(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241024BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241024BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241024BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241024BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241024BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241024BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20241024BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241024BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241024BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C07K16/46
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12N15/62 Z
C12P21/08
A61K39/395 N
A61K39/395 D
A61P35/02
A61P35/00
A61P37/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525546
(86)(22)【出願日】2022-11-04
(85)【翻訳文提出日】2024-04-26
(86)【国際出願番号】 CN2022129803
(87)【国際公開番号】W WO2023078382
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】202111305149.7
(32)【優先日】2021-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516089784
【氏名又は名称】チア タイ ティエンチン ファーマシューティカル グループ カンパニー リミテッド
【氏名又は名称原語表記】Ｃｈｉａ Ｔａｉ Ｔｉａｎｑｉｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．３６９ Ｙｕｚｈｏｕ Ｓｏｕｔｈ Ｒｄ．，Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ，Ｊｉａｎｇｓｕ ２２２０６２ Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001416
【氏名又は名称】弁理士法人信栄事務所
(72)【発明者】
【氏名】ルー、チェンチェン
(72)【発明者】
【氏名】ワン、ユージエ
(72)【発明者】
【氏名】ペン、シュアンリー
(72)【発明者】
【氏名】チャン、チェンピン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA08
4B064CA09
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
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4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA46
4C085BB11
4C085DD62
4C085DD88
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045FA74
(57)【要約】
ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体及びその使用が提供される。具体的には、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体及びその抗原結合フラグメント、それらをコードする核酸、この核酸を含むベクター、このベクターを含む細胞、ならびにそれらを含む医薬組成物が提供され、さらに、腫瘍の減少または腫瘍細胞増殖の阻害、疾患の治療などにおけるそれらの使用が提供される。
【選択図】図２
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１、９、１７、２５または３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２、１０、１８、２６又は３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３、１１、１９、２７または３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４、１２、２０、２８または３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号５、１３、２１、２９又は３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号６、１４、２２、３０または３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と
を含む、単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が、（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｖ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、または、
（ｖ）配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と
を含む、請求項１に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
配列番号７、１５、２３、３１または３９に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８、１６、２４、３２または４０に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
配列番号７に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と；配列番号１５に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と；配列番号２３に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２４に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と；配列番号３１に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号３２に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と；または、配列番号３９に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４０に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項３に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
前記重鎖可変領域が、配列番号７、１５、２３、３１または３９に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、または／及び、前記軽鎖可変領域が、配列番号８、１６、２４、３２または４０に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、下記の（ｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号７に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号１５に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
（ｉｉｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号２３に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２４に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
（ｉｖ）前記重鎖可変領域が、配列番号３１に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３２に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または、
（ｖ）前記重鎖可変領域が、配列番号３９に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４０に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む
ことから選ばれるいずれか一項である、請求項５に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、単離されたＣＤＲ領域またはｓｃＦｖであり、選択的に、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり、
選択的に、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプである、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原フラグメントがヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合し、選択的に、以下の特性のいずれか１つまたは複数も有する：（１）サルＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合すること；
（２）ネズミＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合すること、または
（３）ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、及びＧＰＲＣ５Ｃのうちの１つ以上に結合しないこと、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項9】
前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が単一特異性抗体または多重特異性抗体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項10】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項11】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項１０に記載の融合タンパク質を含み、薬学的に許容される担体をさらに含む、医薬組成物。
【請求項12】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸。
【請求項13】
請求項１２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項14】
請求項１３に記載のベクターを含む、またはゲノムに組み込まれた請求項１２に記載の核酸を有する、宿主細胞。
【請求項15】
請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法であって、前記ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む宿主細胞を培養し、前記宿主細胞または宿主細胞培地から前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することを含む、前記方法。
【請求項16】
疾患を治療する、または腫瘍を減少させる、または腫瘍細胞増殖を阻害する薬剤の調製における、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは請求項１０に記載の融合タンパク質の使用であって、好ましくは、前記疾患ががんまたは自己免疫疾患であり、好ましくは、前記がんが多発性骨髄腫である、前記使用。
【請求項17】
受験者における腫瘍を減少させるもしくは腫瘍細胞増殖を阻害する、または受験者における疾患を治療する方法であって、前記方法が、治療有効量の請求項１～９のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項１０に記載の融合タンパク質、または請求項１１に記載の医薬組成物を前記受験者に投与することを含み、好ましくは、前記疾患ががんまたは自己免疫疾患であり、好ましくは、前記がんが多発性骨髄腫である、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、抗体、特にＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体、調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
多発性骨髄腫（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ，ＭＭ）は、形質細胞悪性腫瘍の一種であり、骨髄由来形質細胞の異常な増殖を特徴とし、これによりＭＭ患者は骨壊死、骨髄浸潤、腎不全、及び免疫不全など多くの疾患の関連症状を経験する。現在、多発性骨髄腫の治療案には、プロテアソーム阻害剤、免疫調節薬、モノクローナル抗体、及び幹細胞移植などが含まれている。
【0003】
ＧＰＲＣ５Ｄ（Ｇ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｌａｓｓＣ ｇｒｏｕｐ ５ ｍｅｍｂｅｒ Ｄ、Ｇタンパク質共役受容体ファミリーＣグループ５メンバーＤ）は、レチノイン酸誘導性オーファンＧタンパク質共役受容体（ＲＡＩＧ）ファミリーに属し、３４５個のアミノ酸残基からなる７回膜貫通タンパク質であり、その正常な生理機能は硬質ケラチンの構造に関連しているが、現在、ＧＰＲＣ５Ｄの具体的な生物学的機能やリガンドはまだ明らかにされていない。いくつかの研究では、６５％の多発性骨髄腫患者の悪性骨髄由来形質細胞においてＧＰＲＣ５Ｄの発現閾値が５０％を超えており、その発現はＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原）とは無関係であることが示されているが、他の研究では、ＧＰＲＣ５Ｄの過剰発現が多発性骨髄腫患者の腫瘍負荷と予後不良に関連していることが示されている。ＧＰＲＣ５Ｄは、皮膚の毛包組織と骨髄由来形質細胞を除いて、正常組織ではまったく発現しないか、発現が非常に低いため、多発性骨髄腫患者に新しい治療法を提供する可能性があり、その臨床的価値が有意である。
【0004】
潜在的な治療標的として、ＧＰＲＣ５Ｄを標的とするいくつかの抗体はすでに開発中であるが、それらはまだ限られており、より多くの利用可能な選択肢が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本開示は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体を提供し、また、提供される抗体をコードすることができる関連する核酸、ベクター、細胞、組成物、調製方法及び使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
一態様では、本開示は、単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、
配列番号１、９、１７、２５または３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２、１０、１８、２６又は３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３、１１、１９、２７または３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４、１２、２０、２８または３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号５、１３、２１、２９又は３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号６、１４、２２、３０または３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
配列番号１、９、１７、２５または３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２、１０、１８、２６又は３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３、１１、１９、２７または３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４、１２、２０、２８または３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号５、１３、２１、２９又は３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号６、１４、２２、３０または３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【0007】
本開示の一実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が、
（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｖ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、または、
（ｖ）配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域とを含む。
（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｖ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、または、
（ｖ）配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0008】
一態様では、本開示は、配列番号７、１５、２３、３１または３９に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８、１６、２４、３２または４０に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【0009】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質を提供する。
【0010】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または融合タンパク質を含み、薬学的に許容される担体をさらに含む、医薬組成物を提供する。
【0011】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸を提供する。
