０４ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）（中間体１）、ＤＩＰＥＡ（０．１４２ｍｌ、０．８２ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（６．６０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の撹拌アセトニトリル混合液（５ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を、８０℃にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性Ｎａ２ＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０から１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ジ（ヘプタデカン－９－イル）８，８’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ジオクタノアート（０．０６２ｇ、３４．９％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（１２Ｈ，ｔ），１．１５－１．７２（７６Ｈ，ｍ），２．２８（８Ｈ，ｍ），２．４１－２．５０（４Ｈ，ｍ），２．７６－２．８４（４Ｈ，ｍ），３．８８（２Ｈ，ｂｒ ｓ），４．８７（２Ｈ，ｍ）．ＵＰＬＣ，ｍｓ検出（ＥＳ＋）（［Ｍ＋Ｈ］＋）＝８９０．２；ＲＴ ＥＬＳＤ＝２．２７分。
【化29】
ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（０．２８５ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）（中間体２）を、アルゴン下で２５℃にて、９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナンジヒドロクロリド（０．０４ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）（中間体１）、ＤＩＰＥＡ（０．１４２ｍｌ、０．８２ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（６．６０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の撹拌アセトニトリル混合液（５ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を、８０℃にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性Ｎａ２ＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０から１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ジ（ヘプタデカン－９－イル）８，８’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ジオクタノアート（０．０６２ｇ、３４．９％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（１２Ｈ，ｔ），１．１５－１．７２（７６Ｈ，ｍ），２．２８（８Ｈ，ｍ），２．４１－２．５０（４Ｈ，ｍ），２．７６－２．８４（４Ｈ，ｍ），３．８８（２Ｈ，ｂｒ ｓ），４．８７（２Ｈ，ｍ）．ＵＰＬＣ，ｍｓ検出（ＥＳ＋）（［Ｍ＋Ｈ］＋）＝８９０．２；ＲＴ ＥＬＳＤ＝２．２７分。
【0083】
実施例３．化合物３の合成
試薬．ａ）ＮａＨ、ＤＭＦ；ｂ）ＬｉＣｌ、Ｈ２Ｏ、ＤＭＳＯ；ｃ）ＬｉＡｌＨ４、ＴＨＦ；ｄ）塩化アクリロイル、ＴＥＡ、ＤＣＭ；ｅ）ＤＩＰＥＡ、ＫＩ、ＡＣＮ；ｆ）ＨＣｌ、ジオキサン；ｇ）ＴＥＡ、ＩＰＡ。
【化30】
【0084】
中間体１：ジメチル２，２－ジオクチルマロナート
工程ａ：
水素化ナトリウム（３．４８ｇ、８７．０５ｍｍｏｌ）を、窒素下で無水ＤＭＦ中にゆっくり懸濁させて、混合液を０℃に冷却した。マロン酸ジメチル（４．３３ｍｌ、３７．８５ｍｍｏｌ）及び１－ブロモオクタン（１９．６１ｍｌ、１１３．５４ｍｍｏｌ）（ＤＭＦ中（それぞれ２５ｍＬ））を次々と加えて、混合液を室温にて３時間撹拌した。反応後、水（２５０ｍＬ）を加えて、水層を（Ｅｔ２Ｏ）により抽出した（３×１００ｍＬ）。組み合わせた有機層を、水（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から５０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ジメチル２，２－ジオクチルマロナート（８．８９ｇ、６５．９％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８５－０．９２（６Ｈ，３），１．２７（２４Ｈ，ｍ），１．７７－１．９３（４Ｈ，ｍ），３．６２－３．７７（６Ｈ，ｓ）．
【化31】
水素化ナトリウム（３．４８ｇ、８７．０５ｍｍｏｌ）を、窒素下で無水ＤＭＦ中にゆっくり懸濁させて、混合液を０℃に冷却した。マロン酸ジメチル（４．３３ｍｌ、３７．８５ｍｍｏｌ）及び１－ブロモオクタン（１９．６１ｍｌ、１１３．５４ｍｍｏｌ）（ＤＭＦ中（それぞれ２５ｍＬ））を次々と加えて、混合液を室温にて３時間撹拌した。反応後、水（２５０ｍＬ）を加えて、水層を（Ｅｔ２Ｏ）により抽出した（３×１００ｍＬ）。組み合わせた有機層を、水（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から５０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ジメチル２，２－ジオクチルマロナート（８．８９ｇ、６５．９％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８５－０．９２（６Ｈ，３），１．２７（２４Ｈ，ｍ），１．７７－１．９３（４Ｈ，ｍ），３．６２－３．７７（６Ｈ，ｓ）．
【0085】
中間体２：メチル２－オクチルデカノアート
工程ｂ：
ジメチル２，２－ジオクチルマロナート（９．２ｇ、２５．８０ｍｍｏｌ）（中間体１）、塩化リチウム（１．４２２ｇ、３３．５４ｍｍｏｌ）、及び水（０．６０４ｇ、３３．５４ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ混合液（８０ｍＬ）を、還流で２４時間撹拌した。室温に冷却した後に、水（１５０ｍＬ）を加えて、反応をクエンチした。反応混合液をＥｔ２Ｏ（３×５０ｍＬ）により抽出した。組み合わせた有機層を、水（３×５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から５０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、メチル２－オクチルデカノアート（７．３０ｇ、９５％）を黄色の液体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．１８－１．７１（２８Ｈ，ｍ），２．２８－２．３９（１Ｈ，ｍ），３．６８（３Ｈ，ｓ）．
【化32】
ジメチル２，２－ジオクチルマロナート（９．２ｇ、２５．８０ｍｍｏｌ）（中間体１）、塩化リチウム（１．４２２ｇ、３３．５４ｍｍｏｌ）、及び水（０．６０４ｇ、３３．５４ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ混合液（８０ｍＬ）を、還流で２４時間撹拌した。室温に冷却した後に、水（１５０ｍＬ）を加えて、反応をクエンチした。反応混合液をＥｔ２Ｏ（３×５０ｍＬ）により抽出した。組み合わせた有機層を、水（３×５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から５０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、メチル２－オクチルデカノアート（７．３０ｇ、９５％）を黄色の液体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．１８－１．７１（２８Ｈ，ｍ），２．２８－２．３９（１Ｈ，ｍ），３．６８（３Ｈ，ｓ）．
【0086】
中間体３：２－オクチルデカン－１－オール
工程ｃ：
メチル２－オクチルデカノアート（７．３ｇ、２４．４５ｍｍｏｌ）（中間体２）のＴＨＦ溶液（１００ｍＬ）に、水素化アルミニウムリチウム（１４．６７ｍｌ、２９．３５ｍｍｏｌ）を０℃にて滴加した。続いて、反応液を温めて、室温にて２４時間撹拌した。完了後、３Ｍ ＨＣｌ（５０ｍＬ）を加えて、反応をクエンチした。反応混合液を、水（１００ｍＬ）及びＤＣＭ（１００ｍＬ）により希釈した。層を分離させて、水層をＤＣＭ（３×５０ｍＬ）により抽出した。組み合わせた有機層を、飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から４０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、２－オクチルデカン－１－オール（４．５６ｇ、６８．９％）を黄色の液体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．１６－１．３９（２８Ｈ，ｍ），１．４２－１．５０（１Ｈ，ｍ），３．５５（２Ｈ，ｂｒ ｓ）．
【化33】
メチル２－オクチルデカノアート（７．３ｇ、２４．４５ｍｍｏｌ）（中間体２）のＴＨＦ溶液（１００ｍＬ）に、水素化アルミニウムリチウム（１４．６７ｍｌ、２９．３５ｍｍｏｌ）を０℃にて滴加した。続いて、反応液を温めて、室温にて２４時間撹拌した。完了後、３Ｍ ＨＣｌ（５０ｍＬ）を加えて、反応をクエンチした。反応混合液を、水（１００ｍＬ）及びＤＣＭ（１００ｍＬ）により希釈した。層を分離させて、水層をＤＣＭ（３×５０ｍＬ）により抽出した。組み合わせた有機層を、飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から４０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、２－オクチルデカン－１－オール（４．５６ｇ、６８．９％）を黄色の液体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．１６－１．３９（２８Ｈ，ｍ），１．４２－１．５０（１Ｈ，ｍ），３．５５（２Ｈ，ｂｒ ｓ）．
【0087】
中間体４：２－オクチルデシルアクリラート
工程ｄ：
塩化アクリロイル（０．３５８ｍｌ、４．４４ｍｍｏｌ）を、窒素下で０℃にて、２－オクチルデカン－１－オール（１ｇ、３．７０ｍｍｏｌ）（中間体３）及びＴＥＡ（２．１１３ｍｌ、１５．１６ｍｍｏｌ）の攪拌ＤＣＭ混合液（２０ｍＬ）に滴下した。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮して、ＤＣＭ（１００ｍＬ）により希釈して、飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から１００％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、２－オクチルデシルアクリラート（０．８５０ｇ、７０．８％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．２３－１．３５（２８Ｈ，ｍ），１．６１－１．７５（１Ｈ，ｍ），４．０７（２Ｈ，ｄ），５．８２（１Ｈ，ｄ），６．１３（１Ｈ，ｄｄ），６．４０（１Ｈ，ｄ）．
【化34】
塩化アクリロイル（０．３５８ｍｌ、４．４４ｍｍｏｌ）を、窒素下で０℃にて、２－オクチルデカン－１－オール（１ｇ、３．７０ｍｍｏｌ）（中間体３）及びＴＥＡ（２．１１３ｍｌ、１５．１６ｍｍｏｌ）の攪拌ＤＣＭ混合液（２０ｍＬ）に滴下した。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮して、ＤＣＭ（１００ｍＬ）により希釈して、飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から１００％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、２－オクチルデシルアクリラート（０．８５０ｇ、７０．８％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．２３－１．３５（２８Ｈ，ｍ），１．６１－１．７５（１Ｈ，ｍ），４．０７（２Ｈ，ｄ），５．８２（１Ｈ，ｄ），６．１３（１Ｈ，ｄｄ），６．４０（１Ｈ，ｄ）．
【0088】
中間体５：ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ジカルバマート
工程ｅ：
