特表 2024-539989 抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-31

(54)【発明の名称】抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/13 20060101AFI20241024BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241024BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 1/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 15/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 9/10 20060101ALN20241024BHJP

【ＦＩ】

C07K1/13

A61K47/68

A61P35/00

A61P37/06

A61P31/00

A61P29/00

A61P35/02

A61P1/00

A61P11/00

A61P15/00

A61K39/395 C

A61K39/395 L

C12N9/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024524766

(86)(22)【出願日】2022-10-25

(85)【翻訳文提出日】2024-04-24

(86)【国際出願番号】 EP2022079787

(87)【国際公開番号】W WO2023072934

(87)【国際公開日】2023-05-04

(31)【優先権主張番号】21204588.4

(32)【優先日】2021-10-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523096827

【氏名又は名称】アラリス バイオテック アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(74)【代理人】

【識別番号】100118371

【弁理士】

【氏名又は名称】▲駒▼谷 剛志

(72)【発明者】

【氏名】アッティンガー－トラー、イザベラ

(72)【発明者】

【氏名】ベルトラン、ロマン

(72)【発明者】

【氏名】シュタルク、ラモナ

(72)【発明者】

【氏名】グラブロウスキ、ドラガン

(72)【発明者】

【氏名】スピッヒャー、フィリップ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC01

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC31

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA22

4C085DD81

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA72

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA70

(57)【要約】

本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－ペイロードコンジュゲートを作製する方法に関する。方法は、構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、式中、（Ｓｐ_１）は化学的スペーサーであるか又は存在せず；（Ｓｐ_２）は化学的スペーサーであるか又は存在せず；（Ｓｐ_３）は化学的スペーサーであるか又は存在せず；Ｋは、リジン又はリジン誘導体又はリジン模倣体であり；Ｂは、連結部分又はペイロードであり；該リンカーは、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；該抗体を、８０モル当量未満の該リンカーと接触させる。更に、本発明は、リジン残基を含む抗体－リンカーコンジュゲート、抗体－薬物コンジュゲート、及びリンカーコンストラクトに関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
前記リンカーが、前記リジン残基、前記リジン誘導体、又は前記リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して前記抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
前記抗体を、８０モル当量未満の前記リンカーと接触させる方法。

【請求項2】

前記リンカーをコンジュゲートするＧｌｎ残基が、ＩｇＧ抗体のＣ_Ｈ２ドメインのＧｌｎ残基Ｑ２９５（ＥＵ付番）である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＩｇＧ抗体が、グリコシル化ＩｇＧ抗体であり、特に、前記ＩｇＧ抗体が、Ｃ_Ｈ２ドメインの残基Ｎ２９７（ＥＵ付番）でグリコシル化されている、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記抗体を、２０モル当量又は２０モル当量未満の前記リンカーと接触させる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記抗体を、２～２０モル当量の前記リンカーと接触させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記抗体が、１～５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記トランスグルタミナーゼが、１～２０Ｕ／ｍｇ抗体の範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記抗体への前記リンカーのコンジュゲーションが、６～８．５の範囲のｐＨで達成される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び（Ｓｐ_３）が、それぞれ独立して、０～１２個のアミノ酸残基を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記リンカーが、２５個、２０個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個以下のアミノ酸残基を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記リンカーの正味電荷が、中性又は正である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記リンカーが、負に荷電したアミノ酸残基を含まない、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

Ｂが、連結部分である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記連結部分Ｂが、
・生体直交型マーカー基、又は
・架橋のための非生体直交型実体
を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記生体直交型マーカー基又は前記架橋のための非生体直交型実体が、
・－Ｎ－Ｎ≡Ｎ又は－Ｎ_３；
・Ｌｙｓ（Ｎ_３）；
・テトラジン；
・アルキン；
・歪みシクロオクチン；
・ＢＣＮ；
・歪みアルケン；
・光反応性基；
・アルデヒド；
・アシルトリフルオロボレート；
・タンパク質分解剤（「ＰＲＯＴＡＣ」）；
・シクロペンタジエン／スピロロシクロペンタジエン；
・チオ選択的求電子剤；
・－ＳＨ；及び
・システイン
からなる群から選択される少なくとも１つの分子又は部分からなるか又は含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

１つ以上のペイロードを前記連結部分Ｂにコンジュゲートする更なる工程を含む、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記１つ以上のペイロードが、クリック反応を介して前記連結部分Ｂにコンジュゲートされる、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

Ｂが、ペイロードである、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記ペイロードが、
・毒素；
・サイトカイン；
・成長因子；
・放射性核種；
・ホルモン；
・抗ウイルス剤；
・抗菌剤；
・蛍光色素；
・免疫調節／免疫賦活剤；
・半減期延長部分；
・溶解度増大部分；
・ポリマー－毒素コンジュゲート；
・核酸；
・ビオチン又はストレプトアビジン部分；
・ビタミン；
・タンパク質分解剤（「ＰＲＯＴＡＣ」）；
・標的結合部分；及び／又は
・抗炎症剤
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記毒素が、
・ピロロベンゾジアゼピン（例えば、ＰＢＤ）；
・アウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）；
・マイタンシノイド（例えば、マイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ４、ＤＭ２１）；
・デュオカルマイシン；
・ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤；
・ツブリシン；
・エンジイン（例えば、カリケアマイシン）；
・アントラサイクリン誘導体（ＰＮＵ）（例えば、ドキソルビシン）；
・ピロールベースのキネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）阻害剤；
・クリプトフィシン；
・薬物排出ポンプ阻害剤；
・サンドラマイシン；
・アマニチン（例えば、α－アマニチン）；及び
・カンプトテシン（例えば、エキサテカン、デルクステカン）
からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記化学的スペーサー（Ｓｐ_２）が、自壊性部分を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記自壊性部分が、前記ペイロードＢに直接結合している、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記自壊性部分が、ｐ－アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢＣ）部分又は自壊性アミノメチレンスペーサーを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。

【請求項24】

前記抗体が、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記抗体が、ブレンツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、イノツズマブ、アベルマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ダラツムマブ、ペルツズマブ、ベドリズマブ、オクレリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オビヌツズマブ、サシツズマブ、ベランタマブ、ポラツズマブ、及びエンホルツマブからなる群から選択される、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記リンカーが、前記抗体に含まれるＧｌｎ残基のγ－カルボキサミド基にコンジュゲートされる、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

前記リンカーが、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のコンジュゲーション効率でグリコシル化抗体にコンジュゲートするのに好適である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

前記トランスグルタミナーゼが、微生物トランスグルタミナーゼであり、好ましくはストレプトマイセス属の種、特にストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）に由来する、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法で生成された抗体－リンカーコンジュゲート。

【請求項30】

請求項２９に記載の抗体－リンカーコンジュゲートを含む医薬組成物。

【請求項31】

少なくとも１つの追加の治療的に活性のある剤を含む、請求項３０に記載の医薬組成物。

【請求項32】

治療及び／又は診断において使用するための、請求項２９に記載の抗体－リンカーコンジュゲート又は請求項３０若しくは３１に記載の医薬組成物であって、特に前記抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つのペイロードを含む、抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物。

【請求項33】

腫瘍性疾患、神経疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、又は感染性疾患
・に罹患している、
・を発症するリスクがある、及び／又は
・と診断された
患者の治療において使用するための、請求項２９に記載の抗体－リンカーコンジュゲート又は請求項３０若しくは３１に記載の医薬組成物であって、特に前記抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つの毒素を含む、抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物。

【請求項34】

前記抗体－リンカーコンジュゲートがポラツズマブを含み、前記腫瘍性疾患がＢ細胞関連がんである、請求項３３に記載の抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物。

【請求項35】

前記Ｂ細胞関連がんが非ホジキンリンパ腫であり、特に前記Ｂ細胞関連がんがびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、請求項３４に記載の抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物。

【請求項36】

前記抗体－リンカーコンジュゲートがトラスツズマブを含み、前記腫瘍性疾患がＨＥＲ２陽性がん、特にＨＥＲ２陽性の乳がん、胃がん、卵巣がん、又は肺がんである、請求項３３に記載の抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物。

【請求項37】

前記抗体－リンカーコンジュゲートがエンホルツマブ又はエンホルツマブバリアントを含み、前記腫瘍性疾患がネクチン－４陽性がん、特にネクチン－４陽性の膵臓がん、肺がん、膀胱がん、又は乳がんである、請求項３３に記載の抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを作製する方法に関する。本発明は更に、抗体－リンカーコンジュゲート、及び本発明の抗体－リンカーコンジュゲートを含む医薬組成物、並びにそれらの使用を提供する。

【背景技術】

【0002】

抗体－薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、通常、抗体と、化学リンカーを介して該抗体にコンジュゲートする低分子薬物とで構成される。数十年にわたる前臨床及び臨床研究の結果、再発性ホジキンリンパ腫及び全身性未分化大細胞リンパ腫に対するブレンツキシマブ・ベドチン（Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標））、急性骨髄性白血病に対するゲムツズマブ・オゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、ＨＥＲ２陽性転移性乳がんに対するアドトラスツズマブ・エムタンシン（Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標））、Ｂ細胞悪性腫瘍に対するイノツズマブ・オゾガマイシン（Ｂｅｓｐｏｎｓａ（登録商標））、そして最近ではポラツズマブ・ベドチン－ｐｉｉｑ（Ｐｏｌｉｖｙ（登録商標））等の一連のＡＤＣが特定の腫瘍型の治療について承認されている。最も最近では、エンホルツマブ・ベドチン（Ｐａｄｃｅｖ（登録商標））、トラスツズマブ・デルクステカン（Ｅｎｈｅｒｔｕ（登録商標））、サシツズマブ・ゴビテカン（Ｔｒｏｄｅｌｖｙ（登録商標））、及びベランタマブ・マファドチン（Ｂｌｅｎｒｅｐ（登録商標））が販売承認を受けている。ＡＤＣに関する総説については、例えば（Ｚｈａｏ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２０２０，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ，１０，１５８９－１６００）を参照されたい。多くのＡＤＣが印象的な抗がん作用を示す一方で、多くの患者がこれら治療に応答しなかったり、有効性の兆候が現れる前に重度の副作用を経験したり、一定期間後に再発を経験したりするため、好ましい薬物様特性を有し、薬物開発を支援するために十分な量及び質を合理的なコストで生産することができ、治療薬として好適な新規ＡＤＣフォーマットに対する医療上のニーズは依然として大きい。

【0003】

ＡＤＣの調製における重要な工程は、ペイロードの抗体への共有結合性コンジュゲート工程である。現在臨床開発されているＡＤＣのほとんどは、平均薬物対抗体比（ＤＡＲ）が３．５～４．０の範囲になるように平均修飾度を慎重に制御しながら、抗体の内因性のリジン又はシステインの残基にコンジュゲートすることによって作製されている。この比は、歴史的には、（ａ）非コンジュゲート抗体の量の最小化と、（ｂ）疎水性が高く溶解度が低いことから製造及び製剤化において問題となる可能性があり（Ｌａｍｂｅｒｔ ＪＭ ａｎｄ Ｂｅｒｋｅｎｂｉｌｔ Ａ．，２０１８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．６９，１９１－２０７）、典型的には、その結果薬物動態学的特性が悪化する（Ｌｙｏｎ ＲＰ，ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，３３，７３３－７３５）、混合物中のＤＡＲの非常に高い分子種の回避に基づいて選択されており、最近、部位特異的コンジュゲーションのための様々な遺伝的、化学的、及び酵素的な方法が開発され、抗体の未修飾又は過剰の修飾を避けながらＤＡＲを２（又は４）にすることができるようになっている。これら方法論の概要は、Ｙａｍａｄａらによって報告されている（Ｋｅｉ Ｙａｍａｄａ ａｎｄ Ｙｕｊｉ Ｉｔｏ，２０１９，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２０，２７２９－２７３９に概説）。

【0004】

酵素的コンジュゲーションが大きな関心を集めているが、その理由は、これらコンジュゲーション反応が通常迅速であり、部位特異的であり、かつ生理学的条件下で行うことができるためである。利用可能な酵素の中でも、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）という種由来の微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）は、抗体を含む機能性部分の従来の化学的タンパク質コンジュゲーションに代わる魅力的な選択肢として関心が高まっている。ＭＴＧは、生理学的条件下で、タンパク質又はペプチドの「反応性」グルタミンとタンパク質又はペプチドの「反応性」リジン残基との間のトランスアミド化反応を触媒するが、後者は５－アミノペンチル基等の単純で低分子量の第一級アミンであってもよい（Ｊｅｇｅｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４９，９９９５－９９９７）。

【0005】

Ｊｅｇｅｒらは、トランスグルタミナーゼを酵素として用いた抗体のコンジュゲーションはＱ２９５残基で起こるが、ＰＮＧａｓｅ Ｆでアスパラギン残基２９７（Ｎ２９７）の糖鎖部分を除去した際にのみコンジュゲーションが可能であり、グリコシル化抗体を効率的にコンジュゲートすることはできなかった（コンジュゲーション効率２０％未満）と述べている（Ｊｅｇｅｒ Ｓ．ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４９，９９９５－９９９７；Ｍｉｎｄｔ Ｔ．ｅｔ ａｌ．２００８，Ｂｉｏｃｏｎｊ Ｃｈｅｍ，９，２７１－２７８）。

【0006】

ＭＴＧを用いてＡＤＣを作製する他のアプローチは、残基Ｎ２９７がグリコシル化を受けることができないアミノ酸残基で置換されている、アグリコシル化抗体の使用に基づくものである。しかし、Ｎ２９７を別のアミノ酸で置換すると、Ｆｃドメイン全体の全体的な安定性（Ｓｕｂｅｄｉ ＧＰ ａｎｄ Ｂａｒｂ ＡＷ．，２０１５，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２３，１５７３－１５８３）及びコンジュゲート全体の有効性に影響を及ぼす可能性があるため、望ましくない効果をもたらす可能性がある。その結果、抗体の凝集が増加し、溶解度が低下する可能性があり、このことは特に疎水性ペイロードにとって重要になる。更に、Ｎ２９７に存在する糖鎖は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）等のエフェクター機能を誘発するので、重要な免疫調節効果を有する。これら免疫調節効果は、脱グリコシル化、又はアグリコシル化抗体を得るための上述した他のアプローチのいずれかによって失われてしまう。更に、確立された抗体の任意の配列を修飾すると規制上の問題につながる可能性があり、これは、多くの場合、承認され、臨床的に検証された抗体がＡＤＣコンジュゲーションの出発点として使用されることから問題となる。

【0007】

近年、Ｓｐｙｃｈｅｒらによって、ペイロードをコンジュゲートするために抗体を事前に脱グリコシル化する必要のないトランスグルタミナーゼベースのコンジュゲーションアプローチが開示された（Ｓｐｙｃｈｅｒら、国際公開第２０１９／０５７７７２号）。ネイティブなグリコシル化抗体をコンジュゲートできることは、製造面で大きな利点をもたらす：酵素的脱グリコシル化工程は、適正製造プロセス（ＧＭＰ）の観点からは望ましくないが、その理由は、脱グリコシル化酵素（例えば、ＰＮＧａｓｅ Ｆ）及び切断された糖鎖の両方が反応混合物から除去されていることを確認しなければならないためである。更に、ペイロードを結合させるために抗体を遺伝子操作する必要がないため、免疫原性を増大させ、抗体の全体的な安定性を低下させる可能性のある配列の挿入を避けることができる。

【0008】

以上に鑑みて、当技術分野では、高いコンジュゲーション効率でＡＤＣを作製するための改良された方法が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0009】

本発明は、本明細書で提供される実施形態及び特許請求の範囲において特徴付けられる。具体的には、本発明は、とりわけ以下の実施形態に関する：

【0010】

１．トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体を、８０モル当量未満の該リンカーと接触させる方法。

【0011】

２．該抗体を、２０モル当量又は２０モル当量未満の該リンカーと接触させる、実施形態１に記載の方法。

【0012】

３．該抗体を、２～２０モル当量の該リンカーと接触させる、実施形態１又は２に記載の方法。

【0013】

４．該抗体が、１～５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加される、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。

【0014】

５．該トランスグルタミナーゼが、１～２０Ｕ／ｍｇ抗体の範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加される、実施形態１～４のいずれか１つに記載の方法。

【0015】

６．該抗体への該リンカーのコンジュゲーションが、６～８．５の範囲のｐＨで達成される、実施形態１～５のいずれか１つに記載の方法。

【0016】

７．該化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び（Ｓｐ_３）が、それぞれ独立して、０～１２個のアミノ酸残基を含む、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法。

【0017】

８．該リンカーが、２５個、２０個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個以下のアミノ酸残基を含む、実施形態１～７のいずれか１つに記載の方法。

【0018】

９．該リンカーの正味電荷が、中性又は正である、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法。

【0019】

１０．該リンカーが、負に荷電したアミノ酸残基を含まない、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法。

【0020】

１１．Ｂが、連結部分である、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。

【0021】

１２．該連結部分Ｂが、
・生体直交型マーカー基、又は
・架橋のための非生体直交型実体
を含む、実施形態１１に記載の方法。

【0022】

１３．該生体直交型マーカー基又は該架橋のための非生体直交型実体が、
・－Ｎ－Ｎ≡Ｎ又は－Ｎ_３；
・Ｌｙｓ（Ｎ_３）；
・テトラジン；
・アルキン；
・歪みシクロオクチン；
・ＢＣＮ；
・歪みアルケン；
・光反応性基；
・アルデヒド；
・アシルトリフルオロボレート；
・タンパク質分解剤（「ＰＲＯＴＡＣ」）；
・シクロペンタジエン／スピロロシクロペンタジエン；
・チオ選択的求電子剤；
・－ＳＨ；及び
・システイン
からなる群から選択される少なくとも１つの分子又は部分からなるか又は含む、実施形態１２に記載の方法。

【0023】

１４．１つ以上のペイロードを該連結部分Ｂにコンジュゲートする更なる工程を含む、実施形態１１～１３のいずれか１つに記載の方法。

【0024】

１５．該１つ以上のペイロードが、クリック反応を介して該連結部分Ｂにコンジュゲートされる、実施形態１４に記載の方法。

【0025】

１６．Ｂが、ペイロードである、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法。

【0026】

１７．該ペイロードが、
・毒素；
・サイトカイン；
・成長因子；
・放射性核種；
・ホルモン；
・抗ウイルス剤；
・抗菌剤；
・蛍光色素；
・免疫調節／免疫賦活剤；
・半減期延長部分；
・溶解度増大部分；
・ポリマー－毒素コンジュゲート；
・核酸；
・ビオチン又はストレプトアビジン部分；
・ビタミン；
・タンパク質分解剤（「ＰＲＯＴＡＣ」）；
・標的結合部分；及び／又は
・抗炎症剤
のうちの少なくとも１つを含む、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の方法。

【0027】

１８．該毒素が、
・ピロロベンゾジアゼピン（例えば、ＰＢＤ）；
・アウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）；
・マイタンシノイド（例えば、マイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ４、ＤＭ２１）；
・デュオカルマイシン；
・ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤；
・ツブリシン；
・エンジイン（例えば、カリケアマイシン）；
・アントラサイクリン誘導体（ＰＮＵ）（例えば、ドキソルビシン）；
・ピロールベースのキネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）阻害剤；
・クリプトフィシン；
・薬物排出ポンプ阻害剤；
・サンドラマイシン；
・アマニチン（例えば、α－アマニチン）；及び
・カンプトテシン（例えば、エキサテカン、デルクステカン）
からなる群から選択される少なくとも１つである、実施形態１７に記載の方法。

【0028】

１９．該化学的スペーサー（Ｓｐ_２）が、自壊性部分を含む、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。

【0029】

２０．該自壊性部分が、該ペイロードＢに直接結合している、実施形態１９に記載の方法。

【0030】

２１．該自壊性部分が、ｐ－アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢＣ）部分又は自壊性アミノメチレンスペーサーを含む、実施形態１９又は２０に記載の方法。

【0031】

２２．該抗体が、ＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体である、実施形態１～２１のいずれか１つに記載の方法。

【0032】

２３．該リンカーをコンジュゲートするＧｌｎ残基が、該抗体のＦｃドメインに含まれ、特に、該リンカーをコンジュゲートするＧｌｎ残基が、ＩｇＧ抗体のＣ_Ｈ２ドメインのＧｌｎ残基Ｑ２９５（ＥＵ付番）である、実施形態２２に記載の方法。

【0033】

２４．該リンカーをコンジュゲートするＧｌｎ残基が、分子工学によって該抗体の重鎖又は軽鎖に導入されている、実施形態２２に記載の方法。

【0034】

２５．分子工学によって抗体の重鎖又は軽鎖に導入されているＧｌｎ残基が、アグリコシル化ＩｇＧ抗体のＣ_Ｈ２ドメインのＮ２９７Ｑ（ＥＵ付番）である、実施形態２４に記載の方法。

【0035】

２６．分子工学によって抗体の重鎖又は軽鎖に導入されているＧｌｎ残基が、（ａ）該抗体の重鎖若しくは軽鎖に組み込まれているか又は（ｂ）該抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端若しくはＣ末端に融合しているペプチドに含まれる、実施形態２４に記載の方法。

【0036】

２７．該Ｇｌｎ残基を含むペプチドが、該抗体の重鎖のＣ末端に融合している、実施形態２６に記載の方法。

【0037】

２８．該ＩｇＧ抗体が、グリコシル化ＩｇＧ抗体であり、特に該ＩｇＧ抗体がＣ_Ｈ２ドメインの残基Ｎ２９７（ＥＵ付番）でグリコシル化されている、実施形態２２～２４又は２６～２７のいずれか１つに記載の方法。

【0038】

２９．該抗体が、ブレンツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、イノツズマブ、アベルマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ダラツムマブ、ペルツズマブ、ベドリズマブ、オクレリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オビヌツズマブ、サシツズマブ、ベランタマブ、ポラツズマブ、及びエンホルツマブからなる群から選択される、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の方法。

【0039】

３０．該リンカーが、該抗体に含まれるＧｌｎ残基のγ－カルボキサミド基にコンジュゲートされる、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法。

【0040】

３１．該リンカーが、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のコンジュゲーション効率でグリコシル化抗体にコンジュゲートするのに好適である、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法。

【0041】

３２．該トランスグルタミナーゼが、微生物トランスグルタミナーゼであり、好ましくはストレプトマイセス属の種、特にストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）に由来する、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の方法。

【0042】

３３．実施形態１～３２のいずれか１つに記載の方法で生成された抗体－リンカーコンジュゲート。

【0043】

３４．実施形態３３に記載の抗体－リンカーコンジュゲートを含む医薬組成物。

【0044】

３５．少なくとも１つの追加の治療的に活性のある剤を含む、実施形態３４に記載の医薬組成物。

【0045】

３６．治療及び／又は診断において使用するための、実施形態３３に記載の抗体－リンカーコンジュゲート又は実施形態３４若しくは３５に記載の医薬組成物であって、特に該抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つのペイロードを含む、抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物。

【0046】

３７．腫瘍性疾患、神経疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、又は感染性疾患
・に罹患している、
・を発症するリスクがある、及び／又は
・と診断された
患者の治療において使用するための、実施形態３３に記載の抗体－リンカーコンジュゲート又は実施形態３４若しくは３５に記載の医薬組成物であって、特に該抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つの毒素を含む、抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物。

【0047】

３８．該抗体－リンカーコンジュゲートがポラツズマブを含み、該腫瘍性疾患がＢ細胞関連がんである、実施形態３７に記載の抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物。

【0048】

３９．該Ｂ細胞関連がんが非ホジキンリンパ腫であり、特に該Ｂ細胞関連がんがびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、実施形態３８に記載の抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物。

【0049】

４０．該抗体－リンカーコンジュゲートがトラスツズマブを含み、該腫瘍性疾患がＨＥＲ２陽性がん、特にＨＥＲ２陽性の乳がん、胃がん、卵巣がん、又は肺がんである、実施形態３７に記載の抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物。

【0050】

４１．該抗体－リンカーコンジュゲートがエンホルツマブ又はエンホルツマブバリアントを含み、該腫瘍性疾患がネクチン－４陽性がん、特にネクチン－４陽性の膵臓がん、肺がん、膀胱がん、又は乳がんである、実施形態３７に記載の抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物。

【発明を実施するための形態】

【0051】

従って、一実施形態においては、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体を、８０モル当量未満の該リンカーと接触させる方法に関する。

【0052】

すなわち、本発明は、少なくとも部分的には、最適化された反応条件下では、リジンベースのリンカーを極めて高い効率でグリコシル化抗体にコンジュゲートすることができるという驚くべき知見に基づく。特に、リンカー対抗体比を最適化すると、驚くほど高いコンジュゲーション効率が得られることが本発明者らによって示された。

【0053】

国際公開第２０１９／０５７７７２号において、リジンベースのペプチドリンカーをグリコシル化抗体にコンジュゲートできることが初めて実証された。効率的なコンジュゲーションを達成するためには、グリコシル化抗体を大過剰のリンカーと接触させなければならないと当技術分野では考えられていた。その結果、国際公開第２０１９／０５７７７２号では、コンジュゲーションを達成するために、グリコシル化抗体を８０モル当量のリジンベースのリンカーと接触させている。これまでの考えに反して、本発明者らは、驚くべきことに、リンカー対抗体比を下げるとグリコシル化抗体のコンジュゲーションが著しくより効率的になることを見出した。その結果、嵩高いペイロードを含む様々なリンカーの定量的なコンジュゲーションが一段階で達成された。

【0054】

特に、抗体を８０モル当量未満のリンカーと接触させると、コンジュゲーション効率が向上することが実証された。好ましい実施形態においては、抗体を７０モル当量未満のリンカーと接触させる。より好ましい実施形態においては、抗体を６０モル当量未満のリンカーと接触させる。更に好ましい実施形態においては、抗体を５０モル当量未満のリンカーと接触させる。更に好ましい実施形態においては、抗体を４０モル当量未満のリンカーと接触させる。更に好ましい実施形態においては、抗体を３０モル当量未満のリンカーと接触させる。更に好ましい実施形態においては、抗体を２０モル当量未満のリンカーと接触させる。更に好ましい実施形態においては、抗体を１５モル当量未満のリンカーと接触させる。最も好ましい実施形態においては、抗体を１０モル当量未満のリンカーと接触させる。