【0012】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の核酸を含むベクターを提供する。
【0013】
一態様では、本開示は、本明細書に記載のベクターを含む、またはゲノムに組み込まれた本明細書に記載の核酸を有する、宿主細胞を提供する。
【0014】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法を提供し、この方法は、宿主細胞を培養し、前記宿主細胞または宿主細胞培地から前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することを含む。
【0015】
一態様では、本開示は、疾患を治療する薬剤の調製における上記の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質の使用を提供し、好ましくは、前記疾患ががんまたは自己免疫疾患である。
【0016】
一態様では、本開示は、受験者における腫瘍を減少させるもしくは腫瘍細胞増殖を阻害するための方法を提供し、前記方法が、治療有効量の本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質または医薬組成物を前記受験者に投与することを含む。
【0017】
一態様では、本開示は、受験者における疾患を治療する方法を提供し、前記方法が、治療有効量の本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは融合タンパク質または医薬組成物を前記受験者に投与することを含み、好ましくは前記疾患ががんまたは自己免疫疾患である。
【0018】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは免疫複合体または医薬組成物を含むキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
本明細書では、本開示の例示的な実施形態について説明するたが、当業者であれば、本開示の保護範囲がそれらに限定されず、本開示の精神と構想に基づいて様々な変形、修正、または変更が可能であり、これらの変形、修正、または変更後の内容は依然として本開示の範囲内に含まれることを理解するであろう。
【0021】
用語
「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、様々な抗体構造をカバーし、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体など）、単鎖抗体などを含むがこれらに限られていない様々な構造の天然抗体及び人工抗体を包含する。抗原結合フラグメントとは、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷の抗体の一部を含む、無傷の抗体以外の分子を指す。抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’フラグメント、Ｆｖフラグメント、単離されたＣＤＲ領域、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）及び当技術分野で公知の他の抗体フラグメントを含む。
「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、様々な抗体構造をカバーし、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体など）、単鎖抗体などを含むがこれらに限られていない様々な構造の天然抗体及び人工抗体を包含する。抗原結合フラグメントとは、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷の抗体の一部を含む、無傷の抗体以外の分子を指す。抗原結合フラグメントは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）’フラグメント、Ｆｖフラグメント、単離されたＣＤＲ領域、単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）及び当技術分野で公知の他の抗体フラグメントを含む。
【0022】
「アイソタイプ」という用語は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体のクラスを指す。一実施形態では、本明細書に開示される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４アイソタイプのものである。本明細書における抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体及びその抗原結合フラグメントは、マウス、ラット、ウサギ、霊長類、ラマ、及びヒトを含むがこれらに限定されない任意の種に由来することができる。前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体はヒト化されている。特定の実施形態では、本明細書で提供される前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体はキメラである。
【0023】
「キメラ抗体」という用語は、ある種に由来する重鎖可変領域の少なくとも一部及び軽鎖可変領域の少なくとも一部、ならびに別の種に由来する定常領域の少なくとも一部を有する抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、ネズミ可変領域及びヒト定常領域を含むことができる。
【0024】
「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域及び定常領域とを含む抗体である。例えば、本明細書で提供されるＧＰＲＣ５Ｄに結合するヒト化抗体は、１つまたは複数のネズミ抗体に由来するＣＤＲ、ならびにヒトフレームワーク及び定常領域を含み得る。
【0025】
「モノクローナル抗体」（「ｍＡｂ」）という用語は、単一分子組成物の抗体分子を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示すか、二重特異性モノクローナル抗体の場合には、２つの異なるエピトープに対して二重の結合特異性を示す。ｍＡｂは単離された抗体の一例である。ｍＡｂは、当業者に知られているハイブリドーマ技術、組換え技術、トランスジェニック技術、または他の技術によって産生することができる。
【0026】
「可変ドメイン」または「可変領域」という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体のドメインを指す。例えば、天然の４本鎖抗体（例えば、ヒト、ネズミなど由来）には重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）があり、ラクダ科やサメなどの動物由来の重鎖抗体（重鎖のみからなる抗体）が単一の可変ドメインを持っている。ほとんどの場合、天然抗体の各可変ドメインは基本的に４つの「フレームワーク領域」と３つの「相補性決定領域」から構成される。４つのフレームワーク領域は、それぞれフレームワーク領域１（ＦＲ１）、フレームワーク領域２（ＦＲ２）、フレームワーク領域３（ＦＲ３）、及びフレームワーク領域４（ＦＲ４）と呼ばれ、前記フレームワーク領域は、当技術分野及び以下でそれぞれ相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるものによって分離される。したがって、可変ドメインの一般構造は、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４のように表すことができる。ひとつの具体例として、重鎖可変領域の一般構造は、ＦＲ１－ＨＣＤＲ１－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３－ＦＲ４のように表すことができる。ひとつの具体例として、軽鎖可変領域の一般構造は、ＦＲ１－ＬＣＤＲ１－ＦＲ２－ＬＣＤＲ２－ＦＲ３－ＬＣＤＲ３－ＦＲ４のように表すことができる。
【0027】
「ＣＤＲ」（相補性決定領域）は、「超可変領域（ＨＶＲ）」とも呼ばれる。例えば、天然の４本鎖抗体には通常６つのＣＤＲが含まれており、そのうち３つは重鎖可変領域にあり、すなわち重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、及び重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）であり、残りの３つは軽鎖可変領域にあり、それぞれ軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、及び軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）である。重鎖抗体または単一可変ドメインには、通常３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）がある。
【0028】
現在、ＣＤＲを区分し定義する方法は数多くある。その中で、Ｋａｂａｔの定義は配列の可変性に基づいてＣＤＲを区分しており、最も一般的に使用されているものである（Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。そしてＣｈｏｔｈｉａの定義は構造ループの位置に基づいている（Ｃｙｒｕｓ Ｃｈｏｔｈｉａ，ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｏｎｉｃａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ Ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））。ＡｂＭの定義は、Ｋａｂａｔの定義とＣｈｏｔｈｉａの定義の間の折衷であり、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「接触（ｃｏｎｔａｃｔ）」によるＣＤＲの定義は、利用可能な複合体の結晶構造の分析に基づいている。ただし、異なる方法に基づいて区分し定義される同じ抗体可変領域のＣＤＲの境界は異なる場合があり、すなわち、異なる方法で区分し定義される同じ抗体可変領域のＣＤＲ配列は異なる場合があることに留意すべきである。したがって、本開示の特定の区分定義によって定義される特定のＣＤＲ配列を使用して抗体を限定する場合、前記抗体の範囲は、他の任意の定義（ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭなどの定義の１つまたは複数の組み合わせなど）に変換されたＣＤＲ配列によって定義される抗体も含む。本開示で保護を求めるＣＤＲは表Ｓ１及び表Ｓ２に示される配列に基づくが、他のＣＤＲの定義規則に従った対応するアミノ酸配列も本開示の保護範囲内に入るべきである。例えば、別の定義によれば、キメラ抗体Ｃｈｉ－１３１の重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列はＮＹＶＭＨ（配列番号７１）である。
【0029】
「フレームワーク領域」（ＦＲ）という用語は、本明細書で定義されるＣＤＲ残基以外の可変ドメインのアミノ酸残基である。
【0030】
「単離された」という用語は、自然環境から分離された目的化合物（例えば、抗体または核酸）を指す。
【0031】
本明細書で使用される場合、「ＥＣ５０」という用語は、抗体の最大反応の５０％である効果濃度を指す。本明細書で使用する場合、「ＩＣ５０」という用語は、抗体の最大反応の５０％である阻害濃度を指す。ＥＣ５０及びＩＣ５０は両方とも、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析、または当技術分野で知られている他の任意の方法によって測定することができる。
【0032】
本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、モル濃度（Ｍ）で表される平衡解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、当技術分野で知られている方法を使用して測定することができる。抗体のＫＤを測定する好ましい方法は、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を使用することであり、より好ましくはＢｉａｃｏｒｅシステムなどのバイオセンサーシステムを使用することである。
【0033】
本明細書で使用される「受験者」という用語には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語は、哺乳類及び非哺乳類などのすべての脊椎動物を含み、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。好ましくは、本開示による受験者はヒトである。特に明記しない限り、「患者」または「受験者」という用語は互換的に使用される。
【0034】
本明細書で使用される場合、「がん」とは、通常、制御されていない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指す。制御されていない細胞の分裂と増殖は、隣接する組織に浸潤する悪性腫瘍の形成につながる可能性があり、リンパ系や血流を介して体の離れた部分に転移する可能性もある。「がん」または「がん組織」には腫瘍が含まれる場合がある。
【0035】
「治療」という用語は、治療を受けた個体における疾患の自然な経過を変えようとする試みを指し、予防のために、または臨床病理の経過中に行われる臨床介入であってもよい。治療の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の軽減、転移の予防、疾患の進行速度の遅延、疾患状態の改善または緩和、及び予後の後退または改善が含まれるが、これらに限定されない。
【0036】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、受験者に治療効果をもたらすのに必要な化合物、組成物、または薬剤組み合わせの量を指す。
【0037】
「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応またはその他の問題や合併症を起こすことなく合理的な利益／リスク比に見合った、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに適している化合物、材料、組成物及び／または剤形を指す。
【0038】
「医薬組成物」とは、活性成分及び薬学的に許容される担体を含む組成物を指す。
【0039】
アミノ酸配列の「同一性パーセント（％）」とは、アラインメントされる配列を本明細書に示される特定のアミノ酸配列とアラインメントさせ、最大の配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入した後、いかなる保存的置換を配列同一性の一部としない場合、アラインメントされる配列と本明細書に示される特定のアミノ酸配列のアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基の割合を指す。アミノ酸配列の同一性アラインメントは、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの当該技術分野の範囲内の様々な方法を使用して実行することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを得るために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメーターを決定することができる。
【0040】
「Ｘｎ」及び「Ｘａａ」という用語は同等であり、不特定のアミノ酸（Ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ）を指し、その範囲は関連する表現における後続の定義によって特定される。
【0041】
「含む」、「含有」、または「包含」という用語、及びそれらの変形は、「含むがこれらに限定されない」と理解されるべきであり、列挙された要素、成分及びステップに加えて、他の不特定の要素、成分及びステップをカバーすることを意味する。
【0042】
本明細書では、文脈で明確に別段の指示がない限り、単数形の用語は複数の指示対象を包含し、またその逆も同様である。
【0043】
すべての特許、特許出願、及びその他の特定の刊行物は、説明及び開示の目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、その開示が本開示の出願日より前であるという理由のみで提供される。これらの文書の日付またはこれらの文書の内容に関するすべての記述は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付またはこれらの文書の内容の正確性について何らかの認めを構成するものではない。さらに、本明細書におけるこれらの出版物へのいかなる言及は、その出版物がいずれの国においても当該技術分野における公知常識の一部を形成していることを認めるものではない。本開示の様々な態様は、以下においてさらに詳細に説明される。
【0044】
Ｉ．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体及びその抗原結合フラグメント
本明細書で使用される場合、「ヒトＧＰＲＣ５Ｄ」及び「ｈＧＰＲＣ５Ｄ」という用語は互換的に使用され、「ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体」及び「抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体」は互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、「ヒトＧＰＲＣ５Ｄ」及び「ｈＧＰＲＣ５Ｄ」という用語は互換的に使用され、「ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体」及び「抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体」は互換的に使用される。
【0045】
本開示は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する新規抗体を提供する。抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、治療用途及び／または診断用途にとって他の多くの望ましい特性を示す。例えば、いくつかの実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄに対して良好な特異性を有する。いくつかの実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体はサルＧＰＲＣ５Ｄまたは／及びネズミＧＰＲＣ５Ｄに結合することができ、それによって抗体開発中の薬理学的評価または／及び安全性評価が容易になる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄ発現が低い細胞に対するより良好な結合能力など、いくつかの既知の抗体と比較してより良好な抗原結合特性を示す。いくつかの実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、多発性骨髄腫細胞などの腫瘍細胞に対して良好な殺傷特性を有する。
【0046】
一態様では、本開示は、単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、
