知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
▶ デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッドの特許一覧
特表2024-540058誘導性クラスターキメラ抗原受容体（ＣＣＡＲ）構築物の開発
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】誘導性クラスターキメラ抗原受容体（ＣＣＡＲ）構築物の開発
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20241024BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/57 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/40 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/19 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/63 Z
C12N15/13
C12N15/12
C12N15/57
C12N15/40
C12N15/19
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525221
(86)(22)【出願日】2022-11-03
(85)【翻訳文提出日】2024-06-25
(86)【国際出願番号】 US2022079218
(87)【国際公開番号】W WO2023081754
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】63/275,752
(32)【優先日】2021-11-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】399052796
【氏名又は名称】デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100103182
【弁理士】
【氏名又は名称】日野 真美
(74)【代理人】
【識別番号】100227008
【弁理士】
【氏名又は名称】大賀 沙央里
(72)【発明者】
【氏名】レーア，ジェンズ ジー．
(72)【発明者】
【氏名】クノーチェル，バージット
(57)【要約】
クラスターＣＡＲおよび治療用ペイロード核酸、それらを含有する免疫細胞、ならびに調節可能な養子細胞治療およびＣＡＲ Ｔ細胞抵抗性腫瘍細胞の殺傷のためのそれらの使用が開示されている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の核酸、第２の核酸、および第３の核酸のうちの少なくとも１つを含む核酸構築物であって、前記第１の核酸が、第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する第１の抗原結合性ドメインを含む第１の細胞外ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１のシグナル伝達ドメインおよびプロテアーゼドメインを含む第１の細胞内ドメインとを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、前記第２の核酸が、第２のＴＡＡに結合する第２の抗原結合性ドメインを含む第２の細胞外ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２のシグナル伝達ドメイン、前記プロテアーゼにより認識される切断部位、および転写活性化因子を含む細胞内ドメインとを含む第２のＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結された第２のプロモーターを含み、
前記第３の核酸が、前記転写活性化因子に結合する転写アクセプターと、第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターと作動可能に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸とを含む、
核酸構築物。
【請求項2】
前記第１、前記第２、および前記第３の核酸を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項3】
前記第１、前記第２、および前記第３の核酸のうちの２つを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項4】
前記第１のプロモーター、前記第２のプロモーター、または前記第１のプロモーターと前記第２のプロモーターの両方が、ＥＦ－１α、ＣＭＶ、ＰＧＫ、ＲＰＢＳＡ、ＡｍｐＲ、またはＣＡＧプロモーターである、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項5】
前記第１および前記第２のプロモーターがＥＦ－１αプロモーターである、請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項6】
前記第１の抗原結合性ドメイン、前記第２の抗原結合性ドメイン、または前記第１の抗原結合性ドメインと前記第２の抗原結合性ドメインの両方が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＦＣＲＨ５、ＧＰＲＣ５Ｄ、またはＳＬＡＭＦ７に結合する、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項7】
前記第１および前記第２の抗原結合性ドメインがＢＣＭＡに結合する、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項8】
前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸配列【化1】
【化2】
【請求項9】
前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインがＣＤ３８に結合する、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項10】
前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸配列【化3】
【化4】
【請求項11】
前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインがＳＬＡＭＦ７に結合する、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項12】
前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸配列【化5】
【化6】
【請求項13】
前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインがＦＣＲＨ５に結合する、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項14】
前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸配列【化7】
【化8】
【請求項15】
前記第１および前記第２の抗原結合性ドメインが同じＴＡＡに結合する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項16】
前記第１および前記第２の抗原結合性ドメインが同じアミノ酸配列を有する、請求項１５に記載の核酸構築物。
【請求項17】
前記第１または前記第２の膜貫通ドメインがＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ２８、またはＣＤ１３７に由来する、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項18】
前記第１および前記第２の膜貫通ドメインがＣＤ２８に由来する、請求項１７に記載の核酸構築物。
【請求項19】
前記第１および前記第２の膜貫通ドメインが、アミノ酸配列ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号５０）を有する、請求項１８に記載の核酸構築物。
【請求項20】
前記第１の細胞外ドメインが、前記第１の抗原結合性ドメインと前記第１の膜貫通ドメインとの間に配置された第１のヒンジドメインをさらに含み、前記第２の細胞外ドメインが、前記第２の抗原結合性ドメインと前記第２の膜貫通ドメインとの間に配置された第２のヒンジドメインをさらに含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項21】
前記第１および前記第２のヒンジドメインがＣＤ８α、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ４に由来する、請求項２０に記載の核酸構築物。
【請求項22】
前記第１および前記第２のヒンジドメインがＣＤ８αに由来する、請求項２１に記載の核酸構築物。
【請求項23】
前記第１および前記第２のヒンジドメインがアミノ酸配列ＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＫＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹ（配列番号５４）を含む、請求項２２に記載の核酸構築物。
【請求項24】
前記第１のシグナル伝達ドメイン、前記第２のシグナル伝達ドメイン、または前記第１のシグナル伝達ドメインと前記第２のシグナル伝達ドメインの両方が、一次シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、または一次シグナル伝達ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインの両方を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項25】
前記第１のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含み、前記第２のシグナル伝達ドメインがＣＤ２８一次シグナル伝達ドメインを含む、請求項２４に記載の核酸構築物。
【請求項26】
前記第１のシグナル伝達ドメイン、前記第２のシグナル伝達ドメイン、または前記第１のシグナル伝達ドメインと前記第２のシグナル伝達ドメインの両方が、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン、および４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインまたはＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、または４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインとＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの両方を含む、請求項２４に記載の核酸構築物。
【請求項27】
前記第１および前記第２のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインならびに４－１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項２６に記載の核酸構築物。
【請求項28】
前記ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインがアミノ酸配列【化9】
【請求項29】
前記第１のＣＡＲが、前記プロテアーゼドメインのＮ末端側にある第１のリンカーをさらに含み、前記第２のＣＡＲが、前記切断部位のＮ末端側にある第２のリンカーをさらに含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項30】
前記プロテアーゼドメインが、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶｐ）に由来し、前記切断部位がＴＥＶｐにより切断可能な配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項31】
前記切断部位がアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＭ（配列番号８３）を含む、請求項３０に記載の核酸構築物。
【請求項32】
前記転写活性化因子がＧａｌ４－ＶＰ６４融合タンパク質を含み、前記転写アクセプターがＧａｌ４結合部位を含み、前記第３のプロモーターが改変型ＣＭＶプロモーターである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項33】
前記治療用ペイロードが、抗体断片、サイトカイン、可溶性サイトカイン受容体、ケモカイン、可溶性ケモカイン受容体、ＲＮＡもしくはオリゴペプチドワクチン、または表面受容体を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項34】
前記治療剤が、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＧＦβ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４に結合する抗体断片を含む、請求項３３に記載の核酸構築物。
【請求項35】
前記治療用ペイロードが、二重特異性抗体断片または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを含む、請求項３４に記載の核酸構築物。
【請求項36】
前記治療用ペイロードが、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖ、およびＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＥＧＦＲ、ＦＣＲＨ５、Ｆｌｔ３、ＧＰＣＲ５Ｄ、ＰＳＭＡ、またはＳＬＡＭＦ７に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体断片を含む、請求項３５に記載の核酸構築物。
【請求項37】
前記治療用ペイロードが、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体断片を含む、請求項３６に記載の核酸構築物。
【請求項38】
前記治療用ペイロードが、アミノ酸配列【化10】
【請求項39】
前記治療用ペイロードが、ＣＤ２０に結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体断片を含む、請求項３６に記載の核酸構築物。
【請求項40】
前記治療用ペイロードが、ＦＣＲＨ５に結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体断片を含む、請求項３６に記載の核酸構築物。
【請求項41】
前記治療用ペイロードが、アミノ酸配列【化11】
【請求項42】
前記治療用ペイロードが、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、またはケモカイン受容体に結合する抗体断片を含む、請求項３３に記載の核酸構築物。
【請求項43】
前記抗体断片がＩＬ－６またはＩＬ－６Ｒに結合する、請求項４２に記載の核酸構築物。
【請求項44】
前記治療用ペイロードが、サイトカイン、可溶性サイトカイン受容体、ケモカイン、または可溶性ケモカイン受容体を含む、請求項３３に記載の核酸構築物。
【請求項45】
前記サイトカインまたはケモカインが、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、またはＴＧＦβである、請求項４４に記載の核酸構築物。
【請求項46】
前記サイトカインまたはケモカインが、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、またはＴＧＦβである、請求項４５に記載の核酸構築物。
【請求項47】
前記可溶性サイトカイン受容体または前記ケモカイン受容体が可溶性ＩＦＮγＲまたは可溶性ＩＬ－２Ｒである、請求項４５に記載の核酸構築物。
【請求項48】
前記治療用ペイロードがＲＮＡまたはオリゴペプチドワクチンを含む、請求項３３に記載の核酸構築物。
【請求項49】
前記ＲＮＡまたはオリゴペプチドワクチンが、サバイビン、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、またはＣＴ７に対して方向付けられている、請求項４６に記載の核酸構築物。
【請求項50】
前記治療用ペイロードが表面受容体を含む、請求項３３に記載の核酸構築物。
【請求項51】
前記表面受容体がＣＡＲ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２を含む、請求項５０に記載の核酸構築物。
【請求項52】
前記第１のリンカー、前記第２のリンカー、または前記第１のリンカーと前記第２のリンカーの両方が、アミノ酸配列ＧＧＧＸ、ＧＧＧＧＸ（配列番号８９）、またはＧＳＳＧＳＸ（配列番号９０）を含み、ＸはＣかまたはＳのいずれかである、請求項２９～５１のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項53】
前記リンカーがアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９４）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号９５）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号９６）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号９７）、またはＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号９８）を有する、請求項５２に記載の核酸。
【請求項54】
請求項１～５３のいずれか一項に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項55】
レンチウイルスベクターである、請求項５４に記載のベクター。
【請求項56】
遺伝子改変型免疫細胞を産生する方法であって、第１の核酸構築物、第２の核酸構築物、および第３の核酸構築物を免疫細胞へ導入するステップを含み、前記第１の核酸構築物が、第１のＴＡＡに結合する第１の抗原結合性ドメインを含む第１の細胞外ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１のシグナル伝達ドメインおよびプロテアーゼドメインを含む第１の細胞内ドメインとを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、
前記第２の核酸構築物が、第２のＴＡＡに結合する第２の抗原結合性ドメインを含む第２の細胞外ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２のシグナル伝達ドメイン、前記プロテアーゼにより認識される切断部位、および転写活性化因子を含む細胞内ドメインとを含む第２のＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結された第２のプロモーターを含み、
前記第３の核酸構築物が、前記転写活性化因子に結合する転写アクセプターと、第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターと作動的に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸とを含む、方法。
【請求項57】
前記第１のＣＡＲが、前記プロテアーゼドメインのＮ末端側にある、第１のシグナル伝達ドメインおよび第１のリンカーをさらに含み、前記第２のＣＡＲが、前記切断部位のＮ末端側にある、第２のシグナル伝達ドメインおよび第２のリンカーをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記第１、第２、および前記第３の核酸構築物が１つのベクターにより前記免疫細胞へ導入される、請求項５６に記載の方法。
【請求項59】
前記第１、第２、および前記第３の核酸構築物のうちの２つが、第１のベクターにより前記免疫細胞へ導入され、前記３つの核酸構築物の３番目が第２のベクターにより前記免疫細胞へ導入される、請求項５６に記載の方法。
【請求項60】
第１の核酸構築物、第２の核酸構築物、および第３の核酸構築物を含む、遺伝子改変型免疫細胞であって、前記第１の核酸構築物が、第１のＴＡＡに結合する第１の抗原結合性ドメインを含む第１の細胞外ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１のシグナル伝達ドメインおよびプロテアーゼドメインを含む第１の細胞内ドメインとを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、
前記第２の核酸構築物が、第２のＴＡＡに結合する第２の抗原結合性ドメインを含む第２の細胞外ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２のシグナル伝達ドメイン、前記プロテアーゼにより認識される切断部位、および転写活性化因子を含む細胞内ドメインとを含む第２のＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結された第２のプロモーターを含み、
前記第３の核酸構築物が、前記転写活性化因子に結合する転写アクセプターと、第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターと作動的に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸とを含む、
免疫細胞。
【請求項61】
前記第１のＣＡＲが、前記プロテアーゼドメインのＮ末端側にある、第１のシグナル伝達ドメインおよび第１のリンカーをさらに含み、前記第２のＣＡＲが、前記切断部位のＮ末端側にある、第２のシグナル伝達ドメインおよび第２のリンカーをさらに含む、請求項６０に記載の免疫細胞。
【請求項62】
前記第１、第２、および前記第３の核酸構築物が１つのベクター内に配置されている、請求項６０に記載の免疫細胞。
【請求項63】
前記第１、第２、および前記第３の核酸構築物のうちの２つが第１のベクター内に配置され、前記３つの核酸構築物の３番目が第２のベクター内に配置されている、請求項６０に記載の免疫細胞。
【請求項64】
Ｔ細胞である、請求項６０～６３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項65】
ＣＤ８＋ Ｔ細胞である、請求項６４に記載の免疫細胞。
【請求項66】
ＮＫ細胞である、請求項６０～６３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項67】
請求項６３～６６のいずれか一項に記載の治療的有効数の免疫細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項68】
癌を処置する方法であって、それを必要としている対象に、請求項６７に記載の薬学的組成物を投与するステップ
を含む、方法。
【請求項69】
前記対象が、以前ＣＡＲ－Ｔ細胞治療またはＢｉＴｅ治療を受けている、請求項６８に記載の方法。
【請求項70】
前記癌が固形腫瘍により特徴付けられる、請求項６８に記載の方法。
【請求項71】
固形腫瘍により特徴付けられる前記癌が、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝癌、前立腺癌、脳癌、胃腸癌、精巣癌、子宮癌、および小児癌である、請求項７０に記載の方法。
【請求項72】
前記癌が血液癌である、請求項６８に記載の方法。
【請求項73】
前記血液癌が多発性骨髄腫、白血病、またはリンパ腫である、請求項７２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願
この出願は、２０２１年１１月４日に出願された米国仮出願第６３／２７５，７５２号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）による優先権の利益を主張し、その米国仮出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
この出願は、２０２１年１１月４日に出願された米国仮出願第６３／２７５，７５２号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ． § １１９（ｅ）による優先権の利益を主張し、その米国仮出願は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【0002】
配列表
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出されており、かつ全体として参照により本明細書に組み入れられている配列表を含有する。２０２２年１１月３日に作成された前記ＸＭＬコピーは、ファイル名が５２０９５＿７５１００１ＷＯ＿ＳＴ．ｘｍｌであり、サイズが１５７ＫＢバイトである。
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出されており、かつ全体として参照により本明細書に組み入れられている配列表を含有する。２０２２年１１月３日に作成された前記ＸＭＬコピーは、ファイル名が５２０９５＿７５１００１ＷＯ＿ＳＴ．ｘｍｌであり、サイズが１５７ＫＢバイトである。
【背景技術】
【0003】
癌のほとんど全部の型は、薬剤抵抗性を発生し、処置に対して不応性となり得る。驚異的な数の多様な薬剤抵抗性機構があり、その機構には、遺伝的に異なる癌細胞の競合的成長を伴うクローン進化、細胞状態の転写変化を有する癌細胞のエピジェネティックな適応、および薬剤標的発現の喪失をもたらす選択的スプライシング事象が挙げられる。癌抵抗性機構を克服すること、および特に播種性癌を有する、癌患者の治癒を見出すことは、依然として重要な医学的必要性がある。
【0004】
さらに、腫瘍細胞は、それらの細胞上の免疫療法標的をいくつかの細胞内因性機構により排除することが知られており、その機構には、癌細胞表面上の標的タンパク質の、転写状態変化およびエピジェネティックな適応を通しての下方制御、標的タンパク質の遺伝子欠失、標的タンパク質の変異、スプライシングを通しての免疫療法結合部位の除去、立体構造変化を通しての標的マスキング、ならびに産生関連機構が挙げられる。
【0005】
