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特表2024-540086Ｃ５をノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ関連方法及び組成物

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-31

(54)【発明の名称】Ｃ５をノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ関連方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

C12N 15/09 20060101AFI20241024BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP

C12N 15/12 20060101ALI20241024BHJP

C07K 16/18 20060101ALI20241024BHJP

C12N 15/13 20060101ALI20241024BHJP

C12N 15/55 20060101ALI20241024BHJP

A61K 31/7088 20060101ALI20241024BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20241024BHJP

A61P 43/00 20060101ALI20241024BHJP

A61K 9/51 20060101ALI20241024BHJP

A61K 47/18 20170101ALI20241024BHJP

A61K 47/28 20060101ALI20241024BHJP

A61K 47/34 20170101ALI20241024BHJP

A61K 47/24 20060101ALI20241024BHJP

A61K 45/00 20060101ALI20241024BHJP

A61K 38/02 20060101ALI20241024BHJP

A61K 39/395 20060101ALI20241024BHJP

A61P 1/00 20060101ALI20241024BHJP

A61P 11/00 20060101ALI20241024BHJP

A61P 27/02 20060101ALI20241024BHJP

A61P 7/06 20060101ALI20241024BHJP

A61P 37/08 20060101ALI20241024BHJP

A61P 17/02 20060101ALI20241024BHJP

A61P 3/04 20060101ALI20241024BHJP

A61P 13/12 20060101ALI20241024BHJP

A61P 37/02 20060101ALI20241024BHJP

A61P 19/02 20060101ALI20241024BHJP

A61P 9/00 20060101ALI20241024BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20241024BHJP

A61P 25/16 20060101ALI20241024BHJP

A61P 3/10 20060101ALI20241024BHJP

A61P 9/10 20060101ALI20241024BHJP

A61K 47/36 20060101ALI20241024BHJP

A61P 25/28 20060101ALI20241024BHJP

A61P 25/08 20060101ALI20241024BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N5/10 ZNA

C12N15/12

C07K16/18

C12N15/13

C12N15/55

A61K31/7088

A61K48/00

A61P43/00 105

A61K9/51

A61K47/18

A61K47/28

A61K47/34

A61K47/24

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K38/02

A61K39/395 N

A61P1/00

A61P11/00

A61P27/02

A61P7/06

A61P37/08

A61P17/02

A61P3/04

A61P13/12

A61P37/02

A61P19/02

A61P9/00

A61P25/00

A61P25/16

A61P3/10

A61P9/10

A61K47/36

A61P25/28

A61P25/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024525346

(86)(22)【出願日】2022-10-28

(85)【翻訳文提出日】2024-05-07

(86)【国際出願番号】 US2022078855

(87)【国際公開番号】W WO2023077053

(87)【国際公開日】2023-05-04

(31)【優先権主張番号】63/272,863

(32)【優先日】2021-10-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ，ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本健策

(72)【発明者】

【氏名】デバララジャ－ナラシマ，キショー

(72)【発明者】

【氏名】モートン，ローリ

(72)【発明者】

【氏名】ペファニス，エヴァンゲロス

(72)【発明者】

【氏名】ハートフォード，スザンヌ

(72)【発明者】

【氏名】カンジョリア，アルティマヘンドラプラカシュ

(72)【発明者】

【氏名】ヘッセ，サラ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA01

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA65

4C076BB13

4C076CC01

4C076CC07

4C076CC11

4C076CC15

4C076CC17

4C076CC21

4C076DD63

4C076DD70

4C076EE30

4C076FF70

4C084AA02

4C084AA13

4C084AA19

4C084BA44

4C084NA14

4C084ZA02

4C084ZA06

4C084ZA16

4C084ZA33

4C084ZA36

4C084ZA45

4C084ZA55

4C084ZA59

4C084ZA61

4C084ZA70

4C084ZA81

4C084ZA96

4C084ZB07

4C084ZB08

4C084ZB13

4C084ZB15

4C084ZC01

4C084ZC35

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB11

4C085EE01

4C085GG02

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA66

4C086NA14

4C086ZA02

4C086ZA06

4C086ZA16

4C086ZA33

4C086ZA36

4C086ZA45

4C086ZA55

4C086ZA59

4C086ZA61

4C086ZA70

4C086ZA81

4C086ZA96

4C086ZB07

4C086ZB08

4C086ZB13

4C086ZB15

4C086ZC01

4C086ZC35

4C086ZC75

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、そのようなガイドＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む脂質ナノ粒子又はウイルスベクター、並びにそのようなガイドＲＮＡ又はシステムを含む細胞又は動物が提供される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用してＣ５遺伝子座又は遺伝子を改変又はノックダウン又はノックアウトする方法、並びにＣ５に関連する疾患、障害、若しくは状態の治療及び／又は予防のため、並びに／あるいはそのような疾患、障害、若しくは状態に関連する少なくとも１つの症状を改善するための予防及び治療適用におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ガイドＲＮＡ又は前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組成物であって、前記ガイドＲＮＡが、Ｃ５遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、前記ガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質に結合し、前記Ｃａｓタンパク質を前記Ｃ５遺伝子の前記ガイドＲＮＡ標的配列に標的とする、組成物。

【請求項2】

前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記Ｃ５遺伝子のコードエキソン２７、２２、２１、１５、１２、若しくは１内にあるか、又は前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記Ｃ５遺伝子のコードエキソン１５若しくは１２内にある、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記Ｃ５遺伝子がヒトＣ５遺伝子である、請求項１又は２に記載の組成物。

【請求項4】

前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含み、又は
前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２０９～２９６のうちのいずれか１つ、配列番号２３６、２４１、２４３、２５８、２６１、２６３、２７３、及び２９５のうちのいずれか１つ、又は配列番号２６１及び２７３のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含み、又は
前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である、
請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項5】

前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、又は
前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２０９～２９６のうちのいずれか１つ、配列番号２３６、２４１、２４３、２５８、２６１、２６３、２７３、及び２９５のうちのいずれか１つ、又は配列番号２６１及び２７３のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、
請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項6】

前記組成物が、ＲＮＡの形態の前記ガイドＲＮＡを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項7】

前記組成物が、前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項8】

前記ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項9】

前記少なくとも１つの修飾が、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項８に記載の組成物。

【請求項10】

前記少なくとも１つの修飾が、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項８又は９に記載の組成物。

【請求項11】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項12】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む、請求項８～１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項８～１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項８～１３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項15】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項８～１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項８～１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

前記少なくとも１つの修飾が、（ｉ）前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉ）前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉｉ）前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、（ｉｖ）前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、を含む、請求項８～１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２９の前記修飾ヌクレオチドを含む、請求項８～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

前記ガイドＲＮＡが、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項20】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２１～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、前記ガイドＲＮＡが、配列番号２９７～３１２及び３１６～３３１のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、前記ガイドＲＮＡが、配列番号２９７～３０４及び３１６～３２３のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、又は前記ガイドＲＮＡが、配列番号２９９、３０１、３１８、及び３２０のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる、
請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記ガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む２つの別個のＲＮＡ分子を含む二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項22】

前記ｃｒＲＮＡが、配列番号１６～１７のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号１８～２０のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項２１又は２２に記載の組成物。

【請求項24】

前記組成物が脂質ナノ粒子と会合している、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項25】

前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、及びステルス脂質を含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

前記カチオン性脂質がリピドＡである、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

前記中性脂質がＤＳＰＣである、請求項２５又は２６に記載の組成物。

【請求項28】

前記ヘルパー脂質がコレステロールである、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項29】

前記ステルス脂質がＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項30】

前記カチオン性脂質がリピドＡであり、前記中性脂質がＤＳＰＣであり、前記ヘルパー脂質がコレステロールであり、前記ステルス脂質がＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、請求項２５～２９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項31】

前記組成物が、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項32】

前記Ｃａｓタンパク質又は前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を更に含む、請求項１～３１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項33】

前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項３２に記載の組成物。

【請求項34】

前記Ｃａｓタンパク質が、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９タンパク質に由来する、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

前記組成物が、タンパク質の形態の前記Ｃａｓタンパク質を含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項36】

前記組成物が、前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸を含み、前記核酸が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含み、任意選択的に、前記組成物が、前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項37】

前記組成物が、前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸を含み、前記核酸が、前記Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡを含み、任意選択的に、前記組成物が、ＲＮＡの形態の前記ガイドＲＮＡを含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項38】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項３７に記載の組成物。

【請求項39】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡが、１つ以上又は全てのウリジン位置に修飾ウリジンを含むように修飾される、請求項３８に記載の組成物。

【請求項40】

前記修飾ウリジンがＮ１－メチル－シュードウリジンである、請求項３９に記載の組成物。

【請求項41】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡが、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで完全に置換されている、請求項３９又は４０に記載の組成物。

【請求項42】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡが、５’キャップを含む、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項43】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを含む、請求項３８～４２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項44】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ｍＲＮＡが、配列番号３３９、３３８、又は１２に示される配列を含む、請求項３７～４３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項45】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸が、哺乳動物細胞又はヒト細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項３２～４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項46】

前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１１又は８に示される配列を含む、請求項３２～４５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項47】

第２のガイドＲＮＡ又は前記第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを更に含み、前記第２のガイドＲＮＡが、前記Ｃ５遺伝子の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、前記第２のガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質に結合し、前記Ｃａｓタンパク質を前記Ｃ５遺伝子の前記第２のガイドＲＮＡ標的配列に標的とする、請求項１～４６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項48】

Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質と会合している、請求項１～４７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項49】

Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質が抗体又はその抗原結合断片である、請求項４８に記載の組成物。

【請求項50】

Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質が、
（１）配列番号３４１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３４９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（２）配列番号３５７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３６５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（３）配列番号３７３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３８１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（４）配列番号３８９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３９７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（５）配列番号４０５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４１３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（６）配列番号４２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（７）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（８）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４５３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（９）配列番号４６１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（１０）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（１１）配列番号４７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（１２）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（１３）配列番号４６１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（１４）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４５３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（１５）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（１６）配列番号４７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（１７）配列番号４９３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５０１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（１８）配列番号５０９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５１７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（１９）配列番号５２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（２０）配列番号５４１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５４９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（２１）配列番号５５７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（２２）配列番号５７３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（２３）配列番号５８９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（２４）配列番号６０５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（２５）配列番号６１３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６２１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（２６）配列番号６２９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（２７）配列番号６４５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６５３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
（２８）配列番号６６１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは
（２９）配列番号６７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６８５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；
を含み、あるいは
Ｃ５への結合について、（１）～（２９）からなる群から選択される抗原結合タンパク質と競合する、あるいは
（１）～（２９）からなる群から選択される抗原結合タンパク質と同じＣ５上のエピトープに結合する、
請求項４８又は４９に記載の組成物。

【請求項51】

Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質が、配列番号６９７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖又はその可変領域又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９８に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖又はその可変領域又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体であり、
任意選択的に、Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質が、配列番号６９７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖及び配列番号６９８に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含むモノクローナル抗体である、
請求項４８～５０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項52】

Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質がポゼリマブである、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項53】

請求項１～５２のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞。

【請求項54】

細胞内のＣ５遺伝子を改変する方法であって、請求項３２～５２のいずれか一項に記載の組成物を前記細胞に導入することを含み、前記ガイドＲＮＡが前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記Ｃ５遺伝子内の前記ガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、前記Ｃａｓタンパク質が前記ガイドＲＮＡ標的配列を切断して前記Ｃ５遺伝子内に標的化遺伝子改変をもたらす、方法。

【請求項55】

前記Ｃａｓタンパク質による切断が、前記Ｃ５遺伝子に二本鎖切断を生じさせる、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記Ｃａｓタンパク質による切断が、前記Ｃ５遺伝子に一本鎖切断を生じさせる、請求項５４に記載の方法。

【請求項57】

前記標的化遺伝子改変が、非相同末端結合による前記切断されたガイドＲＮＡ標的配列の修復によって生成される、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記方法が、前記細胞における前記Ｃ５遺伝子の発現若しくは活性の低下をもたらすか、又は前記細胞における前記Ｃ５遺伝子の機能の喪失若しくは不活性化をもたらす、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記細胞が肝細胞である、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記細胞が哺乳動物細胞であり、前記Ｃ５遺伝子が哺乳動物Ｃ５遺伝子である、請求項５４～５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記細胞がヒト細胞であり、前記Ｃ５遺伝子がヒトＣ５遺伝子である、請求項５４～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記細胞がインビトロ又はエクスビボである、請求項５４～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記細胞がインビボで動物内にある、請求項５４～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

（Ｉ）前記方法が、前記動物における細胞の標的集団の前記Ｃ５遺伝子の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の編集パーセントをもたらすか、又は
（ＩＩ）前記方法が、前記動物における細胞の標的集団の前記Ｃ５遺伝子の約３０％～約３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、約４５％～約５０％、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６０％～約６５％、約６５％～約７０％、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、又は約９５％～約９９％の編集をもたらす、
請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記方法が、前記動物において補体Ｃ５タンパク質の血清レベルの低下をもたらし、任意選択的に、補体Ｃ５タンパク質の血清レベルが、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低下する、請求項６３又は６４に記載の方法。

【請求項66】

前記方法が、前記動物における補体Ｃ５タンパク質活性の低下をもたらし、任意選択的に、前記方法が、感作ヒツジ赤血球を使用してエクスビボで測定した場合、古典経路溶血の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％パーセントの阻害をもたらす、請求項６３～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

細胞中のＣ５遺伝子を改変する方法であって、前記細胞のゲノムを、
（ａ）Ｃａｓタンパク質；及び
（ｂ）前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記Ｃ５遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするガイドＲＮＡ
と接触させることを含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、前記ガイドＲＮＡ標的配列を切断して、前記Ｃ５遺伝子内に標的化遺伝子改変を生成する、方法。

【請求項68】

前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記Ｃ５遺伝子のコードエキソン２７、２２、２１、１５、１２、若しくは１内にあるか、又は前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記Ｃ５遺伝子のコードエキソン１５若しくは１２内にある、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記ガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号３３～１２０のいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、
前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２０９～２９６のうちのいずれか１つ、配列番号２３６、２４１、２４３、２５８、２６１、２６３、２７３、及び２９５のうちのいずれか１つ、又は配列番号２６１及び２７３のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含み、又は
前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である、
請求項６７又は６８に記載の方法。

【請求項70】

前記ガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号３３～１２０のいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、
前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２０９～２９６のうちのいずれか１つ、配列番号２３６、２４１、２４３、２５８、２６１、２６３、２７３、及び２９５のうちのいずれか１つ、又は配列番号２６１及び２７３のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、
請求項６７～６９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項71】

前記方法が、前記細胞に、
（ａ）前記Ｃａｓタンパク質又は前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸；及び
（ｂ）前記ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含む、請求項６０～７０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項72】

前記Ｃａｓタンパク質若しくは前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸及び／又は前記ガイドＲＮＡ若しくは前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、脂質ナノ粒子媒介送達を介して前記細胞に導入される、請求項７１に記載の方法。

【請求項73】

ＲＮＡの形態の前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸が、脂質ナノ粒子媒介送達を介して前記細胞に導入され、前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸がｍＲＮＡである、請求項７２記載の方法。

【請求項74】

前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、及びステルス脂質を含む、請求項７２又は７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項75】

前記カチオン性脂質がリピドＡである、請求項７４に記載の方法。

【請求項76】

前記中性脂質がＤＳＰＣである、請求項７４又は７５に記載の方法。

【請求項77】

前記ヘルパー脂質がコレステロールである、請求項７４～７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項78】

前記ステルス脂質がＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、請求項７４～７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項79】

前記カチオン性脂質がリピドＡであり、前記中性脂質がＤＳＰＣであり、前記ヘルパー脂質がコレステロールであり、前記ステルス脂質がＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、請求項７４～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記Ｃａｓタンパク質若しくは前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸及び／又は前記ガイドＲＮＡ若しくは前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、アデノ随伴ウイルスを介して前記細胞に導入される、請求項７１に記載の方法。

【請求項81】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸を前記細胞に導入することを含む、請求項７１～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸が、哺乳動物細胞又はヒト細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項83】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸がＤＮＡを含み、任意選択的に、前記方法が、前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを前記細胞に導入することを含む、請求項７１～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸がＲＮＡを含み、任意選択的に、前記方法が、ＲＮＡの形態の前記ガイドＲＮＡを前記細胞に導入することを含む、請求項７１～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項８４に記載の方法。

【請求項86】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＲＮＡが、１つ以上又は全てのウリジン位置に修飾ウリジンを含むように修飾される、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記修飾ウリジンがＮ１－メチル－シュードウリジンである、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＲＮＡが、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで完全に置換されている、請求項８６又は８７に記載の方法。

【請求項89】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＲＮＡが、５’キャップを含む、請求項８５～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを含む、請求項８５～８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＲＮＡが、配列番号３３９、３３８、又は１２に示される配列を含む、請求項８４～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

ＲＮＡの形態の前記ガイドＲＮＡを前記細胞に導入することを含む、請求項７１～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを前記細胞に導入することを含む、請求項７１～９１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項７１～９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記少なくとも１つの修飾が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記少なくとも１つの修飾が、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項９４又は９５に記載の方法。

【請求項97】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの前記５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む、請求項９４～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む、請求項９４～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの前記５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項９４～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項９４～９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項９４～１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項９４～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

前記少なくとも１つの修飾が、（ｉ）前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉ）前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉｉ）前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、（ｉｖ）前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、を含む、請求項９４～１０２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２９の修飾ヌクレオチドを含む、請求項９４～１０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項105】

前記ガイドＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項６７～１０４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２１～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含み、前記ガイドＲＮＡが、配列番号２９７～３１２及び３１６～３３１のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、前記ガイドＲＮＡが、配列番号２９７～３０４及び３１６～３２３のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、又は前記ガイドＲＮＡが、配列番号２９９、３０１、３１８、及び３２０のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる、
請求項１０５に記載の方法。

【請求項107】

前記ガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む２つの別個のＲＮＡ分子を含む二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、請求項６７～１０３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

前記ｃｒＲＮＡが、配列番号１６～１７のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項１０７に記載の方法。

【請求項109】

前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号１８～２０のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項１０７又は１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項６７～１０９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項111】

前記Ｃａｓタンパク質が、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９タンパク質に由来する、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１１又は８に示される配列を含む、請求項６７～１１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項113】

第２のガイドＲＮＡ又は前記第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを前記細胞に導入することを更に含み、前記第２のガイドＲＮＡが前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記Ｃａｓタンパク質を前記Ｃ５遺伝子内の第２のガイドＲＮＡ標的配列に標的化し、前記Ｃａｓタンパク質が前記第２のガイドＲＮＡ標的配列を切断して前記Ｃ５遺伝子内に標的化遺伝子改変をもたらす、請求項６７～１１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項114】

前記Ｃａｓタンパク質による切断が、前記Ｃ５遺伝子に二本鎖切断を生じさせる、請求項６７～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項115】

前記Ｃａｓタンパク質による切断が、前記Ｃ５遺伝子に一本鎖切断を生じさせる、請求項６７～１１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記標的化遺伝子改変が、非相同末端結合による前記切断されたガイドＲＮＡ標的配列の修復によって生成される、請求項６７～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

前記方法が、前記細胞における前記Ｃ５遺伝子の発現若しくは活性の低下をもたらすか、又は前記方法が、前記細胞における前記Ｃ５遺伝子の機能の喪失若しくは不活性化をもたらす、請求項６７～１１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記細胞が肝細胞である、請求項６７～１１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項119】

前記細胞が哺乳動物細胞であり、前記Ｃ５遺伝子が哺乳動物Ｃ５遺伝子である、請求項６７～１１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項120】

前記細胞がヒト細胞であり、前記Ｃ５遺伝子がヒトＣ５遺伝子である、請求項６７～１１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項121】

前記細胞がインビトロ又はエクスビボである、請求項６７～１２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項122】

前記細胞がインビボで動物内にある、請求項６７～１２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項123】

【請求項124】

【請求項125】

前記方法が、前記動物における補体Ｃ５タンパク質活性の低下をもたらし、任意選択的に、前記方法が、感作ヒツジ赤血球を使用してエクスビボで測定した場合、古典経路溶血の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％パーセントの阻害をもたらす、請求項１２２～１２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項126】

Ｃ５補体活性が、補体媒介性ヒツジ赤血球溶解のＣＨ５０アッセイによって測定される場合、約９５～１００％低減される、請求項１２２～１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項127】

前記動物に更なる治療剤を投与することを更に含む、請求項１２２～１２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項128】

前記更なる治療剤が、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質、アセトアミノフェン、アルブミン注入、アンクロッド、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗生物質、抗ＣＤ２０剤、抗凝血剤、抗真菌剤、降圧薬、抗炎症薬、抗プラスミン－ａ１、抗発作剤、抗血栓剤、抗ＴＮＦα剤、抗ウイルス剤、アルガトロバン、アスピリン、生物学的治療剤、ビバリルジン、Ｃ３阻害剤、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、ダビガトラン、デフィブロチド、Ｅ－アミノカプロン酸、経腸栄養、エリスロマイシン、エリスロポエチン、線溶剤、葉酸、フォンダパリヌクス、ヘパリン、ホルモン補充療法、イブプロフェン、イドラパリヌクス、免疫抑制薬、インフリキシマブ、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素の阻害剤、鉄サプリメント、レピルジン、脂質低下剤、硫酸マグネシウム、髄膜炎菌ワクチン、メトトレキサート、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、オリゴヌクレオチド、パラセタモール、非経口栄養、ペニシリン、フェニンジオン、妊娠避妊薬、プロスタサイクリン、リツキシマブ、トロンビン阻害剤、ワクチン、ビンクリスチン、ビタミン、及び／又はワルファリンである、請求項１２７に記載の方法。

【請求項129】

前記治療剤が、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質である、請求項１２８に記載の方法。

【請求項130】

前記抗原結合タンパク質が前記動物に静脈内又は皮下投与される、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

前記抗原結合タンパク質の初回用量が前記動物に静脈内投与され、前記抗原結合タンパク質の１つ以上の更なる用量が皮下投与される、請求項１２９又は１３０記載の方法。

【請求項132】

Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質が抗体又はその抗原結合断片である、請求項１２９～１３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項133】

【請求項134】

Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質が、配列番号６９７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖又はその可変領域又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９８に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖又はその可変領域又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体であり、
任意選択的に、Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質が、配列番号６９７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖及び配列番号６９８に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含むモノクローナル抗体である、
請求項１２９～１３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項135】

Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質がポゼリマブである、請求項１２９～１３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項136】

対象においてＣ５遺伝子を改変するか、又はＣ５遺伝子の発現を低下させるか、又は補体Ｃ５タンパク質の活性を低下させる方法であって、対象に、
（ａ）Ｃａｓタンパク質又は前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸；及び
（ｂ）ガイドＲＮＡ又は前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、前記前記ガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃ５遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、ガイドＲＮＡ又は前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
を投与することを含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、前記ガイドＲＮＡ標的配列を切断して、前記Ｃ５遺伝子内に標的化遺伝子改変を生成する、方法。

【請求項137】

Ｃ５に関連する疾患又は障害の少なくとも１つの症状又は適応症を予防、治療又は改善する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の、
（ａ）Ｃａｓタンパク質又は前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸；及び
（ｂ）ガイドＲＮＡ又は前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、前記ガイドＲＮＡが、前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃ５遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする、ガイドＲＮＡ又は前記ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含む医薬組成物を投与することを含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、前記ガイドＲＮＡ標的配列を切断して、前記Ｃ５遺伝子内に標的化遺伝子改変をもたらす、方法。

【請求項138】

前記疾患又は障害が、成人呼吸窮迫症候群；加齢黄斑変性（ＡＭＤ）；アレルギー；アルポート症候群；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）；喘息；アテローム性動脈硬化症；非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）；自己免疫疾患；自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）；バルーン血管形成；気管支収縮；水疱性類天疱瘡；火傷；Ｃ３糸球体症；毛細血管漏出症候群；心血管障害；突発性抗リン脂質症候群（ＣＡＰＳ）；脳血管障害；ＣＨＡＰＬＥ疾患（補体の過剰活性化、血管障害性血栓症及びタンパク質喪失性腸障害を伴うＣＤ５５欠損症）；化学的損傷；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；寒冷凝集素症（ＣＡＤ）；角膜及び／又は網膜組織；クローン病；デゴス病；高密度沈着物疾患（ＤＤＤ）；皮膚筋炎；糖尿病；糖尿病性血管障害；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）；糖尿病性腎症；糖尿病性網膜症；拡張型心筋症；不適切又は望ましくない補体活性化障害；呼吸困難；子癇；気腫；表皮水疱症；てんかん；線維原性ダスト疾患；凍傷；地図状萎縮（ＧＡ）；糸球体腎炎；糸球体症；グッドパスチャー症候群；グレーブス病；ギラン・バレー症候群；橋本甲状腺炎；血液透析合併症；溶血－肝臓酵素上昇及び低血小板（ＨＥＬＬＰ）症候群；溶血性貧血；喀血；Ｈｅｎｏｃｈ－Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ紫斑病性腎炎；遺伝性血管浮腫；超急性同種移植片拒絶；過敏性肺炎；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；ＩｇＡ腎症；免疫複合体障害；免疫複合体血管炎；免疫複合体関連炎症；感染症；自己免疫疾患によって引き起こされる炎症；炎症性障害；遺伝性ＣＤ５９欠損；不活性ダスト及び／又は鉱物による損傷；ＩＬ－２治療中のインターロイキン－２誘導性毒性；虚血－再灌流傷害；川崎病；肺の疾患又は障害；ループス腎炎；膜増殖性糸球体腎炎；膜増殖性腎炎；大動脈再建後の腸間膜動脈再灌流；腸間膜／腸間膜血管障害；多巣性運動ニューロパシー（ＭＭＮ）；多発性硬化症；重症筋無力症；心筋梗塞；心筋炎；神経障害；視神経脊髄炎；肥満；眼血管新生；脈絡膜に影響を及ぼす眼血管新生；有機ダスト病；寄生虫症；パーキンソン病；発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；低免疫性血管炎；天疱瘡；経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）；末梢血管障害；肺炎；虚血後再灌流状態；心肺バイパスにおけるポンプ後症候群；腎バイパスにおけるポンプ後症候群；子癇前症；進行性腎不全；増殖性腎炎；タンパク尿腎疾患；乾癬；肺塞栓症；肺線維症；肺梗塞；肺血管炎；再発性胎児喪失；腎障害；腎虚血；腎虚血－再灌流傷害；腎血管障害；ステント留置後の再狭窄；関節リウマチ（ＲＡ）；回転式アテレクトミー；統合失調症；敗血症；敗血症性ショック；ＳＬＥ腎炎；煙による傷害；脊髄損傷；自然胎児喪失；脳卒中；敗血症に対する全身性炎症反応；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；全身性エリテマトーデス関連血管炎；高安病；熱損傷；血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）；外傷性脳損傷；Ｉ型糖尿病；典型的な溶血性尿毒症症候群（ｔＨＵＳ）；ブドウ膜炎；血管炎；関節リウマチに関連する血管炎；静脈ガス塞栓（ＶＧＥ）；及び／又は異種移植片拒絶である、請求項１３７に記載の方法。

【請求項139】

前記疾患又は障害が、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、加齢黄斑変性、地図状萎縮、ブドウ膜炎、視神経脊髄炎、多発性硬化症、脳卒中、ギラン・バレー症候群、外傷性脳損傷、パーキンソン病、不適切又は望ましくない補体活性化の障害、血液透析合併症、超急性同種移植片拒絶、異種移植片拒絶、ＩＬ－２療法中のインターロイキン－２誘発毒性、炎症性障害、自己免疫疾患の炎症、クローン病、成人呼吸窮迫症候群、火傷又は凍傷を含む熱傷、虚血後再灌流状態、心筋梗塞、毛細血管漏出症候群、肥満、糖尿病、アルツハイマー病、統合失調症、脳卒中、てんかん、アテローム性動脈硬化、血管炎、水疱性類天疱瘡、Ｃ３糸球体症、膜性増殖性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、アルポート症候群、進行性腎不全、タンパク尿性腎疾患、腎虚血－再灌流傷害、ループス腎炎、バルーン血管形成術、心肺バイパス又は腎バイパスにおけるポンプ後症候群、血液透析、腎虚血、大動脈再建後の腸間膜動脈再灌流、感染症又は敗血症、免疫複合体障害及び自己免疫疾患、腎障害、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＳＬＥ腎炎、増殖性腎炎、溶血性貧血、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、肺塞栓症及び梗塞、肺炎、及び重症筋無力症からなる群から選択される、請求項１３７に記載の方法。

【請求項140】

前記疾患又は障害が、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、難治性重症筋無力症（ｒＭＧ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、Ｃ３糸球体症、及びＡＮＣＡ－血管炎である、請求項１３７に記載の方法。

【請求項141】

前記疾患又は障害がａＨＵＳ又はＰＮＨである、請求項１３７に記載の方法。

【請求項142】

前記疾患又は障害がＰＮＨであり、
任意選択的に、前記方法が、前記対象における血清乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベル、脈管内溶血、及び／又は赤血球の輸血の必要性を低減するためのものである、請求項１３７に記載の方法。

【請求項143】

前記疾患又は障害が、ＣＤ５５欠損タンパク質喪失腸疾患（ＣＨＡＰＬＥ疾患）であり、
任意選択的に、前記方法が、（ｉ）胃腸管を通じた、血清アルブミンを正常化及び／若しくは増加させること又はその損失を減少させること；胃腸管を通じた、総血清タンパク質レベルを増加させること、又はその損失を減少させること；血清ビタミンＢ１２又はその胃腸吸収を増加させること；血小板数を減少させること、又は凝固カスケード活性化を減少させること、又は血栓性事象の発生率を減少させること；消化管を通じたアルファ－１－アンチトリプシンの喪失を減少させること；顔面及び／又は末梢浮腫を治療又は予防すること；腸運動の頻度を減少させること；下痢を治療又は予防すること；腹痛を治療又は予防すること；コルチコステロイドの使用を減少させること；及び／又は対象における入院の発生率を低下させること；あるいは（ｉｉ）前記対象における治療的介入を減少させることであって、前記治療的介入が、コルチコステロイドの投与；免疫グロブリンの投与；アルブミンの投与；抗腫瘍壊死因子アルファ治療剤の投与；免疫調節薬の投与；微量栄養素の投与；経腸又は非経口補充の投与；抗凝固剤の投与；抗生物質の投与；及び抗血小板剤の投与からなる群から選択される１つ以上である、こと
のためのものであり、
任意選択的に、前記方法は、血清アルブミンを少なくとも１ｇ／ｄＬ増加させるため、及び／又は血清アルブミンを約３．５～約５．５ｇ／ｄＬに正常化するためのものである、
請求項１３７に記載の方法。

【請求項144】

前記医薬組成物が、それを必要とする前記対象に予防的又は治療的に投与される、請求項１３７～１４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項145】

前記医薬組成物が静脈内投与される、請求項１３７～１４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項146】

前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記Ｃ５遺伝子のコードエキソン２７、２２、２１、１５、１２、若しくは１内にあるか、又は前記ガイドＲＮＡ標的配列が、前記Ｃ５遺伝子のコードエキソン１５若しくは１２内にある、請求項１３６～１４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項147】

【請求項148】

前記ガイドＲＮＡが、前記ガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、前記ＤＮＡ標的化セグメントが、配列番号３３～１２０のいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなり、
前記ガイドＲＮＡ標的配列が、配列番号２０９～２９６のうちのいずれか１つ、配列番号２３６、２４１、２４３、２５８、２６１、２６３、２７３、及び２９５のうちのいずれか１つ、又は配列番号２６１及び２７３のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる、
請求項１３６～１４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項149】

前記Ｃａｓタンパク質又は前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸及び／又は前記ガイドＲＮＡ又は前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、脂質ナノ粒子媒介送達を介して前記対象に投与される、請求項１３６～１４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項150】

ＲＮＡの形態の前記ガイドＲＮＡ及び前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸が脂質ナノ粒子媒介送達を介して前記対象に投与され、前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸がｍＲＮＡである、請求項１４９記載の方法。

【請求項151】

前記脂質ナノ粒子が、カチオン性脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、及びステルス脂質を含む、請求項１４９又は１５０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項152】

前記カチオン性脂質がリピドＡである、請求項１５１に記載の方法。

【請求項153】

前記中性脂質がＤＳＰＣである、請求項１５１又は１５２に記載の方法。

【請求項154】

前記ヘルパー脂質がコレステロールである、請求項１５１～１５３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項155】

前記ステルス脂質がＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、請求項１５１～１５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項156】

前記カチオン性脂質がリピドＡであり、前記中性脂質がＤＳＰＣであり、前記ヘルパー脂質がコレステロールであり、前記ステルス脂質がＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである、請求項１５１～１５５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項157】

前記Ｃａｓタンパク質又は前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸及び／又は前記ガイドＲＮＡ又は前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡが、アデノ随伴ウイルスを介して前記対象に投与される、請求項１３６～１４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項158】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸を投与することを含む、請求項１３６～１５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項159】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸が、哺乳動物細胞又はヒト細胞における発現のためにコドン最適化される、請求項１３６～１５８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項160】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸がＤＮＡを含み、任意選択的に、前記方法が、前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを投与することを含む、請求項１３６～１５９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項161】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記核酸がＲＮＡを含み、任意選択的に、前記方法が、ＲＮＡの形態の前記ガイドＲＮＡを投与することを含む、請求項１３６～１６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項162】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１６１に記載の方法。

【請求項163】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＲＮＡが、１つ以上又は全てのウリジン位置に修飾ウリジンを含むように修飾される、請求項１６２に記載の方法。

【請求項164】

前記修飾ウリジンがＮ１－メチル－シュードウリジンである、請求項１６３に記載の方法。

【請求項165】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＲＮＡが、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで完全に置換されている、請求項１６３又は１６４に記載の方法。

【請求項166】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＲＮＡが、５’キャップを含む、請求項１６２～１６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項167】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＲＮＡが、ポリ（Ａ）テールを含む、請求項１６２～１６６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項168】

前記Ｃａｓタンパク質をコードする前記ＲＮＡが、配列番号３３９、３３８、又は１２に示される配列を含む、請求項１６１～１６７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項169】

前記方法が、ＲＮＡの形態の前記ガイドＲＮＡを投与することを含む、請求項１３６～１６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項170】

前記方法が、前記ガイドＲＮＡをコードする前記ＤＮＡを投与することを含む、請求項１３６～１６８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項171】

前記ガイドＲＮＡが、少なくとも１つの修飾を含む、請求項１３６～１６９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項172】

前記少なくとも１つの修飾が２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項１７１に記載の方法。

【請求項173】

前記少なくとも１つの修飾が、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項１７１又は１７２に記載の方法。

【請求項174】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの前記５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む、請求項１７１～１７３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項175】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む、請求項１７１～１７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項176】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの前記５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項１７１～１７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項177】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項１７１～１７６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項178】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項１７１～１７７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項179】

前記少なくとも１つの修飾が、前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む、請求項１７１～１７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項180】

前記少なくとも１つの修飾が、（ｉ）前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉ）前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉｉ）前記ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、（ｉｖ）前記ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、を含む、請求項１７１～１７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項181】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２９の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１７１～１８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項182】

ガイドＲＮＡが単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１３６～１８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項183】

【請求項184】

前記ガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む２つの別個のＲＮＡ分子を含む二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、請求項１３６～１８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項185】

前記ｃｒＲＮＡが、配列番号１６～１７のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項１８４に記載の方法。

【請求項186】

前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、配列番号１８～２０のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項１８４又は１８５に記載の方法。

【請求項187】

前記Ｃａｓタンパク質が、Ｃａｓ９タンパク質である、請求項１３６～１８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項188】

前記Ｃａｓタンパク質が、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９タンパク質に由来する、請求項１８７に記載の方法。

【請求項189】

前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１１又は８に示される配列を含む、請求項１３６～１８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項190】

第２のガイドＲＮＡ又は前記第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを前記対象に投与することを更に含み、前記第２のガイドＲＮＡが前記Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、前記Ｃａｓタンパク質を前記Ｃ５遺伝子内の第２のガイドＲＮＡ標的配列に標的化し、前記Ｃａｓタンパク質が前記第２のガイドＲＮＡ標的配列を切断して前記Ｃ５遺伝子内に標的化遺伝子改変を生成する、請求項１３６～１８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項191】

前記Ｃａｓタンパク質による切断が、前記Ｃ５遺伝子に二本鎖切断を生じさせる、請求項１３６～１９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項192】

前記Ｃａｓタンパク質による切断が、前記Ｃ５遺伝子に一本鎖切断を生じさせる、請求項１３６～１９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項193】

前記標的化遺伝子改変が、非相同末端結合による前記切断されたガイドＲＮＡ標的配列の修復によって生成される、請求項１３６～１９２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項194】

前記細胞におけるＣ５遺伝子の発現又は活性の低下をもたらす、請求項１３６～１９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項195】

前記方法が、前記細胞における前記Ｃ５遺伝子の機能喪失又は不活性化をもたらす、請求項１３６～１９４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項196】

前記対象が哺乳動物であり、前記Ｃ５遺伝子が哺乳動物Ｃ５遺伝子である、請求項１３６～１９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項197】

前記対象がヒトであり、前記Ｃ５遺伝子がヒトＣ５遺伝子である、請求項１３６～１９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項198】

（Ｉ）前記方法が、前記対象における細胞の標的集団の前記Ｃ５遺伝子の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の編集パーセントをもたらすか、又は
（ＩＩ）前記方法が、前記対象における細胞の標的集団の前記Ｃ５遺伝子の約３０％～約３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、約４５％～約５０％、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６０％～約６５％、約６５％～約７０％、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、又は約９５％～約９９％の編集をもたらす、
請求項１３６～１９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項199】

前記方法が、前記対象において補体Ｃ５タンパク質の血清レベルの低下をもたらし、任意選択的に、補体Ｃ５タンパク質の血清レベルが、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低下する、請求項１３６～１９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項200】

前記方法が、前記対象における補体Ｃ５タンパク質活性の低下をもたらし、任意選択的に、前記方法が、感作ヒツジ赤血球を使用してエクスビボで測定した場合、古典経路溶血の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％パーセントの阻害をもたらす、請求項１３６～１９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項201】

Ｃ５補体活性が、補体媒介性ヒツジ赤血球溶解のＣＨ５０アッセイによって測定される場合、約９５～１００％低減される、請求項１３６～２００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項202】

前記組成物が更なる治療剤と会合して投与される、請求項１３６～２００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項203】

【請求項204】

前記更なる治療剤が、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質である、請求項２０３に記載の方法。

【請求項205】

前記抗原結合タンパク質が前記対象に静脈内又は皮下投与される、請求項２０４に記載の方法。

【請求項206】

前記抗原結合タンパク質の初回用量が前記対象に静脈内投与され、抗原結合タンパク質の１つ以上の更なる用量が皮下投与される、請求項２０４又は２０５に記載の方法。

【請求項207】

Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質が抗体又はその抗原結合断片である、請求項２０４～２０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項208】

【請求項209】

Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質が、配列番号６９７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖又はその可変領域又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９８に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖又はその可変領域又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体であり、
任意選択的に、Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質が、配列番号６９７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖及び配列番号６９８に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含むモノクローナル抗体である、
請求項２０４～２０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項210】

Ｃ５に特異的に結合する前記抗原結合タンパク質がポゼリマブである、請求項２０４～２０９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月２８日に出願された米国特許出願第６３／２７２，８６３号の利益を主張し、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

ＥＦＳＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
ファイル０５７７６６－５８６０８６．ｘｍｌに記載されている配列表は９１４キロバイトであり、２０２２年１０月２８日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0003】

補体系は、活性化されると標的細胞の溶解をもたらし、オプソニン化を介して食作用を促進する血漿タンパク質の群である。補体は、３つの主要な経路：典型的には免疫複合体によって活性化される古典経路；保護されていない細胞表面によって誘導され得る代替経路；及びマンノース結合レクチン経路による一連のタンパク質分解工程を介して活性化される。補体カスケードの３つ全ての経路は、補体成分５（Ｃ５）タンパク質のタンパク質分解切断に集中する。補体成分５（Ｃ５）の切断は、断片Ｃ５ａ及びＣ５ｂの産生を生じ、このプロセスは、補体カスケードの活性化の間に重要である。Ｃ５ａは、その受容体への結合を介して多面的な生理学的応答を生成することができる。Ｃ５ａは、走化性遊走を誘導し、細胞接着を増強し、酸化的バーストを刺激し、ヒスタミン又はサイトカインなどの様々な炎症メディエータの放出を誘導する強力な炎症促進性メディエータである。Ｃ５ｂは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の後期に細胞溶解をもたらす膜侵襲複合体（ＭＡＣ、又はＣ５ｂ－９）の形成を媒介する。更に、Ｃ５ｂ－９による細胞溶解に対して耐性である有核細胞において、亜溶解量のＣ５ｂ－９は、細胞増殖、炎症促進性メディエータの産生及び細胞外マトリックスの産生をもたらす細胞活性化を引き起こし得る。

【0004】

Ｃ５関連疾患の予防及び治療のためにＣ５遺伝子を標的とする治療薬が依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組成物、組成物を含む細胞、細胞においてＣ５遺伝子を改変する方法、対象においてＣ５遺伝子を改変するか、又はＣ５遺伝子の発現を低下させるか、又は補体Ｃ５タンパク質の活性を低下させる方法、及びＣ５に関連する疾患又は障害の少なくとも１つの症状又は適応症を予防、治療又は改善する方法が提供される。

【0006】

一態様では、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む組成物が提供され、ガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質に結合し、Ｃ５遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列へのＣａｓタンパク質を標的とする。

【0007】

いくつかのかかる組成物では、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２７、２２、２１、１５、１２、若しくは１内にあるか、又はガイドＲＮＡ標的配列が、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１５若しくは１２内にある。いくつかのかかる組成物では、Ｃ５遺伝子はヒトＣ５遺伝子である。

【0008】

いくつかのかかる組成物では、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号３３～１２０のいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含む。いくつかのかかる組成物では、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２０９～２９６のうちのいずれか１つ、配列番号２３６、２４１、２４３、２５８、２６１、２６３、２７３、及び２９５のうちのいずれか１つ、又は配列番号２６１及び２７３のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含む。いくつかのかかる組成物では、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号３３～１２０のいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である。

【0009】

いくつかのかかる組成物では、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号３３～１２０のいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。いくつかのかかる組成物では、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２０９～２９６のうちのいずれか１つ、配列番号２３６、２４１、２４３、２５８、２６１、２６３、２７３、及び２９５のうちのいずれか１つ、又は配列番号２６１及び２７３のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0010】

いくつかのかかる組成物では、組成物はＲＮＡの形態のガイドＲＮＡを含む。いくつかのかかる組成物では、組成物はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。いくつかのかかる組成物では、ガイドＲＮＡは少なくとも１つの修飾を含む。いくつかのかかる組成物では、少なくとも１つの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかのかかる組成物では、少なくとも１つの修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかのかかる組成物では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む。いくつかのかかる組成物では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む。いくつかのかかる組成物では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかのかかる組成物では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかのかかる組成物では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかのかかる組成物では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかのかかる組成物では、少なくとも１つの修飾は、（ｉ）ガイドＲＮＡの５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉ）ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、（ｉｖ）ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、を含む。いくつかのかかる組成物では、ガイドＲＮＡは、配列番号２９の修飾ヌクレオチドを含む。

【0011】

いくつかのかかる組成物では、ガイドＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかのかかる組成物では、ガイドＲＮＡは、配列番号２１～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、ガイドＲＮＡが、配列番号２９７～３１２及び３１６～３３１のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、ガイドＲＮＡは、配列番号２９７～３０４及び３１６～３２３のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、又はガイドＲＮＡは、配列番号２９９、３０１、３１８、及び３２０のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。

【0012】

いくつかのかかる組成物では、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む２つの別個のＲＮＡ分子を含む二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である。いくつかのかかる組成物では、ｃｒＲＮＡは、配列番号１６～１７のうちのいずれか１つに示される配列を含む。いくつかのかかる組成物では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号１８～２０のうちのいずれか１つに示される配列を含む。

【0013】

いくつかのかかる組成物では、組成物は脂質ナノ粒子と会合している。いくつかのかかる組成物では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、及びステルス脂質を含む。いくつかのかかる組成物では、カチオン性脂質はリピドＡである。いくつかのかかる組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。いくつかのかかる組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。いくつかのかかる組成物では、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。いくつかのかかる組成物では、カチオン性脂質はリピドＡであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。

【0014】

いくつかのかかる組成物では、組成物は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。

【0015】

いくつかのかかる組成物では、組成物は、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸を更に含む。いくつかのかかる組成物では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかのかかる組成物では、Ｃａｓタンパク質は、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９タンパク質に由来する。いくつかのかかる組成物では、組成物は、タンパク質の形態のＣａｓタンパク質を含む。いくつかのかかる組成物では、組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含み、核酸は、Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含み、任意選択的に、組成物は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。いくつかのかかる組成物では、組成物は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含み、核酸は、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡを含み、任意選択的に、組成物は、ＲＮＡの形態のガイドＲＮＡを含む。いくつかのかかる組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含む。いくつかのかかる組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、１つ以上又は全てのウリジン位置に修飾ウリジンを含むように修飾される。いくつかのかかる組成物では、修飾ウリジンは、シュードウリジンである。いくつかのかかる組成物では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンである。いくつかのかかる組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、シュードウリジンで完全に置換されている。いくつかのかかる組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで完全に置換されている。いくつかのかかる組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは５’キャップを含む。いくつかのかかる組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡはポリ（Ａ）テールを含む。いくつかのかかる組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、配列番号３３９、３３８、又は１２に示される配列を含む。いくつかのかかる組成物では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、哺乳動物細胞又はヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかのかかる組成物では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１１又は８に示される配列を含む。

【0016】

いくつかのかかる組成物では、組成物は、第２のガイドＲＮＡ又は第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを更に含み、第２のガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子の第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、第２のガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質に結合し、Ｃａｓタンパク質をＣ５遺伝子の第２のガイドＲＮＡ標的配列に標的とする。

【0017】

いくつかのかかる組成物では、組成物は、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質と会合している。いくつかのかかる組成物では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質は抗体又はその抗原結合断片である。いくつかのかかる組成物では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、（１）配列番号３４１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３４９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２）配列番号３５７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３６５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（３）配列番号３７３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３８１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（４）配列番号３８９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３９７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（５）配列番号４０５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４１３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（６）配列番号４２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（７）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（８）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４５３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（９）配列番号４６１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１０）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１１）配列番号４７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１２）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１３）配列番号４６１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１４）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４５３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１５）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１６）配列番号４７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１７）配列番号４９３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５０１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１８）配列番号５０９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５１７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１９）配列番号５２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２０）配列番号５４１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５４９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２１）配列番号５５７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２２）配列番号５７３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２３）配列番号５８９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２４）配列番号６０５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２５）配列番号６１３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６２１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２６）配列番号６２９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２７）配列番号６４５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６５３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２８）配列番号６６１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは（２９）配列番号６７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６８５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；を含むか、あるいは（１）～（２９）からなる群から選択される抗原結合タンパク質とＣ５への結合について競合するか、あるいは（１）～（２９）からなる群から選択される抗原結合タンパク質と同じＣ５上のエピトープに結合する。いくつかのかかる組成物では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、配列番号６９７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖又はその可変領域又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９８に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖又はその可変領域又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体である。いくつかのかかる組成物では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、配列番号６９７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖及び配列番号６９８に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含むモノクローナル抗体である。いくつかのかかる組成物では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質はポゼリマブである。

【0018】

別の態様では、上記の組成物のいずれかを含む細胞が提供される。

【0019】

別の態様では、細胞内のＣ５遺伝子を改変する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、上記の組成物のいずれかを細胞に導入することを含み、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃ５遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡ標的配列を切断して、Ｃ５遺伝子内に標的化遺伝子改変をもたらす。

【0020】

いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質による切断は、Ｃ５遺伝子における二本鎖切断を作り出す。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質による切断は、Ｃ５遺伝子中に一本鎖切断を作り出す。いくつかのかかる方法では、標的化遺伝子改変は、非相同末端結合による切断されたガイドＲＮＡ標的配列の修復によって生成される。いくつかのかかる方法では、方法は、細胞におけるＣ５遺伝子の発現若しくは活性の低下をもたらすか、又は方法は、細胞におけるＣ５遺伝子の機能喪失若しくは不活性化をもたらす。

【0021】

いくつかのかかる方法では、細胞は肝細胞である。いくつかのかかる方法では、細胞は哺乳動物細胞であり、Ｃ５遺伝子は哺乳動物Ｃ５遺伝子である。いくつかのかかる方法では、細胞はヒト細胞であり、Ｃ５遺伝子はヒトＣ５遺伝子である。いくつかのかかる方法では、細胞はインビトロ又はエクスビボである。いくつかのかかる方法では、細胞はインビボで動物内にある。

【0022】

いくつかのかかる方法では、方法は、動物における細胞の標的集団のＣ５遺伝子の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の編集パーセントをもたらす。いくつかのかかる方法では、方法は、動物における細胞の標的集団のＣ５遺伝子の約３０％～約３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、約４５％～約５０％、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６０％～約６５％、約６５％～約７０％、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、又は約９５％～約９９％の編集をもたらす。

【0023】

いくつかのかかる方法では、方法は、動物において補体Ｃ５タンパク質の血清レベルの低下をもたらし、任意選択的に、補体Ｃ５タンパク質の血清レベルが、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低下する。いくつかのかかる方法では、方法は、動物における補体Ｃ５タンパク質活性の低下をもたらし、任意選択的に、方法が、感作ヒツジ赤血球を使用してエクスビボで測定した場合、古典経路溶血の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％パーセントの阻害をもたらす。

【0024】

いくつかのかかる方法では、Ｃ５補体活性は、補体媒介性ヒツジ赤血球溶解のＣＨ５０アッセイによって測定される場合、約９５～１００％低減される。いくつかのかかる方法では、方法は、動物に更なる治療剤を投与することを更に含む。いくつかのかかる方法では、更なる治療剤は、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質、アセトアミノフェン、アルブミン注入、アンクロッド、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗生物質、抗ＣＤ２０剤、抗凝血剤、抗真菌剤、降圧薬、抗炎症薬、抗プラスミン－ａ１、抗発作剤、抗血栓剤、抗ＴＮＦα剤、抗ウイルス剤、アルガトロバン、アスピリン、生物学的治療剤、ビバリルジン、Ｃ３阻害剤、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、ダビガトラン、デフィブロチド、Ｅ－アミノカプロン酸、経腸栄養、エリスロマイシン、エリスロポエチン、線溶剤、葉酸、フォンダパリヌクス、ヘパリン、ホルモン補充療法、イブプロフェン、イドラパリヌクス、免疫抑制薬、インフリキシマブ、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素の阻害剤、鉄サプリメント、レピルジン、脂質低下剤、硫酸マグネシウム、髄膜炎菌ワクチン、メトトレキサート、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、オリゴヌクレオチド、パラセタモール、非経口栄養、ペニシリン、フェニンジオン、妊娠避妊薬、プロスタサイクリン、リツキシマブ、トロンビン阻害剤、ワクチン、ビンクリスチン、ビタミン、及び／又はワルファリンである。

【0025】

いくつかのかかる方法では、治療剤は、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。いくつかのかかる方法では、抗原結合タンパク質は動物に静脈内又は皮下投与される。いくつかのかかる方法では、抗原結合タンパク質の初回用量は動物に静脈内投与され、抗原結合タンパク質の１つ以上の更なる用量は皮下投与される。いくつかのかかる方法では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質は抗体又はその抗原結合断片である。いくつかのかかる方法では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、（１）配列番号３４１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３４９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２）配列番号３５７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３６５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（３）配列番号３７３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３８１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（４）配列番号３８９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３９７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（５）配列番号４０５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４１３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（６）配列番号４２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（７）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（８）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４５３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（９）配列番号４６１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１０）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１１）配列番号４７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１２）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１３）配列番号４６１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１４）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４５３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１５）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１６）配列番号４７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１７）配列番号４９３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５０１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１８）配列番号５０９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５１７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１９）配列番号５２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２０）配列番号５４１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５４９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２１）配列番号５５７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２２）配列番号５７３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２３）配列番号５８９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２４）配列番号６０５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２５）配列番号６１３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６２１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２６）配列番号６２９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２７）配列番号６４５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６５３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２８）配列番号６６１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは（２９）配列番号６７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６８５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；を含むか、あるいは（１）～（２９）からなる群から選択される抗原結合タンパク質とＣ５への結合について競合するか、あるいは（１）～（２９）からなる群から選択される抗原結合タンパク質と同じＣ５上のエピトープに結合する。いくつかのかかる方法では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、配列番号６９７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖又はその可変領域又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９８に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖又はその可変領域又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体である。いくつかのかかる方法では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、配列番号６９７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖及び配列番号６９８に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含むモノクローナル抗体である。いくつかのかかる方法では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質はポゼリマブである。

【0026】

別の態様では、細胞内のＣ５遺伝子を改変する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、細胞のゲノムを、（ａ）Ｃａｓタンパク質；及び（ｂ）Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃ５遺伝子内のガイドＲＮＡ標的配列を標的化するガイドＲＮＡと接触させることを含み、Ｃａｓタンパク質はガイドＲＮＡ標的配列を切断して、Ｃ５遺伝子内に標的化遺伝子改変を生成する。

【0027】

いくつかのかかる方法では、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２７、２２、２１、１５、１２、若しくは１内にあるか、又はガイドＲＮＡ標的配列が、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１５若しくは１２内にある。いくつかのかかる方法では、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号３３～１２０のいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。いくつかのかかる方法では、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２０９～２９６のうちのいずれか１つ、配列番号２３６、２４１、２４３、２５８、２６１、２６３、２７３、及び２９５のうちのいずれか１つ、又は配列番号２６１及び２７３のうちのいずれか１つに示される配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含む。いくつかのかかる方法では、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号３３～１２０のいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％同一である。