【0055】

あるいは、抗体を２～８０モル当量のリンカー、好ましくは２～７０モル当量のリンカー、より好ましくは２～６０モル当量のリンカー、更により好ましくは２～５０モル当量のリンカー、更により好ましくは２～４０モル当量のリンカー、更により好ましくは２～３０モル当量のリンカー、更により好ましくは２～２５モル当量のリンカー、更により好ましくは２～２０モル当量のリンカー、更により好ましくは２～１５モル当量のリンカー、更により好ましくは２～１０モル当量のリンカー、最も好ましくは２～８モル当量のリンカーと接触させてもよい。

【0056】

あるいは、抗体を２．５～８０モル当量のリンカー、好ましくは２．５～７０モル当量のリンカー、より好ましくは２．５～６０モル当量のリンカー、更により好ましくは２．５～５０モル当量のリンカー、更により好ましくは２．５～４０モル当量のリンカー、更により好ましくは２．５～３０モル当量のリンカー、更により好ましくは２．５～２５モル当量のリンカー、更により好ましくは２．５～２０モル当量のリンカー、更により好ましくは２．５～１５モル当量のリンカー、更により好ましくは２．５～１０モル当量のリンカー、最も好ましくは２．５～８モル当量のリンカーと接触させてもよい。

【0057】

抗体は、任意の濃度でコンジュゲーション反応に添加してよい。しかし、抗体を０．１～５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加することが好ましい。すなわち、特定の実施形態においては、本発明は、抗体を０．１～５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは１～５０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは１～２５ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは２．５～２０ｍｇ／ｍＬ、更により好ましくは５～２０ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは５～１７ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加する、本発明に係る方法に関する。

【0058】

本発明に係る方法は、好ましくは６～９の範囲のｐＨで実施される。従って、好ましい実施形態においては、本発明は、リンカーの抗体へのコンジュゲーションが６～８．５の範囲のｐＨで、より好ましくは６．５～８の範囲のｐＨで、更により好ましくは７～８の範囲のｐＨで達成される、本発明に係る方法に関する。最も好ましい実施形態においては、本発明は、リンカーの抗体へのコンジュゲーションがｐＨ７．６で達成される、本発明に係る方法に関する。

【0059】

本発明の方法は、ペイロードのリンカーへのコンジュゲーションに適した任意のバッファ中で実施することができる。本発明の方法に適したバッファとしては、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、又はＢｉｓＴｒｉｓのバッファが挙げられるが、これらに限定されない。バッファの濃度は、特に抗体及び／又はリンカーの濃度に依存し、１０～１０００ｍＭ、１０～５００ｍＭ、１０～４００ｍＭ、１０～２５０ｍＭ、１０～１５０ｍＭ、又は１０～１００ｍＭの範囲であってよい。更に、バッファは、本発明の方法を実施するのに適した任意の塩濃度を有していてもよい。例えば、本発明の方法において使用されるバッファは、≦１５０ｍＭ、≦１４０ｍＭ、≦１３０ｍＭ、≦１２０ｍＭ、≦１１０ｍＭ、≦１００ｍＭ、≦９０ｍＭ、≦８０ｍＭ、≦７０ｍＭ、≦６０ｍＭ、≦５０ｍＭ、≦４０ｍＭ、≦３０ｍＭ、≦２０ｍＭ、又は≦１０ｍＭの塩濃度を有していてもよく、又は塩を有していなくてもよい。特定の実施形態においては、本発明の方法は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）中、好ましくは無塩で実施される。

【0060】

最適な反応条件（例えば、ｐＨ、バッファ、塩濃度）はペイロードによって異なり得、リンカー及び／又はペイロードの物理化学的特性にある程度依存することに留意しなければならない。しかし、本発明の方法を実施するのに適した反応条件を特定するために、当業者が過度の実験を行う必要はない。

【0061】

トランスグルタミナーゼは、抗体とリンカーとを効率的にコンジュゲートさせることができる任意の濃度でコンジュゲーション反応に添加してよい。特定の実施形態においては、コンジュゲーション反応におけるトランスグルタミナーゼの濃度は、同じ反応において使用される抗体の量に依存し得る。例えば、トランスグルタミナーゼは、１００Ｕ／ｍｇ抗体未満、９０Ｕ／ｍｇ抗体未満、８０Ｕ／ｍｇ抗体未満、７０Ｕ／ｍｇ抗体未満、６０Ｕ／ｍｇ抗体未満、５０Ｕ／ｍｇ抗体未満、４０Ｕ／ｍｇ抗体未満、３０Ｕ／ｍｇ抗体未満、２０Ｕ／ｍｇ抗体未満、１０Ｕ／ｍｇ抗体未満、又は６Ｕ／ｍｇ抗体未満の濃度でコンジュゲーション反応に添加してよい。特定の実施形態においては、トランスグルタミナーゼを１Ｕ／ｍｇ抗体、３Ｕ／ｍｇ抗体、５Ｕ／ｍｇ抗体、又は６Ｕ／ｍｇ抗体の濃度でコンジュゲーション反応に添加してよい。

【0062】

すなわち、特定の実施形態においては、トランスグルタミナーゼは、１～２０Ｕ／ｍｇ抗体、好ましくは１～１０Ｕ／ｍｇ抗体、より好ましくは１～７．５Ｕ／ｍｇ抗体、更により好ましくは２～６Ｕ／ｍｇ抗体、更により好ましくは２～４Ｕ／ｍｇ抗体、最も好ましくは３Ｕ／ｍｇ抗体の範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加してよい。

【0063】

本発明に係る方法は、好ましくは微生物トランスグルタミナーゼによって触媒される。しかし、非微生物起源のトランスグルタミナーゼ活性を有する酵素によって同等の反応を実施できることに留意されたい。従って、本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲートは、非微生物起源のトランスグルタミナーゼ活性を有する酵素を用いて作製することができる。

【0064】

本出願は、上に開示したリンカー、抗体、トランスグルタミナーゼ、及び／又はバッファ濃度の任意の組み合わせを包含することを理解されたい。

【0065】

好ましい実施形態においては、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体を、２～７０モル当量の該リンカーと接触させ；及び／又は該抗体を、０．１～５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加し；そして任意で、該トランスグルタミナーゼを１～２０Ｕ／ｍｇ抗体の範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加する方法に関する。

【0066】

より好ましい実施形態においては、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体を、２～５０モル当量の該リンカーと接触させ；及び／又は該抗体を、１～５０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加し；そして任意で、該トランスグルタミナーゼを１～２０Ｕ／ｍｇ抗体の範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加する方法に関する。

【0067】

更により好ましい実施形態においては、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体を、２～２５モル当量の該リンカーと接触させ；及び／又は該抗体を、２．５～２５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加し；そして任意で、該トランスグルタミナーゼを１～１５Ｕ／ｍｇ抗体の範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加する方法に関する。

【0068】

更により好ましい実施形態においては、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体を、２～２０モル当量の該リンカーと接触させ；及び／又は該抗体を、２．５～２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加し；そして任意で、該トランスグルタミナーゼを１～１５Ｕ／ｍｇ抗体の範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加する方法に関する。

【0069】

更により好ましい実施形態においては、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体を、２．５～１５モル当量の該リンカーと接触させ；及び／又は該抗体を、２．５～２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加し；そして任意で、該トランスグルタミナーゼを１～１０Ｕ／ｍｇ抗体の範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加する方法に関する。

【0070】

更により好ましい実施形態においては、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体を、２．５～１０モル当量の該リンカーと接触させ；及び／又は該抗体を、５～２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加し；そして任意で、該トランスグルタミナーゼを２～１０Ｕ／ｍｇ抗体の範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加する方法に関する。

【0071】

最も好ましい実施形態においては、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体を、２．５～８モル当量の該リンカーと接触させ；及び／又は該抗体を、５～１７ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加し；そして任意で、該トランスグルタミナーゼを２～１０Ｕ／ｍｇ抗体の範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加する方法に関する。

【0072】

別の実施形態においては、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体を、５～４０モル当量の該リンカーと接触させ；及び／又は該抗体を、５～１７ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加し；そして任意で、該トランスグルタミナーゼを２～１０Ｕ／ｍｇ抗体の範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加する方法に関する。

【0073】

別の実施形態においては、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体を、５～２０モル当量の該リンカーと接触させ；及び／又は該抗体を、５～１７ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加し；そして任意で、該トランスグルタミナーゼを２～１０Ｕ／ｍｇ抗体の範囲の濃度でコンジュゲーション反応に添加する方法に関する。

【0074】

本発明において好ましいのは、リンカーが構造（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）を含み、リンカーの残基Ｋに含まれる第一級アミンを介してリンカーが抗体中のグルタミン残基にコンジュゲートすることである。特定の実施形態においては、残基Ｋはリジン残基である。しかし、特定の実施形態においては、残基Ｋはリジン模倣体又はリジン誘導体であってもよいが、ただし、該リジン模倣体又は該リジン誘導体は、そのアミノ酸側鎖に第一級アミンを含む。

【0075】

従って、特定の実施形態においては、残基Ｋはリジン模倣体であってもよい。「リジン模倣体」という用語は、本明細書で使用される場合、リジンと異なる構造を有するが、リジンと類似の特性を有し、従って、ペプチド又はタンパク質の機能及び／又は構造を大きく変化させることなく該ペプチド又はタンパク質中のリジンを置換するために使用することができる化合物を指す。特定の実施形態においては、リジン模倣体は、第一級アミンとα－炭素原子とを接続する脂肪族鎖の長さ又は組成がリジンと異なる場合がある。従って、特定の実施形態においては、リジン模倣体は、オルニチン、２，３－ジアミノプロピオン酸、２，４－ジアミノ酪酸、２，５－ジアミノペンタン酸、２，６－ジアミノヘキサン酸、又は２，７－ジアミノヘプタン酸であり得る。特定の実施形態においては、リジン模倣体は、β－ホモリジン等のβ－アミノ酸であってもよい。

【0076】

特定の実施形態においては、残基Ｋはリジン誘導体であってもよい。「リジン誘導体」という用語は、本明細書で使用される場合、リジン又はリジン模倣体に含まれる１つ以上の官能基が修飾又は置換されているリジン又はリジン模倣体を指す。本発明では、リジン誘導体の側鎖におけるアミノ基は修飾されず、その結果、タンパク質におけるグルタミン残基へのコンジュゲートに利用可能になることが好ましい。実施形態においては、残基ＫがリンカーのＣ末端位置に位置する場合、Ｋは、α－カルボキシル基が修飾又は置換されたリジン誘導体となり得る。特定の実施形態においては、リジン模倣体のα－カルボキシル基はアミド化されてもよい。

【0077】

本発明において、リジンベースのリンカーは、構造（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）を有し得る。すなわち、リンカーは、１つ以上の化学的スペーサー（Ｓｐ）を含んでいてよい。「化学的スペーサー」という用語は、本発明で使用される場合、リンカーの化学残基に共有結合している及び／又はリンカーの２つの化学残基の間に介在している化学部分を表す。

【0078】

特定の実施形態においては、本発明は、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び（Ｓｐ_３）が、それぞれ独立して、０～１２個のアミノ酸残基を含む、本発明に係る方法に関する。

【0079】

すなわち、特定の実施形態においては、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）及び／又は（Ｓｐ_３）は、存在していてもよく、存在していなくてもよい。（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）が存在する実施形態においては、（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。そのような実施形態においては、（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）はそれぞれ、０～１２個のアミノ酸残基を含み得る。化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、非アミノ酸残基を含んでいてもよいことに留意しなければならず、これについては以下により詳細に開示する。

【0080】

化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）に含まれる「アミノ酸残基」は、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体であってよい。アミノ酸という用語は、α－アミノ酸だけでなく、β－、γ－、又はδ－アミノ酸等の他のアミノ酸も包含することを理解されたい。α－アミノ酸残基は、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）中にそのＬ－又はＤ－形態で存在し得る。実施形態においては、（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）がキラルβ－、γ－、又はδ－アミノ酸を含む場合、キラルβ－、γ－、又はδ－アミノ酸は、そのＳ－又はＲ－形態で存在し得る。従って、その最も広義の意味において、「アミノ酸残基」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ基（－ＮＨ_２）及びカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を含有する任意の有機化合物を指し得る。従って、本開示を通して「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」に言及するときは常に、アミノ酸残基という用語は、アミノ酸の模倣体又は誘導体も包含し得ることを理解されたい。

【0081】

更に、アミノ酸残基という用語は、タンパク質原性アミノ酸の既知のセット、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンに限定されるものではなく、非標準アミノ酸及び非天然アミノ酸も包含する。「非標準アミノ酸」とは、本発明で使用される場合、タンパク質を構成するアミノ酸（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）のセットの一部ではないが、天然源から得ることができる任意のアミノ酸であり得る。しかし、非標準アミノ酸の中には、天然に存在するペプチド及び／又はタンパク質中にみられるものもあることに留意しなければならない。

【0082】

「非天然アミノ酸」又は「合成アミノ酸」は、本発明で使用される場合、アミノ酸の一般的な定義に該当する、すなわち、アミノ基及びカルボキシル基を含むが、自然界にはみられない任意の分子であり得る。従って、非天然アミノ酸は、化学合成によって得られることが好ましい。非標準アミノ酸と非天然アミノ酸との区別は、場合によっては不確実である場合もあることを理解されたい。例えば、非天然アミノ酸として定義されたアミノ酸が、後の時点で自然界において同定され、非標準アミノ酸として再分類されることもある。

【0083】

非標準アミノ酸又は非天然アミノ酸の例は、Ｄ－アミノ酸（Ｄ－アラニン、Ｄ－アルギニン、Ｄ－メチオニン等）、ホモアミノ酸（ホモセリン、ホモアルギニン、ホモシステイン、α－アミノアジピン酸等）、Ｎ－メチル化アミノ酸（サルコシン、Ｎ－Ｍｅ－ロイシン等）、α－メチルアミノ酸（α－メチル－ヒスチジン、α－アミノイソ酪酸等）、β－アミノ酸（β－アラニン、Ｄ－３－アミノイソ酪酸、Ｌ－β－ホモアラニン等）、γ－アミノ酸（γ－アミノ酪酸等）、アラニンの模倣体又は誘導体（β－シクロプロピルアラニン、フェニルグリシン、デヒドロ－アラニン、β－シアノアラニン、β－（３－ピリジル）－アラニン、β－（１，２，４－トリアゾール－１－イル）－アラニン、β－（１－ピペラジニル）－アラニン等）、フェニルアラニンの模倣体又は誘導体（４－ヨードフェニルアラニン、ペンタフルオロ－フェニルアラニン、ナフチル－アラニン、４－アミノフェニルアラニン等）、アルギニンの模倣体又は誘導体（β－ウレイドアラニン、ω－メチルアルギニン等）、リジンの模倣体又は誘導体（（３－（３－メチル－３Ｈ－ジアジリン－３－イル）プロパミノ）カルボニル－Ｌ－リジン、Ｎε，Ｎε，Ｎε－トリメチルリジン等）、ヒスチジンの模倣体又は誘導体（２，５－ジ－ヨードヒスチジン、１－メチルヒスチジン等）、チロシンの模倣体又は誘導体（３－アミノチロシン、チロニン、３，５－ジニトロチロシン、３－ヒドロキシ－メチル－チロシン、Ｏ－ホスホ－Ｌ－チロシン等）、トリプトファンの模倣体又は誘導体（５－ヒドロキシトリプトファン、１－メチルトリプトファン等）、セリンの模倣体又は誘導体（β－（２－チエニル）－セリン、β－（３，４－ジヒドロキシフェニル）－セリン、Ｏ－ホスホセリン等）、スレオニンの模倣体又は誘導体（アロ－スレオニン、Ｏ－ホスホスレオニン等）、プロリンの模倣体又は誘導体（ヒドロキシプロリン、３，４－デヒドロ－プロリン、ピログルタミン酸、チアプロリン、シス－オクタヒドロインドール－２－カルボン酸等）、ロイシン及びイソロイシンの模倣体又は誘導体（アロ－イソロイシン、ノルロイシン、４，５－デヒドロロイシン、（４Ｓ）－４－ヒドロキシ－Ｌ－イソロイシン等）、バリンの模倣体又は誘導体（ノルバリン、γ－ヒドロキシバリン等）、シトルリンの模倣体又は誘導体（チオシトルリン、ホモシトルリン等）、システインの模倣体又は誘導体（ペニシラミン、セレノシステイン、ブチオニン－スルホキシミン等）、メチオニンの模倣体又は誘導体（Ｓ－メチルメチオニン、Ｌ－メチオニンスルホン、Ｌ－メチオニンスルホキシド、Ｌ－メチオニンスルホ－キシミン、セレノメチオニン等）、アスパラギン酸の模倣体又は誘導体（ＤＬ－スレオ－β－ヒドロキシアスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン酸β－メチルエステル等）、グルタミン酸の模倣体又は誘導体（γ－メチレングルタミン酸、γ－カルボキシグルタミン酸等、γ－ヒドロキシグルタミン酸、Ｌ－グルタミン酸５－メチルエステル、Ｌ－２－アミノヘプタン二酸等）、アスパラギンの模倣体又は誘導体（Ｌ－スレオ－３－ヒドロキシアスパラギン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｌ－アスパラギン、Ｌ－２－アミノ－２－カルボキシエタンスルホンアミド、５－ジアゾ－４－オキソ－Ｌ－ノルバリン等）、グルタミンの模倣体又は誘導体（４－Ｆ－（２Ｓ，４Ｒ）－フルオログルタミン、γ－グルタミルメチルアミド、テアニン、Ｌ－グルタミン酸γ－モノヒドロキサメート等）、環状部分を含むアミノ酸（４－アミノピペリジン－４－カルボン酸、アゼチジン－２－カルボン酸、ピペコリン酸、１－アミノシクロペンタンカルボン酸、スピナシン等）、又は生体直交型部分を含むアミノ酸（プロパルギルグリシン、α－アリルグリシン、Ｌ－アジド－ホモアラニン、ｐ－ベンゾイル－ｌ－フェニルアラニン、ｐ－２－フルオロアセチル－ｌ－フェニルアラニン、（Ｓ）－２－アミノ－３－（４－（６－メチル－１，２，４，５－テトラジン－３－イル）フェニル）プロパン酸等）であり得るが、これらに限定されない。

【0084】

上述のα－アミノ酸の他に、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、１つ以上のβ－、γ－、δ－、又はε－アミノ酸を含んでいてもよい。従って、特定の実施形態においては、リンカーはペプチド模倣体であってもよい。ペプチド模倣体は、２つのα－アミノ酸間に形成される古典的なペプチド結合のみを含むのではなくてもよく、それぞれα－アミノ酸とβ－、γ－、δ－、若しくはε－アミノ酸との間又は２つのβ－、γ－、δ－、若しくはε－アミノ酸の間に形成される１つ以上のアミド結合を追加的に又は代わりに含んでいてもよい。従って、リンカーがペプチドであると記載されている本発明のいずれの例においても、リンカーはペプチド模倣体であってもよく、従って、α－アミノ酸のみからなるのではなく、代わりに１つ以上のβ－、γ－、δ－、若しくはε－アミノ酸又はアミノ酸として分類されない分子を含んでいてもよいことを理解されたい。本発明のリンカーに含まれ得るβ－、γ－、δ－、又はε－アミノ酸の例としては、β－アラニン、γ－アミノ酪酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－５－フェニルペンタン酸、４－アミノ－３－ヒドロキシ－６－メチルヘプタン酸、６－アミノヘキサン酸、及びスタチンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0085】

更に、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、アミノ酸誘導体及び／又はアミノ酸模倣体を含み得る。（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）が１つ以上のアミノ酸誘導体を含む実施形態においては、アミノ酸誘導体は、ペプチド結合又はイソペプチド結合の形成を受けることができるように遊離アミノ基及びカルボキシル基を有することが好ましい。（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）が１つ以上のアミノ酸模倣体を含む実施形態においては、アミノ酸模倣体は、ペプチド結合又はイソペプチド結合の形成を受けることができるように遊離アミノ基及びカルボキシル基を有し得る。しかし、特定の実施形態においては、アミノ酸の模倣体又は誘導体は、ペプチド結合の形成を妨げない置換アミノ基を有していてもよい。このようなアミノ酸の模倣体又は誘導体の例は、サルコシン又はＮ－Ｍｅ－ロイシン等のＮ－メチル化アミノ酸であってよい。

【0086】

（Ｓｐ_１）又は（Ｓｐ_３）に含まれるアミノ酸残基が末端アミノ酸残基である実施形態においては、末端アミノ酸残基は、修飾、保護、又は置換されたＮ末端アミノ基又はＣ末端カルボキシル基を含み得る。

【0087】

更に、アミノ酸の模倣体又は誘導体は、誘導体化されたアミノ基を含むアミノ酸、例えば、プロリン、又はアゼチジン－２－カルボン酸、ピペコリン酸、若しくはスピナシン等の他の環状アミノ酸の模倣体又は誘導体であってもよい。更に、アミノ酸模倣体は、標準的なアミノ酸のアミノ基及び／又はカルボキシル基に置き換わる他の官能基を含んでいてもよく、これにより、アミノ酸模倣体は、隣接するアミノ酸、アミノ酸誘導体、及び／又はアミノ酸模倣体との別の結合の形成を受け、ペプチド模倣体を形成することができるようになる。

【0088】

「アミノ酸模倣体」という用語は、本発明で使用される場合、特定のアミノ酸とは異なる構造を有するが、該特定のアミノ酸と同様に機能するので、該特定のアミノ酸を置換するために使用することができる化合物を指す。アミノ酸模倣体は、それが模倣するアミノ酸と少なくともある程度類似した構造的及び／又は機能的特徴を満たす場合、特定のアミノ酸と同様に機能するといわれる。「アミノ酸誘導体」という用語は、アミノ酸に含まれる１つ以上の官能基（複数可）が修飾又は置換されている、本明細書で定義されるアミノ酸を指す。アミノ酸誘導体は、タンパク質を構成するアミノ酸（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）又は非標準アミノ酸の誘導体であることが好ましい場合がある。アミノ酸誘導体の任意の官能基が置換又は修飾されていてもよい。

【0089】

リンカーが１つ以上の末端アミノ酸残基（複数可）を含む実施形態においては、末端アミノ酸残基が保護されていてもよい。例えば、（Ｓｐ_１）がＮ末端アミノ酸残基を含む実施形態においては、Ｎ末端アミノ基が保護されていてもよい。例えば、特定の実施形態においては、スペーサー（Ｓｐ_１）に含まれるＮ末端アミノ酸残基がアセチル化されていてもよい。他の実施形態においては、リジン残基Ｋは、リンカーのＮ末端アミノ酸であり得る。そのような実施形態においては、リジン、リジン模倣体、又はリジン誘導体のＮ末端アミノ基は、例えばアセチル化によって保護されていてよい。特定の実施形態においては、連結部分Ｂ又はペイロードＢは、アミノ酸であってもよく、又はアミノ酸をベースにしていてもよい。そのような実施形態においては、アミノ酸ベースのペイロード又は連結部分ＢのＮ末端アミノ基は、例えばアセチル化によって保護されていてよい。

【0090】

同様に、（Ｓｐ_３）がＣ末端アミノ酸残基を含む実施形態においては、Ｃ末端カルボキシル基が保護されていてもよい。例えば、特定の実施形態においては、スペーサー（Ｓｐ_３）のＣ末端アミノ酸残基がアミド化されていてもよい。他の実施形態においては、Ｋ残基はリンカーのＣ末端アミノ酸であり得る。そのような実施形態においては、リジン、リジン模倣体、又はリジン誘導体のＣ末端カルボキシル基は、例えばアミド化によって保護されていてよい。特定の実施形態においては、連結部分Ｂ又はペイロードＢは、アミノ酸であってもよく、又はアミノ酸をベースにしていてもよい。そのような実施形態においては、アミノ酸ベースのペイロード又は連結部分ＢのＣ末端カルボキシル基は、例えばアミド化によって保護されていてよい。

【0091】

特定の実施形態においては、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）はそれぞれ、アミノ酸誘導体及びアミノ酸模倣体を含む、０～１２個のアミノ酸残基を含み得る。すなわち、特定の実施形態においては、（Ｓｐ_１）は、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個のアミノ酸残基を含んでいてよく、（Ｓｐ_２）は、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個のアミノ酸残基を含んでいてよく、（Ｓｐ_３）は、０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、又は１２個のアミノ酸残基を含んでいてよい。

【0092】

特定の実施形態においては、本発明は、リンカーが２５個、２０個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個以下のアミノ酸残基を含む、本発明に係る方法に関する。

【0093】

すなわち、特定の実施形態においては、リンカーは、アミノ酸模倣体及びアミノ酸誘導体を含む、２５個、２４個、２３個、２２個、２１個、２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、又は２個のアミノ酸残基を含み得る。アミノ酸模倣体及びアミノ酸誘導体を含むリンカーに含まれるアミノ酸残基は、好ましくは、Ｋ残基中、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）中、並びに特定の実施形態においては、Ｂがアミノ酸ベースの連結部分又はペイロードである場合にはＢ中にも含まれるアミノ酸残基であることを理解されたい。