したがって、正常な非疾患組織を温存しながら、有効な治療用物質を腫瘍部位へ特異的に送達する必要性がある。そのような方法および系は、全身投与された場合に通常なら高度に毒性であろう治療用物質の効果的な投与を可能にするだろう。たいていの新生物は、身体にわたって均一に分布するというよりむしろクラスターとして成長しかつ転移する傾向にあるため、それらはまた、特に魅力的であろう。
【発明の概要】
【0006】
本開示の第１の態様は、３つの核酸のうちの少なくとも１つを含有する核酸構築物を対象とする。第１の核酸は、第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する第１の抗原結合性ドメインを有する第１の細胞外ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、ならびに第１のシグナル伝達ドメインおよびプロテアーゼドメインを含む第１の細胞内ドメインを含有する第１のキメラ抗原受容体（本明細書では、「プロテアーゼＣＡＲ」とも呼ばれる）をコードする核酸と作動可能に連結された第１のプロモーターを含有する。３つの核酸の第２の核酸は、ＴＡＡに結合する第２の抗原結合性ドメインを含有する第２の細胞外ドメイン、第２の膜貫通ドメイン、ならびに第２のシグナル伝達ドメイン、プロテアーゼにより認識される切断部位、および転写活性化因子を含有する第２の細胞内ドメインを含有する第２のＣＡＲ（本明細書では、「活性化ＣＡＲ」とも呼ばれる）をコードする核酸と作動可能に連結された第２のプロモーターを含有する。３つの核酸の第３の核酸は、転写活性化因子に結合する転写アクセプター、第３のプロモーター、ならびに第３のプロモーターと作動的に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸を含有する。
【0007】
本開示の別の態様は、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、第３の核酸、３つの核酸のうちの２つの部分的組合せ、または３つ全部の核酸をコードする核酸構築物を含有するベクターを対象とする。
【0008】
本開示のさらに別の態様は、遺伝子改変型免疫細胞を産生する方法を対象とする。方法は、第１の核酸構築物、第２の核酸構築物、および第３の核酸構築物を免疫細胞へ導入するステップを伴い、第１の核酸構築物が、第１のＴＡＡに結合する抗原結合性ドメインを含有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに第１のシグナル伝達ドメインおよびプロテアーゼドメインを含有する細胞内ドメインを含有するプロテアーゼＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含有し；第２の核酸構築物が、第２のＴＡＡに結合する抗原結合性ドメインを含有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに第２のシグナル伝達ドメイン、プロテアーゼにより認識される切断部位、および転写活性化因子を含有する細胞内ドメインを含有する活性化ＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含有し；ならびに第３の核酸構築物が、転写活性化因子に結合する転写アクセプター、第３のプロモーター、ならびに第３の核酸構築物のプロモーターと作動的に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸を含有する。
【0009】
本開示のさらに別の態様は、第１の核酸、第２の核酸、および第３の核酸を含有する遺伝子改変型免疫細胞を対象とする。
【0010】
本開示のさらに別の態様は、治療的有効数の遺伝子改変型免疫細胞および薬学的に許容される担体を含有する薬学的組成物を対象とする。
【0011】
本開示の別の態様は、癌を処置する方法を対象とする。方法は、必要としている対象に薬学的組成物を投与するステップを伴う。
【0012】
動作理論によって縛られるつもりはないが、癌患者への投与時、遺伝子改変型免疫細胞は、癌細胞と結合する際、本明細書でクラスターＣＡＲ（ｃＣＡＲ）細胞と呼ばれる免疫細胞が、免疫細胞の膜上の発現または細胞外スペースへの放出として治療用ペイロードを産生し、その後、その治療用ペイロードは、すぐ近接した他の癌細胞に結合し、治療効果（例えば、殺傷）を発揮する点における「クラスター効果」により治療効力を達成すると出願人は考えている。本明細書に開示された実施例は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）へ適用可能な治療用クラスターＣＡＲ系が、どのように健康な組織を実質的に温存しながら、効率的に腫瘍部位への、治療用物質の送達を可能にするかを実証している。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1】細胞が治療用ペイロードを腫瘍細胞の近くに送達するｃＣＡＲ系の態様を概略的に示す図である。ｃＣＡＲ系は、ＣＡＲ媒介性殺傷を、治療用ペイロードの送達を通してのＣＡＲ非依存性殺傷と組み合わせる。ｃＣＡＲ細胞は、同じかまたは２つの異なるかのいずれかの表面ＴＡＡをエンゲージする、プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲを発現する。ＣＡＲエンゲージメントは、結果として、ＣＡＲ特異的殺傷（内側の四角形）、加えて治療用ペイロード依存性殺傷（内側の円）を生じる。治療用ペイロードは、ｃＣＡＲ細胞の近くで有効な濃度で存在するのみであり、したがって、内側の円の外側の安全ゾーン（外側の円）に存在する非疾患細胞を温存する。
【図2】抗ＢＣＭＡプロテアーゼＣＡＲ、抗ＢＣＭＡ活性化ＣＡＲ、および治療用ペイロードをコードする第３の核酸のドメインを概略的に示す図である。
【図3A】どのようにしてｃＣＡＲ細胞が産生され、かつ治療用ペイロードの腫瘍特異的送達を提供するように作用するのかを示す一連の概略図である。Ｔ細胞上のプロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲによる２つの腫瘍表面タンパク質の認識が、免疫学的シナプスにおけるＣＡＲの癒着をもたらし、それが、ＣＡＲ媒介性細胞傷害性に加えて、治療用ペイロードの転写および分泌をもたらす事象のカスケードを引き起こす。
【図3B】同上。
【図3C】同上。
【図3D】同上。
【図3E】同上。
【図3F】同上。
【図3G】同上。
【図3H】同上。
【図4A】プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、治療用ペイロードをコードする第３の核酸のうちの２つ以上を発現するｃＣＡＲ細胞の実施形態を示す一連のフローサイトメトリープロットであり、プロテアーゼＣＡＲは追加としてｍｙｃタグレポーターをコードし、活性化ＣＡＲは短縮型ＥＧＦＲレポーターをコードし、第３の核酸は追加としてｍＣｈｅｒｒｙレポーターをコードする。プロテアーゼＣＡＲは抗ｍｙｃ－ＡＰＣ抗体で検出され、活性化ＣＡＲは抗ＥＧＦＲ－ＰＥ抗体で検出され、第３の核酸はｍＣｈｅｒｒｙペプチドにより直接的に検出される。図４Ａは、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および第３の核酸を発現する細胞の一連のフローサイトメトリープロットである。
【図5A】プロテアーゼＣＡＲをコードする核酸を含有するベクター、および活性化ＣＡＲをコードする核酸を含有するベクター、および第３の核酸を含有するベクターを示す概略図である。
【図5B】同上。
【図5C】同上。
【図6】ビーズのカウント数に対する生きているＯＰＭ２細胞の比率の関数として決定された場合、ｃＣＡＲ細胞が、プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲの両方、加えて第３の核酸を発現した時、標的癌細胞を殺傷することを示す棒グラフである。
【図7】ＧＦＰ＋ ｃＣＡＲ細胞のパーセンテージにより決定された場合、ｃＣＡＲ細胞は、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および第３の核酸の全部が発現している時、モデル治療用ペイロードとしてのＧＦＰを発現することを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【0014】
他に定義がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本明細書の主題が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書および添付の特許請求の範囲に用いられる場合、反対に特定されることがない限り、以下の用語は、本開示の理解を促進するために、示された意味をもつ。
【0015】
本説明および添付の特許請求の範囲で用いられる場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈上、明らかに他の指図がない限り、「１つまたは複数」を意味し、したがって、複数の指示対象を含む。このように、例えば、「１つの組成物」への言及は、２つ以上のそのような組成物の混合物を含み、「１つの阻害剤」への言及は、２つ以上のそのような阻害剤の混合物を含むなどである。
【0016】
他に明記されない限り、用語「約」は、当技術分野における通常の許容誤差の範囲内、例えば、平均値の標準偏差の２倍以内として理解される。「約」は、述べられた値の１０％内、９％内、８％内、７％内、６％内、５％内、４％内、３％内、２％内、１％内、０．５％内、０．１％内、０．０５％内、または０．０１％内として理解され得る。文脈上、別なふうに明らかでない限り、本明細書に提供される全ての数値は、用語「約」により修飾される。
【0017】
本明細書で用いられる場合、用語「およそ」は、他に明記されない限り、または文脈上、別なふうに明白でない限り、述べられた参照値のいずれかの方向で（より大きい、またはより小さい）の２５％内、２０％内、１９％内、１８％内、１７％内、１６％内、１５％内、１４％内、１３％内、１２％内、１１％内、１０％内、９％内、８％内、７％内、６％内、５％内、４％内、３％内、２％内、１％内、またはそれ未満内に入る値（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）の範囲を指す。
【0018】
「含む（include(s)）」、「含むこと（including）」、「含有する（contain(s)）」、「含有すること（containing）」、または「により特徴付けられる（characterized by）」と同義である移行句「含むこと（comprising）」は、包含的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。対照的に、移行句「からなる」および「からなること」は、特許請求の範囲に特定されていないいかなる要素または方法ステップ（または句「からなること」が結びついている特定の要素または方法ステップ）も除外する。移行句「から本質的になること」は、特許請求の範囲を、特定された要素および方法またはステップ、ならびに特許請求された開示の「基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しない、列挙されていない要素および方法ステップ」に限定する。
【0019】
核酸構築物
一態様において、本開示は、３つの核酸のうちの少なくとも１つを含有する核酸構築物であって、第１の核酸が、第１のＴＡＡに結合する第１の抗原結合性ドメインを有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびプロテアーゼドメインを含有する細胞内ドメインを含む第１のプロテアーゼキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含有する、核酸構築物を提供する。３つの核酸の第２の核酸は、第２のＴＡＡに結合する抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにプロテアーゼにより認識される切断部位および転写活性化因子を含有する細胞内ドメインを含む活性化ＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含有する。３つの核酸の第３の核酸は、転写活性化因子に結合する転写アクセプター、プロモーター、ならびに第３の核酸のプロモーターと作動的に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸を含有する。
一態様において、本開示は、３つの核酸のうちの少なくとも１つを含有する核酸構築物であって、第１の核酸が、第１のＴＡＡに結合する第１の抗原結合性ドメインを有する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、およびプロテアーゼドメインを含有する細胞内ドメインを含む第１のプロテアーゼキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含有する、核酸構築物を提供する。３つの核酸の第２の核酸は、第２のＴＡＡに結合する抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにプロテアーゼにより認識される切断部位および転写活性化因子を含有する細胞内ドメインを含む活性化ＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結されたプロモーターを含有する。３つの核酸の第３の核酸は、転写活性化因子に結合する転写アクセプター、プロモーター、ならびに第３の核酸のプロモーターと作動的に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸を含有する。
【0020】
本明細書で用いられる場合、用語「抗原」および「ＴＡＡ」は、癌細胞により発現した標的分子を指す。抗原は、タンパク質、ペプチド、ペプチドとタンパク質の複合体（例えば、ＭＨＣ分子と結合したペプチド）、タンパク質と炭水化物の複合体（例えば、糖タンパク質）、タンパク質と脂質の複合体（例えば、リポタンパク質）、タンパク質と核酸の複合体（例えば、核タンパク質）、炭水化物、脂質、または核酸であり得る。
【0021】
当技術分野において知られているように、本明細書で用いられる場合、用語「核酸」は、ヌクレオチドのポリマーを指し、ヌクレオチドのそれぞれは、ヌクレオシド（核酸塩基および五炭糖）およびリン酸エステルからなる有機分子である。ヌクレオチドという用語は、別段具体的に明記されない限り、または文脈から明らかでない限り、リボース糖を有するヌクレオシド（すなわち、リボ核酸、ＲＮＡを形成するリボヌクレオチド）または２‘－デオキシリボース糖を有するヌクレオシド（すなわち、デオキシリボ核酸、ＤＮＡを形成するデオキシリボヌクレオチド）を含む。ヌクレオチドは、核酸ポリマーまたはポリヌクレオチドのモノマー単位としての役割を果たす。ＤＮＡにおける４つの核酸塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、およびチミン（Ｔ）である。ＲＮＡにおける４つの核酸塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、およびウラシル（Ｕ）である。核酸は、１個のヌクレオチドのホスホリル基と隣接ヌクレオチドにおける糖（すなわち、リボースまたは２’－デオキシリボース）のヒドロキシル基との間の一連のエステル結合により化学結合したヌクレオチド（例えば、少なくとも３個のヌクレオチド）の直線状の鎖である。本関連において、核酸は、それらが導入され得る免疫細胞に対して外因的であることは理解されている。
【0022】
本明細書で用いられる場合、用語「プロモーター」は、それが作動可能に連結されている対応する核酸コード配列（本開示の関連においては、ＣＡＲまたは治療用ペイロード）の転写を直接的または間接的に制御する非コード核酸を指す。プロモーターは、転写を制御するように単独で機能し得、またはそれは、１つもしくは複数の他の制御配列（例えば、発現ベクター内に存在し得るエンハンサーもしくはサイレンサー、または制御エレメント）と協力して作用し得る。プロモーターは、同じ鎖の遺伝子の転写開始部位の近くで、かつそのＤＮＡ上の上流に（センス鎖の５’領域の方に）位置する。プロモーターの長さは典型的には、約１００～１０００塩基対の範囲である。
【0023】
本明細書で用いられる場合、用語「作動的に連結された」は、核酸コード配列が、その核酸コード配列によりコードされるタンパク質の発現を駆動するように、プロモーターに対して、核酸構築物において空間的に位置しまたは配置されていると理解することができる。
【0024】
いくつかの実施形態において、核酸構築物は、第１、第２、および第３の核酸のうちの２つを含む。いくつかの実施形態において、核酸構築物は第１、第２、および第３の核酸を含む。
【0025】
プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および治療用ペイロードをコードする核酸の発現は、それぞれ、天然プロモーターまたは合成プロモーターであり得るプロモーターによって調節される。いくつかの実施形態において、プロモーターの１つまたは複数は、伸長因子１アルファ（ＥＦ－１α）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、β－アクチン、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ＲＰＢＳＡ（合成、スリーピングビューティ由来）、またはＣＡＧ（合成、ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント、ニワトリβ－アクチン、およびウサギβ－グロビンのスプライスアクセプター）のプロモーターに由来する。タンパク質または核酸配列に言及する時の、本明細書で用いられる場合の用語「由来する」は、別の親配列が起源である配列を指す。親配列に由来する配列は、同一であり得、または親配列の一部分であり得、または親配列からの少なくとも１つのバリアントを有し得る。バリアントは、置換、挿入、または欠失を含み得る。したがって、例えば、親配列に由来するアミノ酸配列は、親のアミノ酸の特定の範囲について同一であり得るが、その特定の領域以外のアミノ酸を含まない。
【0026】
いくつかの実施形態において、プロモーターは、核酸コード配列の最初の所の近くに位置するコア領域を有し得る。いくつかの実施形態において、プロモーターは、天然プロモーターと比べて改変されている。１つの改変は、メチル化感受性部位（例えば、シトシンヌクレオチドの後にグアニンヌクレオチドが続く、すなわち「ＣｐＧ」）の除去を伴う。別の改変は、ＤＮＡメチル化抑制転写因子に結合する制御配列の付加を伴う。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、足場マトリックス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）として知られたＡ／Ｔリッチな、核マトリックスと相互作用する配列を含み、それは、形質転換効率を増強し、導入遺伝子発現の安定性を向上させ得る。
【0027】
第１、第２、および第３のプロモーターは、同じまたは異なり得る。いくつかの実施形態において、第１、第２、および第３のプロモーターは異なる。いくつかの実施形態において、第１および第２のプロモーターは同じであり、第３のプロモーターは、第１および第２のプロモーターと異なる。いくつかの実施形態において、第１および第３のプロモーターは同じであり、第２のプロモーターは異なる。いくつかの実施形態において、第２および第３のプロモーターは同じであり、第１のプロモーターは異なる。
【0028】
ＥＦ－１αプロモーターは、ＮＣＢＩアクセッション番号Ｊ０４６１７．１で提供されている。改変型ＣＭＶプロモーターのバリエーションは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹ２１８８４８、ＡＦ４７７２００、Ｍ６４７５４、およびＡＦ２８６０７６で提供されている。ＰＧＫプロモーターは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００００２３．１１、範囲７８１０４２４８～７８１２９２９５で提供されている。ＲＰＢＳＡプロモーターは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＭＮ８１１１１９．１において提供されている。ＣＡＧプロモーターは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＭＧ７６３２３３．１において提供されている。いくつかの実施形態において、プロモーターの１つまたは複数はＥＦ－１αに由来する。いくつかの実施形態において、第１および第２のプロモーターはＥＦ－１αに由来する。いくつかの実施形態において、第１および第２のプロモーターは、ＥＦ－１αに由来し、第３のプロモーターはＣＭＶに由来する。
【0029】
プロテアーゼＣＡＲの抗原結合性ドメイン（本明細書では、「第１の抗原結合性ドメイン」とも呼ばれる）および活性化ＣＡＲの抗原結合性ドメイン（本明細書では、「第２の抗原結合性ドメイン」とも呼ばれる）はそれぞれ、ＴＡＡに結合する。ＴＡＡは、同じまたは異なり得る。いくつかの実施形態において、第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインのいずれかまたは両方はＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＦＣＲＨ５、ＧＰＲＣ５Ｄ、またはＳＬＡＭＦ７に結合する。
【0030】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインは抗体断片である。いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）および軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含有する単鎖可変抗体断片（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインは、リンカーにより相互接続された、抗体軽鎖の可変ドメインおよび抗体重鎖の可変ドメインを含有する。
【0031】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインはＢＣＭＡに結合する。いくつかの実施形態において、抗原結合性ドメインは、市販の抗ＢＣＭＡ抗体、およびそのＢＣＭＡ結合性断片、またはその誘導体、例えば、ベランタマブ（Ｂｌｅｎｒｅｐ（登録商標））、リンボセルタマブ（ＲＥＧＮ５４５８）、パカナロタマブ（ＡＭＧ ４２０）、パブルタマブ（ＡＭＧ ７０１）、およびテクリスタマブ（Ｔｅｃｖａｙｌｉ（登録商標））に由来し、それらの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は表１に示されている。いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインは、抗ＢＣＭＡ抗体の軽鎖の可変ドメインおよび重鎖の可変ドメインを含有し、その可変ドメインはリンカーにより接続されている。
【0032】
【表1】
【0033】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインは、下記に示されたアミノ酸配列（配列番号１０）を有するＶＬを含有する：
【0034】
【化1】
【0035】
追加として、第１および／または第２の抗原結合性ドメインは、下記に示されたアミノ酸配列（配列番号１１）を有するＶＨを含有する：
【0036】
【化2】
【0037】
追加の抗ＢＣＭＡ結合性ドメインは当技術分野において知られている。例えば、米国特許第１０，０７２，０８８号および第１１，０８４，８８０号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０１３１６５５号、第２０１７／０２２６２１６号、第２０１８／０１３３２９６号、第２０１９／０１５１３６５号、第２０１９／０３８１１７１号、第２０２０／０３３９６９９号、第２０２０／００５５９４８号、および第２０２２／００６４３１６号明細書を参照されたい。
【0038】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインはＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態において、その抗原結合性ドメインは、市販の抗ＣＤ１９抗体、その抗ＣＤ１９結合性断片、またはその誘導体、例えば、ロンカスツキシマブ（Ｚｙｎｌｏｎｔａ（登録商標））、タファシタマブ（Ｍｏｎｊｕｖｉ（登録商標））、デニンツズマブ（ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ）、およびイネビリズマブ（Ｕｐｌｉｚｎａ（登録商標））に由来し、それらの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は表２に示されている：
【0039】
【表2】
【0040】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメイン、例えば、ｓｃＦｖはＣＤ２０に結合する。いくつかの実施形態において、その抗原結合性ドメインは、市販の抗ＣＤ２０抗体、そのＣＤ２０結合性断片、またはその誘導体、例えば、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）、Ｋｅｓｉｍｐｔａ（登録商標））、ベルツズマブ（ＩＭＭＵ－１０６）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、およびリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｒｉａｂｎｉ（登録商標）、Ｔｒｕｘｉｍａｂ（登録商標））に由来し、それらの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は表３に示されている：
【0041】
【表3】
【0042】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインはＣＤ３８に結合する。いくつかの実施形態において、その抗原結合性ドメインは、市販の抗ＣＤ３８抗体、そのＣＤ３８結合性断片、またはその誘導体、例えば、ダラツムマブ（Ｄａｒｚａｌｅｘ（登録商標））、イサツキシマブ（Ｓａｒｃｌｉｓａ（登録商標））、およびメザジタマブ（ＴＡＫ－０７９）に由来し、それらの重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は表４に示されている：
【0043】
【表4】