【0028】

いくつかのかかる方法では、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡ標的配列を標的とするＤＮＡ標的化セグメントを含み、ＤＮＡ標的化セグメントは、配列番号３３～１２０のいずれか１つ、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７及び１１９のうちのいずれか１つ、又は配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。いくつかのかかる方法では、ガイドＲＮＡ標的配列は、配列番号２０９～２９６のうちのいずれか１つ、配列番号２３６、２４１、２４３、２５８、２６１、２６３、２７３、及び２９５のうちのいずれか１つ、又は配列番号２６１及び２７３のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0029】

いくつかのかかる方法では、方法は、細胞に、（ａ）Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸；及び（ｂ）ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することを含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸及び／又はガイドＲＮＡ若しくはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、脂質ナノ粒子媒介送達を介して細胞に導入される。いくつかのかかる方法では、ＲＮＡの形態のガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をコードする核酸は、脂質ナノ粒子媒介送達を介して細胞に導入され、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸はｍＲＮＡである。いくつかのかかる方法では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、及びステルス脂質を含む。いくつかのかかる方法では、カチオン性脂質はリピドＡである。いくつかのかかる方法では、中性脂質はＤＳＰＣである。いくつかのかかる方法では、ヘルパー脂質はコレステロールである。いくつかのかかる方法では、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。いくつかのかかる方法では、カチオン性脂質はリピドＡであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。

【0030】

いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸及び／又はガイドＲＮＡ若しくはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、アデノ随伴ウイルスを介して細胞に導入される。

【0031】

いくつかのかかる方法では、方法は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を細胞に導入することを含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、哺乳動物細胞又はヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸はＤＮＡを含み、任意選択的に、方法は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞に導入することを含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸はＲＮＡを含み、任意選択的に、方法は、ＲＮＡの形態のガイドＲＮＡを細胞に導入することを含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡは、１つ以上又は全てのウリジン位置に修飾ウリジンを含むように修飾される。いくつかのかかる方法では、修飾ウリジンは、シュードウリジンである。いくつかのかかる方法では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンである。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡをシュードウリジンで完全に置換する。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで完全に置換されている。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡは５’キャップを含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡはポリ（Ａ）テールを含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号３３９、３３８、又は１２に示される配列を含む。

【0032】

いくつかのかかる方法では、方法は、ＲＮＡの形態のガイドＲＮＡを細胞に導入することを含む。いくつかのかかる方法では、方法は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞に導入することを含む。いくつかのかかる方法では、ガイドＲＮＡは少なくとも１つの修飾を含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、（ｉ）ガイドＲＮＡの５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉ）ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、（ｉｖ）ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、を含む。いくつかのかかる方法では、ガイドＲＮＡは、配列番号２９の修飾ヌクレオチドを含む。

【0033】

いくつかのかかる方法では、ガイドＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかのかかる方法では、ガイドＲＮＡは、配列番号２１～２９のうちのいずれか１つに示される配列を含み、ガイドＲＮＡは、配列番号２９７～３１２及び３１６～３３１のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、ガイドＲＮＡは、配列番号２９７～３０４及び３１６～３２３のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、又はガイドＲＮＡは、配列番号２９９、３０１、３１８、及び３２０のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。

【0034】

いくつかのかかる方法では、ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む２つの別個のＲＮＡ分子を含む二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である。いくつかのかかる方法では、ｃｒＲＮＡは、配列番号１６～１７のうちのいずれか１つに示される配列を含む。いくつかのかかる方法では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、配列番号１８～２０のうちのいずれか１つに示される配列を含む。

【0035】

いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質である。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質は、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９タンパク質に由来する。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質は、配列番号１１又は８に示される配列を含む。

【0036】

いくつかのかかる方法では、方法は、第２のガイドＲＮＡ又は第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを細胞に導入することを更に含み、第２のガイドＲＮＡはＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をＣ５遺伝子内の第２のガイドＲＮＡ標的配列に標的化し、Ｃａｓタンパク質は第２のガイドＲＮＡ標的配列を切断してＣ５遺伝子内に標的化遺伝子改変を生成する。

【0037】

【0038】

【0039】

【0040】

【0041】

別の態様では、対象においてＣ５遺伝子を改変するか、又はＣ５遺伝子の発現を低下させるか、又は補体Ｃ５タンパク質の活性を低下させる方法が提供される。いくつかのそのような方法は、対象に、（ａ）Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸；及び（ｂ）ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを投与することを含み、ガイドＲＮＡはＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃ５遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、Ｃａｓタンパク質はガイドＲＮＡ標的配列を切断して、Ｃ５遺伝子の標的化遺伝子改変を生成する。別の態様では、Ｃ５に関連する疾患又は障害の少なくとも１つの症状又は適応症を予防、治療、又は改善する方法が提供される。いくつかのそのような方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の、（ａ）Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸；及び（ｂ）ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む医薬組成物を投与することを含み、ガイドＲＮＡはＣａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃ５遺伝子のガイドＲＮＡ標的配列を標的とし、Ｃａｓタンパク質はガイドＲＮＡ標的配列を切断して、Ｃ５遺伝子の標的化遺伝子改変を生成する。

【0042】

いくつかのかかる方法では、疾患又は障害は、成人呼吸窮迫症候群；加齢黄斑変性（ＡＭＤ）；アレルギー；アルポート症候群；アルツハイマー病；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）；喘息；アテローム性動脈硬化症；非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）；自己免疫疾患；自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）；バルーン血管形成；気管支収縮；水疱性類天疱瘡；火傷；Ｃ３糸球体症；毛細血管漏出症候群；心血管障害；突発性抗リン脂質症候群（ＣＡＰＳ）；脳血管障害；ＣＨＡＰＬＥ疾患（補体の過剰活性化、血管障害性血栓症及びタンパク質喪失性腸障害を伴うＣＤ５５欠損症）；化学的損傷；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）；寒冷凝集素症（ＣＡＤ）；角膜及び／又は網膜組織；クローン病；デゴス病；高密度沈着物疾患（ＤＤＤ）；皮膚筋炎；糖尿病；糖尿病性血管障害；糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）；糖尿病性腎症；糖尿病性網膜症；拡張型心筋症；不適切又は望ましくない補体活性化障害；呼吸困難；子癇；気腫；表皮水疱症；てんかん；線維原性ダスト疾患；凍傷；地図状萎縮（ＧＡ）；糸球体腎炎；糸球体症；グッドパスチャー症候群；グレーブス病；ギラン・バレー症候群；橋本甲状腺炎；血液透析合併症；溶血－肝臓酵素上昇及び低血小板（ＨＥＬＬＰ）症候群；溶血性貧血；喀血；Ｈｅｎｏｃｈ－Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ紫斑病性腎炎；遺伝性血管浮腫；超急性同種移植片拒絶；過敏性肺炎；特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）；ＩｇＡ腎症；免疫複合体障害；免疫複合体血管炎；免疫複合体関連炎症；感染症；自己免疫疾患によって引き起こされる炎症；炎症性障害；遺伝性ＣＤ５９欠損；不活性ダスト及び／又は鉱物による損傷；ＩＬ－２治療中のインターロイキン－２誘導性毒性；虚血－再灌流傷害；川崎病；肺の疾患又は障害；ループス腎炎；膜増殖性糸球体腎炎；膜増殖性腎炎；大動脈再建後の腸間膜動脈再灌流；腸間膜／腸間膜血管障害；多巣性運動ニューロパシー（ＭＭＮ）；多発性硬化症；重症筋無力症；心筋梗塞；心筋炎；神経障害；視神経脊髄炎；肥満；眼血管新生；脈絡膜に影響を及ぼす眼血管新生；有機ダスト病；寄生虫症；パーキンソン病；発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）；低免疫性血管炎；天疱瘡；経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）；末梢血管障害；肺炎；虚血後再灌流状態；心肺バイパスにおけるポンプ後症候群；腎バイパスにおけるポンプ後症候群；子癇前症；進行性腎不全；増殖性腎炎；タンパク尿腎疾患；乾癬；肺塞栓症；肺線維症；肺梗塞；肺血管炎；再発性胎児喪失；腎障害；腎虚血；腎虚血－再灌流傷害；腎血管障害；ステント留置後の再狭窄；関節リウマチ（ＲＡ）；回転式アテレクトミー；統合失調症；敗血症；敗血症性ショック；ＳＬＥ腎炎；煙による傷害；脊髄損傷；自然胎児喪失；脳卒中；敗血症に対する全身性炎症反応；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；全身性エリテマトーデス関連血管炎；高安病；熱損傷；血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）；外傷性脳損傷；Ｉ型糖尿病；典型的な溶血性尿毒症症候群（ｔＨＵＳ）；ブドウ膜炎；血管炎；関節リウマチに関連する血管炎；静脈ガス塞栓（ＶＧＥ）；及び／又は異種移植片拒絶である。

【0043】

いくつかのかかる方法では、疾患又は障害は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、加齢黄斑変性、地図状萎縮、ブドウ膜炎、視神経脊髄炎、多発性硬化症、脳卒中、ギラン・バレー症候群、外傷性脳損傷、パーキンソン病、不適切又は望ましくない補体活性化の障害、血液透析合併症、超急性同種移植片拒絶、異種移植片拒絶、ＩＬ－２療法中のインターロイキン－２誘発毒性、炎症性障害、自己免疫疾患の炎症、クローン病、成人呼吸窮迫症候群、熱傷又は霜を含む熱傷、虚血後再灌流状態、心筋梗塞、毛細血管漏出症候群、肥満、糖尿病、アルツハイマー病、統合失調症、脳卒中、てんかん、アテローム性動脈硬化、血管炎、水疱性類天疱瘡、Ｃ３糸球体症、膜性増殖性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、アルポート症候群、進行性腎不全、タンパク尿性腎疾患、腎虚血－再灌流傷害、ループス腎炎、バルーン血管形成術、心肺バイパス又は腎バイパスにおけるポンプ後症候群、血液透析、腎虚血、大動脈再建後の腸間膜動脈再灌流、感染症又は敗血症、免疫複合体障害及び自己免疫疾患、腎障害、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＳＬＥ腎炎、増殖性腎炎、溶血性貧血、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、肺塞栓症及び梗塞、肺炎、及び重症筋無力症からなる群から選択される。いくつかのかかる方法では、疾患又は障害は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、難治性重症筋無力症（ｒＭＧ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、Ｃ３糸球体症、及びＡＮＣＡ－血管炎である。

【0044】

いくつかのかかる方法では、疾患又は障害はａＨＵＳ又はＰＮＨである。いくつかのかかる方法では、疾患又は障害はａＨＵＳである。いくつかのかかる方法では、疾患又は障害はＰＮＨである。いくつかのかかる方法では、疾患又は障害はＰＮＨであり、方法は、対象における血清乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）レベル、脈管内溶血、及び／又は赤血球の輸血の必要性を低減するためのものである。いくつかのかかる方法では、疾患又は障害は、ＣＤ５５欠損タンパク質喪失腸疾患（ＣＨＡＰＬＥ疾患）である。いくつかのかかる方法では、疾患又は障害は、ＣＤ５５欠乏タンパク質喪失性腸症（ＣＨＡＰＬＥ疾患）であり、方法は、（ｉ）胃腸管を通じた、血清アルブミンを正常化及び／若しくは増加させること又はその損失を減少させること；胃腸管を通じた、総血清タンパク質レベルを増加させること、又はその損失を減少させること；血清ビタミンＢ１２又はその胃腸吸収を増加させること；血小板数を減少させること、又は凝固カスケード活性化を減少させること、又は血栓性事象の発生率を減少させること；消化管を通じたアルファ－１－アンチトリプシンの喪失を減少させること；顔面及び／又は末梢浮腫を治療又は予防すること；腸運動の頻度を減少させること；下痢を治療又は予防すること；腹痛を治療又は予防すること；コルチコステロイドの使用を減少させること；及び／又は対象における入院の発生率を低下させること；あるいは（ｉｉ）対象における治療的介入を減少させることであって、治療的介入が、コルチコステロイドの投与；免疫グロブリンの投与；アルブミンの投与；抗腫瘍壊死因子アルファ治療剤の投与；免疫調節薬の投与；微量栄養素の投与；経腸又は非経口補充の投与；抗凝固剤の投与；抗生物質の投与；及び抗血小板剤の投与からなる群から選択される１つ以上である、こと、のためのものである。任意選択的に、方法は、血清アルブミンを少なくとも１ｇ／ｄＬ増加させるため、及び／又は血清アルブミンを約３．５～約５．５ｇ／ｄＬに正常化するためのものである。

【0045】

いくつかのかかる方法では、医薬組成物は、それを必要とする対象に予防的又は治療的に投与される。いくつかのかかる方法では、医薬組成物は静脈内投与される。

【0046】

【0047】

【0048】

いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸及び／又はガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、脂質ナノ粒子媒介送達を介して対象に投与される。いくつかのかかる方法では、ＲＮＡの形態のガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質をコードする核酸は脂質ナノ粒子媒介送達を介して対象に投与され、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸はｍＲＮＡである。いくつかのかかる方法では、脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、及びステルス脂質を含む。いくつかのかかる方法では、カチオン性脂質はリピドＡである。いくつかのかかる方法では、中性脂質はＤＳＰＣである。いくつかのかかる方法では、ヘルパー脂質はコレステロールである。いくつかのかかる方法では、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。いくつかのかかる方法では、カチオン性脂質はリピドＡであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。

【0049】

いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸及び／又はガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、アデノ随伴ウイルスを介して対象に投与される。

【0050】

いくつかのかかる方法では、方法は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を投与することを含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、哺乳動物細胞又はヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸はＤＮＡを含み、任意選択的に、方法は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを投与することを含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸はＲＮＡを含み、任意選択的に、方法は、ＲＮＡの形態のガイドＲＮＡを投与することを含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡは、少なくとも１つの修飾を含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡは、１つ以上又は全てのウリジン位置に修飾ウリジンを含むように修飾される。いくつかのかかる方法では、修飾ウリジンは、シュードウリジンである。いくつかのかかる方法では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンである。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡをシュードウリジンで完全に置換する。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで完全に置換されている。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡは５’キャップを含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡはポリ（Ａ）テールを含む。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質をコードするＲＮＡは、配列番号３３９、３３８、又は１２に示される配列を含む。

【0051】

いくつかのかかる方法では、本方法は、ＲＮＡの形態のガイドＲＮＡを投与することを含む。いくつかのかかる方法では、本方法は、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを投与することを含む。いくつかのかかる方法では、ガイドＲＮＡは少なくとも１つの修飾を含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドを含む。いくつかのかかる方法では、少なくとも１つの修飾は、（ｉ）ガイドＲＮＡの５’末端の最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉ）ガイドＲＮＡの３’末端の最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合と、（ｉｉｉ）ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、（ｉｖ）ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドの２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチドと、を含む。いくつかのかかる方法では、ガイドＲＮＡは、配列番号２９の修飾ヌクレオチドを含む。

【0052】

【0053】

【0054】

【0055】

いくつかのかかる方法では、方法は、第２のガイドＲＮＡ又は第２のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを対象に投与することを更に含み、第２のガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質をＣ５遺伝子内の第２のガイドＲＮＡ標的配列に標的化し、Ｃａｓタンパク質が第２のガイドＲＮＡ標的配列を切断してＣ５遺伝子内に標的化遺伝子改変を生成する。

【0056】

いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質による切断は、Ｃ５遺伝子における二本鎖切断を作り出す。いくつかのかかる方法では、Ｃａｓタンパク質による切断は、Ｃ５遺伝子中に一本鎖切断を作り出す。いくつかのかかる方法では、標的化遺伝子改変は、非相同末端結合による切断されたガイドＲＮＡ標的配列の修復によって生成される。いくつかのかかる方法では、本方法は、細胞におけるＣ５遺伝子の発現又は活性の低減をもたらす。いくつかのかかる方法では、本方法は、細胞におけるＣ５遺伝子の機能喪失又は不活性化をもたらす。

【0057】

いくつかのかかる方法では、対象は哺乳動物であり、Ｃ５遺伝子は哺乳動物Ｃ５遺伝子である。いくつかのかかる方法では、対象はヒトであり、Ｃ５遺伝子はヒトＣ５遺伝子である。

【0058】

いくつかのかかる方法では、方法は、対象における細胞の標的集団のＣ５遺伝子の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、若しくは少なくとも９５％の編集パーセントをもたらす。いくつかのかかる方法では、方法は、対象における細胞の標的集団のＣ５遺伝子の約３０％～約３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、約４５％～約５０％、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６０％～約６５％、約６５％～約７０％、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、又は約９５％～約９９％の編集をもたらす。

【0059】

いくつかのかかる方法では、方法は、対象において補体Ｃ５タンパク質の血清レベルの低下をもたらし、任意選択的に、補体Ｃ５タンパク質の血清レベルが、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％低下する。いくつかのかかる方法では、方法は、対象における補体Ｃ５タンパク質活性の低下をもたらし、任意選択的に、方法が、感作ヒツジ赤血球を使用してエクスビボで測定した場合、古典経路溶血の少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％パーセントの阻害をもたらす。いくつかのかかる方法では、Ｃ５補体活性は、補体媒介性ヒツジ赤血球溶解のＣＨ５０アッセイによって測定される場合、約９５～１００％低減される。

【0060】

いくつかのかかる方法では、組成物は、更なる治療剤と会合して投与される。いくつかのかかる方法では、更なる治療剤は、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質、アセトアミノフェン、アルブミン注入、アンクロッド、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗生物質、抗ＣＤ２０剤、抗凝血剤、抗真菌剤、降圧薬、抗炎症薬、抗プラスミン－ａ１、抗発作剤、抗血栓剤、抗ＴＮＦα剤、抗ウイルス剤、アルガトロバン、アスピリン、生物学的治療剤、ビバリルジン、Ｃ３阻害剤、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、ダビガトラン、デフィブロチド、Ｅ－アミノカプロン酸、経腸栄養、エリスロマイシン、エリスロポエチン、線溶剤、葉酸、フォンダパリヌクス、ヘパリン、ホルモン補充療法、イブプロフェン、イドラパリヌクス、免疫抑制薬、インフリキシマブ、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素の阻害剤、鉄サプリメント、レピルジン、脂質低下剤、硫酸マグネシウム、髄膜炎菌ワクチン、メトトレキサート、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、オリゴヌクレオチド、パラセタモール、非経口栄養、ペニシリン、フェニンジオン、妊娠避妊薬、プロスタサイクリン、リツキシマブ、トロンビン阻害剤、ワクチン、ビンクリスチン、ビタミン、及び／又はワルファリンである。

【0061】

いくつかのかかる方法では、更なる治療剤は、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質である。いくつかのかかる方法では、抗原結合タンパク質は対象に静脈内又は皮下投与される。いくつかのかかる方法では、抗原結合タンパク質の初回用量は対象に静脈内投与され、抗原結合タンパク質の１つ以上の更なる用量は皮下投与される。いくつかのかかる方法では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質は抗体又はその抗原結合断片である。いくつかのかかる方法では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、（１）配列番号３４１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３４９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２）配列番号３５７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３６５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（３）配列番号３７３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３８１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（４）配列番号３８９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号３９７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（５）配列番号４０５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４１３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（６）配列番号４２１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（７）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（８）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４５３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（９）配列番号４６１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１０）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１１）配列番号４７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１２）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１３）配列番号４６１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１４）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４５３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１５）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１６）配列番号４７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１７）配列番号４９３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５０１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１８）配列番号５０９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５１７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（１９）配列番号５２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５３３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２０）配列番号５４１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５４９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２１）配列番号５５７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５６５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２２）配列番号５７３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５８１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２３）配列番号５８９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２４）配列番号６０５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号５９７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２５）配列番号６１３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６２１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２６）配列番号６２９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２７）配列番号６４５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６５３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；（２８）配列番号６６１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６６９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；あるいは（２９）配列番号６７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲ又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６８５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＶＲ又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；を含むか、あるいは（１）～（２９）からなる群から選択される抗原結合タンパク質とＣ５への結合について競合するか、あるいは（１）～（２９）からなる群から選択される抗原結合タンパク質と同じＣ５上のエピトープに結合する。いくつかのかかる方法では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、配列番号６９７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖又はその可変領域又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３、並びに配列番号６９８に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖又はその可変領域又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含むモノクローナル抗体である。いくつかのかかる方法では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、配列番号６９７に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン重鎖及び配列番号６９８に示されるアミノ酸配列を含む免疫グロブリン軽鎖を含むモノクローナル抗体である。いくつかのかかる方法では、Ｃ５に特異的に結合する抗原結合タンパク質はポゼリマブである。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1A】初代ヒト肝細胞への異なるＣ５標的化ｓｇＲＮＡとの１０ｎＭのＣａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の投与後５日目のヒトＣ５挿入／欠失（インデル）頻度を示す。陽性対照ｓｇＲＮＡＰＣＳＫ９＿１２６４及びＴＴＲ＿Ｇ０００４８９は、それぞれＰＣＳＫ９及びＴＴＲ遺伝子中の領域を標的とする。陰性対照ｓｇＲＮＡｍｓＨｃ１はヒト非標的化ｓｇＲＮＡである。

【0063】

【図1B】初代ヒト肝細胞への異なるＣ５標的化ｓｇＲＮＡとの１０ｎＭのＣａｓ９リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体の投与後５日目の培養培地におけるヒト補体Ｃ５タンパク質発現を示す。

【0064】

【図2】初代ヒト肝細胞への２５ｎＭの異なるＣ５標的化ｓｇＲＮＡを含む０．５μｇのＣａｓ９ｍＲＮＡの投与後３日目のヒトＣ５挿入／欠失（インデル）頻度を示す。

【0065】

【図3A】ヒト化Ｃ５マウスへの１ｍｇ／ｋｇの用量でＣａｓ９ｍＲＮＡ及び異なるＣ５標的化ｓｇＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰの注射３週間後のヒト補体Ｃ５の血漿レベルを示す。

【0066】

【図3B】ヒト化Ｃ５マウスへの２ｍｇ／ｋｇの用量でＣａｓ９ｍＲＮＡ及び異なるＣ５標的化ｓｇＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰの注射３週間後のヒト補体Ｃ５の血漿レベルを示す。

【0067】

【図4A】ヒト化Ｃ５マウスへの２ｍｇ／ｋｇの用量でＣａｓ９ｍＲＮＡ及び異なるＣ５標的化ｓｇＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰの注射の３週間後に感作ヒツジ赤血球を使用してエクスビボで測定された、それぞれ、古典経路溶血及び対照に対する低減率としての古典経路溶血を示す。

【図4B】ヒト化Ｃ５マウスへの２ｍｇ／ｋｇの用量でＣａｓ９ｍＲＮＡ及び異なるＣ５標的化ｓｇＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰの注射の３週間後に感作ヒツジ赤血球を使用してエクスビボで測定された、それぞれ、古典経路溶血及び対照に対する低減率としての古典経路溶血を示す。

【0068】

【図5A】ヒト化Ｃ５マウスへの０．１、０．３、又は１ｍｇ／ｋｇの用量での新しいＣａｓ９ｍＲＮＡ及び２つの異なるＣ５標的化ｓｇＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰの注射の３週間後に感作ヒツジ赤血球を使用してエクスビボで測定された、ヒト補体Ｃ５及び古典経路溶血の血漿レベルを示す。

【図5B】ヒト化Ｃ５マウスへの０．１、０．３、又は１ｍｇ／ｋｇの用量での新しいＣａｓ９ｍＲＮＡ及び２つの異なるＣ５標的化ｓｇＲＮＡと共に製剤化されたＬＮＰの注射の３週間後に感作ヒツジ赤血球を使用してエクスビボで測定された、ヒト補体Ｃ５及び古典経路溶血の血漿レベルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0069】

定義
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、コード化及び非コード化アミノ酸並びに化学的又は生化学的に修飾又は誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能又は構造を有するタンパク質又はポリペプチドの任意の部分を指す。

【0070】

タンパク質は、「Ｎ末端」及び「Ｃ末端」を有すると言われる。「Ｎ末端」という用語は、遊離アミン基（－ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端に有する、タンパク質又はポリペプチドの開始部に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）によって終端されたアミノ酸鎖（タンパク質又はポリペプチド）の末端部に関する。

【0071】

本明細書で互換的に使用される、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はそれらの類似体若しくは改変バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらには、一本鎖、二本鎖、及び多重鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、並びにプリン塩基、ピリミジン塩基、又は他の天然、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。

【0072】

１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩がホスホジエステル結合を介して一方向で、その隣の３’酸素に結合する手法でオリゴヌクレオチドを作製するように、モノヌクレオチドが反応するため、核酸は、「５’末端」及び「３’末端」を有すると言われている。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸塩がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩に連結されていない場合、「３’末端」と称される。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部に存在するとしても、５’及び３’末端を有するとも言われ得る。線状又は環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、別個の要素は、「上流」又は「下流」の５’若しくは３’要素であると称される。

【0073】

「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれるように、細胞に導入されている核酸を指す。細胞のゲノムへの核酸の安定した組み込みのために、任意のプロトコルが使用され得る。

【0074】

「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介ライゲーション、又は任意の他の組換え手段によって、細胞のゲノム中の標的位置に導入され得る組換え核酸を指す。

【0075】

「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つのエレメントを含み、かつウイルスベクター粒子へのパッケージングに十分な、又はそれを許容するエレメントを含む、組換え核酸を指す。ベクター及び／又は粒子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他の核酸を、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで細胞に導入する目的で利用することができる。ウイルスベクターの多くの形態が知られている。

【0076】

細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、及び核酸に関して「分離された」という用語は、通常インサイチュで存在し得る他の細菌、ウイルス、細胞、又は他の成分に関して比較的精製されている細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、及び核酸を含み、細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、及び核酸の実質的に純粋な調製物までを含み、並びにそれらの実質的に純粋な調製物を含む。「単離された」という用語はまた、天然に存在する対応物を有さず、化学的に合成され、それにより他の細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、及び核酸が実質的に混入していないか、又はそれらに天然に付随する（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、若しくは他の成分）ほとんどの他の成分（例えば、細胞成分）から分離若しくは精製されている細胞、組織（例えば、肝臓サンプル）、脂肪滴、タンパク質、及び核酸も含む。

【0077】

「野生型」という用語は、（変異体、病変した、改変したなどとは対照的に）正常な状態又は文脈に見られるような構造及び／又は活性を有する実体を含む。野生型遺伝子及びポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。

【0078】

「内因性配列」という用語は、ラット細胞又はラット内で天然に存在する核酸配列を指す。例えば、マウスの内因性Ｃ５配列は、マウスのＣ５遺伝子座で天然に存在する天然のＣ５配列を指す。

【0079】

「外因性」分子又は配列には、その形態で細胞に通常は存在しない分子又は配列が含まれる。通常の存在には、細胞の特定の発生段階及び環境条件に関する存在が含まれる。外因性分子又は配列には、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなど、細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンが含まれ得るか、又は細胞内であるが、異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列が含まれ得る。対照的に、内因性分子又は配列は、その形態で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子又は配列を含む。

【0080】

核酸又はタンパク質の文脈で使用される場合の「異種」という用語は、核酸又はタンパク質が、同じ分子内で一緒に天然に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメント又はタンパク質のセグメントに関して使用される場合、核酸又はタンパク質が、自然界で互いに同じ関係（例えば、一緒に結合）で見出されない２つ以上のサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、自然界で他の分子と関連して見出されない、別の核酸分子内の、又は別の核酸分子に結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、自然界のコード配列に関連して見出されない配列に隣接するコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、自然界の他のペプチド分子（例えば、融合タンパク質、又はタグ付きタンパク質）に関連して見出されない、別のペプチド分子内にあるか、又はそれに結合しているアミノ酸のセグメントである。同様に、核酸又はタンパク質は、異種標識又は異種分泌又は局在化配列を含むことができる。

【0081】

「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組み合わせの多様性によって示されるように、コドンの縮重を利用し、一般に、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、特定の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を修飾するプロセスを含む。例えば、補体Ｃ５タンパク質をコードする核酸は、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、又は他の任意の宿主細胞を含む、所与の原核細胞又は真核細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと修飾することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「コドン使用頻度データベース」において容易に利用可能である。これらの表は、様々な方法で適用することができる。Ｎａｋａｍｕｒａｅｔａｌ．（２０００）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２８（１）：２９２を参照されたく、その全体が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズム（例えば、ＧｅｎｅＦｏｒｇｅを参照されたい）もまた利用可能である。

【0082】

「遺伝子座」という用語は、遺伝子（又は重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列、又は生物のゲノムの染色体上の位置（position）の特定の位置（location）を指す。例えば、Ｃ５遺伝子座は、Ｃ５遺伝子の特定の位置、Ｃ５ＤＮＡ配列、補体Ｃ５コード配列、又はここでそのような配列が存在するとして同定された生物のゲノムの染色体上Ｃ５位置を指すことができる。「Ｃ５遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、又はそれらの組み合わせを含む、Ｃ５遺伝子の調節エレメントを含み得る。

【0083】

「遺伝子」という用語は、自然に存在する場合、少なくとも１つのコーディング領域と、少なくとも１つの非コーディング領域と、を含む可能性のある染色体内のＤＮＡ配列を指す。産物（例えば、非限定的に、ＲＮＡ産物及び／又はポリペプチド産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列は、非コードイントロンで中断されたコード領域及び５’端と３’端の両方のコード領域に隣接して位置する配列を含み得、遺伝子が全長のｍＲＮＡ（５’及び３’の非翻訳配列を含む）に対応するようなる。更に、調節配列を含む他の非コード配列（例えば、非限定的に、プロモーター、エンハンサー、及び転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位、サイレンサー、絶縁配列、及びマトリックス結合領域も遺伝子に存在してもよい。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接（例えば、非限定的に、１０ｋｂ以内）してもよく、又は離れていてもよく、それらは遺伝子の転写と翻訳のレベル又は速度に影響を及ぼす。

【0084】

「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のバリアントを指す。いくつかの遺伝子は、染色体上の同じ位置、又は遺伝子座に位置する様々な異なる形態を有する。二倍体生物は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子がある場合はホモ接合であり、２つの対立遺伝子が異なる場合はヘテロ接合であると記載される。

【0085】

「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域を更に含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書に開示される１つ以上の細胞型（例えば、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、又はそれらの組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、又は空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的又は組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、国際公開第２０１３／１７６７７２号において見出すことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0086】

「作動可能な連結」又は「作動可能に連結される」とは、その両方の成分が正常に機能し、かつ成分の少なくとも１つが他の成分のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーター及び別の配列要素）の並列を含む。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在又は非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が互いに近接していること、又はトランスに作用する（例えば、調節配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。

【0087】

本明細書で提供される方法及び組成物は、様々な異なる構成要素を使用する。記載全体の一部の成分には、活性バリアント及び断片を有し得る。「機能性」という用語は、生物学的活性又は機能を示すタンパク質又は核酸（又はその断片、若しくはバリアント）の生来の能力を指す。機能的断片又はバリアントの生物学的機能は、元の分子と比較して同じであるか、又は実際に変更され得る（例えば、それらの特異性又は選択性又は有効性に関して）が、分子の基本的な生物学的機能を保持する。

【0088】

「バリアント」という用語は、集団で最も一般的な配列とは異なるヌクレオチド配列（例えば、１ヌクレオチド）、又は集団で最も一般的な配列とは異なるタンパク質配列（例えば、１アミノ酸）を指す。

【0089】

「断片」という用語は、タンパク質に言及する場合、完全長タンパク質よりも短いか、又は少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸に言及する場合、全長の核酸よりも短いか、又は少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、又は内部断片（すなわち、タンパク質のＮ末端とＣ末端の各々の一部の除去）であり得る。断片は、例えば、核酸断片を指す場合、５’断片（すなわち、核酸の３’末端の一部の除去）、３’断片（すなわち、核酸の５’末端の一部の除去）、又は内部断片（すなわち、核酸の５’末端と３’末端の各々の一部の除去）であり得る。

【0090】

２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」又は「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基を指す。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なり、その保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整され得る。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のスコアを与えられる場合に、保存的置換は、０～１のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。

【0091】

「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加また欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、及び結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。別段の定めがない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の完全長である。

【0092】

特に明記しない限り、配列同一性／類似性値は、以下のパラメータを使用してＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を含む：ＧＡＰ重み５０及び長さ重み３、並びにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用したヌクレオチド配列についての同一性％及び類似性％；ＧＡＰ重み８及び長さ重み２、並びにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列についての同一性％及び類似性％；又はその任意の同等のプログラム。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の一致及び同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。

【0093】

「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、又は極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、又はロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、又はグリシンとセリンとの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。追加的に、リジン、アルギニン、若しくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、又はアスパラギン酸若しくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、若しくはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、若しくはリシンへの、及び／又は極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類を以下で要約する。

【0094】

【表1】

【0095】

「相同」配列（例えば、核酸配列）としては、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくは１００％同一であるような、既知の参照配列と同一か、又は実質的に同様である配列が挙げられる。相同配列は、例えば、オルソログ配列及びパラロガス配列を含み得る。例えば、相同遺伝子は典型的には、種分化事象（オルソログ遺伝子）又は遺伝子重複事象（パラロガス遺伝子）のいずれかを介して、共通の祖先ＤＮＡ配列に由来する。「オルソログ」遺伝子には、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した様々な種の遺伝子が含まれる。オルソログは典型的には、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子には、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子が含まれる。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。

【0096】

「インビトロ」という用語は、人工環境、及び人工環境（例えば、試験管又は単離された細胞若しくは細胞株）内で生じるプロセス又は反応を含む。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、細胞又は生物又は身体）、及び天然環境内で生じるプロセス又は反応を含む。「エクスビボ」という用語は、個体の身体から取り出された細胞、及びそのような細胞内で起こるプロセス又は反応を含む。

【0097】

「レポーター遺伝子」という用語は、異種プロモーター及び／又はエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列を含むコンストラクトがプロモーター及び／又はエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含む（又は含むようにすることができる）細胞に導入される場合、容易かつ定量的にアッセイされる遺伝子産物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例には、これらに限定されないが、ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする遺伝子、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードする遺伝子、及び蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。

【0098】

本明細書で使用される場合、「蛍光レポータータンパク質」という用語は、蛍光に基づいて検出可能なレポータータンパク質を意味し、ここで、蛍光は、レポータータンパク質から直接、蛍光発生基質に対するレポータータンパク質の活性、又は蛍光タグ付き化合物への結合について親和性を有するタンパク質のいずれかからのものであり得る。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ、単量体ＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、及びＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、及びＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びＴ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン色蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、及びＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄモノマー、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、及びＪｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、及びｔｄＴｏｍａｔｏ）、並びにフローサイトメトリー法で細胞内の存在を検出できるその他の好適な蛍光タンパク質メソッドが挙げられる。

【0099】

１つ又は複数の列挙された要素を「含む（comprising）」又は「含む（including）」組成物又は方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（comprises）」又は「含む（includes）」組成物は、タンパク質を単独で、又は他の成分との組み合わせで含み得る。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲が、特許請求の範囲に記載された特定の要素、及び特許請求された発明の基本的かつ新規の特性に実質的に影響をしない要素を包含すると解釈されることを意味する。したがって、本発明の請求項で使用される場合の「本質的に～からなる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。

【0100】

「任意選択の」又は「任意選択的に」は、それに続いて記載された事象又は状況が起こっても起こらなくてもよいことであって、その記載が、当該事象又は状況が起こる場合の例及びそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。

【0101】

値の範囲の指定は、その範囲内の、又はその範囲を定義する全ての整数、及びその範囲内の整数によって定義される全ての部分範囲を含む。

【0102】

文脈から特に明らかでない限り、「約」という用語は記載された値の±５％である値を包含する。

【0103】

「及び／又は」という用語は、関連する列挙される項目のうちの１つ以上の任意及び全ての可能な組み合わせ、代替物（「又は」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、これらを包含する。

【0104】

「又は」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを指し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。

【0105】

冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「タンパク質」又は「少なくとも１つのタンパク質」という用語は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含むことができる。

【0106】

統計的に有意なとは、ｐ≦０．０５を意味する。
（発明を実施するための形態）

【0107】

Ｉ．概要
Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするガイドＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、そのようなガイドＲＮＡ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む脂質ナノ粒子又はウイルスベクター、並びにそのようなガイドＲＮＡ又はシステムを含む細胞又は動物が本明細書で開示される。そのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単独で、又はＣ５抗原結合タンパク質又は抗体、例えば、限定されないが、本明細書に開示されるもの、又は各々が、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０２１／０３４６３９号、米国特許出願公開第２０２１－００４６１８２号明細書、国際公開第２０２１／０８１２７７号、米国特許出願公開第２０２１－０１３９５７３号明細書、国際公開第２０１７／２１８５１５号、米国特許出願公開第２０２０－０２６２９０１号明細書、米国特許出願公開第２０１７－０３５５７５７号明細書、又は米国特許出願公開第２０２０－０２６２９００号明細書に開示されるものと組み合わせて、又は会合していてもよい。本明細書に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用してＣ５遺伝子座又は遺伝子を改変又はノックダウン又はノックアウトする方法、並びにＣ５に関連する疾患、障害、若しくは状態の治療及び／若しくは予防のため、並びに／又はそのような疾患、障害、若しくは状態に関連する少なくとも１つの症状を改善するための予防及び治療適用におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用も本明細書に開示される。そのような方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを、単独で、又はＣ５抗原結合タンパク質又は抗体、例えば、限定されないが、本明細書に開示されるもの、又は各々が、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０２１／０３４６３９号、米国特許出願公開第２０２１－００４６１８２号明細書、国際公開第２０２１／０８１２７７号、米国特許出願公開第２０２１－０１３９５７３号明細書、国際公開第２０１７／２１８５１５号、米国特許出願公開第２０２０－０２６２９０１号明細書、米国特許出願公開第２０１７－０３５５７５７号明細書、又は米国特許出願公開第２０２０－０２６２９００号明細書に開示されるものと組み合わせて使用することを含み得る。

【0108】

ＩＩ．Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
本明細書に開示される方法及び組成物は、細胞内のＣ５遺伝子又は遺伝子座（例えば、Ｃ５ゲノム遺伝子座）を改変するために、クラスター化して規則的に散在する短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系又はそのような系の構成要素を利用する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与する、又はその活性を指示する転写産物及び他の要素が含まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、例えば、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ系、又はタイプＶ系（例えば、サブタイプＶ－Ａ又はサブタイプＶ－Ｂ）であり得る。本明細書に開示される方法及び組成物は、核酸の部位特異的結合又は切断のためにＣＲＩＳＰＲ複合体（Ｃａｓタンパク質と複合体を形成したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む）を利用することによってＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用することができる。Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓタンパク質（又はＣａｓタンパク質をコードする核酸）及び１つ以上のガイドＲＮＡ（又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）を含み、１つ以上のガイドＲＮＡのそれぞれは、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座における異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的化する。任意選択的に、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的化するそのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃ５遺伝子又はゲノム遺伝子座を標的化する１つ以上の外因性ドナー配列（例えば、標的化ベクター）を更に含むことができる。

【0109】

本明細書に開示される組成物及び方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、天然に存在しなくてもよい。「天然に存在しない」系は、系の１つ以上の構成要素が、それらの天然に存在する状態から改変又は変異されている、それらが天然に関連する少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まない、又はそれらが天然に関連しない少なくとも１つの他の構成要素と関連するなど、ヒトの手の関与を示す任意のものを含む。例えば、いくつかのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、天然に発生しないｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を一緒に含む非天然発生型ＣＲＩＳＰＲ複合体を用いるか、天然に発生しないＣａｓタンパク質を用いるか、又は天然に発生しないｇＲＮＡを用いる。

【0110】

Ａ．Ｃ５
本明細書に記載の組成物及び方法は、補体Ｃ５（補体成分Ｃ５、補体Ｃ５イソ型１プレプロタンパク質、又はＣ３及びＰＺＰ様アルファ－２－マクログロブリンドメイン含有タンパク質４としても公知である）をコードするＣ５遺伝子（ＣＰＡＭＤ４としても知られる）を標的とするためのものである。補体Ｃ５は、炎症、宿主恒常性、及び病原体に対する宿主防御において重要な役割を果たす自然免疫系の一部である補体系の成分である。コードされたプレプロタンパク質は、タンパク質分解的にプロセシングされて、Ｃ５α鎖、Ｃ５β鎖、Ｃ５ａアナフィラトキシン、及びＣ５ｂを含む複数のタンパク質産物を生成する。Ｃ５タンパク質は、ジスルフィド架橋によって連結されたＣ５α鎖及びβ鎖から構成される。コンバターゼ酵素によるアルファ鎖の切断は、強力な収縮刺激性活性及び走化性活性を有するＣ５ａアナフィラトキシン、並びに膜侵襲複合体（ＭＡＣ）のサブユニットであるＣ５ｂ高分子切断生成物の形成をもたらす。この遺伝子における突然変異は、再発性細菌感染を特徴とする疾患である補体成分５欠乏を引き起こす。選択的スプライシングは、複数の転写バリアントをもたらす。

【0111】

Ｃ５転換酵素によるＣ５の活性化は、後期補体成分、Ｃ５－Ｃ９の膜侵襲複合体への自発的アセンブリを開始する。Ｃ５ｂは、Ｃ６に対する一過性の結合部位を有する。Ｃ５ｂ－Ｃ６複合体は、溶解複合体が構築される基礎である。補体Ｃ５のタンパク質分解に由来して、Ｃ５アナフィラトキシンは局所炎症過程のメディエータである。受容体Ｃ５ＡＲ１への結合は、細胞内カルシウム放出、平滑筋の収縮、血管透過性の増加、並びに肥満細胞及び好塩基性白血球からのヒスタミン放出を含む様々な応答を誘導する。Ｃ５ａはまた、多形核白血球の移動を刺激し、炎症部位へのそれらの遊走を指示する強力なケモカインである。補体Ｃ５は、３つ全ての補体活性化経路の末端エフェクター分子であり、いくつかの補体駆動疾患における中心的な媒介因子である。

【0112】

ヒトＣ５は、第９染色体上の９ｑ３３．２にマッピングされる（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ遺伝子ＩＤ７２７；アセンブリＧＲＣｈ３８．ｐ１３（ＧＣＦ＿０００００１４０５．３９）；場所ＮＣ＿０００００９．１２（１２０９５２３３５．．．１２１０７４８６５、補体））。この遺伝子は、４１個のコードエキソンを有することが報告されている。ヒト補体Ｃ５タンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１０３１が割り当てられている。カノニカルアイソフォームの配列、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１７６２６．２及びＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１０３１－１は、配列番号１に示されている。１．標準的なアイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１７３５．３が割り当てられており、配列番号２に示される。２．カノニカルアイソフォームをコードする例示的なコード配列（ＣＤＳ）は、配列番号３（ＣＣＤＳＩＤＣＣＤＳ６８２６．１）に示される。ヒト補体Ｃ５タンパク質の別のアイソフォームにはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００１３０４０９２．１が割り当てられ、配列番号４に示される。この他のアイソフォームをコードするｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）にはＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１３１７１６３．２を割り当て、配列番号５に示される。

【0113】

配列番号１に記載の完全長ヒト補体Ｃ５タンパク質は、１６７６個のアミノ酸を有する。ヒト補体Ｃ５への言及には、標準的な（野生型）形態並びに全ての対立遺伝子形態及びアイソフォームが含まれる。任意の他の形態のヒト補体Ｃ５は、野生型形態との最大アライメントに対して番号が付けられたアミノ酸を有し、アラインされたアミノ酸は同じ番号で示される。

【0114】

マウスＣ５（Ｈｃ又は溶血性補体としても知られる）は２Ｂ；第２染色体上の２２３．２２ｃＭ（ＮＣＢＩＲｅｆＳｅｑ遺伝子ＩＤ１５１３９；アセンブリＧＲＣｍ３８．ｐ６（ＧＣＦ＿０００００１６３５．２６）；場所ＮＣ＿００００６８．７（３４９８３３２９．．．３５０６８５０６、補体））にマッピングされる。この遺伝子は、４１個のコードエキソンを有することが報告されている。マウス成分Ｃ５タンパク質には、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０６６８４及びＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０３４５３６．３が割り当てられている。カノニカルアイソフォームをコードする例示的なｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）には、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿１０４０６．２が割り当てられる。カノニカルアイソフォームをコードする例示的なコード配列（ＣＤＳ）には、ＣＣＤＳＩＤＣＣＤＳ１５９５７．１が割り当てられる。

【0115】

Ｂ．Ｃａｓタンパク質
Ｃａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡと相互作用できる少なくとも１つのＲＮＡ認識又は結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン又はＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及び他のドメインを含み得る。いくつかのそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、ネイティブのＣａｓタンパク質に由来し得る。他のそのようなドメインを追加して、修飾Ｃａｓタンパク質を作製することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む、核酸切断に対する触媒活性を有する。切断は平滑末端又は付着末端を生成することができ、一本鎖又は二本鎖であってもよい。例えば、野生型のＣａｓ９タンパク質は、通常、平滑端切断産物を生成する。代替的に、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は、非標的鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後及び標的鎖の２３番目の塩基の後に切断が生じる、５－ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する切断産物をもたらし得る。Ｃａｓタンパク質は、完全な切断活性を有し、標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断を作成することができ（例えば、平滑末端を持つ二本鎖切断）、又はそれは、標的ゲノム遺伝子座で一本鎖切断を作成するニッカーゼであってもよい。

【0116】

Ｃａｓタンパク質の例には、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１又はＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６、並びにそれらの相同性又は改変バージョンが含まれる。

【0117】

例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質又はＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、タイプＩＩＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに由来するものであり、典型的には、保存されたアーキテクチャを有する４つの重要なモチーフを共有する。モチーフ１、２、及び４はＲｕｖＣ様モチーフであり、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス属（Streptococcus sp.）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、ノカルジオプシス・ダソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトスポランギウム・ロセウム（Streptosporangium roseum）、ストレプトスポランギウム・ロセウム（Streptosporangium roseum）、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）、バチルス・シュードマイコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス・セレニティレデュセンス（Bacillus selenitireducens）、エキシグオバクテリウム・シビリカム（Exiguobacterium sibiricum）、ラクトバチルス・デルブルエッキイー（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、マイクロシーラ・マリナ（Microscilla marina）、バークホルデリア目細菌（Burkholderiales bacterium）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス属（Polaromonas sp.）、クロコスファエラ・ワトソニー（Crocosphaera watsonii）、シアノセイス属（Cyanothece sp.）、ミクロキスティスエルギノーサ（Microcystis aeruginosa）、シネココッカス属（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム・アラバチクム（Acetohalobium arabaticum）、アンモニフェクス・デゲンジイ（Ammonifex degensii）、カルディセルロシルプター・ベシイ（Caldicelulosiruptor becscii）、カンディダタス・デスルフォルディス（Candidatus Desulforudis）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、ナトラナエロビウス・サーモフィルス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム（Pelotomaculum thermopropionicum）、硫黄酸化細菌（Acidithiobacillus caldus）、鉄酸化細菌（Acidithiobacillus ferrooxidans）、アロクロマチウム・ビノスム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター属（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Nitrosococcus halophilus）、ニトロソコッカス・ワッソニ（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、クテドノバクテル・ラセミファー（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Methanohalobium evestigatum）、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノジュラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ノストック属（Nostoc sp.）、アルスロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、アルスロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）、アルスロスピラ属（Arthrospira sp.）、リングビア属（Lyngbya sp.）、ミクロコレス・クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、オシラトリア属（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ・モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、アカリオクロリス・マリナ（Acaryochloris marina）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、又はカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）に由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１３１８３３号に記載されている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられている）は、例示的なＣａｓ９タンパク質である。例示的なＳｐＣａｓ９タンパク質配列は、配列番号８（配列番号９に示されるＤＮＡ配列によってコードされる）に示される。例示的なＳｐＣａｓ９ｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）配列は、配列番号１０に示される。より小さなＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳａＣａｓ９及びＣｊＣａｓ９及びＮｍｅ２Ｃａｓ９などのＣａｓ９及びガイドＲＮＡのガイドＲＮＡコード配列及び調節エレメントと組み合わせた場合にそのコード配列が最大ＡＡＶパッケージング容量と互換性があるＣａｓ９タンパク質）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。同様に、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）由来のＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）例えば、（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｋｉｍｅｔａｌ．（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８：１４５００を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。ＳａＣａｓ９は、ＳｐＣａｓ９よりも小さく、ＣｊＣａｓ９は、ＳａＣａｓ９及びＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）由来のＣａｓ９（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、Ｅｄｒａｋｉｅｔａｌ．（２０１９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ７３（４）：７１４－７２６を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）由来のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座（Ｓｔ１Ｃａｓ９）によってコードされるストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）ＬＭＤ－９Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座（Ｓｔ３Ｃａｓ９）由来の（ストレプトコッカス・サーモフィルスＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）由来のＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）又は代替ＰＡＭを認識するＲＨＡフランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｃａｓ９バリアント（Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１４４９Ｈ／Ｒ１５５６Ａ置換）は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。これら及び他の例示的なＣａｓ９タンパク質は、例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ及びＤａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ２８（７）：２４７－２６１で概説されている。Ｃａｓ９コード配列、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びＣａｓ９タンパク質配列の例は、国際公開第２０１３／１７６７７２号、国際公開第２０１４／０６５５９６号、国際公開第２０１６／１０６１２１号、国際公開第２０１９／０６７９１０号、国際公開第２０２０／０８２０４２号、米国特許出願公開第２０２０／０２７０６１７号明細書、国際公開第２０２０／０８２０４１号、米国特許出願公開第２０２０／０２６８９０６号明細書、国際公開第２０２０／０８２０４６号及び米国特許出願公開第２０２０／０２８９６２８号明細書に提供されており、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＯＲＦ及びＣａｓ９アミノ酸配列の特定の例は、表３０の段落［０４４９］ＷＯ２０１９／０６７９１０に提供され、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びＯＲＦの特定の例は、ＷＯ２０１９／０６７９１０の段落［０２１４］～［０２３４］に提供される。国際公開第２０２０／０８２０４６号（８４～８５ページ）及び国際公開第２０２０／０６９２９６号の表２４も参照されたく、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例示的なＳｐＣａｓ９タンパク質配列は、配列番号１１に示される。ＳｐＣａｓ９タンパク質配列をコードする例示的なＳｐＣａｓ９ｍＲＮＡ配列は、配列番号３３９、３３８、又は１２に示される配列を含む。他の例示的なＳｐＣａｓ９オープンリーディングフレーム配列は、配列番号３３５～３３７（例えば、配列番号３３６）に示される。

【0118】

Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンに富むクラスターの対応物と共に含む大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかしながら、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、ＨＮＨドメインを含む長い挿入を含むＣａｓ９とは対照的に、ＲｕｖＣ様ドメインは、Ｃｐｆ１配列において隣接している。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅｅｔａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ１６３（３）：７５９－７７１を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、野兎病菌（Francisella tularensis 1）、野兎病菌亜種ノビシダ（Francisella tularensis subsp.novicida）、プレボテラ・アルベンシス（Prevotella albensis）、ラクノスピラ科細菌ＭＣ２０１７１（Lachnospiraceae bacterium MC2017 1）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Butyrivibrio proteoclasticus）、ペレグリニバクテリア細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０（Peregrinibacteria bacterium GW2011_GWA2_33_10）、パルクバクテリア細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７（Parcubacteria bacterium GW2011_GWC2_44_17）、スミセラ属ＳＣＡＤＣ（Smithella sp.SCADC）、アシダミノコッカス属ＢＶ３Ｌ６（Acidaminococcus sp.BV3L6）、ラクノスピラ科細菌ＭＡ２０２０（Lachnospiraceae bacterium MA2020）、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Candidatus Methanoplasma termitum）、ユーバクテリウム・エリゲンス細菌（Eubacterium eligens）、モラクセラ・ボーボクリ２３７（Moraxella bovoculi 237）、レプトスピラ・イナダイ（Leptospira inadai）、ラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６（Lachnospiraceae bacterium ND2006）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス３（Porphyromonas crevioricanis 3）、プレボテーラ・ディシエンス（Prevotella disiens）、及びポルフィロモナス・マカカエ（Porphyromonas macacae）に由来する。フランシセラ・ノビシダＵ１１２（Francisella novicida U112）由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１、割り当てられたＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ｑ７Ｑ２）は、例示的なＣｐｆ１タンパク質である。

【0119】

Ｃａｓタンパク質の別の例は、ＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅ）である。ＣａｓＸは、ＤＮＡ中にスタガード二本鎖切断を生成するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼである。ＣａｓＸは、１０００アミノ酸未満のサイズである。例示的なＣａｓＸタンパク質は、デルタプロテオバクテリア（Deltaproteobacteria）（ＤｐｂＣａｓＸ又はＤｐｂＣａｓ１２ｅ）及びプランクトミケス門（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）（ＰｌｍＣａｓＸ又はＰｌｍＣａｓ１２ｅ）由来である。Ｃｐｆ１と同様に、ＣａｓＸは、ＤＮＡ切断のために単一のＲｕｖＣ活性部位を使用する。例えば、Ｌｉｕｅｔａｌ．（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ５６６（７７４３）：２１８－２２３を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

【0120】

Ｃａｓタンパクの別の例は、ＣａｓΦ（ＣａｓＰｈｉ又はＣａｓ１２ｊ）であり、これはバクテリオファージに特有に見出される。ＣａｓΦは、１０００アミノ酸未満のサイズ（例えば、７００～８００アミノ酸）である。ＣａｓΦ切断は、互い違いの５’オーバーハングを生成する。ＣａｓΦにおける単一のＲｕｖＣ活性部位は、ｃｒＲＮＡプロセシング及びＤＮＡ切断が可能である。例えば、Ｐａｕｓｃｈｅｔａｌ．（２０２０）Ｓｃｉｅｎｃｅ３６９（６５０１）：３３３－３３７を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