【0094】

特定の実施形態においては、リンカーは、アミノ酸模倣体及びアミノ酸誘導体を含む、２～２５個のアミノ酸残基を含み得る。他の実施形態においては、リンカーは、２～２０個の、アミノ酸模倣体及びアミノ酸誘導体を含むアミノ酸残基を含み得る。他の実施形態においては、リンカーは、２～１５個の、アミノ酸模倣体及びアミノ酸誘導体を含むアミノ酸残基を含み得る。他の実施形態においては、リンカーは、２～１０個の、アミノ酸模倣体及びアミノ酸誘導体を含むアミノ酸残基を含み得る。他の実施形態においては、リンカーは、３～１０個の、アミノ酸模倣体及びアミノ酸誘導体を含むアミノ酸残基を含み得る。他の実施形態においては、リンカーは、３～８個の、アミノ酸模倣体及びアミノ酸誘導体を含むアミノ酸残基を含み得る。他の実施形態においては、リンカーは、３～６個の、アミノ酸模倣体及びアミノ酸誘導体を含むアミノ酸残基を含み得る。

【0095】

特定の実施形態においては、本発明は、リンカーの正味電荷が中性又は正である、本発明に係る方法に関する。

【0096】

特定の実施形態においては、リンカーは、ペプチドリンカー（又は本明細書に開示されるペプチド模倣体）である。すなわち、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、存在する場合、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体のみからなる。ペプチドの正味電荷は、通常、中性ｐＨ（７．０）で計算される。最も単純なアプローチでは、正に荷電したアミノ酸残基（Ａｒｇ及びＬｙｓ、及び任意でＨｉｓ）の数と負に荷電したアミノ酸残基（Ａｓｐ及びＧｌｕ）の数を足し、２つの群の差を計算することによって正味電荷を求める。リンカーが、荷電官能基が修飾又は置換されている非標準アミノ酸又はアミノ酸誘導体を含む場合、当業者は、中性ｐＨにおける非標準アミノ酸又はアミノ酸誘導体の荷電を求める方法について認識している。

【0097】

特定の実施形態においては、ペイロード若しくは連結部分Ｂ、又は（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／若しくは（Ｓｐ_３）に含まれる任意の非アミノ酸部分もまた、リンカーの正味電荷に寄与し得る。しかし、当業者は、好ましくは中性ｐＨ（７．０）で、任意の非アミノ酸部分を含むリンカー全体の正味電荷を計算する方法について認識している。

【0098】

特定の実施形態においては、リンカーの正味電荷は、アミノ酸模倣体及びアミノ酸誘導体を含むリンカーに含まれるアミノ酸残基のみに基づいて計算される。従って、特定の実施形態においては、本発明は、リンカーに含まれるアミノ酸残基の正味電荷が中性又は正である、本発明に係る方法に関する。

【0099】

特定の実施形態においては、本発明は、リンカーが負に荷電したアミノ酸残基を含まない、本発明に係る方法に関する。

【0100】

すなわち、リンカーは、アミノ酸模倣体及びアミノ酸誘導体を含む、負に荷電したアミノ酸残基を含んでいなくてもよい。負に荷電した有するアミノ酸残基とは、中性ｐＨ（７．０）で負電荷を有するアミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体である。負に荷電した標準アミノ酸は、グルタミン酸及びアスパラギン酸である。しかし、負に荷電した非標準アミノ酸、アミノ酸模倣体、及びアミノ酸誘導体は当技術分野で公知である。

【0101】

特定の実施形態においては、本発明は、リンカーが、残基Ｋ以外に少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸残基を含む、本発明に係る方法に関する。すなわち、（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、少なくとも１つの正に荷電したアミノ酸を含み得る。特定の実施形態においては、（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、少なくとも１つのヒスチジン又はアルギニンの残基を含む。しかし、本明細書では、リンカーが配列モチーフＲＫ（式中、Ｒは、アルギニン、アルギニン模倣体、又はアルギニン誘導体であり、Ｋは、リジン、リジン模倣体、又はリジン誘導体である）を含まないことが好ましい。すなわち、特に好ましい実施形態においては、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体を、８０モル当量未満の該リンカーと接触させ；
該残基Ｋが、Ｎ末端のアルギニン、アルギニン模倣体、又はアルギニン誘導体に直接カップリングされていない方法に関する。

【0102】

特定の実施形態においては、（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、少なくとも１つのヒスチジン残基を含む。特定の実施形態においては、ヒスチジン残基は、リジン残基、リジン模倣体、又はリジン誘導体に直接連結される。すなわち、特定の実施形態においては、本発明に係るリンカーは、モチーフＨＫを含む。

【0103】

特定の実施形態においては、本発明は、トランスグルタミナーゼを用いて抗体－リンカーコンジュゲートを生成する方法であって、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むか又はからなるリンカーを抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートする工程を含み、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該抗体が、８０モル当量未満の該リンカーと接触させられ；
該リンカーが、少なくとも１つのヒスチジン残基を含み、特に、該少なくとも１つのヒスチジン残基が、残基Ｋに直接連結され、特に、該リンカーが、配列モチーフＨＫを含む方法に関する。

【0104】

特定の実施形態においては、本発明は、以下の構造（Ｎ→Ｃ方向に示す）：
（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）
を含むか又はからなるリンカーを含む抗体コンジュゲートであって、
・（Ｓｐ_１）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_２）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・（Ｓｐ_３）が、化学的スペーサーであるか又は存在せず；
・Ｋが、リジン、又はリジン誘導体、又はリジン模倣体であり；
・Ｂが、連結部分又はペイロードであり；
該リンカーが、該リジン残基、該リジン誘導体、又は該リジン模倣体の側鎖に含まれる第一級アミンを介して該抗体中に含まれるＧｌｎ残基にコンジュゲートされ；
該リンカーが、少なくとも１つのヒスチジン残基を含み、特に、該少なくとも１つのヒスチジン残基が、残基Ｋに直接連結され、特に、該リンカーが、配列モチーフＨＫを含むコンジュゲートに関する。

【0105】

アミノ酸の模倣体及び誘導体を含むアミノ酸残基の他に又はその代わりに、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、非アミノ酸部分を含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。

【0106】

すなわち、特定の実施形態においては、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体のみからなっていなくてもよい。すなわち、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、非アミノ酸成分を含んでいてもよく、非アミノ酸成分のみからなっていてもよい。特定の実施形態においては、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、アミノ酸成分及び非アミノ酸成分を含み得る。

【0107】

例えば、限定するものではないが、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）はそれぞれ、１～２００個の原子の骨格を含む炭素、任意で、１つ以上の原子において置換された少なくとも１０個の原子、例えば１０～１００個の原子又は２０～１００個の原子の骨格を含む炭素を含んでいてよく、任意で、該骨格を含む炭素は、直鎖状炭化水素であるか、あるいは環状基、対称若しくは非対称に分岐した炭化水素、単糖、二糖、直鎖状若しくは分岐したオリゴ糖（非対称に分岐又は対称に分岐）、他の天然の直鎖状若しくは分岐状オリゴマー（非対称に分岐又は対称に分岐）、又はより一般的には、任意の連鎖成長若しくは段階成長重合プロセスから得られる任意の二量体、三量体、若しくはそれ以上のオリゴマー（直鎖状、非対称に分岐、又は対称に分岐）を含む。

【0108】

（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、任意の直鎖状、分岐状及び／又は環状のＣ_２－３０アルキル、Ｃ_２－３０アルケニル、Ｃ_２－３０アルキニル、Ｃ_２－３０ヘテロアルキル、Ｃ_２－３０ヘテロアルケニル、Ｃ_２－３０ヘテロアルキニル（任意で、１つ以上の同素環式芳香族化合物ラジカル又は複素環式化合物ラジカルが挿入されていてもよい）；特に、任意の直鎖状若しくは分岐状のＣ_２－５アルキル、Ｃ_５－１０アルキル、Ｃ_{１１－２０}アルキル、－Ｏ－Ｃ_１－５アルキル、－Ｏ－Ｃ_５－１０アルキル、－Ｏ－Ｃ_{１１－２０}アルキル、又は（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－）_１－２４、又は（ＣＨ_２）_ｘ１－（ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２）_１－２４－（ＣＨ_２）_ｘ２－基（式中、ｘ１及びｘ２は、独立して、０～２０の範囲から選択される整数である）、アミノ酸、オリゴペプチド、糖鎖、サルフェート、ホスフェート、又はカルボキシレートであってよい。幾つかの実施形態においては、（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、Ｃ_２－６アルキル基を含み得る。

【0109】

特定の実施形態においては、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、ポリ（カルボキシベタインメタクリレート）（ｐＣＢＭＡ）、ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリビニルピロリドン、又はポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ｐＨＥＭＡ）等の１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分又は同等の縮合ポリマーを含み得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、工業製造から医薬品にいたる多くの用途を有するポリエーテル化合物である。ＰＥＧは、その分子量によってポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）又はポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られている。ＰＥＧの構造は、一般にＨ－（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎ－ＯＨと表される。当業者は、縮合ポリマーをアミノ酸残基又はペイロードにカップリングすることができるように官能化する方法を認識している。

【0110】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、リンカーが１つ以上のＰＥＧ部分を含む、本発明に係る方法に関する。特定の実施形態においては、ＰＥＧ部分は、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）中に含まれ得る。特定の実施形態においては、リンカー中に含まれる各ＰＥＧ部分は、２～２０個のエチレングリコールモノマー、２～１５個のエチレングリコールモノマー、２～１０個のエチレングリコールモノマー、又は２～５個のエチレングリコールモノマーを含み得る。特定の実施形態においては、ＰＥＧ部分は、連結部分又はペイロードをＫ残基に直接接続させるために（Ｓｐ_２）に含まれる。特定の実施形態においては、ＰＥＧ部分は、連結部分又はペイロードを（Ｓｐ_２）に含まれるアミノ酸残基に接続させるために（Ｓｐ_２）に含まれる。特定の実施形態においては、ＰＥＧ部分は、Ｋ残基を自壊性部分に接続させ、次にペイロードに接続させるために（Ｓｐ_２）に含まれる。特定の実施形態においては、ＰＥＧ部分は、（Ｓｐ_２）に含まれるアミノ酸残基を自壊性部分に接続させ、次にペイロードに接続させるために（Ｓｐ_２）に含まれる。

【0111】

特定の実施形態においては、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、デキストランを含み得る。「デキストラン」という用語は、本発明で使用される場合、様々な長さの鎖で構成される複雑な分岐グルカンである複合体を指し、３～２０００ｋＤａの範囲の重量を有し得る。直鎖は、典型的には、グルコース分子間のα－１，６グリコシド結合からなるが、分枝はα－１，３結合から始まる。デキストランは、例えば乳酸菌によってスクロースから合成され得る。本発明の文脈において、担体として使用されるデキストランは、好ましくは約１５～１５００ｋＤａの分子量を有し得る。

【0112】

特定の実施形態においては、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、オリゴヌクレオチドを含み得る。「オリゴヌクレオチド」という用語は、本発明で使用される場合、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のいずれかのオリゴマー又はポリマー、並びに天然には存在しないオリゴヌクレオチドを指す。安定性が高いことから、オリゴヌクレオチドは、好ましくはＤＮＡのポリマーである。

【0113】

特定の実施形態においては、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、存在する場合、アミノ酸の模倣体及び誘導体を含むアミノ酸残基とＰＥＧ部分とのみからなる。特定の実施形態においては、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、存在する場合、アミノ酸の模倣体及び誘導体を含むアミノ酸残基のみからなる。特定の実施形態においては、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）に含まれる全てのアミノ酸残基は、α－Ｌ－アミノ酸である。すなわち、特定の実施形態においては、ペイロード又は連結部分Ｂを除くリンカーは、アミノ酸残基のみからなる。特定の実施形態においては、ペイロード又は連結部分Ｂを除くリンカーは、α－Ｌ－アミノ酸残基のみからなる。このようなペプチドベースのリンカーは、Ｎ末端及び／又はＣ末端に保護基を含んでいてもよい。すなわち、Ｎ末端アミノ基はアセチル化されていてもよい及び／又はＣ末端カルボキシル基はアミド化されていてもよい。

【0114】

化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、（Ｓｐ_３）は、同一の構造を有していてもよいことに留意しなければならない。しかし、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／若しくは（Ｓｐ_３）のそれぞれが異なる構造を有すること並びに／又は化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／若しくは（Ｓｐ_３）の全てが同時には存在しないことが好ましい。すなわち、特定の実施形態においては、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）のうちの１つ又は２つだけがリンカー中に存在していてよい。

【0115】

特定の実施形態においては、Ｋ残基は、１つ以上の小さな疎水性アミノ酸残基に直接接続されてよい。例えば、特定の実施形態においては、Ｋ残基は、１つ以上のアラニン残基に直接接続されてよい。

【0116】

本発明では、リンカーは、残基Ｋの側鎖に含まれる第一級アミンを介して抗体にコンジュゲートすることが好ましい。従って、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、及び／又は（Ｓｐ_３）は、トランスグルタミナーゼベースのコンジュゲーション反応において追加のアミン供与体として機能し得る追加のリジン残基、リジン模倣体、又はリジン誘導体を含まないことが好ましい。他の実施形態においては、リンカーに含まれる任意の遊離Ｎ末端アミノ基は、トランスグルタミナーゼの基質として機能することができないように置換、例えばアセチル化されていてもよい。

【0117】

本発明に係るリンカーは、少なくとも１つの連結部分又はペイロードＢを更に含む。本発明に係るリンカーは、一段階コンジュゲーションプロセスでペイロードを抗体に直接コンジュゲートさせるために使用することができる。他の実施形態においては、第１の段階で１つ以上の連結部分を含むリンカーを抗体にコンジュゲートさせ、次いで、第２の段階で１つ以上のペイロードを抗体－リンカーコンジュゲートに連結させてよい。以下の表１は、本明細書で使用される場合の２つの用語を明確にしたものである。

【0118】

【表1】

【0119】

特定の実施形態においては、リンカーは、１つ以上の連結部分Ｂを含み得る。従って、特定の実施形態においては、本発明は、Ｂが連結部分である、本発明に係る方法に関する。

【0120】

「連結部分」とは、本発明で使用される場合、一般に、少なくとも二官能性の分子を指す。本発明では、連結部分は、連結部分を本発明のリンカーにカップリングさせる第１の官能基と、リンカーが抗体にコンジュゲートする前又は後に追加の分子をリンカーにカップリングさせるために使用することができる第２の官能基とを含む。特定の実施形態においては、本発明の連結部分は、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体である。そのような実施形態においては、連結部分は、好ましくはそのアミノ基を介してリンカーに接続されるが、アミノ酸側鎖に含まれる官能基は、追加の分子をリンカーにカップリングするために使用することができる。あるいは、連結部分は、そのカルボキシル基を介してリンカーに接続されてもよいが、アミノ酸側鎖に含まれる官能基は、追加の分子をリンカーにカップリングするために使用することができる。

【0121】

特定の実施形態においては、本発明は、連結部分Ｂは、
・生体直交型マーカー基、又は
・架橋のための非生体直交型実体
を含む、本発明に係る方法に関する。

【0122】

「生体直交型マーカー基（ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｍａｒｋｅｒ ｇｒｏｕｐ）」という用語は、ネイティブな生化学的プロセスを妨げることなく生物系内で化学反応を起こすことができる反応性基を命名するためにＳｌｅｔｔｅｎ及びＢｅｒｔｏｚｚｉ（Ａ Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｑｕａｄｒｉｃｙｃｌａｎｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１１，１３３（４４），１７５７０－１７５７３）によって確立された。「架橋のための非直交型実体（ｎｏｎ－ｂｉｏ－ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｅｎｔｉｔｙ ｆｏｒ ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）」とは、適合性のある第２の官能基を含むペイロードに化学的又は酵素的に架橋され得る第１の官能基を含むか又はからなる任意の分子であってよい。架橋反応が非生体直交型反応である場合であっても、反応によってペイロードのリンカーへの架橋以外の付加的な修飾が抗体に導入されないことが好ましい。上記の観点から、連結部分Ｂは、「生体直交型マーカー基」又は「非生体直交型実体」からなっていてもよく、「生体直交型マーカー基」又は「非生体直交型実体」を含んでいてもよい。例えば、連結部分Ｌｙｓ（Ｎ_３）の場合、Ｌｙｓ（Ｎ_３）全体及びアジド基のみの両方を本発明における生体直交型マーカー基とみなすことができる。Ｌｙｓ（Ｎ_３）とは、６－アジド－Ｌ－リジンを指し、Ｋ（Ｎ_３）と略されることもある。

【0123】

特定の実施形態においては、本発明は、生体直交型マーカー基又は架橋のための非生体直交型実体が、
・－Ｎ－Ｎ≡Ｎ又は－Ｎ_３；
・Ｌｙｓ（Ｎ_３）；
・テトラジン；
・アルキン；
・歪みシクロオクチン；
・ＢＣＮ；
・歪みアルケン；
・光反応性基；
・アルデヒド；
・アシルトリフルオロボレート；
・タンパク質分解剤（「ＰＲＯＴＡＣ」）；
・シクロペンタジエン／スピロロシクロペンタジエン；
・チオ選択的求電子剤；
・－ＳＨ；及び
・システイン
からなる群から選択される少なくとも１つの分子又は部分からなるか又は含む、本発明に係る方法に関する。

【0124】

リンカー中に含まれる生体直交型マーカー基又は架橋のための非生体直交型実体は、例えば、表２に示す結合反応のいずれかに関与し得る。

【0125】

【表2】

【0126】

連結部分Ｂは、表２において「結合パートナー１」又は「結合パートナー２」と呼ばれるものであってもよく、又は含んでいてもよい。

【0127】

特定の実施形態においては、連結部分Ｂは、遊離スルフヒドリル基を有するシステイン、システイン模倣体、又はシステイン誘導体であり得る。

【0128】

このようなＣｙｓ残基（又は模倣体又は誘導体）の遊離スルフヒドリル基は、マレイミド等のチオ選択的求電子剤を含むペイロードコンストラクトにコンジュゲートすることができる。マレイミド部分を含む毒素コンストラクトは、Ａｄｃｅｔｒｉｓのように高頻度で使用されており、医療当局に承認もされている。従って、ＭＭＡＥ毒素を含む毒素コンストラクトは、本発明のリンカーにおけるＣｙｓ残基の遊離スルフヒドリル基にカップリングされ得る。

【0129】

本発明の方法では、マレイミドの代わりに３－アリールプロピオニトリル（ＡＰＮ）又はホスホンアミデート等の他のチオ選択的求電子剤を使用してもよいことに留意しなければならない。

【0130】

従って、本発明に係るリンカーにおいてＣｙｓ残基を提供することは、既製品の毒素－マレイミドコンストラクトを用いて抗体－ペイロードコンジュゲートを作製することができるようになる又はより一般的には、Ｃｙｓ－マレイミド結合化学の利点を十分に活用することができるという利点がある。同時に、脱グリコシル化する必要がない既製品の抗体を使用することもできる。特定の実施形態においては、Ｃｙｓ残基は、アミノ酸ベースのリンカーにおいてＣ末端又は鎖内に存在してよい。

【0131】

別の実施形態においては、連結部分Ｂは、アジド基を含んでいてもよい。当業者は、６－アジド－リジン（Ｌｙｓ（Ｎ_３））又は４－アジド－ホモアラニン（Ｘａａ（Ｎ_３））等の、本発明に係るリンカーに組み込むことができるアジド基を含む分子について認識している。アジド基を含む連結部分は、例えば、歪み促進型アジド－アルキン環化付加（ＳＰＡＡＣ）、銅触媒アジド－アルキン環化付加（ＣｕＡＡＣ）、又はシュタウディンガーライゲーション等の様々な生体直交型反応において基質として使用することができる。例えば、特定の実施形態においては、ＤＢＣＯ、ＤＩＢＯ、ＢＣＮ、又はＢＡＲＡＣ等のシクロオクチン誘導体を含むペイロードをＳＰＡＡＣによってアジド基を含むリンカーにカップリングすることができる。

【0132】

更に別の実施形態においては、連結部分Ｂは、テトラジン基を含んでいてもよい。当業者は、本発明に係るリンカーに組み込むことができるテトラジンを含む分子、好ましくはテトラジン基を含むアミノ酸誘導体について認識している。テトラジンを含む連結部分は、生体直交型テトラジンライゲーションにおいて基質として使用することができる。例えば、特定の実施形態においては、シクロプロペン、ノルボレン、ノルボレン誘導体、又はビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）等のシクロオクチン基を含むペイロードを、テトラジン基を含むリンカーにカップリングさせることができる。

【0133】

特定の実施形態においては、連結部分Ｂは、シクロペンタジエン誘導体等の環状ジエンを含んでいてもよい。マレイミドを含むペイロード分子に連結させることができる可能性のあるシクロペンタジエン誘導体は、Ａｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｔｕｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｏ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ Ｄｒｕｇ－Ｌｉｎｋｅｒｓ；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１８，２９，７，２４０６－２４１４及びＡｍａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１９，３０，９，２３４０－２３４８によって記載されている。

【0134】

特定の実施形態においては、連結部分Ｂは、光反応性基を含んでもよい。「光反応性基」という用語は、本発明で使用される場合、活性種の生成を受けるために、適用される外部エネルギー源に応答し、その結果、隣接する化学構造（例えば、引き抜き可能な水素）に共有結合する化学基を指す。光反応性基の例は、限定されるものではないが、アリールアジド、例えば、フェニルアジド、ｏ－ヒドロキシフェニルアジド、ｍ－ヒドロキシフェニルアジド、テトラフルオロフェニルアジド、ｏ－ニトロフェニルアジド、ｍ－ニトロフェニルアジド、又はアジド－メチルクマリン、ジアジリン、ソラレン、又はベンゾフェノンである。

【0135】

特定の実施形態においては、本発明は、連結部分Ｂに１つ以上のペイロードをコンジュゲートする更なる工程を含む、本発明に係る方法に関する。

【0136】

本発明は、一段階プロセスで１つ以上のペイロードを含むリンカーを抗体に直接コンジュゲートする代わりに、特定の実施形態においては、第１の段階で少なくとも１つの連結部分Ｂを含むリンカーを抗体にコンジュゲートさせ、続いて第２の段階で１つ以上のペイロードを連結部分Ｂにカップリングさせ得る二段階プロセスに言及する。

【0137】

「ペイロード」という用語は、本発明で使用される場合、化学的に合成可能な低分子量の分子又は化学的実体、及び宿主細胞の発酵によって生成する必要があるか又は化学的に合成することも可能でありかつ抗体に新規の機能性を付与するより大きな分子又は生物学的実体を含む、任意の天然に存在するか又は合成的に生成される分子を表す。ペイロードは、リンカーに含まれる連結部分あるいは化学的スペーサー（Ｓｐ_１）及び／若しくは（Ｓｐ_３）又はＫ残基等のリンカーの他の部分にペイロードをカップリングすることを可能にする更なる構造又は官能基を含んでいてもよいことを理解されたい。

【0138】

二段階コンジュゲーションプロセスにおいて、ペイロードは、当技術分野で公知の任意の好適な方法によって連結部分に連結され得る。好ましくは、ペイロードは、本明細書に開示された生体直交型マーカー基又は架橋のための非生体直交型実体のいずれかに連結され得る。すなわち、ペイロードは、好ましくは、少なくとも１つの連結部分Ｂに含まれる生体直交型マーカー基又は架橋のための非生体直交型実体と適合性のある官能基を含む。

【0139】

ペイロードを連結部分Ｂに含まれる生体直交型マーカー基に連結させるために使用され得る幾つかの生体直交型反応は、当技術分野で公知である。例えば、アジドとシクロオクチンとの間（銅フリークリックケミストリーとも呼ばれる、Ｂａｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ（“Ｃｏｐｐｅｒ－ｆｒｅｅ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｄｙｎａｍｉｃ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｍａｇｉｎｇ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１０４（４３）：１６７９３－７））、ニトロンとシクロオクチンとの間（Ｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ（“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｔｒａｉｎ－Ｐｒｏｍｏｔｅｄ Ａｌｋｙｎｅ－Ｎｉｔｒｏｎｅ Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ”．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ．４９（１７）：３０６５））の１，３－双極性付加環化、アルデヒド及びケトンからのオキシム／ヒドラゾン形成（Ｙａｒｅｍａ，ｅｔ ａｌ（“Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｋｅｔｏｎｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｔｏ Ｓｉａｌｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｉｄｕｅｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｔｏ Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７３（４７）：３１１６８－７９））、テトラジンライゲーション（Ｂｌａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ（“Ｔｈｅ Ｔｅｔｒａｚｉｎｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ：Ｆａｓｔ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｉｎｖｅｒｓｅ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ－ｄｅｍａｎｄ Ｄｉｅｌｓ－Ａｌｄｅｒ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ”．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ．１３０（４１）：１３５１８－９））、イソニトリルベースのクリック反応（Ｓｔｏｃｋｍａｎｎ ｅｔ ａｌ（“Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｉｓｏｎｉｔｒｉｌｅ－ｂａｓｅｄ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”．Ｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．９（２１）：７３０３））、そして最も最近では、クアドリシクランライゲーション（Ｓｌｅｔｔｅｎ ＆ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ（ＪＡＣＳ，Ａ Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｑｕａｄｒｉｃｙｃｌａｎｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ ２０１１，１３３（４４），１７５７０－１７５７３））、銅（Ｉ）触媒アジド－アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ、Ｋｏｌｂ ＆ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ（“Ｔｈｅ ｇｒｏｗｉｎｇ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ”．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ．８（２４）：１１２８－１１３７））、歪み促進型アジド－アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ、Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ（“Ａ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ Ａｚｉｄｅｓ”．ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１：６４４－６４８））、又は歪み促進型アルキン－ニトロン付加環化（ＳＰＡＮＣ、ＭａｃＫｅｎｚｉｅ ｅｔ ａｌ（“Ｓｔｒａｉｎ－ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｎｉｔｒｏｎｅｓ ａｎｄ ａｌｋｙｎｅｓ－ｒａｐｉｄ ｔｕｎａｂｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ”．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２１：８１－８））を含む、生体直交性の要件を満たす化学的ライゲーション戦略が数多く開発されている。これらの文書は全て、十分に実施可能な程度の開示を提供し、冗長な繰り返しを避けるために、参照により本明細書に組み込まれる。