【0044】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインは、下記に示されたアミノ酸配列（配列番号３６）を有するＶＬを含有する：
【0045】
【化3】
【0046】
追加として、第１および／または第２の抗原結合性ドメインは、下記に示されたアミノ酸配列（配列番号３７）を有するＶＨを含有する：
【0047】
【化4】
【0048】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメイン、例えば、ｓｃＦｖはＣＤ１３８に結合する。抗ＣＤ１３８抗体およびそのＣＤ１３８結合性断片は当技術分野において知られている。例えば、米国特許第９，２２１，９１４号、第９，３８７，２６１号、第９，４４６，１４６号、および第１０，９７５，１５８号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００７／０１８３９７１号、第２００９／０２３２８１０号、第２０１８／０３１２５６１号、第２０１９／０１００５８８号、第２０２０／０３８４０２４号、および第２０２０／０３９２２４１号明細書を参照されたい。
【0049】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメイン、例えば、ｓｃＦｖはＦＣＲＨ５に結合する。抗ＦＣＲＨ５抗体およびそのＦＣＲＨ５結合性断片は当技術分野において知られており、例えば、セボスタマブ、および米国特許第８，４６６，２６０号、第９，０１７，９５１号、第１０，３２３，０９４号、第１０，４３５，４７１号明細書である。代表的な抗ＦＣＲＨ５重鎖のアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号３８）：
【0050】
【化5】
【0051】
代表的な抗ＦＣＲＨ５軽鎖のアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号３９）：
【0052】
【化6】
【0053】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインは、下記に示されたアミノ酸配列（配列番号４０）を有するＶＬを含有する：
【0054】
【化7】
【0055】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインは、下記に示されたアミノ酸配列（配列番号４１）を有するＶＨを含有する：
【0056】
【化8】
【0057】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメイン、例えば、ｓｃＦｖはＧＰＲＣ５Ｄに結合する。抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体およびそのＧＰＲＣ５Ｄ結合性断片は当技術分野において知られており、例えば、タルケタマブ、米国特許第１０，５６２，９６８号および第１０，５９０，１９６号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１９／０３６７６１２号、第２０２０／０１２３２５０号、第２０２０／０１９０２０５号、第２０２０／０２７０３２６号、第２０２１／００５４０９４号明細書である。代表的な抗ＦＣＲＨ５抗体ｓｃＦｖ断片のアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号４２）：
【0058】
【化9】
【0059】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメイン、例えば、ｓｃＦｖはＳＬＡＭＦ７に結合する。いくつかの実施形態において、その抗原結合性ドメインは、市販の抗ＳＬＡＭＦ７抗体、ＳＬＡＭＦ７結合性断片、またはその誘導体、例えば、エロツズマブ（Ｅｍｐｌｉｃｉｔｉ（登録商標））に由来する。エロツズマブ重鎖のアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号４３）：
【0060】
【化10】
【0061】
エロツズマブ軽鎖のアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号４４）：
【0062】
【化11】
【0063】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインは、下記に示されたアミノ酸配列（配列番号４５）を有するＶＬを含有する：
【0064】
【化12】
【0065】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の抗原結合性ドメインは、下記に示されたアミノ酸配列（配列番号４６）を有するＶＨを含有する：
【0066】
【化13】
【0067】
追加の抗ＳＬＡＭＦ７抗体およびそのＳＬＡＭＦ７結合性断片は、当技術分野において知られている。例えば、ＳＬＡＭＦ７に結合する代表的な抗体および抗体ｓｃＦｖ断片には、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている抗体、カタログ番号１２－２２２９－４２（クローン１６２）、ＭＡ５－２４２２７（クローン５２０９１４）、ＣＦ８０７４２１（クローンＯＴＩ１Ｆ１）、５７８２３－ＭＳＭ１－Ｐ１ＡＢＸ（クローン３６４９）、ＰＡ５－６３１２５（ポリクローナル）、およびＰＡ５－２５５８９（ポリクローナル）が挙げられる。
【0068】
いくつかの実施形態において、プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲ、それぞれの第１の抗原結合性ドメインおよび第２の抗原結合性ドメインは同じＴＡＡに結合する。これらの実施形態のいくつかにおいて、第１および第２の抗原結合性ドメインは同じアミノ酸配列を有する。
【0069】
プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲ、それぞれの第１の膜貫通ドメインおよび第２の膜貫通ドメインは、抗原結合性ドメインを細胞内ドメインに接続する。いくつかの実施形態において、第１および／または第２の膜貫通ドメインは抗原結合性ドメインへ直接的に接続される。
【0070】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ３α、ＣＤ３β、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１５４、４－１ＢＢ（別名ＣＤ１３７またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９））、ＦｃεＲＩα、ＦｃεＲＩβ、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、またはＮＫＧ２Ｄに由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、またはＣＤ１３７（４－１ＢＢ）に由来する。代表的な膜貫通ドメインのアミノ酸配列は表５に列挙されている：
【0071】
【表5】
【0072】
天然に存在する膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、そのような領域の、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインとの結合を回避するようにアミノ酸置換によって改変され得る。例えば、米国特許出願公開第２０２１／０１０１９５４号明細書；Soudais et al., Nat Genet 3:77-81 (1993)；Muller et al., Front. Immunol. 12:639818-13 (2021)；および Elazar et al., elife 11:e75660-29 (2022)を参照されたい。
【0073】
いくつかの実施形態において、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、または両方のＣＡＲは、抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインとの間に配置されたヒンジドメインをさらに含む。ヒンジドメインは、抗原結合性ドメインが抗原結合のための最適な配向を得ることを可能にするという点で、可動性を与え得、それにより、ＣＡＲを発現する細胞の抗腫瘍活性を増強する。プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲのヒンジドメインは、それぞれ、第１のヒンジドメインおよび第２のヒンジドメインとも呼ばれ、同じまたは異なり得る。
【0074】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２のヒンジドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭに由来する。いくつかの実施形態において、第１および／または第２のヒンジドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４に由来する。代表的なヒンジドメインのアミノ酸配列は表６に列挙されている：
【0075】
【表6】
【0076】
いくつかの実施形態において、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、またはプロテアーゼＣＡＲと活性化ＣＡＲの両方の細胞内ドメインは、それぞれ、本明細書では第１の細胞内ドメインおよび第２の細胞内ドメインとも呼ばれ、細胞内シグナル伝達および免疫細胞機能を可能にするシグナル伝達ドメインを含有する。シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＩＴＡＭ含有分子またはＴＣＲ受容体複合体などの受容体複合体の天然ライゲーションのそれを近似して、シグナルを送達する能力がある。第１および第２の細胞内ドメインに存在し得るシグナル伝達ドメインは同じまたは異なり得る。したがって、いくつかの実施形態において、第１および第２の細胞内ドメインは、同じ一次シグナル伝達ドメインおよび異なる共刺激ドメイン、または逆であり得る。
【0077】
いくつかの実施形態において、第１および／または第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、４－１ＢＢ、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳ、およびＯＸ４０から選択される、本明細書に記載された複数の、例えば、２つまたは３つの、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインとしてＣＤ３ζドメイン、および細胞外から細胞内への方向に、共刺激シグナル伝達ドメインの以下のペア、すなわち、４－１ＢＢ－ＣＤ２７；ＣＤ２７－４－１ＢＢ；４－１ＢＢ－ＣＤ２８；ＣＤ２８－４－１ＢＢ；４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ；ＣＤ３ζ－４－１ＢＢ；ＣＤ２８－ＣＤ３ζ；ＣＤ３ζ－ＣＤ２８；ＯＸ４０－ＣＤ２８、およびＣＤ２８－ＯＸ４０のいずれかを含み得る。いくつかの実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＭｙＤ８８、またはＯＸ４０に由来する。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ２８、ＣＤ７２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＬＥＣ－１、４－１ＢＢ、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、デクチン－１、ＦｃαＲＩ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、ＩＬ－２ＲＢ、ＩＣＯＳ、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＭｙＤ８８、ＯＸ４０、およびＺＡＰ７０のうちの１つまたは複数に由来する。代表的なシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列は表７に列挙されている。
【0078】
【表7-1】
【0079】
【表7-2】
【0080】
いくつかの実施形態において、一次シグナル伝達ドメインはＣＤ２８に由来し、共刺激ドメインは、４－１ＢＢに由来する。いくつかの実施形態において、一次シグナル伝達ドメインはＣＤ２８に由来し、共刺激ドメインはＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、一次シグナル伝達ドメインはＣＤ２８に由来し、共刺激ドメインは４－１ＢＢおよびＣＤ３ζに由来する。
【0081】
ＣＤ２８の追加のアイソフォームのアミノ酸配列は表８に提供されている。
【0082】
【表8】
【0083】
プロテアーゼＣＡＲの細胞内ドメインはプロテアーゼドメインを含有する。いくつかの実施形態において、プロテアーゼは、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ（ＴＥＶｐ）、ＮＥＤＰ１プロテアーゼ、カルパインプロテアーゼ、またはＳＵＭＯプロテアーゼに由来する。ＴＥＶｐ（酵素番号３．４．２２．４４、別名ＴＥＶ核封入ａエンドペプチダーゼ）は、核封入ａプロテアーゼの触媒活性２７ｋＤａ Ｃ末端ドメインである。ＴＥＶｐは、配列特異性が高いシステインプロテアーゼである（Dougherty et al., Virology 172(1):302-10 (1989)）。代表的なＴＥＶｐのアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号８１）：
【0084】
【化14】
【0085】
ＴＥＶｐは切断部位を認識する。ＴＥＶｐは、７個の残基の標的アミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＸ（配列番号８２）を認識し、ここでＸはＭ、Ｇ、またはＳである。切断されるペプチド結合は、ＱとＸの間である。いくつかの実施形態において、切断部位はアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＭ（配列番号８３）を有する。
【0086】
カルパインプロテアーゼは当技術分野において知られている。例えば、米国特許第７，００１，９０７号および第９，８３３，４９８号明細書を参照されたい。ＮＥＤＰ１プロテアーゼは当技術分野において知られている。例えば、米国特許第７，８４２，４６０号、第８，６４２，２５６号、および第１０，４６６，２４９号明細書を参照されたい。ＳＵＭＯプロテアーゼは当技術分野において知られている。例えば、米国特許第７，７５０，１３４号、第８，１１９，３６９号、第１０，７６７，１８５号、および第１１，２６１，４３７号明細書を参照されたい。他の酵素切断系または転写系が報告されており、代替としてまたは追加の「オン」のスイッチとして、この開示の範囲内である。例えば、Barnea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105(1):64-9 (2008)、およびMorsut et al., Cell 164(4):780-91 (2016)を参照されたい。
【0087】
いくつかの実施形態において、プロテアーゼＣＡＲは、下記に示された核酸配列（配列番号８４）を有し、表９に示された特徴を含有し、ｐＬＶＣ－ＣＭＶ １００構築物バックグラウンドへ組み入れられ得る。
【0088】
【化15-1】
【0089】
【化15-2】
【0090】
【化15-3】
【0091】
【化15-4】
【0092】
【表9】
【0093】
活性化ＣＡＲの細胞内ドメインは、転写活性化因子を含有し、その転写活性化因子は、第３の核酸に存在する転写アクセプターと共に、治療用ペイロードの転写および発現を調節する細胞の「オンのスイッチ」としての役割を果たす。いくつかの実施形態において、転写活性化因子は、Ｇａｌ４－ＶＰ６４融合タンパク質をコードする。代表的なＧａｌ４－ＶＰ６４融合タンパク質のアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号８６）：
【0094】
【化16】
【0095】
いくつかの実施形態において、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、またはプロテアーゼＣＡＲと活性化ＣＡＲの両方のドメインのうちの１つまたは複数は、リンカーにより相互接続されている。いくつかの実施形態において、プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲのどちらも、膜貫通ドメインと細胞内ドメインとの間に配置されたリンカーを有する。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＸ、ＧＧＧＧＸ（配列番号８７）、またはＧＳＳＧＳＸ（配列番号８８）（ここでＸはシステイン（Ｃ）かまたはセリン（Ｓ）のいずれかである）のアミノ酸配列またはその反復配列を有する。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＧＧＧＣ（配列番号８９）、ＧＧＧＳ（配列番号９０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９１）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９２）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号９３）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号９４）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号９５）、またはＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号９６）のアミノ酸配列を有する。
【0096】
いくつかの実施形態において、活性化ＣＡＲは、下記に示された核酸配列（配列番号９７）を有し、表１０に示された特徴を含有し、ｐＬＶＣ－ＣＭＶ １００構築物バックグラウンドへ組み入れられ得る：
【0097】
【化17-1】
【0098】
【化17-2】
【0099】
【化17-3】
【0100】
【化17-4】
【0101】
【表10-1】
【0102】
【表10-2】
【0103】
第３の核酸は、転写アクセプター、第３のプロモーター、ならびに第３のプロモーターと作動的に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸を含有する。転写活性化因子が、プロテアーゼＣＡＲのプロテアーゼにより活性化ＣＡＲから切断されたならば、転写活性化因子は転写アクセプターと結合する。転写活性化因子の転写アクセプターとの結合は、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸の転写を惹起する。
【0104】
いくつかの実施形態において、転写アクセプターは、Ｇａｌ４結合部位またはＧａｌ４結合部位の反復である。いくつかの実施形態において、転写アクセプターは、核酸配列ＧＧＡＧＣＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧＡＡＣＧ（配列番号９９）を有する。いくつかの実施形態において、転写アクセプターは、その配列の２個以上、例えば、２～４個の反復を含有する。
【0105】
第３のプロモーターは、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸と作動的に連結されている。第３のプロモーターおよび転写アクセプターは、治療用ペイロードの転写を可能にする。いくつかの実施形態において、第３のプロモーターは改変型ＣＭＶプロモーターである。
【0106】
治療用ペイロードは、ＣＡＲ非依存性腫瘍細胞殺傷を可能にする。治療用ペイロードは可溶性または膜結合型であり得る。本明細書で用いられる場合、治療用ペイロードに言及する時の用語「可溶性」は、膜貫通ドメインを欠損し、かつ細胞から発現した時、細胞膜と付着または会合していないタンパク質を指す。リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸は、転写活性化因子が転写アクセプターに結合した後、転写される。リーダーペプチドは、治療用ペイロードの細胞外環境への分泌を保証する。
【0107】
いくつかの実施形態において、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、治療用ペイロード、またはプロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および治療用ペイロードのそれぞれは、リーダーペプチドをさらに含む。本明細書で用いられる場合、用語「リーダーペプチド」は、タンパク質の輸送を方向付ける、タンパク質のＮ末端におけるまたはタンパク質の膜貫通ドメインに組み込まれたアミノ酸の短い（例えば、５～３０または１０～１００アミノ酸長）ストレッチを指す。リーダーペプチド含有タンパク質は、細胞膜へ輸送されるか、または細胞から分泌されるかのいずれかである。典型的には、リーダーペプチドを有しかつ膜貫通ドメインを含まないタンパク質が分泌される。
【0108】
いくつかの実施形態において、リーダーペプチドは、アルブミン、ＣＤ８α、ＣＤ３３、エリスロポイエチン、ＩＬ－２、ヒトもしくはマウスＩｇ－カッパ鎖Ｖ－ＩＩＩ（ＩｇＫ ＶＩＩＩ）、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、または分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）に由来する。適切なリーダーペプチドは、天然配列から導き出せる合成配列である。代表的なリーダーペプチドのアミノ酸配列は表１１に列挙されている：
【0109】
【表11】
【0110】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、可溶性抗体断片、サイトカイン、可溶性サイトカイン受容体、ケモカイン、可溶性ケモカイン受容体、またはオリゴペプチドもしくはＲＮＡワクチンである。
【0111】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、ＣＤ３、ＣＤ１９、またはＣＤ２０に結合する抗体断片である。その断片は、ＣＤ３、ＣＤ１９、およびＣＤ２０に結合する無傷抗体から導き出せる。例えば、ＣＤ３に結合する抗体の代表的な例には、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（登録商標））、カツマキソマブ（Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標））、フロテツズマブ（ＭＧＤ００６）、ムロモナブ－ＣＤ３（オルソクローンＯＫＴ３（登録商標））、オテリキシズマブ（ＣｈＡｇｌｙＣＤ３、ＴＲＸ４）、テプリズマブ、およびビシリズマブが挙げられる。
【0112】
ＣＤ１９に結合する代表的な抗体には、ロンカスツキシマブ（Ｚｙｎｌｏｎｔａ（登録商標））、タファシタマブ（Ｍｏｎｊｕｖｉ（登録商標））、デニンツズマブ（ＳＧＮ－ＣＤ１９Ａ）、およびイネビリズマブ（Ｕｐｌｉｚｎａ（登録商標））が挙げられる。
【0113】
ＣＤ２０に結合する代表的な抗体には、オファツムマブ（Ｋｅｓｉｍｐｔａ（登録商標））、オビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ（登録商標））、オカラツズマブ、ウブリツキシマブ、ベルツズマブ（ＩＭＭＵ－１０６）、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、およびリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））が挙げられる。
【0114】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、免疫寛容誘発性分子またはチェックポイント阻害剤と結合する抗体断片であり、その免疫寛容誘発性分子またはチェックポイント阻害剤の代表的な例には、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＧＦβ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＥＧＦＲ、およびＮＫＧ２Ａが挙げられる。
【0115】
ＨＬＡ－ＥまたはそのリガンドＮＫＧ２Ａに結合する代表的な抗体は当技術分野において知られている。例えば、米国特許第８，２０６，７０９号、第１０，６７６，５２３号、第１０，８７０，７００号、および第１１，２２５，５１９号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１２／０１７１１９５号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、市販の抗ＮＫＧ２Ａ抗体、その抗体断片またはバリアント、例えば、モナリズマブ（ＩＰＨ２２０１）およびヒト化Ｚ１９９に由来する抗体断片である。代表的な抗ＮＫＧ２Ａ重鎖および軽鎖のアミノ酸配列は表１２に示されている：
【0116】
【表12】
【0117】
ＴＧＦβまたはその受容体に結合する代表的な抗体は、当技術分野において知られており、例えば、フレソリムマブ、および米国特許第８，１４７，８３４号、第９，１０９，０３１号、第９，７８３，６０４号、および第１１，３１２，７６７号明細書である。
【0118】
ＣＴＬＡ－４に結合する代表的な抗体には、バブナリマブ（ＸｍＡｂ ２２８４１）、ボテンシリマブ（ＡＧＥＮ １１８１）、カドニリマブ、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、クアボンリマブ（ＭＫ １３０８）、トレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６）、ブダリマブ（ＸｍＡｂ ２０７１７またはＸｍＡｂ ７１７）、およびザリフレリマブ（ＡＧＥＮ １８８４）が挙げられる。
【0119】
ＰＤ１に結合する代表的な抗体には、バルスチリマブ、ブディジャリマブ、カドニリマブ、セミプリマブ、セトレリマブ、ドスタルリマブ、イズラリマブ、ニボルマブ、パクミリマブ、ペムブロリズマブ、ペンプリマブ、ペレソリマブ、ピジリズマブ、レチファンリマブ、ロスニリマブ、シンチリマブ、スパルタリズマブ、チスレリズマブ、トリパリマブ、ボルルストミグ、ブダリマブ、ゼルバリマブ、およびジムベレリマブが挙げられる。ＰＤ－Ｌ１に結合する代表的な抗体には、アテゾリズマブ、アベルマブ、ビントラフスプ アルファ、コシベリマブ、ダンブルストツグ、デュルバルマブ、インバキセプト、ロダポリマブ、ピミバリマブ、およびソカゾリマブが挙げられる。
