(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】核酸切断のための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20241024BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20241024BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20241024BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241024BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 13/02 20060101ALI20241024BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20241024BHJP
C07D 401/14 20060101ALI20241024BHJP
C07D 417/14 20060101ALI20241024BHJP
C07D 403/12 20060101ALI20241024BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241024BHJP
A61K 31/4709 20060101ALI20241024BHJP
A61K 31/4192 20060101ALI20241024BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241024BHJP
C07D 409/14 20060101ALI20241024BHJP
A61K 31/551 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20241024BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z ZNA
A61P31/04
A61P31/12
A61P31/14
A61P11/00
A61P13/02 105
A61P1/04
C07D401/14 CSP
C07D417/14
C07D403/12
A61P35/00
A61K31/4709
A61K31/4192
A61P43/00 111
C07D409/14
A61K31/551
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525379
(86)(22)【出願日】2022-10-28
(85)【翻訳文提出日】2024-06-18
(86)【国際出願番号】 EP2022080220
(87)【国際公開番号】W WO2023073181
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】2115540.3
(32)【優先日】2021-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501484851
【氏名又は名称】ケンブリッジ・エンタープライズ・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ ＥＮＴＥＲＰＲＩＳＥ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】ベルナルデス ゴンサロ
(72)【発明者】
【氏名】ミクティス シギタス
(72)【発明者】
【氏名】シブ アンナ
【テーマコード（参考）】
4B063
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA05
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR35
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS03
4B063QS25
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4B063QS34
4B063QX02
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC60
4C086BC82
4C086GA07
4C086GA08
4C086GA10
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA13
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4C086MA31
4C086MA32
4C086MA34
4C086MA35
4C086MA37
4C086MA41
4C086MA43
4C086MA52
4C086MA56
4C086MA57
4C086MA58
4C086MA59
4C086MA60
4C086MA63
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA59
4C086ZA66
4C086ZA82
4C086ZB26
4C086ZB33
4C086ZB35
4C086ZC02
(57)【要約】
本発明は、標的核酸分子を切断するための方法を提供する。本方法は、標的核酸分子を式（Ｉ）、Ｃ－Ｌ－Ｂの二官能性分子（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、二官能性分子が標的核酸分子に非共有結合するための非共有結合基である）と接触させるステップ、及び、二官能性分子に、それに結合した標的核酸分子を切断させるステップを含む。本発明はまた、標的核酸内の二次構造又は三次構造を同定する方法、並びに、二官能性分子、及び治療方法において使用するための二官能性分子も提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的核酸分子を切断するための方法であって、前記標的核酸分子を、式（Ｉ）の二官能性分子又はその塩若しくは溶媒和物：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、二官能性分子が前記標的核酸分子に非共有結合するための非共有結合基である）
と接触させるステップ、及び、
前記二官能性分子に、それに結合した前記標的核酸分子を切断させるステップ
を含む、前記方法。
【請求項2】
非共有結合基がポリヌクレオチド基ではない、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
非共有結合基が、１０００ｋＤａ以下の分子量を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
非共有結合基が、標的核酸内の二次構造又は三次構造に結合している、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
非共有結合基が、四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
二官能性分子が、１００００ｎＭ以下の解離定数（ｋＤ）で四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
二官能性分子が、５：１の選択性で四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項8】
非共有結合基が式（Ｂ－Ｉ）～（Ｂ－III）：【化1】
（式中、
ＸはＯ又はＮＨであり、かつ
＊はリンカーとの結合点である）
から選択される、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
切断基が式（Ｃ－Ｉ）～（Ｃ－III）：【化2】
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
ＲＮは水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、かつ
＊は、分子の残り部分（典型的にはリンカーユニットＬ）との結合位置を表す）
によって表される基から選択される、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
切断基が、式（Ｃ－Ｉ）によって表される基である、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
切断基が、置換されていないイミダゾールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
リンカーがポリアルキレングリコール基を含む、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
標的核酸分子がＲＮＡ分子である、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
標的核酸分子を細胞内で二官能性分子と接触させる、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
標的核酸分子内の二次構造又は三次構造を同定するための方法であって、第１及び第２の核酸分子集団を提供するステップであって、前記の各集団が前記標的核酸分子を含む、前記ステップ、
前記第１の核酸分子集団に、式（Ｉ）の二官能性分子又はその塩若しくは溶媒和物：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、前記二官能性分子が前記標的核酸分子に非共有結合するための非共有結合基である）
を導入するステップ、
前記二官能性分子に、前記第１の集団に存在する前記標的核酸分子を切断させるステップ、並びに
前記第２の集団よりも前記第１の集団において少ない量で存在している核酸分子を同定するステップ
を含む、前記方法。
【請求項16】
非共有結合基がポリヌクレオチド基ではない、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
非共有結合基が、１０００ｋＤａ以下の分子量を有する、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項18】
非共有結合基が、標的核酸内の二次構造又は三次構造に結合している、請求項１５～１７のいずれかに記載の方法。
【請求項19】
非共有結合基が、四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
二官能性分子が、１００００ｎＭ以下の解離定数（ｋＤ）で四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
二官能性分子が、５：１の選択性で四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項22】
非共有結合基が式（Ｂ－Ｉ）～（Ｂ－III）：【化3】
（式中、
ＸはＯ又はＮＨであり、かつ
＊はリンカーとの結合点である）
から選択される、請求項１５～２１のいずれかに記載の方法。
【請求項23】
切断基が、式（Ｃ－Ｉ）～（Ｃ－III）：【化4】
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
ＲＮは水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、かつ
＊は、分子の残り部分（典型的にはリンカーユニットＬ）との結合位置を表す）
によって表される基から選択される、請求項１５～２２のいずれかに記載の方法。
【請求項24】
切断基が式（Ｃ－Ｉ）によって表される基である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
切断基が、置換されていないイミダゾールである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
リンカーがポリアルキレングリコール基を含む、請求項１５～２５のいずれかに記載の方法。
【請求項27】
標的核酸分子がＲＮＡ分子である、請求項１５～２６のいずれかに記載の方法。
【請求項28】
標的核酸分子を細胞内で二官能性分子と接触させる、請求項１５～２７のいずれかに記載の方法。
【請求項29】
治療方法における使用のための、式（Ｉ）の二官能性分子又はその薬学的に許容される塩若しくは溶媒和物：Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、標的核酸分子に結合する非共有結合基である）。
【請求項30】
非共有結合基がポリヌクレオチド基ではない、請求項２９に記載の使用のための二官能性分子。
【請求項31】
非共有結合基が１０００ｋＤａ以下の分子量を有する、請求項２９又は３０に記載の使用のための二官能性分子。
【請求項32】
非共有結合基が標的核酸内の二次構造又は三次構造に結合している、請求項２９～３１のいずれかに記載の使用のための二官能性分子。
【請求項33】
非共有結合基が四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項２９～３２のいずれかに記載の使用のための二官能性分子。
【請求項34】
二官能性分子が１００００ｎＭ以下の解離定数（ｋＤ）で四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項３３に記載の使用のための二官能性分子。
【請求項35】
二官能性分子が５：１の選択性で四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項３３又は３４に記載の使用のための二官能性分子。
【請求項36】
非共有結合基が式（Ｂ－Ｉ）～（Ｂ－III）：【化5】
（式中、
ＸはＯ又はＮＨであり、かつ
＊はリンカーとの結合点である）
から選択される、請求項２９～３５のいずれかに記載の使用のための二官能性分子。
【請求項37】
切断基が、式（Ｃ－Ｉ）～（Ｃ－III）：【化6】
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
ＲＮは水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、かつ
＊は、分子の残り部分（典型的にはリンカーユニットＬ）との結合位置を表す）
によって表される基から選択される、請求項２９～３６のいずれかに記載の使用のための二官能性分子。
【請求項38】
切断基が式（Ｃ－Ｉ）によって表される基である、請求項３７に記載の使用のための二官能性分子。
【請求項39】
切断基が、置換されていないイミダゾールである、請求項３８に記載の使用のための二官能性分子。
【請求項40】
リンカーがポリアルキレングリコール基を含む、請求項２９～３９のいずれかに記載の使用のための二官能性分子。
【請求項41】
標的核酸分子がＲＮＡ分子である、請求項２９～４０のいずれかに記載の使用のための二官能性分子。
【請求項42】
治療が、細菌感染又はウイルス感染の治療である、請求項２９～４１のいずれかに記載の使用のための二官能性分子。
【請求項43】
治療が、ＲＮＡウイルスへの感染の治療である、請求項４２に記載の使用のための二官能性分子。
【請求項44】
ウイルスがコロナウイルスである、請求項４３に記載の使用のための二官能性分子。
【請求項45】
治療が、気道感染、尿路感染、又は胃腸炎の治療である、請求項２９～４１のいずれかに記載の使用のための二官能性分子。
【請求項46】
式（Ｉ）の二官能性分子又はその塩若しくは溶媒和物：Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、核酸分子に結合する非共有結合基である）。
【請求項47】
非共有結合基がポリヌクレオチド基ではない、請求項４６に記載の二官能性分子。
【請求項48】
非共有結合基が１０００ｋＤａ以下の分子量を有する、請求項４６又は４７に記載の二官能性分子。
【請求項49】
非共有結合基が四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項４６～４８のいずれかに記載の二官能性分子。
【請求項50】
非共有結合基が式（Ｂ－Ｉ）～（Ｂ－III）：【化7】
（式中、
ＸはＯ又はＮＨであり、かつ
＊はリンカーとの結合点である）
から選択される、請求項４６～４９のいずれかに記載の二官能性分子。
【請求項51】
切断基が、式（Ｃ－Ｉ）～（Ｃ－III）：【化8】
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
ＲＮは水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、かつ
＊は、分子の残り部分（典型的にはリンカーユニットＬ）との結合位置を表す）
によって表される基から選択される、請求項４６～５０のいずれかに記載の二官能性分子。
【請求項52】
切断基が式（Ｃ－Ｉ）によって表される基である、請求項５１に記載の二官能性分子。
【請求項53】
切断基が、置換されていないイミダゾールである、請求項５２に記載の二官能性分子。
【請求項54】
リンカーがポリアルキレングリコール基を含む、請求項４６～５３のいずれかに記載の二官能性分子。
【請求項55】
リンカーが、式（Ｌ－Ｉ）：【化9】
（式中、
Ｌ１は、共有結合又はＣ１－２アルキレン基であり、
Ｌ２は、Ｃ１－６アルキレン基又はＣ１－６ヘテロアルケン基であり、
Ｌ３は、Ｃ１－６アルキレン基であり、
ｎは１～８であり、
＊は、非共有結合基（－Ｂ）との結合点であり、かつ
＊＊は、切断基（－Ｃ）との結合点である）
によって表される基を含む、請求項４６～５４のいずれかに記載の二官能性分子。
【請求項56】
Ｌ１はメチレンであり、Ｌ２はエチレンオキシドであり、
Ｌ３はエチレンであり、かつ
ｎは２～５である、
請求項５５に記載の二官能性分子。
【請求項57】
式Ｄｅｇ－Ｉ～Ｄｅｇ－Ｖ：【化10】
の化合物から選択される、請求項４６に記載の二官能性分子。
【請求項58】
二官能性分子が、１０ｍＭ以下の解離定数（ｋＤ）で四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項５又は１９に記載の方法。
【請求項59】
二官能性分子が、１０ｍＭ以下の解離定数（ｋＤ）でシュードノットに結合している、請求項５又は１９に記載の方法。
【請求項60】
二官能性分子が、１０ｍＭ以下の解離定数（ｋＤ）で四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項３３に記載の使用のための二官能性分子。
【請求項61】
二官能性分子が、１０ｍＭ以下の解離定数（ｋＤ）でシュードノットに結合している、請求項３３に記載の使用のための二官能性分子。
【請求項62】
治療ががんの治療である、請求項２９～４１、６０、及び６１のいずれかに記載の使用のための二官能性分子。
【請求項63】
二官能性分子が、１０ｍＭ以下、例えば１００００ｎＭ以下の解離定数（ｋＤ）で四重鎖又はシュードノットに結合している、請求項４９に記載の二官能性分子。
【請求項64】
二官能性分子が、１００００ｎＭ以下の解離定数（ｋＤ）で四重鎖に結合する、請求項６３に記載の二官能性分子。
【請求項65】
二官能性分子が、１０ｍＭ以下の解離定数（ｋＤ）でシュードノットに結合する、請求項６３に記載の二官能性分子。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本願に繋がるプロジェクトは、マリー・スクウォドフスカ－キュリー補助金契約第８８９９２２号の下で、欧州連合ホライズン（European Union’s Horizon）２０２０研究及びイノベーションプログラムからの財政的支援を受けている。
【0002】
関連出願
本願は、２０２１年１０月２８日（２８／１０／２０２１）に出願された英国特許出願第２１１５５４０．３号の利益、及びこれに対する優先権を主張し、当該出願の内容は、参照によってその全体が組み込まれる。
本願は、２０２１年１０月２８日（２８／１０／２０２１）に出願された英国特許出願第２１１５５４０．３号の利益、及びこれに対する優先権を主張し、当該出願の内容は、参照によってその全体が組み込まれる。
【0003】
本願は、例えばエピゲノミクスマッピング及びエピトランスクリプトミクスマッピングにおける使用、並びに治療法、例えば抗微生物療法及び抗ウイルス療法における使用のための、標的核酸の非酵素的切断のための方法に関する。
【背景技術】
【0004】
核酸の操作及び編集の技術における進歩は、生物学的研究の実施方法に大変革をもたらした。ＲＮＡ干渉系及びｓｈＲＮＡ発現系が、標的の検証にとって、及び、特定の遺伝子が分子疾患において担う役割の解明にとって、非常に貴重であることが証明されている（Zamore, et al., 2000）。さらに最近では、ＣＲＩＳＰＲベースの技術が、ＤＮＡ（Gasiunas, et al., 2012； Jinek, et al., 2012）及びＲＮＡ（Cox, et al., 2017）を操作する能力を強化させており、遺伝子ノックアウト細胞などのさらに単純なシステムをさらに強化し、大規模で精巧なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースの遺伝子スクリーニングアプローチを可能にしている（Tzelepis, et al., 2016）。しかし、最も一般的に使用される核酸操作技術は遺伝子的なものであり、これらを、稀な集団、動物モデル、及び全組織などの、より複雑な生物学的システムに適用することは、絶対に不可能ではないにしても困難であり、これらの技術に基づいた治療法を開発することはさらに困難である（Bobbin, et al., 2016）。したがって、未だ開拓されていない状況での核酸の操作を可能にする新規な低分子ベースの技術を開発することが必要とされている。
【0005】
Mikutis et al., 2020は、クリックケミストリーを介してＲＮＡ種に共有結合することができ、こうして、結合したＲＮＡ分子を切断することができる、低分子の「クリック分解剤」を記載している。著者らは、ＲＮＡ配列内でのＮ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）の存在を同定するためのメチル化ＣＬＩＣＫ分解シーケンシング方法（ｍｅＣＬＩＣＫ－Ｓｅｑ、methylation CLICK degradation sequencing method）を記載している。この方法は、ＲＮＡにメチル基の代わりにアルキン部分を導入するために、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼを制御不能にする。その後の銅（Ｉ）触媒型のアジド－アルキン環付加反応がクリック分解剤分子を組み込み、ＲＮＡ切断を生じさせる。この方法は、メチル化された転写産物を同定し、ＲＮＡメチラーゼの特異性を判定し、そしてイントロン領域及び遺伝子間領域における修飾部位を確実にマッピングする。
【0006】
クリック分解剤分子は共有結合によって標的ＲＮＡに組み込まれるため、これら分子は、適切なクリック反応性基（典型的にはアルキン）を有するように編集され得るＲＮＡ種を分解するためだけに使用することができる。さらに、ＲＮＡの編集が必要であることによって、治療法へのこの技術の適用が制限されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Zamore, et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33
【非特許文献2】Gasiunas, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2012, Vol. 109, E2579-E2586
【非特許文献3】Jinek, et al., Science, 2012, Vol. 337, pp. 816-821
【非特許文献4】Cox, et al., Science, 2017, Vol. 358, pp. 1019-1027
【非特許文献5】Tzelepis, et al., Cell Reports, 2016, Vol. 17, pp. 1193-1205
【非特許文献6】Bobbin, et al., Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2016, Vol. 56, pp. 103-122
【非特許文献7】Mikutis et al., ACS Cent. Sci., 2020, Vol. 6, pp. 2196-2208
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、上記の懸案事項に照らして案出された。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明は、本明細書で分解剤として記載される二官能性分子を、標的核酸分子に非共有結合しこれを切断するための触媒剤として使用することができる、という発見に関する。本明細書で開示されている分解剤は、非共有結合による相互作用を介して標的核酸に結合する。驚くべきことに、本発明者らは、標的核酸の選択的分解を可能にするためには非共有結合で十分であることを発見した。したがって、分解剤は、標的核酸へのクリック反応性基の組み込みを必要としない。本明細書で記載される分解剤を使用する標的核酸分子の選択的切断は、エピジェネティクス及びエピトランスクリプトミクスによる分析、二官能性のマッピング、並びに治療法、例えば、抗細菌療法及び抗ウイルス療法、及びさらには抗がんにおいて有用であり得る。
【0010】
したがって、本発明の第１の態様では、標的核酸分子を切断するための方法であって、
標的核酸分子を、式（Ｉ）の二官能性分子：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基（cleavage group）であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、二官能性分子が標的核酸分子に非共有結合するための非共有結合基である）
と接触させるステップ、及び、
二官能性分子に、それに結合した標的核酸分子を切断させるステップ
を含む、前記方法が提供される。
標的核酸分子を、式（Ｉ）の二官能性分子：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基（cleavage group）であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、二官能性分子が標的核酸分子に非共有結合するための非共有結合基である）
と接触させるステップ、及び、
二官能性分子に、それに結合した標的核酸分子を切断させるステップ
を含む、前記方法が提供される。
【0011】
好ましくは、非共有結合基（－Ｂ）は、ポリヌクレオチド基ではない。
【0012】
好ましくは、非共有結合基（－Ｂ）は、１０００ｋＤａ以下、さらに好ましくは８００ｋＤａ以下の分子量を有する。
【0013】
好ましくは、非共有結合基（－Ｂ）は、標的核酸内の二次構造又は三次構造、例えば、四重鎖、シュードノット、三重鎖、テトラループ、ステップループ、又はヘアピンループに結合している。さらに好ましくは、非共有結合基（－Ｂ）は、四重鎖又はシュードノットに結合している。
【0014】
好ましくは、二官能性分子は、例えばＳＰＲによって、又は或いはマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ、microscale thermophoresis）によって、又は蛍光クエンチングアッセイによって決定すると１００００ｎＭ以下の解離定数（ｋＤ）で二次構造又は三次構造に結合する。好ましくは、二官能性分子は、１０００ｎＭ以下、さらに好ましくは５００ｎＭ以下、さらに好ましくは２００ｎＭ以下、そして最も好ましくは１００ｎＭ以下のｋＤで二次構造又は三次構造に結合する。
【0015】
加えて、又は或いは、二官能性分子は、例えばマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）によって決定すると１０ｍＭ以下の解離定数（ｋＤ）で二次構造又は三次構造に結合する。好ましくは、二官能性分子は、８ｍＭ以下、さらに好ましくは７ｍＭ以下、さらに好ましくは６ｍＭ以下、さらに好ましくは５ｍＭ以下のｋＤで二次構造又は三次構造に結合する。
【0016】
好ましくは、非共有結合基（－Ｂ）は、以下に示す式（Ｂ－Ｉ）～（Ｂ－III）から選択される。
【0017】
好ましくは、標的核酸分子は、ウイルスＲＮＡ又は細菌リボザイムなどのＲＮＡ分子である。
【0018】
好ましくは、標的核酸分子は、細胞内で二官能性分子と接触させられる。
【0019】
本発明の第２の態様では、標的核酸分子内の二次構造又は三次構造を同定するための方法であって、
第１及び第２の核酸分子集団を提供するステップであって、前記の各集団が前記標的核酸分子を含む、前記ステップ、
第１の核酸分子集団に、式（Ｉ）の二官能性分子：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、二官能性分子が標的核酸分子に非共有結合するための非共有結合基である）
を導入するステップ、
二官能性分子に、第１の集団に存在する標的核酸分子を切断させるステップ、並びに
第２の集団よりも第１の集団において少ない量で存在している核酸分子を同定するステップ
を含む方法が提供される。
第１及び第２の核酸分子集団を提供するステップであって、前記の各集団が前記標的核酸分子を含む、前記ステップ、
第１の核酸分子集団に、式（Ｉ）の二官能性分子：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、二官能性分子が標的核酸分子に非共有結合するための非共有結合基である）
を導入するステップ、
二官能性分子に、第１の集団に存在する標的核酸分子を切断させるステップ、並びに
第２の集団よりも第１の集団において少ない量で存在している核酸分子を同定するステップ
を含む方法が提供される。
【0020】
第１の態様について示された式（Ｉ）の二官能性分子の好ましい実施形態は、第２の態様にも適用される。
【0021】
本発明の第３の態様では、治療の方法において使用するための、式（Ｉ）の二官能性分子：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは非共有結合基である）
を提供する。
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは非共有結合基である）
を提供する。
【0022】
第１の態様について示された式（Ｉ）の二官能性分子の好ましい実施形態は、第３の態様にも適用される。
【0023】
好ましくは、治療は、細菌感染又はウイルス感染の治療である。
【0024】
好ましくは、ウイルス感染は、ＲＮＡウイルス、さらに好ましくは（＋）ｓｓＲＮＡウイルス、さらに好ましくはコロナウイルスへの感染である。
【0025】
好ましくは、治療は、気道感染、尿路感染、又は胃腸炎の治療である。
【0026】
加えて、又は或いは、治療はがんの治療である。
【0027】
本発明の第４の態様では、式（Ｉ）の二官能性分子：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、核酸分子に結合する非共有結合基である）
を提供する。
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、核酸分子に結合する非共有結合基である）
を提供する。
【0028】
第１の態様について示された式（Ｉ）の二官能性分子の好ましい実施形態は、第４の態様にも適用される。
【0029】
好ましくは、二官能性分子は、化合物Ｄｅｇ－Ｉ～Ｄｅｇ－Ｖから選択される。
【0030】
本発明のこれらの及び他の態様並びに実施形態を、以下でさらに詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【0031】
本発明を、以下に列挙する図面を参照して説明する。
【図1】分解剤の作用態様の略図である。図１は、コロナウイルスシュードノットの分解戦略における分解剤の使用を示している。シュードノット分解剤は、他の薬剤を必要とせずに、シュードノットを有するコロナウイルス領域を結合し、次いでこれを直接分解する。
【図2】ｒＧ４分解剤が、インビトロで、ｒＧ４含有オリゴマー及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムを切断することを示す図である。（ａ）ｒＧ４コンピテントオリゴマーに対するｒＧ４分解剤の効果を示している。分解剤は、ｒＧ４形成を促進する条件下でオリゴマーを切断する。ｎ＝３。（ｂ）ｒＧ４を形成しないオリゴマーに対するｒＧ４分解剤の効果を示している。分解は見られなかった。ｎ＝３。（ｃ）そのＯＲＦ１ｂにおいてｒＧ４分解剤ＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）で処理した際の、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムに対する広い分解を示す、ナノポアシーケンシングデータを示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、ｎ．ｓ．有意ではない。
【図3】Ｇ４分解剤の抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性のインビトロでの予備調査結果を示す図である。（ａ）５０μＭのＰＤＳ－ｄｅｇ４（９Ｂ）、ＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）、及びＰＤＳ－ＤｅｇＡＬＫ（８）で処理した試料でのプラーク形成単位（ＰＦＵ、plaque forming units）の阻害を示す。（ｂ）ウイルスＲＮＡのＰＣＲ測定値を示している。結果は、５μＭ及び５０μＭのＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）によるウイルス複製の阻害を示している。示されているように、ＰＤＳ－Ｉｍｉ６（９Ａ）は、ＰＤＳ－ｄｅｇ４（９Ｂ）よりも一層、ウイルス増殖を阻害すると考えられる。（ｃ）Ｇ４分解剤の濃度を増加させて２４時間、インキュベーションした後の細胞の生存率を示している。いずれの化合物も、５０μＭまで細胞毒性を示さなかった。
【図4】Ｇ４分解剤のインビボでの抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２活性を示す図である。（ａ）ＰＤＳ－ｄｅｇ４（９Ｂ）を投与したマウス（紫色、三角の記号）は、感染後１日目に１０％の体重減少を示し、これは、１日目から３日目の間で安定しており、その後再び低下して、媒体（水中で０．１％のＤＭＳＯ）で処理した動物（灰色、四角の記号）で見られるように、５日目に７５％の閾値に達した。コントロール（丸の記号）としての、媒体（水中で０．１％のＤＭＳＯ）で処理した無感染マウスは、体重減少を示さなかった。（ｂ）プラークアッセイによる５日目の肺ウイルス負荷の定量は、媒体コントロール群（灰色、左側）と比較して、ＰＤＳ－ｄｅｇ４（９Ｂ）で処理した動物（紫、右側）で低い負荷を示した。＊ｐ＜０．０１。