配列番号１、９、１７、２５または３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２、１０、１８、２６又は３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３、１１、１９、２７または３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４、１２、２０、２８または３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号５、１３、２１、２９又は３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号６、１４、２２、３０または３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域とを含む。
配列番号１、９、１７、２５または３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２、１０、１８、２６又は３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３、１１、１９、２７または３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４、１２、２０、２８または３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号５、１３、２１、２９又は３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号６、１４、２２、３０または３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0047】
いくつかの実施態様では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が、
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0048】
いくつかの実施態様では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が、
配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0049】
いくつかの実施態様では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が、
配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0050】
いくつかの実施態様では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が、
配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、 配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び 配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、 配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び 配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0051】
いくつかの実施態様では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が、
配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、
配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0052】
いくつかの実施形態では、単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントが提供され、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、配列番号７、１５、２３、３１または３９に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８、１６、２４、３２または４０に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む。いくつかの特定の実施形態では、前記重鎖可変領域は、配列番号７に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号８に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、前記重鎖可変領域は、配列番号１５に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１６に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記重鎖可変領域は、配列番号２３に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号２４に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記重鎖可変領域は、配列番号３１に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号３２に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記重鎖可変領域は、配列番号３９に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号４０に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、これらの特定の実施形態において、抗体のＣＤＲ領域は、ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、または他の定義に従って定義されたものであり得る。
【0053】
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域が、配列番号７、１５、２３、３１または３９に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記重鎖可変領域が、配列番号７、１５、２３、３１または３９に示されるアミノ酸配列を含む。
【0054】
いくつかの実施形態では、前記軽鎖可変領域が、配列番号８、１６、２４、３２または４０に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記軽鎖可変領域が、配列番号８、１６、２４、３２または４０に示されるアミノ酸配列を含む。
【0055】
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域が、配列番号７、１５、２３、３１または３９に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域が、配列番号８、１６、２４、３２または４０に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、前記重鎖可変領域が、配列番号７、１５、２３、３１または３９に示されるアミノ酸配列を含み、且つ前記軽鎖可変領域が、配列番号８、１６、２４、３２または４０に示されるアミノ酸配列を含む。
【0056】
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域が、配列番号７に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに、いくつかのこのような実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体がさらに、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0057】
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域が、配列番号１５に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに、いくつかのこのような実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体がさらに、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0058】
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域が、配列番号２３に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２４に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに、いくつかのこのような実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体がさらに、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0059】
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域が、配列番号３１に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３２に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに、いくつかのこのような実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体がさらに、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、前記重鎖可変領域が、配列番号３９に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４０に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。さらに、いくつかのこのような実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体がさらに、配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３を含む。
【0061】
いくつかの特定の実施形態では、前記重鎖可変領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む。
【0062】
いくつかの特定の実施形態では、前記重鎖可変領域は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む。
【0063】
いくつかの特定の実施形態では、前記重鎖可変領域は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む。
【0064】
いくつかの特定の実施形態では、前記重鎖可変領域は、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む。
【0065】
いくつかの特定の実施形態では、前記重鎖可変領域は、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含む。
【0066】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、本明細書に記載の対応する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域に加えて定常領域を含む重鎖及び軽鎖を含む。Ｎ末端からＣ末端まで、前記重鎖は重鎖可変領域と重鎖定常領域からなり、軽鎖は軽鎖可変領域と軽鎖定常領域からなる。
【0067】
いくつかの実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の軽鎖定常領域は、ヒトカッパ鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の軽鎖定常領域はヒトラムダ鎖定常領域である。
【0068】
抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥなどの任意のタイプの定常領域、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４などの任意のアイソタイプに由来することができる。いくつかの実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体はＩｇＧ１アイソタイプである。いくつかの実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体はＩｇＧ４アイソタイプである。
【0069】
いくつかの実施形態では、前記重鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号６９に示され、前記軽鎖定常領域のアミノ酸配列は配列番号７０に示される。
【0070】
いくつかの実施形態では、前記重鎖は、配列番号４９に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号５１に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一つの特定の実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。別の実施形態では、前記重鎖は、配列番号５３に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号５５に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一つの特定の実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。別の実施形態では、前記重鎖は、配列番号５７に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号５９に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一つの特定の実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、配列番号５７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。別の実施形態では、前記重鎖は、配列番号６１に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号６３に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一つの特定の実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６３に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。別の実施形態では、前記重鎖は、配列番号６５に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖は、配列番号６７に示される配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一つの特定の実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、配列番号６５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号６７に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。
【0071】
いくつかの実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、サルＧＰＲＣ５Ｄ抗原及び／またはネズミＧＰＲＣ５Ｄ抗原と交差反応する。
【0072】
いくつかの実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原フラグメントがヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合し、場合により、以下の特性のいずれか１つまたは複数も有する：
（１）サルＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する；
（２）ネズミＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する、または
（３）ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、及びＧＰＲＣ５Ｃのうちの１つ以上に結合しない。
（１）サルＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する；
（２）ネズミＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する、または
（３）ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、及びＧＰＲＣ５Ｃのうちの１つ以上に結合しない。
【0073】
いくつかの実施形態では、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原フラグメントがヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合し、またサルＧＰＲＣ５Ｄ抗原または／及びネズミＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合し、さらにＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、及びＧＰＲＣ５Ｃに結合しない。
【0074】
いくつかの実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体はモノクローナル抗体である。
【0075】
いくつかの実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は単一特異性抗体である。
【0076】
いくつかの実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体は多重特異性抗体である。例えば、二重特異性抗体または三重特異性抗体などである。
【0077】
別の態様では、本明細書は、本明細書で提供される例示的な抗体のいずれかと同じＧＰＲＣ５Ｄ上のエピトープ、例えば、Ｃｈｉ－１３１と同じエピトープ、例えば、Ｃｈｉ－１６９と同じエピトープ、例えば、Ｃｈｉ－８９と同じエピトープに結合する抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。別の態様では、本明細書は、本明細書に提供される例示的な抗体のいずれかと競合する、例えば、ＧＰＲＣ５Ｄへの結合に関してＣｈｉ－１３１と競合する、例えば、ＧＰＲＣ５Ｄへの結合に関してＣｈｉ－１３１と競合する、例えば、ＧＰＲＣ５Ｄへの結合に関してＣｈｉ－１６９と競合する、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ＧＰＲＣ５Ｄへの結合は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ、または当技術分野で知られている他の任意の方法によって測定することができる。
【0078】