【0140】

ペイロードは、好ましくは、トランスグルタミナーゼを用いて本発明に係るリンカーが抗体のＧｌｎ残基にコンジュゲートされた後に、該リンカーに含まれる生体直交型マーカー基又は架橋のための非生体直交型実体にカップリングされることを理解されたい。しかし、本発明は、第１の段階で少なくとも１つの連結部分Ｂを含むリンカーに１つ以上のペイロードをカップリングさせ、第２の段階で、得られたリンカー－ペイロードコンストラクトを抗体にトランスグルタミナーゼによってコンジュゲートさせる、抗体－リンカーコンジュゲートも包含する。

【0141】

特定の実施形態においては、本発明は、１つ以上のペイロードがクリック反応を介して連結部分Ｂにコンジュゲートされる、本発明に係る方法に関する。

【0142】

すなわち、１つ以上のペイロードは、クリック反応、特に本明細書に開示されたクリック反応のいずれかにおいて、連結部分Ｂに連結され得る。

【0143】

特に好ましい実施形態においては、少なくとも１つのペイロードは、チオール－マレイミドコンジュゲーションを介してリンカーに含まれる連結部分Ｂにコンジュゲートされ得る。すなわち、特定の実施形態においては、ペイロードはマレイミド基を含んでいてよく、連結部分Ｂはチオール基を含む分子、例えば限定するものではないが、システイン残基又はホモシステイン等のシステイン模倣体であってよい。しかし、Ｂは、遊離チオール基を含む非アミノ酸分子であってもよい。別の実施形態においては、ペイロードは遊離チオール基を含んでいてよく、連結部分Ｂはマレイミド基を含んでいてよい。

【0144】

別の特に好ましい実施形態においては、少なくとも１つのペイロードは、歪み促進型アジド－アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）を介してリンカーに含まれる連結部分Ｂにコンジュゲートされ得る。すなわち、特定の実施形態においては、ペイロードはアルキン基、例えば限定するものではないがシクロオシチン基を含んでいてよく、連結部分Ｂはアジド基を含む分子、例えば限定するものではないが、本明細書に開示されるリジン誘導体Ｌｙｓ（Ｎ_３）であってよい。しかし、Ｂは、遊離アジド基を含む非アミノ酸分子であってもよい。別の実施形態においては、ペイロードはシクロオクチン基等のアルキン基を含んでいてよく、連結部分Ｂはアジド基を含んでいてよい。

【0145】

リンカーにおける連結部分とペイロードにおける官能基との間のクリック反応の他に、ペイロードは、当技術分野で公知の任意の酵素的又は非酵素的反応によって連結部分に共有結合することができる。

【0146】

ペイロードは共有結合を介して連結部分に連結されることが好ましい。しかし、特定の実施形態においては、ペイロードは、強力な非共有結合を介して連結部分に連結されてもよい。すなわち、特定の実施形態においては、連結部分Ｂは、限定するものではないが、リジン誘導体ビオシチン等のビオチン部分を含んでいてよい。このような実施形態においては、ストレプトアビジン部分を含むペイロードをビオチン部分を含むリンカーに連結させてよい。

【0147】

特定の実施形態においては、本発明は、Ｂがペイロードである、本発明に係る方法に関する。

【0148】

特定の実施形態においては、ペイロードを一段階プロセスで抗体にコンジュゲートすることができるように、ペイロードは予めリンカーの一部であってもよい。このような実施形態においては、リンカーは、好ましくは化学合成によってリンカーにカップリングされる。ペイロードは、好ましくは、リンカーに含まれる化学的スペーサーに又はＫ残基に直接カップリングされる。ペイロードがアミノ酸の模倣体及び誘導体を含むアミノ酸残基にカップリングされる実施形態においては、ペイロードは、アミノ酸残基のＣ末端カルボキシル基又はＮ末端アミノ基にカップリングし得る。あるいは、ペイロードは、アミノ酸残基の側鎖に含まれる官能基にカップリングしてもよい。当業者は、カルボキシル基、アミノ基、又はアミノ酸側鎖とカップリングすることができるようにペイロードを官能化する方法を認識している。

【0149】

更に、当業者は、化学合成によってペイロードをアミノ酸ベースのリンカーにカップリングさせる方法を認識している。例えば、アミンを含むペイロード、又はチオールを含むペイロード（例えば、マイタンシン類似体の場合）、又はヒドロキシルを含有するペイロード（例えば、ＳＮ－３８類似体の場合）は、化学合成によってアミノ酸ベースのリンカーのＣ末端に結合させることができる。しかし、当業者は、化学合成によってペイロードをアミノ酸又はアミノ酸誘導体のＮ末端、Ｃ末端、又は側鎖にカップリングするために利用することができる更なる反応及び反応性基を認識している。化学合成によってペイロードをアミノ酸ベースのリンカーにカップリングさせるために使用することができる典型的な反応としては、限定するものではないが、ペプチドカップリング、活性化エステルカップリング（ＮＨＳエステル、ＰＦＰエステル）、クリック反応（ＣｕＡＡＣ、ＳＰＡＡＣ）、マイケル付加（チオールマレイミドコンジュゲーション）が挙げられる。ペイロードのペプチドへのカップリングについては、例えば、Ｃｏｓｔｏｐｌｕｓ ｅｔ ａｌ．（Ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｓｅｌｆ－ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ Ｄｅｓｉｇｎｅｄ Ｔｏ Ｐｒｏｖｉｄｅ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ Ｋｉｌｌｉｎｇ．ＡＣＳ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２０１９ Ｓｅｐ ２７；１０（１０）：１３９３－１３９９）、Ｓｏｎｚｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｕｓｉｎｇ Ｈｏｓｔ－Ｇｕｅｓｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２０２０ Ｊａｎ １５；３１（１）：１２３－１２９）、Ｂｏｄｅｒｏ ｅｔ ａｌ．（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＧＤ ａｎｄ ｉｓｏＤＧＲ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ－α－ａｍａｎｉｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｂｅｉｌｓｔｅｉｎ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１８，１４，４０７－４１５）、Ｎｕｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｎｅｘｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＴＨＩＯＭＡＢ^TM ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｄｅｌｉｖｅｒｓ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｔａｂｌｅ，ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｎｅａｒ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ＴＨＩＯＭＡＢ^TM ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＴＤＣ）．ＲＳＣ Ａｄｖ．，２０１７，７，２４８２８－２４８３２）、Ｄｏｒｏｎｉｎａ ｅｔ ａｌ．（Ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｆ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｎｋｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｎ ｅｆｆｉｃａｃｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２００６ Ｊａｎ－Ｆｅｂ；１７（１）：１１４－２４）、Ｎａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．（Ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｅｘａｔｅｃａｎ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ－ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｐａｙｌｏａｄｓ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２０１６ Ｍａｒ １５；２６（６）：１５４２－１５４５）、及びＤｉｃｋｇｉｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２０２０ Ｍａｒ １２．ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｂｉｏｃｏｎｊｃｈｅｍ．０ｃ０００６１）によって、先行技術において広範囲に記載されている。

【0150】

ペイロードは、本発明に係るペプチドベースのリンカー又はペプチドを含むリンカーのＮ末端又はＣ末端にカップリングできることを理解されたい。特定の実施形態においては、ペイロードは、ペプチド又はアミノ酸残基のＮ末端アミノ基又はＣ末端カルボキシル基に直接カップリングし得る。

【0151】

当業者は、ペイロードをアミノ酸残基にカップリングするのに適した反応性基を認識している。例えば、アミンを含むペイロードは、アミド結合を介してアミノ酸残基のＣ末端カルボキシル基にカップリングすることができる。あるいは、チオール基又は及びヒドロキシル基を含むペイロードは、それぞれチオエステル又はエステル結合を介してアミノ酸のＣ末端カルボキシル基にカップリングすることができる。カルボン酸基を含むペイロードは、アミド結合を介してアミノ酸残基のＮ末端アミノ基にカップリングすることができる。

【0152】

特定の実施形態においては、ペイロードは、本発明に係るリンカーに含まれるペプチド又はアミノ酸残基のＮ末端又はＣ末端に間接的にカップリングすることができる。当業者は、ペイロードを本発明に係るリンカーに含まれるアミノ酸残基のＮ末端アミノ基又はＣ末端カルボキシル基にカップリングするために使用することができるリンカー分子について認識している。

【0153】

特定の実施形態においては、ヒドロキシル基を含むペイロードは、リンカー分子を介してアミノ酸残基のＮ末端にカップリングすることができる。例えば、ヒドロキシル基を含むペイロードは、カルバメートリンカー分子を介してＮ末端アミノ基にカップリングすることができる。

【0154】

特定の実施形態においては、チオール基を含むペイロードは、リンカー分子を介してアミノ酸残基のＮ末端にカップリングすることができる。例えば、チオール基を含むペイロードは、チオカルバメートリンカー分子を介してＮ末端アミノ基にカップリングすることができる。あるいは、チオール基を含むペイロードは、カルボキシル基及びチオール基を含むアルキルリンカー分子を介してＮ末端アミノ基にカップリングすることもできる。特定の実施形態においては、アルキルリンカー分子は、ペイロードが３－メルカプトプロピオン酸リンカー分子に含まれるチオール基とジスルフィド結合を形成する３－メルカプトプロピオン酸リンカー分子であってもよい。

【0155】

特定の実施形態においては、アミド基を含むペイロードは、リンカー分子を介してアミノ酸残基のＮ末端にカップリングすることができる。例えば、アミン基を含むペイロードは、ペイロード及びＮ末端アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成するジカルボン酸リンカー分子を介してＮ末端アミノ基にカップリングすることができる。本発明でリンカー分子として使用することができるジカルボン酸の例は、限定するものではないが、コハク酸又はピメリン酸である。

【0156】

本発明に係るリンカーに含まれるアミノ酸残基のＮ末端にペイロードを間接的にカップリングするための代替リンカー分子又は本発明に係るリンカーに含まれるアミノ酸残基のＣ末端にペイロードを間接的にカップリングするのに適したリンカー分子は、当技術分野において記載されており、本発明に包含される。

【0157】

特定の実施形態においては、本発明は、ペイロードが
・毒素；
・サイトカイン；
・成長因子；
・放射性核種；
・ホルモン；
・抗ウイルス剤；
・抗菌剤；
・蛍光色素；
・免疫調節／免疫賦活剤；
・半減期延長部分；
・溶解度増大部分；
・ポリマー－毒素コンジュゲート；
・核酸；
・ビオチン又はストレプトアビジン部分；
・ビタミン；
・タンパク質分解剤（「ＰＲＯＴＡＣ」）；
・標的結合部分；及び／又は
・抗炎症剤
のうちの少なくとも１つを含む本発明に係る方法に関する。

【0158】

本明細書に開示されるペイロードのいずれか１つを、本明細書に開示される一段階コンジュゲーションプロセスで使用するためにリンカーに直接カップリングさせてもよく、又は本明細書に開示される二段階プロセスの一部として作製された抗体－リンカーコンジュゲートに含まれる連結部分に連結させてもよい。

【0159】

特定の実施形態においては、ペイロードはサイトカインであってもよい。「サイトカイン」という用語は、本発明で使用される場合、他の細胞の機能に影響を与え、免疫又は炎症応答における細胞間の相互作用を調節する任意の分泌ポリペプチドを意味する。サイトカインとしては、それを生成する細胞にかかわらず、モノカイン、リンホカイン、及びケモカインが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、モノカインは、一般に単球によって産生及び分泌されるといわれているが、ナチュラルキラー細胞、線維芽細胞、好塩基球、好中球、内皮細胞、脳星状細胞、骨髄間質細胞、表皮ケラチノサイト、及びＢリンパ球等の他の多くの細胞もモノカインを産生する。リンホカインは、一般にリンパ球細胞によって産生されるといわれている。サイトカインの例としては、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、及び腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0160】

特定の実施形態においては、ペイロードは抗炎症剤であってもよい。「抗炎症剤」という用語は、本発明で使用される場合、その主な作用機序及び使用が炎症を治療する領域におけるものである剤のクラスに加えて、有用な抗炎症効果を有する別の治療クラスからの任意の他の剤も意味する。このような抗炎症剤としては、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、マクロライド系抗生物質、及びスタチン等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、ＮＳＡＩＤとしては、サリチル酸塩（例えば、アスピリン）、アリールプロピオン酸（例えば、イブプロフェン）、アントラニル酸（例えば、メフェナム酸）、ピラゾール（例えば、フェニルブタゾン）、環状酢酸（インドメチシン）、及びオキシカム（例えば、ピロキシカム）が挙げられる、これらに限定されない。好ましくは、本発明の方法において使用するための抗炎症剤としては、スリンダク、ジクロフェナク、テノキシカム、ケトロラク、ナプロキセン、ナブメトン、ジフルニサル、ケトプロフェン、アリールプロピオン酸、テニダップ、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、メロキシカム、エトリコキシブ、バルデコキシブ、メトトレキサート、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン、ロキシスロマイシン、エリスロマイシン、イブプロフェン、デクスイブプロフェン、フルルビプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、ベノキサプロフェン、デクスケトプロフェン、トルフェナム酸、ニメスリド、及びオキサプロジンが挙げられる。

【0161】

特定の実施形態においては、抗炎症剤は、抗炎症性サイトカインであってもよく、これは、標的特異的抗体にコンジュゲートしたとき、例えば自己免疫疾患によって引き起こされる炎症を改善することができる。抗炎症活性を有するサイトカインは、特に限定されないが、ＩＬ－１ＲＡ、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、又はＴＧＦ－βであってよい。

【0162】

特定の実施形態においては、ペイロードは成長因子であってもよい。「成長因子」という用語は、本発明で使用される場合、細胞の成長、増殖、細胞分化、及び／又は細胞成熟を刺激することができる天然に存在する物質を指す。成長因子は、タンパク質又はステロイドホルモンの形態で存在する。成長因子は、様々な細胞プロセスを制御するために重要である。成長因子は、典型的には、細胞間のシグナル伝達分子として作用する。しかし、細胞の成長、増殖、細胞分化、及び細胞成熟を促進する能力は成長因子によって異なる。成長因子の例の非限定的なリストには、塩基性線維芽細胞成長因子、アドレノメデュリン、アンジオポエチン、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質、脳由来神経栄養因子、表皮成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、グリア細胞株由来神経栄養因子、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、成長分化因子－９、肝細胞成長因子、肝細胞がん由来成長因子、インスリン成長因子、インスリン様成長因子、遊走刺激因子、ミオスタチン、神経成長因子、及び他のニューロトロフィン、血小板由来成長因子、トランスフォーミング成長因子α、トランスフォーミング成長因子β、腫瘍壊死因子α、血管内皮成長因子、胎盤成長因子、ウシ胎児ソマトトロフィン、及びサイトカイン（例えば、ＩＬ－３及びＩＬ－６についてはＩＬ－１－補因子、ＩＬ－２－ｔ細胞成長因子、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、並びにＩＬ－７等）が含まれる。

【0163】

特定の実施形態においては、ペイロードはホルモンであってもよい。「ホルモン」という用語は、本発明で使用される場合、生物の他の部分の細胞に影響を与えるメッセージを発信する、身体のある部分における細胞又は腺によって放出される化学物質を指す。本発明において有用なホルモンの例は、限定されるものではないが、メラトニン（ＭＴ）、セロトニン（５－ＨＴ）、チロキシン（Ｔ４）、トリヨードチロニン（Ｔ３）、エピネフリン又はアドレナリン（ＥＰＩ）、ノルエピネフリン又はノルアドレナリン（ＮＲＥ）、ドーパミン（ＤＰＭ又はＤＡ）、抗ミュラー管ホルモン又はミュラー管抑制ホルモン（ＡＭＨ）、アディポネクチン（Ａｃｒｐ３０）、副腎皮質刺激ホルモン又はコルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、アンジオテンシノーゲン及びアンジオテンシン（ＡＧＴ）、抗利尿ホルモン又はバソプレシン（ＡＤＨ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド又はアトリオペプチン（ＡＮＰ）、カルシトニン（ＣＴ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ガストリン（ＧＲＰ）、グレリン、グルカゴン（ＧＣＧ）、ゴナドトロフィン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロフィン（ｈＣＧ）、ヒト胎盤性ラクトゲン（ＨＰＬ）、成長ホルモン（ＧＨ又はｈＧＨ）、インヒビン、インスリン（ＩＮＳ）、インスリン様成長因子又はソマトメジン（ＩＧＦ）、レプチン（ＬＥＰ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ又はα－ＭＳＨ）、オレキシン、オキシトシン（ＯＸＴ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、リラキシン（ＲＬＮ）、セクレチン（ＳＣＴ）、ソマトスタチン（ＳＲＩＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、甲状腺刺激ホルモン又はサイロトロピン（ＴＳＨ）、サイロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）、エストロン、エストリオール（Ｅ３）、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン（ＰＧ）、ロイコトリエン（ＬＴ）、プロスタサイクリン（ＰＧＩ２）、トロンボキサン（ＴＸＡ２）、プロラクチン放出ホルモン（ＰＲＨ）、リポトロピン（ＰＲＨ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、神経ペプチドＹ（ＮＰＹ）、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、並びにエンケファリンである。

【0164】

特定の実施形態においては、ペイロードは抗ウイルス剤であってもよい。「抗ウイルス剤」という用語は、本発明で使用される場合、哺乳動物におけるウイルスの形成及び／又は複製を阻害するのに有効な剤（化合物又は生物学的）を意味する。これには、哺乳動物におけるウイルスの形成及び／又は複製に必要な宿主又はウイルスの機構のいずれかに干渉する剤が含まれる。抗ウイルス剤としては、例えば、リバビリン、アマンタジン、ＶＸ－４９７（メリメポディブ、Ｖｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＶＸ－４９８（Ｖｅｒｔｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、レボビリン、ビラミジン、セプレン（マキサミン）、ＸＴＬ－００１及びＸＴＬ－００２（ＸＴＬ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。

【0165】

特定の実施形態においては、ペイロードは抗菌剤であってもよい。「抗菌剤」という用語は、本発明で使用される場合、（ｉ）細菌の成長を阻害、低減、若しくは防止する、（ｉｉ）対象において感染を生じさせる細菌の能力を阻害若しくは低下させる、又は（ｉｉｉ）環境において増殖又は感染性を維持する細菌の能力を阻害若しくは低下させることが可能な任意の物質、化合物、物質の組み合わせ、又は化合物の組み合わせを指す。「抗菌剤」という用語は、細菌の感染性又は病原性を低下させることができる化合物も指す。

【0166】

特定の実施形態においては、ペイロードは免疫調節剤であってもよい。「免疫調節剤」という用語は、併用療法について本発明で使用される場合、宿主の免疫系を抑制、マスク、又は増強する作用を有する物質を指す。免疫調節剤の例としては、サイトカイン、ペプチド模倣体、及び抗体（例えば、ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ）２の断片、又はエピトープ結合断片）等のタンパク質性剤、核酸分子（例えば、アンチセンス核酸分子、ｉＲＮＡ、及び三重らせん）、低分子、有機化合物、並びに無機化合物が挙げられるが、これらに限定されない。具体的には、免疫調節剤としては、メトトレキサート、レフルノミド、シクロホスファミド、サイトキサン、イムラン、シクロスポリンＡ、ミノサイクリン、アザチオプリン、抗生物質（例えば、ＦＫ５０６（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナール、マロノニトリロアミン（例えば、レフルナミド）、Ｔ細胞受容体調節因子、及びサイトカイン受容体調節因子が挙げられるが、これらに限定されない。

【0167】

特定の実施形態においては、免疫調節剤は免疫賦活剤であってもよい。「免疫賦活剤」という用語は、本発明で使用される場合、好ましくは、免疫応答（例えば、特定の病原体に対する免疫応答）を惹起し得る任意の物質又は物質を指す。免疫細胞活性化化合物としては、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）アゴニストが挙げられる。このようなアゴニストとしては、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）、例えば細菌由来の免疫調節因子（別名、危険シグナル）等の感染模倣組成物、及び損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、例えばストレス又は損傷を受けた細胞を模倣する組成物が挙げられる。ＴＬＲアゴニストとしては、核酸又は脂質組成物（例えば、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ））が挙げられる。一例では、ＴＬＲアゴニストは、シトシン－グアノシンオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ－ＯＤＮ）、ＰＥＩ－ＣｐＧ－ＯＤＮ等のポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）－縮重オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、又は二本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）等のＴＬＲ９アゴニストを含む。別の例では、ＴＬＲアゴニストは、ポリイノシン－ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））、ＰＥＩ－ポリ（Ｉ：Ｃ）、ポリアデニル－ポリウリジル酸（ポリ（Ａ：Ｕ））、ＰＥＩ－ポリ（Ａ：Ｕ）、又は二本鎖リボ核酸（ＲＮＡ）等のＴＬＲ３アゴニストを含む。他の例示的なワクチン免疫賦活化合物としては、リポ多糖（ＬＰＳ）、ケモカイン／サイトカイン、真菌β－グルカン（レンチナン等）、イミキモド、ＣＲＸ－５２７、及びＯＭ－１７４が挙げられる。

【0168】

特定の実施形態においては、ペイロードは、半減期延長部分又は溶解度増大部分であってもよい。半減期延長部分は、例えば、ＰＥＧ部分（ポリエチレングリコール部分；ＰＥＧ化）、他のポリマー部分、ＰＡＳ部分（プロリン、アラニン、及びセリンを含むオリオゴペプチド；ＰＡＳ化）、又は血清アルブミン結合剤である。溶解度増大部分は、例えば、ＰＥＧ部分（ＰＥＧ化）又はＰＡＳ部分（ＰＡＳ化）である。

【0169】

特定の実施形態においては、ペイロードはポリマー－毒素コンジュゲートであってもよい。ポリマー－毒素コンジュゲートは、多くのペイロード分子を運ぶことができるポリマーである。このようなコンジュゲートは、例えばＭｅｒｓａｎａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって販売されている通りフレキシマーと呼ばれることもある。ポリマー－毒素コンジュゲートは、本明細書に開示される毒素のいずれを含んでいてもよい。

【0170】

特定の実施形態においては、ペイロードはヌクレオチドであってもよい。核酸ペイロードの一例は、ＭｕｌｔｉＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって開発された、腫瘍溶解特性及び免疫活性化特性を有する非常に小さな非コード二本鎖ＲＮＡであるＭＣＴ－４８５である。

【0171】

特定の実施形態においては、ペイロードは蛍光色素であってもよい。「蛍光色素」という用語は、本発明で使用される場合、第１の波長で光を吸収し、該第１の波長よりも長い第２の波長で発光する色素を指す。特定の実施形態においては、蛍光色素は、６５０～９００ｎｍの波長で発光する近赤外蛍光色素である。この領域では、組織の自家蛍光が少なく、蛍光消光が少ないため、バックグラウンド干渉を最小限に抑えながら、組織の深部への透過が強化される。従って、近赤外蛍光イメージングを用いて、本発明の抗体－ペイロードコンジュゲートが結合している組織を手術中に可視化することができる。「近赤外蛍光色素」は当技術分野で公知であり、市販されている。特定の実施形態においては、近赤外蛍光色素は、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷ、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５、ＮＩＲ ＣＦ７５０／７７０／７９０、ＤｙＬｉｇｈｔ ８００、又はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０であり得る。

【0172】

特定の実施形態においては、ペイロードは放射性核種を含んでいてもよい。「放射性核種」という用語は、本発明で使用される場合、例えば、Ｙ、Ｉｎ、Ｔｂ、Ａｃ、Ｃｕ、Ｌｕ、Ｔｃ、Ｒｅ、Ｃｏ、Ｆｅ等の放射性金属の正に荷電したイオンを含む医学的に有用な放射性核種、例えば^９０Ｙ、^１１１Ｉｎ、^６７Ｃｕ、^７７Ｌｕ、^９９Ｔｃ、^１６１Ｔｂ、^２２５Ａｃ等に関する。放射性核種は、ＤＯＴＡ又はＮＯＤＡ－ＧＡ等のキレート剤に含まれていてもよい。更に、放射性核種は、治療用放射性核種であってもよく、後述する通りイメージング技術において造影剤として使用することができる放射性核種であってもよい。放射性核種又は放射性核種を含む分子は当技術分野で公知であり、市販されている。

【0173】

特定の実施形態においては、ペイロードはビタミンであってもよい。ビタミンは、葉酸を含む葉酸塩、フォラシン、及びビタミンＢ９からなる群から選択することができる。

【0174】

特定の実施形態においては、本発明は、毒素が
・ピロロベンゾジアゼピン（例えば、ＰＢＤ）；
・アウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ、ＭＭＡＦ）；
・マイタンシノイド（例えば、マイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ４、ＤＭ２１）；
・デュオカルマイシン；
・ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＡＭＰＴ）阻害剤；
・ツブリシン；
・エンジイン（例えば、カリケアマイシン）；
・アントラサイクリン誘導体（ＰＮＵ）（例えば、ドキソルビシン）；
・ピロールベースのキネシン紡錘体タンパク質（ＫＳＰ）阻害剤；
・クリプトフィシン；
・薬物排出ポンプ阻害剤；
・サンドラマイシン；
・アマニチン（例えば、α－アマニチン）；及び
・カンプトテシン（例えば、エキサテカン、デルクステカン）
からなる群から選択される少なくとも１つである、本発明に係る方法に関する。

【0175】

すなわち、本発明の方法で生成される抗体－リンカーコンジュゲートは、好ましくは、毒素ペイロードを含む。「毒素」という用語は、本発明で使用される場合、生きている細胞又は生物によって生成され、細胞又は生物にとって有毒な任意の化合物に関する。従って、毒素は、例えば、低分子、ペプチド、又はタンパク質であってよい。具体例は、神経毒、壊死毒、血液毒、及び細胞毒である。特定の実施形態においては、毒素は、腫瘍性疾患の治療において使用される毒素である。すなわち、本発明の方法で毒素を抗体にコンジュゲートし、抗体の標的特異性により悪性細胞に送達することができる。