ｔｅｒｔ－ブチル（４－ブロモブチル）カルバマート（０．５０２ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）を、一度に、窒素下で、９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナンジヒドロクロリド（０．１ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．５２１ｍｌ、２．９８ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（０．０１７ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の撹拌アセトニトリル混合液（５ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、８０℃にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０から１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ジカルバマート（０．０９５ｇ、４０．６％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ １．４（１８Ｈ，ｓ）１．５－１．６（８Ｈ，ｍ）２．３（４Ｈ，ｍ）２．４－２．６（４Ｈ，ｍ）３．０－３．１（８Ｈ，ｍ）３．８－３．９（２Ｈ，ｍ）４．８（２Ｈ，ｍ）．
【化35】
ｔｅｒｔ－ブチル（４－ブロモブチル）カルバマート（０．５０２ｇ、１．９９ｍｍｏｌ）を、一度に、窒素下で、９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナンジヒドロクロリド（０．１ｇ、０．５０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．５２１ｍｌ、２．９８ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（０．０１７ｇ、０．１０ｍｍｏｌ）の撹拌アセトニトリル混合液（５ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、８０℃にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０から１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ジカルバマート（０．０９５ｇ、４０．６％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ １．４（１８Ｈ，ｓ）１．５－１．６（８Ｈ，ｍ）２．３（４Ｈ，ｍ）２．４－２．６（４Ｈ，ｍ）３．０－３．１（８Ｈ，ｍ）３．８－３．９（２Ｈ，ｍ）４．８（２Ｈ，ｍ）．
【0089】
中間体６：４，４’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－１－アミン）テトラヒドロクロリド
工程ｆ：
ＨＣｌのジオキサン溶液（４Ｍ、１０．３０ｍｍｏｌ、２．５８ｍＬ）を、不活性雰囲気下でジ－ｔｅｒｔ－ブチル（（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ジカルバマート（０．０９７ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）（中間体５）に加えて、室温にて１６時間撹拌した。ロータリエバポレーション後、反応残留物を２回、ジオキサン（４ｍＬ）により希釈して溶媒を減圧下で除去した。固体を減圧下で濃縮乾固させて、４，４’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－１－アミン）テトラヒドロクロリドを白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ １．７（４Ｈ，ｍ）１．７－１．８（４Ｈ，ｍ）２．７－２．８（４Ｈ，ｍ）２．９－３．０（８Ｈ，ｍ）３．３－３．３（２Ｈ，ｍ）３．５（４Ｈ，ｂｒ ｄ）４．１（２Ｈ，ｂｒ ｓ）．
【化36】
ＨＣｌのジオキサン溶液（４Ｍ、１０．３０ｍｍｏｌ、２．５８ｍＬ）を、不活性雰囲気下でジ－ｔｅｒｔ－ブチル（（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ジカルバマート（０．０９７ｇ、０．２１ｍｍｏｌ）（中間体５）に加えて、室温にて１６時間撹拌した。ロータリエバポレーション後、反応残留物を２回、ジオキサン（４ｍＬ）により希釈して溶媒を減圧下で除去した。固体を減圧下で濃縮乾固させて、４，４’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－１－アミン）テトラヒドロクロリドを白色の固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）δ ｐｐｍ １．７（４Ｈ，ｍ）１．７－１．８（４Ｈ，ｍ）２．７－２．８（４Ｈ，ｍ）２．９－３．０（８Ｈ，ｍ）３．３－３．３（２Ｈ，ｍ）３．５（４Ｈ，ｂｒ ｄ）４．１（２Ｈ，ｂｒ ｓ）．
【0090】
化合物３：テトラキス（２－オクチルデシル）３，３’，３’’，３’’’－（（（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザネトリイル））テトラプロピオナート
工程ｇ：
２－オクチルデシルアクリラート（０．４６８ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）（中間体４）を、一度に、４，４’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－１－アミン）テトラヒドロクロリド（０．０５ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）（中間体５）及びＴＥＡ（０．１３４ｍｌ、０．９６ｍｍｏｌ）の撹拌ｉＰｒＯＨ混合液（４ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、８０℃にて３日間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０から１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及びＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、テトラキス（２－オクチルデシル）３，３’，３’’，３’’’－（（（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザネトリイル））テトラプロピオナート（０．０２７ｇ、１４．０６％）を橙色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４，２７°Ｃ）０．８４－０．９９（２４Ｈ，ｔ），１．２１－１．４１（１１６Ｈ，ｍ），１．４６－１．５６（４Ｈ，ｍ），１．６６（８Ｈ，ｍ），２．４３－２．５２（１０Ｈ，ｍ），２．７３－２．８２（１０Ｈ，ｍ），２．９８－３．０８（４Ｈ，ｍ），３．４２－３．５２（４Ｈ，ｍ），４．００（８Ｈ，ｄ），４．１８（２Ｈ，ｂｒ ｓ）．ＭＳ検出（ＥＳ＋）（［Ｍ＋Ｈ］＋）＝１５６８．４。
【化37】
２－オクチルデシルアクリラート（０．４６８ｇ、１．４４ｍｍｏｌ）（中間体４）を、一度に、４，４’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－１－アミン）テトラヒドロクロリド（０．０５ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）（中間体５）及びＴＥＡ（０．１３４ｍｌ、０．９６ｍｍｏｌ）の撹拌ｉＰｒＯＨ混合液（４ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、８０℃にて３日間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０から１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及びＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、テトラキス（２－オクチルデシル）３，３’，３’’，３’’’－（（（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ビス（ブタン－４，１－ジイル））ビス（アザネトリイル））テトラプロピオナート（０．０２７ｇ、１４．０６％）を橙色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４，２７°Ｃ）０．８４－０．９９（２４Ｈ，ｔ），１．２１－１．４１（１１６Ｈ，ｍ），１．４６－１．５６（４Ｈ，ｍ），１．６６（８Ｈ，ｍ），２．４３－２．５２（１０Ｈ，ｍ），２．７３－２．８２（１０Ｈ，ｍ），２．９８－３．０８（４Ｈ，ｍ），３．４２－３．５２（４Ｈ，ｍ），４．００（８Ｈ，ｄ），４．１８（２Ｈ，ｂｒ ｓ）．ＭＳ検出（ＥＳ＋）（［Ｍ＋Ｈ］＋）＝１５６８．４。
【0091】
実施例４．化合物４の合成
試薬．ａ）ＥＤＣ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＡＰ、ＤＣＭ；ｂ）Ｋ２ＣＯ３、ＫＩ、ＡＣＮ；ｃ）４Ｍ ＨＣｌ、ジオキサン；ｄ）ＥＤＣ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＡＰ、ＤＣＭ；ｅ）ＤＩＰＥＡ、ＫＩ、ＡＣＮ
【化38】
【0092】
中間体１：ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート
工程ａ：
ＥＤＣ（０．７８５ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）を、一度に、アルゴン下で、８－ブロモオクタン酸（０．５２２ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）、ヘプタデカン－９－オール（０．５ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０４８ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（１．３９６ｍｌ、７．９９ｍｍｏｌ）の撹拌ＤＣＭ混合液（１５ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から２０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（０．７１４ｇ、７９％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．２７－１．７０（３６Ｈ，ｍ），１．７７－１．９４（２Ｈ，ｍ），２．２１－２．３７（２Ｈ，ｔ），３．４１（２Ｈ，ｔ），４．７８－４．９５（１Ｈ，ｍ）．
【化39】
ＥＤＣ（０．７８５ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）を、一度に、アルゴン下で、８－ブロモオクタン酸（０．５２２ｇ、２．３４ｍｍｏｌ）、ヘプタデカン－９－オール（０．５ｇ、１．９５ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰ（０．０４８ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（１．３９６ｍｌ、７．９９ｍｍｏｌ）の撹拌ＤＣＭ混合液（１５ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から２０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（０．７１４ｇ、７９％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．２７－１．７０（３６Ｈ，ｍ），１．７７－１．９４（２Ｈ，ｍ），２．２１－２．３７（２Ｈ，ｔ），３．４１（２Ｈ，ｔ），４．７８－４．９５（１Ｈ，ｍ）．
【0093】
中間体２：ｔｅｒｔ－ブチル７－（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラート
工程ｂ：
ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（０．８０８ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）（中間体１）を、アルゴン下で、ｔｅｒｔ－ブチル９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラートヒドロクロリド（０．３８６ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．４２３ｇ、３．０６ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（０．０４８ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の撹拌アセトニトリル混合液（１０ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を、８０℃にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性Ｎａ２ＣＯ３（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０から１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ｔｅｒｔ－ブチル７－（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラート（０．７４７ｇ、８４％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２２°Ｃ）０．８８（６Ｈ，ｔ），１．２０－１．６７（４７Ｈ，ｍ），２．０２－２．１９（２Ｈ，ｍ），２．２２－２．３１（２Ｈ，ｔ），２．３５－２．４９（２Ｈ，ｍ），２．７７－２．９６（２Ｈ，ｍ），３．１８－３．３８（２Ｈ，ｍ），３．６８－３．８３（２Ｈ，ｍ），３．９２－４．１７（２Ｈ，ｍ），４．８７（１Ｈ，ｍ）．
【化40】
ヘプタデカン－９－イル８－ブロモオクタノアート（０．８０８ｇ、１．７５ｍｍｏｌ）（中間体１）を、アルゴン下で、ｔｅｒｔ－ブチル９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラートヒドロクロリド（０．３８６ｇ、１．４６ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．４２３ｇ、３．０６ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（０．０４８ｇ、０．２９ｍｍｏｌ）の撹拌アセトニトリル混合液（１０ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を、８０℃にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性Ｎａ２ＣＯ３（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０から１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ｔｅｒｔ－ブチル７－（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラート（０．７４７ｇ、８４％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２２°Ｃ）０．８８（６Ｈ，ｔ），１．２０－１．６７（４７Ｈ，ｍ），２．０２－２．１９（２Ｈ，ｍ），２．２２－２．３１（２Ｈ，ｔ），２．３５－２．４９（２Ｈ，ｍ），２．７７－２．９６（２Ｈ，ｍ），３．１８－３．３８（２Ｈ，ｍ），３．６８－３．８３（２Ｈ，ｍ），３．９２－４．１７（２Ｈ，ｍ），４．８７（１Ｈ，ｍ）．
【0094】
中間体３：ヘプタデカン－９－イル８－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートジヒドロクロリド
工程ｃ：
ジオキサン中ＨＣｌ（２．２５０ｍｌ、９．００ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で０℃にて、ｔｅｒｔ－ブチル７－（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラート（０．５４８ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）（中間体２）の撹拌ジオキサン混合液（１０ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を温めて、室温にて４時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮乾固させて、ジオキサン（３×５０ｍＬ）により洗浄して、ヘプタデカン－９－イル８－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートジヒドロクロリド（０．４７２ｇ、９６％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４，２７°Ｃ）０．９０（６Ｈ，ｔ），１．２９（３８Ｈ，ｍ），２．２４－２．３９（２Ｈ，ｔ），３．４９－３．５９（３Ｈ，ｔ），４．８５－４．９１（１Ｈ，ｍ）．
【化41】
ジオキサン中ＨＣｌ（２．２５０ｍｌ、９．００ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で０℃にて、ｔｅｒｔ－ブチル７－（８－（ヘプタデカン－９－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－カルボキシラート（０．５４８ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）（中間体２）の撹拌ジオキサン混合液（１０ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を温めて、室温にて４時間撹拌した。反応液を減圧下で濃縮乾固させて、ジオキサン（３×５０ｍＬ）により洗浄して、ヘプタデカン－９－イル８－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートジヒドロクロリド（０．４７２ｇ、９６％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４，２７°Ｃ）０．９０（６Ｈ，ｔ），１．２９（３８Ｈ，ｍ），２．２４－２．３９（２Ｈ，ｔ），３．４９－３．５９（３Ｈ，ｔ），４．８５－４．９１（１Ｈ，ｍ）．
【0095】
中間体４：（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル８－ブロモオクタノアート
工程ｄ：
ＥＤＣ（２．８３ｇ、１４．７６ｍｍｏｌ）を、一度に、アルゴン下で、８－ブロモオクタン酸（２．３５３ｇ、１０．５５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（３．６８ｍｌ、２１．０９ｍｍｏｌ）、（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－オール（１ｇ、７．０３ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（０．１７２ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）の撹拌ＤＣＭ混合液（１５ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から１００％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル８－ブロモオクタノアート（１．９３０ｇ、７９％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７ｏＣ）０．７９－０．９５（３Ｈ，ｔ），１．２１－１．５０（１４Ｈ，ｍ），１．５８－１．６９（２Ｈ，ｍ），１．７２－１．９３（２Ｈ，ｍ），２．１１（２Ｈ，ｍ），２．３１（２Ｈ，ｔ），３．３１－３．６５（２Ｈ，ｔ），４．６３（２Ｈ，ｄ），５．４８－５．７３（２Ｈ，ｍ）．
【化42】
ＥＤＣ（２．８３ｇ、１４．７６ｍｍｏｌ）を、一度に、アルゴン下で、８－ブロモオクタン酸（２．３５３ｇ、１０．５５ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（３．６８ｍｌ、２１．０９ｍｍｏｌ）、（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－オール（１ｇ、７．０３ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（０．１７２ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）の撹拌ＤＣＭ混合液（１５ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（１００ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から１００％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル８－ブロモオクタノアート（１．９３０ｇ、７９％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７ｏＣ）０．７９－０．９５（３Ｈ，ｔ），１．２１－１．５０（１４Ｈ，ｍ），１．５８－１．６９（２Ｈ，ｍ），１．７２－１．９３（２Ｈ，ｍ），２．１１（２Ｈ，ｍ），２．３１（２Ｈ，ｔ），３．３１－３．６５（２Ｈ，ｔ），４．６３（２Ｈ，ｄ），５．４８－５．７３（２Ｈ，ｍ）．
【0096】
化合物４：ヘプタデカン－９－イル（Ｚ）－８－（７－（８－（ノナ－２－エン－１－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアート
工程ｅ：
１：１アセトニトリル／ＣＰＭＥ（１０ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（０．２１２ｍＬ、１．２１ｍｍｏｌ）中に溶解したヘプタデカン－９－イル８－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートジヒドロクロリド（中間体３）を、窒素下で２０℃にて加えた。結果として生じた混合液を、２０℃にて３０分間撹拌した。（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル８－ブロモオクタノアート（０．１２３ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）（中間体４）を窒素下で撹拌溶液に滴加した。結果として生じた混合液を８０℃に加熱して、窒素下で１８時間にわたって撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性塩化ナトリウム（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物をフラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０から１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮して、ヘプタデカン－９－イル（Ｚ）－８－（７－（８－（ノナ－２－エン－１－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアート（０．２１４ｇ、９３％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）０．８６－１．００（９Ｈ，ｔ），１．２３－１．４６（４４Ｈ，ｍ），１．５６（８Ｈ，ｍ），１．６４（４Ｈ，ｍ），２．１５（２Ｈ，ｑ），２．２４－２．３８（８Ｈ，ｍ），２．５１（４Ｈ，ｂｒ ｄ），２．９２（４Ｈ，ｂｒ ｄ），３．９１（２Ｈ，ｂｒ ｓ），４．６４（２Ｈ，ｄ），４．８８－４．９３（１Ｈ，ｍ），５．４９－５．７１（２Ｈ，ｍ）．ＵＰＬＣ，ｍｓ検出（ＥＳ＋）（［Ｍ＋Ｈ］＋）＝７７６．０Ｄａ；ＲＴ ＥＬＳＤ＝１．８８分。
【化43】