【0120】
ＴＩＧＩＴに結合する代表的な抗体は当技術分野において知られており、例えば、ベルレストツグ、ドムバナリマブ、エチギリマブ、オシペルリマブ、チラゴルマブ、ビボストリマブ、米国特許第１０，０１７，５７２号、第１０，７６６，９５７号、第１０，２１３，５０５号、第１０，３２９，３４９号、および第１１，０２１，５３７号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００９／０２５８０１３号、第２０２０／００４００８２号、第２０２０／０３５４４５３号、および第２０２１／００８７２６８号明細書である。
【0121】
ＴＩＭ３に結合する代表的な抗体は当技術分野において知られており、例えば、コボリマブ、サバトリマブ、スルゼビクリマブ、米国特許第１０，５３３，０５２号および第１０，９２７，１７１号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１９／０３８２４８０号、第２０２１／０２２１８８５号、第２０２１／０２６１６６３号、第２０２１／０３６３２４２号、第２０２２／００８９７２０号、および第２０２２／０２３５１３０号明細書である。
【0122】
ＬＡＧ３に結合する代表的な抗体は当技術分野において知られており、例えば、バブナリマブ（ＸｍＡｂ ２２８４１）、イエラミリマブ、レラトリマブ、米国特許第１０，３５８，４９５号、第１０，８９８，５７１号、第１１，０２８，１６９号、および第１１，０４５，５４７号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１９／０３３０３３６号、第２０２１／０３６３２４３号、および第２０２２／０００２４１０号明細書である。
【0123】
ＥＧＦＲに結合する代表的な抗体には、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、ネシツムマブ（Ｐｏｒｔｒａｚｚａ（登録商標））、およびアミバンタマブ（Ｒｙｂｒｅｖａｎｔ（登録商標））が挙げられる。
【0124】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは二重特異性であり、２つの抗体断片を含み、それぞれが、癌細胞上の異なる標的に結合する。いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、癌細胞上のＴＡＡに結合する抗体断片、およびＴ細胞上の抗原（例えば、ＣＤ３）に結合する抗体断片を含有する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。いくつかの実施形態において、１つの抗体断片はＣＤ３に結合し、他方はＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＥＧＦＲ、ＦＣＲＨ５、Ｆｌｔ３、ＧＰＣＲ５Ｄ、ＰＳＭＡ、またはＳＬＡＭＦ７に結合する。本明細書の他の所で提供された代表的な抗体配列が、二重特異性抗体および二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーへ用いられ得る。
【0125】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む。抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３二重特異性抗体断片は当技術分野において知られており、例えば、ブリナツモマブ（Ｂｌｉｎｃｙｔｏ（登録商標））、デュボルツキシズマブ、米国特許第７，１１２，３２４号、第８，８４０，８８８号、第１０，１９１，０３４号、第１０，６３３，４４３号、および第１０，８８９，６５３号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３５５５８８号および第２０２１／０３１７２１２号明細書である。ＣＤ３およびＣＤ１９に結合する代表的な二重特異性抗体断片のアミノ酸配列は、下記に示されている（配列番号１１８）：
【0126】
【化18】
【0127】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、ＦＣＲＨ５に結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む。ＣＤ３およびＦＣＲＨ５に結合する代表的な二重特異性抗体断片のアミノ酸配列は、下記に示されている（配列番号１１９）：
【0128】
【化19】
【0129】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、ＣＤ２０に結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む。抗ＣＤ２０および抗ＣＤ３二重特異性抗体断片は当技術分野において知られており、例えば、エプコリタマブ、グロフィタマブ、モスネツズマブ（Ｌｕｎｓｕｍｉｏ（登録商標））、オドロネクスタマブ、プラモタマブ、ならびに米国特許第１０，５５０，１９３号、第１０，６６２，２４４号、第１０，７８７，５２０号、および第１１，４４０，９７２号明細書である。
【0130】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、サイトカインまたはケモカインに結合する抗体断片である。いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、ＩＬ－６またはＩＬ－６Ｒに結合する抗体断片である。そのような断片は、無傷の抗ＩＬ－６抗体、例えば、シルツキシマブ（Ｓｙｌｖａｎｔ（登録商標））、シルクマブ、米国特許第８，０６２，８６６号、第８，３０９，３００号、および第９，８３４，６０３号明細書、ならびに抗ＩＬ－６Ｒ抗体、例えば、サリルマブ（Ｋｅｖｚａｒａ（登録商標））、サトラリズマブ（Ｅｎｓｐｒｙｎｇ（登録商標））、トシリズマブ（Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標））、米国特許第８，７５３，６３４号、第９，８８４，９１６号、および第１０，０８１，６２８号明細書、ならびに米国出願公開第２０１２／００４５４４０号、第２０１３／０３１７２０３号、および第２０２１／０３０１０２７号明細書から入手可能である。
【0131】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードはサイトカインまたはケモカインである。いくつかの実施形態において、サイトカインまたはケモカインは、ＩＦＮγ、可溶性ＩＦＮγＲ、ＴＧＦβ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、可溶性ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、またはＩＬ－１０であり、それらのアミノ酸配列は当技術分野において知られている。代表的なＩＦＮγのアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号１２０）：
【0132】
【化20】
【0133】
代表的なＩＬ－２のアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号１２１）：
【0134】
【化21】
【0135】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、ＲＮＡまたはオリゴペプチドワクチンである。オリゴペプチドワクチンは、ＨＬＡタンパク質により細胞傷害性Ｔ細胞へ提示される能力がある短いペプチドであり、それらの細胞における細胞傷害性を、それらが、そのオリゴペプチドワクチンが由来するタンパク質を提示する癌を認識した時に、誘導する。いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、サバイビン、ウィルムス腫瘍１転写因子（ＷＴ１）、ムチン１（ＭＵＣ１）、メラノーマ関連抗原３（ＭＡＧＥ－Ａ３）、またはメラノーマ関連抗原Ｃ１（ＭＡＧＥ－Ｃ１、別名ＣＴ７）に由来するＲＮＡまたはオリゴペプチドワクチンである。代表的なアミノ酸配列は、ＷＴ１についてＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０００３６９．４、ＭＵＣ１についてＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１０１８０１６．１、ＭＡＧＥ－Ａ３についてＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５３５３．１、およびＭＡＧＥ－Ｃ１についてＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００５４５３．２で提供されている。
【0136】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、免疫細胞の細胞膜に局在している（すなわち、膜結合型）。膜結合型治療用ペイロードには、細胞表面受容体（例えば、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、阻害性分子に対する受容体、ＣＡＲ）、膜結合型サイトカイン、膜結合型ケモカイン、および膜結合型抗体が挙げられる。
【0137】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは表面受容体である。いくつかの実施形態において、表面受容体は、本明細書に記載されたドメインの組合せまたは部分的組合せを含有するＣＡＲである。いくつかの実施形態において、表面受容体はＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２である。いくつかの実施形態において、表面受容体は、サイトカインまたはケモカインに対する受容体である。代表的なサイトカインまたはケモカイン受容体には、ＩＦＮγＲ、ＩＬ－１Ｒ、ＩＬ－２Ｒ、ＩＬ－３Ｒ、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－８Ｒ、ＩＬ－９Ｒ、ＩＬ－１０Ｒ、ＩＬ－１５Ｒ、およびＴＧＦβＲが挙げられ、それらのアミノ酸配列は当技術分野において知られている。例えば、ＩＬ－２Ｒは、サブユニットＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２５）、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）、および共通γ鎖受容体（ＣＤ１３２）からなるヘテロ複合体である。代表的なＩＬ－２Ｒα（ＣＤ２８）のアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号１２２）：
【0138】
【化22】
【0139】
代表的なＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）のアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号１２３）：
【0140】
【化23】
【0141】
代表的な共通γ鎖受容体（ＣＤ１３２）のアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号１２４）：
【0142】
【化24】
【0143】
ＩＬ－７Ｒは、サブユニットＩＬ－７Ｒα（ＣＤ１２７）および共通γ鎖受容体（ＣＤ１３２）からなるヘテロ二量体である。代表的なＩＬ－７Ｒαのアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号１２５）：
【0144】
【化25】
【0145】
ＩＬ－１５Ｒは、サブユニットＩＬ－１５Ｒα（ＣＤ２１５）、ＩＬ－２Ｒβ（ＣＤ１２２）、および共通γ鎖受容体（ＣＤ１３２）からなるヘテロ二量体である。代表的なＩＬ－１５Ｒα（ＣＤ２１５）のアミノ酸配列は下記に示されている（配列番号１２６）：
【0146】
【化26】
【0147】
いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは、膜結合型サイトカインまたはケモカインであり、それらのアミノ酸配列は、当技術分野において知られている。いくつかの実施形態において、治療用ペイロードは膜結合型抗体であり、それらのアミノ酸配列は当技術分野において知られている。
【0148】
いくつかの実施形態において、第３の核酸は、下記に示された核酸配列（配列番号１２７）を有し、表１３に示された特徴を含有し、ｐＬＶＣ－ＣＭＶ １００構築物バックグラウンドへ組み入れられ得る：
【0149】
【化27-1】
【0150】
【化27-2】
【0151】
【化27-3】
【0152】
【化27-4】
【0153】
【表13】
【0154】
発現ベクター
プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および治療用ペイロードをコードする核酸（または核酸構築物）は、１つまたは複数の適切な発現ベクターにより免疫細胞へ導入され得る。発現ベクターは、免疫細胞への輸送をもたらし、かつ形質転換後、核酸の発現をもたらすように構成され、かつそのために必要なエレメントを含有する。そのようなエレメントは、必ずしも、開示された核酸構築物内に含まれるとは限らないが、それらには、複製開始点、ポリＡテール配列、選択マーカー、および多重クローニング部位（ＭＣＳ）などの、核酸の挿入のための１つまたは複数の適切な部位が挙げられる。
プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および治療用ペイロードをコードする核酸（または核酸構築物）は、１つまたは複数の適切な発現ベクターにより免疫細胞へ導入され得る。発現ベクターは、免疫細胞への輸送をもたらし、かつ形質転換後、核酸の発現をもたらすように構成され、かつそのために必要なエレメントを含有する。そのようなエレメントは、必ずしも、開示された核酸構築物内に含まれるとは限らないが、それらには、複製開始点、ポリＡテール配列、選択マーカー、および多重クローニング部位（ＭＣＳ）などの、核酸の挿入のための１つまたは複数の適切な部位が挙げられる。
【0155】
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。本明細書で用いられる場合、用語「レンチウイルスベクター」は、感染性レンチウイルス粒子を意味することを意図される。レンチウイルス亜科（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅ）（レンチウイルス）は、ビリオン構造、宿主範囲、および病理学的効果により他のウイルスと識別できる、エンベロープ型レトロウイルス科（ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅ）（レトロウイルス）のサブファミリーである。感染性レンチウイルス粒子は、非分裂細胞および免疫細胞に感染しかつ形質導入することを含む、標的宿主細胞に侵入する能力がある。
【0156】
いくつかの実施形態において、発現ベクターは、非組込み型および非複製性組換えレンチウイルスベクターである。レンチウイルスベクターの構築は、例えば、米国特許第５，６６５，５７７号、第５，９８１，２７６号、第６，０１３，５１６号、第７，０９０，８３７号、第８，１１９，１１９号、および第１０，９５４，５３０号明細書に記載されている。レンチウイルスベクターは欠陥レンチウイルスゲノムを含み、すなわち、レンチウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖの少なくとも１つが不活性化または欠失している。
【0157】
他の実施形態において、発現ベクターは、非ウイルスベクターであり、その代表的な例には、プラスミド、ｍＲＮＡ、直鎖状一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡまたは直鎖状二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ、ミニサークル、ならびにトランスポゾンに基づいたベクター、例えばスリーピングビューティ（ＳＢ）に基づいたベクターおよびｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）に基づいたベクターが挙げられる。さらに他の実施形態において、ベクターは、ウイルス性エレメントと非ウイルス性エレメントの両方を含み得る。
【0158】
いくつかの実施形態において、ベクターはプラスミドである。核酸と作動的に連結されたプロモーターに加えて、プラスミドはまた、例えば、免疫細胞において核酸の輸送および発現を促進する、他のエレメントも含有し得る。プラスミドは、制限酵素で直線化され、インビトロで転写されて、ｍＲＮＡを産生し、その後、５’キャップおよび３’ポリＡテールで修飾され得る。いくつかの実施形態において、ベクターは、配列番号８４に示された核酸配列および表９に示された特徴を有するプロテアーゼＣＡＲをコードする第１のプラスミド、配列番号９７に示された核酸配列および表１０に示された特徴を有する活性化ＣＡＲをコードする第２のプラスミド、ならびに配列番号１２７に示された核酸配列および表１３に示された特徴を有する第３の核酸をコードする第３のプラスミドである、複数のプラスミドである。
【0159】
いくつかの実施形態において、担体はベクターを被包する。担体は、脂質に基づき得、例えば、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リポソーム、脂質ベシクル、またはリポプレックスである。いくつかの実施形態において、担体はＬＮＰである。ある特定の実施形態において、ＬＮＰは、水性コンパートメントにより隔てられた２つ以上の同心円状二重層を含む。脂質二重層は、官能化されおよび／または互いに架橋され得る。脂質二重層は、１つまたは複数のリガンド、タンパク質、またはチャネルを含み得る。
【0160】
脂質担体、例えばＬＮＰは、１つもしくは複数のカチオン性／イオン化可能脂質、１つもしくは複数のポリマーコンジュゲート化脂質、１つもしくは複数の構造脂質、および／または１つもしくは複数のリン脂質を含み得る。「カチオン性脂質」は、正に荷電した脂質、または正電荷を保持する能力がある脂質を指す。カチオン性脂質は、ｐＨに依存して正電荷を有する１つまたは複数のアミン基を含む。「ポリマーコンジュゲート化脂質」は、コンジュゲートされたポリマー部分を有する脂質を指す。ポリマーコンジュゲート化脂質には、ポリエチレングリコールとコンジュゲートされた脂質であるＰＥＧ化脂質が挙げられる。「構造脂質」は、生理的ｐＨにおいて正味電荷を有しない非カチオン性脂質を指す。例示的な構造脂質には、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、およびその他同種類のものが挙げられる。「リン脂質」は、２個の脂肪酸および１個のリン酸イオンを含むグリセロールのトリエステルを有する脂質を指す。ＬＮＰにおけるリン脂質は、その脂質を１つまたは複数の脂質二重層へとアセンブルする。ＬＮＰ、それらの調製方法、製剤化、および送達は、例えば、米国特許出願公開第２００４／０１４２０２５号、第２００７／００４２０３１号、および第２０２０／０２３７６７９号明細書、ならびに米国特許第９，３６４，４３５号、第９，５１８，２７２号、第１０，０２２，４３５号、および第１１，１９１，８４９号明細書に開示されている。
【0161】
リポプレックス、リポソーム、および脂質ナノ粒子は、脂質分子、例えば、カチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ポリペプチド－脂質コンジュゲート、および他の安定化コンポーネントの組合せを含み得る。代表的な安定化コンポーネントには、抗酸化剤、界面活性剤、および塩が挙げられる。リポプレックス、リポソーム、および脂質ナノ粒子の組成物および調製方法は当技術分野において知られている。例えば、米国特許第８，０５８，０６９号、第８，９６９，３５３号、第９，６８２，１３９号、第１０，２３８，７５４号明細書、米国特許出願公開第２００５／００６４０２６号および第２０１８／０２９１０８６号明細書、ならびにLasic, Trends Biotechnol. 16(7):307-21 (1998)、Lasic et al., FEBS Lett. 312(2-3):255-8 (1992)、およびDrummond et al., Pharmacol. Rev. 51(4):691-743 (1999)を参照されたい。
【0162】
細胞
本開示の一態様は、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および治療用ペイロードを発現する遺伝子改変型免疫細胞である。本明細書で用いられる場合、「免疫細胞」は、自然および／または適応免疫応答の惹起および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞を指す。免疫細胞の代表的な例には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＮＫ Ｔ（ＮＫＴ）細胞が挙げられる。異なる免疫細胞の組合せが用いられ得る。Ｔ細胞の代表的な例には、細胞傷害性リンパ球、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ Ｔ細胞）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）、αβ Ｔ細胞および／またはγδ Ｔ細胞、ならびにＴｈ１７ Ｔ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＤ４＋ Ｔ細胞の組合せである。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＮＫ細胞である。免疫細胞は、健康な患者から単離された初代細胞であり得、融合タンパク質および任意で、ＣＡＲポリペプチドを発現するように操作され得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞はヒト免疫細胞である。
本開示の一態様は、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および治療用ペイロードを発現する遺伝子改変型免疫細胞である。本明細書で用いられる場合、「免疫細胞」は、自然および／または適応免疫応答の惹起および／または実行に機能的に関与する造血系起源の細胞を指す。免疫細胞の代表的な例には、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびＮＫ Ｔ（ＮＫＴ）細胞が挙げられる。異なる免疫細胞の組合せが用いられ得る。Ｔ細胞の代表的な例には、細胞傷害性リンパ球、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋ Ｔ細胞）、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋ Ｔ細胞）、αβ Ｔ細胞および／またはγδ Ｔ細胞、ならびにＴｈ１７ Ｔ細胞が挙げられる。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＣＤ８＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＣＤ４＋ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＤ４＋ Ｔ細胞の組合せである。いくつかの実施形態において、免疫細胞はＮＫ細胞である。免疫細胞は、健康な患者から単離された初代細胞であり得、融合タンパク質および任意で、ＣＡＲポリペプチドを発現するように操作され得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞はヒト免疫細胞である。
【0163】
免疫細胞には、幹細胞に由来する細胞が挙げられる。幹細胞は、成体幹細胞（例えば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ））、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、細胞株、または細胞バンク細胞に由来する。体液および組織からの細胞の収集、単離、精製、および分化は当技術分野において知られている。例えば、Brown et al., PloS One 5:e11373-9 (2010)、Rivera et al., Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 54:e117-21 (2020)、Seki et al., Cell Stem Cell 7:11-4 (2010)、Takahashi et al., Cell 126:663-76 (2006)、Fusaki et al., Proc. Jpn. Acad. Ser. B Phys. Biol. Sci. 85:348-62 (2009)、Park et al., Nature 451:141-6 (2008)、ならびに米国特許第１０，２１４，７２２号、第１０，３７０，４５２号、第１０，４２８，３０９号、第１０，８４４，３５６号、第１１，１４１，４７１号、第１１，１６２，０７６号、および第１１，１９３，１０８号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１２／０１２１５４４号、第２０１８／０３６２９２７号、第２０１９／０１１２５７７号、および第２０２１／００１５８５９号明細書を参照されたい。
【0164】
いくつかの実施形態において、免疫細胞は、１つまたは複数の遺伝子改変を含有する。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のコンポーネント、例えば、Ｔ細胞受容体α定常領域（ＴＲＡＣ）、Ｔ細胞受容体β定常領域（ＴＲＢＣ）１、ＴＲＢＣ２、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３εのうちの１つまたは複数をノックアウトすることにより遺伝子改変される。いくつかの実施形態において、細胞は、β－２－ミクログロブリン（Ｂ２ＭＧ）、クラスＩＩ主要組織適合複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）、ＨＬＡクラスＩ、およびＨＬＡクラスＩＩのうちの１つまたは複数をノックアウトすることにより遺伝子改変される。
【0165】
プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および第３の核酸を含有するベクターを免疫細胞へ導入する方法は当技術分野において知られている。例えば、米国特許第７，３９９，６３３号、第７，５７５，９２５号、第１０，０７２，０６２号、第１０，３７０，４５２号、および第１０，８２９，７３５号明細書、ならびに米国特許公開第２０１９／００００８８０号および第２０２１／０４０７６３９号明細書を参照されたい。