【0121】

Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、本質的に発生するもの）、修飾Ｃａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質バリアント）、又は野生型若しくは修飾Ｃａｓタンパク質の断片であり得る。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型又は修飾Ｃａｓタンパク質の触媒活性に関して、活性なバリアント又は断片であり得る。触媒活性に関する活性なバリアント又は断片は、野生型又は修飾Ｃａｓタンパク質又はその一部に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を含み得、活性なバリアントは、所望の切断部位で切断する能力を保持し、したがってニック誘導又は二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導又は二本鎖切断誘導活性のアッセイは既知であり、一般に、切断部位を含むＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性及び特異性を測定する。

【0122】

改変されたＣａｓタンパク質の一例は、改変されたＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質であり、これは、非特異的ＤＮＡ接触を減らすように設計された改変（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）を有する化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９の忠実度の高い変異体である。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒｅｔａｌ．（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ５２９（７５８７）：４９０－４９５を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。修飾Ｃａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された修飾ｅＳｐＣａｓ９バリアント（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、Ｓｌａｙｍａｋｅｒｅｔａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。他のＳｐＣａｓ９バリアントには、Ｋ８５５Ａ及びＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが含まれる。これら及びその他の改変Ｃａｓタンパク質は、例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ及びＤａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ２８（７）：２４７－２６１で概説されている。修飾Ｃａｓ９タンパク質の別の例は、ｘＣａｓ９であり、これは拡大された範囲のＰＡＭ配列を認識することができるＳｐＣａｓ９バリアントである。例えば、Ｈｕｅｔａｌ．（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ５５６：５７－６３を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

【0123】

Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、及び酵素活性のうちの１つ以上を増加又は減少させるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質は、安定性など、タンパク質の他の活性又は特性を変更するように修飾することもできる。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ以上のヌクレアーゼドメインを修飾、欠失、又は不活性化することができ、又はＣａｓタンパク質を短縮して、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するか、又はＣａｓタンパク質の活性又は特性を最適化（例えば、増強又は低減）することができる。

【0124】

Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体立体配座で、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。同様に、ＣａｓＸ及びＣａｓΦは一般に、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断する単一のＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含み得る。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインは各々、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡに二本鎖切断を行うことができる。例えば、Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７（６０９６）：８１６－８２１を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

【0125】

ヌクレアーゼドメインの１つ以上又は全てを欠失又は変異させることで、それらがもはや機能しなくさせるか、又はヌクレアーゼ活性を低減させることができる。例えば、Ｃａｓ９タンパク質でヌクレアーゼドメインの１つが欠失又は変異している場合、結果として得られるＣａｓ９タンパク質はニッカーゼと呼ばれ、二本鎖標的ＤＮＡ内で一本鎖切断を生成できるが、二本鎖切断は生成できない（すなわち、相補的鎖又は非相補的鎖を切断できるが、両方を切断することはできない）。ヌクレアーゼドメインの両方が削除又は変異された場合、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌル又はヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質、又は触媒活性を伴わないＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ））を切断する能力が低減される。Ｃａｓ９タンパク質でヌクレアーゼドメインが欠失又は変異している場合、Ｃａｓ９タンパク質は二本鎖切断誘導活性を保持する。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、化膿レンサ球菌（S.pyogenes）由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の位置１０におけるアラニンからアスパラギン酸への）変異である。同様に、ストレプトコッカス・ピオゲネス（S.pyogenes）由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸位置８３９におけるヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸位置８４０におけるヒスチジンからアラニン）、又はＮ８６３Ａ（アミノ酸位置Ｎ８６３におけるアスパラギンからアラニン）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例としては、ストレプトコッカス・サーモフィラス（S.thermophilus）由来のＣａｓ９に対する対応する変異が挙げられる。例えば、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓｅｔａｌ．（２０１１）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３９（２１）：９２７５－９２８２及び国際公開第２０１３／１４１６８０号を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。このような変異は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ媒介変異誘発、又は全遺伝子合成などの方法を使用して生成することができる。ニッカーゼを生成する他の変異の例は、例えば、国際公開第２０１３／１７６７７２号及び国際公開第２０１３／１４２５７８号において見出すことができ、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヌクレアーゼドメインの全てがＣａｓタンパク質で削除又は変異された場合（例えば、ヌクレアーゼドメインの両方がＣａｓ９タンパク質で削除又は変異された場合）、得られたＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、二本鎖ＤＮＡの両方の鎖（例えば、ヌクレアーゼヌル又はヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質）を切断する能力が低減される。１つの特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）Ｃａｓ９二重変異体、又は化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。別の特定の例は、Ｄ１０Ａ／Ｎ８６３Ａ化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）Ｃａｓ９二重変異体、又は化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）Ｃａｓ９と最適にアラインされた場合の別の種からのＣａｓ９の対応する二重変異体である。

【0126】

ｘＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例は、ＳｐＣａｓ９について上に記載されるものと同じである。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である。例えば、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）のＣａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、Ｎ５８０位での置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）及びＤ１０位での置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含み得、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓタンパク質をもたらす。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２０１６／１０６２３６号を参照されたい。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている（例えば、Ｄ１６ＡとＨ５８８Ａとの組み合わせ）。Ｓｔ１Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ９Ａ、Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、及びＮ６２２Ａの組み合わせ）。Ｓｔ３Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｄ１０ＡとＮ８７０Ａとの組み合わせ）。ＣｊＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も知られている（例えば、Ｄ８ＡとＨ５５９Ａとの組み合わせ）。ＦｎＣａｓ９及びＲＨＡＦｎＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も既知である（例えば、Ｎ９９５Ａ）。

【0127】

Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメインにおける不活化変異の例も既知である。フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、アシダミノコッカス属（Acidaminococcus sp.）ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、及びモラクセラ・ボーボクリ（Moraxella bovoculi）２３７（ＭｂＣｐｆ１Ｃｐｆ１）由来のＣｐｆ１タンパク質に関して、そのような変異は、ＡｓＣｐｆ１の位置９０８、９９３又は１２６３あるいはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置、あるいはＬｂＣｐｆ１の位置８３２、９２５、９４７又は１１８０あるいはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置における変異を含むことができる。そのような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、及びＤ１２６３Ａ若しくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異、又はＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、及びＤ１１８０Ａ若しくはＣｐｆ１オルソログの対応する変異のうちの１つ以上を含み得る。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１６／０２０８２４３号を参照されたい。

【0128】

ＣａｓＸタンパク質の触媒ドメインにおける不活化変異の例も既知である。デルタプロテオバクテリア（Deltaproteobacteria）由来のＣａｓＸタンパク質に関して、Ｄ６７２Ａ、Ｅ７６９Ａ、及びＤ９３５Ａ（個々に又は組み合わせて）又は他のＣａｓＸオルソログにおける対応する位置は、不活性化されている。例えば、Ｌｉｕｅｔａｌ．（２０１９）Ｎａｔｕｒｅ５６６（７７４３）：２１８－２２３を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

【0129】

ＣａｓΦタンパク質の触媒ドメインにおける不活化変異の例も既知である。例えば、Ｄ３７１Ａ及びＤ３９４Ａは、単独で又は組み合わせて、不活性化変異である。例えば、Ｐａｕｓｃｈｅｔａｌ．（２０２０）Ｓｃｉｅｎｃｅ３６９（６５０１）：３３３－３３７を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

【0130】

Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、切断ドメイン、エピジェネティック修飾ドメイン、又は転写抑制因子ドメインに融合され得る。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／０８９２９０号を参照されたい。転写リプレッサードメインの例には、誘導性ｃＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ）ドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックスＡ（ＫＲＡＢ－Ａ）リプレッサードメイン、ＹＹ１グリシンリッチリプレッサードメイン、Ｓｐ１様リプレッサー、Ｅ（ｓｐｌ）リプレッサー、ΙκΒリプレッサー、及びＭｅＣＰ２が挙げられる。他の例には、Ａ／Ｂ、ＫＯＸ、ＴＧＦ－ベータ誘導性初期遺伝子（ＴＩＥＧ）、ｖ－ｅｒｂＡ、ＳＩＤ、ＳＩＤ４Ｘ、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＧ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｒｂ、ＲＯＭ２由来の転写抑制因子ドメインが挙げられる。例えば、ＥＰ３０４５５３７及び国際公開第２０１１／１４６１２１号を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれる。Ｃａｓタンパク質は、安定性の増加又は減少を提供する異種ポリペプチドに融合することもできる。融合ドメイン又は異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質の内部に位置し得る。

【0131】

一例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化を提供する１つ以上の異種ポリペプチドに融合され得る。そのような異種ポリペプチドは、例えば、核を標的とするための単一部分ＳＶ４０ＮＬＳ及び／又は二部分アルファインポーチンＮＬＳなどの１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを含んでもよい。例えば、Ｌａｎｇｅｅｔａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（８）：５１０１－５１０５を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。このような細胞内局在化シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこにでも位置することができる。ＮＬＳは、一続きの塩基性アミノ酸を含むことができ、単節型配列又は双節型配列であり得る。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端にＮＬＳ（例えば、アルファ－インポーチンＮＬＳ又は単節型ＮＬＳ）及びＣ末端にＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ＮＬＳ又は双節型ＮＬＳ）を含む２つ以上のＮＬＳを含み得る。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端に２つ以上のＮＬＳ及び／又はＣ末端に２つ以上のＮＬＳを含み得る。

【0132】

Ｃａｓタンパク質は、例えば、１～１０個のＮＬＳと融合され得る（例えば、１～５つのＮＬＳと融合されるか、１つのＮＬＳと融合され得る。１つのＮＬＳが使用される場合、ＮＬＳは、Ｃａｓタンパク質配列のＮ末端又はＣ末端で連結され得る。ＮＬＳはまた、Ｃａｓタンパク質配列内に挿入され得る。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、２つ以上のＮＬＳと融合され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、２、３、４、又は５つのＮＬＳと融合され得る。具体的な例では、Ｃａｓタンパク質は、２つのＮＬＳと融合され得る。特定の状況では、２つのＮＬＳは、同じ（例えば、２つのＳＶ４０ＮＬＳ）又は異なり得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、カルボキシ末端で連結された２つのＳＶ４０ＮＬＳ配列に融合され得る。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、２つのＮＬＳと融合され得、１つはＮ末端で、１つはＣ末端で連結されている。他の例では、Ｃａｓタンパク質は、３つのＮＬＳと融合され得るか、又はＮＬＳなしで融合され得る。ＮＬＳは、例えば、ＳＶ４０ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１３）又はＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号１４）などの単一部分配列であり得る。ＮＬＳは、ヌクレオプラスミンのＮＬＳ、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１５）などの二部分配列であり得る。特定の例では、単一のＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１３）ＮＬＳは、Ｃａｓタンパク質のＣ末端に連結され得る。１つ以上のリンカーは、任意選択的に融合部位に含まれる。

【0133】

Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメイン又はタンパク質導入ドメインに操作可能に連結することができる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルスからのＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルスからの細胞透過性ペプチド、又はポリアルギニンペプチド配列に由来し得る。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／０８９２９０及びＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこにでも位置することができる。

【0134】

Ｃａｓタンパク質はまた、追跡又は精製を容易にするために、蛍光タンパク質、精製タグ、又はエピトープタグなどの異種ポリペプチドに作動可能に連結してもよい。蛍光タンパク質の例には、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ、ＭｏｎｏｍｅｒｉｃＡｚａｍｉＧｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ＭｏｎｏｍｅｒｉｃＫｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）、及び任意の他の好適な蛍光タンパク質が挙げられる。タグの例には、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ１、Ｓｏｆｔａｇ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、及びカルモジュリンが含まれる。

【0135】

Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸に係留され得る。そのような係留（すなわち、物理的結合）は、共有相互作用若しくは非共有相互作用を介して達成することができ、係留は、直接（例えば、タンパク質又はインテイン修飾上のシステイン又はリジン残基の修飾によって達成することができる直接融合又は化学的結合を介して）、又はストレプトアビジン若しくはアプタマーなどの１つ以上の介在するリンカー又はアダプター分子を介して達成することができる。例えば、Ｐｉｅｒｃｅｅｔａｌ．（２００５）ＭｉｎｉＲｅｖ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５（１）：４１－５５；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈｅｔａｌ．（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（４６）：８８１９－８８２２；ＳｃｈａｅｆｆｅｒａｎｄＤｉｘｏｎ（２００９）ＡｕｓｔｒａｌｉａｎＪ．Ｃｈｅｍ．６２（１０）：１３２８－１３３２；Ｇｏｏｄｍａｎｅｔａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．１０（９）：１５５１－１５５７；及びＫｈａｔｗａｎｉｅｔａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０（１４）：４５３２－４５３９を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。タンパク質－核酸コンジュゲートを合成するための非共有戦略には、ビオチン－ストレプトアビジン及びニッケル－ヒスチジン法が含まれる。共有結合タンパク質－核酸コンジュゲートは、様々な化学物質を使用して適切に機能化された核酸とタンパク質を接続することによって合成できる。これらの化学物質のいくつかは、タンパク質表面のアミノ酸残基（例えば、リジンアミン又はシステインチオール）へのオリゴヌクレオチドの直接結合を含むが、他のより複雑なスキームは、タンパク質の翻訳後修飾又は触媒若しくは反応性タンパク質ドメインの関与を必要とする。タンパク質の核酸への共有結合の方法には、例えば、オリゴヌクレオチドのタンパク質リジン又はシステイン残基への化学的架橋、発現されたタンパク質ライゲーション、化学酵素的方法、及び光アプタマーの使用が含まれ得る。標識された核酸は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端、Ｎ末端、又は内部領域に係留され得る。一例では、標識された核酸は、Ｃａｓタンパク質のＣ末端又はＮ末端に係留される。同様に、Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸の５’末端、３’末端、又は内部領域に係留され得る。すなわち、標識された核酸は、任意の方向及び極性で係留され得る。例えば、Ｃａｓタンパク質は、標識された核酸の５’末端又は３’末端に係留され得る。

【0136】

Ｃａｓタンパク質は任意の形態で提供してもよい。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供することができる。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））又はＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供することができる。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞又は生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、又は任意の他の目的の宿主細胞においてより頻度高く使用される代替コドンへと修飾することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞に導入されると、Ｃａｓタンパク質は、一過性に、条件付きで、又は構成的に細胞内で発現され得る。

【0137】

Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、細胞のゲノムに安定して組み込まれ、細胞内で活性のあるプロモーターに作動可能に連結することができる。代替的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現構築物は、遺伝子又は他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在してもよい。代替的に、それは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別個のベクター又はプラスミドであってもよい。発現構築物において使用することができるプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであってよい。任意選択的に、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質と他の方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向プロモーターであり得る。かかる双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、及びＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向ＰｏｌＩＩＩプロモーター、並びに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌＩＩＩプロモーターで構成され得る。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥとＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。

【0138】

様々なプロモーターを使用して、Ｃａｓ発現又はＣａｓ９発現を駆動できる。いくつかの方法では、Ｃａｓ又はＣａｓ９コード配列がＡＡＶ構築物に適合することができるように小さなプロモーターが使用される。例えば、Ｃａｓ又はＣａｓ９及び１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、１つのｇＲＮＡ又は２つのｇＲＮＡ又は３つのｇＲＮＡ又は４つのｇＲＮＡ）は、ＬＮＰ媒介送達（例えば、ＲＮＡの形態）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達（例えば、ＡＡＶ２媒介送達、ＡＡＶ５媒介送達、ＡＡＶ８媒介送達又はＡＡＶ７ｍ８媒介送達）を介して送達することができる。例えば、ヌクレアーゼ剤は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であってもよく、内因性Ｃ５遺伝子座を標的とするＣａｓ９ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡは、ＬＮＰ媒介送達又はＡＡＶ媒介送達を介して送達され得る。Ｃａｓ又はＣａｓ９及びｇＲＮＡ（複数可）は、単一のＡＡＶにおいて、又は２つの別個のＡＡＶを介して送達され得る。例えば、第１のＡＡＶは、Ｃａｓ又はＣａｓ９発現カセットを担持することができ、第２のＡＡＶは、ｇＲＮＡ発現カセットを担持することができる。同様に、第１のＡＡＶは、Ｃａｓ又はＣａｓ９発現カセットを担持することができ、第２のＡＡＶは、２つ以上のｇＲＮＡ発現カセットを担持することができる。代替的に、単一のＡＡＶは、Ｃａｓ又はＣａｓ９発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたＣａｓ又はＣａｓ９コード配列）及びｇＲＮＡ発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたｇＲＮＡコード配列）を担持することができる。同様に、単一のＡＡＶは、Ｃａｓ又はＣａｓ９発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたＣａｓ又はＣａｓ９コード配列）及び２つ以上のｇＲＮＡ発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたｇＲＮＡコード配列）を担持することができる。Ｕ６プロモーター又はｓｍａｌｌｔＲＮＡＧｌｎなど、様々なプロモーターを使用してｇＲＮＡの発現を駆動することができる。同様に、Ｃａｓ９の発現を駆動するために様々なプロモーターを使用できる。例えば、Ｃａｓ９コード配列がＡＡＶ構築物に適合することができるように小さなプロモーターが使用される。同様に、小さなＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳａＣａｓ９又はＣｊＣａｓ９を使用して、ＡＡＶパッケージング容量を最大化する）。

【0139】

ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質は、安定性及び／又は免疫原性の特性を改善するために修飾することができる。修飾は、ｍＲＮＡ内の１つ以上のヌクレオシドに対して行われ得る。ｍＲＮＡ核酸塩基への化学修飾の例としては、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、及び５－メチル－シチジンが挙げられる。Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡはまたキャップされ得る。キャップは、例えば、＋１リボヌクレオチドがリボースの２’Ｏ位置でメチル化されているキャップ１構造であり得る。キャッピングは、例えば、インビボで優れた活性を与えることができ（例えば、天然のキャップを模倣することによって）、宿主の自然免疫系の刺激を低減する天然の構造をもたらすことができる（例えば、自然免疫系のパターン認識受容体の活性化を低減することができる）。Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、ポリアデニル化することもできる（ポリ（Ａ）テールを構成するため）。Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、シュードウリジンを含むように修飾することもできる（例えば、シュードウリジンで完全に置換することができる）。別の例として、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むキャップされポリアデニル化されたＣａｓｍＲＮＡを使用することができる。Ｃａｓタンパク質をコードするｍＲＮＡは、Ｎ１－メチル－シュードウリジン（例えば、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで完全に置換することができる）を含むように修飾することもできる。別の例として、シュードウリジンで完全に置換されたＣａｓｍＲＮＡを使用することができる（すなわち、全ての標準的なウラシル残基は、ウラシルが窒素－炭素ではなく炭素－炭素結合で結合しているウリジン異性体であるシュードウリジンで置換される）。別の例として、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで完全に置換されたＣａｓｍＲＮＡを使用することができる（すなわち、全ての標準ウラシル残基がＮ１－メチル－シュードウリジンで置換されている）。同様に、ＣａｓｍＲＮＡは、同義のコドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾することができる。例えば、シュードウリジンで完全に置換されたキャップ及びポリアデニル化されたＣａｓｍＲＮＡを使用することができる。例えば、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで完全に置換されたキャップ及びポリアデニル化されたＣａｓｍＲＮＡを使用することができる。

【0140】

ＣａｓｍＲＮＡは、少なくとも１つ、複数、又は全てのウリジン位置に修飾ウリジンを含むことができる。修飾ウリジンは、５位で修飾されたウリジンであり得る（例えば、ハロゲン、メチル、又はエチルで）。修飾ウリジンは、１位で修飾されたシュードウリジンであり得る（例えば、ハロゲン、メチル、又はエチルで）。修飾ウリジンは、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、又はそれらの組み合わせであり得る。いくつかの例では、修飾ウリジンは、５－メトキシウリジンである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、シュードウリジンである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、シュードウリジンとＮ１－メチル－シュードウリジンとの組み合わせである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、シュードウリジンと５－メトキシウリジンとの組み合わせである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチルシュードウリジンと５－メトキシウリジンとの組み合わせである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンとＮ１－メチル－シュードウリジンとの組み合わせである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、シュードウリジンと５－ヨードウリジンとの組み合わせである。いくつかの例では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンと５－メトキシウリジンとの組み合わせである。

【0141】

本明細書に開示されるＣａｓｍＲＮＡはまた、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、又はＣａｐ２などの５’キャップを含み得る。５’キャップは、一般に、５’－三リン酸を介して、ｍＲＮＡの５’から３’鎖の最初のヌクレオチドの５’位（すなわち、最初のキャップ近位ヌクレオチド）に連結された７－メチルグアニンリボヌクレオチド（例えば、ＡＲＣＡに関して更に修飾され得る）である。Ｃａｐ０では、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位ヌクレオチドのリボースは両方とも、２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１では、ｍＲＮＡの第１及び第２の転写ヌクレオチドのリボースは、それぞれ、２’－メトキシ及び２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ２では、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位ヌクレオチドのリボースは両方とも、２’－メトキシを含む。例えば、Ｋａｔｉｂａｈｅｔａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」１１１（３３）：１２０２５－３０及びＡｂｂａｓｅｔａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」１１４（１１）：Ｅ２１０６－Ｅ２１１５を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヒトｍＲＮＡなどの哺乳動物ｍＲＮＡを含むほとんどの内因性高等真核生物ｍＲＮＡは、Ｃａｐ１又はＣａｐ２を含む。Ｃａｐ１及びＣａｐ２とは異なるＣａｐ０及び他のキャップ構造は、ＩＦＩＴ－１及びＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素によって非自己として認識されるため、ヒトなどの哺乳動物では免疫原性であり得、Ｉ型インターフェロンを含むサイトカインレベルの上昇を引き起こす可能性がある。ＩＦＩＴ－１及びＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素もｅＩＦ４Ｅと競合して、ｍＲＮＡとＣａｐ１又はＣａｐ２以外のキャップとの結合を競合し、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する可能性がある。

【0142】

キャップは共転写で含めることができる。例えば、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＡＭ８０４５）は、グアニンリボヌクレオチドの５’位に連結された７－メチルグアニン３’－メトキシ－５’－三リン酸を含むキャップ類似体であり、開始時に転写物にインビトロで組み込むことができる。ＡＲＣＡは、最初のキャップ近位ヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるＣａｐ０キャップをもたらす。例えば、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉｅｔａｌ．（２００１）ＲＮＡ７：１４８６－１４９５を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

【0143】

ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１１３）又はＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１３３）を使用して、Ｃａｐ１構造を共転写的に提供する。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ及びＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧの３’－Ｏ－メチル化バージョンはまた、それぞれ、カタログ番号Ｎ－７４１３及びＮ－７４３３としてＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能である。

【0144】

代替的に、転写後にキャップをＲＮＡに追加することもできる。例えば、ワクシニアキャッピング酵素は、市販されており（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ２０８０Ｓ）、Ｄ１サブユニットによって提供されるＲＮＡトリホスファターゼ及びグアニリルトランスフェラーゼ活性と、Ｄ１２サブユニットによって提供されるグアニンメチルトランスフェラーゼを有する。したがって、Ｓ－アデノシルメチオニン及びＧＴＰの存在下で、ＲＮＡに７－メチルグアニンを付加してＣａｐ０を与えることができる。例えば、ＧｕｏａｎｄＭｏｓｓ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」８７：４０２３－４０２７ａｎｄＭａｏａｎｄＳｈｕｍａｎ（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２４４７２－２４４７９を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0145】

ＣａｓｍＲＮＡは、ポリアデニル化（ポリＡ又はポリ（Ａ）又はポリアデニン）テールを更に含むことができる。ポリＡテールは、例えば、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００のアデニン、及び任意選択的に最大３００のアデニンを含む。例えば、ポリＡテールは、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００のアデニンヌクレオチドを含むことができる。

【0146】

Ｃ．ガイドＲＮＡ
「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、かつＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、２つのセグメント：「ＤＮＡ標的化セグメント」（「ガイド配列」とも呼ばれる）及び「タンパク質結合セグメント」を含み得る。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの連続ストレッチなどの分子のセクション又は領域を含む。Ｃａｓ９のものなど、いくつかのｇＲＮＡは、「アクチベーターＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び「ターゲッターＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）の２つの別個のＲＮＡ分子を含み得る。他のｇＲＮＡは、「単一分子ｇＲＮＡ」、「単一ガイドＲＮＡ」又は「ｓｇＲＮＡ」とも呼ばれ得る単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）である。例えば、国際公開第２０１３／１７６７７２号、国際公開第２０１４／０６５５９６号、国際公開第２０１４／０８９２９０号、国際公開第２０１４／０９３６２２号、国際公開第２０１４／０９９７５０号、国際公開第２０１３／１４２５７８号及び国際公開第２０１４／１３１８３３号を参照されたく、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）又はｃｒＲＮＡとトランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組み合わせのいずれかを指す。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一ガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡ）として、又は２つの別個のＲＮＡ分子（二重ガイドＲＮＡ又はｄｇＲＮＡ）として関連付けることができる。例えば、Ｃａｓ９の場合、単一ガイドＲＮＡは、（例えば、リンカーを介して）ｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含み得る。例えば、Ｃｐｆ１及びＣａｓΦの場合、標的配列への結合を実現するために必要なのはｃｒＲＮＡだけである。「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡ及び単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。本明細書に開示されるいくつかの方法及び組成物では、Ｃ５ｇＲＮＡは、化膿性連鎖球菌（S.pyogenes）Ｃａｓ９ｇＲＮＡ又はその同等物である。本明細書に開示されるいくつかの方法及び組成物では、Ｃ５ｇＲＮＡは、黄色ブドウ球菌（S.aureus）Ｃａｓ９ｇＲＮＡ又はその同等物である。

【0147】

例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ」又は「ターゲッターＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡリピート」）分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ」又は「アクチベーターＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）、及びｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチの両方を含む。ＤＮＡ標的化セグメントの下流（３’）に位置するｃｒＲＮＡテール（例えば、化膿レンサ球菌（S.pyogenes）Ｃａｓ９と共に使用するために）の一例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号１６）又はＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号１７）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのいずれも、配列番号１６又は１７の５’末端に結合して、ｃｒＲＮＡを形成することができる。

【0148】

対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーター－ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドの区間を含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチと相補的であり、それをハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言われ得る。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、化膿レンサ球菌（S.pyogenes）Ｃａｓ９と共に使用するため）の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号１８）、ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１９）、又はＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号２０）を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。

【0149】

ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要とされる系では、ｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡは、ハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要なシステムでは、ｃｒＲＮＡはｇＲＮＡであってもよい。ｃｒＲＮＡは追加的に、標的ＤＮＡの相補的鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを提供する。細胞内での改変に使用する場合、所与のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に固有になるように設計することができる。例えば、Ｍａｌｉｅｔａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９（６１２１）：８２３－８２６；Ｊｉｎｅｋｅｔａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７（６０９６）：８１６－８２１；Ｈｗａｎｇｅｔａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２２７－２２９；Ｊｉａｎｇｅｔａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２３３－２３９；及びＣｏｎｇｅｔａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９（６１２１）：８１９－８２３を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0150】

所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、以下により詳細に記載されるように、標的ＤＮＡの相補的鎖上の配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対合）を介して配列特異的様式で標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は変化してもよく、ｇＲＮＡ及び標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。目的のｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように修飾され得る。天然に存在するｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及び生物に応じて異なるが、２１～４６ヌクレオチド長の２つの直接反復（ＤＲ）が隣接する、２１～７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含むことがよくある（例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１３１８３３号を参照されたい）。ストレプトコッカス・ピオゲネス（S.pyogenes）の場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、標的セグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、ハイブリダイズし、転じて、ｔｒａｃｒＲＮＡはＣａｓタンパク質に結合する。

【0151】

ＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、又は少なくとも約４０ヌクレオチドの長さを有し得る。そのようなＤＮＡ標的化セグメントは、例えば、約１２～約１００、約１２～約８０、約１２～約５０、約１２～約４０、約１２～約３０、約１２～約２５、又は約１２～約２０ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１５～約２５ヌクレオチド（例えば、約１７～約２０ヌクレオチド、又は約１７、１８、１９、若しくは２０ヌクレオチド）であり得る。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１６／００２４５２３号を参照されたい。ストレプトコッカス・ピオゲネス（S.pyogenes）由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、１６～２０ヌクレオチド長、又は１７～２０ヌクレオチド長である。黄色ブドウ球菌（S.aureus）由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、２１～２３ヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、典型的なＤＮＡ標的化セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチド長又は少なくとも１８ヌクレオチド長である。

【0152】

一例では、ＤＮＡ標的化セグメントは、約２０ヌクレオチドの長さであり得る。しかしながら、より短い配列及びより長い配列も標的化セグメントに使用することができる（例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５ヌクレオチドの長さなどの、１５～２５ヌクレオチドの長さ）。ＤＮＡ標的化セグメントと対応するガイドＲＮＡ標的配列との間の同一性の程度（又はＤＮＡ標的化セグメントとガイドＲＮＡ標的配列の他の鎖との間の相補性の程度）は、例えば、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％であり得る。ＤＮＡ標的化セグメント及び対応するガイドＲＮＡ標的配列には、１つ以上のミスマッチが含まれ得る。例えば、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント及び対応するガイドＲＮＡ標的配列には、１～４、１～３、１～２、１、２、３、又は４つのミスマッチが含まれ得る（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列の全長が、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０以上のヌクレオチドである）。例えば、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント及び対応するガイドＲＮＡ標的配列には、ガイドＲＮＡ標的配列の全長が、２０ヌクレオチドである、１～４、１～３、１～２、１、２、３、又は４つのミスマッチが含まれ得る。

【0153】

一例として、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列）を含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドと３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。

【0154】

一例として、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７、及び１１９のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列）を含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７、及び１１９のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７、及び１１９のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７、及び１１９のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７、及び１１９のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７、及び１１９のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７、及び１１９のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７、及び１１９のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドと３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。

【0155】

一例として、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列）を含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つに示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドと３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。

【0156】

一例として、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列）を含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５に示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号８５に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドと３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。

【0157】

一例として、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号９７に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメント（すなわち、ガイド配列）を含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号９７に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号９７に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号９７に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号９７に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号９７に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号９７に示される配列（ＤＮＡ標的セグメント）と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号９７に示される配列（ＤＮＡ標的化セグメント）の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の連続するヌクレオチドと３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下異なる配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＤＮＡ標的化セグメントを含むことができる。

【0158】

【表2-1】

【表2-2】

【表2-3】

【表2-4】

【表2-5】

【0159】

【表3-1】

【表3-2】

【表3-3】

【0160】

ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）であってもよく、様々な長さであってもよい。それらには、一次転写物又は処理された形態が含まれ得る。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡの一部として、又は２分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、又はそれ以上のヌクレオチド）の全て又は一部を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり得る。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、及び６５ヌクレオチドのバージョンが挙げられる。例えば、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａｅｔａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ４７１（７３４０）：６０２－６０７；国際公開第２０１４／０９３６６１号を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、及び＋８５バージョン内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９７，３５９号を参照されたい。

【0161】

ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の相補性パーセントは、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）であり得る。ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の相補性パーセントは、約２０個の連続するヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であり得る。一例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補的鎖の５’末端にある１４個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であってもよく、残りの部分にわたって０％まで低くてもよい。そのような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは、１４ヌクレオチド長であると見なされ得る。別の例として、ＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の相補性パーセントは、標的ＤＮＡの相補的鎖の５’末端にある７個の連続するヌクレオチドにわたって１００％であってもよく、残りの部分にわたって０％まで低くてもよい。このような場合、ＤＮＡ標的化セグメントは７ヌクレオチド長であると見なされ得る。いくつかのガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的化セグメント内の少なくとも１７ヌクレオチドがターゲットＤＮＡの相補的鎖に相補的である。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、２０ヌクレオチド長であってもよく、標的ＤＮＡの相補的鎖との１、２、又は３つのミスマッチを含むことができる。一例では、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に対応する相補的鎖（すなわち、ＰＡＭ配列の逆相補体）の領域に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの５’末端にあるか、又はミスマッチは、ＰＡＭ配列に対応する相補的鎖の領域から、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、若しくは１９塩基対離れている）。

【0162】

ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的な２つのヌクレオチドの区間を含むことができる。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。対象のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは結合したＣａｓタンパク質をＤＮＡ標的化セグメントを介して標的化ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。

【0163】

単一ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメント及び足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合又はＣａｓ結合配列）を含み得る。例えば、かかるガイドＲＮＡは、３’足場配列に結合された５’ＤＮＡ標的化セグメントを有することができる。例示的な足場配列（例えば、化膿レンサ球菌（S.pyogenes）Ｃａｓ９と共に使用するため）は、以下を含むか、本質的に以下からなるか、又は以下からなる。ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１；配列番号２１）；ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２；配列番号２２）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３；配列番号２３）；及びＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４；配列番号２４）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（バージョン５；配列番号２５）；ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（バージョン６；配列番号２６）；ＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ（バージョン７；配列番号２７）；又はＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン８；配列番号２８）。いくつかのガイドｓｇＲＮＡでは、バージョン６の４つの末端Ｕ残基が存在しない。いくつかのガイドｓｇＲＮＡでは、バージョン６の４つの末端Ｕ残基のうちの１つ、２つ、又は３つしか存在しない。本明細書に開示されるガイドＲＮＡ標的配列のいずれかを標的とするガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のいずれかに融合したガイドＲＮＡの５’末端のＤＮＡ標的化セグメントを含んでもよい。すなわち、本明細書に開示されるＤＮＡ標的化セグメントのうちのいずれかは、上記の足場配列のうちのいずれか１つの５’末端に結合して、単一ガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。

【0164】

ガイドＲＮＡは、追加の所望の特徴（例えば、改変若しくは調節された安定性、細胞内標的化、蛍光標識による追跡、タンパク質若しくはタンパク質複合体の結合部位など）を提供する改変又は配列を含むことができる。すなわち、ガイドＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオシド若しくはヌクレオチド、又は標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵ残基の代わりに、又はそれに加えて使用される１つ以上の非天然及び／若しくは天然に存在する成分若しくは構成を含むことができる。そのような修飾の例には、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質複合体による調節された安定性及び／又は調節されたアクセス可能性を可能にするため）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する修飾又は配列、追跡を提供する修飾又は配列（例えば、蛍光分子への直接結合、蛍光検出を容易にする部分への複合体化、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）の結合部位を提供する修飾又は配列、並びにそれらの組み合わせが挙げられる。修飾の他の例には、操作されたステムループ二重構造、操作されたバルジ領域、ステムループ二重構造の操作されたヘアピン３’、又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１５／０３７６５８６号を参照されたい。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域と最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される二重鎖内のヌクレオチドの対になっていない領域であり得る。バルジは、二重鎖の片側に、Ｘが任意のプリンであり、Ｙが反対側の鎖のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成できるヌクレオチドであってもよい５’－ＸＸＸＹ－３’、及び二重鎖の他方の側に対になっていないヌクレオチド領域を含むことができる。

【0165】

ガイドＲＮＡは、例えば、以下の１つ以上を含む修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドを含むことができる。（１）ホスホジエステル骨格結合において、非結合リン酸酸素の一方又は両方及び／若しくは結合リン酸酸素の１つ以上の改変又は置換（例示的な骨格修飾）、（２）リボース糖での２’ヒドロキシルの改変又は置換などのリボース糖の構成要素の改変又は置換（例示的な糖修飾）、（３）リン酸部分のデホスホリンカーによる置換（例えば、大規模な置換）（例示的な骨格修飾）、（４）非基準核酸塩基を含む天然に存在する核酸塩基の修飾又は置換（例示的な塩基修飾）、（５）リボース－リン酸骨格の置換又は修飾（例示的な骨格修飾）、（６）オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端の修飾（例えば、末端リン酸基の除去、修飾、若しくは置換、又は部分、キャップ、若しくはリンカーの複合（かかる３’又は５’キャップ修飾は、糖及び／又は骨格修飾を含み得る）、及び（７）糖の修飾又は置換（例示的な糖修飾）。他の可能なガイドＲＮＡ修飾には、ウラシル又はポリ－ウラシルトラクトの修飾又は置換が含まれる。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／０４８５７７号及び米国特許第２０１６／０２３７４５５号を参照されたい。同様の修飾を、ＣａｓｍＲＮＡなどのＣａｓコード核酸に行うことができる。例えば、ＣａｓｍＲＮＡは、同義のコドンを使用してウリジンを枯渇させることによって修飾することができる。

【0166】

上記のホースでのような化学修飾を組み合わせて、２、３、４、又はそれ以上の修飾を有することができる残基（ヌクレオシド及びヌクレオチド）を含む修飾ｇＲＮＡ及び／又はｍＲＮＡを提供することができる。例えば、修飾残基は、修飾された糖及び修飾された核酸塩基を有することができる。一例では、ｇＲＮＡの全ての塩基が修飾されている（例えば、全ての塩基は、ホスホロチオエート基などの修飾されたリン酸基を有する）。例えば、ｇＲＮＡの全て又は実質的に全てのリン酸基をホスホロチオエート基で置換することができる。代替的又は追加的に、修飾ｇＲＮＡは、５’末端又はその近くに少なくとも１つの修飾残基を含むことができる。代替的又は追加的に、修飾ｇＲＮＡは、３’末端又はその近くに少なくとも１つの修飾残基を含み得る。

【0167】

いくつかのｇＲＮＡは、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の修飾残基を含む。例えば、修飾ｇＲＮＡにおける少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は１００％の位置は、修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドであり得る。

【0168】

修飾されていない核酸は分解されやすい可能性がある。外因性核酸はまた、自然免疫応答を誘導し得る。修飾は、安定性を導入し、免疫原性を低減するのに役立ち得る。本明細書に記載のいくつかのｇＲＮＡは、細胞内又は血清ベースのヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシド又はヌクレオチドを含むことができる。本明細書に記載されているいくつかの修飾ｇＲＮＡは、細胞の集団に導入された場合、自然免疫応答の低減を示す可能性がある。

【0169】

本明細書に開示されるｇＲＮＡは、修飾残基のリン酸基が、１つ以上の酸素を異なる置換基で置換することによって修飾され得る骨格修飾を含むことができる。修飾は、本明細書に記載されるように、修飾されていないリン酸部分を修飾されたリン酸基で大規模に置換することを含み得る。リン酸骨格の骨格修飾には、非荷電リンカー又は非対称電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかをもたらす変化も含まれ得る。

【0170】

修飾されたリン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレン酸、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びホスホトリエステルが挙げられる。修飾されていないリン酸基のリン原子は、アキラル性である。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つを上記の原子又は原子の基のうちの１つに置換すると、リン原子がキラルになる可能性がある。立体中心のリン原子は、「Ｒ」配置（Ｒｐ）又は「Ｓ」配置（Ｓｐ）のいずれかを有することができる。骨格は、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに結合する酸素）を、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）で置換することによっても修飾することができる。置換は、結合酸素又は結合酸素の両方で生じる可能性がある。

【0171】

リン酸基は、特定の骨格修飾でリンを含まないコネクタに置換することができる。いくつかの実施形態では、荷電リン酸基は、中性部分によって置換することができる。リン酸基を置換することができる部分の例としては、例えば、メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルマセタール、ホルマセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノが挙げられるが、これらに限定されない。

【0172】

核酸を模倣することができる足場はまた、リン酸リンカー及びリボース糖がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド又はヌクレオチド代用物によって置換させるように構築され得る。そのような修飾は、骨格及び糖修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、代理骨格によってつながれ得る。例としては、モルフォリノ、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代用物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0173】

修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、糖基への１つ以上の修飾（糖修飾）を含むことができる。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）を修飾することができる（例えば、いくつかの異なるオキシ又はデオキシ置換基で置換することができる）。２’－アルコキシドイオンを形成するためにヒドロキシルを脱プロトン化することができなくなるため、２’ヒドロキシル基への修飾は核酸の安定性を高めることができる。

【0174】

２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシ又はアリールオキシ（又は、「Ｒ」は、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であり得る）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＲが挙げられ、式中、Ｒは、例えば、Ｈ又は任意選択的に置換されたアルキルであり得、ｎは、０～２０（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、及び４～２０）の整数であり得る。２’ヒドロキシル基修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅであり得る。同様に、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－フルオロ修飾であり得、これは２’ヒドロキシル基をフッ化物で置き換える。２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが、例えば、Ｃ_１－６アルキレン又はＣ_１－６ヘテロアルキレンブリッジによって、同じリボース糖の４’炭素に接続され得るロックされた核酸（ＬＮＡ）を含み得、例示的なブリッジは、メチレン、プロピレン、エーテル又はアミノブリッジ；Ｏ－アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン又はポリアミノであり得る）及びアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ－アミノ、（アミノは、例えば、ＮＨ_２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、又はポリアミノであり得る）を含み得る。２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’－Ｃ３’結合を欠いているアンロックされた核酸（ＵＮＡ）を含み得る。２’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、例えば、ＰＥＧ誘導体）を含み得る。

【0175】

デオキシ２’修飾には、水素（すなわち、例えば、部分的にｄｓＲＮＡのオーバーハング部分にあるデオキシリボース糖）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ又はヨード）、アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸であり得る）、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２－アミノ（アミノは、例えば、本明細書に記載されるように）、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール又は糖であり得る）、シアノメルカプト、アルキル－チオ－アルキル、チオアルコキシ、並びにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを含み得、これらは、任意選択的に、例えば、本明細書に記載のアミノで置換することができる。

【0176】

糖修飾は、リボース中の対応する炭素とは反対の立体化学的配置を有する１つ以上の炭素を含み得る糖基を含むことができる。したがって、修飾核酸は、糖として、例えば、アラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。修飾核酸はまた、脱塩基糖を含み得る。これらの脱塩基糖はまた、構成糖原子のうちの１つ以上で更に修飾することができる。修飾核酸はまた、Ｌ型である１つ以上の糖（例えば、Ｌ－ヌクレオシド）を含み得る。

【0177】

修飾核酸に組み込むことができる、本明細書に記載の修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含み得る。核酸塩基の例としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾核酸に組み込むことができる修飾残基を提供するために修飾され得るか、又は完全に置換され得る。ヌクレオチドの核酸塩基は、独立して、プリン、ピリミジン、プリン類似体、又はピリミジン類似体から選択することができる。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、例えば、塩基の天然に存在する合成誘導体を含むことができる。

【0178】

二重ガイドＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの各々に修飾を含めることができる。このような修飾は、ｃｒＲＮＡ及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡの一端又は両端にあり得る。ｓｇＲＮＡでは、ｓｇＲＮＡの一端又は両端の１つ以上の残基が化学的に修飾されているか、かつ／又は内部ヌクレオシドが修飾されているか、かつ／又はｓｇＲＮＡ全体が化学的に修飾されている可能性がある。いくつかのｇＲＮＡは、５’末端修飾を含む。いくつかのｇＲＮＡは、３’末端修飾を含む。

【0179】

本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１８／１０７０２８Ａｌに開示される修飾パターンのうちの１つを含むことができる。本明細書に開示されるガイドＲＮＡはまた、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１７／０１１４３３４に開示される構造／修飾パターンのうちの１つを含むことができる。本明細書に開示されるガイドＲＮＡはまた、全ての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１７／１３６７９４、ＷＯ２０１７／００４２７９、ＵＳ２０１８／０１８７１８６、又はＵＳ２０１９／００４８３３８に開示される構造／修飾パターンのうちの１つを含むことができる。

【0180】

一例として、ガイドＲＮＡの５’又は３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含むことができる（例えば、塩基は、ホスホロチオアート基である修飾されたリン酸基を有することができる）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’又は３’末端の２、３、又は４つの末端ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み得る。別の例として、ガイドＲＮＡの５’及び／又は３’末端のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル修飾を有し得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’及び／又は３’末端（例えば、５’末端）の２、３、又は４つの末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル修飾を含み得る。例えば、国際公開第２０１７／１７３０５４号及びＦｉｎｎｅｔａｌ．（２０１８）ＣｅｌｌＲｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。他の可能な修飾は、本明細書の他の場所でより詳細に記載される。特定の例では、ガイドＲＮＡには、最初の３つの５’及び３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体及び３’ホスホロチオエートヌクレオチド間結合が含まれる。かかる化学修飾は、例えば、エキソヌクレアーゼからガイドＲＮＡへのより優れた安定性及び保護を提供し、それらが修飾されていないガイドＲＮＡよりも長く細胞内に持続することを可能にする。かかる化学修飾はまた、例えば、ＲＮＡを積極的に分解し得るか又は細胞死につながる免疫カスケードを引き起こし得る自然細胞内免疫応答から保護することもできる。

【0181】

一例として、本明細書に記載のガイドＲＮＡのいずれも、少なくとも１つの修飾を含むことができる。一例では、少なくとも１つの修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含む。例えば、少なくとも１つの修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むことができる。代替的又は追加的に、少なくとも１つの修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含むことができる。代替的又は追加的に、少なくとも１つの修飾は、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含むことができる。一例では、本明細書に記載のガイドＲＮＡは、１つ以上の２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド間の１つ以上のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。

【0182】

修飾は、ガイドＲＮＡの任意の場所に生じ得る。一例として、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾を含み、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の５つのヌクレオチドのうちの１つ以上での修飾、又はそれらの組み合わせを含む。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの最初の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、ガイドＲＮＡの最後の４つのヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、又はそれらの組み合わせを含むことができる。代替的又は追加的に、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’末端の最初の３つのヌクレオチドでの２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチドを含むことができ、ガイドＲＮＡの３’末端の最後の３つのヌクレオチドでの２’－Ｏ－Ｍｅ修飾ヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを含むことができる。

【0183】

一例では、修飾ｇＲＮＡは、以下の配列：ｍＮ^＊ｍＮ^＊ｍＮ^＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ^＊ｍＵ^＊ｍＵ^＊ｍＵ（配列番号２９）を含み得、ここで、「Ｎ」は、任意の天然又は非天然ヌクレオチドであってもよく、Ｎ残基の全体が、本明細書に記載されるＣ５ＤＮＡ標的化セグメント（例えば、配列番号２９に示される配列）を含み、Ｎ残基は、配列番号３３～１２０のうちのいずれか１つのＤＮＡ標的化セグメントで置き換えられる。別の例では、修飾ｇＲＮＡは、以下の配列：ｍＮ^＊ｍＮ^＊ｍＮ^＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ^＊ｍＵ^＊ｍＵ^＊ｍＵ（配列番号２９）を含み得、ここで、「Ｎ」は、任意の天然又は非天然ヌクレオチドであってもよく、Ｎ残基の全体が、本明細書に記載されるＣ５ＤＮＡ標的化セグメント（例えば、配列番号２９に示される配列）を含み、Ｎ残基は、配列番号６０、６５、６７、８２、８５、８７、９７、及び１１９のうちのいずれか１つのＤＮＡ標的化セグメントで置き換えられる。別の例では、修飾ｇＲＮＡは、以下の配列：ｍＮ^＊ｍＮ^＊ｍＮ^＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ^＊ｍＵ^＊ｍＵ^＊ｍＵ（配列番号２９）を含み得、ここで、「Ｎ」は、任意の天然又は非天然ヌクレオチドであってもよく、Ｎ残基の全体が、本明細書に記載されるＣ５ＤＮＡ標的化セグメント（例えば、配列番号２９に示される配列）を含み、Ｎ残基は、配列番号８５及び９７のうちのいずれか１つのＤＮＡ標的化セグメントで置き換えられる。別の例では、修飾ｇＲＮＡは、以下の配列：ｍＮ^＊ｍＮ^＊ｍＮ^＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ^＊ｍＵ^＊ｍＵ^＊ｍＵ（配列番号２９）を含み得、ここで、「Ｎ」は、任意の天然又は非天然ヌクレオチドであってもよく、Ｎ残基の全体が、本明細書に記載されるＣ５ＤＮＡ標的化セグメント（例えば、配列番号２９に示される配列）を含み、Ｎ残基は、配列番号８５のＤＮＡ標的化セグメントで置き換えられる。別の例では、修飾ｇＲＮＡは、以下の配列：ｍＮ^＊ｍＮ^＊ｍＮ^＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ^＊ｍＵ^＊ｍＵ^＊ｍＵ（配列番号２９）を含み得、ここで、「Ｎ」は、任意の天然又は非天然ヌクレオチドであってもよく、Ｎ残基の全体が、本明細書に記載されるＣ５ＤＮＡ標的化セグメント（例えば、配列番号２９に示される配列）を含み、Ｎ残基は、配列番号９７のＤＮＡ標的化セグメントで置き換えられる。「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、及び「ｍＧ」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅで修飾されたヌクレオチド（それぞれ、Ａ、Ｃ、Ｕ、及びＧ）を示す。「^＊」という記号は、ホスホロチオエート修飾を示す。ホスホロチオエート連結又は結合は、ホスホジエステル結合、例えばヌクレオチド塩基間の結合において、硫黄が１つの非架橋リン酸酸素の代わりに使用される結合を指す。ホスホロチオエートを使用してオリゴヌクレオチドを生成する場合、修飾オリゴヌクレオチドはＳ－オリゴと呼ばれることもあり得る。Ａ^＊、Ｃ^＊、Ｕ^＊又はＧ^＊という用語は、ホスホロチオエート結合で次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結されるヌクレオチドを示す。「ｍＡ^＊」、「ｍＣ^＊」、「ｍＵ^＊」及び「ｍＧ^＊」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅ置換され、ホスホロチオエート結合で次の（例えば、３’）ヌクレオチドに連結されるヌクレオチド（それぞれＡ、Ｃ、Ｕ、及びＧ）を示す。

【0184】

ヌクレオチド糖環に影響を与えることが示されている他の化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環の２’－フルオロ（２’－Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性及びヌクレアーゼ安定性を高めることができる。脱塩基ヌクレオチドとは、窒素塩基を欠くヌクレオチドを指す。反転した塩基とは、通常の５’から３’への結合（すなわち、５’から５’への結合又は３’から３’への結合）から反転した結合を有するものを指す。

【0185】

脱塩基ヌクレオチドは、逆結合で結合することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’から５’への結合を介して末端５’ヌクレオチドに結合され得るか、又は脱塩基ヌクレオチドは、３’から３’への結合を介して末端３’ヌクレオチドに結合され得る。末端の５’又は３’ヌクレオチドのいずれかにある逆脱塩基ヌクレオチドは、逆脱塩基エンドキャップと呼ばれることもあり得る。

【0186】

一例では、５’末端の最初の３、４、又は５ヌクレオチドのうちの１つ以上、及び３’末端の最後の３、４、又は５ヌクレオチドのうちの１つ以上が修飾されている。修飾は、例えば、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、逆塩基性ヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、又は安定性及び／又は性能を高めることがよく知られている他のヌクレオチド修飾であり得る。

【0187】

別の例では、５’末端の最初の４ヌクレオチド、及び３’末端の最後の４ヌクレオチドをホスホロチオエート結合で連結することができる。

【0188】

別の例では、５’末端の最初の３つのヌクレオチド、及び３’末端の最後の３つのヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含むことができる。別の例では、５’末端の最初の３つのヌクレオチド、及び３’末端の最後の３つのヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。別の例では、５’末端の最初の３つのヌクレオチド、及び３’末端の最後の３つのヌクレオチドは、逆塩基性ヌクレオチドを含む。

【0189】

ガイドＲＮＡはどのような形態で提供してもよい。例えば、ｇＲＮＡは、２つの分子（別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）又は１つの分子（ｓｇＲＮＡ）のいずれかとしてＲＮＡの形態で、及び任意にＣａｓタンパク質との複合体の形態で提供され得る。ｇＲＮＡはまた、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）又は別個のＲＮＡ分子（例えば、別個のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードすることができる。後者の場合、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、１つのＤＮＡ分子として、又はそれぞれｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別個のＤＮＡ分子として提供してもよい。

【0190】

ｇＲＮＡがＤＮＡの形態で提供される場合、ｇＲＮＡは一過性、条件付き、又は構成的に細胞内で発現してもよい。ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞のゲノムにおいて安定して組み込まれ、細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、発現構築物中のプロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸などの異種核酸を含むベクター内にあり得る。代替的に、それは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含むベクターとは別個のベクター又はプラスミドであり得る。そのような発現構築物において使用され得るプロモーターには、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発達的に制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであってよい。かかるプロモーターはまた、例えば、双方向プロモーターであり得る。好適なプロモーターの特定の例には、ヒトＵ６プロモーター、ラットＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、又はマウスＵ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが含まれる。

【0191】

代替的に、ｇＲＮＡは、他の様々な方法で調製され得る。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって調製することができる（例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／０８９２９０及び国際公開第２０１４／０６５５９６号を参照されたい）。ガイドＲＮＡはまた、化学的合成によって調製された合成的に生成された分子であり得る。例えば、ガイドＲＮＡを化学的に合成して、最初の３つの５’及び３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体及び３’ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含むことができる。

【0192】

ガイドＲＮＡ（又はガイドＲＮＡをコードする核酸）は、１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、１、２、３、４、又はそれ以上のガイドＲＮＡ）と、ガイドＲＮＡの安定性を増加させる（例えば、所定の保存条件下（例えば、－２０℃、４℃、又は周囲温度）で、分解産物が閾値未満、例えば出発核酸又はタンパク質の０．５重量％未満のままである期間を延長する、あるいはインビボでの安定性を増加させる）担体と、を含む組成物であり得る。そのような担体の非限定的な例には、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（cochleates）、及び脂質微小管が挙げられる。かかる組成物は、Ｃａｓ９タンパク質などのＣａｓタンパク質、又はＣａｓタンパク質をコードする核酸を更に含み得る。

【0193】

一例として、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９７～３１２及び３１６～３３１のうちのいずれか１つに示される配列を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９７～３１２及び３１６～３３１のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ標的化セグメントに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９７～３１２及び３１６～３３１のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ標的化セグメントに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９７～３１２及び３１６～３３１のうちのいずれか１つに示される配列と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下だけ異なる配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。