また、本明細書では、マウス抗ｍｕ－８９、ｍｕ－１０５、ｍｕ－１２８、ｍｕ－１３１、ｍｕ－１６４、ｍｕ－１６９、及びｍｕ－１８０、ならびに構築されたキメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、Ｃｈｉ－１６４、Ｃｈｉ－１６９、及びＣｈｉ－１８０を含む、ＧＰＲＣ５Ｄに結合するいくつかの例示的なモノクローナル抗体が提供される。本明細書で提供されるいくつかの例示的な抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のＨＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、以下の表Ｓ１に提供され、ＬＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３）のアミノ酸配列は、以下の表Ｓ２に提供され、一部の抗体可変領域のアミノ酸配列は、以下の表Ｓ３に提供される。
【0079】
表Ｓ１：重鎖ＣＤＲ配列
【表1】
【0080】
表Ｓ２：軽鎖ＣＤＲ配列
【表2】
【0081】
表Ｓ３：一部の抗体可変領域の配列
【表3】
【0082】
ＩＩ．抗体の変異体
いくつかの実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の変異体またはその抗原結合フラグメントが提供される。抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のアミノ酸配列変異体は、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。このような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内からのアミノ酸残基の欠失、前記アミノ酸配列内へのアミノ酸残基の挿入、及び／または前記アミノ酸配列内でのアミノ酸残基の置換が挙げられる。最終的な変異体が抗原結合効果、例えば腫瘍殺傷能力などの所望の特性を有する限り、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを生成して最終構築物を得ることができる。
いくつかの実施形態では、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の変異体またはその抗原結合フラグメントが提供される。抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体のアミノ酸配列変異体は、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製することができる。このような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内からのアミノ酸残基の欠失、前記アミノ酸配列内へのアミノ酸残基の挿入、及び／または前記アミノ酸配列内でのアミノ酸残基の置換が挙げられる。最終的な変異体が抗原結合効果、例えば腫瘍殺傷能力などの所望の特性を有する限り、欠失、挿入及び置換の任意の組み合わせを生成して最終構築物を得ることができる。
【0083】
ＩＩＩ．融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む融合タンパク質を提供する。
【0084】
ＩＶ．医薬組成物
本開示は、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または前記融合タンパク質を含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、Ｃｈｉ－１６４、Ｃｈｉ－１６９、及びＣｈｉ－１８０抗体のいずれか１つまたは複数を、薬学的に許容される担体とともに医薬組成物に調製する。薬学的に許容される担体には、例えば、賦形剤、希釈剤、カプセル化材料、充填剤、緩衝剤、または他の薬剤が含まれる。
本開示は、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または前記融合タンパク質を含み、さらに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、Ｃｈｉ－１６４、Ｃｈｉ－１６９、及びＣｈｉ－１８０抗体のいずれか１つまたは複数を、薬学的に許容される担体とともに医薬組成物に調製する。薬学的に許容される担体には、例えば、賦形剤、希釈剤、カプセル化材料、充填剤、緩衝剤、または他の薬剤が含まれる。
【0085】
Ｖ．単離された核酸
本開示は、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態では、前記核酸は、抗原結合フラグメント、例えば、Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、Ｃｈｉ－１６４、Ｃｈｉ－１６９、またはＣｈｉ－１８０の抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの実施形態では、前記核酸は、Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、Ｃｈｉ－１６４、Ｃｈｉ－１６９、及びＣｈｉ－１８０などの抗体をコードする。配列表には、いくつかの抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントの核酸配列が例示される。
本開示は、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸を提供する。いくつかの実施形態では、前記核酸は、抗原結合フラグメント、例えば、Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、Ｃｈｉ－１６４、Ｃｈｉ－１６９、またはＣｈｉ－１８０の抗原結合フラグメントをコードする。いくつかの実施形態では、前記核酸は、Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、Ｃｈｉ－１６４、Ｃｈｉ－１６９、及びＣｈｉ－１８０などの抗体をコードする。配列表には、いくつかの抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントの核酸配列が例示される。
【0086】
ＶＩ．ベクター
本開示は、前記単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、前記ベクターはクローニングベクターであり、他の実施形態では、前記ベクターは発現ベクターである。前記発現ベクターは、場合により、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを発現できる任意の発現ベクターであり得、具体的な例としては、発現ベクターはｐｃＤＮＡ３．１である。
本開示は、前記単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、前記ベクターはクローニングベクターであり、他の実施形態では、前記ベクターは発現ベクターである。前記発現ベクターは、場合により、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを発現できる任意の発現ベクターであり得、具体的な例としては、発現ベクターはｐｃＤＮＡ３．１である。
【0087】
ＶＩＩ．宿主細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のベクターを含む、またはゲノムに組み込まれた前記核酸を有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントをクローニングまたは発現するのに適した宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞、または抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメントを調製するのに適した他の細胞から選択される。哺乳動物細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＣＨＯ－Ｓ細胞である。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のベクターを含む、またはゲノムに組み込まれた前記核酸を有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントをクローニングまたは発現するのに適した宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞、または抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメントを調製するのに適した他の細胞から選択される。哺乳動物細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びＣＨＯ－Ｓ細胞である。
【0088】
ＶＩＩＩ．抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体及びその抗原結合フラグメントを調製する方法
いくつかの実施形態において、本開示は、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の宿主細胞を培養し、前記宿主細胞または宿主細胞培養培地から前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することを含む。
いくつかの実施形態において、本開示は、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載の宿主細胞を培養し、前記宿主細胞または宿主細胞培養培地から前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することを含む。
【0089】
前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを産生するために、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸をベクターに挿入して、宿主細胞においてさらなるクローニング及び／または発現を行う。前記核酸は、遺伝子スプライシング及び化学合成などの当技術分野で周知の様々な方法によって得ることができる。前記回収は、遠心分離やアフィニティークロマトグラフィーなどのステップを使用して行うことができる。
【0090】
ＩＸ．使用
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント、及び融合タンパク質は、がんの治療、腫瘍の減少、または腫瘍細胞増殖の阻害に使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント、及び融合タンパク質は、がんの治療、腫瘍の減少、または腫瘍細胞増殖の阻害に使用することができる。
【0091】
本開示は、薬剤の調製における前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または融合タンパク質の使用を提供する。いくつかの実施形態において、その使用は、疾患を治療する薬剤の調製のためである。いくつかの実施形態において、その使用は、腫瘍を減少させるか、または腫瘍細胞の増殖を阻害する薬剤の調製のためである。
【0092】
本開示は、受験者における腫瘍細胞増殖を低減または阻害するための方法を提供し、この方法は、治療有効量の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、または医薬組成物を前記受験者に投与することを含む。
【0093】
本開示は、受験者における疾患を治療する方法を提供し、この方法は、治療有効量の前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、前記融合タンパク質、または前記医薬組成物を前記受験者に投与することを含む。治療を必要とする受験者には、すでに疾患または状態を患っている受験者、ならびに疾患または状態を患う可能性が高く、その目的が疾患または状態を予防、遅延、または軽減することである受験者が含まれる。
【0094】
このうち、上記疾患とは、がんまたは自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、前記自己免疫疾患は、例えば、全身性エリテマトーデス及び／または関節リウマチである。いくつかの実施形態では、前記がんは多発性骨髄腫である。
【0095】
いくつかの実施形態では、サンプル中のＧＰＲＣ５Ｄを検出または測定する方法が提供され、この方法は、前記サンプルを本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させて、結合複合体を検出または測定することを含む。
【0096】
Ｘ．キット
本開示は、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、または医薬組成物を含むキットを提供する。
本開示は、本明細書に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、または医薬組成物を含むキットを提供する。
【0097】
本明細書には、前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、前記融合タンパク質、または前記医薬組成物を含むキットが記載される。前記キットは、本明細書で提供される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、または医薬組成物の使用または他の使用を実施するために使用することができる。いくつかの実施形態では、前記キットは、本明細書に記載される抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、融合タンパク質、または医薬組成物、及び生体試料中のＧＰＲＣ５Ｄの存在を検出するための試薬を含み得る。前記キットには使用説明書も含まれる場合がある。前記キットには、他の緩衝液、希釈剤、針、注射器など、商業的及びユーザーの観点から必要な他の材料も含まれる場合がある。
【0098】
本開示は、以下の特定の実施形態も提供するが、本開示の保護範囲はこれらに限定されない。
【0099】
実施形態１．配列番号１、９、１７、２５または３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２、１０、１８、２６又は３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３、１１、１９、２７または３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４、１２、２０、２８または３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号５、１３、２１、２９又は３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号６、１４、２２、３０または３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と
を含む、単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、またはその抗原結合フラグメント。
配列番号２、１０、１８、２６又は３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３、１１、１９、２７または３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４、１２、２０、２８または３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号５、１３、２１、２９又は３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号６、１４、２２、３０または３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と
を含む、単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【0100】
実施形態２．前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が、
（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｖ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、または、
（ｖ）配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と
を含む、実施形態１に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
（ｉ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｉｉ）配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、
（ｉｖ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と、または、
（ｖ）配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ１、
配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ２、及び
配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むＨＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域と、
配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１、
配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２、及び
配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域と
を含む、実施形態１に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0101】
実施形態３．配列番号７、１５、２３、３１または３９に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８、１６、２４、３２または４０に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【0102】
実施形態４．配列番号７に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号８に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と；配列番号１５に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と；配列番号２３に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２４に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と；配列番号３１に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号３２に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域と；または、配列番号３９に示される可変領域配列を含むＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号４０に示される可変領域配列を含むＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域とを含む、実施形態３に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0103】