【0166】
いくつかの実施形態において、方法は、レンチウイルス発現ベクターの免疫細胞への形質導入を伴う。他の実施形態において、方法は、ガンマレトロウイルスベクターの使用を伴う。例えば、米国特許第９，６６９，０４９号、第１１，０６５，３１１号、および第１１，２３０，７１９号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態において、方法は、第１、第２、および第３の核酸を送達するための、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、またはｄｓＲＮＡの使用を伴う。例えば、米国特許第１０，５６３，２２６号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１９／０２２５９９１号、第２０２０／００８０１０８号、および第２０２２／０１８６２６３号明細書を参照されたい。
【0167】
いくつかの実施形態において、核酸配列を含有するベクターは、リポフェクションにより免疫細胞へ送達される。例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号、および第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい。
【0168】
いくつかの実施形態において、方法は、直鎖状、環状、または自己増幅性ｍＲＮＡのエクスビボまたはインビボ送達を伴う。例えば、米国特許第７，４４２，３８１号、第７，３３２，３２２号、第９，８２２，３７８号、第９，２５４，２６５号、第１０，５３２，０６７号、および第１１，２９１，６８２号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態において、方法は、ベクターにより送達される核酸を免疫細胞のゲノムへ組み込むためのトランスポサーゼの使用を伴う。例えば、米国特許第７，９８５，７３９号、第１０，１７４，３０９号、第１１，１８６，８４７号、および第１１，３５１，２７２号明細書を参照されたい。いくつかの実施形態において、方法は、自己複製性エピソームナノベクターの使用を伴う。例えば、米国特許第５，６２４，８２０号、第５，６７４，７０３号、および第９，３４０，７７５号明細書を参照されたい。
【0169】
薬学的組成物
本開示の薬学的組成物は、治療的有効数の遺伝子改変型免疫細胞および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いられる場合、用語「治療的有効数の免疫細胞」（間接的には、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および治療用ペイロードの対応する量を含む）は、所望の効果を与えるのに十分な数の、核酸を含有する免疫細胞を指す。
本開示の薬学的組成物は、治療的有効数の遺伝子改変型免疫細胞および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いられる場合、用語「治療的有効数の免疫細胞」（間接的には、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および治療用ペイロードの対応する量を含む）は、所望の効果を与えるのに十分な数の、核酸を含有する免疫細胞を指す。
【0170】
所定の患者についての遺伝子改変型免疫細胞の有効数は、対象の年齢、体重、および癌の型、位置、および重症度、ならびに全般的な健康状態を含み得る１つまたは複数の因子によって異なる。最終的には、主治医が、適切な用量および投与レジメンを決定する。典型的には、免疫細胞は、単一用量で与えられる。いくつかの実施形態において、遺伝子改変型免疫細胞の有効数は、対象あたり約１×１０５～約１×１０１０細胞である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変型免疫細胞の有効数は、対象の体重１ｋｇあたり約１×１０５～約６×１０８細胞である。
【0171】
組成物は、選択されたｐＨへ緩衝され得る、無菌液体調製物、例えば、等張性水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液、または粘稠性組成物として提供され得る。同様に、液体担体には、水性または非水性担体が挙げられる。液体担体の代表的な例には、食塩水、リン酸緩衝食塩水、可溶性タンパク質、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール、およびその他同種類のもの）、およびそれらの適切な混合物が挙げられる。いくつかの実施形態において、液体担体は、そこに溶解されまたは分散したタンパク質を含み、代表的な例には、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン、組換えヒトアルブミン）、ゼラチン、およびカゼインが挙げられる。組成物は、典型的には、等張性であり、すなわち、それらは、血液と同じ浸透圧を有する。塩化ナトリウムおよび等張性電解質溶液（例えば、Ｐｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ（登録商標））は、所望の等張性を達成するために用いられ得る。担体および免疫細胞に依存して、他の賦形剤、例えば、当技術分野において知られているような、湿潤剤、分散剤、または乳化剤、ゲル化および粘性増強剤、保存剤、ならびにその他同種類のものが加えられ得る。
【0172】
使用方法
いくつかの態様において、本開示は、対象において癌を処置することを対象とする。方法は、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および治療用ペイロードをコードする核酸を有する遺伝子改変型免疫細胞の治療的有効数を、必要としている対象に投与するステップを伴う。
いくつかの態様において、本開示は、対象において癌を処置することを対象とする。方法は、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、および治療用ペイロードをコードする核酸を有する遺伝子改変型免疫細胞の治療的有効数を、必要としている対象に投与するステップを伴う。
【0173】
本明細書で用いられる場合、用語「対象」（または「患者」）は、示された癌に罹りやすい（またはその傾向がある）またはそれを患っている動物界の全メンバーを含む。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。したがって、「癌を有する」または本開示による処置を「必要としている」対象は、陽性と診断されている対象を広く包含し、例えば、以前、１ラウンドまたは複数ラウンドの治療で処置された可能性がある活性疾患を有する対象、および現在、（例えば、寛解期で）処置中ではないが、まだなお再発のリスクがあり得る対象、および陽性と診断されたことはないが、癌の素因がある（例えば、前病歴および／または家族歴の根拠を理由に、または別なふうに、医療専門家が、対象が癌の素因があるのではないかと合理的に疑い得るような、１つもしくは複数のリスク因子を示す）対象である。
【0174】
本明細書で用いられる場合、用語「処置する」、「処置すること」、および「処置」は、癌に関連した症状、合併症もしくは状態、または生化学的徴候の開始、進行、発生、重症度、または再発を逆転させ、軽減し、寛解させ、阻害し、減少させ、遅らせ、停止させ、安定化させ、または防止することの治療目的（「治療効果」）を以て、必要としている対象に実施される任意の型の介入、工程、またはその対象への遺伝子改変型免疫細胞の投与を指す。
【0175】
いくつかの実施形態において、細胞は、その細胞を受ける対象と同種異系であり、すなわち、細胞は、対象との完全なまたは少なくとも部分的なＨＬＡ適合を有する。いくつかの実施形態において、細胞は自家性である。本明細書で用いられる場合、用語「自家性の」は、材料が後で再導入される同じ対象に由来する任意の材料（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を指す。本明細書で用いられる場合、用語「同種異系の」は、材料が後で導入される対象と同じ種の異なる対象に由来する任意の材料を指す。２つ以上の個々の対象は、１つまたは複数の座における遺伝子（典型的にはＨＬＡ座）が同一ではない場合、同種異系である。
【0176】
いくつかの実施形態において、癌は、固形腫瘍により特徴付けられる。固形腫瘍により特徴付けられる代表的な癌には、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝癌、または前立腺癌が挙げられる。
【0177】
いくつかの実施形態において、癌は血液癌である。代表的な血液癌には、形質細胞腫瘍（例えば、骨髄腫、多発性骨髄腫、再発性もしくは治療抵抗性多発性骨髄腫、形質細胞性骨髄腫、髄外多発性骨髄腫、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＵＧＳ）、無症候性くすぶり型多発性骨髄腫、または孤立性形質細胞腫）、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、形質芽球性リンパ腫、形質細胞様リンパ腫、またはびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫）、白血病（例えば、再発性もしくは治療抵抗性急性Ｂリンパ球白血病、または再発性もしくは治療抵抗性急性リンパ芽球性白血病）、および癌腫（例えば、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症または膠芽腫（星細胞腫））が挙げられる。これらの実施形態において、治療効果は、１つまたは複数の当技術分野で認められた、治療効力の徴候を含み得、それらの代表的な例には、転移の阻止または遅延、生存時間の向上、癌の全体／完全または部分寛解、例えば、それぞれ、検出可能な癌細胞なし、およびより小さい腫瘍細胞もしくはより小さい腫瘍、または腫瘍細胞数の低下が挙げられる。
【0178】
いくつかの実施形態において、血液癌は、多発性骨髄腫、白血病、またはリンパ腫である。いくつかの実施形態において、血液癌は多発性骨髄腫であり、第１および第２の抗原結合性ドメインは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＧＰＣＲ５Ｄ、ＦＣＨＲ５、ＳＬＡＭＦ７、またはその組合せに結合する。いくつかの実施形態において、血液癌は白血病またはリンパ腫であり、第１および第２の抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＦＣＨＲ５、Ｆｌｔ３、またはその組合せに結合する。
【0179】
併用治療
いくつかの実施形態において、本方法は、抗癌剤の同時投与を含み得る。
いくつかの実施形態において、本方法は、抗癌剤の同時投与を含み得る。
【0180】
用語「同時投与」、「同時投与する」、および「同時投与された」は、同じもしくは別々の剤形により、または逐次的に、例えば、同じ処置レジメンの一部としてもしくは連続的な処置レジメンとして、実質的に同時の投与を含む。したがって、逐次的に与えられる場合には、２番目の治療の投与の開始時点において、２つの治療のうちの１番目の治療は、場合によっては、処置の部位で、まだなお有効な濃度で検出可能である。順序および時間間隔は、それらが一緒に（例えば、それらが他の方法で投与された場合よりベネフィットの増加を与えるように相乗的に）作用できるように決定され得る。例えば、治療用物質は、同時に、または異なる時点で任意の順番で逐次的に投与され得る；しかしながら、同時に投与されない場合には、それらは、相乗様式であり得る、所望の治療効果を与えるように時間的に十分接近して投与され得る。したがって、その用語は、正確に同時での活性物質の投与に限定されない。
【0181】
本発明の細胞と共に用いられ得る抗癌剤は当技術分野において知られている。例えば、米国特許第９，１０１，６２２号（そのセクション５．２）を参照されたい。「抗癌」剤は、例えば、癌細胞を殺傷し、癌細胞にアポトーシスを誘導し、癌細胞の成長速度を低下させ、転移の発生率もしくは数を低下させ、腫瘍サイズを低下させ、腫瘍成長を阻害し、腫瘍もしくは癌細胞への血液供給を低下させ、癌細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進し、癌の進行を防止もしくは阻害し、または癌を有する対象の寿命を増加させることにより、対象において癌にマイナスの影響を及ぼす能力がある。より一般的には、これらの他の組成物は、癌性細胞を殺傷しまたはその増殖を阻害するのに有効な混合量で提供される。この工程は、癌細胞を同時にレシピエント細胞および作用物質または複数の因子と接触させることを含み得る。これは、両方の作用物質を含む単一の組成物もしくは薬理学的製剤と癌細胞を接触させることにより、または同時に２つの別個の組成物もしくは製剤（一方の組成物がレシピエント細胞を含み、他方が第２の作用物質を含む）と癌細胞を接触させることにより、達成され得る。
【0182】
いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子改変型免疫細胞は、化学療法的、放射線療法的、免疫療法的介入、標的治療、アポトーシス促進性治療、または細胞周期制御治療と共に用いられる。
【0183】
免疫療法
免疫チェックポイント阻害剤の同時投与を含む、免疫療法は、癌を処置するために用いられ得る。免疫チェックポイント分子には、例えば、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４７、およびＮＫＧ２Ａが挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤の臨床的に利用可能な例には、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、およびアベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））が挙げられる。ＰＤ１阻害剤の臨床的に利用可能な例には、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、およびセミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））が挙げられる。
免疫チェックポイント阻害剤の同時投与を含む、免疫療法は、癌を処置するために用いられ得る。免疫チェックポイント分子には、例えば、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ、ＴＩＧＩＴ、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４７、およびＮＫＧ２Ａが挙げられる。免疫チェックポイント阻害剤の臨床的に利用可能な例には、デュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ（登録商標））、アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ（登録商標））、およびアベルマブ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））が挙げられる。ＰＤ１阻害剤の臨床的に利用可能な例には、ニボルマブ（Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標））、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、およびセミプリマブ（Ｌｉｂｔａｙｏ（登録商標））が挙げられる。
【0184】
化学療法
抗癌治療はまた、化学物質に基づいた処置と放射線に基づいた処置の両方での様々な併用治療を含む。併用化学療法には、例えば、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）、アルトレタミン、ドセタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、メトトレキサート、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標）、Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、Ｔａｘｏｌ（登録商標）、ゲムシタビン、Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標）、ファルネシル－タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、または前述の任意の類似体、誘導体、もしくはバリアント、ならびにまたそれらの組合せが挙げられる。
抗癌治療はまた、化学物質に基づいた処置と放射線に基づいた処置の両方での様々な併用治療を含む。併用化学療法には、例えば、Ａｂｒａｘａｎｅ（登録商標）、アルトレタミン、ドセタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、メトトレキサート、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標）、Ｚｏｌａｄｅｘ（登録商標）、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、Ｔａｘｏｌ（登録商標）、ゲムシタビン、Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標）、ファルネシル－タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、５－フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、または前述の任意の類似体、誘導体、もしくはバリアント、ならびにまたそれらの組合せが挙げられる。
【0185】
放射線療法
抗癌治療はまた、放射線に基づいたＤＮＡ損傷処置を含む。併用放射線療法には、ガンマ線、Ｘ線として一般的に知られているもの、ならびに／または、ＤＮＡへの、ＤＮＡの複製と修復への、および染色体のアセンブリと維持への幅広い範囲の損傷を引き起こす放射性同位元素の腫瘍細胞への方向付けられた送達が挙げられる。放射性同位元素についての投与量範囲は様々であり、同位元素の半減期、放射される放射線の強度および型、ならびに腫瘍性細胞による取込みに依存し、主治医によって決定される。
抗癌治療はまた、放射線に基づいたＤＮＡ損傷処置を含む。併用放射線療法には、ガンマ線、Ｘ線として一般的に知られているもの、ならびに／または、ＤＮＡへの、ＤＮＡの複製と修復への、および染色体のアセンブリと維持への幅広い範囲の損傷を引き起こす放射性同位元素の腫瘍細胞への方向付けられた送達が挙げられる。放射性同位元素についての投与量範囲は様々であり、同位元素の半減期、放射される放射線の強度および型、ならびに腫瘍性細胞による取込みに依存し、主治医によって決定される。
【0186】
放射線療法は、外部または内部放射治療を含み得る。外部放射治療は、対象の身体の外側の放射線源、および放射線を身体内の癌のエリアへ送ることを含む。内部放射線治療は、癌へまたはその近くへ直接的に置かれる針、シード、ワイヤー、またはカテーテル内に密封された放射性物質を用いる。
【0187】
本開示のこれらを始めとする態様は、以下の実施例の考慮によりさらに理解されるだろうし、その実施例は、本開示のある特定の実施形態を例証することを意図され、特許請求の範囲により定義されているようなその範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【0188】
[実施例１]
材料および方法
ｃＣＡＲ細胞を、ベクターおよびレンチウイルス感染を用いて産生した。ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン、加えて４－１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激ドメインを含有する細胞内ドメインと共にＢＣＭＡ抗原を標的化する単鎖可変断片を含有する抗原結合性ドメイン（全て、ＥＦ－１αプロモーターの調節下で発現する）を含む第３世代（ＣＡＲ）構築物（表９および表１０参照）をデザインした。プロテアーゼＣＡＲは、ＧＧＧＳリンカー（配列番号９０）によって分離されたＭＹＣタグおよびΔ２２０－２４２ Ｓ２１９Ｖ ＴＥＶプロテアーゼを含有した；活性化ＣＡＲは、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＭ（配列番号８３））、転写活性化因子ＧＡＬ４－ＶＰ６４、およびＴ２Ａ配列によってＣＡＲから分離された短縮型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）を含有した。第３の核酸（表１３参照）は、Ｇａｌ４結合部位の４個のリピート、続いて最小限ＣＭＶプロモーター、および誘導性ペイロード代理としての高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポータータンパク質、および構築物の成功した組込みを同定するためのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タグを含有した。
材料および方法
ｃＣＡＲ細胞を、ベクターおよびレンチウイルス感染を用いて産生した。ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン、加えて４－１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激ドメインを含有する細胞内ドメインと共にＢＣＭＡ抗原を標的化する単鎖可変断片を含有する抗原結合性ドメイン（全て、ＥＦ－１αプロモーターの調節下で発現する）を含む第３世代（ＣＡＲ）構築物（表９および表１０参照）をデザインした。プロテアーゼＣＡＲは、ＧＧＧＳリンカー（配列番号９０）によって分離されたＭＹＣタグおよびΔ２２０－２４２ Ｓ２１９Ｖ ＴＥＶプロテアーゼを含有した；活性化ＣＡＲは、ＴＥＶプロテアーゼ切断部位（ＥＮＬＹＦＱＭ（配列番号８３））、転写活性化因子ＧＡＬ４－ＶＰ６４、およびＴ２Ａ配列によってＣＡＲから分離された短縮型上皮成長因子受容体（ｔＥＧＦＲ）を含有した。第３の核酸（表１３参照）は、Ｇａｌ４結合部位の４個のリピート、続いて最小限ＣＭＶプロモーター、および誘導性ペイロード代理としての高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）レポータータンパク質、および構築物の成功した組込みを同定するためのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タグを含有した。
【0189】
２９３Ｔ細胞に、プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲのレンチウイルス構築物、ｐｓＰＡＸ２およびｐＣＭＶ－ＶＳＶ－Ｇパッケージングベクターを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されているＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００を用い、製造会社のプロトコールに従って同時トランスフェクトした。１２時間後、２４時間後、および３６時間後、レンチウイルスを収集し、培地を交換した。ウイルスを、濾過および４℃、２０，０００ｒｐｍで２時間の超遠心分離により濃縮した。
【0190】
Ｔ細胞単離および形質導入。Ｔ細胞実験をジャーカット細胞かまたは初代ヒトＴ細胞かのいずれかで実施した。健康なドナー由来のヒト血液をＲｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ、ＬＬＣまたはＣｒｉｍｓｏｎ Ｃｏｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手した。単核球（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ（Ｇｌｏｂａｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ＵＳＡ ＬＬＣ）により単離した。ＰＢＭＣを、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＴ細胞濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＣＤ３＋ Ｔ細胞を単離することによりさらに処理した。ＣＤ８＋またはＣＤ４＋ Ｔ細胞精製について、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）遊離ヒトＣＤ４またはＣＤ８ポジティブセレクションキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造会社のプロトコールに従って選択を実施した。
【0191】
単離されたＴ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ－活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により活性化し、５％ ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を追加したＸ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）中で培養した。５０ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を１日おきに加えた。単離から１日後、Ｔ細胞またはジャーカット細胞を、５のＭＯＩでのスピノキュレーションにより感染させた。７日後、感染効率を、抗ｈＥＧＦＲ抗体（Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ｍｙｃ抗体、およびｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞でのゲーティングを用いるフローサイトメトリーにより決定した。ＣＡＲ発現細胞を、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）遊離ヒトビオチンポジティブセレクションキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いる磁気単離により単離した。再刺激での１０日後、活性化ビーズを、製造会社のプロトコールに従って、除去した。同じドナー由来の非感染Ｔ細胞または非感染ジャーカット細胞を、並行して維持し、対照として用いた。
【0192】