【0194】

一例として、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９７～３０４及び３１６～３２３のうちのいずれか１つに示される配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９７～３０４及び３１６～３２３のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ標的化セグメントに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９７～３０４及び３１６～３２３のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ標的化セグメントに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９７～３０４及び３１６～３２３のうちのいずれか１つに示される配列と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下だけ異なる配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。

【0195】

一例として、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９９、３０１、３１８、及び３２０のうちのいずれか１つに示される配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９９、３０１、３１８、及び３２０のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ標的化セグメントに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９９、３０１、３１８、及び３２０のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ標的化セグメントに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９９、３０１、３１８、及び３２０のうちのいずれか１つに示される配列と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下だけ異なる配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。

【0196】

一例として、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９９及び３０１のうちのいずれか１つに示される配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９９及び３０１のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ標的化セグメントに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９９及び３０１のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ標的化セグメントに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号２９９及び３０１のうちのいずれか１つに示される配列と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下だけ異なる配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。

【0197】

一例として、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１８及び３２０のうちのいずれか１つに示される配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１８及び３２０のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ標的化セグメントに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１８及び３２０のうちのいずれか１つに示されるＤＮＡ標的化セグメントに対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一である配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。代替的に、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、配列番号３１８及び３２０のうちのいずれか１つに示される配列と３ヌクレオチド以下、２ヌクレオチド以下、又は１ヌクレオチド以下だけ異なる配列を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。

【0198】

Ｄ．ガイドＲＮＡ標的配列
ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合に十分な条件が存在する場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当技術分野で公知である（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄＥｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ２００１）を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。ｇＲＮＡに相補的であり、かつそれとハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は、「相補的鎖」と呼ばれることができ、「相補的鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補的鎖」又は「テンプレート鎖」と呼ばれることができる。

【0199】

標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補的鎖上の配列と非相補的鎖上の対応する配列（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）の両方を含む。本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、具体的には、特に、ガイドＲＮＡが相補鎖上でハイブリダイズする配列に対応する（すなわち、その逆相補体）非相補鎖上の配列を指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接する非相補的鎖上の配列（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭの上流又は５’）を指す。ガイドＲＮＡ標的配列は、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと同等であるが、ウラシルの代わりにチミンを含む。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のガイドＲＮＡ標的配列は、非相補的鎖上の５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭの上流の配列を指し得る。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補的鎖に対して相補性を有するように設計されており、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントと標的ＤＮＡの相補的鎖との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡが本明細書でガイドＲＮＡ標的配列を標的とするものとして言及される場合、それは、ガイドＲＮＡが、非相補的鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補体である標的ＤＮＡの相補的鎖配列にハイブリダイズすることを意味する。

【0200】

標的ＤＮＡ又はガイドＲＮＡ標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含み得、例えば、細胞の核又は細胞質内、あるいはミトコンドリア又は葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置し得る。標的ＤＮＡ又はガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性又は外因性の任意の核酸配列であり得る。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列又は非コード配列（例えば、制御性配列）であり得るか、又は両方を含み得る。

【0201】

Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合及び切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの相補的鎖との間の塩基対合相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡの非相補的鎖にある、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で起こり得る。ＰＡＭは、ガイドＲＮＡ標的配列に隣接し得る。任意選択的に、ガイドＲＮＡ標的配列は、３’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃａｓ９の場合）。代替的に、ガイドＲＮＡ標的配列は、５’末端でＰＡＭが隣接し得る（例えば、Ｃｐｆ１の場合）。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流又は下流（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列内）の約１～約１０又は約２～約５塩基対（例えば、３塩基対）であり得る。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（すなわち、非相補的鎖上）は、５’－Ｎ_１ＧＧ－３’であり得、Ｎ_１は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補的鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の３’のすぐ近くである。したがって、相補的鎖上のＰＡＭに対応する（すなわち、逆相補体）配列は、５’－ＣＣＮ_２－３’であり、Ｎ_２は、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが標的ＤＮＡの相補的鎖にハイブリダイズする配列の５’のすぐ近くである。いくつかのそのような場合、Ｎ_１及びＮ_２は、相補的であることができ、Ｎ_１～Ｎ_２塩基対は、任意の塩基対であり得る（例えば、Ｎ_１＝Ｃ及びＮ_２＝Ｇ、Ｎ_１＝Ｇ及びＮ_２＝Ｃ、Ｎ_１＝Ａ及びＮ_２＝Ｔ、又はＮ_１＝Ｔ及びＮ_２＝Ａ）。黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴ又はＮＮＧＲＲであってもよく、ここでＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴであってもよく、Ｒは、Ｇ又はＡであってもよい。カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣ又はＮＮＮＮＲＹＡＣであってもよく、ここでＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴであってもよく、Ｒは、Ｇ又はＡであってもよい。いくつかの場合（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）、ＰＡＭ配列は、５’末端の上流であってもよく、配列５’－ＴＴＮ－３’を有することができる。ＤｐｂＣａｓＸの場合、ＰＡＭは、配列５’－ＴＴＣＮ－３’を有し得る。ＣａｓΦの場合、ＰＡＭは配列５’－ＴＢＮ－３’（式中、ＢはＧ、Ｔ、又はＣである）を有し得る。

【0202】

ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの２つの例は、ＧＮ_１９ＮＧＧ（配列番号３０）又はＮ_２０ＮＧＧ（配列番号３１）である。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１６５８２５号を参照されたい。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭの他の例は、５’末端に２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ_２０ＮＧＧ；配列番号３２）を含んで、インビトロで、Ｔ７ポリメラーゼによる効率的な転写を容易にし得る。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／０６５５９６号を参照されたい。他のガイドＲＮＡ標的配列及びＰＡＭは、４～２２ヌクレオチド長の、配列番号３０～３２（５’Ｇ又はＧＧ及び３’ＧＧ又はＮＧＧを含む）を有し得る。更に他のガイドＲＮＡ標的配列＋ＰＡＭは、１４～２０ヌクレオチド長の、配列番号３０～３２を有し得る。

【0203】

標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列（すなわち、標的ＤＮＡの非相補的鎖上のガイドＲＮＡ標的配列及びガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補的鎖上の逆相補体）に対応する領域内又は領域の近くの標的ＤＮＡの一方又は両方の鎖の切断をもたらし得る。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列内にあり得る（例えば、ＰＡＭ配列に対して定義された位置に）。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断又は二本鎖切断を生成する標的ＤＮＡの位置を含む。切断部位は、一本鎖のみ（例えば、ニッカーゼが使用される場合）又は二本鎖ＤＮＡの両方の鎖上にあり得る。切断部位は、両方の鎖の同じ位置（平滑末端を生成する、例えば、Ｃａｓ９）にあってもよく、又は各鎖の異なる部位（付着末端（すなわち、オーバーハング）を生成する、例えば、Ｃｐｆ１）にあってもよい。千鳥状の末端は、例えば、各々が異なる鎖上の異なる切断部位で一本鎖切断を生成し、それによって二本鎖切断を生成する２つのＣａｓタンパク質を使用することによって生成され得る。例えば、第１のニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖上に一本鎖切断を作成することができ、第２のニッカーゼは、オーバーハング配列が作成されるようにｄｓＤＮＡの第２の鎖上に一本鎖切断を作成することができる。場合によっては、第１の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列又は切断部位は、第２の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列又は切断部位から、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、又は１，０００塩基対離れている。

【0204】

ヒトＣ５遺伝子などのＣ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子の任意の所望の位置を標的とすることができる。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子の任意の連続する配列を含むことができる。Ｃ５遺伝子という用語は、Ｃ５調節プロモーター及びエンハンサー配列並びにコード配列を含むゲノム領域を含む。ガイドＲＮＡ標的配列は、コード配列、非コード配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー領域などの調節エレメント）、又はそれらの組み合わせを含むことができる。一例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、エキソンをコードする任意のＣ５のいずれかの連続するコード配列を含むことができる。一例では、ガイドＲＮＡ標的配列は、この領域がアナフィラトキシンＣ５ａをコードするので、コードエキソン１６及び１７にはない。一例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン４にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン５にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン６にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン７にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン８にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン９にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１０にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１１にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１２にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１３にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１４にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１５にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１６にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１７にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１８にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１９にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２０にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２１にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２２にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２３にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２４にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２５にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２６にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２７にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２８にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２９にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３０にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３１にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３２にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３３にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３４にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３５にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３６にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３７にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３８にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３９にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン４０にあり得る。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子のコードエキソン４１にあり得る。ガイドＲＮＡ標的配列（例えば、少なくとも１つのヌクレオチド）の少なくとも一部がコードエキソンＸ内にある場合、ガイドＲＮＡ標的配列はコードエキソンＸ内にある。

【0205】

特定の例において、ガイドＲＮＡ標的配列は、コードエキソン１、１２、１５、２１、２２、又は２７中にあり得る。別の具体的な例では、ガイドＲＮＡ標的配列は、コードエキソン１２又は１５内にあり得る。

【0206】

ガイドＲＮＡ標的配列は、対応するＣａｓタンパク質による切断が、機能喪失対立遺伝子をもたらすフレームシフト挿入／欠失（インデル）突然変異をもたらすように、Ｃ５遺伝子のコード領域を標的とするように選択することができる。インデルは、標的核酸の二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位で挿入又は欠失されるかのいずれかのヌクレオチドからなる挿入／欠失突然変異を指す。そのようなフレームシフト変異は、標的化ＤＮＡ二本鎖切断、及びそれに続く非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した変異原性修復によって達成することができ、これにより、切断部位にインデルが生成される。ＤＳＢに導入されているインデルはランダムであり、一部のインデルはＣ５遺伝子の早期終了を引き起こすフレームシフト変異をもたらす。別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、対応するＣａｓタンパク質による切断がプロモーター領域又はエンハンサー領域の破壊をもたらすように、Ｃ５遺伝子のプロモーター領域又はエンハンサー領域内にあり得る。そのようなフレームシフト変異は、標的化ＤＮＡ二本鎖切断、及びそれに続く非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した変異原性修復によって達成することができ、これにより、切断部位にインデルが生成される。

【0207】

ガイドＲＮＡ標的配列は、Ｃ５遺伝子の構成的エキソン内にあり得る。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列は、５’構成的エキソン内にあり得る。構成的エキソンは、スプライシング後に一貫して保存されているコードエキソンである。Ｃ５遺伝子が発現される全ての組織にわたって発現されるエキソンは、ｇＲＮＡ標的化の構成的エキソンと見なされ得る。いくつかの例では、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、選択的スプライシング部位を含有するいずれのエキソンも標的としない。単一のＣ５コード転写物のみが存在するので、Ｃ５の４１個のコードエキソン全てが構成的であると考えられる。

【0208】

別の例として、ガイドＲＮＡ標的配列は、開始コドンの約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、若しくは約１，０００ヌクレオチド以内であり得るか、又は開始コドンを含み得る。

【0209】

ガイドＲＮＡ標的配列は、オフターゲット修飾を最小限に抑えるか、又はオフターゲット効果を回避するように選択することもできる（例えば、オフターゲットゲノム配列とのミスマッチが２つ以下になることを回避することによって）。

【0210】

一例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、配列番号２０９～２９６のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列を標的化し得る。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、配列番号２０９～２９６のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを標的化し得る。

【0211】

別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、配列番号２３６、２４１、２４３、２５８、２６１、２６３、２７３、及び２９５のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列を標的化し得る。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、配列番号２３６、２４１、２４３、２５８、２６１、２６３、２７３、及び２９５のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを標的化し得る。

【0212】

別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、配列番号２６１及び２７３のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列を標的化し得る。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、配列番号２６１及び２７３のうちのいずれか１つに示されるガイドＲＮＡ標的配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを標的化し得る。

【0213】

別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、配列番号２６１に示されるガイドＲＮＡ標的配列を標的化し得る。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、配列番号２６１に示されるガイドＲＮＡ標的配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを標的化し得る。

【0214】

別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、配列番号２７３に示されるガイドＲＮＡ標的配列を標的化し得る。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、配列番号２７３に示されるガイドＲＮＡ標的配列の少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、若しくは少なくとも２０の連続するヌクレオチドを標的化し得る。

【0215】

【表4-1】

【表4-2】

【0216】

Ｅ．Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む脂質ナノ粒子
Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む脂質ナノ粒子も提供される。脂質ナノ粒子は、任意の形態（例えば、タンパク質、ＤＮＡ、若しくはｍＲＮＡ）のＣａｓタンパク質を含むことができ、かつ／又は任意の形態（例えば、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）のガイドＲＮＡ（複数可）を含むことができる。一例では、脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡの形態のＣａｓタンパク質（例えば、本明細書に記載される修飾ＲＮＡ）及びＲＮＡの形態のガイドＲＮＡ（複数可）（例えば、本明細書に開示される修飾ガイドＲＮＡ）を含む。別の例として、脂質ナノ粒子は、タンパク質の形態のＣａｓタンパク質及びＲＮＡの形態のガイドＲＮＡ（複数可）を含むことができる。具体的な例では、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質はそれぞれ、同じＬＮＰでのＬＮＰ媒介送達を介してＲＮＡの形態で導入される。本明細書の他の箇所でより詳細に考察されるように、１つ以上のＲＮＡを修飾することができる。例えば、１つ以上のＲＮＡは、５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の安定化末端修飾を含むように修飾され得る。かかる修飾には、例えば、５’末端及び／又は３’末端の１つ以上のホスホロチオエート結合、並びに／あるいは５’末端及び／又は３’末端の１つ以上の２’－Ｏ－メチル修飾が含まれ得る。別の例として、ＣａｓｍＲＮＡ修飾は、シュードウリジンでの置換（例えば、シュードウリジンで完全に置換される）、５’キャップ、及びポリアデニル化を含み得る。別の例として、ＣａｓｍＲＮＡ修飾は、Ｎ１－メチル－シュードウリジンによる置換（例えば、Ｎ１－メチル－シュードウリジンによる完全置換）、５’キャップ、及びポリアデニル化を含むことができる。他の改変もまた、本明細書の他の箇所に開示されるように企図される。かかる方法による送達は、一過性のＣａｓ発現及び／又はガイドＲＮＡの一過性の存在をもたらし得、生分解性脂質はクリアランスを改善し、忍容性を改善し、免疫原性を低下させる。脂質製剤は、生体分子を分解から保護すると同時に、細胞への取り込みを改善することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。これらには、ミクロスフェア（単層及び多層ベシクル、例えば、リポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、又は懸濁液中の内相が含まれる。そのような脂質ナノ粒子は、送達のために１つ以上の核酸又はタンパク質をカプセル化するために使用することができる。カチオン性脂質を含む製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含めることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電又は両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、及びナノ粒子がインビボで存在できる時間を増加させるステルス脂質である。好適なカチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、及びステルス脂質の例は、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／０１０８４０号及び国際公開第２０１７／１７３０５４号に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質及び１つ以上の他の成分を含むことができる。一例において、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含むことができる。別の例において、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質及びＤＳＰＣなどの中性脂質を含むことができる。別の例において、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意の中性脂質、及びＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、又はＳ０３３などのステルス脂質を含むことができる。

【0217】

ＬＮＰは、以下の１つ以上又は全てを含有してもよい。、（ｉ）カプセル化及びエンドソーム脱出のための脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）安定化のためのヘルパー脂質、及び（ｉｖ）ステルス脂質。例えば、Ｆｉｎｎｅｔａｌ．（２０１８）ＣｅｌｌＲｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５及び国際公開第２０１７／１７３０５４号を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定のＬＮＰにおいて、カーゴはガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。特定のＬＮＰにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸を含み得る。特定のＬＮＰでは、カーゴに外因性ドナー配列を含むことができる。特定のＬＮＰにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸、及び外因性ドナー配列を含み得る。いくつかのＬＮＰでは、脂質成分は、生分解性のイオン化可能な脂質などのアミン脂質を含む。いくつかの例において、脂質成分は、生分解性のイオン化可能な脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＭＧを含む。例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡは、イオン化可能な脂質（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート、（３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエートとも呼ばれる）、コレステロール、ＤＳＰＣ及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む脂質製剤を利用して細胞及び動物に送達することができる。

【0218】

いくつかの例では、ＬＮＰはカチオン性脂質を含む。いくつかの例では、ＬＮＰは、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート、（３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）とも呼ばれる）又は別のイオン化可能な脂質を含む。例えば、国際公開第２０１９／０６７９９２号、国際公開第２０１７／１７３０５４号、国際公開第２０１５／０９５３４０号、及び国際公開第２０１４／１３６０８６号を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの例では、ＬＮＰは、リン酸ＲＮＡに対するカチオン性脂質アミンのモル比（Ｎ：P）が約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、又は約６．５である。いくつかの例では、ＬＮＰ脂質の文脈におけるカチオン性及びイオン化可能という用語は交換可能である（例えば、ここで、イオン化可能な脂質はｐＨに応じてカチオン性である）。

【0219】

カプセル化及びエンドソーム脱出のための脂質は、カチオン性脂質であり得る。脂質はまた、生分解性イオン化可能脂質などの生分解性脂質であり得る。好適な脂質の一例は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであるリピドＡ又はＬＰ０１である。例えば、Ｆｉｎｎｅｔａｌ．（２０１８）ＣｅｌｌＲｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５及び国際公開第２０１７／１７３０５４号を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。好適な脂質の別の例は、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）とも呼ばれる、（（５－（（ジメチルアミノ）メチル）－１，３－フェニレン）ビス（オキシ））ビス（オクタン－８，１－ジイル）ビス（デカノアート）である脂質Ｂである。好適な脂質の別の例は、２－（（４－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）ヘキサデカノイル）オキシ）プロパン－１，３－ジイル（９Ｚ，９’Ｚ，１２Ｚ，１２’Ｚ）－ビス（オクタデカ－９，１２－ジエノアート）である脂質Ｃである。好適な脂質の別の例は、３－（（（３－（ジメチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）－１３－（オクタノイルオキシ）トリデシル３－オクチルウンデカノアートである脂質Ｄである。他の好適な脂質には、ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（［（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル］４－（ジメチルアミノ）ブタノエート又はＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３））としても知られる）が含まれる。

【0220】

本明細書に記載のＬＮＰでの使用に好適ないくつかのそのような脂質は、インビボで生分解性である。例えば、そのような脂質を含むＬＮＰには、脂質の少なくとも７５％が、８、１０、１２、２４、若しくは４８時間以内、又は３、４、５、６、７、若しくは１０日以内に血漿から除去されるものが含まれる。別の例として、ＬＮＰの少なくとも５０％が、８、１０、１２、２４、若しくは４８時間以内、又は３、４、５、６、７、若しくは１０日以内に血漿から除去される。

【0221】

このような脂質は、それらが含まれる培地のｐＨに応じてイオン化可能であり得る。例えば、わずかに酸性の培地では、脂質は、プロトン化され、したがって正電荷を帯びることができる。逆に、例えば、ｐＨが約７．３５である血液などのわずかに塩基性の媒体では、脂質はプロトン化されない可能性があり、したがって電荷を帯びない可能性がある。いくつかの実施形態では、脂質は、少なくとも約９、９．５、又は１０のｐＨでプロトン化され得る。そのような脂質が電荷を帯びる能力は、その固有のｐＫａに関連している。例えば、脂質は、独立して、約５．８～約６．２の範囲のｐＫａを有し得る。

【0222】

中性脂質は、ＬＮＰを安定化し、そのプロセシングを改善するよう機能する。好適な中性脂質の例には、様々な中性、非荷電、又は双性イオン性脂質が含まれる。本開示における使用に好適な中性リン脂質の例は、５－ヘプタデシルベンゼン－１，３－ジオール（レゾルシノール）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステロイルホスファチジルコリン、又は１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２－ジアラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１－ミリストイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１－パルミトイル－２－ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１－パルミトイル－２－ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２－ジアラキドイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１－ステアロイル－２－パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２－ジエイコセノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リソホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルロレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、イソホスファチジルエタノールアミン、１－ステアロイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＳＯＰＣ）、及びこれらの組み合わせを含むが、これらには限定されない。例えば、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、及びジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択され得る。

【0223】

ヘルパー脂質には、トランスフェクションを増強する脂質が含まれる。ヘルパー脂質がトランスフェクションを増強するメカニズムは、粒子安定性を増強することを含み得る。場合によっては、ヘルパー脂質は、膜の融合性を増強することができる。ヘルパー脂質は、ステロイド、ステロール、及びアルキルレゾルシノールを含む。好適な好適なヘルパー脂質の例には、コレステロール、５－ヘプタデシルレゾルシノール、及びヘミコハク酸コレステロールが含まれる。一例において、ヘルパー脂質は、コレステロール又はヘミコハク酸コレステロールであり得る。

【0224】

ステルス脂質は、ナノ粒子がインビボで存在することができる時間の長さを変える脂質を含む。ステルス脂質は、例えば、粒子凝集を低減し、粒子サイズを制御することによって、製剤化プロセスにおいて支援し得る。ステルス脂質は、ＬＮＰの薬物動態特性を調節し得る。好適なステルス脂質には、脂質部分に連結された親水性頭部基を有する脂質が含まれる。

【0225】

ステルス脂質の親水性頭部基は、例えば、ＰＥＧ（時折、ポリ（エチレンオキシド）と称される）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、及びポリＮ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドに基づくポリマーから選択されるポリマー部分を含み得る。ＰＥＧという用語は、ポリエチレングリコール又は他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。特定のＬＮＰ製剤において、ＰＥＧはＰＥＧ２０００とも呼ばれるＰＥＧ－２Ｋであり、平均分子量は約２，０００ダルトンである。例えば、国際公開第２０１７／１７３０５４号を参照されたく、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0226】

ステルス脂質の脂質部分は、例えば、独立して約Ｃ４～約Ｃ４０の飽和又は不飽和の炭素原子を含むアルキル鎖長を有するジアルキルグリセロール又はジアルキルグリカミド基を含むものを含むジアシルグリセロール又はジアシルグリカミドから由来し得、ここで鎖は１つ以上の、例えば、アミド又はエステルなどの官能基を含み得る。ジアルキルグリセロール又はジアルキルグリカミド基は、１つ以上の置換アルキル基を更に含み得る。

【0227】

一例として、ステルス脂質は、ＰＥＧ－ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＳＰＥ）、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、及びＰＥＧ－ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスト－５－エン－３［ベータ］－オキシ）カルボキシアミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［オメガ］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＰＥ）、又は１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メチルポリオキシエチレングリコール－２０００（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＰＥ）、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＧ）、ポリ（エチレングリコール）－２０００－ジメタクリレート（ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＡ））、及び１，２－ジステアリルオキシプロピル－３－アミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］（ＰＥＧ２ｋ－ＤＳＡ）から選択され得る。１つの特定の例において、ステルス脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧであり得る。

【0228】

いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はグリセロール基を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ジミリストイルグリセロール（ＤＭＧ）基を含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質は、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧは、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００である。

【0229】

ＬＮＰは、製剤中の成分脂質の異なるそれぞれのモル比を含むことができる。ＣＣＤ脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４２モル％～約４７モル％、又は約４５％であり得る。ヘルパー脂質のモル％は、例えば、約３０モル％～約６０モル％、約３５モル％～約５５モル％、約４０モル％～約５０モル％、約４１モル％～約４６モル％、又は約４４モル％であり得る。中性脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約２０モル％、約５モル％～約１５モル％、約７モル％～約１２モル％、又は約９モル％であり得る。ステルス脂質のモル％は、例えば、約１モル％～約１０モル％、約１モル％～約５モル％、約１モル％～約３モル％、約２モル％、又は約１モル％であり得る。

【0230】

ＬＮＰは、生分解性脂質（Ｎ）の正に帯電したアミン基と、カプセル化される核酸の負に帯電したリン酸基（Ｐ）との間で異なる比を有することができる。これは、式Ｎ／Ｐによって数学的に表すことができる。例えば、Ｎ／Ｐ比は、約０．５～約１００、約１～約５０、約１～約２５、約１～約１０、約１～約７、約３～約５、約４～約５、約４、約４．５、又は約５であり得る。Ｎ／Ｐ比はまた、約４～約７又は約４．５～約６であり得る。特定の例において、Ｎ／Ｐ比は、約４．５であり得るか、又は約６であり得る。

【0231】

一部のＬＮＰでは、カーゴは、ＣａｓｍＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ）及びｇＲＮＡを含むことができる。ＣａｓｍＲＮＡ及びｇＲＮＡは、異なる比であり得る。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５の範囲、又は約１：１のＣａｓｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、又は約１０：１のＣａｓｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、約２５：１、約１０：１、約５：１、約３：１、約１：１、約１：３、約１：５、約１：１０、又は約１：２５のＣａｓｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：２の、ＣａｓｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。特定の例において、ＣａｓｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比は、約１：１又は約１：２であり得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約２：１～約１：２の、ＣａｓｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。具体的な例において、ＣａｓｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比は、約２：１又は約１：１又は約１：２であり得る。

【0232】

ＬＮＰの例示的な投薬には、総ＲＮＡ（Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ）カーゴ含有量に対して約０．１、約０．２５、約０．３、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約８、若しくは約１０ｍｇ／ｋｇ体重（ｍｐｋ）、又は、約０．１～約１０、約０．２５～約１０、約０．３～約１０、約０．５～約１０、約１～約１０、約２～約１０、約３～約１０、約４～約１０、約５～約１０、約６～約１０、約８～約１０、約０．１～約８、約０．１～約６、約０．１～約５、約０．１～約４、約０．１～約３、約０．１～約２、約０．１～約１、約０．１～約０．５、約０．１～約０．３、約０．１～約０．２５、約０．２５～約８、約０．３～約６、約０．５～約５、約１～約５、若しくは約２～約３ｍｇ／ｋｇの体重が含まれる。そのようなＬＮＰは、例えば、静脈内に投与することができる。一例では、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１～約０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。例えば、約０．０１、約０．０３、約０．１、約０．３、約１、約３、又は約１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。ＬＮＰの追加の例示的な投薬には、総ＲＮＡ（Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ）カーゴ含有量に対して約０．１、約０．２５、約０．３、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約８又は約１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）体重、又は約０．１～約１０、約０．２５～約１０、約０．３～約１０、約０．５～約１０、約１～約１０、約２～約１０、約３～約１０、約４～約１０、約５～約１０、約６～約１０、約８～約１０、約０．１～約８、約０．１～約６、約０．１～約５、約０．１～約４、約０．１～約３、約０．１～約２、約０．１～約１、約０．１～約０．５、約０．１～約０．３、約０．１～約０．２５、約０．２５～約８、約０．３～約６、約０．５～約５、約１～約５、若しくは約２～約３ｍｇ／ｋｇの体重が含まれる。そのようなＬＮＰは、例えば、静脈内に投与することができる。一例では、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１～約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約０．０１～約０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。例えば、約０．０１、約０．０３、約０．１、約０．３、約０．５、約１、約２、約３、又は約１０ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。別の例では、約０．５～約１０、約０．５～約５、約０．５～約３、約１～約１０、約１～約５、約１～約３、又は約１～約２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量を使用することができる。

【0233】

一部のＬＮＰでは、カーゴは外因性ドナー核酸及びｇＲＮＡを含むことができる。外因性ドナー核酸及びｇＲＮＡは、異なる比にすることができる。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５、又は約１：１の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡとの比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、約５：１～約１：１、約１０：１、又は約１：１０の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡとの比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、約２５：１、約１０：１、約５：１、約３：１、約１：１、約１：３、約１：５、約１：１０、又は約１：２５の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。

【0234】

適切なＬＮＰの具体例は、約４．５の窒素対リン酸（Ｎ／Ｐ）比を有し、生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを約４５：４４：９：２のモル比（約４５：約４４：約９：約２）で含む。生分解性カチオン性脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり得る。例えば、Ｆｉｎｎｅｔａｌ．（２０１８）ＣｅｌｌＲｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して約１：１（約１：約１）の重量比であり得る。適切なＬＮＰの別の具体例は、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＭＧを約５０：３８：５：１０：１．５モル比（約５０：約３８．５：約１０：約１．５）で含有する。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量で約１：２の比（約１：約２）であり得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量で約１：１の比（約１：約１）であり得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量で約２：１の比（約２：約１）であり得る。

【0235】

適切なＬＮＰの別の具体例は、約６の窒素対リン酸（Ｎ／Ｐ）比を有し、生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを約５０：３８：９：３のモル比（約５０：約３８：約９：約３）で含む。生分解性カチオン性脂質は、リピドＡ３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアート）であり得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量で約１：２の比（約１：約２）であり得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量で約１：１の比（約１：約１）であり得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して約２：１（約２：約１）の重量比であり得る。

【0236】

適切なＬＮＰの別の具体例は、約３の窒素対リン酸（Ｎ／Ｐ）比を有し、カチオン性脂質、構造脂質、コレステロール（例えば、コレステロール（ヒツジ）（Ａｖａｎｔｉ７０００００））及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００（ＮＯＦＡｍｅｒｉｃａ－ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＧＭ－０２０（ＤＭＧ－ＰＥＧ））を約５０：１０：３８．５：１．５の比（約５０：約１０：約３８．５：約１．５）又は約４７：１０：４２：１の比（約４７：約１０：約４２：約１）で含む。構造脂質は、例えば、ＤＳＰＣ（例えば、ＤＳＰＣ（Ａｖａｎｔｉ８５０３６５））、ＳＯＰＣ、ＤＯＰＣ、又はＤＯＰＥであり得る。カチオン性／イオン化可能脂質は、例えば、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（例えば、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＢｉｏｆｉｎｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））であり得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量で約１：２の比（約１：約２）であり得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量で約１：１の比（約１：約１）であり得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量で約２：１の比（約２：約１）であり得る。

【0237】

適切なＬＮＰの別の具体例は、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ脂質を約４５：９：４４：２の比（約４５：約９：約４４：約２）で含む。適切なＬＮＰの別の具体例は、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ脂質又はＰＥＧＤＭＧを約５０：１０：３９：１の比（約５０：約１０：約３９：約１）で含む。適切なＬＮＰの別の具体例は、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを約５５：１０：３２．５：２．５の比（約５５：約１０：約３２．５：約２．５）で有する。適切なＬＮＰの別の具体例は、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを約５０：１０：３８．５：１．５の比（約５０：約１０：約３８．５：約１．５）で有する。適切なＬＮＰの別の具体例は、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを約５０：１０：３８．５：１．５の比（約５０：約１０：約３８．５：約１．５）で有する。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量で約１：２の比（約１：約２）であり得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量で約１：１の比（約１：約１）であり得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量で約２：１の比（約２：約１）であり得る。

【0238】

適切なＬＮＰの他の例は、例えば、国際公開第２０１９／０６７９９２号、国際公開第２０２０／０８２０４２号、米国特許出願公開第２０２０／０２７０６１７号明細書、国際公開第２０２０／０８２０４１号、米国特許出願公開第２０２０／０２６８９０６号明細書、国際公開第２０２０／０８２０４６号明細書（例えば、８５～８６頁を参照のこと）及び米国特許出願公開第２０２０／０２８９６２８号明細書に見出すことができ、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0239】

Ｆ．Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むウイルスベクター
Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含むウイルスベクター、例えばアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターも提供される。核酸の導入は、ＡＡＶ媒介送達又はレンチウイルス媒介送達などのウイルス媒介送達によっても達成することができる。ベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターであり得る。ＡＡＶは任意の好適な血清型であり得、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）又は自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが含まれる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、又は分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し得る。ウイルスは、宿主ゲノムに組み込むことができるか、又は代替的に宿主ゲノムに組み込まない。このようなウイルスは、免疫力が低減するように操作することもできる。ウイルスは、複製可能であり得、複製欠損性（例えば、ビリオン複製及び／又はパッケージングの追加ラウンドに必要な１つ以上の遺伝子に欠損がある）であり得る。ウイルスは、一過性の発現、長期的な発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、又は３ヶ月）、又は永続的な発現（例えば、Ｃａｓ及び／又はｇＲＮＡの）を引き起こし得る。ウイルスベクターは、それらの野生型対応物から遺伝的に改変され得る。例えば、ウイルスベクターは、クローニングを容易にするために、又はベクターの１つ以上の特性が変化するように、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含み得る。このような特性としては、パッケージング能力、形質導入効率、免疫原性、ゲノム組込み、複製、転写、及び翻訳が挙げられ得る。いくつかの例において、ウイルスゲノムの一部は、ウイルスがより大きなサイズを有する外因性配列をパッケージングすることができるように欠失され得る。いくつかの例において、ウイルスベクターは、増強された形質導入効率を有し得る。いくつかの例では、宿主においてウイルスによって誘導される免疫応答が低減され得る。いくつかの例において、宿主ゲノムへのウイルス配列の組込みを促進するウイルス遺伝子（インテグラーゼなど）は、ウイルスが非組込み型になるように突然変異され得る。いくつかの例では、ウイルスベクターは複製欠損であり得る。いくつかの例では、ウイルスベクターは、ベクター上のコード配列の発現を駆動するための外因性転写又は翻訳制御配列を含み得る。いくつかの例では、ウイルスはヘルパー依存性であり得る。例えば、ウイルスは、ベクターを増幅してウイルス粒子にパッケージングするのに必要なウイルス成分（ウイルスタンパク質など）を供給するために１つ以上のヘルパーウイルスを必要とし得る。そのような場合、ウイルス成分をコードする１つ以上のベクターを含む１つ以上のヘルパー成分を、本明細書に記載のベクター系と共に宿主細胞又は宿主細胞の集団に導入することができる。他の例では、ウイルスはヘルパーフリーであり得る。例えば、ウイルスは、ヘルパーウイルスなしでベクターを増幅及びパッケージングすることができる。いくつかの例では、本明細書に記載のベクター系はまた、ウイルスの増幅及びパッケージングに必要なウイルス成分をコードし得る。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）としては、約１０^１２、約１０^１３、約１０^１４、約１０^１５及び約１０^１６のベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、又は約１０^１２～約１０^１６、約１０^１２～約１０^１５、約１０^１２～約１０^１４、約１０^１２～約１０^１３、約１０^１３～約１０^１６、約１０^１４～約１０^１６、約１０^１５～約１０^１６、若しくは約１０^１３～約１０^１５ｖｇ／ｍＬが挙げられる。他の例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）としては、約１０^１２、約１０^１３、約１０^１４、約１０^１５及び約１０^１６のベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの体重、又は約１０^１２～約１０^１６、約１０^１２～約１０^１５、約１０^１２～約１０^１４、約１０^１２～約１０^１３、約１０^１３～約１０^１６、約１０^１４～約１０^１６、約１０^１５～約１０^１６、若しくは約１０^１３～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの体重が挙げられる。一例において、ウイルス力価は、約１０^１３～約１０^１４ｖｇ／ｍＬ又はｖｇ／ｋｇである。

【0240】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）を含む複数の種に固有である。現在までに、少なくとも１２種の天然血清型及び数百種の天然バリアントが単離され、特徴付けられている。例えば、Ｌｉｅｔａｌ．（２０２０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２５５－２７２を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。ＡＡＶ粒子は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）ゲノムを含有するエンベロープのない正二十面体タンパク質キャプシドから自然に構成される。ＤＮＡゲノムは、複製及びパッケージングシグナルのウイルス起源として働く２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接している。ｒｅｐ遺伝子はウイルスの複製及びパッケージングに必要な４つのタンパク質をコードし、ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ血清型を決定する３つの構造的キャプシドサブユニット、及びいくつかの血清型でビリオンアセンブリを促進するアセンブリ活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードする。

【0241】

組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、現在、治療用導入遺伝子を標的細胞にインビボで送達することによってヒト疾患を治療するための遺伝子治療において使用される最も一般的に使用されるウイルスベクターの１つである。実際、ｒＡＡＶベクターは天然ＡＡＶと同様の正二十面体キャプシドから構成されるが、ｒＡＡＶビリオンはＡＡＶタンパク質コード配列又はＡＡＶ複製配列をキャプシド化しない。これらのウイルスベクターは非複製性である。ｒＡＡＶベクターに必要な唯一のウイルス配列は、ｒＡＡＶベクターの製造中にゲノム複製及びパッケージングを誘導するために必要な２つのＩＴＲである。ｒＡＡＶゲノムはＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を欠いており、それらをインビボで非複製性にする。ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶＩＴＲに隣接する意図された導入遺伝子カセットと組み合わせて、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を追加のウイルスヘルパータンパク質と共にトランスで発現させることによって産生される。

【0242】

治療用ｒＡＡＶゲノムにおいて、遺伝子発現カセットは、ＩＴＲ配列の間に配置される。典型的には、ｒＡＡＶゲノムカセットは、治療用導入遺伝子の発現を駆動するためのプロモーター、続いてポリアデニル化配列を含む。ｒＡＡＶ発現カセットに隣接するＩＴＲは、通常、単離され、組換えウイルスベクターに変換される最初の血清型であるＡＡＶ２に由来する。それ以来、ほとんどのｒＡＡＶ産生方法は、ＡＡＶ２Ｒｅｐベースのパッケージング系に依存する。例えば、Ｃｏｌｅｌｌａｅｔａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．ＭｅｔｈｏｄｓＣｌｉｎ．Ｄｅｖ．８：８７－１０４を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

【0243】

使用され得るＩＴＲのいくつかの非限定的な例としては、配列番号７０６、配列番号７０７、又は配列番号７０８を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＩＴＲを含む。ＩＴＲの他の例は、配列番号７０６、配列番号７０７、又は配列番号７０８と比較して１つ以上の変異を含み、配列番号７０６、配列番号７０７、又は配列番号７０８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であり得る。本明細書に開示されるいくつかのｒＡＡＶゲノムでは、ヌクレアーゼ剤（又はその成分）をコードする核酸は、同じＩＴＲ（すなわち、５’末端のＩＴＲ、及び３’末端のＩＴＲの逆相補体）が両側に隣接している。一例では、各末端のＩＴＲは、配列番号７０６を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。別の例では、各末端のＩＴＲは、配列番号７０７を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。一例において、少なくとも１つの末端上のＩＴＲは、配列番号７０８を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。一例では、５’末端のＩＴＲは、配列番号７０８を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。一例では、３’末端のＩＴＲは、配列番号７０８を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。一例では、各末端のＩＴＲは、配列番号７０８を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。本明細書に開示される他のｒＡＡＶゲノムでは、ヌクレアーゼ剤（又はその成分）をコードする核酸は、各末端で異なるＩＴＲに隣接している。一例では、一端のＩＴＲは、配列番号７０６を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、もう一方の末端のＩＴＲは、配列番号７０７を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。別の例では、一端のＩＴＲは、配列番号７０６を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、もう一方の末端のＩＴＲは、配列番号７０８を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。一例では、一端のＩＴＲは、配列番号７０７を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、もう一方の末端のＩＴＲは、配列番号７０８を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。

【0244】

組換えＡＡＶベクターの特定の血清型は、特定の組織に対するそのインビボ指向性に影響を及ぼす。ＡＡＶキャプシドタンパク質は、付着及び標的細胞への進入、その後のエンドソームの逃避及び核への輸送を媒介する役割を果たす。したがって、ｒＡＡＶベクターを開発するときの血清型の選択は、インビボ注射時にベクターがどの細胞型及び組織に最も結合し、形質導入する可能性が高いかに影響を及ぼす。ｒＡＡＶ８を含むｒＡＡＶのいくつかの血清型は、マウス、ＮＨＰ及びヒトにおいて全身送達された場合に肝臓を形質導入することができる。例えば、Ｌｉｅｔａｌ．（２０２０）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２１：２５５－２７２を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

【0245】

核内に入ると、ｓｓＤＮＡゲノムがビリオンから放出され、相補的ＤＮＡ鎖が合成されて二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子が生成される。二本鎖ＡＡＶゲノムは、それらのＩＴＲを介して天然に環状化し、核内で染色体外に存続するエピソームになる。したがって、エピソーム遺伝子治療プログラムの場合、ｒＡＡＶ送達ｒＡＡＶエピソームは、非分裂細胞において長期のプロモーター駆動遺伝子発現を提供する。しかしながら、このｒＡＡＶ送達エピソームＤＮＡは、細胞が分裂するにつれて希釈される。対照的に、本明細書中に記載される遺伝子治療は、長期遺伝子発現を可能にする遺伝子挿入に基づく。

【0246】

ｓｓＤＮＡＡＡＶゲノムは、２つのオープンリーディングフレーム、Ｒｅｐ及びＣａｐで構成され、相補的ＤＮＡ鎖の合成を可能にする２つの末端逆位配列が隣接している。ＡＡＶトランスファープラスミドを構築する場合、導入遺伝子は、２つのＩＴＲの間に配置され、Ｒｅｐ及びＣａｐは、トランスで供給され得る。Ｒｅｐ及びＣａｐに加えて、ＡＡＶはアデノウイルス由来の遺伝子を含むヘルパープラスミドを必要とする場合がある。これらの遺伝子（Ｅ４、Ｅ２ａ、及びＶＡ）はＡＡＶ複製を仲介する。例えば、トランスファープラスミド、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、及びヘルパープラスミドをアデノウイルス遺伝子Ｅ１＋を含むＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトして、感染性ＡＡＶ粒子を生成することができる。代替的に、Ｒｅｐ、Ｃａｐ、及びアデノウイルスヘルパー遺伝子を組み合わせて単一のプラスミドとすることもできる。同様のパッケージングセル及び方法は、レトロウイルスなどの他のウイルスにも使用できる。

【0247】

ＡＡＶの複数の血清型が確認されている。これらの血清型は、感染する細胞の種類（すなわち、それらの指向性）が異なり、特定の細胞型の優先的な形質導入を可能にする。ＡＡＶという用語は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ、６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０及びそれらのハイブリッド、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ及びヒツジＡＡＶを含む。ＡＡＶの種々の血清型のゲノム配列、並びにネイティブ末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びキャプシドサブユニットの配列は、当該分野で公知である。このような配列は、文献又はＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに見出すことができる。本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではない異種配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種の核酸配列）、典型的には目的の異種ポリペプチドをコードする配列を含むＡＡＶベクターを指す。構築物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ、６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０及びそれらのハイブリッド、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ及びヒツジＡＡＶキャプシド配列を含み得る。一般に、異種核酸配列（導入遺伝子）は、少なくとも１つ、一般に２つのＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接している。ＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）又は自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。肝臓組織の血清型の例には、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．７４、及びＡＡＶｈｕ．３７、特にＡＡＶ８を含む。ＣＮＳ組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が含まれる。心臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が含まれる。腎臓組織に対する血清型にはＡＡＶ２が含まれる。肺組織に対する血清型には、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、及びＡＡＶ９が含まれる。膵臓組織に対する血清型にはＡＡＶ８が含まれる。光受容細胞に対する血清型には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８が含まれる。網膜色素上皮組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８が含まれる。骨格筋組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が含まれる。肝臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９、並びに、特にＡＡＶ８が含まれる。具体的な例では、核酸構築物を含むＡＡＶベクターは組換えＡＡＶ８（ｒＡＡＶ８）であり得る。本明細書に記載のｒＡＡＶ８ベクターは、キャプシドがＡＡＶ８に由来するものである。例えば、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ及びＡＡＶ８のキャプシドを使用するＡＡＶベクターは、本明細書ではｒＡＡＶ８ベクターであると考えられる。

【0248】

指向性は、キャプシド及び異なるウイルス血清型からのゲノムの混合である偽型付けによって更に洗練することができる。例えば、ＡＡＶ２／５は、血清型５のキャプシドにパッケージされた血清型２のゲノムを含むウイルスを示す。偽型ウイルスの使用は、形質導入効率を改善するだけでなく、指向性を変えることができる。異なる血清型に由来するハイブリッドキャプシドを使用して、ウイルスの指向性を改変することもできる。例えば、ＡＡＶ－ＤＪには、８つの血清型由来のハイブリッドキャプシドが含まれており、インビボで幅広い細胞型にわたって高い感染力を示す。ＡＡＶ－ＤＪ８は、ＡＡＶ－ＤＪの特性を示すが、脳への取り込みが増強された別の例である。ＡＡＶ血清型は、変異によっても修飾することができる。ＡＡＶ２の変異修飾の例には、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、及びＳ６６２Ｖが含まれる。ＡＡＶ３の変異修飾の例には、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、及びＴ４９２Ｖが含まれる。ＡＡＶ６の変異修飾の例には、Ｓ６６３Ｖ及びＴ４９２Ｖが含まれる。他の偽型／修飾ＡＡＶバリアントには、ＡＡＶ２／１、ＡＡＶ２／６、ＡＡＶ２／７、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ８．２、及びＡＡＶ／ＳＡＳＴＧが含まれる。

【0249】

導入遺伝子の発現を加速するために、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）バリアントを使用することができる。ＡＡＶは細胞のＤＮＡ複製機構に依存して、ＡＡＶの一本鎖ＤＮＡゲノムの相補的鎖を合成するため、導入遺伝子の発現が遅れる可能性がある。この遅延に対処するために、感染時に自発的にアニーリングすることができる相補的配列を含むｓｃＡＡＶを使用することができ、宿主細胞のＤＮＡ合成の必要性を排除する。しかしながら、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）ベクターも使用できる。

【0250】

パッケージング容量を増加させるために、より長い導入遺伝子を、１つ目は３’スプライスドナー、２つ目は５’スプライスアクセプターである２つのＡＡＶトランスファープラスミドに分割することができる。細胞の共感染時に、これらのウイルスはコンカテマーを形成し、一緒にスプライシングされ、完全長の導入遺伝子を発現させることができる。これにより、より長い導入遺伝子の発現が可能になるが、発現の効率は低下する。容量を増加させるための同様の方法は、相同組換えを利用する。例えば、導入遺伝子は２つのトランスファープラスミドに分割できるが、共発現が相同組換え及び全長導入遺伝子の発現を誘導するように、実質的な配列の重複がある。

【0251】

特定のＡＡＶでは、カーゴは、１つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、又は２つ以上のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）をコードする核酸を含み得る。特定のＡＡＶでは、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）、及び１つ以上のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ、又は２つ以上のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）を含み得る。特定のＡＡＶでは、カーゴに外因性ドナー配列を含めることができる。特定のＡＡＶでは、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）、ガイドＲＮＡ（又は複数のガイドＲＮＡ）をコードするＤＮＡ、及び外因性ドナー配列を含み得る。

【0252】

例えば、Ｃａｓ又はＣａｓ９及び１つ以上のｇＲＮＡ（例えば、１つのｇＲＮＡ又は２つのｇＲＮＡ又は３つのｇＲＮＡ又は４つのｇＲＮＡ）は、ＬＮＰ媒介送達（例えば、ＲＮＡの形態）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達（例えば、ＡＡＶ８媒介送達）を介して送達することができる。例えば、Ｃ５遺伝子を標的化するＣａｓ９ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡをＬＮＰ媒介送達によって送達することができ、又はＣａｓ９をコードするＤＮＡ及びＣ５遺伝子を標的化するｇＲＮＡをコードするＤＮＡをＡＡＶ媒介送達によって送達することができる。Ｃａｓ又はＣａｓ９及びｇＲＮＡ（複数可）は、単一のＡＡＶにおいて、又は２つの別個のＡＡＶを介して送達され得る。例えば、第１のＡＡＶは、Ｃａｓ又はＣａｓ９発現カセットを担持することができ、第２のＡＡＶは、ｇＲＮＡ発現カセットを担持することができる。同様に、第１のＡＡＶは、Ｃａｓ又はＣａｓ９発現カセットを担持することができ、第２のＡＡＶは、２つ以上のｇＲＮＡ発現カセットを担持することができる。代替的に、単一のＡＡＶは、Ｃａｓ又はＣａｓ９発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたＣａｓ又はＣａｓ９コード配列）及びｇＲＮＡ発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたｇＲＮＡコード配列）を担持することができる。同様に、単一のＡＡＶは、Ｃａｓ又はＣａｓ９発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたＣａｓ又はＣａｓ９コード配列）及び２つ以上のｇＲＮＡ発現カセット（例えば、プロモーターに作動可能に連結されたｇＲＮＡコード配列）を担持することができる。Ｕ６プロモーター又はｓｍａｌｌｔＲＮＡＧｌｎなど、様々なプロモーターを使用してｇＲＮＡの発現を駆動することができる。同様に、Ｃａｓ９の発現を駆動するために様々なプロモーターを使用できる。例えば、Ｃａｓ９コード配列がＡＡＶ構築物に適合することができるように小さなプロモーターが使用される。同様に、小さなＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳａＣａｓ９又はＣｊＣａｓ９を使用して、ＡＡＶパッケージング容量を最大化する）。

【0253】

ＩＩＩ．Ｃ５抗原結合タンパク質
本明細書に開示される方法及び組成物は、Ｃ５抗体（すなわち、抗Ｃ５抗体）又はその抗原結合断片などのＣ５抗原結合タンパク質（すなわち、抗Ｃ５抗原結合タンパク質）を利用することができる。Ｃ５抗原結合タンパク質の例としては、国際公開第２０２１／０３４６３９号、米国特許出願公開第２０２１－００４６１８２号明細書、国際公開第２０２１／０８１２７７号、米国特許出願公開第２０２１－０１３９５７３号明細書、国際公開第２０１７／２１８５１５号、米国特許出願公開第２０２０－０２６２９０１号明細書、米国特許出願公開第２０１７－０３５５７５７号明細書又は米国特許出願公開第２０２０－０２６２９００号明細書に開示されているものが挙げられるが、これらに限定されず、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0254】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合（例えば、ＩｇＧ）によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）を含む免疫グロブリン分子、例えばＨ２Ｍ１１６８３Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６８６Ｎ；Ｈ４Ｈ１２１５９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６３Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６４Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ３；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ４；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ５；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ６；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ７；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ８；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ９；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ１０；Ｈ４Ｈ１２１６７Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６８Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７１Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７５Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７６Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１７７Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１８３Ｐ２；Ｈ２Ｍ１１６８２Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６８４Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６９４Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６９５Ｎ；クロバリマブ；エクリズマブ；テシドルマブ；ムボジナ；又はラブリズマブ；好ましくはポゼリマブを指す。いくつかの実施形態では、各抗体重鎖（ＨＣ）は、重鎖可変領域（「ＨＣＶＲ」又は「Ｖ_Ｈ」）（例えば、配列番号３４１；３５７；３７３；３８９；４０５；４２１；４３７；４６１；４７７；４８５；４９３；５０９；５２５；５４１；５５７；５７３；５８９；６０５；６１３；６２９；６４５；６６１若しくは６７７；又はそれらのバリアント）及び重鎖定常領域を含み、各抗体軽鎖（ＬＣ）は、軽鎖可変領域（「ＬＣＶＲ」又は「Ｖ_Ｌ」）（例えば、配列番号３４９；３６５；３８１；３９７；４１３；４２９；４４５；４５３；４６９；５０１；５１７；５３３；５４９；５６５；５８１；５９７；６２１；６３７；６５３；６６９；若しくは６８５；又はそれらのバリアント）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（framework region、ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に組み入れられている、相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に更に細分することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法及び組み合わせで使用される抗体又はその抗原結合断片は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物宿主細胞から発現され単離された。

【0255】

本明細書で使用される抗体又は抗原結合タンパク質などの「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」という用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する任意の天然に存在する、酵素的に得られる、合成された、又は遺伝子操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗原結合断片の非限定的な例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片；（ｉｉｉ）Ｆｄ断片（パパインで切断されたＦａｂ断片の重鎖部分）；（ｉｖ）Ｆｖ断片（Ｖ_Ｈ又はＶ_Ｌ）；及び（ｖ）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；抗体（例えば、ＣＤＲ３ペプチドなどの単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））又は拘束性ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４ペプチドの超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる；が挙げられる。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ及び小型モジュール免疫医薬品（ＳＭＩＰ）などの他の操作された分子も、本明細書で使用される「抗原結合断片」という表現に包含される。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、Ｈ２Ｍ１１６８３Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６８６Ｎ；Ｈ４Ｈ１２１５９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６３Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６４Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ３；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ４；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ５；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ６；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ７；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ８；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ９；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ１０；Ｈ４Ｈ１２１６７Ｐ；Ｈ４Ｈｌ２１６８Ｐ；Ｈ４Ｈｌ２１６９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７１Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７５Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７６Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１７７Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１８３Ｐ２；Ｈ２Ｍ１１６８２Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６８４Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６９４Ｎ；又はＨ２Ｍ１１６９５Ｎの３つ以上のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３；並びに／又はＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３を含む。

【0256】

抗体又はその抗原結合断片などの「組換え」抗原結合タンパク質という用語は、例えばＤＮＡスプライシング及びトランスジェニック発現を含む組換えＤＮＡ技術として当技術分野で公知の技術又は方法によって作製、発現、単離、又は得られるそのような分子を指す。この用語は、非ヒト哺乳動物（トランスジェニック非ヒト哺乳動物、例えばトランスジェニックマウスを含む）、又は宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）若しくは細胞発現系で発現される抗体、又は組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体を含む。本明細書に記載される組換え抗原結合タンパク質（例えば、Ｈ２Ｍ１１６８３Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６８６Ｎ；Ｈ４Ｈ１２１５９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６３Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６４Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ３；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ４；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ５；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ６；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ７；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ８；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ９；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ１０；Ｈ４Ｈ１２１６７Ｐ；Ｈ４Ｈｌ２１６８Ｐ；Ｈ４Ｈｌ２１６９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７１Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７５Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７６Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１７７Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１８３Ｐ２；Ｈ２Ｍ１１６８２Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６８４Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６９４Ｎ；又はＨ２Ｍ１１６９５Ｎ）は、本明細書に開示される組成物及び方法において使用することができる。

【0257】

本明細書に記載の抗体には、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体及び／又はヒト化抗体が含まれる。例えば、モノクローナル抗Ｃ５抗原結合タンパク質（例えば、抗体及びその抗原結合断片）が含まれる。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」という用語は、実質的に均一な抗体の集団からの抗体を指し、すなわち、集団を含む抗体分子は、少量存在し得る天然に存在する可能性のある変異を除いてアミノ酸配列が同一である。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体は、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる、Ｋｏｈｌｅｒｅｔａｌ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５によるハイブリドーマ法によって作製され得るか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。）によって作製され得る。

