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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】品質管理方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6869 20180101AFI20241024BHJP
C12Q 1/6876 20180101ALI20241024BHJP
C12N 9/00 20060101ALI20241024BHJP
C12Q 1/6844 20180101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6869 Z ZNA
C12Q1/6876 Z
C12N9/00
C12Q1/6844 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525613
(86)(22)【出願日】2022-11-02
(85)【翻訳文提出日】2024-06-27
(86)【国際出願番号】 US2022079173
(87)【国際公開番号】W WO2023081722
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】63/274,868
(32)【優先日】2021-11-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515059083
【氏名又は名称】ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ケネディ， アンドリュー
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QR90
4B063QS39
4B063QX10
(57)【要約】
本明細書に提供されるのは、塩基対変換手順を用いて、サンプル中のＤＮＡ中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／又は偽陽性検出を監視するための方法である。方法では、ＤＮＡにライゲートされているアダプター内の既知のヌクレオシド同一性及び既知の修飾状態を有するヌクレオシドが使用される。特定の態様では、本開示は、こうした方法の品質管理を改善するための方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプル中のＤＮＡ中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／又は偽陽性検出を監視するための品質管理方法であって、（ａ）前記ＤＮＡをオリゴヌクレオチドアダプターにライゲートすることであって、前記アダプターは修飾ヌクレオシドを含む品質管理ヌクレオシドを含み、前記品質管理ヌクレオシドは、前記ＤＮＡ中の検出対象の修飾ヌクレオシドに対して同じヌクレオシド同一性及び同じ又は異なる修飾状態を有し、前記品質管理ヌクレオシドの前記修飾状態は既知である、ライゲートすることと；
（ｂ）前記適応したＤＮＡ、又はそのサブサンプルに、前記ヌクレオシドの前記修飾状態に応じて、前記品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するか又は前記品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更しない変換手順であって、
（ｉ）前記アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更し、且つ前記アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性であるが異なる修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更しない；及び／又は
（ｉｉ）前記アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更せず、且つ前記アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じ対同一性を有するが、異なる修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更する
ように選択される変換手順を施すことと；
（ｃ）変換ステップ（ｂ）後、前記適応したＤＮＡを配列決定することと；
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた配列データを使用して、前記アダプター内の前記品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性変換を判定することと；
（ｅ）前記アダプター内の前記品質管理ヌクレオシドの前記塩基対特異性変換を変換ステップ（ｂ）のための品質管理尺度として使用することと、を含み、ここでステップ（ｂ）（ｉ）の変換手順後のアダプター品質管理ヌクレオシドの準最適な変換及び／又はステップ（ｂ）（ｉｉ）の変換手順後のアダプター品質管理ヌクレオシドの誤った変換は、前記ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／又は偽陽性検出を予測する、
品質管理方法。
【請求項2】
前記変換手順が、前記アダプター内の修飾された品質管理ヌクレオシドの前記塩基対特異性を変更するが、同じヌクレオシド同一性を有するが異なる修飾状態及び／又は非修飾を有するＤＮＡサンプルのヌクレオシドの塩基対特異性を変更しないように選択され；前記修飾された品質管理ヌクレオシドの準最適な変換が、前記変換手順への曝露時、前記品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態、又は異なる修飾状態及び塩基対特異性の同じ変化を有するＤＮＡサンプルヌクレオシドの偽陰性検出を予測する、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記アダプター内の前記品質管理ヌクレオシドが、５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチル－シトシン（５ｈｍＣ）を含む、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記変換手順が、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換を含み、任意選択的に、前記置換されたボラン還元剤が、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、又はアンモニアボランである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
サンプル中のＤＮＡ中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／又は偽陽性検出を監視するための品質管理方法であって、（ａ）前記ＤＮＡをオリゴヌクレオチドアダプターにライゲートすることであって、前記アダプターは修飾ヌクレオシドを含む品質管理ヌクレオシドを含み、前記品質管理ヌクレオシドは、前記ＤＮＡ中の検出対象の修飾ヌクレオシドに対して同じヌクレオシド同一性及び同じ又は異なる修飾状態を有し、前記品質管理ヌクレオシドの前記修飾状態は既知である、ライゲートすることと；
（ｂ）前記適応したＤＮＡ、又はそのサブサンプルに、前記ヌクレオシドの前記修飾状態に応じて、前記品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するか又は前記品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更しない変換手順であって、
（ｉ）前記アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更し、且つ前記アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性であるが異なる修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更しない；及び／又は
（ｉｉ）前記アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更せず、且つ前記アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じ対同一性を有するが、異なる修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更する
ように選択される変換手順を施すことと；
（ｃ）変換ステップ（ｂ）後、前記適応したＤＮＡを配列決定することと；
（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた前記配列データを使用して、前記アダプター内の前記品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性変換を判定することと；
（ｅ）前記アダプター内の前記品質管理ヌクレオシドの前記塩基対特異性変換を変換ステップ（ｂ）のための品質管理尺度として使用することと、を含み、ここでステップ（ｂ）（ｉ）の変換手順後のアダプターの品質管理ヌクレオシドの準最適な変換及び／又はステップ（ｂ）（ｉｉ）の変換手順後のアダプターの品質管理ヌクレオシドの誤った変換は、前記ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／又は偽陽性検出を予測する、
品質管理方法。
【請求項6】
前記アダプターの品質管理ヌクレオシドが、非修飾ヌクレオシドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記変換手順が、前記アダプター内の品質管理ヌクレオシドの前記塩基対特異性を変更するが、同じヌクレオシド同一性及び異なる修飾状態を有するＤＮＡサンプルヌクレオシドの塩基対特異性を変更しないように選択され；前記品質管理ヌクレオシドの準最適な変換が、前記異なる修飾状態を有するＤＮＡサンプルヌクレオシドの偽陽性検出を予測する、請求項５又は請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記アダプター内の前記品質管理ヌクレオシドがシトシンを含み、且つ／又は変換手順がバイサルファイト変換を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記アダプターの品質管理ヌクレオシドが、第１の修飾状態を有する第１の品質管理ヌクレオシド及び前記第１の修飾状態とは異なる第２の修飾状態を有する第２の品質管理ヌクレオシドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記第１の品質管理ヌクレオシドが修飾され、前記第２の品質管理ヌクレオシドが修飾されない、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記第１の品質管理ヌクレオシドが修飾シトシンであり、前記第２の品質管理ヌクレオシドが非修飾シトシンである、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記第１の品質管理ヌクレオシドが、５－メチルシトシン（５ｍＣ）又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記変換手順が、前記第１の品質管理ヌクレオシドの前記塩基対特異性を変更するが、前記第２の品質管理ヌクレオシドを変更しないように選択される、又は前記変換手順が、前記第２の品質管理ヌクレオシドの前記塩基対特異性を変更するが、前記第１の品質管理ヌクレオシドを変更しないように選択される、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記変換手順が、前記アダプター内の修飾された品質管理ヌクレオシドの前記塩基対特異性を変更するが、同じヌクレオシド同一性を有するが異なる修飾状態及び／又は非修飾を有するＤＮＡサンプルヌクレオシドの前記塩基対特異性を変更しないように選択され；前記修飾された品質管理ヌクレオシドの準最適な変換が、前記変換手順への曝露時、前記品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態、又は異なる修飾状態及び塩基対特異性の同じ変化を有するＤＮＡサンプルヌクレオシドの偽陰性検出を予測する、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
ステップ（ｃ）において得られた前記配列データを使用して、（ｉ）前記アダプター配列内の品質管理ヌクレオシドの準最適な又は誤った変換を伴う適応したＤＮＡ分子を同定することと；
（ｉｉ）ステップ（ｉ）において同定された前記全長分子における同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有するヌクレオシドの準最適な又は誤った変換を推測することと、
をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記適応したＤＮＡ又は個別の適応したＤＮＡ分子における品質管理ヌクレオシドの変換率を判定すること、（ｉ）前記変換率に依存する加重を、
（Ａ）前記ＤＮＡサンプル；又は
（Ｂ）個別の適応したＤＮＡ分子
における前記修飾ヌクレオシド検出の分析に適用すること；
（ｉｉ）修飾ヌクレオシドを検出するためのさらなる分析からの
（Ａ）アダプター品質管理ヌクレオシドの準最適な変換、若しくは所定の品質管理閾値を下回るアダプター品質管理ヌクレオシドの変換率；及び／又は
（Ｂ）アダプター品質管理ヌクレオシドの誤った変換、若しくは所定の品質管理閾値を上回るアダプター品質管理ヌクレオシドの変換率
を有するＤＮＡサンプルを除外すること；並びに／又は
（ｉｉｉ）修飾ヌクレオシドを検出するためのさらなる分析からの
（Ａ）アダプター品質管理ヌクレオシドの準最適な変換、若しくは所定の品質管理閾値を下回るアダプター品質管理ヌクレオシドの変換率；及び／又は
（Ｂ）アダプター品質管理ヌクレオシドの誤った変換、若しくは所定の品質管理閾値を上回るアダプターの品質管理ヌクレオシドの変換率
を有する適応したＤＮＡ分子を除外すること
をさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記サンプルから標的領域セットを捕捉することによって前記ＤＮＡを富化することをさらに含み、前記捕捉ステップは、前記ライゲートステップ（ａ）及び前記変換ステップ（ｂ）の前、後又はその間になされる、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
（ｉ）ステップ（ｃ）において得られた前記配列データを、（Ａ）所定の参照配列；及び／又は
（Ｂ）前記変換手順を受けなかった前記ＤＮＡのサブサンプルを配列決定することによって得られた配列データ
と比較することと；
（ｉｉ）前記変換されたＤＮＡ配列と前記参照配列（Ａ）又は変換されていないＤＮＡ配列データ（Ｂ）との間のポイント差異を、前記変換手順への曝露時、塩基対特異性の変化を可能にする修飾状態を有するヌクレオシドとして同定することと、
をさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記ＤＮＡが、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、任意選択的に、試験対象から得られたｃｆＤＮＡを含み、任意選択的に、前記試験対象は、がんを有するか又は有することが疑われる患者である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの前記検出を用いて、がん細胞若しくは腫瘍によって生成されているＤＮＡの存在を判定若しくは予測すること、試験対象が腫瘍若しくはがんを有する確率を判定すること、又は前記対象のがん若しくは腫瘍を特徴づけることをさらに含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記ＤＮＡのサブサンプルが、配列決定前に前記変換手順を受けず、前記変換されたサブサンプル及び前記変換されていないサブサンプルが、異なるアダプター配列を有し、且つ前記変換されたサブサンプル及び前記変換されていないサブサンプルが、配列決定ステップ（ｃ）のために組み換えられる、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ＤＮＡを分析して、コピー数多型、一塩基変異、挿入、欠失、メチル化、及び／又は融合を検出することをさらに含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
エピジェネティック標的領域を前記アダプターライゲートＤＮＡから捕捉することと、前記エピジェネティック標的領域を増幅及び配列決定することと、をさらに含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記捕捉されたエピジェネティック標的領域が、エピジェネティック標的領域セットを形成する、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記エピジェネティック標的領域セットが、複数の型特異的なエピジェネティック標的領域を含み、且つ前記型特異的なエピジェネティック標的領域が、型特異的な差次的にメチル化された領域及び／又は型特異的断片である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記複数の型特異的なエピジェネティック標的領域が、型特異的な低メチル化領域を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記サンプルが血液サンプルである、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記複数の型特異的なエピジェネティック標的領域が、免疫細胞において前記血液サンプル中に存在する非免疫細胞型と比較して高メチル化されている；結腸において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；
乳房において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；
肝臓において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；
腎臓において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；
膵臓において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；
前立腺において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；
皮膚において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；
又は膀胱において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている
標的領域を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記複数の型特異的なエピジェネティック標的領域が、非免疫血球において前記サンプル中の異なる細胞型若しくは組織型における前記標的領域の前記メチル化レベルと比較して；免疫細胞に特異的な断片において前記血液サンプル中に存在する非免疫細胞型と比較して；又は結腸、肺、乳房、肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、皮膚、若しくは膀胱に特異的な断片において他の組織型と比較して、低メチル化されている標的領域を含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記型特異的なエピジェネティック標的領域の起源である少なくとも１つの細胞型又は組織型を同定することをさらに含む、請求項２３～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
ある細胞型又は組織型に起源を持つ型特異的なエピジェネティック標的領域のレベルが決定される、請求項２３～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
免疫細胞、非免疫血球、結腸、肺、乳房、肝臓、腎臓、前立腺、皮膚、膀胱、又は膵臓に起源を持つ型特異的なエピジェネティック標的領域のレベルが決定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記型特異的なエピジェネティック標的領域が、細胞型特異的、組織型特異的、及び／又はがんタイプ特異的なエピジェネティック標的領域を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記血液サンプルが、少なくともＤＮＡのエピジェネティック標的領域セットを捕捉する前に分画される、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記サンプル又はその一定分量を、第１の分割されたサブサンプル及び第２の分割されたサブサンプルを含む複数の分割されたサブサンプルに分割することと；前記第２の分割されたサブサンプルをメチル化依存性ヌクレアーゼと接触させて、それにより前記第２のサブサンプル中の非特異的に分割されたＤＮＡを分解し、処理された第２のサブサンプルを生成すること、及び任意選択的に、前記第１の分割されたサブサンプルをメチル化感受性エンドヌクレアーゼと接触させて、それにより前記第１の分割されたサブサンプル中の非特異的に分割されたＤＮＡを分解し、処理された第１のサブサンプルを生成することと、
をさらに含み、ここで前記第１のサブサンプルは、シトシン修飾を前記第２のサブサンプルより大きい割合で有するＤＮＡを含み、ここでエピジェネティック標的領域は、前記第１のサブサンプル又は前記処理された第１のサブサンプルの少なくとも一部分から捕捉され、
任意選択的に、前記１つ以上の捕捉プローブと接触されている前記対象からの前記ＤＮＡは、前記第１の分割されたサブサンプル、前記処理された第１のサブサンプル、前記第２の分割されたサブサンプル、及び／又は前記処理された第２のサブサンプルからのＤＮＡを含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
前記シトシン修飾が、メチル化であり、任意選択的に、前記シトシン修飾が、シトシンの５位でのメチル化である、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記第１のサブサンプルが、メチル化感受性エンドヌクレアーゼと接触される、請求項３５又は請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記メチル化感受性エンドヌクレアーゼが、非メチル化ＣｐＧ配列を切断する、請求項３７に記載の方法。
【請求項39】
前記メチル化感受性エンドヌクレアーゼが、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｉＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ１５ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｆｒ１ＯＩ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、及びＳｎａＢＩの１つ以上である、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記変換手順が、バイサルファイト変換；５ｈｍＣの保護；Ｔｅｔ補助バイサルファイト変換；任意選択的に、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、若しくはアンモニアボランである置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換；ｈｍＣの保護とその後の、任意選択的に、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、若しくはアンモニアボランである置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換；ｈｍＣの保護とその後のｍＣ及び／若しくはＣの脱アミノ化；任意選択的に、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、若しくはアンモニアボランである置換されたボラン還元剤による化学的補助変換；又は修飾シトシンの酵素的保護とその後の保護されていないシトシンのウラシルへの脱アミノ化を含む、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記置換されたボラン還元剤が、２－ピコリンボラン又はボランピリジンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
ｍＣ及び／又はＣの前記脱アミノ化が、ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣファミリーＤＮＡデアミナーゼ酵素による処理を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項43】
ｈｍＣの保護が、ｈｍＣのグルコシル化を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項44】
配列多様性の存在若しくは不在を検出すること、及び／又は断片化パターンを判定することをさらに含み、ここで、品質管理ヌクレオシドの準最適な又は誤った変換を意味する品質管理ヌクレオシドを含む適応したＤＮＡは、配列多様性の存在若しくは不在を検出し、及び／又は断片化パターンを判定することに含まれる、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
修飾ヌクレオシド、並びに変換試薬及びリガーゼのうち１つ以上である、品質管理ヌクレオシドを含むアダプターを含むキット。
【請求項46】
前記品質管理ヌクレオシドの前記塩基対特異性を変更することができる前記変換試薬を含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項47】
前記品質管理ヌクレオシドの前記塩基対特異性を実質的に変更することができない前記変換試薬を含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項48】
前記変換試薬が、バイサルファイト変換、酸化バイサルファイト変換、Ｔｅｔ補助（ＴＡＢ）変換、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換と組み合わされたｈｍＣの保護、ＡＰＯＢＥＣ連結エピジェネティック（ＡＣＥ）変換、又は核酸塩基の酵素変換において使用される変換試薬である、請求項４５～４７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項49】
前記オリゴヌクレオチドアダプターが配列決定プライマー結合部位を含み、前記品質管理ヌクレオシドが前記配列決定プライマー結合部位の下流に位置する、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法又は請求項４５～４８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項50】
前記アダプターを標的にするプライマーを使用して、前記ＤＮＡを増幅することをさらに含み、前記増幅ステップが、前記変換ステップ（ｂ）と前記配列決定ステップ（ｃ）との間になされる、請求項１～４４又は４９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に援用される、２０２１年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６３／２７４，８６８号明細書の優先権の利益を主張する。
本願は、あらゆる目的でその全体が参照により本明細書に援用される、２０２１年１１月２日に出願された米国仮特許出願第６３／２７４，８６８号明細書の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【0002】
アッセイでのエピジェネティック変異体又はヌクレオシド修飾の検出について解決する一塩基は、一般に、修飾ヌクレオシド又は対応する非修飾ヌクレオシドの、それらの塩基対特異性を変更するための変換を必要とする。次に、変換は、配列決定することによって検出される。そのような方法の例としては、バイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｄｅ）及び酸化バイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｄｅ）及びＴｅｔ補助バイサルファイト（ｂｉｓｕｌｆｉｄｅ）変換、ＥＭ－ｓｅｑ、ＴＡＰＳ及びＴＡＰＳ β変換及びＡＣＥ－ｓｅｑが挙げられる。例えば、Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８；９：５０６８；Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２；３３６：９３４－９３７；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１２；１４９：１３６８－８０；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９；３７：４２４－４２９；Ｓｃｈｕｔｓｋｙ，Ｅ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．；及びＶａｉｓｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０２１ ３１（７）：１２８０－１２８９を参照されたい。
【0003】
バイサルファイトベース及びＥＭ－Ｓｅｑメチル化アッセイでは、非メチル化シトシンがウラシルに変換され、それはチミンとしてＰＣＲ増幅及びＮＧＳリードがなされる。非メチル化塩基の不完全な（失敗した）変換の結果、その塩基は、メチル化された、即ち偽陽性シグナルとして不正確に同定される。逆に、メチル化塩基の誤った変換の結果、その塩基は、非メチル化された、即ち偽陰性シグナルとして不正確に同定される。非ＣｐＧシトシンの約９９％がヒトゲノムにおいて非メチル化されることから、所与のＤＮＡ分子中のＣＨシトシン（即ち、シトシン、続いてグアニン以外の塩基）の低い変換／非変換を時として使用して、変換されていない分子は、（ＣｐＧ）メチル化レベルを評価する前に濾過して除去される。
【0004】
他の方法では、エピジェネティック変換は、逆である、即ち、非修飾ヌクレオシドではなく、修飾ヌクレオシドが変換される。例えば、Ｌｕｄｗｉｇ Ｃａｎｃｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＳｏｎｇ’ｓ ｌａｂからのＴＡＰＳ法では、メチル化シトシン（５ｍＣ及び５ｈｍＣ）は、ＤＨＵに変換され、チミンとしてＰＣＲ増幅及びＮＧＳリードがなされる。ＴＡＰＳにおけるメチル化残基の不完全な／失敗した変換の結果、その塩基は、非メチル化～即ち、偽陰性シグナルとして不正確に同定される。逆に、非メチル化塩基の誤った変換の結果、その塩基は、メチル化～即ち、偽陽性シグナルとして不正確に同定される。これらの方法では、変換されているヌクレオシドは、一般にサンプル中ではるかに希少であることから、無効な変換、そして結果としての偽陰性シグナルは、十分に検出するのがより困難である。
これらのアッセイにおける偽陽性及び偽陰性シグナルにまつわる課題を仮定すれば、これらの偽シグナルの推定を可能にし、それ故にデータを解釈することが可能であるような品質管理方法が求められている。
これらのアッセイにおける偽陽性及び偽陰性シグナルにまつわる課題を仮定すれば、これらの偽シグナルの推定を可能にし、それ故にデータを解釈することが可能であるような品質管理方法が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８；９：５０６８
【非特許文献2】Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２；３３６：９３４－９３７
【非特許文献3】Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１２；１４９：１３６８－８０
【非特許文献4】Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９；３７：４２４－４２９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本明細書に記載されるのは、ヌクレオシドの修飾状態に対して感受性がある塩基対特異性変換手順を用いることに依存する、ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドを検出及び／又は同定するための方法における変換ステップのための改善された品質管理を提供する方法である。本開示は、以下の例示的な実施形態を含む。
【0007】
実施形態１は、サンプル中のＤＮＡ中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／又は偽陽性検出を監視するための品質管理方法であって、（ａ）ＤＮＡをオリゴヌクレオチドアダプターにライゲートすることであって、アダプターは修飾ヌクレオシドを含む品質管理ヌクレオシドを含み、品質管理ヌクレオシドは、ＤＮＡ中の検出対象の修飾ヌクレオシドに対して同じヌクレオシド同一性及び同じ又は異なる修飾状態を有し、品質管理ヌクレオシドの修飾状態は既知である、ライゲートすることと；（ｂ）適応したＤＮＡ（ａｄａｐｔｅｄ ＤＮＡ）、又はそのサブサンプルに、ヌクレオシドの修飾状態に応じて、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するか又は品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更しない変換手順であって、（ｉ）アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更し、アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性を有するが異なる修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更しない；及び／又は（ｉｉ）アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更せず、且つアダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じ対同一性（ｐａｉｒｉｎｇ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有するが、異なる修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更するように選択される変換手順を施すことと；（ｃ）変換ステップ（ｂ）後、適応したＤＮＡを配列決定することと；（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた配列データを使用して、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性変換を判定することと；（ｅ）アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性変換を変換ステップ（ｂ）のための品質管理尺度として使用することと、を含み、ここでステップ（ｂ）（ｉ）の変換手順後のアダプター品質管理ヌクレオシドの準最適な変換及び／又はステップ（ｂ）（ｉｉ）の変換手順後のアダプター品質管理ヌクレオシドの誤った変換は、ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／又は偽陽性検出を予測する、品質管理方法である。
【0008】
実施形態２は、変換手順が、アダプター内の修飾された品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するが、同じヌクレオシド同一性を有するが異なる修飾状態及び／又は非修飾を有するＤＮＡサンプルのヌクレオシドの塩基対特異性を変更しないように選択され；且つ修飾された品質管理ヌクレオシドの準最適な変換が、変換手順への曝露時、品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態又は異なる修飾状態並びに塩基対特異性における同じ変化を有するＤＮＡサンプルヌクレオシドの偽陰性検出を予測する、実施形態１の方法である。
【0009】
実施形態３は、アダプター内の品質管理ヌクレオシドが、５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチル－シトシン（５ｈｍＣ）を含む、実施形態１又は実施形態２の方法である。
【0010】
実施形態４は、変換手順が、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換を含み、任意選択的に、置換されたボラン還元剤が、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、又はアンモニアボランである、実施形態３の方法である。
【0011】
実施形態５は、サンプル中のＤＮＡ中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／又は偽陽性検出を監視するための品質管理方法であって、（ａ）ＤＮＡをオリゴヌクレオチドアダプターにライゲートすることであって、アダプターは修飾ヌクレオシドを含む品質管理ヌクレオシドを含み、品質管理ヌクレオシドは、ＤＮＡ中の検出対象の修飾ヌクレオシドに対して同じヌクレオシド同一性及び同じ又は異なる修飾状態を有し、品質管理ヌクレオシドの修飾状態は既知である、ライゲートすることと；（ｂ）適応したＤＮＡ、又はそのサブサンプルに、ヌクレオシドの修飾状態に応じて、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するか又は品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更しない変換手順であって、（ｉ）アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更し、且つアダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性であるが異なる修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更しない；及び／又は（ｉｉ）アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更せず、且つアダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じ対同一性を有するが異なる修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更するように選択される変換手順を施すことと；（ｃ）変換ステップ（ｂ）後、適応したＤＮＡを配列決定することと；（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた配列データを使用して、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性変換を判定することと；（ｅ）アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性変換を変換ステップ（ｂ）のための品質管理尺度として使用することと、を含み、ここでステップ（ｂ）（ｉ）の変換手順後のアダプターの品質管理ヌクレオシドの準最適な変換及び／又はステップ（ｂ）（ｉｉ）の変換手順後のアダプターの品質管理ヌクレオシドの誤った変換は、ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／又は偽陽性検出を予測する、品質管理方法である。
【0012】
実施形態６は、アダプターの品質管理ヌクレオシドが非修飾ヌクレオシドを含む場合の実施形態５の方法である。
【0013】
実施形態７は、変換手順が、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するが、同じヌクレオシド同一性及び異なる修飾状態を有するＤＮＡサンプルヌクレオシドの塩基対特異性を変更しないように選択され；品質管理ヌクレオシドの準最適な変換が、異なる修飾状態を有するＤＮＡサンプルヌクレオシドの偽陽性検出を予測する、実施形態５又は実施形態６の方法である。
【0014】
実施形態８は、アダプター内の品質管理ヌクレオシドがシトシンを含み、且つ／又は変換手順がバイサルファイト変換を含む、実施形態７の方法である。
【0015】
実施形態９は、アダプターの品質管理ヌクレオシドが、第１の修飾状態を有する第１の品質管理ヌクレオシド及び第１の修飾状態とは異なる第２の修飾状態を有する第２の品質管理ヌクレオシドを含む、実施形態１～８のいずれか１つの方法である。
【0016】
実施形態１０は、第１の品質管理ヌクレオシドが修飾され、第２の品質管理ヌクレオシドが修飾されない場合の実施形態９の方法である。
【0017】
実施形態１１は、第１の品質管理ヌクレオシドが修飾シトシンであり、第２の品質管理ヌクレオシドが非修飾シトシンである場合の実施形態９の方法である。
【0018】
実施形態１２は、第１の品質管理ヌクレオシドが、５－メチルシトシン（５ｍＣ）又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）である場合の実施形態１１の方法である。
【0019】
実施形態１３は、変換手順が、第１の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するが、第２の品質管理ヌクレオシドを変更しないように選択される、又は変換手順が、第２の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するが、第１の品質管理ヌクレオシドを変更しないように選択される、実施形態９～１１のいずれか１つの方法である。