【0176】

特定の実施形態においては、毒素は、アウリスタチンであってもよい。「アウリスタチン」という用語は、本発明で使用される場合、有糸分裂阻害剤のファミリーを指す。アウリスタチン誘導体も用語「アウリスタチン」の定義に含まれる。アウリスタチンの例としては、アウリスタチンＥ（ＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）、及びドラスタチンの合成類似体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0177】

特定の実施形態においては、毒素は、マイタンシノイドであってもよい。本発明の文脈において、「マイタンシノイド」という用語は、最初にアフリカの低木メイテヌス・オバツス（Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｏｖａｔｕｓ）から単離された一群の高度細胞毒性薬、更にはマイタンシノール（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｌ）及び天然マイタンシノールのＣ－３エステル（米国特許第４，１５１，０４２号）；合成マイタンシノールのＣ－３エステル類似体（Ｋｕｐｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２１：３１－３７，１９７８；Ｈｉｇａｓｈｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７０：７２１－７２２，１９７７；Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｆａｒｍ．Ｂｕｌｌ．３２：３４４１－３４５１；及び米国特許第５，４１６，０６４号）；単純カルボン酸のＣ－３エステル（米国特許第４，２４８，８７０号；同第４，２６５，８１４号；同第４，３０８，２６８号；同第４，３０８，２６９号；同第４，３０９，４２８号；同第４，３１７，８２１号；同第４，３２２，３４８号；及び同第４，３３１，５９８号）；並びにＮ－メチル－Ｌ－アラニンの誘導体とのＣ－３エステル（米国特許第４，１３７，２３０号；同第４，２６０，６０８号；及びＫａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ．１２：３４４１，１９８４）を指す。本発明の方法において使用され得る又は本発明の抗体－ペイロードコンジュゲートに含まれ得る例示的なマイタンシノイドは、マイタンシン、ＤＭ１、ＤＭ３、ＤＭ４、及び／又はＤＭ２１である。

【0178】

特定の実施形態においては、毒素は、デュオカルマイシンであってもよい。好適なデュオカルマイシンは、例えば、デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＢｌ、デュオカルマイシンＢ２、デュオカルマイシンＣＩ、デュオカルマイシンＣ２、デュオカルマイシンＤ、デュオカルマイシンＳＡ、デュオカルマイシンＭＡ、及びＣＣ－１０６５であり得る。「デュオカルマイシン」という用語は、デュオカルマイシンの合成類似体、例えばアドゼレシン、ビゼレシン、カルゼレシン、ＫＷ－２１８９、及びＣＢＩ－ＴＭＩも指すことが理解されるべきである。

【0179】

特定の実施形態においては、毒素は、ＮＡＭＰＴ阻害剤であってもよい。「ＮＡＭＰＴ阻害剤」及び「ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ阻害剤」という用語は、本発明で使用される場合、ＮＡＭＰＴの活性を低下させる阻害剤を指す。「ＮＡＭＰＴ阻害剤」という用語には、ＮＡＭＰＴ阻害剤のプロドラッグも含まれ得る。ＮＡＭＰＴ阻害剤の例としては、ＦＫ８６６（ＡＰＯ８６６とも呼ばれる）、ＧＰＰ７８塩酸塩、ＳＴ１１８８０４、ＳＴＦ３１、ピリジルシアノグアニジン（ＣＨ－８２８とも呼ばれる）、ＧＭＸ－１７７８、及びＰ７Ｃ３が挙げられるが、これらに限定されない。追加のＮＡＭＰＴ阻害剤は当技術分野で公知であり、本明細書に記載される組成物及び方法において使用するのに好適であり得る。例えば、国際公開第２０１５／０５４０６０号、米国特許第８，２１１，９１２号、及び同第９，６７６，７２１号を参照、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。幾つかの実施形態においては、ＮＡＭＰＴ阻害剤はＦＫ８６６である。幾つかの実施形態においては、ＮＡＭＰＴ阻害剤はＧＭＸ－１７７８である。

【0180】

特定の実施形態においては、毒素は、ツブリシンであってもよい。ツブリシンは、細胞毒性ペプチドであり、９つのメンバー（Ａ～Ｉ）を含む。ツブリシンＡは、抗がん剤としての潜在的な用途を有している。それは、細胞をＧ２／Ｍ期で停止させる。ツブリシンＡは、ビンブラスチンよりも効率的に重合を阻害し、単離された微小管の脱重合を誘導する。ツブリシンＡは、様々な腫瘍細胞株に対して強力な細胞分裂阻害効果を有し、そのＩＣ５０はピコモル範囲である。本発明の方法で使用することができる他のツブリシンは、ツブリシンＥであり得る。

【0181】

特定の実施形態においては、毒素は、エンジインであってもよい。「エンジイン」という用語は、本発明で使用される場合、二重結合によって分離されている２つの三重結合を含有する９員及び１０員環のいずれかを特徴とする一群の細菌天然物を指す（例えば、Ｋ．Ｃ．Ｎｉｃｏｌａｏｕ；Ａ．Ｌ．Ｓｍｉｔｈ；Ｅ．Ｗ．Ｙｕｅ（１９９３）．“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｅｎｅｄｉｙｎｅｓ”．ＰＮＡＳ ９０（１３）：５８８１－５８８８を参照；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。幾つかのエンジインはベルグマン環化を受けることができ、その結果生じるジラジカル、１，４－デヒドロベンゼン誘導体はＤＮＡの糖骨格から水素原子を引き抜くことができ、その結果、ＤＮＡ鎖が切断される（例えば、Ｓ．Ｗａｌｋｅｒ；Ｒ．Ｌａｎｄｏｖｉｔｚ；Ｗ．Ｄ．Ｄｉｎｇ；Ｇ．Ａ．Ｅｌｌｅｓｔａｄ；Ｄ．Ｋａｈｎｅ（１９９２）．“Ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ ｏｆ ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ ｇａｍｍａ １ ａｎｄ ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ Ｔ”．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８９（１０）：４６０８－１２を参照；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。ＤＮＡとの反応性により多くのエンジインに抗生物質の特徴が付与され、幾つかのエンジインは、抗がん抗生物質として臨床的に研究されている。エンジインの非限定的な例は、ジネミシン、ネオカルチノスタチン、カリケアマイシン、エスペラミシンである（例えば、Ａｄｒｉａｎ Ｌ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｋ．Ｃ．Ｂｉｃｏｌａｏｕ，“Ｔｈｅ Ｅｎｅｄｉｙｎｅ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ” Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，３９（１１），ｐｐ ２１０３－２１１７；及びＤｏｎａｌｄ Ｂｏｒｄｅｒｓ，“Ｅｎｅｄｉｙｎｅ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｓ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｇｅｎｔｓ，” Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｎｏｖ．２３，１９９４，ＩＳＢＮ－１０：０８２４７８９３８５を参照；その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態においては、毒素は、カリケアマイシンであってもよい。

【0182】

特定の実施形態においては、毒素は、ドキソルビシンであってもよい。「ドキソルビシン」は、本発明で使用される場合、ストレプトマイセス属の細菌であるストレプトマイセス・ペウセチウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）変種カエシウス（ｃａｅｓｉｕｓ）に由来するアントラサイクリンファミリーのメンバーを指し、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、及びイダルビシンを含む。

【0183】

特定の実施形態においては、毒素は、キネシン紡錘体タンパク質阻害剤であってもよい。「キネシン紡錘体タンパク質阻害剤」という用語は、細胞分裂中に双極紡錘体の組み立てに関与するキネシン紡錘体タンパク質を阻害する化合物を指す。キネシン紡錘体タンパク質阻害剤は、がんの治療薬として研究されている。キネシン紡錘体タンパク質阻害剤の例としては、イスピネシブが挙げられる。更に、「キネシン紡錘体タンパク質阻害剤」という用語には、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ製のＳＢ７１５９９２又はＳＢ７４３９２１、及びＣｏｍｂｉｎａｔｏＲｘ製のペンタミジン／クロルプロマリンが含まれる。

【0184】

特定の実施形態においては、毒素は、参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１８００７８６５６Ａ１号に記載されているクリプトフィシンであってもよい。

【0185】

特定の実施形態においては、毒素は、サンドラマイシンであってもよい。サンドラマイシンは、ノカルジオイデス属（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ）の種（ＡＴＣＣ ３９４１９）から初めて単離されたデプシペプチドであり、細胞毒性及び抗腫瘍活性を有することが示されている。

【0186】

特定の実施形態においては、毒素は、アマトキシンであってもよい。アマトキシン（アルファアマニチン、ベータアマニチン、及びアマニチンを含む）は、８個のアミノ酸で構成される環状ペプチドである。これらはタマゴテングタケ（Ａｍａｎｉｔａ ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓ）というキノコから単離することもでき、合成によって構成単位から調製することもできる。アマトキシンは、哺乳類細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、これによって細胞の転写及びタンパク質の生合成に影響を及ぼす。細胞内の転写が阻害されると、成長及び増殖が停止する。共有結合はしていないが、アマニチンとＲＮＡポリメラーゼＩＩとの複合体は非常に強固である（ＫＤ＝３ｎＭ）。酵素からアマニチンが解離するのは非常に緩徐なプロセスであるため、影響を受けた細胞が回復する可能性は低い。細胞内で転写阻害が長く続きすぎると、細胞はプログラム細胞死（アポトーシス）を受ける。好ましい一実施形態においては、「アマトキシン」という用語は、本発明で使用される場合、例えば、国際公開第２０１０／１１５６３０号、同第２０１０／１１５６２９号、同第２０１２／１１９７８７号、同第２０１２／０４１５０４号、及び同第２０１４／１３５２８２号に記載されているようなα－アマニチン又はそのバリアントを指す。

【0187】

特定の実施形態においては、毒素は、カンプトテシンであってもよい。「カンプトテシン」という用語は、本発明で使用される場合、トポイソメラーゼＩ阻害剤として機能するカンプトテシン又はカンプトテシン誘導体を意味することが意図される。例示的なカンプトテシンとしては、例えば、トポテカン、エキサテカン、デルクステカン、イリノテカン、ＤＸ－８９５１ｆ、ＳＮ３８、ＢＮ８０９１５、ルルトテカン、９－ニトロカンプトテシン、及びアミノカンプトテシンが挙げられる。ヒトがん患者を治療するために使用されるカンプトテシンも含む様々なカンプトテシンが報告されている。幾つかのカンプトテシンについては、例えば、Ｋｅｈｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ，１２（２）：８９－１０５，（２００１）又はＬｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１９，１０，１０，１３８６－１３９２）に記載されている。

【0188】

本発明の意味での毒素は、薬物排出トランスポーターの阻害剤であってもよい。毒素と薬物排出トランスポーターの阻害剤とを含む抗体－ペイロードコンジュゲートは、細胞内部に移行したとき、薬物排出トランスポーターの阻害剤が毒素の細胞外への排出を防ぐという利点を有し得る。本発明において、薬物排出トランスポーターは、Ｐ－糖タンパク質であってもよい。Ｐ－糖タンパク質の幾つかの一般的な薬理学的阻害剤としては、アミオダロン、クラリスロマイシン、シクロスポリン、コルヒチン、ジルチアゼム、エリスロマイシン、フェロジピン、ケトコナゾール、ランソプラゾール、オメプラゾール、及び他のプロトンポンプ阻害剤、ニフェジピン、パロキセチン、レセルピン、サキナビル、セルトラリン、キニジン、タモキシフェン、ベラパミル、及びデュロキセチンが挙げられる。エラクリダール及びＣＰ１００３５６は、他の一般的なＰ－ｇｐ阻害剤である。ゾスキダル及びタリキダルも、これを念頭に開発された。最後に、バルスポダル及びリベルサンは、そのような剤の他の例である。

【0189】

本明細書で定義されるペイロードＢは、実際のペイロードとしてのみ理解されるのではなく、むしろペイロード分子として理解されることを理解されたい。ペイロード分子は、本発明で使用される場合、例えば、化学合成を介したペイロードの連結部分Ｂ又はＫ残基又は化学的スペーサーへのカップリングを容易にするために、付加的な構造を含んでいてもよい。

【0190】

すなわち、特定の実施形態においては、実際のペイロードは、本発明のリンカーに連結されるペイロード分子中に含まれ得る。ペイロード分子は、以下の構造：
Ｘ－（スペーサー）－ペイロード、
（式中、ペイロードは、実際のペイロード、例えば、本明細書に開示される化合物のうちの１つを表し、Ｘは、ペイロード分子を連結部分（二段階プロセス）又は化学的スペーサー若しくはリンカーのＫ残基（一段階プロセス）における適合性官能基に結合させるのに好適な反応性基を表し、（スペーサー）は、実際のペイロードを反応性基Ｘから空間的に分離する化学的スペーサーを表す）を有し得る。しかし、特定の実施形態においては、反応性基Ｘは、スペーサー又は実際のペイロードの一部であってもよいことを理解されたい。例えば、スペーサーは、ペプチド又はアミノ酸残基を含み得、反応性基Ｘは、該スペーサーに含まれるＮ末端アミノ酸残基のアミノ基であり得る。他の実施形態においては、スペーサーは存在しなくてもよい。スペーサーが存在しない実施形態においては、官能基は実際のペイロードに含まれ得る。特定の実施形態においては、スペーサーを使用して、対象となる官能基、すなわち、連結部分に含まれる官能基と適合性のある官能基を実際のペイロードに結合させることができる。特定の実施形態においては、反応性基Ｘは、マレイミド基、又はＤＢＣＯ基若しくはＢＣＮ基等であるがこれらに限定されないシクロオクチン基であり得る。

【0191】

特定の実施形態においては、本発明は、化学的スペーサー（Ｓｐ_２）が自壊性部分を含む、本発明に係る方法に関する。

【0192】

すなわち、リンカーは、標的の細胞又は組織におけるペイロードの放出を促進するために、自壊性部分を含んでいてもよい。自壊性部分は、リンカーのいずれの部分に含まれていてもよい。しかし、自壊性部分は、好ましくは、ペイロードをＫ残基から分離する化学的スペーサー（Ｓｐ_２）に含まれる。あるいは、自壊性部分は、上に定義した通り、ペイロード分子に含まれる（スペーサー）に含まれていてもよい。

【0193】

「自壊性部分」という用語は、本発明で使用される場合、リンカーに含めることができ、最初の反応が起こった後に自然に分解し、それによってペイロードを放出する、少なくとも二官能性の分子を指す。最初の反応は、自壊性部分とアミノ酸残基との間の共有結合の加水分解であり得る。特定の実施形態においては、自壊性部分とアミノ酸残基との間の共有結合は、アミノ酸のα－カルボキシル基と自壊性部分に含まれるアミン基との間に形成されるアミド結合であり得、最初の反応は、ペプチダーゼ又はプロテアーゼによって触媒され得る。しかし、他の化学物質も本発明に包含される。

【0194】

特定の実施形態においては、本発明は、自壊性部分がペイロードＢに直接結合する、本発明に係る方法に関する。

【0195】

より好ましくは、自壊性部分はペイロードＢに直接結合し、その結果、自壊性部分の分解時にペイロードが放出される。特定の実施形態においては、自壊性部分は、ペイロードとリンカーに含まれるＫ残基との間に位置する。すなわち、自壊性部分は、Ｋ残基のＮ末端又はＫ残基のＣ末端にカップリングし得る。あるいは、自壊性部分は、ペイロードと化学的スペーサー（Ｓｐ_２）に含まれるアミノ酸残基との間、好ましくは、該アミノ酸残基のＮ末端又はＣ末端に位置してもよい。更に、自壊性部分は、当技術分野で公知の任意の方法によってペイロードと化学的スペーサー（Ｓｐ_２）に含まれる非アミノ酸残基との間に位置する場合もある。

【0196】

自壊性部分の選択は、特にペイロード分子で利用可能な官能基に依存することを理解されたい。

【0197】

特定の実施形態においては、本発明は、自壊性部分がｐ－アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢＣ）部分又はアミノメチレンスペーサーを含む、本発明に係る方法に関する。

【0198】

すなわち、特定の実施形態においては、リンカーは、自壊性部分ｐ－アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢＣ）を含んでいてもよい。ＰＡＢＣは、アミノ酸残基又はペプチドのＣ末端にカップリングするのに適した遊離アミン基と、それを介してペイロード、特にアミンを含むペイロードにカップリングすることができるカルバモイル基とを含む。しかし、当業者は、アミン基を含むようにペイロードを官能化する方法を認識している。自壊性部分ＰＡＢＣは、好ましくは、ペイロードとリンカーに含まれるアミノ酸残基との間に位置する。アミノ酸残基は、好ましくは、残基Ｋ又は化学的スペーサー（Ｓｐ_２）に含まれるアミノ酸である。特定の実施形態においては、自壊性部分ＰＡＢＣは、ペイロードと化学的スペーサー（Ｓｐ_２）に含まれるアラニン残基との間に位置する。特定の実施形態においては、自壊性部分は、ペイロードとペプチダーゼ切断部位との間に位置し得る。特定の実施形態においては、自壊性部分は、ペイロードとカテプシン切断部位との間に位置し得る。すなわち、自壊性部分は、ペイロードとカテプシンによって切断可能であることが知られているモチーフとの間に位置し得る。

【0199】

「カテプシン」という用語は、本発明で使用される場合、プロテアーゼのファミリーを指す。カテプシンという用語は、カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＦ、カテプシンＧ、カテプシンＨ、カテプシンＫ、カテプシンＬ１、カテプシンＬ２、カテプシンＯ、カテプシンＳ、カテプシンＷ、及びカテプシンＺを含む。特定の実施形態においては、切断可能な部分は、バリン－アラニン、バリン－シトルリン、又はアラニン－アラニン等のカテプシンＢによって特異的に加水分解されるモチーフであってよい。ペプチダーゼによって特異的に加水分解され得る更なるモチーフは、Ｓａｌｏｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ（ＡＤＣｓ）ｂｙ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｎｋｅｒｓ，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１９，１６（１２），ｐ．４８１７－４８２５によって開示されている。

【0200】

ＡＤＣリンカーにおいて使用される典型的なジペプチド構造の一つは、例えばブレンツキシマブ・ベドチンに提供されているようなバリン－シトルリンモチーフであり、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ａｎｄ Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ；Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ－ｌａｂｉｌｅ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｆｏｒ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｆｒｏｍ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｍｏｄｅｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ；２００２；１３（４）；ｐ．８５５－６９で論じられている。このリンカーは、カテプシンＢによって切断されて、疾患部位で実際のペイロードを放出することができる。例えばＳＧＮ－ＣＤ３３Ａに提供されているバリン－アラニンモチーフにも同じことが当てはまる。

【0201】

従って、特定の実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－（自壊性部分）－ペイロードを含み得る。特定の実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ペイロードを含み得る。特定の実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ペイロードを含み得る。

【0202】

特定の実施形態においては、リンカーは、構造Ｋ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－（自壊性部分）－ペイロードを含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。特定の実施形態においては、リンカーは、構造Ｋ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ペイロードを含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。特定の実施形態においては、リンカーは、構造Ｋ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥを含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。特定の実施形態においては、リンカーは、構造Ｋ－Ｖａｌ－Ｃｉｔ－ＰＡＢＣ－マイタンシンを含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。

【0203】

ペプチドの切断部位は、カスパーゼ３、レグマイン、若しくは好中球エラスターゼ等の他のペプチダーゼによって切断可能なモチーフであってもよく、Ｄａｌ Ｃｏｒｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｌｉｎｋｅｒ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｕｍｏｒ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ；２５（６５）；ｐ．１４７４０－１４７５７に記載されているようなモチーフであってもよいことに留意しなければならない。

【0204】

しかし、細胞は広範囲にわたる細胞性ペプチダーゼを含むこと、また、あまり保存されていない他のアミノ酸モチーフもペプチダーゼによって効率よく切断され得ることに留意しなければならない。従って、特定の実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－ＰＡＢＣ－ペイロード（式中、（Ｓｐ_２）は、存在しないか又はアミノ酸残基からなる）を含み得る。

【0205】

特定の実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－ＰＡＢＣ－ペイロード（式中、（Ｓｐ_２）は、ＰＡＢＣ部分と（Ｓｐ_２）又はＫ残基に含まれる最もＣ末端側のアミノ酸残基との間のＰＥＧ部分を含む）を含み得る。

【0206】

特定の実施形態においては、自壊性部分ＰＡＢＣを含むリンカーは、アミンを含むペイロード、特に第一級又は第二級アミンを含むペイロードにカップリングされる。特定の実施形態においては、アミンを含むペイロードは、ＭＭＡＥ等のアウスリスタチンである。特定の実施形態においては、アミンを含むペイロードは、マイタンシン等のマイタンシノイドである。

【0207】

ペイロードは、追加のリンカー分子を介して自壊性ＰＡＢＣ部分にカップリングできることに留意しなければならない。例えば、アミンを含むペイロードは、ｐ－ニトロフェノール（ＰＮＰ）基を介してＰＡＢＣ部分にカップリングすることができる。アミン以外の反応性基を含むペイロードをＰＡＢＣ部分にカップリングさせることができる更なるリンカー分子は、Ｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１８，２９，４，１１５５－１１６７；及びＤｏｋｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１４ Ｎｏｖ；１３（１１）：２６１８－２９に開示されている。例えば、アルコール又はフェノール基を含むペイロードは、エチレンジアミン（ＥＤＡ）リンカーを介してＰＡＢＣにカップリングすることができる。

【0208】

特定の実施形態においては、本発明は、自壊性部分がメチルアミン基を含む、本発明に係る方法に関する。メチルアミン基は、ＡＤＣのペプチドベースのリンカーにおいて自壊性部分として使用できることが既に実証されている（Ｃｏｓｔｏｐｌｕｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２０１９，１０，１０，１３９３－１３９９及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１９，１０，１０，１３８６－１３９２）。

【0209】

特に、メチルアミン基を含む自壊性部分は、アミノ酸残基のα－カルボキシル基とメチルアミン基に含まれるアミンとの間に形成されるアミド結合を介してアミノ酸残基のＣ末端にカップリングし得る。アミノ酸残基は、（Ｓｐ_２）又は残基Ｋに含まれるアミノ酸残基であってよい。メチルアミン基に含まれるメチル基は、エーテル結合又はチオエーテル結合によってペイロードにカップリングし得る。従って、ペイロードがヒドロキシル基又はチオール基を含む場合、メチルアミン基を自壊性基として使用することが好ましい。特定の実施形態においては、ヒドロキシルを含むペイロードは、エキサテカン誘導体Ｄｘｄ等のカンプトテシン又はＰＮＵ－１５９６８２等のアントラサイクリンであり得る。特定の実施形態においては、チオールを含むペイロードは、ＤＭ１、ＤＭ４、又はＤＭ２１等のマイタンシノイドであってよい。

【0210】

アミノメチレンスペーサーを含むリンカーは、分子構造Ｃ－（ＮＨ）－（ＣＨ_３）－Ｏ－Ｃ又はＣ－（ＮＨ）－（ＣＨ_３）－Ｓ－Ｃを含み得る。

【0211】

アミノ酸残基のＣ末端カルボキシル基にペイロードをカップリングさせるためには、アミノメチレンスペーサーを含むＰＡＢＣ及び自壊性部分が好ましく用いられることを理解されたい。

【0212】

ペイロードをアミノ酸残基のＣ末端カルボキシル基にカップリングするために使用することができる他の自壊性部分は、フェノールを含むペイロードをアミノ酸残基のＣ末端カルボキシル基にカップリングするためのｐ－アミノベンジルエタノール（ＰＡＢＥ）リンカー（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１８，２９，６，１８５２－１８５８）又は第三級アミン若しくはヘテロアリール部分を含むペイロードをアミノ酸残基のＣ末端カルボキシル基にカップリングするためのパラメチルアニリン（ＰＭＡ）リンカー（Ｓｔａｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｖｏｌｕｍｅ ８， ｐａｇｅｓ １１１２－１１１９（２０１６））を含む。フェノール基を含むペイロードの非限定的な例は、デュオカルマイシンＧＡ又はピロロベンゾジアゼピンＰＢＤである。第三級アミンを含むペイロードの非限定的な例は、デュオカルマイシンＧＡである。

【0213】

しかし、ペイロードは、自壊性部分を介してＮ末端アミノ基にカップリングすることもできる。例えば、ペイロードは、オルトヒドロキシ保護されたアリール硫酸を含む自壊性部分を介してアミノ酸残基のＮ末端アミノ基にカップリングすることができる。例えば、ＰＢＤ等のフェノール性ペイロードをアミノ酸残基のＮ末端アミノ基にカップリングさせるために、オルトヒドロキシ保護されたアリール硫酸（ＯＨＰＡＳ）を使用することができる。ＯＨＰＡＳ部分は、好ましくはカルボキシル基を含み、それを介してアミノ酸残基のＮ末端アミノ基に直接カップリングすることができる。あるいは、ＯＨＰＡＳ部分は、官能化ＰＥＧリンカー、例えば、限定するものではないが、官能化（ＰＥＧ）_２リンカーを介してアミノ酸残基のＮ末端アミノ基にカップリングしてもよい。好ましくは、ＰＥＧリンカーは、ＯＨＰＡＳ部分に含まれるカルボキシル基へのカップリングを可能にするために一端がアミノ基で官能化され、アミノ酸残基のＮ末端アミノ基へのカップリングを可能にするために他端がカルボキシル基で官能化される（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１９，３０，７，１９５７－１９６８）。

【0214】

あるいは又はそれに加えて、非フェノール性ペイロードのＯＨＰＡＳへのカップリングを可能にするために、リンカー分子をＯＨＰＡＳの硫酸基とペイロードとの間に配置してもよい。例えば、カルバメートの形成を通じて第一級又は第二級のアミンを含むペイロードをＯＨＰＡＳ部分にカップリングさせるために、パラヒドロキシベンジル（ＰＨＢ）リンカー分子を使用することができる。第三級アミンを含むペイロードは、第四級アンモニウムの形成を通じてリンカーを含むＯＨＰＡＳにカップリングすることができる。更に、カルバメートの形成を通じてヒドロキシル基を含むペイロードをＯＨＰＡＳ部分にカップリングさせるために、パラヒドロキシベンジルエチレンジアミン（ＰＨＢ－ＥＤＡ）リンカー分子を使用することができる（Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１９，３０，７，１９５７－１９６８）。