【0258】

いくつかの実施形態では、各フレームワーク又はＣＤＲドメインへのアミノ酸の割り当ては、ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔ，ｅｔａｌ．；ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈｅｄ．；ＮＩＨＰｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１－７５；Ｋａｂａｔｅｔａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；又はＣｈｏｔｈｉａｅｔａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４２：８７８－８８３の定義に従い、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、Ｖ_ＨのＣＤＲ及びＶ_ＬのＣＤＲを含む抗体及び抗原結合断片が含まれ、Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、本明細書に記載のアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含み、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ及び／又はＣｈｏｔｈｉａに従って定義される通りである。

【0259】

いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質、例えば、抗体又は抗原結合断片は、例えば、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１又はＩｇＡ２）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４（例えば、Ｓ２２８Ｐ及び／又はＳ１０８Ｐ変異を含む））型又はＩｇＭ型の重鎖定常ドメインを含む。例えば、Ｓｉｌｖａｅｔａｌ．（２０１５）ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．２９０（９）：５４６２－９を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質、例えば抗体又は抗原結合断片は、例えばカッパ又はラムダ型の軽鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、例えば上記の重鎖及び／又は軽鎖定常ドメインに連結された本明細書に記載の可変ドメインを含む抗原結合タンパク質（例えば、Ｈ２Ｍ１１６８３Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６８６Ｎ；Ｈ４Ｈ１２１５９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６３Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６４Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ３；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ４；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ５；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ６；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ７；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ８；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ９；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ１０；Ｈ４Ｈ１２１６７Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６８Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７１Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７５Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７６Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１７７Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１８３Ｐ２；Ｈ２Ｍ１１６８２Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６８４Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６９４Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６９５Ｎ；クロバリマブ；エクリズマブ、テシドルマブ、ムボジナ、ＩＦＸ－１（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０１３７４９９号明細書を参照されたい）、オレンタリズマブ、又はラブリズマブ；好ましくは、ポゼリマブ）が含まれる。

【0260】

「単離された」抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）、ポリペプチド、ポリヌクレオチド及びベクターは、それらが産生される細胞又は細胞培養物からの他の生物学的分子を少なくとも部分的に含まない。そのような生物学的分子には、核酸、タンパク質、他の抗体若しくは抗原結合断片、脂質、炭水化物、又は細胞残屑及び増殖培地などの他の材料が含まれる。単離された抗原結合タンパク質は更に、宿主細胞からの生物学的分子又はその増殖培地などの発現系成分を少なくとも部分的に含まなくてもよい。一般に、「単離された」という用語は、そのような生物学的分子が完全に存在しないこと（例えば、微量又はわずかな量の不純物が残っていてもよい）、又は水、緩衝剤若しくは塩が存在しないこと、又は抗原結合タンパク質（例えば、抗体若しくは抗原結合断片）を含む医薬製剤の成分を指すことを意図しない。

【0261】

いくつかの実施形態では、補体因子５（Ｃ５）タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、ＮＭＡＴＧＭＤＳＷ（配列番号６９２）（又はその中の少なくとも１、２、３、４若しくは５個のアミノ酸）；又はＷＥＶＨＬＶＰＲＲＫＱＬＱＦＡＬＰＤＳＬ（配列番号６９３）（又はその中の少なくとも１、２、３、４又は５個のアミノ酸）内に含まれる１つ以上のアミノ酸と相互作用する。いくつかの実施形態では、補体因子５（Ｃ５）タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、水素／重水素交換によって決定されるように、Ｃ５のアルファ鎖及び／又はベータ鎖内に含まれる１つ以上のアミノ酸と相互作用する。例えば、いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合断片は、水素／重水素交換によって決定されるように、Ｃ５のＣ５ａアナフィラトキシン領域のアミノ酸と相互作用しない。いくつかの実施形態では、補体因子５（Ｃ５）タンパク質に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片は、（ａ）ＮＭＡＴＧＭＤＳＷ（配列番号６９２）；（ｂ）ＡＴＧＭＤＳＷ（配列番号６９４）；（ｃ）ＷＥＶＨＬＶＰＲＲＫＱＬＱ（配列番号６９５）；（ｄ）ＷＥＶＨＬＶＰＲＲＫＱＬＱＦＡＬＰＤＳＬ（配列番号６９３）；並びに（ｅ）ＬＶＰＲＲＫＱＬＱ（配列番号６９６）からなる群から選択されるアミノ酸配列と相互作用する。

【0262】

いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質は、例えば残基５９１～５９９及び／又は７７５～７９４、例えばＮＭＡＴＧＭＤＳＷ（配列番号６９２）及び／又はＷＥＶＨＬＶＰＲＲＫＱＬＱＦＡＬＰＤＳＬ（配列番号６９３）のＣ５のアルファ鎖若しくはベータ鎖又は両方に結合する。いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質はＣ５ａに結合しない。

【0263】

いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質は、残基ＫＤＭＱＬＧＲＬＨＭＫＴＬＬＰＶＳＫ（配列番号６９９）において、Ｃ５に結合する。

【0264】

いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質は、例えば残基３３２～３９８、３３２～３７８、３３２～３６４、３３２～３４８、３５０～４２０、３６９～４０９、３７９～３９８及び／又は３８６～３９２においてｍそのＣ５のベータ鎖に結合する。

【0265】

いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質は、例えば残基ＮＤＥＴＣＥＱＲＡ（配列番号７００）及び／又はＳＨＫＤＭＱＬ（配列番号７０１）において、Ｃ５ａに結合する。

【0266】

いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質は、Ｃ５のベータ鎖、例えば残基１９～１８０に結合する。いくつかの実施形態では、Ｃ５への結合は、Ｅ４８Ａ、Ｄ５１Ａ及び／又はＫ１０９ＡのＣ５変異によって低下する。

【0267】

本明細書に開示される方法及び組み合わせにおいて使用され得るＣ５抗体及びその抗原結合断片の例の配列を以下の表５に示す。

【0268】

【表5】

【0269】

表５に記載の鎖をコードするポリヌクレオチドを以下の表６に示す。

【0270】

【表6】

^＊抗体及び断片は、当該配列の１つ以上のバリアントを含み得る。
例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／２１８５１５号を参照されたい。国際公開第２０２１／０３４６３９号、米国特許出願公開第２０２１－００４６１８２号明細書、国際公開第２０２１／０８１２７７号、米国特許出願公開第２０２１－０１３９５７３号明細書、米国特許出願公開第２０２０－０２６２９０１号明細書、米国特許出願公開第２０１７－０３５５７５７号明細書、又は米国特許出願公開第２０２０－０２６２９００号明細書も参照されたく、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＧＧＣＡＴＴＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＡＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＧＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＡＡＣＴＡＴＴＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＡＧＣＡＣＣＡＧＴＣＣＣＴＧＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号３４０）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＶＡＳＧＦＴＦＳＳＹＧＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＷＤＤＧＮＮＩＮＹＳＤＳＶＫＧＲＦＩＩＳＲＤＮＳＲＫＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＧＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＡＰＩＡＰＶＰＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３４１）
ＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＧＴＴＡＴＧＧＣ（配列番号３４２）
ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号３４３）
ＡＴＡＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＧＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡ（配列番号３４４）
ＩＷＤＤＧＮＮＩ（配列番号３４５）
ＧＣＧＡＧＡＧＡＴＧＣＣＣＣＣＡＴＡＧＣＡＣＣＡＧＴＣＣＣＴＧＡＣＴＡＴ（配列番号３４６）
ＡＲＤＡＰＩＡＰＶＰＤＹ（配列番号３４７）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＴＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＴＧＧＴＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＡＡＧＧＣＧＴＣＴＡＧＴＴＴＡＧＡＣＡＣＴＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＣＡＧＴＡＴＡＡＴＡＣＴＴＡＴＴＣＧＴＡＣＡＣＴＴＴＴＧＧＣＣＴＧＧＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ（配列番号３４８）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫＡＳＳＬＤＴＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＮＴＹＳＹＴＦＧＬＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号３４９）
ＣＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＴＧＧ（配列番号３５０）
ＱＳＩＳＳＷ（配列番号３５１）
ＡＡＧＧＣＧＴＣＴ（配列番号３５２）
ＫＡＳ（配列番号３５３）
ＣＡＡＣＡＧＴＡＴＡＡＴＡＣＴＴＡＴＴＣＧＴＡＣＡＣＴ（配列番号３５４）
ＱＱＹＮＴＹＳＹＴ（配列番号３５５）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＣＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＡＴＧＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＡＴＴＡＧＣＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＡＴＡＣＣＡＴＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＴＡＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＣＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＧＴＡＴＡＡＡＡＧＴＴＣＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＣＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号３５６）
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＹＹＭＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＳＳＧＮＴＩＫＹＡＤＳＭＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＫＳＬＦＶＥＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＫＳＳＳＤＹＦＤＨＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３５７）
ＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣ（配列番号３５８）
ＧＦＴＦＳＤＹＹ（配列番号３５９）
ＡＴＴＡＧＣＡＧＴＡＧＴＧＧＴＡＡＴＡＣＣＡＴＡ（配列番号３６０）
ＩＳＳＳＧＮＴＩ（配列番号３６１）
ＧＣＧＡＧＧＴＡＴＡＡＡＡＧＴＴＣＧＴＣＣＧＡＣＴＡＣＴＴＴＧＡＣＣＡＣ（配列番号３６２）
ＡＲＹＫＳＳＳＤＹＦＤＨ（配列番号３６３）
ＧＡＡＡＴＴＧＴＧＴＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＧＡＧＴＴＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＡＣＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＣＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＡＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＡ（配列番号３６４）
ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＡＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＬＡＶＹＹＣＱＱＳＧＮＷＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３６５）
ＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＧＡＧＴＴＡＣ（配列番号３６６）
ＱＳＶＲＳＹ（配列番号３６７）
ＧＡＴＧＣＡＴＣＣ（配列番号３６８）
ＤＡＳ（配列番号３６９）
ＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＣＡＡＣＴＧＧＣＣＧＣＴＣＡＣＴ（配列番号３７０）
ＱＱＳＧＮＷＰＬＴ（配列番号３７１）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＧＧＴＣＣＴＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＧＡＧＣＧＴＣＴＧＧＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＣＴＴＡＴＧＧＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＧＣＡＧＴＴＡＴＣＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＧＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＴＴＣＧＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＴＧＴＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＧＴＣＧＣＣＣＣＡＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号３７２）
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ＡＲＥＮＮＷＮＦＹＦＤＹ（配列番号６６７）
ＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＴＣＴＧＴＧＴＣＴＣＧＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＧＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＡＡＣＴＴＡＧＣＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＴＴＧＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＧＴＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＴＣＣＣＡＧＣＣＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＣＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＡＧＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＣＡＧＣＡＧＴＡＴＡＡＴＡＡＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡ（配列番号６６８）
ＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＲＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＮＬＡＷＹＱＱＫＬＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＮＷＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号６６９）
ＣＡＧＡＧＴＧＴＴＡＧＣＡＧＣＡＡＣ（配列番号６７０）
ＱＳＶＳＳＮ（配列番号６７１）
ＧＧＴＧＣＡＴＣＣ（配列番号６７２）
ＧＡＳ（配列番号６７３）
ＣＡＧＣＡＧＴＡＴＡＡＴＡＡＣＴＧＧＣＣＧＴＧＧＡＣＧ（配列番号６７４）
ＱＱＹＮＮＷＰＷＴ（配列番号６７５）
ＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＡＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＴＴＴＣＣＧＧＡＡＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＴＧＡＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＣＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＡＣＡＧＡＡＧＴＴＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＣＴＡＣＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＡＴＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ（配列番号６７６）
ＱＶＨＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＶＳＧＮＴＬＴＥＬＳＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＭＧＧＦＤＰＥＤＧＤＴＩＹＳＱＫＦＱＧＲＶＴＬＴＥＤＴＳＴＤＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＳＴＶＧＧＰＴＳＤＣＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６７７）
ＧＧＡＡＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＴＧＡＡＴＴＡＴＣＣ（配列番号６７８）
ＧＮＴＬＴＥＬＳ（配列番号６７９）
ＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡ（配列番号６８０）
ＦＤＰＥＤＧＤＴ（配列番号６８１）
ＴＣＡＡＣＡＧＴＧＧＧＧＧＧＡＣＣＴＡＣＣＴＣＴＧＡＣＴＧＣ（配列番号６８２）
ＳＴＶＧＧＰＴＳＤＣ（配列番号６８３）
ＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＧＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＣＣＣＴＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＴＣＴＴＣＧＡＴＧＣＡＴＣＣＡＡＴＴＴＡＧＡＡＣＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＣＡＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＣＴＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＴＡＴＴＧＣＡＡＣＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＣＡＡＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＡＣＣＴＴＣＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＡＣＧＡＣＴＧＧＡＣＡＴＴＡＡＡ（配列番号６８４）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＦＤＡＳＮＬＥＰＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＩＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＹＤＮＬＰＩＴＦＧＱＧＴＲＬＤＩＫ（配列番号６８５）
ＣＡＧＧＡＣＡＴＴＡＧＣＡＡＣＴＡＴ（配列番号６８６）
ＱＤＩＳＮＹ（配列番号６８７）
ＧＡＴＧＣＡＴＣＣ（配列番号６８８）
ＤＡＳ（配列番号６８９）
ＣＡＡＣＡＡＴＡＴＧＡＴＡＡＴＣＴＣＣＣＧＡＴＣＡＣＣ（配列番号６９０）
ＱＱＹＤＮＬＰＩＴ（配列番号６９１）

【0271】

いくつかの実施形態では、Ｃ５に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（例えば、本明細書に記載の組み合わせで使用される）は、（１）配列番号３４１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号３４９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（２）配列番号３５７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号３６５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（３）配列番号３７３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号３８１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（４）配列番号３８９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号３９７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（５）配列番号４０５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４１３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（６）配列番号４２１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４２９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（７）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（８）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４５３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（９）配列番号４６１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（１０）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（１１）配列番号４７７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（１２）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（１３）配列番号４６１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（１４）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４５３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（１５）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（１６）配列番号４７７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（１７）配列番号４９３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号５０１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（１８）配列番号５０９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号５１７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（１９）配列番号５２５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号５３３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（２０）配列番号５４１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号５４９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（２１）配列番号５５７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号５６５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（２２）配列番号５７３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号５８１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（２３）配列番号５８９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号５９７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（２４）配列番号６０５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号５９７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（２５）配列番号６１３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号６２１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（２６）配列番号６２９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号６３７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（２７）配列番号６４５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号６５３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；（２８）配列番号６６１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号６６９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）；並びに／あるいは（２９）配列番号６７７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＶＲのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号６８５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＶＲのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。

【0272】

いくつかの実施形態では、Ｃ５に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（例えば、本明細書に開示される組み合わせで使用される）は、（ａ）配列番号３４３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号３４５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号３４７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号３５１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号３５３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号３５５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｂ）配列番号３５９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号３６１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号３６３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号３６７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号３６９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号３７１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｃ）配列番号３７５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号３７７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号３７９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号３８３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号３８５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号３８７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｄ）配列番号３９１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号３９３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号３９５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号３９９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４０１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４０３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｅ）配列番号４０７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４０９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４１１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４１５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４１７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４１９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｆ）配列番号４２３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４２５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４２７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４３１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４３３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４３５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｈ）配列番号４３９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４４３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４４７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４４９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４５１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｊ）配列番号４３９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４４３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４５５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４５７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４５９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｋ）配列番号４６３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４６５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４６７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４４７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４４９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４５１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｍ）配列番号４３９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４４１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４４３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４７１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４７５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｎ）配列番号４７９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４８１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４８３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４４７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４４９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４５１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｐ）配列番号４８７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４８９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４９１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４４７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４４９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４５１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｑ）配列番号４６３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４６５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４６７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４７１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４７５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｒ）配列番号４８７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４８９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４９１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４５５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４５７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４５９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｓ）配列番号４８７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４８９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４９１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４７１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４７５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｔ）配列番号４７９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４８１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４８３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４７１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号４７３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号４７５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｕ）配列番号４９５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号４９７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号４９９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５０３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号５０５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号５０７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｖ）配列番号５１１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号５１３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号５１５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５１９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号５２１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号５２３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｗ）配列番号５２７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号５２９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号５３１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５３５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号５３７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号５３９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｘ）配列番号５４３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号５４５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号５４７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５５１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号５５３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号５５５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｙ）配列番号５５９に示されるア
ミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号５６１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号５６３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５６７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号５６９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号５７１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ｚ）配列番号５７５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号５７７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号５７９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５８３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号５８５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号５８７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ａａ）配列番号５９１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号５９３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号５９５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５９９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号６０１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号６０３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ａｂ）配列番号６０７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号６０９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号６１１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５９９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号６０１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号６０３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ａｃ）配列番号６１５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号６１７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号６１９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６２３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号６２５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号６２７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ａｄ）配列番号６３１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号６３３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号６３５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６３９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号６４１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号６４３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ａｅ）配列番号６４７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号６４９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号６５１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６５５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号６５７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号６５９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；（ａｆ）配列番号６６３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号６６５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号６６７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６７１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号６７３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号６７５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域；並びに／あるいは（ａｇ）配列番号６７９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ１、配列番号６８１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ２、配列番号６８３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６８７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ１、配列番号６８９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ２、配列番号６９１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

【0273】

いくつかの実施形態では、Ｃ５に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片（例えば、本明細書に記載の組み合わせで使用される）は、（１）配列番号３４１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号３４９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｉｉ）配列番号３５７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号３６５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）配列番号３７３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号３８１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｉｖ）配列番号３８９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号３９７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｖ）配列番号４０５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４１３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｖｉ）配列番号４２１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４２９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｖｉｉ）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｖｉｉｉ）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４５３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｉｘ）配列番号４６１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘ）配列番号４３７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｉ）配列番号４７７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｉｉ）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４４５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｉｉｉ）配列番号４６１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｉｖ）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４５３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｖ）配列番号４８５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｖｉ）配列番号４７７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号４６９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｖｉｉ）配列番号４９３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５０１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｖｉｉｉ）配列番号５０９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５１７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｉｘ）配列番号５２５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５３３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｘ）配列番号５４１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５４９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｘｉ）配列番号５５７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５６５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｘｉｉ）配列番号５７３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５８１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｘｉｉｉ）配列番号５８９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５９７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｘｉｖ）配列番号６０５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５９７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｘｖ）配列番号６１３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６２１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｘｖｉ）配列番号６２９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６３７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｘｖｉｉ）配列番号６４５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６５３に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号６６１に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６６９に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域；並びに／あるいは（ｘｘｉｘ）配列番号６７７に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む重鎖可変領域、並びに配列番号６８５に示されるアミノ酸配列（又はそのバリアント）を含む軽鎖可変領域を含む。

【0274】

いくつかの実施形態では、本明細書で論じられるＣ５（抗Ｃ５）に特異的に結合する任意の抗原結合タンパク質はアンタゴニストである。そのようなアンタゴニスト（例えば、Ｃ５に特異的に結合するアンタゴニスト抗原結合タンパク質）は、Ｃ５に結合し、Ｃ５の少なくとも１つの生物学的活性を阻害し、例えば、古典的経路又は代替経路による補体媒介溶血の防止又は遮断並びに／あるいはＣ５からＣ５ａ及びＣ５ｂへの切断の阻害並びに／あるいは赤血球の補体媒介溶解の阻害並びに／あるいは膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成の阻害並びに／あるいはＣ５ｂ－６複合体の形成の阻害である。

【0275】

いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質は、エクリズマブ（Ｓｏｌｉｒｉｓとして販売されている）、クロバリマブ、ラブリズマブ（ＡＬＸＮ１２１０；Ｕｌｔｏｍｉｒｉｓとして販売）、テシドルマブ（米国特許第８，２４１，６２８号明細書；国際公開第２０１０／０１５６０８号；又は国際公開第２０１７／２１２３７５号を参照されたく、その各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる））、又はムボジナ（米国特許第７，９９９，０８１号明細書を参照されたく、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）である。

【0276】

いくつかの実施形態では、Ｃ５に特異的に結合する抗体は、ポゼリマブ（ＲＥＧＮ３９１８；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ）抗体である。ポゼリマブ（ＲＥＧＮ３９１８；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ）抗体は、アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＥＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＤＳＶＳＳＳＹＷＴＷＩＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＹＹＳＧＳＳＮＹＮＰＳＬＫＳＲＡＴＩＳＶＤＴＳＫＮＱＦＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＧＮＶＤＴＴＭＩＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ（配列番号６９７）
を含む重鎖免疫グロブリン及びアミノ酸配列：
ＡＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＡＧＲＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＦＮＹＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号６９８）を含む軽鎖を含む。

【0277】

いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質は、アミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＶＨＳＳＹＹＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＡＩＦＴＧＳＧＡＥＹＫＡＥＷＡＫＧＲＶＴＩＳＫＤＴＳＫＮＱＶＶＬＴＭＴＮＭＤＰＶＤＴＡＴＹＹＣＡＳＤＡＧＹＤＹＰＴＨＡＭＨＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＲＲＧＰＫＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＬＨＥＡＬＨＡＨＹＴＲＫＥＬＳＬＳＰ（配列番号７０２）又はそのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３；又はそのＶ_Ｈ（又はそのバリアント）を含む重鎖免疫グロブリン；並びにアミノ酸配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＳＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＧＡＳＥＴＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＮＴＫＶＧＳＳＹＧＮＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号７０３）又はそのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３；又はそのＶ_Ｌ（又はそのバリアント）を含む軽鎖免疫グロブリンを含む。

【0278】

いくつかの実施形態では、ヒトＣ５（シグナル配列を含む）は、配列番号７０４に示されるアミノ酸配列を含み、変異Ｒ８８５Ｈを含む成熟ヒトＣ５は、配列番号７０５に示されるアミノ酸配列を含む。

【0279】

「Ｈ２Ｍ１１６８３Ｎ」；「Ｈ２Ｍ１１６８６Ｎ」；「Ｈ４Ｈ１２１５９Ｐ」；「Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ」；「Ｈ４Ｈ１２１６３Ｐ」；「Ｈ４Ｈ１２１６４Ｐ」；「Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ」；「Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ２」；「Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ３」；「Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ４」；「Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ５」；「Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ６」；「Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ７」；「Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ８」；「Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ９」；「Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ１０」；「Ｈ４Ｈ１２１６７Ｐ」；「Ｈ４Ｈ１２１６８Ｐ」；「Ｈ４Ｈ１２１６９Ｐ」；「Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ」；「Ｈ４Ｈ１２１７１Ｐ」；「Ｈ４Ｈ１２１７５Ｐ」；「Ｈ４Ｈ１２１７６Ｐ２」；「Ｈ４Ｈ１２１７７Ｐ２」；「Ｈ４Ｈ１２１８３Ｐ２」；「Ｈ２Ｍ１１６８２Ｎ」；「Ｈ２Ｍ１１６８４Ｎ」；「Ｈ２Ｍ１１６９４Ｎ」又は「Ｈ２Ｍ１１６９５Ｎ」は、特に明記しない限り、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、本明細書の表５又は国際公開第２０１７／２１８５１５号の表１に具体的に示されるアミノ酸配列（及びそこに示される配列）を含み、免疫グロブリン重鎖又はその可変領域（Ｖ_Ｈ）を含む、Ｈ２Ｍ１１６８３Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６８６Ｎ；Ｈ４Ｈ１２１５９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６３Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６４Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ３；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ４；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ５；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ６；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ７；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ８；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ９；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ１０；Ｈ４Ｈ１２１６７Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６８Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７１Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７５Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７６Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１７７Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１８３Ｐ２；Ｈ２Ｍ１１６８２Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６８４Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６９４Ｎ又はＨ２Ｍ１１６９５Ｎ（例えば、配列番号３４１；３５７；３７３；３８９；４０５；４２１；４３７；４６１；４７７；４８５；４９３；５０９；５２５；５４１；５５７；５７３；５８９；６０５；６１３；６２９；６４５；６６１；又は６７７）（又はそのバリアント）に対応するＣ５に特異的に結合するＣ５抗原結合タンパク質、例えば抗体及びその抗原結合断片（多重特異性抗原結合タンパク質を含む）、並びに／あるいはあらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、本明細書の表５又は国際公開第２０１７／２１８５１５号の表１（及びそこに示される配列）において、本明細書に具体的に示されるアミノ酸配列を含む、Ｈ２Ｍ１１６８３Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６８６Ｎ；Ｈ４Ｈ１２１５９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６１Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６３Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６４Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ３；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ４；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ５；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ６；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ７；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ８；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ９；Ｈ４Ｈ１２１６６Ｐ１０；Ｈ４Ｈ１２１６７Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６８Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１６９Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７０Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７１Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７５Ｐ；Ｈ４Ｈ１２１７６Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１７７Ｐ２；Ｈ４Ｈ１２１８３Ｐ２；Ｈ２Ｍ１１６８２Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６８４Ｎ；Ｈ２Ｍ１１６９４Ｎ又はＨ２Ｍ１１６９５Ｎ（例えば、配列番号３４９；３６５；３８１；３９７；４１３；４２９；４４５；４５３；４６９；５０１；５１７；５３３；５４９；５６５；５８１；５９７；６２１；６３７；６５３；６６９；又は６８５）（又はそのバリアント）に対応する免疫グロブリン軽鎖又はその可変領域（ＶＬ）を指し、並びに／あるいはそのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１（又はそのバリアント）、ＣＤＲ－Ｈ２（又はそのバリアント）及びＣＤＲ－Ｈ３（又はそのバリアント））を含む重鎖又はＶ_Ｈ及び／又はそのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１（又はそのバリアント）、ＣＤＲ－Ｌ２（又はそのバリアント）及びＣＤＲ－Ｌ３（又はそのバリアント））を含む軽鎖又はＶ_Ｌを含む。いくつかの実施形態では、Ｖ_ＨはＩｇＧ定常重鎖ドメイン（例えば、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４（例えば、ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ変異体）））に連結されており、かつ／又はＶ_Ｌはラムダ又はカッパ定常軽鎖ドメインに連結されている。

【0280】

Ｃ５抗原結合タンパク質（すなわち、抗Ｃ５抗原結合タンパク質）又はＣ５抗体又は抗原結合断片又はＣ５に「特異的に結合する」抗体又は抗原結合断片は、少なくとも１ｎＭ（すなわち、１ｎＭ以上の親和性）、例えば約０．１又は０．２ｎＭのＫ_ＤでヒトＣ５に結合する。

【0281】

Ｃ５抗原結合タンパク質及び抗体（すなわち、「抗Ｃ５」抗原結合タンパク質及び抗体）は、医薬製剤、例えば水性製剤であり得る。医薬製剤は、例えば、国際公開第２０２１／０３４６３９号、米国特許出願公開第２０２１－００４６１８２号明細書、国際公開第２０２１／０８１２７７号、米国特許出願公開第２０２１－０１３９５７３号明細書、国際公開第２０１７／２１８５１５号、米国特許出願公開第２０２０－０２６２９０１号明細書、米国特許出願公開第２０１７－０３５５７５７号明細書又は米国特許出願公開第２０２０－０２６２９００号明細書に開示されているものが挙げられ、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、それらは、本明細書に開示されるＣ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせて又は共製剤化することができる。いくつかの実施形態では、それらは、本明細書に開示されるＣ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせてもよいが、共製剤ではない。そのような医薬製剤又は共製剤は、本明細書で使用される場合、Ｃ５抗原結合タンパク質又は抗体及び薬学的に許容される担体を含む製剤を指す。薬学的に許容される担体としては、例えば、１種以上の賦形剤が挙げられる。いくつかの実施形態では、医薬製剤又は共製剤は水性であり、すなわち水を含む。

【0282】

Ｃ５抗原結合タンパク質を含む医薬製剤は、抗原結合タンパク質を１つ以上の賦形剤と混合することによって調製され得る（例えば、Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔａｌ．（２００１）ＧｏｏｄｍａｎａｎｄＧｉｌｍａｎ’ｓＴｈｅＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌＢａｓｉｓｏｆＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ａｎｄＷｉｌｋｉｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；Ａｖｉｓ，ｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９３）ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ：ＰａｒｅｎｔｅｒａｌＭｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，ｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）（１９９０）ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ：ＤｉｓｐｅｒｓｅＳｙｓｔｅｍｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒａｎｄＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）ＥｘｃｉｐｉｅｎｔＴｏｘｉｃｉｔｙａｎｄＳａｆｅｔｙ，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。医薬製剤は、例えば、粘度低下剤、安定剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0283】

抗体含有製剤と共に使用するための様々な粘度低下剤が当技術分野で公知である。そのような粘度低下剤としては、アミノ酸（例えば、Ｄ－又はＬ－異性体）、例えば、（Ｄ－又はＬ－）アルギニン（例えば、Ｌ－アルギニン、例えば、Ｌ－アルギニンＨＣｌ又はＤ－アルギニン）、（Ｄ－又はＬ－）アラニン、プロリン、（Ｄ－又はＬ－）バリン、グリシン、（Ｄ－又はＬ－）セリン、（Ｄ－又はＬ－）フェニルアラニン、（Ｄ－又はＬ－）リジン、及び（Ｄ－又はＬ－）グルタミン酸、及びその塩（例えば、Ｎａ塩又はＨＣｌ塩）；無機塩（例えば、ＮａＣｌ又はＭｇＣｌ_２）、ピリドキサミン；Ｌ－オルニチン；チアミンリン酸塩化エステル二水和物、ベンゼンスルホン酸及び／又はピリドキシンが挙げられる。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、Ｌ－アルギニンなどのＬ－アミノ酸である。

【0284】

安定剤には、抗体又は抗原結合断片の分解、例えば凝集の低減を助ける作用物質、例えば糖又はポリオールが含まれる。ポリオールは、複数のヒドロキシル基を有する糖アルコールである。安定剤としては、糖又はポリオール、例えば、トレハロース、ソルビトール、マンニトール、タウリン、プロパンスルホン酸、Ｌ－プロリン、スクロース、グリセロール、トレイトール、マルチトール、及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ；例えば、ＰＥＧ３３５０）が挙げられる。

【0285】

非イオン性界面活性剤は、帯電していない頭部基を有する分子を含有する。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレン部分を含む非イオン性界面活性剤；ソルビタン；オクタエチレングリコールモノドデシルエーテルなどのポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル；ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル；ポリオキシプロピレングリコールアルキルエーテル；デシルグルコシド、ラウリルグルコシド、オクチルグルコシドなどのグルコシドアルキルエーテル；トリトンＸ－１００などのポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル；ノノキシノール－９などのポリオキシエチレングリコールアルキルフェノールエーテル；グリセリルラウレートなどのグリセロールアルキルエステル；ポリソルベートなどのポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル；スパンなどのソルビタンアルキルエステル；コカミドＭα、コカミドＤＥＡ、ドデシルジメチルアミンオキシド；ポロキサマーなどのポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのブロックコポリマー；及びポリエトキシル化タローアミン（ＰＯＥＡ）；ポロキサマー１８８、ポリエチレングリコール３３５０、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ３３５０）、又はポリソルベート８０（ＰＳ８０）若しくはポリソルベート２０（ＰＳ２０）などのポリソルベートが挙げられる。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート－２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート－８０（ＰＳ８０）である。

【0286】

緩衝剤は、弱酸とその共役塩基又はその逆の混合物からなる水溶液であり、そのｐＨの変化に抵抗し、したがってｐＨをほぼ一定の値に維持する。様々な緩衝剤、例えばヒスチジン系緩衝剤、リン酸緩衝剤又はクエン酸緩衝剤を医薬製剤又は共製剤に使用することができる。ヒスチジンベースの緩衝剤は、ヒスチジンを含む緩衝剤である。ヒスチジン緩衝剤の例としては、塩化ヒスチジン、塩酸ヒスチジン、酢酸ヒスチジン、リン酸ヒスチジン及び硫酸ヒスチジンが挙げられる。

【0287】

いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体は、高濃度（少なくとも１５０ｍｇ／ｍＬ又は少なくとも２００ｍｇ／ｍＬ）の低粘度（例えば、約１５ｃＰ未満、例えば、約１４又は１４．３）を有するＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体を含む医薬製剤であり得る。例えば、そのような医薬製剤は、２００ｍｇ／ｍＬのポゼリマブ；２０ｍＭのヒスチジン緩衝剤；１００ｍＭのＬ－アルギニン塩酸塩；２％（ｗ／ｖ）スクロース；０．１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート－８０；水、ｐＨ５．８を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。

【0288】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、Ｃ５抗原結合タンパク質（例えば、≧１５０ｍｇ／ｍＬ、≧２００ｍｇ／ｍＬ、≧２５０ｍｇ／ｍＬ、≧２７４ｍｇ／ｍｌ又は≧２７５ｍｇ／ｍＬの抗Ｃ５抗原結合タンパク質）；緩衝剤（例えば、約２０ｍＭ）；アミノ酸（例えば、約１００ｍＭ）；任意選択の糖（例えば、約２％）；任意選択の非イオン性界面活性剤（例えば、約０．１５％）；及び水；ｐＨ約５～６（例えば、約ｐＨ．５．８）を含み得る。

【0289】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、約１５０又は２００ｍｇ／ｍＬ又はそれを超えるＣ５抗原結合タンパク質と、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤又はイミダゾール緩衝剤）；アルギニン（例えば、Ｌ－アルギニンＨＣｌ、例えば、５０～１００ｍＭ、例えば、１００ｍＭ）；水；及び任意選択的に、オリゴ糖（例えば、スクロース、マンニトール、デキストロース、グリセロール、ＴＭＡＯ（トリメチルアミンＮ－オキシド）、トレハロース、エチレングリコール、グリシンベタイン、キシリトール又はソルビトール、例えば２％）；任意選択的に、非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレン系清浄剤又はグリコシド化合物系清浄剤、ポリソルベート－２０、ポリソルベート－８０又はツイーン－２０）、ｐＨ約６．１まで、例えば５～６、例えば５．８；約１４、１４．３又は１５ｃＰ（２０℃）以下の粘度を有する。

【0290】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は水性（例えば、静脈内及び／又は皮下投与に適している）であり、Ｃ５抗原結合タンパク質若しくは抗体又はその抗原結合断片（例えば、ポゼリマブ）（例えば、約２００ｍｇ／ｍＬ又は約１８０～２１０ｍｇ／ｍＬ）、ヒスチジン（例えば、ヒスチジン－ＨＣｌ；例えば、約２０ｍＭ又は２０ｍＭ±４ｍＭ）、ｐＨ約５．８又は５．８±０．３、アルギニン（例えば、約１００ｍＭ又は１００ｍＭ±２０ｍＭ；例えば、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アルギニンＨＣｌ又はＬ－アルギニン一塩酸塩）、ポリオール、例えばスクロース（例えば、約２％又は２％±０．４％（ｗ／ｖ））、及び非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート（例えば、ポリソルベート８０；例えば、約０．１５％又は０．１５％＋０．０７５％（ｗ／ｖ）を含む。例えば、医薬製剤は、２００ｍｇ／ｍＬのポゼリマブ、２０ｍＭのヒスチジン緩衝剤、１００ｍＭのＬ－アルギニン塩酸塩、２％（ｗ／ｖ）スクロース、０．１５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート－８０及び水、ｐＨ５．８を含み得る。

【0291】

「アルギニン」又は「Ｌ－アルギニン」は、その任意の薬学的に許容される塩形態、例えば、Ｌ－アルギニン塩酸塩を含む。

【0292】

緩衝剤は製剤のｐＨを制御し、場合によってはタンパク質産物の全体的な安定性に寄与する。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤又はイミダゾール緩衝剤である。

【0293】

アミノ酸は、２０個の必須アミノ酸のいずれか１つであり得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸は、グリシン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、アスパラギン、グルタミン、プロリン又はヒスチジンである。

【0294】

いくつかの実施形態では、オリゴ糖は、スクロース、マンニトール、デキストロース、グリセロール、ＴＭＡＯ（トリメチルアミンＮ－オキシド）、トレハロース、エチレングリコール、グリシンベタイン、キシリトール又はソルビトールである。

【0295】

非イオン性界面活性剤は、荷電していない頭部基を有する分子を含有する。本発明の一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン系又はグリコシド化合物系である。いくつかの実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート－２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート－８０（ＰＳ８０）又はツイーン－２０である。

【0296】

いくつかの実施形態では、医薬製剤は、国際公開第２０２１／０３４６３９号又は米国特許出願公開第２０２１－００４６１８２号明細書に記載されているものであり、その各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0297】

ＩＶ．組み合わせ
Ｃ５抗原結合タンパク質及び／又は他の治療剤と組み合わせて、又はそれと会合させて、Ｃ５遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの組み合わせも本明細書に開示される。Ｃ５遺伝子座及びＣ５抗原結合タンパク質を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、本明細書の他の箇所に詳細に記載されている。本明細書で使用される場合、「と組み合わせて」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの投与前、投与と同時、又は投与後に追加の治療活性成分を投与することができることを意味する。「と組み合わせて」という用語はまた、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及び第２の治療剤の連続投与又は同時投与を含む。

【0298】

本明細書中に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃ５に伴う疾患又は障害を治療するために使用される１つ以上の薬物又は治療と相乗的に組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを第２の治療剤と組み合わせて、疾患の１つ以上の症状を改善することができる。

【0299】

Ｃ５関連疾患又は障害に応じて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、限定されないが、Ｃ５抗原結合タンパク質、抗凝固薬（例えば、ワルファリン、アスピリン、ヘパリン、フェニンジオン、フォンダパリヌクス、イドラパリヌクス、及びアルガトロバン、レピルジン、ビバリルジン、又はダビガトランなどのトロンビン阻害剤）、抗炎症薬（例えば、コルチコステロイド、及び非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ））、降圧薬（例えば、アンジオテンシン変換酵素阻害剤）、免疫抑制薬（例えば、ビンクリスチン、シクロスポリンＡ又はメトトレキサート）、線溶剤（例えば、ａｎｃｒｏｄ、Ｅ－アミノカプロン酸、抗プラスミン－ａ１、プロスタサイクリン及びデフィブロチド）、脂質低下剤、例えばヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの阻害剤、抗ＣＤ２０剤、例えばリツキシマブ、抗ＴＮＦα剤、例えばインフリキシマブ、抗発作剤（例えば、硫酸マグネシウム）、Ｃ３阻害剤、又は抗血栓剤を含む１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて使用され得る。いくつかの実施形態では、更なる治療剤は、アセトアミノフェン、アルブミン（例えば、注入の形態で）、アンクロッド、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、抗生物質（例えば、経口抗生物質）、更なる抗体、抗ＣＤ２０剤、リツキシマブ、抗凝固剤、抗真菌剤、降圧剤、抗炎症薬、抗プラスミン－ａ１、抗発作剤、抗血栓剤、抗ＴＮＦα剤、抗ウイルス剤、アルガトロバン、アスピリン、生物学的治療剤、ビバリルジン、Ｃ３阻害剤、コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、ダビガトラン、デフィブロチド、Ｅ－アミノカプロン酸、経腸栄養、エリスロマイシン、エリスロポエチン、線溶剤、葉酸、フォンダパリヌクス、ヘパリン、ホルモン補充療法、イブプロフェン、イドラパリヌクス、免疫抑制薬、インフリキシマブ、ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡレダクターゼの阻害剤、鉄サプリメント、レピルジン、脂質低下剤、硫酸マグネシウム、髄膜炎菌ワクチン（例えば、血清型Ａ、Ｃ、Ｙ、Ｗ及び血清型Ｂ）、メトトレキサート、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、オリゴヌクレオチド、パラセタモール、非経口栄養、ペニシリン、フェニンジオン、妊娠避妊薬、プロスタサイクリン、リツキシマブ、トロンビン阻害剤、ワクチン、ビンクリスチン、ビタミン、及び／又はワルファリンである。

【0300】

特定の実施形態では、第２の治療剤は、Ｃ５抗原結合タンパク質（例えば、Ｃ５抗体）又はＣ５抗原結合タンパク質の組み合わせである。本明細書では、Ｃ５に対する広範な中和又は阻害活性を有する抗体の組み合わせ（「カクテル」）を使用することが企図される。いくつかの実施形態では、非競合抗体を組み合わせ、それを必要とする対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、組み合わせを含む抗体は、タンパク質上の異なる重複しないエピトープに結合する。組み合わせを含む抗体は、Ｃ５コンバターゼへのＣ５の結合を遮断し得、及び／又はＣ５ａ及びＣ５ｂへのＣ５の切断を防止／阻害し得る。特定の実施形態では、第２の抗体は、ヒト血清中でより長い半減期を有し得る。

【0301】

追加の治療活性成分（複数可）は、Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの投与前に対象に投与され得る。例えば、第１の成分が第２の成分の投与の１週間前、７２時間前、６０時間前、４８時間前、３６時間前、２４時間前、１２時間前、６時間前、５時間前、４時間前、３時間前、２時間前、１時間前、３０分前、１５分前、１０分前、５分前、又は１分未満前に投与される場合、第１の成分は第２の成分「前に」投与されると見なされ得る。他の実施形態では、追加の治療活性成分は、Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの投与後に対象に投与され得る。例えば、第１の成分が、第２の成分の投与の１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、１時間後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、１２時間後、２４時間後、３６時間後、４８時間後、６０時間後、７２時間後に投与される場合、第１の成分は、第２の成分の「後に」投与されたと見なされ得る。更に他の実施形態では、追加の治療活性成分は、Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの投与と同時に対象に投与され得る。「同時」投与には、例えば、Ｃ５遺伝子座又は遺伝子及び更なる治療活性成分を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを対象に単一剤形で、又は互いに約３０分以内に対象に投与される別々の剤形で投与することが含まれる。別々の剤形で投与される場合、各剤形は同じ経路を介して投与され得（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及び更なる治療活性成分（例えば、抗Ｃ５抗体）の両方が静脈内などに投与され得る）、あるいは、各剤形は、異なる経路を介して投与され得る（例えば、Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが静脈内投与され得、更なる治療活性成分が皮下投与され得る）。いずれにしても、成分を単一剤形で、同じ経路による別個の剤形で、又は異なる経路による別個の剤形で投与することは、本開示の目的のために、全て「同時投与」と見なされる。本開示の目的のために、Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの投与は、追加の治療活性成分の投与の「前に」、「同時に」又は「後に」（それらの用語は本明細書中上で定義される）は、追加の治療活性成分と「組み合わせて」Ｃ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの投与と見なされる。

【0302】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが、本明細書の他の箇所に記載されるような１つ以上の追加の治療活性成分（例えば、Ｃ５抗原結合タンパク質又は抗体）と共製剤化される医薬組成物が使用される。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む医薬組成物は、本明細書の他の箇所に記載されているような１つ以上の追加の治療活性成分（例えば、Ｃ５抗原結合タンパク質又は抗体）と組み合わせて使用されるが、共製剤では使用されない。例えば、１つ以上の更なる治療剤（例えば、本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質）と関連してＣ５遺伝子座又は遺伝子を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む医薬製剤が提供される。「～と会合して」という用語は、医薬製剤の成分、（１）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及び薬学的に許容される担体成分が、（２）Ｃ５抗原結合タンパク質又は抗体などの１つ以上の更なる治療剤と共に、例えば同時送達のために単一の組成物に製剤化され得るか、又は２つ以上の組成物に別々に製剤化され得ることを示す（例えば、更なる治療剤が別個の製剤中にある、各成分を含むキット）。互いに会合して投与される成分は、他の成分が投与されるときと同時に又は異なる時間に対象に投与することができ、例えば、各投与は、所与の期間にわたって１つ以上の間隔で同時に（例えば、単一の組成物中で一緒に、又は同じ投与セッション中に本質的に同時に）又は非同時に与えられ得る。更に、互いに関連して投与される別個の成分は、同じ又は異なる経路によって対象に投与され得る。

【0303】

Ｖ．Ｃ５を標的とする方法
本明細書中にはまた、本明細書中に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用してＣ５遺伝子座又は遺伝子を改変するか、又は標的化するか、又はノックダウンするか、又はノックアウトする方法、同様にまた、Ｃ５に伴う疾患、障害又は状態の治療及び／又は予防のための、並びに／あるいはそのような疾患、障害又は状態に伴う少なくとも１つの症状を、単独で、又は他の治療剤（例えば、本明細書中に開示されるＣ５抗原結合タンパク質又は抗体など）と組み合わせてのいずれかで、改善するための予防的及び治療的適用におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用が開示される。

【0304】

Ａ．Ｃ５遺伝子座を改変又はノックアウトする方法
本明細書の他の箇所に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬（例えば、Ｃａｓタンパク質又はそれをコードする核酸及び１つ以上のＣ５標的化ｇＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡ）を使用してＣ５遺伝子又は遺伝子座（例えば、内在性Ｃ５遺伝子又はＣ５ゲノム遺伝子座）を改変又は不活性化（例えば、ノックダウン又はノックアウト）して、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座（例えば、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座内の標的ゲノム遺伝子座）において標的化遺伝子改変を生成するための様々な方法が提供される。任意選択的に、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座を標的とする外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬と共に使用することができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬は、外因性ドナー核酸なしで使用することができる。ノックダウンは、Ｃ５遺伝子産物（例えば、Ｃ５タンパク質、Ｃ５ｍＲＮＡ、又はその両方）の発現の減少を指す。Ｃ５タンパク質のノックダウンは、目的の組織若しくは細胞集団又は血清中からタンパク質の総細胞量を検出することによって測定することができる。Ｃ５ｍＲＮＡのノックダウンを測定するための方法は公知であり、目的の組織又は細胞集団から単離されたｍＲＮＡの配列決定を含む。ノックダウンは、Ｃ５遺伝子産物の発現のいくらかの喪失、例えば、転写されるＣ５ｍＲＮＡの量の減少又は細胞集団（組織において見出されるものなどのインビボ集団を含む）によって発現されるＣ５タンパク質の量の減少を指し得る。ノックアウトとは、細胞におけるＣ５タンパク質の発現の喪失を指す。ノックアウトは、細胞、組織若しくは細胞集団又は血清中のＣ５タンパク質の総細胞量を検出することのいずれかによって測定することができる。本明細書中に記載される方法は、１つ以上の細胞において（例えば、組織に見られるものなどのインビボ集団を含む細胞の集団において）Ｃ５をノックアウトすることができる。いくつかの方法において、ノックアウトは、変異Ｃ５タンパク質（例えば、インデルによって作成される）の形成ではなく、むしろ細胞におけるＣ５タンパク質の発現の完全な喪失である。そのような方法はまた、Ｃ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体の投与と組み合わせてもよい。例えば、本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体のいずれかを使用することができる。

【0305】

Ｃ５遺伝子又は遺伝子座は、動物又は細胞中に存在することができ、方法は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで行うことができる。動物には、哺乳動物、魚類及び鳥類が含まれる。哺乳動物は、例えば、非ヒト哺乳動物、ヒト、げっ歯動物、ラット、マウス、又はハムスターであり得る。一例では、動物はヒトである。他の非ヒト哺乳動物には、例えば、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）、サル、類人猿、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、雄ウシ、シカ、バイソン、家畜（例えば、ウシ、去勢牛などのウシ種、ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種、並びにブタ、及びイノシシなどのブタ種）が含まれる。鳥類には、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ダチョウ、ガチョウ、アヒルなどが含まれる。飼育動物及び農業用動物も含まれる。本明細書に開示される方法における動物はヒトであり得るか、又は非ヒト動物であり得る。「非ヒト」という用語はヒトを除外する。非ヒト動物の特定の例としては、マウス及びラットなどのげっ歯類、又はカニクイザルなどの非ヒト霊長類が挙げられる。

【0306】

本方法において使用される細胞は、任意のタイプの動物に由来し得、それらは、任意のタイプの未分化状態又は分化状態であり得る。細胞は、インビトロ、エクスビボ、又はインビボであり得る。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞、又はマウス胚性幹（ＥＳ）細胞又はラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、又は非多能性細胞であってよい。全能性細胞には、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞が含まれ、多能性細胞には、２つ以上の分化細胞型に発達する能力を有する未分化細胞が含まれる。

【0307】

本明細書で提供される細胞はまた、生殖細胞（例えば、精子又は卵母細胞）であり得る。細胞は、有糸分裂能力のある細胞又は有糸分裂的に不活性な細胞、減数分裂能力のある細胞又は減数分裂的に不活性な細胞であり得る。同様に、細胞はまた、初代体細胞又は初代体細胞ではない細胞であり得る。体細胞には、配偶子、生殖細胞、配偶子細胞、又は未分化幹細胞ではない任意の細胞が含まれる。例えば、細胞は、肝細胞、腎臓細胞、造血細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、間葉系細胞、ケラチノサイト、血液細胞、メラノサイト、単球、単核細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、赤芽球－巨核球細胞、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、膵島ベータ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、ニューロン、グリア細胞、神経幹細胞、ニューロン、肝芽細胞、肝細胞、心筋細胞、骨格筋芽細胞、平滑筋細胞、管細胞、腺房細胞、アルファ細胞、ベータ細胞、デルタ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色又は褐色脂肪細胞、又は眼細胞（例えば、小柱網目細胞、網膜色素上皮細胞、網膜微小血管内皮細胞、網膜周囲細胞、結膜上皮細胞、結膜線維芽細胞、虹彩色素上皮細胞、角膜細胞、水晶体上皮細胞、非色素繊毛上皮細胞、眼脈絡膜線維芽細胞、光受容細胞、神経節細胞、双極細胞、水平細胞、又はアマクリン細胞）であり得る。例えば、細胞は、肝芽細胞又は肝細胞などの肝細胞であり得る。本明細書で提供される細胞は、正常で健康な細胞であり得るか、又は罹患した細胞若しくは変異体を担持する細胞であり得る。

【0308】

非ヒト動物は、あらゆる遺伝的背景からのものであってよい。例えば、好適なマウスは、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９及びＣ５７ＢＬ／６の雑種、ＢＡＬＢ／ｃ系統、又はスイスウェブスター系統からのものであり得る。１２９系統の例には、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、及び１２９Ｔ２が含まれる。例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇｅｔａｌ．（１９９９）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ１０（８）：８３６を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。Ｃ５７ＢＬ系統の例には、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが含まれる。好適なマウスはまた、前述の１２９系統及び前述のＣ５７ＢＬ／６系統の雑種（例えば、５０％１２９及び５０％Ｃ５７ＢＬ／６）からのものであり得る。同様に、好適なマウスは、前述の１２９系統の雑種又は前述のＢＬ／６系統の雑種（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）からのものであり得る。

【0309】

同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、ＤａｒｋＡｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、又はフィッシャーＦ３４４若しくはフィッシャーＦ６などのフィッシャーラット系統からのものであり得る。ラットはまた、上述の２つ以上の系統の雑種に由来する系統から得ることができる。例えば、好適なラットは、ＤＡ系統又はＡＣＩ系統からのものであり得る。ＡＣＩラット系統は、白い腹及び足、並びにＲＴ１^ａｖ１ハプロタイプを有する黒いアグーチを持っていることを特徴としている。このような系統は、ＨａｒｌａｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。ＤａｒｋＡｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートとＲＴ１^ａｖ１ハプロタイプを有することを特徴としている。このようなラットは、ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む様々な供給源から入手できる。場合によっては、好適なラットは近交系ラット系統に由来する可能性がある。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１４／０２３５９３３号を参照されたい。

【0310】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬（及び任意選択的に外因性ドナー核酸）は、本明細書の他の箇所に記載されるような任意の形態及び任意の手段によって細胞又は動物に導入することができ、全て又はいくつかは、本明細書の他の箇所に記載されるような任意の組み合わせで同時に又は連続的に導入することができる。同様に、任意の追加の薬剤（例えば、Ｃ５抗原結合タンパク質）を、本明細書の他の箇所に記載される任意の形態及び任意の手段で導入することができる。

【0311】

いくつかの方法では、１つのガイドＲＮＡが使用される。他の方法では、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座内の追加のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする１つ以上の追加のガイドＲＮＡを使用することができる。１つ以上の更なるガイドＲＮＡ（例えば、第２のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする第２のガイドＲＮＡ）を使用することによって、Ｃａｓタンパク質による切断は、２つ又はそれを超える二本鎖切断又は２つ又はそれを超える一本鎖切断を生じ得る（例えば、Ｃａｓタンパク質がニッカーゼである場合）。いくつかの方法では、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座中のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする２つ以上のガイドＲＮＡを使用することができる（例えば、２つのガイドＲＮＡを使用することができる）。いくつかの方法では、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座中のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする３つ以上のガイドＲＮＡを使用することができる（例えば、３つのガイドＲＮＡを使用することができる）。いくつかの方法では、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座中のガイドＲＮＡ標的配列を標的とする４つ以上のガイドＲＮＡを使用することができる（例えば、４つのガイドＲＮＡを使用することができる）。

【0312】

任意選択的に、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座中の標的ゲノム遺伝子座と組換える１つ以上の外因性ドナー配列を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬と一緒に使用して、標的化遺伝子改変を生成することができる。本方法で使用することができる外因性ドナー配列の例及び変形は、本明細書の他の箇所に開示されている。

