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特表2024-540165ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムのためのエレクトロポレーションエンハンサー
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムのためのエレクトロポレーションエンハンサー
(51)【国際特許分類】
C12N 15/09 20060101AFI20241024BHJP
C12N 15/87 20060101ALI20241024BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241024BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241024BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241024BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241024BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C12N15/09 110
C12N15/87 Z ZNA
C12N15/09 100
C12N9/16 Z
C12N15/11 Z
C07K19/00
C12N1/15
C12N1/19
C12N5/10
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525602
(86)(22)【出願日】2022-11-01
(85)【翻訳文提出日】2024-06-28
(86)【国際出願番号】 US2022079037
(87)【国際公開番号】W WO2023077149
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/274,272
(32)【優先日】2021-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】311016949
【氏名又は名称】シグマ－アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー
【氏名又は名称原語表記】Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ． ＬＬＣ
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】チェン，フーチアン
(72)【発明者】
【氏名】ガービー，グレイム
(72)【発明者】
【氏名】チェン，シャオ
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA01
4B065CA31
4B065CA46
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA11
4H045DA89
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
本開示は、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション）中のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のゲノム修飾効率を改善する方法および組成物を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム編集効率を高めるための方法であって、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の存在下、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムをエレクトロポレーションによって真核細胞に導入することを含む方法。
【請求項2】
ゲノム編集効率が、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の非存在下であること以外は同一の方法と比べて高められる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
エレクトロポレーションが、プログラム可能なＤＮＡ修飾システム、真核細胞、およびポリアニオン性ポリマーまたはその塩をエレクトロポレーション溶液に配合すること、およびエレクトロポレーション溶液に電圧を印加し、それによって真核細胞にプログラム可能なＤＮＡ修飾システムを導入することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムを真核細胞に導入する前に、真核細胞がポリアニオン性ポリマーまたはその塩と接触される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
真核細胞およびポリアニオン性ポリマーが、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムとの配合の前および／またはエレクトロポレーション溶液への電圧の印加の前にエレクトロポレーション溶液中でインキュベートされる、請求項３または４に記載の方法。
【請求項6】
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩の存在下、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが真核細胞に導入される、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
導入が単一のエレクトロポレーション工程を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
導入が複数のエレクトロポレーション工程を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が、約５ｋＤａより大きい、約１５ｋＤａより大きい、約２５ｋＤａより大きい、約５０ｋＤａより大きい、約７５ｋＤａより大きい、約１００ｋＤａより大きい、約１５０ｋＤａより大きい、約２００ｋＤａより大きい、約２５０ｋＤａより大きい、約３００ｋＤａより大きい、約３５０ｋＤａより大きい、約４００ｋＤａより大きい、約４５０ｋＤａより大きい、または約５００ｋＤａより大きい平均分子量を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が約５００ｋＤａより大きい平均分子量を有する、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が多糖ポリマー、例えば硫酸化多糖ポリマーである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
（ｉ）ポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、カラギーナン（例えば、Ｋ－、Ｉ－、および／またはＬ－カラギーナン）、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース）、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの組合せ、誘導体、および／もしくは塩のうちの１つもしくは複数を含むか；または（ｉｉ）ポリアニオン性ポリマーが、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖もしくはその塩であり、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびそれらの塩のうちの１つもしくは複数を含む、
前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項16】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項17】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムがＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項20】
Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性であるか、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼである、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、核酸配列内の塩基を修飾するための塩基エディターである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項22】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｉ型、ＩＩ型（例えば、Ｃａｓ９）、ＩＩＩ型、Ｖ型（例えば、Ｃｐｆ１）、またはＶＩ型（例えば、Ｃａｓ１３）Ｃａｓタンパク質を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項23】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１タンパク質、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ４タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ８タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１０タンパク質、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、またはＣａｓ１３タンパク質を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項24】
プログラム可能なＤＮＡ結合システムがＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）を含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項25】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項26】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、請求項１７～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むＣａｓ９タンパク質である、請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１７～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
Ｃａｓタンパク質が、１つまたは２つの核局在化シグナルをさらに含む、請求項１７～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼシステムである、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項32】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
ガイドＲＮＡが単一分子である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項34】
ガイドＲＮＡが２個の分子である、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項35】
ガイドＲＮＡが酵素的に合成される、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡが化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡが酵素的に合成されるか、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも酵素的に合成される、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
真核細胞がヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項38】
真核細胞が哺乳動物細胞または植物細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項39】
真核細胞がヒト細胞である、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項40】
前記請求項のいずれかに記載の方法により調製される、真核細胞。
【請求項41】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システム、真核細胞、および少なくとも１つのポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含むトランスフェクション組成物。
【請求項42】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が硫酸化多糖塩である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項43】
（ｉ）ポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、カラギーナン（例えば、Ｋ－、Ｉ－、および／またはＬ－カラギーナン）、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース）、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの組合せ、誘導体、および／もしくは塩のうちの１つもしくは複数を含むか；または（ｉｉ）ポリアニオン性ポリマーが、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖もしくはその塩であり、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびそれらの塩のうちの１つもしくは複数を含む、
請求項４１または４２に記載の組成物。
【請求項44】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸を含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項45】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項46】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩である、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項47】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、請求項４１～４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項48】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムがＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項４１～４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項49】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項50】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むリボ核タンパク質複合体である、請求項４１～４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項51】
Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性であるか、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼである、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項52】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、核酸配列内の塩基を修飾するための塩基エディターである、請求項４１～５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項53】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｉ型、ＩＩ型（例えば、Ｃａｓ９）、ＩＩＩ型、Ｖ型（例えば、Ｃｐｆ１）、またはＶＩ型（例えば、Ｃａｓ１３）Ｃａｓタンパク質を含む、請求項４１～５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項54】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１タンパク質、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ４タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ８タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１０タンパク質、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、またはＣａｓ１３タンパク質を含む、請求項４１～５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項55】
プログラム可能なＤＮＡ結合システムがＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）を含む、請求項４１～５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項56】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、請求項４１～５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項57】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、請求項４１～５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項58】
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、請求項５０～５７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項59】
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むＣａｓ９タンパク質である、請求項５０～５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項60】
Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項５０～５９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項61】
Ｃａｓタンパク質が、１つまたは２つの核局在化シグナルをさらに含む、請求項５０～６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項62】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼシステムである、請求項４１～６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項63】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項６２に記載の組成物。
【請求項64】
ガイドＲＮＡが単一分子である、請求項６２または６３に記載の組成物。
【請求項65】
ガイドＲＮＡが２個の分子である、請求項６２または６３に記載の組成物。
【請求項66】
ガイドＲＮＡが酵素的に合成される、請求項６２～６５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項67】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡが化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡが酵素的に合成されるか、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも酵素的に合成される、請求項６２～６５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項68】
真核細胞がヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、請求項４１～６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項69】
真核細胞が哺乳動物細胞または植物細胞である、請求項４１～６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項70】
真核細胞がヒト細胞である、請求項４１～６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項71】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システム、真核細胞、および２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含むトランスフェクション組成物。
【請求項72】
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩が硫酸化多糖塩である、請求項７１に記載の組成物。
【請求項73】
（ｉ）２つ以上のポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、カラギーナン（例えば、Ｋ－、Ｉ－、および／またはＬ－カラギーナン）、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース）、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの組合せ、誘導体、および／もしくは塩のうちの１つもしくは複数から選択されるか；または（ｉｉ）２つ以上のポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖もしくはその塩であり、２つ以上のポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびその塩から選択される、
請求項７１または７２に記載の組成物。
【請求項74】
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの少なくとも１つがデキストラン硫酸を含む、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項75】
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの少なくとも１つがデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項76】
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの１つがデキストラン硫酸ナトリウム塩であり、２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの別の１つが、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびデルマタン硫酸から選択される、請求項７１～７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項77】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、請求項７１～７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項78】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムがＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項７１～７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項79】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項７８に記載の組成物。
【請求項80】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むリボ核タンパク質複合体である、請求項７１～７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項81】
Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性であるか、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼである、請求項７８～８０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項82】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、核酸配列内の塩基を修飾するための塩基エディターである、請求項７１～８１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項83】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｉ型、ＩＩ型（例えば、Ｃａｓ９）、ＩＩＩ型、Ｖ型（例えば、Ｃｐｆ１）、またはＶＩ型（例えば、Ｃａｓ１３）Ｃａｓタンパク質を含む、請求項７１～８２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項84】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１タンパク質、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ４タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ８タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１０タンパク質、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、またはＣａｓ１３タンパク質を含む、請求項７１～８３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項85】
プログラム可能なＤＮＡ結合システムがＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）を含む、請求項７１～８４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項86】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、請求項７１～８５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項87】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、請求項７１～８５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項88】
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、請求項８０～８７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項89】
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むＣａｓ９タンパク質である、請求項８０～８６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項90】
Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項８０～８９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項91】
Ｃａｓタンパク質が、１つまたは２つの核局在化シグナルをさらに含む、請求項８０～９０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項92】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼシステムである、請求項７１～９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項93】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項９２に記載の組成物。
【請求項94】
ガイドＲＮＡが単一分子である、請求項９２または９３に記載の組成物。
【請求項95】
ガイドＲＮＡが２個の分子である、請求項９２または９３に記載の組成物。
【請求項96】
ガイドＲＮＡが酵素的に合成される、請求項９２～９５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項97】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡが化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡが酵素的に合成されるか、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも酵素的に合成される、請求項９２～９５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項98】
真核細胞がヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、請求項７１～９７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項99】
真核細胞が哺乳動物細胞または植物細胞である、請求項７１～９８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項100】
真核細胞がヒト細胞である、請求項７１～９９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項101】
Ｃａｓタンパク質、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液、および１つまたは複数の緩衝溶液を含むキット。
【請求項102】
１つまたは複数の緩衝溶液が再構成溶液および希釈溶液を含む、請求項１０１に記載のキット。
【請求項103】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液がデキストラン硫酸を含む、請求項１０１または１０２に記載のキット。
【請求項104】
再構成溶液が５０％グリセロールを含み、希釈溶液が２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）および２０ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項１０２または１０３に記載のキット。
【請求項105】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液が、１μｇ／μＬデキストラン硫酸ナトリウム塩を２ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）および２０ｍＭ ＮａＣｌ中に含む、請求項１０３または１０４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６３／２７４，２７２号の優先権の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６３／２７４，２７２号の優先権の利益を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、概して、標的ゲノム修飾、標的転写制御、および／または標的エピジェネティック修飾の効率を上げるための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
プログラム可能なエンドヌクレアーゼは、真核生物における標的ゲノム改変または修飾の重要なツールになっている。ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）システムは、新世代のゲノム修飾ツールとして登場した。これらのプログラム可能なエンドヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの前世代のヌクレアーゼと比較して前例のない簡単さおよび汎用性を提供する。
【0004】
ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムは、多様な細胞型および生物におけるゲノム修飾のためのエンドヌクレアーゼとして広く採用されてきた。より最近では、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステムの使用は、Ｃａｓポリペプチドと他の機能性ドメイン、例えば、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、および逆転写酵素などとの融合による塩基編集およびプライム編集へとさらに発展している。プラスミドＤＮＡは伝統的に、これらのゲノム修飾因子（ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｇｅｎｔ）を細胞にデリバリーするための媒体として使用されてきたが、組換えＣａｓタンパク質およびシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）からなるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、近年多くの遺伝子編集用途において重要なデリバリー様式になっている。ＲＮＰ複合体デリバリーは、宿主ゲノムへの外因性ＤＮＡ組み込みのリスクを最小化するかもしくは排除することさえでき、オフターゲット効果を低減し、プラスミドＤＮＡに対して感受性が高いＴ細胞などの一部の細胞型においてトランスフェクション関連細胞傷害性を軽減することができる。
【0005】
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２）ＲＮＰ複合体をゲノム修飾に使用する上で１つの限界は、プラスミドＤＮＡデリバリーと比較してより高い変わりやすい編集効率となり得ることである。この欠点にはいくつかの要因が寄与し得る。特に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）におけるＲＮＰ複合体の貯留はデリバリー効率を低下させる可能性があり、細胞質へのＲＮＰ複合体の凝集は、遺伝子編集のために核に輸送される複合体の量を実質的に制限する可能性がある。Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＩＤＴ）は、編集効率を改善するためにＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９およびＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ ＲＮＰ複合体デリバリー用のエレクトロポレーションエンハンサーとして１００ｎｔ合成一本鎖ＤＮＡオリゴを開発した。しかし、これらのＤＮＡベースのエンハンサーは宿主ゲノムへの外因性ＤＮＡ組み込みのリスクをもたらし、遺伝子編集アッセイを妨げる可能性がある。
【発明の概要】
【0006】
本開示の様々な態様の中に、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション）中のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のゲノム修飾効率を改善する方法および組成物の提供がある。
【0007】
したがって、簡単には、本開示はゲノム編集効率を高めるための方法に関する。方法は、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の存在下、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムをエレクトロポレーションによって真核細胞に導入することを含む。ある特定の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムはＲＮＰ複合体である。ある特定の実施形態では、エレクトロポレーションエンハンサーはＲＮＡフリーおよびＤＮＡフリーであり、すなわち、検出可能な核酸は、エンハンサー組成物または溶液の中にほとんど存在しないかまたは存在しない。これらのおよび他の実施形態では、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩はデキストラン硫酸ナトリウム塩である。
【0008】