【0215】

特定の実施形態においては、ペイロードは、切断可能な部分を介してリンカーに含まれるアミノ酸残基にカップリングすることができる。「切断可能な部分」とは、本発明で使用される場合、酵素的又は非酵素的加水分解によって実際のペイロードから分離することができる化学単位である。特定の実施形態においては、切断可能な部分は、ペプチダーゼ又はプロテアーゼによって加水分解可能なアミノ酸モチーフであり得る。

【0216】

他の実施形態においては、リンカーに含まれる切断可能な部分は、炭水化物部分であってもよい。そのような実施形態においては、切断可能な部分は、グルコシダーゼによって切断可能な部分であってよい。従って、特定の実施形態においては、切断可能な部分は、β－グルクロニダーゼ又はβ－ガラクトシダーゼによって切断可能な部分であってよい。

【0217】

他の実施形態においては、リンカーに含まれる切断可能な部分は、リン酸部分であってもよい。そのような実施形態においては、切断可能な部分は、ホスファターゼによって切断可能な部分であってもよい。従って、特定の実施形態においては、切断可能な部分は、βリソソーム酸ピロホスファターゼ又は酸ホスファターゼによって切断可能な部分であってもよい。

【0218】

リンカー分子からペイロードを放出させるのに使用され得る更なる切断可能な部分についての例は、Ｂａｒｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ；Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ．２０１９ Ａｕｇ １２；４８（１６）：４３６１－４３７４によって記載されている。特定の実施形態においては、リンカーは、構造（切断可能な部分）－（自壊性部分）－ペイロードを含み得る。そのような実施形態においては、自壊性部分は、切断可能な部分の切断時に分解され、ペイロードを放出し得る。

【0219】

特定の実施形態においては、リンカーは単一の連結部分又はペイロードを含み得る。

【0220】

特定の実施形態においては、リンカーは、２つ以上の連結部分及び／又はペイロードＢを含んでいてもよい。すなわち、特定の実施形態においては、リンカーは、以下の構造を含み得る：
ａ）（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）－Ｂ_２－（Ｓｐ_４）、
ｂ）（Ｓｐ_４）－Ｂ_２－（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）、
ｃ）（Ｓｐ_１）－Ｂ_１－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）－Ｂ_２－（Ｓｐ_４）、又は
ｄ）（Ｓｐ_４）－Ｂ_２－（Ｓｐ_１）－Ｂ_１－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）。

【0221】

そのような実施形態においては、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、（Ｓｐ_３）、及びＫ残基は、上に定義したのと同じ特徴を有することができる。更に、部分Ｂ_１及びＢ_２は、上に定義した連結部分及び／又はペイロードのいずれか１つであってもよい。更に、化学的スペーサー（Ｓｐ_４）は、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、又は（Ｓｐ_３）と同じ特徴を有していてもよく、存在しなくてもよい。

【0222】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、リンカーが第２の連結部分又はペイロードＢ_２を含み、特にＢ_２が化学的スペーサー（Ｓｐ_１）又は（Ｓｐ_３）を介してリンカーに接続される、本発明に係る方法に関する。

【0223】

すなわち、ペイロード又は連結部分Ｂ_２は、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）又は（Ｓｐ_３）に接続されてもよく、ペイロード又は連結部分Ｂ_１に直接接続されてもよい。ペイロード又は連結部分Ｂ_２は、Ｂ_２を（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_３）、又はＢ_１に含まれる官能基にカップリングするのに適した任意の官能基を含み得る。

【0224】

特定の実施形態においては、ペイロード又は連結部分Ｂ_２は、それを用いてＢ_２が（Ｓｐ_３）又はＢ_１に接続するアミノ基を含んでいてよい。すなわち、Ｂ_２は、該アミノ基を介して（Ｓｐ_３）又はＢ_１に含まれるカルボキシル基に接続し得る。特定の実施形態においては、（Ｓｐ_３）に含まれるカルボキシル基は、化学的スペーサー（Ｓｐ_３）のＣ末端アミノ酸残基に含まれるカルボキシル基であってよい。特定の実施形態においては、Ｂ_１に含まれるカルボキシル基は、アミノ酸ベースのペイロード又は連結部分のα－カルボキシル基であってよい。特定の実施形態においては、Ｂ_２は、リンカー分子を介して（Ｓｐ_３）又はＢ_１に含まれるカルボキシル基にカップリングされ得る。特定の実施形態においては、リンカー分子は、自壊性部分を含んでいてもよい。

【0225】

特定の実施形態においては、ペイロード又は連結部分Ｂ_２は、それを用いてＢ_２が（Ｓｐ_１）又はＢ_１に接続するカルボキシル基を含んでいてよい。すなわち、Ｂ_２は、該カルボキシル基を介して（Ｓｐ_１）又はＢ_１に含まれるアミン基に接続し得る。特定の実施形態においては、（Ｓｐ_１）に含まれるアミン基は、化学的スペーサー（Ｓｐ_１）のＮ末端アミノ酸残基に含まれるアミン基であってよい。特定の実施形態においては、Ｂ_１に含まれるアミン基は、アミノ酸ベースのペイロード又は連結部分のα－アミノ基であってよい。特定の実施形態においては、Ｂ_２は、リンカー分子を介して（Ｓｐ_１）又はＢ_１に含まれるアミン基にカップリングされ得る。特定の実施形態においては、リンカー分子は、自壊性部分を含んでいてもよい。

【0226】

しかし、Ｂ_２は、アミン又はカルボキシル基以外の官能基を含んでいてもよいことに留意しなければならない。このような実施形態においては、Ｂ_２は、直接又はリンカー若しくは自壊性基を介して、当技術分野で公知の任意の方法によって（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_３）、又はＢ_１にカップリングすることができる。

【0227】

特定の実施形態においては、ペイロード又は連結部分Ｂ_２は、（Ｓｐ_１）又は（Ｓｐ_３）に含まれるアミノ酸側鎖にカップリングされ得る。すなわち、Ｂ_２は、適合性官能基を介して（Ｓｐ_１）又は（Ｓｐ_３）に含まれるアミノ酸側鎖の官能基に接続され得る。

【0228】

特定の実施形態においては、（Ｓｐ_１）、（Ｓｐ_２）、（Ｓｐ_３）、及びＫ残基は、アミノ酸、アミノ酸模倣体、及び／又はアミノ酸誘導体のみからなる。特定の実施形態においては、Ｂ_１及び／又はＢ_２もアミノ酸骨格を含む。このような実施形態においては、リンカーは、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体であってよい。Ｂ_１がアミノ酸、アミノ酸模倣体。又はアミノ酸誘導体である実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１を有し得、（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１は、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体である。Ｂ_１が、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体である実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）を有し得、（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）は、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体である。Ｂ_１が、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体である実施形態においては、リンカーは、構造Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）を有し得、Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）は、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体である。Ｂ_１が、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体である実施形態においては、リンカーは、構造Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１を有し得、Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１は、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体である。Ｂ_１が、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体である実施形態においては、リンカーは、構造Ｋ－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）を有し得、Ｋ－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）は、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体である。Ｂ_１が、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体である実施形態においては、リンカーは構造Ｋ－Ｂ_１を有し得、Ｋ－Ｂ_１は、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体である。

【0229】

Ｂ_１及びＢ_２が、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体である実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）－Ｂ_２－（Ｓｐ_４）を有し得、（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）－Ｂ_２－（Ｓｐ_４）は、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体である。Ｂ_１及びＢ_２が、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体である他の実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_４）－Ｂ_２－（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）を有し得、（Ｓｐ_４）－Ｂ_２－（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）は、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体である。Ｂ_１及びＢ_２が、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体である他の実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_４）－Ｂ_２－（Ｓｐ_１）－Ｂ_１－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）を有し得、（Ｓｐ_４）－Ｂ_２－（Ｓｐ_１）－Ｂ_１－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）は、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体である。

【0230】

Ｂ_１が、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体ではない実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）を有し得、（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）は、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体であり、Ｂ_１は、（Ｓｐ_２）に含まれるＣ末端カルボキシル基に接続される。Ｂ_１が、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体ではない実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_１）－Ｂ_１－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）を有し得、（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）は、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体であり、Ｂ_１は、（Ｓｐ_２）に含まれるＮ末端アミノ基に接続される。しかし、Ｂ_１は必ずしもペプチド又はペプチド模倣体に直接カップリングする必要はないことに留意しなければならない。その代わり、Ｂ_１は、リンカー分子及び／又は自壊性部分を介してペプチド又はペプチド模倣体にカップリングしてもよい。

【0231】

Ｂ_１がアミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体であり、Ｂ_２がアミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体ではない実施形態においては、リンカーは、構造（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）－Ｂ_２－（Ｓｐ_４）、（Ｓｐ_４）－Ｂ_２－（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）、（Ｓｐ_１）－Ｂ_１－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）－Ｂ_２－（Ｓｐ_４）、又は（Ｓｐ_４）－Ｂ_２－（Ｓｐ_１）－Ｂ_１－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）を有し得、（Ｓｐ_１）－Ｋ－（Ｓｐ_２）－Ｂ_１－（Ｓｐ_３）又は（Ｓｐ_１）－Ｂ_１－（Ｓｐ_２）－Ｋ－（Ｓｐ_３）は、直鎖状ペプチド又はペプチド模倣体であり、Ｂ_２は、（Ｓｐ_３）、Ｂ_１、若しくはＫ残基に含まれるＣ末端カルボキシル基に、又は（Ｓｐ_１）、Ｂ_１、若しくはＫ残基のＮ末端アミノ基にカップリングされる。

【0232】

このような実施形態においては、例えば、抗体対ペイロード比が２又は４である、例えば、各Ｑ２９５残基に１個又は２個のペイロードがコンジュゲートしている抗体－ペイロードコンジュゲートが作製され得る。

【0233】

特定の実施形態においては、本発明は、Ｂ_１及びＢ_２が同一であるか又は互いに異なる、本発明に係る方法に関する。

【0234】

すなわち、ペイロード又は連結部分Ｂ_１及びＢ_２は、同一であってもよく、すなわち同じ化学構造を有していてもよく、又は構造的に異なっていてもよい。特定の実施形態においては、Ｂ_１及びＢ_２は、両方ともペイロードであるか又は両方とも連結部分である。Ｂ_１及びＢ_２が両方ともペイロードである実施形態においては、ペイロードＢ_１及びＢ_２は同一であってもよく、異なるペイロードであってもよい。Ｂ_１及びＢ_２が両方とも連結部分である実施形態においては、連結部分Ｂ_１及びＢ_２は、同一又は異なる連結部分であってよい。特定の実施形態においては、Ｂ_１が連結部分であり、Ｂ_２がペイロードであってもよく、その逆であってもよい。

【0235】

全てのペイロード又は連結部分がＢ_１の位置で鎖内のペイロード又は連結部分として機能できるわけではないが、その理由は、例えば、一端で（Ｓｐ_２）又はＫ残基と、他端で（Ｓｐ_３）、（Ｓｐ_１）、又はＢ_２と共有結合を形成するための官能基を有しないためであることを理解されたい。従って、Ｂ_１が鎖内のペイロード又は連結部分である実施形態においては、Ｂ_１は二価又は多価の分子であることが好ましい。例えば、Ｂ_１は、アミノ酸、アミノ酸模倣体、又はアミノ酸誘導体であってよい。そのような実施形態においては、Ｂ_１は、そのアミノ基を介して（Ｓｐ_２）又はＫのＣ末端カルボキシル基に、そして、そのカルボキシル基を介して（Ｓｐ_３）又はＢ_２のＮ末端アミノ基にカップリングされ得る。あるいは、Ｂ_１は、そのカルボキシル基を介して（Ｓｐ_２）又はＫのＮ末端アミノ基に、そして、そのアミノ基を介して（Ｓｐ_１）又はＢ_２のＣ末端カルボキシル基にカップリングされ得る。

【0236】

特定の実施形態においては、リンカーは、２つの連結部分Ｂ_１及びＢ_２を含み得る。

【0237】

すなわち、特定の実施形態においては、本発明は、２つの生体直交型マーカー基及び／又は非生体直交型実体を含むリンカーを包含する。例えば、本発明に係るリンカーは、Ｌｙｓ（Ｎ_３）又はＸａａ（Ｎ_３）等のアジドを含む連結部分と、システイン等のスルフヒドリルを含む連結部分とを含み得る。特定の実施形態においては、本発明に係るリンカーは、Ｌｙｓ（Ｎ_３）又はＸａａ（Ｎ_３）等のアジドを含む連結部分と、テトラジン修飾アミノ酸等のテトラジンを含む連結部分とを含み得る。特定の実施形態においては、本発明に係るリンカーは、システイン等のスルフヒドリルを含む連結部分と、テトラジン修飾アミノ酸等のテトラジンを含む連結部分とを含み得る。２つの異なる生体直交型マーカー基及び／又は非生体直交型実体を含むリンカーは、２つの異なるペイロードを受容することができるという利点を有するので、１つを超えるペイロードを含む抗体－ペイロードコンジュゲートが得られる。

【0238】

このようにして、２＋２の抗体ペイロード比を得ることができる。第２のペイロードを用いることにより、有効性及び効力に関して現在の治療アプローチを超える、まったく新しいクラスの抗体ペイロードコンジュゲートの開発が可能になるかもしれない。

【0239】

このような実施形態は、特に、例えばＤＮＡ及び微小管のような細胞内の２つの異なる構造を標的とすることを可能にし得る。がんの中には微小管毒素のようなある薬物に対して耐性を有するものもあるので、ＤＮＡ毒素は、依然としてがん細胞を殺傷することができる。

【0240】

別の実施形態によれば、同じ時点で同じ組織において放出された場合にのみ十分な効力を発揮する２つの薬物を使用することができる。これにより、抗体が健常組織で部分的に分解されたり、ある薬物が早期に失われたりした場合に、オフターゲット毒性が軽減される可能性がある。

【0241】

更に、非侵襲的イメージング及び療法又は術中／術後のイメージング／手術に二重標識プローブを使用してもよい。このような実施形態においては、非侵襲的イメージングを用いて腫瘍患者を選択することができる。その後、手術中に外科医又はロボットが全てのがん性組織を特定するのに役立つ他方の造影剤（例えば、蛍光色素）を用いて腫瘍を外科的に切除することができる。

【0242】

特定の実施形態においては、Ｂ_１及びＢ_２の一方は、システイン等のチオール基を含む連結部分であってよく、Ｂ_１及びＢ_２の他方は、Ｌｙｓ（Ｎ_３）等のアジド部分を含む連結部分であってよい。このような実施形態においては、一方はチオール－マレイミドコンジュゲーションを介して、他方はＳＰＡＡＣ反応を介して、２つの異なるペイロードをリンカーにカップリングさせてよい。

【0243】

特定の実施形態においては、リンカーは２つのペイロードを含んでいてよい。ペイロードのみで連結部分を含まないリンカーは、一段階プロセスで抗体にコンジュゲートすることができる。

【0244】

Ｂ_１及びＢ_２が両方ともペイロードである実施形態においては、Ｂ_１及びＢ_２は同一であってもよく、構造が異なっていてもよいことを理解されたい。特定の実施形態においては、１つ以上のペイロードを含むリンカーは、化学的に合成することができる。あるいは、リンカーを抗体にコンジュゲートする前に、本明細書に開示される方法のいずれかによって１つ以上のペイロードをリンカーに含まれる連結部分にカップリングさせてもよい。

【0245】

特定の実施形態においては、本発明のリンカーにより、抗体のＣ_Ｈ２ドメインの残基Ｑ２９５に２つの異なるペイロードをコンジュゲートすることが可能になり得る。第２のペイロードを用いることにより、有効性及び効力に関して現在の治療アプローチを超える、まったく新しいクラスの抗体－ペイロードコンジュゲートの開発が可能になる。また、イメージング及び療法又は術中／術後の手術のためのデュアルタイプのイメージング等、新たな応用分野も想定されている（Ａｚｈｄａｒｉｎｉａ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｕａｌ－Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｍｏｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ；１４（３）：２６１－２７６を参照）。例えば、術前陽電子放射断層撮影（ＰＥＴ）用の分子造影剤及び切除縁のガイド描写用の近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）色素を包含する二重標識抗体は、がんの診断、病期分類、及び切除を大幅に向上させることができる（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ＪＬ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｔｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｌａｂｅｌｅｄ ＣＡ１９．９－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＰＥＴ，ＮＩＲＦ，ａｎｄ ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ ＰＥＴ／ＮＩＲＦ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１５ Ｄｅｃ ２９；１１２（５２）：１５８５０－５を参照）。ＰＥＴ及びＮＩＲＦ光イメージングは、それぞれ疾患の位置を特定し、手術中に腫瘍縁を同定するための非侵襲的な全身イメージングを可能にする補完的な臨床応用を提供する。しかし、これまでこのような二重標識プローブの作製は、好適な部位特異的方法がないことから困難であった。化学的手段によって２つの異なるプローブを結合させると、プローブがランダムにコンジュゲートするため、解析及び再現性がほとんど不可能になる。

【0246】

更に、Ｌｅｖｅｎｇｏｏｄ Ｍ．らの研究（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ｅｎａｂｌｅｓ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｕｌｔｉ－Ｄｒｕｇ Ａｎｔｉｂｏｄｙ－Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｖｏｌｕｍｅ５６，Ｉｓｓｕｅ３，Ｊａｎｕａｒｙ １６，２０１７）では、２つの異なるアウリスタチン毒素（異なる物理化学的特性を有し、補完的な抗がん活性を発揮する）が結合している二重薬物標識抗体は、個々のアウリスタチン成分で構成されたＡＤＣに抵抗性であった細胞株及び異種移植モデルにおいて活性を付与した。このことは、二重標識ＡＤＣによって、単一の従来型ＡＤＣ単独よりも効果的にがんの不均一性及び耐性に対処できるようになることを示唆している。ＡＤＣに対する耐性機序の１つにはがん細胞からの細胞毒性部分の能動的なポンピングアウトが含まれるので、別の二重薬物応用は、細胞毒性薬の排出機序を特異的に遮断する薬物を追加的にかつ同時に送達することを含み得る。従って、このような二重標識ＡＤＣは、従来のＡＤＣよりも効果的にＡＤＣに対するがんの耐性を克服するのに役立つ可能性がある。

【0247】

「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で用いられ、具体的には、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクトな抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を網羅する。「抗体」及び「抗体（複数）」という用語は、天然に存在する形態の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）を広く包含する。

【0248】

抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。抗体はヒト起源であってもよいが、同様にマウス、ラット、ヤギ、ロバ、ハムスター、又はウサギ由来であってもよい。コンジュゲートが治療用である場合、マウス又はウサギの抗体は、任意でキメラ化又はヒト化されてもよい。

【0249】

Ｃ_Ｈ２ドメインを含む抗体の断片又は組換えバリアントは、例えば、
・単なる重鎖ドメインを含む抗体フォーマット（サメ抗体／ＩｇＮＡＲ（Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３－Ｃ_Ｈ４－Ｃ_Ｈ５）_２又はラクダ抗体／ｈｃＩｇＧ（Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ２－Ｃ_Ｈ３）_２）
・ｓｃＦｖ－Ｆｃ（ＶＨ－ＶＬ－Ｃ_Ｈ２－ＣＨ３）２
・Ｆｃドメイン及び１つ以上の受容体ドメインを含むＦｃ融合ペプチド
であってよい。

【0250】

抗体はまた、二重特異性（例えば、ＤＶＤ－ＩｇＧ、ｃｒｏｓｓＭａｂ、付加ＩｇＧ－ＨＣ融合体）又は二重パラトープ性（ｂｉｐａｒａｔｏｐｉｃ）であってもよい。概要については、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ；Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ；２０１５；２０（７）；ｐ．８３８－４７を参照。

【0251】

特定の実施形態においては、本発明は、抗体がＩｇＧ抗体、特にＩｇＧ１抗体である、本発明に係る方法に関する。

【0252】

「ＩｇＧ」とは、本発明で使用される場合、認識された免疫グロブリンガンマ遺伝子によって実質的にコードされている抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４のサブクラス又はアイソタイプを含む。マウスでは、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。完全長ＩｇＧは、２本の免疫グロブリン鎖の同一の２対からなり、各対は１本の軽鎖及び１本の重鎖を有し、各軽鎖は免疫グロブリンドメインＶＬ及びＣＬを含み、各重鎖は免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ１（ＣＨ１とも呼ばれる）、Ｃγ２（ＣＨ２とも呼ばれる）及びＯγ３（ＣＨ３とも呼ばれる）を含む。ヒトＩｇＧ１の文脈では、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従って、「ＣＨ１」は、１１８～２１５位を指し、ＣＨ２ドメインは２３１～３４０位を指し、ＣＨ３ドメインは３４１～４４７位を指す。ＩｇＧ１はヒンジドメインも含み、これはＩｇＧ１の場合２１６～２３０位を指す。

【0253】

本発明の方法又は本発明の抗体－ペイロードコンジュゲートで使用される抗体は、任意の抗体、好ましくは任意のＩｇＧ型抗体であってもよく、又は含んでいてもよい。例えば、抗体は、これらに限定するものではないが、ブレンツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、イノツズマブ、アベルマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ダラツムマブ、ペルツズマブ、ベドリズマブ、オクレリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オビヌツズマブ、サシツズマブ、ベランタマブ、ポラツズマブ、及びエンホルツマブであってよい。

【0254】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、抗体がブレンツキシマブ、トラスツズマブ、ゲムツズマブ、イノツズマブ、アベルマブ、セツキシマブ、リツキシマブ、ダラツムマブ、ペルツズマブ、ベドリズマブ、オクレリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ゴリムマブ、オビヌツズマブ、サシツズマブ、ベランタマブ、ポラツズマブ、及びエンホルツマブからなる群から選択される、本発明に係る方法に関する。

【0255】

好ましい実施形態においては、本発明は、抗体ブレンツキシマブ、ゲムツズマブ、トラスツズマブ、イノツズマブ、ポラツズマブ、エンホルツマブ、サシツズマブ、及びベランタマブからなる群から選択される、本発明に係る方法に関する。

【0256】

より好ましい実施形態においては、本発明は、抗体がポラツズマブ又はトラスツズマブ又はエンホルツマブである、本発明に係る方法に関する。

【0257】

すなわち、特定の実施形態においては、本発明は、抗体がポラツズマブであり、リンカーが本明細書に開示されるリンカーのいずれか１つである、抗体－リンカーコンジュゲートに関する。

【0258】

別の実施形態においては、本発明は、抗体がトラスツズマブであり、リンカーが本明細書に開示されるリンカーのうちのいずれか１つである、抗体－リンカーコンジュゲートに関する。

【0259】

別の実施形態においては、本発明は、抗体がエンホルツマブであり、リンカーが本明細書に開示されるリンカーのうちのいずれか１つである、抗体－リンカーコンジュゲートに関する。

【0260】

本発明に係る方法において使用するための抗体は、グリコシル化抗体、脱グリコシル化抗体、又はアグリコシル化抗体であってよい。

【0261】

すなわち、特定の実施形態においては、抗体は、好ましくは残基Ｎ２９７でグリコシル化されたＩｇＧ抗体であってよい。従って、特定の実施形態においては、本発明は、ＩｇＧ抗体がグリコシル化ＩｇＧ抗体であり、特にＩｇＧ抗体がＣ_Ｈ２ドメインの残基Ｎ２９７（ＥＵ付番）でグリコシル化されている、本発明に係る方法に関する。

【0262】

本明細書で論じるように、残基Ｎ２９７でグリコシル化されたＩｇＧ抗体は、非グリコシル化抗体に比べて幾つかの利点を有する。

【0263】

しかし、抗体は、好ましくは残基Ｎ２９７の糖鎖が酵素ＰＮＧａｓｅ Ｆで切断されている脱グリコシル化抗体であってもよい。更に、抗体は、好ましくは残基Ｎ２９７が非アスパラギン残基で置換されているアグリコシル化抗体であってもよい。抗体を脱グリコシル化する方法及びアグリコシル化抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。

【0264】

特定の実施形態においては、本発明のリンカーは、抗体のＦｃドメインにおける内因性Ｇｌｎ残基又は分子工学によって抗体に導入されたＧｌｎ残基にコンジュゲートすることができる。

【0265】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、リンカーをコンジュゲートするＧｌｎ残基が抗体のＦｃドメインに含まれ、特に、リンカーをコンジュゲートするＧｌｎ残基がＩｇＧ抗体のＣ_Ｈ２ドメインのＧｌｎ残基Ｑ２９５（ＥＵ付番）である、本発明に係る方法に関する。

【0266】

本発明のリンカーは、トランスグルタミナーゼの基質として機能し得る抗体のＦｃドメインにおける任意のＧｌｎ残基にコンジュゲートすることができる。典型的には、Ｆｃドメインという用語は、本発明で使用される場合、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン（Ｃ_Ｈ２及びＣ_Ｈ３）、並びにＩｇＥ、ＩｇＹ、及びＩｇＭの最後の３つの定常領域ドメイン（Ｃ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、及びＣ_Ｈ４）を指す。すなわち、本発明に係るリンカーは、抗体のＣ_Ｈ２、Ｃ_Ｈ３、及び適用可能な場合はＣ_Ｈ４のドメインにコンジュゲートすることができる。