【0020】
実施形態１４は、変換手順が、アダプター内の修飾された品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するが、同じヌクレオシド同一性を有するが、異なる修飾状態及び／又は非修飾を有するＤＮＡサンプルヌクレオシドの塩基対特異性を変更しないように選択され；修飾された品質管理ヌクレオシドの準最適な変換が、変換手順への曝露時、品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態、又は異なる修飾状態及び塩基対特異性の同じ変化を有するＤＮＡサンプルヌクレオシドの偽陰性検出を予測する、実施形態９～１１のいずれか１つの方法である。
【0021】
実施形態１５は、ステップ（ｃ）において得られた配列データを使用して、（ｉ）アダプター配列内の品質管理ヌクレオシドの準最適な又は誤った変換を伴う適応したＤＮＡ分子を同定することと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）において同定された全長分子における同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有するヌクレオシドの準最適な又は誤った変換を推測することと、をさらに含む、実施形態１～１４のいずれか１つの方法である。
【0022】
実施形態１６は、適応したＤＮＡ又は個別の適応したＤＮＡ分子における品質管理ヌクレオシドの変換率を判定すること、（ｉ）変換率に依存する加重を、（Ａ）ＤＮＡサンプル；又は（Ｂ）個別の適応したＤＮＡ分子における修飾ヌクレオシド検出の分析に適用すること；（ｉｉ）修飾ヌクレオシドを検出するためのさらなる分析からの、（Ａ）アダプター品質管理ヌクレオシドの準最適な変換若しくは所定の品質管理閾値を下回るアダプター品質管理ヌクレオシドの変換率；及び／又は（Ｂ）アダプター品質管理ヌクレオシドの誤った変換、若しくは所定の品質管理閾値を上回るアダプター品質管理ヌクレオシドの変換率を有するＤＮＡサンプルを除去すること；並びに／又は（ｉｉｉ）修飾ヌクレオシドを検出するためのさらなる分析からの、（Ａ）アダプター品質管理ヌクレオシドの準最適な変換若しくは所定の品質管理閾値を下回るアダプター品質管理ヌクレオシドの変換率；及び／又は（Ｂ）アダプター品質管理ヌクレオシドの誤った変換、若しくは所定の品質管理閾値を上回るアダプター品質管理ヌクレオシドの変換率を有する適応したＤＮＡ分子を除去すること、をさらに含む、実施形態１～１５のいずれか１つの方法である。
【0023】
実施形態１７は、サンプルから標的領域セットを捕捉することによって、ＤＮＡを富化することをさらに含み、捕捉ステップは、ライゲートステップ（ａ）及び変換ステップ（ｂ）の前、後又はその間になされる、実施形態１～１６のいずれか１つの方法である。
【0024】
実施形態１８は、（ｉ）ステップ（ｃ）において得られた配列データを、（Ａ）所定の参照配列；及び／又は（Ｂ）変換手順を受けなかったＤＮＡのサブサンプルを配列決定することによって得られた配列データと比較することと；（ｉｉ）変換されたＤＮＡ配列と参照配列（Ａ）又は変換されていないＤＮＡ配列データ（Ｂ）との間のポイント差異を、変換手順への曝露時、塩基対特異性の変化を可能にする修飾状態を有するヌクレオシドとして同定することと、をさらに含む、実施形態１～１７のいずれか１つの方法である。
【0025】
実施形態１９は、ＤＮＡが、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、任意選択的に、試験対象から得られたｃｆＤＮＡを含み、任意選択的に、試験対象は、がんを有するか又は有することが疑われる患者である、実施形態１～１８のいずれか１つの方法である。
【0026】
実施形態２０は、ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの検出を用いて、がん細胞若しくは腫瘍によって生成されているＤＮＡの存在を判定又は予測すること、試験対象が腫瘍若しくはがんを有する確率を判定すること、又は対象のがん若しくは腫瘍を特徴づけることをさらに含む、実施形態１～１９のいずれか１つの方法である。
【0027】
実施形態２１は、ＤＮＡのサブサンプルが配列決定前に変換手順を受けず、変換されたサブサンプル及び変換されていないサブサンプルが異なるアダプター配列を有し、且つ変換されたサブサンプル及び変換されていないサブサンプルが配列決定ステップ（ｃ）のために組み換えられる、実施形態１～２０のいずれか１つの方法である。
【0028】
実施形態２２は、ＤＮＡを分析して、コピー数多型、一塩基変異、挿入、欠失、メチル化、及び／又は融合を検出することをさらに含む、実施形態１～２１のいずれか１つの方法である。
【0029】
実施形態２３は、エピジェネティック標的領域をアダプターライゲートＤＮＡから捕捉することと、エピジェネティック標的領域を増幅及び配列決定することと、をさらに含む、実施形態１～２２のいずれか１つの方法である。
【0030】
実施形態２４は、捕捉されたエピジェネティック標的領域が、エピジェネティック標的領域セットを形成する、実施形態２３の方法である。
【0031】
実施形態２５は、エピジェネティック標的領域セットが、複数の型特異的なエピジェネティック標的領域を含み、且つ型特異的なエピジェネティック標的領域が、型特異的な差次的にメチル化された領域及び／又は型特異的断片である、実施形態２４の方法である。
【0032】
実施形態２６は、複数の型特異的なエピジェネティック標的領域が、型特異的な低メチル化領域を含む、実施形態２５の方法である。
【0033】
実施形態２７は、サンプルが血液サンプルである、実施形態１～２６のいずれか１つの方法である。
【0034】
実施形態２８は、複数の型特異的なエピジェネティック標的領域が、免疫細胞において血液サンプル中に存在する非免疫細胞型と比較して高メチル化されている；結腸において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；乳房において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；肝臓において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；腎臓において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；膵臓において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；前立腺において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；皮膚において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている；又は膀胱において他の組織型と比較して差次的にメチル化されている標的領域を含む、実施形態２５～２７のいずれか１つの方法である。
【0035】
実施形態２９は、複数の型特異的なエピジェネティック標的領域が、非免疫血球においてサンプル中の異なる細胞型若しくは組織型における標的領域のメチル化レベルと比較して；免疫細胞に特異的な断片において血液サンプル中に存在する非免疫細胞型と比較して；又は結腸、肺、乳房、肝臓、腎臓、膵臓、前立腺、皮膚、若しくは膀胱に特異的な断片において他の組織型と比較して、低メチル化されている標的領域を含む、実施形態２５～２８のいずれか１つの方法である。
【0036】
実施形態３０は、型特異的なエピジェネティック標的領域の起源である少なくとも１つの細胞型又は組織型を同定することをさらに含む、実施形態２３～２９のいずれか１つの方法である。
【0037】
実施形態３１は、ある細胞型又は組織型に起源を持つ型特異的なエピジェネティック標的領域のレベルが決定される、実施形態２３～３０のいずれか１つの方法である。
【0038】
実施形態３２は、免疫細胞、非免疫血球、結腸、肺、乳房、肝臓、腎臓、前立腺、皮膚、膀胱、又は膵臓に起源を持つ型特異的なエピジェネティック標的領域のレベルが決定される、実施形態３１の実施形態の方法である。
【0039】
実施形態３３は、型特異的なエピジェネティック標的領域が、細胞型特異的、組織型特異的、及び／又はがんタイプ特異的なエピジェネティック標的領域を含む、実施形態３２の方法である。
【0040】
実施形態３４は、血液サンプルが、少なくともＤＮＡのエピジェネティック標的領域セットを捕捉する前に分画される、実施形態２７～３３のいずれか１つの方法である。
【0041】
実施形態３５は、サンプル又はその一定分量を、第１の分割されたサブサンプル及び第２の分割されたサブサンプルを含む複数の分割されたサブサンプルに分割することと；第２の分割されたサブサンプルをメチル化依存性ヌクレアーゼと接触させて、それにより第２のサブサンプル中の非特異的に分割されたＤＮＡを分解し、処理された第２のサブサンプルを生成すること、及び任意選択的に、第１の分割されたサブサンプルをメチル化感受性エンドヌクレアーゼと接触させて、それにより第１の分割されたサブサンプル中の非特異的に分割されたＤＮＡを分解し、処理された第１のサブサンプルを生成することと、をさらに含み、ここで第１のサブサンプルは、シトシン修飾を第２のサブサンプルより大きい割合で有するＤＮＡを含み、ここでエピジェネティック標的領域は、第１のサブサンプル又は処理された第１のサブサンプルの少なくとも一部分から捕捉され、任意選択的に、１つ以上の捕捉プローブと接触されている対象からのＤＮＡは、第１の分割されたサブサンプル、処理された第１のサブサンプル、第２の分割されたサブサンプル、及び／又は処理された第２のサブサンプルからのＤＮＡを含む、実施形態１～３４のいずれか１つの方法である。
【0042】
実施形態３６は、シトシン修飾がメチル化であり、任意選択的に、シトシン修飾がシトシンの５位でのメチル化である、実施形態３５の方法である。
【0043】
実施形態３７は、第１のサブサンプルが、メチル化感受性エンドヌクレアーゼと接触される、実施形態３５又は実施形態３６の方法である。
【0044】
実施形態３８は、メチル化感受性エンドヌクレアーゼが、非メチル化ＣｐＧ配列を切断する、実施形態３７の方法である。
【0045】
実施形態３９は、メチル化感受性エンドヌクレアーゼが、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｉＩ、Ａｏｒ１３ＨＩ、Ａｏｒ１５ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｆｒ１ＯＩ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＭｌｕＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、及びＳｎａＢＩの１つ以上である、実施形態３５～３８のいずれか１つの方法である。
【0046】
実施形態４０は、変換手順が、バイサルファイト変換；５ｈｍＣの保護；Ｔｅｔ補助バイサルファイト変換；任意選択的に、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、若しくはアンモニアボランである置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換；ｈｍＣの保護とその後の、任意選択的に、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、若しくはアンモニアボランである置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換；ｈｍＣの保護とその後のｍＣ及び／若しくはＣの脱アミノ化；任意選択的に、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、若しくはアンモニアボランである置換されたボラン還元剤による化学的補助変換（ｃｈｅｍｉｃａｌ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）；又は修飾シトシンの酵素的保護とその後の保護されていないシトシンのウラシルへの脱アミノ化を含む、実施形態１～３９のいずれか１つの方法である。
【0047】
実施形態４１は、置換されたボラン還元剤が、２－ピコリンボラン又はボランピリジンである、実施形態４０の方法である。
【0048】
実施形態４２は、ｍＣ及び／又はＣの脱アミノ化が、ＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣファミリーＤＮＡデアミナーゼ酵素による処理を含む、実施形態４０の方法である。
【0049】
実施形態４３は、ｈｍＣの保護が、ｈｍＣのグルコシル化を含む、実施形態４０の方法である。
【0050】
実施形態４４は、配列多様性の存在若しくは不在を検出すること、及び／又は断片化パターンを判定することをさらに含み、ここで、品質管理ヌクレオシドの準最適な又は誤った変換を意味する品質管理ヌクレオシドを含む適応したＤＮＡは、配列多様性の存在若しくは不在を検出し、且つ／又は断片化パターンを判定することに含まれる、実施形態１～４３のいずれか１つの方法である。
【0051】
実施形態４５は、修飾ヌクレオシド、並びに変換試薬及びリガーゼのうち１つ以上である、品質管理ヌクレオシドを含むアダプターを含むキットである。
【0052】
実施形態４６は、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更することができる変換試薬を含む、実施形態４５のキットである。
【0053】
実施形態４７は、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を実質的に変更することができない変換試薬を含む、実施形態４５のキットである。
【0054】
実施形態４８は、変換試薬が、バイサルファイト変換、酸化バイサルファイト変換、Ｔｅｔ補助（ＴＡＢ）変換、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換と組み合わされたｈｍＣの保護、ＡＰＯＢＥＣ連結エピジェネティック（ＡＣＥ）変換、又は核酸塩基の酵素変換において使用される変換試薬である、実施形態４５～４７のいずれか１つのキットである。
【0055】
実施形態４９は、オリゴヌクレオチドアダプターが配列決定プライマー結合部位を含み、品質管理ヌクレオシドが配列決定プライマー結合部位の下流に位置する、実施形態１～４４のいずれか１つの方法又は実施形態４５～４８のいずれか１つのキットである。鎖の５’末端のアダプターについてのプライマー結合部位「の下流」であることは、プライマー結合部位の３’に位置することを意味し、鎖の３’末端のアダプターについては、プライマー結合部位の５’に位置することを意味する。
【0056】
実施形態５０は、アダプターを標的にするプライマーを使用して、ＤＮＡを増幅することをさらに含み、増幅ステップが、変換ステップ（ｂ）と配列決定ステップ（ｃ）との間になされる、実施形態１～４４又は４９のいずれか１つの方法である。
【0057】
ある態様では、本開示は、サンプル中のＤＮＡ中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／又は偽陽性検出を監視するための品質管理方法であって、（ａ）ＤＮＡをオリゴヌクレオチドアダプターにライゲートすることであって、アダプターは修飾ヌクレオシドを含む品質管理ヌクレオシドを含み、品質管理ヌクレオシドは、ＤＮＡ中の検出対象の修飾ヌクレオシドに対して同じヌクレオシド同一性及び同じ又は異なる修飾状態を有し、品質管理ヌクレオシドの修飾状態は既知である、ライゲートすることと；（ｂ）適応したＤＮＡ、又はそのサブサンプルに、ヌクレオシドの修飾状態に応じて、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するか又は品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更しない変換手順であって、（ｉ）アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更し、且つアダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性を有するが異なる修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更しない；及び／又は（ｉｉ）アダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更せず、且つアダプター内の品質管理ヌクレオシドと同じ対同一性を有するが、異なる修飾状態を有する適応したＤＮＡヌクレオシドの塩基対特異性を変更するように選択される変換手順を施すことと；（ｃ）変換ステップ（ｂ）後、適応したＤＮＡを配列決定することと；（ｄ）ステップ（ｃ）において得られた配列データを使用して、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性変換を判定することと；（ｅ）アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性変換を変換ステップ（ｂ）のための品質管理尺度として使用することと、を含み、ここでステップ（ｂ）（ｉ）の変換手順後のアダプターの品質管理ヌクレオシドの準最適な変換及び／又はステップ（ｂ）（ｉｉ）の変換手順後のアダプターの品質管理ヌクレオシドの誤った変換は、ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／又は偽陽性検出を予測する、品質管理方法を提供する。
【0058】
いくつかの実施形態では、方法は、ステップ（ｃ）において得られた配列データを使用して、（ｉ）アダプター配列内の品質管理ヌクレオシドの準最適な又は誤った変換を伴う適応したＤＮＡ分子を同定することと；（ｉｉ）ステップ（ｉ）において同定された全長分子における同じヌクレオシド同一性及び修飾状態を有するヌクレオシドの（追加的な）準最適な又は誤った変換を推測することと、をさらに含む。
【0059】
いくつかの実施形態では、方法は、適応したＤＮＡ又は個別の適応したＤＮＡ分子における品質管理ヌクレオシドの変換率を判定することと、（ｉ）変換率に依存する加重を、（Ａ）ＤＮＡサンプル；又は（Ｂ）個別の適応したＤＮＡ分子における修飾ヌクレオシド検出の分析に適用することと；（ｉｉ）修飾ヌクレオシドを検出するためのさらなる分析から、（Ａ）アダプター品質管理ヌクレオシドの準最適な変換、若しくは品質管理閾値若しくは所定の品質管理閾値を下回るアダプター品質管理ヌクレオシドの変換率；及び／若しくは（Ｂ）アダプター品質管理ヌクレオシドの誤った変換、若しくは品質管理閾値若しくは所定の品質管理閾値を上回るアダプター品質管理ヌクレオシドの変換率を有するＤＮＡサンプルを除去することと；並びに／又は（ｉｉｉ）修飾ヌクレオシドを検出するためのさらなる分析から、（Ａ）アダプター品質管理ヌクレオシドの準最適な変換、若しくは品質管理閾値若しくは所定の品質管理閾値を下回るアダプター品質管理ヌクレオシドの変換率；及び／又は（Ｂ）アダプター品質管理ヌクレオシドの誤った変換、若しくは品質管理閾値若しくは所定の品質管理閾値を上回るアダプター品質管理ヌクレオシドの変換率を有する適応したＤＮＡ分子を除去することと、をさらに含む。
【0060】
いくつかの実施形態では、アダプター品質管理ヌクレオシドは修飾ヌクレオシドを含む。
【0061】
修飾されたアダプターの品質管理ヌクレオシドを使用して、修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変換する変換手順を用いる場合、偽陰性（即ち、修飾されていないとして不正確に同定されたヌクレオシド）を検出することができる。したがって、いくつかの実施形態では、変換手順は、アダプター内の修飾された品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するが、品質管理ヌクレオシドと比較して、ヌクレオシド同一性が同じであるが異なる修飾状態及び／若しくは非修飾を有するＤＮＡサンプルのヌクレオシドの塩基対特異性を変更しないように選択され；修飾された品質管理ヌクレオシドの準最適な変換は、品質管理ヌクレオシドと同じ同一性及び修飾状態、又は変換手順への曝露時、同じ塩基対特異性の変化を有するＤＮＡサンプルのヌクレオシドの偽陰性検出を予測する。即ち、修飾されていない品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性の変換は、同じヌクレオシド同一性を有するＤＮＡサンプル中の他の非修飾ヌクレオシド（又は品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性を有するが、変換手順への曝露時、塩基対特異性の変化からヌクレオシドを保護する異なる修飾状態を有するＤＮＡサンプルの修飾ヌクレオシド）が、品質管理ヌクレオシドの修飾状態（又は、適用可能な場合、変換手順への曝露時、塩基対特異性における同じ変化を依然として可能にする異なる修飾）を有するとして誤って同定されることを予測する。
【0062】
いくつかの実施形態では、アダプター内の品質管理ヌクレオシドは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチル－シトシン（５ｈｍＣ）を含む。いくつかの実施形態では、変換手順は、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換を含み、任意選択的に、置換されたボラン還元剤は、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、又はアンモニアボランである。
【0063】
また、修飾されたアダプターの品質管理ヌクレオシドを使用して、非修飾ヌクレオシドを変換する変換手順を用いる場合、偽陰性（即ち、修飾されていないとして不正確に同定されたヌクレオシド）を検出することができる。したがって、いくつかの実施形態では、変換手順は、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更しないが、品質管理ヌクレオシドと比較して、ヌクレオシド同一性が同じであるが、異なる修飾状態及び／又は非修飾を有するＤＮＡサンプルのヌクレオシドの塩基対特異性を変更するように選択され、ここで品質管理ヌクレオシドの誤った変換は、変換手順への曝露時、品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び修飾状態又は同じ塩基対特異性変化を有するＤＮＡサンプルのヌクレオシドの偽陰性検出／同定を予測する。即ち、修飾された品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性の変換は、同じヌクレオシド同一性及び同じ修飾（又は異なる修飾状態であるが、変換手順への曝露時の塩基対特異性の同じ予想される変化）を有する他のＤＮＡサンプルのヌクレオシドが、非修飾（又は、適用可能な場合、変換手順への曝露時に塩基対特異性の変化からヌクレオシドを保護する異なる修飾）を有するとして誤って同定されることを予測する。いくつかの実施形態では、アダプター内の品質管理ヌクレオシドは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチル－シトシン（５ｈｍＣ）を含む。いくつかの実施形態では、変換手順は、バイサルファイト変換を含む。
【0064】
いくつかの実施形態では、アダプター品質管理ヌクレオシドは非修飾ヌクレオシドを含む。
【0065】
他の場合、修飾されていないアダプターの品質管理ヌクレオシドを使用して、非修飾ヌクレオシドを変換する変換手順を用いる場合、偽陽性（即ち、修飾されているとして不正確に同定されたヌクレオシド）を検出することができる。したがって、いくつかの実施形態では、変換手順は、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するが、品質管理ヌクレオシドと比較して、同じヌクレオシド同一性を有するが、異なる修飾状態を有するＤＮＡサンプルのヌクレオシドの塩基対特異性を変更しないように選択され；ここで品質管理ヌクレオシドの準最適な変換は、異なる修飾状態を有するＤＮＡサンプルのヌクレオシドの偽陽性検出を予測する。即ち、修飾されていない品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性の非変換は、品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性（及び／又は、適用可能な場合、同じヌクレオシド同一性及び異なる修飾状態、具体的に、変換手順への曝露時に塩基対特異性の変化からヌクレオシドを保護しない場合）を有する他のＤＮＡサンプルの非修飾ヌクレオシドが、修飾されていると（又は、適用可能な場合、変換手順への曝露時に塩基対特異性の変化からヌクレオシドを保護しない修飾を有すると）誤って同定されることを予測する。いくつかの実施形態では、アダプター内の品質管理ヌクレオシドは、シトシンを含む。いくつかの実施形態では、変換手順は、バイサルファイト変換を含む。
【0066】
また、修飾されていないアダプターの品質管理ヌクレオシドを使用して、修飾ヌクレオシドを変換する変換手順を用いる場合、偽陽性（即ち、修飾されているとして不正確に同定されたヌクレオシド）を検出することができる。したがって、いくつかの実施形態では、変換手順は、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更しないが、品質管理ヌクレオシドと比較して、ヌクレオシド同一性が同じであるが、異なる修飾状態を有するＤＮＡサンプルのヌクレオシドの塩基対特異性を変更するように選択され；ここで品質管理ヌクレオシドの誤った変換は、異なる修飾状態を有するＤＮＡサンプルのヌクレオシドの偽陽性検出を予測する。即ち、修飾されていない品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性の変換は、同じヌクレオシド同一性を有するＤＮＡサンプル中の他の非修飾ヌクレオシド（又は品質管理ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性を有するが、変換手順への曝露時、塩基対特異性の変化からヌクレオシドを保護する異なる修飾状態を有するＤＮＡサンプルの修飾ヌクレオシド）が、品質管理ヌクレオシドの修飾状態（又は、適用可能な場合、変換手順への曝露時、塩基対特異性における同じ変化を依然として可能にする異なる修飾）を有するとして誤って同定されることを予測する。いくつかの実施形態では、アダプター内の品質管理ヌクレオシドは、シトシンを含む。いくつかの実施形態では、変換手順は、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換を含み、任意選択的に、置換されたボラン還元剤は、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、又はアンモニアボランである。
【0067】
方法は、サンプルから標的領域セットを捕捉することによってＤＮＡを富化することをさらに含んでもよい。捕捉ステップは、ライゲートステップ（ａ）及び変換ステップ（ｂ）の前、後又はその間に行われてもよい。
【0068】
配列決定ステップ（ｃ）は、初期サンプル中の修飾ヌクレオシドを変換されているものとして同定することを可能にする。例えば、方法は、（ｉ）ステップ（ｃ）において得られた配列データを、（Ａ）（所定の）参照配列；及び／又は（Ｂ）変換手順を受けなかったＤＮＡのサブサンプルを配列決定することによって得られた配列データと比較することと；（ｉｉ）変換されたＤＮＡ配列と参照配列（Ａ）又は変換されていないＤＮＡ配列データ（Ｂ）との間のポイント差異を、変換手順への曝露時に塩基対特異性の変化を可能にする修飾状態を有するヌクレオチドとして同定することと、を含んでもよい。
【0069】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を含む。ｃｆＤＮＡは、例えば、試験対象から得てもよい。いくつかの場合、試験対象は、がんを有するか又は有することが疑われる患者である。
【0070】
いくつかの場合、方法は、ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの検出を用いて、がん細胞又は腫瘍によって生成されているＤＮＡの存在を判定又は予測し、試験対象が腫瘍若しくはがんを有する確率を判定する、又は対象のがん若しくは腫瘍を特徴づけることをさらに含んでもよい。
【0071】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡのサブサンプルは、配列決定前に変換手順を受けない。いくつかの場合、変換されたサブサンプル及び変換されていないサブサンプルは、異なるアダプター配列を有し得る。変換されたサブサンプル及び変換されていないサブサンプルは、配列決定ステップ（ｃ）のために組み換えることができる。異なるアダプター配列を使用して、後のステップ又は分析において、曝露されたサブサンプル及び曝露されていないサブサンプルから配列又は分子を区別することができる。
【0072】
さらなる態様では、本開示は、サンプル中のＤＮＡの修飾ヌクレオシドプロファイルを分析するための方法であって、（ａ）ＤＮＡを、１つ以上の既知の修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドアダプターにライゲートすることと；（ｂ）適応したＤＮＡ、又はそのサブサンプルに、アダプター内の既知の修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順を施すことと；（ｃ）ステップ（ｂ）の適応したＤＮＡを配列決定することと；（ｄ）配列データを使用して、アダプター内の既知の修飾ヌクレオシドの変換率を判定することと；（ｅ）ステップ（ｄ）で判定されている変換率を使用して、ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの変換率を推定することと、を含む方法を提供する。他の実施形態では、ステップ（ｄ）は、ステップ（ｃ）において得られた配列データを使用して、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性変換を判定することを含み；ステップ（ｅ）は、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性変換を変換ステップ（ｂ）における品質管理尺度として用いることを含む。配列決定ステップ（ｃ）は、初期サンプル中の修飾ヌクレオシドが変換されているものとして同定することを可能にする。例えば、方法は、（ｆ）ステップ（ｃ）において得られた配列データを、（Ａ）所定の参照配列；及び／又は（Ｂ）変換手順を受けなかったＤＮＡのサブサンプルを配列決定することによって得られた配列データと比較することと；（ｇ）変換されたＤＮＡ配列と参照又は変換されていないＤＮＡ配列との間のポイント差異をＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオチドとして同定することと、を含んでもよい。
【0073】
本開示の方法を用いて、サンプルレベル又は分子レベルのいずれかに対する変換率を推測することができる。それ故、さらなる態様では、本開示は、サンプル中のＤＮＡの修飾ヌクレオシドプロファイルを分析するための方法であって、（ａ）ＤＮＡを、１つ以上の既知の修飾ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドアダプターにライゲートすることと；（ｂ）適応したＤＮＡ、又はそのサブサンプルに、アダプター内の既知の修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順を施すことと；（ｃ）ステップ（ｂ）の適応したＤＮＡを配列決定することと；（ｄ）配列データを使用して、アダプター内の既知の修飾ヌクレオシドの準最適な変換を伴う適応したＤＮＡ分子を同定することと；（ｅ）ステップ（ｄ）で同定された全長の適応したＤＮＡ分子中の修飾ヌクレオチドの準最適な変換を推測／予測することと、を含む方法を提供する。方法は、配列データを使用して、ステップ（ｄ）で同定された１つ以上の分子のアダプター内の既知の修飾ヌクレオシドの変換率を判定することと；判定された変換率を使用して、全長の適応したＤＮＡ分子の変換率を推定することと、をさらに含んでもよい。
【0074】
さらなる態様では、本開示は、ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドを検出する方法を提供する。方法は、上に記載されているステップ（ａ）～（ｅ）のいずれかのセットを含んでもよい。また、上に記載されている他の特徴は、必要に応じて、こうした方法に適用可能である。例えば、方法は、（ｆ）ステップ（ｃ）において得られた配列データを、（Ａ）所定の参照配列；及び／又は（Ｂ）変換手順を受けなかったＤＮＡのサブサンプルを配列決定することによって得られた配列データと比較することと；（ｇ）変換されたＤＮＡ配列と参照又は変換されていないＤＮＡ配列との間のポイント差異をＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオチドとして同定することと、をさらに含んでもよい。ステップ（ｅ）は、方法における品質管理尺度を提供する。
【0075】
ステップ（ｄ）において判定されている変換率は、変換手順における品質管理尺度を提供し、それを使用して、偽陰性、即ち、変換手順によって有効に変換されず、それ故に誤って同定された初期サンプル中の修飾残基の比率を推定することができる。
【0076】
それ故、さらなる態様において、本開示は、サンプル中のＤＮＡの修飾ヌクレオシドプロファイルを分析するため、又はＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドを検出するための品質管理方法を提供する。方法は、上に記載されているステップ（ａ）～（ｅ）のいずれかのセットを含んでもよい。また、上に記載されている他の特徴は、必要に応じて、こうした方法に適用可能である。
【0077】
いくつかの実施形態では、方法は、分析における加重を、ＤＮＡサンプル又はサンプル中の個別の適応したＤＮＡ分子に適用することをさらに含み、ここで加重は、ステップ（ｄ）で判定されている変換率に依存する。典型的に、より大きい加重が、変換率がより高く判定されたサンプル又は分子に与えられ、より小さい加重が、変換率がより低く判定されたサンプル又は分子に与えられる。加重は、変換後にサンプルのＤＮＡ分子を配列決定することによって判定されている修飾ヌクレオシドプロファイルに割り当てることができる確度のレベルを反映する。いくつかの場合、（所定の）品質管理閾値を下回る準最適な変換又は変換率を伴うサンプル又は分子は、さらなる分析から除外してもよい。
【0078】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法の結果は、報告を作成するための入力として使用される。報告は、紙又は電子形式であってもよい。例えば、本明細書で開示される方法、又はそれから得られた情報によって得られるとおりの偽陽性及び／又は偽陰性の検出は、こうした報告中で直接的に提示することができる。代替的に、又は追加的に、少なくとも部分的に本明細書で開示される方法に基づく診断情報又は治療推奨は、報告に含めることができる。
【0079】
本明細書で開示される方法の様々なステップは、同じ若しくは異なる時点で、同じ若しくは異なる地理的位置、例えば国において、及び／又は同じ若しくは異なる人々によって実施してもよい。
【0080】
追加的利点は、一部には以下の説明において記載されることになり、又は実践によって学習することができる。利点は、特に添付の請求項に指摘される要素及び組み合わせを用いて実現され、達成されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0081】
【図1】図１は、バイサルファイト配列決定、ＮＥＢ ＥＭ－ｓｅｑ及びＴＡＰＳといった３つの一塩基分解メチル化アッセイ間の差異を図示する。３つ全ての方法では、メチルシトシン及びヒドロキシメチル－シトシンが非メチル化シトシンと区別される。しかし、ＴＡＰＳは、他の２つの方法に対する逆変換ロジックを有し、メチル化シトシン（「Ｔ」として解読されている配列）の塩基対を変更し、非メチル化シトシン（さらに「Ｃ」として解読されている）を変更しない一方で、バイサルファイト配列決定及びＥＭ－ｓｅｑは、非メチル化シトシン（「Ｔ」として解読されている配列）の塩基対を変更し、メチル化シトシン（さらに「Ｃ」として解読されている）を変更しない。
【発明を実施するための形態】
【0082】
ここで、本開示の特定の実施形態に対して、詳細に参照がなされる。本開示がこうした実施形態と組み合わせて記載される一方で、それらが本発明をそれらの実施形態に限定することが意図されていないことは理解されるであろう。それに対して、本開示は、添付の特許請求の範囲によって定義されている本発明の中に含めてもよい、全ての代替物、修飾、及び均等物を包含することが意図されている。
【0083】
本教示内容を詳細に説明する前に、本開示が、具体的な組成物又はプロセスステップに、それらが変動し得ることから、限定されないことは理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」が、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の参照を含むことは注目すべきである。したがって、例えば、「核酸」は、複数の核酸を含む。
【0084】
数値範囲は、範囲を定義する数を包含する。測定された値及び測定可能な値は、有効数字及び測定に伴う誤差を考慮する近似値であると理解される。
【0085】
上の明細書中で具体的に記述されない限り、様々な成分を「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」として列記する明細書中の実施形態は、列記された成分「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことも企図される。
【0086】
本明細書で用いられるセクション見出しは、構造化を目的としており、決して開示される主題を限定するものとして解釈されるべきでない。
【0087】
本明細書中で引用されている全ての特許、特許出願、ウェブサイト、他の出版物又は文書などは、上記又は下記のいずれであっても、あらゆる目的として、各個別の項目が参照により援用されることが具体的且つ個別に示される場合と同程度に、それら全体が参照により明示的に援用される。出版物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが異なる時点で公開される場合、別段の指示がない限り、ごく最近、本願の有効出願日に公開されているバージョンを意味する。
【0088】
定義
本明細書で使用する場合、「塩基対特異性」は、所与の塩基が最も優先的に対合する場合の標準的なＤＮＡ塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）を指す。したがって、例えば、非修飾シトシン及び５－メチルシトシンは、同じ塩基対特異性（即ち、Ｇに対する特異性）を有する一方で、ウラシル及びシトシンは、ウラシルがＡに対する塩基対特異性を有する一方で、シトシンがＧに対する塩基対特異性を有することから、異なる塩基対特異性を有する。例えば、ウラシルがＧとゆらぎ対を形成する能力は、ウラシルがやはり４つの標準的なＤＮＡ塩基の中のＡと最も優先的に対合することから、無関係である。
本明細書で使用する場合、「塩基対特異性」は、所与の塩基が最も優先的に対合する場合の標準的なＤＮＡ塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）を指す。したがって、例えば、非修飾シトシン及び５－メチルシトシンは、同じ塩基対特異性（即ち、Ｇに対する特異性）を有する一方で、ウラシル及びシトシンは、ウラシルがＡに対する塩基対特異性を有する一方で、シトシンがＧに対する塩基対特異性を有することから、異なる塩基対特異性を有する。例えば、ウラシルがＧとゆらぎ対を形成する能力は、ウラシルがやはり４つの標準的なＤＮＡ塩基の中のＡと最も優先的に対合することから、無関係である。
【0089】
「同じ同一性」のヌクレオシド又は「同じヌクレオシド同一性」は、同じ塩基を、その塩基の修飾状態と無関係に有するヌクレオシドを指す。例えば、シトシンは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチル－シトシン（５ｈｍＣ）と、それらが異なる修飾状態を有することと無関係に「同じ同一性」であると考えられる。
【0090】
「変換試薬」は、核酸中の少なくとも１つの修飾又は非修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するために使用することができる試薬を指す。例えば、バイサルファイトは、（Ｇに対する塩基対特異性を有する）非修飾シトシンを（Ａに対する塩基対特異性を有する）ウラシルに変更するために使用することができる変換試薬であり、Ｔｅｔ酵素及びピリジンボランは、（Ｇに対する塩基対特異性を有する）メチル化又はヒドロキシメチル化シトシンを（Ａに対する塩基対特異性を有する）ジヒドロウラシルに変更するために一緒に使用することができる変換試薬である。変換手順は、核酸中の少なくとも１つの修飾又は非修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するために１つ以上の変換試薬を使用する手順である。
【0091】
変換試薬又は手順は、変換試薬又は手順が、第２の異なる修飾状態を有するそのヌクレオシドの塩基対特異性を、第１の修飾状態を有するヌクレオシドの塩基対特異性への変更が誤っていると適切にみなされるポイントまで優先的に変更する場合、（修飾又は非修飾であり得る）第１の修飾状態を有するヌクレオシドの「塩基対特異性を実質的に変更することができない」。例えば、バイサルファイト変換は、５ｍＣ（第１の修飾状態を有するヌクレオシド）の塩基対特異性を実質的に変更することができないが、非修飾シトシン（第２の修飾状態を有するヌクレオシド）の塩基対特異性を優先的に変更する。それに対し、ＴＡＰＳは、５ｍＣ（及び５ｈｍＣ）（それらのいずれかは、第２の修飾状態を有すると考えることができる）の塩基対特異性を優先的に変更するが、ＴＡＰＳは、非修飾Ｃ（第１の修飾状態を有するヌクレオシド）の塩基対特異性を実質的に変更することができない。