本開示の別の態様は、本明細書に記載される方法により調製される真核細胞に関する。
【0009】
本開示のさらに別の態様は、プログラム可能なＤＮＡ修飾システム、真核細胞、およびポリアニオン性ポリマーまたはその塩（例えば、デキストラン硫酸およびその塩）を含むトランスフェクション組成物に関する。本開示の別の態様は、２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩（例えば、デキストラン硫酸およびその塩、ならびに別のポリアニオン性ポリマーまたはその塩）を含むトランスフェクション組成物に関する。
【0010】
本開示の他の態様は、エレクトロポレーション溶液およびＣａｓタンパク質、再構成溶液、タンパク質希釈溶液、ならびに適宜、本明細書に記載の他の成分のうちの１つまたは複数を含むキットを含む。１つの特定の態様では、キットは、Ｃａｓタンパク質、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液、および１つまたは複数の緩衝溶液を含む。１つの実施形態では、キットは、組換えＣａｓタンパク質、デキストラン硫酸（例えば、ナトリウム塩）溶液、再構成溶液、希釈溶液、およびこれらをエレクトロポレーションに使用するための説明書を含む。
【0011】
他の目的および特徴は一部は明白であり、一部は以下に指摘される。
【0012】
本開示の新規の特徴は、特に添付の特許請求の範囲に記載される。本開示の特徴および利点のさらなる理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面を参照することによって得られる。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【0014】
【0015】
【図3】図３Ａ～３Ｆは、ヒトＨＥＫ２９３細胞のヌクレオフェクション中にデキストラン硫酸の存在下および非存在下、ヒトＣＣＲ５（図３Ａ）、ＲＮＦ２（図３Ｂ）、ＨＥＫ２９３＿ｓｉｔｅ２（図３Ｃ）、ＨＥＫ２９３＿ｓｉｔｅ３（図３Ｄ）、ＥＭＸ１（図３Ｄ）、およびＨＢＢ（図３Ｆ）標的部位において、ＳｐＣａｓ９ Ｄ１０ＡニッカーゼおよびヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａシチジンデアミナーゼ、ならびに６つの合成ｓｇＲＮＡを含む組換えシトシン塩基エディター融合タンパク質によって生成されたＣからＴへの塩基転移編集頻度を示すグラフである。これらの図は、出現順にそれぞれ、配列番号３８、および７６～８０を開示する（以下の実施例３も参照のこと）。
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【発明を実施するための形態】
【0020】
ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステム、例えば、組換えＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡから構築されたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、多様な細胞型および生物におけるゲノム修飾の重要な試薬になっている。本開示は、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション）中のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のゲノム修飾効率を改善するエンハンサーとして使用するための、ある特定のポリアニオン性ポリマーおよびその塩（硫酸化多糖など）を提供する。ある特定の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、例えばＲＮＰ複合体としてデリバリーされる、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、および塩基エディターを含むＣａｓタンパク質である。本明細書に開示される方法は、ゲノム編集効率または関連する生物学的効果を高める他の組換えタンパク質のエレクトロポレーションデリバリーに適用されることもある。
【0021】
本開示の１つの態様は、ゲノム編集効率を改善する方法に関する。一般に、方法は、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の存在下、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムを真核細胞に導入することを含む。典型的には、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムは、エレクトロポレーションにより真核細胞に導入される。本明細書に記載される方法によれば、ゲノム編集効率は、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の非存在下であること以外は同一の方法と比べて高められる。本開示の他の態様は、ゲノム編集効率を高める組成物（エレクトロポレーション溶液を含む）を含む。
【0022】
エレクトロポレーションエンハンサーとしてのポリアニオン性ポリマー
本明細書に開示される方法、組成物、および使用によれば、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムのゲノム修飾効率を改善または高めるためにポリアニオン性ポリマーが使用される。そのようなプログラム可能なＤＮＡ修飾システムには、例えば、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、および／または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質が含まれる。１つの特定の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼシステムである。別の特定の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ヌクレアーゼシステムである。さらに別の特定の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼシステムである。
本明細書に開示される方法、組成物、および使用によれば、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムのゲノム修飾効率を改善または高めるためにポリアニオン性ポリマーが使用される。そのようなプログラム可能なＤＮＡ修飾システムには、例えば、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、および／または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質が含まれる。１つの特定の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼシステムである。別の特定の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９またはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ヌクレアーゼシステムである。さらに別の特定の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾はＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはニッカーゼシステムである。
【0023】
ポリアニオン性ポリマーは、典型的には、エレクトロポレーション方法を実施する前に従来のエレクトロポレーション溶液に添加されるか、またはそうでなければ該溶液中に存在する。様々な実施形態では、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩は、細胞がエレクトロポレーション溶液に再懸濁され、エレクトロポレーション電圧が供給される前または後のどちらかで該溶液に添加される。例えば従来のエレクトロポレーションシステムを使用する以下の例で例示されるように、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩（例えば、デキストラン硫酸ナトリウム塩）がＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）溶液Ｖ（Ｌｏｎｚａ）などの標準的なエレクトロポレーション溶液に添加され、次いで、エレクトロポレーション（当技術分野および本明細書ではヌクレオフェクションとも呼ばれる）の前に細胞がポリアニオン性ポリマー含有エレクトロポレーション溶液に再懸濁される。あるいは、最初に細胞がエレクトロポレーション溶液に再懸濁され、エレクトロポレーション／ヌクレオフェクションの前にポリアニオン性ポリマーが細胞懸濁液に添加されてもよい。当業者は、ゲノム修飾のためにプログラム可能なＤＮＡ修飾システムを細胞にデリバリーするのに適した多くの異なるエレクトロポレーションシステムがあり、方法、組成物、使用、およびキットを含む本開示はこれらのシステムに適用され得ることを理解するであろう。
【0024】
ポリアニオン性ポリマーは、１つまたは複数の有機ポリマーまたはその塩であってもよい。適切な有機ポリマーの例には多糖ポリマーが含まれるが、これに限定されない。１つの実施形態では、多糖ポリマーは、カラギーナン（例えば、Ｋ－、Ｉ－、および／またはＬ－カラギーナン）、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース）、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの誘導体および／または塩から選択される。一部の実施形態では、ポリアニオン性ポリマーは、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖またはその塩である。硫酸化多糖の例は、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびそれらの塩からなる群から選択され得る。特定の実施形態では、ポリアニオン性ポリマーは硫酸化多糖のナトリウム塩である。
【0025】
特定の実施形態では、ポリアニオン性ポリマーは、デキストラン硫酸またはその塩（例えば、デキストラン硫酸ナトリウム塩）などのポリ硫酸ポリマーである。一部の好ましい実施形態では、ポリアニオン性ポリマーはデキストラン硫酸またはその塩、例えばデキストラン硫酸ナトリウム塩である。
【0026】
ポリアニオン性ポリマーおよびその塩の組合せが、本開示において企図される。例えば、ポリアニオン性ポリマーおよびその塩は、デキストラン硫酸（例えば、デキストラン硫酸ナトリウム塩）ならびに別の１つまたは複数のポリアニオン性ポリマーまたは硫酸多糖、例えば、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびそれらの塩であってもよい。
【0027】
本明細書に記載のエレクトロポレーション増強溶液において使用するために選択される特定のポリアニオン性ポリマーまたは硫酸化多糖に関係なく、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の平均分子量は、典型的には約１ｋＤａ～約１，０００ｋＤａである。一般に、平均分子量は、分子の総数で割ったポリマーの総重量として定義される。例えば、デキストラン硫酸ナトリウム塩の分子量は、典型的にはゲル浸透クロマトグラフィー（参照としてデキストランを使用するサイズ排除クロマトグラフィー）によって決定される。１つの特定の実施形態では、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の平均分子量は約５ｋＤａ～約５００ｋＤａである。例えば、１つの実施形態では、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の平均分子量は、約５ｋＤａ、１５ｋＤａ、２５ｋＤａ、３５ｋＤａ、４５ｋＤａ、５５ｋＤａ、６５ｋＤａ、７５ｋＤａ、８５ｋＤａ、９５ｋＤａ、１０５ｋＤａ、１１５ｋＤａ、１２５ｋＤａ、１３５ｋＤａ、１４５ｋＤａ、１５５ｋＤａ、１６５ｋＤａ、１７５ｋＤａ、１８５ｋＤａ、１９５ｋＤａ、２０５ｋＤａ、２１５ｋＤａ、２２５ｋＤａ、２３５ｋＤａ、２４５ｋＤａ、２５５ｋＤａ、２６５ｋＤａ、２７５ｋＤａ、２８５ｋＤａ、２９５ｋＤａ、３０５ｋＤａ、３１５ｋＤａ、３２５ｋＤａ、３３５ｋＤａ、３４５ｋＤａ、３５５ｋＤａ、３６５ｋＤａ、３７５ｋＤａ、３８５ｋＤａ、３９５ｋＤａ、４０５ｋＤａ、４１５ｋＤａ、４２５ｋＤａ、４３５ｋＤａ、４４５ｋＤａ、４５５ｋＤａ、４６５ｋＤａ、４７５ｋＤａ、４８５ｋＤａ、４９５ｋＤａ、または５００ｋＤａであってもよい。
【0028】
別の実施形態では、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の平均分子量は、約５ｋＤａより大きい、約１０ｋＤａより大きい、約２５ｋＤａより大きい、約５０ｋＤａより大きい、７５ｋＤａより大きい、約１００ｋＤａより大きい、約１２５ｋＤａより大きい、約１５０ｋＤａより大きい、約１７５ｋＤａより大きい、約２００ｋＤａより大きい、約２２５ｋＤａより大きい、約２５０ｋＤａより大きい、約２７５ｋＤａより大きい、約３００ｋＤａより大きい、約３２５ｋＤａより大きい、約３５０ｋＤａより大きい、約３７５ｋＤａより大きい、約４００ｋＤａより大きい、約４２５ｋＤａより大きい、約４５０ｋＤａより大きい、約４７５ｋＤａより大きい、または約５００ｋＤａより大きい。
【0029】
別の実施形態では、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の平均分子量は、約５ｋＤａ～約５００ｋＤａ、約２５ｋＤａ～約２５０ｋＤａ、約５０ｋＤａ～約２００ｋＤａ、約７５ｋＤａ～約１７５ｋＤａ、または約１００ｋＤａ～約１５０ｋＤａである。
【0030】
別の実施形態では、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の平均分子量は、約５ｋＤａ～約２５ｋＤａ、約５ｋＤａ～約２０ｋＤａ、または約５ｋＤａ～約１５ｋＤａである。
【0031】
さらなる他の実施形態では、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の平均分子量は、厳密には重要ではなない。
【0032】
ポリアニオン性ポリマーは、ナトリウム塩形態または他の塩形態で得られてもよく、典型的には、水または緩衝液（例えば、デキストラン硫酸ナトリウム塩を含む標準的なエレクトロポレーション溶液）に溶解される。各トランスフェクションで使用されるポリアニオン性ポリマーまたはその塩の量は、典型的には、エレクトロポレーション溶液に懸濁された細胞１００μＬあたり０．１μｇ～１０μｇに及び得る。１つの好ましい実施形態では、該量は細胞１００μＬあたり０．２μｇ～１μｇに及び得る。最適な量は、使用される細胞型、エレクトロポレーションシステム、およびＣＲＩＳＰＲシステムなどのプログラム可能なＤＮＡ修飾システムのタイプ（例えば、ＲＮＰ）に応じて異なる可能性があり、異なるであろう。
【0033】
ポリアニオン性物質が硫酸化多糖またはその塩である場合、硫酸化多糖の各糖単位（すなわち、反復単位）は１～３個のアニオン性基を含み得る。例えば、硫酸化多糖がデキストラン硫酸である場合、デキストラン硫酸反復単位は３個の硫酸基を含有し得る。
【0034】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩（例えば、硫酸化多糖またはその塩）は、細胞に対して実質的に非毒性の濃度および使用期間で使用されるべきことが理解されよう。同様に、実質的に非毒性の濃度および使用期間は、細胞型、エレクトロポレーション条件、および／または他の要因に応じて異なり得ることが理解されよう。ある特定の実施形態では、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含むトランスフェクションまたはエレクトロポレーション溶液はＲＮＡフリーおよびＤＮＡフリーであり、すなわち、検出可能な核酸は溶液中にほとんど存在しないかまたは存在しない。
【0035】
エレクトロポレーション
一般に、エレクトロポレーションは、外来物質を生細胞に導入するのにインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）操作の両方で使用される。インビトロ適用に関しては、まず生細胞の試料が目的の薬剤と混合され、平行板などの電極の間に置かれる。次いで、電極が細胞／埋入混合物に電界を印加する。インビトロエレクトロポレーションを行うシステムの例には、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）システム、ＭａｘＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標）システム、およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎシステムが含まれる。
一般に、エレクトロポレーションは、外来物質を生細胞に導入するのにインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）操作の両方で使用される。インビトロ適用に関しては、まず生細胞の試料が目的の薬剤と混合され、平行板などの電極の間に置かれる。次いで、電極が細胞／埋入混合物に電界を印加する。インビトロエレクトロポレーションを行うシステムの例には、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）システム、ＭａｘＣｙｔｅ Ｆｌｏｗ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ（登録商標）システム、およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎシステムが含まれる。
【0036】
公知のエレクトロポレーション法（インビトロでもインビボでも）は、処置領域の周囲に置かれた電極に短い高電圧パルスを印加することによって機能する。電極間に生成された電界は、一時的に細胞膜を目的の薬剤の分子が細胞に侵入する孔になるようにする。公知のエレクトロポレーション適用では、この電界は約１００μｓ時間、１０００Ｖ／ｃｍオーダーで単一矩形波パルスを含む。そのようなパルスは、例えば、当技術分野で公知の、またはエレクトロポレーション装置文献に詳述されている標準的な手法による、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）システム（または同様の装置）の公知の適用において生成され得る。
【0037】
電界の適用は、マルチパルス、例えば、同じ強度および電気容量のダブルパルス、あるいは様々な強度および／または電気容量の連続パルスの形態であることが多い。本明細書で使用される場合、用語「パルス」は、可変電気容量および電圧での、ならびに指数関数波形および／または矩形波形および／または変調波形／矩形波形を含む、１つまたは複数の電気パルスを含む。
【0038】
電気パルスは、典型的には指数関数波形、矩形波形、変調波形、および変調矩形波形から選択される波形としてデリバリーされる。
【0039】
好ましい実施形態は、低電圧の直流を使用する。例えば、電界は、１００ミリ秒以上、好ましくは１５ミリ秒以上の時間にわたり１Ｖ／ｃｍ～２０Ｖ／ｃｍの電界強度で適用されてもよい。しかし、一般に、エレクトロポレーションに関する電気よび時間パラメーターは、製造者の推奨設定および／または所与のトランスフェクション用途（例えば、細胞型、タンパク質型など）のためにインストールされたプログラムに従って選択されることが当業者に理解されよう。１つの特定の実施形態では、エレクトロポレーションは、ＲＮＰ複合体を使用して哺乳動物（例えば、ヒト）細胞で行われる。
【0040】
ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステム（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２）などのプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のエレクトロポレーション法は、本明細書に記載されたエレクトロポレーション増強を除いて当技術分野で一般に公知である。
【0041】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、染色体ＤＮＡ中の特定の標的配列に結合することを目的とするタンパク質であり、標的配列においてまたはその近くでＤＮＡまたはＤＮＡと結合するタンパク質を修飾する。故に、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、典型的には、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよび触媒的に活性な修飾ドメインを含み得る。
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、染色体ＤＮＡ中の特定の標的配列に結合することを目的とするタンパク質であり、標的配列においてまたはその近くでＤＮＡまたはＤＮＡと結合するタンパク質を修飾する。故に、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、典型的には、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインおよび触媒的に活性な修飾ドメインを含み得る。
【0042】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質のＤＮＡ結合ドメインはプログラム可能であり、これは、該ドメインが異なるＤＮＡ配列を認識し、結合するように設計または改変され得ることを意味する。一部の実施形態では、例えば、ＤＮＡ結合は、ＤＮＡ修飾タンパク質と標的ＤＮＡとの間の相互作用によって媒介される。故に、ＤＮＡ結合ドメインは、タンパク質改変によって目的のＤＮＡ配列に結合するようにプログラムすることができる。他の実施形態では、例えば、ＤＮＡ結合は、ＤＮＡ修飾タンパク質および標的ＤＮＡと相互作用するガイドＲＮＡによって媒介される。そのような場合、プログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質は、適当なガイドＲＮＡを設計することによって目的のＤＮＡ配列を標的にすることができる。
【0043】
様々な修飾ドメインがプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質に含まれ得る。一部の実施形態では、修飾ドメインはヌクレアーゼ活性を有し、二本鎖ＤＮＡ配列のうちの一方または両方の鎖を切断することができる。ＤＮＡ切断は、次いで、ＤＮＡ配列が少なくとも１つの塩基対の欠失、挿入、および／または置換によって修飾され得るように、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）などの細胞ＤＮＡ修復プロセスによって修復され得る。ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の例には、限定するものではないが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（またはニッカーゼ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインが含まれる。ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は以下に詳述される。
【0044】
他の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が、ＤＮＡおよび／またはＤＮＡと結合するタンパク質の構造および／または活性を修飾するように、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の修飾ドメインは非ヌクレアーゼ活性（例えば、エピジェネティック修飾活性または転写制御活性）を有する。故に、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含むことができる。そのようなタンパク質は以下に詳述される。
【0045】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、野生型または天然に存在するＤＮＡ結合および／または修飾ドメイン、天然に存在するＤＮＡ結合および／または修飾ドメインの修飾または改変バージョン、合成または人工のＤＮＡ結合および／または修飾ドメイン、ならびにそれらの組合せを含むことができる。
【0046】
ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質
【0047】
ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質の例は、限定するものではないが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、およびヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインが含まれる。
【0048】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、様々な細菌および古細菌に存在するＩ型、ＩＩ型（すなわち、Ｃａｓ９）、ＩＩＩ型、Ｖ型（すなわち、Ｃａｓ１２／Ｃｐｆ１）、またはＶＩ型（すなわち、Ｃａｓ１３）ＣＲＩＳＰＲタンパク質に由来し得る。さらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、古細菌ＣＲＩＳＰＲシステム、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＸシステム、またはＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹシステムに由来し得る［Burstein et al., Nature, 2017, 542(7640):237-241］。様々な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（またはニッカーゼ、以下参照）は、連鎖球菌属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）［例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・パスツリアヌス（Ｓ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）］、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）［例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）］、フランシセラ属種（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｓｐ．）［例えば、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）］、アカリオクロリス属種（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｐ．）、アセトハロビウム属種（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、アシダミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、硫黄酸化菌属種（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アリシクロバチルス属種（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、アロクロマチウム属種（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｓｐ．）、アンモニフェクス属種（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｓｐ．）、アナベナ属種（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ．）、アルスロスピラ属種（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、バークホルデリア属種（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｓｐ．）、カルディセルロシラプター属種（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓｐ．）、カンディダトゥス属種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｓｐ．）、クロストリジウム属種（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐ．）、クロコスフェラ属種（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｓｐ．）、シアノセイス属種（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．）、エキシグオバクテリウム属種（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）、フィネゴルディア属種（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｓｐ．）、クテドノバクター属種（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ラクノスピラ属種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．）、ラクトバチルス属種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、リングビア属種（Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．）、マリノバクター属種（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、メタノハロビウム属種（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、ミクロスシラ属種（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｓｐ．）、ミクロコレウス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｓｐ．）、ミクロキスティス属種（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）、ナトラネロビウス属種（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｓｐ．）、ナイセリア属種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．）、ニトロソコッカス属種（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ノカルジオプシス属種（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｓｐ．）、ノドゥラリア属種（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐ．）、ノストック属種（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．）、オシラトリア属種（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．）、ポラロモナス属種（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、ペロトマクルム属種（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｓｐ．）、シュードアルテロモナス属種（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、ペトロトガ属種（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｓｐ．）、プレボテラ属種（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｓｐ．）、ブドウ球菌属種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ストレプトマイセス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ストレプトスポランギウム属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｓｐ．）、シネココッカス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、サーモシフォ属種（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ｓｐ．）、またはベルコミクロビア属種（Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ ｓｐ．）由来であってもよい。
【0049】
化膿連鎖球菌、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス、アシドボラクス・アベナエ（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ）、アクチノバチルス・プルロニューモニアス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、アクチノバチルス・スイス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ）、アクチノミセス属種（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、シクフィルス・デニトリフィカンス（Ｃｙｃｈｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アミノモナス・パウシボランス（Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・スミシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ）、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、バクテロイデス属種（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．）、ブラストピレルラ・マリナ（Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ）、ブラディリゾビウム属種（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．）、ブレビバチルス・ラテロスポクス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｘｕｓ）、カンピロバクター・コリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ、カンピロバクター・ラリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ）、カンディダトゥス・プニセイスピリルム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、コリネバクテリウム・マトルコチイ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ）、ディノロセオバクター・シバエ（Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ）、ユーバクテリウム・ドリカム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ）、ガンマプロテオバクテリア（Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・スプトム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｍｍ）、ヘリコバクター・カナデンシス（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヘリコバクター・シネディ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、イリオバクター・ポリトロパス（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ）、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、リステリア・イバノビイ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、リステリア科細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メチロシスチス属種（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．）、メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、モビルンカス・ムリエリス（Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ）、ナイセリア・バシリフォルミス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ）、ナイセリア・シネレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ）、ナイセリア・フラベセンス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ）、髄膜炎菌、ナイセリア属種、ナイセリア・ワズワーシイ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ）、ニトロソモナス属種（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、パルビバクラム・ラバメンティボランス（Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ファスコラルクトバクテリウム・スクシナテュテンス（Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ）、ラルストニア・シジジイ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドブラム属種（Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．）、シモンシエラ・ムエレリ（Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ）、スフィンゴモナス属種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、スポロラクトバチルス・ビネア（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ）、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ）、連鎖球菌属種、サブドリグラヌルム属種（Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．）、ティストレラ・モビリス（Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、トレポネーマ属種（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．）、またはベルミネフロバクター・エイセニア（Ｖｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅ）に由来するＣａｓ分子を含む様々な種のＣａｓ分子が、本明細書に記載された方法、組成物、使用、およびキットにおいて使用され得る。