【図5】ＭＴＤＢ分解剤（１６ａ）がインビトロでコロナウイルスシュードノットを切断することを示す図である。（ａ）ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）の合成設計を示す。（ｂ）弱いシュードノットバインダー及びイミダゾール切断部分を特徴とするコントロール分子ＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）の構造を示している。（ｃ）コントロールと比較した、分解剤の存在下でのシュードノットの破壊を示す、ＬＣ－ＭＳデータである。ｎ＝３。（ｄ）シュードノット分解剤の活性を確認するゲル写真を示している。（ｅ）シュードノットシステムの１つが変異してシュードノットの二次構造が乱れるとシュードノット分解剤の効率が弱まることを示す、ＬＣＭＳデータである。ｎ＝３。（ｆ）コントロールと比較した、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）による、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から抽出されたネイティブＲＮＡの分解を示すゲル写真である。ｎ．ｓ．有意ではない。
【図6】直接的なＲＮＡナノポアシーケンシングが、ＭＴＤＢ－ｄｅｇで分解されるゲノム位置を明らかにすることを示す図である。（ａ）ｍｉｎｉｍａｐ２でのアラインメントに基づく、コントロール（水中で０．１％のＤＭＳＯ）又はＭＴＤＢ－ｄｅｇで処理したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡについての、シュードノット区域に隣接するアラインされたリードの分布及び存在量を示す。ｂ． ｍｉｎｉｍａｐ２でのアラインメントに基づく、コントロール又はＭＴＤＢ－ｄｅｇで処理したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡについての、Ｓ ｓｇＲＮＡ領域について排他的にマッピングされた、アラインされたリードの分布及び存在量。
【図7】ＭＴＤＢ－ｄｅｇでの処理がサブゲノムのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡに対して効果を有していないことを示す図である。ｍｉｎｉｍａｐ２でのアラインメントに基づく、コントロール（水中で０．１％のＤＭＳＯ）又はＭＴＤＢ－ｄｅｇで処理したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡについての、示されているｓｇＲＮＡ領域について排他的にマッピングされた、アラインされたリードの分布及び存在量。
【図8】ＭＴＤＢ分解剤が細胞内でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害することを示す図である。（ａ）、（ｂ）シュードノット分解剤（ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ））並びにコントロール分子（ＭＴＤＢ及びＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ））の濃度を増加させてインキュベーションした後の、媒体コントロール（破線）に対して正規化された、ウイルス複製の阻害のパーセンテージを示す。ウイルス複製を、２４時間の感染（感染多重度（ＭＯＩ、multiplicity of infection）０．０５）後に、Ｅ遺伝子及びシュードノット領域のＲＮＡレベルに基づいて評価した。ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）の抗ウイルス活性は、０．０５ＭＯＩのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２での感染前（ａ）及び感染後（ｂ）の両方で見られた。３セットの平均±ＳＤが示されており、ｐ＜０．０１の平均間の差が示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、対応のある両側ｔ検定。（ｃ）薬物が感染後に添加されるとシュードノット分解剤ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０、50% inhibitory concentration）が低下することを示している。（ｄ）６ｕＭのＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）、ＭＴＤＢ、及びＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）で２４時間処理したウイルス培養物の上清と４日間インキュベートした後の細胞単層の写真である。６ｍＭのＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）での２４時間の処理は、感染前の添加又は感染後の添加の両方で、媒体コントロールと比較してウイルスプラーク数の減少を示した。コントロール分子ＭＴＤＢは、感染前の添加でウイルスプラーク数の減少を示しただけであり、ＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）は減少を示さなかった。（ｅ）いずれの化合物も２４時間後にＶｅｒｏＣＣＬ８１細胞で細胞毒性を示さなかったことを示す細胞生存率アッセイ。（ｆ）分解剤を含有する培地を除去した２４時間後の、媒体コントロールと比較したウイルス複製のパーセンテージを示す。ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）での２４時間の処理は、ウイルスの、薬物曝露から生存する能力を低下させた。
【図9】ＭＴＤＢ－ｄｅｇ、ＭＴＤＢ、及びＴＤＢ－ｄｅｇの用量応答曲線を示す図である。（ａ）、（ｂ）感染前及び感染後のシュードノット分解剤ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）値を示している。コントロール分子（ＭＴＤＢ及びＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）はウイルス複製を阻害せず、したがって、ＩＣ５０値は決定されなかった。（ｃ）用量応答曲線（Ｅ遺伝子を標的化するＰＣＲによって決定される）であり、これは、増大したＩＣ５０を示す、より高い濃度の１８μＭを含んでいる。
【図10】ＭＴＤＢ分解剤曝露の後のウイルス生存及び殺ウイルス活性を示す図である。（ａ）シュードノット領域を標的化するｑＰＣＲによって決定される、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）並びにコントロール分子ＭＴＤＢ及びＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）と２４時間インキュベートした後の、ウイルスの生存能力。ウイルスの生存は、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）で処理した試料で低下したが、コントロール分子ＭＴＤＢ及びＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）で処理した試料では低下しなかった。（ｂ）殺ウイルス活性を、１０００ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を６μＭの化合物と３７℃で１時間インキュベートすることによって評価し、その後、残りのウイルスの感染性をプラークアッセイによって決定した。ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）、ＭＴＤＢ、及びＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）は、セルフリービリオンに対する殺ウイルス効果を示さず、このことは、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）の抗ウイルス活性がセルフリービリオンの不活化ではなく宿主細胞内でのウイルス複製の阻害によって媒介されることを示唆している。
【図11】リボソーム分解アッセイのアガロースゲル分析を示す図である。左側：エチルリンカー、分解は見られない。中央左側：ジエチレングリコールリンカー、１５ｍＭ濃度で分解が見られる。中央右側：ヘキサエチレングリコールリンカー、分解は見られない。右側：コントロールであるクロラムフェニコール、分解なし。Ｂ＝ブランク（分解剤なし）、分解剤濃度：１ａ／１ｂ＝１５ｍＭ、２ａ／２ｂ＝７．５ｍＭ、３ａ／３ｂ＝３．７５ｍＭ、４ａ／４ｂ＝１．８８ｍＭ、５ａ／５ｂ＝０．９４ｍＭ、６ａ／６ｂ＝０．４７ｍＭ。
【図12】Ｋ１８－ｈＡＣＥ２マウスにおけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に対するＭＴＤＢ分解剤のインビボでの活性を示す図である。（ａ）８～１２週齢のメスのＫ１８－ｈＡＣＥ２－トランスジェニックマウスを１０４プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に鼻腔内感染させ、感染の１時間前及び感染の３時間後に、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ（２５ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝６）、ＭＴＤＢ（１０ｍｇ／ｋｇ、所与の限界溶解度で投与することができた最大用量）（ｎ＝３）、ＴＤＢ－ｄｅｇ １６ｂ（２５ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝５）、及び媒体コントロール（ｎ＝６）で鼻腔内処理した。（ｂ）ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａの投与は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスの肺ウイルス負荷を低下させる。媒体コントロール処理マウスとＭＴＤＢ処理マウス及びＴＤＢ－ｄｅｇ １６ｂ処理マウスとの間の肺ウイルス負荷の間に差は見られなかった。平均±ＳＤが示されている。＊ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定。（ｃ）感染の１時間前並びに感染の１日及び２日後（ｎ＝２）に３用量の１０ｍｇ／ｋｇの媒体（Ｖ１、Ｖ２）又はＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ（Ｄ１、Ｄ２）で処理したトランスジェニックＫ１８－ｈＡＣＥ２マウスの肺抽出物のホスホ－ｐ３８のウェスタンブロット分析。
【図13】細胞システムにおける分解特異性のＲＴ－ｑＰＣＲでの検証を示す図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＶｅｒｏ ＣＣＬ－８１細胞を、６μＭのＭＴＤＢ－ｄｅｇ又は媒体（Ｈ２Ｏ）コントロールのいずれかで２４時間処理した（ｎ＝３）。ステューデントｔ検定。３回の独立した反復の平均＋ＳＤが示されている。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【図14】ＰＤＳファミリーの分子及びＭＴＤＢファミリーの分子の、それらの標的に対する結合親和性を示す図である。（ａ）蛍光クエンチングアッセイを介して決定される、Ｇ４形成ＮＲＡＳオリゴヌクレオチドに対するＰＤＳファミリーのリガンドの結合親和性。（ｂ）ＭＳＴを介して測定される、シュードノットオリゴヌクレオチドに対するＭＴＤＢファミリーのリガンドの結合親和性。（ｃ）ＭＳＴを介して測定される、破壊されたシュードノットオリゴヌクレオチドに対する、ＭＴＤＢファミリーのリガンド結合親和性。ｎ＝３。
【発明を実施するための形態】
【0032】
本発明は、本明細書で分解剤としても記載される二官能性分子を、標的核酸分子に非共有結合しこれを切断するための触媒剤として使用することができる、という発見に関する。本明細書で開示されている分解剤は、非共有結合による相互作用を介して標的核酸に結合する。したがって、分解剤は、標的核酸へのクリック反応性基の組み込みを必要としない。本明細書で記載される分解剤を使用する標的核酸分子の選択的な切断は、エピジェネティクス及びエピトランスクリプトミクスによる分析、二官能性のマッピング、並びに治療法、例えば、抗細菌療法及び抗ウイルス療法、及びさらには抗がんにおいて有用であり得る。
【0033】
分解剤は、式（Ｉ）：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、Ｃは切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは非共有結合基である）
を有する。
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、Ｃは切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは非共有結合基である）
を有する。
【0034】
切断基（－Ｃ）
切断基はイミダゾール（１，３－ジアゾール）であり、これは、本明細書で記載されるように置換されていてもよい。
切断基はイミダゾール（１，３－ジアゾール）であり、これは、本明細書で記載されるように置換されていてもよい。
【0035】
分解剤のイミダゾール切断基は、標的核酸分子と反応して標的核酸分子を切断することができる。典型的には、イミダゾールは、リボース糖の２’位のヒドロキシル基からプロトンを取り除くことができる。場合によって、イミダゾールは、銅を結合して、銅介在性のＲＮＡ分解を誘導することができる（Li, Zhong-Rui, et al. Nat Chem 11.10 (2019)：880-889、Wong, K, et al. Can J Biochem 52.11 (1974)： 950-958、Subramaniam, Siddharth, et al. F1000Research 4 (2015)）。
【0036】
イミダゾールは塩基性基である。すなわち、イミダゾールは、水素カチオン（Ｈ＋）を受け取ることができる。イミダゾールはまた、電子対を付与することもできる。
【0037】
基の塩基性は、会合した共役酸のｐＫａを使用して定量的に評価することができる。すなわち、塩基性基の塩基性［Ｂａ］は、共役酸［ＢａＨ］＋のｐＫａを使用して評価することができる。共役酸のｐＫａは分かっていても、酸塩基滴定などの標準的な技術を使用して決定してもよい。理論に拘束されることは望まないが、本発明者らは、ｐＫａ値がある特定の閾値を超えている、例えばｐＫａが６．５以上、例えば６．８以上の共役酸を有する塩基性残基は、リボース糖の２’位のヒドロキシル基を脱プロトン化して、標的核酸内でのホスホジエステル骨格の切断を可能にし得ると考えている。イミダゾールは、７に近いｐＫａを有する。
【0038】
イミダゾールは、孤立電子対を有する窒素原子を含む。孤立電子対を有する窒素原子を含む基は、典型的には、銅が配位していてよい。イミダゾールは、銅をキレート化することが分かっている。
【0039】
イミダゾールは置換されていなくても、又は、同一であっても異なっていてもよい１つ、２つ、又は３つのＣ１－６アルキル基によって置換されていてもよい。
【0040】
アルキル基は、一価の飽和炭化水素基である。アルキル基は、Ｃ１－６アルキル基、例えばＣ１－４アルキル基であり得る。この状況では、接頭語（例えばＣ１－６）は、炭化水素骨格内の炭素原子数を示す。アルキル基は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。
【0041】
Ｃ１－６直鎖状アルキル基の例としては、メチル（－Ｍｅ）、エチル（－Ｅｔ）、ｎ－プロピル（－ｎＰｒ）、ｎ－ブチル（－ｎＢｕ）、ｎ－ペンチル（－Ａｍｙｌ）、及びｎ－ヘキシルが含まれる。Ｃ１－６分枝状アルキル基の例としては、イソプロピル（－ｉＰｒ）、イソブチル（－ｉＢｕ）、ｓｅｃ－ブチル（－ｓＢｕ）、ｔｅｒｔ－ブチル（－ｔＢｕ）、イソペンチル、ネオペンチル、イソヘキシル、及びネオヘキシルが含まれる。
【0042】
一部の好ましい実施形態では、イミダゾールは、式（Ｃ－Ｉ）～（Ｃ－III）：
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
ＲＮは水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、かつ
＊は、分子の残り部分（典型的にはリンカーユニットＬ）との結合位置を表す）
によって表される基から選択される。
【化1】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、
ＲＮは水素原子又はＣ１－６アルキル基を表し、かつ
＊は、分子の残り部分（典型的にはリンカーユニットＬ）との結合位置を表す）
によって表される基から選択される。
【0043】
このようなケースでは、分解剤はイミダゾール分解剤と記載され得る。
【0044】
好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲＮはそれぞれ独立して水素原子又はＣ１－４アルキル基を表す。
【0045】
さらに好ましくは、切断基は、式（Ｃ－Ｉ）によって表される基である。
【0046】
さらに好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はそれぞれ独立して水素を表す。このようなケースでは、切断基は、置換されていないイミダゾール基である。すなわち、切断基は、式（Ｃ－IV）：
（式中、＊は、分解剤の残り部分（典型的にはリンカーユニットＬ）との結合位置を表す）
によって表される。
【化2】
（式中、＊は、分解剤の残り部分（典型的にはリンカーユニットＬ）との結合位置を表す）
によって表される。
【0047】
リンカー及び結合基を介して標的核酸分子に非共有結合すると、イミダゾール基は標的核酸分子と反応して、１又は２以上のホスホジエステル結合を切断し、これによって、標的核酸分子の分解を生じさせる。例えば、結合した分解剤のイミダゾール基は、核酸分子上の２’ＯＨ位からプロトンを取り除いて、標的核酸分子内のホスホジエステル結合の切断を生じさせ得る。さらに、イミダゾール基は、標的核酸分子内のホスホジエステル結合を切断する銅錯体を形成し得る。
【0048】
リンカー（－Ｌ－）
分解剤のリンカーＬは、切断基（Ｃ）が非共有結合基（Ｂ）に結合（すなわち共有結合）するための基を含む。適切なリンカーは、当技術分野において周知である。
分解剤のリンカーＬは、切断基（Ｃ）が非共有結合基（Ｂ）に結合（すなわち共有結合）するための基を含む。適切なリンカーは、当技術分野において周知である。
【0049】
典型的には、リンカーは、遊離原子価の１つが切断基（Ｃ）への単結合の一部を形成し、残りの遊離原子価が非共有結合基（Ｂ）への単結合の一部を形成している、二価の基を含む。
【0050】
好ましくは、リンカーは安定なリンカーである。すなわち、リンカーは、インビボで実質的に切断も分解もされない基を含む。安定なリンカーは、典型的には、生理学的ｐＨで非反応性であり、インビボで酵素作用によって実質的に分解されない。
【0051】
典型的には、リンカーは可動性（flexible）リンカーである。すなわち、リンカーは、切断基（Ｃ）及び結合基（Ｂ）が高い自由度で互いに対して動くことを可能にする。
【0052】
典型的なリンカーは、アルキレン、ヘテロアルキレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリレン、及びヘテロアリレンから選択される基を含む。共有結合している異なる基、例えばアルキレン－アリレン（アラルキレン）及びヘテロアルキレン－アリレンを含む混合リンカーも可能である。
【0053】
アルキレン（アルカンジイル）基は、２つの遊離原子価がそれぞれ、隣接している原子への単結合の一部を形成している、二価の飽和炭化水素基である。アルキレン基は、Ｃ１－６アルキレン基、例えば、Ｃ１－４、Ｃ１－３、又はＣ１－２アルキレン基であり得る。この状況では、接頭語（例えばＣ１－６）は、炭化水素骨格内の原子数を示す。アルキレン基は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。直鎖状アルキレン基の例としては、メタンジイル（メチレン架橋）、エタン－１，２－ジイル（エチレン架橋）、プロパン－１，３－ジイル、ブタン－１，４－ジイル、ペンタン－１，５－ジイル、及びヘキサン－１，６－ジイルが含まれる。分枝状アルキレン基の例としては、エタン－１，１－ジイル及びプロパン－１，２－ジイルが含まれる。
【0054】
ヘテロアルキレン基は、１又は２以上の炭素原子がＮ、Ｏ、及びＳなどのヘテロ原子で置換されているアルキレン基である。ヘテロアルキレン基は、Ｃ１－６ヘテロアルキレン基、例えば、Ｃ１－４、Ｃ１－３、又はＣ１－２ヘテロアルキレン基であり得る。この状況では、接頭語（例えばＣ１－６）は、炭素原子又はヘテロ原子のいずれかの、ヘテロアルキレン骨格内の原子数を示す。ヘテロアルキレン基は、直鎖状であっても分枝状であってもよい。直鎖状ヘテロアルキレン基の例としては、オキシメチレン（例えば、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ、polyoxymethylene））、エチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ、polyethylene glycol））、エチレンイミン（例えば、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、polyethyleneimine）、ポリアジリジン）、及びテトラメチレングリコール（例えば、ポリテトラメチレングリコール（ＰＴＭＥＧ、polytetramethylene glycol）、ポリテトラヒドロフラン）から誘導されるものが含まれる。分枝状ヘテロアルキレン基の例としては、プロピレングリコール（例えば、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ、polypropylene glycol））から誘導されるものが含まれる。窒素原子がヘテロアルキレン基内に存在する場合、この窒素原子は、置換されていなくても（ＮＨ）、又はＣ１－４アルキル基などのアルキル基で置換されていてもよい。硫黄原子がヘテロアルキル基内に存在している場合、この硫黄原子は、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、又はＳ（Ｏ）２であり得る。
【0055】
シクロアルキレン基は、１つの環を含む二価の飽和炭化水素基であり、当該環では、環原子の全てが炭素原子であり、２つの遊離原子価がそれぞれ、隣接している原子への単結合の一部を形成している。シクロアルキレン基は、Ｃ５－６シクロアルキレン基であり得る。この状況では、接頭語（例えばＣ５－６）は、環原子の数又は範囲を示す。シクロアルキレン基は単環であり得る。単環シクロアルキレン基の例としては、１，３－シクロペンチレン及び１，４－シクロヘキシレンが含まれる。
【0056】
ヘテロシクロアルキレン（ヘテロシクレン）基は、１又は２以上の炭素原子がヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、及びＳで置換されているか、又は１若しくは２以上の炭素原子がオキソ置換基（＝Ｏ）を有している、シクロアルキレン基である。ヘテロシクロアルキレン基は、Ｃ５－６ヘテロシクロアルキレン基であり得る。この状況では、接頭語（例えばＣ５－６）は、炭素原子又はヘテロ原子のいずれかの、環原子の数又は範囲を示す。ヘテロシクロアルキレン基は、単環であり得る。窒素原子がヘテロアルキレン基内に存在する場合、この窒素原子は、置換されていなくても（ＮＨ）、又はＣ１－４アルキル基などのアルキル基で置換されていてもよい。硫黄原子がヘテロアルキル基内に存在している場合、この硫黄原子は、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、又はＳ（Ｏ）２であり得る。
【0057】
アリレン基は、１つの芳香環を含む二価の炭化水素基であり、当該芳香環では、環原子の全てが炭素原子であり、２つの遊離原子価がそれぞれ、隣接している原子への単結合の一部を形成している。アリレン基は、Ｃ６－１０アリレン基であり得る。この状況では、接頭語（例えばＣ６－１０）は、環原子の数又は範囲を示す。アリレン基は単環であっても、２又は３以上の環を含んでいてもよい。単環アリレン基の例としては、１，４－フェニレンが含まれる。二環アリレン基の例としては、２，６－ナフチレンが含まれる。
【0058】
ヘテロアリレン基は、１つの芳香環を含むアリレン基であり、当該芳香環では、１若しくは２以上の環原子がヘテロ原子、例えば、Ｎ、Ｏ、及びＳであるか、又は１若しくは２以上の炭素原子がオキソ置換基（＝Ｏ）を有している。ヘテロアリレン基は、Ｃ６－１０ヘテロアリレン基であり得る。この状況では、接頭語（例えばＣ６－１０）は、炭素又はヘテロ原子のいずれかの、環原子の数又は範囲を示す。ヘテロアリレン基は単環であっても、２又は３以上の環を含んでいてもよい。単環ヘテロアリレン基の例としては、ピロリレン及びピリジレンが含まれる。
【0059】
好ましいリンカーは、アルキレン及びヘテロアルキレンから選択される基を含む。さらに好ましいリンカーは、ヘテロアルキレン基を含む。さらに好ましいリンカーは、アルキレンエーテル基を含む。最も好ましいリンカーは、エチレンオキシド基（例えば、ポリエチレングリコール、ＰＥＧから誘導される）を含む。
【0060】
好ましい実施形態では、リンカーは、式（Ｌ－Ｉ）：
（式中、
Ｌ１は、共有結合又はＣ１－２アルキレン基であり、
Ｌ２は、Ｃ１－６アルキレン基又はＣ１－６ヘテロアルケン基であり、
Ｌ３は、Ｃ１－６アルキレン基であり、
ｎは１～８であり、
＊は、非共有結合基（－Ｂ）との結合点であり、かつ
＊＊は、切断基（－Ｃ）との結合点である）
によって表される基であるか、又はこれを含む。
【化3】
（式中、
Ｌ１は、共有結合又はＣ１－２アルキレン基であり、
Ｌ２は、Ｃ１－６アルキレン基又はＣ１－６ヘテロアルケン基であり、
Ｌ３は、Ｃ１－６アルキレン基であり、
ｎは１～８であり、
＊は、非共有結合基（－Ｂ）との結合点であり、かつ
＊＊は、切断基（－Ｃ）との結合点である）
によって表される基であるか、又はこれを含む。
【0061】
適切なＣ１－２アルキレン基としては、メチレン（メタンジイル）、エチレン（エタン－１，２－ジイル）が含まれる。
【0062】
適切なＣ１－６アルキレン基としては、メチレン（メタンジイル）、エチレン（エタン－１，２－ジイル）、プロピレン（プロパン－１，３－ジイル）、ブチレン（ブタン－１，４－ジイル）、ペンチレン（ペンタン－１，５－ジイル）、及びヘキシレン（ヘキサン－１，６－ジイル）が含まれる。
【0063】
好ましくは、Ｌ１は、共有結合又はメチレンである。
【0064】
好ましくは、Ｌ３はＣ１－４アルキレンである。さらに好ましくは、Ｌ３はエチレンである。
【0065】
好ましくは、ｎは２～５である。
【0066】
適切なＣ１－６ヘテロアルケン基としては、アルキレンエーテル基、例えばエチレンオキシド（－ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）、プロピレンオキシド（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）、及びテトラメチレンオキシド（－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｏ－）が含まれる。
【0067】
好ましくは、Ｌ２はエチレンオキシドである。このようなケースでは、リンカーは、式（Ｌ－II）：
（式中、Ｌ１、Ｌ３、ｎ、＊、及び＊＊は、式（Ｌ－Ｉ）について記載した通りであり、同じ優先傾向が適用される）
によって表される基であるか、又はこれを含む。
【化4】
（式中、Ｌ１、Ｌ３、ｎ、＊、及び＊＊は、式（Ｌ－Ｉ）について記載した通りであり、同じ優先傾向が適用される）
によって表される基であるか、又はこれを含む。
【0068】
代替的な実施形態では、リンカーは、式（Ｌ－III）：
（式中、
Ｌ４は、Ｃ１－６アルキレン基であり、
Ｌ５は、Ｃ１－６アルキレン基又はＣ１－６ヘテロアルケン基であり、
Ｌ６は、共有結合又はＣ１－２アルキレン基であり、
ｍは１～８であり、
＊は、非共有結合基（－Ｂ）との結合点であり、かつ
＊＊は、切断基（－Ｃ）との結合点である）
によって表される基であるか、又はこれを含む。
【化5】
（式中、
Ｌ４は、Ｃ１－６アルキレン基であり、
Ｌ５は、Ｃ１－６アルキレン基又はＣ１－６ヘテロアルケン基であり、
Ｌ６は、共有結合又はＣ１－２アルキレン基であり、
ｍは１～８であり、
＊は、非共有結合基（－Ｂ）との結合点であり、かつ
＊＊は、切断基（－Ｃ）との結合点である）
によって表される基であるか、又はこれを含む。
【0069】
好ましくは、Ｌ４はＣ１－４アルキレンである。さらに好ましくは、Ｌ３はエチレンである。
【0070】
好ましくは、Ｌ６はメチレン又はエチレンである。
【0071】
好ましくは、ｍは２～５である。
【0072】
好ましくは、Ｌ５はエチレンオキシドである。このようなケースでは、リンカーは、式（Ｌ－IV）：
（式中、Ｌ４、Ｌ６、ｍ、＊、及び＊＊は、式（Ｌ－III）で記載した通りであり、同じ優先傾向が適用される）
によって表される基であるか、又はこれを含む。
【化6】
（式中、Ｌ４、Ｌ６、ｍ、＊、及び＊＊は、式（Ｌ－III）で記載した通りであり、同じ優先傾向が適用される）
によって表される基であるか、又はこれを含む。
【0073】
非共有結合基（－Ｂ）
分解剤の結合基は、標的核酸分子に結合し得る基を含む。結合基は、非共有結合を介して標的核酸分子に結合する。
分解剤の結合基は、標的核酸分子に結合し得る基を含む。結合基は、非共有結合を介して標的核酸分子に結合する。
【0074】
ある特定の低分子リガンドは、核酸に非共有結合することが分かっており、したがって、非共有結合基の基礎を形成し得る。
【0075】
非共有結合基は、ポリヌクレオチド（例えば核酸）基ではない。共有結合基はヌクレオチドではなく、またヌクレオチドを含まない。
【0076】
非共有結合基は抗体ではない。
【0077】
典型的には、非共有結合基は、１０００ｋＤａ以下の分子量を有する。好ましくは、非共有結合基は、８００ｋＤａ以下の分子量を有する。
【0078】
典型的には、非共有結合基は、標的核酸内の二次構造又は三次構造に結合する。適切な二次構造又は三次構造としては、四重鎖、シュードノット、三重鎖、テトラループ、ステップループ、及びヘアピンループが含まれる。好ましくは、非共有結合基は、四重鎖又はシュードノットに結合する。
【0079】
好ましくは、非共有結合基は、標的核酸内の二次構造又は三次構造に選択的に結合する。このようなケースでは、非共有結合基は、直鎖状の又は構造化されていない核酸よりも、標的核酸内の二次構造又は三次構造に優先的に結合する。好ましくは、非共有結合基は、四重鎖又はシュードノットに選択的に結合する。
【0080】
好ましくは、非共有結合基は、リボ核酸（ＲＮＡ、ribonucleic acid）に選択的に結合する。したがって、非共有結合基は、非共有ＲＮＡ結合基として知られている場合がある。
【0081】
非共有結合基は、静電気的相互作用、例えばイオン相互作用、水素結合、及びハロゲン結合；ファンデルワールス相互作用、例えば永続性の双極子間相互作用、双極子誘導型の双極子相互作用、及び誘導双極子誘導型の双極子相互作用；並びにΠ効果、例えばΠ－Π相互作用、Π－カチオン相互作用、及び極性－Π相互作用を介して、標的核酸に結合し得る。
【0082】
非共有結合基は、以下の低分子核酸結合分子に基づき得る。
【表1】
【0083】
非共有結合基は、任意の適切な位置でリンカーに結合することができる。典型的には、非共有結合基は、ヘテロ原子（Ｏ若しくはＮＨなど）を介してリンカーに結合しているか、又はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）に隣接している。
【0084】
好ましくは、結合基は、式（Ｂ－Ｉ）～（Ｂ－III）から選択される。
【0085】
動態特性
分解剤と標的核酸との間の相互作用は、解離定数（ｋＤ）を使用して定量することができる。所与の非共有結合基を含む分解剤と核酸との間の解離定数は公知であり得るか、又は、この定数は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、surface plasmon resonance）、例えばBiacore（Santos et al., 2021）などの標準的な技術を使用して決定することができる。解離定数を測定するための適切なシステムには、Biacore T200が含まれる。
分解剤と標的核酸との間の相互作用は、解離定数（ｋＤ）を使用して定量することができる。所与の非共有結合基を含む分解剤と核酸との間の解離定数は公知であり得るか、又は、この定数は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、surface plasmon resonance）、例えばBiacore（Santos et al., 2021）などの標準的な技術を使用して決定することができる。解離定数を測定するための適切なシステムには、Biacore T200が含まれる。
【0086】
典型的には、分解剤は、例えばＳＰＲによって決定すると、１００００ｎＭ以下の解離定数（ｋＤ）で標的核酸に結合する。好ましくは、分解剤は、１０００ｎＭ以下、さらに好ましくは５００ｎＭ以下、さらに好ましくは２００ｎＭ以下、そして最も好ましくは１００ｎＭ以下のｋＤで標的核酸に結合する。
【0087】
上記のように、分解剤の非共有結合基は、典型的には、標的核酸内の二次構造又は三次構造に結合する。したがって、分解剤は、例えばＳＰＲによって決定すると、典型的には、１００００ｎＭ以下の解離定数（ｋＤ）で二次構造又は三次構造に結合する。好ましくは、分解剤は、１０００ｎＭ以下、さらに好ましくは５００ｎＭ以下、さらに好ましくは２００ｎＭ以下、そして最も好ましくは１００ｎＭ以下のｋＤで二次構造又は三次構造に結合する。
【0088】
一部の実施形態では、分解剤は、例えばＳＰＲによって決定すると、１００００ｎＭ以下の解離定数（ｋＤ）で四重鎖に結合する。このようなケースでは、分解剤は、好ましくは、１０００ｎＭ以下、さらに好ましくは５００ｎＭ以下、さらに好ましくは２００ｎＭ以下、そして最も好ましくは１００ｎＭ以下のｋＤで四重鎖に結合する。
【0089】
一部の実施形態では、分解剤は、例えばＳＰＲによって決定すると、１００００ｎＭ以下の解離定数（ｋＤ）でシュードノットに結合する。このようなケースでは、分解剤は、好ましくは、１０００ｎＭ以下、さらに好ましくは５００ｎＭ以下、さらに好ましくは２００ｎＭ以下、そして最も好ましくは１００ｎＭ以下のｋＤでシュードノットに結合する。
【0090】
追加の又は代替的な実施形態では、分解剤は、例えばマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ、microscale thermophoresis）によって決定すると、１００ｍＭ以下の解離定数（ｋＤ）で標的核酸に結合する。このようなケースでは、ｋＤは、５０ｍＭ以下、例えば２５ｍＭ以下、例えば２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば１０ｍＭ以下、例えば９ｍＭ以下、例えば８ｍＭ以下、例えば７ｍＭ以下、例えば６ｍＭ以下、例えば５ｍＭ以下、例えば４ｍＭ以下、例えば３ｍＭ以下、例えば２ｍＭ以下であり得る。好ましくは、分解剤は、１０ｍＭ以下、さらに好ましくは５ｍＭ以下の解離定数（ｋＤ）で標的核酸に結合する。