【0092】
１つ以上の標的核酸を「捕捉すること」は、１つ以上の標的核酸を非標的核酸から優先的に単離又は分離することを指す。
【0093】
核酸の「捕捉されたセット」は、捕捉を受けている核酸を指す。
【0094】
「標的領域セット」又は「標的領域のセット」は、捕捉のために標的化され、且つ／又は（例えば、配列相補性を通じて）プローブのセットによって標的化される複数のゲノム遺伝子座を指す。
【0095】
「標的領域セットに対応する」は、核酸、例えばｃｆＤＮＡが、標的領域セットにおける遺伝子座に起源を持つ、又は標的領域セットに対する１つ以上のプローブに特異的に結合することを意味する。
【0096】
「配列可変標的領域」は、新生細胞（例えば、腫瘍細胞及びがん細胞）における、正常細胞に対する、ヌクレオチド置換（即ち、一塩基多様性）、挿入、欠失、又は遺伝子融合若しくは転位などの配列の変化を示し得る標的領域を指す。配列可変標的領域セットは、配列可変標的領域のセットである。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域は、５０以下の隣接ヌクレオチド、例えば、４０、３０、２０、１０、５、４、３、若しくは２以下のヌクレオチドに影響する、又は１ヌクレオチドに影響する変化を示し得る標的領域である。
【0097】
「エピジェネティック標的領域」は、組織型を通じた配列非依存性の変化を示し得る標的領域（例えば、固形組織型において造血細胞内と異なる程度のメチル化を有する標的領域）、又は新生細胞、例えば腫瘍細胞又はがん細胞における正常細胞との差異を示し得る標的領域を指す。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域は、通常はｃｆＤＮＡに実質的に寄与しない組織型、例えば、肺、結腸などに起源を持つｃｆＤＮＡにおける、バックグラウンドｃｆＤＮＡ、例えば、造血細胞に起源を持つｃｆＤＮＡに対する配列非依存性の差異を示す。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域は、がんを有する対象からのｃｆＤＮＡにおける、健常対象からのｃｆＤＮＡに対する配列非依存性の差異を示す。配列非依存性の変化の例としては、限定はされないが、メチル化の変化（増加又は減少）、ヌクレオソーム分布、ｃｆＤＮＡ断片化パターン、ＣＣＣＴＣ結合因子（「ＣＴＣＦ」）結合、転写開始部位、及び調節タンパク質結合領域が挙げられる。エピジェネティック標的領域セットは、エピジェネティック標的領域のセットである。それ故、エピジェネティック標的領域セットとして、限定はされないが、高メチル化可変標的領域セット、低メチル化可変標的領域セット、及び断片化可変標的領域セット、例えば、ＣＴＣＦ結合部位及び転写開始部位が挙げられる。本目的として、新生物、腫瘍、若しくはがん関連の限局的増幅及び／又は遺伝子融合を受けやすい遺伝子座は、例えば、限局的増幅及び／又は遺伝子融合が、それらの検出が１つ又はいくつかの個別位置で塩基要求の正確性に依存しないことから、比較的浅い配列決定の深さで検出可能であるという点で、配列決定によるコピー数の変化又は参照ゲノム内の２つ以上の遺伝子座に位置づける融合された配列の検出が、ヌクレオチド置換、挿入、又は欠失の検出よりも、上で考察された代表的なエピジェネティック変化の検出に類似する傾向があるため、エピジェネティック標的領域セットに含めることもできる。
【0098】
本明細書で使用する場合、「エピジェネティックな特徴」は、主要な配列（即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、及びＴ塩基の配列）以外のＤＮＡ又はクロマチンの任意の特徴を指す。エピジェネティックな特徴は、塩基の共有結合修飾、例えばメチル化、並びにヒストン及び他の安定なＤＮＡ関連タンパク質の修飾及びポジショニングを含む。
【0099】
本明細書で使用する場合、「差次的メチル化領域」は、組織の少なくとも１つのタイプにおいて、健常対象からの無細胞ＤＮＡにおけるメチル化の程度に対して検出可能に異なる程度のメチル化を有する領域を指す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの差次的メチル化領域は、組織の少なくとも１つのタイプにおいて、組織の別のタイプにおけるメチル化の程度に対して；又は健常対象からのサンプルにおいて、前がん、がん、又は新生物を有する対象におけるメチル化の程度に対して、検出可能に異なる程度のメチル化を有する。いくつかの実施形態では、差次的メチル化領域は、組織の少なくとも１つのタイプにおいて、健常対象からの無細胞ＤＮＡにおけるメチル化の程度に対して検出可能により高い程度のメチル化を有する。いくつかの実施形態では、差次的メチル化領域は、組織の少なくとも１つのタイプにおいて、健常対象からの無細胞ＤＮＡにおけるメチル化の程度に対して検出可能により低い程度のメチル化を有する。いくつかの実施形態では、差次的メチル化領域は、赤血球系統において、又は未熟赤血球（例えば、網状赤血球）において低メチル化され、少なくとも１つの非赤血球細胞型又は組織型（例えば、白血球又は固形組織細胞型、例えば、上皮細胞、筋細胞など）において高メチル化される。
【0100】
本明細書で使用する場合、エピジェネティック変異との関連での「型特異的な」は、１つの細胞型若しくは組織型において、又は複数の関連する細胞型若しくは組織型において、他の細胞型又は組織型に対して検出可能に異なる程度で存在するエピジェネティック変異を意味する。同様に、「型特異的なエピジェネティック標的領域」は、１つの細胞型若しくは組織型において、又は複数の関連する細胞型若しくは組織型において、他の細胞型又は組織型に対して検出可能に異なるエピジェネティックな特徴を有するエピジェネティック標的領域である。例示的なエピジェネティックな特徴は、上記のエピジェネティック標的領域の定義において考察されている。例えば、「型特異的な差次的メチル化領域」は、１つの細胞型若しくは組織型において、又は複数の関連する細胞型若しくは組織型において、他の細胞型又は組織型に対して検出可能に異なる程度のメチル化を有するＤＮＡの領域である。型特異的な差次的メチル化領域の例としては、組織特異的な差次的メチル化領域、例えば、早期がんにおけるコピー数増加を伴うものが挙げられる。いくつかの実施形態では、型特異的な差次的メチル化領域の捕捉、同定、及び／又は検出により、ＤＮＡの起源である細胞型又は組織型の同定が容易になる。型特異的な差次的メチル化領域の起源である細胞又は組織は、野生型細胞若しくは組織又は新生細胞若しくは組織であってもよい。別の例では、ＤＮＡの「型特異的断片」は、１つの細胞型若しくは組織型において、又は複数の関連する細胞型若しくは組織型において、他の細胞型又は組織型に対して検出可能に異なる程度で存在する型特異的な断片化パターンから生じるＤＮＡ断片である。いくつかの実施形態では、型特異的断片は、特定の細胞型又は組織型に限って存在する。いくつかの実施形態では、型特異的断片は、特定の細胞型又は組織型において検出可能により大きい程度で存在する。
【0101】
本明細書で使用する場合、「血液サンプル」は、全血又はその成分（例えば、血漿、血清、バフィーコート、血漿ペレット）を含むサンプルを指す。
【0102】
「バフィーコート」は、サンプルの白血球及び血小板の全部又は大部分を含有する、血液（全血など）又は骨髄サンプルの一部分を指す。サンプルのバフィーコート画分は、サンプル成分を密度によって分離する遠心分離を用いて、サンプルから調製することができる。例えば、全血サンプルの遠心分離後、バフィーコート画分は、血漿層と赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ））層との間に位置する。バフィーコートは、単核（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、及び単球）と多形核（例えば、好中球及び好酸球などの顆粒球）白血球の両方を含有し得る。
【0103】
本明細書で使用する場合、「プライマーとアニールされたＤＮＡ」は、少なくとも１つのプライマーがアニールされる対象のＤＮＡを意味する。
【0104】
本明細書中のＤＮＡの「イントロン領域」は、イントロン又はその一部分をコードする。イントロン領域は、ｍＲＮＡを生成するためのプレｍＲＮＡの転写後スプライシング中に除去されるイントロンをコードする領域とともに、（例えば、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体遺伝子座における）生殖系列Ｊ遺伝子セグメント間に介入し、体細胞Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え中に除去される配列である「Ｊイントロン領域」を含む。本明細書中のＤＮＡの「エクソン領域」は、プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡにおける少なくとも１つのエクソン又はその一部分をコードする。いくつかの実施形態では、エクソン領域は、ＶＤＪエクソン領域であり、それがプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡにおける１つ以上のＶ、Ｄ、又はＪエクソンをコードすることを意味する。本明細書中のＤＮＡの「エクソン－エクソン接合領域」は、任意のイントロンがスプライシングによって除去される前、プレｍＲＮＡ（例えば、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体のプレｍＲＮＡ）における少なくとも１つのエクソン－エクソン接合部をコードする。エクソン－エクソン接合領域は、例えば、ＪセグメントがＤ若しくはＶセグメントに連結される、又はＶセグメントがＤ若しくはＪセグメントに連結されるとき、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えによって形成され得る。
【0105】
本明細書で使用する場合、ＤＮＡ「構造変異」又は「構造変異体」は、点突然変異以外の野生型ゲノム中に存在しないＤＮＡ配列を含む突然変異である（例えば、少なくとも５、１０、２０、又は５０の隣接ヌクレオチドが対応する遺伝子座で野生型配列と異なる場合）。ＤＮＡ構造変異の例として、再配列、例えば、転位、挿入、欠失、重複、コピー数多型、及び逆位が挙げられる。本明細書で使用する場合、「構造変異配列」又は「構造変異体配列」は、構造変異の一部分又は全体を含むか又はそれからなるＤＮＡ配列である。
【0106】
本明細書で使用する場合、ＤＮＡ分子などの核酸の「分割」は、核酸のサンプル又は集団の、核酸の複数のサブサンプル又は亜集団への、複数のサブサンプル又は亜集団のそれぞれにおいて異なる割合である１つ以上の修飾又は特徴に基づく、分離、分画、選別、又は富化を意味する。分割は、核酸分子を、１つ以上のメチル化核酸塩基の存在又は不在に基づき、物理的に分割することを含んでもよい。サンプル又は集団は、遺伝的又はエピジェネティックな変化又は病態を意味する特徴に基づき、１つ以上の分割されたサブサンプル又は亜集団に分割してもよい。
【0107】
本明細書で使用する場合、「最初に単離された」サンプルの形態は、サンプルの、それが単離された時点、及び単離されたサンプルの化学構造を変更する任意の手順を受ける前の組成物又は化学構造を指す。同様に、分子中に「最初に存在する」特徴は、「元の分子」又はその分子が分子の化学構造を変更する任意の手順を受ける前に特徴を「最初に含む」分子に存在する特徴を指す。
【0108】
本明細書で使用する場合、所与の核酸塩基の「塩基対特異性の実質的変更を伴わない」は、配列決定可能であるその核酸塩基を含む分子の大半が、所与の核酸塩基の塩基対特異性の、最初に単離されたサンプル中に存在したときのその塩基対特異性に対する変更を有しないことを意味する。いくつかの実施形態では、配列決定可能であるその核酸塩基を含む分子の７５％、９０％、９５％、又は９９％は、塩基対特異性の、最初に単離されたサンプル中に存在したときのその塩基対特異性に対する変更を有しない。本明細書で使用する場合、所与の核酸塩基の「変更された塩基対特異性」は、配列決定可能であるその核酸塩基を含む分子の大半が、その核酸塩基での塩基対特異性の、最初に単離されたサンプル中のその塩基対特異性に対する変更を有することを意味する。
【0109】
本明細書で使用する場合、複数のメンバーを含む「組み合わせ」は、例えば、別々の容器又は区画であって、より大きい容器、例えば、マルチウェルプレート、チューブラック、冷蔵庫、冷凍庫、インキュベーター、水槽、アイスバケット、器具、又は他の貯蔵形態に内包される容器又は区画内に、メンバーを含む単一組成物又は近接した組成物のセットのいずれかを指す。
【0110】
本明細書で使用する場合、「標識」は、それが付着するものの検出、分離、又は単離を容易にする、捕捉部分、フルオロフォア、オリゴヌクレオチド、又は他の部分である。
【0111】
本明細書で使用する場合、「捕捉部分」は、捕捉部分に連結されている分子の、捕捉部分を欠いている分子からの親和性分離を可能にする分子である。例示的な捕捉部分は、固相に連結されているか又は連結可能であるストレプトアビジンに結合することによって親和性分離を可能にするビオチン、又は固相に連結されているか又は連結可能である相補的オリゴヌクレオチドへの結合を通じた親和性分離を可能にするオリゴヌクレオチドを含む。
【0112】
本明細書で使用する場合、「捕捉プローブ」は、捕捉部分を含み、増幅によって生成されることから、鋳型ＤＮＡのアンプリコンを含むプローブを意味する。いくつかの実施形態では、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。
【0113】
本明細書で使用する場合、２つのプライマーの「逆平行方向」は、プライマーが互いに対して逆方向で核酸に（例えば、核酸の逆鎖に）、及び／又は指数関数的なＰＣＲ増幅に適合する方向で核酸にアニールすることを意味する。例えば、逆平行方向で再配列にアニールするプライマーは、再配列ブレークポイントを含むアンプリコンの増幅を促進し得る。
【0114】
本明細書で使用する場合、「タグ」は、タグの会合対象の分子の特徴を示す情報を含む、核酸、標識、フルオロフォア、又はペプチドなどの分子である。例えば、分子は、（１つのサンプル中の分子を異なるサンプル中の分子と区別する）サンプルタグ、（（固有及び非固有の両方のタグ付けシナリオにおいて）異なる分子を互いから区別する分子タグ／分子バーコード／バーコード、精製タグ、及び／又は検出可能なタグ若しくは標識を有し得る。
【0115】
プローブ又は他のオリゴヌクレオチド及び標的配列との関連での「特異的に結合する」は、適切なハイブリダイゼーション条件下で、オリゴヌクレオチド又はプローブがその標的配列、又はその複製物とハイブリダイズして、安定なプローブ：標的ハイブリッドを形成する一方で、同時に安定なプローブ：非標的ハイブリッドの形成が最小化されることを意味する。したがって、プローブは、標的配列又はその複製物と、非標的配列より十分に大きい範囲までハイブリダイズして、標的配列の捕捉又は検出を可能にする。当該技術分野で周知である適切なハイブリダイゼーション条件は、配列組成物に基づいて予測することができ、又は通常の試験方法を用いることによって決定することができる（例えば、参照により本明細書に援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）の§§１．９０～１．９１，７．３７～７．５７，９．４７～９．５１及び１１．４７～１１．５７、特に§§９．５０～９．５１，１１．１２～１１．１３，１１．４５～１１．４７及び１１．５５～１１．５７を参照されたい）。
【0116】
核酸は、それが腫瘍細胞に起源を有した場合、「腫瘍によって生成される」、又はｃｔＤＮＡ又は循環腫瘍ＤＮＡである。腫瘍細胞は、それらが腫瘍内に留まるか又は腫瘍から分かれるようになるか（例えば、転移性がん細胞及び循環腫瘍細胞の症例などの場合）にかかわらず、腫瘍に起源を持つ新生細胞である。
【0117】
核酸との関連での「標的領域」は、例えば、（例えば、配列相補性を通じた）プローブを使用することによる同定及び／又は捕捉が標的とされる遺伝子座を指す。「標的領域セット」又は「標的領域のセット」は、例えば、（例えば、配列相補性を通じた）プローブのセットを使用することによる同定及び／又は捕捉が標的とされる複数のゲノム遺伝子座を指す。
【0118】
所与の標的領域セットに対するプローブの収集の「捕捉収率」は、プローブの収集物が典型的な条件下で捕捉する、標的領域セットに対応する核酸の量（例えば、別の標的領域セットに対する量又は絶対量）を指す。例示的な典型的な捕捉条件は、サンプル核酸及びプローブの、ストリンジェントなハイブリダイゼーション緩衝液を含有する小さい反応体積（約２０μＬ）内、６５℃で１０～１８時間のインキュベーションである。捕捉収率は、絶対項で表すことができ、又は複数のプローブの収集物の場合、相対項で表すことができる。複数の標的領域のセットについての捕捉収率が比較される場合、それらは（例えば、キロベース当たりを基準として）標的領域セットのフットプリントサイズに対して正規化される。それ故、例えば、第１及び第２の標的領域のフットプリントサイズのそれぞれが５０ｋｂ及び５００ｋｂである（０．１の正規化係数を示す）場合、
第１の標的領域セットに対応する捕捉されたＤＮＡの体積濃度当たりの質量が、第２の標的領域セットに対応する捕捉されたＤＮＡの体積濃度当たりの質量の０．１倍を超えるとき、第１の標的領域セットに対応するＤＮＡは、第２の標的領域セットに対応するＤＮＡより高い収率で捕捉される。さらなる例として、同じフットプリントサイズを用いると、第１の標的領域セットに対応する捕捉されたＤＮＡが、第２の標的領域セットに対応する捕捉されたＤＮＡの体積濃度当たりの質量の０．２倍の体積濃度当たりの質量を有する場合、第１の標的領域セットに対応するＤＮＡは、第２の標的領域セットに対応するＤＮＡより２倍大きい捕捉収率で捕捉された。
第１の標的領域セットに対応する捕捉されたＤＮＡの体積濃度当たりの質量が、第２の標的領域セットに対応する捕捉されたＤＮＡの体積濃度当たりの質量の０．１倍を超えるとき、第１の標的領域セットに対応するＤＮＡは、第２の標的領域セットに対応するＤＮＡより高い収率で捕捉される。さらなる例として、同じフットプリントサイズを用いると、第１の標的領域セットに対応する捕捉されたＤＮＡが、第２の標的領域セットに対応する捕捉されたＤＮＡの体積濃度当たりの質量の０．２倍の体積濃度当たりの質量を有する場合、第１の標的領域セットに対応するＤＮＡは、第２の標的領域セットに対応するＤＮＡより２倍大きい捕捉収率で捕捉された。
【0119】
「メチル化」又は「ＤＮＡメチル化」という用語は、メチル基の核酸分子中のヌクレオチド塩基への付加を指す。いくつかの実施形態では、メチル化は、メチル基のシトシンへのＣｐＧ部位（シトシン－リン酸塩－グアニン部位（即ち、核酸配列の５’→３’方向でのシトシンとそれに続くグアニン））での付加を指す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化は、メチル基のアデニンへの付加であって、例えば、Ｎ６－メチルアデニンなどの場合を指す。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化は、５－メチル化（シトシン環の５位における炭素の修飾）である。いくつかの実施形態では、５－メチル化は、５－メチルシトシン（５ｍＣ）を生成するためのメチル基のシトシンの５Ｃ位への付加を指す。いくつかの実施形態では、メチル化は、５ｍＣの誘導体を含む。５ｍＣの誘導体として、限定はされないが、５－ヒドロキシメチルシトシン（５－ｈｍＣ）、５－ホルミルシトシン（５－ｆＣ）、及び５－カルボキシルシトシン（ｃａｒｙｂｏｘｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ）（５－ｃａＣ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡメチル化は、３Ｃメチル化（シトシン環の３位における炭素の修飾）である。いくつかの実施形態では、３Ｃメチル化は、３－メチルシトシン（３ｍＣ）を生成するためのメチル基のシトシンの３Ｃ位への付加を含む。メチル化はまた、非ＣｐＧ部位で行うことができ、例えば、メチル化は、ＣｐＡ、ＣｐＴ、又はＣｐＣ部位で行うことができる。ＤＮＡメチル化は、メチル化ＤＮＡ領域の活性を変更し得る。例えば、プロモーター領域内のＤＮＡがメチル化される場合、遺伝子の転写は抑制され得る。ＤＮＡメチル化は、正常な発現のために決定的であり、メチル化の異常は、エピジェネティック調節を破壊し得る。エピジェネティック調節における破壊、例えば抑制は、がんなどの疾患を引き起こすことがある。ＤＮＡにおけるプロモーターメチル化は、がんを意味し得る。
【0120】
「ＤＮＡの修飾ヌクレオシドプロファイル」は、ＤＮＡ配列内のヌクレオシドの位置及び同一性並びにヌクレオシドの修飾状態、例えばメチル化を意味する。上記のとおり、変換とそれに続く配列決定の異なる方法により、修飾又は非修飾ヌクレオシドの１つ以上の異なるタイプが検出される。例えば、ＴＡＰＳ法は、５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び５－ヒドロキシメチル－シトシン（５ｈｍＣ）を検出するが、それらの間を区別することがない。それ故、サンプル中のＤＮＡの修飾ヌクレオシドプロファイルを分析するための方法は、典型的に、特定の修飾又は修飾基、例えば５ｍＣ及び／又は５ｈｍＣを同定することを意味する。修飾ヌクレオシドは、上記のように用いられている特定の方法／変換手順に従って同定される。これは一般に、変換手順を受けているＤＮＡから得られた配列データを参照配列と比較することを含む。典型的に、方法は、（ｉ）配列データを、（Ａ）典型的には、例えば、がんの診断、予後又は特徴づけにおいて、修飾ヌクレオシドプロファイルに特定の有意性が加わる場合の１つ以上のエピジェネティック標的領域に対応する、１つ以上の所定の参照配列；又は（Ｂ）変換手順を受けなかったＤＮＡのサブサンプル、例えば、例えば本明細書に記載のとおり、別々のサブサンプルを変換手順にかける前に分離されたサブサンプルを配列決定することによって得られた配列データと比較することと；（ｉｉ）変換されたＤＮＡ配列と参照配列（Ａ）又は変換されていないＤＮＡ配列（Ｂ）との間のポイント差異を、変換手順への曝露時の塩基対特異性の変化を可能にする修飾状態を有する（初期サンプル中の）ヌクレオシドとして同定することと、を含む。
【0121】
標準変換及び配列決定方法によって判定されている修飾ヌクレオシドプロファイルが、サンプル中の修飾又は非修飾ヌクレオシドの不完全な又は誤った変換に起因するエラーを含有してもよいことは理解される。本開示の方法は、サンプル又は分子基盤のいずれかに対する変換率を評価するための手段を提供する。
【0122】
「高メチル化」という用語は、核酸分子の、核酸分子の集団（例えば、サンプル）中の他の核酸分子に対するメチル化のレベル又は程度の増加を指す。いくつかの実施形態では、高メチル化ＤＮＡは、少なくとも１つのメチル化残基、少なくとも２つのメチル化残基、少なくとも３つのメチル化残基、少なくとも５つのメチル化残基、又は少なくとも１０のメチル化残基を含むＤＮＡ分子を含み得る。本明細書で使用する場合、「型特異的な高メチル化」は、１つの細胞型若しくは組織型における、又は複数の関連する細胞型若しくは組織型における、他の細胞型又は組織型に対する、ＤＮＡのメチル化のレベル又は程度の増加を意味する。いくつかの実施形態では、型特異的な高メチル化領域の捕捉、同定、及び／又は検出により、ＤＮＡの起源である細胞型又は組織型の同定が促進される。型特異的な高メチル化領域の起源である細胞又は組織は、野生型細胞若しくは組織又は新生細胞若しくは組織であってもよい。
【0123】
「低メチル化」という用語は、核酸分子の、核酸分子の集団（例えば、サンプル）中の他の核酸分子に対するメチル化のレベル又は程度の低下を指す。いくつかの実施形態では、低メチル化ＤＮＡは、非メチル化ＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態では、低メチル化ＤＮＡは、０のメチル化残基、最大で１つのメチル化残基、最大で２つのメチル化残基、最大で３つのメチル化残基、最大で４つのメチル化残基、又は最大で５つのメチル化残基を含むＤＮＡ分子を含み得る。本明細書で使用する場合、「型特異的な低メチル化」は、１つの細胞型若しくは組織型における、又は複数の関連する細胞型若しくは組織型における、他の細胞型又は組織型に対する、ＤＮＡのメチル化のレベル又は程度の低下を意味する。いくつかの実施形態では、型特異的な低メチル化領域の捕捉、同定、及び／又は検出により、ＤＮＡの起源である細胞型又は組織型の同定が促進される。型特異的な低メチル化領域の起源である細胞又は組織は、野生型細胞若しくは組織又は新生細胞若しくは組織であってもよい。
【0124】
「ＤＮＡ中の修飾核酸塩基を認識する薬剤」、例えば「ＤＮＡ中の修飾シトシンを認識する薬剤」という用語は、ＤＮＡ中の１つ以上の修飾核酸塩基、例えばメチルシトシンに結合する、又はそれを検出する分子又は試薬を指す。
【0125】
「修飾ヌクレオシド」は、非修飾ヌクレオシドとの化学構造の差異を含むヌクレオシドである。ＤＮＡの場合、非修飾ヌクレオシドは、デオキシリボシル及びアデニン、シトシン、グアニン、又はチミンの１つを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾シトシンを含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドは、メチル化核酸塩基を含む。いくつかの実施形態では、修飾シトシンは、メチルシトシン、例えば、５－メチルシトシンである。かかる実施形態では、シトシン修飾は、メチルである。ＤＮＡ中のメチルシトシンを認識する薬剤は、限定はされないが、本明細書中でメチルシトシンに結合する試薬を指す「メチル結合試薬」を含む。メチル結合試薬は、限定はされないが、メチル結合ドメイン（ＭＢＤ）及びメチル結合タンパク質（ＭＢＰ）並びにメチルシトシンに特異的な抗体を含む。いくつかの実施形態では、そのような抗体は、ＤＮＡ中の５－メチルシトシンに結合する。いくつかのそのような実施形態では、ＤＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってもよい。
【0126】
「又はその組み合わせ（ｏｒ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｔｈｅｒｅｏｆ）」及び「又はその組み合わせ（ｏｒ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｔｈｅｒｅｏｆ）」は、本明細書で使用する場合、その用語に先行する列記された用語のありとあらゆる並べ替え及び組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はその組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣの少なくとも１つを含む、そして特定の状況下で順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、又はＣＡＢも含むことが意図されている。この例に続き、明示的に含まれるのは、例えば、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの１つ以上の項目又は用語の繰り返しを含む組み合わせである。当業者は、文脈から特に明白でない限り、典型的には任意の組み合わせでの項目又は用語の数に対する制限がないことを理解するであろう。
【0127】
「又は」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、包括的意味で、即ち、「及び／又は」と同等に使用される。
【0128】
サンプル及び対象
本開示は、核酸の修飾ヌクレオシドプロファイルを分析する方法、又はサンプル中のＤＮＡ、例えばサンプル中のＤＮＡ中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／若しくは偽陽性検出を監視するための品質管理方法に関する。いくつかの場合、核酸は、対象から得られる又は得られた。いくつかの実施形態では、核酸サンプルは、対象から得られる生体サンプルからの核酸、例えばＤＮＡを含んでもよい、又はそれから構成されてもよい。対象は、ヒト、哺乳動物、動物、霊長類、齧歯類（マウス及びラットを含む）、又は他の通常の実験、家庭用、コンパニオン、サービス若しくは農業動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ又はブタであってもよい。対象は、いくつかの場合、がん、腫瘍又は新生物を有し得る、又は有することが疑われ得る。他の場合、対象は、がん又は検出可能ながん症状を有しないことがある。対象は、１つ以上のがん療法、例えば、化学療法、抗体、ワクチン又は生物剤（ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれか１つ以上で治療されているかもしれない。対象は、例えば、（例えば、化学療法、外科的切除、放射線、又はその組み合わせなどの治療後）腫瘍、がん、又は新生物から寛解状態であり得る。対象は、がん又は任意のがん関連遺伝子の突然変異／障害に罹りやすいことが診断されているか又はされていないかのいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、腫瘍組織生検から得られるポリヌクレオチドサンプルである。がん、腫瘍又は新生物は、一般に、任意のタイプ、例えば、肺、結腸、直腸（又は結腸直腸）、腎臓、乳房、前立腺、若しくは肝臓のがん、腫瘍若しくは新生物、又は本明細書に記載されるがんの他のタイプであってもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、（例えば、化学療法、外科的切除、放射線、又はその組み合わせの後）腫瘍、がん、又は新生物からの寛解状態にある対象から得られる。前記実施形態のいずれかにおいて、前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物又は疑われる前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物は、膀胱、頭頸部、肺、結腸、直腸、腎臓、乳房、前立腺、皮膚、又は肝臓に属することがある。いくつかの実施形態では、前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物又は疑われる前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物は、肺に属する。いくつかの実施形態では、前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物又は疑われる前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物は、結腸又は直腸に属する。いくつかの実施形態では、前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物又は疑われる前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物は、乳房に属する。いくつかの実施形態では、前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物又は疑われる前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物は、前立腺に属する。前記実施形態のいずれかにおいて、対象は、ヒト対象であってもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、ステージＩのがん、ステージＩＩのがん、ステージＩＩＩのがん又はステージＩＶのがんを有する対象から得られる。
本開示は、核酸の修飾ヌクレオシドプロファイルを分析する方法、又はサンプル中のＤＮＡ、例えばサンプル中のＤＮＡ中の修飾ヌクレオシドの偽陰性及び／若しくは偽陽性検出を監視するための品質管理方法に関する。いくつかの場合、核酸は、対象から得られる又は得られた。いくつかの実施形態では、核酸サンプルは、対象から得られる生体サンプルからの核酸、例えばＤＮＡを含んでもよい、又はそれから構成されてもよい。対象は、ヒト、哺乳動物、動物、霊長類、齧歯類（マウス及びラットを含む）、又は他の通常の実験、家庭用、コンパニオン、サービス若しくは農業動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ又はブタであってもよい。対象は、いくつかの場合、がん、腫瘍又は新生物を有し得る、又は有することが疑われ得る。他の場合、対象は、がん又は検出可能ながん症状を有しないことがある。対象は、１つ以上のがん療法、例えば、化学療法、抗体、ワクチン又は生物剤（ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれか１つ以上で治療されているかもしれない。対象は、例えば、（例えば、化学療法、外科的切除、放射線、又はその組み合わせなどの治療後）腫瘍、がん、又は新生物から寛解状態であり得る。対象は、がん又は任意のがん関連遺伝子の突然変異／障害に罹りやすいことが診断されているか又はされていないかのいずれかであってもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、腫瘍組織生検から得られるポリヌクレオチドサンプルである。がん、腫瘍又は新生物は、一般に、任意のタイプ、例えば、肺、結腸、直腸（又は結腸直腸）、腎臓、乳房、前立腺、若しくは肝臓のがん、腫瘍若しくは新生物、又は本明細書に記載されるがんの他のタイプであってもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、（例えば、化学療法、外科的切除、放射線、又はその組み合わせの後）腫瘍、がん、又は新生物からの寛解状態にある対象から得られる。前記実施形態のいずれかにおいて、前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物又は疑われる前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物は、膀胱、頭頸部、肺、結腸、直腸、腎臓、乳房、前立腺、皮膚、又は肝臓に属することがある。いくつかの実施形態では、前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物又は疑われる前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物は、肺に属する。いくつかの実施形態では、前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物又は疑われる前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物は、結腸又は直腸に属する。いくつかの実施形態では、前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物又は疑われる前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物は、乳房に属する。いくつかの実施形態では、前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物又は疑われる前がん、がん、腫瘍、若しくは新生物は、前立腺に属する。前記実施形態のいずれかにおいて、対象は、ヒト対象であってもよい。いくつかの実施形態では、サンプルは、ステージＩのがん、ステージＩＩのがん、ステージＩＩＩのがん又はステージＩＶのがんを有する対象から得られる。
【0129】
サンプルは、対象から単離されている任意の生体サンプルであり得る。サンプルは、身体サンプルであり得る。サンプルは、身体組織、例えば既知の又は疑われた固形腫瘍、全血、血小板、血清、血漿、便、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）若しくは白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ）、内皮細胞、組織生検、脳脊髄液、滑液、リンパ液、腹水、間質若しくは細胞外液、細胞間の空間内の体液、例えば、歯肉溝滲出液、骨髄、胸水貯留液、脳脊髄液、唾液、粘液、痰、精液、汗、尿を含み得る。サンプルは、好ましくは、体液、特に血液及びその画分、並びに尿である。サンプルは、対象から最初に単離される形態であり得る、又は細胞などの成分を除去若しくは添加する、若しくは１つの成分を別の成分に対して富化するため、さらなる処理を受けている可能性がある。
【0130】
いくつかの実施形態では、核酸の集団は、新生物、腫瘍、前がん、若しくはがんを有することが疑われる、又は以前に新生物、腫瘍、前がん、若しくはがんと診断された対象からの血清、血漿又は血液サンプルから得られる。集団は、異なるレベルの配列多様性、エピジェネティック変異、及び／又は複製後修飾若しくは転写修飾を有する核酸を含む。複製後修飾は、特に核酸塩基の５位に、シトシンの修飾、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン及び５－カルボキシルシトシンを含む。
【0131】
サンプルは、対象から単離又は取得し、サンプル分析の場所に輸送することができる。サンプルは、望ましい温度、例えば、室温、４℃、－２０℃、及び／又は－８０℃で保存し、輸送することができる。サンプルは、サンプル分析の場所で、対象から単離又は取得することができる。対象は、ヒト、哺乳動物、動物、コンパニオン動物、サービス動物、又はペットであり得る。対象は、がん、前がん、感染、移植片拒絶、又は免疫系の変化に関連する他の疾患又は障害を有し得る。対象は、がん又は検出可能ながん症状を有しない場合がある。対象は、１つ以上のがん療法、例えば、化学療法、抗体、ワクチン又は生物剤のいずれか１つ以上で治療されている場合がある。対象は、寛解状態であってもよい。対象は、がん又は任意のがん関連遺伝子の突然変異／障害に罹りやすいと診断されているか又はされていないかのいずれであってもよい。
【0132】
血漿の体積は、配列決定された領域の所望のリード深度に依存し得る。例示的な体積は、０．４～４０ｍＬ、５～２０ｍＬ、１０～２０ｍＬである。例えば、体積は、０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、又は４０ｍＬであり得る。採取された血漿の体積は、５～２０ｍＬであってもよい。
【0133】
サンプルは、様々な量のゲノム等価物を含有する核酸を含み得る。例えば、約３０ｎｇのＤＮＡのサンプルは、約１０，０００（１０４）の一倍体ヒトゲノム等価物、そして無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の場合、約２０００億（２×ｌ０１１）の個別のポリヌクレオチド分子を含有し得る。同様に、約１００ｎｇのＤＮＡのサンプルは、約３０，０００の一倍体ヒトゲノム等価物、そしてｃｆＤＮＡの場合、約６０００億の個別分子を含有し得る。
【0134】
サンプルは、異なる供給源から、例えば、同じ対象の細胞及び無細胞から、異なる対象の細胞及び無細胞からの核酸を含み得る。サンプルは、突然変異を有する核酸を含み得る。例えば、サンプルは、生殖系列突然変異及び／又は体細胞突然変異を有するＤＮＡを含み得る。生殖系列突然変異は、対象の生殖系列ＤＮＡ中に存在する突然変異を指す。体細胞突然変異は、対象の体細胞内、例えばがん細胞内に起源を持つ突然変異を指す。サンプルは、がん関連突然変異（例えば、がん関連体細胞突然変異）を有するＤＮＡを含み得る。サンプルは、エピジェネティック変異体（即ち、化学又はタンパク質修飾）を含み得て、ここでエピジェネティック変異体は、がん関連突然変異などの遺伝子変異体の存在に関連する。いくつかの実施形態では、サンプルは、遺伝子変異体の存在に関連するエピジェネティック変異体を含み、ここでサンプルは、遺伝子変異体を含まない。
【0135】
サンプルは、無細胞核酸又はｃｆＤＮＡであってもよく、又はそれを含んでもよい。ｃｆＤＮＡは、例えば上記のような試験対象から得てもよい。例えば、分析用のサンプルは、無細胞核酸を含有する血漿又は血清であってもよい。「無細胞ＤＮＡ」「ｃｆＤＮＡ分子」、又は「ｃｆＤＮＡ」は、例えば、対象において細胞外形態（例えば、血液、血清、血漿、又は他の体液、例えば、リンパ、脳脊髄液、尿、若しくは痰）で天然に存在するＤＮＡ分子を含む。ｃｆＤＮＡが大規模な複雑な生物、例えば哺乳動物内の１つ以上の細胞内に最初から存在した一方で、それは細胞からインビボで生物内に見出される体液への放出を経ており、体液のサンプルを、インビトロ細胞溶解ステップを実施する必要なく取得することによって得ることができる。換言すれば、無細胞核酸又はＤＮＡは、細胞内に含まれない、若しくはそうでなければ細胞に結合されている核酸若しくはＤＮＡ、又は無傷細胞の除去後にサンプル中に残存している核酸若しくはＤＮＡである。無細胞核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそのハイブリッド、例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長鎖非翻訳ＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡ）、又はこれらのいずれかの断片を含む。無細胞核酸は、二本鎖、一本鎖、又はそのハイブリッドであり得る。無細胞核酸は、分泌又は細胞死プロセス、例えば、細胞壊死及びアポトーシスを通じて、体液に放出され得る。一部の無細胞核酸は、がん細胞から体液へ放出され、例えば、循環腫瘍ＤＮＡ、（ｃｔＤＮＡ）が挙げられる。その他は、健常細胞から放出される。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡは、無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、無細胞核酸は、腫瘍細胞によって生成される。いくつかの実施形態では、無細胞核酸は、腫瘍細胞と非腫瘍細胞の混合物によって生成される。
【0136】