【0050】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、野生型または天然に存在するタンパク質であってもよい。あるいは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、特異性を改善させ、ＰＡＭ特異性を変化させ、オフターゲット効果を減少させ、安定性を向上させるなどのために改変されてもよい。
【0051】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は天然に存在するＣａｓタンパク質である。他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は改変Ｃａｓタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１（本明細書ではＣａｓ１２ａとも呼ばれる）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓｌ、Ｃａｓｌ Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓｈ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、およびＣｓｆ４からなる群から選択される。
【0052】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ１３タンパク質などのエンドリボヌクレアーゼである。一部の実施形態では、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ａ［Abudayyeh et al., Nature 550 (2017), 280-284］、Ｃａｓ１３ｂ［Cox et al., Science (2017) 358:6336, 1019-1027］、Ｃａｓ１３ｃ［Cox et al., Science (2017) 358:6336, 1019-1027］、またはＣａｓ１３ｄ［Zhang et al., Cell 175 (2018), 212-223］タンパク質である。
【0053】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、野生型または天然に存在するＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オーソログである。野生型Ｃａｓ９は、ＤＮＡの標的鎖を切断するＨＮＨヌクレアーゼドメイン、および非標的鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを使用するマルチドメイン酵素である。ｇＲＮＡ特異性に基づくＤＮＡへのＷＴ Ｃａｓ９の結合は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復することができる二本鎖ＤＮＡ切断をもたらす。
【0054】
一部の実施形態では、天然に存在するＣａｓ９ポリペプチドは、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９、およびＮｍｅＣａｓ９からなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737；Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6に記載されたＣａｓ９アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0055】
一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは以下の活性のうちの１つまたは複数を含む：（ａ）ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の一本鎖、例えば、非相補鎖または相補鎖を切断する能力；（ｂ）二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断をもたらす能力（一実施形態では、２つのニッカーゼ活性の存在である）；（ｃ）エンドヌクレアーゼ活性；（ｄ）エキソヌクレアーゼ活性；および／または（ｅ）ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力。他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は死んでいてもよく、または不活性であってもよい（例えば、ｄＣａｓ）。
【0056】
一部の実施形態では、Ｃａｓポリペプチドは、塩基デアミナーゼ活性を有する異種ポリペプチド／タンパク質に融合される。
【0057】
一部の実施形態では、異なるＣａｓタンパク質（すなわち、様々な種由来のＣａｓ９タンパク質）は、種々のＣａｓタンパク質の様々な酵素特性を利用するために（例えば、種々のＰＡＭ配列優先性のために；酵素活性の増減のために；細胞傷害性のレベルの増減のために；ＮＨＥＪ、相同組換え修復、一本鎖切断、二本鎖切断などの間のバランスを変化させるために）、様々な提供された方法において使用するのに有利であり得る。
【0058】
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は化膿連鎖球菌に由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＧ、ＮＡＧ、および／またはＮＧＡを認識する［Mali et al, Science 2013; 339(6121): 823-826］。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス・サーモフィルスに由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＧＮＧおよび／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）を認識する［例えば、Horvath et al, Science, 201O; 327(5962): 167-170、およびDeveau et al, J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400を参照］。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）に由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＧおよび／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する［例えば、Deveau et al, J BACTERIOL 2008; 190(4): 1390-1400を参照］。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、黄色ブドウ球菌に由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、黄色ブドウ球菌に由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮ ＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、黄色ブドウ球菌に由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮ ＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、髄膜炎菌に由来するＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮ ＧＡＴＴまたはＮ ＧＣＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣ）を認識する（例えば、Hou et ah, PNAS 2013, 1-6を参照）。上述の実施形態では、Ｎは任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかであってもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、レプトトリキア・シャーイイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉ）に由来するＣａｓ１３ａタンパク質であり、単一３’Ａ、Ｕ、またはＣのＰＦＳ配列モチーフを認識する。
【0059】
一部の実施形態では、本明細書に記載されたＣａｓポリペプチドは、ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性を変更するように改変することができる。一部の実施形態では、突然変異体Ｃａｓポリペプチドは、親ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性とは異なるＰＡＭ／ＰＦＳ特異性を有する。例えば、天然に存在するＣａｓタンパク質は、突然変異体Ｃａｓポリペプチドが認識するＰＡＭ／ＰＦＳ配列を変更してオフターゲット部位を減少させ、特異性を改善し、またはＰＡＭ／ＰＦＳ認識要件を取り除くように修飾されてもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＰＡＭ／ＰＦＳ認識配列の長さを増加させるように修飾されてもよい。一部の実施形態では、ＰＡＭ認識配列の長さは、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長である。異なるＰＡＭ／ＰＦＳ配列を認識し、および／またはオフターゲット活性が低下したＣａｓポリペプチドは、定向進化を使用して生成することができる。Ｃａｓポリペプチドの定向進化に使用することができる例示的な方法およびシステムは、例えば、Esvelt et al. Nature 2011, 472(7344): 499-503に記載されている。
【0060】
様々な実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓタンパク質の野生型バージョンと比べて１つまたは複数の突然変異および／または欠失が存在するＣａｓ突然変異体であってもよい。例えば、以下のアミノ酸位置のうちの１つまたは複数が突然変異され得る（化膿連鎖球菌Ｃａｓ９、ＳｐＣａｓ９のナンバリングシステム：Ｋ５２６、Ｋ５６２、Ｋ６５２、Ｒ６６１、Ｒ６９１、Ｒ７８０、Ｋ８１０、Ｋ８４８、Ｋ８５５、Ｋ１００３、およびＫ１０６０を参照）。例示的なＣａｓ突然変異体は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／１６１２７６；国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０２１／１８３７７１；およびKonermann et al., Cell 173 (2018), 665-676に記載されている。さらなる他のＣａｓ突然変異体には、ｅＳｐＣａｓ９ １．０（Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ）、ｅＳｐＣａｓ９ １．１（Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａ）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１（Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａ）、ＨｙｐａＣａｓ９（Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａ）、ＥｖｏＣａｓ９（Ｍ４９５Ｖ、Ｙ５１５Ｎ、Ｋ５２６Ｅ、Ｒ６６１Ｌ）、Ｓｎｉｐｅｒ Ｃａｓ９（Ｆ５３９Ｓ、Ｍ７６３Ｉ、Ｋ８９０Ｎ）、ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ Ｖ３（Ｒ６９１Ａ）、Ｏｐｔｉ－ＳｐＣａｓ９（Ｒ６６１ＡおよびＫ１００３Ｈ）、およびＯｐｔｉＨＦ－ＳｐＣａｓ９（Ｑ６９５Ａ、Ｋ８４８Ａ、Ｅ２９３Ｍ、Ｔ９２４ＶおよびＱ９２６Ａ）が含まれる（Slaymaker et al., Science 351, 84-88；Kleinstiver et al., Nature 523, 490-495；Chen et al. Nature 550, 407-410；Casini et al., Nature Biotechnology 36, 265-271；Lee et al., Nature Communications 9, 3048；Vakulskas et al., Nature Medicine 24, 1216-1224；Choi et al., Nature Methods 16, 722-730）。
【0061】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質であってもよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルスＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）、ストレプトコッカス・パスツリアヌス（ＳｐａＣａｓ９）、カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、黄色ブドウ球菌（ＳａＣａｓ９）、フランシセラ・ノビシダＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）、ナイセリア・シネレアＣａｓ９（ＮｃＣａｓ９）、またはナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）Ｃａｓ９（ＮｍＣａｓ９）であってもよい。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、例えば、フランシセラ・ノビシダＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）（ＦｎＣｐｆ１）、アシダミノコッカス属種Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）（ＡｓＣｐｆ１）、またはラクノスピラ属菌ＮＤ２００６ Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）（ＬｂＣｐｆ１）であってもよい。さらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３タンパク質、例えば、レプトトリキア・ワデイ（Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｗａｄｅｉ）Ｃａｓ１３ａ（ＬｗａＣａｓ１３ａ）またはレプトトリキア・シャーイイＣａｓ１３ａ（ＬｓｈＣａｓ１３ａ）であってもよい。
【0062】
一般に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性を有する少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ相補鎖を切断するＨＮＨドメイン、および非相補鎖を切断するＲｕｖＣドメインを含み、Ｃｐｆ１タンパク質はＲｕｖＣドメインおよびＮＵＣドメインを含み、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼは２つのＨＮＥＰＮドメインを含む。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは両方とも活性であり、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは二本鎖切断活性を有する（すなわち、二本鎖核酸配列の両方の鎖を切断する）。他の実施形態では、ヌクレアーゼドメインのうちの１つは、１つまたは複数の突然変異および／または欠失によって不活性化され、ＣＲＩＳＰＲ変異体は二本鎖核酸配列の一方の鎖を切断するニッカーゼである。例えば、Ｃａｓ９タンパク質のＲｕｖＣドメイン中の１つまたは複数の突然変異（例えば、Ｄ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａ）は、ガイドＲＮＡ相補鎖にニックを入れるＨＮＨニッカーゼをもたらし、Ｃａｓ９タンパク質のＨＮＨドメイン中の１つまたは複数の突然変異（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８５６Ａ、および／またはＮ８６３Ａ）は、ガイドＲＮＡ非相補鎖にニックを入れるＲｕｖＣニッカーゼをもたらす。同等の突然変異は、Ｃａｓ１２／Ｃｐｆ１およびＣａｓ１３ａヌクレアーゼをニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓニッカーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼに関して上に詳述した同じ細菌種から供給され得る。
【0063】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲシステム（例えば、ＲＮＰ）は、Ｃ ＧからＴ ＡまたはＡ ＴからＧ Ｃへの塩基編集デアミナーゼ酵素によって媒介される部位特異的塩基編集を作成することができる［Gaudelli et al., Programmable base editing of A T to G C in genomic DNA without DNA cleavage." Nature 551, 464-471 (2017)；Nishida et al. "Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems." Science 353 (6305) (2016)；Komar et al. "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage." Nature 533, 420-424 (2016)］。シチジンデアミナーゼまたはアデニンデアミナーゼタンパク質に融合された触媒的に死んだｄＣａｓ９は、ＤＮＡ切断を誘導することなくＤＮＡ塩基を変更することができる特定の塩基エディターになる。塩基エディターは、Ｃ→Ｔ（または逆鎖ではＧ→Ａ）に変換し、またはアデニンをイノシンに変換することになるアデニン塩基エディターは、ｇＲＮＡによって指定された編集ウィンドウ内でＡ→Ｇ変化をもたらす。本明細書で使用される場合、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓ複合体、ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓシステム、ガイドされたＣａｓシステム、および上述の複数の形態は、本明細書において互換的に使用され、複合体を形成することができる少なくとも１つのガイドポリヌクレオチドおよび少なくとも１つのＣａｓタンパク質（すなわち、エンドヌクレアーゼ）を指す。前記ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的部位に向けることができ、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識、結合、および適宜ニックまたは切断（一本鎖または二本鎖切断を導入）できるようにする。ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ複合体は本明細書において、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムなどの４種類の公知のＣＲＩＳＰＲシステム（Horvath and Barrangou, 2010, Science 327: 167-170）のうちのいずれかのＣａｓタンパク質および適切なポリヌクレオチド成分を含み得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは標的配列でＤＮＡ二重鎖をほどき、Ｃａｓタンパク質との複合体中にあるポリヌクレオチド（限定されるものではないが、ｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡなどの）による標的配列の認識によって媒介されるとき、少なくとも１つのＤＮＡ鎖を適宜切断する。Ｃａｓエンドヌクレアーゼによる標的配列のそのような認識およびカッティングは、典型的には、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）がＤＮＡ標的配列の３末端もしくは５末端に、またはこれに隣接して位置する場合に生じる。あるいは、Ｃａｓタンパク質は本明細書においてＤＮＡ切断活性またはニッキング活性を欠く場合があるが、適切なＲＮＡ成分と複合体化されると、依然としてＤＮＡ標的配列に特異的に結合することができる。
【0064】
一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼ－不活性化Ｃａｓ９ドメインのＮ末端に融合される。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは、ヌクレアーゼ－不活性化Ｃａｓ９ドメインのＣ末端に融合される。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインおよびヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９ドメインはリンカーを通じて融合される。リンカーは、二次構造またはそれより高次の構造、Ｎ末端、およびＣ末端の１つまたは複数のＮＬＳを持たない非機能性アミノ酸配列であってもよい。１つを超えるＮＬＳがある場合、各ＮＬＳは他のＮＬＳとは独立するように選択され得る。一部の実施形態では、標的塩基編集融合タンパク質は２つのＮＬＳを含み、例えば、２つのＮＬＳはそれぞれＮ末端およびＣ末端に位置する。
【0065】
一部の実施形態では、標的塩基修飾は、任意のヌクレオチドＣ、Ａ、Ｔ、またはＧの、任意の他のヌクレオチドへの変換である。Ｃ、Ａ、ＴまたはＧヌクレオチドのうちのいずれか１つは、塩基エディター、または触媒的に活性なその断片によって媒介されるとき、別のヌクレオチドへ部位特異的に交換され得る。塩基編集複合体は、目的のヌクレオチドを目的の任意の他のヌクレオチドへ標的的に変換することができる任意の塩基エディター、または塩基エディタードメインもしくは触媒的に活性なその断片を含むことができる。
【0066】
本開示による塩基編集ドメインは、少なくとも１つのシチジンデアミナーゼ、または触媒的に活性なその断片を含むことができる。少なくとも１つの塩基編集複合体は、塩基エディターとしてシチジンデアミナーゼ、または触媒的に活性な断片の形態でのそのドメインを含むことができる。
【0067】
本開示によれば、本開示に関連して使用され得るシチジンデアミナーゼには、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｂ ｍＲＮＡ－ｅｄｉｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼとして知られる酵素ファミリーのメンバー、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）、またはシチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、デアミナーゼは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、およびＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼ、またはＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼである。
【0068】
シチジンデアミナーゼは、ＤＮＡ一本鎖中のシトシンを標的にすることができる。ある特定の例示実施形態では、シチジン（ｃｙｔｏｄｉｎｅ）デアミナーゼは、結合成分、例えば、結合されたＣａｓ９および／またはＣａｓ１３の外側に存在する一本鎖上で編集してもよい。他の例示実施形態では、シチジン（ｃｙｔｏｄｉｎｅ）デアミナーゼは、局在化したバブル、例えば、ガイド配列以外の標的編集部位でのミスマッチによって形成される局在化バブルにおいて編集してもよい。
【0069】
一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼタンパク質は、ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二重鎖の一本鎖バブル中の１つまたは複数の標的シトシン残基を認識し、ウラシル残基に変換する。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼタンパク質は、ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二重鎖の一本鎖バブル上の結合ウィンドウを認識する。一部の実施形態では、結合ウィンドウは、少なくとも１個の標的シトシン残基を含有する。一部の実施形態では、結合ウィンドウは約３ｂｐ～約１００ｂｐの範囲にある。一部の実施形態では、結合ウィンドウは約５ｂｐ～約５０ｂｐの範囲にある。一部の実施形態では、結合ウィンドウは約１０ｂｐ～約３０ｂｐの範囲にある。一部の実施形態では、結合ウィンドウは約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、５ｂｐ、７ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ、または１００ｂｐである。
【0070】
一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼタンパク質は、１つまたは複数のデアミナーゼドメインを含む。理論に拘束されるものではないが、デアミナーゼドメインは、ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二重鎖の一本鎖バブルに含有される１つまたは複数の標的シトシン（Ｃ）残基を認識し、ウラシル（Ｕ）残基に変換するように機能することが企図される。一部の実施形態では、デアミナーゼドメインは活性中心を含む。一部の実施形態では、活性中心は亜鉛イオンを含む。一部の実施形態では、活性中心のまたはその近くのアミノ酸残基は、標的シトシン残基の５’側で１つまたは複数のヌクレオチドと相互作用する。一部の実施形態では、活性中心のまたはその近くのアミノ酸残基は、標的シトシン残基の３’側で１つまたは複数のヌクレオチドと相互作用する。
【0071】
一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＰＯＢＥＣ１完全タンパク質（ｆｕｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ｈＡＰＯＢＥＣｌ）またはそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＰＯＢＥＣｌ－Ｄ）もしくはそのＣ末端トランケートバージョン（ｈＡＰＯＢＥＣ－Ｔ）を含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣｌ、ｈＡＰＯＢＥＣ－ＤまたはｈＡＰＯＢＥＣ－Ｔに相同なＡＰＯＢＥＣファミリーメンバーである。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＩＤ１完全タンパク質（ｈＡＩＤ）またはそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＩＤ－Ｄ）もしくはそのＣ末端トランケートバージョン（ｈＡＩＤ－Ｔ）を含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、ｈＡＩＤ、ｈＡＩＤ－ＤまたはｈＡＩＤ－Ｔに相同なＡＩＤファミリーメンバーである。一部の実施形態では、ｈＡＩＤＴは、約２０個のアミノ酸がＣ末端トランケートされたｈＡＩＤである。
【0072】
一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、シトシンデアミナーゼの野生型アミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、シチジンデアミナーゼは、シトシンデアミナーゼの編集効率、および／または基質編集優先性が特定のニーズに従って変更されるように、シトシンデアミナーゼ配列中に１つまたは複数の突然変異を含む。
【0073】
ＡＰＯＢＥＣ１およびＡＰＯＢＥＣ３タンパク質のある特異的突然変異は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるKim et al., Nature Biotechnology (2017) 35(4):371-377およびHarris et al. Mal. Cell (2002) 10: 1247-1253、に記載されている。
【0074】
シチジンデアミナーゼの追加の実施形態は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／０７０６３２およびＷＯ２０１８／２１３７２６に開示されている。
【0075】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ。さらなる他の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、一組のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であってもよい。ＺＦＮは、ＤＮＡ結合ジンクフィンガー領域およびヌクレアーゼドメインを含む。ジンクフィンガー領域は約２～７個のジンクフィンガー、例えば、約４～６個のジンクフィンガーを含み得、各ジンクフィンガーは３個の連続する塩基対に結合する。ジンクフィンガー領域は、任意のＤＮＡ配列を認識し、結合するように改変することができる。ジンクフィンガー設計ツールまたはアルゴリズムは、インターネット上でまたは商業的供給源から入手可能である。ジンクフィンガーは、適切なリンカー配列を使用して連結し合うことができる。
【0076】
ＺＦＮは、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができるヌクレアーゼドメインも含む。ヌクレアーゼドメインが由来し得るエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＩＩ型Ｓ制限エンドヌクレアーゼに由来してもよい。ＩＩ型Ｓエンドヌクレアーゼは、認識／結合部位から典型的には数塩基対離れている、それ故に分離可能な結合および切断ドメインを有する部位でＤＮＡを切断する。これらの酵素は、一般に、一時的に会合して二量体を形成して、互い違いの位置でＤＮＡの各鎖を切断する単量体である。適切なＩＩ型Ｓエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、ＢｆｉＩ、ＢｐｍＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、およびＳａｐＩが含まれる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインまたはその誘導体であってもよい。ＩＩ型Ｓヌクレアーゼドメインは、２つの異なるヌクレアーゼドメインの二量体化を促進するように修飾することができる。例えば、ＦｏｋＩの切断ドメインは、ある特定のアミノ酸残基を突然変異させることによって修飾されてもよい。非限定的な例として、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの４４６位、４４７位、４７９位、４８３位、４８４位、４８６位、４８７位、４９０位、４９１位、４９６位、４９８位、４９９位、５００位、５３１位、５３４位、５３７位、および５３８位のアミノ酸残基が修飾の標的である。特定の実施形態では、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、Ｑ４８６Ｅ、Ｉ４９９Ｌ、および／またはＮ４９６Ｄ突然変異を含む第１のＦｏｋＩハーフドメイン、ならびにＥ４９０Ｋ、Ｉ５３８Ｋ、および／またはＨ５３７Ｒ突然変異を含む第２のＦｏｋＩハーフドメインを含んでもよい。一部の実施形態では、ＺＦＮは二本鎖切断活性を有する。他の実施形態では、ＺＦＮはニッカーゼ活性を有する（すなわち、ヌクレアーゼドメインのうちの１つは不活性化されている）。
【0077】
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ。代替の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であってもよい。ＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼドメインに連結された転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来する高度に保存された反復からなるＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥは、宿主植物細胞において遺伝子の転写を変える植物病原体ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）によって分泌されるタンパク質である。ＴＡＬＥ反復アレイは、モジュラータンパク質設計により改変されて目的の任意のＤＮＡ配列を標的にすることができる。ＴＡＬＥＮのヌクレアーゼドメインは、ＺＦＮを説明するサブセクションに上記されている任意のヌクレアーゼドメインであってもよい。特定の実施形態では、ヌクレアーゼドメインはＦｏｋＩに由来する［Sanjana et al., 2012, Nat Protoc, 7(1):171-192］。ＴＡＬＥＮは、二本鎖切断活性またはニッカーゼ活性を有することができる。
【0078】
メガヌクレアーゼまたはレアカッティング（Ｒａｒｅ－Ｃｕｔｔｉｎｇ）エンドヌクレアーゼ。さらなる他の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、メガヌクレアーゼまたはその誘導体であってもよい。メガヌクレアーゼは、長い認識配列を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼである。すなわち、認識配列は一般に約１２塩基対～約４５塩基対にわたる。この要件の結果として、認識配列は一般に任意の所与のゲノムにおいて１回しか生じない。メガヌクレアーゼのうち、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号１）という名のホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、ゲノム研究およびゲノム工学の有用なツールになっている。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、またはそれらの変異体であってもよい。メガヌクレアーゼは、当業者に周知の手法を使用してその認識配列を修飾することによって特定の染色体配列を標的にすることができる。代替の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、レアカッティングエンドヌクレアーゼまたはその誘導体であってもよい。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、その認識配列がゲノム中でめったに生じない、好ましくはゲノム中で１回しか生じない部位特異的エンドヌクレアーゼである。レアカッティングエンドヌクレアーゼは、７ヌクレオチド配列、８ヌクレオチド配列、またはより長い認識配列を認識し得る。レアカッティングエンドヌクレアーゼの非限定的な例には、ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＳｂｆＩ、およびＦｓｅＩが含まれる。