生細胞顕微鏡観察画像化を、５％ヒト血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を追加した、フェノールレッドを含まないＸ－ＶＩＶＯ １５培地（Ｌｏｎｚａ）において実施した。腫瘍細胞をＣＦＳＥで染色した。ステージトップインキュベーターを用いて、３７℃において一定の加湿Ｏ２およびＣＯ２流を維持した（Ｏｋｏｌａｂ）。１０６細胞をペトリディッシュ上に播種し、タイムラプス画像化前の少なくとも３０分間、定着させた。ＣＡＲ Ｔ細胞をおよそ１：１比で慎重に加えた。適切な場合、ＳＹＴＯＸ青色死細胞染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を培地へ１ｍＭで加えた。
【0193】
ホログラフィック顕微鏡システム（holotomography）に基づいた３次元ライブ顕微鏡観察について、相互作用部位は、６０×倍率対物レンズでの５１２×５１２解像度における３Ｄ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ顕微鏡システム（Ｎａｎｏｌｉｖｅ）を用いた、屈折率およびＣＦＳＥ蛍光シグナルの測定により記録された。画像を、３次元タイムラプスを示すように、ＮａｎｏｌｉｖｅのソフトウェアＳＴＥＶＥ ｖ１．６．３４９６でさらに処理した。
【0194】
免疫学的シナプスにおけるクラスタリングを可視化するために、Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ顕微鏡システムを用いて、１０分ごとに６時間、２０×倍率対物レンズで２０４８×２０４８解像度において相互作用部位を記録した。Ｚスタック画像を、Ｎｉｋｏｎのパーフェクトフォーカスシステム（Perfect Focus System）を用いて、細胞の中間層、加えて上下２μｍに焦点を合わせて記録した。死細胞を、ＳＹＴＯＸ青色染色の陽性により決定した。典型的には、分析は、分析の時間においてＳＹＴＯＸ青色陰性である腫瘍細胞だけを含んだ。
【0195】
フローサイトメトリーを、１０５個の標的ＯＭＰ２（標的、Ｔ）細胞をｃＣＡＲ Ｔ細胞またはｃＣＡＲジャーカット細胞（エフェクター、Ｅ）と１：１、２：１、および５：１のＥ：Ｔ比で、９６ウェル丸底プレートにおいて１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、および２４時間、共培養する方法により実施した。細胞を、二次染色ＰＥストレプトアビジン（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５４０６１）と共に、抗ＭＹＣ ＡＰＣ（９Ｂ１１ Ｍｏｕｓｅ ｍＡｂ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗ｔＥＧＦＲ ＰＥ（組換えモノクローナルヒトＩｇＧ１クローン番号Ｈｕ１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＰＥストレプトアビジン、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはヒトＥＧＦＲビオチン化抗体、組換えモノクローナルヒトＩｇＧ１クローン番号Ｈｕ１（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＦＡＢ９５７７Ｂ－１００）で染色し、ＡｂＣ（商標）トータル抗体補正ビーズキット（Ｔｏｔａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ Ｂｅａｄ Ｋｉｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｃ）により補正を実施して、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において分析した。適切な場合、絶対カウント数を、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎカウントビーズ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で測定した。フローサイトメトリー分析を、ＦｌｏｗＪｏ Ｖ１０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施した。
【0196】
以下の核酸構築物を作製した、すなわち：配列番号８４の配列を有する、ｐＬＶＸ－ＣＭＶ １００ベクターバックボーンを含有する第１の核酸構築物（表９に要約する）；配列番号９７の配列を有する第２の核酸構築物（表１０に要約する）；および配列番号１２７の配列を有する第３の核酸構築物（表１３に要約する）。
【0197】
[実施例２]
ｃＣＡＲ細胞の調製
それぞれ、図３Ａ～４Ｄに示され、表９（配列番号８４）および表１０（配列番号９７）に要約されているように、抗腫瘍タンパク質Ａの抗原結合性ドメインを有するプロテアーゼＣＡＲをコードする核酸、抗腫瘍タンパク質Ｂの抗原結合性ドメインを有する活性化ＣＡＲをコードする核酸、および高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）のモデルペイロードタンパク質をコードする第３の核酸を含む３つの核酸を含有する核酸構築物を設計し、その第３の核酸は、ｃＣＡＲ細胞が、腫瘍タンパク質Ａおよび腫瘍タンパク質Ｂ（すなわち、第１および第２のＴＡＡ）を発現する癌細胞に遭遇した時に発現する。プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、図３Ａに示されているように、ＣＤ２８または４－１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含有する細胞内ドメインと連結された細胞外リンカーおよび膜貫通ドメインと共に、抗腫瘍タンパク質Ａかまたは抗腫瘍タンパク質Ｂかのいずれかを標的化する抗体のｓｃＦｖ断片を含有した。これらのシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ特異的殺傷を媒介した。プロテアーゼＣＡＲにおいて、シグナル伝達ドメインの後に、ＴＥＶプロテアーゼが続き、活性化ＣＡＲにおいて、シグナル伝達ドメインの後に、ＴＥＶプロテアーゼの対応する切断部位が続き、その切断部位は、Ｇａｌ４－ＶＰ６４転写活性化因子と融合していた（図３Ａ）。
ｃＣＡＲ細胞の調製
それぞれ、図３Ａ～４Ｄに示され、表９（配列番号８４）および表１０（配列番号９７）に要約されているように、抗腫瘍タンパク質Ａの抗原結合性ドメインを有するプロテアーゼＣＡＲをコードする核酸、抗腫瘍タンパク質Ｂの抗原結合性ドメインを有する活性化ＣＡＲをコードする核酸、および高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）のモデルペイロードタンパク質をコードする第３の核酸を含む３つの核酸を含有する核酸構築物を設計し、その第３の核酸は、ｃＣＡＲ細胞が、腫瘍タンパク質Ａおよび腫瘍タンパク質Ｂ（すなわち、第１および第２のＴＡＡ）を発現する癌細胞に遭遇した時に発現する。プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲの抗原結合性ドメインは、図３Ａに示されているように、ＣＤ２８または４－１ＢＢおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含有する細胞内ドメインと連結された細胞外リンカーおよび膜貫通ドメインと共に、抗腫瘍タンパク質Ａかまたは抗腫瘍タンパク質Ｂかのいずれかを標的化する抗体のｓｃＦｖ断片を含有した。これらのシグナル伝達ドメインは、ＣＡＲ特異的殺傷を媒介した。プロテアーゼＣＡＲにおいて、シグナル伝達ドメインの後に、ＴＥＶプロテアーゼが続き、活性化ＣＡＲにおいて、シグナル伝達ドメインの後に、ＴＥＶプロテアーゼの対応する切断部位が続き、その切断部位は、Ｇａｌ４－ＶＰ６４転写活性化因子と融合していた（図３Ａ）。
【0198】
図３Ｂ～Ｈにおいて概略的に示されているように、同じ腫瘍細胞の表面上の腫瘍タンパク質ＡおよびＢの認識は、プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲを共局在化させ、免疫学的シナプスを形成し、細胞内ＴＥＶプロテアーゼとその対応する切断部位を互いに接近させる（図３Ｂ～３Ｄ）。結果として、Ｇａｌ４－ＶＰ６４転写活性化因子が、タンパク質の残りから切り離され（図３Ｅおよび３Ｆ）、核への移行を可能にする（図３Ｆ）。核において、Ｇａｌ４－ＶＰ６４転写因子は、第３の核酸によりコードされるその転写アクセプターに結合し、同時に、第３の核酸は、他の２つの核酸と共に細胞へ導入される（図３Ｆ）。第３の核酸は、治療用ペイロードの転写を調節する転写アクセプター（ここでは、Ｇａｌ４－ＶＰ６４転写因子アクセプター部位）をコードする。Ｇａｌ４－ＶＰ６４転写因子の転写アクセプターとの結合で、誘導性治療用ペイロードは、改変型ＣＭＶプロモーターの調節下で転写され、タンパク質へ翻訳される（図３Ｇ）。治療用ペイロードタンパク質の核酸配列より前に、所望の位置、例えば、細胞外環境へと治療用ペイロードタンパク質を標的化するリーダーペプチドがあった。したがって、治療用ペイロードは、細胞の隣接環境へ分泌される（図３Ｈ）。
【0199】
ｃＣＡＲ細胞をフローサイトメトリーによりアッセイした。図４Ａ～４Ｄに示されているように、ｃＣＡＲ細胞は、両方のＣＡＲ構築物（プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲ）が最小ベースライン発現（１％未満）でのそれらの標的ＴＡＡを認識かつ結合した時のみ、モデル治療用ペイロードタンパク質、ここではｅＧＦＰを発現した。
【0200】
本明細書に開示された治療概念は、以下に詳述されているように、既存の免疫療法概念と比べて、いくつかの新規な特徴を有し、大幅な進歩を示している：１）開示されているようなｃＣＡＲ系は、細胞間の界面で癒着する（免疫学的シナプス）ヘテロタイプの受容体の性質を利用することによる、治療用ペイロードを送達するための細胞のオンのスイッチを含む；２）２つの異なる標的ＴＡＡが同じ腫瘍細胞上に発現している場合のみ、免疫療法用ペイロード送達が惹起されるため、ｃＣＡＲ系は優れた特異性を提供する。この追加された特異性は、正常組織を温存することにより毒性を軽減する；３）いったん引き起こされたならば、ＣＡＲ特異的殺傷のための２つの異なる標的腫瘍表面タンパク質が存在しない場合でさえも、分泌されたペイロードは、クラスター内の腫瘍細胞を殺傷する。クラスター内のいくつかの細胞が、標的エピトープ発現の喪失を通してＣＡＲ媒介性殺傷に対して抵抗性になっている場合でさえも、これは、腫瘍細胞のクラスター全体が排除されること（フィールド効果）を確実にする。したがって、その系は、ＣＡＲ細胞抵抗性を克服する；４）ｃＣＡＲ系はまた、ＣＡＲ媒介性殺傷なしに（すなわち、プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲがシグナル伝達ドメインを含有しない実施形態）、身体における限定された部位への精巧な特異性で治療用物質を送達するために用いることができ、例えば癌における、免疫療法的送達系としてのその使用を可能にする。
【0201】
[実施例３]
多発性骨髄腫を処置するための抗ＢＣＭＡ ｃＣＡＲ細胞
難治性血液悪性腫瘍である多発性骨髄腫を、最初の概念実証研究のために選択した。ｃＣＡＲ系は、ＢＣＭＡをプロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲの抗原結合性ドメインの両方についての抗腫瘍タンパク質ＡおよびＢとして標的化し（図２）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を治療用ペイロードの代理として用いた。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、高レベルのＢＣＭＡを発現する骨髄腫細胞に対して優れた活性を有し、再発性／治療抵抗性骨髄腫を有する患者においてＦＤＡ認可されている。ｃＣＡＲ細胞に、ｃＣＡＲ系の全ての３つの核酸を感染させ、ＢＣＭＡ発現骨髄腫細胞（例えば、ＯＰＭ２細胞株）と共培養し、図４Ａに示されているように、ｃＣＡＲ細胞の約８０％は高レベルのｅＧＦＰペイロードを産生した。ｃＣＡＲ系の全ての３つのコンポーネントは、有効なｅＧＦＰ産生に必要とされ、プロテアーゼＣＡＲコード構築物の非存在下でｅＧＦＰの有意なバックグラウンド産生はなかった（＜１％）（図４Ｂ～４Ｄ）。抗ＢＣＭＡプロテアーゼＣＡＲおよび抗ＢＣＭＡ活性化ＣＡＲ構築物は、ＣＡＲ媒介性骨髄腫細胞殺傷を与えた。核酸のドメインは、図２および図４Ｅ～５Ｃに、より詳細に示されている。図４Ａ～４Ｄのフローサイトメトリープロットは、それぞれ、左から右へ、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、第３の核酸、およびｅＧＦＰについて染色されたｃＣＡＲを示す。図４Ａにおいて、ジャーカットＴ細胞を、全ての３つの核酸を含むレンチウイルスで形質転換した。細胞に、図４Ｂにおいては、活性化ＣＡＲおよび第３の核酸のみを含有するウイルスを、図４Ｃにおいては、プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲのみを含有するウイルスを、ならびに図４Ｄにおいては、プロテアーゼＣＡＲおよび第３の核酸のみを含有するウイルスを感染させた。
多発性骨髄腫を処置するための抗ＢＣＭＡ ｃＣＡＲ細胞
難治性血液悪性腫瘍である多発性骨髄腫を、最初の概念実証研究のために選択した。ｃＣＡＲ系は、ＢＣＭＡをプロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲの抗原結合性ドメインの両方についての抗腫瘍タンパク質ＡおよびＢとして標的化し（図２）、高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を治療用ペイロードの代理として用いた。抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ Ｔ細胞は、高レベルのＢＣＭＡを発現する骨髄腫細胞に対して優れた活性を有し、再発性／治療抵抗性骨髄腫を有する患者においてＦＤＡ認可されている。ｃＣＡＲ細胞に、ｃＣＡＲ系の全ての３つの核酸を感染させ、ＢＣＭＡ発現骨髄腫細胞（例えば、ＯＰＭ２細胞株）と共培養し、図４Ａに示されているように、ｃＣＡＲ細胞の約８０％は高レベルのｅＧＦＰペイロードを産生した。ｃＣＡＲ系の全ての３つのコンポーネントは、有効なｅＧＦＰ産生に必要とされ、プロテアーゼＣＡＲコード構築物の非存在下でｅＧＦＰの有意なバックグラウンド産生はなかった（＜１％）（図４Ｂ～４Ｄ）。抗ＢＣＭＡプロテアーゼＣＡＲおよび抗ＢＣＭＡ活性化ＣＡＲ構築物は、ＣＡＲ媒介性骨髄腫細胞殺傷を与えた。核酸のドメインは、図２および図４Ｅ～５Ｃに、より詳細に示されている。図４Ａ～４Ｄのフローサイトメトリープロットは、それぞれ、左から右へ、プロテアーゼＣＡＲ、活性化ＣＡＲ、第３の核酸、およびｅＧＦＰについて染色されたｃＣＡＲを示す。図４Ａにおいて、ジャーカットＴ細胞を、全ての３つの核酸を含むレンチウイルスで形質転換した。細胞に、図４Ｂにおいては、活性化ＣＡＲおよび第３の核酸のみを含有するウイルスを、図４Ｃにおいては、プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲのみを含有するウイルスを、ならびに図４Ｄにおいては、プロテアーゼＣＡＲおよび第３の核酸のみを含有するウイルスを感染させた。
【0202】
プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲはどちらも、ＢＣＭＡ表面タンパク質に対して方向付けられた（すなわち、プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲはＢＣＭＡに結合する）。これらの実験について、各構築物を、構築物発現を検出するためのマーカーを含むように設計した。プロテアーゼＣＡＲは、α－ｍｙｃ－ＡＰＣで染色されたｍｙｃタグについての配列を含む。活性化ＣＡＲは、α－ＥＧＦＲ－ＰＥで染色された短縮型ＥＧＦＲ受容体についての配列を含む。第３の核酸は、ＰＧＫプロモーターの調節下でのｍＣｈｅｒｒｙフルオロフォアについての配列を含む。その後、細胞を、表面にＣＡＲ標的としてＢＣＭＡを発現するＯＰＭ２骨髄腫細胞と共培養した。２４時間の共培養後、フローサイトメトリーを実施し、３つの核酸をトランスフェクトされた生細胞（すなわち、図４ＡにおけるＡＰＣ＋ＰＥ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋）についてゲーティングした。図４Ａからわかるように、ゲーティングされた細胞の大部分は、モデルペイロードとしてのｅＧＦＰを発現している。とりわけ、３つの核酸のうちの２つのみがトランスフェクトされて、発現した場合には、最小のｅＧＦＰペイロード発現のみが検出されている（図４Ｂ～４Ｄ）。
【0203】
[実施例４]
ＢＣＭＡに結合するｃＣＡＲ Ｔ細胞はＢＣＭＡ発現ＯＰＭ２多発性骨髄腫細胞を殺傷する
治療用ペイロードをコードする第３の核酸（図６において「３」と名前を付けられている）、ならびにα－ＢＣＭＡプロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲ（図６において、それぞれ「１」および「２」と名前を付けられている）の一方または両方にレンチウイルス性感染したＴ細胞またはＣＡＲ Ｔ細胞を、ＯＰＭ２多発性骨髄腫細胞と２：１のエフェクター対標的比で４０時間、共培養した。ビーズのカウント数に対する生きているＯＰＭ２細胞の比率を、非トランスフェクト化Ｔ細胞共培養物に対して正規化し、図６において、破線で分けられた２つの代表的な実験が示されている。どちらの実験においても、治療用ペイロードをコードする第３の核酸に加えて、プロテアーゼＣＡＲかまたは活性化ＣＡＲかのいずれかを形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞は、多発性骨髄腫細胞を殺傷することにおいて有効であった（それぞれ、０．１５および０．１９ 生きているＯＰＭ２／ビーズのカウント数）。２つのα－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物（プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲ、すなわち、「１および２」）、および第３の核酸を保有するペイロード（「３」）を形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞は、単一のα－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物（すなわち、プロテアーゼＣＡＲまたは活性化ＣＡＲ）を形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞と同様に、骨髄腫細胞を殺傷した（０．１３ 生きているＯＰＭ２／ビーズのカウント数）。これらのデータは、α－ＢＣＭＡに方向付けられたプロテアーゼＣＡＲまたは活性化ＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞が、ＢＣＭＡ発現骨髄腫細胞を殺傷したことを実証している。
ＢＣＭＡに結合するｃＣＡＲ Ｔ細胞はＢＣＭＡ発現ＯＰＭ２多発性骨髄腫細胞を殺傷する
治療用ペイロードをコードする第３の核酸（図６において「３」と名前を付けられている）、ならびにα－ＢＣＭＡプロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲ（図６において、それぞれ「１」および「２」と名前を付けられている）の一方または両方にレンチウイルス性感染したＴ細胞またはＣＡＲ Ｔ細胞を、ＯＰＭ２多発性骨髄腫細胞と２：１のエフェクター対標的比で４０時間、共培養した。ビーズのカウント数に対する生きているＯＰＭ２細胞の比率を、非トランスフェクト化Ｔ細胞共培養物に対して正規化し、図６において、破線で分けられた２つの代表的な実験が示されている。どちらの実験においても、治療用ペイロードをコードする第３の核酸に加えて、プロテアーゼＣＡＲかまたは活性化ＣＡＲかのいずれかを形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞は、多発性骨髄腫細胞を殺傷することにおいて有効であった（それぞれ、０．１５および０．１９ 生きているＯＰＭ２／ビーズのカウント数）。２つのα－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物（プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲ、すなわち、「１および２」）、および第３の核酸を保有するペイロード（「３」）を形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞は、単一のα－ＢＣＭＡ ＣＡＲ構築物（すなわち、プロテアーゼＣＡＲまたは活性化ＣＡＲ）を形質導入されたＣＡＲ Ｔ細胞と同様に、骨髄腫細胞を殺傷した（０．１３ 生きているＯＰＭ２／ビーズのカウント数）。これらのデータは、α－ＢＣＭＡに方向付けられたプロテアーゼＣＡＲまたは活性化ＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞が、ＢＣＭＡ発現骨髄腫細胞を殺傷したことを実証している。
【0204】
Ｔ細胞を、治療用ペイロードをコードする第３の核酸を単独でか、またはα－ＢＣＭＡ プロテアーゼＣＡＲおよびα－ＢＣＭＡ 活性化ＣＡＲに加えてかのいずれかでレンチウイルス性感染させた（図７）。感染したＴ細胞を、ＢＣＭＡ発現ＯＰＭ２多発性骨髄腫細胞と１：１のエフェクター対標的細胞比で４０時間、共培養した。ＧＦＰを、ペイロード転写率および発現率を評価するためにニセ治療用ペイロードとして用いた。バックグラウンド治療用ペイロード発現（１１．３％ ＧＦＰ＋ ＣＡＲ Ｔ細胞）が、第３の核酸のみを保有するＴ細胞において見られた。ペイロード発現の有意な増加（４０．９％ ＧＦＰ＋ ＣＡＲ Ｔ細胞）が、プロテアーゼＣＡＲおよび活性化ＣＡＲおよび治療用物質をコードする第３の核酸の全部を発現するＣＡＲ Ｔ細胞において観察されている（図７）。ＯＰＭ２標的細胞死は、治療用ペイロード発現と相関した。
【0205】
[実施例５]
多発性骨髄腫インビトロモデルに対するｃＣＡＲ細胞の効力
一実施形態において、ｃＣＡＲ細胞を、ＣＤ３８抗原に結合するプロテアーゼＣＡＲおよびＢＣＭＡに結合する活性化ＣＡＲを発現する細胞を産生するように同時レンチウイルス感染により作製した。細胞はまた、ＢｉＴＥ ＣＤ３－ＣＤ１９およびＢｉＴＥ ＣＤ３－ＣＤ２０の一方または両方をコードする第３の核酸を含有する。これらのｃＣＡＲ細胞は、これらの細胞の周囲のクラスターである、ＣＤ３８およびＢＣＭＡを発現する癌細胞を認識し、ＢｉＴＥの転写を惹起するはずである。ＢｉＴＥは、第３の核酸の一部として導入される細胞外分泌のための隣接リーダーペプチドにより、分泌される。
多発性骨髄腫インビトロモデルに対するｃＣＡＲ細胞の効力
一実施形態において、ｃＣＡＲ細胞を、ＣＤ３８抗原に結合するプロテアーゼＣＡＲおよびＢＣＭＡに結合する活性化ＣＡＲを発現する細胞を産生するように同時レンチウイルス感染により作製した。細胞はまた、ＢｉＴＥ ＣＤ３－ＣＤ１９およびＢｉＴＥ ＣＤ３－ＣＤ２０の一方または両方をコードする第３の核酸を含有する。これらのｃＣＡＲ細胞は、これらの細胞の周囲のクラスターである、ＣＤ３８およびＢＣＭＡを発現する癌細胞を認識し、ＢｉＴＥの転写を惹起するはずである。ＢｉＴＥは、第３の核酸の一部として導入される細胞外分泌のための隣接リーダーペプチドにより、分泌される。
【0206】
この実施形態において、治療用ペイロードは、二重特異性抗体または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーをコードする。この治療用ペイロードは、ペイロードタンパク質の細胞外分泌を保証するリーダーペプチドを含む。二重特異性抗体／二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は癌細胞をＴ細胞と連結させ、連結された癌細胞へ細胞傷害活性を発揮するようにＴ細胞を活性化する。原理の証明として、２つの異なる特異性は、２つの異なる治療用ペイロードとしてＣＤ３－ＣＤ１９に対するＢｉＴＥおよびＣＤ３－ＣＤ２０に対するＢｉＴＥを導入することにより試験される。ＣＤ１９とＣＤ２０のどちらも、骨髄腫細胞の小サブセットに発現していることが知られている。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーまたは二重特異性抗体はＣＤ３－ＣＤ１９（ブリナツモマブ）についてＦＤＡ認可されており、ＣＤ３－ＣＤ２０（オドロネクスタマブ）について現在、臨床試験中である。これらの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーまたは二重特異性抗体は、細胞株に関するペイロード分子としての効力について試験することができる。治療用ペイロード効力の一つの例示的な実施形態において、Ｍｏｌｐ２骨髄腫細胞が標的癌細胞としての役割を果たし得、それらの細胞表面にＣＤ１９を発現するが、ＣＤ２０を発現しない。表面にＣＤ２０を発現するが、ＣＤ１９を発現しないＫａｒｐａｓ６２０骨髄腫細胞もまた、標的癌細胞としての役割を果たし得る。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集は、ＣＤ３８もしくはＢＣＭＡもしくはＳＬＡＭＦ７、またはこれらの分子の２つもしくは３つ全部の組合せの発現を欠損するＭｏｌｐ２およびＫａｒｐａｓ６２０骨髄腫細胞を作製するために用いることができる。
【0207】
ｃＣＡＲ細胞の特異性を試験するために、上記のｃＣＡＲ細胞を、ＣＤ３８およびＢＣＭＡがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集でノックアウトされているＭｏｌｐ２細胞（Ｍｏｌｐ２ＣＤ３８ ＫＯ／ＢＣＭＡ ＫＯ）と、野生型Ｍｏｌｐ２細胞の存在下または非存在下で共培養する。ＣＤ３－ＣＤ１９ ＢｉＴＥ治療用ペイロードの分泌は、表面ＣＤ３８とＢＣＭＡの両方を発現する野生型Ｍｏｌｐ２細胞の存在下でのみ起こることが予想される。したがって、Ｍｏｌｐ２ＣＤ３８ ＫＯ／ＢＣＭＡ ＫＯ骨髄腫細胞の殺傷は、野生型Ｍｏｌｐ２細胞もまた共培養中に存在する場合のみ起こると予測される。追加のＣＡＲ特異性、例えば、ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ１３８、ＣＤ３８、およびＢＣＭＡは、本明細書で開示されている。
【0208】
[実施例６]
ｃＣＡＲ細胞は抗原発現腫瘍細胞を選択的に殺傷する