増幅前のサンプル中の無細胞核酸の例示的な量は、約１ｆｇ～約１ｐｇ、例えば、１ｐｇ～２００ｎｇ、１ｎｇ～１００ｎｇ、１０ｎｇ～１０００ｎｇの範囲である。例えば、その量は、最大で約６００ｎｇ、最大で約５００ｎｇ、最大で約４００ｎｇ、最大で約３００ｎｇ、最大で約２００ｎｇ、最大で約１００ｎｇ、最大で約５０ｎｇ、又は最大で約２０ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。量は、少なくとも１ｆｇ、少なくとも１０ｆｇ、少なくとも１００ｆｇ、少なくとも１ｐｇ、少なくとも１０ｐｇ、少なくとも１００ｐｇ、少なくとも１ｎｇ、少なくとも１０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも１５０ｎｇ、又は少なくとも２００ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。量は、最大で１フェムトグラム（ｆｇ）、１０ｆｇ、１００ｆｇ、１ピコグラム（ｐｇ）、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、又は２００ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。方法は、サンプルから１フェムトグラム（ｆｇ）～２００ｎｇの無細胞核酸分子を得ることを含み得る。
【0137】
無細胞ＤＮＡは、対象からのその単離時に細胞内に含有されていないＤＮＡを指す。例えば、ｃｆＤＮＡは、細胞を溶解せず、又はそうでなければ細胞内ＤＮＡを抽出することなく、無傷細胞を除去した後にサンプル中に残存しているＤＮＡとして、サンプルから単離することができる。無細胞核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそのハイブリッド、例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長鎖非翻訳ＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡ）、又はこれらのいずれかの断片を含む。無細胞核酸は、二本鎖、一本鎖、又はそのハイブリッドであり得る。無細胞核酸は、分泌又は細胞死プロセス、例えば、細胞壊死及びアポトーシスを通じて体液中に放出され得る。一部の無細胞核酸は、がん細胞から体液中に放出され、例えば、循環腫瘍ＤＮＡ、（ｃｔＤＮＡ）が挙げられる。その他は、健常細胞から放出される。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡは、無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、無細胞核酸は、腫瘍細胞によって生成される。いくつかの実施形態では、無細胞核酸は、腫瘍細胞と非腫瘍細胞の混合物によって生成される。
【0138】
無細胞核酸は、約１００～５００ヌクレオチドの代表的なサイズ分布を有し、１１０～約２３０ヌクレオチドの分子は分子の約９０％を表し、約１６８ヌクレオチドのモードと２４０～４４０ヌクレオチドの範囲内に２番目のマイナーピークとを有する。
【0139】
無細胞核酸は、溶液中で見出される無細胞核酸が体液の無傷細胞及び他の非可溶性成分から分離される場合の分画又は分割ステップを通じて、体液から単離することができる。分割は、遠心分離又は濾過などの技術を含んでもよい。或いは、体液中の細胞を溶解させ、無細胞及び細胞核酸を一緒に処理することができる。一般に、緩衝液の添加及び洗浄ステップ後、核酸をアルコールで沈殿させることができる。さらに、シリカベースのカラムなど、クリーンアップステップを使用して、汚染物質又は塩を除去することができる。非特異的な大量の担体の核酸、例えば、Ｃ１ ＤＮＡ、バイサルファイト配列決定、ハイブリダイゼーション、及び／又はライゲーションのためのＤＮＡ又はタンパク質を、反応全体を通じて添加して、収率などの手順の特定の態様を最適化することができる。
【0140】
このような処理後、サンプルは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡを含む、核酸の様々な形態を含み得る。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡは、後の処理及び分析ステップに含められるように、二本鎖形態に変換することができる。
【0141】
サンプル中の二本鎖ＤＮＡ分子及び二本鎖ＤＮＡ分子に変換されている一本鎖核酸分子は、一方の末端又は両方の末端のいずれかでアダプターに連結することができる。典型的に、二本鎖分子は、全部で４つの標準ヌクレオチドの存在下で、５’－３’ポリメラーゼ及び３’－５’エキソヌクレアーゼ（又はプルーフリーディング機能）を有するポリメラーゼによる処理によって平滑末端化される。クレノウ大断片及びＴ４ポリメラーゼは、好適なポリメラーゼの例である。平滑末端化ＤＮＡ分子は、少なくとも部分的に、二本鎖アダプター（例えば、Ｙ形状又は釣鐘状のアダプター）とライゲートすることができる。或いは、相補的なヌクレオチドをサンプル核酸及びアダプターの平滑末端に付加して、ライゲーションを促進することができる。本明細書で企図されるのは、平滑末端ライゲーションと粘着末端ライゲーションの両方である。平滑末端ライゲーションでは、核酸分子とアダプタータグの両方が平滑末端を有する。粘着末端ライゲーションでは、典型的に、核酸分子は、「Ａ」オーバーハングを有し、アダプターは、「Ｔ」オーバーハングを有する。
【0142】
アダプターへのライゲーション
二本鎖核酸、例えば、サンプル中のＤＮＡ分子、及び二本鎖分子に変換されている一本鎖核酸分子は、一方の末端又は両方の末端のいずれかでアダプターに連結することができる。いくつかの場合、ＤＮＡは、例えば、ＤＮＡ分子の末端オーバーハングを伸長させ、アデノシン残基を断片の３’末端に付加し、各ＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化することによって、ライゲート可能になる。典型的に、二本鎖分子は、全部で４つの標準ヌクレオチドの存在下で、５’－３’ポリメラーゼ及び３’－５’エキソヌクレアーゼ（又はプルーフリーディング機能）を有するポリメラーゼによる処理によって平滑末端化される。クレノウ大断片及びＴ４ポリメラーゼは、好適なポリメラーゼの例である。
二本鎖核酸、例えば、サンプル中のＤＮＡ分子、及び二本鎖分子に変換されている一本鎖核酸分子は、一方の末端又は両方の末端のいずれかでアダプターに連結することができる。いくつかの場合、ＤＮＡは、例えば、ＤＮＡ分子の末端オーバーハングを伸長させ、アデノシン残基を断片の３’末端に付加し、各ＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化することによって、ライゲート可能になる。典型的に、二本鎖分子は、全部で４つの標準ヌクレオチドの存在下で、５’－３’ポリメラーゼ及び３’－５’エキソヌクレアーゼ（又はプルーフリーディング機能）を有するポリメラーゼによる処理によって平滑末端化される。クレノウ大断片及びＴ４ポリメラーゼは、好適なポリメラーゼの例である。
【0143】
平滑末端ＤＮＡ分子は、少なくとも部分的に、二本鎖のアダプター（例えば、Ｙ形状又は釣鐘状のアダプター）とライゲートすることができる。或いは、相補的なヌクレオチドをサンプル核酸及びアダプターの平滑末端に付加して、ライゲーションを促進することができる。本明細書で企図されるのは、平滑末端ライゲーションと粘着末端ライゲーションの両方である。平滑末端ライゲーションでは、核酸分子とアダプタータグの両方が平滑末端を有する。粘着末端ライゲーションでは、典型的に、核酸分子は、「Ａ」オーバーハングを有し、アダプターは、「Ｔ」オーバーハングを有する。
【0144】
ＤＮＡリガーゼ及びアダプターを付加して、サンプル中のＤＮＡ分子を一方の末端又は両方の末端でアダプターとライゲートする、即ち、適応したＤＮＡを形成する。本明細書で使用する場合、「アダプター」は、典型的に、少なくとも部分的に二本鎖である短い核酸（例えば、約５００未満、約１００未満若しくは約５０ヌクレオチド未満の長さ、又は末端から末端まで２０～３０、２０～４０、３０～５０、３０～６０、４０～６０、４０～７０、５０～６０、５０～７０、２０～５００、若しくは３０～１００塩基である）を指し、所与のサンプル核酸分子の末端にライゲートすることができる。いくつかの場合、２つのアダプターを単一のサンプル核酸分子にライゲートし、一方のアダプターをサンプル核酸分子の各末端にライゲートすることができる。
【0145】
アダプターは、両方の末端でアダプターによって隣接されているサンプル核酸分子の増幅を可能にする核酸プライマー結合部位、及び／又は配列決定適用、例えば様々な次世代配列決定（ＮＧＳ）適用におけるプライマー結合部位を含む、配列決定プライマー結合部位を含み得る。アダプターは、固体支持体にハイブリダイズするための配列、例えば、フローセル配列を含み得る。アダプターはまた、捕捉プローブの結合部位、例えば、フローセル支持体などに付着されたオリゴヌクレオチドを含み得る。アダプターはまた、サンプルインデックス及び／又は分子バーコードを含み得る。これらは、典型的に、増幅プライマー及び配列決定プライマー結合部位に対して、サンプルインデックス及び／又は分子バーコードが所与の核酸分子のアンプリコン及び配列決定リードに含まれるように位置づけられる。同じ又は異なる配列のアダプターは、サンプル核酸分子の各末端に連結され得る。いくつかの場合、同じ又は異なる配列のアダプターは、サンプルインデックス及び／又は分子バーコードがその配列において異なる点を除き、核酸分子の各末端に連結される。いくつかの実施形態では、アダプターは、Ｙ形状アダプターであり、ここで一末端は、本明細書に記載のように平滑末端化又はテール化され、それは、アダプターのテール内に対して１つ以上の相補的なヌクレオチドでさらに平滑末端化又はテール化されている核酸分子に連結する場合である。別の例示的な実施形態では、アダプターは、分析対象の核酸分子に連結するための平滑又はテール末端を含む釣鐘状のアダプターである。他の例示的なアダプターは、Ｔテール、Ｃテールアダプター又はヘアピン形状のアダプターを含む。例えば、ヘアピン形状のアダプターは、二本鎖部分が二本鎖ポリヌクレオチドに付着｛例えば、ライゲート）可能である場合、相補的な二本鎖部分及びループ部分を含み得る。ヘアピン形状の配列決定アダプターは、ポリヌクレオチド断片の両方の末端に付着して、複数回配列決定可能である環状分子を生成することができる。本開示の方法において使用されるアダプターは、１つ以上の既知の修飾ヌクレオシド、例えば、メチル化ヌクレオシドを含む。２つのアダプターがサンプル核酸に（各末端に１つ）ライゲートされる場合、アダプターの一方又は両方は、１つ以上の既知の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。典型的に、プライマー結合部位、配列決定プライマー結合部位、サンプルインデックス及び／又は分子バーコードは、存在する場合、変換手順の結果として塩基対特異性を変更する既知の修飾ヌクレオシドを含まない。
【0146】
いくつかの実施形態では、アダプターによって隣接されているサンプル核酸は、ＰＣＲ及び他の増幅方法によって増幅することができる。こうした増幅は、配列決定などの後続ステップに利用可能なＤＮＡの量を増加させるために用いることができ、再構成された配列を含むＤＮＡの選択的増幅に加えて実施することができる。例えば、この種の増幅は、ライブラリー調製の一部として（例えば、再構成された配列を含むＤＮＡの選択的増幅前）及び／又は（再構成された配列を含むＤＮＡの選択的増幅後となろう）標的化ライブラリーの調製後、実施することができる。増幅は、増幅対象のＤＮＡ分子に隣接するアダプター内のプライマー結合部位に結合するプライマーによって刺激することができる。増幅方法は、サーモサイクリングから得られる、変性、アニーリング及び伸長のサイクルを含み得る、又は転写媒介性増幅などの場合、等温であり得る。他の増幅方法は、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸配列に基づく増幅、及び自己持続的配列に基づく複製を含む。
【0147】
いくつかの実施形態では、本方法では、アダプターへの連結前に二本鎖核酸の少なくとも５０、６０、７０又は８０％の増幅をもたらす、Ｔテールアダプター及びＣテールアダプターとのｄｓＤＮＡライゲーションが実施される。好ましくは、本方法は、増幅された分子の量又は数を、Ｔテールアダプター単独によって実施される対照方法と比較して、少なくとも１０、１５又は２０％増加させる。
【0148】
いくつかの実施形態では、アダプターをＤＮＡ又はそのサブサンプルに付加することができる。アダプターは、本明細書の方法において、いずれかのポイントでＤＮＡにライゲートすることができる。いくつかの実施形態では、アダプターは、捕捉プローブを生成するためのＤＮＡへのプライマーのアニーリング前に、そのサンプル又はサブサンプルのＤＮＡにライゲートされる。いくつかのそのような実施形態では、アダプターライゲートＤＮＡは、捕捉プローブを生成するためのＤＮＡへのプライマーのアニーリング前に増幅される。いくつかの実施形態では、アダプターは、ＤＮＡが捕捉プローブと接触される前に、そのサンプル又はサブサンプルのＤＮＡにライゲートされる。いくつかの実施形態では、アダプターがライゲートされる対象のＤＮＡは、同じサンプル又はサブサンプル中に、捕捉プローブを生成するための鋳型として使用されるＤＮＡとして存在する。いくつかの実施形態では、アダプターがライゲートされる対象のＤＮＡは、捕捉プローブを生成するための鋳型として使用されるＤＮＡと異なるサンプル又はサブサンプル、例えば、第２のサンプル又は第１のサンプルの第２のサブサンプル中に存在する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡにライゲートされているアダプターは、捕捉プローブによって捕捉される。
【0149】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブを生成するために使用されるプライマーは、アダプターに対して相補的でなく、それ故、得られる捕捉プローブは、アダプターを含まない。したがって、アダプターライゲートＤＮＡは、アダプターを含まない捕捉プローブの存在下で、選択的に増幅することができる。同様に、アダプターライゲートＤＮＡは、アダプターを含まないＤＮＡから分離することができる。
【0150】
いくつかの実施形態では、開示される方法は、サンプル中のＤＮＡを分析することを含む。そのような方法では、アダプターをＤＮＡに付加することができる。これは、例えば、プライマーの５’部分にアダプターを提供することによって、増幅手順（ＰＣＲが使用される場合、これはライブラリーｐｒｅｐ－ＰＣＲ又はＬＰ－ＰＣＲと称することができる）と同時に、増幅ステップの前、又は後に行ってもよい。いくつかの実施形態では、アダプターは、他の手法、例えばライゲーションによって付加される。いくつかのそのような方法では、第１のアダプターは、一本鎖ＤＮＡへのライゲーションを含み得るライゲーションによって、核酸の３’末端に付加される。いくつかの実施形態では、任意の分割又は捕捉ステップの前に、第１のアダプターは、一本鎖ＤＮＡへの（例えば、その３’末端への）ライゲーションを含み得るライゲーションによって、核酸に付加される。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、分割及びライゲーション後に単離することができる。例えば、低メチル化画分は、アダプターとライゲート可能であり、次にライゲートされた低メチル化画分の一部分を使用して、再配列のための捕捉プローブを生成することができる。アダプターは、例えば、ユニバーサルプライマー及びＤＮＡポリメラーゼを使用する、二本鎖合成のためのプライミング部位として使用することができる。次に、第２のアダプターは、少なくともこの二本鎖分子の第２鎖の３’末端にライゲートすることができる。いくつかの実施形態では、第１のアダプターは、ビオチンなどのアフィニティータグを含み、第１のアダプターにライゲートされている核酸は、ストレプトアビジンなどのアフィニティータグに対する結合パートナーを含み得る固体支持体（例えば、ビーズ）に結合される。関連手順のさらなる考察においては、Ｇａｎｓａｕｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ８：７３７－７４８（２０１３）を参照されたい。一本鎖核酸に適合できる配列決定ライブラリー調製のための市販キット、例えば、Ｓｗｉｆｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＡｃｃｅｌ－ＮＧＳ（登録商標）Ｍｅｔｈｙｌ－Ｓｅｑ ＤＮＡライブラリーキットが利用可能である。いくつかの実施形態では、アダプターライゲーション後、核酸は増幅される、
【0151】
いくつかの実施形態では、アダプターは、タグの組み合わせの数において、同じ開始及び停止ポイントを有する２つの核酸が低い確率、例えば、９５、９９又は９９．９％でタグの同じ組み合わせを受ける結果となるのに十分な数の異なるタグを含む。アダプターは、同じタグを有するか又は異なるタグを有するかにかかわらず、同じ又は異なるプライマー結合部位を含み得るが、好ましくは、アダプターは同じプライマー結合部位を含む。
【0152】
いくつかの実施形態では、アダプターの付着後、核酸は、増幅を受ける。増幅では、例えば、アダプター内のプライマー結合部位を認識するユニバーサルプライマーを使用することができる。
【0153】
いくつかの実施形態では、アダプターの付着後、ＤＮＡ又はＤＮＡのサブサンプル又は一部分は分割され、ＤＮＡを、エピジェネティック修飾を有する核酸に優先的に結合する薬剤と接触させることが含まれる。核酸は、核酸が薬剤への結合からの修飾を有する程度が異なる、少なくとも２つの分割されたサブサンプルに分割される。例えば、薬剤が修飾を有する核酸に対して親和性を有する場合、修飾において（集団における中央値表現と比較して）過剰表現されている核酸は、薬剤に優先的に結合する一方で、修飾において過小表現されている核酸は、薬剤に結合しない、又は薬剤からより容易に溶出される。次に、核酸は、アダプター内のプライマー結合部位に結合しているプライマーから増幅され得る。分割は、アダプター付着前に代わりに実施することができ、いずれの場合でも、アダプターは、いずれの分割が分子で生じたかを特定する成分を含む差次的タグを含んでもよい。
【0154】
いくつかの実施形態では、核酸は、プライマー結合部位及びタグを含むＹ形状アダプターの両方の末端側で連結される。分子は増幅される。
【0155】
分子タグ付け
いくつかの実施形態では、サンプルの核酸分子は、サンプルインデックス及び／又は分子バーコード（一般に「タグ」と称される）でタグ付けされ得る。
いくつかの実施形態では、サンプルの核酸分子は、サンプルインデックス及び／又は分子バーコード（一般に「タグ」と称される）でタグ付けされ得る。
【0156】
タグ又はインデックスは、タグが会合される相手の分子の特徴を示す情報を含む分子、例えば核酸であり得る。例えば、分子は、（ある１つのサンプル中の分子を異なるサンプル中の分子と区別する）サンプルタグ又はサンプルインデックス、（ある１つの分割における分子を異なる分割における分子と区別する）分割タグ及び／又は（（固有及び非固有両方のタグ付けシナリオにおいて）異なる分子を互いから区別する分子タグ／分子バーコード／バーコードを有し得る。
【0157】
タギング戦略は、固有のタギング戦略及び非固有のタギング戦略に分割することができる。固有のタギングでは、サンプル中の分子の全て又は実質的に全ては、異なるタグを有することで、タグ情報単独に基づき、リードを元の分子に割り当てることができる。こうした方法において使用されるタグは、時として「固有タグ」と称される。非固有のタギングでは、同じサンプル中の異なる分子は、同じタグを有し得ることで、タグ情報に加わる他の情報を使用して、配列リードが元の分子に割り当てられる。こうした情報は、開始及び停止座標、分子を位置づける座標、開始又は停止座標単独などを含んでもよい。こうした方法において使用されるタグは、時として、「非固有タグ」と称される。したがって、サンプル中の全ての分子を固有にタグ付けすることは必要でない。それは、サンプル中の同定可能なクラス内に入る分子を固有にタグ付けするのに十分である。したがって、異なる同定可能なファミリー内の分子は、タグ付け分子の同一性についての情報を欠いていない、同じタグを有し得る。
【0158】
特定の実施形態では、タグは、１つのバーコード又はバーコードの組み合わせを含み得る。本明細書で使用する場合、「バーコード」という用語は、特定のヌクレオチド配列を有する核酸分子、又は状況に応じて、ヌクレオチド配列それ自体を指す。バーコードは、例えば、１０～１００ヌクレオチドを有し得る。バーコードの収集物は、特定の目的として所望されるとおり、縮重配列を有し得る、又は特定のハミング距離を有する配列を有し得る。それ故、例えば、分子バーコードは、１つのバーコード又は各々が分子の異なる末端に付着されている２つのバーコードの組み合わせで構成され得る。追加的に、又は代替的に、異なる画分及び／又はサンプルの場合、分子バーコード、分子タグ、又は分子インデックスの異なるセットを使用して、バーコードがそれら個別の配列を通じた分子タグとして役立つだけでなく、それらがメンバーであるセットに基づいてそれらが対応する画分及び／又はサンプルを同定するために役立つことが可能である。
【0159】
いくつかの実施形態では、２つ以上の画分、例えば、各画分は、差次的にタグ付けされる。タグを使用して、個別のポリヌクレオチド集団の画分を標識することで、タグ（ｔａｇ）（又はタグ（ｔａｇｓ））を特定の画分と相関させるができる。或いは、タグは、分割ステップを用いない本開示の実施形態において使用することができる。いくつかの実施形態では、単一のタグを使用して、特定の画分を標識することができる。いくつかの実施形態では、複数の異なるタグを使用して、特定の画分を標識することができる。複数の異なるタグを使用して、特定の画分を標識する実施形態では、１つの画分を標識するために使用されるタグのセットは、他の画分を標識するために使用されるタグのセットに対して容易に区別することができる。いくつかの実施形態では、タグは、追加的機能を有してもよく、例えば、タグを使用して、サンプル源を示すことができる、又は固有の分子識別子として使用することができる（使用することで、配列決定エラーを突然変異と区別することによって配列決定データの質を改善することができる、例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８：９５３０－９５３５（２０１１），Ｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ０ＮＥ，１１：ｅ０１４６６３８（２０１６））などの場合、又は例えば、米国特許第９，５９８，７３１号明細書に記載されるとおり、非固有の分子識別子として使用することができる。同様に、いくつかの実施形態では、タグは、追加的機能を有し得る、例えば、タグを使用して、サンプル源を示すことができる、又は非固有の分子識別子として使用することができる（使用することで、配列決定エラーを突然変異と区別することによって配列決定データの質を改善することができる）。
【0160】
タグは、中でも、化学合成、ライゲーション（例えば、上記のとおり、例えば、平滑末端ライゲーション又は粘着末端ライゲーションによる）、又は重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、アダプターに組み込むか、又はそうでなければアダプターに連結してもよい。こうしたアダプターは、結局は標的核酸分子に連結される。他の実施形態では、１ラウンド以上の増幅サイクル（例えば、ＰＣＲ増幅）を適用して、従来の核酸増幅方法を用いて、サンプルインデックスを核酸分子に導入することができる。増幅は、１つ以上の反応混合物（例えば、アレイ内の複数のマイクロウェル）において実施してもよい。分子バーコード及び／又はサンプルインデックスは、同時に、又は任意の逐次的順序で導入してもよい。いくつかの実施形態では、分子バーコード及び／又はサンプルインデックスは、変換手順の前及び／又は後に導入される。いくつかの実施形態では、分子バーコード及び／又はサンプルインデックスは、配列捕捉ステップ（存在する場合）が実施される前及び／又は後に導入される。いくつかの実施形態では、分子バーコードに限り、プローブ捕捉前に導入され、サンプルインデックスは、配列捕捉ステップが実施された後に導入される。いくつかの実施形態では、分子バーコードとサンプルインデックスの両方は、プローブベースの捕捉ステップ（存在する場合）を実施する前に導入される。いくつかの実施形態では、サンプルインデックスは、配列捕捉ステップ（存在する場合）が実施された後に導入される。いくつかの実施形態では、サンプルインデックスは、重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を通じて組み入れられる。
【0161】
いくつかの実施形態では、タグは、サンプル核酸分子の一方の末端又は両方の末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、タグは、所定の又は無作為若しくは準無作為なオリゴヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、タグは、共に約５００、２００、１００、５０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１ヌクレオチド未満の長さであってもよい。典型的に、タグは、約５～２０又は６～１５ヌクレオチドの長さである。タグは、無作為に又は非無作為にサンプル核酸に連結されてもよい。
【0162】
いくつかの実施形態では、各サンプル又は画分（以下に考察される）は、サンプルインデックス又はサンプルインデックスの組み合わせで固有にタグ付けされる。いくつかの実施形態では、サンプル又はサブサンプルの各核酸分子は、分子バーコード又は分子バーコードの組み合わせで固有にタグ付けされる。他の実施形態では、複数の分子バーコードを使用して、分子バーコードが複数において必ずしも互いに固有でない（例えば、非固有の分子バーコード）ようにしてもよい。これらの実施形態では、分子バーコードは、一般に（例えば、ライゲーションによって）個別分子に付着されることで、分子バーコード及びそれが付着され得る配列の組み合わせにより、個別に追跡可能な固有の配列が作出される。内因性配列情報（例えば、初期（開始）及び／若しくは終了（停止）ゲノム位置／サンプル中の元の核酸分子の配列に対応する位置、サンプル中の元の核酸分子の配列に対応する開始及び停止ゲノム位置、初期（開始）及び／若しくは終了（停止）ゲノム位置／参照配列に位置づけられている配列リードの位置、参照配列に位置づけられている配列リードの開始及び停止ゲノム位置、一方若しくは両方の末端の配列リードの下位配列、配列リードの長さ、並びに／又はサンプル中の元の核酸分子の長さ）と組み合わせた非固有の分子バーコードの検出は、典型的に、固有の同一性の特定分子への割り当てを可能にする。いくつかの実施形態では、初期領域は、参照配列に整列する配列決定リードの５’末端での最初の１、最初の２、最初の５、最初の１０、最初の１５、最初の２０、最初の２５、最初の３０又は少なくとも最初の３０塩基位置を含む。いくつかの実施形態では、末端領域は、参照配列に整列する配列決定リードの３’末端での最終の１、最終の２、最終の５、最終の１０、最終の１５、最終の２０、最終の２５、最終の３０又は少なくとも最終の３０塩基位置を含む。また、個別の配列リードの長さ、又は塩基対の数を任意選択的に使用して、固有の同一性が所与の分子に割り当てられる。それにより、本明細書に記載のとおり、固有の同一性が割り当てられている核酸の一本鎖からの断片は、親鎖、及び／又は相補鎖からの断片のその後の同定を可能にし得る。
【0163】
非固有のタグ付けの特定の実施形態では、使用される異なるタグの数は十分であり得て、特定基の全てのＤＮＡ分子が異なるタグを有する可能性は非常に高い（例えば、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．９９％又は少なくとも９９．９９９％。バーコードがタグとして使用される場合、またバーコードが例えば無作為に分子の両方の末端に付着される場合、バーコードの組み合わせが一緒にタグを構成し得ることは注目されるべきである。この数は、項において、要件に該当する分子の数の関数である。例えば、クラスは、参照ゲノム上の同じ開始－停止位置に位置している全ての分子であってもよい。クラスは、特定の遺伝子座、例えば、特定の塩基又は特定の領域（例えば、最大で１００の塩基又は遺伝子又は遺伝子のエクソン）を通じて位置している全ての分子であってもよい。特定の実施形態では、クラス内の分子の数ｚを固有に特定するために使用される異なるタグの数は、２＊ｚ、３＊ｚ、４＊ｚ、５＊ｚ、６＊ｚ、７＊ｚ、８＊ｚ、９＊ｚ、１０＊ｚ、１１＊ｚ、１２＊ｚ、１３＊ｚ、１４＊ｚ、１５＊ｚ、１６＊ｚ、１７＊ｚ、１８＊ｚ、１９＊ｚ、２０＊ｚ又は１００＊ｚのいずれか（例えば、下限）と１００，０００＊ｚ、１０，０００＊ｚ、１０００＊ｚ又は１００＊ｚのいずれか（例えば、上限）との間であり得る。いくつかの実施形態では、分子バーコードは、識別子のセット（例えば、固有又は非固有の分子バーコードの組み合わせ）のサンプル中の分子に対する予想される比で導入される。フォーマットの一例では、標的分子の両方の末端にライゲートされている、約２～約１，０００，０００の異なる分子バーコード配列、又は約５～約１５０の異なる分子バーコード配列、又は約２０～約５０の異なる分子バーコード配列が使用される。或いは、約２５～約１，０００，０００の異なる分子バーコード配列を使用してもよい。例えば、２０－５０×２０－５０の分子バーコード配列（即ち、２０－５０の異なる分子バーコード配列の１つが標的分子の各末端に付着され得る）を使用することができる。識別子のかかる数は、典型的に、識別子の異なる組み合わせを受ける高い確率（例えば、少なくとも９４％、９９．５％、９９．９９％、又は９９．９９９％）を有するように、同じ開始及び停止ポイントを有する異なる分子にとって十分である。いくつかの実施形態では、分子の約８０％、約９０％、約９５％、又は約９９％は、分子バーコードの同じ組み合わせを有する。
【0164】
例えば、約５ｎｇ～３０ｎｇの無細胞ＤＮＡのサンプル中で、特定のヌクレオチド座標に位置づけるためにおよそ３０００個の分子、また同じ停止座標を共有するために任意の開始座標を有する約３～１０個の分子が予想される。したがって、約５０～約５０，０００の異なるタグ（例えば、約６～２２０のバーコードの組み合わせ）は、全てのかかる分子を固有にタグ付けするのに十分であり得る。ヌクレオチド座標を通じて位置づけている全部で３０００個の分子を固有にタグ付けするため、約１００万～約２０００万の異なるタグが必要となろう。
【0165】
いくつかの実施形態では、反応物における固有又は非固有の分子バーコードの割り当ては、例えば、米国特許出願公開第２００１００５３５１９号明細書、米国特許出願公開第２００３０１５２４９０号明細書、及び米国特許出願公開第２０１１０１６００７８号明細書、及び米国特許第６，５８２，９０８号明細書、米国特許第７，５３７，８９８号明細書、米国特許第９，５９８，７３１号明細書、及び米国特許第９，９０２，９９２号明細書（これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されている方法及びシステムを用いて実施される。或いは、いくつかの実施形態では、サンプルの異なる核酸分子は、内因性配列情報（例えば、開始及び／若しくは停止位置、配列の一方若しくは両方の末端の下位配列、並びに／又は長さ）のみを用いて同定してもよい。
【0166】
いくつかの実施形態では、タグ付け核酸は、マイクロウェルプレートへの負荷後、配列決定される。マイクロウェルプレートは、９６、３８４、又は１５３６マイクロウェルを有し得る。いくつかの場合、それらは、固有のタグ対マイクロウェルの予想される比で導入される。例えば、固有のタグは、ゲノムサンプル当たり、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００又は１，０００，０００，０００を超える固有のタグが負荷されるように負荷されてもよい。いくつかの場合、固有のタグは、ゲノムサンプル当たり、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００又は１，０００，０００，０００未満の固有のタグが負荷されるように負荷されてもよい。いくつかの場合、ゲノムサンプル当たり負荷されている固有のタグの平均数は、ゲノムサンプル当たり、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００、５０，０００、１００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００又は１，０００，０００，０００未満の、又はそれを超える固有のタグである。
【0167】
好ましいフォーマットでは、標的核酸の両方の末端にライゲートされている２０～５０の異なるタグ（例えば、バーコード）が使用される。例えば、標的分子の両方の末端にライゲートされている３５の異なるタグ（例えば、バーコード）は、３５のタグに対して１２２５に相当する、３５×３５の並べ替えを生じさせる。タグのかかるメンバーは、同じ開始及び停止ポイントを有する異なる分子が、タグの異なる組み合わせを受ける高い確率（例えば、少なくとも９４％、９９．５％、９９．９９％、９９．９９９％）を有するのに十分である。他のバーコードの組み合わせは、１０～５００の任意の数、例えば、約１５×１５、約３５×３５、約７５×７５、約１００×１００、約２５０×２５０、約５００×５００を含む。
【0168】
いくつかの場合、固有のタグは、所定の又は無作為な若しくは準無作為なオリゴヌクレオチド配列であってもよい。他の場合、複数のバーコードを、バーコードが複数において必ずしも互いに固有でないように使用してもよい。この例において、バーコードが個別の分子にライゲートされ得ることで、バーコード及びそれがライゲートされ得る配列の組み合わせにより、個別に追跡可能な固有の配列が作出される。本明細書に記載のとおり、配列リードの初期（開始）及び終了（停止）部分の配列データと組み合わせた非固有のバーコードの検出は、固有の同一性の特定分子への割り当てを可能にし得る。また、個別の配列リードの長さ又は塩基対の数を使用して、固有の同一性をこうした分子に割り当てることができる。それにより、本明細書に記載のとおり、固有の同一性が割り当てられている核酸の一本鎖からの断片は、親鎖からの断片のその後の同定を可能にし得る。
【0169】
いくつかの実施形態では、方法は、内部対照ＤＮＡを増幅するため、１つ以上の内部対照ＤＮＡ並びにフォワード及びリバースプライマーを付加することを含む。内部対照ＤＮＡは、再配列ブレークポイントの上流及び下流をアニールするプライマーを使用する増幅前に付加してもよい。内部対照ＤＮＡを増幅するためのフォワード及びリバースプライマーは、再配列ブレークポイントの上流及び下流をアニールするプライマーとともに含めてもよい、又はそれと同時に付加してもよい。内部対照ＤＮＡは、対象のゲノム中に存在しない、又は対象がメンバーである種のゲノム（例えば、ヒトゲノム）中に存在しない配列を含んでもよい、又はそれらから構成されてもよい。内部対照ＤＮＡを増幅するためのフォワード及び／又はリバースプライマーは、対象のゲノム、例えばヒトゲノム中の任意の配列に相補的でない配列を含んでもよい。内部対照ＤＮＡを使用することで、増幅プロセスが設計通りに進行したことを保証することができる。こうしたことから、方法は、１つ以上の内部対照ＤＮＡから増幅されている分子及び／又はそれによって捕捉されている分子を検出する（例えば、配列決定する）ことを含んでもよい。方法は、内部対照ＤＮＡの量（例えば、内部対照ＤＮＡ配列に対応する、検出されている分子又はリードの数）を所定の閾値と比較することと、所定の閾値が満たされない場合に配列決定結果を拒絶するか又は所定の閾値が満たされる場合に配列決定結果を受け入れることと、を含み得る。所定の閾値は、例えば、ヒストリカルデータに基づき、又は試験対象、例えば健常ボランティアからのＤＮＡのサンプルに対して方法を試験することによって確立することができる。例えば、１つ以上の内部対照ＤＮＡの増幅及び検出は、増幅プロセスが適切に進行し、それ故、偽陰性の可能性が低減されることの確証をもたらす。
【0170】
変換手順
本明細書で開示される方法に記載されるとおり、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの使用は、修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変換する変換手順（例えば、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換）又は非修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変換する変換手順（例えば、バイサルファイト変換）によって有利に用いることができる。例えば、いくつかの実施形態では、２つ以上の品質管理ヌクレオシドを含有するアダプターを含む分子が、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するために選択される変換手順に曝露される場合、品質管理ヌクレオシドの第１の部分（例えば、少なくとも１つ）の塩基対特異性は変更されるが、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの第２の部分（例えば、少なくとも１つ）の塩基対特異性は影響を受けず、それは準最適な変換を示し得る。本明細書で開示される方法に記載されるとおり、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの使用は、ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの偽陰性検出及び／若しくは同定（即ち、塩基を修飾されていないとして不正確に同定する）並びに／又はＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの偽陽性検出及び／若しくは同定（即ち、塩基を修飾されているとして不正確に同定する）を予測／推測／指示するために有利に用いることができる。修飾ヌクレオシドの偽陽性検出の発生を検出するための使用を意図した本明細書に記載される品質管理ヌクレオシドは、「偽陽性品質管理ヌクレオシド」と称してもよい。修飾ヌクレオシドの偽陰性検出の発生を検出するための使用を意図した本明細書に記載される品質管理ヌクレオシドは、「偽陰性品質管理ヌクレオシド」と称してもよい。修飾状態を有するヌクレオシドであって、特定の変換手順に曝露されるときにその塩基対特異性が変更されないことを意味するものは、いくつかの場合、「保護された」ヌクレオシド又は「保護された修飾状態」又は類するものを有すると称してもよい。
本明細書で開示される方法に記載されるとおり、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの使用は、修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変換する変換手順（例えば、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換）又は非修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変換する変換手順（例えば、バイサルファイト変換）によって有利に用いることができる。例えば、いくつかの実施形態では、２つ以上の品質管理ヌクレオシドを含有するアダプターを含む分子が、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更するために選択される変換手順に曝露される場合、品質管理ヌクレオシドの第１の部分（例えば、少なくとも１つ）の塩基対特異性は変更されるが、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの第２の部分（例えば、少なくとも１つ）の塩基対特異性は影響を受けず、それは準最適な変換を示し得る。本明細書で開示される方法に記載されるとおり、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの使用は、ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの偽陰性検出及び／若しくは同定（即ち、塩基を修飾されていないとして不正確に同定する）並びに／又はＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシドの偽陽性検出及び／若しくは同定（即ち、塩基を修飾されているとして不正確に同定する）を予測／推測／指示するために有利に用いることができる。修飾ヌクレオシドの偽陽性検出の発生を検出するための使用を意図した本明細書に記載される品質管理ヌクレオシドは、「偽陽性品質管理ヌクレオシド」と称してもよい。修飾ヌクレオシドの偽陰性検出の発生を検出するための使用を意図した本明細書に記載される品質管理ヌクレオシドは、「偽陰性品質管理ヌクレオシド」と称してもよい。修飾状態を有するヌクレオシドであって、特定の変換手順に曝露されるときにその塩基対特異性が変更されないことを意味するものは、いくつかの場合、「保護された」ヌクレオシド又は「保護された修飾状態」又は類するものを有すると称してもよい。
【0171】
修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変換する変換手順を用いて偽陰性を検出する場合、アダプター内の品質管理ヌクレオシドは、変換手順／準最適な変換の変換効率が測定でき、それ故、偽陰性の頻度が予測できるような修飾ヌクレオシドを含んでもよい。準最適な変換は、通常変換する変換手順；例えば、Ｔｅｔ酵素及びピリジンボラン（例えば、ＴＡＰＳ中）による準最適な変換において使用される試薬が、一部であるが全部でない５ｍＣ及び５ｈｍＣのジヒドロウラシルへの変換をもたらすようなタイプの全てに満たないヌクレオシドの変換を指す。準最適（ｓｕｂ－ｏｐｔｉｍａｌ）及び準最適な（ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌ）という用語は、等価な意味を有する。準最適な変換はまた、完全反応における変換手順によって変換されているはずである一部のヌクレオシド（修飾又は非修飾）が実際には変換されなかったという意味で、不完全変換と称してもよい。
【0172】
非修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変換する変換手順を用いて偽陽性を検出する場合、アダプター内の品質管理ヌクレオシドは、修飾ヌクレオシドの誤った変換頻度が測定でき、それ故、偽陽性の頻度が予測できるような修飾ヌクレオシドを含んでもよい。誤った変換は、典型的に変換手順によって変換されるヌクレオシド以外のヌクレオシドの変換を指す。（典型的に非修飾シトシンのみを変換する）バイサルファイト変換によるメチル化シトシンの変換は、誤った変換の例である。