【0079】
ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン。さらなる追加の実施形態では、ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質であってもよい。ヌクレアーゼドメインは、ＺＦＮを説明するサブセクションに上記されたもの（例えば、ヌクレアーゼドメインは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインであってもよい）、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｃａｓ９のＲｕｖＣまたはＨＮＨヌクレアーゼドメイン）、またはメガヌクレアーゼもしくはレアカッティングエンドヌクレアーゼに由来するヌクレアーゼドメインのうちのいずれかであってもよい。
【0080】
キメラタンパク質のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、例えば、ジンクフィンガータンパク質または転写活性化因子様エフェクターなどの任意のプログラム可能なＤＮＡ結合タンパク質であってもよい。あるいは、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、すべてのヌクレアーゼ活性を欠くように欠失または突然変異によって修飾された、触媒的に不活性な（死んだ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質であってもよい。例えば、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＲｕｖＣドメインがＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａ突然変異を含み、ＨＮＨドメインがＨ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６５Ａ、および／またはＮ８６３Ａ突然変異を含む、触媒的に不活性な（死んだ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であってもよい。あるいは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン中に同等の突然変異を含む触媒的に不活性な（死んだ）Ｃｐｆ１タンパク質であってもよい。さらなる他の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性が突然変異および／または欠失によって取り除かれた触媒的に不活性なメガヌクレアーゼであってもよく、例えば、触媒的に不活性なメガヌクレアーゼはＣ末端トランケーションを含み得る。
【0081】
非ヌクレアーゼ活性を有するプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質
【0082】
代替の実施形態では、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質は、非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質であってもよい。プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質、転写活性化因子様エフェクター、触媒的に不活性な（死んだ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質、または触媒的に不活性な（死んだ）メガヌクレアーゼであってもよい。例えば、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ＲｕｖＣドメインがＤ１０Ａ、Ｄ８Ａ、Ｅ７６２Ａ、および／またはＤ９８６Ａ突然変異を含み、ＨＮＨドメインがＨ８４０Ａ、Ｈ５５９Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６５Ａ、および／またはＮ８６３Ａ突然変異を含む、触媒的に不活性な（死んだ）Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）であってもよい。あるいは、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ヌクレアーゼドメイン中に同等の突然変異を含む触媒的に不活性な（死んだ）Ｃｐｆ１タンパク質であってもよい。
【0083】
一部の実施形態では、キメラタンパク質の非ヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡまたはクロマチン構造を変える（およびＤＮＡ配列を変えても変えなくてもよい）エピジェネティック修飾ドメインであってもよい。適切なエピジェネティック修飾ドメインの非限定的な例には、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性（例えば、シトシンメチルトランスフェラーゼ）、ＤＮＡ脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ脱アミノ化（例えば、シトシンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グアニンデアミナーゼ）、ＤＮＡアミノ化、ＤＮＡ酸化活性、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）活性（例えば、Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ３００に由来するＨＡＴドメイン）、ヒストン脱アセチル化酵素活性、ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストン脱メチル化酵素活性、ヒストンキナーゼ活性、ヒストンホスファターゼ活性、ヒストンユビキチンリガーゼ活性、ヒストン脱ユビキチン化活性、ヒストンアデニル化活性、ヒストン脱アデニル化活性、ヒストンＳＵＭＯ化活性、ヒストン脱ＳＵＭＯ化活性、ヒストンリボシル化活性、ヒストン脱リボシル化活性、ヒストンミリストイル化活性、ヒストン脱ミリストイル化活性、ヒストンシトルリン化活性、ヒストンアルキル化活性、ヒストン脱アルキル化活性、またはヒストン酸化活性を有するものが含まれる。特定の実施形態では、エピジェネティック修飾ドメインは、シチジンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、またはＤＮＡメチルトランスフェラーゼ活性を含み得る。
【0084】
他の実施形態では、キメラタンパク質の非ヌクレアーゼ修飾ドメインは、転写活性化ドメインまたは転写抑制因子ドメインであってもよい。適切な転写活性化ドメインには、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６ドメイン、ＶＰ６４（ＶＰ１６の四量体誘導体である）、ＶＰ１６０、ＮＦκＢ ｐ６５活性化ドメイン、ｐ５３活性化ドメイン１および２、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）活性化ドメイン、Ｅ２Ａ活性化ドメイン、ヒト熱ショック因子１（ＨＳＦ１）由来の活性化ドメイン、またはＮＦＡＴ（活性化Ｔ細胞の核内因子）活性化ドメインが含まれる。適切な転写抑制因子ドメインの非限定的な例には、誘導性ｃＡＭＰ初期抑制因子（ＩＣＥＲ）ドメイン、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢ）抑制因子ドメイン、ＹＹ１グリシンリッチ抑制因子ドメイン、Ｓｐ１様抑制因子、Ｅ（ｓｐｌ）抑制因子、ＩκＢ抑制因子、またはメチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）抑制因子が含まれる。転写活性化または転写抑制因子ドメインは、ＤＮＡ結合タンパク質に遺伝的に融合させることができ、または非共有結合タンパク質－タンパク質、タンパク質－ＲＮＡ、もしくはタンパク質－ＤＮＡ相互作用を介して結合することができる。
【0085】
特定の実施形態では、キメラタンパク質の非ヌクレアーゼドメインは、シチジンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を含むことができる。
【0086】
一部の実施形態では、非ヌクレアーゼ活性を有するキメラタンパク質は、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含むことができる。検出可能な標識は、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、オレゴングリーン、アレクサフルオロ、ハロタグ、または適切な蛍光色素）、検出タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）、量子ドット、または金粒子であってもよい。
【0087】
適宜の核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、および／またはマーカードメイン
本明細書に開示されるプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）は、少なくとも１つの核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、および／またはマーカードメインをさらに含むことができる。
本明細書に開示されるプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）は、少なくとも１つの核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、および／またはマーカードメインをさらに含むことができる。
【0088】
核局在化シグナルの非限定的な例には、PKKKRKV（配列番号２）、PKKKRRV（配列番号３）、KRPAATKKAGQAKKKK（配列番号４）、YGRKKRRQRRR（配列番号５）、RKKRRQRRR（配列番号６）、PAAKRVKLD（配列番号７）、RQRRNELKRSP（配列番号８）、VSRKRPRP（配列番号９）、PPKKARED（配列番号１０）、PQPKKKPL（配列番号１１）、SALIKKKKKMAP（配列番号１２）、PKQKKRK（配列番号１３）、RKLKKKIKKL（配列番号１４）、REKKKFLKRR（配列番号１５）、KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK（配列番号１６）、RKCLQAGMNLEARKTKK（配列番号１７）、NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY（配列番号１８）、およびRMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV（配列番号１９）が含まれる。
【0089】
適切な細胞膜透過ドメインの例には、限定するものではないが、GRKKRRQRRRPPQPKKKRKV（配列番号２０）、PLSSIFSRIGDPPKKKRKV（配列番号２１）、GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV（配列番号２２）、GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV（配列番号２３）、KETWWETWWTEWSQPKKKRKV（配列番号２４）、YARAAARQARA（配列番号２５）、THRLPRRRRRR（配列番号２６）、GGRRARRRRRR（配列番号２７）、RRQRRTSKLMKR（配列番号２８）、GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL（配列番号２９）、KALAWEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA（配列番号３０）、およびRQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号３１）が含まれる。
【0090】
マーカードメインは、蛍光タンパク質および精製またはエピトープタグを含む。適切な蛍光タンパク質には、限定するものではないが、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、エメラルド、アザミグリーン、単量体アザミグリーン、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、シトリン、ビーナス、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａ１、ＧＦＰｕｖ、サファイア、Ｔ－サファイア）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、ミドリイシシアン）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ－単量体、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、およびオレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍオレンジ、ｍＫＯ、クサビラオレンジ、単量体クサビラオレンジ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）が含まれる。適切な精製またはエピトープタグの非限定的な例には、６×Ｈｉｓ（配列番号３２）、ＦＬＡＧ（登録商標）、ＨＡ、ＧＳＴ、Ｍｙｃなどが含まれる。
【0091】
少なくとも１つの核局在化シグナル、細胞膜透過ドメイン、および／またはマーカードメインは、融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および／または内部位置に位置し得る。
【0092】
特定の実施形態では、融合タンパク質のプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質はＣＲＩＳＰＲタンパク質である。例えば、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィルスＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）、ストレプトコッカス・パスツリアヌス（ＳｐａＣａｓ９）、カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）、黄色ブドウ球菌（ＳａＣａｓ９）、フランシセラ・ノビシダＣａｓ９（ＦｎＣａｓ９）、ナイセリア・シネレアＣａｓ９（ＮｃＣａｓ９）、ナイセリア・メニンギティディスＣａｓ９（ＮｍＣａｓ９）、フランシセラ・ノビシダＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）、アシダミノコッカス属種Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）、またはラクノスピラ属菌ＮＤ２００６ Ｃｐｆ１（ＬｂＣｐｆ１）であってもよい。
【0093】
複合体
本開示の別の態様は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲシステム（すなわち、ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイドＲＮＡ）および、適宜少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む複合体を包含する。一部の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインがＣＲＩＳＰＲシステムのＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結され得る（すなわち、上記の通り複合体はＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質を含む）。他の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＣＲＩＳＰＲシステムのガイドＲＮＡに連結され得る。基本的に上記の通り、連結は直接的または間接的であってもよい。例えば、ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質に連結されてもよく、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質のＲＮＡアプタマー配列への結合がヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインをガイドＲＮＡに連結させるように、ガイドＲＮＡはアプタマー配列を含むことができる。
本開示の別の態様は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲシステム（すなわち、ＣＲＩＳＰＲタンパク質およびガイドＲＮＡ）および、適宜少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインを含む複合体を包含する。一部の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインがＣＲＩＳＰＲシステムのＣＲＩＳＰＲタンパク質に連結され得る（すなわち、上記の通り複合体はＣＲＩＳＰＲ融合タンパク質を含む）。他の実施形態では、少なくとも１つのヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＣＲＩＳＰＲシステムのガイドＲＮＡに連結され得る。基本的に上記の通り、連結は直接的または間接的であってもよい。例えば、ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインは、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質に連結されてもよく、ＲＮＡアプタマー結合タンパク質のＲＮＡアプタマー配列への結合がヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインをガイドＲＮＡに連結させるように、ガイドＲＮＡはアプタマー配列を含むことができる。
【0094】
ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインはセクション（Ｉ）（ａ）に上記され、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は上に詳述されている。ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、ヌクレアーゼまたはニッカーゼ活性を有してもよい（例えば、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９型、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ１３であってもよい）。例えば、複合体はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含んでもよく、または複合体は２つのＣＲＩＳＰＲニッカーゼを含んでもよい。あるいは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、すべてのヌクレアーゼ活性を欠くように修飾され、非ヌクレアーゼドメイン（例えば、シトシンデアミナーゼ活性、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ活性、転写活性化活性、または転写抑制因子活性を有するドメイン）に連結されてもよい。一部の実施形態では、非ヌクレアーゼドメインはＲＮＡアプタマー結合タンパク質に連結することもできる。
【0095】
ヌクレオソーム相互作用タンパク質ドメインの有無にかかわらず、本明細書に記載されたＣＲＩＳＰＲシステムではガイドＲＮＡは、（ｉ）５末端にガイド配列を含有し、標的配列とハイブリダイズするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、および（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用するトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）配列を含む。各ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡガイド配列は異なる（すなわち、配列特異的である）。特定の細菌種由来のＣＲＩＳＰＲタンパク質と複合体化するように設計されたガイドＲＮＡでは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は一般に同じである。
【0096】
ｃｒＲＮＡガイド配列は、二本鎖配列においてプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と隣接する標的配列とハイブリダイズするように設計される（すなわち、プロトスペーサー）。Ｃａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列には、５’－ＮＧＧ、５’－ＮＧＧＮＧ、５’－ＮＮＡＧＡＡＷ、および５’－ＡＣＡＹが含まれ、Ｃｐｆ１のＰＡＭ配列には５’－ＴＴＮが含まれる（Ｎは任意のヌクレオチドとして定義され、ＷはＡまたはＴのどちらかとして定義され、ＹはＣまたはＴのどちらかとして定義される）。一般に、ｃｒＲＮＡガイド配列と標的配列との間の相補性は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。特定の実施形態では、相補性は完全（すなわち、１００％）である。様々な実施形態では、ｃｒＲＮＡガイド配列の長さは約１５ヌクレオチド～約２５ヌクレオチドにわたり得る。例えば、ｃｒＲＮＡガイド配列は、約１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長であってもよい。特定の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、約１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド長であってもよい。
【0097】
ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質と相互作用することができる１つまたは複数の１つのステムループ構造を形成する反復配列を含む。各ループおよびステムの長さは異なり得る。例えば、１つまたは複数のループは約３～約１０ヌクレオチド長にわたり得、１つまたは複数のステムは約６～約２０塩基対長にわたり得る。１つまたは複数のステムは、１～約１０ヌクレオチドのうちの１つまたは複数のバルジを含む場合がある。
【0098】
ｃｒＲＮＡは、長さ約２５ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドにわたり得る。様々な実施形態では、ｃｒＲＮＡは、長さ約２５～約５０ヌクレオチド、約５０～約７５ヌクレオチド、または約７５～約１００ヌクレオチドにわたり得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さ約５０ヌクレオチド～約３００ヌクレオチドにわたり得る。様々な実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さ約５０～約９０ヌクレオチド、約９０～約１１０ヌクレオチド、約１１０～約１３０ヌクレオチド、約１３０～約１５０ヌクレオチド、約１５０～約１７０ヌクレオチド、約１７０～約２００ヌクレオチド、約２００～約２５０ヌクレオチド、または約２５０～約３００ヌクレオチドにわたり得る。
【0099】
ガイドＲＮＡにおけるｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、一般に、目的の細菌種の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡのコード配列に基づく。一部の実施形態では、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（またはｃｒＲＮＡ定常反復領域およびｃｒＲＮＡ定常反復領域と二重構造を形成するｔｒａｃｒＲＮＡの対応する５’領域）が修飾されて、二次構造形成を促進し、二次構造安定性を高め、真核細胞での発現を促進し、編集効率を上げることなどができる。例えば、１つまたは複数のヌクレオチド変化が定常ガイドＲＮＡ配列に導入され得る。
【0100】
ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列がｔｒａｃｒＲＮＡ配列に連結された単一分子（すなわち、シングルガイドＲＮＡまたはｓｇＲＮＡ）であってもよい。あるいは、ガイドＲＮＡは２つの別々の分子であってもよい。第１の分子は、ｃｒＲＮＡガイド配列を５’末端に、および第２の分子の５’末端と塩基対を形成することができる追加の配列を３’末端に含み、第２の分子は、第１の分子の３’末端と塩基対を形成することができる５’配列、および追加のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムのガイドＲＮＡはｃｒＲＮＡのみを含んでもよい。
【0101】
一部の実施形態では、ガイドＲＮＡの１つまたは複数のステム－ループ領域は、１つまたは複数のアプタマー配列を含むように修飾され得る［Konermann et al., Nature, 2015, 517(7536):583-588；Zalatan et al., Cell, 2015, 160(1-2):339-50］。適切なＲＮＡアプタマータンパク質ドメインの例には、ＭＳ２コートタンパク質（ＭＣＰ）、ＰＰ７バクテリオファージコートタンパク質（ＰＣＰ）、ＭｕバクテリオファージＣｏｍタンパク質、ラムダバクテリオファージＮ２２タンパク質、ステム－ループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）、脆弱Ｘ精神遅滞症候群関連タンパク質１（ＦＸＲ１）、ＡＰ２０５、ＢＺ１３、ｆ１、ｆ２、ｆｄ、ｆｒ、ＩＤ２、ＪＰ３４／ＧＡ、ＪＰ５０１、ＪＰ３４、ＪＰ５００、ＫＵ１、Ｍ１１、Ｍ１２、ＭＸ１、ＮＬ９５、ＰＰ７、φＣｂ５、φＣｂ８ｒ、φＣｂ１２ｒ、φＣｂ２３ｒ、Ｑβ、Ｒ１７、ＳＰ－β、ＴＷ１８、ＴＷ１９、およびＶＫなどのバクテリオファージ由来のタンパク質、それらの断片、またはそれらの誘導体が含まれる。追加のアプタマー配列の長さは、約２０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチドにわたり得る。
【0102】
ガイドＲＮＡは、標準的なリボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド（例えば、シュードウリジン）、リボヌクレオチド異性体、および／またはリボヌクレオチド類似体を含むことができる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含むことができる。検出可能な標識は、フルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＭＲ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、オレゴングリーン、アレクサフルオロ、ハロタグ、または適切な蛍光色素）、検出タグ（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンなど）、量子ドット、または金粒子であってもよい。当業者はｇＲＮＡ設計および構築に精通しており、例えば、ｇＲＮＡ設計ツールはインターネット上でまたは商業的供給源から入手可能である。
【0103】
ガイドＲＮＡは、化学合成、酵素合成されてもよく、またはそれらの組合せであってもよい。例えば、ガイドＲＮＡは、標準的なホスホルアミダイトベースの固相合成方法を使用して合成することができる。あるいは、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを、ファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーター制御配列に作動可能に連結して、インビトロで合成することができる。適切なファージプロモーター配列の例には、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６プロモーター配列、またはそれらのバリエーションが含まれる。ガイドＲＮＡが２つの別々の分子（すなわち、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む実施形態では、ｃｒＲＮＡは化学的に合成され得、ｔｒａｃｒＲＮＡは酵素的に合成され得る。
【0104】
一部の実施形態では、複合体は、相同組換え修復プロセス（ＨＤＲ）による二本鎖切断の修復中に、ドナーポリヌクレオチド中のドナー配列が標的染色体配列で染色体配列と交換され、または染色体配列に組み込まれ得るように、標的染色体配列のどちらかの側に位置する配列に対して実質的な配列同一性を有する配列と隣接するドナー配列を含むドナーポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。外因性配列の組み込みは、「ノックイン」と呼ばれる。
【0105】
プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がヌクレアーゼ活性を含む実施形態では、方法は、本明細書に記載のおよびエレクトロポレーションエンハンサーを利用するエレクトロポレーションにより、少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することをさらに含むことができる。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖、直鎖もしくは環状であってもよく、および／またはＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドはベクター、例えば、プラスミドベクターであってもよい。
【0106】
ドナーポリヌクレオチドは、少なくとも１つのドナー配列を含む。一部の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、内因性または天然の染色体配列の修飾バージョンであってもよい。例えば、ドナー配列は、ＤＮＡ修飾タンパク質によって標的にされる配列のまたはその近くの染色体配列の一部と本質的に同一であってもよいが、少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。故に、組み込まれた配列または天然の配列と交換されると、標的染色体位置の配列は少なくとも１つのヌクレオチド変化を含む。例えば、該変化は、１つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、１つもしくは複数のヌクレオチドの欠失、１つもしくは複数のヌクレオチドの置換、またはそれらの組合せであってもよい。修飾配列の「遺伝子修正」組み込みの結果、細胞は標的染色体配列から修飾遺伝子産物を産生することができる。
【0107】
他の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は外因性配列であってもよい。本明細書で使用される場合、「外因性」配列とは、細胞にとって天然でない配列、またはその天然の位置が細胞のゲノム中の異なる位置にある配列を指す。例えば、外因性配列は、ゲノムに組み込むと、組み込まれた配列によってコードされるタンパク質を細胞が発現できるように、外因性プロモーター制御配列に作動可能に連結され得るタンパク質コード配列を含むことができる。あるいは、外因性配列は、その発現が内因性プロモーター制御配列によって調節されるように染色体配列に組み込むことができる。他のバージョンでは、外因性配列は、転写制御配列、別の発現制御配列、ＲＮＡコード配列などであってもよい。上述の通り、染色体配列への外因性配列の組み込みは、「ノックイン」と呼ばれる。
【0108】
当業者に理解され得るように、ドナー配列の長さは異なり得るものであり、実際に異なるであろう。例えば、ドナー配列は、数ヌクレオチドから数百ヌクレオチドから数十万ヌクレオチドの長さで異なり得る。
【0109】
典型的には、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質によって標的にされる配列の上流および下流に位置する配列に対して実質的な配列同一性をそれぞれ有する上流配列および下流配列と隣接する。これらの配列類似性のため、ドナーポリヌクレオチドの上流および下流配列は、ドナー配列が染色体配列に組み込まれ（または染色体配列と交換され）得るようなドナーポリヌクレオチドと標的染色体配列との間の相同組換えを可能にする。
【0110】
上流配列は、本明細書で使用される場合、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質によって標的にされる配列の上流の染色体配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。同様に、下流配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質によって標的にされる配列の下流の染色体配列と実質的な配列同一性を共有する核酸配列を指す。本明細書で使用される場合、「実質的な配列同一性」という句は、少なくとも約７５％の配列同一性を有する配列を指す。故に、ドナーポリヌクレオチド中の上流および下流配列は、標的配列の上流または下流の配列と約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し得る。例示的な実施形態では、ドナーポリヌクレオチド中の上流および下流配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質によって標的にされる配列の上流または下流の染色体配列と約９５％または１００％の配列同一性を有し得る。
【0111】
一部の実施形態では、上流配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質によって標的にされる配列のすぐ上流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態では、上流配列は、標的配列から約１００ヌクレオチド以内上流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。故に、例えば、上流配列は、標的配列から約１～約２０、約２１～約４０、約４１～約６０、約６１～約８０、または約８１～約１００ヌクレオチド上流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有し得る。一部の実施形態では、下流配列は、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質によって標的にされる配列のすぐ下流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。他の実施形態では、下流配列は、標的配列から約１００ヌクレオチド以内下流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有する。故に、例えば、下流配列は、標的配列から約１～約２０、約２１～約４０、約４１～約６０、約６１～約８０、または約８１～約１００ヌクレオチド下流に位置する染色体配列と実質的な配列同一性を共有し得る。
【0112】
各上流または下流配列は、長さ約２０ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチドにわたり得る。一部の実施形態では、上流および下流配列は、約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、または５０００ヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、上流および下流配列は、長さ約５０～約１５００ヌクレオチドにわたり得る。
【0113】
細胞型
様々な細胞が、本明細書に開示される方法、組成物、および使用における使用に適している。好ましくは、細胞は、本開示によりトランスフェクトされる［すなわち、ポリアニオン性ポリマー（例えば、デキストラン硫酸）の存在下、エレクトロポレーションによりトランスフェクトされる］真核細胞である。例えば、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単細胞真核生物であってもよい。一部の実施形態では、細胞は１細胞期胚であることもできる。例えば、非ヒト哺乳動物胚は、ラット、ハムスター、齧歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、および霊長類の胚を含む。さらなる他の実施形態では、細胞は、幹細胞、例えば胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞などであってもよい。１つの実施形態では、幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。さらに、幹細胞は、その全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００３／０４６１４１、またはChung et al.（Cell Stem Cell, 2008, 2: 113-117）に開示された手法によって作成されるものを含み得る。細胞は、インビトロまたはインビボ（すなわち、生体内）であってもよい。例示的な実施形態では、細胞は哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株である。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞またはヒト細胞株である。他の特定の実施形態では、細胞は植物細胞または植物細胞株である。