実施形態５．前記重鎖可変領域が、配列番号７、１５、２３、３１または３９に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～４のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0104】
実施形態６．前記軽鎖可変領域が、配列番号８、１６、２４、３２または４０に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～５のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0105】
実施形態７．前記重鎖可変領域が、配列番号７、１５、２３、３１または３９に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８、１６、２４、３２または４０に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１～６のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0106】
実施形態８．前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、下記の
（ｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号７に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号１５に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
（ｉｉｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号２３に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２４に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
（ｉｖ）前記重鎖可変領域が、配列番号３１に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３２に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または、
（ｖ）前記重鎖可変領域が、配列番号３９に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４０に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む
ことから選ばれるいずれか一項である、実施形態７に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
（ｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号７に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号１５に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
（ｉｉｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号２３に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２４に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；
（ｉｖ）前記重鎖可変領域が、配列番号３１に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３２に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む；または、
（ｖ）前記重鎖可変領域が、配列番号３９に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４０に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む
ことから選ばれるいずれか一項である、実施形態７に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0107】
実施形態９．前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域が、下記の
（ｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む；
（ｉｉｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む；
（ｉｖ）前記重鎖可変領域が、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む；または、
（ｖ）前記重鎖可変領域が、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含む
ことから選ばれるいずれか一項である、実施形態７に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
（ｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号７に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含む；
（ｉｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む；
（ｉｉｉ）前記重鎖可変領域が、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む；
（ｉｖ）前記重鎖可変領域が、配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む；または、
（ｖ）前記重鎖可変領域が、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を含む
ことから選ばれるいずれか一項である、実施形態７に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0108】
実施形態１０．前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、単離されたＣＤＲ領域またはｓｃＦｖである、実施形態１～９のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0109】
実施形態１１．前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体である、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0110】
実施形態１２．前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４アイソタイプである、実施形態１～１１のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0111】
実施形態１３．前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原フラグメントがヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合し、選択的に、以下の特性のいずれか１つまたは複数も有する：
（１）サルＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する；
（２）ネズミＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する、または
（３）ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、及びＧＰＲＣ５Ｃのうちの１つ以上に結合しない、実施形態１～１２のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
（１）サルＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する；
（２）ネズミＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合する、または
（３）ＧＰＲＣ５Ａ、ＧＰＲＣ５Ｂ、及びＧＰＲＣ５Ｃのうちの１つ以上に結合しない、実施形態１～１２のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0112】
実施形態１４．前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体が単一特異性抗体または多重特異性抗体である、実施形態１～１３のいずれか一項に記載の単離された抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメント。
【0113】
実施形態１５．実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、融合タンパク質。
【0114】
実施形態１６．実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または実施形態１５に記載の免疫複合体(融合タンパク質)を含み、薬学的に許容される担体をさらに含む、医薬組成物。
【0115】
実施形態１７．実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸。
【0116】
実施形態１８．実施形態１７に記載の核酸を含むベクター。
【0117】
実施形態１９．実施形態１８に記載のベクターを含む、またはゲノムに組み込まれた実施形態１７に記載の核酸を有する、宿主細胞。
【0118】
実施形態２０．実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法であって、実施形態１９に記載の宿主細胞を培養し、前記宿主細胞または宿主細胞培地から前記抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することを含む、前記方法。
【0119】
実施形態２１．疾患の治療、または腫瘍の減少、または腫瘍細胞増殖の阻害における、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは実施形態１５に記載の融合タンパク質または実施形態１６に記載の医薬組成物の使用であって、好ましくは、前記疾患ががんまたは自己免疫疾患である、前記使用。
【0120】
実施形態２２．疾患を治療する、または腫瘍を減少させる、または腫瘍細胞増殖を阻害する薬剤の調製における、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメントまたは実施形態１５に記載の融合タンパク質の使用であって、好ましくは、前記疾患ががんまたは自己免疫疾患である、前記使用。
【0121】
実施形態２３．受験者における腫瘍を減少させるまたは腫瘍細胞増殖を阻害する方法であって、前記方法が、治療有効量の実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または実施形態１５に記載の融合タンパク質、または実施形態１６に記載の医薬組成物を前記受験者に投与することを含む、前記方法。
【0122】
実施形態２４．受験者における疾患を治療する方法であって、前記方法が、治療有効量の実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または実施形態１５に記載の融合タンパク質、または実施形態１６に記載の医薬組成物を前記受験者に投与することを含み、好ましくは、前記疾患ががんまたは自己免疫疾患である、前記方法。
【0123】
実施形態２５．前記がんが多発性骨髄腫である、実施形態２１、２２、または２４に記載の形態。
【0124】
実施形態２６．実施形態１～１４のいずれか一項に記載の抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体もしくはその抗原結合フラグメント、実施形態１５に記載の融合タンパク質、または実施形態１６に記載の医薬組成物を含むキット。
実施例
実施例
【0125】
実施例１：抗原免疫
１、ＤＮＡ抗原免疫
ヒトＧＰＲＣ５Ｄタンパク質（アミノ酸配列は配列番号４１に示される）をコードするｃＤＮＡ配列を遺伝子合成により取得し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にサブクローニングしてプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲＣ５Ｄを構築した。大規模なプラスミドの調製は、エンドトキシンフリーマキシ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号：１２３９１）の取扱説明書に従って実行された。
１、ＤＮＡ抗原免疫
ヒトＧＰＲＣ５Ｄタンパク質（アミノ酸配列は配列番号４１に示される）をコードするｃＤＮＡ配列を遺伝子合成により取得し、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にサブクローニングしてプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲＣ５Ｄを構築した。大規模なプラスミドの調製は、エンドトキシンフリーマキシ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号：１２３９１）の取扱説明書に従って実行された。
【0126】
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲＣ５Ｄを抗原として使用して、Ａ／Ｊマウス（南京大学模式動物研究所）、ＢＡＬＢ／ｃマウス（上海霊暢）及びＳＪＬマウス（北京Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）をそれぞれ免疫化した。まず、ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｈ４２７２）を各マウスの左右の後肢筋肉に予注射して前処理し、その後、ＣｐＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ｔｌｒｌ－１８２６）とプラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲＣ５Ｄを質量比１：１で均一に混合した。均一に混合した抗原複合体を、生体遺伝子導入装置（タイプＩＩ、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｔｅｒｅｓａ Ｂｉｏ－Ｔｅｃｈ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を介して、前処理したマウスの筋肉部分に注射し、２～３週間ごとに上記と同様の免疫を一回繰り返し、合計４回の免疫を行った。免疫の完了後、各マウスから血清を収集した。
【0127】
２．マウス血清力価の評価
ＤＮＡ抗原で免疫したマウス体内で産生された抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体の免疫応答を評価するために、マウス血清の抗体力価をＦＡＣＳによって検出した。より高い血清力価を有するマウスを、後続の脾細胞融合前のショック免疫のために選択した。
ＤＮＡ抗原で免疫したマウス体内で産生された抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体の免疫応答を評価するために、マウス血清の抗体力価をＦＡＣＳによって検出した。より高い血清力価を有するマウスを、後続の脾細胞融合前のショック免疫のために選択した。
【0128】
３．細胞性抗原免疫
リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｌ３００００１５）の取扱説明書に従って、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲＣ５ＤをＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクトし、安定かつ高発現のｈＧＰＲＣ５Ｄ細胞株ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉを得た。上記のＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ細胞を抗原としてマウスのショック免疫を行った。脾臓細胞融合の３～４日前に、最終細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬのＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ細胞懸濁液と最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのＣｐＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ｔｌｒｌ－１８２６）を均一に混合した後、１００μＬ／匹でマウスの腹腔内に注射した。
リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｌ３００００１５）の取扱説明書に従って、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲＣ５ＤをＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクトし、安定かつ高発現のｈＧＰＲＣ５Ｄ細胞株ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉを得た。上記のＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ細胞を抗原としてマウスのショック免疫を行った。脾臓細胞融合の３～４日前に、最終細胞濃度５×１０７細胞／ｍＬのＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ細胞懸濁液と最終濃度０．５ｍｇ／ｍＬのＣｐＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、カタログ番号：ｔｌｒｌ－１８２６）を均一に混合した後、１００μＬ／匹でマウスの腹腔内に注射した。
【0129】
実施例２：マウス抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体のスクリーニング
１．ハイブリドーマ細胞の調製
融合当日、マウスの脾臓を無菌的に摘出し、研磨し、赤血球溶解液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｒ７７５７）を加え、ＰＢＳ溶液で細胞を洗浄した後、脾細胞を電気融合緩衝液（ＢＴＸ、カタログ番号：４７－０００１）で再懸濁し、脾細胞とＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞を細胞数比２：１で均一に混合し、電気融合装置（ＢＴＸ）を使用して脾細胞を融合した。１×ＨＡＴ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：２１０６０－０１７）を含むハイブリドーマ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１２０４５－０７６）を加えて融合細胞を希釈し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７～１０日間培養してハイブリドーマ細胞を調製した。ハイブリドーマ細胞の培養上清を回収し、マウス抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体のスクリーニングに使用した。