【0091】
ｋＤは、例えば以下の実施例で記載されているように、標準的な技術を使用して、例えばマイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）によって、決定することができる。測定は、分解剤とインキュベートされる、蛍光でタグ付けされた核酸、例えばＦＡＭ機能化核酸を使用して行うことができる。核酸は５０ｎＭの濃度であり得、バッファー、例えばｐＨ７．４のＨＥＰＥＳバッファー中で提供してよい。分解剤は、最大８ｍＭ、例えば最大２５０μＭの最大濃度で、連続希釈で試験することができる。測定は、２５℃の温度で行うことができる。ＭＳＴ測定は、３０％のＭＳＴ出力で行うことができる。解離定数を測定するための適切なシステムには、NanoTemper Monolith NT.115が含まれる。
【0092】
好ましくは、分解剤は、２０ｎＭ以下、さらに好ましくは１５ｎＭ以下、さらに好ましくは１０ｍＭ以下、さらに好ましくは５ｍＭ以下のｋＤで標的核酸内の二次構造又は三次構造に結合する。
【0093】
一部の実施形態では、分解剤は、２０ｍＭ以下、さらに好ましくは１５ｍＭ以下、さらに好ましくは１０ｍＭ以下、さらに好ましくは５ｍＭ以下、そして最も好ましくは２ｍＭ以下の解離定数（ｋＤ）でシュードノットに結合する。
【0094】
さらに、又は或いは、分解剤と標的核酸との間の相互作用は、５０％最大有効定数（ＥＣ５０）を使用して定量することができる。ＥＣ５０は解離定数（ｋＤ）と同一であり得るか、又はＥＣ５０は異なっていてもよい。ＥＣ５０についての優先傾向は、解離定数（ｋＤ）について上記で記載した通りである。
【0095】
所与の非共有結合基を含む分解剤と核酸との間の５０％最大有効定数（ＥＣ５０）は公知であるか、又は、例えば蛍光クエンチングアッセイを使用して実験的に決定することができる（Di Antonio et al., 2012、及び以下の実施例で記載されている方法を参照されたい）。ＥＣ５０を測定するための適切なシステムとしては、蛍光を測定するためのシステム、例えばプレートリーダー、例えばBMG CLARIOstarが挙げられる。核酸は、蛍光でタグ付けされた核酸であり得、これは、例えば４℃の温度でのインキュベーションで、例えば４０分の時間にわたり、分解剤で処理され得る。測定は、２５℃の温度で行うことができる。核酸の濃度は５０ｎＭであり得、場合によって、核酸は、ｐＨ７．４のＨＥＰＥＳバッファーなどのバッファー中にあってもよい。分解剤の濃度は、分解剤をおよそ２ｎＭからおよそ１０μＭまでの連続希釈で処理するなど、最大１０μＭであり得る。
【0096】
典型的には、分解剤は、例えば蛍光クエンチングアッセイによって決定すると、１００００ｎＭ以下の５０％最大有効定数（ＥＣ５０）で標的核酸に結合する。好ましくは、分解剤は、１０００ｎＭ以下、さらに好ましくは５００ｎＭ以下、さらに好ましくは２００ｎＭ以下、そして最も好ましくは１００ｎＭ以下のＥＣ５０で標的核酸に結合する。
【0097】
上記のように、分解剤の非共有結合基は、典型的には、標的核酸内の二次構造又は三次構造に結合する。したがって、分解剤は、典型的には、１００００ｎＭ以下の５０％最大有効定数（ＥＣ５０）で二次構造又は三次構造に結合する。好ましくは、分解剤は、１０００ｎＭ以下、さらに好ましくは５００ｎＭ以下、さらに好ましくは２００ｎＭ以下、そして最も好ましくは１００ｎＭ以下のＥＣ５０で二次構造又は三次構造に結合する。
【0098】
一部の実施形態では、分解剤は、例えば本明細書で記載される蛍光クエンチングアッセイによって決定すると、１００００ｎＭ以下の５０％最大有効定数（ＥＣ５０）で四重鎖に結合する。このようなケースでは、分解剤は、好ましくは、１０００ｎＭ以下、さらに好ましくは５００ｎＭ以下、さらに好ましくは２００ｎＭ以下、最も好ましくは１００ｎＭ以下のＥＣ５０で四重鎖に結合する。
【0099】
一部の実施形態では、分解剤は、例えば本明細書で記載される蛍光クエンチングアッセイによって決定すると、１００００ｎＭ以下の５０％最大有効定数（ＥＣ５０）でシュードノットに結合する。このようなケースでは、分解剤は、好ましくは、１０００ｎＭ以下、さらに好ましくは５００ｎＭ以下、さらに好ましくは２００ｎＭ以下、そして最も好ましくは１００ｎＭ以下のＥＣ５０でシュードノットに結合する。
【0100】
一部の実施形態では、分解剤は、１００ｍＭ以下、例えば５０ｍＭ以下、例えば２５ｍＭ以下、例えば２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、例えば１０ｍＭ以下、例えば９ｍＭ以下、例えば８ｍＭ以下、例えば７ｍＭ以下、例えば６ｍＭ以下、例えば５ｍＭ以下、例えば４ｍＭ以下、例えば３ｍＭ以下、例えば２ｍＭ以下の５０％最大有効定数（ＥＣ５０）で標的核酸に結合する。好ましくは、分解剤は、１０ｍＭ以下、さらに好ましくは５ｍＭ以下の５０％最大有効定数（ＥＣ５０）で標的核酸に結合する。
【0101】
好ましくは、分解剤は、２０ｎＭ以下、さらに好ましくは１５ｎＭ以下、さらに好ましくは１０ｍＭ以下、さらに好ましくは５ｍＭ以下の５０％最大有効定数（ＥＣ５０）で標的核酸内の二次構造又は三次構造に結合する。
【0102】
一部の実施形態では、分解剤は、２０ｍＭ以下、例えば１５ｍＭ以下、さらに好ましくは１０ｍＭ以下、さらに好ましくは５ｍＭ以下、最も好ましくは２ｍＭ以下の５０％最大有効定数（ＥＣ５０）でシュードノットに結合する。
【0103】
上記のように、分解剤の非共有結合基は、好ましくは、標的核酸内の二次構造又は三次構造に選択的に結合する。結合選択性は、直鎖状の又は構造化されていない核酸、例えば直鎖状の又は構造化されていないＲＮＡへの結合の解離定数に対する、所与の二次構造又は三次構造への結合の解離定数の比率を使用して定量化することができる。典型的には、比較用の直鎖状の又は構造化されていない核酸は、所望の二次構造又は三次構造内の１又は２以上の残基を変異させて、配列の残り部分は維持しながら二次構造又は三次構造が形成されないようにすることによって、調製される。例えば、ＲＮＡのＧ四重鎖への結合の選択性は、１又は２以上のGGGモチーフがAUCモチーフに変わっている比較用のＲＮＡを使用することによって評価することができる。
【0104】
典型的には、所与の二次構造又は三次構造と直鎖状の又は構造化されていない核酸との間の結合選択性は、「５：１」以上である。好ましくは、所与の二次構造又は三次構造と直鎖状の又は構造化されていない核酸との間の選択性は、「１０：１」以上、さらに好ましくは「２０：１」以上、さらに好ましくは「５０：１」以上、そして最も好ましくは「１００：１」以上である。
【0105】
一実施形態では、四重鎖と直鎖状の又は構造化されていない核酸との間の結合選択性は、「５：１」以上である。好ましくは、四重鎖と直鎖状の又は構造化されていない核酸との間の選択性は、「１０：１」以上、さらに好ましくは「２０：１」以上、さらに好ましくは「５０：１」以上、そして最も好ましくは「１００：１」以上である。
【0106】
一実施形態では、四重鎖と直鎖状の又は構造化されていない核酸との間の結合選択性は、「５：１」以上である。好ましくは、四重鎖と直鎖状の又は構造化されていない核酸との間の選択性は、「１０：１」以上、さらに好ましくは「２０：１」以上、さらに好ましくは「５０：１」以上、そして最も好ましくは「１００：１」以上である。
【0107】
好ましい実施形態
好ましい実施形態では、分解剤は、化合物Ｄｅｇ－Ｉ～Ｄｅｇ－Ｖから選択される。
好ましい実施形態では、分解剤は、化合物Ｄｅｇ－Ｉ～Ｄｅｇ－Ｖから選択される。
【表2】
【0108】
塩及び溶媒和物
式（Ｉ）の分解剤は、遊離塩基形態で提供され得る。
式（Ｉ）の分解剤は、遊離塩基形態で提供され得る。
【0109】
式（Ｉ）の分解剤は、塩、好ましくは薬学的に許容される塩の形態で提供され得る。
【0110】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている分解剤は、適切なカウンターアニオンを伴うプロトン化された形態の塩として提供され得る。
【0111】
適切な対イオンには、有機アニオン及び無機アニオンの両方が含まれる。無機アニオンの例としては、クロライド（Ｃｌ－）、ブロマイド（Ｂｒ－）、ヨード（Ｉ－）、スルフェート（ＳＯ４
２－）、スルファイト（ＳＯ３
２－）、ニトレート（ＮＯ３
－）、ニトライト（ＮＯ２
－）、ホスフェート（ＰＯ４
３－）、及びホスファイト（ＰＯ３
３－）を含む、無機酸から誘導されるものが含まれる。有機のアニオンの例としては、２－アセトキシベンゾエート（2-acetoxybenzoate）、アセテート（acetate）、アスコルベート（ascorbate）、アスパルテート（aspartate）、ベンゾエート（benzoate）、カンファースルホネート（camphorsulfonate）、シンナメート（cinnamate）、シトレート（citrate）、エデテート（edetate）、エタンジスルホネート（ethanedisulfonate）、エタンスルホネート（ethanesulfonate）、ホルメート（formate）、フマレート（fumarate）、グルコネート（gluconate）、グルタメート（glutamate）、グリコレート（glycolate）、ヒドロキシマレート（hydroxymalate）、カルボキシレート（carboxylate）、ラクテート（lactate）、ラウレート（laurate）、ラクテート（lactate）、マレエート（maleate）、マレート（malate）、メタンスルホネート（methanesulfonate）、オレエート（oleate）、オキサレート（oxalate）、パルミテート（palmitate）、フェニルアセテート（phenylacetate）、フェニルスルホネート（phenylsulfonate）、プロピオネート（propionate）、ピルベート（pyruvate）、サリチレート（salicylate）、ステアレート（stearate）、スクシネート（succinate）、スルファニレート（sulfanilate）、タータレート（tartarate）、トルエンスルホネート（toluenesulfonate）、及びバレレート（valerate）が含まれる。適切なポリマー性有機アニオンの例としては、タンニン酸及びカルボキシメチルセルロースから誘導されるものが含まれる。
【0112】
一部の実施形態では、本明細書で開示されている分解剤は、適切なカウンターカチオンを伴う脱プロトン化された形態の塩として提供され得る。
【0113】
適切な対イオンには、無機カチオン及び有機カチオンの両方が含まれる。適切な無機カチオンの例としては、Ｎａ＋及びＫ＋などのアルカリ金属イオン、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋などのアルカリ土類カチオン、並びにＡｌ３＋などの他のカチオンが含まれる。適切な有機カチオンの例としては、アンモニウムイオン（すなわちＮＨ４
＋）及び置換されたアンモニウムイオン（例えば、ＮＨ３Ｒ＋、ＮＨ２Ｒ２
＋、ＮＨＲ３
＋、ＮＲ４
＋）が含まれる。置換されたアンモニウムイオンの例としては、エチルアミン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミンから誘導されるもの、並びに、リジン及びアルギニンなどのアミノ酸が含まれる。置換されたアンモニウムイオンの追加の又は代替的な例としては、プトレシン及びスペルミジンから誘導されるもの、又はテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ、tetramethylethylenediamine）などの多価アミンが含まれる。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、Ｎ（ＣＨ３）４
＋である。
【0114】
式（Ｉ）の分解剤は、溶媒和物（溶質（例えば、化合物、化合物の塩）及び溶媒の複合体）の形態で提供され得る。溶媒和物の例としては、水和物、例えば、一水和物、二水和物、及び三水和物が含まれる。
【0115】
式（Ｉ）の分解剤は、脱溶媒された形態、例えば脱水された形態で提供され得る。
【0116】
標的核酸で切断するための方法
本発明は、標的核酸分子を切断するための方法を提供する。本方法は、
標的核酸分子を、式（Ｉ）の分解剤：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、分解剤が標的核酸分子に非共有結合するための非共有結合基である）
と接触させるステップ、及び
分解剤に、それに結合した標的核酸分子を切断させるステップ
を含む。
本発明は、標的核酸分子を切断するための方法を提供する。本方法は、
標的核酸分子を、式（Ｉ）の分解剤：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、分解剤が標的核酸分子に非共有結合するための非共有結合基である）
と接触させるステップ、及び
分解剤に、それに結合した標的核酸分子を切断させるステップ
を含む。
【0117】
式（Ｉ）の分解剤の好ましい実施形態は、上記で示されている。
【0118】
一部の実施形態では、標的核酸分子を、溶液中で分解剤と接触させてもよい。
【0119】
さらに好ましくは、標的核酸分子を、細胞の内部で（すなわち細胞内で）分解剤と接触させてもよい。細胞はインビトロであり得、また、単離された細胞、例えば、個体から（生検などの組織試料から）単離された、単離された細胞又は細胞株であり得る。
【0120】
適切な細胞には、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞が含まれ得る。細胞には体細胞及び生殖系細胞が含まれ得、また、細胞は任意の発生段階であり得、これには、成体幹細胞又は体性幹細胞、胎児幹細胞又は胚性幹細胞などの幹細胞を含む、完全に若しくは部分的に分化した細胞又は非分化細胞又は多能性細胞が含まれる。例えば、細胞には、ニューロン及びグリア細胞を含む神経細胞、収縮性筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、ホルモン合成細胞、脂腺細胞、膵島細胞、副腎皮質細胞、線維芽細胞、ケラチン生成細胞、内皮細胞及び尿路上皮細胞、骨細胞、並びに軟骨細胞が含まれ得る。一部の実施形態では、細胞は、疾患状態に関連し得、例えば、癌細胞、肉腫細胞、リンパ腫細胞、芽細胞腫細胞、又は生殖系腫瘍細胞などのがん細胞、及び、ハンチントン病、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、フェニルケトン尿症、ダウン症、又はマルファン症候群などの遺伝障害の遺伝子型を有する細胞であり得る。
【0121】
標的核酸分子は、細胞内に存在する内因性核酸であり得る。分解剤は外因性分子であり得る。本方法は、分解剤を細胞に導入するステップ、及び分解剤を標的核酸分子に結合させるステップを含み得る。
【0122】
標的核酸分子は、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子であり得る。適切な標的ＲＮＡ分子には、ｍＲＮＡ及び長鎖の非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ、long non-coding RNA）が含まれ得る。ＲＮＡ分子は、イントロン領域及び遺伝子間領域を含み得る。
【0123】
標的核酸分子は、二次構造又は三次構造を含み得る。適切な二次構造及び三次構造には、四重鎖、シュードノット、テトラループ、ステップループ、及びヘアピンループが含まれる。好ましくは、標的核酸分子は、四重鎖又はシュードノットを含む。
【0124】
例えば、二次構造又は三次構造を含む標的核酸を切断するための方法は、
標的核酸分子を、式（Ｉ）の分解剤：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、二次構造又は三次構造と相互作用して分解剤を標的核酸分子に非共有結合させる非共有結合基である）
と接触させるステップステップ、及び
分解剤に、それに結合した標的核酸分子を切断させるステップ
を含み得る。
標的核酸分子を、式（Ｉ）の分解剤：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、二次構造又は三次構造と相互作用して分解剤を標的核酸分子に非共有結合させる非共有結合基である）
と接触させるステップステップ、及び
分解剤に、それに結合した標的核酸分子を切断させるステップ
を含み得る。
【0125】
好ましい実施形態では、二次構造又は三次構造は四重鎖である。このようなケースでは、本方法は、
四重鎖を含む標的核酸分子を、式（Ｉ）の分解剤：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、四重鎖と相互作用して分解剤を標的核酸分子に非共有結合させる非共有結合基である）
と接触させるステップ、及び、
分解剤に、それに結合した標的核酸分子を切断させるステップ
を含み得る。
四重鎖を含む標的核酸分子を、式（Ｉ）の分解剤：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、四重鎖と相互作用して分解剤を標的核酸分子に非共有結合させる非共有結合基である）
と接触させるステップ、及び、
分解剤に、それに結合した標的核酸分子を切断させるステップ
を含み得る。
【0126】
好ましい実施形態では、二次構造又は三次構造はシュードノットである。このようなケースでは、本方法は、
シュードノットを含む標的核酸分子を、式（Ｉ）の分解剤：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、シュードノットと相互作用して分解剤を標的核酸分子に非共有結合させる非共有結合基である）
と接触させるステップ、及び、
分解剤に、それに結合した標的核酸分子を切断させるステップ
を含み得る。
シュードノットを含む標的核酸分子を、式（Ｉ）の分解剤：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、シュードノットと相互作用して分解剤を標的核酸分子に非共有結合させる非共有結合基である）
と接触させるステップ、及び、
分解剤に、それに結合した標的核酸分子を切断させるステップ
を含み得る。
【0127】
標的核酸分子に非共有結合すると、分解剤は標的核酸を切断する。典型的には、分解剤は、標的核酸内の１又は２以上のホスホジエステル結合を切断する。
【0128】
標的核酸分子に非共有結合すると、切断基は、標的核酸内のヌクレオチドの２’ＯＨからタンパク質を取り除き得る。ホスホジエステル骨格の切断は、３’位のリン酸基への分子内攻撃によって生じ得る。
【0129】
標的核酸分子に非共有結合すると、切断基は、１又は２以上の遷移金属（例えば銅）に結合し得る。分解剤は、銅を介する核酸分解を通して標的核酸を切断することができる。
【0130】
標的核酸への分解剤の結合は、中間種を介して進行し得る。すなわち、標的核酸分子は、標的核酸分子を分解剤に結合させて、式：
Ｃ－Ｌ－Ｂ～ＮＡ
（式中、－Ｃは、１～３のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは非共有結合基であり、～は非共有結合による相互作用であり、ＮＡは標的核酸である）
を有する中間体を生成させるステップ、及び
分解剤に標的核酸分子を切断させるステップ
を含む方法によって、本明細書で記載されるように切断され得る。
Ｃ－Ｌ－Ｂ～ＮＡ
（式中、－Ｃは、１～３のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは非共有結合基であり、～は非共有結合による相互作用であり、ＮＡは標的核酸である）
を有する中間体を生成させるステップ、及び
分解剤に標的核酸分子を切断させるステップ
を含む方法によって、本明細書で記載されるように切断され得る。
【0131】
式（Ｉ）の分解剤の好ましい実施形態は、上記で示されている。
【0132】
二次構造又は三次構造を同定するための方法
上記の分解剤による標的核酸分子の選択的な切断の後、本方法は、標的核酸分子を同定するステップを含み得る。これは、例えば、核酸内の二次構造又は三次構造を含む部位のマッピングにおいて有用であり得る。
上記の分解剤による標的核酸分子の選択的な切断の後、本方法は、標的核酸分子を同定するステップを含み得る。これは、例えば、核酸内の二次構造又は三次構造を含む部位のマッピングにおいて有用であり得る。
【0133】
本方法はまた、核酸集団内の１又は２以上の核酸分子の存在量又は量を決定するステップを含んでいてもよい。コントロールと比較した、集団内の核酸分子の存在量又は量の減少は、核酸分子が、分解剤によって選択的に切断された標的核酸分子である、ということを示している。適切なコントロールは、分解剤で処理されていない核酸の集団であり得る。
【0134】
したがって、本発明は、標的核酸分子内の二次構造又は三次構造を同定するための方法であって、
第１及び第２の核酸分子集団を提供するステップであって、前記の各集団が前記標的核酸分子を含む、前記ステップ、
第１の核酸分子集団に、式（Ｉ）の分解剤：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、分解剤が標的核酸分子に非共有結合するための非共有結合基である）
を導入するステップ、
分解剤に、第１の集団に存在する標的核酸分子を切断させるステップ、並びに
第２の集団よりも第１の集団において少ない量で存在している核酸分子を同定するステップ
を含む、方法を提供する。
第１及び第２の核酸分子集団を提供するステップであって、前記の各集団が前記標的核酸分子を含む、前記ステップ、
第１の核酸分子集団に、式（Ｉ）の分解剤：
Ｃ－Ｌ－Ｂ（Ｉ）
（式中、－Ｃは、１～３個のＣ１－６アルキル基で置換されていてもよいイミダゾールである切断基であり、－Ｌ－はリンカーであり、－Ｂは、分解剤が標的核酸分子に非共有結合するための非共有結合基である）
を導入するステップ、
分解剤に、第１の集団に存在する標的核酸分子を切断させるステップ、並びに
第２の集団よりも第１の集団において少ない量で存在している核酸分子を同定するステップ
を含む、方法を提供する。
【0135】
式（Ｉ）の分解剤の好ましい実施形態は、上記で示されている。
【0136】
非共有結合基は、標的核酸分子内の二次構造又は三次構造に結合し得る。適切な二次構造又は三次構造としては、四重鎖、シュードノット、テトラループ、ステップループ、及びヘアピンループが含まれる。好ましくは、二次構造又は三次構造は、四重鎖又はシュードノットである。
【0137】
第１及び第２の核酸分子集団は、独立して、単離された（エクスビボで）核酸分子集団であり得る。或いは、核酸分子集団の１又は２以上は、細胞内に存在し得る。
【0138】
本方法は、全核酸、例えば全ＤＮＡ又は全ＲＮＡを細胞から抽出するステップを含み得る。核酸は、例えば、１又は２以上の核酸分子の存在量又は量を決定するために、さらに分析され得る。例えば、抽出された全核酸はシーケンシングされ得、シーケンスリードが分析され得る。
【0139】
細胞内の核酸分子の存在量又は量を決定する適切な方法は当技術分野において周知であり、当該方法としては、ＲＴ－ｑＰＣＲ、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ、RNA-sequencing）、次世代シーケンシング（ＮＧＳ、next generation sequencing）、ナノポアシーケンシング、並びに他のシーケンシング技術、例えばサンガーシーケンシング、デコンポジションによるインデルのトラッキング（ＴＩＤＥ、Tracking Indels by DEcomposition）（Brinkman et al Nucleic Acids Res. 2014 Dec 16; 42(22)： e168）、及びＰＣＲ分析が含まれる。一部の実施形態では、方法は、核酸分子を細胞から抽出するステップ、抽出された核酸分子をシーケンシングするステップ、及び、それぞれの抽出された核分子についてのシーケンスリードの数（すなわちリードカウント）を決定して、細胞内の各核酸分子の存在量又は量を決定するステップを含み得る。一部の実施形態では、生のリードカウントを正規化し、ＲＰＫＭ（１００万リード当たりの、１キロベースのエクソンモデル当たりのリード数、reads per kilobase of exon model per million reads）又はＦＰＫＭ（マッピングした１００万リード当たりの、１キロベースのエクソンモデル当たりの断片数、fragments per kilobase of exon model per million reads mapped）で表してもよい。シーケンシング及び配列分析の適切な方法は、当技術分野において良く確立されている。
【0140】
医薬における使用
上記の分解剤による標的核酸分子の選択的な切断は、標的核酸分子の下流効果を変化させ得る。このことは、例えば、標的核酸分子が介在する疾患の治療又は予防において有用であり得る。
上記の分解剤による標的核酸分子の選択的な切断は、標的核酸分子の下流効果を変化させ得る。このことは、例えば、標的核酸分子が介在する疾患の治療又は予防において有用であり得る。
【0141】
したがって、本発明は、療法によるヒト又は動物の身体の治療方法における使用のための、例えば、障害（例えば疾患）の治療方法における使用のための、式（Ｉ）の分解剤を提供する。
【0142】
本発明の別の態様は、治療有効量の式（Ｉ）の分解剤を、治療を必要とする対象に投与するステップを含む、治療方法、例えば、障害（例えば疾患）の治療方法に関する。
【0143】
本発明の別の態様は、障害（例えば疾患）の治療において使用するための医薬品の製造における、式（Ｉ）の分解剤の使用に関する。典型的には、医薬品は、式（Ｉ）の分解剤を含む。
【0144】
治療対象の障害
（例えば、治療の方法における使用の、医薬品の製造における使用の、治療の方法の）一実施形態では、治療は、細菌感染又はウイルス感染の治療である。
（例えば、治療の方法における使用の、医薬品の製造における使用の、治療の方法の）一実施形態では、治療は、細菌感染又はウイルス感染の治療である。
【0145】
好ましくは、ウイルス感染は、ＲＮＡウイルス（例えば、ウイルスゲノムが一本鎖又は二本鎖ＲＮＡを有するウイルス）への感染である。多くの病原性ウイルスは、タンパク質の正確な翻訳のためのメカニズムとして－１のリボソームフレームシフトを利用し、この現象は、ステムループ及びシュードノットなどの二次ＲＮＡ構造によって可能となる。したがって、式（Ｉ）の分解剤でこれらの二次ＲＮＡ構造を標的化することで、ウイルスＲＮＡを切断及び不活化することができ、ウイルス感染を治療することができる。
【0146】
ＲＮＡウイルスの例としては、コロナウイルス、ピコルナウイルス、及びトガウイルスなどの（＋）ｓｓＲＮＡウイルス；オルソミクソウイルス及びラブドウイルスなどの（－）ｓｓＲＮＡウイルス；並びにレオウイルスなどのｄｓＲＮＡウイルスが含まれる。
【0147】
好ましくは、ウイルスは、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス、さらに好ましくはコロナウイルスである。コロナウイルスの例としては、伝染性胃腸炎ウイルス、ネココロナウイルス、イヌコロナウイルスなどのアルファコロナウイルス；中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、middle east respiratory syndrome-related coronavirus）、マウスコロナウイルス（Ｍ－ＣｏＶ、murine coronavirus）、及び重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、severe acute respiratory syndrome-related coronavirus）などのベータコロナウイルス；鳥類コロナウイルスなどのガンマコロナウイルス；並びにヒヨドリコロナウイルスＨＫＵ１１及びブタコロナウイルスＨＫＵ１５などのデルタコロナウイルスが含まれる。
【0148】
細菌感染は、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌への感染であり得る。いずれのクラスの細菌も、タンパク質ユニット及びＲＮＡユニットの両方を含むリボ酵素である細菌リボソームを有する。したがって、式（Ｉ）の分解剤でＲＮＡユニットを標的化することで、細菌リボソームを切断及び不活化することができ、細菌感染を治療することができる。
【0149】
医学的に関連するグラム陰性細菌の例としては、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、及びシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）（これらは主に、呼吸器の問題に関連する）；大腸菌（Escherichia coli）及びエンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）（これらは主に、泌尿器の問題に関連する）；並びにヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）及びサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）（これらは主に、胃腸の問題に関連する）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）（これは主に、髄膜炎に関連する）が含まれる。
【0150】
したがって、一実施形態では、グラム陰性細菌種は、大腸菌、エンテロバクター・クロアカ、ヘリコバクター・ピロリ、サルモネラ・エンテリカ、インフルエンザ菌、クレブシエラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、緑膿菌（P. aeruginosa）、及び髄膜炎菌からなる群から選択される。
【0151】
医学的に関連するグラム陽性細菌の例としては、アクチノマイセス属（actinomyces）、バチルス属（bacillus）、クロストリジウム属（clostridium）、コリネバクテリウム属（corynebacterium）（例えば、ジフテリア菌（corynebacterium diphtheriae））、エンテロコッカス属（enterococcus）、エリジペロスリックス属（erysipelothrix）、リステリア属（listerial）（例えば、リステリア・モノサイトゲネス（listeria monocytogenes））、ノカルジア属（nocardia）、ブドウ球菌属（staphylococcal）、及び連鎖球菌属（streptococcal）（例えば、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））が含まれる。
【0152】
したがって、一実施形態では、グラム陰性細菌の属は、アクチノマイセス属、バチルス属、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、エンテロコッカス属、エリジペロスリックス属、リステリア属、ノカルジア属、ブドウ球菌属、及び連鎖球菌属からなる群から選択される。
【0153】
（例えば、治療の方法における使用の、医薬品の製造における使用の、治療の方法の）一実施形態では、治療は、気道感染、尿路感染、又は胃腸炎の治療である。
【0154】
（例えば、治療の方法における使用の、医薬品の製造における使用の、治療の方法の）一部の追加の又は代替的な実施形態では、治療は、がんの治療である。がんは、関連するがん遺伝子が分かっている、又は、関連するがん遺伝子が二次構造若しくは三次構造を形成していると予想されるか若しくは形成するのに適していると予想される、又は、関連するがん遺伝子が、本明細書で記載される四重鎖若しくはシュードノット構造などの二次構造若しくは三次構造を有する核酸を発現しているがん遺伝子である、がんであり得る。
【0155】
がんなどの治療対象の疾患は、とりわけ神経芽細胞腫ＲＡＳ（ＮＲＡＳ、neuroblastoma RAS）、転移関連肺腺がん転写産物１（ＭＡＬＡＴ１、metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1）、ＥＷＳ ＲＮＡ結合タンパク質１（ＥＷＳＲ１、EWS RNA Binding Protein 1）、テロメアリピート含有ＲＮＡ（ＴＥＲＲＡ、telomeric repeat containing RNA）、Ｂ細胞リンパ腫エクストララージ（ＢＣＬ－ＸＬ、B-cell lymphoma-extra large）、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ、fibroblast growth factor receptor）、及びＭｉｃｒｏＲＮＡ ２１（ＭＩＲ２１、MicroRNA 21）の発現、又は調節の変化（例えば上方調節）に関連し得る。
【0156】
治療対象の患者
（例えば、治療の方法における使用の、医薬品の製造における使用の、治療の方法の）一実施形態では、治療は、治療を必要とする対象に投与される。
（例えば、治療の方法における使用の、医薬品の製造における使用の、治療の方法の）一実施形態では、治療は、治療を必要とする対象に投与される。
【0157】
治療を必要とする対象（患者）は、脊索動物、脊椎動物、哺乳動物、有胎盤哺乳動物、有袋類（例えば、カンガルー、ウォンバット）、齧歯動物（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科動物（例えばマウス）、ウサギ目動物（例えばウサギ）、鳥類（例えばトリ）、イヌ科動物（例えばイヌ）、ネコ科動物（例えばネコ）、ウマ科動物（例えばウマ）、ブタ類動物（例えばブタ）、ヒツジ類動物（例えばヒツジ）、ウシ属動物（例えばウシ）、霊長類動物、形類人猿動物（例えば、サル若しくはサル科動物）、サル（例えば、マーモセット、ヒヒ）、サル科動物（例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）、又はヒトであり得る。
【0158】
治療を必要とする対象は、成体又は若年であり得る。
【0159】
好ましくは、治療を必要とする対象は、ヒト、さらに好ましくは成体のヒトである。
【0160】
或いは、治療を必要とする対象は、実験研究で使用される非ヒト動物である。好ましくは、非ヒト動物は、齧歯動物（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）である。
【0161】
投与経路
（例えば、治療方法における使用の、医薬品の製造における使用の、治療方法の）一実施形態では、治療は、全身的に／末梢に、又は局所的に（すなわち、所望の作用のある部位で）、任意の都合の良い投与経路によって投与される。
（例えば、治療方法における使用の、医薬品の製造における使用の、治療方法の）一実施形態では、治療は、全身的に／末梢に、又は局所的に（すなわち、所望の作用のある部位で）、任意の都合の良い投与経路によって投与される。
【0162】