【0313】

ゲノム内のＣ５遺伝子又は遺伝子座における標的化遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）及び１つ以上のガイドＲＮＡを含む複合体とゲノムを接触させることによって生成することができ、それぞれがＣ５遺伝子内の異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的化し、Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡ標的配列において１つ以上のニック又は二本鎖切断を生成する。任意選択的に、ゲノムを１つ以上の外来性ドナー核酸と更に接触させることができる。例えば、ゲノム中のＣ５遺伝子に対する標的化遺伝子改変は、Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡ標的配列において１つ以上のニック又は二本鎖切断を作り出すように、Ｃ５遺伝子中の異なるガイドＲＮＡ標的配列をそれぞれ標的化するＣａｓタンパク質（又はＣａｓタンパク質をコードする核酸、例えばｍＲＮＡ又はＤＮＡ）及び１つ以上のガイドＲＮＡ（又は１つ以上のガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）を細胞又は動物に導入することによって生成することができる。任意選択的に、１つ以上の外因性ドナー核酸を細胞に導入することもできる。Ｃａｓタンパク質は、各ガイドＲＮＡと異なる複合体を形成し、Ｃａｓタンパク質はガイドＲＮＡ標的配列を切断する。外因性ドナー核酸は、使用される場合、標的ゲノム遺伝子座と組み換わることができる。Ｃａｓタンパク質による切断は、二本鎖切断又は一本鎖切断を生じ得る（例えば、Ｃａｓタンパク質がニッカーゼである場合）。本方法で使用することができるＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの例及び変形は、本明細書の他の箇所に記載されている。

【0314】

ガイドＲＮＡは、例えばＲＮＡ（例えば、本明細書中に開示される改変ガイドＲＮＡなどのインビトロ転写ＲＮＡ）の形態で、又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で、動物又は細胞に導入することができる。ＤＮＡの形態で導入される場合、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞内又は動物の細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ＡＡＶを介して送達され、Ｕ６プロモーターの下で、インビボで発現され得る。そのようなＤＮＡは、１つ以上の発現構築物中にあり得る。例えば、そのような発現構築物は、単一の核酸分子の構成要素であり得る。代替的に、それらは、２つ以上の核酸分子の間で任意の組み合わせで分離することができる（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲＲＮＡをコードするＤＮＡ及び１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、別個の核酸分子の構成要素であり得る）。

【0315】

同様に、Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で動物又は細胞に導入することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供することができる。あるいは、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸、例えばＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））、例えば本明細書に開示される修飾ｍＲＮＡ又はＤＮＡ）の形態で提供され得る。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞又は生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、又は任意の他の目的の宿主細胞においてより高い頻度で使用される代替コドンへと改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞又は動物に導入される場合、Ｃａｓタンパク質は、細胞又は動物の細胞において一過性、条件付き又は構成的に発現され得る。

【0316】

一例では、Ｃａｓタンパク質はｍＲＮＡ（例えば、本明細書中に開示されるような修飾ｍＲＮＡ）の形態で導入され、ガイドＲＮＡはＲＮＡ、例えば本明細書に開示される修飾ｇＲＮＡ（例えば、同じ脂質ナノ粒子内で一緒に）の形態で導入される。

【0317】

ガイドＲＮＡは、本明細書の他の箇所に開示されるように修飾することができる。同様に、ＣａｓｍＲＮＡは、本明細書の他の箇所に開示されるように修飾することができる。

【0318】

Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子内の任意の所望の位置を標的とすることができる。ヒトＣ５遺伝子などのＣ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子内の任意の連続配列を標的化することができる。Ｃ５遺伝子という用語は、Ｃ５調節プロモーター及びエンハンサー配列並びにＣ５コード配列を含むゲノム領域を含む。Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、コード配列、非コード配列（例えば、プロモーター領域又はエンハンサー領域などの調節エレメント）、又はそれらの組み合わせを標的化することができる。一例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、コードエキソンのいずれか中の連続したコード配列を標的化することができる。一例では、ガイドＲＮＡ標的配列は、この領域がアナフィラトキシンＣ５ａをコードするので、コードエキソン１６及び１７にはない。一例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン４を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン５を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン６を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン７を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン８を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン９を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１０を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１１を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１２を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１３を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１４を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１５を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１６を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１７を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１８を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン１９を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２０を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２１を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２２を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２３を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２４を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２５を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２６を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２７を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２８を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン２９を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３０を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３１を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３２を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３３を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３４を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３５を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３６を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３７を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３８を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン３９を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン４０を標的化することができる。別の例として、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のコードエキソン４１を標的化することができる。ガイドＲＮＡ標的配列（例えば、少なくとも１つのヌクレオチド）の少なくとも一部がコードエキソンＸ内にある場合、ガイドＲＮＡ標的配列はコードエキソンＸ内にある。

【0319】

具体的な例において、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、コードエキソン１、１２、１５、２１、２２又は２７を標的化し得る。別の具体例において、Ｃ５遺伝子を標的化するガイドＲＮＡは、コードエキソン１２又は１５を標的化し得る。

【0320】

ガイドＲＮＡは、対応するＣａｓタンパク質による切断が、機能喪失対立遺伝子をもたらすフレームシフト挿入／欠失（インデル）突然変異をもたらすように、Ｃ５遺伝子のコード領域を標的とするように設計することができる。そのようなフレームシフト変異は、標的化ＤＮＡ二本鎖切断、及びそれに続く非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した変異原性修復によって達成することができ、これにより、切断部位にインデルが生成される。ＤＳＢに導入されているインデルはランダムであり、一部のインデルはＣ５遺伝子の早期終了を引き起こすフレームシフト変異をもたらす。別の例として、ガイドＲＮＡは、対応するＣａｓタンパク質による切断がプロモーター領域又はエンハンサー領域の破壊をもたらすように、Ｃ５遺伝子のプロモーター領域又はエンハンサー領域を標的化するように設計され得る。そのようなフレームシフト変異は、標的化ＤＮＡ二本鎖切断、及びそれに続く非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介した変異原性修復によって達成することができ、これにより、切断部位にインデルが生成される。

【0321】

Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子の構成的エキソンを標的とすることができる。例えば、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、５’構成エキソンを標的とすることができる。構成的エキソンは、スプライシング後に一貫して保存されているコードエキソンである。全ての関連組織にわたって発現されるエキソンは、ガイドＲＮＡ標的化のための構成的エキソンと考えることができる。いくつかの例では、Ｃ５遺伝子を標的とするガイドＲＮＡは、選択的スプライシング部位を含有するいずれのエキソンも標的としない。単一のＣ５コード転写物のみが存在するので、Ｃ５の４１個のコードエキソン全てが構成的であると考えられる。

【0322】

【0323】

【0324】

２つのガイドＲＮＡが使用される方法において、各々は、Ｃ５遺伝子若しくは遺伝子座の同じ領域、又はＣ５遺伝子若しくは遺伝子座の異なる領域を標的とすることができる。例えば、各ガイドＲＮＡは、（例えば、Ｃａｓタンパク質による切断後に開始コドンが破壊されるように）開始コドンの約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、又は約１，０００ヌクレオチド以内、又は開始コドンを含む異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的とし得る。代替的又は追加的に、各ガイドＲＮＡは、異なる連続したコード配列を標的とすることができる。例えば、各ガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子の構成エキソン又はＣ５遺伝子の５’構成エキソン内の異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。別の例として、各ガイドＲＮＡは、コードエキソン１～４１、コードエキソン１、１２、１５、２１、２２及び２７、又はコードエキソン１２及び１５から選択されるコードエキソン中の異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。別の例として、各ガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のプロモーター領域又はエンハンサー領域内の異なるガイドＲＮＡ標的配列を標的とするように設計することができる。別の例として、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子の連続したコード配列を標的とすることができ、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、Ｃ５遺伝子のプロモーター領域又はエンハンサー領域のガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる。別の例として、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、開始コドンの約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、若しくは約１，０００ヌクレオチド以内、又は開始コドンを含むガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができ、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、停止コドンの約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２００、約３００、約４００、約５００、若しくは約１，０００ヌクレオチド以内、又は停止コドンを含むガイドＲＮＡ標的配列を標的とすることができる（例えば、両方のガイドＲＮＡ標的配列でのＣａｓタンパク質による切断は、２つのガイドＲＮＡ標的配列の間のコード領域の欠失をもたらし得る）。

【0325】

Ｃａｓタンパク質による切断後に１つ以上の外因性ドナー核酸を使用してＣ５遺伝子又は遺伝子座を改変する方法では、Ｃａｓタンパク質は標的ゲノム遺伝子座を切断して一本鎖切断（ニック）又は二本鎖切断を作ることができ、切断又はニックが入った遺伝子座は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介挿入又は相同組換え修復を介して外因性ドナー核酸によって修復され得る。任意選択的に、外因性ドナー核酸による修復は、標的化された対立遺伝子がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬によって再標的化され得ないように、ガイドＲＮＡ標的配列（複数可）を除去又は破壊する。

【0326】

外因性ドナー核酸は、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座の任意の配列を標的とすることができる。いくつかの外因性ドナー核酸は、相同性アームを含む。他の外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まない。外因性ドナー核酸は、相同組換え修復によってＣ５遺伝子若しくは遺伝子座に挿入することができ、及び／又は非相同末端結合によってＣ５遺伝子若しくは遺伝子座に挿入することができる。

【0327】

外因性ドナー核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができ、それらは一本鎖又は二本鎖であり得、かつそれらは直線状又は環状の形態であり得る。例えば、外因性ドナー核酸は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。例えば、全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる、Ｙｏｓｈｉｍｉｅｔａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．。７：１０４３１を参照されたい。外因性ドナー核酸は、ネイキッド核酸であってもよく、ＡＡＶなどのウイルスによって送達されてもよい。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶを介して送達することができ、非相同末端結合によってＣ５遺伝子又は遺伝子座に挿入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まないものであってよい）。

【0328】

例示的な外因性ドナー核酸は、約５０ヌクレオチド～約５ｋｂの長さ、又は約５０ヌクレオチド～約３ｋｂの長さである。代替的に、外因性ドナー核酸は、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、約２ｋｂ～約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ～約３ｋｂ、約３ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４ｋｂ、約４ｋｂ～約４．５ｋｂ、又は約４．５ｋｂ～約５ｋｂの長さであってよい。代替的に、外因性ドナー核酸は、例えば、５ｋｂ、４．５ｋｂ、４ｋｂ、３．５ｋｂ、３ｋｂ、又は２．５ｋｂ以下の長さであってよい。

【0329】

一例では、外因性ドナー核酸は、約８０ヌクレオチド～約３ｋｂの長さのｓｓＯＤＮである。そのようなｓｓＯＤＮは、５’末端及び／又は３’末端にホモロジーアーム又は短い一本鎖領域を有することができ、これらは、例えばそれぞれ約４０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチドの長さである、標的ゲノム遺伝子座でのＣａｓ剤媒介切断によって作成される１つ以上の突出に相補的である。そのようなｓｓＯＤＮはまた、例えば、それぞれ約３０ヌクレオチドから～１００ヌクレオチドの長さであるホモロジーアーム又は相補的領域を有してもよい。ホモロジーアーム又は相補的領域は、対称的（例えば、各４０ヌクレオチド又は各６０ヌクレオチド長）であってもよく、又はそれらは非対称的（例えば、３６ヌクレオチド長である１つのホモロジーアーム又は相補的領域、及び９１ヌクレオチド長である１つのホモロジーアーム又は相補的領域）であってもよい。

【0330】

外因性ドナー核酸は、追加の望ましい特徴（例えば、修飾又は調節された安定性、蛍光標識による追跡又は検出、タンパク質又はタンパク質複合体の結合部位など）を提供する修飾又は配列を含み得る。外因性ドナー核酸は、１つ以上の蛍光標識、精製タグ、エピトープタグ、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。例えば、外因性ドナー核酸は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの蛍光標識などの１つ以上の蛍光標識（例えば、蛍光タンパク質又は他のフルオロフォア又は色素）を含んでもよい。例示的な蛍光標識としては、フルオレセイン（例えば、６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ））、テキサスレッド、ＨＥＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、パシフィックブルー、５－（及び－６）－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）及びＣｙ７などのフルオロフォアが挙げられる。オリゴヌクレオチドを標識するための幅広い蛍光色素が市販されている（例えば、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）。そのような蛍光標識（例えば、内部蛍光標識）は、例えば、外因性ドナー核酸の末端と適合性のある突出端を有する切断された標的核酸に直接組み込まれた外因性ドナー核酸を検出するために使用することができる。標識又はタグは、外因性ドナー核酸の５’末端、３’末端、又は内部にあってよい。例えば、外因性ドナー核酸は、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＩＲ７００フルオロフォア（５’ＩＲＤＹＥ（登録商標）７００）を有する５’末端にコンジュゲートさせることができる。

【0331】

本明細書に開示される外因性ドナー核酸はまた、標的ゲノム遺伝子座に組み込まれるＤＮＡのセグメントを含む核酸インサートを含む。標的ゲノム遺伝子座での核酸インサートの組み込みは、標的ゲノム遺伝子座への目的の核酸配列の付加、又は標的ゲノム遺伝子座での目的の核酸配列の置換（すなわち、欠失及び挿入）をもたらし得る。いくつかの外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座における対応する挿入なしに、標的ゲノム遺伝子座における核酸配列の欠失のために設計される。いくつかの外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座での対応する欠失なしに、標的ゲノム遺伝子座での核酸インサートの挿入のために設計されている。他の外因性ドナー核酸は、標的ゲノム遺伝子座で目的の核酸配列を欠失し、それを核酸インサートで置き換えるように設計されている。

【0332】

欠失及び／又は置換される標的ゲノム遺伝子座における核酸インサート又は対応する核酸は、様々な長さであってよい。欠失及び／又は置換される標的ゲノム遺伝子座における例示的な核酸インサート又は対応する核酸は、約１ヌクレオチドから約５ｋｂの長さであるか、又は約１ヌクレオチドから約３ｋｂヌクレオチドの長さである。例えば、欠失及び／又は置換される標的ゲノム遺伝子座における核酸インサート又は対応する核酸は、約１～約１００、約１００～約２００、約２００～約３００、約３００～約４００、約４００～約５００、約５００～約６００、約６００～約７００、約７００～約８００、約８００～約９００、又は約９００～約１，０００ヌクレオチドの長さであってよい。同様に、欠失及び／又は置換される標的ゲノム遺伝子座における核酸インサート又は対応する核酸は、約１ｋｂ～１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、約２ｋｂ～約２．５ｋｂ、約２．５ｋｂ～約３ｋｂ、約３ｋｂ～約３．５ｋｂ、約３．５ｋｂ～約４ｋｂ、約４ｋｂ～約４．５ｋｂ、約４．５ｋｂ～約５ｋｂ、又はそれ以上の長さであってよい。

【0333】

欠失及び／又は置換される標的ゲノム遺伝子座の核酸インサート又は対応する核酸は、エキソンなどのコード領域、イントロン、非翻訳領域、又は調節領域（例えば、プロモーター、若しくはエンハンサー）などの非コード領域、又はそれらの任意の組み合わせであってよい。

【0334】

核酸インサートはまた、条件付き対立遺伝子を含み得る。条件付き対立遺伝子は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されているように、多機能対立遺伝子であってよい。例えば、条件付き対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に関してセンス方向の作動配列、（ｂ）センス又はアンチセンス方向の薬物選択カセット（ＤＳＣ）、（ｃ）アンチセンス配向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）、（ｄ）逆方向の条件付き反転モジュール（ＣＯＩＮ、エキソン分割イントロンと反転可能な遺伝子トラップのようなモジュールを利用）を含み得る。例えば米国特許第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい。条件付き対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼへの曝露時に再結合して、（ｉ）作動配列及びＤＳＣを欠き、（ｉｉ）センス方向のＮＳＩとアンチセンス方向のＣＯＩＮを含む、条件付き対立遺伝子を形成する再結合可能なユニットを更に含むことができる。例えば米国特許第２０１１／０１０４７９９号を参照されたい。

【0335】

核酸インサートはまた、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含み得る。代替的に、核酸インサートは、選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを欠くことができる。選択マーカーは、選択カセットに入れることができる。任意選択で、選択カセットは自己削除カセットにすることができる。例えば、米国特許第８，６９７，８５１号明細書及び米国特許出願公開第２０１３／０３１２１２９号明細書を参照されたく、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例として、自己削除カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結されたＣｒｅｉ遺伝子（イントロンによって分離されたＣｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエキソンを含む）及びヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結されたネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。Ｐｒｍ１プロモーターを使用することにより、Ｆ０動物のオスの生殖細胞で特異的に自己欠失カセットを削除することができる。例示的な選択マーカーとしては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ^ｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ^ｒ）、ピューロマイシン－Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏ^ｒ）、ブラスチシジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒ^ｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、又は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｋ）、又はそれらの組み合わせが挙げられる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドは、標的とされる細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。プロモーターの例は、本明細書の他の場所に記載されている。

【0336】

核酸インサートはまた、レポーター遺伝子を含み得る。例示的なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、強化青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、ＤｓＲｅｄ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＭｍＧＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－Ｒｅｄ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びアルカリホスファターゼをコードするものが含まれる。このようなレポーター遺伝子は、標的とされる細胞で活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例は、本明細書の他の場所に記載されている。

【0337】

核酸インサートはまた、１つ以上の発現カセット又は削除カセットを含み得る。所与のカセットは、発現に影響を及ぼす様々な調節成分とともに、目的のヌクレオチド配列、選択マーカーをコードするポリヌクレオチド、及びレポーター遺伝子のうちの１つ以上を含むことができる。含めることができる選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の例は、本明細書の他の場所で詳細に論じられている。

【0338】

核酸インサートは、部位特異的組換え標的配列に隣接する核酸を含むことができる。代替的に、核酸インサートは、１つ以上の部位特異的組換え標的配列を含むことができる。核酸インサート全体がそのような部位特異的組換え標的配列に隣接することができるが、核酸インサート内の任意の領域又は目的の個々のポリヌクレオチドもまた、そのような部位に隣接することができる。核酸インサート又は核酸インサート内の目的の任意のポリヌクレオチドに隣接することができる部位特異的組換え標的配列は、例えば、ｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、ｌｏｘ５１７１、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ＦＲＴ、ｒｏｘ、又はそれらの組み合わせを含んでもよい。一例では、部位特異的組換え部位は、核酸インサート内に含まれる選択マーカー及び／又はレポーター遺伝子をコードするポリヌクレオチドに隣接している。標的遺伝子座での核酸インサートの組み込みに続いて、部位特異的組換え部位間の配列を除去することができる。任意選択で、２つの外因性ドナー核酸を使用することができ、それぞれが部位特異的組換え部位を含む核酸インサートを有する。外因性ドナー核酸は、目的の核酸に隣接する５’及び３’領域を標的にすることができる。２つの核酸インサートを標的ゲノム遺伝子座に組み込んだ後、２つの挿入された部位特異的組換え部位の間の目的の核酸を除去することができる。

【0339】

核酸インサートはまた、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、及びタイプＩＶエンドヌクレアーゼを含む、制限エンドヌクレアーゼ（すなわち、制限酵素）のための１つ以上の制限部位を含むことができる。タイプＩ及びタイプＩＩＩの制限エンドヌクレアーゼは特定の認識部位を認識するが、典型的には、ヌクレアーゼ結合部位から可変位置で切断する。これは、切断部位（認識部位）から数百塩基対離れている場合がある。タイプＩＩシステムでは、制限活性はメチラーゼ活性とは無関係であり、切断は典型的には、結合部位内又は結合部位の近くの特定の部位で起こる。ほとんどのタイプＩＩ酵素はパリンドローム配列を切断するが、タイプＩＩａ酵素は非パリンドローム認識部位を認識して認識部位の外側で切断し、タイプＩＩｂ酵素は認識部位の外側の両方の部位で配列を２回切断し、タイプＩＩｓ酵素は非対称認識部位を認識し、片側で、認識部位から約１～２０ヌクレオチドの定義された距離で切断する。ＩＶ型制限酵素はメチル化されたＤＮＡを標的とする。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｗｅｂｐａｇｅａｔｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ；Ｒｏｂｅｒｔｓｅｔａｌ．，（２００３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：４１８－４２０；Ｒｏｂｅｒｔｓｅｔａｌ．，（２００３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：１８０５－１８１２；及びＢｅｌｆｏｒｔｅｔａｌ．（２００２）ｉｎＭｏｂｉｌｅＤＮＡＩＩ，ｐｐ．７６１－７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅｅｔａｌ．，（ＡＳＭＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ））で更に説明及び分類されている。

【0340】

一部の外因性ドナー核酸は、非相同末端結合によってＣ５遺伝子又は遺伝子座に挿入することができる。場合によっては、そのような外因性ドナー核酸はホモロジーアームを含まない。例えば、そのような外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質による切断後の平滑末端二本鎖切断に挿入することができる。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶを介して送達することができ、非相同末端結合によってＣ５遺伝子又は遺伝子座に挿入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、ホモロジーアームを含まないものであってよい）。

【0341】

具体的な例では、外因性ドナー核酸は、相同性に依存しない標的化された組み込みを介して挿入することができる。例えば、外因性ドナー核酸中の核酸挿入物は、ガイドＲＮＡ標的配列（例えば、Ｃ５遺伝子座と同じ標的部位、並びにＣ５遺伝子又は遺伝子座中の標的部位を切断するために使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬（Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡ））によって各側に隣接される。次いで、Ｃａｓタンパク質は、核酸挿入物に隣接する標的部位を切断することができる。具体的な例では、外因性ドナー核酸は、ＡＡＶ媒介送達で送達され、核酸挿入物に隣接する標的部位の切断は、ＡＡＶの末端逆位配列（ＩＴＲ）を除去することができる。いくつかの方法では、核酸インサートが正しい向きでＣ５遺伝子又は遺伝子座に挿入された場合、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座の標的部位（例えば、隣接するプロトスペーサー隣接モチーフを含むガイドＲＮＡ標的配列）はもはや存在しないが、核酸インサートが反対の向きでＣ５遺伝子又は遺伝子座に挿入された場合には再形成される。

【0342】

他の外因性ドナー核酸は、５’末端及び／又は３’末端に短い一本鎖領域を有し、これは、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座でのＣａｓ媒介切断によって作成される１つ以上の突出に相補的である。例えば、いくつかの外因性ドナー核酸は、５’末端及び／又は３’末端に短い一本鎖領域を有し、これらはＣ５遺伝子又は遺伝子座の５’及び／又は３’標的配列でのＣａｓ媒介切断によって作成された１つ以上のオーバーハングに相補的である。いくつかのそのような外因性ドナー核酸は、５’末端のみ又は３’末端のみに相補的領域を有する。例えば、いくつかのそのような外因性ドナー核酸は、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座の５’標的配列で作成されたオーバーハングに相補的な５’末端にのみ、又はＣ５遺伝子又は遺伝子座の３’標的配列で作成されたオーバーハングに相補的な３’末端にのみ、相補的領域を有する。他のそのような外因性ドナー核酸は、５’末端及び３’末端の両方に相補的領域を有する。例えば、他のそのような外因性ドナー核酸は、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座でのＣａｓ媒介性切断によって生成された５’及び３’末端の両方に相補的領域（例えば、それぞれ第１及び第２のオーバーハングに相補的である）を有する。例えば、外因性ドナー核酸が二本鎖である場合、一本鎖相補的領域は、ドナー核酸の上部鎖の５’末端及びドナー核酸の下部鎖の５’末端から伸長し、両端に５’突出を作成することができる。代替的に、一本鎖相補領域は、ドナー核酸の上部鎖の３’末端から、及びテンプレートの下部鎖の３’末端から伸長し、３’突出を作成することができる。

【0343】

相補的領域は、外因性ドナー核酸と標的核酸との間のライゲーションを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例示的な相補的領域は、約１～約５ヌクレオチドの長さ、約１～約２５ヌクレオチドの長さ、又は約５～約１５０ヌクレオチドの長さである。例えば、相補的領域は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ヌクレオチドの長さであってよい。代替的に、相補的領域は、約５～約１０、約１０～約２０、約２０～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１１０、約１１０～約１２０、約１２０～約１３０、約１３０～約１４０、約１４０～約１５０ヌクレオチド、又はそれ以上の長さであってよい。

【0344】

このような相補的領域は、２対のニッカーゼによって作成された突出を相補的にすることができる。ＤＮＡの反対側の鎖を切断して第１の二本鎖切断を作成する第１及び第２のニッカーゼ、及びＤＮＡの反対側の鎖を切断して第２の二本鎖切断を作成する第３及び第４のニッカーゼを使用することにより、両端が千鳥状の２つの二本鎖切断を作成できる。例えば、Ｃａｓタンパク質を使用して、第１、第２、第３、及び第４のガイドＲＮＡに対応する第１、第２、第３、及び第４のガイドＲＮＡ標的配列にニックを入れることができる。第１及び第２のガイドＲＮＡ標的配列は、ＤＮＡの第１及び第２の鎖上の第１及び第２のニッカーゼによって作成されたニックが二本鎖切断を作成するように、第１の切断部位を作成するように配置することができる（すなわち、第１の切断部位は、第１及び第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニックを含む）。同様に、第３及び第４のガイドＲＮＡ標的配列は、ＤＮＡの第１及び第２の鎖上の第３及び第４のニッカーゼによって作成されたニックが二本鎖切断を作成するように、第２の切断部位を作成するように配置することができる（すなわち第２の切断部位は、第３及び第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックを含む）。第１及び第２のガイドＲＮＡ標的配列及び／又は第３及び第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックは、突出を作成するオフセットニックであり得る。オフセットウィンドウは、例えば、少なくとも約５ｂｐ、１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、又はそれ以上であり得る。Ｒａｎｅｔａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ１５４：１３８０－１３８９；Ｍａｌｉｅｔａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３－８３８；ａｎｄＳｈｅｎｅｔａｌ．（２０１４）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ１１：３９９－４０４を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのような場合、二本鎖外因性ドナー核酸は、第１及び第２のガイドＲＮＡ標的配列内のニック及び第３及び第４のガイドＲＮＡ標的配列内のニックによって作成された突出に相補的な一本鎖相補領域で設計することができる。次いで、そのような外因性ドナー核酸は、非相同末端結合媒介ライゲーションによって挿入することができる。

【0345】

いくつかの外因性ドナー核酸は、相同性アームを含む。外因性ドナー核酸が核酸インサートも含む場合、ホモロジーアームは核酸インサートに隣接することができる。参照を容易にするために、ホモロジーアームは、本明細書では５’及び３’（すなわち、上流及び下流）ホモロジーアームと呼ばれる。この用語は、外因性ドナー核酸内の核酸インサートに対するホモロジーアームの相対位置に関連している。５’及び３’相同アームは、本明細書でそれぞれ「５’標的配列」及び「３’標的配列」と呼ばれる、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座の標的ゲノム遺伝子座内の領域に対応する。

【0346】

相同性アーム及び標的配列は、２つの領域が相同組換え反応の基質として作用するのに十分なレベルの配列同一性を互いに共有する場合、互いに「対応する」又は「対応している」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるか、又は配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と外因性ドナー核酸に見られる対応するホモロジーアームとの間の配列同一性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、外因性ドナー核酸（又はその断片）のホモロジーアーム及び標的配列（又はその断片）によって共有される配列同一性の量は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性であり得、これにより、配列は相同組換えを起こす。更に、ホモロジーアームと対応する標的配列との間の対応する相同性領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであり得る。例示的なホモロジーアームは、約２５ヌクレオチド～約２．５ｋｂの長さであるか、約２５ヌクレオチド～約１．５ｋｂの長さであるか、又は約２５～約５００ヌクレオチドの長さである。例えば、所与のホモロジーアーム（又はホモロジーアームのそれぞれ）及び／又は対応する標的配列は、約２５～約３０、約３０～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１５０、約１５０～約２００、約２００～約２５０、約２５０～約３００、約３００～約３５０、約３５０～約４００、約４００～約４５０、又は約４５０～約５００ヌクレオチド長の対応する相同性領域を含み得、その結果、ホモロジーアームは、標的核酸内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有する。代替的に、所与のホモロジーアーム（又は各ホモロジーアーム）及び／又は対応する標的配列は、約０．５ｋｂ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、又は約２ｋｂ～約２．５ｋｂの長さである対応する相同性領域を含み得る。例えば、ホモロジーアームは、それぞれ約７５０ヌクレオチドの長さであり得る。相同性アームは対称的（それぞれの長さがほぼ同じサイズ）であってもよく、非対称的（一方が他方よりも長い）であってもよい。

【0347】

いくつかの方法では、外因性ドナー核酸は、「標的化ベクター」又は「ＬＴＶＥＣ」であってよく、これには、細胞内で相同組換えを行うことを目的とした他のアプローチで典型的に使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、それに由来する相同性アームを含む標的化ベクターが含まれる。ＬＴＶＥＣにはまた、細胞内で相同組換えを行うことを目的とした他のアプローチで通常使用されるものよりも大きい核酸配列を有する核酸インサートを含む標的化ベクターが含まれる。例えば、ＬＴＶＥＣは、サイズの制限のために従来のプラスミドベースの標的化ベクターでは対応できない大きな遺伝子座の変更を可能にする。例えば、標的化された遺伝子座は、従来の方法を使用して標的化できないか、又はヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニック若しくは二本鎖切断の非存在下で不正確にのみ、又は有意に低い効率でのみ標的化され得る細胞の遺伝子座であり得る（すなわち、５’及び３’相同性アームが対応し得る）。ＬＴＶＥＣは、任意の長さであり得、通常は少なくとも１０ｋｂ長である。ＬＴＶＥＣの５’相同性アームと３’相同性アームの合計は、典型的には、少なくとも１０ｋｂである。ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）遺伝子工学技術を使用する細菌相同組換え（ＢＨＲ）反応によって細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ由来の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）の生成及び使用は、例えば、ＵＳ６，５８６，２５１及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａｅｔａｌ．（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（６）：６５２－６５９に記載され、これらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。インビトロアセンブリ法によるＬＴＶＥＣの生成は、例えば、ＵＳ２０１５／０３７６６２８及び国際公開第２０１５／２００３３４号を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ支援ＬＴＶＥＣターゲティングは、例えば、米国特許第９，５４６，３８４号；米国特許出願公開第２０１５－０１５９１７４号；米国特許第９，２２８，２０８号；米国特許出願公開第２０１５－０１５９１７５号；米国特許出願公開第２０１６－００６０６５７号；米国特許第１０，２０８，３１７号；米国特許出願公開第２０１７－００６７０７８号；米国特許第１０，７１１，２８０号；米国特許出願公開第２０１９－０１１２６１９号；及び国際公開第２０１５／０８８６４３号に記載され、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0348】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを外因性ドナー核酸と組み合わせて使用する場合、Ｃａｓ切断部位での一本鎖切断（ニック）又は二本鎖切断の際に、標的配列とホモロジーアームとの間の相同組換え事象の発生を促進するように、５’及び３’標的配列をＣａｓ切断部位に十分に近接して（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列に十分に近接して）配置することができる。「Ｃａｓ切断部位」という用語は、ガイドＲＮＡと複合体化したＣａｓタンパク質によってニック又は二本鎖切断が生じるＤＮＡ配列を含む。外因性ドナー核酸の５’及び３’ホモロジーアームに対応する標的化遺伝子座内の標的配列は、距離がＣａｓ切断部位での一本鎖切断又は二本鎖切断の際の５’及び３’標的配列とホモロジーアームとの間の相同組換え事象の発生を促進するような距離である場合、Ｃａｓ切断部位に「十分に近接して位置する」。したがって、外因性ドナー核酸の５’及び／又は３’ホモロジーアームに対応する標的配列は、例えば、所与のＣａｓ切断部位の少なくとも１ヌクレオチド内、又は所与のＣａｓ切断部位の少なくとも１０ヌクレオチド～約１，０００ヌクレオチド内であり得る。一例として、Ｃａｓ切断部位は、標的配列の少なくとも一方又は両方に直接隣接し得る。

【0349】

外因性ドナー核酸のホモロジーアーム及びＣａｓ切断部位に対応する標的配列の空間的関係は変化し得る。例えば、標的配列は、Ｃａｓ切断部位の５’に位置してもよく、標的配列は、Ｃａｓ切断部位の３’に位置してもよく、又は標的配列は、Ｃａｓ切断部位に隣接していてもよい。

【0350】

本明細書に記載される方法におけるＣａｓタンパク質によるＣ５遺伝子又は遺伝子座の切断に応答した修復は、任意の修復経路を介して起こり得る。例えば、修復は、相同組換え（ＨＲ）又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して起こり得る。二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路である相同組換え（ＨＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して生じる。全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋａｓｐａｒｅｋ＆Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎ．ＣｅｌｌＤｅｖ．Ｂｉｏｌ．」、２２（８）：８８６－８９７を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み得る。

【0351】

「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝的情報を交換する任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こり得る。組換えは、相同性指向修復（ＨＤＲ）又は相同組換え（ＨＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲ又はＨＲには、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得る核酸修復の形式が含まれ、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝的情報の伝達をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、そのような伝達は、壊れた標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、及び／又はドナーが標的の一部となる遺伝的情報を再合成するために使用される合成依存性鎖アニーリング、及び／又は関連するプロセスを含み得る。いくつかの場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、又はドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。Ｗａｎｇｅｔａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ１５３：９１０－９１８；Ｍａｎｄａｌｏｓｅｔａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳＯＮＥ７：ｅ４５７６８：１－９；及びＷａｎｇｅｔａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0352】

非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、相同テンプレートを必要とせずに、切断末端を互いに又は外因性配列への直接ライゲーションによる、核酸における二本鎖切断の修復を含む。ＮＨＥＪによる非隣接配列のライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位の近くで欠失、挿入、又は転座をもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪはまた、切断末端を外因性ドナー核酸の末端と直接ライゲーションすることにより、外因性ドナー核酸の標的化組み込みをもたらすことができる（すなわち、ＮＨＥＪベースの捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介標的化組み込みは、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用することができない場合（例えば、非分裂細胞、一次細胞、及び相同性に基づくＤＮＡ修復を不十分に行う細胞）、外因性ドナー核酸の挿入に好ましい場合がある。加えて、相同性指向修復とは対照的に、切断部位に隣接する配列同一性の大きな領域に関する知識は必要なく、これは、ゲノム配列の知識が限られているゲノムを有する生物への標的化挿入を試みるときに有益であり得る。組み込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列との間の平滑末端のライゲーションを介して、又は切断されたゲノム配列においてヌクレアーゼ剤によって生成されたものに適合するオーバーハングに隣接する外因性ドナー核酸を使用する粘着末端（すなわち、５’又は３’オーバーハングを有する）のライゲーションを介して進行することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１１／０２０７２２号、国際公開第２０１４／０３３６４４号、国際公開第２０１４／０８９２９０号、及びＭａｒｅｓｃａｅｔａｌ．（２０１３）ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ．２３（３）：５３９－５４６を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。平滑末端がライゲーションされている場合、断片結合に必要なマイクロホモロジーの生成領域のために、標的及び／又はドナーの切除が必要になる場合があり、これにより、標的配列に望ましくない改変が生じ得る。

【0353】

本明細書に記載の方法を使用して、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座における様々なタイプの標的化遺伝子改変を導入することができる。そのような標的化修飾には、例えば、１つ以上のヌクレオチドの付加、１つ以上のヌクレオチドの欠失、１つ以上のヌクレオチドの置換、点突然変異、又はそれらの組み合わせが含まれ得る。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０個又はそれ以上のヌクレオチドを変更（例えば、欠失、挿入、又は置換）して、標的化ゲノム改変を形成することができる。本明細書の他の場所に開示されているように、欠失、挿入、又は置換は、任意のサイズであってもよい。例えば、Ｗａｎｇｅｔａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ１５３：９１０－９１８；Ｍａｎｄａｌｏｓｅｔａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳＯＮＥ７：ｅ４５７６８：１－９；及びＷａｎｇｅｔａｌ．（２０１３）ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0354】

そのような標的化遺伝子改変は、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座の破壊をもたらし得る。破壊は、調節エレメント（例えば、プロモーター又はエンハンサー）、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、フレームシフト突然変異、短縮突然変異、ヌル突然変異、又は少数のヌクレオチドの挿入若しくは欠失の変化（例えば、フレームシフト突然変異を引き起こすこと）を含み得、不活性化（すなわち、機能の喪失）又は対立遺伝子の喪失をもたらし得る。例えば、標的化修飾は、開始コドンがもはや機能的でないようにＣ５遺伝子の開始コドンを破壊すること、又は機能的Ｃ５タンパク質がもはや発現されないようにフレームシフト突然変異を導入することを含み得る。いくつかの方法では、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座は、もはや機能的Ｃ５タンパク質を発現しないように不活性化又はノックアウトされる。いくつかの方法において、Ｃ５遺伝子又は遺伝子座は、減少した量の機能的Ｃ５タンパク質を発現するように改変される。

【0355】

特定の例において、標的化修飾は、第１及び第２のガイドＲＮＡ標的配列又はＣａｓ切断部位の間の欠失を含むことができる。外因性ドナー配列（例えば、修復テンプレート又は標的化ベクター）が使用される場合、改変は、第１及び第２のガイドＲＮＡ標的配列又はＣａｓ切断部位の間の欠失、並びに５’及び３’標的配列の間の核酸挿入物の挿入を含み得る。

【0356】

あるいは、外因性ドナー配列がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬と組み合わせて使用される場合、改変は、５’標的配列と３’標的配列との間の欠失、並びに第１及び第２の相同染色体の対における５’標的配列と３’標的配列との間の核酸インサートの挿入を含み得、それにより、ホモ接合性改変ゲノムが得られる。あるいは、外因性ドナー配列が核酸インサートを含まない５’及び３’相同アームを含む場合、改変は５’と３’の標的配列間の欠失を含み得る。

【0357】

第１のガイドＲＮＡ標的配列と第２のガイドＲＮＡ標的配列との間の欠失、又は５’標的配列と３’標的配列との間の欠失は、改変ゲノム標的遺伝子座において追加の欠失又は挿入が存在しないように、欠失された核酸が第１のヌクレアーゼ切断部位と第２のヌクレアーゼ切断部位との間の核酸配列のみ、又は５’標的配列と３’標的配列との間の核酸配列のみからなる正確な欠失であり得る。第１及び第２のガイドＲＮＡ標的配列間の欠失はまた、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による不正確な修復と一致して、第１及び第２のヌクレアーゼ切断部位を超えて広がる不正確な欠失であり得、改変ゲノム遺伝子座において更なる欠失及び／又は挿入をもたらす。例えば、欠失は、第１及び第２のＣａｓタンパク質切断部位を超えて、約１ｂｐ、約２ｂｐ、約３ｂｐ、約４ｂｐ、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ又はそれを超えて伸長することができる。同様に、改変ゲノム遺伝子座は、ＮＨＥＪによる不正確な修復と一致する更なる挿入、例えば約１ｂｐ、約２ｂｐ、約３ｂｐ、約４ｂｐ、約５ｂｐ、約１０ｂｐ、約２０ｂｐ、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ又はそれを超える挿入を含み得る。

【0358】

標的化遺伝子改変は、例えば、二対立遺伝子改変又は単一対立遺伝子改変であり得る。二対立遺伝子修飾には、対応する相同染色体上（例えば、二倍体細胞において）の同じ遺伝子座に対して同じ修飾が行われる事象、又は対応する相同染色体上の同じ遺伝子座に対して異なる修飾が行われる事象が含まれる。いくつかの方法では、標的化遺伝子改変は、単一対立遺伝子改変である。単一対立遺伝子改変には、１つの対立遺伝子のみに改変が加えられる事象（すなわち、２つの相同染色体のうちの１つのみにおけるＣ５遺伝子に対する改変）が含まれる。相同染色体には、同じ遺伝子座に同じ遺伝子を有するが、おそらく異なる対立遺伝子を有する染色体（例えば、分裂中に対になる染色体）が含まれる。対立遺伝子という用語は、遺伝子配列の１つ以上の代替形態のいずれかを含む。二倍体細胞又は生物において、所与の配列の２つの対立遺伝子は、典型的には、相同染色体対上の対応する遺伝子座を占める。

【0359】

単一対立遺伝子変異は、標的Ｃ５修飾についてヘテロ接合性である細胞をもたらし得る。ヘテロ接合性には、Ｃ５遺伝子の１つの対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対応する対立遺伝子）のみが標的化修飾を有する状況が含まれる。

【0360】

二対立遺伝子改変は、標的化された改変についてホモ接合性をもたらし得る。ホモ接合性には、Ｃ５遺伝子の両方の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対応する対立遺伝子）が標的化修飾を有する状況が含まれる。あるいは、二対立遺伝子修飾は、標的修飾のための化合物のヘテロ接合性（例えば、ヘミ接合性）をもたらし得る。化合物のヘテロ接合性には、標的遺伝子座の両方の対立遺伝子（すなわち、両方の相同染色体上の対立遺伝子）が修飾されているが、それらが異なる方法で修飾されている状況が含まれる（例えば、一方の対立遺伝子における標的化修飾及び他方の対立遺伝子の不活性化又は破壊）。例えば、標的化修飾を有さない対立遺伝子では、Ｃａｓタンパク質によって作り出された二本鎖切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）媒介ＤＮＡ修復によって修復されている可能性があり、これは、核酸配列の挿入又は欠失を含む突然変異対立遺伝子を生成し、それによってそのゲノム遺伝子座の破壊を引き起こす。例えば、細胞が、標的化された改変を有する１つの対立遺伝子と、発現することができない別の対立遺伝子とを有する場合、二対立遺伝子改変は、化合物のヘテロ接合性をもたらし得る。化合物のヘテロ接合性にはヘミ接合性が含まれる。ヘミ接合性には、標的遺伝子座のただ１つの対立遺伝子（すなわち、２つの相同染色体の一方にある対立遺伝子）が存在する状況が含まれる。例えば、二対立遺伝子改変は、標的化された改変が一方の対立遺伝子において他方の対立遺伝子の対応する欠失又は欠失を伴って生じる場合、標的化された改変についてヘミ接合性をもたらし得る。

【0361】

Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的化するための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性を評価する方法は周知であり、本明細書の他の箇所に提供される。活性の評価は、任意の細胞型（例えば、肝細胞などの肝細胞）、任意の組織型（例えば、肝臓）、又は任意の器官型（例えば、肝臓）であり得る。

【0362】

例えば、方法は、Ｃ５遺伝子座の改変を評価することを含み得る。一例として、評価することは、Ｃ５遺伝子座における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）活性を測定することを含み得る。これは、例えば、Ｃ５遺伝子座内の挿入又は欠失の頻度を測定することを含み得る。例えば、インビボ方法では、評価することは、動物から単離された１つ以上の細胞においてＣ５遺伝子座を配列決定することを含み得る（例えば、次世代シーケンシング）。評価は、非ヒト動物から標的臓器又は組織（例えば、肝臓）を単離すること、及び標的臓器又は組織におけるＣ５遺伝子座の改変を評価することを含み得る。評価はまた、標的器官又は組織内の２つ以上の異なる細胞型におけるＣ５遺伝子座の改変を評価することを含み得る。同様に、評価は、非標的器官又は組織（例えば、２つ以上の非標的器官又は組織）を動物から単離することと、及び非標的器官又は組織におけるＣ５遺伝子座の改変を評価することと、を含み得る。１つの具体例として、Ｃ５遺伝子座における編集パーセント（例えば、溶解された細胞のプールからＰＣＲ反応で読み取られた配列の総数にわたって観察された挿入又は欠失の総数）を評価することができる（例えば、肝細胞などの肝細胞において）。

【0363】

そのような方法はまた、Ｃ５遺伝子座によって産生されるｍＲＮＡの発現レベルを測定すること、又はＣ５遺伝子座によってコードされるタンパク質の発現レベルを測定することを含み得る。例えば、タンパク質レベルは、特定の細胞、組織、又は器官のタイプ（例えば、肝臓）で測定することができ、又は分泌レベルは、血清で測定することができる。Ｃ５遺伝子座から発現されるＣ５ｍＲＮＡ又はＣ５タンパク質の発現を評価する方法は、本明細書の他の箇所に提供され、周知である。

【0364】

いくつかの方法では、インビトロ、エクスビボ、又はインビボでの細胞（例えば肝細胞、例えば初代ヒト肝細胞）の標的集団中のＣ５遺伝子の編集パーセント（例えば、インデルを有するリードのパーセント）は、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％であり得るか、又は細胞の集団の約３０％～約９９％、又は細胞の集団の約３０％～約３５％、約３５％～約４０％、約４０％～約４５％、約４５％～約５０％、約５０％～約５５％、約５５％～約６０％、約６０％～約６５％、約６５％～約７０％、約７０％～約７５％、約７５％～約８０％、約８０％～約８５％、約８５％～約９０％、約９０％～約９５％、約９５％～約９９％であり得る。例えば、編集パーセントは、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％であり得る（例えば、２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量でインビボ）。

【0365】

いくつかの方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの投与前と比較した場合、又は陰性対照と比較した場合の血漿中又は血清中Ｃ５レベルの低下パーセントは、投与後１週間、投与後２週間、投与後３週間、又は投与後４週間において、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は約５０％～約９９％、約５５％～約９９％、約６０％～約９９％、約５５％～約９９％、約６０％～約９９％、約６５％～約９９％、約７０％～約９９％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、又は約９５％～約９９％である。一例として、血漿又は血清Ｃ５レベルの低下率は、投与後３週間で少なくとも５０％であり得る（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを０．３ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量で送達した場合）。別の例として、血漿又は血清Ｃ５レベルの減少パーセントは、投与後３週間で少なくとも９０％又は少なくとも９５％であり得る（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを１ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量で送達した場合）。別の例として、血漿又は血清Ｃ５レベルの減少パーセントは、投与後３週間で少なくとも９５％又は少なくとも９８％であり得る（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量で送達した場合）。

【0366】

このような方法はまた、Ｃ５活性を測定することを含み得る。例えば、古典的経路溶血は、感作ヒツジ赤血球を使用してエクスビボで測定することができる。いくつかの方法では、古典的経路溶血における阻害パーセントは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの投与前と比較した場合、又は陰性対照と比較した場合、投与後１週間、投与後２週間、投与後３週間、又は投与後４週間において、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、又は約５０％～約９９％、約５５％～約９９％、約６０％～約９９％、約６５％～約９９％、約７０％～約９９％、約７５％～約９９％、約８０％～約９９％、約８５％～約９９％、約９０％～約９９％、又は約９５％～約９９％である。一例として、古典的経路溶血における阻害パーセントは、少なくとも７０％又は少なくとも７５％（例えば、投与後３週間で（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを２ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ用量で送達した場合））であり得る。

【0367】

本明細書中に記載の方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの導入又は投与は、Ｃ５遺伝子若しくは遺伝子座の編集、及び／又は血漿若しくは血清Ｃ５レベルの低下、及び／又はＣ５活性の低下において永続的効果をもたらし得る。例えば、耐久効果は、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、又は少なくとも１５週間延びることができ、又は少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１８、少なくとも２４、少なくとも３０、又は少なくとも３６ヶ月延びることができ、又は少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、又は少なくとも１０年延びることができる。一例では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単回投与は、Ｃ５遺伝子若しくは遺伝子座の編集、及び／又は血漿若しくは血清Ｃ５レベルの低下、及び／又はＣ５活性の低下において永続的効果をもたらし得る。

【0368】

Ｂ．予防的又は治療的用途
Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、単独で、又はＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせて、又はそれと会合してのいずれかで、Ｃ５に関連する疾患、障害、若しくは状態の治療及び／若しくは予防、並びに／又はそのような疾患、障害、若しくは状態に関連する少なくとも１つの症状の改善に有用である。例えば、本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質又は抗体のいずれかを使用することができる。いくつかの方法では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃ５に関連する疾患又は障害又は状態を有する患者に治療用量で投与され得る。Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはまた、単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせて若しくはそれと会合してのいずれかで、Ｃ５に関連する疾患又は障害（例えば、Ｃ５発現又は活性の低下から利益を得る疾患又は障害）に罹患している患者を治療するための医薬組成物又は医薬品の調製に使用することもできる。Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的化するための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む治療用又は医薬組成物は、改善された移入、送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれる適切な担体、賦形剤、及び他の薬剤と共に投与することができる。多数の適切な製剤は、全ての薬剤師に知られている処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．に見出すことができる。またＰｏｗｅｌｌｅｔａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓｆｏｒｐａｒｅｎｔｅｒａｌｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２３８－３１１を参照されたい。

【0369】

「Ｃ５関連疾患」という用語は、補体系活性によって直接的又は間接的に引き起こされる、維持される、若しくは増悪される、又はその徴候及び／若しくは症状が引き起こされる、維持される、若しくは増悪される疾患、障害、状態又は症候群を指し、補体系活性は、Ｃ５活性の阻害によって減少又は安定化される、若しくは排除され得る。例えば、国際公開第２０２１／０３４６３９号、米国特許出願公開第２０２１－００４６１８２号明細書、国際公開第２０２１／０８１２７７号、米国特許出願公開第２０２１－０１３９５７３号明細書、国際公開第２０１７／２１８５１５号、米国特許出願公開第２０２０－０２６２９０１号明細書、米国特許出願公開第２０１７－０３５５７５７号明細書、又は米国特許出願公開第２０２０－０２６２９００号明細書も参照されたく、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。そのようなＣ５活性は、例えば、Ｃ５前駆体のＣ５ａ及びＣ５ｂ鎖への切断、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成及び／又はＭＡＣの標的細胞（例えば、赤血球）の表面への結合を防止することによって阻害することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ５活性阻害は、ＣＨ５０アッセイで測定される通りである。

【0370】

ＣＨ５０（５０％溶血性補体）は、古典的補体経路のレベルを決定するためのアッセイであり、当該分野で周知の経路の任意の成分の減少、非存在及び／又は不活性に感受性である。ＣＨ５０は、古典的経路の血清補体成分が、例えばウサギ抗ヒツジ赤血球抗体（溶血素）でプレコートされたヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を溶解する機能的能力を試験する。例えば、抗体被覆ＳＲＢＣを試験血清とインキュベートすると、補体の古典的経路が活性化され、溶血が生じる。補体成分が存在しない場合、ＣＨ５０レベルは０であり、古典経路の１つ以上の成分が減少する場合、ＣＨ５０は減少する。一定量の最適に感作されたＳＲＢＣを各血清希釈物に添加する。例えば、インキュベーション後、混合物を遠心分離し、５４０ｎＭで上清に放出されたヘモグロビンの吸光度を測定することによって溶血の程度を定量する。補体活性の量は、試験血清の様々な希釈物が抗体被覆ＳＲＢＣを溶解する能力を調べることによって決定される。Ｃｏｓｔａｂｉｌｅ，Ｍｅａｓｕｒｉｎｇｔｈｅ５０％ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ（ＣＨ５０）ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｓｅｒｕｍ，ＪＶｉｓＥｘｐ．２０１０（３７）：１９２３；及びＭａｙｅｒ，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｎｄｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｆｉｘａｔｉｏｎ，１ｐ．１３３－２４０．ＩｎＥ．Ａ．２ＫａｂａｔａｎｄＭ．Ｍ．Ｍａｙｅｒ（ｅｄ．），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄを参照されたい。ＡＨ５０は、代替経路機能を測定するための類似の試験である。例えばＭａｙｅｒ，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｎｄｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｆｉｘａｔｉｏｎ，ｐ．１３３－２４０．ＩｎＥ．ＫａｂａｔａｎｄＭ．Ｍ．Ｍａｙｅｒ（ｅｄ．），Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｃ．Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌ．１９６１；ａｎｄＲａｐｐ＆Ｂｏｒｓｏｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂａｓｉｓｏｆｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｃｔｉｏｎ．ＡｐｐｔｏｎＣｅｎｔｕｒｙＣｒｏｆｔｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９７０を参照されたい。代替経路（ＡＨ５０）の機能的活性を評価する試験は、標的細胞としてモルモット、ウサギ、又はニワトリ赤血球を使用する。ＡＰはヒツジ赤血球に対して弱い溶血活性を有する。ここで、古典的経路の活性化は、ＥＧＴＡをキレート２^＋に添加することによって遮断されなければならず、最適な濃度のＭｇ２^＋が必要である。ＣＨ５０及び／又はＡＨ５０における溶血活性の低さ又は欠如の検出は、更なる補体分析を導く。例えばＪｏｉｎｅｒｅｔａｌ．，１９８３．Ａｓｔｕｄｙｏｆｏｐｔｉｍａｌｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｆｏｒａｎａｓｓａｙｏｆｔｈｅｈｕｍａｎａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｐａｔｈｗａｙ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．７９：６５－７２を参照されたい。

【0371】

Ｃ５関連疾患には、例えば、成人呼吸窮迫症候群；加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、アレルギー、アルポート症候群、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、喘息、アテローム性動脈硬化症、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、バルーン血管形成、気管支収縮、水疱性類天疱瘡、火傷、Ｃ３糸球体症、毛細血管漏出症候群、心血管障害、突発性抗リン脂質症候群（ＣＡＰＳ）、脳血管障害、ＣＨＡＰＬＥ疾患（補体の過剰活性化、血管障害性血栓症及びタンパク質喪失性腸障害を伴うＣＤ５５欠損症）、化学的損傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、角膜及び／又は網膜組織、クローン病、デゴス病、高密度沈着物疾患（ＤＤＤ）、皮膚筋炎、糖尿病、糖尿病性血管障害、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、拡張型心筋症、不適切又は望ましくない補体活性化障害、呼吸困難、子癇、気腫、表皮水疱症、てんかん、線維原性ダスト疾患、凍傷、地図状萎縮（ＧＡ）、糸球体腎炎、糸球体症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、血液透析合併症、溶血－肝臓酵素上昇及び低血小板（ＨＥＬＬＰ）症候群、溶血性貧血、喀血、Ｈｅｎｏｃｈ－Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ紫斑病性腎炎、遺伝性血管浮腫、超急性同種移植片拒絶、過敏性肺炎、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫複合体障害、免疫複合体血管炎、免疫複合体関連炎症、感染症、自己免疫疾患によって引き起こされる炎症、炎症性障害、遺伝性ＣＤ５９欠損、不活性ダスト及び／又は鉱物による損傷、ＩＬ－２治療中のインターロイキン－２誘導性毒性、虚血－再灌流傷害、川崎病、肺の疾患又は障害、ループス腎炎、膜増殖性糸球体腎炎、膜増殖性腎炎、大動脈再建後の腸間膜動脈再灌流、腸間膜／腸間膜血管障害、多巣性運動ニューロパシー（ＭＭＮ）、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋梗塞、心筋炎、神経障害、視神経脊髄炎、肥満、眼血管新生、脈絡膜に影響を及ぼす眼血管新生、有機ダスト病、寄生虫症、パーキンソン病、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、例えば活動性ＰＮＨ、低免疫性血管炎、天疱瘡、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、末梢（例えば筋骨格）血管障害、肺炎、虚血後再灌流状態、心肺バイパスにおけるポンプ後症候群、腎バイパスにおけるポンプ後症候群、子癇前症、進行性腎不全、増殖性腎炎、タンパク尿腎疾患、乾癬、肺塞栓症、肺線維症、肺梗塞、肺血管炎、再発性胎児喪失、腎障害、腎虚血、腎虚血－再灌流傷害、腎血管障害、ステント留置後の再狭窄、関節リウマチ（ＲＡ）、回転式アテレクトミー、統合失調症、敗血症、敗血症性ショック、ＳＬＥ腎炎、煙による傷害、脊髄損傷、自然胎児喪失、脳卒中、敗血症に対する全身性炎症反応、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性エリテマトーデス関連血管炎、高安病、熱損傷、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、外傷性脳損傷、Ｉ型糖尿病、典型的な溶血性尿毒症症候群（ｔＨＵＳ）、ブドウ膜炎、血管炎、関節リウマチに関連する血管炎、静脈ガス塞栓（ＶＧＥ）、又は異種移植片拒絶が含まれる。