様々な細胞が、本明細書に開示される方法、組成物、および使用における使用に適している。好ましくは、細胞は、本開示によりトランスフェクトされる［すなわち、ポリアニオン性ポリマー（例えば、デキストラン硫酸）の存在下、エレクトロポレーションによりトランスフェクトされる］真核細胞である。例えば、細胞は、ヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、または単細胞真核生物であってもよい。一部の実施形態では、細胞は１細胞期胚であることもできる。例えば、非ヒト哺乳動物胚は、ラット、ハムスター、齧歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、および霊長類の胚を含む。さらなる他の実施形態では、細胞は、幹細胞、例えば胚性幹細胞、ＥＳ様幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞などであってもよい。１つの実施形態では、幹細胞はヒト胚性幹細胞ではない。さらに、幹細胞は、その全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００３／０４６１４１、またはChung et al.（Cell Stem Cell, 2008, 2: 113-117）に開示された手法によって作成されるものを含み得る。細胞は、インビトロまたはインビボ（すなわち、生体内）であってもよい。例示的な実施形態では、細胞は哺乳動物細胞または哺乳動物細胞株である。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞またはヒト細胞株である。他の特定の実施形態では、細胞は植物細胞または植物細胞株である。
【0114】
一部の実施形態では、本開示は、非ヒト哺乳動物細胞が、限定されるものではないが、霊長類、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ブタ（ｐｒｏｃｉｎｅ）、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、齧歯類、ウサギ科（Ｌｅｐｏｒｉｄａｅ）、例えば、サル、ウシ（ｃｏｗ）、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、ブタ（ｐｉｇ）、イヌ（ｄｏｇ）、ウサギ、ラット、またはマウスの細胞を含み得る、本明細書で論じられる方法、組成物、および使用を提供する。一部の実施形態では、本開示は、細胞が非哺乳動物真核細胞、例えば、家禽のトリ（例えば、ニワトリ）、脊椎動物魚（例えば、サケ）または甲殻類［例えば、カキ、アサリ（ｃｌａｉｍ）、ロブスター、エビ］の細胞であり得る、本明細書で論じられる方法、組成物、および使用を提供する。一部の実施形態では、本開示は、非ヒト真核生物細胞が植物細胞である、本明細書で論じられる方法、組成物、および使用を提供する。植物細胞は、単子葉もしくは双子葉植物、または作物もしくは穀物植物、例えば、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、ダイズ、コムギ、カラスムギ、もしくはイネの植物細胞であってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木または生産植物、果物または野菜（例えば、樹木、例えば柑橘樹、例えば、オレンジ、グレープフルーツまたはレモン樹；モモまたはネクタリン樹；リンゴまたは西洋ナシ樹；アーモンドまたはクルミまたはピスタチオ樹などの堅果樹；ナス科植物；アブラナ属の植物；アキノノゲシ属の植物；ホウレンソウ属の植物；トウガラシ属の植物；ワタ、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、コショウ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココアなど）の植物細胞であってもよい。
【0115】
ある特定の実施形態では、真核細胞は、非ヒト動物（細胞）、例えば、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類、有蹄類、齧歯類（好ましくはマウスまたはラット）、ウサギ、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、イヌ（ｄｏｇ）、ウシ（ｃｏｗ）、ウシ（ｂｏｖｉｎｅ）、ヒツジ（ｓｈｅｅｐ）、ヒツジ（ｏｖｉｎｅ）、ヤギ、ブタ、鳥、家禽、ニワトリ、魚、昆虫、または節足動物、好ましくは哺乳動物、例えば齧歯類、特にマウス（の細胞または細胞集団）である。一部の実施形態では、生物また対象または細胞は、節足動物、例えば、昆虫、または線虫（に由来する細胞または細胞集団）であってもよい。本開示の一部の方法では、生物また対象または細胞は植物（細胞）である。一部の実施形態では、生物また対象または細胞は、微細藻類を含む藻類、または菌類である（または由来する）。当業者は、本明細書で言及される方法により非ヒト真核生物に移植または導入され得る真核細胞は、好ましくは、それらが移植される真核生物と同じ種に由来するかまたは起源を持つことを理解するであろう。例えば、マウス細胞はマウスに移植され得る。ある特定の実施形態では、真核細胞は免疫不全真核生物、すなわち、免疫システムが部分的にまたは完全に停止している真核生物である。例えば、免疫不全マウスが、本明細書に記載の方法、組成物、および使用に関与してもよい。免疫不全マウスの例には、ヌードマウス、ＲＡＧ－／－マウス、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症）マウス、ＳＣＩＤベージュマウス、ＮＯＤ（非肥満糖尿病）ＳＣＩＤマウス、ＮＯＧまたはＮＳＧマウスなどが含まれるが、これらに限定されない。
【0116】
適切な哺乳動物細胞または細胞株の非限定的な例には、ヒト胎児性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；ヒトＵ２－ＯＳ骨肉腫細胞、ヒトＡ５４９細胞、ヒトＡ－４３１細胞、およびヒトＫ５６２細胞；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞；マウス骨髄腫ＮＳ０細胞、マウス胚性線維芽細胞３Ｔ３細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、マウスＢリンパ腫Ａ２０細胞；マウスメラノーマＢ１６細胞；マウス筋芽細胞Ｃ２Ｃ１２細胞；マウス骨髄腫ＳＰ２／０細胞；マウス胚性間葉系Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２細胞；マウス癌腫ＣＴ２６細胞、マウス前立腺ＤｕＣｕＰ細胞；マウス乳房ＥＭＴ６細胞；マウス肝細胞癌Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７細胞；マウス骨髄腫Ｊ５５８２細胞；マウス上皮ＭＴＤ－１Ａ細胞；マウス心筋ＭｙＥｎｄ細胞；マウス腎臓ＲｅｎＣａ細胞；マウス膵臓ＲＩＮ－５Ｆ細胞；マウスメラノーマＸ６４細胞；マウスリンパ腫ＹＡＣ－１細胞；ラット神経膠芽腫９Ｌ細胞；ラットＢリンパ腫ＲＢＬ細胞；ラット神経芽細胞腫Ｂ３５細胞；ラット肝細胞癌細胞（ＨＴＣ）；バッファローラット肝臓ＢＲＬ３Ａ細胞；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；イヌ乳腺（ＣＭＴ）細胞；ラット骨肉腫Ｄ１７細胞；ラット単球／マクロファージＤＨ８２細胞；サル腎臓ＳＶ－４０形質転換線維芽細胞（ＣＯＳ７）細胞；サル腎臓ＣＶＩ－７６細胞；アフリカミドリザル腎臓（ＶＥＲＯ－７６）細胞が含まれる。適切な細胞株のさらなる他の非限定的な例には、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ－３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ－Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ－３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ－２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ－７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ－ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ－Ｋ２、ＷＥＨＩ－２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ－１、ＢＣ－３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ－５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－６、ＣＯＳ－Ｍ６Ａ、ＢＳ－Ｃ－１サル腎臓上皮細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３ Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３－Ｌ１、１３２－ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３－Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ－５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ－１細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ－２１、ＢＲ ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ－２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ－７、ＣＨＯ－ＩＲ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｋ２、ＣＨＯ－Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ－／－、ＣＯＲ－Ｌ２３、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ－Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ－Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ－７、ＣＯＶ－４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ－６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ－２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ－Ｍｅｌ １－４８、ＭＣ－３８、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－１０Ａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ ６、ＭＴＤ－１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＮＡＬＭ－１、ＮＷ－１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ－１Ａ／ＰＮＴ ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ－５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｓｆ－９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ－４９、Ｘ６３、ＹＡＣ－１、ＹＡＲ、およびそれらのトランスジェニック種が含まれるが、これらに限定されない。哺乳動物細胞株の広範なリストは、アメリカンタイプカルチャーコレクションカタログ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に見出すことができる。
【0117】
用途
本明細書に開示される方法、組成物、使用、および／またはキットは、様々な治療的、診断的、工業的、および研究的用途において使用することができる。一部の実施形態では、本開示は、遺伝子の機能をモデル化および／もしくは研究する、目的の遺伝子状態もしくはエピジェネティック状態を研究する、または様々な疾患もしくは障害に関与する生化学的経路を研究するために、細胞、動物、または植物における目的の任意の染色体配列を修飾するのに使用することができる。例えば、疾患または障害をモデル化するトランスジェニック生物が作出されてもよく、疾患または障害と関連する１つまたは複数の核酸配列の発現が変更される。疾患モデルは、生物における突然変異の影響を研究し、疾患の発生および／または進行を研究し、疾患に対する薬学的に活性な化合物の効果を研究し、ならびに／または可能性のある遺伝子治療戦略の有効性を評価するのに使用することができる。
本明細書に開示される方法、組成物、使用、および／またはキットは、様々な治療的、診断的、工業的、および研究的用途において使用することができる。一部の実施形態では、本開示は、遺伝子の機能をモデル化および／もしくは研究する、目的の遺伝子状態もしくはエピジェネティック状態を研究する、または様々な疾患もしくは障害に関与する生化学的経路を研究するために、細胞、動物、または植物における目的の任意の染色体配列を修飾するのに使用することができる。例えば、疾患または障害をモデル化するトランスジェニック生物が作出されてもよく、疾患または障害と関連する１つまたは複数の核酸配列の発現が変更される。疾患モデルは、生物における突然変異の影響を研究し、疾患の発生および／または進行を研究し、疾患に対する薬学的に活性な化合物の効果を研究し、ならびに／または可能性のある遺伝子治療戦略の有効性を評価するのに使用することができる。
【0118】
他の実施形態では、方法、組成物、使用、および／またはキットは、特定の生物学的プロセスに関与する遺伝子の機能を研究し、遺伝子発現における任意の変化が生物学的プロセスにどのように影響し得るかを研究するために、または細胞表現型と組み合わせたゲノム遺伝子座の飽和もしくはディープスキャニング突然変異誘発（ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ ｏｒ ｄｅｅｐ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を行うために使用され得る、効率的で費用対効果の高い機能的ゲノムスクリーニングを行うのに使用することができる。飽和またはディープスキャニング突然変異誘発は、例えば、遺伝子発現、薬物耐性、および疾患の好転に必要な機能的要素の重要な最小限の特徴および個別の脆弱性を決定するのに使用することができる。
【0119】
さらなる実施形態では、本明細書に開示される方法、組成物、使用、および／またはキットは、疾患もしくは障害の存在を確立するための診断検査、および／または処置選択肢を決定する上での使用に使用することができる。適切な診断検査の例には、がん細胞における特異的突然変異（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２などにおける特異的突然変異）の検出、特定の疾患と関連する特異的突然変異（例えば、トリヌクレオチド反復、鎌状赤血球症と関連するβグロビンの突然変異、特異的ＳＮＰなど）の検出、肝炎の検出、ウイルス（例えば、ジカ）の検出などが含まれる。
【0120】
追加の実施形態では、本明細書に開示される方法、組成物、使用、および／またはキットは、特定の疾患または障害と関連する遺伝子突然変異を修正する、例えば、鎌状赤血球症もしくはサラセミアと関連するグロビン遺伝子突然変異を修正するか、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）と関連するアデノシンデアミナーゼ遺伝子の突然変異を修正するか、ハンチントン病の病因遺伝子であるＨＴＴの発現を低減するか、または網膜色素変性症の処置のためにロドプシン遺伝子の突然変異を修正するのに使用することができる。そのような修飾は、エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で細胞でなされ得る。
【0121】
さらなる他の実施形態では、本明細書に開示される方法、組成物、使用、および／またはキットは、形質が改善した、または環境ストレスに対する耐性が向上した作物を生成するのに使用することができる。本開示は、形質が改善した家畜、または生産動物を精製するのに使用することもできる。例えば、ブタは、特に再生医学または異種移植における生物医学モデルとして魅力的なものにする多くの特徴を有する。
【0122】
キット
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載された方法および使用において使用する１つまたは複数の成分を含むキットを提供する。
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載された方法および使用において使用する１つまたは複数の成分を含むキットを提供する。
【0123】
キットは、例えば、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質、ガイドＲＮＡ、トランスフェクション試薬、細胞増殖培地、選択培地、転写試薬、核酸精製試薬、タンパク質精製試薬、緩衝液、溶液などを含むことができる。１つの特定の実施形態では、キットは、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ（成分は別々に提供されてもよく、またはリボ核タンパク質として一緒に複合体化されてもよい）ならびに本明細書に記載のポリアニオン性ポリマー（例えば、デキストラン硫酸）を含む要素を含む。キットは、例えば、細胞、トランスフェクション試薬（例えば、エレクトロポレーション溶液またはその成分）、細胞増殖培地、選択培地、転写試薬、核酸精製試薬、タンパク質精製試薬、緩衝液、溶液などをさらにまたはあるいは含むことができる。要素は、個々にまたは組み合わせて提供されてもよく、バイアル、ボトル、またはチューブなどの任意の適切な容器で提供されてもよい。
【0124】
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載された要素のうちの１つまたは複数を利用する方法において使用する１つまたは複数の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器で提供されてもよい。例えば、キットは、１つまたは複数の反応、再構成、安定化、希釈、および／または貯蔵緩衝液または溶液を提供してもよい。試薬は、特にアッセイにおいて使用可能な形態、または使用前に１つもしくは複数の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮または凍結乾燥形態）で提供され得る。緩衝液または溶液は、限定されるものではないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、およびそれらの組合せを含む、バイオテクノロジー用途で一般的に使用される任意の緩衝液または溶液であってもよい。一部の実施形態では、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態では、緩衝液は約７～約１０のｐＨを有する。一部の実施形態では、キットは、ガイド配列および調節エレメントを作動可能に連結するようにベクターに挿入するガイド配列に対応する１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載されたベクターのうちの１つもしくは複数、ならびに／またはポリヌクレオチドのうちの１つもしくは複数を含む。キットは、有利には、本開示の方法および／またはシステムのすべての要素の提供を可能にし得る。
【0125】
本明細書に提供されるキットは、一般に、以下に詳述される方法を実行するための説明書を含む。キットに含まれる説明書は包装材料に添付されてもよく、または添付文書として含まれてもよい。説明書は典型的には書かれたまたは印刷された資料であるが、そのようなものに限定されない。そのような説明書を保存し、それらをエンドユーザーに伝えることができる任意の媒体が、本開示によって企図される。そのような媒体には、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ、ストレージドライブ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）などが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、用語「説明書」は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。キットは、１つまたは複数の言語、例えば１つを超える言語で説明書を含むこともできる。
【0126】
１つの態様では、本開示は、上記の方法および組成物において開示された要素のうちのいずれか１つまたは複数を含有するキットを提供する。１つの特定の実施形態では、キットは、ポリアニオン性ポリマーもしくはその塩、またはポリアニオン性ポリマーもしくはその塩の組合せを含む溶液、および１つまたは複数の緩衝液を含む。別の特定の実施形態では、キットは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９もしくはＣａｓ１２などの組換えＣａｓタンパク質、または上記された別のＣａｓタンパク質）、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩（例えば、デキストラン硫酸ナトリウム塩および／または上記された別の硫酸化多糖）を含有する溶液、再構成溶液、および希釈溶液のうちの１つまたは複数を含む。適切および例示的な再構成溶液は、例えば、５０％グリセロールを含むものである。適切なおよび例示的な希釈溶液は、例えば、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）および２０ｍＭ ＮａＣｌを含むものである。１つの例示的なポリアニオン性ポリマー溶液は、２ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）および２０ｍＭ ＮａＣｌに１μｇ／μＬデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む。
【0127】
定義
以下の定義および方法は、本開示をさらに良く定義し、本開示を実施する上で当業者を導くために提供される。特に断りのない限り、用語は当業者による従来の用法に従って理解されるべきである。
以下の定義および方法は、本開示をさらに良く定義し、本開示を実施する上で当業者を導くために提供される。特に断りのない限り、用語は当業者による従来の用法に従って理解されるべきである。
【0128】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語および化学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本開示で使用される用語のうちの多くの一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd Ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、特に指定されない限りそれらに帰する意味を有する。
【0129】
本開示またはその好ましい実施形態を紹介する場合、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「前記（ｓａｉｄ）」は、要素のうち１つまたは複数があることを意味すると意図される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は、包括的であり、列挙された要素以外の追加の要素があることを意味すると意図される。
【0130】
用語「約」は、例えば、数値ｘと関連して使用される場合、ｘ±５％を意味する。
【0131】
本明細書で使用される場合、用語「相補的な」または「相補性」とは、特異的水素結合を通じた塩基対形成による二本鎖核酸の結合を指す。塩基対形成は、標準的なワトソン－クリック塩基対形成であってもよい（例えば、５’－Ａ Ｇ Ｔ Ｃ－３’は相補的配列３’－Ｔ Ｃ Ａ Ｇ－５’と対を形成する）。塩基対形成は、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型水素結合でもあってもよい。相補性は、典型的には二重領域に関して測定され、故に、例えばオーバーハングを除外する。二重領域の２本鎖間の相補性は部分的であってもよく、塩基の一部（例えば、７０％）のみが相補的な場合、パーセンテージ（例えば、７０％）として表され得る。相補的でない塩基は「ミスマッチ」である。相補性はまた、二重領域の塩基すべてが相補的である場合、完全（すなわち、１００％）であり得る。
【0132】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＲＩＳＰＲシステム」とは、ＣＲＩＳＰＲタンパク質（すなわち、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、または触媒的に死んだタンパク質）およびガイドＲＮＡを含む複合体を指す。
【0133】
用語「内因性」または「内因性配列」は、本明細書で使用される場合、細胞にとって天然の染色体配列を指す。
【0134】
用語「標的配列」、「標的染色体配列」、および「標的部位」は互換的に使用されて、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が標的にする染色体ＤＮＡ中の特定の配列、およびプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がＤＮＡまたはＤＮＡと結合するタンパク質を修飾する部位を指す。
【0135】
本明細書で使用される場合、用語「外因性」または「外因性配列」とは、細胞にとって天然ではない配列、または細胞のゲノムにおけるその天然の位置が、異なる染色体位置にある染色体配列を指す。
【0136】
「遺伝子」とは本明細書で使用される場合、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域（エクソンおよびイントロンを含む）、および遺伝子産物の産生を制御するすべてのＤＮＡ領域（そのような制御配列が、コード配列および／または転写された配列に隣接しているか否かにかかわらず）を指す。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位などの転写制御配列、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位、ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、必ずしもそれらに限定されない。
【0137】
用語「異種の」とは、目的の細胞にとって内因性または天然の実体を指す。例えば、異種タンパク質とは、外因的に導入された核酸配列などの外因性供給源に由来するか、または元々由来するタンパク質を指す。一部の例では、異種タンパク質は目的の細胞によって通常は産生されない。
【0138】
用語「ニッカーゼ」とは、二本鎖核酸配列の一方の鎖を切断する（すなわち、二本鎖配列にニックを入れる）酵素を指す。例えば、二本鎖切断活性を有するヌクレアーゼが、ニッカーゼとして機能し、二本鎖配列の一方の鎖のみを切断するように突然変異および／または欠失によって修飾され得る。
【0139】
用語「ヌクレアーゼ」とは本明細書で使用される場合、二本鎖核酸配列の両方の鎖を切断する酵素を指す。
【0140】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、直鎖または環状コンフォメーションの、および一本鎖または二本鎖形態どちらかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定として解釈されるべきではない。該用語は、天然のヌクレオチドの既知の類似体、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分で修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対形成特異性を有する；すなわち、Ａの類似体はＴと塩基対を形成することになる。
【0141】
用語「ヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド（すなわち、アデノシン、グアノシン、シトシン、チミジン、およびウリジン）、ヌクレオチド異性体、またはヌクレオチド類似体であってもよい。ヌクレオチド類似体とは、修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾されたリボース部分を有するヌクレオチを指す。ヌクレオチド類似体は、天然に存在するヌクレオチド（例えば、イノシン、シュードウリジンなど）または天然に存在しないヌクレオチドであってもよい。ヌクレオチドの糖または塩基部分における修飾の非限定的な例には、アセチル基、アミノ基、カルボキシル基、カルボキシメチル基、ヒドロキシル基、メチル基、ホスホリル基、およびチオール基の付加（または除去）、ならびに塩基の炭素および窒素原子の他の原子（例えば、７－デアザプリン）との置換が含まれる。ヌクレオチド類似体には、ジデオキシヌクレオチド、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびモルホリノも含まれる。
【0142】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は互換的に使用されて、アミノ酸残基のポリマーを指す。
【0143】
本明細書で使用される場合、用語「プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質」とは、染色体ＤＮＡ中の特定の標的配列に結合するように改変され、該標的配列においてまたはその近くでＤＮＡまたはＤＮＡと結合するタンパク質を修飾するタンパク質を指す。
【0144】
用語「配列同一性」は本明細書で使用される場合、実質的に等しい長さの２つの配列間の同一性の程度の定量的尺度を示す。核酸であれアミノ酸配列であれ、２つの配列の同一性パーセントは、２つの整列された配列間の完全一致の数を短いほうの配列の長さで割り、１００をかけたものである。核酸配列のおよそのアライメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. 0. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.c., USAによって開発されたスコアリングマトリックスを使用してアミノ酸配列に適用され得、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)によって正規化され得る。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実装は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティーアプリケーションでＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒグループ（マジソン、ウィスコンシン州）によって提供されている。配列間の同一性または類似性パーセントを算出するための他の適切なプログラムは、一般に当技術分野で公知であり、例えば、別のアライメントプログラムは、デフォルトパラメーターを用いて使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメーターを使用して使用することができる：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；説明＝５０配列ｓ；ソート順＝高スコア；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、ＧｅｎＢａｎｋＷｅｂサイトに見出すことができる。一般に、置換は保存的アミノ酸置換であり：グループ１：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；グループ２：セリン、システイン、スレオニン、およびメチオニン；グループ３：プロリン；グループ４：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；グループ５：アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、およびグルタミンのメンバー内での交換に限定される。
【0145】
用語「標的配列」、「標的染色体配列」、および「標的部位」は互換的に使用されて、プログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質が標的にする染色体ＤＮＡ中の特定の配列、およびプログラム可能なＤＮＡ修飾タンパク質がＤＮＡまたはＤＮＡと結合するタンパク質を修飾する部位を指す。
【0146】
核酸およびアミノ酸配列同一性を決定するための手法は、当技術分野で公知である。典型的には、そのような手法は、遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること、および／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、およびこれらの配列を第２のヌクレオチドもしくはアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列もこのようにして決定および比較することができる。
【0147】
一般に、同一性とは、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列それぞれの完全なヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸対応を指す。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの同一性パーセントを決定することによって比較することができる。
【0148】
本開示の範囲を逸脱することなく上記の方法および組成物に様々な変更が行われ得るため、上記の記載および以下に示される例に含有されるすべての事項は例示的で、限定的な意味ではないと解釈されるものとする。
【0149】
本発明を詳細に記載してきたため、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲を逸脱することなく変更および変形が可能であることは明らかであろう。さらに、本開示におけるすべての例は、非限定的な例として提供されることが理解されるべきである。
【実施例】
【0150】
以下の非限定的な例は、本発明をさらに例示するために提供される。以下の例で開示される手法は、本発明を実施する上で十分に機能することを本発明者らが見出したアプローチであり、故に本発明の実施様式の例をなすとみなされ得ることが当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態では多くの変更を行うことができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を依然として得ることができることを理解するべきである。
【0151】
実施例１：ヒト細胞でのＳｐＣａｓ９エンドヌクレアーゼゲノム修飾効率に関するデキストラン硫酸用量依存的増強
ＳｐＣａｓ９タンパク質（製品番号：ＣＡＳ９ＰＲＯＴ）およびヒトＲｅｌＡ遺伝子座を標的にする５’－ＧＡＧＧＧＧＧＡＡＣＡＧＵＵＣＵＧＡＡＡ－３’（配列番号３３）のスペーサー配列を含む合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。
ＳｐＣａｓ９タンパク質（製品番号：ＣＡＳ９ＰＲＯＴ）およびヒトＲｅｌＡ遺伝子座を標的にする５’－ＧＡＧＧＧＧＧＡＡＣＡＧＵＵＣＵＧＡＡＡ－３’（配列番号３３）のスペーサー配列を含む合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。
【0152】
【表1】
【0153】
５００ｋＤａを超える平均分子量を有するデキストラン硫酸ナトリウム塩（製品番号：Ｄ８９０６）もＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。デキストラン硫酸溶液は、化学物質を５０μｇ／μＬで水に溶解して調製し、０．２２μｍフィルターを通して濾過により滅菌した。ストック溶液を水で希釈して作業溶液を調製した。
【0154】
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）、１００ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質５μｇを１．５ｍＬ微小遠心管に１０μＬ総反応容量で添加して調製した。ｓｇＲＮＡ対Ｃａｓ９タンパク質モル比は約３：１である。複合体を室温で１５分間インキュベートし、次いでトランスフェクションまで氷上で維持した。ヒトＫ５６２細胞は、トランスフェクションの前日に１ｍＬあたり０．２５×１０６細胞で播種し、トランスフェクションの時点で１ｍＬあたり約０．５×１０６細胞であった。細胞をハンクス平衡塩溶液で２回洗浄し、次いでＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｌｏｎｚａ）に１００μＬあたり約０．３５×１０６細胞で再懸濁した。ヌクレオフェクションは、最初に細胞１００μＬをデキストラン硫酸溶液１μＬと混合し、次いで、気泡を導入することなくピペットを上下させ穏やかに混和してＲＮＰ複合体と混合した後、ＡｍａｘａプログラムＴ－０１６によるエレクトロポレーション用キュベットに移して行った。細胞を、１ウェルあたり２ｍＬ余熱培地を含有する６ウェルプレートに直ちに移し、３７℃および５％ ＣＯ２で３日間増殖させた後、ゲノム修飾アッセイのために回収した。