【0173】
修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変換する変換手順を用いて偽陽性を検出する場合、アダプター内の品質管理ヌクレオシドは、非修飾ヌクレオシドの誤った変換頻度が測定でき、それ故、偽陽性の頻度が予測できるような非修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
【0174】
非修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変換する変換手順を用いて偽陽性を検出する場合、アダプター内の品質管理ヌクレオシドは、変換手順／準最適な変換の変換効率が測定でき、それ故、偽陽性の頻度が予測できるような非修飾ヌクレオシドを含んでもよい。
【0175】
ヌクレオシドの修飾状態に基づく、ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順に応じて、修飾ヌクレオシドを検出し、且つ／又は同定する様々な方法が存在する。次に、配列決定により、塩基対特異性のこれらの変更が検出でき、それ故、ヌクレオシドの修飾状態が推測できる。
【0176】
いくつかの場合、本開示の方法において使用される変換手順は、修飾ヌクレオシド（例えば、メチル化シトシン）の塩基対特異性を変更するが、対応する非修飾ヌクレオシド（例えば、シトシン）の塩基対特異性を変更しない、又は任意の非修飾ヌクレオシド（例えば、シトシン、アデノシン、グアノシン及びチミジン（又はウラシル））の塩基対特異性を変更しないものである。非修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変換しない方法の利点は、配列複雑性の喪失の減少、より高い配列決定効率及びアラインメント欠損の減少を含む。加えて、ＴＡＰＳなどの方法は、いくつかの場合、破壊性がより低く（ｃｆＤＮＡなどの低収率のサンプルにとって特に重要である）、変性を必要とせず、非変換のエラーが理論的に無作為である可能性がより高いことを意味することから、バイサルファイト配列決定及びＥＭ－ｓｅｑなどの方法よりも好ましいことがある（図１参照）。変換のために変性を必要とする方法では、ＤＮＡ分子を変性しないことから、ＤＮＡ分子中の全ての塩基の非変換がもたらされる。メチル化における生物学的変化が主に目的の局在化領域に協調されることから、これらの非無作為（局在化）変換は、偽陰性（非メチル化領域）として認めることができる。無作為な非変換方法は、領域内の低いパーセントの塩基に最大限影響する可能性があり、それ故、メチル化変化検出の特異性は、メチル化／非メチル化されている領域内の塩基の％で閾値を設けることによって最大化される（偽陽性を低減する）可能性がある。それ故、いくつかの場合、変性を含まない変換手順が好ましい。
【0177】
いくつかの実施形態では、アダプターは、（例えば、修飾された、例えばメチル化された）第１の修飾状態を有する第１の品質管理ヌクレオシド及び（例えば、修飾されていない）第２の修飾状態を有する第２の品質管理ヌクレオシドを含む。そのようなアダプターを使用して、準最適な変換及び誤った変換の両方を検出することができる。
【0178】
図３は、ＴＡＰＳ塩基変換手順を受けているＤＮＡの偽陰性及び／又は偽陽性検出を監視するための品質管理方法の実施形態を示す。（例えば、分子バーコードにおいて）５ｍＣを含有するアダプターは、ＤＮＡにライゲートされ、次にＴＡＰＳ変換手順を受けることで、メチル化シトシン（「Ｔ」としての配列リード）の塩基対合が変更され、非メチル化シトシン（さらに「Ｃ」としてのリード）の場合は変更されない。各鎖は、配列決定される。準最適な変換を受けた分子が同定され、少なくともメチル化の判定を目的として、濾過・除去され得る。いくつかの実施形態では、準最適な変換を受けた分子は、０／２のバーコード５ｍＣがＴに変換される場合のｓｓＤＮＡ分子を含む。サンプル変換率は、全ての変換されたバーコード５ｍＣをバーコード５ｍＣの合計で割ることによって計算することができる（この場合、３１／３６＝８６％のＴＡＰＳ変換率）。
【0179】
他の場合、本開示の方法において使用される変換手順は、非修飾ヌクレオシド（例えば、シトシン）の塩基対特異性を変更するが、対応する修飾ヌクレオシド（例えば、メチル化シトシン）の塩基対特異性を変更しないものである。こうした方法は、例えば、バイサルファイト配列決定を含む。
【0180】
当業者は、好適な方法を、どのヌクレオシド修飾が検出及び／又は同定されるべきであるかを含む、その必要性に応じて選択することができる。
【0181】
いくつかの実施形態では、変換手順は、修飾ヌクレオシドを変換する。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドを変換する変換手順は、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換を含み、任意選択的に、置換されたボラン還元剤は、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、アンモニアボラン又はピリジンボランである。置換されたボラン還元剤変換によるＴｅｔ補助ｐｉｃ－ボラン変換では、ＴＥＴタンパク質を使用して、ｍＣ及びｈｍＣが、非修飾Ｃに影響することなく、ｃａＣに変換される。次いで、ｃａＣ、及びｆＣは、存在する場合、２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ボラン）又はボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、若しくはアンモニアボランなどの別の置換されたボラン還元剤による処理により、やはり非修飾Ｃに影響することなく、ジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に変換される。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９；３７：４２４－４２９（例えば、付録の図１及び付録の注７）を参照されたい。ＤＨＵは、配列決定においてＴとして解読される。したがって、このタイプの変換が用いられる場合、第１の核酸塩基は、ｍＣ、ｆＣ、ｃａＣ、又はｈｍＣの１つ以上を含み、第２の核酸塩基は、非修飾シトシンを含む。変換されたＤＮＡの配列決定では、非修飾Ｃの位置であるシトシンとして解読されている位置が同定される。一方で、Ｔとして解読されている位置は、Ｔ、ｍＣ、ｆＣ、ｃａＣ、又はｈｍＣであるとして同定される。それ故、ＴＡＰ変換の実施により、得られた配列リードを用いて、非修飾Ｃを含有する位置の特定が容易になる。それ故、これらの実施形態では、方法において使用されるアダプター内の品質管理ヌクレオシドは、メチル－シトシン（５ｍＣ）及び／又はヒドロキシメチル－シトシン（ｈｍＣ）を含む。この手順は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２０１９、上記にさらに詳細に記載されている、Ｔｅｔ補助ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）を包含する。この方法では、Ｔｅｔ酵素を使用して、５ｍＣ及び５ｈｍＣを５ｆＣ又は５ＣａＣに次第に酸化して、次にピリジンボランが５ｆＣ、５ＣａＣをＤＨＵに脱アミノ化する（Ｔとして増幅される）。この手順は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２０１９、上記にさらに詳細に記載されている、Ｔｅｔ補助ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）を包含する。
【0182】
或いは、（例えば、βＧＴを用いる）ｈｍＣの保護は、例えば、上記のとおり、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換と組み合わせることができる。この方法（ＴＡＰＳ－β）では、ｈｍＣは、例えば、ｇｈｍＣを形成する（５－グルコシルヒドロキシメチルシトシンを形成する）β－グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）を用いるグルコシル化を通じて、変換から保護することができる。これは、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１２；１４９：１３６８－８０に記載されている。次に、ｍＴｅｔ１などのＴＥＴタンパク質による処理は、ｍＣをｃａＣに変換するが、Ｃ又はｇｈｍＣを変換しない。次に、ｃａＣは、ｐｉｃ－ボラン又はボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、若しくはアンモニアボランなどの別の置換されたボラン還元剤による処理によってＤＨＵに変換されるが、やはり非修飾Ｃ又はｇｈｍＣに影響しない。変換されたＤＮＡの配列決定では、ｈｍＣ又は非修飾Ｃのいずれかの位置であるシトシンとして解読されている位置が同定される。一方、Ｔとして解読されている位置は、Ｔ、ｆＣ、ｃａＣ、又はｍＣであるとして同定される。それ故、本明細書に記載されるサンプルに対するＴＡＰＳβ変換の実施により、非修飾Ｃ又はｈｍＣを含有する位置を、一方ではｍＣを含有する位置と、得られた配列リードを用いて区別することが容易になる。それ故、これらの実施形態では、方法において使用されるアダプター内の品質管理ヌクレオシドは、典型的に、メチル－シトシン（５ｍＣ）及びヒドロキシメチル－シトシン（ｈｍＣ）の両方を含んでもよい。これは、２つのステップのそれぞれの効率を別々に決定することを可能にする。例えば、アダプターの配列決定が５ｍＣ及びｈｍＣヌクレオシドの両方が塩基対特異性を変換していることを示す場合、これはｈｍＣの保護ステップが無効であったことを示す。５ｍＣヌクレオシドもｈｍＣヌクレオシドのいずれも塩基対特異性を変換していない場合、これは（少なくとも）Ｔｅｔ補助変換が無効であったことを示す。アダプター内のｍＣヌクレオシドの塩基対合が塩基対特異性を変換しているが、ｈｍＣヌクレオシドの場合には変換していない場合、両方のステップが有効であった。或いは、ちょうど一方のステップ又は他方の効率は、ちょうどｍＣ又はｈｍＣをアダプター内の品質管理ヌクレオシドとして含めることによって判定することができた。変換の効率及び／又は保護ステップが無効であったか否かの判定を用いて、本明細書で開示される方法において定義する場合、準最適な変換が存在するか否かを判定することができる。このタイプの変換の例示的説明については、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９；３７：４２４－４２９を参照されたい。
【0183】
修飾ヌクレオシドの準最適な変換のために制御することに加えて、アダプター内の品質管理ヌクレオシドを使用して、偽陽性（即ち、修飾されていると誤って分類されているヌクレオシド）を予測することもできる。この場合、アダプター内の品質管理ヌクレオシドは、適切な変換手順の場合、非修飾Ｃを含む。アダプターの配列決定で、品質管理ヌクレオシドが塩基対特異性を変換していることを示す場合、これは非修飾塩基（例えば、非修飾Ｃ）が誤って変換されていることを示す。次に、この情報を用いて、ＤＮＡサンプル中の修飾ヌクレオシド（例えば、修飾Ｃ）の偽陽性検出を予測することができる。
【0184】
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシドを変換する変換手順は、置換されたボラン還元剤による化学的な補助変換を含み、任意選択的に、置換されたボラン還元剤は、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、ボランピリジン又はアンモニアボランである。置換されたボラン還元剤による化学的な補助変換では、（ｏｘ－ＢＳ変換における使用にも適する）過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）などの酸化剤を使用して、ｈｍＣがｆＣに特異的に酸化される。ｐｉｃ－ボラン又はボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、若しくはアンモニアボランなどの別の置換されたボラン還元剤による処理は、ｆＣ及びｃａＣをＤＨＵに変換するが、ｍＣ又は非修飾Ｃに影響しない。変換されたＤＮＡの配列決定により、ｍＣ又は非修飾Ｃのいずれかの位置であるシトシンとして解読されている位置が同定される。一方で、Ｔとして解読されている位置は、Ｔ、ｆＣ、ｃａＣ、又はｈｍＣであるとして同定される。それ故、本明細書に記載されるこのタイプの変換の実施により、一方では非修飾Ｃ又はｍＣを含有する位置を、得られた配列リードを用いて、ｈｍＣを含有する位置と区別することが容易になる。それ故、これらの実施形態において、そして偽陰性（即ち、修飾されていないと誤って分類されているヌクレオシド）について制御する場合、方法において使用されるアダプターは、ヒドロキシメチル－シトシン（ｈｍＣ）を含む。このタイプの変換の例示的説明については、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９；３７：４２４－４２９を参照されたい。
【0185】
修飾シトシンの塩基対特異性を変更する例示的な変換手順が記載されている。しかし、本明細書に記載の方法では、原則として、任意の修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する好適な変換手順（即ち、一塩基のエピジェネティック変換アッセイ）を使用することができたが、それにより、配列決定の際、修飾塩基を、対応する非修飾ヌクレオシド及び／又は修飾の他のタイプと区別することを可能にする。例えば、任意の変換手順を使用して、Ｎ６－メチルアデニン（ｍＡ）、Ｎ６－ヒドロキシメチルアデニン（ｈｍＡ）、又はＮ６－ホルミルアデニン（ｆＡ）のいずれか１つを、Ｎ６－メチルアデニン（ｍＡ）、Ｎ６－ヒドロキシメチルアデニン（ｈｍＡ）、又はＮ６－ホルミルアデニン（ｆＡ）の任意の他の１つ以上、及び／又は対応する非修飾ヌクレオシド、即ち、非修飾アデノシンと区別することを可能にできた。
【0186】
いくつかの実施形態では、変換手順は、非修飾ヌクレオシドを変換する。いくつかの実施形態では、非修飾ヌクレオシドを変換する変換手順は、バイサルファイト変換を含む。バイサルファイトによる処理は、非修飾シトシン及び特定の修飾シトシンヌクレオチド（例えば、５－ホルミルシトシン（ｆＣ）又は５－カルボキシルシトシン（ｃａＣ））をウラシルに変換する一方で、他の修飾シトシン（例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン（ｈｙｄｒｏｘｙｌｍｅｔｈｙｌｃｙｓｔｏｓｉｎｅ））は変換されない。したがって、バイサルファイト変換が用いられる場合、変換された核酸塩基は、バイサルファイトによる影響を受ける、非修飾シトシン、５－ホルミルシトシン、５－カルボキシルシトシン、又は他のシトシン形態の１つ以上を含むことが推測される。変換されていない核酸塩基は、ｍＣ及びｈｍＣの１つ以上を含むことが推測される。バイサルファイト処理されたＤＮＡの配列決定では、ｍＣ又はｈｍＣ位置であるシトシンとして解読されている位置が同定される。一方で、Ｔとして解読されている位置は、Ｔ又はＣのバイサルファイト感受性形態、例えば、非修飾シトシン、５－ホルミルシトシン、又は５－カルボキシルシトシンであるとして同定される。それ故、本明細書に記載されるバイサルファイト変換の実施により、ｍＣ又はｈｍＣを含有する位置を特定することが容易になる。バイサルファイト変換の例示的説明については、例えば、Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８；９：５０６８を参照されたい。
【0187】
いくつかの実施形態では、非修飾ヌクレオシドを変換する手順は、酸化バイサルファイト（Ｏｘ－ＢＳ）変換を含む。この手順では、最初にｈｍＣをｆＣ（バイサルファイト感受性である）に変換し、続いてバイサルファイト変換を行う。したがって、酸化バイサルファイト変換が用いられる場合、変換された核酸塩基は、バイサルファイトによる影響を受ける、非修飾シトシン、ｆＣ、ｃａＣ、ｈｍＣ、又は他のシトシン形態の１つ以上を含むことが推測される。変換されていない核酸塩基は、ｍＣを含むことが推測される。Ｏｘ－ＢＳ変換されたＤＮＡの配列決定では、ｍＣ位置であるシトシンとして解読されている位置が同定される。一方で、Ｔとして解読されている位置は、Ｔ、ｈｍＣ、又はＣのバイサルファイト感受性形態、例えば、非修飾シトシン、ｆＣ、又はｈｍＣであるとして同定される。それ故、Ｏｘ－ＢＳ変換の実施により、ｍＣを含有する位置を特定することが容易になる。酸化バイサルファイト変換の例示的説明については、例えば、Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２；３３６：９３４－９３７を参照されたい。
【0188】
いくつかの実施形態では、非修飾ヌクレオシドを変換する手順は、Ｔｅｔ補助バイサルファイト（ＴＡＢ）変換を含む。ＴＡＢ変換では、ｈｍＣが変換から保護され、ｍＣがバイサルファイト処理に先立って酸化されることで、ｍＣによって最初に占められた位置がＵに変換される一方で、ｈｍＣによって最初に占められた位置がシトシンの保護形態として残る。例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１２；１４９：１３６８－８０に記載のとおり、β－グルコシルトランスフェラーゼを使用して、（５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン（ｇｈｍＣ）を形成する）ｈｍＣを保護することができ、次にｍＴｅｔ１などのＴＥＴタンパク質を使用して、ｍＣをｃａＣに変換することができ、次にバイサルファイト処理を使用して、Ｃ及びｃａＣをＵに変換することができる一方で、ｇｈｍＣは影響を受けないままである。したがって、ＴＡＢ変換が使用される場合、変換された核酸塩基は、バイサルファイトによる影響を受ける、非修飾シトシン、ｆＣ、ｃａＣ、ｍＣ、又は他のシトシン形態の１つ以上を含むことが推測される。変換されていない核酸塩基は、ｈｍＣを含むことが推測される。ＴＡＢ変換されたＤＮＡの配列決定では、ｈｍＣ位置であるシトシンとして解読されている位置が同定される。一方で、Ｔとして解読されている位置は、Ｔ、ｍＣ、又はＣのバイサルファイト感受性形態、例えば、非修飾シトシン、ｆＣ、又はｃａＣであるとして同定される。それ故、本明細書に記載される第１のサブサンプルに対するＴＡＢ変換の実施により、ｈｍＣを含有する位置を特定することが容易になる。
【0189】
いくつかの実施形態では、非修飾ヌクレオシドを変換する変換手順は、ＡＰＯＢＥＣ連結エピジェネティック（ＡＣＥ）変換を含む。ＡＣＥ変換では、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ（Ａ３Ａ）などのＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣファミリーＤＮＡデアミナーゼ酵素を使用して、非修飾シトシン及びｍＣが脱アミノ化されるが、ｈｍＣ、ｆＣ、又はｃａＣは脱アミノ化されない。ＡＣＥ変換されたＤＮＡの配列決定では、ｈｍＣ、ｆＣ、又はｃａＣ位置であるシトシンとして解読されている位置が同定される。一方で、Ｔとして解読されている位置は、Ｔ、非修飾Ｃ、又はｍＣであるとして同定される。それ故、本明細書に記載されるＡＣＥ変換の実施により、ｈｍＣを含有する位置を、第１のサブサンプルから得られた配列リードを用いて、ｍＣ又は非修飾Ｃを含有する位置と区別することが容易になる。ＡＣＥ変換の例示的説明については、例えば、Ｓｃｈｕｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１８；３６：１０８３－１０９０を参照されたい。
【0190】
いくつかの実施形態では、変換手順は、修飾シトシンの酵素的保護とそれに続く保護されていないシトシンのウラシルへの脱アミノ化（次いでＴとして解読される）を含む。修飾シトシンの酵素的保護及び脱アミノ化の前、ヘアピンがＤＮＡにライゲートされ、ここでヘアピンは、相補的ＤＮＡ鎖に連結する。次に、ＤＮＡ鎖は分離され、欠損している鎖が合成される。アダプターがＤＮＡにライゲートされ、ヘアピンが開かれ、ＰＣＲ増幅がなされる。ヘアピンの各側は、解読され、ＤＮＡの同じストレッチを表し、分解ルールのセットは、リードを、Ａ、非修飾Ｃ、修飾Ｃ、Ｇ、又はＴの１つに分解する。この変換手順の例示的説明については、例えば、Ｆｕｌｌｇｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ ２０２２；０７．０８．４９９２８５を参照されたい。
【0191】
特定の実施形態では、本開示の方法は、任意の配列コンテクスト内に存在しないメチル化シトシン（即ち、ＣｐＧ及びＣｐＨシトシン）を同定するための品質管理方法を提供することにおいて有用性を有する。メチル化ＣｐＨ又は非ＣｐＧシトシンはまれであり、それ故、確実に検出するための高レベルの感度を必要とする。加えて、メチル化非ＣｐＧと同位置にあるメチル化ＣｐＧは、準最適な分子変換の指標として非ＣｐＧシトシンのメチル化状態を用いる方法によって検出することができない。本開示の方法は、特定の修飾状態を有することが知られている品質管理ヌクレオシドを提供することによってこれを達成し、それ故、誤った変換及び／又は準最適な変換の頻度の信頼できる尺度を提供する。
【0192】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、配列多様性及び／又は断片化パターンの分析を含み、配列多様性及び／又は断片化パターンの分析からの品質管理ヌクレオシドの準最適な又は誤った変換を伴う適応したＤＮＡを除外しない。例えば、方法は、配列多様性の存在若しくは不在を検出し、且つ／又は断片化パターンを判定することを含み得て、ここで品質管理ヌクレオシドの準最適な又は誤った変換を意味する、品質管理ヌクレオシドを含む適応したＤＮＡは、配列多様性の存在若しくは不在を検出し、且つ／又は断片化パターンを判定することに含まれる。このようにして、本方法は、修飾ヌクレオシド（例えば、ｍＣ又はｈｍＣ）の検出における偽陰性及び／又は偽陽性の可能性を、準最適な又は誤った変換に起因する、その目的に適さない適応したＤＮＡを除去することによって低減し得る一方で、こうした適応したＤＮＡを、（準最適な又は誤った変換による影響を受けない）配列多様性及び／又は断片化パターンの分析のために保持し、それ故、感受性への影響を回避することができる。
【0193】
ＤＮＡの分析及び／又は分割
いくつかの場合、異質性核酸サンプルが、２つ以上の画分（サブサンプル）に分割される。いくつかの実施形態では、各画分は、差次的にタグ付けされる。次に、タグ付けされた画分は、集団サンプルのｐｒｅｐ及び／又は配列決定のため、一緒にプールすることができる。分割－タグ付け－プーリングステップは、２回以上行うことができ、分割の各ラウンドは、異なる特徴に基づいて行い、タグ付けでは、他の画分及び分割手段と区別されている差次的タグを使用する。
いくつかの場合、異質性核酸サンプルが、２つ以上の画分（サブサンプル）に分割される。いくつかの実施形態では、各画分は、差次的にタグ付けされる。次に、タグ付けされた画分は、集団サンプルのｐｒｅｐ及び／又は配列決定のため、一緒にプールすることができる。分割－タグ付け－プーリングステップは、２回以上行うことができ、分割の各ラウンドは、異なる特徴に基づいて行い、タグ付けでは、他の画分及び分割手段と区別されている差次的タグを使用する。
【0194】
分割するために使用することができる特徴の例としては、配列の長さ、メチル化レベル、ヌクレオソーム結合、配列ミスマッチ、免疫沈降、及び／又はＤＮＡに結合するタンパク質が挙げられる。得られる画分は、以下の核酸形態の１つ以上を含み得る：一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、より短いＤＮＡ断片及びより長いＤＮＡ断片。いくつかの実施形態では、一般にシトシン修飾（例えば、シトシンメチル化）又はメチル化に基づく分割が実施され、任意選択的に、ＤＮＡの前述の特徴又は形態のいずれかに基づき得る、少なくとも１つの追加的な分割ステップと組み合わされる。いくつかの実施形態では、核酸の異質な集団が、１つ以上のエピジェネティック修飾の存在下及び１つ以上のエピジェネティック修飾の不在下で核酸に分割される。エピジェネティック修飾の例としては、メチル化の存在又は不在；メチル化のレベル；メチル化のタイプ（例えば、５－メチルシトシンとメチル化の他のタイプ、例えば、アデニンのメチル化及び／又はシトシンのヒドロキシメチル化）；並びに１つ以上のタンパク質、例えばヒストンとの会合及び会合のレベルが挙げられる。代替的又は追加的に、核酸の異質な集団は、ヌクレオソームと会合した核酸分子及びヌクレオソームを欠く核酸分子に分割することができる。代替的又は追加的に、核酸の異質な集団は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に分割してもよい。代替的に、又は追加的に、核酸の異質な集団は、核酸の長さ（例えば、最大１６０ｂｐの分子及び１６０ｂｐより大きい長さを有する分子）に基づいて分割してもよい。
【0195】
いくつかの場合、異なる手順を異なる画分に適用して、初期サンプルの異なる特徴が判定される。少なくとも１つの画分の核酸、例えばＤＮＡは、本明細書に記載される開示の方法に従って変換手順を受ける。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの画分は、変換手順を受けない。変換された画分及び変換されていない画分からの対応する配列を比較して、変換を受けている一塩基を同定し、それ故、初期サンプル中の対応する修飾ヌクレオシドを同定することができる。
【0196】
分割ステップを含む方法の場合、分割タグ（１つの画分中の分子を異なる画分中の分子と区別する）をアダプター内に含めてもよく、又はサンプル分子に付加してもよい。
【0197】
いくつかの実施形態では、２つ以上の画分、例えば、各画分は、差次的にタグ付けされる。タグを使用して、個別のポリヌクレオチド集団の画分を標識することで、タグ（ｔａｇ）（又はタグ（ｔａｇｓ））を特定の画分と相関させるができる。いくつかの実施形態では、単一のタグを使用して、特定の画分を標識することができる。いくつかの実施形態では、複数の異なるタグを使用して、特定の画分を標識することができる。複数の異なるタグを使用して、特定の画分を標識する実施形態では、１つの画分を標識するために使用されるタグのセットは、他の画分を標識するために使用されるタグのセットに対して容易に区別することができる。いくつかの実施形態では、タグは、追加的機能を有してもよく、例えば、タグを使用して、サンプル源を示すことができる、又は固有の分子識別子として使用することができる（使用することで、配列決定エラーを突然変異と区別することによって配列決定データの質を改善することができる、例えば、Ｋｉｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０８：９５３０－９５３５（２０１１），Ｋｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ０ＮＥ，１１：ｅ０１４６６３８（２０１６））などの場合、又は例えば、米国特許第９，５９８，７３１号明細書に記載されるとおり、非固有の分子識別子として使用することができる。同様に、いくつかの実施形態では、タグは、追加的機能を有し得る、例えば、タグを使用して、サンプル源を示すことができる、又は非固有の分子識別子として使用することができる（使用することで、配列決定エラーを突然変異と区別することによって配列決定データの質を改善することができる）。
【0198】
いくつかの実施形態では、分割タグ付けは、各画分中の分子を分割タグでタグ付けすることを含む。画分を再結合させ（例えば、必要な配列決定ランの数を低減し、不必要なコストを回避するため）、分子を配列決定した後、分割タグは、源の画分を同定する。別の実施形態では、異なる画分は、例えば、バーコードのペアから構成される、分子タグの異なるセットでタグ付けされる。このようにして、各分子バーコードは、源の画分を示すとともに、画分中の分子を識別するのに有用である。例えば、３５のバーコードの第１のセットを使用して、第１の画分中の分子をタグ付けすることができる一方で、３５のバーコードの第２のセットを使用して、第２の画分中の分子をタグ付けすることができる。
【0199】
いくつかの実施形態では、分割及び分割タグによるタグ付け後、分子は、単一ランでの配列決定のためにプールしてもよい。いくつかの実施形態では、例えば、分割タグの付加及びプーリングに続くステップにおいて、サンプルタグが分子に付加される。サンプルタグは、単一の配列決定ランにおける配列決定のため、複数のサンプルから生成されている材料をプールすることを容易にし得る。
【0200】
或いは、いくつかの実施形態では、分割タグは、サンプル及び画分と相関させることができる。単純な例としては、第１のタグは、第１のサンプルの第１の画分を示すことができ；第２のタグは、第１のサンプルの第２の画分を示すことができ；第３のタグは、第２のサンプルの第１の画分を示すことができ；そして第４のタグは、第２のサンプルの第２の画分を示すことができる。
【0201】
タグが、１つ以上の特徴に基づいて既に分割されている分子に付着され得る一方で、ライブラリー内の最終的なタグ付け分子は、その特徴をもはや有しないことがある。例えば、一本鎖ＤＮＡ分子が分割及びタグ付けされ得る一方で、ライブラリー内の最終的なタグ付け分子は、二本鎖である可能性が高い。同様に、ＤＮＡが最終ライブラリー内のメチル化の異なるレベルに基づいて分割を受け得る一方で、これら分子由来のタグ付け分子は、メチル化されない可能性が高い。したがって、ライブラリー内の分子に付着されているタグは、典型的に、最終的なタグ付け分子の由来元である「親分子」の特徴を示し、必ずしもタグ付け分子自体の特徴を示さない。
【0202】
例としては、バーコード１、２、３、４などを使用して、第１の画分中の分子がタグ付け及び標識され；バーコードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄなどを使用して、第２の画分中の分子がタグ付け及び標識され；バーコードａ、ｂ、ｃ、ｄなどを使用して、第３の画分中の分子がタグ付け及び標識される。差次的にタグ付けされた画分は、配列決定前にプールすることができる。差次的にタグ付けされた画分は、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンサーの同じフローセルにおいて、別々に配列決定する、又は一緒に同時に配列決定することができる。
【0203】
配列決定後、リードの分析は、画分毎のレベル、及び全ＤＮＡ集団レベルで実施することができる。タグを使用して、リードが異なる画分から選別される。分析は、配列情報、ゲノム配座の長さ、カバー率、及び／又はコピー数を用いて、遺伝子及びエピジェネティック変異（メチル化、クロマチン構造などの１つ以上）を判定するためのインシリコ分析を含み得る。いくつかの実施形態では、より高いカバー率は、ゲノム領域内のより高いヌクレオソーム占有率と相関し得る一方で、より低いカバー率は、より低いヌクレオソーム占有率又はヌクレオソーム枯渇領域（ＮＤＲ）と相関し得る。
【0204】
本明細書で開示される方法は、サンプル中のＤＮＡを分析することを含む。本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、開示される方法は、ＤＮＡを分割することを含む。こうした方法では、ＤＮＡの異なる形態（例えば、高メチル化及び低メチル化ＤＮＡ）は、ＤＮＡの１つ以上の特徴に基づき、物理的に分割することができる。この手法を用いて、例えば、特定の配列が高メチル化されるか又は低メチル化されるかを判定することができる。いくつかの実施形態では、サンプルの第１のサブサンプル又は一定分量は、本明細書中の他の箇所に記載される捕捉プローブを生成するためのステップを受け、サンプルの第２のサブサンプル又は一定分量は、分割を受ける。いくつかの実施形態では、サンプル又はそのサブサンプル若しくは一定分量は、分割及び差次的タグ付けとそれに続く再構成された配列に対する捕捉プローブ及び任意選択的には例えば配列変数及び／又はエピジェネティック標的領域に対する追加的な捕捉プローブを用いる捕捉ステップを受ける。
【0205】
メチル化のプロファイリングは、ゲノムの異なる領域を通じたメチル化パターンを判定することを含み得る。例えば、分子をメチル化の程度（例えば、１分子当たりのメチル化核酸塩基の相対数）に基づいて分割し、配列決定した後、異なる画分中の分子の配列は、参照ゲノムに位置づけることができる。これは、他の領域と比較して、より高度にメチル化されるか又は大して高度にメチル化されないゲノムの領域を示し得る。このようにして、ゲノム領域は、個別の分子に対して、そのメチル化の程度が異なり得る。
【0206】
サンプル中の核酸分子の分割により、例えば、サンプルの１つの画分中でより優位である希少な核酸分子を富化することによって、希少なシグナルが増加し得る。例えば、高メチル化ＤＮＡ中に存在するが、低メチル化ＤＮＡ中により少なく存在する（又は存在しない）遺伝的変異は、サンプルを高メチル化及び低メチル化核酸分子に分割することによって、より容易に検出することができる。サンプルの複数の画分を分析することにより、単一分子の多次元分析を実施することができ、それ故、より大きい感受性を達成することができる。分割は、１つ以上のメチル化核酸塩基の存在又は不在に基づき、核酸分子を画分又はサブサンプルに物理的に分割することを含んでもよい。サンプルは、画分又はサブサンプルに、差次的な遺伝子発現又は病態を意味する特徴に基づいて分割してもよい。サンプルは、核酸、例えば、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、非ｃｆＤＮＡ、腫瘍ＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）及び無細胞核酸（ｃｆＮＡ）の分析中、正常及び病的状態の間のシグナルの差異をもたらす特徴、又はその組み合わせに基づいて分割してもよい。
【0207】
いくつかの実施形態では、高メチル化及び／又は低メチル化可変エピジェネティック標的領域を分析して、それらが腫瘍細胞又は通常は分析中のＤＮＡサンプル（ｃｆＤＮＡなど）に寄与しないタイプの細胞、及び／又は特定の免疫細胞型の差次的メチル化の特徴を示すか否かが判定される。
【0208】
いくつかの場合、サンプル中の異質なＤＮＡは、２つ以上の画分（例えば、少なくとも３、４、５、６又は７つの画分）に分割される。いくつかの実施形態では、各画分は、差次的にタグ付けされる。次に、タグ付けされた画分は、集団サンプルのｐｒｅｐ及び／又は配列決定のために一緒にプールすることができる。分割－タグ付け－プーリングステップは、２回以上行うことができ、分割の各ラウンドは、異なる特徴に基づいて行い（本明細書に提供される例）、タグ付けでは、他の画分及び分割手段と区別されている差次的タグを使用する。その他の場合、差次的にタグ付けされた画分は、別々に配列決定される。
【0209】
いくつかの実施形態では、差次的にタグ付けされ、プールされたＤＮＡからの配列リードは、取得されて、インシリコで分析される。タグを使用して、リードが異なる画分から選別される。遺伝子変異体を検出するための分析は、画分毎のレベル、及び全核酸集団レベルで実施することができる。例えば、分析は、各画分におけるＣＮＶ、ＳＮＶ、インデル、核酸の融合などの遺伝子変異体を判定するためのインシリコ分析を含み得る。いくつかの場合、インシリコ分析は、クロマチン構造を判定することを含み得る。例えば、配列リードのカバー率を用いて、クロマチン中のヌクレオソームポジショニングを判定することができる。より高いカバー率は、ゲノム領域内のより高いヌクレオソーム占有率と相関し得る一方で、より低いカバー率は、より低いヌクレオソーム占有率又はヌクレオソーム枯渇領域（ＮＤＲ）と相関し得る。
【0210】
分割に使用可能である特徴の例としては、配列の長さ、メチル化レベル、ヌクレオソーム結合、配列ミスマッチ、免疫沈降、及び／又はＤＮＡに結合するタンパク質が挙げられる。得られる画分は、以下の核酸形態の１つ以上を含み得る：一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、より短いＤＮＡ断片及びより長いＤＮＡ断片。いくつかの実施形態では、一般にシトシン修飾（例えば、シトシンメチル化）又はメチル化に基づく分割が実施され、任意選択的に、ＤＮＡの前述の特徴又は形態のいずれかに基づき得る、少なくとも１つの追加的な分割ステップと組み合わされる。いくつかの実施形態では、核酸の異質な集団が、１つ以上のエピジェネティック修飾の存在下及び１つ以上のエピジェネティック修飾の不在下で核酸に分割される。エピジェネティック修飾の例としては、メチル化の存在又は不在；メチル化のレベル；メチル化のタイプ（例えば、５－メチルシトシンとメチル化の他のタイプ、例えば、アデニンのメチル化及び／又はシトシンのヒドロキシメチル化）；並びに１つ以上のタンパク質、例えばヒストンとの会合及び会合のレベルが挙げられる。代替的又は追加的に、核酸の異質な集団は、ヌクレオソームと会合した核酸分子及びヌクレオソームを欠く核酸分子に分割することができる。代替的又は追加的に、核酸の異質な集団は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に分割してもよい。代替的に、又は追加的に、核酸の異質な集団は、核酸の長さ（例えば、最大１６０ｂｐの分子及び１６０ｂｐより大きい長さを有する分子）に基づいて分割してもよい。
【0211】
サンプル中の核酸の集団を分割するために使用される薬剤は、親和性薬剤、例えば、所望の特異性を有する抗体、天然結合パートナー又はその変異体（Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２８：１１０６－１１１４（２０１０）；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２９：６８－７２（２０１１））、又は所与の標的に対する特異性を有するように、例えばファージディスプレイによって選択される人工ペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、分割において使用される薬剤は、修飾核酸塩基を認識する薬剤である。いくつかの実施形態では、薬剤によって認識される修飾核酸塩基は、修飾シトシン、例えばメチルシトシン（例えば、５－メチルシトシン）である。いくつかの実施形態では、薬剤によって認識される修飾核酸塩基は、ＤＮＡ中の第１の核酸塩基に、サンプルのＤＮＡ中の第２の核酸塩基と異なるように影響する手順の産物である。いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、その塩基対特異性が手順によって変更されたことを意味する、「変換された核酸塩基」であってもよい。例えば、特定の手順は、非メチル化又は非修飾シトシンをジヒドロウラシルに変換し、又はより一般に、シトシンの少なくとも１つの修飾又は非修飾形態は、脱アミノ化を受け、ウラシル（ＤＮＡとの関連において修飾核酸塩基と考えられる）又はウラシルのさらなる修飾形態をもたらす。分割剤の例としては、抗体、例えば、修飾シトシン、例えばメチルシトシン（例えば、５－メチルシトシン）であり得る修飾核酸塩基を認識する抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、分割剤は、５－メチルシトシン以外の修飾シトシン、例えば、５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）を認識する抗体である。代替的な分割剤は、ＭｅＣＰ２などのタンパク質を含む、本明細書に記載のようなメチル結合ドメイン（ＭＢＤ）及びメチル結合タンパク質（ＭＢＰ）を含む。
【0212】
追加的な分割剤の非限定例が、ヒストンに結合している核酸を遊離又は非結合核酸から分離し得る、ヒストン結合タンパク質である。本明細書で開示される方法において使用可能であるヒストン結合タンパク質の例としては、ＲＢＢＰ４、ＲｂＡｐ４８及びＳＡＮＴドメインペプチドが挙げられる。
【0213】
いくつかの実施形態では、分割は、二成分分割及び修飾の程度／レベルに基づく分割の両方を含み得る。例えば、メチル化断片は、メチル化ＤＮＡ免疫沈降（ＭｅＤＩＰ）によって分割することができ、又は全てのメチル化断片は、メチル結合ドメインタンパク質（例えば、ＭｅｔｈｙｌＭｉｎｄｅｒメチル化ＤＮＡ富化キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、非メチル化断片から分割することができる。その後、追加的な分割は、異なるレベルのメチル化を有する断片を、メチル結合ドメイン及び結合断片を有する溶液中の塩濃度を調節することによって溶出させることを含み得る。塩濃度が増加すると、より大きいメチル化レベルを有する断片が溶出される。
【0214】
ＤＮＡの分析は、目的のＤＮＡを検出又は定量化することを含んでもよい。ＤＮＡの分析は、遺伝子変異体及び／又はエピジェネティックな特徴（例えば、ＤＮＡメチル化及び／又はＤＮＡ断片化）を検出することを含み得る。
【0215】
いくつかの実施形態では、メチル化レベルは、分割、バイサルファイト変換などの修飾感受性の変換、配列決定中の直接検出、メチル化感受性制限酵素の消化、メチル化依存性制限酵素の消化、又は任意の他の好適な手法を用いて判定することができる。例えば、ＤＮＡの異なる形態（例えば、高メチル化及び低メチル化ＤＮＡ）は、ＤＮＡの１つ以上の特徴に基づいて物理的に分割することができる。例えば、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＭＢＤ２、ＭＢＤ４、又はＭｅＣＰ２などのＭＢＤ）又は５－メチルシトシンに特異的な抗体（ＭｅＤＩＰなどの場合）を使用して、ＤＮＡを分割することができる。この手法を使用して、例えば、特定の配列が高メチル化されるか又は低メチル化されるかを判定することができる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ分子、例えばｃｆＤＮＡ分子の終点及び／又は中央点に基づき、ＤＮＡ断片化パターンを判定することができる。
【0216】