１．ハイブリドーマ細胞の調製
融合当日、マウスの脾臓を無菌的に摘出し、研磨し、赤血球溶解液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｒ７７５７）を加え、ＰＢＳ溶液で細胞を洗浄した後、脾細胞を電気融合緩衝液（ＢＴＸ、カタログ番号：４７－０００１）で再懸濁し、脾細胞とＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞を細胞数比２：１で均一に混合し、電気融合装置（ＢＴＸ）を使用して脾細胞を融合した。１×ＨＡＴ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：２１０６０－０１７）を含むハイブリドーマ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１２０４５－０７６）を加えて融合細胞を希釈し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で７～１０日間培養してハイブリドーマ細胞を調製した。ハイブリドーマ細胞の培養上清を回収し、マウス抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体のスクリーニングに使用した。
【0130】
２．安定した細胞株の構築
マウス抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体の種間交差結合活性を細胞レベルで評価するために、以下の細胞株を構築した。全長サルＧＰＲＣ５Ｄ（アミノ酸配列は配列番号４２に示される）及びマウスＧＰＲＣ５Ｄ（アミノ酸配列は配列番号４３に示される）をコードするｃＤＮＡをそれぞれ遺伝子合成により取得し、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にサブクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ及びｐｃＤＮＡ３．１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄ組換えプラスミドを得た。リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｌ３００００１５）の取扱説明書に従って、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ及びｐｃＤＮＡ３．１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５ＤをそれぞれＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクトし、ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ及びＣＨＯ－Ｋ１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄ安定細胞株を得た。
マウス抗ヒトＧＰＲＣ５Ｄ抗体の種間交差結合活性を細胞レベルで評価するために、以下の細胞株を構築した。全長サルＧＰＲＣ５Ｄ（アミノ酸配列は配列番号４２に示される）及びマウスＧＰＲＣ５Ｄ（アミノ酸配列は配列番号４３に示される）をコードするｃＤＮＡをそれぞれ遺伝子合成により取得し、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にサブクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ及びｐｃＤＮＡ３．１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄ組換えプラスミドを得た。リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｌ３００００１５）の取扱説明書に従って、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ及びｐｃＤＮＡ３．１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５ＤをそれぞれＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクトし、ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ及びＣＨＯ－Ｋ１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄ安定細胞株を得た。
【0131】
３．細胞ＥＬＩＳＡ予備スクリーニング
対数増殖期のＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ細胞を回収し、１０体積％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１３２００３３）培地で再懸濁し、細胞濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェル平底プレートにプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件で一晩インキュベートした。翌日、細胞プレートをＰＢＳで洗浄し、４％（体積パーセント）パラホルムアルデヒド（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、カタログ番号：Ｐ００９９）を加えて室温で３０分間固定した。ＰＢＳで洗浄後、３％（体積パーセント）ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を２００μＬ／ウェルで加え、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング後、ハイブリドーマ細胞培養上清を１００μＬ／ウェルで細胞プレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１１５－０３５－０６８）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ反応溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、カタログ番号：ＲＰ１２００）を１００μＬ／ウェルで加え、室温、暗所で５分間インキュベートし、０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。Ｂｉｏ－ｒａｄ ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダーを使用してＯＤ４５０吸光度値を読み取った。吸光度が１．０を超える培養上清に対応するハイブリドーマ細胞を、その後のＦＡＣＳスクリーニング用の陽性クローンとして選択した。
対数増殖期のＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ細胞を回収し、１０体積％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１３２００３３）培地で再懸濁し、細胞濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルで９６ウェル平底プレートにプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件で一晩インキュベートした。翌日、細胞プレートをＰＢＳで洗浄し、４％（体積パーセント）パラホルムアルデヒド（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、カタログ番号：Ｐ００９９）を加えて室温で３０分間固定した。ＰＢＳで洗浄後、３％（体積パーセント）ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を２００μＬ／ウェルで加え、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング後、ハイブリドーマ細胞培養上清を１００μＬ／ウェルで細胞プレートに添加し、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１１５－０３５－０６８）を添加し、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ反応溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、カタログ番号：ＲＰ１２００）を１００μＬ／ウェルで加え、室温、暗所で５分間インキュベートし、０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。Ｂｉｏ－ｒａｄ ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダーを使用してＯＤ４５０吸光度値を読み取った。吸光度が１．０を超える培養上清に対応するハイブリドーマ細胞を、その後のＦＡＣＳスクリーニング用の陽性クローンとして選択した。
【0132】
４．抗体のフローサイトメトリーＦＡＣＳスクリーニング
９６ウェルＵ底プレートに細胞濃度５×１０５細胞／ｍＬのＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルでプレーティングし、陽性クローンの培養上清を１００μＬ／ウェルで加えて均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８がコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１１５－５４５－０４４）を添加し、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ細胞との結合を、染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析した。
９６ウェルＵ底プレートに細胞濃度５×１０５細胞／ｍＬのＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルでプレーティングし、陽性クローンの培養上清を１００μＬ／ウェルで加えて均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８がコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１１５－５４５－０４４）を添加し、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ細胞との結合を、染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析した。
【0133】
５．サブクローニングの調製
細胞ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによるスクリーニング後、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ及びＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄの両方に陽性結合するハイブリドーマ細胞ピックアップし、を拡大培養のために選択した。拡大した細胞を半固形培地Ｄ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号：３８１０）と体積比１：１０で均一に混合し、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で５日間培養し、モノクローナル細胞塊を４倍の顕微鏡下で吸引し、ハイブリドーマ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１２０４５－０７６）で覆われた９６ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養を続けた。各ウェルからサブクローン細胞培養上清を収集し、サブクローン細胞のさらなるスクリーニングに使用した。
細胞ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによるスクリーニング後、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ及びＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄの両方に陽性結合するハイブリドーマ細胞ピックアップし、を拡大培養のために選択した。拡大した細胞を半固形培地Ｄ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ、カタログ番号：３８１０）と体積比１：１０で均一に混合し、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で５日間培養し、モノクローナル細胞塊を４倍の顕微鏡下で吸引し、ハイブリドーマ培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１２０４５－０７６）で覆われた９６ウェルプレートに移し、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で２日間培養を続けた。各ウェルからサブクローン細胞培養上清を収集し、サブクローン細胞のさらなるスクリーニングに使用した。
【0134】
６．サブクローンのスクリーニング
（１）抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体のＦＡＣＳスクリーニング
細胞濃度３×１０５細胞／ｍＬのＨ９２９（即ち、ＮＣＩ－Ｈ９２９）細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレートに１００μＬ／ウェルでプレーティングし、サブクローン細胞培養上清を１００μＬ／ウェルまたは同等体積の培地（以下においてＭｅｄｉｕｍと略称する）を加え、均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８がコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１１５－５４５－０４４）を加え、４℃で１時間インキュベートした。細胞を２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、マウス抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＨ９２９細胞との結合を、染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析し、一部の結果を表１に示す。
（１）抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体のＦＡＣＳスクリーニング
細胞濃度３×１０５細胞／ｍＬのＨ９２９（即ち、ＮＣＩ－Ｈ９２９）細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレートに１００μＬ／ウェルでプレーティングし、サブクローン細胞培養上清を１００μＬ／ウェルまたは同等体積の培地（以下においてＭｅｄｉｕｍと略称する）を加え、均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８がコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１１５－５４５－０４４）を加え、４℃で１時間インキュベートした。細胞を２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、マウス抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＨ９２９細胞との結合を、染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析し、一部の結果を表１に示す。
【0135】
表１ 一部のマウス抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＨ９２９細胞のＦＡＣＳ結合アッセイ
【表4】
【0136】
（２）抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体の細胞ＥＬＩＳＡスクリーニング
対数増殖期のＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞をそれぞれ収集し、１０％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１３２００３３）培地で再懸濁し、細胞濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調整し、９６ウェル平底プレートに１００μＬ／ウェルでプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で一晩インキュベートした。翌日、細胞プレートをＰＢＳで洗浄し、４％（体積パーセント）パラホルムアルデヒド（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、カタログ番号：Ｐ００９９）を添加し、室温で３０分間固定した。ＰＢＳで洗浄後、３％（体積パーセント）ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を２００μＬ／ウェルで添加し、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング後、細胞プレートにサブクローン細胞培養上清を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１１５－０３５－０６８）を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ反応溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、カタログ番号：ＲＰ１２００）を１００μＬ／ウェルで加え、室温、暗所で５分間インキュベートし、０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。Ｂｉｏ－ｒａｄ ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダーを使用してＯＤ４５０吸光度値を読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、サブクローン吸光度値の棒グラフを作成した。図１は、典型的なマウス抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体（例えば、ｍｕ－８９、ｍｕ－１０５、ｍｕ－１２６、ｍｕ－１２８、ｍｕ－１３１、ｍｕ－１５３、ｍｕ－１６４、ｍｕ－１６９、ｍｕ－１８０、ｍｕ－１８３など）を示し、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ細胞及び／またはＣＨＯ－Ｋ１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄ細胞の吸光度値は、対照細胞ＣＨＯ－Ｋ１と比較して、吸光度値に２倍以上の差がある。