投与経路は、経口経路（例えば摂取による）；口腔内経路；舌下経路；経皮経路（例えば、パッチ、膏薬などによるものを含む）；経粘膜経路（例えば、パッチ、膏薬などによるものを含む）；鼻腔内経路（例えば経鼻スプレーによる）；眼経路（例えば点眼薬による）；肺経路（例えばエアロゾルを介する、例えば口又は鼻を通しての、例えば吸入又は吹送療法による）；直腸経路（例えば、坐剤又は浣腸による）；膣経路（例えばペッサリーによる）；皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、静脈内注射、動脈内注射、心臓内注射、髄腔内注射、脊髄内注射、嚢内注射、被膜下注射、眼窩内注射、腹腔内注射、気管内注射、表皮下注射、関節内注射、くも膜下注射、及び胸骨内注射を含む注射による非経口経路；例えば皮下又は筋肉内へのデポ又はリザーバーのインプラントによる非経口経路であり得る。
【0163】
製剤
（例えば、治療の方法における使用の、医薬品の製造における使用の、治療の方法の）一実施形態では、式（Ｉ）の分解剤は、単独で投与される。典型的には、しかし、本明細書で記載される少なくとも１つの分解剤を含む薬学的製剤（例えば、組成物、調製物、医薬品）中の分解剤は、限定はしないが、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、充填剤、バッファー、防腐剤、抗酸化剤、潤滑剤、安定剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば湿潤剤）、マスキング剤、着色剤、着香剤、及び甘味料を含む、当業者に周知の１又は２以上の他の薬学的に許容される成分と共に存在することが好ましい。製剤は、他の活性薬剤、例えば他の治療的置又は予防的薬剤をさらに含み得る。
（例えば、治療の方法における使用の、医薬品の製造における使用の、治療の方法の）一実施形態では、式（Ｉ）の分解剤は、単独で投与される。典型的には、しかし、本明細書で記載される少なくとも１つの分解剤を含む薬学的製剤（例えば、組成物、調製物、医薬品）中の分解剤は、限定はしないが、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、アジュバント、充填剤、バッファー、防腐剤、抗酸化剤、潤滑剤、安定剤、可溶化剤、界面活性剤（例えば湿潤剤）、マスキング剤、着色剤、着香剤、及び甘味料を含む、当業者に周知の１又は２以上の他の薬学的に許容される成分と共に存在することが好ましい。製剤は、他の活性薬剤、例えば他の治療的置又は予防的薬剤をさらに含み得る。
【0164】
したがって、本発明はさらに、医薬組成物、及び、本明細書で記載されている少なくとも１つの分解剤を当業者に周知の１又は２以上の他の薬学的に許容される成分、例えば、担体、希釈剤、賦形剤などと混合するステップを含む、医薬組成物を作製する方法を提供する。個別の単位として製剤された場合（例えば錠剤など）、各単位は、所定の量（投与量）の化合物を含有する。
【0165】
「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、妥当なベネフィット／リスク比に見合った、確かな医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症も伴わずに、問題となっている対象（例えばヒト）の組織と接触させての使用に適している、化合物、成分、材料、組成物、投与形態などに関する。各担体、希釈剤、賦形剤などは、製剤の他の成分と適合するという意味でも「許容され」なくてはならない。
【0166】
適切な担体、希釈剤、賦形剤などは、標準的な薬学のテキスト、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990、及びHandbook of Pharmaceutical Excipients, 5th edition, 25 2005で見ることができる。
【0167】
製剤は、調剤学の分野において周知の任意の方法によって調製することができる。このような方法は、分解剤を、１又は２以上の補助成分を構成する担体と一緒にするステップを含む。通常、製剤は、分解剤を担体（例えば、液体担体、細かく砕かれた固体担体など）と均一に混合し、次いで必要に応じて生成物を成形することによって調製され得る。
【0168】
製剤は、速放又は遅放；即時放出、遅延放出、長時間放出、若しくは持続放出；又はこれらの組み合わせをもたらすように調製され得る。
【0169】
製剤は、適切には、液体、溶液（例えば、水性、非水性）、懸濁液（例えば、水性、非水性）、エマルジョン（例えば、水中油型、油中水型）、エリキシル、シロップ、舐薬、マウスウォッシュ、ドロップ、錠剤（例えばコーティング錠を含む）、顆粒、粉末、薬用キャンディー剤、芳香錠、カプセル（例えばハードゼラチンカプセル及びソフトゼラチンカプセルを含む）、カシェ剤、ピル、アンプル、ボーラス、坐剤、ペッサリー、チンキ剤、ゲル、ペースト、軟膏剤、クリーム、ローション、オイル、発泡体、スプレー、ミスト、又はエアロゾルの形態であり得る。
【0170】
製剤は、適切には、１又は２以上の化合物、並びに場合によって、例えば進入増強剤、浸透増強剤、及び吸収増強剤を含む１又は２以上の他の薬学的に許容される成分を染み込ませた、パッチ、接着性膏薬、バンデージ、包帯、又はこれらに類するものとして提供され得る。製剤はまた、適切には、デポ又はリザーバーの形態で提供され得る。
【0171】
分解剤は、１又は２以上の他の薬学的に許容される成分中に溶解していても、懸濁していても、又は当該成分と混合されていてもよい。化合物は、化合物を例えば血液成分又は１若しくは２以上の器官に標的化するように設計されているリポソーム又は他の微粒子内に存在していてもよい。
【0172】
投与量
（例えば、治療方法における使用の、医薬品の製造における使用の、治療方法の）一実施形態では、治療は、治療有効量の式（Ｉ）の分解剤を、治療を必要とする対象に投与するステップを含む。
（例えば、治療方法における使用の、医薬品の製造における使用の、治療方法の）一実施形態では、治療は、治療有効量の式（Ｉ）の分解剤を、治療を必要とする対象に投与するステップを含む。
【0173】
当業者には、本明細書で記載される分解剤、及び分解剤を含む組成物の、適切な投与量が、患者ごとに変化し得ることが理解されよう。最適な投与量の決定は、一般に、あらゆるリスク又は有害な副作用に対する治療利益のレベルのバランスを取ることを伴う。選択された投与量レベルは、限定はしないが、特定の分解剤の活性、投与経路、投与時間、分解剤の排出速度、治療期間、組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／又は材料、障害の重症度、並びに患者の種、性別、年齢、体重、状態、全体的健康、及びこれまでの病歴を含む、様々な因子に応じる。分解剤の量及び投与経路は、最終的には、医師、獣医師、又は臨床医の裁量であるが、一般に、投与量は、大きな有害又は有毒な副作用を生じさせずに所望の効果を達成する、作用部位での局所的濃度を達成するように選択される。
【0174】
投与は、１用量で、治療の過程を通して連続的に又は断続的に（例えば、適切な間隔での分割投与で）行うことができる。投与の最も有効な手段及び投与量を決定する方法は、当業者に周知であり、治療に使用する製剤、治療の目的、治療対象の標的細胞、及び治療の対象で変化する。単回投与又は複数回投与を、治療を担う医師、獣医師、又は臨床医によって選択される用量のレベル及びパターンで行うことができる。
【0175】
通常、分解剤の適切な用量は、１日当たり対象の体重１キログラム当たり約１０μｇ～約２５０ｍｇ（さらに典型的には約１００μｇ～約２５ｍｇ）の範囲である。化合物が塩、エステル、アミド、プロドラッグ、又はこれらに類するものである場合、投与される量は親化合物に基づいて計算され、したがって、使用される実際の重量はそれに比例して増大する。
【0176】
他の優先傾向
上記の実施形態のそれぞれの及び全ての適合した組み合わせは、それぞれの及び全ての組み合わせが個別にかつ明確に記載されているかのように、明確に本明細書で開示されている。
上記の実施形態のそれぞれの及び全ての適合した組み合わせは、それぞれの及び全ての組み合わせが個別にかつ明確に記載されているかのように、明確に本明細書で開示されている。
【0177】
本発明の様々なさらなる態様及び実施形態は、本開示に照らして当業者に明らかとなろう。
【0178】
「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、２つの特定の特徴又は構成要素の各々の、他方を伴うか又は伴わない、具体的な開示を意味する。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、それぞれが本明細書で個別に示されているかのように、（ｉ）Ａ、（ii）Ｂ、及び（iii）Ａ及びＢ、のそれぞれの具体的な開示を意味する。
【0179】
文脈から別段のことが示されていない限り、上記で示した特徴の説明及び定義は、本発明のいかなる特定の態様にも実施形態にも限定されず、記載されている全ての態様及び実施形態に等しく適用される。
【0180】
［実施例］
本発明のある特定の態様及び実施形態をここで、例として、及び上記の図面を参照して、記載する。
本発明のある特定の態様及び実施形態をここで、例として、及び上記の図面を参照して、記載する。
【0181】
全般的な実験プロトコル
インビトロでのシュードノットオリゴ分解反応
ＲＮＡオリゴ（２０μＭ）を、ＫＣｌ（５０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を補充したｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）バッファーに添加した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ、ＭＴＤＢ、又はＴＤＢ－ｄｅｇ １６ｂ（１ｍＭ）を次いで添加した。反応混合物を３７℃で３時間インキュベートし、次いで、４℃で維持した。反応混合物をＬＣ－ＭＳ又はゲル電気泳動によって分析した。
インビトロでのシュードノットオリゴ分解反応
ＲＮＡオリゴ（２０μＭ）を、ＫＣｌ（５０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を補充したｐＨ７．５のＨＥＰＥＳ（２０ｍＭ）バッファーに添加した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ、ＭＴＤＢ、又はＴＤＢ－ｄｅｇ １６ｂ（１ｍＭ）を次いで添加した。反応混合物を３７℃で３時間インキュベートし、次いで、４℃で維持した。反応混合物をＬＣ－ＭＳ又はゲル電気泳動によって分析した。
【0182】
オリゴヌクレオチドのＬＣ－ＭＳ分析。
オリゴヌクレオチドを、Mikutis et al., 2020の方法に従ってＬＣ－ＭＳによって分析した。
オリゴヌクレオチドを、Mikutis et al., 2020の方法に従ってＬＣ－ＭＳによって分析した。
【0183】
オリゴマーを、Acquity UPLC BEH C18の１．７μｍカラムを使用して、Acquity UPLCシステムと組み合わせたXevo G2-S TOF質量分析計を使用して分析した。このシステムは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ、electrospray ionisation）を利用する。０．２００ｍＬ／分の流量で、Ｈ２Ｏ中の１６．３ｍＭのＴＥＡ、４００ｍＭのＨＦＩＰ、並びに、８０：２０ｖ／ｖのＭｅＣＮ及びＨ２Ｏ中の１６．３ｍＭのＴＥＡ、４００ｍＭのＨＦＩＰ、という２つの移動相を使用した。ＲＮＡ種の検量線は、Ａ２６０又は特定のネガティブｍ／ｚシグナルの強度のいずれかに基づくものであった。組み込まれたピークの強度を、KNIMEソフトウェアプラットフォームのネイティブモジュールを使用して計算した（非特許文献３３）。トータル質量スペクトルを、製造者の指示に従ってMassLynxソフトウェア（Watersのバージョン４．１）にプレインストールされたMaxEntアルゴリズムを使用してイオンシリーズから再構成した。記載されたネガティブイオンシリーズを得るために、クロマトグラムにおけるオリゴマーのピークを、組み込み及びさらなる分析のために選択した。
【0184】
ＲＮＡ分解ゲル電気泳動
ゲル電気泳動を、Mikutis et al., 2020の方法に従って行った。
ゲル電気泳動を、Mikutis et al., 2020の方法に従って行った。
【0185】
インビトロでのＲＮＡ分解反応を上記のように行った。クエンチされた反応混合物を、ローディングバッファー（９５％ホルムアミド、０．０２５％ＳＤＳ、０．０２５％ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ、bromophenol blue）、０．０２５％キシレンシアノールＦＦ、０．０２５％エチジウムブロマイド、０．５ｍＭのＥＤＴＡ）と１：１の比で混合し、７０℃で５分間加熱し、そして０℃まで冷却した。ＰＡＧＥを、１×ＴＢＥバッファー（８９ｍＭのＴｒｉｓ、８９ｍＭのホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡ）の下で、１５％ポリアクリルアミドを含有するNovex（商標）TBEUrea Gels上で、１８０Ｖで６０分間行った。ゲル染色を、１×ＴＢＥバッファー中でSYBR Green II RNA Gel Stain（Invitrogen社製）を使用して行った。染色されたＲＮＡを、ChemiDoc MP（Bio-Rad社、英国）を使用して可視化した。
【0186】
ウイルスストック
Ｖｅｒｏ ＣＣＬ－８１細胞を感染させるために使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ストックは、Ｖｅｒｏ ＣＣＬ－８１培養の４日後の、およそ１．７×１０６ＰＦＵ／ｍＬで、ポルトガル人患者（内部参照：６０６＿ＩＭＭ ＩＤ＿５４５２）から単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の継代４から確立された。ストックの力価をプラークアッセイによって計算した。簡潔に述べると、およそ８×１０５のＣＣＬ－８１細胞／ウェルを６ウェルプレートに播種し、コンフルエンスになるまで２４時間増殖させた。培地を除去し、ウイルス含有上清の５００μＬの１０倍連続希釈物を３７℃で１時間、２セット吸着させた。プレートを１５分ごとに手で揺らして、接種材料を再分布させた。細胞に、補充されたＤＭＥＭ中の１．２５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、carboxymethylcellulose）を重ね、３７℃で４日間インキュベートした。インキュベーションの後、ＣＭＣの重層を除去し、細胞を４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、そして０．１％トルイジンブルーで染色した。固定によって不活化した後、プレートをパラフィルムで密封し、消毒し、その後、ＢＳＣ及びＢＳＬ３から取り出した。ウイルスプラークを計数して、感染力価（ＰＦＵ（プラーク形成単位）／ｍＬ）を決定した。
Ｖｅｒｏ ＣＣＬ－８１細胞を感染させるために使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ストックは、Ｖｅｒｏ ＣＣＬ－８１培養の４日後の、およそ１．７×１０６ＰＦＵ／ｍＬで、ポルトガル人患者（内部参照：６０６＿ＩＭＭ ＩＤ＿５４５２）から単離されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の継代４から確立された。ストックの力価をプラークアッセイによって計算した。簡潔に述べると、およそ８×１０５のＣＣＬ－８１細胞／ウェルを６ウェルプレートに播種し、コンフルエンスになるまで２４時間増殖させた。培地を除去し、ウイルス含有上清の５００μＬの１０倍連続希釈物を３７℃で１時間、２セット吸着させた。プレートを１５分ごとに手で揺らして、接種材料を再分布させた。細胞に、補充されたＤＭＥＭ中の１．２５％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、carboxymethylcellulose）を重ね、３７℃で４日間インキュベートした。インキュベーションの後、ＣＭＣの重層を除去し、細胞を４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、そして０．１％トルイジンブルーで染色した。固定によって不活化した後、プレートをパラフィルムで密封し、消毒し、その後、ＢＳＣ及びＢＳＬ３から取り出した。ウイルスプラークを計数して、感染力価（ＰＦＵ（プラーク形成単位）／ｍＬ）を決定した。
【0187】
Ｖｅｒｏ ＣＣＬ－８１のウイルス感染
８０％コンフルエンシーのＶｅｒｏ ＣＣＬ－８１細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２接種材料と３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、接種材料を除去し、２．５％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培地を２４時間又は試料を採取するまで添加した。
８０％コンフルエンシーのＶｅｒｏ ＣＣＬ－８１細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２接種材料と３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、接種材料を除去し、２．５％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培地を２４時間又は試料を採取するまで添加した。
【0188】
ゲル電気泳動分析
５００ｎｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを、１×ＨＥＰＥＳバッファー中の１００μＭのＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａを伴って又は伴わずに、穏やかに撹拌しながら３７℃で２時間インキュベートした。試料を次いで、１．５％アガロースゲル上で分析した。
５００ｎｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを、１×ＨＥＰＥＳバッファー中の１００μＭのＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａを伴って又は伴わずに、穏やかに撹拌しながら３７℃で２時間インキュベートした。試料を次いで、１．５％アガロースゲル上で分析した。
【0189】
ナノポアシーケンシング
５００ｎｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを、１×ＨＥＰＥＳバッファー中の１００μＭのＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａを伴って又は伴わずに、穏やかに撹拌しながら３７℃で２時間インキュベートした。試料を次いで、直接ＲＮＡシーケンシング（Direct RNA Sequencing）（SQK-RNA002、ONT社）についての製造者のプロトコルに従って、シーケンシングのために調製した。調製されたライブラリーをFLO-MIN 106Dフローセル（ONT社）にロードし、MinION Mk1Cデバイス（ONT社）でシーケンシングした。
５００ｎｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡを、１×ＨＥＰＥＳバッファー中の１００μＭのＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａを伴って又は伴わずに、穏やかに撹拌しながら３７℃で２時間インキュベートした。試料を次いで、直接ＲＮＡシーケンシング（Direct RNA Sequencing）（SQK-RNA002、ONT社）についての製造者のプロトコルに従って、シーケンシングのために調製した。調製されたライブラリーをFLO-MIN 106Dフローセル（ONT社）にロードし、MinION Mk1Cデバイス（ONT社）でシーケンシングした。
【0190】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＷｕｈａｎ－ｈｕ１株のゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＭＮ９０８９４７．３）及びゲノムアノテーション（ＮＣ＿４５５１２．２）をＮＣＢＩデータベースからダウンロードした。シーケンスリードを、ｍｉｎｉｍａｐ２を使用して、パラメータ「－ａｘ ｓｐｌｉｃｅ－Ｎ３２－ｕｎ－ｋ１３」で、Ｗｕｈａｎ－ｈｕ１ゲノムに対してアラインした（Li et al.,2018）。アラインメントのＣＩＧＡＲストリングを、カスタマイズされたスクリプトによって処理した。リード内のスプライスジャンクションがゲノムの最初の６０～１２０ｂｐの間で開始する場合、リードをリーダーとしてフラグ付けした。リードが、アノテーションされた転写産物の９０％超をカバーしているか、又はリード配列の９０％超が転写産物内に存在していれば、リードを個々の転写産物に割り当てた。
【0191】
５０％阻害濃度を決定するための薬物アッセイ
ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ（０．０７～２５μＭの範囲）の濃度を増加させて試験して、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。媒体（Ｈ２Ｏ）コントロール及びコントロール分子を並行して含めた。細胞をおよそ４０％のコンフルエンシーで９６ウェルプレートに播種し、その２４時間後に感染させた。ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ、ＭＴＤＢ、又はＴＤＢ－ｄｅｇ １６ｂを、感染の１時間前又は感染の１時間後に添加した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の凍結保存ストックを室温で解凍し、これを使用して０．０５感染多重度（ＭＯＩ）で細胞を感染させた。細胞を感染の２４後に採取することによって、ウイルス増殖の阻害を測定した。Ｅ遺伝子及びシュードノット領域を標的化するＰＣＲによってウイルス負荷を測定することによって、ウイルス増殖を評価した。
ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ（０．０７～２５μＭの範囲）の濃度を増加させて試験して、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を決定した。媒体（Ｈ２Ｏ）コントロール及びコントロール分子を並行して含めた。細胞をおよそ４０％のコンフルエンシーで９６ウェルプレートに播種し、その２４時間後に感染させた。ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ、ＭＴＤＢ、又はＴＤＢ－ｄｅｇ １６ｂを、感染の１時間前又は感染の１時間後に添加した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の凍結保存ストックを室温で解凍し、これを使用して０．０５感染多重度（ＭＯＩ）で細胞を感染させた。細胞を感染の２４後に採取することによって、ウイルス増殖の阻害を測定した。Ｅ遺伝子及びシュードノット領域を標的化するＰＣＲによってウイルス負荷を測定することによって、ウイルス増殖を評価した。
【0192】
プラークアッセイによるウイルスプラーク形成単位の検出
およそ８×１０５のＣＣＬ－８１細胞／ウェルを６ウェルプレートに播種し、８０％のコンフルエンスになるまで２４時間増殖させた。化合物で処理した培養物の上清を、２．５％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培地中で希釈し、事前に播種した６ウェルプレートのウェルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートを１５分ごとに手で揺らして、接種材料を再分布させた。細胞に、補充されたＤＭＥＭ中の１．２５％ＣＭＣを重ね、３７℃で４日間インキュベートした。インキュベーションの後、ＣＭＣの重層を除去し、細胞を４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、そして０．１％トルイジンブルーで染色した。固定によって不活化した後、プレートをパラフィルムで密封し、消毒し、その後、ＢＳＣ及びＢＳＬ３から取り出した。ウイルスプラークを計数して、感染力価（ＰＦＵ（プラーク形成単位）／ｍＬ）を決定した。
およそ８×１０５のＣＣＬ－８１細胞／ウェルを６ウェルプレートに播種し、８０％のコンフルエンスになるまで２４時間増殖させた。化合物で処理した培養物の上清を、２．５％ＦＣＳを補充したＤＭＥＭ培地中で希釈し、事前に播種した６ウェルプレートのウェルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートした。プレートを１５分ごとに手で揺らして、接種材料を再分布させた。細胞に、補充されたＤＭＥＭ中の１．２５％ＣＭＣを重ね、３７℃で４日間インキュベートした。インキュベーションの後、ＣＭＣの重層を除去し、細胞を４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、そして０．１％トルイジンブルーで染色した。固定によって不活化した後、プレートをパラフィルムで密封し、消毒し、その後、ＢＳＣ及びＢＳＬ３から取り出した。ウイルスプラークを計数して、感染力価（ＰＦＵ（プラーク形成単位）／ｍＬ）を決定した。
【0193】
ＰＣＲによるウイルス負荷の定量
細胞ペレットを３００μＬの溶解バッファー中に採取した。製造者の指示に従って、ウイルスＲＮＡをNZY Viral RNA Isolationキット（NZYtech社）を使用して抽出し、ｃＤＮＡをNZY First-Strand cDNA Synthesisキット（NZYtech社）を使用して合成した。定量ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ、quantitative RT-PCR）を次いで、デフォルトのSYBR greenプログラムを伴うApplied Biosystems社製のRT-PCR 7500Fast機器によって設定された、PowerUp SYBR Green Master Mix（BIO-RAD社）を使用することによって行った。
細胞ペレットを３００μＬの溶解バッファー中に採取した。製造者の指示に従って、ウイルスＲＮＡをNZY Viral RNA Isolationキット（NZYtech社）を使用して抽出し、ｃＤＮＡをNZY First-Strand cDNA Synthesisキット（NZYtech社）を使用して合成した。定量ＲＴ－ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ、quantitative RT-PCR）を次いで、デフォルトのSYBR greenプログラムを伴うApplied Biosystems社製のRT-PCR 7500Fast機器によって設定された、PowerUp SYBR Green Master Mix（BIO-RAD社）を使用することによって行った。
【0194】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の検出に使用したプライマーは以下の通りである：
Ｅ遺伝子：
５’－ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT－３’（フォワード）、
５’－ATATTGCAGCAGTACGCACACA－３’（リバース）；
Ｎ遺伝子：
５’－GACCCCAAAATCAGCGAAAT－３’（フォワード）、
５’－TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG－３’（リバース）；
シュードノット：
５’－CCGCGAACCCATGCTTCAGTCA－３’（フォワード）、
５’－CACGGTGTAAGACGGGCTGCAC－３’（リバース）；
１８Ｓ：
５’－GTAACCCGTTGAACCCCATT－３’（フォワード）、
５’－CCATCCAATCGGTAGTAGCG－３’（リバース）。
Ｅ遺伝子：
５’－ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT－３’（フォワード）、
５’－ATATTGCAGCAGTACGCACACA－３’（リバース）；
Ｎ遺伝子：
５’－GACCCCAAAATCAGCGAAAT－３’（フォワード）、
５’－TCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG－３’（リバース）；
シュードノット：
５’－CCGCGAACCCATGCTTCAGTCA－３’（フォワード）、
５’－CACGGTGTAAGACGGGCTGCAC－３’（リバース）；
１８Ｓ：
５’－GTAACCCGTTGAACCCCATT－３’（フォワード）、
５’－CCATCCAATCGGTAGTAGCG－３’（リバース）。
【0195】
ウイルス生存アッセイ
２セットの試料を生存アッセイのために調製し、このアッセイでは、８０％コンフルエンシーの細胞を、０．０５ＭＯＩのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２凍結保存ストックで２時間感染させた。次いで、接種材料を除去し、感染した細胞を、６μＭのＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ、ＭＴＤＢ、及びＴＤＢ－ｄｅｇ １６ｂと、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、ウイルス増殖のＰＣＲ分析のために、１セットの試料中の細胞を溶解バッファー中に採取した。他方のセットの試料では、上清中の化合物を除去し、薬物を含有しない培地で置き換え、そして３７℃及び５％ＣＯ２でさらに２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後（４８時間の時点に対応する）、細胞を溶解バッファー中に採取し、ウイルス増殖を、Ｅ遺伝子及びシュードノット領域を標的化するＰＣＲによって測定した。ウイルス生存のパーセンテージを、媒体コントロールに対して正規化した。
２セットの試料を生存アッセイのために調製し、このアッセイでは、８０％コンフルエンシーの細胞を、０．０５ＭＯＩのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２凍結保存ストックで２時間感染させた。次いで、接種材料を除去し、感染した細胞を、６μＭのＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ、ＭＴＤＢ、及びＴＤＢ－ｄｅｇ １６ｂと、３７℃及び５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、ウイルス増殖のＰＣＲ分析のために、１セットの試料中の細胞を溶解バッファー中に採取した。他方のセットの試料では、上清中の化合物を除去し、薬物を含有しない培地で置き換え、そして３７℃及び５％ＣＯ２でさらに２４時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後（４８時間の時点に対応する）、細胞を溶解バッファー中に採取し、ウイルス増殖を、Ｅ遺伝子及びシュードノット領域を標的化するＰＣＲによって測定した。ウイルス生存のパーセンテージを、媒体コントロールに対して正規化した。
【0196】
細胞毒性アッセイ
化合物が細胞に対して毒性であったかどうかを判定するために、ウェル当たり１×１０４のＶｅｒｏ Ｅ６細胞を９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ、ＭＴＤＢ、又はＴＤＢ－ｄｅｇ １６ｂ（０．０５μＭ～２５μＭの範囲）の濃度を増加させてインキュベートした。化合物との２４時間のインキュベーションの後の細胞の生存率を、製造者のプロトコルに従って、CellTiter Blue生存率アッセイ（Promega社）によって評価した。簡潔に述べると、Cell titer blueストック溶液を１：２０で希釈した。８０μＬ容積の希釈されたcell titer blueを各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。
化合物が細胞に対して毒性であったかどうかを判定するために、ウェル当たり１×１０４のＶｅｒｏ Ｅ６細胞を９６ウェルプレートに播種した。２４時間後、細胞を、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ、ＭＴＤＢ、又はＴＤＢ－ｄｅｇ １６ｂ（０．０５μＭ～２５μＭの範囲）の濃度を増加させてインキュベートした。化合物との２４時間のインキュベーションの後の細胞の生存率を、製造者のプロトコルに従って、CellTiter Blue生存率アッセイ（Promega社）によって評価した。簡潔に述べると、Cell titer blueストック溶液を１：２０で希釈した。８０μＬ容積の希釈されたcell titer blueを各ウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。
【0197】
動的光散乱（ＤＬＳ、Dynamic Light Scattering）
各スクリーニング分子のストック溶液（１０ｍＭ）を、希釈していないＤＭＳＯ中に調製し、２５又は１２．５μＭの最終濃度まで水中に連続希釈した。データを、Zetasizer Nano S（Malvern社製）で２５℃で収集した。
各スクリーニング分子のストック溶液（１０ｍＭ）を、希釈していないＤＭＳＯ中に調製し、２５又は１２．５μＭの最終濃度まで水中に連続希釈した。データを、Zetasizer Nano S（Malvern社製）で２５℃で収集した。
【0198】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の動物モデルでの抗ウイルス活性
１０～１２週齢の、特定病原体除去した、Ｔｇ（Ｋ１８－ＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎについてヘミ接合の（株Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｋ１８－ＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ、Jackson laboratory株０３４８６０）マウスを、この研究で使用した。マウスを、５０μｌのＰＢＳ中の１×１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に鼻腔内感染させた。化合物を、感染の１時間前及び感染の３時間後に鼻腔内投与した。マウスを、媒体（ｎ＝６）、２５ｍｇ／ｋｇのＭＴＤＢ分解剤１６ａ（ｎ＝６）、１０ｍｇ／ｋｇのＭＴＤＢ（ｎ＝３）、又は２５ｍｇ／ｋｇのＴＤＢ分解剤１６ｂ（ｎ＝５）で処理した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後５日目に、動物を人道的に安楽死させ、左肺をプラークアッセイによるウイルス定量のために採取し、右肺を組織病理学的分析のために採取した。