【0155】
トランスフェクト細胞からのゲノムＤＮＡ抽出物を、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を使用して調製した。標的ゲノム領域は、以下のサイクル条件：９８℃／２分；９８℃／１５秒、６２℃／３０秒、および７２℃／４５秒、３４サイクル；７２℃／５分で、定量ＰＣＲキット用のＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してＮＧＳプライマーでＰＣＲ増幅した。
【0156】
【表2】
【0157】
次いで、最初のＰＣＲ産物を、以下のサイクル条件：９５℃／３分；９５℃／３０秒、５５℃／３０秒、および７２℃／３０秒、８サイクル；７２℃／５分で、定量ＰＣＲキット用ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａインデックスプライマーで再増幅した。インデックス付与ＰＣＲ産物を、Ｓｅｌｅｃｔ－ａ－Ｓｉｚｅ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ）を用いて精製し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって定量化した。ＰＣＲ産物を次いで正規化し、ＮＧＳライブラリーを作成するためにプールした。ＮＧＳは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器および２×３００ｂｐキットを使用して行った。ゲノム編集頻度について試料ごとにＦＡＳＴＱファイルを解析した。
【0158】
結果を図１に示す。結果は、細胞をデキストラン硫酸溶液で処理するとヌクレアーゼ活性が増強され、デキストラン硫酸の用量が細胞１００μＬあたり０．２５μｇ～約１μｇに増加するとき、増強の大きさが増加することを示している。
【0159】
実施例２：デキストラン硫酸はヒト細胞の種々の内因性標的でＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼ編集効率を増強する
６つのヒトゲノム部位を標的にするＳｐＣａｓ９タンパク質（製品番号：ＣＡＳ９ＰＲＯＴ）および合成ｓｇＲＮＡを、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。各ゲノム部位を３回の生物学的反復で試験した。これらのｓｇＲＮＡのスペーサー配列を表１にリストする。デキストラン硫酸ナトリウム塩溶液を実施例１に記載のように調製し、水で希釈して作業溶液を１μｇ／μＬで調製した。ＲＮＰ複合体は、実施例１に記載のようにＳｐＣａｓ９タンパク質５μｇおよび１００ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡを使用して調製した。ヒトｋ５６２細胞は、トランスフェクションの前日に１ｍＬあたり０．２５×１０６細胞で播種し、トランスフェクションの時点で１ｍＬあたり約０．５×１０６細胞であった。細胞をハンクス平衡塩溶液で２回洗浄し、次いで、１００μＬあたり１μｇ／μＬのデキストラン硫酸１μＬ、または水１μＬ（対照）を補充したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖに１００μＬあたり約０．３５×１０６細胞で再懸濁した。ヌクレオフェクションは、細胞１００μＬをＲＮＰ複合体に移し、気泡を導入することなくピペットを上下させ穏やかに混和して直ちに混合した後、ＡｍａｘａプログラムＴ－０１６によるエレクトロポレーション用キュベットに移して行った。細胞を、１ウェルあたり２ｍＬ余熱培地を含有する６ウェルプレートに直ちに移し、３７℃および５％ ＣＯ２で３日間増殖させた後、ゲノム修飾アッセイのために回収した。
６つのヒトゲノム部位を標的にするＳｐＣａｓ９タンパク質（製品番号：ＣＡＳ９ＰＲＯＴ）および合成ｓｇＲＮＡを、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。各ゲノム部位を３回の生物学的反復で試験した。これらのｓｇＲＮＡのスペーサー配列を表１にリストする。デキストラン硫酸ナトリウム塩溶液を実施例１に記載のように調製し、水で希釈して作業溶液を１μｇ／μＬで調製した。ＲＮＰ複合体は、実施例１に記載のようにＳｐＣａｓ９タンパク質５μｇおよび１００ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡを使用して調製した。ヒトｋ５６２細胞は、トランスフェクションの前日に１ｍＬあたり０．２５×１０６細胞で播種し、トランスフェクションの時点で１ｍＬあたり約０．５×１０６細胞であった。細胞をハンクス平衡塩溶液で２回洗浄し、次いで、１００μＬあたり１μｇ／μＬのデキストラン硫酸１μＬ、または水１μＬ（対照）を補充したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖに１００μＬあたり約０．３５×１０６細胞で再懸濁した。ヌクレオフェクションは、細胞１００μＬをＲＮＰ複合体に移し、気泡を導入することなくピペットを上下させ穏やかに混和して直ちに混合した後、ＡｍａｘａプログラムＴ－０１６によるエレクトロポレーション用キュベットに移して行った。細胞を、１ウェルあたり２ｍＬ余熱培地を含有する６ウェルプレートに直ちに移し、３７℃および５％ ＣＯ２で３日間増殖させた後、ゲノム修飾アッセイのために回収した。
【0160】
トランスフェクト細胞からのゲノムＤＮＡ抽出物を、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を使用して調製した。ＣＡＲ１９、ＣＣＲ５、ＣＨＩ３Ｌ１、ＰＯＲ２３、およびＶＥＧＦＡに関して、標的ゲノム領域は、以下のサイクル条件：９８℃／２分；９８℃／１５秒、６２℃／３０秒、および７２℃／４５秒、３４サイクル；７２℃／５分で、定量ＰＣＲキット用のＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してＮＧＳプライマーでＰＣＲ増幅した。ＨＥＫＳｉｔｅ４に関して、標的ゲノム領域は、以下のサイクル条件：９５℃／３分；９８℃／２０秒、６８℃／３０秒、および７２℃／４５秒、３４サイクル；７２℃／５分で、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＲｅａｄｙＭｉｘ ＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＮＧＳプライマーでＰＣＲ増幅した。標的部位およびＰＡＭを表３にリストし、ＮＧＳプライマーを表４にリストする。次いで、最初のＰＣＲ産物を、以下のサイクル条件：９５℃／３分；９５℃／３０秒、５５℃／３０秒、および７２℃／３０秒、８サイクル；７２℃／５分で、定量ＰＣＲキット用のＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａインデックスプライマーで再増幅した。インデックス付与ＰＣＲ産物を、Ｓｅｌｅｃｔ－ａ－Ｓｉｚｅ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ）を用いて精製し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって定量化した。ＰＣＲ産物を次いで正規化し、ＮＧＳライブラリーを作成するためにプールした。ＮＧＳは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器および２×３００ｂｐキットを使用して行った。ゲノム編集頻度について試料ごとにＦＡＳＴＱファイルを解析した。
【0161】
【表3】
【0162】
【表4-1】
【表4-2】
【0163】
結果を図２に示す。結果は、デキストラン硫酸処理が、試験したあらゆる標的部位でＳｐＣａｓ９の編集効率を有意に上げたことを示している。対照と比較して、エンハンサーによる改善の大きさは、標的部位に応じて約２倍～３倍に及んだ。
【0164】
実施例３：デキストラン硫酸は種々の内因性部位でシトシン塩基エディターのＣからＴへの編集効率を高める
シトシン塩基エディターは、ヒトＡＰＯＢＥＣ３ＡをＳｐＣａｓ９ Ｄ１０Ａニッカーゼのアミノ酸末端に融合させて構築した。塩基エディターの組換えタンパク質は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）から９０％を超える均一性まで精製した。ヒト細胞の６つの内因性部位を標的にする合成ｓｇＲＮＡをＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。各部位を３回の生物学的反復で試験した。これらのｓｇＲＮＡのスペーサー配列を表５にリストする。デキストラン硫酸ナトリウム塩溶液を実施例１に記載のように調製し、水で希釈して作業溶液を１μｇ／μＬで調製した。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）、２００ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ、およびシトシン塩基エディタータンパク質１５μｇを１．５ｍＬ微小遠心管に１０μＬ総反応容量で添加して調製した。ｓｇＲＮＡ対シトシン塩基エディタータンパク質モル比は約３：１である。複合体を室温で１５分間インキュベートし、次いでトランスフェクションまで氷上で維持した。ヒトＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクションの２日前に約２０％培養密度で播種し、トランスフェクションの時点で約８０％培養密度であった。細胞をトリプシン溶液で剥離し、ハンクス平衡塩溶液で２回洗浄し、次いで、１００μＬあたり１μｇ／μＬのデキストラン硫酸１μＬ、または水１μＬ（対照）を補充したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖに１００μＬあたり約０．３×１０６細胞で再懸濁した。ヌクレオフェクションは、細胞１００μＬをＲＮＰ複合体に移し、気泡を導入することなくピペットを上下させ穏やかに混和して直ちに混合した後、ＡｍａｘａプログラムＱ－００１によるエレクトロポレーション用キュベットに移して行った。細胞を、１ウェルあたり２ｍＬ余熱培地を含有する６ウェルプレートに直ちに移し、３７℃および５％ ＣＯ２で３日間増殖させた後、ゲノム修飾アッセイのために回収した。
シトシン塩基エディターは、ヒトＡＰＯＢＥＣ３ＡをＳｐＣａｓ９ Ｄ１０Ａニッカーゼのアミノ酸末端に融合させて構築した。塩基エディターの組換えタンパク質は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）から９０％を超える均一性まで精製した。ヒト細胞の６つの内因性部位を標的にする合成ｓｇＲＮＡをＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。各部位を３回の生物学的反復で試験した。これらのｓｇＲＮＡのスペーサー配列を表５にリストする。デキストラン硫酸ナトリウム塩溶液を実施例１に記載のように調製し、水で希釈して作業溶液を１μｇ／μＬで調製した。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）、２００ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ、およびシトシン塩基エディタータンパク質１５μｇを１．５ｍＬ微小遠心管に１０μＬ総反応容量で添加して調製した。ｓｇＲＮＡ対シトシン塩基エディタータンパク質モル比は約３：１である。複合体を室温で１５分間インキュベートし、次いでトランスフェクションまで氷上で維持した。ヒトＨＥＫ２９３細胞は、トランスフェクションの２日前に約２０％培養密度で播種し、トランスフェクションの時点で約８０％培養密度であった。細胞をトリプシン溶液で剥離し、ハンクス平衡塩溶液で２回洗浄し、次いで、１００μＬあたり１μｇ／μＬのデキストラン硫酸１μＬ、または水１μＬ（対照）を補充したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖに１００μＬあたり約０．３×１０６細胞で再懸濁した。ヌクレオフェクションは、細胞１００μＬをＲＮＰ複合体に移し、気泡を導入することなくピペットを上下させ穏やかに混和して直ちに混合した後、ＡｍａｘａプログラムＱ－００１によるエレクトロポレーション用キュベットに移して行った。細胞を、１ウェルあたり２ｍＬ余熱培地を含有する６ウェルプレートに直ちに移し、３７℃および５％ ＣＯ２で３日間増殖させた後、ゲノム修飾アッセイのために回収した。
【0165】
トランスフェクト細胞からのゲノムＤＮＡ抽出物を、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を使用して調製した。標的ゲノム領域は、以下のサイクル条件：９８℃／２分；９８℃／１５秒、６２℃／３０秒、および７２℃／４５秒、３４サイクル；７２℃／５分で、定量ＰＣＲキット用のＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してＮＧＳプライマーでＰＣＲ増幅した。ＮＧＳプライマーを表５にリストする。次いで、最初のＰＣＲ産物を、以下のサイクル条件：９５℃／３分；９５℃／３０秒、５５℃／３０秒、および７２℃／３０秒、８サイクル；７２℃／５分で、定量ＰＣＲキット用のＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａインデックスプライマーで再増幅した。インデックス付与ＰＣＲ産物を、Ｓｅｌｅｃｔ－ａ－Ｓｉｚｅ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ）を用いて精製し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって定量化した。ＰＣＲ産物を次いで正規化し、ＮＧＳライブラリーを作成するためにプールした。ＮＧＳは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器および２×３００ｂｐキットを使用して行った。ＣからＴへの変換頻度について試料ごとにＦＡＳＴＱファイルを解析した。
【0166】
【表5】
【0167】
【表6-1】
【表6-2】
【0168】
結果を図３Ａ～３Ｆに示す。結果は、対照と比較してデキストラン硫酸処理が、シトシン塩基エディターの編集ウィンドウ内のあらゆるＣで、および試験したあらゆる標的部位でＣからＴへの変換効率を上げたことを示している。改善は、プロトスペーサーおよび標的部位における変換されたＣの位置に応じて約２倍～３倍に及んだ。
【0169】
実施例４：Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性に関するペントサンポリ硫酸増強
高忠実度ＳｐＣａｓ９タンパク質（カタログ番号ＣＡＳ９ Ｐｌｕｓ）、およびヒトＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座を標的にする５’－ＧＧＣＡＣＵＧＣＧＧＣＵＧＧＡＧＧＵＧＧ－３’のスペーサー配列（配列番号４６）を含む合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。（Ｃ５Ｈ６Ｎａ２Ｏ１０Ｓ２）ｎの式を有するペントサンポリ硫酸ナトリウム塩をＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから購入した（カタログ番号Ｓ３５００）。ペントサンポリ硫酸溶液は、該化学物質を５０ｍｇ／ｍｌで水に溶解して調製した。ポリアニオン性ポリマーの分子構造単位は、次の通りである：
高忠実度ＳｐＣａｓ９タンパク質（カタログ番号ＣＡＳ９ Ｐｌｕｓ）、およびヒトＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座を標的にする５’－ＧＧＣＡＣＵＧＣＧＧＣＵＧＧＡＧＧＵＧＧ－３’のスペーサー配列（配列番号４６）を含む合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。（Ｃ５Ｈ６Ｎａ２Ｏ１０Ｓ２）ｎの式を有するペントサンポリ硫酸ナトリウム塩をＳｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから購入した（カタログ番号Ｓ３５００）。ペントサンポリ硫酸溶液は、該化学物質を５０ｍｇ／ｍｌで水に溶解して調製した。ポリアニオン性ポリマーの分子構造単位は、次の通りである：
【化1】
【0170】
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）、１００ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質５μｇを１．５ｍＬ微小遠心管に１０μＬ総反応容量で添加して調製した。ｓｇＲＮＡ対Ｃａｓ９タンパク質モル比は約３：１である。複合体を室温で１５分間インキュベートし、次いでトランスフェクションまで氷上で維持した。ヒト皮膚線維芽細胞をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入し（製品番号：１０６－０５Ａ）、トランスフェクションの２日前に約２０％培養密度で播種し、トランスフェクションの時点で約８０％培養密度であった。ヒトＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣから購入し（カタログ番号ＣＲＬ １５７３）、トランスフェクションの２日前に約２０％培養密度で播種し、トランスフェクションの時点で約８０％培養密度であった。細胞をトリプシン処理により剥離し、ハンクス平衡塩溶液で２回洗浄し、次いで、線維芽細胞についてはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液 ＶＰＤ－１００１（Ｌｏｎｚａ）に、またはＨＥＫ２９３についてはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｌｏｎｚａ）に１００μＬあたり約０．２５×１０６細胞で再懸濁した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液は両方とも、細胞再懸濁前にペントサンポリ硫酸溶液を種々の用量で補充した。ヌクレオフェクションは、気泡を導入することなくピペットを上下させ穏やかに混和して細胞１００μＬをＲＮＰ複合体と混合した後、エレクトロポレーション用キュベットに移して行った。線維芽細胞およびＨＥＫ２９３を、それぞれＡｍａｘａプログラムＵ－０２３およびＴ－０１６でトランスフェクトした。細胞を、１ウェルあたり２ｍＬ余熱培地を含有する６ウェルプレートに直ちに移し、３７℃および５％ ＣＯ２で３日間増殖させた後、ゲノム修飾アッセイのために回収した。線維芽細胞トランスフェクションを２回行った。
【0171】
トランスフェクト細胞からのゲノムＤＮＡ抽出物を、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を使用して調製した。標的ゲノム領域は、以下のサイクル条件：９８℃／２分；９８℃／１５秒、６２℃／３０秒、および７２℃／４５秒、３４サイクル；７２℃／５分で、定量ＰＣＲキット用のＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してＮＧＳプライマーでＰＣＲ増幅した。
【0172】
【表7】
【0173】
次いで、最初のＰＣＲ産物を、以下のサイクル条件：９５℃／３分；９５℃／３０秒、５５℃／３０秒、および７２℃／３０秒、８サイクル；７２℃／５分で、定量ＰＣＲキット用のＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａインデックスプライマーで再増幅した。インデックス付与ＰＣＲ産物を、Ｓｅｌｅｃｔ－ａ－Ｓｉｚｅ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ）を用いて精製し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって定量化した。ＰＣＲ産物を次いで正規化し、ＮＧＳライブラリーを作成するためにプールした。ＮＧＳは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器および２×３００ｂｐキットを使用して行った。ゲノム編集頻度について試料ごとにＦＡＳＴＱファイルを解析した。
【0174】
【0175】
実施例５：Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性に関するヘパラン硫酸増強
高忠実度ＳｐＣａｓ９タンパク質（カタログ番号ＣＡＳ９ Ｐｌｕｓ）、およびヒトＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座を標的にする５’－ＧＧＣＡＣＵＧＣＧＧＣＵＧＧＡＧＧＵＧＧ－３’のスペーサー配列（配列番号４６）を含む合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。ヘパラン硫酸を、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから購入した（カタログ番号Ｓ５９９２）。ヘパラン硫酸溶液は、該化学物質を５０ｍｇ／ｍｌで水に溶解して調製した。ポリアニオン性ポリマーの分子構造単位は、次の通りである：
高忠実度ＳｐＣａｓ９タンパク質（カタログ番号ＣＡＳ９ Ｐｌｕｓ）、およびヒトＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座を標的にする５’－ＧＧＣＡＣＵＧＣＧＧＣＵＧＧＡＧＧＵＧＧ－３’のスペーサー配列（配列番号４６）を含む合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。ヘパラン硫酸を、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍから購入した（カタログ番号Ｓ５９９２）。ヘパラン硫酸溶液は、該化学物質を５０ｍｇ／ｍｌで水に溶解して調製した。ポリアニオン性ポリマーの分子構造単位は、次の通りである：
【化2】
【0176】
リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）、１００ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質５μｇを１．５ｍＬ微小遠心管に１０μＬ総反応容量で添加して調製した。ｓｇＲＮＡ対Ｃａｓ９タンパク質モル比は約３：１である。複合体を室温で１５分間インキュベートし、次いでトランスフェクションまで氷上で維持した。ヒト皮膚線維芽細胞をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入し（製品番号：１０６－０５Ａ）、トランスフェクションの２日前に約２０％培養密度で播種し、トランスフェクションの時点で約８０％培養密度であった。ヒトＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣから購入し（カタログ番号ＣＲＬ １５７３）、トランスフェクションの２日前に約２０％培養密度で播種し、トランスフェクションの時点で約８０％培養密度であった。細胞をトリプシン処理により剥離し、ハンクス平衡塩溶液で２回洗浄し、次いで、線維芽細胞についてはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液ＶＰＤ－１００１（Ｌｏｎｚａ）に、またはＨＥＫ２９３についてはＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｌｏｎｚａ）に１００μＬあたり約０．２５×１０６細胞で再懸濁した。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液は両方とも、細胞再懸濁前にヘパラン硫酸溶液を種々の用量で補充した。ヌクレオフェクションは、気泡を導入することなくピペットを上下させ穏やかに混和して細胞１００μＬをＲＮＰ複合体と混合した後、エレクトロポレーション用キュベットに移して行った。線維芽細胞およびＨＥＫ２９３を、それぞれＡｍａｘａプログラムＵ－０２３およびＴ－０１６でトランスフェクトした。細胞を、１ウェルあたり２ｍＬ余熱培地を含有する６ウェルプレートに直ちに移し、３７℃および５％ ＣＯ２で３日間増殖させた後、ゲノム修飾アッセイのために回収した。線維芽細胞トランスフェクションを２回行った。
【0177】
トランスフェクト細胞からのゲノムＤＮＡ抽出物を、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を使用して調製した。標的ゲノム領域は、以下のサイクル条件：９８℃／２分；９８℃／１５秒、６２℃／３０秒、および７２℃／４５秒、３４サイクル；７２℃／５分で、定量ＰＣＲキット用のＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してＮＧＳプライマーでＰＣＲ増幅した。
【0178】
【表8】
【0179】
次いで、最初のＰＣＲ産物を、以下のサイクル条件：９５℃／３分；９５℃／３０秒、５５℃／３０秒、および７２℃／３０秒、８サイクル；７２℃／５分で、定量ＰＣＲキット用のＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａインデックスプライマーで再増幅した。インデックス付与ＰＣＲ産物を、Ｓｅｌｅｃｔ－ａ－Ｓｉｚｅ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ）を用いて精製し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって定量化した。ＰＣＲ産物を次いで正規化し、ＮＧＳライブラリーを作成するためにプールした。ＮＧＳは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器および２×３００ｂｐキットを使用して行った。ゲノム編集頻度について試料ごとにＦＡＳＴＱファイルを解析した。
【0180】
【0181】
実施例６：細胞トランスフェクションによるＣａｓ９ ＲＮＰ編集増強に関する追加の化合物の評価
すべての化合物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入し、対照緩衝液（２ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解させた。各化合物を、表１０（Ｔａｂｌｅ １）に記載のように３つの用量で試験した。高忠実度ＳｐＣａｓ９タンパク質（カタログ番号ＣＡＳ９ Ｐｌｕｓ）、およびヒトＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座を標的にする５’－ＧＧＣＡＣＵＧＣＧＧＣＵＧＧＡＧＧＵＧＧ－３’のスペーサー配列（配列番号４６）を含む合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ）、１００ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質５μｇを１．５ｍＬ微小遠心管に１０μＬ総反応容量で添加して調製した。ｓｇＲＮＡ対Ｃａｓ９タンパク質モル比は約３：１である。複合体を室温で１５分間インキュベートし、次いでトランスフェクションまで氷上で維持した。
すべての化合物をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入し、対照緩衝液（２ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解させた。各化合物を、表１０（Ｔａｂｌｅ １）に記載のように３つの用量で試験した。高忠実度ＳｐＣａｓ９タンパク質（カタログ番号ＣＡＳ９ Ｐｌｕｓ）、およびヒトＨＥＫＳｉｔｅ４遺伝子座を標的にする５’－ＧＧＣＡＣＵＧＣＧＧＣＵＧＧＡＧＧＵＧＧ－３’のスペーサー配列（配列番号４６）を含む合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ）、１００ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質５μｇを１．５ｍＬ微小遠心管に１０μＬ総反応容量で添加して調製した。ｓｇＲＮＡ対Ｃａｓ９タンパク質モル比は約３：１である。複合体を室温で１５分間インキュベートし、次いでトランスフェクションまで氷上で維持した。
【0182】
ヒトＨＥＫ２９３細胞をＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＲＬ １５７３）から購入し、トランスフェクションの２日前に約２０％培養密度で播種し、トランスフェクションの時点で約８０％培養密度であった。細胞をトリプシン処理により剥離し、ハンクス平衡塩溶液で２回洗浄し、次いで、各化合物２μＬを補充したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ（Ｌｏｎｚａ）１００μＬあたり約０．２５×１０６細胞で再懸濁した。各化合物は、細胞再懸濁の前にＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖと混ぜ合わせた。対照緩衝液（２ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ）もトランスフェクション１回あたり２μＬで使用した。ヌクレオフェクションは、気泡を導入することなくピペットを上下させ穏やかに混和して細胞１００μＬをＲＮＰ複合体と混合した後、エレクトロポレーション用キュベットに移して行った。細胞を、ＡｍａｘａプログラムＴ－０１６でトランスフェクトした。細胞を、１ウェルあたり２ｍＬ余熱培地を含有する６ウェルプレートに直ちに移し、３７℃および５％ ＣＯ２で３日間増殖させた後、ゲノム修飾アッセイのために回収した。各トランスフェクション試験を２回行った。
【0183】
トランスフェクト細胞からのゲノムＤＮＡ抽出物を、ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ溶液を使用して調製した。標的ゲノム領域は、以下のサイクル条件：９８℃／２分；９８℃／１５秒、６２℃／３０秒、および７２℃／４５秒、３４サイクル；７２℃／５分で、定量ＰＣＲキット用のＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してＮＧＳプライマーでＰＣＲ増幅した。
【0184】
【表9】
【0185】
次いで、最初のＰＣＲ産物を、以下のサイクル条件：９５℃／３分；９５℃／３０秒、５５℃／３０秒、および７２℃／３０秒、８サイクル；７２℃／５分で、定量ＰＣＲキット用のＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）Ｔａｑ ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａインデックスプライマーで再増幅した。インデックス付与ＰＣＲ産物を、Ｓｅｌｅｃｔ－ａ－Ｓｉｚｅ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ）を用いて精製し、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）によって定量化した。ＰＣＲ産物を次いで正規化し、ＮＧＳライブラリーを作成するためにプールした。ＮＧＳは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ機器および２×３００ｂｐキットを使用して行った。ゲノム編集頻度について試料ごとにＦＡＳＴＱファイルを解析した。結果を図６に示す。
【0186】
結果は、コンブ（Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ）由来のフコイダン、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ラット尾由来のコラーゲン、κ－カラギーナン、およびラミナリア・ディギタータ（ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａ）由来のラミナリンが、試験した３つの用量の少なくとも１つで対照緩衝液より有意に高いレベルの編集効率をもたらしたことを示している。
【0187】
【表10】
【0188】
実施例７：ヒト初代Ｔ細胞におけるＣａｓ９ヌクレアーゼ活性に関するデキストラン硫酸増強
ヒト初代Ｔ細胞培養。ＣＤ８＋ ヒト初代Ｔ細胞をＳｔｅｍＣｅｌｌから購入した。細胞を、１０％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）、８ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）、および５０μＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）で維持した。ヌクレオフェクションの３日前に、細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ）で刺激した。ヌクレオフェクション後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）の存在下、細胞を製造者のプロトコールに従って培養した。
ヒト初代Ｔ細胞培養。ＣＤ８＋ ヒト初代Ｔ細胞をＳｔｅｍＣｅｌｌから購入した。細胞を、１０％ヒトＡＢ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）、８ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－２（Ｇｉｂｃｏ）、および５０μＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ（Ｔｈｅｒｍｏ）で維持した。ヌクレオフェクションの３日前に、細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ－Ｅｘｐａｎｄｅｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ）で刺激した。ヌクレオフェクション後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）の存在下、細胞を製造者のプロトコールに従って培養した。
【0189】
Ｃａｓ９ ＲＮＰアセンブリーおよびヌクレオフェクション。５００ｋＤａより大きい平均分子量を有するデキストラン硫酸ナトリウム塩（製品番号：Ｄ８９０６）をＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。デキストラン硫酸溶液は、化学物質を１μｇ／μＬで対照緩衝液（２ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ）に溶解して調製し、０．２２μｍフィルターを通して濾過により滅菌した。高忠実度ＳｐＣａｓ９タンパク質（カタログ番号ＣＡＳ９ Ｐｌｕｓ）、およびヒトＰＤ－１遺伝子座を標的にする５’－ＴＣＴＧＧＴＴＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＡＴＧ－３’のスペーサー配列（配列番号８１）を含む合成シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）もＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２０ｍＭ ＮａＣｌ）、１００ｐｍｏｌ ｓｇＲＮＡ、およびＣａｓ９タンパク質５μｇを１．５ｍＬ微小遠心管に１０μＬ総反応容量で添加して調製した。ｓｇＲＮＡ対Ｃａｓ９タンパク質モル比は約３：１である。複合体を室温で１５分間インキュベートし、次いでトランスフェクションまで氷上で維持した。１．５ｍＬエッペンドルフチューブに、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液を用いて１，０００，０００細胞を再懸濁し、次いでデキストラン硫酸の関連用量を添加した後、適当なＲＮＰ複合体を添加し、１００μＬの総容量を得た。４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ中、細胞をＡｍａｘａプログラムＤＳ－１２０でトランスフェクトした。細胞を、１ウェルあたり２ｍＬ余熱培地を含有する６ウェルプレートに直ちに移し、３７℃および５％ ＣＯ２で３日間増殖させた後、ゲノム修飾アッセイのために回収した。各トランスフェクション試験を２回行った。
【0190】
タグ付きプライマーを使用したＰＣＲ。トランスフェクト細胞からのゲノムＤＮＡ抽出物を、ＧｅｎＥｌｕｔｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡキット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して調製した。ＰＤ１のゲノム切断部位と隣接するプライマーと一緒に、ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）ＲＥＤＴａｑ（登録商標）ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をＰＣＲ増幅に使用した。プライマーを、以下のプライマーを使用して部分的Ｉｌｌｕｍｉｎａアダプター配列でタグ付けした：
熱サイクル条件は、９５℃で５分間、その後、９５℃で３０秒間、６７．７℃で３０秒間アニーリング、および７０℃で３０秒間伸長を３４サイクルの熱変性工程を含んだ。増幅の後に続いて、７０℃で１０分間の最終伸長、および４℃での冷却を行った。
【表11】
【0191】
試料インデックス付与。限定サイクルＰＣＲを実行して、増幅ＰＣＲ産物にインデックスを付与した。５０μＬの総反応容量は、２５μＬ ＪｕｍｐＳｔａｒｔ（商標）ＲＥＤＴａｑ（登録商標）ＲｅａｄｙＭｉｘ（商標）Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、増幅ＰＣＲ産物５μＬ、１０μＬ Ｈ２Ｏ、ならびに５μＭ Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｉｎｄｅｘ １（ｉ７）およびＩｎｄｅｘ ２（ｉ５）オリゴ各５μＬを含んだ。熱サイクル条件は、９５℃で３分間の最初の熱変性、その後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間を８サイクルからなった。最終伸長は７２℃で５分間実行し、反応を４℃に冷却した。ＰＣＲ精製は、ＡｘｙＰｒｅｐ（商標）Ｍａｇ ＰＣＲビーズ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）およびインデックス付与試料２５μＬを０．８：１ビーズ対ＰＣＲ比で使用して実行した。ＤＮＡを２５μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓに溶出した。