【0267】

特定の実施形態においては、内因性Ｇｌｎ残基は、ＩｇＧ抗体のＣ_Ｈ２ドメインのＧｌｎ残基Ｑ２９５（ＥＵ付番）であってもよい。従って、特定の実施形態においては、本発明は、抗体のＦｃドメインにおけるＧｌｎ残基がＩｇＧ抗体のＣ_Ｈ２ドメインのＧｌｎ残基Ｑ２９５（ＥＵ付番）である、本発明に係る方法に関する。特に好ましい実施形態においては、抗体のＦｃドメインにおけるＧｌｎ残基は、グリコシル化ＩｇＧ抗体、特に未修飾の定常領域を有するグリコシル化ＩｇＧ抗体のＣＨ２ドメインのＧｌｎ残基Ｑ２９５（ＥＵ付番）である。

【0268】

Ｑ２９５はＩｇＧ型抗体において極めてよく保存されたアミノ酸残基であることを理解することが重要である。特に、ヒトのＩｇＧ１、２、３、４、並びにウサギ及びラットの抗体において保存されている。従って、Ｑ２９５を使用できることは、治療用抗体－ペイロードコンジュゲート又は抗体が非ヒト起源であることが多い診断用コンジュゲートを作製する上で大きな利点となる。従って、本発明に係る方法は、極めて汎用性が高く、広く適用可能なツールを提供する。残基Ｑ２９５はＩｇＧ型抗体の中でも極めてよく保存されているにもかかわらず、マウス及びラットのＩｇＧ２ａ抗体等、この残基を有しないＩｇＧ型抗体もある。従って、本発明の方法で使用される抗体は、好ましくはＣ_Ｈ２ドメインの残基Ｑ２９５（ＥＵ付番）を含むＩｇＧ型抗体であると理解されたい。

【0269】

更に、ペイロードの結合にＱ２９５を用いる遺伝子操作された人工コンジュゲートが良好な薬物動態及び有効性を示し（Ｌｈｏｓｐｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ ｔｏ Ａｎｔｉ－Ｃｄ３０ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｉｍｐｒｏｖｅｓ Ｔｈｅｉｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ ｉｎ Ｒｏｄｅｎｔ Ｍｏｄｅｌｓ，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ；２０１５；１２（６），ｐ．１８６３－１８７１）、分解されやすい不安定な毒素でも保有し得る（Ｄｏｒｙｗａｌｓｋａ ｅｔ ａｌ．；Ｓｉｔｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｎｏｎ－Ｃｌｅａｖａｂｌｅ Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ－Ｂａｓｅｄ Ｌｉｎｋｅｒ－Ｐａｙｌｏａｄ ｉｎ Ｒｏｄｅｎｔ Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＡＤＣ Ｅｆｆｉｃａｃｙ．ＰＬｏＳ ＯＮＥ ；２０１５；１０（７）：ｅ０１３２２８２）ことが示されている。従って、グリコシル化抗体であることを除いて同じ残基が修飾されるため、この部位特異的手法でも類似の効果がみられると予測される。グリコシル化は、ＡＤＣ全体の安定性に更に寄与する可能性があり、前述のアプローチと同様に糖鎖部分を除去すると、安定性の低い抗体が得られることが示されている（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．；Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｍａｂｓ－Ａｕｓｔｉｎ；２０１１，３（６），ｐ．５６８－５７６）。

【0270】

トランスグルタミナーゼを用いたリンカーのＣ_Ｈ２のＧｌｎ残基へのコンジュゲートについて論じた文献では、小さな低分子量の基質に焦点が当てられてきた。しかし、先行技術の文献では、このようなコンジュゲーションを達成するためには、Ｎ２９７位における脱グリコシル化工程又はアグリコシル化抗体の使用が常に必要であると記載されている（国際公開第２０１５／０１５４４８号、同第２０１７／０２５１７９号、同第２０１３／０９２９９８号）。

【0271】

しかし、かなり驚くべきことに、そして全ての予想に反して、上述のリンカー構造を用いることにより、グリコシル化抗体のＱ２９５への部位特異的コンジュゲーションが実際に効率的に可能になる。特に、毒素分子を含むリンカーのカップリングは８０％を超えるコンジュゲーション効率で達成された。

【0272】

Ｑ２９５がＮ２９７に非常に近接しており、Ｎ２９７はネイティブの状態ではグリコシル化されているにもかかわらず、本発明に係る方法では、指定のリンカーを用いると、依然としてリンカー又はペイロードをそれにコンジュゲートさせることができる。

【0273】

示されているように、本発明に係る方法は、グリコシル化を防ぐためにＮ２９７を前もって酵素的に脱グリコシル化することも、アグリコシル化抗体を使用することも、Ｎ２９７を別のアミノ酸に置換することも、Ｔ２９９Ａ変異を導入することも必要としない。

【0274】

これら２点は、製造面において大きな利点となる。酵素的脱グリコシル化工程はＧＭＰの観点から望ましくないが、その理由は、脱グリコシル化酵素（例えば、ＰＮＧａｓｅ Ｆ）及び切断された糖鎖の両方を培地から確実に除去しなければならないからである。

【0275】

更に、ペイロードを結合させるために抗体を遺伝的に操作する必要がないため、免疫原性を増大させ、抗体の全体的な安定性を低下させる可能性のある配列の挿入を避けることができる。

【0276】

Ｎ２９７の別のアミノ酸への置換も望ましくない作用を有するが、その理由は、Ｆｃドメイン全体の全体的な安定性（Ｓｕｂｅｄｉ ｅｔ ａｌ，Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｒｏｌｅ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｎ－Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０１５，２３（９），１５７３－１５８３）及びコンジュゲート全体の有効性に影響を及ぼす可能性があり、その結果、抗体の凝集が増加し、溶解度が低下する可能性がある（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．；Ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｍａｂｓ－Ａｕｓｔｉｎ ２０１１，３（６），５６８－５７６）ためであり、このことは、ＰＢＤ等の疎水性ペイロードにとって特に重要になる。更に、Ｎ２９７に存在する糖鎖は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）等を惹起することから、重要な免疫調節効果を有する。これら免疫調節効果は、脱グリコシル化、又はアグリコシル化抗体を得るための上述の他のアプローチのいずれかによって失われてしまう。更に、確立された抗体の任意の配列改変は規制上の問題につながる可能性があり、これは、ＡＤＣコンジュゲーションの出発点として承認され、臨床的に検証された抗体が使用されることが多いため問題となる。

【0277】

従って、本発明に係る方法は、部位特異的にペイロードが結合している化学量論的に明確に規定されたＡＤＣを容易にかつ不利益なく作製することを可能にする。

【0278】

上記に鑑みて、本発明の方法は、好ましくは、Ｃ_Ｈ２ドメインの残基Ｎ２９７（ＥＵ付番）においてグリコシル化されている抗体のＣ_Ｈ２ドメインの残基Ｑ２９５（ＥＵ付番）におけるＩｇＧ抗体のコンジュゲーションに使用されることが記載される。しかし、本発明の方法は、残基Ｑ２９５又は抗体の任意の他の好適なＧｌｎ残基における脱グリコシル化又はアグリコシル化抗体のコンジュゲーションも包含し、該Ｇｌｎ残基は内因性Ｇｌｎ残基であってもよく、分子工学によって導入されたＧｌｎ残基であってもよいことが明示される。

【0279】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、リンカーをコンジュゲートするＧｌｎ残基が分子工学によって抗体の重鎖又は軽鎖に導入されている、本発明に係る方法に関する。

【0280】

「分子工学」という用語は、本発明で使用される場合、核酸配列を操作するための分子生物学的方法の使用を指す。本発明では、分子工学を用いて抗体の重鎖又は軽鎖にＧｌｎ残基を導入することができる。一般に、抗体の重鎖又は軽鎖にＧｌｎ残基を導入するための２つの異なる戦略が本発明では想定されている。第１に、抗体の重鎖又は軽鎖の単一残基をＧｌｎ残基で置換してよい。第２に、２つ以上のアミノ酸残基からなるＧｌｎ含有ペプチドタグを抗体の重鎖又は軽鎖に組み込んでよい。そのために、ペプチドタグを重鎖又は軽鎖の内部位置、すなわち重鎖若しくは軽鎖の２つの既存のアミノ酸残基の間に組み込んでもよく、又はそれらを置き換えることによって組み込んでもよく、又はペプチドタグを抗体の重鎖若しくは軽鎖のＮ末端若しくはＣ末端に融合（付加）させてもよい。

【0281】

例えば、得られた抗体がトランスグルタミナーゼによって本発明のリンカーとコンジュゲートすることができる限り、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ残基をＧｌｎ残基で置換してもよい。特定の実施形態においては、抗体は、ＩｇＧ抗体のＣ_Ｈ２ドメインのアミノ酸残基Ｎ２９７（ＥＵ付番）が置換されている抗体であり、特に、置換はＮ２９７Ｑ置換である。Ｎ２９７Ｑ変異を含む抗体は、抗体の重鎖１本あたり１つを超えるリンカーにコンジュゲートし得る。例えば、Ｎ２９７Ｑ変異を含む抗体は、４つのリンカーにコンジュゲートすることができ、１つのリンカーは抗体の第１の重鎖の残基Ｑ２９５にコンジュゲートし、１つのリンカーは抗体の第１の重鎖の残基Ｎ２９７Ｑにコンジュゲートし、１つのリンカーは抗体の第２の重鎖の残基Ｑ２９５にコンジュゲートし、１つのリンカーは抗体の第２の重鎖の残基Ｎ２９７Ｑにコンジュゲートする。当業者は、ＩｇＧ抗体の残基Ｎ２９７をＧｌｎ残基で置換するとアグリコシル化抗体が得られることを認識している。

【0282】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、分子工学によって抗体の重鎖又は軽鎖に導入されているＧｌｎ残基がアグリコシル化ＩｇＧ抗体のＣ_Ｈ２ドメインのＮ２９７Ｑ（ＥＵ付番）である、本発明に係る方法に関する。

【0283】

特定の実施形態においては、本発明は、分子工学によって抗体の重鎖又は軽鎖に導入されているＧｌｎ残基が、（ａ）抗体の重鎖若しくは軽鎖に組み込まれているか又は（ｂ）抗体の重鎖若しくは軽鎖のＮ末端若しくはＣ末端に融合しているペプチドに含まれる、本発明に係る方法に関する。

【0284】

抗体の単一アミノ酸残基を置換する代わりに、トランスグルタミナーゼがアクセス可能なＧｌｎ残基を含むペプチドタグを抗体の重鎖又は軽鎖に導入してもよい。このようなペプチドタグは、抗体の重鎖又は軽鎖のＮ末端又はＣ末端に融合させてよい。あるいは、ペプチドタグを抗体の重鎖又は軽鎖の好適な位置に挿入してもよい。好ましくは、トランスグルタミナーゼがアクセス可能なＧｌｎ残基を含むペプチドタグを抗体の重鎖のＣ末端に融合させる。更により好ましくは、トランスグルタミナーゼがアクセス可能なＧｌｎ残基を含むペプチドタグをＩｇＧ抗体の重鎖のＣ末端に融合させる。抗体の重鎖のＣ末端に融合し、トランスグルタミナーゼの基質として機能し得る幾つかのペプチドタグが、国際公開第２０１２／０５９８８２号及び同第２０１６／１４４６０８号に記載されている。

【0285】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、Ｇｌｎ残基を含むペプチドが抗体の重鎖のＣ末端に融合している、本発明に係る方法に関する。

【0286】

抗体の重鎖又は軽鎖に導入され得る、特に抗体の重鎖のＣ末端に融合し得る例示的なペプチドタグは、ＬＬＱＧＧ（配列番号１）、ＬＬＱＧ（配列番号２）、ＬＳＬＳＱＧ（配列番号３）、ＧＧＧＬＬＱＧＧ（配列番号４）、ＧＬＬＱＧ（配列番号５）、ＬＬＱ，ＧＳＰＬＡＱＳＨＧＧ（配列番号６）、ＧＬＬＱＧＧＧ（配列番号７）、ＧＬＬＱＧＧ（配列番号８）、ＧＬＬＱ（配列番号９）、ＬＬＱＬＬＱＧＡ（配列番号１０）、ＬＬＱＧＡ（配列番号１１）、ＬＬＱＹＱＧＡ（配列番号１２）、ＬＬＱＧＳＧ（配列番号１３）、ＬＬＱＹＱＧ（配列番号１４）、ＬＬＱＬＬＱＧ（配列番号１５）、ＳＬＬＱＧ（配列番号１６）、ＬＬＱＬＱ（配列番号１７）、ＬＬＱＬＬＱ（配列番号１８）、ＬＬＱＧＲ（配列番号１９）、ＥＥＱＹＡＳＴＹ（配列番号２０）、ＥＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号２１）、ＥＥＱＹＮＳＴＹ（配列番号２２）、ＥＥＱＹＱＳ（配列番号２３）、ＥＥＱＹＱＳＴ（配列番号２４）、ＥＱＹＱＳＴＹ（配列番号２５）、ＱＹＱＳ（配列番号２６）、ＱＹＱＳＴＹ（配列番号２７）、ＹＲＹＲＱ（配列番号２８）、ＤＹＡＬＱ（配列番号２９）、ＦＧＬＱＲＰＹ（配列番号３０）、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号３１）、ＬＱＲ、及びＹＱＲである。

【0287】

当業者は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊｏｓｅｐｈ．（２００１）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓに記載されているような分子クローニングの方法によって抗体のアミノ酸残基を置換する又はペプチドタグを抗体に導入する方法を認識している。

【0288】

一般に、当業者は抗体のどの位置にリンカーがコンジュゲートするかを決定する方法を認識している。例えば、コンジュゲーション部位は、抗体－ペイロードコンジュゲートのタンパク質分解消化及び得られた断片のＬＣ－ＭＳ分析によって決定することができる。例えば、サンプルを、それぞれ取扱説明書に従ってＧｌｙｃｉＮＡＴＯＲ（Ｇｅｎｏｖｉｓ）で脱グリコシル化し、その後トリプシンゴールド（質量分析グレード、Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化してよい。従って、１μｇのタンパク質を５０ｎｇのトリプシンと共に３７℃で一晩インキュベートしてよい。ＬＣ－ＭＳ分析は、Ｓｙｎａｐｔ－Ｇ２質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ）に連結したｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＨＰＬＣシステムを用いて行ってよい。そのためには、１００ｎｇのペプチド溶液をＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｓｙｍｍｅｔｒｙ Ｃ１８トラップカラム（Ｗａｔｅｒｓ、部品番号１８６００６５２７）にロードし、流速５μＬ／分の１％バッファＡ（水、０．１％ギ酸）及び９９％バッファＢ（アセトニトリル、０．１％ギ酸）で３分間トラップしてよい。次いで、ペプチドを２５分以内に３％→６５％バッファＢへの直線勾配で溶出してよい。データは、正極性の分離モード及び５０～２０００ｍ／ｚの質量範囲で取得することができる。他の機器の設定は以下の通りであってよい：キャピラリー電圧３．２ｋＶ、サンプリングコーン４０Ｖ、抽出コーン４．０Ｖ、ソース温度１３０℃、コーンガス３５Ｌ／ｈ、ナノフローガス０．１ｂａｒ、及びパージガス１５０Ｌ／ｈ。質量分析計は、［Ｇｌｕ１］－フィブリノペプチドで較正してよい。

【0289】

更に、当業者は、抗体－ペイロードコンストラクトの薬物対抗体（ＤＡＲ）比又はペイロード対抗体比を求める方法を認識している。例えば、ＤＡＲは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）又はＬＣ－ＭＳによって求めることができる。

【0290】

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）では、サンプルを０．５Ｍ硫酸アンモニウムに調整し、ＭＡＢ ＰＡＫ ＨＩＣ Ｂｕｔｙｌカラム（５μｍ、４．６×１００ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を介してＡ（１．５Ｍ硫酸アンモニウム、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５）からＢ（２０％イソプロパノール、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５）へのフル勾配を用いて、１ｍＬ／分及び３０℃で２０分間にわたって評価してよい。通常、４０μｇのサンプルを使用してよく、２８０ｎｍにおけるシグナルを記録してよい。相対ＨＩＣ保持時間（ＨＩＣ－ＲＲＴ）は、２種のＡＤＣ ＤＡＲの絶対保持時間をそれぞれの非コンジュゲートｍＡｂの保持時間で除することにより算出することができる。

【0291】

ＬＣ－ＭＳ ＤＡＲを求める場合、最終濃度が０．０２５ｍｇ／ｍＬになるようにＡＤＣをＮＨ_４ＨＣＯ_３で希釈してよい。その後、４０μＬのこの溶液を室温で５分間１μＬのＴＣＥＰ（５００ｍＭ）で還元し、次いで、１０μＬのクロロアセトアミド（２００ｍＭ）を添加することによってアルキル化し、続いて、暗所において３７℃で一晩インキュベートしてよい。逆相クロマトグラフィーについては、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕ３０００システムをソフトウェアＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎと組み合わせて使用してよい。システムは、７０℃に加熱されたＲＰ－１０００カラム（１０００Å、５μｍ、１．０×１００ｍｍ、Ｓｅｐａｘ）及び波長２１４ｎｍに設定されたＵＶ検出器を備えていてよい。溶媒Ａは０．１％のギ酸を含む水からなり得、溶媒Ｂは０．１％のギ酸を含む８５％のアセトニトリルを含み得る。還元及びアルキル化されたサンプルをカラムにロードし、１４分かけて３０→５５％の溶媒Ｂの勾配によって分離してよい。ＤＡＲ種を同定するために、液体クロマトグラフィーシステムをＳｙｎａｐｔ－Ｇ２質量分析計に連結してもよい。質量分析計のキャピラリー電圧は３ｋＶ、サンプリングコーンは３０Ｖに設定してよく、抽出コーンは合計５Ｖの値になるようにしてよい。ソース温度は１５０℃に、脱溶媒温度は５００℃に、コーンガスは２０ｌ／ｈに、脱溶媒ガスは６００ｌ／ｈに設定してよく、取得は６００～５０００Ｄａの質量範囲においてポジティブモードで１秒のスキャンタイムで行ってよい。機器はヨウ化ナトリウムで較正してよい。ＭａｓｓＬｙｎｘのＭａｘＥｎｔ１アルゴリズムで収束するまでスペクトルのデコンボリューションを実行してよい。クロマトグラフィーのピークにＤＡＲ種を割り当てた後、逆相クロマトグラムの積分ピーク面積に基づいてＤＡＲを計算することができる。

【0292】

特定の実施形態においては、本発明は、抗体に含まれるＧｌｎ残基のγ－カルボキサミド基にリンカーをコンジュゲートする、本発明に係る方法に関する。

【0293】

すなわち、本発明に係るリンカーは、好ましくは、抗体に含まれるＧｌｎ残基、好ましくは本明細書に開示されるＧｌｎ残基のいずれか１つ、より好ましくはＧｌｎ残基Ｑ２９５（ＥＵ付番）の側鎖のアミド基にコンジュゲートする。

【0294】

特定の実施形態においては、本発明は、リンカーが少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％のコンジュゲーション効率でグリコシル化抗体にコンジュゲートするのに好適である、本発明に係る方法に関する。

【0295】

すなわち、特定の実施形態においては、リンカーは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％の効率でグリコシル化抗体にコンジュゲートすることができるリンカーであり得る。好ましい実施形態においては、リンカーは、少なくとも７０％の効率でグリコシル化抗体にコンジュゲートすることができるリンカーであり得る。別の好ましい実施形態においては、リンカーは、少なくとも７５％の効率でグリコシル化抗体にコンジュゲートすることができるリンカーであり得る。別の好ましい実施形態においては、リンカーは、少なくとも８０％の効率でグリコシル化抗体にコンジュゲートすることができるリンカーであり得る。別の好ましい実施形態においては、リンカーは、少なくとも８５％の効率でグリコシル化抗体にコンジュゲートすることができるリンカーであり得る。別の好ましい実施形態においては、リンカーは、少なくとも９０％の効率でグリコシル化抗体にコンジュゲートすることができるリンカーであり得る。別の好ましい実施形態においては、リンカーは、少なくとも９５％の効率でグリコシル化抗体にコンジュゲートすることができるリンカーであり得る。好ましくは、グリコシル化抗体はグリコシル化ＩｇＧ抗体であり、より好ましくは残基Ｎ２９７（ＥＵ付番）でグリコシル化されたＩｇＧ抗体である。

【0296】

当業者は、抗体と特定のリンカーとのコンジュゲーション効率を求める方法を認識している。例えば、コンジュゲーション効率は、本明細書に記載の通り求めることができる。すなわち、抗体、特にＩｇＧ１抗体を、本明細書で定義する条件下でインキュベートしてよい。インキュベーション期間後、還元条件下でＬＣ－ＭＳ分析によりコンジュゲーション効率を求めることができる。トランスグルタミナーゼは、Ｚｅｄｉｒａ（ドイツ）から入手可能なストレプトマイセス・モバラエンシス由来の微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）であってよい。好適なバッファは、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、又はＢｉｓＴｒｉｓのバッファであってよい。しかし、バッファ系の選択は異なっていてもよく、リンカーの化学的性質に大きく依存し得ることを理解されたい。しかし、当業者であれば、本発明の開示に基づいて最適なバッファ条件を特定することができる。あるいは、コンジュゲーション効率は、Ｓｐｙｃｈｅｒら（Ｄｕａｌ，Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１９ １８（１９）：１９２３－１９２７）に記載の通り求め、Ｂｅｎｊａｍｉｎら（Ｔｈｉｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｑ２９５：Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ Ｐａｙｌｏａｄｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ Ｎｅｅｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１９，１６：２７９５－２８０７）に従って分析してもよい。

【0297】

特定の実施形態においては、抗体は、実施例１に記載の通りコンジュゲートし得る。すなわち、５Ｕ／ｍｇ抗体の濃度の微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ、Ｚｅｄｉｒａ）及び５モル当量の指定のリンカーペイロードを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６中で、５ｍｇ／ｍＬのネイティブなグリコシル化モノクローナル抗体を３７℃で２４時間、回転サーモミキサーでインキュベートしてよい。

【0298】

特定の実施形態においては、本発明は、微生物トランスグルタミナーゼがストレプトマイセス属の種、特にストレプトマイセス・モバラエンシスに由来する、本発明に係る方法に関する。

【0299】

すなわち、本発明の方法において使用される微生物トランスグルタミナーゼは、ストレプトマイセス属の種、特に、ストレプトマイセス・モバラエンシスに由来していてよく、優先的にはネイティブな酵素に対して８０％の配列同一性を有する。従って、ＭＴＧはネイティブな酵素であってもよく、ネイティブな酵素の遺伝子操作されたバリアントであってもよい。

【0300】

このような微生物トランスグルタミナーゼの一つは、Ｚｅｄｉｒａ（ドイツ）から市販されている。それは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で組換え的に産生される。ストレプトマイセス・モバラエンシストランスグルタミナーゼは、配列番号３２に開示されているアミノ酸配列を有する。他のアミノ酸配列を有するＳ．モバラエンシスＭＴＧバリアントが報告されており、これも本発明に包含される（配列番号３３及び３４）。

【0301】

別の実施形態においては、ストレプトマイセス・ラダカヌム（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌａｄａｋａｎｕｍ）（以前はストレプトベルチキリウム・ラダカヌム（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌａｄａｋａｎｕｍ）として知られていた）由来の微生物トランスグルタミナーゼを使用してもよい。ストレプトマイセス・ラダカヌムトランスグルタミナーゼ（米国特許第６，６６０，５１０ Ｂ２号）は、配列番号３５に開示されているアミノ酸配列を有する。

【0302】

上記のトランスグルタミナーゼはいずれも、配列が改変されていてもよい。幾つかの実施形態においては、配列番号３２～３５のいずれか１つと８０％、８５％、９０％、又は９５％以上の配列同一性を有するトランスグルタミナーゼを使用することができる。

【0303】

ＡＣＴＩＶＡ ＴＧと呼ばれる別の好適な微生物トランスグルタミナーゼがＡｊｉｎｏｍｏｔｏから市販されている。Ｚｅｄｉｒａ製のトランスグルタミナーゼと比較すると、ＡＣＴＩＶＡ ＴＧはＮ末端のアミノ酸を４つ欠いているが、類似の活性を有する。

【0304】

本発明の文脈において使用され得る更なる微生物トランスグルタミナーゼは、Ｋｉｅｌｉｓｚｅｋ及びＭｉｓｉｅｗｉｃｚ（Ｆｏｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（Ｐｒａｈａ）．２０１４；５９（３）：２４１－２５０）、国際公開第２０１５／１９１８８３ Ａ１号、同第２００８／１０２００７ Ａ１号、及び米国特許出願公開第２０１０／０１４３９７０号に開示されており、これらの内容は参照により本明細書に完全に組み込まれる。

【0305】

特定の実施形態においては、微生物トランスグルタミナーゼの変異体バリアントを、リンカーの抗体へのコンジュゲートに使用することができる。すなわち、本発明の方法において使用される微生物トランスグルタミナーゼは、配列番号３２又は３３に記載のＳ．モバラエンシストランスグルタミナーゼのバリアントであってもよい。特定の実施形態においては、配列番号３２に記載の組換えＳ．モバラエンシストランスグルタミナーゼは、変異Ｇ２５４Ｄを含み得る。特定の実施形態においては、配列番号３２に記載の組換えＳ．モバラエンシストランスグルタミナーゼは、変異Ｇ２５４Ｄ及びＥ３０４Ｄを含み得る。特定の実施形態においては、配列番号３２に記載の組換えＳ．モバラエンシストランスグルタミナーゼは、変異Ｄ８Ｅ及びＧ２５４Ｄを含み得る。特定の実施形態においては、配列番号３２に記載の組換えＳ．モバラエンシストランスグルタミナーゼは、変異Ｅ１２４Ａ及びＧ２５４Ｄを含み得る。特定の実施形態においては、配列番号３２に記載の組換えＳ．モバラエンシストランスグルタミナーゼは、変異Ａ２１６Ｄ及びＧ２５４Ｄを含み得る。特定の実施形態においては、配列番号３２に記載の組換えＳ．モバラエンシストランスグルタミナーゼは、変異Ｇ２５４Ｄ及びＫ３３１Ｔを含み得る。