この実験は、抗ＢＣＭＡ プロテアーゼＣＡＲ、抗ＢＣＭＡ 活性化ＣＡＲ、およびＣＤ３／ＣＤ１９ ＢｉＴＥをコードする第３の核酸を発現するｃＣＡＲ細胞が、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞の存在下でのみＣＤ１９陽性腫瘍細胞を選択的に殺傷したことを示している。ＯＰＭ２（図８Ａ）およびＮＡＬＭ－６（図８Ｂ）癌細胞を、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）発現について評価した。赤色ヒストグラムは未染色細胞を表し、一方、青色はα－ＢＣＭＡ染色を表し、ＯＰＭ２細胞（図８Ａ）がＢＣＭＡ陽性であったが、ＮＡＬＭ－６細胞（図８Ｂ）がＢＣＭＡ陰性であったことを示している。ｃＣＡＲ Ｔ細胞に、抗ＢＣＭＡ プロテアーゼＣＡＲ、抗ＢＣＭＡ 活性化ＣＡＲ、およびＣＤ３／ＣＤ１９ ＢｉＴＥをコードする第３の核酸をレンチウイルス性感染させた（図８Ｃにおいて、１＋２＋３ ＣＡＲ Ｔと名前を付けられている）。これらのｃＣＡＲ Ｔ細胞または非感染対照Ｔ細胞（Ｔ細胞）を、ＢＣＭＡ陰性／ＣＤ１９陽性ＮＡＬＭ－６細胞とＢＣＭＡ陽性ＯＰＭ２細胞の両方と、２：１のエフェクター対標的比で４０時間、共培養した。ＣＤ３／ＣＤ１９ ＢｉＴＥ発現および殺傷効力は、非感染Ｔ細胞による殺傷に対して正規化された、ビーズのカウント数に対する生きているＮＡＬＭ－６細胞の比率として示されている。ＣＤ３／ＣＤ１９ ＢｉＴＥによるＣＤ１９陽性ＮＡＬＭ－６細胞の治療用ペイロード媒介性殺傷は、ＢＣＭＡ陽性ＯＰＭ２細胞の存在下でのｃＣＡＲ Ｔ細胞に関してのみ観察された（図８Ｃ）。
ｃＣＡＲ細胞は抗原発現腫瘍細胞を選択的に殺傷する
この実験は、抗ＢＣＭＡ プロテアーゼＣＡＲ、抗ＢＣＭＡ 活性化ＣＡＲ、およびＣＤ３／ＣＤ１９ ＢｉＴＥをコードする第３の核酸を発現するｃＣＡＲ細胞が、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞の存在下でのみＣＤ１９陽性腫瘍細胞を選択的に殺傷したことを示している。ＯＰＭ２（図８Ａ）およびＮＡＬＭ－６（図８Ｂ）癌細胞を、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９）発現について評価した。赤色ヒストグラムは未染色細胞を表し、一方、青色はα－ＢＣＭＡ染色を表し、ＯＰＭ２細胞（図８Ａ）がＢＣＭＡ陽性であったが、ＮＡＬＭ－６細胞（図８Ｂ）がＢＣＭＡ陰性であったことを示している。ｃＣＡＲ Ｔ細胞に、抗ＢＣＭＡ プロテアーゼＣＡＲ、抗ＢＣＭＡ 活性化ＣＡＲ、およびＣＤ３／ＣＤ１９ ＢｉＴＥをコードする第３の核酸をレンチウイルス性感染させた（図８Ｃにおいて、１＋２＋３ ＣＡＲ Ｔと名前を付けられている）。これらのｃＣＡＲ Ｔ細胞または非感染対照Ｔ細胞（Ｔ細胞）を、ＢＣＭＡ陰性／ＣＤ１９陽性ＮＡＬＭ－６細胞とＢＣＭＡ陽性ＯＰＭ２細胞の両方と、２：１のエフェクター対標的比で４０時間、共培養した。ＣＤ３／ＣＤ１９ ＢｉＴＥ発現および殺傷効力は、非感染Ｔ細胞による殺傷に対して正規化された、ビーズのカウント数に対する生きているＮＡＬＭ－６細胞の比率として示されている。ＣＤ３／ＣＤ１９ ＢｉＴＥによるＣＤ１９陽性ＮＡＬＭ－６細胞の治療用ペイロード媒介性殺傷は、ＢＣＭＡ陽性ＯＰＭ２細胞の存在下でのｃＣＡＲ Ｔ細胞に関してのみ観察された（図８Ｃ）。
【0209】
[実施例７]
多発性骨髄腫インビトロモデルに対するｃＣＡＲ細胞の効力
この実施例において、本開示は、インビボで不均一な腫瘍細胞クラスターの標的化についてのｃＣＡＲ系の特異性および効力を調べるための実施形態に適用される。多発性骨髄腫が再び、モデル系として用いられ、最初は、本明細書の他の所で詳述された治療用ペイロードの例として抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥおよび抗ＣＤ２０ ＢｉＴＥを用いることに焦点を合わせる。今まで、骨髄腫プリマグラフト（primagraft）モデルを作製するのが困難であったが、例えば、Bianchi et al., Blood Cancer Discov. 2(4):338-353 (2021)に記載されているように、髄内異種移植ＮＯＤ－ｓｃｉｄ－ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌ（ＮＳＧ）モデルが骨髄間質を模倣するように用いることに成功している（μ－ＳＣＩＤ異種移植モデル）。この目的のために、ＮＳＧドナーマウスの両側大腿骨を摘出し、吸引し、内因性骨髄を廃棄する。その後、Ｍｏｌｐ２またはＫａｒｐａｓ６２０骨髄腫細胞、それぞれを、髄内に注射し、その後、マトリゲルで大腿骨頭を封鎖する。大腿骨をＮＳＧレシピエントマウスへ皮下に移植する（マウスあたり２個の移植片、群あたり７匹のマウス）。その後、マウスに、抗ＣＤ３８／抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３－ＣＤ１９ ＢｉＴＥ治療用ペイロードを発現するｃＣＡＲ細胞または抗ＣＤ３８／抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３－ＣＤ２０ ＢｉＴＥ治療用ペイロードを発現するｃＣＡＲ細胞、それぞれを注射する。治療用ペイロードの効力を評価するために、Ｍｏｌｐ２ＣＤ３８ ＫＯ／ＢＣＭＡ ＫＯまたはＫａｒｐａｓ６２０ＣＤ３８ ＫＯ／ＢＣＭＡ ＫＯ細胞をそれぞれ、野生型Ｍｏｌｐ２またはＫａｒｐａｓ６２０細胞の同時移植ありおよびなしで、同時移植する。ＢｉＴＥ治療用ペイロードの細胞傷害性により、野生型とノックアウト骨髄腫細胞の両方が、効果的に殺傷されることが予想されるが、ただし、野生型Ｍｏｌｐ２またはＫａｒｐａｓ６２０細胞が存在する場合でのみである。腫瘍殺傷は、腫瘍負荷について、ルミネセンスを用いかつカプラン・マイアー生存曲線を作成して、評価される。
多発性骨髄腫インビトロモデルに対するｃＣＡＲ細胞の効力
この実施例において、本開示は、インビボで不均一な腫瘍細胞クラスターの標的化についてのｃＣＡＲ系の特異性および効力を調べるための実施形態に適用される。多発性骨髄腫が再び、モデル系として用いられ、最初は、本明細書の他の所で詳述された治療用ペイロードの例として抗ＣＤ１９ ＢｉＴＥおよび抗ＣＤ２０ ＢｉＴＥを用いることに焦点を合わせる。今まで、骨髄腫プリマグラフト（primagraft）モデルを作製するのが困難であったが、例えば、Bianchi et al., Blood Cancer Discov. 2(4):338-353 (2021)に記載されているように、髄内異種移植ＮＯＤ－ｓｃｉｄ－ＩＬ２Ｒｇｎｕｌｌ（ＮＳＧ）モデルが骨髄間質を模倣するように用いることに成功している（μ－ＳＣＩＤ異種移植モデル）。この目的のために、ＮＳＧドナーマウスの両側大腿骨を摘出し、吸引し、内因性骨髄を廃棄する。その後、Ｍｏｌｐ２またはＫａｒｐａｓ６２０骨髄腫細胞、それぞれを、髄内に注射し、その後、マトリゲルで大腿骨頭を封鎖する。大腿骨をＮＳＧレシピエントマウスへ皮下に移植する（マウスあたり２個の移植片、群あたり７匹のマウス）。その後、マウスに、抗ＣＤ３８／抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３－ＣＤ１９ ＢｉＴＥ治療用ペイロードを発現するｃＣＡＲ細胞または抗ＣＤ３８／抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３－ＣＤ２０ ＢｉＴＥ治療用ペイロードを発現するｃＣＡＲ細胞、それぞれを注射する。治療用ペイロードの効力を評価するために、Ｍｏｌｐ２ＣＤ３８ ＫＯ／ＢＣＭＡ ＫＯまたはＫａｒｐａｓ６２０ＣＤ３８ ＫＯ／ＢＣＭＡ ＫＯ細胞をそれぞれ、野生型Ｍｏｌｐ２またはＫａｒｐａｓ６２０細胞の同時移植ありおよびなしで、同時移植する。ＢｉＴＥ治療用ペイロードの細胞傷害性により、野生型とノックアウト骨髄腫細胞の両方が、効果的に殺傷されることが予想されるが、ただし、野生型Ｍｏｌｐ２またはＫａｒｐａｓ６２０細胞が存在する場合でのみである。腫瘍殺傷は、腫瘍負荷について、ルミネセンスを用いかつカプラン・マイアー生存曲線を作成して、評価される。
【0210】
第２セットの実験において、ＢｉＴＥ媒介性殺傷からのＣＤ１９またはＣＤ２０を発現する非癌性Ｂ細胞の死を、評価する。この目的のために、ＮＳＧレシピエントマウスに、正常ドナーＢ細胞を移植する。移植が末梢血フローサイトメトリーにより確認されたならば、Ｍｏｌｐ２またはＫａｒｐａｓ６２０骨髄腫細胞を含有する大腿骨移植片を移植し、上記で詳述されているようなそれぞれのＣＤ３８／ＢＣＭＡ ＫＯ骨髄腫細胞を同時トランスフェクトする。その後、抗ＣＤ３８／抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３－ＣＤ１９ ＢｉＴＥ治療用ペイロードを発現するｃＣＡＲ細胞または抗ＣＤ３８／抗ＢＣＭＡ／ＣＤ３－ＣＤ２０ ＢｉＴＥ治療用ペイロードを発現するｃＣＡＲ細胞を、それぞれ、注射し、疾患負荷を上記のようにモニターする。加えて、末梢血中の非癌性Ｂ細胞の数、非癌性骨髄、および骨髄の骨髄腫移植片を、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ７９ａについてのフローサイトメトリー染色により評価する。骨髄腫の骨髄移植片におけるＢ細胞の減少が予想されるが、末梢血および非癌性骨髄におけるＢ細胞の数への効果はないと予想される。
【0211】
これらの実験は、ｉ）不均一な腫瘍細胞クラスターの標的化およびｉｉ）別個のコンパートメントに局在した正常組織の温存のためのｃＣＡＲ依存性治療用ペイロードの効力を確立する。
【0212】
全ての特許刊行物および非特許刊行物は、本開示が関連する技術分野の当業者の技術のレベルを示す。全てのこれらの刊行物（参照されるそれらの任意の特定の部分を含む）は、あたかも各個々の刊行物が、参照により組み入れられているものとして具体的かつ個々に示されているかのように同じ程度で参照により本明細書に組み入れられている。
【0213】
本明細書における本開示は、特定の実施形態を参照して記載されているが、これらの実施形態は、単に、本開示の原理および適用の実例となるに過ぎないことは理解されるべきである。したがって、添付の特許請求の範囲により定義されるような本開示の精神および範囲から逸脱することなく、多数の改変が実例的な実施形態になされ得ること、および他の配置が考案され得ることは理解されるべきである。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-27
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の核酸、第２の核酸、および第３の核酸のうちの少なくとも１つを含む核酸構築物であって、前記第１の核酸が、第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する第１の抗原結合性ドメインを含む第１の細胞外ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１のシグナル伝達ドメインおよびプロテアーゼドメインを含む第１の細胞内ドメインとを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、前記第２の核酸が、第２のＴＡＡに結合する第２の抗原結合性ドメインを含む第２の細胞外ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２のシグナル伝達ドメイン、前記プロテアーゼにより認識される切断部位、および転写活性化因子を含む細胞内ドメインとを含む第２のＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結された第２のプロモーターを含み、
前記第３の核酸が、前記転写活性化因子に結合する転写アクセプターと、第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターと作動可能に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸とを含む、
核酸構築物。
【請求項2】
前記第１、前記第２、および前記第３の核酸を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項3】
前記第１、前記第２、および前記第３の核酸のうちの２つを含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項4】
前記プロテアーゼドメインが、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶｐ）に由来し、前記切断部位がＴＥＶｐにより切断可能な配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項5】
前記治療用ペイロードが、抗体断片、サイトカイン、可溶性サイトカイン受容体、ケモカイン、可溶性ケモカイン受容体、ＲＮＡもしくはオリゴペプチドワクチン、または表面受容体を含む、請求項１に記載の核酸構築物。【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0213】
本明細書における本開示は、特定の実施形態を参照して記載されているが、これらの実施形態は、単に、本開示の原理および適用の実例となるに過ぎないことは理解されるべきである。したがって、添付の特許請求の範囲により定義されるような本開示の精神および範囲から逸脱することなく、多数の改変が実例的な実施形態になされ得ること、および他の配置が考案され得ることは理解されるべきである。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］ 第１の核酸、第２の核酸、および第３の核酸のうちの少なくとも１つを含む核酸構築物であって、前記第１の核酸が、第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する第１の抗原結合性ドメインを含む第１の細胞外ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１のシグナル伝達ドメインおよびプロテアーゼドメインを含む第１の細胞内ドメインとを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、
前記第２の核酸が、第２のＴＡＡに結合する第２の抗原結合性ドメインを含む第２の細胞外ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２のシグナル伝達ドメイン、前記プロテアーゼにより認識される切断部位、および転写活性化因子を含む細胞内ドメインとを含む第２のＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結された第２のプロモーターを含み、
前記第３の核酸が、前記転写活性化因子に結合する転写アクセプターと、第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターと作動可能に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸とを含む、
核酸構築物。
［２］ 前記第１、前記第２、および前記第３の核酸を含む、［１］に記載の核酸構築物。
［３］ 前記第１、前記第２、および前記第３の核酸のうちの２つを含む、［１］に記載の核酸構築物。
［４］ 前記第１のプロモーター、前記第２のプロモーター、または前記第１のプロモーターと前記第２のプロモーターの両方が、ＥＦ－１α、ＣＭＶ、ＰＧＫ、ＲＰＢＳＡ、ＡｍｐＲ、またはＣＡＧプロモーターである、［１］～［３］のいずれかに記載の核酸構築物。
［５］ 前記第１および前記第２のプロモーターがＥＦ－１αプロモーターである、［４］に記載の核酸構築物。
［６］ 前記第１の抗原結合性ドメイン、前記第２の抗原結合性ドメイン、または前記第１の抗原結合性ドメインと前記第２の抗原結合性ドメインの両方が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＦＣＲＨ５、ＧＰＲＣ５Ｄ、またはＳＬＡＭＦ７に結合する、［１］に記載の核酸構築物。
［７］ 前記第１および前記第２の抗原結合性ドメインがＢＣＭＡに結合する、［６］に記載の核酸構築物。
［８］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸配列
を含むＶＬドメイン、およびアミノ酸配列
を含むＶＨドメインを含む、［７］に記載の核酸構築物。
［９］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインがＣＤ３８に結合する、［６］に記載の核酸構築物。
［１０］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸配列
を含むＶＬドメイン、およびアミノ酸配列
を含むＶＨドメインを含む、［９］に記載の核酸構築物。
［１１］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインがＳＬＡＭＦ７に結合する、［６］に記載の核酸構築物。
［１２］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸配列
を含むＶＬドメイン、およびアミノ酸配列
を含むＶＨドメインを含む、［１１］に記載の核酸構築物。
［１３］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインがＦＣＲＨ５に結合する、［６］に記載の核酸構築物。
［１４］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸配列
を含むＶＬドメイン、およびアミノ酸配列
を含むＶＨドメインを含む、［１４］に記載の核酸構築物。
［１５］ 前記第１および前記第２の抗原結合性ドメインが同じＴＡＡに結合する、［１］～［１４］のいずれかに記載の核酸構築物。
［１６］ 前記第１および前記第２の抗原結合性ドメインが同じアミノ酸配列を有する、［１５］に記載の核酸構築物。
［１７］ 前記第１または前記第２の膜貫通ドメインがＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ２８、またはＣＤ１３７に由来する、［１］に記載の核酸構築物。
［１８］ 前記第１および前記第２の膜貫通ドメインがＣＤ２８に由来する、［１７］に記載の核酸構築物。
［１９］ 前記第１および前記第２の膜貫通ドメインが、アミノ酸配列ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号５０）を有する、［１８］に記載の核酸構築物。
［２０］ 前記第１の細胞外ドメインが、前記第１の抗原結合性ドメインと前記第１の膜貫通ドメインとの間に配置された第１のヒンジドメインをさらに含み、前記第２の細胞外ドメインが、前記第２の抗原結合性ドメインと前記第２の膜貫通ドメインとの間に配置された第２のヒンジドメインをさらに含む、［１］に記載の核酸構築物。
［２１］ 前記第１および前記第２のヒンジドメインがＣＤ８α、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ４に由来する、［２０］に記載の核酸構築物。
［２２］ 前記第１および前記第２のヒンジドメインがＣＤ８αに由来する、［２１］に記載の核酸構築物。
［２３］ 前記第１および前記第２のヒンジドメインがアミノ酸配列ＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＫＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹ（配列番号５４）を含む、［２２］に記載の核酸構築物。
［２４］ 前記第１のシグナル伝達ドメイン、前記第２のシグナル伝達ドメイン、または前記第１のシグナル伝達ドメインと前記第２のシグナル伝達ドメインの両方が、一次シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、または一次シグナル伝達ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインの両方を含む、［１］に記載の核酸構築物。
［２５］ 前記第１のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含み、前記第２のシグナル伝達ドメインがＣＤ２８一次シグナル伝達ドメインを含む、［２４］に記載の核酸構築物。
［２６］ 前記第１のシグナル伝達ドメイン、前記第２のシグナル伝達ドメイン、または前記第１のシグナル伝達ドメインと前記第２のシグナル伝達ドメインの両方が、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン、および４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインまたはＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、または４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインとＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの両方を含む、［２４］に記載の核酸構築物。
［２７］ 前記第１および前記第２のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインならびに４－１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む、［２６］に記載の核酸構築物。
［２８］ 前記ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインがアミノ酸配列
を含み、前記４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインがアミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号６８）を含み、前記ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインがアミノ酸配列ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号７２）を含む、［２７］に記載の核酸構築物。
［２９］ 前記第１のＣＡＲが、前記プロテアーゼドメインのＮ末端側にある第１のリンカーをさらに含み、前記第２のＣＡＲが、前記切断部位のＮ末端側にある第２のリンカーをさらに含む、［１］に記載の核酸構築物。
［３０］ 前記プロテアーゼドメインが、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶｐ）に由来し、前記切断部位がＴＥＶｐにより切断可能な配列を含む、［１］に記載の核酸構築物。
［３１］ 前記切断部位がアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＭ（配列番号８３）を含む、［３０］に記載の核酸構築物。
［３２］ 前記転写活性化因子がＧａｌ４－ＶＰ６４融合タンパク質を含み、前記転写アクセプターがＧａｌ４結合部位を含み、前記第３のプロモーターが改変型ＣＭＶプロモーターである、［１］に記載の核酸構築物。
［３３］ 前記治療用ペイロードが、抗体断片、サイトカイン、可溶性サイトカイン受容体、ケモカイン、可溶性ケモカイン受容体、ＲＮＡもしくはオリゴペプチドワクチン、または表面受容体を含む、［１］に記載の核酸構築物。
［３４］ 前記治療剤が、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＧＦβ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４に結合する抗体断片を含む、［３３］に記載の核酸構築物。
［３５］ 前記治療用ペイロードが、二重特異性抗体断片または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを含む、［３４］に記載の核酸構築物。
［３６］ 前記治療用ペイロードが、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖ、およびＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＥＧＦＲ、ＦＣＲＨ５、Ｆｌｔ３、ＧＰＣＲ５Ｄ、ＰＳＭＡ、またはＳＬＡＭＦ７に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体断片を含む、［３５］に記載の核酸構築物。
［３７］ 前記治療用ペイロードが、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体断片を含む、［３６］に記載の核酸構築物。
［３８］ 前記治療用ペイロードが、アミノ酸配列
を含む二重特異性抗体断片を含む、［３７］に記載の核酸構築物。
［３９］ 前記治療用ペイロードが、ＣＤ２０に結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体断片を含む、［３６］に記載の核酸構築物。
［４０］ 前記治療用ペイロードが、ＦＣＲＨ５に結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体断片を含む、［３６］に記載の核酸構築物。
［４１］ 前記治療用ペイロードが、アミノ酸配列
を含む二重特異性抗体断片を含む、［４０］に記載の核酸構築物。
［４２］ 前記治療用ペイロードが、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、またはケモカイン受容体に結合する抗体断片を含む、［３３］に記載の核酸構築物。
［４３］ 前記抗体断片がＩＬ－６またはＩＬ－６Ｒに結合する、［４２］に記載の核酸構築物。
［４４］ 前記治療用ペイロードが、サイトカイン、可溶性サイトカイン受容体、ケモカイン、または可溶性ケモカイン受容体を含む、［３３］に記載の核酸構築物。
［４５］ 前記サイトカインまたはケモカインが、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、またはＴＧＦβである、［４４］に記載の核酸構築物。
［４６］ 前記サイトカインまたはケモカインが、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、またはＴＧＦβである、［４５］に記載の核酸構築物。
［４７］ 前記可溶性サイトカイン受容体または前記ケモカイン受容体が可溶性ＩＦＮγＲまたは可溶性ＩＬ－２Ｒである、［４５］に記載の核酸構築物。
［４８］ 前記治療用ペイロードがＲＮＡまたはオリゴペプチドワクチンを含む、［３３］に記載の核酸構築物。
［４９］ 前記ＲＮＡまたはオリゴペプチドワクチンが、サバイビン、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、またはＣＴ７に対して方向付けられている、［４６］に記載の核酸構築物。