【0192】
精製インデックス付与ＰＣＲの定量化およびライブラリープーリング。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をインデックス付与試料の定量化に使用した。精製インデックス付与ＰＣＲを１×ＴＥで１：１００に希釈した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎは、製造者のプロトコール（５０μＬ ＰｉｃｏＧｒｅｅ＋１０ｍＬ １×ＴＥ）に従って希釈した。等容量の希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎを希釈したインデックス付与ＰＣＲ試料に添加し、蛍光プレートリーダーで最終１：１希釈比を得た。試料を４７５ｎｍで励起し、５３０ｎｍで読み取った。すべての試料を１×ＴＥで４ｎＭに正規化し、各正規化試料６μＬを回収し、プールした。
【0193】
配列決定のためのライブラリー調製。ストック１０Ｍ ＮａＯＨをＨ２Ｏで段階希釈して、ライブラリー調製の日に最終１：１００希釈（０．１Ｍ ＮａＯＨ）を得た。ＤＮＡを変性させるために、０．１Ｍ ＮａＯＨ５μＬおよびプールした４ｎＭライブラリー５μＬをエッペンドルフチューブで混ぜ合わせ、ＲＴで５分間インキュベートした。冷Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨＴ１緩衝液９９０μＬを変性ＤＮＡに添加し、２０ｐＭプール変性ライブラリーを得た。ＰｈｉＸ（２０ｐＭ）を解凍し、３０μＬを新鮮なチューブに移した。２０ｐＭライブラリー５７０μＬをＰｈｉＸに添加し、ライブラリー多様化、クラスター生成の品質管理、配列決定、およびアライメントのための５％ ＰｈｉＸを得た。これを混合し、９６℃で２分間熱ショックを与え、次いで直ちに氷上に置いた。３００サイクルｖ２ ＭｉＳｅｑ試薬カートリッジを氷水槽で解凍し、反転させて混合した。ＭｉＳｅｑ ｖ２フローセルを水およびエタノールでよくすすぎ、キムワイプで乾燥させ、すべての液体が除去され、細胞の表面に塩が検出されないことを確かめた。ｐ１２００チップを使用して、解凍した試薬カートリッジのウェル１７のホイルに穴を開けた。新しいチップを使用して、ＰｈｉＸ含有ライブラリー６００μＬをウェル１７に添加した。ラン後、ゲノム編集頻度について試料ごとにＦＡＳＴＱファイルを解析した。結果を図７に示す。
【0194】
結果は、トランスフェクション１回あたり０．５および１．０μｇの用量のデキストラン硫酸が、ヒト初代Ｔ細胞において対照緩衝液より有意に高いレベルの編集効率をもたらしたことを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-06-28
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ゲノム編集効率を高めるための方法であって、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の存在下、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムをエレクトロポレーションによって真核細胞に導入することを含む方法。
【請求項2】
ゲノム編集効率が、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の非存在下であること以外は同一の方法と比べて高められる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩の存在下、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが真核細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
導入が１つまたは複数のエレクトロポレーション工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が、約５ｋＤａより大きい、約１５ｋＤａより大きい、約２５ｋＤａより大きい、約５０ｋＤａより大きい、約７５ｋＤａより大きい、約１００ｋＤａより大きい、約１５０ｋＤａより大きい、約２００ｋＤａより大きい、約２５０ｋＤａより大きい、約３００ｋＤａより大きい、約３５０ｋＤａより大きい、約４００ｋＤａより大きい、約４５０ｋＤａより大きい、または約５００ｋＤａより大きい平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が約５００ｋＤａより大きい平均分子量を有する、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が多糖ポリマー、例えば硫酸化多糖ポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
（ｉ）ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が、カラギーナン、セルロース、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの組合せ、誘導体、および／もしくは塩のうちの１つもしくは複数を含むか；または（ｉｉ）ポリアニオン性ポリマーが、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖もしくはその塩であり、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびそれらの塩のうちの１つもしくは複数を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項9】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸および／またはデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩である、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムがＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性であるか、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｉ型、ＩＩ型（例えば、Ｃａｓ９）、ＩＩＩ型、Ｖ型（例えば、Ｃｐｆ１）、またはＶＩ型（例えば、Ｃａｓ１３）Ｃａｓタンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１タンパク質、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ４タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ８タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１０タンパク質、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、またはＣａｓ１３タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
プログラム可能なＤＮＡ結合システムがＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項19】
Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項20】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
ガイドＲＮＡが単一分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項22】
ガイドＲＮＡが２個の分子である、請求項１７に記載の方法。
【請求項23】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡが化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡが酵素的に合成されるか、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも酵素的に合成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項24】
真核細胞がヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
請求項２４に記載の方法により調製される、真核細胞。
【請求項26】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システム、真核細胞、および少なくとも１つのポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含むトランスフェクション組成物。
【請求項27】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が硫酸化多糖塩である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項28】
（ｉ）ポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、カラギーナン（例えば、Ｋ－、Ｉ－、および／またはＬ－カラギーナン）、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース）、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの組合せ、誘導体、および／もしくは塩のうちの１つもしくは複数を含むか；または（ｉｉ）ポリアニオン性ポリマーが、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖もしくはその塩であり、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびそれらの塩のうちの１つもしくは複数を含む、
請求項２６に記載の組成物。
【請求項29】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸および／またはデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項30】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩である、請求項２９に記載の組成物。
【請求項31】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項32】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムがＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項33】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項34】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むリボ核タンパク質複合体である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項35】
Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性であるか、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項36】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、核酸配列内の塩基を修飾するための塩基エディターである、請求項２６に記載の組成物。
【請求項37】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１タンパク質、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ４タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ８タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１０タンパク質、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、またはＣａｓ１３タンパク質を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項38】
プログラム可能なＤＮＡ結合システムがＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項39】
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項40】
Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項41】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項42】
ガイドＲＮＡが単一分子である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項43】
ガイドＲＮＡが２個の分子である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項44】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡが化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡが酵素的に合成されるか、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも酵素的に合成される、請求項３８に記載の組成物。
【請求項45】
真核細胞がヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項46】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システム、真核細胞、および２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含むトランスフェクション組成物。
【請求項47】
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩が硫酸化多糖塩である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項48】
（ｉ）２つ以上のポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、カラギーナン（例えば、Ｋ－、Ｉ－、および／またはＬ－カラギーナン）、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース）、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの組合せ、誘導体、および／もしくは塩のうちの１つもしくは複数から選択されるか；または（ｉｉ）２つ以上のポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖もしくはその塩であり、２つ以上のポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびその塩から選択される、
請求項４６記載の組成物。
【請求項49】
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの少なくとも１つがデキストラン硫酸および／またはデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項50】
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの１つがデキストラン硫酸ナトリウム塩であり、２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの別の１つが、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびデルマタン硫酸から選択される、請求項４６に記載の組成物。
【請求項51】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項52】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムがＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項53】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項５２に記載の組成物。
【請求項54】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むリボ核タンパク質複合体である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項55】
Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性であるか、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼである、請求項５２に記載の組成物。
【請求項56】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、核酸配列内の塩基を修飾するための塩基エディターである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項57】
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１タンパク質、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ４タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ８タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１０タンパク質、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、またはＣａｓ１３タンパク質を含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項58】
プログラム可能なＤＮＡ結合システムがＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、請求項４６に記載の組成物。
【請求項59】
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項60】
Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項61】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項５８に記載の組成物。
【請求項62】
ガイドＲＮＡが単一分子である、請求項５８に記載の組成物。
【請求項63】
ガイドＲＮＡが２個の分子である、請求項５８に記載の組成物。
【請求項64】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡが化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡが酵素的に合成されるか、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも酵素的に合成される、請求項５８に記載の組成物。
【請求項65】
真核細胞がヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項66】
Ｃａｓタンパク質、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液、および１つまたは複数の緩衝溶液を含むキット。
【請求項67】
１つまたは複数の緩衝溶液が再構成溶液および希釈溶液を含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項68】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液がデキストラン硫酸を含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項69】
再構成溶液が５０％グリセロールを含み、希釈溶液が２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）および２０ｍＭ ＮａＣｌを含む、請求項６７に記載のキット。
【請求項70】
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液が、１μｇ／μＬデキストラン硫酸ナトリウム塩を２ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）および２０ｍＭ ＮａＣｌ中に含む、請求項６８に記載のキット。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0149】
本発明を詳細に記載してきたため、添付の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲を逸脱することなく変更および変形が可能であることは明らかであろう。さらに、本開示におけるすべての例は、非限定的な例として提供されることが理解されるべきである。
本開示は、例えば、以下に関する。
［１］
ゲノム編集効率を高めるための方法であって、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の存在下、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムをエレクトロポレーションによって真核細胞に導入することを含む方法。
［２］
ゲノム編集効率が、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の非存在下であること以外は同一の方法と比べて高められる、前記［１］に記載の方法。
［３］
エレクトロポレーションが、プログラム可能なＤＮＡ修飾システム、真核細胞、およびポリアニオン性ポリマーまたはその塩をエレクトロポレーション溶液に配合すること、およびエレクトロポレーション溶液に電圧を印加し、それによって真核細胞にプログラム可能なＤＮＡ修飾システムを導入することを含む、前記［２］に記載の方法。
［４］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムを真核細胞に導入する前に、真核細胞がポリアニオン性ポリマーまたはその塩と接触される、前記［３］に記載の方法。
［５］
真核細胞およびポリアニオン性ポリマーが、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムとの配合の前および／またはエレクトロポレーション溶液への電圧の印加の前にエレクトロポレーション溶液中でインキュベートされる、前記［３］または［４］に記載の方法。
［６］
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩の存在下、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが真核細胞に導入される、前記項のいずれかに記載の方法。
［７］
導入が単一のエレクトロポレーション工程を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［８］
導入が複数のエレクトロポレーション工程を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［９］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が、約５ｋＤａより大きい、約１５ｋＤａより大きい、約２５ｋＤａより大きい、約５０ｋＤａより大きい、約７５ｋＤａより大きい、約１００ｋＤａより大きい、約１５０ｋＤａより大きい、約２００ｋＤａより大きい、約２５０ｋＤａより大きい、約３００ｋＤａより大きい、約３５０ｋＤａより大きい、約４００ｋＤａより大きい、約４５０ｋＤａより大きい、または約５００ｋＤａより大きい平均分子量を有する、前記項のいずれかに記載の方法。
［１０］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が約５００ｋＤａより大きい平均分子量を有する、前記項のいずれかに記載の方法。
［１１］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が多糖ポリマー、例えば硫酸化多糖ポリマーである、前記項のいずれかに記載の方法。
［１２］
（ｉ）ポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、カラギーナン（例えば、Ｋ－、Ｉ－、および／またはＬ－カラギーナン）、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース）、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの組合せ、誘導体、および／もしくは塩のうちの１つもしくは複数を含むか；または
（ｉｉ）ポリアニオン性ポリマーが、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖もしくはその塩であり、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびそれらの塩のうちの１つもしくは複数を含む、
前記項のいずれかに記載の方法。
［１３］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［１４］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［１５］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩である、前記項のいずれかに記載の方法。
［１６］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［１７］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムがＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［１８］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記［１７］に記載の方法。
［１９］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体である、前記項のいずれかに記載の方法。
［２０］
Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性であるか、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼである、前記［１７］～［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、核酸配列内の塩基を修飾するための塩基エディターである、前記項のいずれかに記載の方法。
［２２］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｉ型、ＩＩ型（例えば、Ｃａｓ９）、ＩＩＩ型、Ｖ型（例えば、Ｃｐｆ１）、またはＶＩ型（例えば、Ｃａｓ１３）Ｃａｓタンパク質を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［２３］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１タンパク質、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ４タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ８タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１０タンパク質、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、またはＣａｓ１３タンパク質を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［２４］
プログラム可能なＤＮＡ結合システムがＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［２５］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［２６］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記［１］～［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２７］
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、前記［１７］～［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むＣａｓ９タンパク質である、前記［１７］～［２５］のいずれか一項に記載の方法。
［２９］
Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、前記［１７］～［２８］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］
Ｃａｓタンパク質が、１つまたは２つの核局在化シグナルをさらに含む、前記［１７］～［２９］のいずれか一項に記載の方法。
［３１］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼシステムである、前記項のいずれかに記載の方法。
［３２］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記［３１］に記載の方法。
［３３］
ガイドＲＮＡが単一分子である、前記［３１］または［３２］に記載の方法。
［３４］
ガイドＲＮＡが２個の分子である、前記［３１］または［３２］に記載の方法。
［３５］
ガイドＲＮＡが酵素的に合成される、前記［３１］～［３４］のいずれか一項に記載の方法。
［３６］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡが化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡが酵素的に合成されるか、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも酵素的に合成される、前記［３１］～［３４］のいずれか一項に記載の方法。
［３７］
真核細胞がヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、前記項のいずれかに記載の方法。
［３８］
真核細胞が哺乳動物細胞または植物細胞である、前記項のいずれかに記載の方法。
［３９］
真核細胞がヒト細胞である、前記項のいずれかに記載の方法。
［４０］
前記項のいずれかに記載の方法により調製される、真核細胞。
［４１］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システム、真核細胞、および少なくとも１つのポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含むトランスフェクション組成物。
［４２］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が硫酸化多糖塩である、前記［４１］に記載の組成物。
［４３］
（ｉ）ポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、カラギーナン（例えば、Ｋ－、Ｉ－、および／またはＬ－カラギーナン）、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース）、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの組合せ、誘導体、および／もしくは塩のうちの１つもしくは複数を含むか；または
（ｉｉ）ポリアニオン性ポリマーが、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖もしくはその塩であり、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびそれらの塩のうちの１つもしくは複数を含む、
前記［４１］または［４２］に記載の組成物。
［４４］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸を含む、前記［４１］～［４３］のいずれか一項に記載の組成物。
［４５］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む、前記［４１］～［４３］のいずれか一項に記載の組成物。
［４６］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩である、前記［４１］～［４３］のいずれか一項に記載の組成物。
［４７］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、前記［４１］～［４６］のいずれか一項に記載の組成物。
［４８］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムがＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、前記［４１］～［４７］のいずれか一項に記載の組成物。
［４９］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記［４８］に記載の組成物。
［５０］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むリボ核タンパク質複合体である、前記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載の組成物。
［５１］
Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性であるか、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼである、前記［４８］～［５０］のいずれか一項に記載の組成物。
［５２］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、核酸配列内の塩基を修飾するための塩基エディターである、前記［４１］～［５１］のいずれか一項に記載の組成物。
［５３］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｉ型、ＩＩ型（例えば、Ｃａｓ９）、ＩＩＩ型、Ｖ型（例えば、Ｃｐｆ１）、またはＶＩ型（例えば、Ｃａｓ１３）Ｃａｓタンパク質を含む、前記［４１］～［５２］のいずれか一項に記載の組成物。
［５４］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１タンパク質、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ４タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ８タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１０タンパク質、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、またはＣａｓ１３タンパク質を含む、前記［４１］～［５３］のいずれか一項に記載の組成物。
［５５］
プログラム可能なＤＮＡ結合システムがＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）を含む、前記［４１］～［５４］のいずれか一項に記載の組成物。
［５６］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記［４１］～［５５］のいずれか一項に記載の組成物。
［５７］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記［４１］～［５５］のいずれか一項に記載の組成物。
［５８］
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、前記［５０］～［５７］のいずれか一項に記載の組成物。
［５９］
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むＣａｓ９タンパク質である、前記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組成物。
［６０］
Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、前記［５０］～［５９］のいずれか一項に記載の組成物。
［６１］
Ｃａｓタンパク質が、１つまたは２つの核局在化シグナルをさらに含む、前記［５０］～［６０］のいずれか一項に記載の組成物。