１：１アセトニトリル／ＣＰＭＥ（１０ｍＬ）及びＤＩＰＥＡ（０．２１２ｍＬ、１．２１ｍｍｏｌ）中に溶解したヘプタデカン－９－イル８－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアートジヒドロクロリド（中間体３）を、窒素下で２０℃にて加えた。結果として生じた混合液を、２０℃にて３０分間撹拌した。（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル８－ブロモオクタノアート（０．１２３ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）（中間体４）を窒素下で撹拌溶液に滴加した。結果として生じた混合液を８０℃に加熱して、窒素下で１８時間にわたって撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性塩化ナトリウム（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物をフラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０から１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮して、ヘプタデカン－９－イル（Ｚ）－８－（７－（８－（ノナ－２－エン－１－イルオキシ）－８－オキソオクチル）－９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３－イル）オクタノアート（０．２１４ｇ、９３％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，メタノール－ｄ４）０．８６－１．００（９Ｈ，ｔ），１．２３－１．４６（４４Ｈ，ｍ），１．５６（８Ｈ，ｍ），１．６４（４Ｈ，ｍ），２．１５（２Ｈ，ｑ），２．２４－２．３８（８Ｈ，ｍ），２．５１（４Ｈ，ｂｒ ｄ），２．９２（４Ｈ，ｂｒ ｄ），３．９１（２Ｈ，ｂｒ ｓ），４．６４（２Ｈ，ｄ），４．８８－４．９３（１Ｈ，ｍ），５．４９－５．７１（２Ｈ，ｍ）．ＵＰＬＣ，ｍｓ検出（ＥＳ＋）（［Ｍ＋Ｈ］＋）＝７７６．０Ｄａ；ＲＴ ＥＬＳＤ＝１．８８分。
【0097】
実施例５．化合物５の合成
試薬 ａ）ホスホノ酢酸トリエチル、ＮａＨ、ＴＨＦ；ｂ）Ｐｔ（ＩＶ）Ｏ２、Ｈ２、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ；ｃ）ＬｉＡｌＨ４、ＴＨＦ；ｄ）ＥＤＣ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＡＰ、ＤＣＭ；ｅ）ＤＩＰＥＡ、ＫＩ、ＡＣＮ
【化44】
【0098】
中間体１：エチル３－オクチルウンデカ－２－エノアート
工程ａ：
ホスホノ酢酸トリエチル（１２．５９ｍｌ、６２．８８ｍｍｏｌ）を、窒素下で０℃にて、水素化ナトリウム（２．５１ｇ、６２．８８ｍｍｏｌ）の撹拌ＴＨＦ溶液（５０ｍＬ）にゆっくり加えた。結果として生じた混合液を、０℃にて３０分間撹拌した。ヘプタデカン－９－オン（２ｇ、７．８６ｍｍｏｌ）を混合液に加えて、窒素下で３０℃に温めた。結果として生じた混合液を、還流下で１８時間攪拌した。室温に冷却した後に、反応混合液を水（１００ｍＬ）によりクエンチして、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）により抽出して、組み合わせた有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、黄色の油を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から４０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲを用いて、各画分の純度を判定した。組み合わせた生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、エチル３－オクチルウンデカ－２－エノアート（１．８５０ｇ、７２．５％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．２１－１．５３（２７Ｈ，ｍ），２．１３（２Ｈ，ｔ），２．５３－２．６５（２Ｈ，ｔ），４．１５（２Ｈ，ｑ），５．６２（１Ｈ，ｓ）．
【化45】
ホスホノ酢酸トリエチル（１２．５９ｍｌ、６２．８８ｍｍｏｌ）を、窒素下で０℃にて、水素化ナトリウム（２．５１ｇ、６２．８８ｍｍｏｌ）の撹拌ＴＨＦ溶液（５０ｍＬ）にゆっくり加えた。結果として生じた混合液を、０℃にて３０分間撹拌した。ヘプタデカン－９－オン（２ｇ、７．８６ｍｍｏｌ）を混合液に加えて、窒素下で３０℃に温めた。結果として生じた混合液を、還流下で１８時間攪拌した。室温に冷却した後に、反応混合液を水（１００ｍＬ）によりクエンチして、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）により抽出して、組み合わせた有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、黄色の油を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から４０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。１Ｈ ＮＭＲを用いて、各画分の純度を判定した。組み合わせた生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、エチル３－オクチルウンデカ－２－エノアート（１．８５０ｇ、７２．５％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．２１－１．５３（２７Ｈ，ｍ），２．１３（２Ｈ，ｔ），２．５３－２．６５（２Ｈ，ｔ），４．１５（２Ｈ，ｑ），５．６２（１Ｈ，ｓ）．
【0099】
中間体２：エチル３－オクチルウンデカノアート
工程ｂ：
ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（５：１）（３０ｍＬ）中のエチル３－オクチルウンデカ－２エノアート（２．０ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）（中間体１）及び酸化白金（ＩＶ）（０．０２８ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、大気圧にて１６時間、水素のバルーン下で撹拌した。反応混合液をセライトにより濾過した。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から４０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。分離は、ヘプタデカン－９－オン出発材料との重複に起因して、困難であった。１Ｈ ＮＭＲを用いて、各画分の純度を判定した。組み合わせた生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、エチル３－オクチルウンデカノアート（１．５４０ｇ、７７％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８３－０．９５（６Ｈ，ｔ），１．１６－１．３９（３１Ｈ，ｍ），１．７９－１．９２（１Ｈ，ｂｒ ｔ），２．２２（２Ｈ，ｄ），４．１３（２Ｈ，ｑ）．
【化46】
ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（５：１）（３０ｍＬ）中のエチル３－オクチルウンデカ－２エノアート（２．０ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）（中間体１）及び酸化白金（ＩＶ）（０．０２８ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を、大気圧にて１６時間、水素のバルーン下で撹拌した。反応混合液をセライトにより濾過した。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から４０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。分離は、ヘプタデカン－９－オン出発材料との重複に起因して、困難であった。１Ｈ ＮＭＲを用いて、各画分の純度を判定した。組み合わせた生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、エチル３－オクチルウンデカノアート（１．５４０ｇ、７７％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８３－０．９５（６Ｈ，ｔ），１．１６－１．３９（３１Ｈ，ｍ），１．７９－１．９２（１Ｈ，ｂｒ ｔ），２．２２（２Ｈ，ｄ），４．１３（２Ｈ，ｑ）．
【0100】
中間体３：３－オクチルウンデカン－１－オール
工程ｃ：
水素化アルミニウムリチウム（７．７５ｍｌ、７．７５ｍｍｏｌ）を、窒素下で０℃にて、エチル３－オクチルウンデカノアート（２．３ｇ、７．０４ｍｍｏｌ）（中間体２）の撹拌ＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）にゆっくり加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１８時間撹拌した。完了後、反応液を０℃に冷却して、３Ｍ ＨＣｌ（１００ｍＬ）によりクエンチして、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）により抽出して、組み合わせた有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、黄色の油を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から４０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、３－オクチルウンデカン－１－オール（１．３５４ｇ、６７．６％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．１８－１．３６（２８Ｈ，ｍ），１．３８－１．４６（１Ｈ，ｂｒ ｔ），１．５３（２Ｈ，ｑ），３．６７（２Ｈ，ｔ）．
【化47】
水素化アルミニウムリチウム（７．７５ｍｌ、７．７５ｍｍｏｌ）を、窒素下で０℃にて、エチル３－オクチルウンデカノアート（２．３ｇ、７．０４ｍｍｏｌ）（中間体２）の撹拌ＴＨＦ溶液（２０ｍＬ）にゆっくり加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１８時間撹拌した。完了後、反応液を０℃に冷却して、３Ｍ ＨＣｌ（１００ｍＬ）によりクエンチして、ＥｔＯＡｃ（３×５０ｍＬ）により抽出して、組み合わせた有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、黄色の油を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から４０％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、３－オクチルウンデカン－１－オール（１．３５４ｇ、６７．６％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（６Ｈ，ｔ），１．１８－１．３６（２８Ｈ，ｍ），１．３８－１．４６（１Ｈ，ｂｒ ｔ），１．５３（２Ｈ，ｑ），３．６７（２Ｈ，ｔ）．
【0101】
中間体４：３－オクチルウンデシル８－ブロモオクタノアート
工程ｄ：
ＥＤＣ（０．７０７ｇ、３．６９ｍｍｏｌ）を、一度に、アルゴン下で、８－ブロモオクタン酸（０．４７０ｇ、２．１１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．６４５ｍｌ、３．６９ｍｍｏｌ）、３－オクチルウンデカン－１－オール（０．５ｇ、１．７６ｍｍｏｌ）（中間体３）、及びＤＭＡＰ（０．０４３ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の撹拌ＤＣＭ混合液（１０ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から１００％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、３－オクチルウンデシル８－ブロモオクタノアート（０．５４５ｇ、６３．３％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８３－０．９８（６Ｈ，ｔ），１．２０－１．４９（３５Ｈ，ｍ），１．５３－１．７０（４Ｈ，ｍ），１．７９－１．９２（２Ｈ，ｍ），２．３０（２Ｈ，ｔ），３．４１（２Ｈ，ｔ），４．０３－４．１５（２Ｈ，ｔ）．
【化48】
ＥＤＣ（０．７０７ｇ、３．６９ｍｍｏｌ）を、一度に、アルゴン下で、８－ブロモオクタン酸（０．４７０ｇ、２．１１ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．６４５ｍｌ、３．６９ｍｍｏｌ）、３－オクチルウンデカン－１－オール（０．５ｇ、１．７６ｍｍｏｌ）（中間体３）、及びＤＭＡＰ（０．０４３ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の撹拌ＤＣＭ混合液（１０ｍＬ）に加えた。結果として生じた混合液を、室温にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性ＮａＨＣＯ３（１００ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、溶離勾配０から１００％ＥｔＯＡｃ（ヘキサン中）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、３－オクチルウンデシル８－ブロモオクタノアート（０．５４５ｇ、６３．３％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８３－０．９８（６Ｈ，ｔ），１．２０－１．４９（３５Ｈ，ｍ），１．５３－１．７０（４Ｈ，ｍ），１．７９－１．９２（２Ｈ，ｍ），２．３０（２Ｈ，ｔ），３．４１（２Ｈ，ｔ），４．０３－４．１５（２Ｈ，ｔ）．