対数増殖期のＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄ細胞、及びＣＨＯ－Ｋ１細胞をそれぞれ収集し、１０％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１３２００３３）培地で再懸濁し、細胞濃度を１×１０６細胞／ｍＬに調整し、９６ウェル平底プレートに１００μＬ／ウェルでプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２の培養条件下で一晩インキュベートした。翌日、細胞プレートをＰＢＳで洗浄し、４％（体積パーセント）パラホルムアルデヒド（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、カタログ番号：Ｐ００９９）を添加し、室温で３０分間固定した。ＰＢＳで洗浄後、３％（体積パーセント）ＢＳＡを含むＰＢＳ溶液を２００μＬ／ウェルで添加し、室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング後、細胞プレートにサブクローン細胞培養上清を５０μＬ／ウェルで加え、室温で２時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１１５－０３５－０６８）を加え、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄後、ＴＭＢ反応溶液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ、カタログ番号：ＲＰ１２００）を１００μＬ／ウェルで加え、室温、暗所で５分間インキュベートし、０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４で反応を停止させた。Ｂｉｏ－ｒａｄ ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダーを使用してＯＤ４５０吸光度値を読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、サブクローン吸光度値の棒グラフを作成した。図１は、典型的なマウス抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体（例えば、ｍｕ－８９、ｍｕ－１０５、ｍｕ－１２６、ｍｕ－１２８、ｍｕ－１３１、ｍｕ－１５３、ｍｕ－１６４、ｍｕ－１６９、ｍｕ－１８０、ｍｕ－１８３など）を示し、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ細胞及び／またはＣＨＯ－Ｋ１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄ細胞の吸光度値は、対照細胞ＣＨＯ－Ｋ１と比較して、吸光度値に２倍以上の差がある。
【0137】
実施例３：抗ｈＧＰＲＣ５Ｄキメラ抗体の調製
１．マウス抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体をコードする可変領域の配列決定
スクリーニングされたハイブリドーマ細胞中の全ＲＮＡをＲＮＡ抽出キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号：９７６７）の取扱説明書に従って単離し、逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｋ１６５２）を使用して第一鎖ｃＤＮＡを合成した。第一鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして使用し、それぞれマウス重鎖及び軽鎖定常領域プライマーと混合し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、得られたマウス抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体可変領域配列をクローニングして配列決定した。
１．マウス抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体をコードする可変領域の配列決定
スクリーニングされたハイブリドーマ細胞中の全ＲＮＡをＲＮＡ抽出キット（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号：９７６７）の取扱説明書に従って単離し、逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｋ１６５２）を使用して第一鎖ｃＤＮＡを合成した。第一鎖ｃＤＮＡをテンプレートとして使用し、それぞれマウス重鎖及び軽鎖定常領域プライマーと混合し、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を使用して、得られたマウス抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体可変領域配列をクローニングして配列決定した。
【0138】
２．キメラ抗体発現ベクターの構築
化学合成法を使用して、マウス抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のヌクレオチド配列を、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びカッパ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列とそれぞれ連結した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを用いて組換えヒト－マウスキメラ抗体発現ベクターを構築し、キメラ抗体を調製するためにトランスフェクション発現に使用した。各キメラ抗体の全長及びＶＨ／ＶＬのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の詳細を表２に示す。
化学合成法を使用して、マウス抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）のヌクレオチド配列を、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域及びカッパ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列とそれぞれ連結した。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを用いて組換えヒト－マウスキメラ抗体発現ベクターを構築し、キメラ抗体を調製するためにトランスフェクション発現に使用した。各キメラ抗体の全長及びＶＨ／ＶＬのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の詳細を表２に示す。
【0139】
表２ 全長キメラ抗体とＶＨ／ＶＬのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列
【表5】
【0140】
３．陽性参照抗体発現ベクターの構築
ＧＣ５Ｂ５９６を参照抗体（モノクローナル抗体、出典ＷＯ２０１８０１７７８６Ａ２）として選択し、抗体ＶＨ（配列番号４４）及びＶＬ（配列番号４５）のヌクレオチド配列を化学合成法を使用して取得し、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域とカッパ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列にそれぞれ連結し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを使用して陽性参照抗体を発現する発現ベクターを構築し、陽性参照抗体を調製するためにトランスフェクション・発現に使用した。陽性参照抗体（モノクローナル抗体）を本明細書においてＢＭ－ｍＡｂと呼ぶ。
ＧＣ５Ｂ５９６を参照抗体（モノクローナル抗体、出典ＷＯ２０１８０１７７８６Ａ２）として選択し、抗体ＶＨ（配列番号４４）及びＶＬ（配列番号４５）のヌクレオチド配列を化学合成法を使用して取得し、ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域とカッパ軽鎖定常領域のヌクレオチド配列にそれぞれ連結し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターを使用して陽性参照抗体を発現する発現ベクターを構築し、陽性参照抗体を調製するためにトランスフェクション・発現に使用した。陽性参照抗体（モノクローナル抗体）を本明細書においてＢＭ－ｍＡｂと呼ぶ。
【0141】
４．抗ｈＧＰＲＣ５Ｄキメラ抗体及び陽性参照抗体の調製
ｅｘｐｉＣＨＯ発現システム（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：Ａ２９１２９）の操作マニュアルに従って、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体を一時的にトランスフェクトし、発現させ、トランスフェクション後、ｅｘｐｉＣＨＯ細胞を３７℃、８％ＣＯ２の条件下で７日間振盪培養した。細胞培養上清を回収し、清澄化した培養上清をプロテインＡカラム（Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：１７－５４７４）にロードし、１０倍カラム容量のＰＢＳ緩衝液を加えてプロテインＡカラムを洗浄し、酢酸緩衝液（３００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．６）を加えてプロテインＡカラムに結合したＩｇＧ抗体を溶出及び収集し、収集したＩｇＧ抗体成分を限外濾過装置（分子量カットオフ３０ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＵＦＣ９０３０２４）を用いてＰＢＳ緩衝液に置き換え、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体溶液を得た。
ｅｘｐｉＣＨＯ発現システム（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：Ａ２９１２９）の操作マニュアルに従って、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体を一時的にトランスフェクトし、発現させ、トランスフェクション後、ｅｘｐｉＣＨＯ細胞を３７℃、８％ＣＯ２の条件下で７日間振盪培養した。細胞培養上清を回収し、清澄化した培養上清をプロテインＡカラム（Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：１７－５４７４）にロードし、１０倍カラム容量のＰＢＳ緩衝液を加えてプロテインＡカラムを洗浄し、酢酸緩衝液（３００ｍＭ酢酸、ｐＨ３．６）を加えてプロテインＡカラムに結合したＩｇＧ抗体を溶出及び収集し、収集したＩｇＧ抗体成分を限外濾過装置（分子量カットオフ３０ｋＤａ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号：ＵＦＣ９０３０２４）を用いてＰＢＳ緩衝液に置き換え、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体溶液を得た。
【0142】
実施例４：ヒトＧＰＲＣ５Ｄを安定的に発現する細胞に対する抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体の結合活性の測定
１．安定高発現ヒトＧＰＲＣ５Ｄ細胞に対する抗ｈＧＰＲＣ５Ｄキメラ抗体の結合特性
細胞濃度３×１０５細胞／ｍＬのＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ（ＧＰＲＣ５Ｄ発現量は約２Ｅ＋０６－３Ｅ＋０６抗原／細胞）の細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレートに１００μＬ／ウェルでプレーティングし、勾配希釈（最終濃度範囲は４．１～３０００ｎｇ／ｍＬ、３倍勾配希釈）した抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体を加え、均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１６－１７０）を加え、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉとの結合を染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析した。ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍにより計算されたＥＣ５０の解析結果を図２に示す。キメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、Ｃｈｉ－１６４、Ｃｈｉ－１６９、及びＣｈｉ－１８０はすべて、ｈＧＰＲＣ５Ｄを高発現する細胞に対して濃度勾配依存的な結合活性を示し、ＢＭ－ｍＡｂよりも高い最大抗原結合能を持っている。
１．安定高発現ヒトＧＰＲＣ５Ｄ細胞に対する抗ｈＧＰＲＣ５Ｄキメラ抗体の結合特性
細胞濃度３×１０５細胞／ｍＬのＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉ（ＧＰＲＣ５Ｄ発現量は約２Ｅ＋０６－３Ｅ＋０６抗原／細胞）の細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレートに１００μＬ／ウェルでプレーティングし、勾配希釈（最終濃度範囲は４．１～３０００ｎｇ／ｍＬ、３倍勾配希釈）した抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体を加え、均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１６－１７０）を加え、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｈｉとの結合を染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析した。ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍにより計算されたＥＣ５０の解析結果を図２に示す。キメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、Ｃｈｉ－１６４、Ｃｈｉ－１６９、及びＣｈｉ－１８０はすべて、ｈＧＰＲＣ５Ｄを高発現する細胞に対して濃度勾配依存的な結合活性を示し、ＢＭ－ｍＡｂよりも高い最大抗原結合能を持っている。
【0143】
２．安定低発現ヒトＧＰＲＣ５Ｄ細胞に対する抗ｈＧＰＲＣ５Ｄキメラ抗体の結合特性
リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｌ３００００１５）の取扱説明書に従って、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲＣ５ＤをＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクトし、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｌｏｗ安定低発現細胞株（ＧＰＲＣ５Ｄ発現量は約２０００～２５００抗原／細胞）を得た。細胞濃度３×１０５細胞／ｍＬのＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｌｏｗ細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレートに１００μＬ／ウェルでプレーティングし、勾配希釈（最終濃度範囲は４．１～３０００ｎｇ／ｍＬ、３倍勾配希釈）した抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体を加え、均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１６－１７０）を加え、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｌｏｗとの結合を染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析した。図３に示すように、ｈＧＰＲＣ５Ｄの発現が低い細胞では、キメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１６４、及びＣｈｉ－１８０は、ＢＭ－ｍＡｂと同等の結合レベルを示しているが、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、及びＣｈｉ－１６９は、強力な標的結合能力を示している。
リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｌ３００００１５）の取扱説明書に従って、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１－ｈＧＰＲＣ５ＤをＣＨＯ－Ｋ１細胞にトランスフェクトし、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｌｏｗ安定低発現細胞株（ＧＰＲＣ５Ｄ発現量は約２０００～２５００抗原／細胞）を得た。細胞濃度３×１０５細胞／ｍＬのＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｌｏｗ細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレートに１００μＬ／ウェルでプレーティングし、勾配希釈（最終濃度範囲は４．１～３０００ｎｇ／ｍＬ、３倍勾配希釈）した抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体を加え、均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１６－１７０）を加え、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＣＨＯ－Ｋ１－ｈＧＰＲＣ５Ｄｌｏｗとの結合を染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析した。図３に示すように、ｈＧＰＲＣ５Ｄの発現が低い細胞では、キメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１６４、及びＣｈｉ－１８０は、ＢＭ－ｍＡｂと同等の結合レベルを示しているが、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、及びＣｈｉ－１６９は、強力な標的結合能力を示している。
【0144】
実施例５：腫瘍細胞に対する抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体の結合活性の測定