［６２］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼシステムである、前記［４１］～［６１］のいずれか一項に記載の組成物。
［６３］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記［６２］に記載の組成物。
［６４］
ガイドＲＮＡが単一分子である、前記［６２］または［６３］に記載の組成物。
［６５］
ガイドＲＮＡが２個の分子である、前記［６２］または［６３］に記載の組成物。
［６６］
ガイドＲＮＡが酵素的に合成される、前記［６２］～［６５］のいずれか一項に記載の組成物。
［６７］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡが化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡが酵素的に合成されるか、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも酵素的に合成される、前記［６２］～［６５］のいずれか一項に記載の組成物。
［６８］
真核細胞がヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、前記［４１］～［６７］のいずれか一項に記載の組成物。
［６９］
真核細胞が哺乳動物細胞または植物細胞である、前記［４１］～［６８］のいずれか一項に記載の組成物。
［７０］
真核細胞がヒト細胞である、前記［４１］～［６９］のいずれか一項に記載の組成物。
［７１］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システム、真核細胞、および２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含むトランスフェクション組成物。
［７２］
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩が硫酸化多糖塩である、前記［７１］に記載の組成物。
［７３］
（ｉ）２つ以上のポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、カラギーナン（例えば、Ｋ－、Ｉ－、および／またはＬ－カラギーナン）、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース）、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの組合せ、誘導体、および／もしくは塩のうちの１つもしくは複数から選択されるか；または
（ｉｉ）２つ以上のポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖もしくはその塩であり、２つ以上のポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびその塩から選択される、
前記［７１］または［７２］に記載の組成物。
［７４］
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの少なくとも１つがデキストラン硫酸を含む、前記［７１］～［７３］のいずれか一項に記載の組成物。
［７５］
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの少なくとも１つがデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む、前記［７１］～［７３］のいずれか一項に記載の組成物。
［７６］
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの１つがデキストラン硫酸ナトリウム塩であり、２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの別の１つが、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびデルマタン硫酸から選択される、前記［７１］～［７３］のいずれか一項に記載の組成物。
［７７］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、前記［７１］～［７６］のいずれか一項に記載の組成物。
［７８］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムがＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、前記［７１］～［７７］のいずれか一項に記載の組成物。
［７９］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記［７８］に記載の組成物。
［８０］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むリボ核タンパク質複合体である、前記［７１］～［７９］のいずれか一項に記載の組成物。
［８１］
Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性であるか、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼである、前記［７８］～［８０］のいずれか一項に記載の組成物。
［８２］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、核酸配列内の塩基を修飾するための塩基エディターである、前記［７１］～［８１］のいずれか一項に記載の組成物。
［８３］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｉ型、ＩＩ型（例えば、Ｃａｓ９）、ＩＩＩ型、Ｖ型（例えば、Ｃｐｆ１）、またはＶＩ型（例えば、Ｃａｓ１３）Ｃａｓタンパク質を含む、前記［７１］～［８２］のいずれか一項に記載の組成物。
［８４］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１タンパク質、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ４タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ８タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１０タンパク質、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、またはＣａｓ１３タンパク質を含む、前記［７１］～［８３］のいずれか一項に記載の組成物。
［８５］
プログラム可能なＤＮＡ結合システムがＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）を含む、前記［７１］～［８４］のいずれか一項に記載の組成物。
［８６］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記［７１］～［８５］のいずれか一項に記載の組成物。
［８７］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記［７１］～［８５］のいずれか一項に記載の組成物。
［８８］
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、前記［８０］～［８７］のいずれか一項に記載の組成物。
［８９］
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むＣａｓ９タンパク質である、前記［８０］～［８６］のいずれか一項に記載の組成物。
［９０］
Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、前記［８０］～［８９］のいずれか一項に記載の組成物。
［９１］
Ｃａｓタンパク質が、１つまたは２つの核局在化シグナルをさらに含む、前記［８０］～［９０］のいずれか一項に記載の組成物。
［９２］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼシステムである、前記［７１］～［９１］のいずれか一項に記載の組成物。
［９３］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記［９２］に記載の組成物。
［９４］
ガイドＲＮＡが単一分子である、前記［９２］または［９３］に記載の組成物。
［９５］
ガイドＲＮＡが２個の分子である、前記［９２］または［９３］に記載の組成物。
［９６］
ガイドＲＮＡが酵素的に合成される、前記［９２］～［９５］のいずれか一項に記載の組成物。
［９７］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡが化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡが酵素的に合成されるか、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも酵素的に合成される、前記［９２］～［９５］のいずれか一項に記載の組成物。
［９８］
真核細胞がヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、前記［７１］～［９７］のいずれか一項に記載の組成物。
［９９］
真核細胞が哺乳動物細胞または植物細胞である、前記［７１］～［９８］のいずれか一項に記載の組成物。
［１００］
真核細胞がヒト細胞である、前記［７１］～［９９］のいずれか一項に記載の組成物。
［１０１］
Ｃａｓタンパク質、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液、および１つまたは複数の緩衝溶液を含むキット。
［１０２］
１つまたは複数の緩衝溶液が再構成溶液および希釈溶液を含む、前記［１０１］に記載のキット。
［１０３］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液がデキストラン硫酸を含む、前記［１０１］または［１０２］に記載のキット。
［１０４］
再構成溶液が５０％グリセロールを含み、希釈溶液が２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）および２０ｍＭ ＮａＣｌを含む、前記［１０２］または［１０３］に記載のキット。
［１０５］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液が、１μｇ／μＬデキストラン硫酸ナトリウム塩を２ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）および２０ｍＭ ＮａＣｌ中に含む、前記［１０３］または［１０４］に記載のキット。
本開示は、例えば、以下に関する。
［１］
ゲノム編集効率を高めるための方法であって、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の存在下、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムをエレクトロポレーションによって真核細胞に導入することを含む方法。
［２］
ゲノム編集効率が、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩の非存在下であること以外は同一の方法と比べて高められる、前記［１］に記載の方法。
［３］
エレクトロポレーションが、プログラム可能なＤＮＡ修飾システム、真核細胞、およびポリアニオン性ポリマーまたはその塩をエレクトロポレーション溶液に配合すること、およびエレクトロポレーション溶液に電圧を印加し、それによって真核細胞にプログラム可能なＤＮＡ修飾システムを導入することを含む、前記［２］に記載の方法。
［４］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムを真核細胞に導入する前に、真核細胞がポリアニオン性ポリマーまたはその塩と接触される、前記［３］に記載の方法。
［５］
真核細胞およびポリアニオン性ポリマーが、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムとの配合の前および／またはエレクトロポレーション溶液への電圧の印加の前にエレクトロポレーション溶液中でインキュベートされる、前記［３］または［４］に記載の方法。
［６］
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩の存在下、プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが真核細胞に導入される、前記項のいずれかに記載の方法。
［７］
導入が単一のエレクトロポレーション工程を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［８］
導入が複数のエレクトロポレーション工程を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［９］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が、約５ｋＤａより大きい、約１５ｋＤａより大きい、約２５ｋＤａより大きい、約５０ｋＤａより大きい、約７５ｋＤａより大きい、約１００ｋＤａより大きい、約１５０ｋＤａより大きい、約２００ｋＤａより大きい、約２５０ｋＤａより大きい、約３００ｋＤａより大きい、約３５０ｋＤａより大きい、約４００ｋＤａより大きい、約４５０ｋＤａより大きい、または約５００ｋＤａより大きい平均分子量を有する、前記項のいずれかに記載の方法。
［１０］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が約５００ｋＤａより大きい平均分子量を有する、前記項のいずれかに記載の方法。
［１１］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が多糖ポリマー、例えば硫酸化多糖ポリマーである、前記項のいずれかに記載の方法。
［１２］
（ｉ）ポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、カラギーナン（例えば、Ｋ－、Ｉ－、および／またはＬ－カラギーナン）、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース）、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの組合せ、誘導体、および／もしくは塩のうちの１つもしくは複数を含むか；または
（ｉｉ）ポリアニオン性ポリマーが、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖もしくはその塩であり、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびそれらの塩のうちの１つもしくは複数を含む、
前記項のいずれかに記載の方法。
［１３］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［１４］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［１５］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩である、前記項のいずれかに記載の方法。
［１６］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ ｓｈｏｒｔ ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［１７］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムがＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［１８］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記［１７］に記載の方法。
［１９］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含むリボ核タンパク質複合体である、前記項のいずれかに記載の方法。
［２０］
Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性であるか、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼである、前記［１７］～［１９］のいずれか一項に記載の方法。
［２１］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、核酸配列内の塩基を修飾するための塩基エディターである、前記項のいずれかに記載の方法。
［２２］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｉ型、ＩＩ型（例えば、Ｃａｓ９）、ＩＩＩ型、Ｖ型（例えば、Ｃｐｆ１）、またはＶＩ型（例えば、Ｃａｓ１３）Ｃａｓタンパク質を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［２３］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１タンパク質、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ４タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ８タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１０タンパク質、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、またはＣａｓ１３タンパク質を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［２４］
プログラム可能なＤＮＡ結合システムがＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）を含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［２５］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記項のいずれかに記載の方法。
［２６］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記［１］～［２４］のいずれか一項に記載の方法。
［２７］
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、前記［１７］～［２６］のいずれか一項に記載の方法。
［２８］
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むＣａｓ９タンパク質である、前記［１７］～［２５］のいずれか一項に記載の方法。
［２９］
Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、前記［１７］～［２８］のいずれか一項に記載の方法。
［３０］
Ｃａｓタンパク質が、１つまたは２つの核局在化シグナルをさらに含む、前記［１７］～［２９］のいずれか一項に記載の方法。
［３１］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼシステムである、前記項のいずれかに記載の方法。
［３２］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記［３１］に記載の方法。
［３３］
ガイドＲＮＡが単一分子である、前記［３１］または［３２］に記載の方法。
［３４］
ガイドＲＮＡが２個の分子である、前記［３１］または［３２］に記載の方法。
［３５］
ガイドＲＮＡが酵素的に合成される、前記［３１］～［３４］のいずれか一項に記載の方法。
［３６］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡが化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡが酵素的に合成されるか、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも酵素的に合成される、前記［３１］～［３４］のいずれか一項に記載の方法。
［３７］
真核細胞がヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、前記項のいずれかに記載の方法。
［３８］
真核細胞が哺乳動物細胞または植物細胞である、前記項のいずれかに記載の方法。
［３９］
真核細胞がヒト細胞である、前記項のいずれかに記載の方法。
［４０］
前記項のいずれかに記載の方法により調製される、真核細胞。
［４１］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システム、真核細胞、および少なくとも１つのポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含むトランスフェクション組成物。
［４２］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩が硫酸化多糖塩である、前記［４１］に記載の組成物。
［４３］
（ｉ）ポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、カラギーナン（例えば、Ｋ－、Ｉ－、および／またはＬ－カラギーナン）、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース）、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの組合せ、誘導体、および／もしくは塩のうちの１つもしくは複数を含むか；または
（ｉｉ）ポリアニオン性ポリマーが、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖もしくはその塩であり、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびそれらの塩のうちの１つもしくは複数を含む、
前記［４１］または［４２］に記載の組成物。
［４４］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸を含む、前記［４１］～［４３］のいずれか一項に記載の組成物。
［４５］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む、前記［４１］～［４３］のいずれか一項に記載の組成物。
［４６］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩がデキストラン硫酸ナトリウム塩である、前記［４１］～［４３］のいずれか一項に記載の組成物。
［４７］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、前記［４１］～［４６］のいずれか一項に記載の組成物。
［４８］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムがＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、前記［４１］～［４７］のいずれか一項に記載の組成物。
［４９］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記［４８］に記載の組成物。
［５０］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むリボ核タンパク質複合体である、前記［４１］～［４９］のいずれか一項に記載の組成物。
［５１］
Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性であるか、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼである、前記［４８］～［５０］のいずれか一項に記載の組成物。
［５２］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、核酸配列内の塩基を修飾するための塩基エディターである、前記［４１］～［５１］のいずれか一項に記載の組成物。
［５３］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｉ型、ＩＩ型（例えば、Ｃａｓ９）、ＩＩＩ型、Ｖ型（例えば、Ｃｐｆ１）、またはＶＩ型（例えば、Ｃａｓ１３）Ｃａｓタンパク質を含む、前記［４１］～［５２］のいずれか一項に記載の組成物。
［５４］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１タンパク質、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ４タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ８タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１０タンパク質、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、またはＣａｓ１３タンパク質を含む、前記［４１］～［５３］のいずれか一項に記載の組成物。
［５５］
プログラム可能なＤＮＡ結合システムがＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）を含む、前記［４１］～［５４］のいずれか一項に記載の組成物。
［５６］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記［４１］～［５５］のいずれか一項に記載の組成物。
［５７］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記［４１］～［５５］のいずれか一項に記載の組成物。
［５８］
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、前記［５０］～［５７］のいずれか一項に記載の組成物。
［５９］
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むＣａｓ９タンパク質である、前記［５０］～［５６］のいずれか一項に記載の組成物。
［６０］
Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、前記［５０］～［５９］のいずれか一項に記載の組成物。
［６１］
Ｃａｓタンパク質が、１つまたは２つの核局在化シグナルをさらに含む、前記［５０］～［６０］のいずれか一項に記載の組成物。
［６２］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼシステムである、前記［４１］～［６１］のいずれか一項に記載の組成物。
［６３］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記［６２］に記載の組成物。
［６４］
ガイドＲＮＡが単一分子である、前記［６２］または［６３］に記載の組成物。
［６５］
ガイドＲＮＡが２個の分子である、前記［６２］または［６３］に記載の組成物。
［６６］
ガイドＲＮＡが酵素的に合成される、前記［６２］～［６５］のいずれか一項に記載の組成物。
［６７］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡが化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡが酵素的に合成されるか、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも酵素的に合成される、前記［６２］～［６５］のいずれか一項に記載の組成物。
［６８］
真核細胞がヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、前記［４１］～［６７］のいずれか一項に記載の組成物。
［６９］
真核細胞が哺乳動物細胞または植物細胞である、前記［４１］～［６８］のいずれか一項に記載の組成物。
［７０］
真核細胞がヒト細胞である、前記［４１］～［６９］のいずれか一項に記載の組成物。
［７１］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システム、真核細胞、および２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含むトランスフェクション組成物。
［７２］
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩が硫酸化多糖塩である、前記［７１］に記載の組成物。
［７３］
（ｉ）２つ以上のポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、カラギーナン（例えば、Ｋ－、Ｉ－、および／またはＬ－カラギーナン）、セルロース（例えば、カルボキシメチルセルロース）、コンドロイチン、コラーゲン、デキストラン、フコイダン、ヘパラン、ヘパリン、グルコサミン、ラミナリン、ペントサン、ならびにそれらの組合せ、誘導体、および／もしくは塩のうちの１つもしくは複数から選択されるか；または
（ｉｉ）２つ以上のポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、反復糖単位が少なくとも１つの硫酸基を含む硫酸多糖もしくはその塩であり、２つ以上のポリアニオン性ポリマーもしくはその塩が、デキストラン硫酸、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、およびその塩から選択される、
前記［７１］または［７２］に記載の組成物。
［７４］
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの少なくとも１つがデキストラン硫酸を含む、前記［７１］～［７３］のいずれか一項に記載の組成物。
［７５］
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの少なくとも１つがデキストラン硫酸ナトリウム塩を含む、前記［７１］～［７３］のいずれか一項に記載の組成物。
［７６］
２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの１つがデキストラン硫酸ナトリウム塩であり、２つ以上のポリアニオン性ポリマーまたはその塩のうちの別の１つが、フコイダン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、およびデルマタン硫酸から選択される、前記［７１］～［７３］のいずれか一項に記載の組成物。
［７７］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、ＲＮＡ誘導型のクラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）ヌクレアーゼシステム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ二重ニッカーゼシステム、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質、または非ヌクレアーゼドメインに連結されたプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインを含む融合タンパク質を含む、前記［７１］～［７６］のいずれか一項に記載の組成物。
［７８］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムがＣａｓタンパク質およびガイドＲＮＡを含む、前記［７１］～［７７］のいずれか一項に記載の組成物。
［７９］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記［７８］に記載の組成物。
［８０］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むリボ核タンパク質複合体である、前記［７１］～［７９］のいずれか一項に記載の組成物。
［８１］
Ｃａｓタンパク質が、触媒的に活性であるか、触媒的に不活性であるか、またはニッカーゼである、前記［７８］～［８０］のいずれか一項に記載の組成物。
［８２］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、核酸配列内の塩基を修飾するための塩基エディターである、前記［７１］～［８１］のいずれか一項に記載の組成物。
［８３］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｉ型、ＩＩ型（例えば、Ｃａｓ９）、ＩＩＩ型、Ｖ型（例えば、Ｃｐｆ１）、またはＶＩ型（例えば、Ｃａｓ１３）Ｃａｓタンパク質を含む、前記［７１］～［８２］のいずれか一項に記載の組成物。
［８４］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１タンパク質、Ｃａｓ２タンパク質、Ｃａｓ３タンパク質、Ｃａｓ４タンパク質、Ｃａｓ５タンパク質、Ｃａｓ６タンパク質、Ｃａｓ７タンパク質、Ｃａｓ８タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ１０タンパク質、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）タンパク質、またはＣａｓ１３タンパク質を含む、前記［７１］～［８３］のいずれか一項に記載の組成物。
［８５］
プログラム可能なＤＮＡ結合システムがＣａｓ９またはＣａｓ１２（Ｃｐｆ１）を含む、前記［７１］～［８４］のいずれか一項に記載の組成物。
［８６］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ９、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記［７１］～［８５］のいずれか一項に記載の組成物。
［８７］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓ１２（Ｃｐｆ１）、ｇＲＮＡ、および適宜ドナーポリヌクレオチドを含む、前記［７１］～［８５］のいずれか一項に記載の組成物。
［８８］
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含む、前記［８０］～［８７］のいずれか一項に記載の組成物。
［８９］
Ｃａｓタンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質と比べて少なくとも１つのアミノ酸突然変異を含むＣａｓ９タンパク質である、前記［８０］～［８６］のいずれか一項に記載の組成物。
［９０］
Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞膜透過ドメイン、少なくとも１つのマーカードメイン、またはそれらの組合せをさらに含む、前記［８０］～［８９］のいずれか一項に記載の組成物。
［９１］
Ｃａｓタンパク質が、１つまたは２つの核局在化シグナルをさらに含む、前記［８０］～［９０］のいずれか一項に記載の組成物。
［９２］
プログラム可能なＤＮＡ修飾システムが、Ｃａｓタンパク質およびガイドＲＮＡ、ならびに適宜ドナーポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼシステムである、前記［７１］～［９１］のいずれか一項に記載の組成物。
［９３］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記［９２］に記載の組成物。
［９４］
ガイドＲＮＡが単一分子である、前記［９２］または［９３］に記載の組成物。
［９５］
ガイドＲＮＡが２個の分子である、前記［９２］または［９３］に記載の組成物。
［９６］
ガイドＲＮＡが酵素的に合成される、前記［９２］～［９５］のいずれか一項に記載の組成物。
［９７］
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含み、ｃｒＲＮＡが化学的に合成され、ｔｒａｃｒＲＮＡが酵素的に合成されるか、またはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが両方とも酵素的に合成される、前記［９２］～［９５］のいずれか一項に記載の組成物。
［９８］
真核細胞がヒト細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、植物細胞、または単細胞真核生物である、前記［７１］～［９７］のいずれか一項に記載の組成物。
［９９］
真核細胞が哺乳動物細胞または植物細胞である、前記［７１］～［９８］のいずれか一項に記載の組成物。
［１００］
真核細胞がヒト細胞である、前記［７１］～［９９］のいずれか一項に記載の組成物。
［１０１］
Ｃａｓタンパク質、ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液、および１つまたは複数の緩衝溶液を含むキット。
［１０２］
１つまたは複数の緩衝溶液が再構成溶液および希釈溶液を含む、前記［１０１］に記載のキット。
［１０３］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液がデキストラン硫酸を含む、前記［１０１］または［１０２］に記載のキット。
［１０４］
再構成溶液が５０％グリセロールを含み、希釈溶液が２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）および２０ｍＭ ＮａＣｌを含む、前記［１０２］または［１０３］に記載のキット。
［１０５］
ポリアニオン性ポリマーまたはその塩を含む溶液が、１μｇ／μＬデキストラン硫酸ナトリウム塩を２ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）および２０ｍＭ ＮａＣｌ中に含む、前記［１０３］または［１０４］に記載のキット。
【国際調査報告】