【0102】
化合物５：ビス（３－オクチルウンデシル）８，８’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ジオクタノアート
工程ｅ：
３－オクチルウンデシル８－ブロモオクタノアート（０．３０２ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）（中間体４）を、アルゴン下で２５℃にて、９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナンジヒドロクロリド（０．０４ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．１４２ｍｌ、０．８２ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（６．６０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の撹拌アセトニトリル混合液（５ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を、８０℃にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性Ｎａ２ＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０から１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ビス（３－オクチルウンデシル）８，８’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ジオクタノアート（０．０５４ｇ、２８．６％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（１２Ｈ，ｔ），１．１６－１．６９（８０Ｈ，ｍ），１．７３－１．８５（２Ｈ，ｍ），２．２０－２．２６（４Ｈ，ｂｒ ｔ），２．２６－２．３１（４Ｈ，ｔ），２．４０－２．５２（４Ｈ，ｍ），２．８２（４Ｈ，ｂｒ ｄ），３．８２－３．９４（２Ｈ，ｂｒ ｔ），４．０９（４Ｈ，ｔ）．ＵＰＬＣ，ｍｓ検出（ＥＳ＋）（［Ｍ＋Ｈ］＋）＝９４５．７；ＲＴ ＥＬＳＤ＝２．４３分。
【化49】
３－オクチルウンデシル８－ブロモオクタノアート（０．３０２ｇ、０．６２ｍｍｏｌ）（中間体４）を、アルゴン下で２５℃にて、９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナンジヒドロクロリド（０．０４ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（０．１４２ｍｌ、０．８２ｍｍｏｌ）、及びヨウ化カリウム（６．６０ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）の撹拌アセトニトリル混合液（５ｍＬ）に滴加した。結果として生じた混合液を、８０℃にて１６時間撹拌した。反応混合液を減圧下で濃縮乾固させて、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に再溶解させて、飽和水性Ｎａ２ＣＯ３（５０ｍＬ）及び飽和水性ＮａＣｌ（５０ｍＬ）により順に洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、減圧下で濃縮乾固させて、粗生成物を得た。結果として生じた残留物を、フラッシュシリカクロマトグラフィ、ＤＣＭ中溶離勾配０から１００％（ＤＣＭ中２０％ＭｅＯＨ及び１％ＮＨ４ＯＨ）によって精製した。生成物画分を減圧下で濃縮乾固させて、ビス（３－オクチルウンデシル）８，８’－（９－オキサ－３，７－ジアザビシクロ［３．３．１］ノナン－３，７－ジイル）ジオクタノアート（０．０５４ｇ、２８．６％）を淡黄色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，クロロホルム－ｄ，２７°Ｃ）０．８９（１２Ｈ，ｔ），１．１６－１．６９（８０Ｈ，ｍ），１．７３－１．８５（２Ｈ，ｍ），２．２０－２．２６（４Ｈ，ｂｒ ｔ），２．２６－２．３１（４Ｈ，ｔ），２．４０－２．５２（４Ｈ，ｍ），２．８２（４Ｈ，ｂｒ ｄ），３．８２－３．９４（２Ｈ，ｂｒ ｔ），４．０９（４Ｈ，ｔ）．ＵＰＬＣ，ｍｓ検出（ＥＳ＋）（［Ｍ＋Ｈ］＋）＝９４５．７；ＲＴ ＥＬＳＤ＝２．４３分。
【0103】
実施例６．ｅＧＦＰ ｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の調製
ＬＮＰを、マイクロフルイディックセットアップ、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いて調製した。簡潔に、脂質のストックをエタノール中に溶解させて、１２．５ｍＭの脂質濃度を得るような適切なモル比で混合した。ＬＮＰのサイズを、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．のＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いるＤＬＳ測定によって判定した。個数基準（ｎｕｍｂｅｒ－ｗｅｉｇｈｔｅｄ）粒子サイズ分布を、１．４５の粒子屈折率を用いて算出した。ＬＮＰの特性評価を表１に示す。エタノール中脂質溶液（９９．５％）を、４つの異なる脂質成分：イオン化可能脂質、すなわち、ＭＣ３、ＭＯＤ５、化合物１、化合物２、又は化合物４；コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ）；及びポリマーコンジュゲート脂質により調製した。全ての実験における脂質の比は、イオン化可能脂質／コレステロール／ＤＳＰＣ／ポリマーコンジュゲート脂質（５０／３８．５／１０／１．５モル％）であった。全ての実験における脂質の総濃度は、１２．５ｍＭであった。ＭＯＤ５は、以下に示す構造を有するイオン化可能脂質であり、より詳細な説明は、Ｓａｂｎｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ ２６，６，２０１８，１５０９－１５１９にて見出すことができる。
ＬＮＰを、マイクロフルイディックセットアップ、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いて調製した。簡潔に、脂質のストックをエタノール中に溶解させて、１２．５ｍＭの脂質濃度を得るような適切なモル比で混合した。ＬＮＰのサイズを、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．のＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いるＤＬＳ測定によって判定した。個数基準（ｎｕｍｂｅｒ－ｗｅｉｇｈｔｅｄ）粒子サイズ分布を、１．４５の粒子屈折率を用いて算出した。ＬＮＰの特性評価を表１に示す。エタノール中脂質溶液（９９．５％）を、４つの異なる脂質成分：イオン化可能脂質、すなわち、ＭＣ３、ＭＯＤ５、化合物１、化合物２、又は化合物４；コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ）；及びポリマーコンジュゲート脂質により調製した。全ての実験における脂質の比は、イオン化可能脂質／コレステロール／ＤＳＰＣ／ポリマーコンジュゲート脂質（５０／３８．５／１０／１．５モル％）であった。全ての実験における脂質の総濃度は、１２．５ｍＭであった。ＭＯＤ５は、以下に示す構造を有するイオン化可能脂質であり、より詳細な説明は、Ｓａｂｎｉｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ ２６，６，２０１８，１５０９－１５１９にて見出すことができる。
【化50】
【0104】
ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）のクエン酸バッファ溶液を、ＭｉｌｌｉＱ水中に溶解したｍＲＮＡ、１００ｍＭクエン酸バッファ（ｐＨ３）、及びＭｉｌｌｉＱ水を混合することによって調製して、５０ｍＭシトラートの溶液を得た。ｍＲＮＡ及び脂質溶液を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）のマイクロ流体混合システムにより、水溶液：ＥｔＯＨ＝３：１の混合比及び１２ｍＬ／分の一定流速にて混合した。混合時点にて、イオン化可能脂質上の窒素原子とｍＲＮＡ鎖上のリン原子との比（Ｎ／Ｐ比）が３：１又は５：１となるように、クエン酸バッファ溶液中のｍＲＮＡを調製した（表１参照）。ＬＮＰを、１０Ｋの分子量カットオフにより、Ｔｈｅｒｍｏ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからＳｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ Ｇ２透析カセットを用いる５００×試料容量に対して一晩透析した。
【0105】
調製したＬＮＰ懸濁液の最初の０．２～０．３５ｍＬ及び最終の０．０５～０．１ｍＬを廃棄した一方で、残りの容量を試料画分として収集した。ｍＲＮＡ脂質ナノ粒子のサイズを、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＬｔｄのＺｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳを用いる動的光散乱測定によって判定して、ｚ－平均粒径を直接得た。個数基準粒子サイズ分布及び平均を、１．４５の粒子屈折率を用いて算出した。
【0106】
ｍＲＮＡのカプセル化及び濃度を、Ｒｉｂｏ－Ｇｒｅｅｎアッセイを用いて判定した。全試料におけるカプセル化は、典型的に、９０～９９％であった。最終のｍＲＮＡ濃度及びカプセル化効率パーセンテージ（％ＥＥ）を、ＬＮＰを破壊するためのトリトン－Ｘ１００を用いて、Ｑｕａｎｔ－ｉｔ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）によって測定した。ｍＲＮＡカプセル化効率を、以下の式に従って求めた：
【数1】
【0107】
表１は、ＭＣ３、ＭＯＤ５、化合物１、化合物２、又は化合物４を含むＬＮＰ製剤の特性評価を要約する。
【0108】
【表1】
【0109】
ＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００は、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）２０００（ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得た）である。
【0110】
ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００は、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である。
【0111】
実施例７．ＬＮＰ－ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ製剤の、ラットへのインビボ気管内投与
インビボ研究を、Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇの承認（ｎｏ．８２－２０１５）の下で、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ、ＳｗｅｄｅｎのＡＡＡＬＡＣ公認の動物施設にて実行した。雄Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎラットを購入して（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｇｅｒｍａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、到着して直ぐに、飼料（Ｒ７０ Ｒａｔ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ ｃｈｏｗ（Ｌａｎｔｍａｅｎｎｅｎ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）と共にかんなくずの上に４頭の群でケージに入れて、給水本管から引き込んだ飲用水を自由に与えた。動物は、投与の開始時は約１０週齢であった。環境を、１９～２４℃の標的温度及び４０～７０％の相対湿度にて、１２時間の明／暗サイクルで維持した。動物を、あらゆる実験手順の前に少なくとも５日間、収容部の条件に順応させた。吸入用量を受けた動物をさらに、投与の開始前に最大５日間、拘束手順に曝す期間を各研究の最大予想期間まで徐々に増やすことによって、吸入拘束手順に慣らした。