１０～１２週齢の、特定病原体除去した、Ｔｇ（Ｋ１８－ＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎについてヘミ接合の（株Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（Ｋ１８－ＡＣＥ２）２Ｐｒｌｍｎ／Ｊ、Jackson laboratory株０３４８６０）マウスを、この研究で使用した。マウスを、５０μｌのＰＢＳ中の１×１０４ＰＦＵのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に鼻腔内感染させた。化合物を、感染の１時間前及び感染の３時間後に鼻腔内投与した。マウスを、媒体（ｎ＝６）、２５ｍｇ／ｋｇのＭＴＤＢ分解剤１６ａ（ｎ＝６）、１０ｍｇ／ｋｇのＭＴＤＢ（ｎ＝３）、又は２５ｍｇ／ｋｇのＴＤＢ分解剤１６ｂ（ｎ＝５）で処理した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染後５日目に、動物を人道的に安楽死させ、左肺をプラークアッセイによるウイルス定量のために採取し、右肺を組織病理学的分析のために採取した。
【0199】
ウェスタンブロット分析。
インビトロでの実験では、試料を媒体（Ｈ２Ｏ）又はＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ（６ｍＭ）で２４時間処理した。細胞を次いで、１ｍＭのＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤（Sigma社）、及びホスファターゼ阻害剤（Sigma社）を補充した全細胞溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０、４５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＮＰ－４０、１ｍＭのＥＤＴＡ）を使用して溶解した。インビボでの実験では、マウスの左肺全部を３ｍＬのＤＭＥＭ中にホモジナイズし、７５０μＬを、上記のような補充を行った等容積の全細胞溶解バッファーに移した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイ（BioRad社）を使用して調べた。ロードする前に、試料にＬＤＳローディングバッファー（Life technologies社）及び試料還元剤（Sample Reducing Agent）（Life technologies社）を補充した。４０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ、polyvinylidene difluoride）膜（GE Healthcare社）にブロットした。ウェスタンブロット実験を、以下の抗体を使用して行った：抗ベータアクチン（Abcam社、ａｂ８２２４）、抗ホスホ－ＭＡＰＫＡＰＫ－２（Ｔｈｒ３３４）（２７Ｂ７）（Cell Signalling社、３００７）、抗ホスホ－ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）（Ｄ３Ｆ９）ＸＰ（登録商標）（Cell Signalling社、４５１１）、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）（Abcam社、ａｂ２０５７１９）、及びヤギ抗ウサギＨＲＰ（Abcam社、ａｂ６７２１）。
インビトロでの実験では、試料を媒体（Ｈ２Ｏ）又はＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ（６ｍＭ）で２４時間処理した。細胞を次いで、１ｍＭのＤＴＴ、プロテアーゼ阻害剤（Sigma社）、及びホスファターゼ阻害剤（Sigma社）を補充した全細胞溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝８．０、４５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％ＮＰ－４０、１ｍＭのＥＤＴＡ）を使用して溶解した。インビボでの実験では、マウスの左肺全部を３ｍＬのＤＭＥＭ中にホモジナイズし、７５０μＬを、上記のような補充を行った等容積の全細胞溶解バッファーに移した。タンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイ（BioRad社）を使用して調べた。ロードする前に、試料にＬＤＳローディングバッファー（Life technologies社）及び試料還元剤（Sample Reducing Agent）（Life technologies社）を補充した。４０μｇのタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で分離し、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ、polyvinylidene difluoride）膜（GE Healthcare社）にブロットした。ウェスタンブロット実験を、以下の抗体を使用して行った：抗ベータアクチン（Abcam社、ａｂ８２２４）、抗ホスホ－ＭＡＰＫＡＰＫ－２（Ｔｈｒ３３４）（２７Ｂ７）（Cell Signalling社、３００７）、抗ホスホ－ｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）（Ｄ３Ｆ９）ＸＰ（登録商標）（Cell Signalling社、４５１１）、ヤギ抗マウスＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（ＨＲＰ）（Abcam社、ａｂ２０５７１９）、及びヤギ抗ウサギＨＲＰ（Abcam社、ａｂ６７２１）。
【0200】
アジド－イミダゾールの合成
スキーム１：アジド－イミダゾールの合成
【化7】
【0201】
ヘキサエチレングリコールジ（ｐ－トルエンスルホネート）（１）の合成
ヘキサエチレングリコール（１．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）及びｐ－トルエンスルホニルクロライド（２．２ｍｍｏｌ）中に溶解し、ＫＯＨ（１０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を室温で６時間撹拌し、次いで、濾過し、水で洗浄した。ＭｇＳＯ４上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させた。さらなる精製は不要であった。収量：９５％（無色の油）。
ヘキサエチレングリコール（１．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１０ｍＬ）及びｐ－トルエンスルホニルクロライド（２．２ｍｍｏｌ）中に溶解し、ＫＯＨ（１０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を室温で６時間撹拌し、次いで、濾過し、水で洗浄した。ＭｇＳＯ４上で乾燥させた後、溶媒を減圧下で蒸発させた。さらなる精製は不要であった。収量：９５％（無色の油）。
【0202】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δＨ ７．７８（ｄ，４Ｈ）、７．３３（ｄ，４Ｈ）、４．１４（ｔ，４Ｈ）、３．６７（ｂｒ ｔｒ，４Ｈ，３．６０（ｂｒ ｓ，８Ｈ）、３．５７（ｂｒ ｓ，８Ｈ）、２．４３（ｂｒ ｓ，６Ｈ）。ＭＳ：Ｃ２６Ｈ３９Ｏ１１Ｓ２のｍ／ｚ：５９１．１９。
【0203】
物理的及び分光学的データは、文献（Mikutis et al., 2020）で記載されているものと一致した。
【0204】
ヘキサエチレングリコールｐ－トルエンスルホネートアジド（２ａ）の合成
ヘキサエチレングリコールジ（ｐ－トルエンスルホネート）１（１．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解し、アジ化ナトリウム（１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０℃で６時間撹拌し、次いで室温まで冷却し、そして一晩撹拌した。混合物をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。ＤＭＦを除去するために、トルエンを添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、カラムクロマトグラフィーを介して精製した（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン、１：１）。収量：５４％（無色の油）。
ヘキサエチレングリコールジ（ｐ－トルエンスルホネート）１（１．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解し、アジ化ナトリウム（１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０℃で６時間撹拌し、次いで室温まで冷却し、そして一晩撹拌した。混合物をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。ＤＭＦを除去するために、トルエンを添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、カラムクロマトグラフィーを介して精製した（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン、１：１）。収量：５４％（無色の油）。
【0205】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δＨ ７．８２（ｄ，２Ｈ）、７．３６（ｄ，２Ｈ）、４．１８（ｔ，２Ｈ）、３．５９～３．７３（２０Ｈ，ＰＥＧ）、３．４１（ｔ，２Ｈ）、２．４７（ｓ，３Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１９Ｈ３１Ｎ３ＮａＯ８Ｓのｍ／ｚ：４８４．２。
【0206】
物理的及び分光学的データは、文献（Mikutis et al., 2020）で記載されているものと一致した。
【0207】
テトラエチレングリコールｐ－トルエンスルホネートアジド（２ｂ）の合成
テトラエチレングリコールジ（ｐ－トルエンスルホネート）（２．７ｇ、５．４ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）中に溶解した。アジ化ナトリウム（３５５ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２下に置き、そして５５℃で１８時間撹拌した。溶媒を真空内で除去し、生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーを介して精製した（３：１のＰｅｔ．エーテル：ＡｃＯＥｔから１：１のＰｅｔ．エーテル：ＡｃＯＥｔ）。生成物が無色の油として得られた（７９８ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、３９％）。
テトラエチレングリコールジ（ｐ－トルエンスルホネート）（２．７ｇ、５．４ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（１０ｍｌ）中に溶解した。アジ化ナトリウム（３５５ｍｇ、５．４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物をＮ２下に置き、そして５５℃で１８時間撹拌した。溶媒を真空内で除去し、生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーを介して精製した（３：１のＰｅｔ．エーテル：ＡｃＯＥｔから１：１のＰｅｔ．エーテル：ＡｃＯＥｔ）。生成物が無色の油として得られた（７９８ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、３９％）。
【0208】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．８２（ｄ，２Ｈ）、７．３７（ｄ，２Ｈ）、４．１９（ｔ，１Ｈ）、３．６０～３．７３（１２Ｈ，ＰＥＧ）、３．４０（ｔ，２Ｈ）、２．４７（ｓ，３Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１５Ｈ２３Ｎ３ＮａＯ６Ｓのｍ／ｚ ３９６．１２０７。
【0209】
ジエチレングリコールｐ－トルエンスルホネートアジド（２ｃ）の合成
ジエチレングリコールジ（ｐ－トルエンスルホネート）（１．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解し、アジ化ナトリウム（１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０℃で６時間撹拌し、次いで室温まで冷却し、そして一晩撹拌した。混合物をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。ＤＭＦを除去するために、トルエンを添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、カラムクロマトグラフィーを介して精製した（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン、１：１）。収量：５９％（無色の油）。
ジエチレングリコールジ（ｐ－トルエンスルホネート）（１．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解し、アジ化ナトリウム（１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０℃で６時間撹拌し、次いで室温まで冷却し、そして一晩撹拌した。混合物をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。ＤＭＦを除去するために、トルエンを添加し、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、カラムクロマトグラフィーを介して精製した（ＥｔＯＡｃ：ヘキサン、１：１）。収量：５９％（無色の油）。
【0210】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δＨ ７．８０（ｄ，２Ｈ）、７．３５（ｄ，２Ｈ）、４．１７（ｔ，２）、３．７０（ｔ，２Ｈ）、３．６１（ｔ，２Ｈ）、３．３２（ｔ，２Ｈ）、２．４５（ｓ，３Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１１Ｈ１５Ｎ３ＮａＯ４Ｓのｍ／ｚ：３０８．０６８。
【0211】
物理的及び分光学的データは、文献（Mikutis et al., 2020）で記載されているものと一致した。
【0212】
ヘキサエチレングリコールイミダゾレートアジド（３ａ）の合成
イミダゾール（１．０ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）中で、不活性条件下で溶解し、水素化ナトリウム（鉱油中に６０％の分散、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で３０分間撹拌した後、２ａ（１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０℃で一晩撹拌し、室温まで冷却した後、混合物を水（２０ｍＬ）でクエンチした。その後の、ＥｔＯＡｃ及びＤＣＭでの抽出、ＭｇＳＯ４上での乾燥、並びに減圧下での溶媒の蒸発によって、粗生成物が得られた。粗生成物を次いで、カラムクロマトグラフィーを介して精製した（ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ、３：１）。収量：３５％（無色の油）。
イミダゾール（１．０ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）中で、不活性条件下で溶解し、水素化ナトリウム（鉱油中に６０％の分散、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で３０分間撹拌した後、２ａ（１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０℃で一晩撹拌し、室温まで冷却した後、混合物を水（２０ｍＬ）でクエンチした。その後の、ＥｔＯＡｃ及びＤＣＭでの抽出、ＭｇＳＯ４上での乾燥、並びに減圧下での溶媒の蒸発によって、粗生成物が得られた。粗生成物を次いで、カラムクロマトグラフィーを介して精製した（ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ、３：１）。収量：３５％（無色の油）。
【0213】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δＨ ７．５２（ｓ，１Ｈ）、７．０２（ｓ，１Ｈ）、６．９８（ｓ，１Ｈ）、４．０９（ｔ，２Ｈ）、３．７２（ｔ，２Ｈ）、３．５５～３．７８（１８Ｈ，ＰＥＧ）、３．３６（ｔ，２Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１５Ｈ２８Ｎ５Ｏ５のｍ／ｚ ３５８．２１。
【0214】
物理的及び分光学的データは、文献（Mikutis et al., 2020）で記載されているものと一致した。
【0215】
テトラエチレングリコールイミダゾレートアジド（３ｂ）の合成
イミダゾール（１８ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）及びＮａＨ（鉱油中に６０％の分散、１２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を、０℃の無水ＤＭＦ（１ｍｌ）中に懸濁した。混合物をＮ２雰囲気下に置き、室温まで温め、そして３０分間撹拌した。２ｂ（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１ｍｌ）中に溶解し、得られた溶液を最初の混合物に添加した。これを次いで５５℃で２０時間撹拌した。溶媒を次いで真空内で除去し、得られた残渣を、フラッシュクロマトグラフィーを介して精製した（ドライローディング、９：１のＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨまでの勾配ＥｔＯＡＣ）。生成物が無色の油として得られた（５４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、７４％）。
イミダゾール（１８ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）及びＮａＨ（鉱油中に６０％の分散、１２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を、０℃の無水ＤＭＦ（１ｍｌ）中に懸濁した。混合物をＮ２雰囲気下に置き、室温まで温め、そして３０分間撹拌した。２ｂ（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１ｍｌ）中に溶解し、得られた溶液を最初の混合物に添加した。これを次いで５５℃で２０時間撹拌した。溶媒を次いで真空内で除去し、得られた残渣を、フラッシュクロマトグラフィーを介して精製した（ドライローディング、９：１のＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨまでの勾配ＥｔＯＡＣ）。生成物が無色の油として得られた（５４ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、７４％）。
【0216】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５５（ｓ，１Ｈ）、７．０５（ｓ，１Ｈ）、７．０５（ｓ，１Ｈ）、４．１２（ｔ，２Ｈ）、３．７５（ｔ，２Ｈ）、３．６０～３．７１（１０Ｈ，ＰＥＧ）、３．３９（ｔ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３） δＣ １３７．６、１２９．２、１１９．４、７０．５～７０．７（複数のＰＥＧピーク）、７０．０、５０．７、４７．１。ＭＳ：Ｃ１１Ｈ１９Ｎ５Ｏ３のｍ／ｚ ２７０．１５８２。
【0217】
ジエチレングリコールイミダゾレートアジド（３ｃ）の合成
イミダゾール（１．０ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）中で、不活性条件下で溶解し、水素化ナトリウム（鉱油中に６０％の分散、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で３０分間撹拌した後、２ｃ（１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０℃で一晩撹拌し、次いで室温まで冷却した。混合物を水（２０ｍＬ）でクエンチした。ＥｔＯＡｃ及びＤＣＭでの抽出、ＭｇＳＯ４上での乾燥、並びに減圧下での溶媒の蒸発の後、粗生成物が得られた。粗生成物を次いで、カラムクロマトグラフィーを介して精製した（ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ、３：１）。収量：３８％（無色の油）。
イミダゾール（１．０ｍｍｏｌ）を、乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）中で、不活性条件下で溶解し、水素化ナトリウム（鉱油中に６０％の分散、１．２ｍｍｏｌ）を添加した。０℃で３０分間撹拌した後、２ｃ（１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を６０℃で一晩撹拌し、次いで室温まで冷却した。混合物を水（２０ｍＬ）でクエンチした。ＥｔＯＡｃ及びＤＣＭでの抽出、ＭｇＳＯ４上での乾燥、並びに減圧下での溶媒の蒸発の後、粗生成物が得られた。粗生成物を次いで、カラムクロマトグラフィーを介して精製した（ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ、３：１）。収量：３８％（無色の油）。
【0218】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δＨ ７．５３（ｓ，１Ｈ）、７．０６（ｓ，１Ｈ）、６．９９（ｓ，１Ｈ）、４．１４（ｔ，２Ｈ）、３．７５（ｔ，２Ｈ）、３．６０（ｔ，２Ｈ）、３．３６（ｔ，２Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１１Ｈ１９Ｎ５Ｏ３のｍ／ｚ １８２．１
【0219】
物理的及び分光学的データは、文献（Mikutis et al., 2020）で記載されているものと一致した。
【0220】
アジド－エチルイミダゾール（４）の合成
スキーム２：エチルアジド－イミダゾール４の合成
【化8】
スキーム２：エチルアジド－イミダゾール４の合成
【0221】
ヒドロキシエチルイミダゾール（１．０ｍｍｏｌ）を０℃のＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解し、ＫＯＨ（１０ｍｍｏｌ）及びｐ－トルエンスルホニルクロライド（１．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で６時間撹拌し、次いで濾過し、そして溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をＤＭＦ中に溶解し、アジ化ナトリウム（１．０ｍｍｏｌ）を添加した。これを６０℃で６時間撹拌し、次いで室温まで冷却し、そして一晩撹拌した。トルエンを添加し、溶媒を減圧下で除去した。精製を、カラムクロマトグラフィーを介して行った（ＥｔＯＡＣ：ＭｅＯＨ、３：１）。収量：２６％（白色の固体）。
【0222】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．５１（ｓ，１Ｈ）、７．０９（ｓ，１Ｈ）、６．９６（ｓ，１Ｈ）、４．０９（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）、３．６２（ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ，１Ｈ）。
【0223】
ピリドスタチン分解剤の合成
スキーム３：ピリドスタチン誘導体の合成。
【化9】
【0224】
ケリダム酸ジメチルエステル（５）の合成
ケリダム酸水和物（２．０ｇ、１１ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのＭｅＯＨ中に懸濁した。塩化チオニル（５００μＬ、６．９ｍｍｏｌ）を－１０℃で懸濁液に滴下して添加した。白色から茶色への色の変化が見られた。溶液をＲＴに温め、一晩撹拌した。茶色の溶液を２時間還流し、溶媒を真空内で除去した。茶色の粗生成物を次いで、ＥｔＯＨからから再結晶化させ、ベージュ色の固体であるケリダム酸ジメチルエステル５（８６４ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ、３６％）を得た。
ケリダム酸水和物（２．０ｇ、１１ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのＭｅＯＨ中に懸濁した。塩化チオニル（５００μＬ、６．９ｍｍｏｌ）を－１０℃で懸濁液に滴下して添加した。白色から茶色への色の変化が見られた。溶液をＲＴに温め、一晩撹拌した。茶色の溶液を２時間還流し、溶媒を真空内で除去した。茶色の粗生成物を次いで、ＥｔＯＨからから再結晶化させ、ベージュ色の固体であるケリダム酸ジメチルエステル５（８６４ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ、３６％）を得た。
【0225】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１１．７７（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、７．６１（ｓ，２Ｈ）、３．８８（ｓ，６Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）δ１６５．９７、１６４．８８、１４９．３７、１１５．３３、５２．６８。ＨＲＭＳ（ＥＳ） Ｃ９Ｈ１０ＮＯ５の計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）ｍ／ｚ：２１２．０５５９、実測値２１２．０５６７。
【0226】
プロパルギルケリダム酸（６）の合成
ケリダム酸ジメチルエステル５（０．８２ｇ、３．８ｍｍｏｌ）、プロパルギルアルコール（０．３３ｍＬ、５．７ｍｍｏｌ）、及びポリマー結合型トリフェニルホスフィン（３．４７ｇ、１．５ｍｍｏｌのロード／ｇ、５．２ｍｍｏｌ）を、５５ｍＬの新たに蒸留したＴＨＦ中に懸濁した。溶液を、凍結－ポンプ－解凍サイクル（freeze-pump-thaw cycling）を使用して脱気し、０℃まで冷却し、ＤＩＡＤ（１．０ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）をアルゴン下で滴下して添加した。溶液をＲＴまで温め、３日間撹拌した。溶液を濾過し、溶媒を真空内で除去した。カラムクロマトグラフィーを介してケリダム酸ジメチルエステルが得られた（５０％ＥｔＯＡｃ、５０％ｐｅｔ．エーテル）。これを次いで５０ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、その後、５０ｍＬの水性ＮａＯＨ（０．３３ｇ、７．５ｍｍｏｌ）溶液を添加した。得られた混合物を５分間撹拌し、脱保護をＴＬＣによって確認した。有機溶媒を真空内で除去した。５％ギ酸を添加して酸性にし、その後、３×１００ｍＬのＥｔＯＡＣで抽出した。有機層を次いでＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空内で除去した。これによって、オフホワイト色の固体であるプロパルギルケリダム酸６が得られた（０．１７ｇ、０．７７ｍｍｏｌ、２０％）。
ケリダム酸ジメチルエステル５（０．８２ｇ、３．８ｍｍｏｌ）、プロパルギルアルコール（０．３３ｍＬ、５．７ｍｍｏｌ）、及びポリマー結合型トリフェニルホスフィン（３．４７ｇ、１．５ｍｍｏｌのロード／ｇ、５．２ｍｍｏｌ）を、５５ｍＬの新たに蒸留したＴＨＦ中に懸濁した。溶液を、凍結－ポンプ－解凍サイクル（freeze-pump-thaw cycling）を使用して脱気し、０℃まで冷却し、ＤＩＡＤ（１．０ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）をアルゴン下で滴下して添加した。溶液をＲＴまで温め、３日間撹拌した。溶液を濾過し、溶媒を真空内で除去した。カラムクロマトグラフィーを介してケリダム酸ジメチルエステルが得られた（５０％ＥｔＯＡｃ、５０％ｐｅｔ．エーテル）。これを次いで５０ｍＬのＭｅＯＨに溶解し、その後、５０ｍＬの水性ＮａＯＨ（０．３３ｇ、７．５ｍｍｏｌ）溶液を添加した。得られた混合物を５分間撹拌し、脱保護をＴＬＣによって確認した。有機溶媒を真空内で除去した。５％ギ酸を添加して酸性にし、その後、３×１００ｍＬのＥｔＯＡＣで抽出した。有機層を次いでＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空内で除去した。これによって、オフホワイト色の固体であるプロパルギルケリダム酸６が得られた（０．１７ｇ、０．７７ｍｍｏｌ、２０％）。
【0227】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ７．９３（ｓ，２Ｈ）、５．０２（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．１５（ｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ１６８．１２、１６６．９８、１５０．５４、１５０．４３、１１５．７３、７８．９７、７７．９０、７７．８８、５７．７４、５７．６８。ＨＲＭＳ（ＥＳ） Ｃ１０Ｈ８ＮＯ５の計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）ｍ／ｚ：２２２．０３９７、実測値２２２．０３９１。
【0228】
Ｏ－（エチル－２－Ｎ－ｂｏｃ－アミン）－２－アミノキノリノン（７）の合成
２－アミノキノリノン（１．０ｇ、６．２ｍｍｏｌ）、Ｎ－ｂｏｃエタノールアミン（１．４ｍＬ、９．１ｍｍｏｌ）、及びトリフェニルホスフィン（３．３ｇ、１３ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬの新たに蒸留したＴＨＦ中に溶解した。溶液を、凍結－ポンプ－解凍サイクルを使用して脱気し、０℃まで冷却し、ＤＩＡＤ（１．８ｍＬ、９．２ｍｍｏｌ）をアルゴン下で滴下して添加した。溶液をＲＴまで温め、３日間撹拌した。溶媒を次いで真空内で除去した。生成物を、１００％ＥｔＯＡｃから９０％ＥｔＯＡｃ、１０％ＭｅＯＨまででの勾配カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を真空内で除去して、オフホワイト色の固体７を得た（５５２ｍｇ、１．８２ｍｍｏｌ、２９％）。
２－アミノキノリノン（１．０ｇ、６．２ｍｍｏｌ）、Ｎ－ｂｏｃエタノールアミン（１．４ｍＬ、９．１ｍｍｏｌ）、及びトリフェニルホスフィン（３．３ｇ、１３ｍｍｏｌ）を、１０ｍＬの新たに蒸留したＴＨＦ中に溶解した。溶液を、凍結－ポンプ－解凍サイクルを使用して脱気し、０℃まで冷却し、ＤＩＡＤ（１．８ｍＬ、９．２ｍｍｏｌ）をアルゴン下で滴下して添加した。溶液をＲＴまで温め、３日間撹拌した。溶媒を次いで真空内で除去した。生成物を、１００％ＥｔＯＡｃから９０％ＥｔＯＡｃ、１０％ＭｅＯＨまででの勾配カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶媒を真空内で除去して、オフホワイト色の固体７を得た（５５２ｍｇ、１．８２ｍｍｏｌ、２９％）。
【0229】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９８（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．０Ｈｚ，２Ｈ）、７．６０（ｄｄ，Ｊ＝８．４，１．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．５５（ｄｄｄ，Ｊ＝８．５，６．７，１．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．２３（ｄｄｄ，Ｊ＝８．１，６．６，１．３Ｈｚ，２Ｈ）、６．０４（ｓ，１Ｈ）、５．０１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、４．６９（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、４．１８（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，４Ｈ）、３．６８（ｑ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，４Ｈ）、１．４６（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６２．３２、１５８．１３、１５５．９０、１４８．５５、１３０．２５、１２５．６３、１２１．９７、１２１．６０、１１７．５２、９０．０９、７９．８３、６７．５２、３９．８２、２８．３８。ＨＲＭＳ（ＥＳ） Ｃ１６Ｈ２２Ｎ３Ｏ３の計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）ｍ／ｚ：３０４．１６６１、実測値３０４．１６４９。
【0230】
アルキン－ピリドスタチン（８）の合成
プロパルギルケリダム酸６（０．１２ｇ、０．５４ｍｏｌ）を、１．２ｍＬのＤＣＭ中に溶解した。次いで、Ghosez試薬（１７０μＬ、１．３ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して添加した。オレンジ色の溶液を次いで、ＲＴで２時間撹拌した。塩素化をＴＬＣによって確認した。トリエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．３ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して添加した。溶液を次いで、ＲＴで１時間撹拌した。７（０．３７ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を１．２ｍＬのＤＣＭ中に懸濁し、次いで、混合物に滴下して添加した。混合物は赤褐色に変化し、これをアルゴン下で一晩撹拌した。粗保護生成物８ａ（示されていない）を熱いＭｅＣＮから赤色の固体として沈殿させた。赤色の固体８ａを次いでＤＣＭ中に溶解した。２：１のＤＣＭ：ＴＦＡ混合物を添加して溶液を酸性にし、Ｎ－ｂｏｃ保護を除去した。溶媒を真空内で除去し、生成物がＨＰＬＣ（１００％Ｈ２Ｏ、０．１％ＦＡから、１００％ＭｅＣＮ、０．１％ＦＡまでの勾配）を介して精製した。凍結乾燥によって、オフホワイト色の固体であるアルキン－ピリドスタチン８が得られた（５１ｍｇ、８６μｍｏｌ、１６％）。