いくつかの場合、最終画分は、修飾の異なる程度（修飾の過剰表現又は過小表現）を有する核酸において富化される。過剰表現及び過小表現は、集団内の鎖当たりの修飾の中央値数に対する、核酸によって生じている修飾の数によって定義することができる。例えば、サンプル中の核酸における５－メチルシトシン残基の中央値数が２である場合、３つ以上の５－メチルシトシン残基を含む核酸は、この修飾において過剰表現され、１又は０の５－メチルシトシン残基を有する核酸は、過小表現される。親和性分離の効果は、結合相中の修飾において過剰表現されている核酸及び非結合相中（即ち、溶液中）の修飾において過小表現されている核酸を富化することである。結合相中の核酸は、後続処理の前に溶出させることができる。
【0217】
ＭｅＤＩＰ又はＭｅｔｈｙｌＭｉｎｅｒ（登録商標）メチル化ＤＮＡ富化キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するとき、連続的溶出を用いて、様々なレベルのメチル化を分割することができる。例えば、低メチル化画分（非メチル化）は、核酸集団を、磁気ビーズに付着されている、キットからのＭＢＤと接触させることによって、メチル化画分から分離することができる。ビーズを使用して、メチル化核酸が非メチル化核酸から分離・除去される。その後、１つ以上の溶出ステップを連続的に実施することで、異なるレベルのメチル化を有する核酸が溶出される。例えば、メチル化核酸の第１のセットは、１６０ｍＭ以上、例えば、少なくとも１５０ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ、１０００ｍＭ、又は２０００ｍＭの塩濃度で溶出することができる。こうしたメチル化核酸が溶出された後、磁気分離を再び使用して、より高いレベルのメチル化核酸が、メチル化のレベルがより低い核酸から分離される。溶出及び磁気分離ステップを繰り返して、低メチル化画分（非メチル化を含む核酸において富化されている）、メチル化画分（低いレベルのメチル化を含む核酸において富化されている）、及び高メチル化画分（高いレベルのメチル化を含む核酸において富化されている）などの様々な画分を作出することができる。
【0218】
いくつかの方法では、親和性分離に基づく分割に使用される薬剤に結合されている核酸は、洗浄ステップを受ける。洗浄ステップでは、親和性薬剤に弱く結合している核酸が洗い流される。こうした核酸は、修飾を有する核酸において、平均値又は中央値（即ち、サンプルの薬剤との初期接触時の、固相に結合されたままである核酸と固相に結合していない核酸との間の中間）に近い程度まで富化することができる。
【0219】
親和性分離は、異なる程度の修飾を有する核酸の、少なくとも２つ、時として３つ以上の画分をもたらす。画分が依然として分離される一方で、少なくとも１つの画分、及び通常は２つ又は３つ（以上）の画分の核酸は、通常はアダプターの成分として提供されている核酸タグに連結されることで、異なる画分中の核酸は、一方の画分のメンバーを他方と識別する異なるタグを受ける。同じ画分の核酸分子に連結されているタグは、互いに同一又は異なる可能性がある。しかし、互いに異なる場合、タグは、それらのコードの一部を共有することで、それらが特定の画分であるように付着されている分子を特定することができる。
【0220】
メチル化などの特徴に基づく核酸サンプルの分割に関するさらなる詳細については、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１８／１１９４５２号パンフレットを参照されたい。
【0221】
いくつかの実施形態では、分割は、ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）及び／又はメチル化依存性制限酵素（ＭＤＲＥ）と接触させることを含む。ＤＮＡのＭＳＲＥ又はＭＤＲＥによる処理後、ＤＮＡをサイズに基づいて分割して、高メチル化（ＭＳＲＥ処理後の最長のＤＮＡ分子及びＭＤＲＥ処理後の最短のＤＮＡ断片）、中間（ＭＳＲＥ又はＭＤＲＥ処理後の中間長のＤＮＡ分子）、及び低メチル化（ＭＳＲＥ処理後の最短のＤＮＡ分子及びＭＤＲＥ処理後の最長のＤＮＡ断片）サブサンプルを生成することができる。
【0222】
いくつかの実施形態では、分割は、核酸をメチル結合タンパク質（「ＭＢＰ」）のメチル結合ドメイン（「ＭＢＤ」）と接触させることによって実施される。いくつかのそのような実施形態では、核酸は、全ＭＢＰと接触される。いくつかの実施形態では、ＭＢＤは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）に結合し、ＭＢＰは、ＭＢＤを含み、本明細書で互換的にメチル結合タンパク質又はメチル結合ドメインタンパク質と称される。いくつかの実施形態では、ＭＢＤは、ビオチンリンカーを介して、常磁性ビーズ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－２８０ストレプトアビジンにカップリングされる。異なる程度のメチル化を伴う画分への分割は、ＮａＣｌ濃度を増加させることにより画分を溶出することによって実施することができる。
【0223】
いくつかの実施形態では、結合されたＤＮＡは、抗体又はＭＢＤをプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫと接触させることによって溶出される。これは、上で考察されるとおり、ＮａＣｌを使用する溶出ステップの代わりに又はそれに加えて実施することができる。
【0224】
本明細書で企図される修飾核酸塩基を認識する薬剤の例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：
（ａ）ＭｅＣＰ２は、非修飾シトシンよりも５－メチル－シトシンに優先的に結合するタンパク質である。
（ｂ）ＲＰＬ２６、ＰＲＰ８及びＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭＨＳ６は、非修飾シトシンよりも５－ヒドロキシメチル－シトシンに優先的に結合する。
（ｃ）ＦＯＸＫ１、ＦＯＸＫ２、ＦＯＸＰ１、ＦＯＸＰ４及びＦＯＸＩ３は、好ましくは、非修飾シトシンよりも５－ホルミル－シトシンに結合する（Ｉｕｒｌａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１４：Ｒ１１９（２０１３））。
（ｄ）１つ以上のメチル化又は修飾核酸塩基又はその変換産物、例えば、５ｍＣ、５ｃａＣ、又はＤＨＵに特異的な抗体。
（ａ）ＭｅＣＰ２は、非修飾シトシンよりも５－メチル－シトシンに優先的に結合するタンパク質である。
（ｂ）ＲＰＬ２６、ＰＲＰ８及びＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭＨＳ６は、非修飾シトシンよりも５－ヒドロキシメチル－シトシンに優先的に結合する。
（ｃ）ＦＯＸＫ１、ＦＯＸＫ２、ＦＯＸＰ１、ＦＯＸＰ４及びＦＯＸＩ３は、好ましくは、非修飾シトシンよりも５－ホルミル－シトシンに結合する（Ｉｕｒｌａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１４：Ｒ１１９（２０１３））。
（ｄ）１つ以上のメチル化又は修飾核酸塩基又はその変換産物、例えば、５ｍＣ、５ｃａＣ、又はＤＨＵに特異的な抗体。
【0225】
一般に、溶出は、修飾の数、例えば、１分子当たりのメチル化部位の数の関数であり、より多くのメチル化を有する分子が増加した塩濃度下で溶出する。ＤＮＡをメチル化の程度に基づいて異なる集団に溶出するため、ＮａＣｌ濃度を増加させる一連の溶出緩衝液を使用することができる。塩濃度は、約１００ｎｍ～約２５００ｍＭのＮａＣｌの範囲であり得る。一実施形態では、プロセスは、３つの画分をもたらす。分子は、第１の塩濃度で溶液と接触され、修飾核酸塩基を認識する薬剤を含む分子を含み、分子は、捕捉部分、例えばストレプトアビジンに付着され得る。第１の塩濃度で、分子の集団は、薬剤に結合することになり、集団は、非結合のままとなる。非結合集団は、「低メチル化」集団として分離され得る。例えば、ＤＮＡの低メチル化形態で富化されている第１の画分は、低い塩濃度、例えば、１００ｍＭ又は１６０ｍＭで非結合のままであるものである。中程度にメチル化されたＤＮＡにおいて富化されている第２の画分は、中程度の塩濃度、例えば、１００ｍＭ～２０００ｍＭの濃度を用いて溶出される。これもまた、サンプルから分離される。ＤＮＡの高メチル化形態で富化されている第３の画分は、高い塩濃度、例えば少なくとも約２０００ｍＭを用いて溶出される。
【0226】
いくつかの実施形態では、５－メチルシチジン（５ｍＣ）に対して産生されているモノクローナル抗体を使用して、メチル化ＤＮＡが精製される。ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ断片を得るため、例えば９５℃で変性される。標準又は磁気ビーズに共役されたプロテインＧ及び抗５ｍＣ抗体とのインキュベーション後の洗浄を用いて、抗体に結合したＤＮＡを免疫沈降させる。次に、こうしたＤＮＡを溶出することができる。画分は、沈殿していないＤＮＡ及びビーズから溶出した１つ以上の画分を含んでもよい。
【0227】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡの画分は、ライブラリー調製の酵素ステップのための調製において脱塩及び富化される。
【0228】
異常に高いコピー数を含む配列は、高メチル化される傾向があり得る。したがって、いくつかの実施形態では、型特異的な差次的にメチル化された領域及びコピー数多型の両方である複数の標的領域を含むエピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な捕捉プローブと接触されているＤＮＡは、高メチル化画分の少なくとも一部分を含む。高メチル化画分の少なくとも一部分に由来するか又はそれを含むＤＮＡは、１つ以上の他の画分、例えば、中間の画分又は低メチル化画分の少なくとも一部分に由来するか又はそれを含むＤＮＡと組み合わせてもよく、又は組み合わせなくてもよい。
【0229】
いくつかの実施形態では、メチル化は、変換手順を用いて検出される。変換手順は、修飾依存性に、第１の核酸塩基を差次的に変更するが、第２の核酸塩基を差次的に変更しない、例えば、非修飾に対してメチル化されている（又はヒドロキシメチル化、又はホルミル化、又はカルボキシル化など）、且つ／又はある１つの様式で、別の様式に対して修飾されている（例えば、メチル化対ヒドロキシメチル化）、任意の技術を含む。こうした変換手順の例としては、非修飾シトシン及び特定の修飾シトシン（例えば、５－ホルミルシトシン（ｆＣ）又は５－カルボキシルシトシン（ｃａＣ））をウラシルに変換する一方で、他の修飾シトシン（例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン（ｈｙｄｒｏｘｙｌｍｅｔｈｙｌｃｙｓｔｏｓｉｎｅ））が変換されない、バイサルファイト変換が挙げられる。バイサルファイト変換の実施は、配列リードを用いて、ｍＣ又はｈｍＣを含有する位置を特定することを容易にし得る。バイサルファイト変換の例示的説明については、例えば、Ｍｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１８；９：５０６８を参照されたい。
【0230】
こうした変換手順の例としては、酸化バイサルファイト（Ｏｘ－ＢＳ）変換も挙げられる。Ｏｘ－ＢＳ変換の実施は、配列リードを用いて、ｍＣを含有する位置を特定することを容易にし得る。酸化バイサルファイト変換の例示的説明については、例えば、Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０１２；３３６：９３４－９３７を参照されたい。
【0231】
こうした変換手順の例としては、Ｔｅｔ補助バイサルファイト（ＴＡＢ）変換も挙げられる。例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１２；１４９：１３６８－８０に記載のとおり、β－グルコシルトランスフェラーゼを使用して、（５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン（ｇｈｍＣ）を形成する）ｈｍＣを保護することができ、次にｍＴｅｔ１などのＴＥＴタンパク質を使用して、ｍＣをｃａＣに変換することができ、次にバイサルファイト処理を使用して、Ｃ及びｃａＣをＵに変換することができる一方で、ｇｈｍＣは影響を受けないままである。したがって、ＴＡＢ変換が使用される場合、第１の核酸塩基は、バイサルファイトによる影響を受ける、非修飾シトシン、ｆＣ、ｃａＣ、ｍＣ、又は他のシトシン形態の１つ以上を含み、第２の核酸塩基は、ｈｍＣを含む。ＴＡＢ変換の実施は、配列リードを用いて、ｈｍＣを含有する位置を特定することを容易にし得る。
【0232】
こうした変換手順の例としては、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換も挙げられ、任意選択的に、置換されたボラン還元剤は、２－ピコリンボラン、ボランピリジン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、又はアンモニアボランである。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９；３７：４２４－４２９（例えば、付録の図１及び付録の注７）を参照されたい。ＴＡＰ変換の実施は、配列リードを用いて、非修飾Ｃを含有する位置を特定することを容易にし得る。この手順は、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．２０１９、上記にさらに詳細に記載されている、Ｔｅｔ補助ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）を包含する。．
【0233】
或いは、（例えば、βＧＴを使用する）ｈｍＣの保護は、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換と組み合わせることができる。こうしたＴＡＰＳβ変換の実施は、配列リードを用いて、非修飾Ｃ又はｈｍＣを含有する位置を、一方ではｍＣを含有する位置と区別することを容易にし得る。このタイプの変換の例示的説明については、例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１９；３７：４２４－４２９を参照されたい。
【0234】
こうした変換手順の例としては、ＡＰＯＢＥＣ連結エピジェネティック（ＡＣＥ）変換も挙げられる。ＡＣＥ変換の実施は、配列リードを用いて、ｈｍＣを含有する位置を、ｍＣ又は非修飾Ｃを含有する位置と区別することを容易にし得る。ＡＣＥ変換の例示的説明については、例えば、Ｓｃｈｕｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１８；３６：１０８３－１０９０を参照されたい。
【0235】
こうした変換手順の例としては、核酸塩基の酵素変換、例えば、ＥＭ－Ｓｅｑなどの場合も挙げられる。例えば、ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／２０１９．１２．２０．８８４６９２ｖｌで利用可能である、Ｖａｉｓｖｉｌａ Ｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＥＭ－ｓｅｑ：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｉｃｏｇｒａｍｓ ｏｆ ＤＮＡ．ｂｉｏＲｘｉｖ；ＤＯＩ：１０．１１０１／２０１９．１２．２０．８８４６９２を参照されたい。
【0236】
いくつかの実施形態では、メチル化は、メチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）を用いて検出される。例えば、サンプル、サブサンプル、又はサンプルの一部分は、非メチル化配列を切断するため、１つ以上のＭＳＲＥによる消化を受け得る。例示的なＭＳＲＥとして、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｉＩ、Ａｏｒｌ３ＨＩ、Ａｏｒｌ５ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｆｒ１ＯＩ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＭｌｕＩ、ＭｓｐＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、及びＳｎａＢＩが挙げられる。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのメチル化感受性ヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのメチル化感受性ヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、メチル化感受性ヌクレアーゼは、ＢｓｔＵＩ及びＨｐａＩＩを含む。いくつかの実施形態では、２つのメチル化感受性ヌクレアーゼは、ＨｈａＩ及びＡｃｃＩＩを含む。いくつかの実施形態では、メチル化感受性ヌクレアーゼは、ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ及びＨｉｎ６Ｉを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＭＳＲＥと接触されているサンプルの一部分は、高メチル化ＤＮＡを含む、又は高メチル化ＤＮＡ画分であるか若しくはそれを含み、それは本明細書中の他の箇所に記載されるとおりに得てもよい。
【0237】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片化は、ＤＮＡ（例えば、ｃｆＤＮＡ）の配列決定された断片の終点及び／又は中間点を判定することによって検出される。例えば、断片化パターンにおける差異は、断片が腫瘍に起源を有するか又は健常細胞に起源を有するかに応じて生じ得る。ｃｆＤＮＡの腫瘍細胞由来ＤＮＡを断片化に基づいて検出するため、異常な断片のレベル増加の存在又は不在は、例えば、増加及び異常が対照又は健常サンプルに対する場合、（例えば、増幅の程度に比例する）コピー数増幅を伴う領域で判定することができる。
【0238】
いくつかの実施形態では、サンプル又はサブサンプル（例えば、本明細書に記載されるサンプルを、例えば、メチル化などのシトシン修飾、例えば、シトシンなどの５－メチル化のレベルに基づいて分割することによって調製されている第１、第２、又は第３のサブサンプル）は、メチル化依存性ヌクレアーゼ又はメチル化感受性ヌクレアーゼと接触される。別段の指示がない限り、分割がシトシン修飾に基づいて実施される場合、第１のサブサンプルは、より高いレベルの修飾を有するサブサンプルであり；第２のサブサンプルは、より低いレベルの修飾を有するサブサンプルであり；また、存在する場合、第３のサブサンプルは、第１及び第２のサブサンプル間の中間レベルの修飾を有する。
【0239】
上で考察したように、分割手順は、サブサンプル中のＤＮＡ分子の不完全な選別を生じ得る。メチル化依存性ヌクレアーゼ又はメチル化感受性ヌクレアーゼの選択は、非特異的に分割されたＤＮＡを分解するように行うことができる。例えば、第２のサブサンプルは、メチル化依存性ヌクレアーゼ、例えば、メチル化依存性制限酵素と接触させることができる。これは、第２のサブサンプル中の非特異的に分割されたＤＮＡ（例えば、メチル化ＤＮＡ）を分解して、処理された第２のサブサンプルを生成することができる。代替的に又は追加的に、第１のサブサンプルは、メチル化感受性エンドヌクレアーゼ、例えばメチル化感受性制限酵素と接触させて、それにより第１のサブサンプル中の非特異的に分割されたＤＮＡを分解して、処理された第１のサブサンプルを生成することができる。第１又は第２のサブサンプルのいずれか又は両方における非特異的に分割されたＤＮＡの分解は、例えば、サンプル中の異常に修飾されたＤＮＡの存在を検出する、ＤＮＡの起源の組織を判定する、且つ／又は対象ががんを有するか否かを判定するための、シトシン修飾に基づくＤＮＡの正確な分割に依存する方法の性能に対する改善として提起される。例えば、こうした分解は、改善された感受性を提起し、且つ／又は下流分析を簡素化し得る。一般に、非特異的に分割されたＤＮＡが、例えば低メチル化画分において高メチル化される場合、メチル化依存性ヌクレアーゼ、例えばメチル化依存性制限酵素が使用される必要がある。逆に、非特異的に分割されたＤＮＡが、例えば高メチル化画分において低メチル化される場合、メチル化感受性ヌクレアーゼ、例えばメチル化感受性制限酵素が使用される必要がある。メチル化依存性ヌクレアーゼ、例えばメチル化依存性制限酵素は、メチル化ＤＮＡを非メチル化ＤＮＡに対して優先的に切断する一方で、メチル化感受性ヌクレアーゼ、例えばメチル化感受性制限酵素は、非メチル化ＤＮＡをメチル化ＤＮＡに対して優先的に切断する。
【0240】
サブサンプルをヌクレアーゼと接触させる場合、１つ以上のヌクレアーゼを使用することができる。いくつかの実施形態では、サブサンプルは、複数のヌクレアーゼと接触される。サブサンプルは、逐次的に又は同時にヌクレアーゼと接触させてもよい。ヌクレアーゼの同時使用は、ヌクレアーゼが不必要なサンプル操作を回避するための類似条件下（例えば、緩衝液組成物）で活性である場合、有利であり得る。第２のサブサンプルを２つ以上のメチル化依存性制限酵素と接触させることにより、非特異的に分割された高メチル化ＤＮＡがより完全に分解され得る。同様に、第１のサブサンプルを２つ以上のメチル化感受性制限酵素と接触させることにより、非特異的に分割された低メチル化及び／又は非メチル化ＤＮＡがより完全に分解され得る。
【0241】
いくつかの実施形態では、メチル化依存性ヌクレアーゼは、ＭｓｐＪＩ、ＬｐｎＰＩ、ＦｓｐＥＩ、又はＭｃｒＢＣの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのメチル化依存性ヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのメチル化依存性ヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、メチル化依存性ヌクレアーゼは、ＦｓｐＥＩを含む。いくつかの実施形態では、メチル化依存性ヌクレアーゼは、例えば逐次的に使用される、ＦｓｐＥＩ及びＭｓｐＪＩを含む。
【0242】
いくつかの実施形態では、メチル化感受性ヌクレアーゼは、ＡａｔＩＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｉＩ、Ａｏｒｌ３ＨＩ、Ａｏｒｌ５ＨＩ、ＢｓｐＴ１０４Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｔＵＩ、Ｃｆｒ１ＯＩ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、ＨａｅＩＩ、ＨａｐＩＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＭｌｕＩ、ＭｓｐＩ、ＮａｅＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＰｍａＣＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、ＰｖｕＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、及びＳｎａＢＩの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのメチル化感受性ヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのメチル化感受性ヌクレアーゼが使用される。いくつかの実施形態では、メチル化感受性ヌクレアーゼは、ＢｓｔＵＩ及びＨｐａＩＩを含む。いくつかの実施形態では、２つのメチル化感受性ヌクレアーゼは、ＨｈａＩ及びＡｃｃＩＩを含む。いくつかの実施形態では、メチル化感受性ヌクレアーゼは、ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ及びＨｉｎ６Ｉを含む。
【0243】
いくつかの実施形態では、ＦｓｐＥＩは、少なくとも１つのサブサンプル（例えば、低メチル化画分）中の核酸分子を消化するために使用される。いくつかの実施形態では、ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ及びＨｉｎ６Ｉは、少なくとも１つのサブサンプル（例えば、高メチル化画分）中の核酸分子を消化するために使用され、ＦｓｐＥＩは、少なくとも１つの他のサブサンプル（例えば、低メチル化画分）中の核酸分子を消化するために使用される。中程度にメチル化された画分を含む実施形態では、その中の核酸分子は、メチル化感受性ヌクレアーゼ又はメチル化依存性ヌクレアーゼで消化され得る。いくつかの実施形態では、中程度にメチル化された画分中の核酸分子は、高メチル化画分と同じヌクレアーゼで消化される。例えば、中程度にメチル化された画分は、高メチル化画分とともにプールすることができ、次にプールされた画分は、消化を受け得る。いくつかの実施形態では、中程度にメチル化された画分中の核酸分子は、低メチル化画分と同じヌクレアーゼで消化される。例えば、中程度にメチル化された画分は、低メチル化画分とともにプールすることができ、次にプールされた画分は、消化を受け得る。
【0244】
いくつかの実施形態では、サブサンプルは、アダプターをタグ付けするか又はアダプターをＤＮＡの両方の末端に付着させるステップ後、上記のヌクレアーゼと接触される。タグ又はアダプターは、上記の手法のいずれかを用いる、ヌクレアーゼによる切断に対して抵抗性であり得る。この手法では、切断産物が両方の末端でタグ又はアダプターを欠いていることから、切断は非特異的に分割された分子に対する分析実行を阻止し得る。
【0245】
或いは、アダプターをタグ付け又は付着させるステップは、上記のヌクレアーゼによる切断後、実施することができる。次に、切断された分子は、ヌクレアーゼ認識部位に対応する末端（タグ又はアダプターへの付着点）を有することに基づき、配列リードにおいて同定することができる。また、分子をこのように処理することで、例えば、体細胞突然変異の観察といった切断された分子からの情報の取得が可能であり得る。サブサンプルをヌクレアーゼと接触後にアダプターをタグ付け又は付着し、ｃｆＤＮＡなどの低分子量ＤＮＡが分析中であるとき、接触ステップ前にサンプルから高分子量ＤＮＡ（汚染しているゲノムＤＮＡなど）を除去することが望ましいことがある。また、比較的低い温度（例えば、６５℃以下、又は６０℃以下）で熱不活性化され得るヌクレアーゼを使用して、変性がその後のライゲーションステップに干渉し得ることから、ＤＮＡの変性を回避することが望ましいことがある。
【0246】
サンプルが、中程度にメチル化された分子を含有する第３のサブサンプルを含む３つのサブサンプルに分割される場合、第３のサブサンプルは、いくつかの実施形態において、メチル化感受性ヌクレアーゼと接触される。こうしたステップは、接触ステップに関連する本明細書中の他の箇所に記載の特徴のいずれかを有してもよく、上で考察したようなアダプターをタグ付け又は付着させるステップの前又は後に実施してもよい。いくつかの実施形態では、第１及び第３のサブサンプルは、メチル化感受性ヌクレアーゼと接触させる前に組み合わされる。こうしたステップは、接触ステップに関連する本明細書中の他の箇所に記載の特徴のいずれかを有してもよく、上で考察したようなアダプターをタグ付け又は付着させるステップの前又は後に実施してもよい。いくつかの実施形態では、第１及び第３のサブサンプルは、組み合わされる前に、差次的にタグ付けされる。
【0247】
或いは、サンプルが、中程度にメチル化された分子を含有する第３のサブサンプルを含む３つのサブサンプルに分割される場合、第３のサブサンプルは、いくつかの実施形態において、メチル化依存性ヌクレアーゼと接触される。こうしたステップは、接触ステップに関連する本明細書中の他の箇所に記載の特徴のいずれかを有してもよく、上で考察したようなアダプターをタグ付け又は付着させるステップの前又は後に実施してもよい。いくつかの実施形態では、第２及び第３のサブサンプルは、メチル化依存性ヌクレアーゼと接触させる前に組み合わされる。こうしたステップは、接触ステップに関連する本明細書中の他の箇所に記載の特徴のいずれかを有してもよく、上で考察したようなアダプターをタグ付け又は付着させるステップの前又は後に実施してもよい。いくつかの実施形態では、第２及び第３のサブサンプルは、組み合わされる前に、差次的にタグ付けされる。
【0248】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、例えばＳＰＲＩビーズを使用して、ヌクレアーゼと接触された後に精製される。こうした精製は、ヌクレアーゼの熱不活性化後に行ってもよい。或いは、精製は、省略することができ；それ故、例えば、増幅などの後続ステップは、熱不活性化ヌクレアーゼ（ｈｅａｔ－ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ）を含有するサブサンプルに対して実施することができる。別の実施形態では、接触ステップは、ＳＰＲＩビーズなどの精製試薬の存在下で行い、例えば、チューブ交換に伴う減少を最小化することができる。切断及び熱不活性化後、ＳＰＲＩビーズは、分子クラウディング試薬（例えば、ＰＥＧ）及び塩を加えることによって、精製のために再使用することができる。
【0249】
いくつかの実施形態では、変換手順がサンプル又はサブサンプルに対して実施される場合、１つ以上の標的領域セット（例えば、少なくともエピジェネティック標的領域セット）のそのサンプル又はサブサンプルからの後続する捕捉において、（例えば、プローブがハイブリダイズする配列内の少なくとも１つの塩基の）修飾状態に特異的である、例えば、所望のとおり、変換（例えば、修飾又は非修飾シトシンの、アデニンと優先的に対合する、ウラシル又はその類似体、例えばＤＨＵへの変換）を受けている、又は変換を受けていない標的配列に対して相補的である、プローブを含む捕捉プローブが使用される。そのようなものとして、プローブは、目的の修飾、例えばメチル化が存在した又は不在であった配列に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、修飾感受性変換（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）がサンプル又はサブサンプルに対して実施される場合、１つ以上の標的領域セット（例えば、少なくともエピジェネティック標的領域セット）のそのサンプル又はサブサンプルからの後続する捕捉において、修飾状態と無関係に標的配列とハイブリダイズし得るプローブを含む（例えば、修飾又は非修飾シトシンの、アデニンと優先的に対合する（例えば、イノシンはＣ又はＵと対合し得る）、ウラシル又はその類似体、例えばＤＨＵへの変換を受けているか又は受けていない可能性がある位置で乱雑に対合する核酸塩基を含む）捕捉プローブが使用される。
【0250】
いくつかの実施形態では、方法は、（低メチル化画分とも称される）第２のサブサンプルのＤＮＡの少なくとも一部分及び（高メチル化画分とも称される）第１のサブサンプルのＤＮＡの少なくとも一部分を含むプールを調製することを含む。例えば、エピジェネティック標的領域及び／又は配列可変標的領域を含む標的領域は、プールから捕捉されてもよい。標的領域セットを本明細書中の他の箇所に記載のサブサンプルの少なくとも一部分から捕捉するステップは、第１及び第２のサブサンプルからのＤＮＡを含むプールに対して実施される捕捉ステップを包含する。プール中のＤＮＡを増幅するステップは、標的領域をプールから捕捉する前に実施してもよい。捕捉ステップは、本明細書中の他の箇所に記載の特徴のいずれかを有してもよい。
【0251】
エピジェネティック標的領域は、本明細書中の別の箇所で考察のとおり、それらが腫瘍に起源を持つか若しくは健常細胞に起源を持つか、又はそれらの起源である組織のタイプが何であるかに応じて、メチル化レベル及び／又は断片化パターンにおける差異を示し得る。配列可変標的領域は、それらが腫瘍に起源を持つか又は健常細胞に起源を持つかに応じて、配列における差異を示し得る。
【0252】
低メチル化画分からのエピジェネティック標的領域の分析は、いくつかの適用において、高メチル化画分及び低メチル化画分からの配列可変標的領域並びに高メチル化画分からのエピジェネティック標的領域の分析よりも有用でない可能性がある。そのようなものとして、配列可変標的領域及びエピジェネティック標的領域が捕捉中である場合の方法では、後者は、高メチル化画分及び低メチル化画分からの配列可変標的領域並びに高メチル化画分からのエピジェネティック標的領域の１つ以上より少ない程度まで捕捉され得る。例えば、配列可変標的領域は、高メチル化画分とともにプールされていない低メチル化画分の一部分から捕捉することができ、プールは、高メチル化画分からのＤＮＡの一部（例えば、大半、実質的に全て、又は全て）、及び低メチル化画分からのＤＮＡを含めないか、又はその一部（ｎｏｎｅ ｏｒ ｓｏｍｅ）（例えば、少数）によって調製することができる。こうした手法は、低メチル化画分からのエピジェネティック標的領域を配列決定することを低減又は除去し、それによりさらなる分析にとって十分である配列決定データの量を低減することができる。
【0253】
いくつかの実施形態では、プール中の低メチル化画分のＤＮＡの少数を含めることで、１つ以上のエピジェネティックな特徴（例えば、本明細書中の別の箇所で詳細に考察されているメチル化又は他のエピジェネティックな特徴）の、例えば相対ベースでの定量化が容易になる。
【0254】
いくつかの実施形態では、プールは、低メチル化画分のＤＮＡの少数、例えば、低メチル化画分のＤＮＡの約５０％未満、例えば、低メチル化画分のＤＮＡの約４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、又は５％以下を含む。いくつかの実施形態では、プールは、低メチル化画分のＤＮＡの約５％～２５％を含む。いくつかの実施形態では、プールは、低メチル化画分のＤＮＡの約１０％～２０％を含む。いくつかの実施形態では、プールは、低メチル化画分のＤＮＡの約１０％を含む。いくつかの実施形態では、プールは、低メチル化画分のＤＮＡの約１５％を含む。いくつかの実施形態では、プールは、低メチル化画分のＤＮＡの約２０％を含む。
【0255】
いくつかの実施形態では、プールは、高メチル化画分の一部分を含み、それは高メチル化画分のＤＮＡの少なくとも約５０％であってもよい。例えば、プールは、高メチル化画分のＤＮＡの少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％を含んでもよい。いくつかの実施形態では、プールは、高メチル化画分のＤＮＡの５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、又は９５～１００％を含む。いくつかの実施形態では、第２のプールは、高メチル化画分の全て又は実質的に全てを含む。
【0256】
いくつかの実施形態では、方法は、低メチル化画分のＤＮＡの少なくとも一部分を含む第１のプールを調製することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、高メチル化画分のＤＮＡの少なくとも一部分を含む第２のプールを調製することを含む。いくつかの実施形態では、第１のプールは、高メチル化画分のＤＮＡの一部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のプールは、低メチル化画分のＤＮＡの一部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のプールは、低メチル化画分のＤＮＡの大半、及び任意選択的に高メチル化画分のＤＮＡの少数を含む。いくつかの実施形態では、第２のプールは、高メチル化画分のＤＮＡの大半及び低メチル化画分のＤＮＡの少数を含む。中程度にメチル化された画分を含むいくつかの実施形態では、第２のプールは、中程度にメチル化された画分のＤＮＡの少なくとも一部分、例えば、中程度にメチル化された画分のＤＮＡの大半を含む。いくつかの実施形態では、第１のプールは、低メチル化画分のＤＮＡの大半を含み、第２のプールは、高メチル化画分のＤＮＡの大半及び中程度にメチル化された画分のＤＮＡの大半を含む。
【0257】
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも標的領域の第１のセットを第１のプールから捕捉することを含み、例えば、第１のプールは、上の実施形態のいずれかに記載されるとおりである。いくつかの実施形態では、第１のセットは、配列可変標的領域を含む。いくつかの実施形態では、第１のセットは、低メチル化可変標的領域及び／又は断片化可変標的領域を含む。いくつかの実施形態では、第１のセットは、配列可変標的領域及び断片化可変標的領域を含む。いくつかの実施形態では、第１のセットは、配列可変標的領域、低メチル化可変標的領域及び断片化可変標的領域を含む。第１のプール中のＤＮＡを増幅するステップは、この捕捉ステップ前に実施してもよい。いくつかの実施形態では、標的領域の第１のセットを第１のプールから捕捉することは、第１のプールのＤＮＡを捕捉プローブの第１のセットと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブの第１のセットは、配列可変標的領域に特異的な標的結合プローブを含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブの第１のセットは、配列可変標的領域、低メチル化可変標的領域及び／又は断片化可変標的領域に特異的な標的結合プローブを含む。
【0258】
いくつかの実施形態では、方法は、標的領域の第２のセット又は標的領域の複数のセットを第２のプールから捕捉することを含み、例えば、第１のプールは、上の実施形態のいずれかに記載されるとおりである。いくつかの実施形態では、第２の複数は、エピジェネティック標的領域、例えば、高メチル化可変標的領域及び／又は断片化可変標的領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の複数は、配列可変標的領域及びエピジェネティック標的領域、例えば、高メチル化可変標的領域及び／又は断片化可変標的領域を含む。第２のプール中のＤＮＡを増幅するステップは、この捕捉ステップ前に実施してもよい。いくつかの実施形態では、標的領域の第２の複数のセットを第２のプールから捕捉することは、第１のプールのＤＮＡを捕捉プローブの第２のセットと接触させることを含み、捕捉プローブの第２のセットは、配列可変標的領域に特異的な標的結合プローブ及びエピジェネティック標的領域に特異的な標的結合プローブを含む。いくつかの実施形態では、標的領域の第１のセット及び標的領域の第２のセットは、同一でない。例えば、標的領域の第１のセットは、標的領域の第２のセット内に存在しない１つ以上の標的領域を含んでもよい。代替的に又は追加的に、標的領域の第２のセットは、標的領域の第１のセット内に存在しない１つ以上の標的領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの高メチル化可変標的領域は、第２のプールから捕捉されるが、第１のプールから捕捉されない。いくつかの実施形態では、複数の高メチル化可変標的領域は、第２のプールから捕捉されるが、第１のプールから捕捉されない。いくつかの実施形態では、標的領域の第１のセットは、配列可変標的領域を含み、且つ／又は標的領域の第２のセットは、エピジェネティック標的領域を含む。いくつかの実施形態では、標的領域の第１のセットは、配列可変標的領域、及び断片化可変標的領域を含み；且つ標的領域の第２のセットは、エピジェネティック標的領域、例えば、高メチル化可変標的領域及び断片化可変標的領域を含む。いくつかの実施形態では、標的領域の第１のセットは、配列可変標的領域、断片化可変標的領域を含み、低メチル化可変標的領域を含み；且つ標的領域の第２のセットは、エピジェネティック標的領域、例えば、高メチル化可変標的領域及び断片化可変標的領域を含む。
【0259】
いくつかの実施形態では、第１のプールは、低メチル化画分のＤＮＡの大半及び高メチル化画分のＤＮＡの一部分（例えば、約半分）を含み、第２のプールは、高メチル化画分のＤＮＡの一部分（例えば、約半分）を含む。いくつかのそのような実施形態では、標的領域の第１のセットは、配列可変標的領域を含み、且つ／又は標的領域の第２のセットは、エピジェネティック標的領域を含む。配列可変標的領域及び／又はエピジェネティック標的領域は、本明細書中の他の箇所に記載の実施形態のいずれかに記載のとおりであってもよい。
【0260】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡの画分は、ライブラリー調製の酵素ステップにおける調製において脱塩及び富化される。構造変異を含む配列は、低メチル化される傾向があり得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＤＮＡの再構成された配列に対して逆平行方向にアニールする少なくとも２つのプライマーを含む複数のプライマーと接触されているＤＮＡは、低メチル化画分の少なくとも一部分に由来するか又はそれを含む。低メチル化画分の少なくとも一部分に由来するか又はそれを含むＤＮＡは、中程度の画分又は高メチル化画分などの１つ以上の他の画分の少なくとも一部分に由来するか又はそれを含むＤＮＡと組み合わせてもよく、又は組み合わさなくてもよい。
【0261】
増幅
アダプターによって隣接されているサンプル核酸は、ＰＣＲ及び他の増幅方法によって増幅することができる。増幅は、典型的に、増幅対象のＤＮＡ分子に隣接するアダプター内のプライマー結合部位に結合しているプライマーによって刺激される。増幅方法は、サーモサイクリングに起因する、変性、アニーリング及び伸長のサイクルを含み得る、又は転写媒介性増幅などの場合、等温であり得る。他の増幅方法は、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸配列に基づく増幅、及び自己持続的配列に基づく複製を含む。
アダプターによって隣接されているサンプル核酸は、ＰＣＲ及び他の増幅方法によって増幅することができる。増幅は、典型的に、増幅対象のＤＮＡ分子に隣接するアダプター内のプライマー結合部位に結合しているプライマーによって刺激される。増幅方法は、サーモサイクリングに起因する、変性、アニーリング及び伸長のサイクルを含み得る、又は転写媒介性増幅などの場合、等温であり得る。他の増幅方法は、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸配列に基づく増幅、及び自己持続的配列に基づく複製を含む。
【0262】