【0306】

特定の実施形態においては、本発明は、本発明に係る方法で生成された抗体－リンカーコンジュゲートに関する。

【0307】

すなわち、本発明は、前述の工程のいずれかを経て作製された抗体－リンカーコンジュゲートに関する。

【0308】

更に、本発明は、本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲートを含む医薬組成物に関する。

【0309】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲートを含む医薬組成物であって、特に、該抗体－リンカーコンジュゲートが、少なくとも１つのペイロードと、少なくとも１つの薬学的に許容し得る成分とを含む医薬組成物に関する。

【0310】

医薬組成物は、本明細書に開示される一段階又は二段階のプロセスで生成された抗体－ペイロードコンジュゲートを含み得ることを理解されたい。

【0311】

医薬組成物に含まれる抗体－ペイロードコンストラクトに含まれるペイロードの種類は、医薬組成物の用途によって異なる。医薬組成物が疾患の治療に使用される実施形態においては、ペイロードは、好ましくは薬物である。疾患が腫瘍性疾患である場合、ペイロードは好ましくは毒素である。医薬組成物が診断に使用される実施形態においては、ペイロードは好ましくは造影剤である。

【0312】

特定の実施形態においては、本発明は、少なくとも１つの追加の治療的に活性のある剤を含む、本発明に係る医薬組成物に関する。

【0313】

本発明に係る医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容し得る成分を含み得る。

【0314】

薬学的に許容し得る成分とは、対象に対して非毒性である、医薬製剤中の活性成分以外の成分を指す。薬学的に許容し得る成分としては、バッファ、賦形剤、安定剤、又は保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。

【0315】

凍結乾燥製剤又は水溶液の形態の本明細書に記載される抗体－リンカーコンジュゲートの医薬製剤は、所望の純度を有するこのようなコンジュゲートを１つ以上の任意の薬学的に許容し得る成分と混合することにより調製される（Ｆｌｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｌｏ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））。薬学的に許容し得る成分は、一般に、使用される投与量及び濃度でレシピエントにとって無毒であり、そして、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸等のバッファ；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール；メチル若しくはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、若しくは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、若しくはリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、若しくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、若しくはソルビトール等の糖類；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；並びに／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含むが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容し得る成分としては、更に、間質性（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）等のヒト可溶性ＰＨ－２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質が挙げられる。ｒＨｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及びその使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。例えば、ｓＨＡＳＥＧＰをコンドロイチナーゼ等の１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせてもよい。

【0316】

特定の実施形態においては、本発明は、特に抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つのペイロードを含む本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート、又は治療及び／若しくは診断において使用するための本発明に係る医薬組成物に関する。

【0317】

すなわち、本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物は、対象の治療又は対象における疾患若しくは病態の診断において使用することができる。個体又は対象は、好ましくは、哺乳動物である。哺乳動物としては、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びマカク等の非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、個体又は対象はヒトである。本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート又は抗体－リンカーコンジュゲートを含む医薬組成物を治療に使用する場合、リンカーが薬物を含むことが好ましい。本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート又は抗体－リンカーコンジュゲートを含む医薬組成物を診断に使用する場合、リンカーが少なくとも１つの造影剤を含むことが好ましい。

【0318】

特定の実施形態においては、本発明は、特に抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つのペイロードを含む本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート、又は腫瘍性疾患、神経疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、若しくは感染性疾患
・に罹患している、
・を発症するリスクがある、及び／若しくは
・と診断された
患者の治療において使用するための本発明に係る医薬組成物に関する。

【0319】

特定の実施形態においては、本発明は、特に抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つのペイロードを含む本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート、又は腫瘍性疾患に罹患している患者の治療において使用するための本発明に係る医薬組成物に関する。

【0320】

「腫瘍性疾患」という用語は、本発明で使用される場合、細胞の制御不能な異常成長を特徴とする状態を指す。腫瘍性疾患にはがんも含まれる。がんの例としては、がん腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が挙げられるが、これらに限定されない。このようながんのより具体的な例としては、乳がん、前立腺がん、結腸がん、扁平上皮がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、頸部がん、消化器がん、膵臓がん、神経膠芽腫、肝臓がん、膀胱がん、肝細胞がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、唾液腺がん、腎臓がん、外陰がん、甲状腺がん、肝がん、皮膚がん、黒色腫、脳腫瘍、卵巣がん、神経芽細胞腫、骨髄腫、各種頭頸部がん、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、及び末梢神経上皮腫が挙げられる。好ましいがんとしては、肝臓がん、リンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、ユーイング肉腫、及び末梢神経上皮腫が挙げられる。

【0321】

すなわち、本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲートは、好ましくはがんの治療に使用される。このように、特定の実施形態においては、本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲートは、腫瘍細胞上に存在する抗原に特異的に結合する抗体を含む。特定の実施形態においては、抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原であってよい。特定の実施形態においては、腫瘍細胞の表面上の抗原は、抗体－リンカーコンジュゲートが抗原に結合すると、抗体－リンカーコンジュゲートと共に細胞内部に移行し得る。

【0322】

本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲートをがんの治療に使用する場合、抗体－リンカーコンジュゲートは、抗体－リンカーコンジュゲートが結合する腫瘍細胞を殺傷するか又は増殖を阻害する能力を有する少なくとも１つのペイロードを含むことが好ましい。特定の実施形態においては、少なくとも１つのペイロードは、抗体－リンカーコンジュゲートが腫瘍細胞内部に移行した後に細胞毒性活性を示す。特定の実施形態においては、少なくとも１つのペイロードは毒素である。

【0323】

炎症性疾患は、自己免疫疾患であってよい。感染性疾患は、細菌感染であってもウイルス感染であってもよい。

【0324】

特定の実施形態においては、本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート及び／又は医薬組成物は、Ｂ細胞関連がんの治療において使用することができる。

【0325】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、本発明に従って使用するための抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物であって、医薬組成物中に含まれる抗体－リンカーコンジュゲートがポラツズマブを含み、腫瘍性疾患がＢ細胞関連がんである抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物に関する。

【0326】

このためには、抗体－リンカーコンジュゲートが本明細書に開示される抗ＣＤ７９ｂ抗体を含むことが好ましく、好ましくは、抗ＣＤ７９ｂ抗体はＣＤ７９ｂに結合すると標的細胞内部に移行する。特定の実施形態においては、抗ＣＤ７９ｂ抗体は、配列番号３６に記載の重鎖及び配列番号３７に記載の軽鎖を有するポラツズマブである。更に、抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つの毒素を含むことが好ましい。

【0327】

Ｂ細胞関連がんは、高、中、及び低悪性度のリンパ腫（例えば、粘膜関連リンパ組織Ｂ細胞リンパ腫及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）等のＢ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、並びにホジキンリンパ腫、並びにＴ細胞リンパ腫を含む）、並びに白血病（続発性白血病、Ｂ細胞白血病（ＣＤ５＋Ｂリンパ球）等の慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病等の骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）等のリンパ性白血病、及び骨髄異形成を含む）、並びに好塩基球、好酸球、好中球、及び単球等の多形核白血球、樹状細胞、血小板、赤血球、並びにナチュラルキラー細胞を含む追加の造血細胞のがんを含む他の血液学的がん及び／又はＢ細胞若しくはＴ細胞の関連がんからなる群から選択されるいずれか１つであってよい。また、以下から選択されるがん性Ｂ細胞増殖障害も含まれる：リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、侵襲性ＮＨＬ、再発性侵襲性ＮＨＬ、再発性低悪性度ＮＨＬ、難治性ＮＨＬ、難治性低悪性度ＮＨＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫、白血病、ヘアリーセル白血病（ＨＣＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、及びマントル細胞リンパ腫。

【0328】

特定の実施形態においては、本発明は、Ｂ細胞関連がんが非ホジキンリンパ腫であり、特にＢ細胞関連がんがびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、本発明に従って使用するための抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物に関する。

【0329】

更に、抗ＣＤ７９ｂ抗体－リンカーコンジュゲート及び／又は抗ＣＤ７９ｂ抗体－リンカーコンジュゲートを含む医薬組成物は、Ｂ細胞関連がんの治療に適した他の治療法と併用してもよい。

【0330】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、本発明に従って使用するための抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物であって、ベンダムスチン及び／又はリツキシマブと組み合わせて投与される抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物に関する。

【0331】

抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物は、ベンダムスチン及び／又はリツキシマブ等の追加の治療剤と必ずしも同時に投与される必要はないことを理解されたい。その代わり、抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物は、同じ疾患の治療に使用される他の治療剤と異なる投与スケジュールで、その結果、異なる日に投与されてもよい。

【0332】

特定の実施形態においては、本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート及び／又は医薬組成物は、ＨＥＲ２陽性がんの治療において使用することができる。

【0333】

従って、特定の実施形態においては、本発明に従って使用するための抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物であって、医薬組成物中に含まれる抗体－リンカーコンジュゲートがトラスツズマブを含み、腫瘍性疾患がＨＥＲ２陽性がん、特にＨＥＲ２陽性の乳がん、胃がん、卵巣がん、又は肺がんである抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物に関する。

【0334】

このためには、抗体－リンカーコンジュゲートが本明細書に開示される抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体を含むことが好ましく、好ましくは、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体はＨＥＲ２／ｎｅｕに結合すると標的細胞内部に移行する。特定の実施形態においては、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は、配列番号３８に記載の重鎖及び配列番号３９に記載の軽鎖を有するトラスツズマブである。更に、抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つの毒素を含むことが好ましい。

【0335】

ＨＥＲ２陽性がんは、本明細書で使用される場合、限定するものではないが、ＨＥＲ２陽性の乳がん、胃がん、卵巣がん、又は肺がんであり得る。当業者であれば、がんがＨＥＲ２陽性がんであるかどうかを判定することができる。例えば、腫瘍細胞は生検で単離され得、ＨＥＲ２／ｎｅｕの存在は当技術分野で公知の任意の方法で判定され得る。

【0336】

更に、抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体－リンカーコンジュゲート及び／又は抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体－リンカーコンジュゲートを含む医薬組成物は、ＨＥＲ２細胞陽性がんの治療に適した他の治療法と併用してもよい。

【0337】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、本発明に従って使用するための抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物であって、ラパチニブ、カペシタビン、及び／又はタキサンと組み合わせて投与される、抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物に関する。

【0338】

抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物は、ラパチニブ、カペシタビン、及び／又はタキサン等の追加の治療剤と必ずしも同時に投与される必要はないことを理解されたい。その代わり、抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物は、同じ疾患の治療に使用される他の治療剤と異なる投与スケジュールで、その結果、異なる日に投与されてもよい。

【0339】

特定の実施形態においては、本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート及び／又は医薬組成物は、ネクチン－４陽性がんの治療に使用することができる。

【0340】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、本発明に従って使用するための抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物であって、医薬組成物中に含まれる抗体－リンカーコンジュゲートがエンホルツマブ又はエンホルツマブバリアントを含み、腫瘍性疾患が、ネクチン－４陽性がん、特にネクチン－４陽性の膵臓がん、肺がん、膀胱がん、又は乳がんである抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物に関する。

【0341】

このためには、抗体－リンカーコンジュゲートが本明細書に開示される抗ネクチン－４抗体を含むことが好ましく、好ましくは、抗ネクチン－４抗体はネクチン－４に結合すると標的細胞内部に移行する。特定の実施形態においては、抗ネクチン－４抗体は、配列番号４０又は配列番号４２に記載の重鎖及び配列番号４１に記載の軽鎖を有するエンホルツマブである。更に、抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つの毒素を含むことが好ましい。

【0342】

ネクチン－４陽性がんは、本明細書で使用される場合、限定されるものではないが、ネクチン－４陽性の膵臓がん、肺がん、膀胱がん、又は乳がんであり得る。当業者であれば、がんがネクチン－４陽性がんであるかどうかを判定することができる。例えば、腫瘍細胞は生検で単離され得、ネクチン－４の存在は当技術分野で公知の任意の方法で判定され得る。

【0343】

更に、抗ネクチン－４抗体－リンカーコンジュゲート及び／又は抗ネクチン－４抗体－リンカーコンジュゲートを含む医薬組成物は、ネクチン－４細胞陽性がんの治療に適した他の治療法と併用してもよい。

【0344】

従って、特定の実施形態においては、本発明は、本発明に従って使用するための抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物であって、シスプラチンベースの化学療法剤及び／又はペンブロリズマブと組み合わせて投与される、抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物に関する。

【0345】

抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物は、シスプラチンベースの化学療法剤及び／又はペムブロリズマブ等の追加の治療剤と必ずしも同時に投与される必要はないことを理解されたい。その代わり、抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物は、同じ疾患の治療に使用される他の治療剤と異なるスケジュールで、その結果、異なる日に投与されてもよい。

【0346】

特定の実施形態においては、本発明は、特に抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つのペイロードを含む本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲートの使用、又は腫瘍性疾患、神経疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、若しくは感染性疾患
・に罹患している、
・を発症するリスクがある、及び／若しくは
・と診断された
患者を治療するための医薬を製造するための本発明に係る医薬組成物の使用に関する。

【0347】

特定の実施形態においては、本発明は、腫瘍性疾患を治療又は予防する方法であって、特に抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つのペイロードを含む本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート又は本発明に係る医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法に関する。

【0348】

特定の実施形態においては、本発明は、術前、術中若しくは術後のイメージングに使用するための、特に抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つのペイロードを含む本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート又は本発明に係る医薬組成物に関する。

【0349】

すなわち、本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲートは、医療用イメージングにおいて使用することができる。そのために、特定の標的分子、細胞、又は組織に結合している間に抗体－リンカーコンジュゲートを可視化することができる。特定のペイロードを可視化するために、当技術分野では様々な技術が知られている。例えば、ペイロードが放射性核種である場合、抗体－リンカーコンジュゲートが結合する分子、細胞、又は組織をＰＥＴ又はＳＰＥＣＴによって可視化することができる。ペイロードが蛍光色素の場合、抗体－リンカーコンジュゲートが結合する分子、細胞、又は組織は蛍光イメージングによって可視化することができる。特定の実施形態においては、本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲートは、２つの異なるペイロード、例えば放射性核種及び蛍光色素を含む。この場合、抗体－リンカーコンジュゲートが結合する分子、細胞、又は組織は、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ及び蛍光イメージング等の２つの異なる及び／又は補完的なイメージング技術を用いて可視化することができる。

【0350】

抗体－リンカーコンジュゲートは、術前、術中、及び／又は術後のイメージングに使用することができる。

【0351】

術前イメージングは、特定の疾患又は病態を診断する際に特定の標的分子、細胞、又は組織を可視化し、任意で手術のガイダンスを提供するために手術前に実施され得る全てのイメージング技術を包含する。術前イメージングは、腫瘍上の抗原に特異的に結合し、放射性核種を含むペイロードにコンジュゲートする抗体を含む抗体－リンカーコンジュゲートを用いることによって、手術前にＰＥＴ又はＳＰＥＣＴにより腫瘍を可視化する工程を含んでいてもよい。

【0352】

術中イメージングは、特定の標的分子、細胞、又は組織を可視化し、手術のガイダンスを提供するために手術中に実施され得る全てのイメージング技術を包含する。特定の実施形態においては、近赤外蛍光イメージングによって手術中に腫瘍を可視化するために、近赤外蛍光色素を含む抗体－リンカーコンジュゲートを使用することがる。術中イメージングにより、外科医は手術中に特定の組織、例えば腫瘍組織を特定することができるようになるため、腫瘍組織を完全に除去できるようになる。

【0353】

術後イメージングは、特定の標的分子、細胞、又は組織を可視化し、手術の結果を評価するために手術後に実施され得る全てのイメージング技術を包含する。術後イメージングは術前の手術と同様に行うことができる。

【0354】

特定の実施形態においては、本発明は、２つ以上の異なるペイロードを含む抗体－リンカーコンジュゲートに関する。例えば、抗体－リンカーコンジュゲートは、放射性核種及び近赤外蛍光色素を含み得る。このような抗体－ペイロードコンジュゲートは、ＰＥＴ／ＳＰＥＣＴ及び近赤外蛍光イメージングによるイメージングに使用することができる。このような抗体の利点は、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴによって手術の前及び後に標的組織、例えば腫瘍を可視化するために使用できることである。同時に、手術中に近蛍光赤外イメージングによって腫瘍を可視化することもできる。

【0355】

特定の実施形態においては、本発明は、術中画像誘導がん手術において使用するための、特に抗体－リンカーコンジュゲートが少なくとも１つのペイロードを含む本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート又は本発明に係る医薬組成物に関する。

【0356】

上述したように、本発明の抗体－リンカーコンジュゲートは、標的分子、細胞、又は組織を可視化し、手術中に外科医又はロボットを誘導するために使用することができる。すなわち、抗体－リンカーコンジュゲートは、例えば近赤外イメージングによって手術中に腫瘍組織を可視化し、腫瘍組織を完全に除去することを可能にするために使用することができる。

【0357】

本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物は、疾患を効率的に治療するか又は診断目的に十分な量又は投与量で、ヒト又は動物の対象に投与してよい。

【0358】

本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物は、非経口、肺内、及び経鼻、並びに局所治療が望ましい場合には、病巣内、子宮内、又は膀胱内投与を含む任意の好適な手段によって投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下への投与を含む。投与が短期間であるか慢性的であるかに一部依存するが、任意の好適な経路、例えば静脈内注射又は皮下注射等の注射によって投薬を行ってもよい。単回投与又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが本明細書において企図される。

【0359】

本発明に合致した方法で製剤化、投薬、及び投与することができる本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物は、適正医療行為に合致した方法で製剤化、投薬、及び投与することができる。この状況において考慮すべき要因は、治療される具体的な障害、治療される具体的な哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医師に公知の他の要因を含む。本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物は、必ずしもそうである必要はないが、任意で、対象となる障害を予防又は治療するために現在使用されている１つ以上の剤と共に製剤化される。このような他の剤の有効量は、製剤中に存在する抗体－リンカーコンジュゲートの量、障害又は治療の種類、及び上で論じた他の要因に依存する。これらは、一般的に、本明細書に記載するのと同じ投与量及び投与経路で、又は本明細書に記載する投薬量の約１～９９％で、又は任意の投薬量で、そして、実験的に／臨床的に適切であると判定された任意の経路によって用いられる。

【0360】

疾患を予防又は治療するため、本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物の適切な投薬量（単独で使用又は１つ以上の他の追加の治療剤と併用するとき）は、治療される疾患の種類、抗体－ペイロードコンジュゲートの種類、疾患の重症度及び経過、抗体－リンカーコンジュゲートが予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、薬歴、患者の臨床歴及び抗体－リンカーコンジュゲートに対する応答、並びに主治医の裁量に依存する。本発明に係る抗体－リンカーコンジュゲート又は医薬組成物は、好適には一度に又は一連の治療にわたって患者に投与される。

【実施例】

【0361】

一般法
抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ、薬局で購入）、並びにペプチド－リンカー及びリンカー－ペイロード（それぞれＬｉｆｅＴｅｉｎ及びＬｅｖｅｎａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａによってカスタム合成）は全て市販されていた。配列番号３６及び３７の配列からなる重鎖及び軽鎖を有するポラツズマブを浮遊適応性のＣＨＯ－Ｋ１細胞に一過的にトランスフェクトし、無血清／動物成分不含培地で発現させた。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって上清からタンパク質を精製した。

【0362】

ネイティブのグリコシル化されたモノクローナル抗体、微生物トランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ、Ｚｅｄｉｒａ）、及び指定のペプチド－リンカー又はリンカー－ペイロードを回転サーモミキサー内のバッファ中で混合することによって、コンジュゲーション反応を行った。ＤＴＴ還元条件下でＬＣ－ＭＳによりコンジュゲーション効率を評価した。５０ｍＭ ＤＴＴ（最終）及び５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファ中３７℃で１５分間サンプルをインキュベートすることにより、サンプルの還元を達成した。Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗａｔｅｒｓ）及びＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラムに連結されたＸｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ ＱＴＯＦ（Ｗａｔｅｒｓ）でプローブを分析した。デコンボリューションしたスペクトルからコンジュゲーション効率（ＣＥ）を計算し、％で提示した。以下の式による計算のために、両糖型（Ｇ１Ｆ及びＧ０Ｆ）から得られる強度を考慮した。

【0363】

【数1】

【0364】

式中、ｃｊ＝コンジュゲートされている、ｎｃｊ＝コンジュゲートされていない。

【0365】

実施例１：最適化された反応条件の特定
方法
２つの異なる反応条件セットを用いて反応を行った：条件１：Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ ｐＨ７．６中１ｍｇ／ｍＬのネイティブのグリコシル化されたトラスツズマブ抗体、６Ｕ／ｍｇの濃度のＭＴＧ、及び８０モル当量の指定のペプチド－リンカー又はリンカー－ペイロードを回転サーモミキサーにおいて３７℃で２０時間、又は条件２：Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ ｐＨ７．６中５ｍｇ／ｍＬのネイティブなグリコシル化されたトラスツズマブ抗体、５Ｕ／ｍｇの濃度のＭＴＧ、及び５モル当量の指定のペプチド－リンカー又はリンカー－ペイロードを回転式サーモミキサーにおいて３７℃で２４時間。一般法に記載の通りＬＣＭＳによってコンジュゲーション効率を評価した。

【0366】

結果
驚くべきことに、表３に示すように、ペプチドリンカー及びリンカーペイロードの当量が実質的に少なく（８０モル当量対５モル当量）、ＭＴＧ濃度が低い（５Ｕ／ｍｇ対６Ｕ／ｍｇ）場合、優れたコンジュゲーション効率が得られた。更により際立ったことに、官能化されたペプチド又はリンカーペイロードを用いると、条件２、すなわちペプチド－リンカー又はリンカー－ペイロードを８０ではなく５モル当量使用することでコンジュゲーション効率が著しく向上した。この所見は、様々なリンカーだけでなく、様々なペイロードクラス（３種の細胞毒素：ＭＭＡＥ、マイタンシン、及びエキサテカン、並びに１種のステロイド：コルチゾール）についても当てはまり、これは非常に驚くべきことである。

【0367】

【表3】

【0368】

実施例２：更なる反応条件の特定
リジン－リンカー－ペイロードを用いたコンジュゲーションが多種多様な反応条件に耐えることを実証するために、パラメータを変化させた様々な反応条件を用いてリンカー－ペイロードのポラツズマブへのコンジュゲーションを行った。

【0369】

方法
標準条件として、以下のパラメータを使用した：Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ ｐＨ７．６中５ｍｇ／ｍＬのネイティブなグリコシル化されたポラツズマブ抗体、５Ｕ／ｍｇの濃度のＭＴＧ、及び５モル当量のＲＫＡＡ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥを回転式サーモミキサーにおいて３７℃で２４時間。

【0370】

可変パラメータを表４に示す。

【0371】

ＬＣＭＳで以下の通りコンジュゲーション効率を評価した：デコンボリューションしたスペクトルからコンジュゲーション効率（ＣＥ）を計算し、％で提示した。以下の式による計算のために、両糖型（Ｇ１Ｆ及びＧ０Ｆ）から得られる強度を考慮した。

【0372】

【数2】

【0373】

式中、ｃｊ＝コンジュゲートされている、ｎｃｊ＝コンジュゲートされていない。

【0374】

結果
ＲＫＡＡ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥリンカー－ペイロードは、非常に広い範囲の反応条件にわたって非常に高いコンジュゲーション効率でコンジュゲートした：抗体濃度５～１７ｍｇ／ｍＬ、抗体濃度に対するＭＴＧ濃度（Ｕ／ｍｇ）２～１０Ｕ／ｍｇで、８０％を超えるコンジュゲーション効率が得られた。更に、リンカー対抗体のモル濃度（２～８当量）及び非常に広範囲のｐＨでも高いコンジュゲーション効率が得られた（ｐＨ６．０でのコンジュゲーション効率６７％からｐＨ８では８６％）。

【0375】

驚くべきことに、抗体に対するリンカーペイロード過剰が低下するほど、より高いコンジュゲーション効率が得られた、すなわち、２～２０当量のリンカーペイロードからは８０当量のリンカーペイロードを用いた場合よりも高いコンジュゲーション効率が得られ、これは予想に反していた（表４）。

【0376】

【表4】

【0377】

実施例３：更なる反応条件の特定
リンカー濃度の重要性を実証するために、様々な配列及びペイロードを有する更なるリンカーを、様々な濃度で抗体ポラツズマブ及びトランツズマブにコンジュゲートした。

【0378】

方法
標準条件として、以下のパラメータを使用した：Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ ｐＨ７．６中３．５ｍｇ／ｍＬのネイティブなグリコシル化されたポラツズマブ又はトラスツズマブ抗体及び５Ｕ／ｍｇの濃度のＭＴＧを回転式サーモミキサーにおいて３７℃で２４時間。リンカーＲＫＡＡ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ、ＫＡＲ－ＰＡＢＣ－ＭＭＡＥ、及びＡＨＫ－ＰＡＢＣ－Ｅｘａを様々な濃度で反応混合物に添加した。

【0379】

可変パラメータを表５に示す。

【0380】

以下の通りＲＰＬＣによってコンジュゲーション効率を評価した：還元後、ＢｉｏＲｅｓｏｌｖｅ ＲＰ ｍＡｂ Ｐｏｌｙｐｈｅｎｙｌカラムを用いたＵＨＰＬＣ Ｄｉｏｎｅｘ ＵｌｔｉＭａｔｅ ３０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）でサンプルを分析した。式に従ってＲＰＬＣクロマトグラムから抽出した相対ピーク面積を用いてコンジュゲーション効率（ＣＥ）を計算し、％で提示した。

【0381】

【数3】

【0382】

式中、ｃｊ＝コンジュゲートされている、ｎｃｊ＝コンジュゲートされていない。

【0383】

結果
試験した全てのリンカーで、５～２０当量のリンカーペイロードを反応に添加すると、並外れて高いコンジュゲーション効率が得られた。

【0384】

【表5】

【配列表】

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【国際調査報告】