［５０］ 前記治療用ペイロードが表面受容体を含む、［３３］に記載の核酸構築物。
［５１］ 前記表面受容体がＣＡＲ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２を含む、［５０］に記載の核酸構築物。
［５２］ 前記第１のリンカー、前記第２のリンカー、または前記第１のリンカーと前記第２のリンカーの両方が、アミノ酸配列ＧＧＧＸ、ＧＧＧＧＸ（配列番号８９）、またはＧＳＳＧＳＸ（配列番号９０）を含み、ＸはＣかまたはＳのいずれかである、［２９］～［５１］のいずれかに記載の核酸。
［５３］ 前記リンカーがアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９４）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号９５）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号９６）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号９７）、またはＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号９８）を有する、［５２］に記載の核酸。
［５４］ ［１］～［５３］のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
［５５］ レンチウイルスベクターである、［５４］に記載のベクター。
［５６］ 遺伝子改変型免疫細胞を産生する方法であって、
第１の核酸構築物、第２の核酸構築物、および第３の核酸構築物を免疫細胞へ導入するステップを含み、前記第１の核酸構築物が、第１のＴＡＡに結合する第１の抗原結合性ドメインを含む第１の細胞外ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１のシグナル伝達ドメインおよびプロテアーゼドメインを含む第１の細胞内ドメインとを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、
前記第２の核酸構築物が、第２のＴＡＡに結合する第２の抗原結合性ドメインを含む第２の細胞外ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２のシグナル伝達ドメイン、前記プロテアーゼにより認識される切断部位、および転写活性化因子を含む細胞内ドメインとを含む第２のＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結された第２のプロモーターを含み、
前記第３の核酸構築物が、前記転写活性化因子に結合する転写アクセプターと、第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターと作動的に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸とを含む、方法。
［５７］ 前記第１のＣＡＲが、前記プロテアーゼドメインのＮ末端側にある、第１のシグナル伝達ドメインおよび第１のリンカーをさらに含み、前記第２のＣＡＲが、前記切断部位のＮ末端側にある、第２のシグナル伝達ドメインおよび第２のリンカーをさらに含む、［５６］に記載の方法。
［５８］ 前記第１、第２、および前記第３の核酸構築物が１つのベクターにより前記免疫細胞へ導入される、［５６］に記載の方法。
［５９］ 前記第１、第２、および前記第３の核酸構築物のうちの２つが、第１のベクターにより前記免疫細胞へ導入され、前記３つの核酸構築物の３番目が第２のベクターにより前記免疫細胞へ導入される、［５６］に記載の方法。
［６０］ 第１の核酸構築物、第２の核酸構築物、および第３の核酸構築物を含む、遺伝子改変型免疫細胞であって、
前記第１の核酸構築物が、第１のＴＡＡに結合する第１の抗原結合性ドメインを含む第１の細胞外ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１のシグナル伝達ドメインおよびプロテアーゼドメインを含む第１の細胞内ドメインとを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、
前記第２の核酸構築物が、第２のＴＡＡに結合する第２の抗原結合性ドメインを含む第２の細胞外ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２のシグナル伝達ドメイン、前記プロテアーゼにより認識される切断部位、および転写活性化因子を含む細胞内ドメインとを含む第２のＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結された第２のプロモーターを含み、
前記第３の核酸構築物が、前記転写活性化因子に結合する転写アクセプターと、第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターと作動的に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸とを含む、
免疫細胞。
［６１］ 前記第１のＣＡＲが、前記プロテアーゼドメインのＮ末端側にある、第１のシグナル伝達ドメインおよび第１のリンカーをさらに含み、前記第２のＣＡＲが、前記切断部位のＮ末端側にある、第２のシグナル伝達ドメインおよび第２のリンカーをさらに含む、［６０］に記載の免疫細胞。
［６２］ 前記第１、第２、および前記第３の核酸構築物が１つのベクター内に配置されている、［６０］に記載の免疫細胞。
［６３］ 前記第１、第２、および前記第３の核酸構築物のうちの２つが第１のベクター内に配置され、前記３つの核酸構築物の３番目が第２のベクター内に配置されている、［６０］に記載の免疫細胞。
［６４］ Ｔ細胞である、［６０］～［６３］のいずれかに記載の免疫細胞。
［６５］ ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞である、［６４］に記載の免疫細胞。
［６６］ ＮＫ細胞である、［６０］～［６３］のいずれかに記載の免疫細胞。
［６７］ ［６３］～［６６］のいずれかに記載の治療的有効数の免疫細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
［６８］ 癌を処置する方法であって、
それを必要としている対象に、［６７］に記載の薬学的組成物を投与するステップ
を含む、方法。
［６９］ 前記対象が、以前ＣＡＲ－Ｔ細胞治療またはＢｉＴｅ治療を受けている、［６８］に記載の方法。
［７０］ 前記癌が固形腫瘍により特徴付けられる、［６８］に記載の方法。
［７１］ 固形腫瘍により特徴付けられる前記癌が、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝癌、前立腺癌、脳癌、胃腸癌、精巣癌、子宮癌、および小児癌である、［７０］に記載の方法。
［７２］ 前記癌が血液癌である、［６８］に記載の方法。
［７３］ 前記血液癌が多発性骨髄腫、白血病、またはリンパ腫である、［７２］に記載の方法。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］ 第１の核酸、第２の核酸、および第３の核酸のうちの少なくとも１つを含む核酸構築物であって、前記第１の核酸が、第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する第１の抗原結合性ドメインを含む第１の細胞外ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１のシグナル伝達ドメインおよびプロテアーゼドメインを含む第１の細胞内ドメインとを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、
前記第２の核酸が、第２のＴＡＡに結合する第２の抗原結合性ドメインを含む第２の細胞外ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２のシグナル伝達ドメイン、前記プロテアーゼにより認識される切断部位、および転写活性化因子を含む細胞内ドメインとを含む第２のＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結された第２のプロモーターを含み、
前記第３の核酸が、前記転写活性化因子に結合する転写アクセプターと、第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターと作動可能に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸とを含む、
核酸構築物。
［２］ 前記第１、前記第２、および前記第３の核酸を含む、［１］に記載の核酸構築物。
［３］ 前記第１、前記第２、および前記第３の核酸のうちの２つを含む、［１］に記載の核酸構築物。
［４］ 前記第１のプロモーター、前記第２のプロモーター、または前記第１のプロモーターと前記第２のプロモーターの両方が、ＥＦ－１α、ＣＭＶ、ＰＧＫ、ＲＰＢＳＡ、ＡｍｐＲ、またはＣＡＧプロモーターである、［１］～［３］のいずれかに記載の核酸構築物。
［５］ 前記第１および前記第２のプロモーターがＥＦ－１αプロモーターである、［４］に記載の核酸構築物。
［６］ 前記第１の抗原結合性ドメイン、前記第２の抗原結合性ドメイン、または前記第１の抗原結合性ドメインと前記第２の抗原結合性ドメインの両方が、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＦＣＲＨ５、ＧＰＲＣ５Ｄ、またはＳＬＡＭＦ７に結合する、［１］に記載の核酸構築物。
［７］ 前記第１および前記第２の抗原結合性ドメインがＢＣＭＡに結合する、［６］に記載の核酸構築物。
［８］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸配列
【化28】
を含むＶＬドメイン、およびアミノ酸配列
【化29】
を含むＶＨドメインを含む、［７］に記載の核酸構築物。
［９］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインがＣＤ３８に結合する、［６］に記載の核酸構築物。
［１０］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸配列
【化30】
を含むＶＬドメイン、およびアミノ酸配列
【化31】
を含むＶＨドメインを含む、［９］に記載の核酸構築物。
［１１］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインがＳＬＡＭＦ７に結合する、［６］に記載の核酸構築物。
［１２］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸配列
【化32】
を含むＶＬドメイン、およびアミノ酸配列
【化33】
を含むＶＨドメインを含む、［１１］に記載の核酸構築物。
［１３］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインがＦＣＲＨ５に結合する、［６］に記載の核酸構築物。
［１４］ 前記第１または前記第２の抗原結合性ドメインが、アミノ酸配列
【化34】
を含むＶＬドメイン、およびアミノ酸配列
【化35】
を含むＶＨドメインを含む、［１４］に記載の核酸構築物。
［１５］ 前記第１および前記第２の抗原結合性ドメインが同じＴＡＡに結合する、［１］～［１４］のいずれかに記載の核酸構築物。
［１６］ 前記第１および前記第２の抗原結合性ドメインが同じアミノ酸配列を有する、［１５］に記載の核酸構築物。
［１７］ 前記第１または前記第２の膜貫通ドメインがＣＤ３、ＣＤ８α、ＣＤ２８、またはＣＤ１３７に由来する、［１］に記載の核酸構築物。
［１８］ 前記第１および前記第２の膜貫通ドメインがＣＤ２８に由来する、［１７］に記載の核酸構築物。
［１９］ 前記第１および前記第２の膜貫通ドメインが、アミノ酸配列ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号５０）を有する、［１８］に記載の核酸構築物。
［２０］ 前記第１の細胞外ドメインが、前記第１の抗原結合性ドメインと前記第１の膜貫通ドメインとの間に配置された第１のヒンジドメインをさらに含み、前記第２の細胞外ドメインが、前記第２の抗原結合性ドメインと前記第２の膜貫通ドメインとの間に配置された第２のヒンジドメインをさらに含む、［１］に記載の核酸構築物。
［２１］ 前記第１および前記第２のヒンジドメインがＣＤ８α、ＩｇＧ１、またはＩｇＧ４に由来する、［２０］に記載の核酸構築物。
［２２］ 前記第１および前記第２のヒンジドメインがＣＤ８αに由来する、［２１］に記載の核酸構築物。
［２３］ 前記第１および前記第２のヒンジドメインがアミノ酸配列ＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＫＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹ（配列番号５４）を含む、［２２］に記載の核酸構築物。
［２４］ 前記第１のシグナル伝達ドメイン、前記第２のシグナル伝達ドメイン、または前記第１のシグナル伝達ドメインと前記第２のシグナル伝達ドメインの両方が、一次シグナル伝達ドメイン、共刺激シグナル伝達ドメイン、または一次シグナル伝達ドメインと共刺激シグナル伝達ドメインの両方を含む、［１］に記載の核酸構築物。
［２５］ 前記第１のシグナル伝達ドメインがＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインを含み、前記第２のシグナル伝達ドメインがＣＤ２８一次シグナル伝達ドメインを含む、［２４］に記載の核酸構築物。
［２６］ 前記第１のシグナル伝達ドメイン、前記第２のシグナル伝達ドメイン、または前記第１のシグナル伝達ドメインと前記第２のシグナル伝達ドメインの両方が、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメイン、および４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインまたはＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメイン、または４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインとＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインの両方を含む、［２４］に記載の核酸構築物。
［２７］ 前記第１および前記第２のシグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインならびに４－１ＢＢおよびＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインを含む、［２６］に記載の核酸構築物。
［２８］ 前記ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインがアミノ酸配列
【化36】
を含み、前記４－１ＢＢ共刺激シグナル伝達ドメインがアミノ酸配列ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号６８）を含み、前記ＣＤ２８共刺激シグナル伝達ドメインがアミノ酸配列ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号７２）を含む、［２７］に記載の核酸構築物。
［２９］ 前記第１のＣＡＲが、前記プロテアーゼドメインのＮ末端側にある第１のリンカーをさらに含み、前記第２のＣＡＲが、前記切断部位のＮ末端側にある第２のリンカーをさらに含む、［１］に記載の核酸構築物。
［３０］ 前記プロテアーゼドメインが、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（ＴＥＶｐ）に由来し、前記切断部位がＴＥＶｐにより切断可能な配列を含む、［１］に記載の核酸構築物。
［３１］ 前記切断部位がアミノ酸配列ＥＮＬＹＦＱＭ（配列番号８３）を含む、［３０］に記載の核酸構築物。
［３２］ 前記転写活性化因子がＧａｌ４－ＶＰ６４融合タンパク質を含み、前記転写アクセプターがＧａｌ４結合部位を含み、前記第３のプロモーターが改変型ＣＭＶプロモーターである、［１］に記載の核酸構築物。
［３３］ 前記治療用ペイロードが、抗体断片、サイトカイン、可溶性サイトカイン受容体、ケモカイン、可溶性ケモカイン受容体、ＲＮＡもしくはオリゴペプチドワクチン、または表面受容体を含む、［１］に記載の核酸構築物。
［３４］ 前記治療剤が、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＬＡ－Ｅ、ＴＧＦβ、ＰＤ－Ｌ１、ＥＧＦＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ４に結合する抗体断片を含む、［３３］に記載の核酸構築物。
［３５］ 前記治療用ペイロードが、二重特異性抗体断片または二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーを含む、［３４］に記載の核酸構築物。
［３６］ 前記治療用ペイロードが、ＣＤ３に結合するｓｃＦｖ、およびＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＥＧＦＲ、ＦＣＲＨ５、Ｆｌｔ３、ＧＰＣＲ５Ｄ、ＰＳＭＡ、またはＳＬＡＭＦ７に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体断片を含む、［３５］に記載の核酸構築物。
［３７］ 前記治療用ペイロードが、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体断片を含む、［３６］に記載の核酸構築物。
［３８］ 前記治療用ペイロードが、アミノ酸配列
【化37】
を含む二重特異性抗体断片を含む、［３７］に記載の核酸構築物。
［３９］ 前記治療用ペイロードが、ＣＤ２０に結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体断片を含む、［３６］に記載の核酸構築物。
［４０］ 前記治療用ペイロードが、ＦＣＲＨ５に結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含む二重特異性抗体断片を含む、［３６］に記載の核酸構築物。
［４１］ 前記治療用ペイロードが、アミノ酸配列
【化38】
を含む二重特異性抗体断片を含む、［４０］に記載の核酸構築物。
［４２］ 前記治療用ペイロードが、サイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、またはケモカイン受容体に結合する抗体断片を含む、［３３］に記載の核酸構築物。
［４３］ 前記抗体断片がＩＬ－６またはＩＬ－６Ｒに結合する、［４２］に記載の核酸構築物。
［４４］ 前記治療用ペイロードが、サイトカイン、可溶性サイトカイン受容体、ケモカイン、または可溶性ケモカイン受容体を含む、［３３］に記載の核酸構築物。
［４５］ 前記サイトカインまたはケモカインが、ＩＦＮγ、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、またはＴＧＦβである、［４４］に記載の核酸構築物。
［４６］ 前記サイトカインまたはケモカインが、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、またはＴＧＦβである、［４５］に記載の核酸構築物。
［４７］ 前記可溶性サイトカイン受容体または前記ケモカイン受容体が可溶性ＩＦＮγＲまたは可溶性ＩＬ－２Ｒである、［４５］に記載の核酸構築物。
［４８］ 前記治療用ペイロードがＲＮＡまたはオリゴペプチドワクチンを含む、［３３］に記載の核酸構築物。
［４９］ 前記ＲＮＡまたはオリゴペプチドワクチンが、サバイビン、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＭＡＧＥ－Ａ３、またはＣＴ７に対して方向付けられている、［４６］に記載の核酸構築物。
［５０］ 前記治療用ペイロードが表面受容体を含む、［３３］に記載の核酸構築物。
［５１］ 前記表面受容体がＣＡＲ、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２を含む、［５０］に記載の核酸構築物。
［５２］ 前記第１のリンカー、前記第２のリンカー、または前記第１のリンカーと前記第２のリンカーの両方が、アミノ酸配列ＧＧＧＸ、ＧＧＧＧＸ（配列番号８９）、またはＧＳＳＧＳＸ（配列番号９０）を含み、ＸはＣかまたはＳのいずれかである、［２９］～［５１］のいずれかに記載の核酸。
［５３］ 前記リンカーがアミノ酸配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９４）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号９５）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号９６）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号９７）、またはＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号９８）を有する、［５２］に記載の核酸。
［５４］ ［１］～［５３］のいずれかに記載の核酸構築物を含むベクター。
［５５］ レンチウイルスベクターである、［５４］に記載のベクター。
［５６］ 遺伝子改変型免疫細胞を産生する方法であって、
第１の核酸構築物、第２の核酸構築物、および第３の核酸構築物を免疫細胞へ導入するステップを含み、前記第１の核酸構築物が、第１のＴＡＡに結合する第１の抗原結合性ドメインを含む第１の細胞外ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１のシグナル伝達ドメインおよびプロテアーゼドメインを含む第１の細胞内ドメインとを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、
前記第２の核酸構築物が、第２のＴＡＡに結合する第２の抗原結合性ドメインを含む第２の細胞外ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２のシグナル伝達ドメイン、前記プロテアーゼにより認識される切断部位、および転写活性化因子を含む細胞内ドメインとを含む第２のＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結された第２のプロモーターを含み、
前記第３の核酸構築物が、前記転写活性化因子に結合する転写アクセプターと、第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターと作動的に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸とを含む、方法。
［５７］ 前記第１のＣＡＲが、前記プロテアーゼドメインのＮ末端側にある、第１のシグナル伝達ドメインおよび第１のリンカーをさらに含み、前記第２のＣＡＲが、前記切断部位のＮ末端側にある、第２のシグナル伝達ドメインおよび第２のリンカーをさらに含む、［５６］に記載の方法。
［５８］ 前記第１、第２、および前記第３の核酸構築物が１つのベクターにより前記免疫細胞へ導入される、［５６］に記載の方法。
［５９］ 前記第１、第２、および前記第３の核酸構築物のうちの２つが、第１のベクターにより前記免疫細胞へ導入され、前記３つの核酸構築物の３番目が第２のベクターにより前記免疫細胞へ導入される、［５６］に記載の方法。
［６０］ 第１の核酸構築物、第２の核酸構築物、および第３の核酸構築物を含む、遺伝子改変型免疫細胞であって、
前記第１の核酸構築物が、第１のＴＡＡに結合する第１の抗原結合性ドメインを含む第１の細胞外ドメインと、第１の膜貫通ドメインと、第１のシグナル伝達ドメインおよびプロテアーゼドメインを含む第１の細胞内ドメインとを含む第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸と作動可能に連結された第１のプロモーターを含み、
前記第２の核酸構築物が、第２のＴＡＡに結合する第２の抗原結合性ドメインを含む第２の細胞外ドメインと、第２の膜貫通ドメインと、第２のシグナル伝達ドメイン、前記プロテアーゼにより認識される切断部位、および転写活性化因子を含む細胞内ドメインとを含む第２のＣＡＲをコードする核酸と作動可能に連結された第２のプロモーターを含み、
前記第３の核酸構築物が、前記転写活性化因子に結合する転写アクセプターと、第３のプロモーターと、前記第３のプロモーターと作動的に連結されている、リーダーペプチドおよび治療用ペイロードをコードする核酸とを含む、
免疫細胞。
［６１］ 前記第１のＣＡＲが、前記プロテアーゼドメインのＮ末端側にある、第１のシグナル伝達ドメインおよび第１のリンカーをさらに含み、前記第２のＣＡＲが、前記切断部位のＮ末端側にある、第２のシグナル伝達ドメインおよび第２のリンカーをさらに含む、［６０］に記載の免疫細胞。
［６２］ 前記第１、第２、および前記第３の核酸構築物が１つのベクター内に配置されている、［６０］に記載の免疫細胞。
［６３］ 前記第１、第２、および前記第３の核酸構築物のうちの２つが第１のベクター内に配置され、前記３つの核酸構築物の３番目が第２のベクター内に配置されている、［６０］に記載の免疫細胞。
［６４］ Ｔ細胞である、［６０］～［６３］のいずれかに記載の免疫細胞。
［６５］ ＣＤ８ ＋ Ｔ細胞である、［６４］に記載の免疫細胞。
［６６］ ＮＫ細胞である、［６０］～［６３］のいずれかに記載の免疫細胞。
［６７］ ［６３］～［６６］のいずれかに記載の治療的有効数の免疫細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
［６８］ 癌を処置する方法であって、
それを必要としている対象に、［６７］に記載の薬学的組成物を投与するステップ
を含む、方法。
［６９］ 前記対象が、以前ＣＡＲ－Ｔ細胞治療またはＢｉＴｅ治療を受けている、［６８］に記載の方法。
［７０］ 前記癌が固形腫瘍により特徴付けられる、［６８］に記載の方法。
［７１］ 固形腫瘍により特徴付けられる前記癌が、乳癌、膀胱癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝癌、前立腺癌、脳癌、胃腸癌、精巣癌、子宮癌、および小児癌である、［７０］に記載の方法。
［７２］ 前記癌が血液癌である、［６８］に記載の方法。
［７３］ 前記血液癌が多発性骨髄腫、白血病、またはリンパ腫である、［７２］に記載の方法。
【国際調査報告】