【0372】

同様に、本明細書に開示されるＣ５遺伝子又は遺伝子座を改変又はノックするための方法は、本明細書に開示されるＣ５標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬を単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせて若しくはそれと会合するかのいずれかで使用して、対象におけるＣ５に関連する疾患又は障害を治療するために使用することができる。そのような治療方法は、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。そのような治療方法は、Ｃ５遺伝子座又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む医薬組成物及びＣ５抗原結合タンパク質又は抗体を含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。そのような治療方法は、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とし、Ｃ５抗原結合タンパク質又は抗体を含む本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む医薬組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に投与することを含み得る。治療される障害は、Ｃ５活性の阻害又は低下によって改善、改善、阻害又は予防されるあらゆる疾患又は状態であり得る。いくつかのこのような方法は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の少なくとも１つの症状を予防、治療又は改善するものであり、この方法は、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書中に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの治療有効量をそれを必要とする対象に投与することを含む。いくつかのそのような方法は、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを投与することによって、対象における発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）の少なくとも１つの症状又は適応症の重症度を改善又は軽減する。いくつかの方法では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃ５関連疾患又は障害を有するか又は有するリスクがある対象に予防的又は治療的に投与され得る。Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的化するための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、若しくは筋肉内に、又は任意の他の適切な手段によって投与され得る。

【0373】

治療有効量は、それが投与される所望の効果を生じる量である。正確な量は、治療の目的に依存し、公知の技術を使用して当業者によって確認可能であろう。例えば、Ｌｌｏｙｄ（１９９９）ＴｈｅＡｒｔ，ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇを参照されたい。

【0374】

対象は、Ｃ５関連疾患又は障害（例えば、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）又は発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）など）の改善、予防及び／又は治療を必要とする動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトであり得る。この用語は、そのような疾患又は障害を有するか又は有するリスクがあるヒト対象を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸アルギニン８８５は、対象のＣ５において別のアミノ酸、例えばＲ８８５Ｈ又はＲ８８５Ｃに変異されている。

【0375】

治療する、治療する、又は治療するという用語は、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの治療剤（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）を、それを必要とする対象に投与することによる、Ｃ５関連疾患又は障害の少なくとも１つの症状又は適応症の重症度の軽減又は改善を指す。この用語は、疾患の進行又は症状／適応症の悪化の阻害を含む。この用語はまた、疾患のポジティブな予後を含む（すなわち、対象は、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムなどの治療剤（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）を投与すると、疾患を有さないか、又は疾患が減少し得る）。治療剤は、治療用量で対象に投与され得る。これらの用語は、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書中に開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを投与したときの、Ｃ５関連疾患若しくは障害又はそのような疾患若しくは障害の任意の症状若しくは適応症の発現の阻害を指す。

【0376】

Ｃ５関連疾患又は障害は、Ｃ５ａ及び／又はＣ５ｂによって媒介される炎症、細胞傷害及び／又は細胞死滅によって（直接的又は間接的に）引き起こされる疾患又は障害を指す。Ｃ５関連疾患の非限定的な例としては、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、難治性重症筋無力症（ｒＭＧ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、ＩｇＡ腎症、膜性腎症、ループス腎炎、Ｃ３糸球体症、及びＡＮＣＡ－血管炎が挙げられる。具体的な例において、Ｃ５関連疾患又は障害は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）である。具体的な例において、Ｃ５関連疾患又は障害は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）である。

【0377】

特定の用途では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）の症状又は適応症を治療又は予防するのに有用である。ａＨＵＳは、循環赤血球が破壊されることによる低レベルの循環赤血球（溶血性貧血）、循環赤血球が消費されることによる低血小板数（血小板減少症）、及び腎臓が血液からの老廃物を処理して尿中に排出することができないこと（急性腎不全）、尿毒症として知られる状態を特徴とする希な疾患である。ａＨＵＳの徴候及び症状には、例えば、病気、疲労、過敏性及び嗜眠、貧血、血小板減少症、急性腎不全、高血圧及び臓器損傷が含まれ得る。ａＨＵＳの症状及び適応症には、血小板活性化、溶血、脳卒中、心臓発作、腎不全及び／又は死亡につながる全身性血栓性微小血管障害（全身の小血管における血栓の形成）、末期腎疾患、永久的腎障害、腹痛、錯乱、浮腫、疲労、悪心／嘔吐、下痢及び微小血管障害性貧血が含まれるが、これらに限定されない。

【0378】

非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）は、循環赤血球が破壊されることによる低レベルの循環赤血球（溶血性貧血）、赤血球が消費されることによる低血小板数（血小板減少症）、及び腎臓が血液からの老廃物を処理して尿中に排出することができないこと（急性腎不全）、尿毒症として知られる状態を特徴とするまれな疾患である。ほとんどのａＨＵＳは、通常の調節機構を損なう補体系欠陥によって引き起こされる。したがって、活性化事象は、広範な内皮損傷をもたらす非架橋性の継続的な補体活性をもたらす。ａＨＵＳの徴候及び症状には、例えば、病気、疲労、過敏性及び嗜眠、貧血、血小板減少症、急性腎不全、高血圧及び臓器損傷が含まれ得る。

【0379】

特定の用途では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）の症状又は適応症を治療又は予防するのに有用である。ＰＮＨは、まれな後天性の生命を脅かす血液の疾患である。この疾患は、赤血球の破壊（溶血性貧血）、血栓（血栓症）及び骨髄機能障害（３つの血液成分を十分に作らない）を特徴とする。ＰＮＨの徴候及び症状としては、著しい倦怠感又は衰弱、打撲又は易出血、息切れ、再発性感染及び／又はインフルエンザ様症状、出血を制御することの困難、非常に軽微な創傷からでさえ、皮膚下の出血を示す皮膚上の小さな赤い点の出現、重度の頭痛、感染による発熱及び血餅（血栓形成）が挙げられ得る。ＰＮＨの症状及び適応症には、赤血球の破壊、血栓症（深部静脈血栓症、肺塞栓症を含む）、血管内溶血性貧血、尿の赤変、貧血の症状、例えば疲労、息切れ及び動悸、腹痛及び嚥下困難が含まれるが、これらに限定されない。

【0380】

発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）は、ホスファチジルイノシトールグリカン生合成クラスＡ（ＰＩＧＡ）遺伝子の変異を獲得する多分化能造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する。ＰＩＧＡ遺伝子産物は、数十のタンパク質を細胞の原形質膜に付着させる糖脂質部分であるグリコフォスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの生合成に必要である。その結果、ＰＮＨ幹細胞及びその子孫の全ては、ＧＰＩアンカー型タンパク質の減少又は非存在を有する。造血性クローンに由来する成熟血球は、ＧＰＩ結合タンパク質の完全欠損（ＩＩＩ型）又は部分欠損（ＩＩ型）を有し得る（Ｈｉｌｌｍｅｎｅｔａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｃｕｌｉｚｕｍａｂｏｎｈｅｍｏｌｙｓｉｓａｎｄｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｐａｒｏｘｙｓｍａｌｎｏｃｔｕｒｎａｌｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２００４；３５０（６）：５５２－９）。ＧＰＩアンカーの非存在によって影響を受けるタンパク質の２つは、補体調節タンパク質であるＣＤ５５及びＣＤ５９である。ＣＤ５５は補体成分３（Ｃ３）コンバターゼを阻害することによって補体活性化を調節するが、ＣＤ５９はＣ８及びＣ９と相互作用することによって膜侵襲複合体（ＭＡＣ）Ｃ５ｂ～Ｃ９の集合を阻害する（Ｂｒｏｄｓｋｙ，ＨｏｗＩｔｒｅａｔｐａｒｏｘｙｓｍａｌｎｏｃｔｕｒｎａｌｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ．Ｂｌｏｏｄ２００９；１１３（２６）：６５２２－７）。それらが存在しないことにより、ＰＮＨ赤血球は補体媒介血管内溶血を受けやすくなる。ＰＮＨ患者におけるこの血管内溶血は、貧血（しばしば輸血を必要とする）及びヘモグロビン尿症を引き起こす。ＰＮＨの合併症には、血栓症、腹痛、嚥下障害、勃起不全及び肺高血圧症が含まれる（Ｈｉｌｌｍｅｎｅｔａｌ．，Ｔｈｅｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｃｕｌｉｚｕｍａｂｉｎｐａｒｏｘｙｓｍａｌｎｏｃｔｕｒｎａｌｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２００６；３５５（１２）：１２３３－４３）。血栓塞栓症は、ＰＮＨ患者の死亡の一般的な原因である。血栓塞栓症の潜在的な機序としては、血小板活性化、遊離ヘモグロビンの毒性、一酸化窒素欠乏、他のＧＰＩ結合タンパク質の非存在、及び内皮機能障害が挙げられる（Ｈｉｌｌｅｔａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓｉｎｐａｒｏｘｙｓｍａｌｎｏｃｔｕｒｎａｌｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ．Ｂｌｏｏｄ２０１３；１２１（２５）：４９８５－９６）。ＰＮＨは、自己免疫性再生不良性貧血と共に起こる（Ｌｕｚｚａｔｔｏ＆Ｒｉｓｉｔａｎｏ，Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓｏｆａｃｑｕｉｒｅｄａｐｌａｓｔｉｃａｎａｅｍｉａ．ＢｒＪＨａｅｍａｔｏｌ２０１８；１８２（６）：７５８－７６）。ＰＮＨに罹患している対象に、本明細書に記載の投薬レジメンによってＲＥＧＮ３９１８などのＣ５に特異的に結合するアンタゴニスト抗原結合タンパク質を投与することによって、ＰＮＨによって引き起こされる溶血に続発する貧血に対処するための輸血の必要性を減少させる、エリスロポエチン、鉄サプリメント及び／又は葉酸の必要性を減少させる、貧血の発生率を減少させる、ヘモグロビン尿症の発生率を減少させる、又は溶血の発生率を減少させる方法が本明細書に含まれる。

【0381】

ＰＮＨの診断は、フローサイトメトリーによって末梢血中で測定された１０％を超えるＰＮＨ顆粒球クローンサイズの存在の国際的に受け入れられている定義を使用して確立することができる。「活動性疾患」（活動性ＰＮＨ）の許容される定義は、３ヶ月以内の以下のＰＮＨ関連の徴候又は症状の１つ以上の存在である：疲労、ヘモグロビン尿症、腹痛、息切れ（呼吸困難）、貧血（ヘモグロビン＜１０ｇ／ｄＬ）、主要有害血管事象（ＭＡＶＥ；血栓症を含む）の病歴、嚥下障害、又は勃起不全。あるいは、３ヶ月以内のＰＮＨによるＲＢＣ輸血の病歴によって活動性を確立することができる。活動性ＰＮＨを治療するための方法も含まれる。

【0382】

特定の用途では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、ＣＨＡＰＬＥの症状又は適応症（補体の過剰活性化、血管障害性血栓症及びタンパク質喪失性腸障害を伴うＣＤ５５欠損症）を治療又は予防するのに有用である。ＣＨＡＰＬＥ疾患は、ＣＤ５５（減衰加速係数ＤＡＦとしても知られている）における機能突然変異の喪失によって引き起こされる常染色体劣性障害である。ＣＨＡＰＬＥの徴候及び症状には、低タンパク質血症（アルブミン及び免疫グロブリンの血清レベルが低い）（低タンパク質血症は、顔面及び四肢の浮腫及び再発性感染をもたらす）、吸収不良症候群（慢性下痢、発育不全、貧血及び微量栄養素欠乏）、補体過剰活性化、腸リンパ管拡張症（ＩＬ）及び腸炎症並びに／あるいは内臓血栓症に対する感受性の増加が含まれ得る。

【0383】

ＣＨＡＰＬＥ疾患（補体の過剰活性化、血管障害性血栓症及びタンパク質喪失性腸障害を伴うＣＤ５５欠損症）は、ＣＤ５５（減衰加速係数ＤＡＦとしても知られている）における機能突然変異の喪失によって引き起こされる常染色体劣性障害である。ＣＨＡＰＬＥの徴候及び症状には、低タンパク質血症（アルブミン及び免疫グロブリンの血清レベルが低い）（低タンパク質血症は、顔面及び四肢の浮腫及び再発性感染をもたらす）、吸収不良症候群（慢性下痢、発育不全、貧血及び微量栄養素欠乏）、補体過剰活性化、腸リンパ管拡張症（ＩＬ）及び腸炎症並びに／あるいは内臓血栓症に対する感受性の増加が含まれ得る。ＣＨＡＰＬＥ疾患は、ＣＤ５５遺伝子における二対立遺伝子機能喪失変異によって引き起こされる。臨床的には、しばしば重度であり、致死的な全身症状を伴い得る原発性腸リンパ管拡張症（ＰＩＬ）又はワルトマン病によって引き起こされる家族性形態のタンパク質喪失性腸症（ＰＬＥ）として現れる。ＣＤ５５は、Ｃ３ｂ及びＣ４ｂの酵素活性を阻害し、したがって最終的に膜侵襲複合体（Ｃ５ｂ～Ｃ９）の構築をもたらすＣ３及びＣ５コンバターゼの形成を防止する糖質ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー膜タンパク質である。したがって、ＣＤ５５の非存在は補体系の過活性化を引き起こし、アナフィラトキシン及び膜侵襲複合体を含む様々な補体産物の産生を引き起こす。造血幹細胞におけるＰＩＧＡ遺伝子の体細胞変異（ＧＰＩアンカーの生合成に必要）に起因して存在しない場合、ＣＤ５５喪失及びＣＤ５９喪失は、造血細胞に特異的である（ＣＤ５９は別のＧＰＩ連結補体調節タンパク質である）。典型的には、結果として生じる赤血球及び血小板の補体媒介溶解は、ＰＮＨにおける血管内溶血及び血栓症を引き起こす。ＣＨＡＰＬＥでは、全ての組織におけるＣＤ５５発現の単離された生殖系列喪失は、ＰＬＥを引き起こす原発性腸リンパ管拡張症として、消化管に現れる。一般に、ＰＮＨとは異なり、ＣＨＡＰＬＥ患者では溶血は観察されない。ＣＨＡＰＬＥを患っている対象に、本明細書に記載される投与レジメンによって、ＲＥＧＮ３９１８などのＣ５に特異的に結合するアンタゴニスト抗原結合タンパク質を対象に投与することによる、コルチコステロイド、免疫グロブリン、アルブミン、生物学的治療剤（例えば、抗体又はその抗原結合断片、例えば抗ＴＮＦα、又はベドリズマブ）、免疫調節剤（例えば、アザチオプリン又はメサラジン）、微量栄養素、経腸又は非経口補充、抗凝固剤（例えば、低分子量ヘパリン）、抗生物質及び／又は抗血小板剤（例えば、低用量アスピリンなどのアスピリン）の投与の必要性を減らすための方法も含まれた。Ｋｕｒｏｌａｐｅｔａｌ．，ＬｏｓｓｏｆＣＤ５５ｉｎＥｃｕｌｉｚｕｍａｂ－ＲｅｓｐｏｎｓｉｖｅＰｒｏｔｅｉｎ－ＬｏｓｉｎｇＥｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２０１７；３７７（１）：８７－９．；及びＯｚｅｎｅｔａｌ．，ＣＤ５５ＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙａｎｄＰｒｏｔｅｉｎ－ＬｏｓｉｎｇＥｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２０１７ｂ；３７７（１５）：１４９９－５００を参照されたい。ＣＨＡＰＬＥ疾患に関連するＣＤ５５変異としては、例えば、１４９－１５０ｄｅｌＡＡ；１４９－１５０ｉｎｓＣＣＴＴ；１０９ｄｅｌＣ；８００Ｇ＞Ｃ；２８７－１Ｇ＞Ｃ；１４９－１５０ｄｅｌＡＡｉｎｓＣＣＴＴ；（国際公開第２０１８／０５３０３９号に記載）又は同じ変異アミノ酸配列をもたらすＣＤ５５変異が挙げられる。

【0384】

ＣＨＡＰＬＥの診断は、ＣＤ５５機能喪失変異を同定するための遺伝子分析によって行うことができる。診断は、ＣＤ５５の存在の減少を同定するために、末梢血細胞のフローサイトメトリー又はウェスタンブロッティングによって確認することができる。活性ＣＨＡＰＬＥ疾患は、いくつかの実施形態では、３．２ｇ／ｄＬ以下の低アルブミン血症、及びＣＨＡＰＬＥに起因する以下の徴候又は症状：下痢、嘔吐、腹痛、末梢若しくは顔面浮腫、又は付随する低ガンマグロブリン血症を伴う感染症のエピソード、又は新たな血栓塞栓性事象のうちの１つ以上を特徴とする。血清アルブミンの正常範囲は、典型的には約３．５～５．５ｇ／ｄＬである。

【0385】

特定の用途では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）の症状又は適応症を治療又は予防するのに有用である。ＡＰＳは、抗リン脂質抗体による動脈及び静脈の血栓症を特徴とする自己免疫疾患である。障害は、別の自己免疫疾患の非存在下で起こる場合、原発性と呼ばれる。二次性ＡＰＳは、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫障害に関連して起こる。壊滅的なＡＰＳ（ＣＡＰＳ）は、広範な血管内血栓症が多臓器虚血及び不全をもたらす、まれな生命を脅かすＡＰＳの形態である。

【0386】

特定の用途では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、重症筋無力症（ＭＧ）の症状又は適応症を治療又は予防するのに有用である。ＭＧは、骨格筋の衰弱を引き起こす慢性自己免疫性神経筋疾患であり、骨格筋は、腕及び脚を含む身体の呼吸及び運動部分を担う。

【0387】

特定の用途では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、典型的な溶血性尿毒症症候群（ｔＨＵＳ）の症状又は適応症を治療又は予防するのに有用である。ｔＨＵＳは、志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）による胃腸感染後に起こり得る。典型的なＨＵＳ（店舗；志賀毒素産生大腸菌（ＳＴＥＣ）溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ））は、既知の強力な細胞毒である志賀毒素（又は志賀様毒素）が（ドメインＢを介して）細胞膜糖脂質Ｇｂ３に結合すると開始され得る。ドメインＡは内在化され、続いてタンパク質合成を停止させ、罹患細胞のアポトーシスを誘導する。志賀毒素は、内皮細胞に対していくつかの更なる効果を有し、そのうちの１つは、微小血管血栓症に寄与し得る機能的組織因子の発現増強である。毒素は、内皮、赤血球及び血小板の損傷又は活性化を引き起こす。

【0388】

特定の用途では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、Ｃ５関連眼科疾患、例えば、加齢黄斑変性（ＡＭＤ；例えば、湿潤又は乾燥）、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、非感染性ブドウ膜炎、地図状萎縮、シュタルガルト黄斑ジストロフィー又は視神経炎の症状又は適応症を治療又は予防するのに有用である。そのような方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及び／又は他の治療剤を、例えば眼内注射又は硝子体内注射によって投与することができる。

【0389】

ＡＭＤは、典型的には５５歳以上の人々における黄斑（網膜の中心部分）の進行性変性である。Ｃ３、Ｃ５ｂ－９、ＣＦＢ及びＣＦＨを含む様々な補体成分が、ドルーゼン及びＡＭＤ病変において検出されている。更に、Ｃ３ａ、Ｃ３ｄ、Ｂｂ及びＣ５ａの血漿レベルの増加がＡＭＤ患者で観察されている。これらの結果は、ＡＭＤにおける局所及び全身の補体活性化の増加を示唆する。

【0390】

ＤＲは、糖尿病の結果としての網膜血管系及びニューロンの進行性変性である。ＤＲ眼の脈絡毛細管板は、有意なレベルのＣ３ｄ及びＣ５ｂ－９複合体を含有する。Ｃ５ｂ－９沈着は、＞９歳の２型糖尿病患者の網膜血管でも検出可能であり得、Ｃ５ａの増加は、増殖性ＤＲ患者の硝子体で検出され得、補体活性化がＤＲの網膜血管損傷に関与することを示唆している。

【0391】

非感染性ブドウ膜炎は、片眼又は両眼の炎症（熱、発赤、疼痛及び腫脹）であり、これは感染に起因しない。

【0392】

地図状萎縮（ＧＡ）は、後期加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の一部としての、黄斑の慢性進行性変性である。この疾患は、網膜外組織、網膜色素上皮及び脈絡毛細管板の限局性で境界が明確な萎縮を特徴とする。これは、典型的には、周中心窩周辺領域で始まり、時間とともに中心窩を含むように拡大し、中心暗点及び視力の永続的喪失をもたらす。それはほとんどの場合、両側性である。

【0393】

常染色体劣性シュタルガルト黄斑ジストロフィー（ＳＴＧＤ１）は、ＡＢＣＡ４（ＡＢＣＲ）遺伝子の突然変異に起因するジストロフィーである。ＡＢＣＡ４の変異も錐体－桿体ジストロフィーをもたらす。若年性及び早期成人ＳＴＧＤ１の発症年齢は通常８～２５歳であり、一部の症例は高齢者に発生する（後期成人発症ＳＴＧＤ１）。この疾患の特徴は、眼の網膜色素上皮（ＲＰＥ）におけるリポフスチン（加齢に関連する褐色－黄色自己蛍光色素）の早期蓄積であり、黄斑から外側に広がる黄色がかった斑点のパターンを引き起こす。

【0394】

視神経炎は、視神経を損傷する炎症である。片眼の痛み及び一時的な視力喪失は、視神経炎の一般的な症状である。

【0395】

特定の用途では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、対象の体内の補体活性（例えば、Ｃ５媒介補体活性）を低下させるのに有用である。例えば、いくつかの実施形態では、補体活性は、補体媒介溶血（例えば、古典的経路媒介性又は代替経路媒介性）又はＣ５活性（例えば、Ｃ５ａのＣ５ａＲ１への結合、Ｃ５前駆体からのＣ５ａ及び／又はＣ５ｂの生成；又は細胞、例えば内皮細胞における膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成若しくは沈着）である。いくつかの実施形態では、補体活性は、抗ヒツジ抗体でコーティングされたヒツジ赤血球を溶解する、対象の身体から採取された血清の能力である。

【0396】

特定の用途では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、神経障害、腎障害、多発性硬化症、脳卒中、ギラン・ベン症候群、外傷性脳損傷、パーキンソン病、不適切又は望ましくない補体活性化の障害、血液透析合併症、超急性同種移植片拒絶、異種移植片拒絶、ＩＬ－２治療中のインターロイキン－２誘導性毒性、炎症性障害、自己免疫疾患の炎症、クローン病、成人呼吸窮迫症候群、火傷又は凍傷を含む熱傷、虚血後再灌流状態、心筋梗塞、毛細血管漏出症候群、肥満、糖尿病、アルツハイマー病、統合失調症、脳卒中、てんかん、アテローム性動脈硬化、血管炎、水疱性類天疱瘡、Ｃ３糸球体症、膜増殖性糸球体腎炎、バルーン血管形成術、心肺バイパス又は腎バイパスにおけるポンプ後症候群、血液透析、腎虚血、大動脈再建後の腸間膜動脈再灌流、感染性疾患又は敗血症、免疫複合体障害及び自己免疫疾患、糖尿病性腎症、アルポート症候群、進行性腎不全、タンパク尿性腎疾患、腎虚血再灌流傷害、ループス腎炎、糸球体症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ＳＬＥ腎炎、膜増殖性腎炎、溶血性貧血、視神経脊髄炎、腎移植、遺伝性ＣＤ５９欠乏症、乾癬、及び重症筋無力症からなる群から選択されるＣ５関連疾患又は障害の少なくとも１つの症状又は適応症を治療又は予防するために有用である。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、呼吸困難、喀血、ＡＲＤＳ、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、肺塞栓症及び梗塞、肺炎、線維性ダスト疾患、不活性塵及び鉱物（例えば、ケイ素、石炭粉、ベリリウム、及びアスベスト）による傷害、肺線維症、有機ダスト疾患、化学的傷害（刺激性のガス及び化学物質、例えば塩素、ホスゲン、二酸化硫黄、硫化水素、二酸化窒素、アンモニア、及び塩酸に起因する）、煙傷害、熱傷害（例えば、火傷、凍結）、喘息、アレルギー、気管支収縮、過敏性肺炎、寄生虫症、グッドパスチャー症候群、肺血管炎、遺伝性血管浮腫、及び免疫複合体関連炎症などの肺疾患及び障害からなる群から選択されるＣ５関連疾患又は障害の少なくとも１つの症状又は適応症を治療又は予防するために（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれかで）有用である。

【0397】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、成人呼吸窮迫症候群；加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、アレルギー、アルポート症候群、アルツハイマー病、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、喘息、アテローム性動脈硬化症、非典型溶血性尿毒症症候群（ａＨＵＳ）、自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、バルーン血管形成、気管支収縮、水疱性類天疱瘡、火傷、Ｃ３糸球体症、毛細血管漏出症候群、心血管障害、突発性抗リン脂質症候群（ＣＡＰＳ）、脳血管障害、ＣＨＡＰＬＥ疾患（補体の過剰活性化、血管障害性血栓症及びタンパク質喪失性腸障害を伴うＣＤ５５欠損症）、化学的損傷、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、寒冷凝集素症（ＣＡＤ）、角膜及び／又は網膜組織、クローン病、デゴス病、高密度沈着物疾患（ＤＤＤ）、皮膚筋炎、糖尿病、糖尿病性血管障害、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、拡張型心筋症、不適切又は望ましくない補体活性化障害、呼吸困難、気腫、表皮水疱症、てんかん、線維原性ダスト疾患、凍傷、地図状萎縮（ＧＡ）、糸球体腎炎、糸球体症、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本甲状腺炎、血液透析合併症、溶血－肝臓酵素上昇及び低血小板（ＨＥＬＬＰ）症候群、溶血性貧血、喀血、Ｈｅｎｏｃｈ－Ｓｃｈｏｎｌｅｉｎ紫斑病性腎炎、遺伝性血管浮腫、超急性同種移植片拒絶、過敏性肺炎、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、免疫複合体障害、免疫複合体血管炎、免疫複合体関連炎症、感染症、自己免疫疾患によって引き起こされる炎症、炎症性障害、遺伝性ＣＤ５９欠損、不活性ダスト及び／又は鉱物による損傷、ＩＬ－２治療中のインターロイキン－２誘導性毒性、虚血－再灌流傷害、川崎病、肺の疾患又は障害、ループス腎炎、膜増殖性糸球体腎炎、膜増殖性腎炎、大動脈再建後の腸間膜動脈再灌流、腸間膜／腸間膜血管障害、多巣性運動ニューロパシー（ＭＭＮ）、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋梗塞、心筋炎、神経障害、視神経脊髄炎、肥満、眼血管新生、脈絡膜に影響を及ぼす眼血管新生、有機ダスト病、寄生虫症、パーキンソン病、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、低免疫性血管炎、天疱瘡、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、末梢（例えば筋骨格）血管障害、肺炎、虚血後再灌流状態、心肺バイパスにおけるポンプ後症候群、腎バイパスにおけるポンプ後症候群、進行性腎不全、増殖性腎炎、タンパク尿腎疾患、乾癬、肺塞栓症、肺線維症、肺梗塞、肺血管炎、再発性胎児喪失、腎障害、腎虚血、腎虚血－再灌流傷害、腎血管障害、ステント留置後の再狭窄、関節リウマチ（ＲＡ）、回転式アテレクトミー、統合失調症、敗血症、敗血症性ショック、ＳＬＥ腎炎、煙による傷害、脊髄損傷、自然胎児喪失、脳卒中、敗血症に対する全身性炎症反応、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、全身性エリテマトーデス関連血管炎、高安病、熱損傷、血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、外傷性脳損傷、Ｉ型糖尿病、典型的な溶血性尿毒症症候群（ｔＨＵＳ）、ブドウ膜炎、血管炎、関節リウマチに関連する血管炎、静脈ガス塞栓（ＶＧＥ）、及び／又は異種移植片拒絶のうちの１つ以上である、Ｃ５関連疾患を治療又は予防するために（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれかで）有用である。

【0398】

特定の用途では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性黄斑浮腫（ＤＭＥ）、糖尿病性網膜症、眼血管形成（脈絡膜、角膜又は網膜組織に影響を及ぼす眼血管新生）、地図状萎縮（ＧＡ）、ブドウ膜炎及び視神経脊髄炎などの眼疾患に罹患している対象を治療するのに有用である。Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、乾燥型ＡＭＤ又は湿潤型ＡＭＤの少なくとも１つの症状又は適応症を治療又は改善するために使用され得る。いくつかの方法では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、視力喪失の予防又は速度の遅延に有用である。いくつかの方法では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的化するための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、乾燥型ＡＭＤを有する対象の眼のドルーゼンを減少させるのに有用である。いくつかの方法では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれか）は、ＡＭＤを有する対象の視力喪失を予防又は低減／遅延させるのに有用である。

【0399】

Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、眼の疾患又は障害の症状又は状態／適応症の１つ以上の重症度を軽減又は予防又は減少させるために（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれかで）投与され得る。Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、視力喪失、視覚歪み、低照度レベルへの適応困難、屈曲した中心視力、中心／全視力の混濁の増加、ドルーゼンの存在（網膜上に蓄積する細胞外物質の小さな蓄積）、色素変化、直線のグリッドが波状に見え、グリッドの一部が空白に見えることがある、変性視症の形態の歪んだ視覚、滲出性変化（眼の出血、硬性滲出液、網膜下／ＲＰＥ下／網膜内液）、明光への曝露後の視覚機能の回復の遅延（光ストレス試験）、初期及び地図状萎縮、視力の劇的な低下（２つのレベル又はそれ以上）、例えば２０／２０～２０／８０、優先的な高視力視野測定の変化（湿性ＡＭＤの場合）、かすみ眼、中心視力の漸進的喪失（非滲出性黄斑変性の患者の場合）、視力喪失の急速な発症（滲出性黄斑変性の対象における異常な血管の漏出及び出血によって引き起こされることが多い）、中心暗点（陰影又は視覚の欠落領域）、色の識別に問題があり、具体的には暗い色からの暗い色及び明るい色からの明るい色、コントラスト感度の喪失、直線がアムスラーグリッドにおいて湾曲して現れることが挙げられるがこれらに限定されない、少なくとも１つの症状の重症度を改善又は低減するために（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれかで）使用され得る。

【0400】

Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはまた、黄斑変性を発症するリスクがある対象、例えば５０歳を超える対象、黄斑変性の家族歴を有する対象、喫煙者、及び肥満、高コレステロール、心血管疾患、又は非健康な食事を有する対象において予防的に（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれかで）使用され得る。

【0401】

Ｃ．Ｃ５を動物又は細胞に標的化するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬及び／又はＣ５抗原結合タンパク質及び／又は他の試薬の投与
本明細書に開示される方法は、核酸の形態（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）、タンパク質、核酸タンパク質複合体を含む、Ｃ５を標的とする様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ試薬（及び任意選択的にＣ５を標的とする外因性ドナー核酸）を動物（例えば、ヒトなどの哺乳動物）又は細胞に導入することを含み得る。本明細書に開示される方法はまた、動物（例えば、ヒトなどの哺乳動物）又は細胞に様々なＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体又は他の治療剤を導入することを含み得る。「導入する」は、動物若しくは細胞の内部又は動物内の細胞の内部にアクセスできるように分子（複数可）（例えば、核酸（複数可）又はタンパク質（複数可））を細胞又は動物に提示することを含む。導入することは、任意の手段によって達成することができ、２つ以上の構成要素（例えば、２つの構成要素、又はすべての構成要素）を、任意の組み合わせで同時に又は逐次的に細胞又は動物に導入することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ガイドＲＮＡの導入前に細胞又は動物に導入することができ、又はガイドＲＮＡの導入後に導入することができる。別の例として、外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの導入前に導入することができるか、又はＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの導入後に導入することができる（例えば、外因性ドナー核酸は、Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの導入の約１、２、３、４、８、１２、２４、３６、４８、又は７２時間前又は後に投与することができる）。例えば、米国特許出願公開第２０１５／０２４０２６３号明細書及び米国特許出願公開第２０１５／０１１０７６２号明細書を参照されたく、これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。加えて、２つ以上の構成要素は、同じ送達方法又は異なる送達方法によって細胞又は動物に導入することができる。同様に、２つ以上の構成要素は、同じ投与経路又は異なる投与経路によって動物に導入することができる。

【0402】

ガイドＲＮＡは、例えばＲＮＡ（例えば、インビトロ転写ＲＮＡ）の形態で、又はガイドＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で、動物又は細胞に導入することができる。ガイドＲＮＡは、本明細書の他の箇所に開示されるように修飾することができる。ＤＮＡの形態で導入される場合、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡは、細胞内又は動物の細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結され得る。例えば、ガイドＲＮＡは、ＡＡＶを介して送達され、Ｕ６プロモーターの下で、インビボで発現され得る。そのようなＤＮＡは、１つ以上の発現構築物中にあり得る。例えば、そのような発現構築物は、単一の核酸分子の構成要素であり得る。代替的に、それらは、２つ以上の核酸分子の間で任意の組み合わせで分離することができる（すなわち、１つ以上のＣＲＩＳＰＲＲＮＡをコードするＤＮＡ及び１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、別個の核酸分子の構成要素であり得る）。

【0403】

同様に、Ｃａｓタンパク質は、任意の形態で提供することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質は、ｇＲＮＡと複合体を形成したＣａｓタンパク質などのタンパク質の形態で提供することができる。代替的に、Ｃａｓタンパク質は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））又はＤＮＡなどの、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の形態で提供することができる。ＣａｓＲＮＡは、本明細書の他の箇所に開示されるように修飾することができる。任意選択的に、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、特定の細胞又は生物におけるタンパク質への効率的な翻訳のためにコドン最適化することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、天然に存在するポリヌクレオチド配列と比較して、哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、又は任意の他の目的の宿主細胞においてより高い頻度で使用される代替コドンへと改変することができる。Ｃａｓタンパク質をコードする核酸が細胞又は動物に導入される場合、Ｃａｓタンパク質は、細胞又は動物の細胞において一過性、条件付き又は構成的に発現され得る。

【0404】

Ｃａｓタンパク質又はガイドＲＮＡをコードする核酸は、発現コンストラクト中のプロモーターに作動可能に連結され得る。発現構築物は、遺伝子又は他の目的の核酸配列（例えば、Ｃａｓ遺伝子）の発現を指示することができ、そのような目的の核酸配列を標的細胞に導入することができる任意の核酸構築物を含む。例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクター内に存在し得る。代替的に、それは、１つ以上のｇＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターとは別のベクター又はプラスミドであり得る。発現コンストラクトにおいて使用することができる好適なプロモーターとしては、例えば、真核細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、ウサギ細胞、多能性細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、成体幹細胞、発生が制限された前駆細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は１細胞期胚のうちの１つ以上において活性なプロモーターが挙げられる。例えば、適切なプロモーターは、肝細胞などの肝臓細胞において活性であり得る。そのようなプロモーターは、例えば、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、又は組織特異的プロモーターであってよい。任意選択的に、プロモーターは、一方向のＣａｓタンパク質と他の方向のガイドＲＮＡの両方の発現を駆動する双方向プロモーターであり得る。このような双方向プロモーターは、（１）遠位配列要素（ＤＳＥ）、近位配列要素（ＰＳＥ）、及びＴＡＴＡボックスの３つの外部制御要素を含む完全な従来の一方向ＰｏｌＩＩＩプロモーター、並びに（２）ＤＳＥの５’末端に逆方向に融合されたＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを含む第２の基本的なＰｏｌＩＩＩプロモーターで構成することができる。例えば、Ｈ１プロモーターでは、ＤＳＥはＰＳＥとＴＡＴＡボックスに隣接しており、プロモーターは、Ｕ６プロモーターに由来するＰＳＥ及びＴＡＴＡボックスを追加することによって逆方向の転写が制御されるハイブリッドプロモーターを作成することにより、双方向にすることができる。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／００７４５３５を参照されたい。双方向プロモーターを使用してＣａｓタンパク質とガイドＲＮＡをコードする遺伝子を同時に発現させることにより、コンパクトな発現カセットを生成して送達を容易にすることができる。

【0405】

動物又は細胞に導入された分子（例えば、Ｃａｓタンパク質又はガイドＲＮＡ又はＣ５抗原結合タンパク質をコードする核酸）は、導入された分子の安定性を増加させる担体（例えば、所与の貯蔵条件下（例えば、－２０℃、４℃、又は周囲温度）での、分解産物が閾値未満、例えば出発核酸又はタンパク質の０．５重量％未満のままである期間を延長する、又はインビボでの安定性を増加させる）を含む組成物で提供することができる。そのような担体の非限定的な例には、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ミクロスフェア、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸－コグリコール－酸）（ＰＬＧＡ）ミクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質コキレート（cochleates）、及び脂質微小管が挙げられる。

【0406】

細胞又は動物への分子（例えば、核酸又はタンパク質）の導入を可能にするために、様々な方法及び組成物が本明細書で提供される。分子を様々な細胞型に導入するための方法は既知であり、例えば、安定したトランスフェクション法、一過性トランスフェクション法、及びウイルス媒介法が含まれる。

【0407】

トランスフェクションプロトコル、並びに分子を細胞に導入するためのプロトコルは異なり得る。非限定的なトランスフェクション方法としては、リポソーム；ナノ粒子；リン酸カルシウム（Ｇｒａｈａｍｅｔａｌ．（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ５２（２）：４５６－６７，Ｂａｃｃｈｅｔｔｉｅｔａｌ．（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」７４（４）：１５９０－４，ａｎｄＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｍ（１９９１）．ＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．ＮｅｗＹｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ．ｐｐ．９６－９７）、デンドリマー、又はＤＥＡＥ－デキストラン若しくはポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーを使用する化学ベースのトランスフェクション方法が挙げられる。非化学的方法には、電気穿孔法、ソノポレーション、及び光トランスフェクションが含まれる。粒子ベースのトランスフェクションには、遺伝子銃の使用、又はマグネットアシストトランスフェクション（Ｂｅｒｔｒａｍ（２００６）ＣｕｒｒｅｎｔＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７，２７７－２８）が含まれる。ウイルス法もトランスフェクションに使用することができる。

【0408】

細胞への核酸又はタンパク質の導入はまた、エレクトロポレーション、細胞質内注射、ウイルス感染、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、又はヌクレオフェクションによって媒介され得る。ヌクレオフェクションは、核酸基質を細胞質だけでなく核膜を介して核に送達することを可能にする改良されたエレクトロポレーション技術である。加えて、本明細書に開示される方法でのヌクレオフェクションの使用は、典型的には、通常の電気穿孔法よりもはるかに少ない細胞を必要とする（例えば、通常の電気穿孔法による７００万に対してわずか約２００万）。一例では、ヌクレオフェクションは、ＬＯＮＺＡ（登録商標）ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲ（商標）システムを使用して行われる。

【0409】

細胞（例えば、接合子）への分子（例えば、核酸又はタンパク質）の導入は、マイクロインジェクションによっても達成され得る。接合子（すなわち、１細胞期胚）では、マイクロインジェクションは母体及び／又は父方の前核又は細胞質に行うことができる。マイクロインジェクションが１つの前核のみに行われる場合は、サイズが大きいため、父方の前核が適している。ｍＲＮＡのマイクロインジェクションは、好ましくは細胞質へ（例えば、ｍＲＮＡを翻訳機構に直接送達するために）のものであるが、一方で、Ｃａｓタンパク質若しくはＣａｓタンパク質をコードするか又はＲＮＡをコードするポリヌクレオチドのマイクロインジェクションは、核／前核へのものが好ましい。代替的に、マイクロインジェクションは、核／前核及び細胞質の両方への注射によって実施することができ、針を最初に核／前核に導入し、最初の量を注射することができ、１細胞期胚から針を除去しながら、２番目の量を細胞質に注射することができる。Ｃａｓタンパク質が細胞質に注入される場合、Ｃａｓタンパク質は、核／前核への送達を確実にするために、核局在化シグナルを含むことが好ましい。マイクロインジェクションを実施する方法は周知である。例えば、Ｎａｇｙｅｔａｌ．（ＮａｇｙＡ，ＧｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎＭ，ＶｉｎｔｅｒｓｔｅｎＫ，ＢｅｈｒｉｎｇｅｒＲ．，２００３，ＭａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇｔｈｅＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）；またＭｅｙｅｒｅｔａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」１０７：１５０２２－１５０２６及びＭｅｙｅｒｅｔａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．」１０９：９３５４－９３５９を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0410】

分子（例えば、核酸又はタンパク質）を細胞又は動物に導入するための他の方法には、例えば、ベクター送達、粒子媒介送達、エクソソーム媒介送達、脂質ナノ粒子媒介送達、細胞透過性ペプチド媒介送達、又は埋め込み型デバイス媒介配達が含まれ得る。具体的な例として、核酸又はタンパク質は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）マイクロスフェア、ポリ（Ｄ、Ｌ－乳酸－コグリコール酸）（ＰＬＧＡ）マイクロスフェア、リポソーム、ミセル、逆ミセル、脂質渦巻状物、又は脂質微小管などの担体中で、細胞又は動物に導入することができる。動物への送達のいくつかの特定の例には、流体力学的送達、ウイルス媒介送達（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）媒介送達）、及び脂質ナノ粒子媒介送達が含まれる。

【0411】

細胞又は動物への核酸及びタンパク質の導入は、流体力学的送達（ＨＤＤ）によって達成することができる。実質細胞への遺伝子送達では、必須のＤＮＡ配列のみを選択した血管から注射する必要があり、現在のウイルス及び合成ベクターに関連する安全性の懸念が排除される。ＤＮＡは血流に注入されると、血液にアクセスできる様々な組織の細胞に到達することができる。流体力学的送達は、循環中の非圧縮性血液への大量の溶液の迅速な注射によって生成される力を利用して、大きくかつ膜不透過性の化合物が実質細胞に入るのを妨げる内皮及び細胞膜の物理的障壁を克服する。ＤＮＡの送達に加えて、この方法は、ＲＮＡ、タンパク質、及び他の小さな化合物をインビボで効率的に細胞内に送達するのに役立つ。例えば、Ｂｏｎａｍａｓｓａｅｔａｌ．（２０１１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２８（４）：６９４－７０１を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。

【0412】

核酸の導入は、ＡＡＶ媒介送達又はレンチウイルス媒介送達などのウイルス媒介送達によっても達成することができる。ベクターは、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターであり得る。ＡＡＶは任意の好適な血清型であり得、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）又は自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）であり得る。他の例示的なウイルス／ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、及び単純ヘルペスウイルスが含まれる。ウイルスは、分裂細胞、非分裂細胞、又は分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し得る。ウイルスは、宿主ゲノムに組み込むことができるか、又は代替的に宿主ゲノムに組み込まない。このようなウイルスは、免疫力が低減するように操作することもできる。ウイルスは、複製可能であり得、複製欠損性（例えば、ビリオン複製及び／又はパッケージングの追加ラウンドに必要な１つ以上の遺伝子に欠損がある）であり得る。ウイルスは、一過性の発現、長期的な発現（例えば、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、又は３ヶ月）、又は永続的な発現（例えば、Ｃａｓ９及び／又はｇＲＮＡの）を引き起こし得る。ウイルスベクターは、それらの野生型対応物から遺伝的に改変され得る。例えば、ウイルスベクターは、クローニングを容易にするために、又はベクターの１つ以上の特性が変化するように、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含み得る。このような特性としては、パッケージング能力、形質導入効率、免疫原性、ゲノム組込み、複製、転写、及び翻訳が挙げられ得る。いくつかの例において、ウイルスゲノムの一部は、ウイルスがより大きなサイズを有する外因性配列をパッケージングすることができるように欠失され得る。いくつかの例において、ウイルスベクターは、増強された形質導入効率を有し得る。いくつかの例では、宿主においてウイルスによって誘導される免疫応答が低減され得る。いくつかの例において、宿主ゲノムへのウイルス配列の組込みを促進するウイルス遺伝子（インテグラーゼなど）は、ウイルスが非組込み型になるように突然変異され得る。いくつかの例では、ウイルスベクターは複製欠損であり得る。いくつかの例では、ウイルスベクターは、ベクター上のコード配列の発現を駆動するための外因性転写又は翻訳制御配列を含み得る。いくつかの例では、ウイルスはヘルパー依存性であり得る。例えば、ウイルスは、ベクターを増幅してウイルス粒子にパッケージングするのに必要なウイルス成分（ウイルスタンパク質など）を供給するために１つ以上のヘルパーウイルスを必要とし得る。そのような場合、ウイルス成分をコードする１つ以上のベクターを含む１つ以上のヘルパー成分を、本明細書に記載のベクター系と共に宿主細胞又は宿主細胞の集団に導入することができる。他の例では、ウイルスはヘルパーフリーであり得る。例えば、ウイルスは、ヘルパーウイルスなしでベクターを増幅及びパッケージングすることができる。いくつかの例では、本明細書に記載のベクター系はまた、ウイルスの増幅及びパッケージングに必要なウイルス成分をコードし得る。例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）としては、約１０^１２、約１０^１３、約１０^１４、約１０^１５及び約１０^１６のベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬ、又は約１０^１２～約１０^１６、約１０^１２～約１０^１５、約１０^１２～約１０^１４、約１０^１２～約１０^１３、約１０^１３～約１０^１６、約１０^１４～約１０^１６、約１０^１５～約１０^１６、若しくは約１０^１３～約１０^１５ｖｇ／ｍＬが挙げられる。他の例示的なウイルス力価（例えば、ＡＡＶ力価）としては、約１０^１２、約１０^１３、約１０^１４、約１０^１５及び約１０^１６のベクターゲノム（ｖｇ）／ｋｇの体重、又は約１０^１２～約１０^１６、約１０^１２～約１０^１５、約１０^１２～約１０^１４、約１０^１２～約１０^１３、約１０^１３～約１０^１６、約１０^１４～約１０^１６、約１０^１５～約１０^１６、若しくは約１０^１３～約１０^１５ｖｇ／ｋｇの体重が挙げられる。一例において、ウイルス力価は、約１０^１３～約１０^１４ｖｇ／ｍＬ又はｖｇ／ｋｇである。

【0413】

【0414】

【0415】

【0416】

使用され得るＩＴＲのいくつかの非限定的な例としては、配列番号７０６、配列番号７０７、又は配列番号７０８を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなるＩＴＲを含む。ＩＴＲの他の例は、配列番号７０６、配列番号７０７、又は配列番号７０８と比較して１つ以上の変異を含み、配列番号７０６、配列番号７０７、又は配列番号７０８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一であり得る。本明細書に開示されるいくつかのｒＡＡＶゲノムでは、ヌクレアーゼ剤（又はその成分）をコードする核酸は、同じＩＴＲ（すなわち、５’末端のＩＴＲ、及び３’末端のＩＴＲの逆相補体）が両側に隣接している。一例では、各末端のＩＴＲは、配列番号７０６を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。別の例では、各末端のＩＴＲは、配列番号７０７を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。一例において、少なくとも１つの末端上のＩＴＲは、配列番号７０８を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。一例では、５’末端のＩＴＲは、配列番号７０８を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。一例では、３’末端のＩＴＲは、配列番号７０８を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。一例では、各末端のＩＴＲは、配列番号７０８を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、又はそれからなり得る。本明細書に開示される他のｒＡＡＶゲノムでは、ヌクレアーゼ剤（又はその成分）をコードする核酸は、各末端で異なるＩＴＲに隣接している。一例では、一端のＩＴＲは、配列番号７０６を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、もう一方の末端のＩＴＲは、配列番号７０７を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。別の例では、一端のＩＴＲは、配列番号７０６を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、もう一方の末端のＩＴＲは、配列番号７０８を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。一例では、一端のＩＴＲは、配列番号７０７を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなり、もう一方の末端のＩＴＲは、配列番号７０８を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。

【0417】

【0418】

【0419】

【0420】

ＡＡＶの複数の血清型が確認されている。これらの血清型は、感染する細胞の種類（すなわち、それらの指向性）が異なり、特定の細胞型の優先的な形質導入を可能にする。ＡＡＶという用語は、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ、６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０及びそれらのハイブリッド、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ及びヒツジＡＡＶを含む。ＡＡＶの種々の血清型のゲノム配列、並びにネイティブ末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びキャプシドサブユニットの配列は、当該分野で公知である。このような配列は、文献又はＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに見出すことができる。本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではない異種配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種の核酸配列）、典型的には目的の異種ポリペプチドをコードする配列を含むＡＡＶベクターを指す。構築物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ、６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０及びそれらのハイブリッド、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ及びヒツジＡＡＶキャプシド配列を含み得る。一般に、異種核酸配列（導入遺伝子）は、少なくとも１つ、一般に２つのＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）に隣接している。ＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）又は自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであり得る。肝臓組織の血清型の例には、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．７４、及びＡＡＶｈｕ．３７、特にＡＡＶ８を含む。具体的な例では、核酸構築物を含むＡＡＶベクターは組換えＡＡＶ８（ｒＡＡＶ８）であり得る。本明細書に記載のｒＡＡＶ８ベクターは、キャプシドがＡＡＶ８に由来するものである。例えば、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ及びＡＡＶ８のキャプシドを使用するＡＡＶベクターは、本明細書ではｒＡＡＶ８ベクターであると考えられる。ＣＮＳ組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が含まれる。心臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が含まれる。腎臓組織に対する血清型にはＡＡＶ２が含まれる。肺組織に対する血清型には、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、及びＡＡＶ９が含まれる。膵臓組織に対する血清型にはＡＡＶ８が含まれる。光受容細胞に対する血清型には、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８が含まれる。網膜色素上皮組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、及びＡＡＶ８が含まれる。骨格筋組織に対する血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９が含まれる。肝臓組織に対する血清型には、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９、並びに、特にＡＡＶ８が含まれる。

【0421】

【0422】

【0423】

【0424】

特定のＡＡＶでは、カーゴはガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸を含むことができる。特定のＡＡＶにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸を含み得る。特定のＡＡＶでは、カーゴに外因性ドナー配列を含めることができる。特定のＡＡＶにおいて、カーゴは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ガイドＲＮＡ又はガイドＲＮＡをコードする核酸、及び外因性ドナー配列を含み得る。

【0425】

核酸及びタンパク質の導入は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）媒介送達によっても達成できる。例えば、ＬＮＰ媒介送達は、ＣａｓｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの組み合わせ、又はＣａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの組み合わせを送達するために使用することができる。ＬＮＰ媒介送達を使用して、ＲＮＡの形態のガイドＲＮＡを送達することができる。具体的な例では、ガイドＲＮＡとＣａｓタンパク質はそれぞれ、同じＬＮＰでのＬＮＰ媒介送達を介してＲＮＡの形態で導入される。本明細書の他の箇所でより詳細に考察されるように、１つ以上のＲＮＡを修飾することができる。例えば、１つ以上のＲＮＡは、５’末端及び／又は３’末端に１つ以上の安定化末端修飾を含むように修飾され得る。かかる修飾には、例えば、５’末端及び／又は３’末端の１つ以上のホスホロチオエート結合、又は５’末端及び／又は３’末端の１つ以上の２’－Ｏ－メチル修飾が含まれ得る。別の例として、ＣａｓｍＲＮＡ修飾は、シュードウリジンでの置換（例えば、シュードウリジンで完全に置換される）、５’キャップ、及びポリアデニル化を含み得る。別の例として、ＣａｓｍＲＮＡ修飾は、Ｎ１－メチル－シュードウリジンによる置換（例えば、Ｎ１－メチル－シュードウリジンによる完全置換）、５’キャップ、及びポリアデニル化を含むことができる。他の改変もまた、本明細書の他の箇所に開示されるように企図される。かかる方法による送達は、一過性のＣａｓ発現及び／又はガイドＲＮＡの一過性の存在をもたらし得、生分解性脂質はクリアランスを改善し、忍容性を改善し、免疫原性を低下させる。脂質製剤は、生体分子を分解から保護すると同時に、細胞への取り込みを改善することができる。脂質ナノ粒子は、分子間力によって互いに物理的に結合した複数の脂質分子を含む粒子である。これらには、ミクロスフェア（単層及び多層ベシクル、例えば、リポソームを含む）、エマルジョン中の分散相、ミセル、又は懸濁液中の内相が含まれる。そのような脂質ナノ粒子は、送達のために１つ以上の核酸又はタンパク質をカプセル化するために使用することができる。カチオン性脂質を含む製剤は、核酸などのポリアニオンを送達するのに有用である。含めることができる他の脂質は、中性脂質（すなわち、非荷電又は両性イオン脂質）、陰イオン脂質、トランスフェクションを増強するヘルパー脂質、及びナノ粒子がインビボで存在できる時間を増加させるステルス脂質である。好適なカチオン性脂質、中性脂質、アニオン性脂質、ヘルパー脂質、及びステルス脂質の例は、すべての目的のためにそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１６／０１０８４０号及び国際公開第２０１７／１７３０５４号に見出すことができる。例示的な脂質ナノ粒子は、カチオン性脂質及び１つ以上の他の成分を含むことができる。一例において、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質を含むことができる。別の例において、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質及びＤＳＰＣなどの中性脂質を含むことができる。別の例において、他の成分は、コレステロールなどのヘルパー脂質、ＤＳＰＣなどの任意の中性脂質、及びＳ０１０、Ｓ０２４、Ｓ０２７、Ｓ０３１、又はＳ０３３などのステルス脂質を含むことができる。