インビボ研究を、Ａｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇの承認（ｎｏ．８２－２０１５）の下で、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ、Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ、ＳｗｅｄｅｎのＡＡＡＬＡＣ公認の動物施設にて実行した。雄Ｗｉｓｔａｒ Ｈａｎラットを購入して（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｇｅｒｍａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ）、到着して直ぐに、飼料（Ｒ７０ Ｒａｔ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ ｃｈｏｗ（Ｌａｎｔｍａｅｎｎｅｎ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）と共にかんなくずの上に４頭の群でケージに入れて、給水本管から引き込んだ飲用水を自由に与えた。動物は、投与の開始時は約１０週齢であった。環境を、１９～２４℃の標的温度及び４０～７０％の相対湿度にて、１２時間の明／暗サイクルで維持した。動物を、あらゆる実験手順の前に少なくとも５日間、収容部の条件に順応させた。吸入用量を受けた動物をさらに、投与の開始前に最大５日間、拘束手順に曝す期間を各研究の最大予想期間まで徐々に増やすことによって、吸入拘束手順に慣らした。
【0112】
ｅＧＦＰ ｍＲＮＡの化合物１ ＬＮＰ製剤を、０．０２ｍｇ／ｅＧＦＰｋｇの標的肺用量での単回の吸入投与によって、又は単回の気管内投与によって投与した。同じサイズの一群を、吸入又は気管内設置（ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ ｉｎｓｔａｌｌａｔｉｏｎ）によってリン酸緩衝生理食塩水に動物を曝すプラセボ対照として用いた。気管内投与後の２４時間目のラット肺におけるｅＧＦＰの発現レベルを図３に示し、気管内投与後の２４時間目のラットＢＡＬＦにおけるＢＡＬＦ好中球濃度を図４に示した 。吸入投与後の５時間及び２４時間目のラット肺におけるｅＧＦＰの発現レベルを図６に示し、吸入投与後の２４時間目のラットＢＡＬＦにおけるＢＡＬＦ好中球濃度を図７に示した。さらに、免疫組織化学（ＩＨＣ）試験は、マクロファージにおけるだけでなく、１型上皮細胞におけるｅＧＦＰの発現を示す（図５Ａ及び図５Ｂ参照）。
【0113】
実施例６に記載されるｅＧＦＰ ｍＲＮＡのＭＣ３、ＭＯＤ５、化合物２、及び化合物４ ＬＮＰ製剤を各々、０．１ｍｇ／ｅＧＦＰｋｇの標的肺用量での単回の気管内投与によって投与した。同じサイズの一群を、気管内設置によってリン酸緩衝生理食塩水に動物を曝すプラセボ対照として用いた。２４時間目のラット肺におけるｅＧＦＰの発現レベルを図１に示し、２４時間目のラットＢＡＬＦにおけるＢＡＬＦ好中球濃度を図２に示した。
【0114】
吸入投与
エーロゾルを、Ａｅｒｏｇｅｎ Ｓｏｌｏ振動メッシュネブライザ（Ｇａｌｗａｙ Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いて生成した。ネブライザを、５．６ｍＬのビヒクル又はＬＮＰ製剤中ｅＧＦＰ ｍＲＮＡで満たして、投与期間の間、およそ６０μｌ／分にて霧状にした。ラットを、齧歯類拘束につかせてから、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ設計の吸入投与システムに置いた。動物を、臨床所見のない投与後の病的影響のあらゆるサイン又は注目される体重の異常な変化について、実験手順を通して監視した。最終用量後の２４時間目に、ラットを、イソフルラン麻酔の鎮静、並びにその後の大静脈のカット及び心臓の除去によって殺処分した。
エーロゾルを、Ａｅｒｏｇｅｎ Ｓｏｌｏ振動メッシュネブライザ（Ｇａｌｗａｙ Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いて生成した。ネブライザを、５．６ｍＬのビヒクル又はＬＮＰ製剤中ｅＧＦＰ ｍＲＮＡで満たして、投与期間の間、およそ６０μｌ／分にて霧状にした。ラットを、齧歯類拘束につかせてから、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ設計の吸入投与システムに置いた。動物を、臨床所見のない投与後の病的影響のあらゆるサイン又は注目される体重の異常な変化について、実験手順を通して監視した。最終用量後の２４時間目に、ラットを、イソフルラン麻酔の鎮静、並びにその後の大静脈のカット及び心臓の除去によって殺処分した。
【0115】
気管内投与
ラットを、イソフルラン混合物（空気／酸素及び３．５％イソフルラン）により麻酔をかけて、３０～４０°の角度の仰臥位に置いてから、ＬＮＰ製剤内のｅＧＦＰ ｍＲＮＡ又はビヒクルを、最上部にボーラス－バルブを有する修飾金属カニューレを用いて注ぎ込んだ。投与後、ラットを、意識が戻るまで頭を上にして仰臥位でケージに入れる。動物を、臨床所見のない投与後の病的影響のあらゆるサイン又は注目される体重の異常な変化について、実験手順を通して監視した。最終用量後の２４時間目に、ラットを、イソフルラン麻酔の鎮静、並びにその後の大静脈の切断及び心臓の除去によって殺処分した。
ラットを、イソフルラン混合物（空気／酸素及び３．５％イソフルラン）により麻酔をかけて、３０～４０°の角度の仰臥位に置いてから、ＬＮＰ製剤内のｅＧＦＰ ｍＲＮＡ又はビヒクルを、最上部にボーラス－バルブを有する修飾金属カニューレを用いて注ぎ込んだ。投与後、ラットを、意識が戻るまで頭を上にして仰臥位でケージに入れる。動物を、臨床所見のない投与後の病的影響のあらゆるサイン又は注目される体重の異常な変化について、実験手順を通して監視した。最終用量後の２４時間目に、ラットを、イソフルラン麻酔の鎮静、並びにその後の大静脈の切断及び心臓の除去によって殺処分した。
【0116】
ＢＡＬサンプリング
気管支（Ｂｒｏｎｃｈｅｏ）肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、肺全体を手作業で潅流して実施した。気管を露出させた後、ポリエチレンチューブ（ＰＥ１２０）を挿入して、１－０絹縫合糸により結紮した。チューブを、室温の４ｍｌのＰＢＳにより予め充填したシリンジに連結して、ＰＢＳを肺中にゆっくり注入した。流体を、シリンジ中へのゆっくりした吸引によって再収集した。この手順を２回実行した。最終的なＢＡＬ流体を、試験管（４ｍｌ、ポリプロピレン［ＰＰ］）に移す。
気管支（Ｂｒｏｎｃｈｅｏ）肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、肺全体を手作業で潅流して実施した。気管を露出させた後、ポリエチレンチューブ（ＰＥ１２０）を挿入して、１－０絹縫合糸により結紮した。チューブを、室温の４ｍｌのＰＢＳにより予め充填したシリンジに連結して、ＰＢＳを肺中にゆっくり注入した。流体を、シリンジ中へのゆっくりした吸引によって再収集した。この手順を２回実行した。最終的なＢＡＬ流体を、試験管（４ｍｌ、ポリプロピレン［ＰＰ］）に移す。
【0117】
ＢＡＬ試料の入っているチューブを秤量した（１グラムが１ｍｌに等しいと仮定）。ＢＡＬを、遠心分離（Ｈｅｔｔｉｃｈ ＲＯＴＡＮＴＡ ４６Ｒ、１２００ｒｐｍ、１０分、４℃）まで氷冷した。遠心分離後、上清を収集して、９６ウェルプレート上に分けて（０．１５ｍＬ／ウェル、５プレート）、ドライアイス（０．１ｍｌ／ウェル）上で保持した。プレートを、更なるあらゆる分析用に、最低－７５℃にて保存した。細胞ペレットを、０．５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させて、氷上で保持して、細胞カウントに向けて
直ぐにプロセシングした。細胞の総数及び差分数を、自動ＳＹＳＭＥＸ ＸＴ－１８００ｉ Ｖｅｔ（シスメックス株式会社、神戸、日本）を用いて数える。
直ぐにプロセシングした。細胞の総数及び差分数を、自動ＳＹＳＭＥＸ ＸＴ－１８００ｉ Ｖｅｔ（シスメックス株式会社、神戸、日本）を用いて数える。
【0118】
器官収集
右肺葉を縛って別々にして、非肺組織から切り取って、血塊をなくして、食塩によりリンスした。右葉を、縫い目を用いて離脱させて、解放させて、ＰＢＳによりリンスして、いかなる血液混入も除去した。上葉及び中葉を秤量して、ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ分析のために７ｍＬ ｐｒｅｃｅｌｌｙｓチューブ内に収集した。下大静脈葉を秤量して、ｅＧＦＰタンパク質分析のために７ｍＬ ｐｒｅｃｅｌｌｙｓチューブ内に収集した。全ての右葉試料を、液体窒素内で急速凍結させる。試料を節約して、分析のための更なるプロセシングまで、最低－８０℃にて保存した。左葉をホルマリンで膨張させて、プラスチック蓋付きコンテナ内で過剰ホルマリン中に入れた。
右肺葉を縛って別々にして、非肺組織から切り取って、血塊をなくして、食塩によりリンスした。右葉を、縫い目を用いて離脱させて、解放させて、ＰＢＳによりリンスして、いかなる血液混入も除去した。上葉及び中葉を秤量して、ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ分析のために７ｍＬ ｐｒｅｃｅｌｌｙｓチューブ内に収集した。下大静脈葉を秤量して、ｅＧＦＰタンパク質分析のために７ｍＬ ｐｒｅｃｅｌｌｙｓチューブ内に収集した。全ての右葉試料を、液体窒素内で急速凍結させる。試料を節約して、分析のための更なるプロセシングまで、最低－８０℃にて保存した。左葉をホルマリンで膨張させて、プラスチック蓋付きコンテナ内で過剰ホルマリン中に入れた。
【0119】
実施例８．ＬＮＰ－ｅＧＦＰ ｍＲＮＡ製剤の、マウスへのインビボ静脈内投与
ＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵに従って、全ての研究が、Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｕ．Ｋ．倫理及び管理基準に合わされて、そしてＵＫ Ｐｒｏｊｅｃｔライセンスの権限下で実行されて、Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏｄｙ（ＡＷＥＲＢ）によって審査且つ承認された。野生型雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、ＵＫから購入して、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ動物施設に収容した。全てのマウスに、１００μｌのＭＣ３を注入して、化合物２及び化合物３ ＬＮＰ製剤を、実施例６に記載する類似した手順によって調製した。特性評価を表２に示す。０．４ｍｇ／ｅＧＦＰ ｍＲＮＡｋｇを含有するＬＮＰ製剤は、尾静脈内注射を介する。マウスを、投与の２４時間後に安楽死させて、以下の器官：肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び心臓を抽出した。器官をクライオバイアル中に収集して、急速凍結させた。２４時間目のマウス器官におけるｅＧＦＰの発現レベルを、図８（肝臓）、図９（脾臓）、図１０（肺）、図１１（腎臓）、及び図１２（心臓）に示す。
ＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵに従って、全ての研究が、Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅ Ｕ．Ｋ．倫理及び管理基準に合わされて、そしてＵＫ Ｐｒｏｊｅｃｔライセンスの権限下で実行されて、Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ ａｎｄ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏｄｙ（ＡＷＥＲＢ）によって審査且つ承認された。野生型雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）を、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、ＵＫから購入して、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ動物施設に収容した。全てのマウスに、１００μｌのＭＣ３を注入して、化合物２及び化合物３ ＬＮＰ製剤を、実施例６に記載する類似した手順によって調製した。特性評価を表２に示す。０．４ｍｇ／ｅＧＦＰ ｍＲＮＡｋｇを含有するＬＮＰ製剤は、尾静脈内注射を介する。マウスを、投与の２４時間後に安楽死させて、以下の器官：肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び心臓を抽出した。器官をクライオバイアル中に収集して、急速凍結させた。２４時間目のマウス器官におけるｅＧＦＰの発現レベルを、図８（肝臓）、図９（脾臓）、図１０（肺）、図１１（腎臓）、及び図１２（心臓）に示す。