プロパルギルケリダム酸６（０．１２ｇ、０．５４ｍｏｌ）を、１．２ｍＬのＤＣＭ中に溶解した。次いで、Ghosez試薬（１７０μＬ、１．３ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して添加した。オレンジ色の溶液を次いで、ＲＴで２時間撹拌した。塩素化をＴＬＣによって確認した。トリエチルアミン（０．１８ｍＬ、１．３ｍｍｏｌ）を０℃で滴下して添加した。溶液を次いで、ＲＴで１時間撹拌した。７（０．３７ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を１．２ｍＬのＤＣＭ中に懸濁し、次いで、混合物に滴下して添加した。混合物は赤褐色に変化し、これをアルゴン下で一晩撹拌した。粗保護生成物８ａ（示されていない）を熱いＭｅＣＮから赤色の固体として沈殿させた。赤色の固体８ａを次いでＤＣＭ中に溶解した。２：１のＤＣＭ：ＴＦＡ混合物を添加して溶液を酸性にし、Ｎ－ｂｏｃ保護を除去した。溶媒を真空内で除去し、生成物がＨＰＬＣ（１００％Ｈ２Ｏ、０．１％ＦＡから、１００％ＭｅＣＮ、０．１％ＦＡまでの勾配）を介して精製した。凍結乾燥によって、オフホワイト色の固体であるアルキン－ピリドスタチン８が得られた（５１ｍｇ、８６μｍｏｌ、１６％）。
【0231】
ＨＲＭＳ（ＥＳ） Ｃ３２Ｈ３０Ｎ７Ｏ５の計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）ｍ／ｚ：５９２．２３０８、実測値５９２．２３２７。
【0232】
ピリドスタチン分解剤（９Ａ～９Ｃ）の合成
アルキン－ピリドスタチン８（１５ｍｇ、２５μｍｏｌ）を、２．５ｍＬの２：１のＨ２Ｏ：ｔＢｕＯＨ混合物中に溶解した。硫酸銅（II）五水和物溶液（２５０μＬ、１００ｍＭ、２５μｍｏｌ）を添加し、その後、アスコルビン酸ナトリウム溶液（１．３ｍＬ、１００ｍＭ、１３０μｍｏｌ）を添加した。濁った黄色の溶液を脱気し、１０分間撹拌した。適切なアジド－イミダゾール（３ａ、３ｂ、又は３－アジドプロピオン酸）の溶液（３．８ｍＬ、１０ｍＭ）を次いで添加した。溶液をアルゴン下で２時間撹拌した。有機溶媒を真空内で除去した。次いで、生成物を、ＨＰＬＣを介して精製した（１００％Ｈ２Ｏ、０．１％ＦＡから、１００％ＭｅＣＮ、０．１％ＦＡまでの勾配）。生成物を、白色又はオフホワイト色の固体として得た。
アルキン－ピリドスタチン８（１５ｍｇ、２５μｍｏｌ）を、２．５ｍＬの２：１のＨ２Ｏ：ｔＢｕＯＨ混合物中に溶解した。硫酸銅（II）五水和物溶液（２５０μＬ、１００ｍＭ、２５μｍｏｌ）を添加し、その後、アスコルビン酸ナトリウム溶液（１．３ｍＬ、１００ｍＭ、１３０μｍｏｌ）を添加した。濁った黄色の溶液を脱気し、１０分間撹拌した。適切なアジド－イミダゾール（３ａ、３ｂ、又は３－アジドプロピオン酸）の溶液（３．８ｍＬ、１０ｍＭ）を次いで添加した。溶液をアルゴン下で２時間撹拌した。有機溶媒を真空内で除去した。次いで、生成物を、ＨＰＬＣを介して精製した（１００％Ｈ２Ｏ、０．１％ＦＡから、１００％ＭｅＣＮ、０．１％ＦＡまでの勾配）。生成物を、白色又はオフホワイト色の固体として得た。
【0233】
９Ａ（ＰＤＳ－ｄｅｇ６）。収率４８％（１１．３ｍｇ，１２μｍｏｌ）。ＨＲＭＳ（ＥＳ） Ｃ４７Ｈ５２Ｎ１２Ｏ１０の計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）ｍ／ｚ：９４９．４３２１、実測値９４９．４３４４。
９Ｂ（ＰＤＳ－ｄｅｇ４）。収率６９％（１４．８ｍｇ，１７μｍｏｌ）。ＨＲＭＳ（ＥＳ） Ｃ４３Ｈ４９Ｎ１２Ｏ８の計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）ｍ／ｚ：８６１．３７９６、実測値８６１．３７６。
９Ｃ（ＰＤＳ－ＣＢＸ）。収率２８％（４．９ｍｇ，６．９μｍｏｌ）。ＨＲＭＳ（ＥＳ） Ｃ３５Ｈ３４Ｎ１０Ｏ７の計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）ｍ／ｚ：７０７．２６９０、実測値：７０７．２６８４。
９Ｂ（ＰＤＳ－ｄｅｇ４）。収率６９％（１４．８ｍｇ，１７μｍｏｌ）。ＨＲＭＳ（ＥＳ） Ｃ４３Ｈ４９Ｎ１２Ｏ８の計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）ｍ／ｚ：８６１．３７９６、実測値８６１．３７６。
９Ｃ（ＰＤＳ－ＣＢＸ）。収率２８％（４．９ｍｇ，６．９μｍｏｌ）。ＨＲＭＳ（ＥＳ） Ｃ３５Ｈ３４Ｎ１０Ｏ７の計算値（［Ｍ＋Ｈ］＋）ｍ／ｚ：７０７．２６９０、実測値：７０７．２６８４。
【0234】
シュードノット分解剤の合成
スキーム４：シュードノット分解剤の合成
【化10】
スキーム４：シュードノット分解剤の合成
【0235】
化合物１１ａの合成
ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の２－メチルチアゾール－４－カルバルデヒド（１０．０ｇ、７８．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を、化合物１０（１６．５ｇ、８２．６ｍｍｏｌ、１６．２ｍＬ、１．１当量）に、２５℃、Ｎ２下で一度に添加した。混合物を、２５℃で３時間撹拌した。混合物にＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（２５．０ｇ、１１８ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、１０時間撹拌した。残渣を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、１０分間撹拌した。水性相をＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空内で除去した。生成物を、カラムクロマトグラフィー（石油エーテルから、１０／１の石油エーテル／酢酸エチルまでの勾配）を介して精製して、化合物１１ａ（１３．５ｇ、４３．４ｍｍｏｌ、５５％収量）を黄色の油として得た。
ＤＣＭ（１００ｍＬ）中の２－メチルチアゾール－４－カルバルデヒド（１０．０ｇ、７８．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を、化合物１０（１６．５ｇ、８２．６ｍｍｏｌ、１６．２ｍＬ、１．１当量）に、２５℃、Ｎ２下で一度に添加した。混合物を、２５℃で３時間撹拌した。混合物にＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（２５．０ｇ、１１８ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加し、１０時間撹拌した。残渣を水（５０ｍＬ）中に注ぎ、１０分間撹拌した。水性相をＤＣＭ（３×２０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過した。溶媒を真空内で除去した。生成物を、カラムクロマトグラフィー（石油エーテルから、１０／１の石油エーテル／酢酸エチルまでの勾配）を介して精製して、化合物１１ａ（１３．５ｇ、４３．４ｍｍｏｌ、５５％収量）を黄色の油として得た。
【0236】
ＬＣＭＳ［＋スキャン］：計算値ｍ／ｚ Ｃ２０Ｈ２６Ｎ３Ｏ３Ｓ ３８８．２；実測値３８８．１。
【0237】
化合物１２ａの合成
ＴＦＡ（４０．０ｇ、３５１ｍｍｏｌ、２６ｍＬ、８．４当量）を、ＤＣＭ（１３０ｍＬ）中の化合物１１ａ（１３．０ｇ、４１．７ｍｍｏｌ、１．０当量）に、２５℃、Ｎ２で添加した。混合物を１２時間撹拌した。溶媒を真空内で除去して、化合物１２ａのＴＦＡ塩（２３．０ｇ、粗生成物）を赤色の油として得た。
ＴＦＡ（４０．０ｇ、３５１ｍｍｏｌ、２６ｍＬ、８．４当量）を、ＤＣＭ（１３０ｍＬ）中の化合物１１ａ（１３．０ｇ、４１．７ｍｍｏｌ、１．０当量）に、２５℃、Ｎ２で添加した。混合物を１２時間撹拌した。溶媒を真空内で除去して、化合物１２ａのＴＦＡ塩（２３．０ｇ、粗生成物）を赤色の油として得た。
【0238】
ＬＣＭＳ［＋スキャン］：計算値ｍ／ｚ Ｃ１０Ｈ１８Ｎ３Ｓ ２１２．１；実測値２１２．０。
【0239】
ＭＴＤＢ（化合物１３ａ）の合成
ＤＣＭ（２００ｍＬ）中の化合物１２ａ（２０．０ｇ、４５．５ｍｍｏｌ、１．０当量）溶液に、ＴＥＡ（９．２１ｇ、９１．０ｍｍｏｌ、１２．７ｍＬ、２．０当量）を、２０℃、Ｎ２下で添加した。次いで、エチル２－イソシアナトベンゾエート（isocyanatobenzoate）（８．７０ｇ、４５．５ｍｍｏｌ、１．０当量）を、混合物に０℃で添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。溶媒を真空内で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１００／１～２０／１の石油エーテル／酢酸エチル勾配）によって精製して、ＭＴＤＢ（化合物１３ａ、５．６２ｇ、１４．０ｍｍｏｌ、３１％収量）をオフホワイト色の固体として得た。
ＤＣＭ（２００ｍＬ）中の化合物１２ａ（２０．０ｇ、４５．５ｍｍｏｌ、１．０当量）溶液に、ＴＥＡ（９．２１ｇ、９１．０ｍｍｏｌ、１２．７ｍＬ、２．０当量）を、２０℃、Ｎ２下で添加した。次いで、エチル２－イソシアナトベンゾエート（isocyanatobenzoate）（８．７０ｇ、４５．５ｍｍｏｌ、１．０当量）を、混合物に０℃で添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。溶媒を真空内で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１００／１～２０／１の石油エーテル／酢酸エチル勾配）によって精製して、ＭＴＤＢ（化合物１３ａ、５．６２ｇ、１４．０ｍｍｏｌ、３１％収量）をオフホワイト色の固体として得た。
【0240】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δ８．４２（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、８．０８（ｂｒ ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．６２（ｓ，１Ｈ）、７．５２～７．５９（ｍ，１Ｈ）、７．０９（ｂｒ ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．３４～４．４６（ｍ，４Ｈ）、３．９３（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、３．７７（ｂｒ ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．４９（ｂｒ ｓ，４Ｈ）、３．２８～３．３１（ｍ，１Ｈ）、２．７４（ｓ，３Ｈ）、２．３１（ｂｒ ｄ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ）、１．４３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）。ＬＣＭＳ［＋スキャン］：計算値ｍ／ｚ Ｃ２０Ｈ２７Ｎ４Ｏ３Ｓ ４０３．２；実測値４０３．１。
【0241】
化合物１４ａの合成
ＥｔＯＨ（１２０ｍＬ）中のＭＴＤＢ（化合物１３ａ ５．６０ｇ、１３．９ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＨ２Ｏ（３０ｍＬ）の混合物に、ＬｉＯＨ一水和物（２．３４ｇ、５５．７ｍｍｏｌ、４．０当量）を、２５℃、Ｎ２下で添加した。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。混合物を１ＭのＨＣｌでｐＨ６に調整し、水性相を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。次いで、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして真空内で濃縮して、化合物１４ａ（２．６０ｇ、６．９４ｍｍｏｌ、５０％）を黄色の固体として得た。
ＥｔＯＨ（１２０ｍＬ）中のＭＴＤＢ（化合物１３ａ ５．６０ｇ、１３．９ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＨ２Ｏ（３０ｍＬ）の混合物に、ＬｉＯＨ一水和物（２．３４ｇ、５５．７ｍｍｏｌ、４．０当量）を、２５℃、Ｎ２下で添加した。混合物を２５℃で１２時間撹拌した。混合物を１ＭのＨＣｌでｐＨ６に調整し、水性相を酢酸エチル（３×４０ｍＬ）で抽出した。次いで、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして真空内で濃縮して、化合物１４ａ（２．６０ｇ、６．９４ｍｍｏｌ、５０％）を黄色の固体として得た。
【0242】
ＬＣＭＳ［＋スキャン］：計算値ｍ／ｚ Ｃ１８Ｈ２３Ｎ４Ｏ３Ｓ ３７５．１；実測値３７５．１。
【0243】
化合物１５ａの合成
化合物１４ａ（２．６０ｇ、６．９４ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＤＭＦ（２００ｍＬ）中のプロパルギルアミン（１．１５ｇ、２０．８ｍｍｏｌ、１．３３ｍＬ、３．０当量）の混合物に、ＤＩＥＡ（４．４９ｇ、３４．７ｍｍｏｌ、６．０５ｍＬ、５．００当量）を、２５℃、Ｎ２下で添加した。混合物に、Ｔ３Ｐ（４．４２ｇ、１３．９ｍｍｏｌ、４．１３ｍＬ、２．０当量）を添加し、５０℃で１２時間撹拌した。混合物を水（２００ｍＬ）に注ぎ、水性相を酢酸エチル（３×７０ｍＬ）で抽出した。次いで、有機相をブライン（６０ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空内で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１００／１の石油エーテル／酢酸エチルから、酢酸エチルまでの勾配）によって精製して、１５ａ（１．２０ｇ、２．８０ｍｍｏｌ、４０％収量）を得た。
化合物１４ａ（２．６０ｇ、６．９４ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＤＭＦ（２００ｍＬ）中のプロパルギルアミン（１．１５ｇ、２０．８ｍｍｏｌ、１．３３ｍＬ、３．０当量）の混合物に、ＤＩＥＡ（４．４９ｇ、３４．７ｍｍｏｌ、６．０５ｍＬ、５．００当量）を、２５℃、Ｎ２下で添加した。混合物に、Ｔ３Ｐ（４．４２ｇ、１３．９ｍｍｏｌ、４．１３ｍＬ、２．０当量）を添加し、５０℃で１２時間撹拌した。混合物を水（２００ｍＬ）に注ぎ、水性相を酢酸エチル（３×７０ｍＬ）で抽出した。次いで、有機相をブライン（６０ｍＬ）で洗浄し、有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして溶媒を真空内で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（１００／１の石油エーテル／酢酸エチルから、酢酸エチルまでの勾配）によって精製して、１５ａ（１．２０ｇ、２．８０ｍｍｏｌ、４０％収量）を得た。
【0244】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１０．５４（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、８．４６（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．４３～７．５１（ｍ，２Ｈ）、７．１１～７．１１（ｍ，１Ｈ）、６．９９（ｑ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ）、６．４９（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、４．２２（ｄｄ，Ｊ＝５．２，２．６Ｈｚ，２Ｈ）、３．７２～３．８３（ｍ，４Ｈ）、３．６４～３．６９（ｍ，２Ｈ）、２．７７～２．９６（ｍ，４Ｈ）、２．７２（ｓ，３Ｈ）、２．３２（ｔ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ）、２．０４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１５．２Ｈｚ，２Ｈ）。ＬＣＭＳ［＋スキャン］：計算値ｍ／ｚ Ｃ２１Ｈ２６Ｎ５Ｏ２Ｓ ４１２．２；実測値４１２．０。
【0245】
ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（化合物１６ａ）の合成
ＤＣＭ（５ｍＬ）中のアジド－イミダゾール３ａ（２００ｍｇ、２８０μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１５ａ（１１５ｍｇ、２８０μｍｏｌ、１．０当量）、及びＣｕＳＯ４（２２．３ｍｇ、１４０μｍｏｌ、２１．５ｕＬ、０．５当量）、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）、並びにＨ２Ｏ（５ｍＬ）の混合物を、２０℃で０．５時間撹拌した。次いで、ＮａＡｓｃ（１１．１ｍｇ、５５．９μｍｏｌ、０．２当量）を混合物に添加し、２０℃で４．５時間撹拌した。混合物をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）で希釈し、次いで、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして真空内で濃縮した。残渣を、ＨＰＬＣ（カラム：Phenomenex社製のGemini-NX、８０×４０ｍｍ×３ｕｍ、移動相：［水（１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～３５％、８分間）を介して精製して、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ（２８．０ｍｇ、３４．９μｍｏｌ、１３％収量）を淡黄色の油として得た。
ＤＣＭ（５ｍＬ）中のアジド－イミダゾール３ａ（２００ｍｇ、２８０μｍｏｌ、１．０当量）、化合物１５ａ（１１５ｍｇ、２８０μｍｏｌ、１．０当量）、及びＣｕＳＯ４（２２．３ｍｇ、１４０μｍｏｌ、２１．５ｕＬ、０．５当量）、ＭｅＯＨ（５ｍＬ）、並びにＨ２Ｏ（５ｍＬ）の混合物を、２０℃で０．５時間撹拌した。次いで、ＮａＡｓｃ（１１．１ｍｇ、５５．９μｍｏｌ、０．２当量）を混合物に添加し、２０℃で４．５時間撹拌した。混合物をＨ２Ｏ（１０ｍＬ）で希釈し、次いで、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして真空内で濃縮した。残渣を、ＨＰＬＣ（カラム：Phenomenex社製のGemini-NX、８０×４０ｍｍ×３ｕｍ、移動相：［水（１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３）－ＡＣＮ］；Ｂ％：１５％～３５％、８分間）を介して精製して、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ（２８．０ｍｇ、３４．９μｍｏｌ、１３％収量）を淡黄色の油として得た。
【0246】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）：δ１１．０３（ｓ，１Ｈ）、９．２９（ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ）、８．３７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．９６（ｓ，１Ｈ）、７．７４（ｂｒ ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．６３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、７．４３（ｔ，Ｊ＝７．６０Ｈｚ，１Ｈ）、７．１５～７．３１（ｍ，２Ｈ）、６．９９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、６．８９（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、４．４６～４．５３（ｍ，４Ｈ）、４．１０（ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．７７～３．８１（ｍ，２Ｈ）、３．７１（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、３．６６（ｂｒ ｔ，Ｊ＝５．０７Ｈｚ，２Ｈ）、３．４４～３．５７（ｍ，２０Ｈ）、３．３４（ｓ，２５Ｈ）、２．７３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、２．６２（ｂｒ ｓ，６Ｈ）、１．８４（ｂｒ ｓ，２Ｈ）。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：計算値ｍ／ｚ Ｃ３６Ｈ５３Ｎ１０Ｏ７Ｓ ７６９．３８１９；実測値７６９．３８３０。
【0247】
シュードノット実験のためのコントロール分解剤の合成
スキーム５：シュードノットコントロール分解剤（ＴＢＤ－ｄｅｇ）の合成
【化11】
スキーム５：シュードノットコントロール分解剤（ＴＢＤ－ｄｅｇ）の合成
【0248】
化合物１１ｂの合成
ＤＣＭ（８０ｍＬ）中のチオフェン－３－カルバルデヒド（２．００ｇ、１７．８ｍｍｏｌ、１．６３ｍＬ、１．０当量）に、化合物１０（３．９３ｇ、１９．６ｍｍｏｌ、３．８５ｍＬ、１．１当量）を、２０℃、Ｎ２下で添加した。混合物を２０℃で３時間撹拌した。次いで、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（５．６７ｇ、２６．８ｍｍｏｌ、１．５当量）を混合物に０℃で添加し、２０℃で１０時間撹拌した。反応混合物を、水（６０ｍＬ）を添加することによってクエンチし、ＤＣＭ（２×２０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして真空内で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／１～２０／１の勾配）によって精製して、化合物１１ｂ（１．７０ｇ、５．７３ｍｍｏｌ、３２％収量）を赤色の油として得た。
ＤＣＭ（８０ｍＬ）中のチオフェン－３－カルバルデヒド（２．００ｇ、１７．８ｍｍｏｌ、１．６３ｍＬ、１．０当量）に、化合物１０（３．９３ｇ、１９．６ｍｍｏｌ、３．８５ｍＬ、１．１当量）を、２０℃、Ｎ２下で添加した。混合物を２０℃で３時間撹拌した。次いで、ＮａＢＨ（ＯＡｃ）３（５．６７ｇ、２６．８ｍｍｏｌ、１．５当量）を混合物に０℃で添加し、２０℃で１０時間撹拌した。反応混合物を、水（６０ｍＬ）を添加することによってクエンチし、ＤＣＭ（２×２０ｍＬ）で抽出した。組み合わされた有機層をブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、そして真空内で濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／１～２０／１の勾配）によって精製して、化合物１１ｂ（１．７０ｇ、５．７３ｍｍｏｌ、３２％収量）を赤色の油として得た。
【0249】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ７．２１～７．３１（ｍ，１Ｈ）、７．０３～７．１５（ｍ，２Ｈ）、３．６４（ｓ，２Ｈ）、３．３７～３．５４（ｍ，４Ｈ）、２．５５～２．６８（ｍ，４Ｈ）、１．８１（ｂｒ ｄｄ，Ｊ＝１０．８，４．９Ｈｚ，２Ｈ）、１．４０～１．５２（ｍ，９Ｈ）。
【0250】
化合物１２ｂの合成
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の化合物１１ｂ（１．７０ｇ、５．７３ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ＴＦＡ（６．１６ｇ、５４．０ｍｍｏｌ、４．００ｍＬ、９．４当量）を、２０℃、Ｎ２下で添加した。混合物を、２０℃で８時間撹拌した。溶媒を真空内で除去して化合物１２ｂ（３．００ｇ、粗生成物）のＴＦＡ塩を赤色の油として得、これを、さらなる精製を伴わずに次のステップで使用した。
ＤＣＭ（２０ｍＬ）中の化合物１１ｂ（１．７０ｇ、５．７３ｍｍｏｌ、１．０当量）の溶液に、ＴＦＡ（６．１６ｇ、５４．０ｍｍｏｌ、４．００ｍＬ、９．４当量）を、２０℃、Ｎ２下で添加した。混合物を、２０℃で８時間撹拌した。溶媒を真空内で除去して化合物１２ｂ（３．００ｇ、粗生成物）のＴＦＡ塩を赤色の油として得、これを、さらなる精製を伴わずに次のステップで使用した。
【0251】
ＴＤＢ（化合物１３ｂ）の合成
ＤＣＭ（４０ｍＬ）中の化合物１２ｂ（３．００ｇ、９．６７ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物に、ＴＥＡ（１．９６ｇ、１９．３ｍｍｏｌ、２．６９ｍＬ、２．０当量）を、２０℃、Ｎ２下で添加した。次いで、エチル２－イソシアナトベンゾエート（１．８５ｇ、９．６７ｍｍｏｌ、１．０当量）を、混合物に０℃で添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。溶媒を真空内で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／１～２０／１の勾配）によって精製して、ＴＤＢ １３ｂ（３．３０ｇ、８．３５ｍｍｏｌ、８６％収量）をオフホワイト色の固体として得た。
ＤＣＭ（４０ｍＬ）中の化合物１２ｂ（３．００ｇ、９．６７ｍｍｏｌ、１．０当量）の混合物に、ＴＥＡ（１．９６ｇ、１９．３ｍｍｏｌ、２．６９ｍＬ、２．０当量）を、２０℃、Ｎ２下で添加した。次いで、エチル２－イソシアナトベンゾエート（１．８５ｇ、９．６７ｍｍｏｌ、１．０当量）を、混合物に０℃で添加した。混合物を２０℃で１２時間撹拌した。溶媒を真空内で除去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル／酢酸エチル＝１００／１～２０／１の勾配）によって精製して、ＴＤＢ １３ｂ（３．３０ｇ、８．３５ｍｍｏｌ、８６％収量）をオフホワイト色の固体として得た。
【0252】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１０．５９（ｓ，１Ｈ）、８．５２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．９４（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．５３Ｈｚ，１Ｈ）、７．４２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ）、７．１４～７．２４（ｍ，１Ｈ）、６．９６～７．０７（ｍ，２Ｈ）、６．８８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．２８（ｑ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．５５～３．６７（ｍ，６Ｈ）、２．７０（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、２．５３～２．６５（ｍ，２Ｈ）、１．９１（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、１．３３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ）。ＬＣＭＳ［＋スキャン］：計算値ｍ／ｚ Ｃ２０Ｈ２６Ｎ３Ｏ３Ｓ ３８８．２；実測値３８８．１。
【0253】
化合物１４ｂの合成
ＥｔＯＨ（１．２ｍＬ）中のＴＤＢ２１（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＨ２Ｏ（１．２ｍＬ）の混合物に、ＬｉＯＨ一水和物（６５ｇ、１．５ｍｍｏｌ、６．０当量）を、２５℃、Ｎ２下で添加した。混合物を２５℃で１６時間撹拌し、この時点の後、追加のＬｉＯＨ一水和物（１３０ｇ、３．１ｍｍｏｌ、１２．０当量）を添加した。２時間後、混合物を１ＭのＨＣｌでｐＨ６に調整し、水性相をＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出した。次いで、有機相を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして真空内で濃縮して、化合物１４ｂ（７０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、７６％）を黄色の油状の固体として得た。
ＥｔＯＨ（１．２ｍＬ）中のＴＤＢ２１（１００ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ、１．０当量）及びＨ２Ｏ（１．２ｍＬ）の混合物に、ＬｉＯＨ一水和物（６５ｇ、１．５ｍｍｏｌ、６．０当量）を、２５℃、Ｎ２下で添加した。混合物を２５℃で１６時間撹拌し、この時点の後、追加のＬｉＯＨ一水和物（１３０ｇ、３．１ｍｍｏｌ、１２．０当量）を添加した。２時間後、混合物を１ＭのＨＣｌでｐＨ６に調整し、水性相をＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で抽出した。次いで、有機相を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして真空内で濃縮して、化合物１４ｂ（７０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、７６％）を黄色の油状の固体として得た。
【0254】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）：δＨ ８．４１（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）、８．０８（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．７６（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、７．６４（ｍ，１Ｈ）、７．５３（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．３２（ｄ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，１Ｈ）、７．０７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、４．４６（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、３．９５（ｍ，２Ｈ）、３．７５（ｔｒ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ）、３．４７（ｍ，４Ｈ）、２．３４（ｍ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）δＣ１７０．９、１５５．４、１４２．７、１３３．７、１３１．２、１２９．７、１２９．３、１２８．８、１２７．６、１２１．２、１１９．０、１１５．３、５５．２、５４．９、５３．３、４４．５、４０．２、２４．０。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：計算値ｍ／ｚ Ｃ１８Ｈ２２Ｎ３Ｏ３Ｓ ３６０．１３８２；実測値３６０．１３８６。
【0255】
化合物１５ｂの合成
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物１４ｂ（７０ｍｇ、１９５μｍｏｌ、１．０当量）及びプロパルギルアミン（１１．２ｍｇ、２００μｍｏｌ、１３．１μＬ、１．０当量）の混合物に、ＴＥＡ（７５．５ｍｇ、７４．６μｍｏｌ、１０４μＬ、４．０当量）を、２５℃、Ｎ２下で添加した。混合物に、ＤＭＦ（２３８ｍｇ、３７０μｍｏｌ、１．９当量）中の５０％Ｔ３Ｐを添加し、２５℃で１６時間撹拌した。溶媒を真空内で除去し、表題の化合物をカラム（ＤＣＭから、９：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨまでの勾配）上で精製した。残留ＤＭＦを除去するため、化合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解し、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）及び１％水性ＮａＯＨ溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を真空内で除去して、１５ｂ（２６ｍｇ、６６μｍｏｌ、３４％収量、４：１の比率）を得た。
ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物１４ｂ（７０ｍｇ、１９５μｍｏｌ、１．０当量）及びプロパルギルアミン（１１．２ｍｇ、２００μｍｏｌ、１３．１μＬ、１．０当量）の混合物に、ＴＥＡ（７５．５ｍｇ、７４．６μｍｏｌ、１０４μＬ、４．０当量）を、２５℃、Ｎ２下で添加した。混合物に、ＤＭＦ（２３８ｍｇ、３７０μｍｏｌ、１．９当量）中の５０％Ｔ３Ｐを添加し、２５℃で１６時間撹拌した。溶媒を真空内で除去し、表題の化合物をカラム（ＤＣＭから、９：１のＤＣＭ：ＭｅＯＨまでの勾配）上で精製した。残留ＤＭＦを除去するため、化合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解し、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）及び１％水性ＮａＯＨ溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を真空内で除去して、１５ｂ（２６ｍｇ、６６μｍｏｌ、３４％収量、４：１の比率）を得た。
【0256】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，主ジアステレオマーについて報告）：δ１０．４２（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、８．３５（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．３６～７．４１（ｍ，２Ｈ）、７．２６（ｍ，１Ｈ）、７．１１（ｍ，１Ｈ）、７．０６（ｍ，１Ｈ）、６．８７～６．９７（ｍ，２Ｈ）、６．４９（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、４．１６（ｄｄ，Ｊ＝５．２，２．５Ｈｚ，２Ｈ）、３．５９～３．７１（ｍ，６Ｈ）、２．７５（ｂｒ ｓ，２Ｈ）、２．６５（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ）、２．２７（ｔ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，１Ｈ）、１．９６（ｂｒ ｓ，２Ｈ）。１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δＣ １６９．４、１５５．４、１４１．５、１４０．０、１３２．５、１２８．４、１２６．８、１２５．５、１２２．７、１２１．１、１２０．９、１１８．９、７９．２、７１．８、５７．４、５５．０、４６．０、２９．６。ＨＲＭＳ［＋スキャン］：計算値ｍ／ｚ Ｃ３６Ｈ５２Ｎ９Ｏ７Ｓ ３９７．１６９８；実測値３９７．１７１６。