細胞濃度３×１０５細胞／ｍＬのＨ９２９及びＭＭ１Ｓヒト骨髄腫細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＵ底プレートにプレーティングし、勾配希釈（最終濃度範囲は４．１～１０００ｎｇ／ｍＬ、３倍勾配希釈）した抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体を加え、均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１６－１７０）を加え、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とヒト骨髄腫細胞との結合を染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析し、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍを使用してプロットした。図４Ａ及び４Ｂから分かるように、キメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、及びＣｈｉ－１６９はすべて、Ｈ９２９細胞及びＭＭ１Ｓ細胞に対して濃度勾配依存的な結合活性を示している。
細胞濃度３×１０５細胞／ｍＬのＨ９２９及びＭＭ１Ｓヒト骨髄腫細胞懸濁液を１００μＬ／ウェルで９６ウェルＵ底プレートにプレーティングし、勾配希釈（最終濃度範囲は４．１～１０００ｎｇ／ｍＬ、３倍勾配希釈）した抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体を加え、均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄した後、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１６－１７０）を加え、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とヒト骨髄腫細胞との結合を染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析し、ＧｒａｐｈｐａｄＰｒｉｓｍを使用してプロットした。図４Ａ及び４Ｂから分かるように、キメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、及びＣｈｉ－１６９はすべて、Ｈ９２９細胞及びＭＭ１Ｓ細胞に対して濃度勾配依存的な結合活性を示している。
【0145】
実施例６：抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体の種交差活性アッセイ
細胞濃度５×１０５細胞／ｍＬのＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ及びＣＨＯ－Ｋ１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄの細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレートに１００μＬ／ウェルでプレーティングし、勾配希釈（最終濃度範囲は４．６～１００００ｎｇ／ｍＬ、３倍勾配希釈）した抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体を加え、均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した後、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１６－１７０）を加え、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ及びＣＨＯ－Ｋ１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄ細胞との結合を染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析した。図５Ａ及び５Ｂに示すように、キメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、及びＣｈｉ－１６９はすべて、ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ及びＣＨＯ－Ｋ１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄ細胞に対して濃度勾配依存的な結合活性を示している。これは、ＢＭ－ｍＡｂと比較して、これらの抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体がサル及びマウスＧＰＲＣ５Ｄとの交差結合活性を有するのに対し、キメラ抗体Ｃｈｉ－１０５はサルＧＰＲＣ５Ｄとのみ交差結合活性を有することを示している。
細胞濃度５×１０５細胞／ｍＬのＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ及びＣＨＯ－Ｋ１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄの細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレートに１００μＬ／ウェルでプレーティングし、勾配希釈（最終濃度範囲は４．６～１００００ｎｇ／ｍＬ、３倍勾配希釈）した抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体を加え、均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した後、ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１１６－１７０）を加え、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ及びＣＨＯ－Ｋ１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄ細胞との結合を染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析した。図５Ａ及び５Ｂに示すように、キメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、及びＣｈｉ－１６９はすべて、ＣＨＯ－Ｋ１－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ及びＣＨＯ－Ｋ１－ｍｕｒｉｎｅＧＰＲＣ５Ｄ細胞に対して濃度勾配依存的な結合活性を示している。これは、ＢＭ－ｍＡｂと比較して、これらの抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体がサル及びマウスＧＰＲＣ５Ｄとの交差結合活性を有するのに対し、キメラ抗体Ｃｈｉ－１０５はサルＧＰＲＣ５Ｄとのみ交差結合活性を有することを示している。
【0146】
実施例７：抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体の特異性検証
１．細胞レベルでの抗ｈＧＰＲＣ５Ｄキメラ抗体の同ファミリータンパク質への結合の検証
ＧＰＲＣ５Ｄに加えて、既知のＧＰＲＣファミリータンパク質には、ＧＰＲＣ５Ａ（ＲＡＩＧ１）、ＧＰＲＣ５Ｂ（ＲＡＩＧ２）、及びＧＰＲＣ５Ｃ（ＲＡＩＧ３）も含まれている。全長ＧＰＲＣ５Ａ（配列番号４６）、ＧＰＲＣ５Ｂ（配列番号４７）、及びＧＰＲＣ５Ｃ（配列番号４８）をコードするｃＤＮＡを遺伝子合成によって取得し、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にサブクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．１－ＧＰＲＣ５Ａ－ＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１－ＧＰＲＣ５Ｂ－ＧＦＰ、及びｐｃＤＮＡ３．１－ＧＰＲＣ５Ｃ－ＧＦＰ組換えプラスミドを得た。リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｌ３００００１５）の取扱説明書に従って、上記の組換えプラスミドＤＮＡをＣＨＯ－Ｋ１細胞にそれぞれトランスフェクトし、ＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ａ、ＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ｂ及びＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ｃの安定な細胞株を得た。
１．細胞レベルでの抗ｈＧＰＲＣ５Ｄキメラ抗体の同ファミリータンパク質への結合の検証
ＧＰＲＣ５Ｄに加えて、既知のＧＰＲＣファミリータンパク質には、ＧＰＲＣ５Ａ（ＲＡＩＧ１）、ＧＰＲＣ５Ｂ（ＲＡＩＧ２）、及びＧＰＲＣ５Ｃ（ＲＡＩＧ３）も含まれている。全長ＧＰＲＣ５Ａ（配列番号４６）、ＧＰＲＣ５Ｂ（配列番号４７）、及びＧＰＲＣ５Ｃ（配列番号４８）をコードするｃＤＮＡを遺伝子合成によって取得し、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）にサブクローニングして、ｐｃＤＮＡ３．１－ＧＰＲＣ５Ａ－ＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ３．１－ＧＰＲＣ５Ｂ－ＧＦＰ、及びｐｃＤＮＡ３．１－ＧＰＲＣ５Ｃ－ＧＦＰ組換えプラスミドを得た。リポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：Ｌ３００００１５）の取扱説明書に従って、上記の組換えプラスミドＤＮＡをＣＨＯ－Ｋ１細胞にそれぞれトランスフェクトし、ＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ａ、ＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ｂ及びＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ｃの安定な細胞株を得た。
【0147】
細胞濃度５×１０５細胞／ｍＬのＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ａ、ＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ｂ及びＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ｃの細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレートに１００μＬ／ウェルでプレーティングし、勾配希釈（最終濃度範囲は４．１～３０００ｎｇ／ｍＬ、３倍勾配希釈）した抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体を加え、均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した後、ＡＰＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号：１０９－１３５－０９８）を加え、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体とＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ａ、ＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ｂ及びＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ｃ細胞との結合を染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析した。図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃに示すように、キメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１０５、Ｃｈｉ－１２８、Ｃｈｉ－１３１、及びＣｈｉ－１６９はすべて、４．１～３０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲内でＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ａ、ＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ｂ及びＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ｃ細胞に結合しなく、ＢＭ－ｍＡｂは、１０００ｎｇ／ｍＬを超える濃度でＣＨＯ－Ｋ１－ＧＰＲＣ５Ａ細胞への非特異的結合を示している。
【0148】
２．抗ｈＧＰＲＣ５Ｄキメラ抗体のＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合の検証
まず、ＥＺ－ｌｉｎｋＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎビオチン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：２０２１７）の取扱説明書に従って、ビオチンがコンジュゲートされた抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体をそれぞれ調製し、それぞれＢｉｏｔｉｎ－ＢＭ－ｍＡｂ、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｃｈｉ－８９、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｃｈｉ－１２８、及びＢｉｏｔｉｎ－Ｃｈｉ－１３１と名付けた。ここで、Ｂｉｏｔｉｎはビオチンを意味する。
まず、ＥＺ－ｌｉｎｋＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎビオチン試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号：２０２１７）の取扱説明書に従って、ビオチンがコンジュゲートされた抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体をそれぞれ調製し、それぞれＢｉｏｔｉｎ－ＢＭ－ｍＡｂ、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｃｈｉ－８９、Ｂｉｏｔｉｎ－Ｃｈｉ－１２８、及びＢｉｏｔｉｎ－Ｃｈｉ－１３１と名付けた。ここで、Ｂｉｏｔｉｎはビオチンを意味する。
【0149】
細胞濃度３×１０５細胞／ｍＬのＣＨＯ－Ｋ１細胞懸濁液を９６ウェルＵ底プレートに１００μＬ／ウェルでプレーティングし、勾配希釈（３倍勾配希釈、最終濃度範囲は４．６～１００００ｎｇ／ｍＬ）したビオチンがコンジュゲートされた抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体を加え、均一に混合した後、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した後、ＰＥ標識ストレプトアビジン（ＢＤ、カタログ番号：５５４０６１）を加え、４℃で１時間インキュベートした。２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用して、ビオチンがコンジュゲートされた後にＭＦＩシグナルが増幅した抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体がＣＨＯ－Ｋ１細胞に非特異的に結合するかどうかを分析した。結果は図７に示すように、ビオチンがコンジュゲートされたキメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１２８、及びＣｈｉ－１３１はすべて、ＣＨＯ－Ｋ１細胞と非結合シグナルを生成した。
【0150】
実施例８：抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体の内在化活性
ＭＭ１Ｓ細胞を１０％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：２２４０００７１）で再懸濁し、細胞濃度を２×１０６細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルＶ底プレートに２０μＬ／ウェルをプレーティングした。抗体内在化試薬（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号：９０５６４）を抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＢＭ－ｍＡｂ、Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１２８、及びＣｈｉ－１３１、ならびにアイソタイプ対照抗体ｈＩｇＧ１（Ｂｉｏｉｎｔｒｏｎ、カタログ番号：Ｂ１１７９０１）にそれぞれ添加し、３７℃、暗所で１５分間インキュベートした。次に、１０％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：２２４０００７１）を使用して、上記の抗体の勾配希釈を実行し（最終濃度範囲は０．４６～１０００ｎｇ／ｍＬ、３倍勾配希釈）、２０μＬ／ウェルをピペットで採取し、細胞懸濁液と均一に混合し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体の内在化活性を染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析した。結果は図８に示すように、キメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１２８、及びＣｈｉ－１３１によって媒介される標的ＧＰＲＣ５Ｄの内在化は、ＢＭ－ｍＡｂの場合と同等のレベルであり、弱い内在化効果のみをもたらした。
ＭＭ１Ｓ細胞を１０％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：２２４０００７１）で再懸濁し、細胞濃度を２×１０６細胞／ｍＬに調整し、９６ウェルＶ底プレートに２０μＬ／ウェルをプレーティングした。抗体内在化試薬（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号：９０５６４）を抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体ＢＭ－ｍＡｂ、Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１２８、及びＣｈｉ－１３１、ならびにアイソタイプ対照抗体ｈＩｇＧ１（Ｂｉｏｉｎｔｒｏｎ、カタログ番号：Ｂ１１７９０１）にそれぞれ添加し、３７℃、暗所で１５分間インキュベートした。次に、１０％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：２２４０００７１）を使用して、上記の抗体の勾配希釈を実行し（最終濃度範囲は０．４６～１０００ｎｇ／ｍＬ、３倍勾配希釈）、２０μＬ／ウェルをピペットで採取し、細胞懸濁液と均一に混合し、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、２％（体積パーセント）ＦＢＳを含むＰＢＳで細胞を洗浄して再懸濁し、フローサイトメーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩＱｕｅ３）を使用して蛍光シグナルを検出し、抗ｈＧＰＲＣ５Ｄ抗体の内在化活性を染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって分析した。結果は図８に示すように、キメラ抗体Ｃｈｉ－８９、Ｃｈｉ－１２８、及びＣｈｉ－１３１によって媒介される標的ＧＰＲＣ５Ｄの内在化は、ＢＭ－ｍＡｂの場合と同等のレベルであり、弱い内在化効果のみをもたらした。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】