【0120】
【表2】
【0121】
組織均質化
器官／組織均質化及び細胞溶解を、ＥＬＩＳＡの前に実行した。簡潔に、器官／組織を氷上で解凍して、１×ＤＰＢによりリンスして、いかなる血液も除去した。器官／組織を、約１００～２００ｍｇのスライスにカットして、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ７８４４５）並びに５ｍｍのステンレス鋼ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）入りの０．５～１ｍＬの氷冷１×Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＰＴＲ（ＥＬＩＳＡキットａｂ１７１５８１由来）を含有する２ｍＬチューブに移した。器官／組織試料を、３０ １／ｓの頻度にセットしたＴｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）上で３分間均質化してから、クリーンチューブに移して、氷上で２０分間インキュベートした。続いて、試料を１８０００×ｇ、４℃にて２０分遠心分離して、澄んだホモジェネートを、クリーンなチューブに移して、分注して、更なる使用まで－８０℃にて保存した。
器官／組織均質化及び細胞溶解を、ＥＬＩＳＡの前に実行した。簡潔に、器官／組織を氷上で解凍して、１×ＤＰＢによりリンスして、いかなる血液も除去した。器官／組織を、約１００～２００ｍｇのスライスにカットして、プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ７８４４５）並びに５ｍｍのステンレス鋼ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）入りの０．５～１ｍＬの氷冷１×Ｃｅｌｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ ＰＴＲ（ＥＬＩＳＡキットａｂ１７１５８１由来）を含有する２ｍＬチューブに移した。器官／組織試料を、３０ １／ｓの頻度にセットしたＴｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）上で３分間均質化してから、クリーンチューブに移して、氷上で２０分間インキュベートした。続いて、試料を１８０００×ｇ、４℃にて２０分遠心分離して、澄んだホモジェネートを、クリーンなチューブに移して、分注して、更なる使用まで－８０℃にて保存した。
【0122】
エクスビボＥＬＩＳＡによる器官内のｅＧＦＰの定量化
肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び心臓におけるｅＧＦＰ発現レベルを、ＧＦＰ ＳｉｍｐｌｅＳｔｅｐ ＥＬＩＳＡ（登録商標）Ｋｉｔ（ａｂ１７１５８１）を用いて、メーカーの指示に従って測定した。全ての試薬を、使用前に室温に平衡化させた。以下のバッファ：プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ７８４４５）入り１×細胞抽出バッファＰＴＲ、１×洗浄バッファＰＴ、１×抗体希釈剤、抗体カクテル、及びＥＧＦＰ標準曲線を調製した。組織ホモジェネートの更なる希釈が必要とされる場合、これを、氷冷した１×細胞抽出バッファＰＴＲにより実行した。続いて、５０μｌの希釈サンプル及びｅＧＦＰ基準を各ウェルに加えてから、５０μｌの抗体カクテルを加えた。続いて、プレートをシールして、４００ｒｐｍにセットしたプレートシェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルを、３５０μｌの１×洗浄バッファＰＴにより３回洗浄した。最終の洗浄工程後に、過剰な液体を、クリーンなペーパータオルに対してプレートを吸い取ることによって除去した。続いて、１００μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに加えて、プレートを、アルミニウムホイルでカバーして、４００ｒｐｍにセットしたプレートシェーカー上で１０分間インキュベートした。最後に、１００μｌの停止溶液を各ウェルに加えて、プレートを１分間振盪させて、４５０ｎｍでの吸光度を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて記録した。ｅＧＦＰ標準曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を用いてシグモイド４ＰＬ曲線にフィットさせて、ｎｇ ｅＧＦＰタンパク質を曲線から推定した。
肝臓、脾臓、肺、腎臓、及び心臓におけるｅＧＦＰ発現レベルを、ＧＦＰ ＳｉｍｐｌｅＳｔｅｐ ＥＬＩＳＡ（登録商標）Ｋｉｔ（ａｂ１７１５８１）を用いて、メーカーの指示に従って測定した。全ての試薬を、使用前に室温に平衡化させた。以下のバッファ：プロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ７８４４５）入り１×細胞抽出バッファＰＴＲ、１×洗浄バッファＰＴ、１×抗体希釈剤、抗体カクテル、及びＥＧＦＰ標準曲線を調製した。組織ホモジェネートの更なる希釈が必要とされる場合、これを、氷冷した１×細胞抽出バッファＰＴＲにより実行した。続いて、５０μｌの希釈サンプル及びｅＧＦＰ基準を各ウェルに加えてから、５０μｌの抗体カクテルを加えた。続いて、プレートをシールして、４００ｒｐｍにセットしたプレートシェーカー上で室温にて１時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルを、３５０μｌの１×洗浄バッファＰＴにより３回洗浄した。最終の洗浄工程後に、過剰な液体を、クリーンなペーパータオルに対してプレートを吸い取ることによって除去した。続いて、１００μｌのＴＭＢ基質を各ウェルに加えて、プレートを、アルミニウムホイルでカバーして、４００ｒｐｍにセットしたプレートシェーカー上で１０分間インキュベートした。最後に、１００μｌの停止溶液を各ウェルに加えて、プレートを１分間振盪させて、４５０ｎｍでの吸光度を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて記録した。ｅＧＦＰ標準曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９を用いてシグモイド４ＰＬ曲線にフィットさせて、ｎｇ ｅＧＦＰタンパク質を曲線から推定した。
【0123】
ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ ２３２２５）によって、メーカーの指示に従って判定して、ｅＧＦＰ量を総組織タンパク質によって正規化した。簡潔に、２５μｌの希釈組織ホモジェネート又はＢＳＡ基準を各ウェルに加えてから、２００μｌのワーキング試薬を各ウェルに加えて、内容物をプレートシェーカー上で３０秒間素早く混合した。続いて、プレートをカバーして、３７℃にて３０分間インキュベートした。プレートを室温に冷却した後に、５６２ｎｍでの吸光度を、Ｅｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて記録した。総タンパク質（ｍｇ）を、ＢＳＡ標準曲線から推定した。データを、組織タンパク質の平均ｎｇ ｅＧＦＰ／ｍｇ±ＳＤとして報告する。
【0124】
実施例９．ｈＥＰＯ及びルシフェラーゼｍＲＮＡのＬＮＰ共製剤の、マウスへのインビボ静脈内投与
ｈＥＰＯ及びルシフェラーゼｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の調製：
ヌクレアーゼフリー水中に溶解したｍＲＮＡ、１００ｍＭクエン酸バッファ（ｐＨ３）、及びヌクレアーゼフリー水を混合して、５０ｍＭシトラートの溶液を与えることよって、ｈＥＰＯ（ヒトＥＰＯ）ｍＲＮＡ及びルシフェラーゼｍＲＮＡ（双方とも、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）の溶液を、クエン酸バッファ中に１：１の比で混合した。エタノール中の脂質溶液（９９．５％）を、実施例６に記載する類似した手順によって、４つの異なる脂質成分：イオン化可能脂質、すなわち、ＭＣ３又は化合物２又は化合物３；コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ）；及びＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００（ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）２０００、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共に調製した。ＬＮＰの特性評価を表３に示す。全ての実験における脂質の総濃度は１２．５ｍＭであった。ｍＲＮＡ及び脂質溶液を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）のマイクロ流体混合システムにより、水溶液：ＥｔＯＨ＝３：１の混合比及び１２ｍＬ／分の一定流速にて混合した。混合時点にて、イオン化可能脂質及びｍＲＮＡ鎖上のリン原子のモル比は、６に等しかった。調製したＬＮＰ懸濁液の最初の０．２～０．３５ｍＬ及び最終の０．０５～０．１ｍＬを廃棄した一方で、残りの容量を試料画分として収集した。試料容量を、Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒ Ｇ２透析カセット（１００００ ＭＷＣＯ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）に直ちに移して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して４℃にて一晩透析した。ＰＢＳバッファの容量は、試料画分容量の５００～１０００倍であった。翌日、試料をカセットから、シリンジ及び針により採った。続いて、針を、０．２μｍシリンジフィルタによって置き換えて、試料を、滅菌チューブ内にフィルタ滅菌した。この試料から、１０μＬを、９９０μｌ ＰＢＳバッファｐＨ７．４により希釈して、Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒ（ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）による強度平均粒子サイズ、及び多分散指数（ＰＤＩ）を測定するのに用いた。最終のｍＲＮＡ濃度及びカプセル化効率パーセンテージ（％ＥＥ）を、ＬＮＰを破壊するためのトリトン－Ｘ１００を用いて、Ｑｕａｎｔ－ｉｔ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）によって測定した。
ｈＥＰＯ及びルシフェラーゼｍＲＮＡを含有する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤の調製：