【0257】
ＴＤＢ－ｄｅｇ（化合物１６ｂ）の合成
化合物１５ｂ（９．９ｍｇ、２５μｍｏｌ、１．０当量）を、Ｈ２Ｏ（１．７ｍＬ）及びｔＢｕＯＨ（０．８ｍＬ）の混合物中に溶解した。水性ＣｕＳＯ４溶液（２５０μＬ、１００ｍＭ、２５μｍｏｌ、１．０当量）を添加し、その後、水性ＮａＡｓｃ溶液（１．３ｍＬ、１００ｍＭ、１３０μｍｏｌ、５．２当量）を添加した。得られた濁った黄色の混合物を、アルゴン雰囲気下に置いた。アジド－イミダゾール３ａ（３．８ｍＬ、１０ｍＭ、３８μｍｏｌ、１．５当量）の水性溶液を次いで添加した。反応物を室温で１時間撹拌し、その後、この反応混合物は澄明な黄色に変化した。反応をＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物（９．３ｍｇ、２５μｍｏｌ、１当量）でクエンチし、有機溶媒を真空内で除去し、そしてＨＰＬＣを介して混合物を精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥し、得られたＴＤＢ－ｄｅｇ（１５ｂ）を黄色から茶色の油状の固体（１０．２ｍｇ、１４μｍｏｌ、５４％収量）として得た。
化合物１５ｂ（９．９ｍｇ、２５μｍｏｌ、１．０当量）を、Ｈ２Ｏ（１．７ｍＬ）及びｔＢｕＯＨ（０．８ｍＬ）の混合物中に溶解した。水性ＣｕＳＯ４溶液（２５０μＬ、１００ｍＭ、２５μｍｏｌ、１．０当量）を添加し、その後、水性ＮａＡｓｃ溶液（１．３ｍＬ、１００ｍＭ、１３０μｍｏｌ、５．２当量）を添加した。得られた濁った黄色の混合物を、アルゴン雰囲気下に置いた。アジド－イミダゾール３ａ（３．８ｍＬ、１０ｍＭ、３８μｍｏｌ、１．５当量）の水性溶液を次いで添加した。反応物を室温で１時間撹拌し、その後、この反応混合物は澄明な黄色に変化した。反応をＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物（９．３ｍｇ、２５μｍｏｌ、１当量）でクエンチし、有機溶媒を真空内で除去し、そしてＨＰＬＣを介して混合物を精製した。生成物を含有する画分を凍結乾燥し、得られたＴＤＢ－ｄｅｇ（１５ｂ）を黄色から茶色の油状の固体（１０．２ｍｇ、１４μｍｏｌ、５４％収量）として得た。
【0258】
ＨＲＭＳ［＋スキャン］：計算値ｍ／ｚ Ｃ３６Ｈ５２Ｎ９Ｏ７Ｓ ７５４．３７１０；実測値７５４．３６９８。
【0259】
クロラムフェニコール分解剤の合成
スキーム６：クロラムフェニコール－ＰＥＧ－イミダゾール分解剤の合成
【化12】
スキーム６：クロラムフェニコール－ＰＥＧ－イミダゾール分解剤の合成
【0260】
クロラムフェニコール－６ＰＥＧ－イミダゾール分解剤（１８ａ）の合成
プロピオール酸（１．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中に不活性条件下で溶解し、０℃まで冷却した。ＨＡＴＵ（２．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。（１Ｒ，２Ｒ）－（－）－２－アミノ－１－（４－ニトロフェニル）－１，３－プロパンジオール（１．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。濾過した後、粗混合物を銅クリック反応に直接使用した。アジド－イミダゾール３ａ（１．０ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４（５ｍｏｌ％）、アスコルビン酸ナトリウム（０．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。トルエンを添加した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣを介して精製した。収量：１０％（黄色の油）。
プロピオール酸（１．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中に不活性条件下で溶解し、０℃まで冷却した。ＨＡＴＵ（２．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。（１Ｒ，２Ｒ）－（－）－２－アミノ－１－（４－ニトロフェニル）－１，３－プロパンジオール（１．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。濾過した後、粗混合物を銅クリック反応に直接使用した。アジド－イミダゾール３ａ（１．０ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４（５ｍｏｌ％）、アスコルビン酸ナトリウム（０．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。トルエンを添加した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣを介して精製した。収量：１０％（黄色の油）。
【0261】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ８．２９（ｓ，１Ｈ）、８．１４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、７．７９（ｓ，１Ｈ）、７．６７（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ）、７．４４（ｓ，１Ｈ）、７．２２（ｓ，１Ｈ）、５．２３（ｄ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，１Ｈ）、４．６１～４．５６（ｍ，２Ｈ）、４．３４（ｓ，１Ｈ）、４．２２（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ）、３．８９～３．８２（ｍ，２Ｈ）、３．７９～３．６８（ｍ，２Ｈ）、３．６２～３．５０（ｍ，１８Ｈ）。ＭＳ：Ｃ２７Ｈ３９Ｎ７Ｏ１０のｍ／ｚ：６２１．３。
【0262】
クロラムフェニコール－２ＰＥＧ－イミダゾール分解剤（１８ｂ）の合成
プロピオール酸（１．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中に不活性条件下で溶解し、０℃まで冷却した。ＨＡＴＵ（２．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。（１Ｒ，２Ｒ）－（－）－２－アミノ－１－（４－ニトロフェニル）－１，３－プロパンジオール（１．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。濾過した後、粗混合物を銅クリック反応に直接使用した。アジド－イミダゾール３ｃ（１．０ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４（５ｍｏｌ％）、アスコルビン酸ナトリウム（０．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。トルエンを添加した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣを介して精製した。収量：１０％（白色の固体）。
プロピオール酸（１．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中に不活性条件下で溶解し、０℃まで冷却した。ＨＡＴＵ（２．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。（１Ｒ，２Ｒ）－（－）－２－アミノ－１－（４－ニトロフェニル）－１，３－プロパンジオール（１．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。濾過した後、粗混合物を銅クリック反応に直接使用した。アジド－イミダゾール３ｃ（１．０ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４（５ｍｏｌ％）、アスコルビン酸ナトリウム（０．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。トルエンを添加した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣを介して精製した。収量：１０％（白色の固体）。
【0263】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ８．１９（ｓ，１Ｈ）、８．１６（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、７．６９（ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ，２Ｈ）、７．５５（ｓ，１Ｈ）、７．００（ｓ，１Ｈ）、６．８８（ｓ，１Ｈ）、５．２５（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ）、４．６０（ｄｄ，Ｊ＝５．５，４．５Ｈｚ，２Ｈ）、４．３８（ｄｄｄ，Ｊ＝７．０，５．９，２．９Ｈｚ，１Ｈ）、４．１４（ｄｄ，Ｊ＝５．５，４．４Ｈｚ，２Ｈ）、３．８９（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，７．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．８４（ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．７５（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，５．９Ｈｚ，１Ｈ）、３．７１（ｔ，Ｊ＝４．９Ｈｚ，２Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１９Ｈ２３Ｎ７Ｏ６のｍ／ｚ：４４５．２。
【0264】
クロラムフェニコール－エチル－イミダゾール分解剤（１８ｃ）の合成
プロピオール酸（１．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中に不活性条件下で溶解し、０℃まで冷却した。ＨＡＴＵ（２．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。（１Ｒ，２Ｒ）－（－）－２－アミノ－１－（４－ニトロフェニル）－１，３－プロパンジオール（１．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。濾過した後、粗混合物を銅クリック反応に直接使用した。アジド－イミダゾール４（１．０ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４（５ｍｏｌ％）、アスコルビン酸ナトリウム（０．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。トルエンを添加した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣを介して精製した。収量：１２％（白色の固体）。
プロピオール酸（１．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中に不活性条件下で溶解し、０℃まで冷却した。ＨＡＴＵ（２．０ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（２．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。（１Ｒ，２Ｒ）－（－）－２－アミノ－１－（４－ニトロフェニル）－１，３－プロパンジオール（１．０ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。濾過した後、粗混合物を銅クリック反応に直接使用した。アジド－イミダゾール４（１．０ｍｍｏｌ）、ＣｕＳＯ４（５ｍｏｌ％）、アスコルビン酸ナトリウム（０．２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。トルエンを添加した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。粗生成物を、ｐｒｅｐ－ＨＰＬＣを介して精製した。収量：１２％（白色の固体）。
【0265】
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）δ８．１４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、８．０３（ｓ，１Ｈ）、７．６４（ｄ，Ｊ＝８．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．４３（ｓ，１Ｈ）、６．９７（ｓ，１Ｈ）、６．９３（ｓ，１Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝２．７Ｈｚ，１Ｈ）、４．８２（ｄｄ，Ｊ＝６．８，５．０Ｈｚ，２Ｈ）、４．５８（ｄｄ，Ｊ＝６．７，４．９Ｈｚ，２Ｈ）、４．３１（ｄｄｄ，Ｊ＝７．２，５．９，２．８Ｈｚ，１Ｈ）、３．８４（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，７．２Ｈｚ，１Ｈ）、３．６９（ｄｄ，Ｊ＝１０．９，５．９Ｈｚ，１Ｈ）。ＭＳ：Ｃ１７Ｈ１９Ｎ７Ｏ５のｍ／ｚ：４０１，１。
【0266】
Ｇ－四重鎖の標的化及びＲＮＡの分解
公知のＧ４バインダーであるピリドスタチンを、異なる長さのアジド－イミダゾール（９Ａ、９Ｂ）と繋ぐことによって、２つの分解剤を、ＲＮＡ Ｇ－四重鎖（ｒＧ４）を標的化するように合理的に設計した。２つの構成要素を繋ぐために使用した銅誘導型のアジド－アルキン環付加（ＣｕＡＡＣ、copper-induced azide-alkyne cycloaddition）は大きな基質アレイに適用することができ、アミド及び生物学的システムで良く忍容される部分の生物学的等価体である、トリアゾールを生じさせる。本発明者らは、同一の戦略を利用して、ＲＮＡ Ｇ－四重鎖に選択的に結合しＤＮＡ Ｇ－四重鎖には結合しないことが分かっているピリドスタチン誘導体であるＣＢＸ－ＰＤＳを合成した。２つのｒＧ４分解剤及び結合コントロールを、インビトロ及び細胞システムで試験した。
公知のＧ４バインダーであるピリドスタチンを、異なる長さのアジド－イミダゾール（９Ａ、９Ｂ）と繋ぐことによって、２つの分解剤を、ＲＮＡ Ｇ－四重鎖（ｒＧ４）を標的化するように合理的に設計した。２つの構成要素を繋ぐために使用した銅誘導型のアジド－アルキン環付加（ＣｕＡＡＣ、copper-induced azide-alkyne cycloaddition）は大きな基質アレイに適用することができ、アミド及び生物学的システムで良く忍容される部分の生物学的等価体である、トリアゾールを生じさせる。本発明者らは、同一の戦略を利用して、ＲＮＡ Ｇ－四重鎖に選択的に結合しＤＮＡ Ｇ－四重鎖には結合しないことが分かっているピリドスタチン誘導体であるＣＢＸ－ＰＤＳを合成した。２つのｒＧ４分解剤及び結合コントロールを、インビトロ及び細胞システムで試験した。
【0267】
ｒＧ４オリゴマーのインビトロでの分解
本発明者らの分解剤がＧ４構造を選択的に分解できることを示すために、本発明者らは、異なるオリゴマー及びカチオンの存在下でのそれらの活性を調べた。本発明者らは、本発明者らの分解剤を、ＮＲＡＳ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内のｒＧ４構造に対応するＲＮＡオリゴマー又はｒＧ４を形成できなかったその変異型のいずれかとインキュベートした。さらに、本発明者らは、Ｋ＋（ｒＧ４形成のプロモーター）及びＬｉ＋（ｒＧ４形成を阻害することが分かっている）の存在下で本発明者らの分子を試験した。ｒＧ４コンピテントオリゴマーでは、分解はＫ＋の存在下でのみ見られ、Ｌｉ＋の存在下では見られない（図２ａ）。このことは、これら分子によって標的化されるＧに富んだ配列をオリゴマーが有するだけでは不十分であることを示唆している。オリゴマーは、分解されるには、Ｇ－四重鎖を形成していなくてはならない。際立ったことに、Ｋ＋又はＬｉ＋のいずれかを伴う破壊されたｒＧ４インコンピテントＮＲＡＳ配列では分解は見られず、このことは同様に、これらの分解剤がｒＧ４構造に対して特異的に作用することを示している（図２ｂ）。さらに、ｒＧ４バインダー部分であるＰＤＳを有するが分解剤は有していないコントロール分子であるＣＢＸ－ＰＤＳでは分解は見られず、このことは、分解を達成するには結合のみでは不十分であり、分解剤部分が必要であることを示している（図２ａ、図２ｂ）。興味深いことに、本発明者らは、６つのＰＥＧサブユニットからなるリンカーを有する分解剤であるＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）が、４つのＰＥＧサブユニットを有するＰＤＳ－ｄｅｇ４（９Ｂ）よりも速くＲＮＡを分解していることを観察した。このことは、リンカーが長いほど、届く範囲が広いことの結果であり得る。総合すると、これらの実験は、本発明者らの分解剤がｒＧ４種を特異的に切断するがフォールディングしていないＲＮＡ領域は切断しないことを示している。
本発明者らの分解剤がＧ４構造を選択的に分解できることを示すために、本発明者らは、異なるオリゴマー及びカチオンの存在下でのそれらの活性を調べた。本発明者らは、本発明者らの分解剤を、ＮＲＡＳ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ内のｒＧ４構造に対応するＲＮＡオリゴマー又はｒＧ４を形成できなかったその変異型のいずれかとインキュベートした。さらに、本発明者らは、Ｋ＋（ｒＧ４形成のプロモーター）及びＬｉ＋（ｒＧ４形成を阻害することが分かっている）の存在下で本発明者らの分子を試験した。ｒＧ４コンピテントオリゴマーでは、分解はＫ＋の存在下でのみ見られ、Ｌｉ＋の存在下では見られない（図２ａ）。このことは、これら分子によって標的化されるＧに富んだ配列をオリゴマーが有するだけでは不十分であることを示唆している。オリゴマーは、分解されるには、Ｇ－四重鎖を形成していなくてはならない。際立ったことに、Ｋ＋又はＬｉ＋のいずれかを伴う破壊されたｒＧ４インコンピテントＮＲＡＳ配列では分解は見られず、このことは同様に、これらの分解剤がｒＧ４構造に対して特異的に作用することを示している（図２ｂ）。さらに、ｒＧ４バインダー部分であるＰＤＳを有するが分解剤は有していないコントロール分子であるＣＢＸ－ＰＤＳでは分解は見られず、このことは、分解を達成するには結合のみでは不十分であり、分解剤部分が必要であることを示している（図２ａ、図２ｂ）。興味深いことに、本発明者らは、６つのＰＥＧサブユニットからなるリンカーを有する分解剤であるＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）が、４つのＰＥＧサブユニットを有するＰＤＳ－ｄｅｇ４（９Ｂ）よりも速くＲＮＡを分解していることを観察した。このことは、リンカーが長いほど、届く範囲が広いことの結果であり得る。総合すると、これらの実験は、本発明者らの分解剤がｒＧ４種を特異的に切断するがフォールディングしていないＲＮＡ領域は切断しないことを示している。
【0268】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノム材料のインビトロでの分解
ｒＧ４分解剤がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムを分解できることを証明し、分解のメカニズムを知るために、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＶＥＲＯ細胞からウイルスＲＮＡを抽出し、これをＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）で処理し、次いで、直接的なＲＮＡシーケンシングを介してこれを分析した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムはいくつかの推定上のｒＧ４部位を有しており（Zhao et al., 2021）、きつくパッキングされているためにそのほとんどがｒＧ４部位に近接していることが示された（Ziv, et al., 2020）ため、本発明者らは、本発明者らの分解剤が広範なダメージを誘発することを期待した。実際、本発明者らは、ゲノムの多くの領域にわたって実質的な分解を観察し、このことは、本発明者らの分解剤がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝物質にダメージを与える点で強力であることを示している（図２ｃ）。この現象は、本発明者らの分解剤が細胞内のウイルスＲＮＡを分解し、それゆえ不活化し得ることを示唆している。
ｒＧ４分解剤がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムを分解できることを証明し、分解のメカニズムを知るために、本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＶＥＲＯ細胞からウイルスＲＮＡを抽出し、これをＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）で処理し、次いで、直接的なＲＮＡシーケンシングを介してこれを分析した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムはいくつかの推定上のｒＧ４部位を有しており（Zhao et al., 2021）、きつくパッキングされているためにそのほとんどがｒＧ４部位に近接していることが示された（Ziv, et al., 2020）ため、本発明者らは、本発明者らの分解剤が広範なダメージを誘発することを期待した。実際、本発明者らは、ゲノムの多くの領域にわたって実質的な分解を観察し、このことは、本発明者らの分解剤がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の遺伝物質にダメージを与える点で強力であることを示している（図２ｃ）。この現象は、本発明者らの分解剤が細胞内のウイルスＲＮＡを分解し、それゆえ不活化し得ることを示唆している。
【0269】
インビトロでのｒＧ４分解剤の抗ウイルス活性
インビトロでのＧ４分解剤の抗ウイルス活性を試験するために、感染の１時間前に、細胞を、０．５μＭ、５μＭ、及び５０μＭのＧ４分解剤（ＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）、ＰＤＳ－ｄｅｇ４（９Ｂ）、及び分解剤を伴わないコントロール分子であるＰＤＳ－Ａｌｋ（８））並びにコントロールとしての５μＭのクロロキンとインキュベートした（図３ａ及び図３ｂ）。ウイルス増殖の阻害を、感染の２４時間後に上清及び細胞の両方を採取することによって測定した。ウイルス増殖を、プラークアッセイ（上清中）及びＰＣＲ（細胞中）でウイルス負荷を測定することによって評価した。Ｇ４分解剤の濃度を上昇させた（０．０５μＭ～５０μＭの範囲）、２４時間のインキュベーションの後の細胞の生存率を、従来の細胞生存率キット（例えば、CellTiter Blueアッセイ）を製造者のプロトコルに従って使用して評価した。
インビトロでのＧ４分解剤の抗ウイルス活性を試験するために、感染の１時間前に、細胞を、０．５μＭ、５μＭ、及び５０μＭのＧ４分解剤（ＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）、ＰＤＳ－ｄｅｇ４（９Ｂ）、及び分解剤を伴わないコントロール分子であるＰＤＳ－Ａｌｋ（８））並びにコントロールとしての５μＭのクロロキンとインキュベートした（図３ａ及び図３ｂ）。ウイルス増殖の阻害を、感染の２４時間後に上清及び細胞の両方を採取することによって測定した。ウイルス増殖を、プラークアッセイ（上清中）及びＰＣＲ（細胞中）でウイルス負荷を測定することによって評価した。Ｇ４分解剤の濃度を上昇させた（０．０５μＭ～５０μＭの範囲）、２４時間のインキュベーションの後の細胞の生存率を、従来の細胞生存率キット（例えば、CellTiter Blueアッセイ）を製造者のプロトコルに従って使用して評価した。
【0270】
本発明者らは、Ｇ４分解剤が５μＭ及び５０μＭでウイルス増殖を成功裏に阻害することを観察した（図３）。ＰＣＲの結果は、ＰＤＳ－ｄｅｇ４がウイルス複製を阻害しないと考えられる一方で、ＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）はＤＭＳＯコントロールと比較して５μＭでウイルス複製の７０％を阻害したことを示した（図３ｂ）。重要なことに、いずれの化合物も、５０μＭまで細胞毒性を示さなかった（図３ｃ）。
【0271】
インビボでのｒＧ４分解剤の抗ウイルス活性
インビボでのＧ４分解剤の抗ウイルス活性を評価するために、トランスジェニックＫ１８ｈＡＣＥ２マウス（ｈＡＣＥ２タンパク質を発現している）に２５ｍｇ／ｋｇのＰＤＳ－ｄｅｇ４（９Ｂ）及びＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）を鼻腔内投与し、その４０分後に感染させ、感染の３時間及び１８時間後に再び投与した（図４）。マウスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に鼻腔内感染させ（０日目に、５０μｌのＰＢＳ中に２．５～５×１０４ＰＦＵ／マウスで）、体重、罹患率、及び死亡率（死亡していることが発見された又は死亡の直前に安楽死させた）、並びに感染の臨床的兆候について１日に１回モニタリングした。５日目に、全てのマウスを屠殺し、プラークアッセイによるウイルス負荷の定量のために左肺を回収した。組織病理学的分析のために、右肺、心臓、肝臓、腎臓、及び脾臓を採取した。
インビボでのＧ４分解剤の抗ウイルス活性を評価するために、トランスジェニックＫ１８ｈＡＣＥ２マウス（ｈＡＣＥ２タンパク質を発現している）に２５ｍｇ／ｋｇのＰＤＳ－ｄｅｇ４（９Ｂ）及びＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）を鼻腔内投与し、その４０分後に感染させ、感染の３時間及び１８時間後に再び投与した（図４）。マウスをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に鼻腔内感染させ（０日目に、５０μｌのＰＢＳ中に２．５～５×１０４ＰＦＵ／マウスで）、体重、罹患率、及び死亡率（死亡していることが発見された又は死亡の直前に安楽死させた）、並びに感染の臨床的兆候について１日に１回モニタリングした。５日目に、全てのマウスを屠殺し、プラークアッセイによるウイルス負荷の定量のために左肺を回収した。組織病理学的分析のために、右肺、心臓、肝臓、腎臓、及び脾臓を採取した。
【0272】
結果は、２５ｍｇ／ｋｇのＰＤＳ－ｄｅｇ６（９Ａ）の投与が毒性であることを示し、これらの処理されたマウスは０日目を屠殺しなければならなかった。器官を組織病理学的分析のために回収した。ＰＤＳ－ｄｅｇ４（９Ｂ）を投与されたマウスは、感染後の初日に１０％の体重減少を示した（図４ａ）。しかし、体重は１日目から３日目の間で安定しており、その後、媒体コントロールと同じ速度で再び減少した。ＰＤＳ－ｄｅｇ４（９Ｂ）で処理した動物は、肺ウイルス負荷の有意な減少を示した（図４ｂ）。
【0273】
この試験は、Ｇ４分解剤の投与によって、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したｋ１８ｈＡＣＥ２マウスの肺におけるウイルス負荷が減少することを示した。
【0274】
シュードノットの標的化及びＲＮＡの分解
非共有結合分解剤分子であるＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）を、公知のシュードノットバインダーであるＭＴＤＢをアジド－イミダゾール３ａと結合することによって、ＲＮＡシュードノットを標的化するように合理的に設計した（図５ａ）。ＭＴＤＢはエチルエステル部分を有しているが、これを、安定性を増大させるため、及び分解剤の結合のためのハンドルとして使用するために、アミドに交換した。本発明者らはアジドイミダゾール３ａを使用したが、これは、６つのＰＥＧサブユニットからなるリンカーを有しており、また、アルキニルでタグ付けされたＲＮＡのＲＮＡ分解について、そのより短い対応物よりも有効であることを本発明者らが以前に発見している（Mikutis et al., 2020）。ＣｕＡＡＣは、頑健（robust）で、実施が容易で、モジュール性が高く、そして本発明者らが結合ステップを変えることなく２つの断片の構造を変化させることが可能であるため、本発明者らは、これをバインダー及び分解剤断片を結合するための反応として選択した。
非共有結合分解剤分子であるＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）を、公知のシュードノットバインダーであるＭＴＤＢをアジド－イミダゾール３ａと結合することによって、ＲＮＡシュードノットを標的化するように合理的に設計した（図５ａ）。ＭＴＤＢはエチルエステル部分を有しているが、これを、安定性を増大させるため、及び分解剤の結合のためのハンドルとして使用するために、アミドに交換した。本発明者らはアジドイミダゾール３ａを使用したが、これは、６つのＰＥＧサブユニットからなるリンカーを有しており、また、アルキニルでタグ付けされたＲＮＡのＲＮＡ分解について、そのより短い対応物よりも有効であることを本発明者らが以前に発見している（Mikutis et al., 2020）。ＣｕＡＡＣは、頑健（robust）で、実施が容易で、モジュール性が高く、そして本発明者らが結合ステップを変えることなく２つの断片の構造を変化させることが可能であるため、本発明者らは、これをバインダー及び分解剤断片を結合するための反応として選択した。
【0275】
３ステム型のコロナウイルスシュードノットの選択的分解
本発明者らの戦略を検証するために、本発明者らは、コロナウイルスシュードノットに対応しており、そのためそれを形成することが予想される配列を有するＲＮＡ ６９－ｅｒに対して、本発明者らのシュードノット分解剤を試験した。本発明者らは、この６９－ｅｒを、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）、或いは、２つのコントロール分子の一方、すなわち、分解が不可能な親バインダー分子であるＭＴＤＢ、又は、ＭＴＤＢに密に関連しているがシュードノットに対する結合親和性がより低い、２－（４－（チオフェン－３－イルメチル）－［１，４］ジアゼパン－１－カルボニル］－アミノ）－安息香酸エチルエステル（ＴＤＢ）から誘導された分解剤であるＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）とインキュベートした（図５ｂ）（Park et al., 2011）。ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）と３時間インキュベートした後、ＲＮＡシュードノットは有意に分解され、未処理試料と比較してちょうど２３％がインタクトなまま残り、一方、ＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）では不十分な分解が見られ、ＭＴＤＢでは分解は見られなかった（図５ｃ、図５ｄ）。これら分子がシュードノットを特異的に結合し分解することを説明するために、本発明者らは、シュードノットに類似しているが第３のステムが大きく破壊されておりシュードノットの適正な形成が阻害されているオリゴを用いて、同一の実験を行った。予想した通り、いずれの分子も、オリゴ安定性に影響を与えなかった（図５ｅ）。したがって、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）は、シュードノットを効率的かつ選択的に結合し、分解することが示された。
本発明者らの戦略を検証するために、本発明者らは、コロナウイルスシュードノットに対応しており、そのためそれを形成することが予想される配列を有するＲＮＡ ６９－ｅｒに対して、本発明者らのシュードノット分解剤を試験した。本発明者らは、この６９－ｅｒを、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）、或いは、２つのコントロール分子の一方、すなわち、分解が不可能な親バインダー分子であるＭＴＤＢ、又は、ＭＴＤＢに密に関連しているがシュードノットに対する結合親和性がより低い、２－（４－（チオフェン－３－イルメチル）－［１，４］ジアゼパン－１－カルボニル］－アミノ）－安息香酸エチルエステル（ＴＤＢ）から誘導された分解剤であるＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）とインキュベートした（図５ｂ）（Park et al., 2011）。ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）と３時間インキュベートした後、ＲＮＡシュードノットは有意に分解され、未処理試料と比較してちょうど２３％がインタクトなまま残り、一方、ＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）では不十分な分解が見られ、ＭＴＤＢでは分解は見られなかった（図５ｃ、図５ｄ）。これら分子がシュードノットを特異的に結合し分解することを説明するために、本発明者らは、シュードノットに類似しているが第３のステムが大きく破壊されておりシュードノットの適正な形成が阻害されているオリゴを用いて、同一の実験を行った。予想した通り、いずれの分子も、オリゴ安定性に影響を与えなかった（図５ｅ）。したがって、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）は、シュードノットを効率的かつ選択的に結合し、分解することが示された。
【0276】
ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）が機能的であり、完全長コロナウイルスＲＮＡを切断し得ることを示すために、本発明者らは、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）並びにコントロールのＭＴＤＢ及びＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から抽出されたＲＮＡとインキュベートした。ウイルスＲＮＡを次いで、アガロースゲル上で分析した。本発明者らは、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）に対応するレーンでのみ分解を観察し（図５ｆ）、このことは、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）がネイティブなコロナウイルスシュードノットを実際に分解する一方で、２つのコントロール分子は分解しないことをさらに裏付けており、このアプローチの特異性を際立たせている。
【0277】
ＭＴＤＢ－ｄｅｇによるコロナウイルスシュードノット分解の特異性
ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）がウイルスＲＮＡを切断することをさらに証明するため、及び切断が生じている箇所のさらに精密な写真を得るために、本発明者らは、直接的なＲＮＡナノポアシーケンシングによって、切断されたゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ、genomic RNA）を分析した。予想した通り、シュードノット周辺の領域は最も影響を受けた（図６ａ）。興味深いことに、シュードノット隣接部は、シュードノット自体よりも分解された。実際、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ＲＮＡのインタラクトームでの研究では、フレームシフトしているエレメントの周辺の領域が、隣接しているＯＲＦ１ａ及び特にＯＲＦ１ｂと、広範囲にわたる短距離及び長距離の相互作用を形成することが明らかになった。これらのエレメントがシュードノットに近いことで、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）がこれらを効率的に切断することが可能となる可能性が高い（図６ａ）（Ziv, et al., 2020）。興味深いことに、分子による影響を受けた唯一の他の構造的エレメントはＳ遺伝子であり、これは、ＯＲＦ１ｂと長距離の相互作用を形成することが示されており（Ziv, et al., 2020）、したがって、分解剤の影響の届く範囲内にあると予想される（図６ｂ）。際立ったことに、いずれの他のサブゲノム領域も影響を受けず、このことは、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）の特異性を強力に証明している（図７）。上記の結果は、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）がＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２シュードノット及びその直接的なＲＮＡ－ＲＮＡインタラクトームの完全に機能的かつ選択的な分解剤であるという原理を強力に証明している（Ziv, et al., 2020）。
ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）がウイルスＲＮＡを切断することをさらに証明するため、及び切断が生じている箇所のさらに精密な写真を得るために、本発明者らは、直接的なＲＮＡナノポアシーケンシングによって、切断されたゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ、genomic RNA）を分析した。予想した通り、シュードノット周辺の領域は最も影響を受けた（図６ａ）。興味深いことに、シュードノット隣接部は、シュードノット自体よりも分解された。実際、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２ ＲＮＡのインタラクトームでの研究では、フレームシフトしているエレメントの周辺の領域が、隣接しているＯＲＦ１ａ及び特にＯＲＦ１ｂと、広範囲にわたる短距離及び長距離の相互作用を形成することが明らかになった。これらのエレメントがシュードノットに近いことで、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）がこれらを効率的に切断することが可能となる可能性が高い（図６ａ）（Ziv, et al., 2020）。興味深いことに、分子による影響を受けた唯一の他の構造的エレメントはＳ遺伝子であり、これは、ＯＲＦ１ｂと長距離の相互作用を形成することが示されており（Ziv, et al., 2020）、したがって、分解剤の影響の届く範囲内にあると予想される（図６ｂ）。際立ったことに、いずれの他のサブゲノム領域も影響を受けず、このことは、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）の特異性を強力に証明している（図７）。上記の結果は、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）がＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２シュードノット及びその直接的なＲＮＡ－ＲＮＡインタラクトームの完全に機能的かつ選択的な分解剤であるという原理を強力に証明している（Ziv, et al., 2020）。
【0278】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞におけるシュードノット分解の効率及び特異性
インビトロでのコロナウイルスシュードノットに対するＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）の効率を実証したことを受けて、本発明者らは、これが感染細胞内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムを分解することができるかどうか、ひいてはウイルス複製を防ぐことができるかどうかを調べた。本発明者らはインビトロでの薬物アッセイを行い、このアッセイにおいて、本発明者らは、Ｖｅｒｏ ＣＣＬ－８１細胞でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を測定した。本発明者らは、低マイクロモル濃度のＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）が顕著な抗ウイルス効果を示したことを観察し（図８ａ～図８ｃ）、感染前（図８ａ、図９ａ）又は感染後（図８ｂ、図９ｂ）に処理した細胞で、コロナウイルスＲＮＡの有意な低減が見られた。これらの結果は、プラークアッセイの結果によって裏付けられた（図８ｄ）。重要なことに、コントロール分子ＭＴＤＢ及びＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）は、ＭＴＤＢがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のフレームシフトを乱すことが知られているにもかかわらず（Kelly et al., 2020）、抗ウイルス効果を示さなかった。さらに、本発明者らは、いずれの化合物も宿主細胞に対して細胞毒性ではなかったことを見出し、このことは、ウイルス複製に対する観察された効果が化合物の特異的な抗ウイルス活性の結果であったことを示している（図８ｅ）。不思議なことに、分解剤は、６μＭよりも高い濃度では活性が下がった（図９ｃ）が、これらの読み取りの正当性を示し得るコロイド凝集は動的光散乱スクリーンでは見られなかった。さらに、ウイルスが２４時間の薬物曝露から生存する能力は、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）で処理した試料では低下したが、コントロール分子ＭＴＤＢ及びＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）で処理した試料では低下しなかった（図８ｆ、図１０ａ）。最後に、セルフリーウイルスをＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）、ＭＴＤＢ、又はＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）とインキュベートした場合に、殺ウイルス効果は見られず、このことは、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）の抗ウイルス活性が、宿主細胞におけるウイルス複製の直接的な阻害によって媒介されることを示唆している（図１０ｂ）。全体として、抗ウイルス薬物アッセイは、ＭＴＤＢ分解剤（１６ａ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する効率的な抗ウイルス薬であること、及びコロナウイルスの３つのステムを有するシュードノットに対して特異的であり、不可逆的な影響を有することを示している。
インビトロでのコロナウイルスシュードノットに対するＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）の効率を実証したことを受けて、本発明者らは、これが感染細胞内のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のゲノムを分解することができるかどうか、ひいてはウイルス複製を防ぐことができるかどうかを調べた。本発明者らはインビトロでの薬物アッセイを行い、このアッセイにおいて、本発明者らは、Ｖｅｒｏ ＣＣＬ－８１細胞でのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を測定した。本発明者らは、低マイクロモル濃度のＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）が顕著な抗ウイルス効果を示したことを観察し（図８ａ～図８ｃ）、感染前（図８ａ、図９ａ）又は感染後（図８ｂ、図９ｂ）に処理した細胞で、コロナウイルスＲＮＡの有意な低減が見られた。これらの結果は、プラークアッセイの結果によって裏付けられた（図８ｄ）。重要なことに、コントロール分子ＭＴＤＢ及びＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）は、ＭＴＤＢがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のフレームシフトを乱すことが知られているにもかかわらず（Kelly et al., 2020）、抗ウイルス効果を示さなかった。さらに、本発明者らは、いずれの化合物も宿主細胞に対して細胞毒性ではなかったことを見出し、このことは、ウイルス複製に対する観察された効果が化合物の特異的な抗ウイルス活性の結果であったことを示している（図８ｅ）。不思議なことに、分解剤は、６μＭよりも高い濃度では活性が下がった（図９ｃ）が、これらの読み取りの正当性を示し得るコロイド凝集は動的光散乱スクリーンでは見られなかった。さらに、ウイルスが２４時間の薬物曝露から生存する能力は、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）で処理した試料では低下したが、コントロール分子ＭＴＤＢ及びＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）で処理した試料では低下しなかった（図８ｆ、図１０ａ）。最後に、セルフリーウイルスをＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）、ＭＴＤＢ、又はＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ｂ）とインキュベートした場合に、殺ウイルス効果は見られず、このことは、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ（１６ａ）の抗ウイルス活性が、宿主細胞におけるウイルス複製の直接的な阻害によって媒介されることを示唆している（図１０ｂ）。全体として、抗ウイルス薬物アッセイは、ＭＴＤＢ分解剤（１６ａ）がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する効率的な抗ウイルス薬であること、及びコロナウイルスの３つのステムを有するシュードノットに対して特異的であり、不可逆的な影響を有することを示している。
【0279】
インビボでのシュードノット分解剤の抗ウイルス活性
感染のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２マウスモデル（トランスジェニックＫ１８－ｈＡＣＥ２マウス）を使用して、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａのインビボでの抗ウイルス活性を判定した（図１２ａ）。ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ（２５ｍｇ／ｋｇ）を投与された動物は、プラークアッセイによると、媒体コントロール群と比較して肺ウイルス負荷の有意な低減を示した（図１２ｂ）。さらに、本発明者らは、感染後３日目又は６日目にＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスの肺から抽出したタンパク質を使用して、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ処理又は媒体処理のインビボでの抗ウイルス能力を調べた。心強いことに、本発明者らは、感染の両時点で、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａで処理したコホートが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染及び複製の重要なバイオマーカーであるｐ３８のリン酸化型レベルの大きな低減を示したことを観察した（図１２ｃ）。
感染のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２マウスモデル（トランスジェニックＫ１８－ｈＡＣＥ２マウス）を使用して、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａのインビボでの抗ウイルス活性を判定した（図１２ａ）。ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ（２５ｍｇ／ｋｇ）を投与された動物は、プラークアッセイによると、媒体コントロール群と比較して肺ウイルス負荷の有意な低減を示した（図１２ｂ）。さらに、本発明者らは、感染後３日目又は６日目にＫ１８－ｈＡＣＥ２トランスジェニックマウスの肺から抽出したタンパク質を使用して、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａ処理又は媒体処理のインビボでの抗ウイルス能力を調べた。心強いことに、本発明者らは、感染の両時点で、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ １６ａで処理したコホートが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染及び複製の重要なバイオマーカーであるｐ３８のリン酸化型レベルの大きな低減を示したことを観察した（図１２ｃ）。
【0280】
細菌リボソームの標的化
公知のリボソームＲＮＡバインダーであるクロラムフェニコールを、異なる長さのアジド－イミダゾール（１８ａ、１８ｂ、１８ｃ）と繋ぐことによって、３つの分解剤を、細菌リボソームを標的化するように合理的に設計した。ＨＡＴＵ及びＤＩＰＥＡを使用してプロパルギル酸を（１Ｒ，２Ｒ）－（－）－２－アミノ－１－（４－ニトロフェニル）－１，３－プロパンジオールとペプチド結合させること、及びその後の、銅クリック化学を使用する結合ステップによって、クロラムフェニコールバインダー部位を生じさせた。２つの構成要素を繋ぐために使用した銅誘導型のアジド－アルキン環付加（ＣｕＡＡＣ）は大きな基質アレイに適用することができ、アミド及び生物学的システムで良く忍容される部分の生物学的等価体である、トリアゾールを生じさせる。３つのリボソーム分解剤及び結合コントロールを、インビトロ及び細胞システムで試験した。
公知のリボソームＲＮＡバインダーであるクロラムフェニコールを、異なる長さのアジド－イミダゾール（１８ａ、１８ｂ、１８ｃ）と繋ぐことによって、３つの分解剤を、細菌リボソームを標的化するように合理的に設計した。ＨＡＴＵ及びＤＩＰＥＡを使用してプロパルギル酸を（１Ｒ，２Ｒ）－（－）－２－アミノ－１－（４－ニトロフェニル）－１，３－プロパンジオールとペプチド結合させること、及びその後の、銅クリック化学を使用する結合ステップによって、クロラムフェニコールバインダー部位を生じさせた。２つの構成要素を繋ぐために使用した銅誘導型のアジド－アルキン環付加（ＣｕＡＡＣ）は大きな基質アレイに適用することができ、アミド及び生物学的システムで良く忍容される部分の生物学的等価体である、トリアゾールを生じさせる。３つのリボソーム分解剤及び結合コントロールを、インビトロ及び細胞システムで試験した。
【0281】
大腸菌リボザイムのインビトロでの分解
大腸菌リボソームを標的化して、分解活性をインビトロでのアッセイで測定した。２００μＭのリボザイムを、１５ｍＭ～０．４７ｍＭの範囲の異なる濃度の分解剤と３７℃で１８時間インキュベートした。アガロースゲル分析によって評価を行った。
大腸菌リボソームを標的化して、分解活性をインビトロでのアッセイで測定した。２００μＭのリボザイムを、１５ｍＭ～０．４７ｍＭの範囲の異なる濃度の分解剤と３７℃で１８時間インキュベートした。アガロースゲル分析によって評価を行った。
【0282】
最良の結果はＰＥＧ－２リンカー（１８ｂ）を使用して得られ、この場合、リボソーム分解は１５ｍＭの濃度で見られた（図１１）。
【0283】
追加の実施例
材料及び方法
ＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルス負荷の定量
ウイルス培養に由来する細胞をＲＬＴバッファーに再懸濁し、RNeasy Mini Kitを使用して抽出した。５００ｎｇのＲＮＡを、SuperScript（商標）VILO（商標）Master Mixを使用してｃＤＮＡに変換した。ゲノム及びサブゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写産物のレベルを、PowerUp（商標）SYBR（商標）Green Master Mix（Applied Biosciences社製）を製造者の指示に従って使用して、QuantStudio（商標）５リアルタイムＰＣＲ機器（Applied Biosystems社製）で分析した。鋳型コントロールを含む全ての試料を３セットアッセイした。標的遺伝子発現の相対的定量を、比較サイクル閾値（ＣＴ、cycle threshold）法を使用して行った。プライマー配列を表１に列挙する。
材料及び方法
ＲＴ－ｑＰＣＲによるウイルス負荷の定量
ウイルス培養に由来する細胞をＲＬＴバッファーに再懸濁し、RNeasy Mini Kitを使用して抽出した。５００ｎｇのＲＮＡを、SuperScript（商標）VILO（商標）Master Mixを使用してｃＤＮＡに変換した。ゲノム及びサブゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２転写産物のレベルを、PowerUp（商標）SYBR（商標）Green Master Mix（Applied Biosciences社製）を製造者の指示に従って使用して、QuantStudio（商標）５リアルタイムＰＣＲ機器（Applied Biosystems社製）で分析した。鋳型コントロールを含む全ての試料を３セットアッセイした。標的遺伝子発現の相対的定量を、比較サイクル閾値（ＣＴ、cycle threshold）法を使用して行った。プライマー配列を表１に列挙する。
【表3】
【0284】
結合研究のためのオリゴヌクレオチドの調製
結合研究のためのオリゴヌクレオチドを調製するために、オリゴヌクレオチドを適切なバッファーに１００ｎＭの最終濃度まで溶解し、次いで、振とうしながら９５℃で５分間インキュベートした。試料を室温で少なくとも１時間冷却し、その後、さらに希釈／処理を行った。
結合研究のためのオリゴヌクレオチドを調製するために、オリゴヌクレオチドを適切なバッファーに１００ｎＭの最終濃度まで溶解し、次いで、振とうしながら９５℃で５分間インキュベートした。試料を室温で少なくとも１時間冷却し、その後、さらに希釈／処理を行った。
【0285】
蛍光クエンチングアッセイ
ＮＲＡＳ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ上で見られるＧ４構造に対応する、Ｃｙ５でタグ付けされたオリゴヌクレオチド（最終濃度５０ｎＭ）を、ＫＣｌ（１００ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）を補充した２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４に溶解し、９６ウェルプレートに播種した。オリゴヌクレオチドを、５ｎＭ～１０μＭの範囲の様々な濃度の、示されているＰＤＳファミリーリガンド又は水媒体コントロールで処理し、その後、４℃で３０分間インキュベートした。Ｃｙ５フルオロフォアに対応する蛍光を次いで、プレートリーダー（BMG社製のCLARIOstar）を使用して２５．０℃で、各オリゴヌクレオチド－低分子／媒体コントロールの組み合わせについて測定した。全ての分子で、希釈比１：１の１２の連続希釈物を使用し、試験した最大濃度は１０μＭであった。蛍光を媒体コントロールに対して正規化し、各分子の結合曲線を、ヒル傾斜の係数を１に設定することによって、シグモイダルフィットを介して得た。
ＮＲＡＳ ｍＲＮＡの５’ＵＴＲ上で見られるＧ４構造に対応する、Ｃｙ５でタグ付けされたオリゴヌクレオチド（最終濃度５０ｎＭ）を、ＫＣｌ（１００ｍＭ）及びＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）を補充した２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４に溶解し、９６ウェルプレートに播種した。オリゴヌクレオチドを、５ｎＭ～１０μＭの範囲の様々な濃度の、示されているＰＤＳファミリーリガンド又は水媒体コントロールで処理し、その後、４℃で３０分間インキュベートした。Ｃｙ５フルオロフォアに対応する蛍光を次いで、プレートリーダー（BMG社製のCLARIOstar）を使用して２５．０℃で、各オリゴヌクレオチド－低分子／媒体コントロールの組み合わせについて測定した。全ての分子で、希釈比１：１の１２の連続希釈物を使用し、試験した最大濃度は１０μＭであった。蛍光を媒体コントロールに対して正規化し、各分子の結合曲線を、ヒル傾斜の係数を１に設定することによって、シグモイダルフィットを介して得た。
【0286】
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）アッセイ
ＦＡＭでタグ付けされたオリゴヌクレオチド（最終濃度５０ｎＭ）を、ＫＣｌ（１００ｍＭ）及びＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を補充した２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４に溶解した。オリゴヌクレオチド溶液を次いで、様々な濃度の低分子で処理し、製造者の指示に従ってＭＳＴを介して分析した（NanoTemper Monolith NT.115）。これらのＭＳＴ測定では、以下のプログラムを使用した：５秒のレーザーオフ、３０秒のレーザーオン、５秒のレーザーオフ；２０％ＬＥＤ（青色）パワー、３０％ＭＳＴパワー；測定は２５．０℃で行った。ＭＴＤＢ－Ｄｅｇ、ＴＤＢ－Ｄｅｇ、及びクリック分解剤１では、希釈比５：３の１２の連続希釈物を使用し、試験した最大濃度は８ｍＭであった。ＭＴＤＢでは、希釈比３：１の１２の連続希釈物を使用し、試験した最大濃度は２５０μＭであった。各分子の結合曲線を、ヒル傾斜の係数を１に設定することによって、シグモイダルフィットを介して得た。
ＦＡＭでタグ付けされたオリゴヌクレオチド（最終濃度５０ｎＭ）を、ＫＣｌ（１００ｍＭ）及びＥＤＴＡ（１０ｍＭ）を補充した２０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ７．４に溶解した。オリゴヌクレオチド溶液を次いで、様々な濃度の低分子で処理し、製造者の指示に従ってＭＳＴを介して分析した（NanoTemper Monolith NT.115）。これらのＭＳＴ測定では、以下のプログラムを使用した：５秒のレーザーオフ、３０秒のレーザーオン、５秒のレーザーオフ；２０％ＬＥＤ（青色）パワー、３０％ＭＳＴパワー；測定は２５．０℃で行った。ＭＴＤＢ－Ｄｅｇ、ＴＤＢ－Ｄｅｇ、及びクリック分解剤１では、希釈比５：３の１２の連続希釈物を使用し、試験した最大濃度は８ｍＭであった。ＭＴＤＢでは、希釈比３：１の１２の連続希釈物を使用し、試験した最大濃度は２５０μＭであった。各分子の結合曲線を、ヒル傾斜の係数を１に設定することによって、シグモイダルフィットを介して得た。
【表4】
【0287】
ＭＴＤＢ－ｄｅｇによるシュードノットの分解
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染モデルにおける、ＭＴＤＢ－ｄｅｇとシュードノットとの間の相互作用を調べる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したベロ細胞を、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ又は媒体コントロールのいずれかで処理し、その後、ＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ分析をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの１４の遺伝子座で行って、広範なゲノムカバレッジを得、どのセグメントが最も影響を受けたかを明らかにした。
この実施例は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染モデルにおける、ＭＴＤＢ－ｄｅｇとシュードノットとの間の相互作用を調べる。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したベロ細胞を、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ又は媒体コントロールのいずれかで処理し、その後、ＲＮＡ抽出及びｑＰＣＲ分析をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムの１４の遺伝子座で行って、広範なゲノムカバレッジを得、どのセグメントが最も影響を受けたかを明らかにした。
【0288】
結果を図１３に示す。これはインビトロでの実験と大部分が合致しており、このことは、ＭＴＤＢ－ｄｅｇがシュードノット区域の隣接部に影響するが完全長のゲノム又はサブゲノムＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡのいかなる他の領域にも影響しないことを示している。このことは、ＭＴＤＢ－ｄｅｇがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２シュードノット及びその直接的なＲＮＡ－ＲＮＡインタラクトームの機能的かつ選択的な分解剤であることを示している。
【0289】
結合親和性の判定
２つの化合物シリーズを調製し、次に、結合の親和性及び選択性に対する、分解剤での官能基化の影響を試験した。ＰＤＳは公知の蛍光クエンチャーであり、したがって、蛍光クエンチングアッセイを使用して、この足場に由来する化合物を評価した（Di Antonio et al., Angew. Chem. Int. Edit., 2012, Vol 51, pp. 11073-11078）。
２つの化合物シリーズを調製し、次に、結合の親和性及び選択性に対する、分解剤での官能基化の影響を試験した。ＰＤＳは公知の蛍光クエンチャーであり、したがって、蛍光クエンチングアッセイを使用して、この足場に由来する化合物を評価した（Di Antonio et al., Angew. Chem. Int. Edit., 2012, Vol 51, pp. 11073-11078）。
【0290】
ＰＤＳ及びその誘導体を、良く確立されたＧ４モデルであるＮＲＡＳの５’ＵＴＲにおけるＧ－四重鎖に対応する、Ｃｙ５で官能基化されたオリゴマーとインキュベートした。蛍光クエンチングは近位で誘導されるため、Ｃｙ５に対応するシグナルはＰＤＳが結合するとクエンチされる。このアッセイに基づいて、本発明者らは、親化合物ＰＤＳが、５１ｎＭのＥＣ５０で（図１４ａ）、親化合物と比較してわずかに低い親和性を有するＰＤＳ誘導体と結合することを見出した。これは、誘導体化されていないＰＤＳが、誘導体化されている化合物ではトリアゾールで置換されているピリジン核上に、追加のアミン基を有しているためである可能性が高い。この正に帯電したアミン基は、負に帯電したリン酸骨格とさらなる相互作用を形成し得る。
【0291】
ＭＴＤＢ及び由来するリガンドは蛍光をクエンチさせず、したがって、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）を利用して、このＲＮＡバインダーファミリーの結合親和性を評価した。ＭＳＴワークフローでは、コロナウイルスシュードノットに対応する、ＦＡＭで官能基化されたオリゴマーを、バインダーの１つとインキュベートし、結合したオリゴマーの蛍光は、非結合オリゴマーと比較して異なる温度依存性を示す。
【0292】
ＭＴＤＢの結合選択性を調べるために、シュードノットに加えて、破壊されたシュードノットに対応するオリゴヌクレオチドでアッセイを行った。破壊されたシュードノットは、そのステムの１つが、長さが同一のランダムな配列に変更されており、したがって、完全なシュードノット構造をもはや形成することができない。
【0293】
ＭＴＤＢは、ＭＳＴを使用するＫＤの決定には十分に可溶性ではないことが分かったが、曲線の傾向は、１８７．５μＭ以上の濃度で顕著な結合を示した（図１４ｂ）。変異した（破壊された）シュードノットでは十分な結合は見られなかった（図１４ｃ）。試験した他の２つの分子であるＭＴＤＢ－ｄｅｇ及びＴＤＢ－ｄｅｇは、水性培地にさらに可溶性であることが分かり、したがって、２９μＭ～８ｍＭの範囲の濃度を試験した。
【0294】
ＭＳＴアプローチを使用して、ＭＴＤＢ－ｄｅｇ及びＴＤＢ－ｄｅｇがそれぞれ１．８６ｍＭ及び２．８８ｍＭのＫＤ値を有することが分かった（図１４ｂ）。破壊されたシュードノットで行った場合、ＫＤ値はそれぞれ５．１３ｍＭ及び６．９１ｍＭに低下した（図１４ｃ）。このことは、バインダー分解剤分子が選択的ではあるが弱いバインダーであることを示している。ＭＴＤＢと同様に、ＭＴＤＢ－ｄｅｇの結合曲線の形状は、１３４μＭを上回る濃度で十分な結合を示し、このことは、分解剤での官能基化がこの分子の結合親和性を低下させなかったことを示している。
【0295】
分解剤－リンカー構成要素３ａ（クリック分解剤１）を、シュードノットオリゴヌクレオチドへの結合についても試験した。試験した濃度では、結合はＫＤ値を得るには弱すぎ、このことは、この分子が、ＭＴＤＢ又はＴＤＢに由来する分子よりもはるかに質の悪いバインダーであることを示唆している（図１４ｂ、図１４ｃ）。
【0296】
参考文献
多くの刊行物が、本発明及び本発明が属する分野の先行技術をより完全に記載及び開示するために、上記で引用されている。これらの参考文献の完全な引用を以下に示す。これらの参考文献の各々の全体が本明細書に組み込まれる。
1. Bobbin, et al., Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2016, Vol. 56, pp. 103-122
2. Cox, et al., Science, 2017, Vol. 358, pp. 1019-1027
3. Di Antonio et al., Angew. Chem. Int. Edit., 2012, Vol 51, pp. 11073-11078
4. Gasiunas, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2012, Vol. 109, E2579-E2586
5. Jinek, et al., Science, 2012, Vol. 337, pp. 816-821
6. Kelly et al., J. Biol. Chem., 2020, Vol. 295, pp. 10741-10748
7. Li. Bioinformatics, 2018, Vol. 34, pp. 3094-3100
8. Mikutis et al., ACS Cent. Sci., 2020, Vol. 6, pp. 2196-2208
9. Park et al., J. Am. Chem. Soc., 2011, Vol. 133, pp. 10094-10100
10. Santos et al., Pharmaceuticals, 2021, Vol. 14, No. 769
11. Tzelepis, et al., Cell Reports, 2016, Vol. 17, pp. 1193-1205
12. Zamore, et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33
13. Zhao et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60 (1), 432-438
14. Ziv, et al., "Mol. Cell., 2020, Vol. 80, pp. 1067-1077
多くの刊行物が、本発明及び本発明が属する分野の先行技術をより完全に記載及び開示するために、上記で引用されている。これらの参考文献の完全な引用を以下に示す。これらの参考文献の各々の全体が本明細書に組み込まれる。
1. Bobbin, et al., Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 2016, Vol. 56, pp. 103-122
2. Cox, et al., Science, 2017, Vol. 358, pp. 1019-1027
3. Di Antonio et al., Angew. Chem. Int. Edit., 2012, Vol 51, pp. 11073-11078
4. Gasiunas, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2012, Vol. 109, E2579-E2586
5. Jinek, et al., Science, 2012, Vol. 337, pp. 816-821
6. Kelly et al., J. Biol. Chem., 2020, Vol. 295, pp. 10741-10748
7. Li. Bioinformatics, 2018, Vol. 34, pp. 3094-3100
8. Mikutis et al., ACS Cent. Sci., 2020, Vol. 6, pp. 2196-2208
9. Park et al., J. Am. Chem. Soc., 2011, Vol. 133, pp. 10094-10100
10. Santos et al., Pharmaceuticals, 2021, Vol. 14, No. 769
11. Tzelepis, et al., Cell Reports, 2016, Vol. 17, pp. 1193-1205
12. Zamore, et al., Cell, 2000, Vol. 101, pp. 25-33
13. Zhao et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2021, 60 (1), 432-438
14. Ziv, et al., "Mol. Cell., 2020, Vol. 80, pp. 1067-1077
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】