【0426】

【0427】

【0428】

【0429】

【0430】

【0431】

【0432】

【0433】

【0434】

【0435】

【0436】

【0437】

【0438】

【0439】

【0440】

一部のＬＮＰでは、カーゴは、ＣａｓｍＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ）及びｇＲＮＡを含むことができる。ＣａｓｍＲＮＡ及びｇＲＮＡは、異なる比であり得る。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５の範囲、又は約１：１のＣａｓｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、又は約１０：１のＣａｓｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、又は１：２５のＣａｓｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：２の、ＣａｓｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。特定の例において、ＣａｓｍＲＮＡとｇＲＮＡとの比は、約１：１又は約１：２であり得る。

【0441】

【0442】

一部のＬＮＰでは、カーゴは外因性ドナー核酸及びｇＲＮＡを含むことができる。外因性ドナー核酸及びｇＲＮＡは、異なる比にすることができる。例えば、ＬＮＰ製剤は、約２５：１～約１：２５の範囲、約１０：１～約１：１０の範囲、約５：１～約１：５、又は約１：１の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡとの比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１～約１：５、約５：１～約１：１、約１０：１、又は約１：１０の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡとの比を含み得る。代替的に、ＬＮＰ製剤は、約１：１０、２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：１：３、１：５、１：１０、又は１：２５の外因性ドナー核酸とｇＲＮＡ核酸との比を含み得る。

【0443】

好適なＬＮＰの特定の例は、４．５の窒素対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比を有し、４５：４４：９：２のモル比で生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。生分解性カチオン性脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり得る。例えば、Ｆｉｎｎｅｔａｌ．（２０１８）ＣｅｌｌＲｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量比で１：１にすることができる。好適なＬＮＰの別の具体的な例には、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＭＣ３）、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＭＧが５０：３８．５：１０：１．５のモル比で含まれている。

【0444】

好適なＬＮＰの別の特定の例は、６の窒素対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比を有し、５０：３８：９：３のモル比で生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む。生分解性カチオン性脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであり得る。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量比で１：２にすることができる。

【0445】

好適なＬＮＰの別の特定の例は、３の窒素対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比を有し、５０：１０：３８．５：１．５の比又は４７：１０：４２：１の比でカチオン性脂質、構造脂質、コレステロール（例えば、コレステロール（ヒツジ）（Ａｖａｎｔｉ７０００００））、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧ（例えば、ＰＥＧ－ＤＭＧ２０００（ＮＯＦＡｍｅｒｉｃａ－ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＧＭ－０２０（ＤＭＧ－ＰＥＧ））を含む。構造脂質は、例えば、ＤＳＰＣ（例えば、ＤＳＰＣ（Ａｖａｎｔｉ８５０３６５））、ＳＯＰＣ、ＤＯＰＣ、又はＤＯＰＥであり得る。カチオン性／イオン化可能脂質は、例えば、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（例えば、Ｄｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ（ＢｉｏｆｉｎｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））であり得る。

【0446】

好適なＬＮＰの別の特定の例には、４５：９：４４：２の比でのＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ脂質が含まれる。好適なＬＮＰの別の特定の例には、５０：１０：３９：１の比でのＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＯＰＥ、コレステロール、及びＰＥＧ脂質又はＰＥＧＤＭＧが含まれる。好適なＬＮＰの別の特定の例は、５５：１０：３２．５：２．５の比でのＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを有する。好適なＬＮＰの別の特定の例は、５０：１０：３８．５：１．５の比でのＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを有する。好適なＬＮＰの別の特定の例は、５０：１０：３８．５：１．５の比でのＤｌｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ－ＤＭＧを有する。

【0447】

適切なＬＮＰの他の例は、例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１９／０６７９９２号に見出すことができる。

【0448】

免疫原性を低下させるために、送達様式を選択することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質及びｇＲＮＡは、異なる様式（例えば、バイモーダル（ｂｉ－ｍｏｄａｌ）送達）によって送達され得る。これらの異なる様式は、対象の送達された分子（例えば、Ｃａｓ又は核酸をコードする、ｇＲＮＡ又は核酸をコードする、又は外因性ドナー核酸／修復テンプレート）に異なる薬力学又は薬物動態特性を与える可能性がある。例えば、異なる様式は、異なる組織分布、異なる半減期、又は異なる時間的分布をもたらす可能性がある。いくつかの送達様式（例えば、自律複製又はゲノム組み込みによって細胞内で持続する核酸ベクターの送達）は、分子のより持続的な発現及び存在をもたらすが、他の送達様式は、一過性で持続性が低い（例えば、ＲＮＡ又はタンパク質の送達）。例えばｍＲＮＡ又はタンパク質としてのより一時的な方法でのＣａｓタンパク質の送達は、Ｃａｓ／ｇＲＮＡ複合体が短期間のみ存在し、活性であることを保証し、ＭＨＣ分子によって細胞の表面に表示される細菌由来のＣａｓ酵素からのペプチドによって引き起こされる免疫原性を低下させることができる。このような一時的な送達は、オフターゲット修飾の可能性を低減することもできる。

【0449】

インビボでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、又は筋肉内を含む任意の好適な経路によることができる。全身投与様式には、例えば、経口及び非経口経路が含まれる。非経口経路の例には、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、皮内、皮下、鼻腔内、及び腹腔内経路が含まれる。特定の例は、静脈内注入である。鼻腔内注入及び硝子体内注射は、他の特定の例である。局所投与様式には、例えば、髄腔内、脳室内、実質内（例えば、線条体（例えば、尾状核又は被殻へ）、大脳皮質、前中心回旋、海馬（例えば、歯状回又はＣＡ３領域）、側頭皮質、扁桃体、前頭皮質、視床、小脳、髄質、視床、視蓋、被殻、又はニグラ実質への局所的な実質内送達）、眼内、眼窩内、結膜下、硝子体内、網膜下、及び強膜を介した経路が含まれる。（全身的アプローチと比較して）有意に少量の成分は、全身的に投与された場合（例えば、静脈内）と比較して、局所的に投与された場合（例えば、実質内又は硝子体内）に効果を発揮し得る。局所投与様式はまた、治療有効量の成分が全身投与されるときに起こり得る潜在的に毒性の副作用の発生率を低減又は排除し得る。具体的な例において、インビボでの投与は静脈内投与である。投与経路としては、例えば、非経口、非経口以外、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口、筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、眼内、吸入、吹送、局所、皮膚、眼内、硝子体内、経皮又は動脈内が挙げられ得る。

【0450】

インビボでの投与は、例えば、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、腹腔内、局所、鼻腔内、又は筋肉内を含む任意の好適な経路によることができる。特定の例は、静脈内注入である。ガイドＲＮＡ及び／又はＣａｓタンパク質（又はガイドＲＮＡ及び／又はＣａｓタンパク質をコードする核酸）を含む組成物は、１つ以上の生理学的及び薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は助剤を使用して処方することができる。製剤は、選択した投与経路に依存し得る。「薬学的に許容される」は、担体、希釈剤、賦形剤、又は補助剤が製剤の他の成分と適合性であり、そのレシピエントに実質的に有害ではないことを意味する。具体例では、投与経路及び／又は製剤、又は肝臓（例えば、肝細胞）への送達のために選択される。

【0451】

投与の頻度及び投与回数は、他の要因の中でもとりわけ、外因性ドナー核酸又はガイドＲＮＡ、又はＣａｓタンパク質（又はガイドＲＮＡ若しくはＣａｓタンパク質をコードする核酸）の半減期及び投与経路に依存し得る。細胞又は動物への核酸又はタンパク質の導入は、ある期間にわたって１回又は複数回実施することができる。例えば、導入は、ある期間にわたって一度だけ、ある期間にわたって少なくとも２回、ある期間にわたって少なくとも３回、ある期間にわたって少なくとも４回、ある期間にわたって少なくとも５回、ある期間にわたって少なくとも６回、ある期間にわたって少なくとも７回、ある期間にわたって少なくとも８回、ある期間にわたって少なくとも９回、ある期間にわたって少なくとも１０回、ある期間にわたって少なくとも１１回、ある期間にわたって少なくとも１２回、ある期間にわたって少なくとも１３回、ある期間にわたって少なくとも１４回、ある期間にわたって少なくとも１５回、ある期間にわたって少なくとも１６回、ある期間にわたって少なくとも１７回、ある期間にわたって少なくとも１８回、ある期間にわたって少なくとも１９回、又はある期間にわたって少なくとも２０回、実施することができる。

【0452】

いくつかの方法では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単回用量を（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせて、又はそれと会合させることのいずれかで）それを必要とする対象に投与することができる。他の方法では、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの複数回用量を（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせて、若しくはそれと会合させることのいずれかで）定義された時間経過にわたって対象に投与することができる。そのような方法は、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書中に開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの複数回用量を（単独で、又は本明細書中に開示のＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせて、又は会合させることのいずれかで）対象に投与することを含み得る。逐次投与とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの各用量が、異なる時点、例えば、所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間、又は数ヶ月）で隔てられた異なる日に対象に投与されることを意味する。いくつかの方法は、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書中に開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの単回初回用量を（単独で、又は本明細書中に開示のＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれかで）患者に逐次投与し、続いてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１回又は複数回の二次用量を（単独で、又は本明細書中に開示のＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれかで）投与し、任意選択的にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの１回又は複数回の三次用量を（単独で、又は本明細書中に開示のＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれかで）投与することを含む。

【0453】

初回用量、二次用量及び三次用量は、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの投与の時間的順序を指す。したがって、初回用量は治療レジメンの開始時に投与される用量（ベースライン用量とも呼ばれる）であり、二次用量は初回用量の後に投与される用量であり、三次用量は二次用量の後に投与される用量である。初回用量、二次用量及び三次用量は全て、同じ量のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含有し得るが、一般に、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかしながら、いくつかの方法では、初回、二次及び／又は三次用量に含まれるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの量は、治療の経過中に互いに異なる（例えば、必要に応じて上下に調整）。いくつかの方法において、２つ又はそれを超える（例えば、２、３、４、又は５）用量が、負荷用量として治療レジメンの開始時に投与され、続いて、より低い頻度で投与されるその後の用量（例えば、維持用量）が投与される。

【0454】

そのような方法は、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするための本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの任意の数の二次及び／又は三次用量を（単独で、又は本明細書に開示されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体などの他の治療剤と組み合わせてのいずれかで）患者に投与することを含み得る。一例では、単一の二次用量のみが患者に投与される。別の例では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれを超える）の二次用量が患者に投与される。同様に、別の例では、単一の三次用量のみが患者に投与される。他の例では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれを超える）の三次用量が患者に投与される。

【0455】

二次及び／又は三次用量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの経過にわたって変化し得る。投与の頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療の経過中に調整され得る。

【0456】

本明細書中に記載されるＣ５抗原結合タンパク質若しくは抗体又はその抗原結合性断片を含む治療用組成物は、改善された移入、送達、耐性などを提供するために製剤に組み込まれる好適な担体、賦形剤及び他の薬剤とともに投与され得る。多数の適切な製剤は、全ての薬剤師に知られている処方集：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．に見出すことができる。これらの製剤には、例えば、粉末、ペースト、軟膏、ゼリー、ワックス、油、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有小胞（ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）など）、ＤＮＡコンジュゲート、無水吸収ペースト、水中油型及び油中水型エマルジョン、エマルジョンカルボワックス（様々な分子量のポリエチレングリコール）、半固体ゲル、及びカルボワックスを含有する半固体混合物が含まれる。またＰｏｗｅｌｌｅｔａｌ．「Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓｆｏｒｐａｒｅｎｔｅｒａｌｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」ＰＤＡ（１９９８）ＪＰｈａｒｍＳｃｉＴｅｃｈｎｏｌ５２：２３８－３１１を参照されたい。

【0457】

抗原結合タンパク質又は抗体の用量は、投与される対象の年齢及びサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに応じて変動し得る。本明細書に開示される抗原結合タンパク質又は抗体が、成人患者の疾患又は障害を治療するため、又はそのような疾患を予防するために使用される場合、抗原結合タンパク質又は抗体を通常約０．１～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約５～約８０、約１０～約７０、又は約２０～約５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量（例えば、単回用量）で投与することが有利であり得る。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質又は抗体は、約１、約３、約１０、約１５、又は約３０ｍｇ／ｋｇの用量（例えば、静脈内用量）で投与することができる。状態の重症度に応じて、治療の頻度及び期間を調整することができる。一定の実施形態では、抗原結合タンパク質若しくは抗体又はその抗原結合性断片を、少なくとも約０．１ｍｇ～約８００ｍｇ、約１～約６００ｍｇ、約５～約５００ｍｇ又は約１０～約４００ｍｇの初回用量として投与することができる。特定の実施形態では、初回用量の後に、抗原結合タンパク質若しくは抗体又はその抗原結合性断片の２回目又は複数の後続の用量を、初回用量とほぼ同じ又はそれ未満であり得る量で投与することができ、後続の用量は少なくとも１日～３日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、少なくとも６週間、少なくとも７週間、少なくとも８週間、少なくとも９週間、少なくとも１０週間、少なくとも１２週間、又は少なくとも１４週間離れている。

【0458】

様々な送達系が公知であり、医薬組成物を投与するために使用することができ、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、変異型ウイルスを発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシスである（例えば、Ｗｕｅｔａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる）。導入方法には、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路が含まれるが、これらに限定されない。組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば注入又はボーラス注射によって、上皮又は皮膚粘膜ライニング（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与され得、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与され得る。投与は全身的又は局所的であり得る。医薬組成物は、小胞、特にリポソーム中に送達することもできる（例えば、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＬａｎｇｅｒ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３を参照されたい）。

【0459】

抗原結合タンパク質又は抗体を送達するためのナノ粒子の使用も本明細書で企図される。抗体コンジュゲート化ナノ粒子は、治療用途及び診断用途の両方に使用され得る。抗体コンジュゲートナノ粒子並びに調製及び使用の方法は、Ａｒｒｕｅｂｏｅｔａｌ．（２００９）（「Ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｆｏｒｂｉｏｍｅｄｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」ｉｎＪ．Ｎａｎｏｍａｔ．Ｖｏｌｕｍｅ２００９，ＡｒｔｉｃｌｅＩＤ４３９３８９，２４ｐａｇｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９）によって詳細に記載されており、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。ナノ粒子を開発し、医薬組成物に含まれる抗体に結合させて細胞を標的化することができる。薬物送達のためのナノ粒子はまた、例えば、米国特許第８，２５７，７４０号明細書、又は米国特許第８，２４６，９９５に記載されており、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0460】

特定の状況では、医薬組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態では、ポンプを使用することができる。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。更に別の実施形態では、制御放出システムを組成物の標的の近くに配置することができ、したがって、全身用量の一部のみを必要とする。

【0461】

注射剤には、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、腹腔内及び筋肉内注射、点滴などのための剤形が含まれ得る。これらの注射剤は、公知の方法によって調製され得る。例えば、注射用調製物は、例えば、注射に従来使用されている滅菌水性媒体又は油性媒体に上記の抗体又はその塩を溶解、懸濁又は乳化することによって調製され得る。注射用水性媒体としては、例えば、生理食塩水、アルコール（例えば、エタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤［例えば、ポリソルベート８０、ＨＣＯ－５０（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（５０ｍｏｌ）付加物）］等の適当な可溶化剤と組み合わせて使用してもよいグルコースやその他の助剤を含む等張液等が挙げられる。油性媒体としては、例えば、安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の可溶化剤と組み合わせて使用してもよいゴマ油、大豆油等が挙げられる。このようにして調製された注射剤は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。

【0462】

抗原結合タンパク質又は抗体を含む医薬組成物は、標準的な針及び注射器を用いて皮下又は静脈内に送達することができる。更に、皮下送達に関して、ペン送達装置は、本明細書に開示される医薬組成物を送達する際の用途を容易に有する。そのようなペン送達装置は、再使用可能又は使い捨て可能であり得る。再使用可能なペン送達装置は、一般に、医薬組成物を含む交換可能なカートリッジを利用する。カートリッジ内の全ての医薬組成物が投与され、カートリッジが空になると、空のカートリッジを容易に廃棄し、医薬組成物を含む新しいカートリッジと交換することができる。次いで、ペン送達装置を再使用することができる。使い捨てのペン送達装置では、交換可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てペン送達装置は、装置内のリザーバに保持された医薬組成物で予め充填される。リザーバから医薬組成物が空になると、装置全体が廃棄される。

【0463】

多数の再使用可能なペン及び自己注射器送達装置は、本明細書に開示される医薬組成物の皮下送達に用途を有する。例としては、ほんの数例を挙げると、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（ＯｗｅｎＭｕｍｆｏｒｄ、Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＵＫ）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（ＤｉｓｅｔｒｏｎｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｒｇｈｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＨＵＭＡＬＯＧＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ７０／３０（商標）ペン（ＥｌｉＬｉｌｌｙ及びＣｏ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩ（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＮＯＶＯＰＥＮＪＵＮＩＯＲ（商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、ＢＤ（商標）ペン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ、Ｎ．Ｊ．）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮＳＴＡＲＬＥＴ（商標）、及びＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）が挙げられるが、確かにこれらに限定されない。医薬組成物の皮下送達における用途を有する使い捨てペン送達デバイスの例は、確かに限定されないが、ほんの数例を挙げると、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ）、及びＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（ＥｌｉＬｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）Ａｕｔｏｉｎｊｅｃｔｏｒ（Ａｍｇｅｎ，ＴｈｏｕｓａｎｄＯａｋｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）、及びＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（ＡｂｂｏｔｔＬａｂｓ、ＡｂｂｏｔｔＰａｒｋ、ＩＬ）である。

【0464】

上記の経口又は非経口使用のための医薬組成物は、活性成分の用量に適合する単位用量の剤形に調製することができる。単位用量におけるそのような剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤などが挙げられる。含有される抗原結合タンパク質又は抗体の量は、一般に、単位用量における剤形当たり約５～約５００ｍｇである。特に注射の形態では、抗原結合タンパク質又は抗体が、他の剤形については約５～約３００ｍｇ及び約１０～約３００ｍｇで含まれることが好ましい。

【0465】

いくつかの実施形態では、単回用量のＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体（すなわち、抗Ｃ５抗原結合タンパク質又は抗体）（又はＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体と本明細書に記載の追加の治療活性剤のいずれかとの組み合わせを含む医薬組成物）を、それを必要とする対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、単回用量のＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体（すなわち、抗Ｃ５抗原結合タンパク質又は抗体）（又はＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体と本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとの組み合わせを含む医薬組成物）を、それを必要とする対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体（又はＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体と本明細書に記載の追加の治療活性剤のいずれかとの組み合わせを含む医薬組成物）の複数回用量を、定義された時間経過にわたって対象に投与することができる。いくつかの方法は、Ｃ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体を対象に複数回投与することを含む。いくつかの方法は、最初の用量のＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体を本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせて投与し、次いで、更なる用量のＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体（例えば、単独で、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせて）を逐次投与することを含む。本明細書で使用される場合、「逐次投与する」とは、各用量が異なる時点、例えば所定の間隔（例えば、数時間、数日、数週間又は数ヶ月）で隔てられた異なる日に対象に投与されることを意味する。

【0466】

いくつかの実施形態は、単回初回用量のＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体（例えば、静脈内）を患者に逐次投与し、続いて１回又は複数回の二次用量のＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体（例えば、皮下）を投与し、任意選択的に１回又は複数回の三次用量のＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体（例えば、皮下）を投与することを含む方法を含む。いくつかの実施形態では、初回用量は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせており、二次及び三次用量は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせていなくてもよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及びＣ５抗原結合タンパク質は別々の製剤中にあり、共製剤ではない。いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質の初回用量は、その後の二次及び／又は三次用量よりも高い。いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質の初回用量は、その後の二次及び／又は三次用量と同じである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ媒介性Ｃ５ノックダウンの定常状態効果が達成されるまで、Ｃ５抗原結合タンパク質又はより高頻度及び／又はより高頻度の用量が使用され、その後、より低用量及び／又はより低頻度の用量のＣ５抗原結合タンパク質が使用される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ介在性Ｃ５ノックダウンの定常状態での効果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの投与後約２週間～約６週間、約３週間～約５週間、又は約１ヶ月で達成され得る。

【0467】

「初回用量」、「二次用量」及び「三次用量」という用語は、Ｃ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体の投与の時間的順序を指す。したがって、「初回用量」は治療レジメンの開始時に投与される用量（「ベースライン用量」とも呼ばれる）であり、「二次用量」は「初回用量」の後に投与される用量であり、「三次用量」は二次用量の後に投与される用量である。初回、二次及び三次用量は全て、同じ量のＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体を含有し得るが、一般に、投与頻度に関して互いに異なり得る。しかし、特定の実施形態では、初回、二次及び／又は三次用量に含まれるＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体の量は、治療の過程で互いに異なる（例えば、必要に応じて上下に調整）。ある特定の実施形態では、２つ又はそれを超える（例えば、２、３、４、又は５）用量が、治療レジメンの開始時に「負荷用量」として投与され、続いて、より低い頻度で投与されるその後の用量（例えば、「維持用量」）が投与される。

【0468】

いくつかの実施形態では、各二次及び／又は三次用量は、直前の用量の１～４８時間後（例えば、１、１％、２、２％、３、３％、４、４％、５、５％、６、６％、７、７％、８、８％、９、９％、１０、１０％、１１、１１％、１２、１２％、１３、１３％、１４、１４％、１５、１５％、１６、１６％、１７、１７％、１８、１８％、１９、１９％、２０、２０％、２１、２１％、２２、２２％、２３、２３％、２４、２４％、２５、２５％、２６、２６％以上）に投与される。本明細書で使用される「直前の用量」という語句は、複数回投与のシーケンスにおいて、介在する用量なしでシーケンス内のまさに次の用量の投与の前に患者に投与されるＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体の用量を意味する。

【0469】

この方法は、任意の数の二次及び／又は三次用量のＣ５抗原結合タンパク質又はＣ５抗体を患者に投与することを含み得る。例えば、特定の実施形態では、単一の二次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれを超える）の二次用量が患者に投与される。同様に、特定の実施形態では、単一の三次用量のみが患者に投与される。他の実施形態では、２つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれを超える）の三次用量が患者に投与される。

【0470】

いくつかの実施形態では、二次及び／又は三次用量が患者に投与される頻度は、治療レジメンの経過にわたって変化し得る。投与の頻度はまた、臨床検査後の個々の患者の必要性に応じて、医師によって治療の経過中に調整され得る。

【0471】

いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質（例えば、ＲＥＧＮ３９１８）は、以下のように対象に投与される。（ｉ）約３０ｍｇ／ｋｇ（体重（ＢＷ））の抗原結合タンパク質の１以上の用量（例えば、１回の用量）を静脈内（ＩＶ）に投与（例えば、本明細書中に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせて）；次いで（ｉｉ）１つ以上の用量（例えば２以上）の約８００ｍｇの抗原結合タンパク質（例えば、皮下（ＳＣ））（これは、本明細書では、３０＋８００投与レジメンと呼ばれることがある）、又は以下：体重（ＢＷ）＜１０ｋｇの場合：約１２５ｍｇ；ＢＷ≧１０ｋｇ及び＜２０ｋｇの場合：約２００ｍｇ；ＢＷ≧２０ｋｇ及び＜４０ｋｇの場合：約３５０ｍｇ；ＢＷ≧４０ｋｇ及び＜６０ｋｇの場合：約５００ｍｇ；ＢＷ≧６０ｋｇの場合：約８００ｍｇのように体重に従って１つ以上のＳＣ用量のいずれかの投与。そのようなＳＣ用量（複数可）は、初回ＩＶ用量（複数可）の後に毎週与えられ得る。毎週の用量は、例えば、治療効果又は望ましくない結果（例えば、血清アルブミンの喪失、又は血清ＬＤＨレベルの上昇）の防止が望まれる限り、無期限に継続することができる。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０２１／０８１２７７号又は米国特許出願公開第２０２１－０１３９５７３号明細書を参照されたい。

【0472】

いくつかの実施形態では、約３０ｍｇ／ｋｇ（体重（ＢＷ））のＣ５抗原結合タンパク質（例えば、ＲＥＧＮ３９１８）又はその薬学的製剤の静脈内（ＩＶ）（例えば、本明細書中に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせて）への１回又は複数回の用量（例えば、１つ以上）。３０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量は、持続的な最大ＣＨ５０阻害に必要な抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の定常状態のトラフ濃度を迅速に達成するのを助けることが実証されており、したがって、これは対象において治療効果をもたらすであろう。抗原結合タンパク質の任意の更なる皮下用量が、例えば、毎週、例えば、ＩＶ用量の後に対象に与えられ得る。

【0473】

いくつかの実施形態では、対象（例えば、ＰＮＨに罹患している人）に、（ｉ）約３０ｍｇ／ｋｇのＣ５抗原結合タンパク質を最初に（１日目）静脈内（ＩＶ）に（例えば、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせて）；次いで、（ｉｉ）約８００ｍｇの抗原結合タンパク質（例えば、皮下（ＳＣ））を週１回（例えば、±１、±２又は±３日目）、例えば、約８日目（例えば±１、±２又は±３日間）、１５日間（例えば±１、±２又は±３日）、２２日（例えば±１、±２又は±３日）など、及び毎週（±１、±２又は±３日後）投与する。

【0474】

いくつかの実施形態では、対象には、治療有効用量のＣ５抗原結合タンパク質又は抗体（例えば、３０ｍｇ／ｋｇ静脈内）（例えば、本明細書中に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせて）が投与される。いくつかの実施形態では、対象（例えば、ＣＨＡＰＬＥ）に、（ｉ）約３０ｍｇ／ｋｇの抗原結合タンパク質を静脈内（ＩＶ）（１日目に）；次いで（ｉｉ）約８日目（例えば、８日目、８日目＋１日目、８日目＋２日目又は８日目＋３日目）に開始して、１回又は複数回の用量を皮下（ＳＣ）投与し、その後、以下のように体重（ＢＷ）に応じた用量で週１回ベースで継続する：体重（ＢＷ）＜１０ｋｇ：約１２５ｍｇ；ＢＷ≧１０ｋｇ及び＜２０ｋｇ：約２００ｍｇ；ＢＷ≧２０ｋｇ及び＜４０ｋｇ：約３５０ｍｇ；ＢＷ≧４０ｋｇ及び＜６０ｋｇ：約５００ｍｇ；及びＢＷ≧６０ｋｇ：約８００ｍｇ。

【0475】

１週間に１回の投薬又は毎週の投薬又はＱＷ投薬は、それぞれが直前の投薬の約７（例えば、＋１、＋２又は＋３）日後に行われる１回又は複数回の用量を投与することを指す。

【0476】

いくつかの実施形態では、ＩＶ用量及び第１のＳＣ用量は同じ日に与えられる。

【0477】

いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質又は抗体は、皮下（ＳＣ）投与される場合、７ｍｌ未満の体積、約０．６２５ｍＬ、約１ｍＬ、約１．７５ｍＬ、約２．５ｍＬ、約４ｍＬ、約０．５～４．０ｍＬ又は約０．６２５～４．０ｍＬで送達される。いくつかの実施形態では、各ＳＣ用量は単回注射で送達される。いくつかの実施形態では、ＳＣ注射は約６０秒以下で送達される。

【0478】

いくつかの実施形態では、対象（例えば、Ｃ５関連疾患に罹患している）は、以下のように１つ以上の用量のＣ５抗原結合タンパク質又は抗体を投与される。１ｍｇ／ｋｇＩＶ；３ｍｇ／ｋｇＩＶ；３００ｍｇＳＣ；８００ｍｇＳＣ；１０ｍｇ／ｋｇＩＶ；６００ｍｇＳＣ；若しくは３０ｍｇ／ｋｇＩＶ；又は１５ｍｇ／ｋｇＩＶの負荷用量、続いて週１回投与される４００ｍｇの１回若しくは複数回のＳＣ用量。

【0479】

ヒト対象における約１００ｍｇ／リットルのＣ５抗原結合タンパク質又は抗体（例えば、ＲＥＧＮ３９１８）の血清濃度は、Ｃ５活性（例えば、代替、古典的及びレクチン経路）を最大限に抑制する（例えば、ＡＨ５０及び／又はＣＨ５０アッセイによって測定した場合）。したがって、対象において補体活性又はＣ５活性（例えば、副経路（ＡＰ））（例えば、Ｃ５活性をその最大レベル付近まで抑制すること（例えば、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％）；例えば、ＡＨ５０及び／又はＣＨ５０活性として測定される）を抑制するための方法であって、抗Ｃ５抗原結合タンパク質の血清濃度を約１００ｍｇ／リットル以上（例えば、１５０、４００、６００又は７００ｍｇ／リットル）に維持するのに十分なレベルで抗原結合タンパク質の１つ以上の用量を投与することを含む方法が本明細書に含まれる。いくつかの実施形態では、投薬レジメンは、（ｉ）約３０ｍｇ／ｋｇ（体重（ＢＷ））の抗原結合タンパク質の１つ以上の用量（例えば、１回の用量）を静脈内（ＩＶ）投与すること；次いで、任意選択的に、（ｉｉ）約８００ｍｇの抗原結合タンパク質（例えば、皮下（ＳＣ））の１回又は複数回の毎週の用量（例えば、２以上）を投与すること；又は、体重（ＢＷ）に応じて、以下：週１回又は複数回の用量：体重（ＢＷ）＜１０ｋｇの場合：約１２５ｍｇ；ＢＷ≧１０ｋｇ及び＜２０ｋｇの場合：約２００ｍｇ；ＢＷ≧２０ｋｇ及び＜４０ｋｇの場合：約３５０ｍｇ；ＢＷ≧４０ｋｇ及び＜６０ｋｇの場合：約５００ｍｇ；又はＢＷ≧６０ｋｇの場合：約８００ｍｇのように皮下（ＳＣ）投与することを含む。毎週の用量は、例えば、抗Ｃ５抗原結合タンパク質の血清濃度の維持及び／又はＣ５活性の抑制が望まれる限り、無期限に継続することができる。

【0480】

対象において約１００ｍｇ／リットル以上のＣ５抗原結合タンパク質又は抗体の血清濃度（例えば、経時的な定常状態の血清トラフ濃度）を達成又は達成及び維持するための方法であって、（ｉ）約３０ｍｇ／ｋｇ（体重（ＢＷ））の抗原結合タンパク質の１つ以上の用量（例えば、１回の用量）を静脈内（ＩＶ）に投与すること（例えば、本明細書中に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせて）；次いで、任意選択的に、（ｉｉ）約８００ｍｇの抗原結合タンパク質（例えば、皮下（ＳＣ））の１回又は複数回の毎週の用量（例えば、２以上）を投与すること；又は以下：体重（ＢＷ）＜１０ｋｇの場合：約１２５ｍｇ；ＢＷ≧１０ｋｇ及び＜２０ｋｇの場合：約２００ｍｇ；ＢＷ≧２０ｋｇ及び＜４０ｋｇの場合：約３５０ｍｇ；ＢＷ≧４０ｋｇ及び＜６０ｋｇの場合：約５００ｍｇ；又はＢＷ≧６０ｋｇの場合：約８００ｍｇのように体重（ＢＷ）に応じて皮下（ＳＣ）投与される１つ以上の毎週の用量を含む、方法も含まれる。毎週の用量は、例えば、抗Ｃ５抗原結合タンパク質血清濃度の維持が望まれる限り、無期限に継続することができる。

【0481】

いくつかの実施形態では、Ｃ５抗原結合タンパク質又は抗体の静脈内注入は、注入の期間中に対象が１つ以上の有害事象、例えば、咳、寒気／悪寒、発疹、掻痒症（痒み）、蕁麻疹（urticaria）（蕁麻疹（hive）、疣贅、水疱）、発汗（汗をかく）、低血圧、呼吸困難（息切れ）、嘔吐又は潮紅などを患っている場合、最初の注入率の５０％で中断され、再開される。

【0482】

Ｃ５抗原結合タンパク質又は抗体５（例えば、ＲＥＧＮ３９１８）を対象に投与する方法であって、（ｉ）約３０ｍｇ／ｋｇ（体重（ＢＷ））の抗原結合タンパク質（例えば、ＲＥＧＮ３９１８）の１つ以上の用量（例えば、１回の用量）を静脈内（ＩＶ）に投与すること（例えば、本明細書中に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせて）；次いで、任意選択的に、（ｉｉ）約８００ｍｇの抗原結合タンパク質（例えば、皮下（ＳＣ））の１つ以上の用量（例えば、２以上）を投与することを含む方法も含まれる。そのようなＳＣ用量（複数可）は、初回ＩＶ用量（複数可）の後に毎週与えられ得る。抗原結合タンパク質（例えば、ＲＥＧＮ３９１８）を対象に投与する方法であって、（ｉ）約３０ｍｇ／ｋｇ（体重（ＢＷ））の抗原結合タンパク質の１つ以上の用量（例えば、１回の用量）を静脈内（ＩＶ）に投与すること（例えば、本明細書中に開示されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと組み合わせて）；次いで、任意選択的に、（ｉｉ）以下：体重（ＢＷ）＜１０ｋｇの場合：約１２５ｍｇ；ＢＷ≧１０ｋｇ及び＜２０ｋｇの場合：約２００ｍｇ；ＢＷ≧２０ｋｇ及び＜４０ｋｇの場合：約３５０ｍｇ；ＢＷ≧４０ｋｇ及び＜６０ｋｇの場合：約５００ｍｇ；ＢＷ≧６０ｋｇの場合：約８００ｍｇのように体重に応じて１つ以上のＳＣ用量を投与することを含む方法も含まれる。そのようなＳＣ用量（複数可）は、初回ＩＶ用量（複数可）の後に毎週与えられ得る。いくつかの実施形態では、対象は、例えばＣＨＡＰＬＥ、ＰＮＨ、ａＨＵＳ又はＭＧなどのＣ５関連疾患に罹患している。

【0483】

Ｄ．Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの送達、活性、又は有効性の測定
本明細書に開示される方法は、Ｃ５遺伝子又はＣ５遺伝子座を標的とするＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの活性を検出又は測定することを更に含み得る。

【0484】

測定することは、改変についてＣ５遺伝子座を評価することを含み得る。標的化遺伝子改変を有する細胞を同定するために様々な方法を使用することができる。スクリーニングは、親染色体の対立遺伝子の改変（ＭＯＡ）を評価するための定量的アッセイを含むことができる。例えば、米国特許出願公開第２００４／００１８６２６号明細書；米国特許出願公開第２０１４／０１７８８７９号；米国特許出願公開第２０１６／０１４５６４６号；国際公開第２０１６／０８１９２３号；及びＦｒｅｎｄｅｗｅｙｅｔａｌ．（２０１０）ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．４７６：２９５－３０７を参照されたく、それらの各々は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、定量的アッセイは、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲを介して実施することができる。リアルタイムＰＣＲは、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセット及び非標的参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含むことができる。好適な定量的なアッセイの他の例としては、蛍光媒介インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化プローブ全てに対する定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）プローブ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分子ビーコンプローブ、又はＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、の目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）もまた、スクリーニングに使用することができる。次世代シーケンシングは、「ＮＧＳ」又は「大規模並列シーケンシング」又は「ハイスループットシーケンシング」とも呼ばれ得る。標的化遺伝子改変の正確な性質及びそれが細胞型又は組織型又は器官型にわたって一貫しているかどうかを定義するために、ＭＯＡアッセイに加えてＮＧＳをスクリーニングツールとして使用することができる。

【0485】

測定はまた、Ｃ５ｍＲＮＡ又はＣ５タンパク質発現を評価することを含み得る。ｍＲＮＡ及びタンパク質発現を測定する方法は周知である。

【0486】

測定することはまた、Ｃ５活性を評価することを含み得る。例えば、古典的経路溶血は、本明細書の他の箇所に開示される感作ヒツジ赤血球を使用してエクスビボで測定することができる。

【0487】

動物における評価は、任意の組織又は臓器からの任意の細胞型にあり得る。例えば、評価は、同じ組織若しくは臓器（例えば、肝臓）からの複数の細胞型、又は組織若しくは臓器内の複数の場所からの細胞で行うことができる。これは、標的組織又は臓器内のどの細胞型が標的化されているか、又は組織又は臓器のどのセクションがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによって到達されているかについての情報を提供することができる。別の例として、評価は複数の種類の組織又は複数の臓器で行うことができる。特定の組織、器官、又は細胞型が標的にされる方法では、これは、その組織又は器官がどれほど効果的に標的にされるか、及び他の組織又は器官にオフターゲット効果があるかどうかについての情報を提供することができる。

【0488】

使用できるアッセイの一例は、無傷の固定組織との関連で、単一ヌクレオチドの変化を含む、細胞特異的に編集された転写産物を定量化することができる方法である、ＲＮＡＳＣＯＰＥ（商標）及びＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）アッセイである。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＲＮＡＩＳＨアッセイは、遺伝子編集の特性評価においてＮＧＳ及びｑＰＣＲを補完することができる。ＮＧＳ／ｑＰＣＲは野生型及び編集された配列の定量的平均値を提供できるが、組織内の編集された細胞の不均一性又はパーセンテージに関する情報は提供しない。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）ＩＳＨアッセイは、組織全体のランドスケープビューと、編集されたｍＲＮＡ転写物を含む標的組織内の実際の細胞数を定量化できる単一細胞分解能での野生型対編集された転写物の定量化とを提供できる。ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）アッセイは、ペアオリゴ（「ＺＺ」）プローブを使用して非特異的なバックグラウンドなしでシグナルを増幅し、単一分子ＲＮＡ検出を実現する。しかしながら、ＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）プローブの設計とシグナル増幅システムにより、ＺＺプローブを使用した単一分子ＲＮＡの検出が可能になり、無傷の固定組織における単一ヌクレオチドの編集と変異を差次的に検出できる。

【0489】

いくつかの方法において、ガイドＲＮＡの効力は、Ｃ５の編集パーセントによって測定される。いくつかの方法では、Ｃ５の編集パーセントは、Ｃ５タンパク質のノックダウンを達成するのに必要な編集パーセントと比較される（例えば、血清中で）。

【0490】

いくつかの方法では、インビトロモデル（例えば、培養細胞）において欠失又は挿入が起こるオフターゲット部位の数は、例えば、ＣａｓｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡをインビトロでトランスフェクトした細胞からのゲノムＤＮＡを分析することによって決定される。

【0491】

いくつかの方法では、ガイドＲＮＡの有効性は、標的細胞型のゲノム内のオフターゲット配列におけるインデルの数及び／又は頻度によって測定される。いくつかの実施形態では、細胞集団において非常に低い頻度（例えば、＜５％）で、かつ／又は標的部位におけるインデル生成の頻度に対して非常に低い頻度で、オフターゲット部位においてインデルを産生する効果的なガイドＲＮＡが提供される。したがって、本開示は、標的細胞型においてオフターゲットのインデル形成を示さないか、又は細胞集団において及び／若しくは標的部位におけるインデル形成の頻度に対して５％未満のオフターゲットのインデル形成の頻度をもたらすガイドＲＮＡを提供する。いくつかの方法において、本開示は、標的細胞型においてオフターゲットインデル形成を何ら示さないガイドＲＮＡを提供する。いくつかの方法では、５つ未満のオフターゲット部位（例えば、本明細書中に記載される１つ以上の公知の方法又は複数の方法によって評価される場合）でインデルを産生するガイドＲＮＡが提供される。いくつかの方法において、４個、３個、２個又は１個以下のオフターゲット部位（例えば、本明細書中に記載される１つ以上の公知の方法又は方法によって評価される場合）においてインデルを産生するガイドＲＮＡが提供される。いくつかの実施形態では、オフターゲット部位（複数可）は、標的細胞ゲノム内のタンパク質コード領域には存在しない。

【0492】

上記又は下記で引用されている全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前又は優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。別段に他の指示がない限り、本発明の任意の特徴、工程、要素、実施形態、又は態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さ及び理解の目的に対し図表及び例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化及び修正を実施することができることが明らかになろう。

【0493】

配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、及びアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補的鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントもまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。

【0494】

【表7】

【実施例】

【0495】

実施例１．初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）におけるガイドＲＮＡのスクリーニング－編集及びタンパク質ノックダウン
いくつかのＣ５ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡを、Ｃ５遺伝子をノックアウトし、それによって循環Ｃ５レベルを低下させることを目的としてインシリコ設計した。初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を解凍し、サプリメント（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．ＣＭ７５００）を有する肝細胞解凍培地に懸濁し、続いて遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化した細胞を肝細胞プレーティング培地（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓＥＭｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ａ１２１７６０１）と、デキサメタゾン＋カクテルサプリメント、ＦＢＳ内容物、及びプレーティングサプリメント（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．ＣＭ３０００）に懸濁した。細胞を計数し、Ｂｉｏ－ｃｏａｔコラーゲンＩ被覆９６ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．８７７２７２）に、ＰＨＨについて３０，０００～３５，０００細胞／ウェルの密度で播種した。播種した細胞を、３７℃及び５％ＣＯ_２雰囲気の組織培養インキュベーター中で４～６時間沈降させ、接着させた。インキュベーション後、細胞を単層形成についてチェックし、肝細胞維持培地（維持サプリメントを含むＷｉｌｌｉａｍ’ｓＥＭｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．ＣＭ４０００）で１度洗浄した。

【0496】

解凍の６時間後、表８に記載の個々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒＲＮＡ）を、等量の試薬を混合し、９５℃で２分間インキュベートし、室温に冷却することによってプレアニールした。プレアニールされたｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡからなる二重ガイド（ｄｇＲＮＡ）を化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）タンパク質とインキュベートして、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成した。細胞をリポフェクタミンＮＡｉＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｃａｔ．１３７７８１５０）で、製造業者のプロトコルに従ってトランスフェクトした。細胞を、ＳｐｙＣａｓ９（１０ｎＭ）、ｃｒＲＮＡ（１０ｎＭ）、ｔｒＲＮＡ（１０ｎＭ）、リポフェクタミンＲＮＡｉＭＡＸ（１．０μＬ／ウェル）、及びＯｐｔｉＭＥＭ培地を含有するＲＮＰでトランスフェクトした。

【0497】

トランスフェクションの４８時間後に細胞を溶解し、５０μＬ／ウェルのＢｕｃｃＡｍＰＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｃａｔ．ＱＥ０９０５０）を使用して、製造業者のプロトコルに従って単離した。ＰＣＲプライマーを目的の遺伝子内の標的部位の周りに設計し（例えば、Ｃ５）、目的のゲノム領域を増幅した。当分野で標準的であるようにプライマー配列設計を行った。

【0498】

更なるＰＣＲを製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って実施して、配列決定のための化学反応を加えた。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ装置で配列決定した。低品質スコアを有するものを排除した後、リードをヒト参照ゲノム（例えば、ｈｇ３８）にアラインメントした。リードを含有する得られたファイルを参照ゲノム（ＢＡＭファイル）にマッピングし、ここで、目的の標的領域と重複するリードを選択し、野生型リードの数対挿入又は欠失（「インデル」）を含有するリードの数を計算した。編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」又は「編集パーセント」）は、野生型を含む配列リードの総数に対する、挿入又は欠失（「インデル」）を有する配列リードの総数として定義される。試験したガイドによる編集結果を表８に示す。

【0499】

【表8-1】

【表8-2】

【0500】

実施例２．Ｃ５ガイドＲＮＡのオフターゲット分析
ＨＬＡ－Ａを標的化するＣａｓ９によって切断される潜在的なオフターゲットゲノム部位についてのスクリーニングを行った。例えば、Ｃａｍｅｒｏｎｅｔａｌ．（２０１７）ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ６，６００－６０６を参照されたく、その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。この実験では、リンパ芽球細胞株ＮＡ２４３８５（ＣｏｒｉｅｌｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅ）由来の精製ゲノムＤＮＡを使用して、既知のオフターゲットプロファイルを有する、ヒトＣ５を標的とする８つのｓｇＲＮＡ並びにＥＭＸ１及びＶＥＧＦＡを標的とする対照ガイドをスクリーニングした。潜在的なオフターゲット部位の数を、生化学アッセイにおいて１９２ｎＭのｓｇＲＮＡ及び６４ｎＭのＲＮＰの濃度で表９に示されるようなｓｇＲＮＡを使用して検出した。アッセイは、表９に示されるように、試験したｓｇＲＮＡについて潜在的なオンターゲット及びオフターゲット部位を同定した。

【0501】

【表9】

【0502】

【表10】

【0503】

上記で使用される生化学的方法などの既知のオフターゲット検出アッセイでは、通常、多数の潜在的なオフターゲット部位が、他の状況で、例えば、目的の初代細胞において検証され得る潜在的な部位について「広いネットを張る」ように、設計によって回収される。例えば、生化学的方法は、典型的には、アッセイが細胞環境を含まない精製された高分子量ゲノムＤＮＡを利用し、使用されるＣａｓ９ＲＮＰの用量に依存するので、潜在的なオフターゲット部位の数を過剰に表す。したがって、これらの方法によって同定された潜在的なオフターゲット部位は、同定された潜在的なオフターゲット部位の標的化配列決定を使用してガイドごとに検証される。

【0504】

実施例３．ヒトＣ５を標的とするガイドＲＮＡの試験インビトロ
１５個のガイドＲＮＡを、初代ヒト肝細胞及び初代カニクイザル肝細胞におけるインビトロでのそれらの有効性について試験した。カニクイザルＣ５コード配列は、配列番号７に示される。これら１５個のガイドＲＮＡの配列を表１１に提供する。

【0505】

【表11】

【0506】

初代ヒト肝細胞への１０ｎＭＣａｓ９リボ核タンパク質複合体の投与後５日目のＣ５インデル頻度を図１Ａに示す。Ｃａｓ９：ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡリボ核タンパク質複合体を、ＣＲＩＳＰＲＭＡＸ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）トランスフェクション試薬を使用して、培養培地中１０ｎＭの最終濃度で細胞にトランスフェクトした。ＲＮＰ実験で使用したＣａｓ９タンパク質は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入した。トランスフェクションの５日後、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して細胞溶解物を調製した。溶解物を、それぞれのｇＲＮＡ標的部位におけるアンプリコンに基づく次世代シーケンシングのためのゲノムＤＮＡ鋳型として使用した。陽性対照ｓｇＲＮＡＰＣＳＫ９＿１２６４及びＴＴＲ＿Ｇ０００４８９は、それぞれＰＣＳＫ９及びＴＴＲ遺伝子中の領域を標的とする。陰性対照ｓｇＲＮＡｍｓＨｃ１はヒト非標的化ｓｇＲＮＡである。対応するＣ５タンパク質発現を図１Ｂに示す。初代ヒト肝細胞馴化培地におけるＣ５タンパク質の最大８０％のノックダウンが観察された。初代ヒト肝細胞へのＣａｓ９ｍＲＮＡ及び２５ｎＭ化学修飾ｓｇＲＮＡの投与後３日目のＣ５インデル頻度を図２に示す。ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）トランスフェクション試薬を使用して、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びｓｇＲＮＡを細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）ＤＮＡ抽出溶液（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用して細胞溶解物を調製した。溶解物を、それぞれのｇＲＮＡ標的部位におけるアンプリコンに基づく次世代シーケンシングのためのゲノムＤＮＡ鋳型として使用した。このアッセイは、両方のアプローチがリボヌクレオチドとしてＣａｓ９及びｓｇＲＮＡを標的細胞に送達するという点で、インビボで使用されるＬＮＰ送達様式をインビトロでより厳密に模倣する。

【0507】

実施例４．ヒト化Ｃ５マウスにおけるインビボでヒトＣ５を標的とするガイドＲＮＡの試験
８つのトップガイドＲＮＡ（ＣＲ０００５６８０、ＣＲ０００５６９２、ＣＲ０００５６８２、ＣＲ０００５６６０、ＣＲ０００５６５５、ＣＲ０００５６７７、ＣＲ０００５６６２、及びＣＲ０００５７１４に対応するｓｇＲＮＡ）をインビボ実験のために選択し、Ｃａｓ９ｍＲＮＡと（配列番号３３８、配列番号３３９に示されるＣＤＳと）インビボ送達のための脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で合成した。ＬＮＰは、生分解性カチオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを５０：３８：９：３のモル比で含有していた。生分解性カチオン性脂質は、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノアートとも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノアートであった。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡに対して重量比で１：１であった。

【0508】

８つのＣ５ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９配合ＬＮＰは、ヒト化Ｃ５マウスにおいて循環Ｃ５レベルの用量依存的減少をもたらした。ヒト化Ｃ５マウスでは、ヒトＣ５遺伝子（９７ｋｂ）のコードエキソン２～４２が、コードエキソン２～４１に及んでおり、３’ＵＴＲの一部を含むマウスＣ５遺伝子座の７５．８ｋｂ部分と置き換わっていた。例えば、国際公開第２０１５／１７１５２３号を参照されたく、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ヒト化Ｃ５遺伝子のコード配列が配列番号６に示される。血漿Ｃ５レベルをインビボのＣ５遺伝子の編集パーセントと比較した場合、良好な相関が存在した（データは示さず）。２つのガイド、ＣＲ００５６８０及びＣＲ００５６９２に対応するｓｇＲＮＡは、ヒト化Ｃ５マウスに単回静脈内注射として送達した場合、投与後３週間で０．３ｍｇ／ｋｇで５０％超及び１ｍｇ／ｋｇで約９５％の循環Ｃ５レベルを低下させた（データは示さず）。図３Ａを参照されたい。ヒト化Ｃ５マウスに、Ｃ５ＬＮＰ配合ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドを１ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射で投与した。治療群は、治療の１週間前に測定された血漿Ｃ５に基づいて形成された。８つのガイド（群当たりｎ＝５）：ＬＮＰ０３６５；ＬＮＰ０３６６；ＬＮＰ０３６７；ＬＮＰ０３６８；ＬＮＰ０３６９；ＬＮＰ０３７０；ＬＮＰ０３７１；及びＬＮＰ０３７２を実験で試験した。ＬＮＰ０３７３は、実験で使用した対照であった。血漿Ｃ５レベルを、市販のＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）を使用して、３週間のガイド投与後に毎週測定した。３つのガイド、ＬＮＰ０３６９、ＬＮＰ０３６７及びＬＮＰ０３６８は、血漿Ｃ５レベルの９０～９５％の低下を達成した（図３Ａ）。別の実験では、ヒト化Ｃ５マウスに、Ｃ５ＬＮＰ製剤化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドを２ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射で投与した。治療群は、治療の１週間前に測定された血漿Ｃ５に基づいて形成された。４つのガイド（群当たりｎ＝５）：ＬＮＰ０３６７；ＬＮＰ０３６８；ＬＮＰ０３６９；及びＬＮＰ０３７０を実験で試験した。ＬＮＰ０３７３（非標的化マウスガイドＲＮＡ）は実験で使用した対照であった。血漿Ｃ５レベルを、異なるエピトープでＣ５に結合する２つのＣ５モノクローナル抗体を用いて、社内で開発されたＥＬＩＳＡを使用して２週間及び３週間で測定した。Ｃ５機能に対する効果を調べるために、感作ＲＢＣを使用した古典的経路（ＣＰ）溶血をガイドの投与後３週間で利用した。例えば、Ｌａｔｕｓｚｅｋｅｔａｌ．（２０２０）ＰＬｏＳＯｎｅ１５（５）：ｅ０２３１８９２を参照されたく、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＬＮＰ０３６９及びＬＮＰ０３６７は、約９８％の血漿Ｃ５レベルの低下を達成した（図３Ｂ）。ＬＮＰ０３６９及びＬＮＰ０３６７では溶血の約７５％の減少が観察された（図４Ａ及び４Ｂ）。ヒト化Ｃ５マウスに、ＬＮＰ１４５７（ＣＲ００５６９２に対応するｓｇＲＮＡを含む）及びＬＮＰ１４５８（ＣＲ００５６６２に対応するｓｇＲＮＡを含む）を０．１、０．３又は１ｍｇ／ｋｇで投与した。血漿Ｃ５レベルの用量依存的減少があり、ＬＮＰ１４５７は１ｍｇ／ｋｇで約９２％減少し（図５Ａ）、エクスビボで古典的経路溶血は対応する８０％減少した（図５Ｂ）。

【0509】

両方のトップリード（ＣＲ００５６８０及びＣＲ００５６９２に対応するｓｇＲＮＡ）は、ＧｕｉｄｅＳｅｑ実験及びＳｉｔｅＳｅｑ実験によって行われたように、オフターゲットヒットがほとんど又は全くないＣ５に非常に特異的であった。結果を表１２にまとめる。「ＨＥＫ２９３オフターゲット」は、Ｃａｓ９を安定的に過剰発現するＨＥＫ２９３細胞において同定された潜在的オフターゲット部位の数を表す。これらの実験は、Ｃ５に対して非常に効率的かつ選択的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡの生成の成功を示す。

【0510】

【表12】