ヌクレアーゼフリー水中に溶解したｍＲＮＡ、１００ｍＭクエン酸バッファ（ｐＨ３）、及びヌクレアーゼフリー水を混合して、５０ｍＭシトラートの溶液を与えることよって、ｈＥＰＯ（ヒトＥＰＯ）ｍＲＮＡ及びルシフェラーゼｍＲＮＡ（双方とも、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入）の溶液を、クエン酸バッファ中に１：１の比で混合した。エタノール中の脂質溶液（９９．５％）を、実施例６に記載する類似した手順によって、４つの異なる脂質成分：イオン化可能脂質、すなわち、ＭＣ３又は化合物２又は化合物３；コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ）；及びＤＭＰＥ－ＰＥＧ２０００（ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン－ポリ（エチレングリコール）２０００、ＮＯＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共に調製した。ＬＮＰの特性評価を表３に示す。全ての実験における脂質の総濃度は１２．５ｍＭであった。ｍＲＮＡ及び脂質溶液を、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）のマイクロ流体混合システムにより、水溶液：ＥｔＯＨ＝３：１の混合比及び１２ｍＬ／分の一定流速にて混合した。混合時点にて、イオン化可能脂質及びｍＲＮＡ鎖上のリン原子のモル比は、６に等しかった。調製したＬＮＰ懸濁液の最初の０．２～０．３５ｍＬ及び最終の０．０５～０．１ｍＬを廃棄した一方で、残りの容量を試料画分として収集した。試料容量を、Ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒ Ｇ２透析カセット（１００００ ＭＷＣＯ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）に直ちに移して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して４℃にて一晩透析した。ＰＢＳバッファの容量は、試料画分容量の５００～１０００倍であった。翌日、試料をカセットから、シリンジ及び針により採った。続いて、針を、０．２μｍシリンジフィルタによって置き換えて、試料を、滅菌チューブ内にフィルタ滅菌した。この試料から、１０μＬを、９９０μｌ ＰＢＳバッファｐＨ７．４により希釈して、Ｍａｌｖｅｒｎ ＺｅｔａＳｉｚｅｒ（ＺｅｔａＳｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）による強度平均粒子サイズ、及び多分散指数（ＰＤＩ）を測定するのに用いた。最終のｍＲＮＡ濃度及びカプセル化効率パーセンテージ（％ＥＥ）を、ＬＮＰを破壊するためのトリトン－Ｘ１００を用いて、Ｑｕａｎｔ－ｉｔ Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）によって測定した。
【0125】
【表3】
【0126】
動物実験：
実験を、野生型（ＷＴ）及びＬＤＬｒノックアウト（ＫＯ）マウスにおいて実行した。全ての実験は、Ｓｗｅｄｉｓｈ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅに従って実行されて、Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ、ＳｗｅｄｅｎにおけるＥｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓによって承認された。等しい数の雄及び雌のＣ５７ｂｌ６ ＬＤＬＲ－／－マウス並びにそれらの野生型同腹仔を社内で育てた。２０頭のＣ５７ｂｌ６ ＬＤＬＲ－／－及び４０頭のＷＴマウスを研究に含めた（群毎にＮ≧５頭）。動物を、２５ｇの平均体重にて用いた。動物を拘束して、上述のＬＮＰ中に共製剤化した０．１５ｍｇ／ｈＥＰＯ ｍＲＮＡｋｇ＋０．１５ｍｇ／Ｌｕｃ ｍＲＮＡｋｇ（０．３ｍｇ／総ｍＲＮＡｋｇ）、又は対照としてのＰＢＳを静脈内注射した。血液試料をＥＤＴＡチューブ内に、犠牲前のｔ＝６時にて尾静脈採血を介して、そしてｔ＝２４時にて眼窩叢採血を介して収集した。マウスを、終了の２０分前に、５ｍｇ／ルシフェリン基質（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのＲｅｄｉＪｅｃｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）ｋｇを皮下注射した。心臓、肺、脾臓、及び肝臓を、終了直後に収集して、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像化した。各器官からの総発光を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて定量化した。結果として生じたＩＶＩＳ画像を、図１４に示す。ｈＥＰＯ分析のために、血液試料をスピンダウンして、Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて血漿を分析した。データをｈＥＰＯとしてｎｇ／ｍｌで報告して、試料を３反復で分析した。図１３は、ＭＣ３、化合物２、及び化合物３を含むＬＮＰ製剤の静脈内投与後の２４時間目のＷＴ及びＫＯマウス肝臓におけるルシフェラーゼタンパク質の発現を示す一方、図１５は、ＭＣ３、化合物２、及び化合物３を含むＬＮＰ製剤の静脈内投与後の６時間目のＷＴ及びＫＯマウス血漿におけるｈＥＰＯタンパク質濃度を示す。
実験を、野生型（ＷＴ）及びＬＤＬｒノックアウト（ＫＯ）マウスにおいて実行した。全ての実験は、Ｓｗｅｄｉｓｈ Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅに従って実行されて、Ｇｏｔｈｅｎｂｕｒｇ、ＳｗｅｄｅｎにおけるＥｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓによって承認された。等しい数の雄及び雌のＣ５７ｂｌ６ ＬＤＬＲ－／－マウス並びにそれらの野生型同腹仔を社内で育てた。２０頭のＣ５７ｂｌ６ ＬＤＬＲ－／－及び４０頭のＷＴマウスを研究に含めた（群毎にＮ≧５頭）。動物を、２５ｇの平均体重にて用いた。動物を拘束して、上述のＬＮＰ中に共製剤化した０．１５ｍｇ／ｈＥＰＯ ｍＲＮＡｋｇ＋０．１５ｍｇ／Ｌｕｃ ｍＲＮＡｋｇ（０．３ｍｇ／総ｍＲＮＡｋｇ）、又は対照としてのＰＢＳを静脈内注射した。血液試料をＥＤＴＡチューブ内に、犠牲前のｔ＝６時にて尾静脈採血を介して、そしてｔ＝２４時にて眼窩叢採血を介して収集した。マウスを、終了の２０分前に、５ｍｇ／ルシフェリン基質（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒのＲｅｄｉＪｅｃｔ Ｄ－Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）ｋｇを皮下注射した。心臓、肺、脾臓、及び肝臓を、終了直後に収集して、ＩＶＩＳ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて画像化した。各器官からの総発光を、ＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて定量化した。結果として生じたＩＶＩＳ画像を、図１４に示す。ｈＥＰＯ分析のために、血液試料をスピンダウンして、Ｈｕｍａｎ Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＩＶＤ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて血漿を分析した。データをｈＥＰＯとしてｎｇ／ｍｌで報告して、試料を３反復で分析した。図１３は、ＭＣ３、化合物２、及び化合物３を含むＬＮＰ製剤の静脈内投与後の２４時間目のＷＴ及びＫＯマウス肝臓におけるルシフェラーゼタンパク質の発現を示す一方、図１５は、ＭＣ３、化合物２、及び化合物３を含むＬＮＰ製剤の静脈内投与後の６時間目のＷＴ及びＫＯマウス血漿におけるｈＥＰＯタンパク質濃度を示す。
【0127】
実施例１０．ルシフェラーゼｍＲＮＡのＬＮＰ製剤の、マウスへのインビボ線条体内投与
ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有するＭＯＤ５及び化合物５（ＡＺ８６０８）ＬＮＰ製剤を、実施例６及び９に記載する類似した手順によって調製した。ここで、脂質成分は、ＭＯＤ５／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＤＭＰＥ－ＰＥＧ＝５０／３８．５／１０／１．５モル％；化合物５／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＤＭＰＥ－ＰＥＧ＝４２．５／４０／１６／１．５モル％である。ＬＮＰの特性評価を、表４に示す。
ルシフェラーゼｍＲＮＡを含有するＭＯＤ５及び化合物５（ＡＺ８６０８）ＬＮＰ製剤を、実施例６及び９に記載する類似した手順によって調製した。ここで、脂質成分は、ＭＯＤ５／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＤＭＰＥ－ＰＥＧ＝５０／３８．５／１０／１．５モル％；化合物５／コレステロール／ＤＳＰＣ／ＤＭＰＥ－ＰＥＧ＝４２．５／４０／１６／１．５モル％である。ＬＮＰの特性評価を、表４に示す。
【0128】
サイクリックリコンビナーゼ酵素（Ｃｒｅ）誘導性ルシフェラーゼ発現カセットを含有する自社生成リポーターマウス（ＬｏｘＰ Ｌｕｃ）を、標準的なランダム組込み遺伝子付加トランスジェネシスによって生成した。ＬＮＰ投与の前に、ＬｏｘＰ Ｌｕｃリポーターマウスを、イソフルラン４．０／１．５ Ｏ２ ｉにより麻酔をかけた。マウスに、２単位（２０μｌ）希釈したＣｏｍｆｏｒｉｏｎ Ｖｅｔ（１０ｍｇ／ｍｌ；１００μｇ／マウス）を、インスリンシリンジ（ＢＤ Ｕ－１００）により首皮膚下に皮下注射した。次に、毛皮をシェービングして、頭蓋骨をＤｅｓｃｕｔａｎスワブ（４％クロルヘキシジン）により洗浄してから、動物を、加熱パッド付き定位ボード上に置いた。マウスを適切にアタッチして、頭蓋骨を水平位置に調整して、開放孔付きプラスチックフィルムで頭蓋骨をカバーした。外科手術の間に、６～８ｍｍの切込みを、頭蓋骨の正中線内に実行して、前頂部周りの領域を乾燥させてから、正確な座標を算出した後にドリルを当該位置上に置いた。１又は２つの小さな孔を、正中線の両側の頭蓋骨に穿孔して、ポンプに、接触走性に対するＨａｍｉｌｔｏｎシリンジをアタッチした。シリンジを、ドリル孔の上に置いて、ゆっくり右側深くに降ろして、５μｌのＬＮＰ溶液を、孔あたり０．５μｌ／分のフローインジェクションポンプ率にて注入した。マウスに、局所脳線条体中へのマウスあたり５ｍＬの２回注射（半球あたり１回）により１．７ｍｇ ＲＮＡ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ／ｇＲＮＡ１／ｇＲＮＡ２ ５０／２５／２５ ｗ／ｗ）を投与した。インジェクタを、各注射後の３分間、適所に保持してから、シリンジをゆっくり上げて、ポンプ及びシリンジの双方を取り除いた。穿孔上の皮膚を閉じるために、２～３個のステッチ（Ｓｕｔｕｒｅ Ｐｏｌｙｓｏｒｂ ６－０）を、切込みに沿って置いた組織接着剤と共に用いた。動物を観察して、毎日秤量した。回復プロセス及び創傷治癒を、３～５日間密接に追った。７日後、双方の半球のエクスビボ脳ルシフェラーゼ分析を実行した。図１６は、ＭＯＤ５及び化合物５を含むＬＮＰ製剤の線条体内投与後の、ＬｏｘＰ Ｌｕｃリポーターマウスにおける皮質及び線条体平均Ｌｕｃ発現レベルを示す。
【0129】
【表4】
【0130】
タンパク質抽出及びルシフェラーゼアッセイ
ＬＮＰ投与の１週後、ＬｏｘＰ Ｌｕｃリポーターマウスを犠牲にして、脳全体を解剖して、線条体及び皮質を単離して、秤量して、別々のチューブ内に入れて、更なる分析まで凍結させた。ＬＮＰ媒介機能送達レベルを測定するために、タンパク質を、Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いてメーカーの推奨通りにマウス脳組織から抽出した。組織をクラッシュして、乳棒を動かして均質化して、遠心分離して、懸濁液から非可溶性の組織残渣を除去した。上清を別々のチューブに移して、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ実験によって求めた。ルシフェラーゼアッセイのために、２０μｌの各上清を、マイクロプレート（白色のＯｐｔｉＰｌａｔｅ－９６）に加え、そして１００μｌのＤ－ルシフェリンを各ウェルに加えた。試料を混合して、結果として生じた発光シグナルをルミノメータにより測定した。発光シグナルを、組織重量に対して正規化した。
ＬＮＰ投与の１週後、ＬｏｘＰ Ｌｕｃリポーターマウスを犠牲にして、脳全体を解剖して、線条体及び皮質を単離して、秤量して、別々のチューブ内に入れて、更なる分析まで凍結させた。ＬＮＰ媒介機能送達レベルを測定するために、タンパク質を、Ｑｉａｇｅｎ ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いてメーカーの推奨通りにマウス脳組織から抽出した。組織をクラッシュして、乳棒を動かして均質化して、遠心分離して、懸濁液から非可溶性の組織残渣を除去した。上清を別々のチューブに移して、タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ実験によって求めた。ルシフェラーゼアッセイのために、２０μｌの各上清を、マイクロプレート（白色のＯｐｔｉＰｌａｔｅ－９６）に加え、そして１００μｌのＤ－ルシフェリンを各ウェルに加えた。試料を混合して、結果として生じた発光シグナルをルミノメータにより測定した。発光シグナルを、組織重量に対して正規化した。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A-B】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【国際調査報告】