いくつかの実施形態では、本方法では、二本鎖核酸の少なくとも５０、６０、７０又は８０％の増幅をもたらす、Ｔテールアダプター及びＣテールアダプターとのｄｓＤＮＡライゲーションが実施される。好ましくは、本方法により、増幅された分子の量又は数が、Ｔテールアダプター単独によって実施される対照方法と比較して、少なくとも１０、１５又は２０％増加する。
【0263】
いくつかの実施形態では、サンプル核酸は、配列決定前に増幅される。増幅は、変換ステップの前及び／又は後であってもよい。増幅は、いくつかの場合、１つ以上の捕捉ステップの前であってもよい。いくつかの実施形態では、ライゲートは、増幅前に又は増幅と同時に行われる。
【0264】
いくつかの実施形態では、増幅は、アダプターオリゴヌクレオチドにおけるプライマー結合部位に結合しているプライマーによって刺激される。アダプターの既知の修飾ヌクレオシドは、プライマー結合部位の外側に存在してもよい、即ち、品質管理方法に使用される既知の修飾ヌクレオシドは、プライマー結合部位に存在しない、又は増幅プライマーによって結合されない。
【0265】
捕捉プローブ；標的領域の富化、捕捉及び使用
サンプル中の核酸は、標的配列を有する分子がその後の分析のために捕捉される場合の捕捉ステップを受け得る。捕捉は、当該技術分野で公知の任意の好適な手法を用いて実施してもよい。標的捕捉は、捕捉部分、例えば、ビオチン又は以下に記される他の例で標識されているオリゴヌクレオチドベイトを含むベイトセットの使用を含み得る。プローブは、遺伝子などの領域のパネルを通じて並べて表示するために選択されている配列を有し得る。こうしたベイトセットは、標的分子のベイトとのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でサンプルと組み合わされる。次に、捕捉された分子は、捕捉部分を用いて単離される。例えば、ビオチン捕捉部分は、ビーズベースのストレプトアビジンを介する。こうした方法は、例えば、参照により本明細書に援用される、２０１７年１２月２６日交付の米国特許第９，８５０，５２３号明細書にさらに記載されている。
サンプル中の核酸は、標的配列を有する分子がその後の分析のために捕捉される場合の捕捉ステップを受け得る。捕捉は、当該技術分野で公知の任意の好適な手法を用いて実施してもよい。標的捕捉は、捕捉部分、例えば、ビオチン又は以下に記される他の例で標識されているオリゴヌクレオチドベイトを含むベイトセットの使用を含み得る。プローブは、遺伝子などの領域のパネルを通じて並べて表示するために選択されている配列を有し得る。こうしたベイトセットは、標的分子のベイトとのハイブリダイゼーションを可能にする条件下でサンプルと組み合わされる。次に、捕捉された分子は、捕捉部分を用いて単離される。例えば、ビオチン捕捉部分は、ビーズベースのストレプトアビジンを介する。こうした方法は、例えば、参照により本明細書に援用される、２０１７年１２月２６日交付の米国特許第９，８５０，５２３号明細書にさらに記載されている。
【0266】
捕捉部分は、限定はされないが、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、特定のヌクレオチド配列を含む核酸、抗体によって認識されるハプテン、及び磁気吸引性粒子を含む。抽出部分は、ビオチン／ストレプトアビジン又はハプテン／抗体などの結合ペアのメンバーであり得る。いくつかの実施形態では、分析物に付着されている捕捉部分は、単離可能な部分、例えば、磁気吸引性粒子又は遠心分離を通じて沈降され得る大きい粒子に付着されているその結合ペアによって捕捉される。捕捉部分は、捕捉部分を有する核酸の捕捉部分を欠いている核酸からの親和性分離を可能にする分子の任意のタイプであり得る。例示的な捕捉部分は、固相又はオリゴヌクレオチドに連結されているか又は連結可能であるストレプトアビジンに結合することによって親和性分離を可能にするビオチンであり、それは固相に連結されているか又は連結可能である相補的オリゴヌクレオチドに結合することによって親和性分離を可能にする。
【0267】
いくつかの実施形態では、型特異的なエピジェネティック変異を含む領域を含むＤＮＡが捕捉される。いくつかの実施形態では、変異は、健常細胞内に存在するが、通常は血液サンプルなどのサンプルタイプ中に存在しない。いくつかの実施形態では、変異は、異常細胞（例えば、過形成、異形成、又は新生物細胞）内に存在する。
【0268】
いくつかの実施形態では、サンプル又は第１のサブサンプルから捕捉されている第１の捕捉されたエピジェネティック標的領域セットは、高メチル化可変標的領域を含む。いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域は、１つ以上の関連する細胞型又は組織型からの健常ｃｆＤＮＡにおいて型特異的な高メチル化を示す。任意の特定の理論によって拘束されることは望まないが、がん細胞の存在は、（例えば、がん及び／又は周囲組織からの）血流へのＤＮＡの排出を増加させ得る。そのようなものとして、ｃｆＤＮＡの起源の組織の分布は、発がん時に変化し得る。したがって、第１のサブサンプル中の高メチル化可変標的領域のレベル増加は、がんの存在（又は対象の病歴に応じては、再発）の指標であり得る。
【0269】
いくつかの実施形態では、本明細書中の方法は、第２の捕捉されたエピジェネティック標的領域セットをサンプル又は第２のサブサンプルから捕捉することを含む。いくつかの実施形態では、第２のエピジェネティック標的領域セットは、低メチル化可変標的領域を含む。任意の特定の理論によって拘束されることは望まないが、がん細胞は、同じ組織型の健常細胞よりも、より多くのＤＮＡを血流に排出し得る。そのようなものとして、ｃｆＤＮＡの起源の組織の分布は、発がん時に変化し得る。したがって、第２のサブサンプル中の低メチル化可変標的領域のレベル増加は、がんの存在（又は対象の病歴に応じては、再発）の指標であり得る。
【0270】
加えて、捕捉された標的領域セットは、配列可変標的領域セットに対応するＤＮＡを含んでもよい。捕捉されたセットを組み合わせて、組み合わされた捕捉されたセットを提供してもよい。
【0271】
配列可変標的領域セット及びエピジェネティック標的領域セットに対応するＤＮＡを含む捕捉されたセットが上で考察されている組み合わされた捕捉されたセットを含むいくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに対応するＤＮＡは、エピジェネティック標的領域セットに対応するＤＮＡより大きい濃度、例えば、１．１～１．２倍大きい濃度、１．２～１．４倍大きい濃度、１．４～１．６倍大きい濃度、１．６～１．８倍大きい濃度、１．８～２．０倍大きい濃度、２．０～２．２倍大きい濃度、２．２～２．４倍大きい濃度、２．４～２．６倍大きい濃度、２．６～２．８倍大きい濃度、２．８～３．０倍大きい濃度、３．０～３．５倍大きい濃度、３．５～４．０倍大きい濃度、４．０～４．５倍大きい濃度、４．５～５．０倍大きい濃度、５．０～５．５倍大きい濃度、５．５～６．０倍大きい濃度、６．０～６．５倍大きい濃度、６．５～７．０倍大きい濃度、７．０～７．５倍大きい濃度、７．５～８．０倍大きい濃度、８．０～８．５倍大きい濃度、８．５～９．０倍大きい濃度、９．０～９．５倍大きい濃度、９．５～１０．０倍大きい濃度、１０～１１倍大きい濃度、１１～１２倍大きい濃度、１２～１３倍大きい濃度、１３～１４倍大きい濃度、１４～１５倍大きい濃度、１５～１６倍大きい濃度、１６～１７倍大きい濃度、１７～１８倍大きい濃度、１８～１９倍大きい濃度、１９～２０倍大きい濃度、２０～３０倍大きい濃度、３０～４０倍大きい濃度、４０～５０倍大きい濃度、５０～６０倍大きい濃度、６０～７０倍大きい濃度、７０～８０倍大きい濃度、８０～９０倍大きい濃度、又は９０～１００倍大きい濃度で存在し得る。濃度における差異の程度は、定義セクションで考察のとおり、標的領域のフットプリントサイズに対する正規化を説明する。
【0272】
いくつかの実施形態では、捕捉されているＤＮＡは、イントロン領域を含む。いくつかの実施形態では、イントロン領域は、ＤＮＡを、新生（例えば、腫瘍又はがん）細胞及び健常細胞、例えば非新生の循環細胞と区別する可能性が高い１つ以上のイントロンを含む。例えば、一部の新生細胞内に存在し、健常細胞では不在であることが知られている再配列を含むイントロンを使用して、ＤＮＡを新生（例えば、腫瘍又はがん）細胞及び健常細胞と区別することができる。いくつかの実施形態では、再配列は、転位である。
【0273】
いくつかの実施形態では、捕捉されたイントロン領域は、少なくとも３０ｂｐ、例えば、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、又は少なくとも４００ｋｂのフットプリントを有する。いくつかの実施形態では、イントロン標的領域セットは、３０ｂｐ～１０００ｋｂ、例えば、３０ｂｐ～１００ｂｐ、１００ｂｐ～２００ｂｐ、２００ｂｐ～５００ｂｐ、５００ｂｐ～ｌｋｂ、１ｋｂ～２ｋｂ、２ｋｂ～５ｋｂ、５ｋｂ～１０ｋｂ、１０ｋｂ～２０ｋｂ、２０ｋｂ～５０ｋｂ、５０ｋｂ～１００ｋｂ、１００～２００ｋｂ、２００～３００ｋｂ、３００～４００ｋｂ、４００～５００ｋｂ、５００～６００ｋｂ、６００～７００ｋｂ、７００～８００ｋｂ、８００～９００ｋｂ、及び９００～１，０００ｋｂの範囲内のフットプリントを有する。
【0274】
例示的な再配列、例えば、本明細書に記載の方法を用いて検出可能であるイントロン転位としては、限定はされないが、転位に関与する２つの遺伝子の少なくとも１つが受容体チロシンキナーゼである転位が挙げられる。例示的な転位産物は、ＢＣＲ－ＡＢＬ融合体、及びＡＬＫ、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＮＴＲＫ１、ＲＥＴ、又はＲＯＳ１のいずれかを含む融合体である。
【0275】
いくつかの実施形態では、捕捉されているＤＮＡは、型特異的なエピジェネティック変異を有する標的領域を含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、型特異的なエピジェネティック変異を有する標的領域からなる。いくつかの実施形態では、型特異的なエピジェネティック変異、例えば、差次的メチル化又は型特異的な断片化パターンは、１つ以上の関連する細胞型又は組織型の細胞からのＤＮＡをサンプル中又は対象中に存在する他の細胞型又は組織型からのＤＮＡと区別する可能性が高い。
【0276】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を用いて捕捉又は富化されている核酸は、捕捉されたＤＮＡ、例えば、１つ以上の捕捉されたＤＮＡのセットを含む。いくつかの実施形態では、捕捉されたＤＮＡは、異なる免疫細胞型において差次的にメチル化されている標的領域を含む。いくつかの実施形態では、免疫細胞型は、希少な又は密接に関連した免疫細胞型、例えば、異なる分化のステージでの活性化及びナイーブリンパ球又は骨髄系細胞を含む。
【0277】
いくつかの実施形態では、サンプル又は第１のサブサンプルから捕捉されている捕捉されたエピジェネティック標的領域セットは、高メチル化可変標的領域を含む。いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域は、１つ以上の関連する細胞型又は組織型において差次的又は排他的に高メチル化される。いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域は、１つの細胞型又は１つの免疫細胞型、又はクラスター内の１つの免疫細胞型において差次的又は排他的に高メチル化される。いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域は、識別可能により高い、又は１つの細胞型若しくは１つの免疫細胞型若しくはクラスター内の１つの免疫細胞型において排他的に存在する程度まで高メチル化される。こうした高メチル化可変標的領域は、他の細胞型又は組織型において高メチル化され得るが、１つ以上の関連する細胞型又は組織型において認められる程度には至らない。いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域は、健常なｃｆＤＮＡにおいて、少なくとも１つの他の組織型における場合より低いメチル化を示す。いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域は、１つ以上の関連する細胞型又は組織型の異常細胞からのｃｆＤＮＡにおいて、さらにより高いメチル化を示す。いくつかの実施形態では、標的領域は、異常に高いコピー数を有する高メチル化領域を含む。いくつかのそのような実施形態では、標的領域は、健常組織及び罹患した結腸組織において高メチル化され、前がん又は癌性結腸組織において異常に高いコピー数を有する。そのような標的領域の例が下の表１に示される。
【0278】
【表1】
【0279】
【表2】
【0280】
いくつかの実施形態では、サンプル又はサブサンプルから捕捉されている捕捉されたエピジェネティック標的領域セットは、低メチル化可変標的領域を含む。いくつかの実施形態では、低メチル化可変標的領域は、１つ以上の関連する細胞型又は組織型において排他的に低メチル化される。いくつかの実施形態では、低メチル化可変標的領域は、１つの細胞型又は１つの免疫細胞型、又はクラスター内の１つの免疫細胞型において排他的に低メチル化される。いくつかの実施形態では、低メチル化可変標的領域は、１つの細胞型又は１つの免疫細胞型、又はクラスター内の１つの免疫細胞型において排他的に存在する程度まで低メチル化される。こうした低メチル化可変標的領域は、他の細胞型又は組織型において低メチル化され得るが、１つ以上の細胞型又は組織型において認められる程度には至らない。いくつかの実施形態では、低メチル化可変標的領域は、健常なｃｆＤＮＡにおいて、少なくとも１つの他の組織型における場合より高いメチル化を示す。
【0281】
任意の特定の理論に拘束されることを望むものではないが、がんを有する個体において、増殖する又は活性化された免疫細胞及び／又は死滅するがん細胞は、それぞれ、健常者における免疫細胞及び／又は同じ組織型の健常細胞よりも多くのＤＮＡを血流に排出し得る。そのようなものとして、ｃｆＤＮＡの起源の細胞型及び／又は組織の分布は、発がん時に変化し得る。したがって、特定の細胞型又は組織型に起源を持つｃｆＤＮＡの存在及び／又はレベルは、疾患の指標であり得る。高メチル化及び／又は低メチル化における変異は、疾患の指標であり得る。例えば、分割ステップ後のサブサンプル中の高メチル化可変標的領域及び／又は低メチル化可変標的領域のレベル増加は、がんの存在（又は対象の病歴に応じては、再発）の指標であり得る。
【0282】
様々な細胞型の間を区別するのに有用である、限定はされないが、免疫細胞型を含む、例示的な高メチル化可変標的領域及び低メチル化可変標的領域は、様々な細胞型から得られたＤＮＡを、例えば、Ｓｃｏｔｔ，Ｃ．Ａ．，Ｄｕｒｙｅａ，Ｊ．Ｄ．，ＭａｃＫａｙ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｂｕｌｋ ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ，”Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ ２１，１５６（２０２０）（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／ｓｌ３０５９－０２０－０２０６５－５）に記載されるような全ゲノムバイサルファイト配列決定を介して分析することによって同定された。全ゲノムバイサルファイト配列決定データは、インターネット上のｄｃｃ．ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ－ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ．ｅｕで閲覧可能なＢｌｕｅｐｒｉｎｔコンソーシアムから入手可能である。
【0283】
いくつかの実施形態では、例えば、国際公開第２０２０／１６０４１４号パンフレットに記載のとおり、第１及び第２の捕捉された標的領域セットはそれぞれ、配列可変標的領域セットに対応するＤＮＡ及びエピジェネティック標的領域セットに対応するＤＮＡを含む。第１及び第２の捕捉されたセットを組み合わせて、組み合わされた捕捉されたセットを提供してもよい。配列可変標的領域セット及びエピジェネティック標的領域セットは、その全体が参照により本明細書に援用される、国際公開第２０２０／１６０４１４号パンフレットにおけるこうしたセットについて記載された特徴のいずれかを有してもよい。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、高メチル化可変標的領域セットを含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、低メチル化可変標的領域セットを含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、ＣＴＣＦ結合領域を含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、断片化可変標的領域を含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、転写開始部位を含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、がんにおける限局的増幅を示し得る領域、例えば、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＥ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＲＡＦ１の１つ以上を含む。例えば、いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、前記標的の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８を含む。
【0284】
いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットは、がんにおける体細胞突然変異を受けることが知られている複数の領域を含む。いくつかの態様では、配列可変標的領域セットは、複数の異なる遺伝子又はゲノム領域（「パネル」）であって、がんを有する対象の判定された割合がパネルにおける１つ以上の異なる遺伝子又はゲノム領域内の遺伝子変異体又は腫瘍マーカーを示すように選択されるものを標的にする。パネルは、一定数の塩基対に対する配列決定のための領域を制限するために選択されてもよい。パネルを選択して、例えば、本明細書中の他の箇所に記載されるプローブの親和性及び／又は量を調節することによって、所望量のＤＮＡを配列決定することができる。パネルをさらに選択して、所望の配列リード深度を達成することができる。パネルを選択して、配列決定された塩基対の量に対する所望の配列リード深度又は配列リードカバー率を達成することができる。パネルを選択して、サンプル中の１つ以上の遺伝子変異体を検出するための理論上の感受性、理論上の特異性、及び／又は理論上の正確性を達成することができる。
【0285】
領域のパネルを検出するためのプローブは、目的のゲノム領域（ホットスポット領域）を検出するためのものを含み得る。クロマチン構造についての情報は、プローブの設計において考慮することができ、且つ／又はプローブは、特定部位（例えば、ＫＲＡＳコドン１２及び１３）が捕捉され得る可能性を最大化するように設計することができ、且つヌクレオソーム結合パターン及びＧＣ配列組成物によって影響を受けるｃｆＤＮＡのカバー率及び断片サイズ変異の分析に基づいて捕捉を最適化するように設計してもよい。本明細書で用いられる領域は、ヌクレオソーム位置及びＧＣモデルに基づいて最適化されている非ホットスポット領域も含み得る。
【0286】
領域のパネルを検出するためのプローブは、目的のゲノム領域（ホットスポット領域）を検出するためのものを含み得る。クロマチン構造についての情報は、プローブの設計において考慮することができ、且つ／又はプローブは、特定部位（例えば、ＫＲＡＳコドン１２及び１３）が捕捉され得る可能性を最大化するように設計することができ、且つヌクレオソーム結合パターン及びＧＣ配列組成物によって影響を受けるｃｆＤＮＡのカバー率及び断片サイズ変異の分析に基づいて捕捉を最適化するように設計してもよい。本明細書で用いられる領域は、ヌクレオソーム位置及びＧＣモデルに基づいて最適化されている非ホットスポット領域も含み得る。
【0287】
目的のゲノム位置のリストの例は、国際公開第２０２０／１６０４１４号パンフレットの表３及び表４に見出すことができる。いくつかの実施形態では、本開示の方法において使用されている配列可変標的領域セットは、国際公開第２０２０／１６０４１４号パンフレットの表３の遺伝子の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、又は７０の少なくとも一部分を含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法において使用されている配列可変標的領域セットは、国際公開第２０２０／１６０４１４号パンフレットの表４の遺伝子の少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、又は７３の少なくとも一部分を含む。追加的又は代替的に、好適な標的領域セットは、文献から入手可能である。例えば、参照により本明細書に援用される、Ｇａｌｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １３：ｅ０１９４６３０（２０１８）は、配列可変標的領域セットの一部又は全部として使用可能である３５のがん関連遺伝子標的のパネルを記載している。これら３５の標的は、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＤ１２、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、及びＵ２ＡＦ１である。
【0288】
いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットは、少なくとも１０、２０、３０、又は３５のがん関連遺伝子、例えば、上に列記されたがん関連遺伝子及び国際公開第２０２０／１６０４１４号パンフレット中のがん関連遺伝子からの標的領域を含む。
【0289】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブの収集は、本明細書に記載の方法において使用され、例えば、そのように行うための本明細書で開示される任意の方法によって調製されている捕捉プローブが含まれる。いくつかの実施形態では、捕捉プローブの収集は、配列可変標的領域セットに特異的な標的結合プローブ及び／又はエピジェネティック標的領域セットに特異的な標的結合プローブをさらに含む。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的結合プローブの捕捉収率は、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的結合プローブの捕捉収率より高い（例えば、少なくとも２倍高い）。いくつかの実施形態では、捕捉プローブの収集は、配列可変標的領域セットに特異的な捕捉収率であって、エピジェネティック標的領域セットに特異的なその捕捉収率より高い（例えば、少なくとも２倍高い）捕捉収率を有するように設計される。
【0290】
いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的結合プローブの捕捉収率は、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的結合プローブの捕捉収率よりも少なくとも１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．２５倍、２．５倍、２．７５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍高い。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的結合プローブの捕捉収率は、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的結合プローブの捕捉収率よりも１．２５～１．５倍、１．５～１．７５倍、１．７５～２倍、２～２．２５倍、２．２５～２．５倍、２．５～２．７５倍、２．７５～３倍、３～３．５倍、３．５～４倍、４～４．５倍、４．５～５倍、５～５．５倍、５．５～６倍、６～７倍、７～８倍、８～９倍、９～１０倍、１０～１１倍、１１～１２倍、１３～１４倍、又は１４～１５倍高い。
【0291】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブの収集は、配列可変標的領域セットに特異的な捕捉収率であって、エピジェネティック標的領域セットに対するその捕捉収率よりも少なくとも１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．２５倍、２．５倍、２．７５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍高い捕捉収率を有するように設計される。いくつかの実施形態では、捕捉プローブの収集は、配列可変標的領域セットに特異的な捕捉収率であって、エピジェネティック標的領域セットに特異的なその捕捉収率よりも１．２５～１．５倍、１．５～１．７５倍、１．７５～２倍、２～２．２５倍、２．２５～２．５倍、２．５～２．７５倍、２．７５～３倍、３～３．５倍、３．５～４倍、４～４．５倍、４．５～５倍、５～５．５倍、５．５～６倍、６～７倍、７～８倍、８～９倍、９～１０倍、１０～１１倍、１１～１２倍、１３～１４倍、又は１４～１５倍高い捕捉収率を有するように設計される。
【0292】
プローブの収集は、配列可変標的領域セットに対するより高い捕捉収率を、濃度、異なる長さ及び／又はケミストリー（例えば、親和性に影響する）、並びにそれらの組み合わせを含む様々な方法において提供するように設計することができる。親和性は、プローブ長さを調節し、且つ／又は以下で考察されるようなヌクレオチド修飾を含めることによって調節することができる。
【0293】
いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な捕捉プローブは、エピジェネティック標的領域セットに特異的な捕捉プローブより高い濃度で存在する。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的結合プローブの濃度は、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的結合プローブの濃度よりも少なくとも１．２５倍、１．５倍、１．７５倍、２倍、２．２５倍、２．５倍、２．７５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、又は１５倍高い。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な標的結合プローブの濃度は、エピジェネティック標的領域セットに特異的な標的結合プローブの濃度よりも１．２５～１．５倍、１．５～１．７５倍、１．７５～２倍、２～２．２５倍、２．２５～２．５倍、２．５～２．７５倍、２．７５～３倍、３～３．５倍、３．５～４倍、４～４．５倍、４．５～５倍、５～５．５倍、５．５～６倍、６～７倍、７～８倍、８～９倍、９～１０倍、１０～１１倍、１１～１２倍、１３～１４倍、又は１４～１５倍高い。かかる実施形態では、濃度は、各セットにおける個別プローブの体積濃度当たりの平均質量を指してもよい。
【0294】
いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な捕捉プローブは、エピジェネティック標的領域セットに特異的な捕捉プローブよりも、それらの標的に対して高い親和性を有する。親和性は、当業者に公知の任意の方法で、例えば、異なるプローブケミストリーを使用することによって調節することができる。例えば、特定のヌクレオチド修飾、例えば、（特定の配列内容における）シトシン５－メチル化、２’糖位置にヘテロ原子を提供する修飾、及びＬＮＡヌクレオチドは、二本鎖核酸の安定性を増加させることができ、そのような修飾を有するオリゴヌクレオチドがそれらの相補的配列に対して比較的より高い親和性を有することが示される。例えば、Ｓｅｖｅｒｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３９：８７４０－８７５１（２０１１）；Ｆｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４４２９－４４４３（１９９７）；米国特許第９，７３８，８９４号明細書を参照されたい。また、より長い配列の長さは、一般に親和性の増加をもたらすことになる。他のヌクレオチド修飾、例えば、核酸塩基ヒポキサンチンのグアニンとの置換は、オリゴヌクレオチドとその相補的配列との間の水素結合の量を低減することによって親和性を低下させる。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な捕捉プローブは、それらの標的に対するそれらの親和性を増加させる修飾を有する。いくつかの実施形態では、代替的又は追加的に、エピジェネティック標的領域セットに特異的な捕捉プローブは、それらの標的に対するそれらの親和性を低下させる修飾を有する。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な捕捉プローブは、エピジェネティック標的領域セットに特異的な捕捉プローブより長い平均長さ及び／又はより高い平均融解温度を有する。これらの実施形態は、捕捉収率における所望の倍数変化、例えば、上に記載の任意の倍数変化又はその範囲を達成するため、相互に及び／又は上で考察されるような濃度の差異と組み合わせてもよい。
【0295】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、捕捉部分を含む。捕捉部分は、本明細書に記載の捕捉部分のいずれか、例えばビオチンであってもよい。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、例えば、共有結合的に又は非共有結合的に、例えば、捕捉部分の結合ペアの相互作用を通じて、固体支持体に連結される。いくつかの実施形態では、固体支持体は、磁気ビーズなどのビーズである。
【0296】
いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的な捕捉プローブ及び／又はエピジェネティック標的領域セットに特異的な捕捉プローブは、上で考察された捕捉プローブセット、例えば、捕捉部分及び遺伝子などの領域のパネルを通じて並べて表示するように選択されている配列を含むプローブである。
【0297】
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、単一組成物で提供される。単一組成物は、溶液（液体又は凍結物）であってもよい。或いは、それは凍結乾燥物であってもよい。
【0298】
或いは、捕捉プローブは、例えば、エピジェネティック標的領域セットに特異的なプローブを含む第１の組成物及び配列可変標的領域セットに特異的なプローブを含む第２の組成物を含む、複数の組成物として提供することができる。これらのプローブを適切な割合で混合して、濃度及び／又は捕捉収率における前述の倍数変化のいずれかを伴う組み合わせたプローブ組成物を提供することができる。或いは、それらを（例えば、サンプルの一定分量による、又は連続的に同じサンプルによる）別々の捕捉手順において使用して、捕捉されたエピジェネティック標的領域及び配列可変標的領域をそれぞれ含む第１及び第２の組成物を提供することができる。
【0299】
エピジェネティック標的領域に特異的なプローブ
エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、新生（例えば、腫瘍又はがん）細胞からのＤＮＡを健常細胞、例えば非新生物循環細胞からのＤＮＡと区別する可能性が高い標的領域の１つ以上のタイプに特異的なプローブを含んでもよい。そのような領域の例示的なタイプは、本明細書中の、例えば捕捉されたセットに関連する上のセクションで詳細に考察されている。エピジェネティック標的領域セットに対するプローブはまた、例えば本明細書に記載される、１つ以上の対照領域に対するプローブを含んでもよい。
エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、新生（例えば、腫瘍又はがん）細胞からのＤＮＡを健常細胞、例えば非新生物循環細胞からのＤＮＡと区別する可能性が高い標的領域の１つ以上のタイプに特異的なプローブを含んでもよい。そのような領域の例示的なタイプは、本明細書中の、例えば捕捉されたセットに関連する上のセクションで詳細に考察されている。エピジェネティック標的領域セットに対するプローブはまた、例えば本明細書に記載される、１つ以上の対照領域に対するプローブを含んでもよい。
【0300】
いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、少なくとも１００ｋｂｐ、例えば、少なくとも２００ｋｂｐ、少なくとも３００ｋｂｐ、又は少なくとも４００ｋｂｐのフットプリントを有する。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、１００～２０Ｍｂｐ、例えば、１００～２００ｋｂｐ、２００～３００ｋｂｐ、３００～４００ｋｂｐ、４００～５００ｋｂｐ、５００～６００ｋｂｐ、６００～７００ｋｂｐ、７００～８００ｋｂｐ、８００～９００ｋｂｐ、９００～１，０００ｋｂｐ、１～１．５Ｍｂｐ、１．５～２Ｍｂｐ、２～３Ｍｂｐ、３～４Ｍｂｐ、４～５Ｍｂｐ、５～６Ｍｂｐ、６～７Ｍｂｐ、７～８Ｍｂｐ、８～９Ｍｂｐ、９～１０Ｍｂｐ、又は１０～２０Ｍｂｐの範囲のフットプリントを有する。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットは、少なくとも２０Ｍｂｐのフットプリントを有する。
【0301】
高メチル化可変標的領域
いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、１つ以上の高メチル化可変標的領域に特異的なプローブを含む。高メチル化可変標的領域は、本明細書中で高メチル化ＤＭＲ（差次的にメチル化された領域）と称してもよい。高メチル化可変標的領域は、上に記載されているもののいずれかであってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、表１に列記されている遺伝子座の複数、例えば、表１に列記されている遺伝子座の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、表２に列記されている遺伝子座の複数、例えば、表２に列記されている遺伝子座の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、表１又は表２に列記されている遺伝子座の複数、例えば、表１又は表２に列記されている遺伝子座の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、標的領域として含まれる各遺伝子座の場合、遺伝子の転写開始部位と停止コドン（交互スプライスされている遺伝子の最後の停止コドン）との間で結合するハイブリダイゼーション部位を有する１つ以上のプローブが存在し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のプローブは、列記された位置の３００ｂｐ以内、例えば、２００又は１００ｂｐ以内で結合する。いくつかの実施形態では、プローブは、上に列記されている位置と重複しているハイブリダイゼーション部位を有する。いくつかの実施形態では、高メチル化標的領域に特異的なプローブは、乳がん、結腸がん、腎臓がん、肝臓がん、及び肺がんの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つにおける高メチル化を集合的に示す、高メチル化標的領域の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのサブセットに特異的なプローブを含む。
いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、１つ以上の高メチル化可変標的領域に特異的なプローブを含む。高メチル化可変標的領域は、本明細書中で高メチル化ＤＭＲ（差次的にメチル化された領域）と称してもよい。高メチル化可変標的領域は、上に記載されているもののいずれかであってもよい。例えば、いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、表１に列記されている遺伝子座の複数、例えば、表１に列記されている遺伝子座の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、表２に列記されている遺伝子座の複数、例えば、表２に列記されている遺伝子座の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、表１又は表２に列記されている遺伝子座の複数、例えば、表１又は表２に列記されている遺伝子座の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、標的領域として含まれる各遺伝子座の場合、遺伝子の転写開始部位と停止コドン（交互スプライスされている遺伝子の最後の停止コドン）との間で結合するハイブリダイゼーション部位を有する１つ以上のプローブが存在し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のプローブは、列記された位置の３００ｂｐ以内、例えば、２００又は１００ｂｐ以内で結合する。いくつかの実施形態では、プローブは、上に列記されている位置と重複しているハイブリダイゼーション部位を有する。いくつかの実施形態では、高メチル化標的領域に特異的なプローブは、乳がん、結腸がん、腎臓がん、肝臓がん、及び肺がんの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つにおける高メチル化を集合的に示す、高メチル化標的領域の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのサブセットに特異的なプローブを含む。
【0302】
低メチル化可変標的領域
いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、１つ以上の低メチル化可変標的領域に特異的なプローブを含む。低メチル化可変標的領域は、本明細書中で低メチル化ＤＭＲ（差次的にメチル化された領域）と称してもよい。低メチル化可変標的領域は、上に記載されているもののいずれかであってもよい。例えば、１つ以上の低メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、反復配列、例えば、ＬＩＮＥ１要素、Ａｌｕ要素、セントロメアのタンデムリピート、ペリセントロメアのタンデムリピート、及びサテライトＤＮＡなどの領域に対するプローブを含んでもよく、健常細胞内で通常はメチル化されている遺伝子間領域は、腫瘍細胞内でメチル化の低下を示し得る。
いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、１つ以上の低メチル化可変標的領域に特異的なプローブを含む。低メチル化可変標的領域は、本明細書中で低メチル化ＤＭＲ（差次的にメチル化された領域）と称してもよい。低メチル化可変標的領域は、上に記載されているもののいずれかであってもよい。例えば、１つ以上の低メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、反復配列、例えば、ＬＩＮＥ１要素、Ａｌｕ要素、セントロメアのタンデムリピート、ペリセントロメアのタンデムリピート、及びサテライトＤＮＡなどの領域に対するプローブを含んでもよく、健常細胞内で通常はメチル化されている遺伝子間領域は、腫瘍細胞内でメチル化の低下を示し得る。
【0303】
いくつかの実施形態では、低メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、反復配列及び／又は遺伝子間領域に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、反復配列に特異的なプローブは、ＬＩＮＥ１要素、Ａｌｕ要素、セントロメアのタンデムリピート、ペリセントロメアのタンデムリピート、及び／又はサテライトＤＮＡの１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つに特異的なプローブを含む。
【0304】
がん関連低メチル化を示すゲノム領域に特異的な例示的なプローブは、ヒト染色体１のヌクレオチド８４０３５６５－８９５３７０８及び／又は１５１１０４７０１－１５１１０６０３５に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、低メチル化可変標的領域に特異的なプローブは、ヒト染色体１のヌクレオチド８４０３５６５－８９５３７０８及び／又は１５１１０４７０１－１５１１０６０３５と重複している又はそれを含む領域に特異的なプローブを含む。
【0305】
ＣＴＣＦ結合領域
いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、ＣＴＣＦ結合領域に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＣＦ結合領域に特異的なプローブは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、若しくは５００のＣＴＣＦ結合領域、又は１０～２０、２０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～５００、若しくは５００～１０００のＣＴＣＦ結合領域、例えば、上に記載されている、又は上で引用されているＣＴＣＦＢＳＤＢ若しくはＣｕｄｄａｐａｈら、Ｍａｒｔｉｎら、若しくはＲｈｅｅらの論文の１つ以上におけるＣＴＣＦ結合領域などに特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、ＣＴＣＦ結合部位の少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、又は少なくとも１０００ｂｐの上流及び下流領域を含む。
いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、ＣＴＣＦ結合領域に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＣＦ結合領域に特異的なプローブは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、若しくは５００のＣＴＣＦ結合領域、又は１０～２０、２０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～５００、若しくは５００～１０００のＣＴＣＦ結合領域、例えば、上に記載されている、又は上で引用されているＣＴＣＦＢＳＤＢ若しくはＣｕｄｄａｐａｈら、Ｍａｒｔｉｎら、若しくはＲｈｅｅらの論文の１つ以上におけるＣＴＣＦ結合領域などに特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、ＣＴＣＦ結合部位の少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、又は少なくとも１０００ｂｐの上流及び下流領域を含む。
【0306】
転写開始部位
いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、転写開始部位に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、転写開始部位に特異的なプローブは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、若しくは５００の転写開始部位、又は１０～２０、２０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～５００、若しくは５００～１０００の転写開始部位、例えば、ＤＢＴＳＳに列記されている転写開始部位などに特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、転写開始部位の少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、又は少なくとも１０００ｂｐの上流及び下流の配列に対するプローブを含む。
いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、転写開始部位に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、転写開始部位に特異的なプローブは、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、若しくは５００の転写開始部位、又は１０～２０、２０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～５００、若しくは５００～１０００の転写開始部位、例えば、ＤＢＴＳＳに列記されている転写開始部位などに特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに対するプローブは、転写開始部位の少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも７５０ｂｐ、又は少なくとも１０００ｂｐの上流及び下流の配列に対するプローブを含む。
【0307】
限局的増幅
上記のとおり、限局的増幅は体細胞突然変異であるが、それらは、メチル化における変化などの特定のエピジェネティックな変化を検出するための手法と類似する様式でリード頻度に基づいて配列決定することによって検出することができる。そのようなものとして、がんにおける限局的増幅を示し得る領域は、上で考察のとおり、エピジェネティック標的領域セットに含めることができる。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに特異的なプローブは、限局的増幅に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、限局的増幅に特異的なプローブは、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＥ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＲＡＦ１の１つ以上に特異的なプローブを含む。例えば、いくつかの実施形態では、限局的増幅に特異的なプローブは、前述の標的の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８の１つ以上に特異的なプローブを含む。
上記のとおり、限局的増幅は体細胞突然変異であるが、それらは、メチル化における変化などの特定のエピジェネティックな変化を検出するための手法と類似する様式でリード頻度に基づいて配列決定することによって検出することができる。そのようなものとして、がんにおける限局的増幅を示し得る領域は、上で考察のとおり、エピジェネティック標的領域セットに含めることができる。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに特異的なプローブは、限局的増幅に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、限局的増幅に特異的なプローブは、ＡＲ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＤ２、ＣＣＮＥ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＲＡＦ１の１つ以上に特異的なプローブを含む。例えば、いくつかの実施形態では、限局的増幅に特異的なプローブは、前述の標的の少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８の１つ以上に特異的なプローブを含む。
【0308】
対照領域
データ検証を容易にするため、対照領域を含むことは有用であり得る。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに特異的なプローブは、本質的に全てのサンプル中のメチル化されることが予想される対照メチル化領域に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに特異的なプローブは、本質的に全てのサンプル中の低メチル化されることが予想される対照低メチル化領域に特異的なプローブを含む。
データ検証を容易にするため、対照領域を含むことは有用であり得る。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに特異的なプローブは、本質的に全てのサンプル中のメチル化されることが予想される対照メチル化領域に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域セットに特異的なプローブは、本質的に全てのサンプル中の低メチル化されることが予想される対照低メチル化領域に特異的なプローブを含む。
【0309】
配列可変標的領域に特異的なプローブ
配列可変標的領域セットに対するプローブは、がんにおける体細胞突然変異を受けることが知られている複数の領域に特異的なプローブを含んでもよい。プローブは、本明細書に記載される任意の配列可変標的領域セットに特異的であってもよい。例示的な配列可変標的領域セットは、本明細書中の、例えば捕捉されたセットに関連する上のセクションで詳細に考察されている。
配列可変標的領域セットに対するプローブは、がんにおける体細胞突然変異を受けることが知られている複数の領域に特異的なプローブを含んでもよい。プローブは、本明細書に記載される任意の配列可変標的領域セットに特異的であってもよい。例示的な配列可変標的領域セットは、本明細書中の、例えば捕捉されたセットに関連する上のセクションで詳細に考察されている。
【0310】
いくつかの実施形態では、配列可変標的領域プローブセットは、少なくとも０．５ｋｂ、例えば、少なくとも１ｋｂ、少なくとも２ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、又は少なくとも４０ｋｂのフットプリントを有する。いくつかの実施形態では、エピジェネティック標的領域プローブセットは、０．５～１００ｋｂ、例えば、０．５～２ｋｂ、２～１０ｋｂ、１０～２０ｋｂ、２０～３０ｋｂ、３０～４０ｋｂ、４０～５０ｋｂ、５０～６０ｋｂ、６０～７０ｋｂ、７０～８０ｋｂ、８０～９０ｋｂ、及び９０～１００ｋｂの範囲内のフットプリントを有する。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域プローブセットは、少なくとも５０ｋｂｐ、例えば、少なくとも１００ｋｂｐ、少なくとも２００ｋｂｐ、少なくとも３００ｋｂｐ、又は少なくとも４００ｋｂｐのフットプリントを有する。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域プローブセットは、１００～２０００ｋｂｐ、例えば、１００～２００ｋｂｐ、２００～３００ｋｂｐ、３００～４００ｋｂｐ、４００～５００ｋｂｐ、５００～６００ｋｂｐ、６００～７００ｋｂｐ、７００～８００ｋｂｐ、８００～９００ｋｂｐ、９００～１，０００ｋｂｐ、１～１．５Ｍｂｐ又は１．５～２Ｍｂｐの範囲内のフットプリントを有する。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットは、少なくとも２Ｍｂｐのフットプリントを有する。
【0311】
いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表３の遺伝子の少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、又は少なくとも７０の少なくとも一部分に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表３のＳＮＶの少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、又は７０に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表３の融合の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は６つに特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表３のインデルの少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は３つの少なくとも一部分に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表４の遺伝子の少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、又は７３の少なくとも一部分に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表４のＳＮＶの少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、又は７３に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表４の融合の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、又は６つに特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表４のインデルの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、又は１８の少なくとも一部分に特異的なプローブを含む。いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、表５の遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、又は少なくとも２０の少なくとも一部分に特異的なプローブを含む。
【0312】
【表3】
【0313】
【表4】
【0314】
【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【0315】
いくつかの実施形態では、配列可変標的領域セットに特異的なプローブは、ＡＫＴ１、ＡＬＫ、ＢＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ２Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＯＸＬ２、ＧＡＴＡ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＫＩＴ、ＫＲＡＳ、ＭＥＤ１２、ＭＥＴ、ＭＹＣ、ＮＦＥ２Ｌ２、ＮＲＡＳ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＰＰ２Ｒ１Ａ、ＰＴＥＮ、ＲＥＴ、ＳＴＫ１１、ＴＰ５３、及びＵ２ＡＦｌなどの少なくとも１０、２０、３０、又は３５のがん関連遺伝子からの標的領域に特異的なプローブを含む。
【0316】
配列決定
一般に、事前の増幅の存在下又は不在下で、アダプターによって隣接されるサンプル核酸は、配列決定を施すことができる。配列決定方法としては、例えば、サンガー配列決定、ハイスループット配列決定、パイロシークエンシング、合成による配列決定、単一分子配列決定、ナノポア配列決定、半導体配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定（ＮＧＳ）、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模並列配列決定、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｇｅｎｉａ、Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、プライマー歩行、及びＰａｃＢｉｏ，ＳＯＬｉＤ，Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、又はＮａｎｏｐｏｒｅプラットフォームを使用する配列決定が挙げられる。配列決定反応は、複数のサンプルセットを実質的に同時に処理する、複数のレーン、複数のチャネル、複数のウェル、又は他の手段を含んでもよい、種々のサンプル処理ユニットで実施することができる。サンプル処理ユニットは、複数ランの処理を同時に可能にする複数のサンプルチャンバーも含み得る。
一般に、事前の増幅の存在下又は不在下で、アダプターによって隣接されるサンプル核酸は、配列決定を施すことができる。配列決定方法としては、例えば、サンガー配列決定、ハイスループット配列決定、パイロシークエンシング、合成による配列決定、単一分子配列決定、ナノポア配列決定、半導体配列決定、ライゲーションによる配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、デジタル遺伝子発現（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、次世代配列決定（ＮＧＳ）、合成による単一分子配列決定（ＳＭＳＳ）（Ｈｅｌｉｃｏｓ）、大規模並列配列決定、クローン単一分子アレイ（Ｓｏｌｅｘａ）、ショットガン配列決定、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｒｏｃｈｅ Ｇｅｎｉａ、Ｍａｘｉｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、プライマー歩行、及びＰａｃＢｉｏ，ＳＯＬｉＤ，Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ、又はＮａｎｏｐｏｒｅプラットフォームを使用する配列決定が挙げられる。配列決定反応は、複数のサンプルセットを実質的に同時に処理する、複数のレーン、複数のチャネル、複数のウェル、又は他の手段を含んでもよい、種々のサンプル処理ユニットで実施することができる。サンプル処理ユニットは、複数ランの処理を同時に可能にする複数のサンプルチャンバーも含み得る。
【0317】
いくつかの実施形態では、ゲノムの配列カバー率は、例えば、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、９９．９％又は１００％未満であってもよい。いくつかの実施形態では、配列反応は、例えば、ゲノムの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％の配列カバー率を提供し得る。配列カバー率は、例えば、少なくとも５、１０、２０、７０、１００、２００若しくは５００の異なる遺伝子、又は最大で、例えば、５０００、２５００、１０００、５００若しくは１００の異なる遺伝子に対して実施することができる。
【0318】
同時配列決定反応は、多重配列決定を用いて実施することができる。いくつかの場合、無細胞核酸は、少なくとも、例えば、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、又は１００，０００の配列決定反応で配列決定することができる。他の場合、無細胞核酸は、例えば、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、又は１００，０００未満の配列決定反応で配列決定することができる。配列決定反応は、連続的又は同時に実施することができる。その後のデータ分析は、配列決定反応の全部又は一部に対して実施することができる。いくつかの場合、データ分析は、少なくとも、例えば、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、又は１００，０００の配列決定反応に対して実施することができる。他の場合、データ分析は、例えば、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、５００００、又は１００，０００未満の配列決定反応に対して実施することができる。例示的なリード深度は、遺伝子座（塩基）当たり、１０００～５００００又は１０００～１００００又は１０００～２００００リードである。
【0319】
一般に、例えば、ＤＮＡの修飾ヌクレオシドプロファイルを分析するためのエピジェネティック標的領域の配列決定は、例えば、突然変異の分析のため、配列可変標的領域の配列決定より小さい深度の配列決定を必要とする。それ故、本明細書に記載される、より小さい配列決定深度は、いくつかの場合、本明細書に記載の方法にとって十分であり得る。
【0320】
分析
修飾ヌクレオシドを変換する変換手順を伴う偽陰性の検出
これらの実施形態では、開示の方法において使用されるアダプター配列は、既知の修飾を有する品質管理ヌクレオシドを含む。修飾された品質管理ヌクレオシドが、修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順と組み合わせて使用される場合、適用される変換手順の結果として、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更することが予想される。それ故、変換手順が特定の既知の修飾ヌクレオシドにとって有効であったか否かは、単にどの程度の修飾ヌクレオチドが配列決定されているかを解読することによって判定される。例えば、品質管理ヌクレオシドにｍＣを含むアダプター分子がＴＡＰＳ手順を受けており、Ｔとして配列決定される際に解読される場合、変換は有効であった。品質管理ヌクレオシドにおける既知のｍＣがＣとして解読される場合、変換は無効であった。それ故、アダプター内の品質変換ヌクレオシド（ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）の準最適な変換を伴う（個別の／単一の）適応したＤＮＡ分子を同定することは可能である。アダプター（又は複数のアダプターで、１つが各末端に含まれる場合）が複数の既知の修飾された品質管理ヌクレオシドを含む場合、修飾された品質管理ヌクレオシドの一部は正確に変換されており、それ以外はそうではない可能性がある。したがって、分子アダプターの品質管理ヌクレオシドにおける既知の修飾ヌクレオシドの総数で割られた、正確に変換された既知の修飾された品質管理ヌクレオシドの数に等しい、特定分子の変換率を判定することは可能である。同様に、全サンプル（又はその画分／サブサンプル）の変換率は、サンプルの固有に同定された分子中の正確に変換された既知の修飾された品質管理ヌクレオシドの総数を、固有に同定されたサンプル分子の同じセット中の既知の修飾ヌクレオシドの総数で割ることによって判定することができる。換言すれば、未知の修飾状態を有するヌクレオシドを含む、サンプル又は分子の変換率は、アダプター配列内の既知の修飾ヌクレオシドの変換率から推測される。
修飾ヌクレオシドを変換する変換手順を伴う偽陰性の検出
これらの実施形態では、開示の方法において使用されるアダプター配列は、既知の修飾を有する品質管理ヌクレオシドを含む。修飾された品質管理ヌクレオシドが、修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順と組み合わせて使用される場合、適用される変換手順の結果として、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更することが予想される。それ故、変換手順が特定の既知の修飾ヌクレオシドにとって有効であったか否かは、単にどの程度の修飾ヌクレオチドが配列決定されているかを解読することによって判定される。例えば、品質管理ヌクレオシドにｍＣを含むアダプター分子がＴＡＰＳ手順を受けており、Ｔとして配列決定される際に解読される場合、変換は有効であった。品質管理ヌクレオシドにおける既知のｍＣがＣとして解読される場合、変換は無効であった。それ故、アダプター内の品質変換ヌクレオシド（ｑｕａｌｉｔｙ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）の準最適な変換を伴う（個別の／単一の）適応したＤＮＡ分子を同定することは可能である。アダプター（又は複数のアダプターで、１つが各末端に含まれる場合）が複数の既知の修飾された品質管理ヌクレオシドを含む場合、修飾された品質管理ヌクレオシドの一部は正確に変換されており、それ以外はそうではない可能性がある。したがって、分子アダプターの品質管理ヌクレオシドにおける既知の修飾ヌクレオシドの総数で割られた、正確に変換された既知の修飾された品質管理ヌクレオシドの数に等しい、特定分子の変換率を判定することは可能である。同様に、全サンプル（又はその画分／サブサンプル）の変換率は、サンプルの固有に同定された分子中の正確に変換された既知の修飾された品質管理ヌクレオシドの総数を、固有に同定されたサンプル分子の同じセット中の既知の修飾ヌクレオシドの総数で割ることによって判定することができる。換言すれば、未知の修飾状態を有するヌクレオシドを含む、サンプル又は分子の変換率は、アダプター配列内の既知の修飾ヌクレオシドの変換率から推測される。
【0321】
変換率は、サンプルレベル又は分子レベルでの変換率の品質管理尺度として用いることができる。いくつかの場合、準最適な変換率、例えば、所定の閾値を下回る変換率を有する個別の分子又はサンプルは、さらなる分析から除外することができる。他の場合、変換率は、部分的又は準最適であり得るが、分子又はサンプル中の修飾ヌクレオシドの既知の不完全な変換を考慮して、やはり分析に使用することができる。例えば、スコア又は加重を、判定された変換率に依存している各分子及び／又はサンプルに適用することができる。より高い変換率を有する分子又はサンプルには、より高い加重が割り当てられる、即ち、サンプルＤＮＡの修飾ヌクレオシドプロファイルの下流分析又は判定において、より高い有意性が帰せられる。より低い相対変換率を有する分子又はサンプルには、より低い加重が割り当てられる、即ち、下流分析において、より低い有意性が帰せられる。例えば、ＤＮＡは、がんを有することが疑われる対象から得てもよい。分析は、変更された修飾ヌクレオシドプロファイルががんに関連している場合、複数のエピジェネティック標的領域の修飾ヌクレオシドプロファイルを判定することを含む。開示の方法では、標的領域のそれぞれからのＤＮＡ分子における異なる変換率を判定することができる。より低い変換率を有する領域内の分子を配列決定することによって判定されている修飾ヌクレオシドプロファイルの診断値は、より高い変換率を有する領域内の分子を配列決定することによって判定されている修飾ヌクレオシドプロファイルの診断値と比較して減少する。それ故、より低い変換率領域は、領域の全てからの修飾ヌクレオシドプロファイル分析が、典型的に、がん関連配列突然変異の検出などの他の指標とも組み合わされる場合、より低い加重が割り当てられ、例えばリスクスコアの総和として、全体的な診断判定が提供される。
【0322】
非修飾ヌクレオシドを変換する変換手順を伴う偽陰性の検出
修飾された品質管理ヌクレオシドが、非修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順と組み合わせて使用される場合、典型的に、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を、適用されている変換手順の結果として変更することは予想されない。それ故、変換手順が特定の既知の修飾ヌクレオシドに対して有効であったか否かは、単にどの程度の修飾ヌクレオチドが配列決定されているかを解読することによって判定される。例えば、品質管理ヌクレオシドにｍＣを含むアダプター分子がバイサルファイト手順を受けており、Ｃとして配列決定される際に解読される場合、変換手順はｍＣを誤って変換することはなく、既知のｍＣはメチル化されていると正確に同定される。品質管理ヌクレオシドにおける既知のｍＣがＴとして解読される場合、変換手順はｍＣを誤って変換し、既知のｍＣはメチル化されていない（即ち、偽陰性）と不正確に同定される。それ故、アダプター内の品質変換ヌクレオシドの誤った変換を伴う（個別の／単一の）適応したＤＮＡ分子を同定することは可能である。アダプター（又は複数のアダプターで、１つが各末端に含まれる場合）が複数の既知の修飾ヌクレオシドを含む場合、修飾ヌクレオシドの一部は誤って変換されており、それ以外はそうではない可能性がある。したがって、分子アダプターの品質管理ヌクレオシドにおける既知の修飾ヌクレオシドの総数で割られた、誤って変換された既知の修飾ヌクレオシドの数に等しい、特定分子の誤った変換率を判定することは可能である。同様に、全サンプル（又はその画分／サブサンプル）の誤った変換率は、サンプルの固有に同定された分子中の誤って変換された既知の修飾ヌクレオシドの総数を、固有に同定されたサンプル分子の同じセット中の既知の修飾ヌクレオシドの総数で割ることによって判定することができる。換言すれば、未知の修飾状態を有するヌクレオシドを含む、全サンプル又は分子の誤った変換率は、アダプター配列内の既知の修飾ヌクレオシドの誤った変換率から推測される。
修飾された品質管理ヌクレオシドが、非修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順と組み合わせて使用される場合、典型的に、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を、適用されている変換手順の結果として変更することは予想されない。それ故、変換手順が特定の既知の修飾ヌクレオシドに対して有効であったか否かは、単にどの程度の修飾ヌクレオチドが配列決定されているかを解読することによって判定される。例えば、品質管理ヌクレオシドにｍＣを含むアダプター分子がバイサルファイト手順を受けており、Ｃとして配列決定される際に解読される場合、変換手順はｍＣを誤って変換することはなく、既知のｍＣはメチル化されていると正確に同定される。品質管理ヌクレオシドにおける既知のｍＣがＴとして解読される場合、変換手順はｍＣを誤って変換し、既知のｍＣはメチル化されていない（即ち、偽陰性）と不正確に同定される。それ故、アダプター内の品質変換ヌクレオシドの誤った変換を伴う（個別の／単一の）適応したＤＮＡ分子を同定することは可能である。アダプター（又は複数のアダプターで、１つが各末端に含まれる場合）が複数の既知の修飾ヌクレオシドを含む場合、修飾ヌクレオシドの一部は誤って変換されており、それ以外はそうではない可能性がある。したがって、分子アダプターの品質管理ヌクレオシドにおける既知の修飾ヌクレオシドの総数で割られた、誤って変換された既知の修飾ヌクレオシドの数に等しい、特定分子の誤った変換率を判定することは可能である。同様に、全サンプル（又はその画分／サブサンプル）の誤った変換率は、サンプルの固有に同定された分子中の誤って変換された既知の修飾ヌクレオシドの総数を、固有に同定されたサンプル分子の同じセット中の既知の修飾ヌクレオシドの総数で割ることによって判定することができる。換言すれば、未知の修飾状態を有するヌクレオシドを含む、全サンプル又は分子の誤った変換率は、アダプター配列内の既知の修飾ヌクレオシドの誤った変換率から推測される。
【0323】
誤った変換率は、サンプルレベル又は分子レベルでの誤った変換率の品質管理尺度として用いることができる。いくつかの場合、高い誤った変換率、例えば、所定の閾値を上回る変換率を有する個別の分子又はサンプルは、さらなる分析から除外することができる。他の場合、誤った変換率は、所定の閾値を上回り得るが、分子又はサンプル中の修飾ヌクレオシドの既知の誤った変換を考慮して、やはり分析に使用することができる。例えば、スコア又は加重を、判定された誤った変換率に依存している各分子及び／又はサンプルに適用することができる。より高い誤った変換率を有する分子又はサンプルには、より低い加重が割り当てられる、即ち、サンプルＤＮＡの修飾ヌクレオシドプロファイルの下流分析又は判定において、より低い有意性が帰せられる。より低い相対的な誤った変換率を有する分子又はサンプルには、より高い加重が割り当てられる、即ち、下流分析において、より高い有意性が帰せられる。例えば、ＤＮＡは、がんを有することが疑われる対象から得てもよい。分析は、変更された修飾ヌクレオシドプロファイルががんに関連している場合、複数のエピジェネティック標的領域の修飾ヌクレオシドプロファイルを判定することを含む。開示の方法では、標的領域のそれぞれからのＤＮＡ分子における異なる誤った変換率を判定することができる。より高い誤った変換率を有する領域内の分子を配列決定することによって判定されている修飾ヌクレオシドプロファイルの診断値は、より低い誤った変換率を有する領域内の分子を配列決定することによって判定されている修飾ヌクレオシドプロファイルの診断値と比較して減少する。それ故、より高い誤った変換率領域は、領域の全てからの修飾ヌクレオシドプロファイル分析が、典型的に、がん関連配列突然変異の検出などの他の指標とも組み合わされる場合、より低い加重が割り当てられ、例えばリスクスコアの総和として、全体的な診断判定が提供される。
【0324】
修飾ヌクレオシドを変換する変換手順を伴う偽陽性の検出
修飾されていない品質管理ヌクレオシドが、修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順と組み合わせて使用される場合、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を、適用されている変換手順の結果として変更することは予想されない。それ故、変換手順が特定の既知の非修飾ヌクレオシドに対して有効であったか否かは、単にどの程度の非修飾ヌクレオチドが配列決定されているかを解読することによって判定される。例えば、品質管理ヌクレオシドに非修飾Ｃを含むアダプター分子がＴＡＰＳ手順を受けており、Ｃとして配列決定される際に解読される場合、変換手順は非修飾Ｃを誤って変換することはなく、既知の非修飾Ｃはメチル化されていないと正確に同定される。品質管理ヌクレオシドにおける既知の非修飾ＣがＴとして解読される場合、変換手順は非修飾Ｃを誤って変換し、既知の非修飾Ｃはメチル化されている（即ち、偽陽性）と不正確に同定される。それ故、アダプター内の品質変換ヌクレオシドの誤った変換を伴う（個別の／単一の）適応したＤＮＡ分子を同定することは可能である。アダプター（又は複数のアダプターで、１つが各末端に含まれる場合）が複数の既知の非修飾ヌクレオシドを含む場合、非修飾ヌクレオシドの一部は誤って変換されており、それ以外はそうではない可能性がある。したがって、分子アダプターの品質管理ヌクレオシドにおける既知の非修飾ヌクレオシドの総数で割られた、誤って変換された既知の非修飾ヌクレオシドの数に等しい、特定分子の誤った変換率を判定することは可能である。同様に、全サンプル（又はその画分／サブサンプル）の誤った変換率は、サンプルの固有に同定された分子中の誤って変換された既知の非修飾ヌクレオシドの総数を、固有に同定されたサンプル分子の同じセット中の既知の非修飾ヌクレオシドの総数で割ることによって判定することができる。換言すれば、未知の修飾状態を有するヌクレオシドを含む、全サンプル又は分子の誤った変換率は、アダプター配列内の既知の非修飾ヌクレオシドの誤った変換率から推測される。
修飾されていない品質管理ヌクレオシドが、修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順と組み合わせて使用される場合、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を、適用されている変換手順の結果として変更することは予想されない。それ故、変換手順が特定の既知の非修飾ヌクレオシドに対して有効であったか否かは、単にどの程度の非修飾ヌクレオチドが配列決定されているかを解読することによって判定される。例えば、品質管理ヌクレオシドに非修飾Ｃを含むアダプター分子がＴＡＰＳ手順を受けており、Ｃとして配列決定される際に解読される場合、変換手順は非修飾Ｃを誤って変換することはなく、既知の非修飾Ｃはメチル化されていないと正確に同定される。品質管理ヌクレオシドにおける既知の非修飾ＣがＴとして解読される場合、変換手順は非修飾Ｃを誤って変換し、既知の非修飾Ｃはメチル化されている（即ち、偽陽性）と不正確に同定される。それ故、アダプター内の品質変換ヌクレオシドの誤った変換を伴う（個別の／単一の）適応したＤＮＡ分子を同定することは可能である。アダプター（又は複数のアダプターで、１つが各末端に含まれる場合）が複数の既知の非修飾ヌクレオシドを含む場合、非修飾ヌクレオシドの一部は誤って変換されており、それ以外はそうではない可能性がある。したがって、分子アダプターの品質管理ヌクレオシドにおける既知の非修飾ヌクレオシドの総数で割られた、誤って変換された既知の非修飾ヌクレオシドの数に等しい、特定分子の誤った変換率を判定することは可能である。同様に、全サンプル（又はその画分／サブサンプル）の誤った変換率は、サンプルの固有に同定された分子中の誤って変換された既知の非修飾ヌクレオシドの総数を、固有に同定されたサンプル分子の同じセット中の既知の非修飾ヌクレオシドの総数で割ることによって判定することができる。換言すれば、未知の修飾状態を有するヌクレオシドを含む、全サンプル又は分子の誤った変換率は、アダプター配列内の既知の非修飾ヌクレオシドの誤った変換率から推測される。
【0325】
誤った変換率は、サンプルレベル又は分子レベルでの誤った変換率の品質管理尺度として用いることができる。いくつかの場合、高い誤った変換率、例えば、所定の閾値を上回る変換率を有する個別の分子又はサンプルは、さらなる分析から除外することができる。他の場合、誤った変換率は、所定の閾値を上回り得るが、分子又はサンプル中の修飾ヌクレオシドの既知の誤った変換を考慮して、やはり分析に使用することができる。例えば、スコア又は加重を、判定された誤った変換率に依存している各分子及び／又はサンプルに適用することができる。より高い誤った変換率を有する分子又はサンプルには、より低い加重が割り当てられる、即ち、サンプルＤＮＡの修飾ヌクレオシドプロファイルの下流分析又は判定において、より低い有意性が帰せられる。より低い相対的な誤った変換率を有する分子又はサンプルには、より高い加重が割り当てられる、即ち、下流分析において、より高い有意性が帰せられる。例えば、ＤＮＡは、がんを有することが疑われる対象から得てもよい。分析は、変更された修飾ヌクレオシドプロファイルががんに関連している場合、複数のエピジェネティック標的領域の修飾ヌクレオシドプロファイルを判定することを含む。開示の方法では、標的領域のそれぞれからのＤＮＡ分子における異なる誤った変換率を判定することができる。より高い誤った変換率を有する領域内の分子を配列決定することによって判定されている修飾ヌクレオシドプロファイルの診断値は、より低い誤った変換率を有する領域内の分子を配列決定することによって判定されている修飾ヌクレオシドプロファイルの診断値と比較して減少する。それ故、より高い誤った変換率領域は、領域の全てからの修飾ヌクレオシドプロファイル分析が、典型的に、がん関連配列突然変異の検出などの他の指標とも組み合わされる場合、より低い加重が割り当てられ、例えばリスクスコアの総和として、全体的な診断判定が提供される。
【0326】
非修飾ヌクレオシドを変換する変換手順を伴う偽陽性の検出
修飾されていない品質管理ヌクレオシドが、非修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順と組み合わせて使用される場合、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を、適用されている変換手順の結果として変更することは予想されない。それ故、変換手順が特定の既知の非修飾ヌクレオシドに対して有効であったか否かは、単にどの程度の非修飾ヌクレオチドが配列決定されているかを解読することによって判定される。例えば、品質管理ヌクレオシドに非修飾Ｃを含むアダプター分子がバイサルファイト手順を受けており、Ｔとして配列決定される際に解読される場合、変換は有効であった。品質管理ヌクレオシドにおける既知の非修飾ＣがＣとして解読される場合、変換は無効であった。そのような場合、これは通常であれば、非修飾Ｃが修飾されている（即ち、偽陽性）と同定されることになる。それ故、アダプター内の品質変換ヌクレオシドの準最適な変換を伴う（個別の／単一の）適応したＤＮＡ分子を同定することは可能である。アダプター（又は複数のアダプターで、１つが各末端に含まれる場合）が複数の既知の非修飾ヌクレオシドを含む場合、非修飾ヌクレオシドの一部は正確に変換されており、それ以外はそうではない可能性がある。したがって、分子アダプターの品質管理ヌクレオシドにおける既知の非修飾ヌクレオシドの総数で割られた、正確に変換された既知の非修飾ヌクレオシドの数に等しい、特定分子の変換率を判定することは可能である。同様に、全サンプル（又はその画分／サブサンプル）の変換率は、サンプルの固有に同定された分子中の正確に変換された既知の非修飾ヌクレオシドの総数を、固有に同定されたサンプル分子の同じセット中の既知の非修飾ヌクレオシドの総数で割ることによって判定することができる。換言すれば、未知の修飾状態を有するヌクレオシドを含む、全サンプル又は分子の変換率は、アダプター配列内の既知の非修飾ヌクレオシドの変換率から推測される。変換率は、サンプルレベル又は分子レベルでの変換率の品質管理尺度として用いることができる。いくつかの場合、準最適な変換率、例えば、所定の閾値を下回る変換率を有する個別の分子又はサンプルは、さらなる分析から除外することができる。他の場合、変換率は、部分的又は準最適であり得るが、分子又はサンプル中の非修飾ヌクレオシドの既知の不完全な変換を考慮して、やはり分析に使用することができる。例えば、スコア又は加重を、判定された変換率に依存している各分子及び／又はサンプルに適用することができる。より高い変換率を有する分子又はサンプルには、より高い加重が割り当てられる、即ち、サンプルＤＮＡの修飾ヌクレオシドプロファイルの下流分析又は判定において、より高い有意性が帰せられる。より低い相対変換率を有する分子又はサンプルには、より低い加重が割り当てられる、即ち、下流分析において、より低い有意性が帰せられる。例えば、ＤＮＡは、がんを有することが疑われる対象から得てもよい。分析は、変更された修飾ヌクレオシドプロファイルががんに関連している場合、複数のエピジェネティック標的領域の修飾ヌクレオシドプロファイルを判定することを含む。開示の方法では、標的領域のそれぞれからのＤＮＡ分子における異なる変換率を判定することができる。より低い変換率を有する領域内の分子を配列決定することによって判定されている修飾ヌクレオシドプロファイルの診断値は、より高い変換率を有する領域内の分子を配列決定することによって判定されている修飾ヌクレオシドプロファイルの診断値と比較して減少する。それ故、より低い変換率領域は、領域の全てからの修飾ヌクレオシドプロファイル分析が、典型的に、がん関連配列突然変異の検出などの他の指標とも組み合わされる場合、より低い加重が割り当てられ、例えばリスクスコアの総和として、全体的な診断判定が提供される。
修飾されていない品質管理ヌクレオシドが、非修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順と組み合わせて使用される場合、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を、適用されている変換手順の結果として変更することは予想されない。それ故、変換手順が特定の既知の非修飾ヌクレオシドに対して有効であったか否かは、単にどの程度の非修飾ヌクレオチドが配列決定されているかを解読することによって判定される。例えば、品質管理ヌクレオシドに非修飾Ｃを含むアダプター分子がバイサルファイト手順を受けており、Ｔとして配列決定される際に解読される場合、変換は有効であった。品質管理ヌクレオシドにおける既知の非修飾ＣがＣとして解読される場合、変換は無効であった。そのような場合、これは通常であれば、非修飾Ｃが修飾されている（即ち、偽陽性）と同定されることになる。それ故、アダプター内の品質変換ヌクレオシドの準最適な変換を伴う（個別の／単一の）適応したＤＮＡ分子を同定することは可能である。アダプター（又は複数のアダプターで、１つが各末端に含まれる場合）が複数の既知の非修飾ヌクレオシドを含む場合、非修飾ヌクレオシドの一部は正確に変換されており、それ以外はそうではない可能性がある。したがって、分子アダプターの品質管理ヌクレオシドにおける既知の非修飾ヌクレオシドの総数で割られた、正確に変換された既知の非修飾ヌクレオシドの数に等しい、特定分子の変換率を判定することは可能である。同様に、全サンプル（又はその画分／サブサンプル）の変換率は、サンプルの固有に同定された分子中の正確に変換された既知の非修飾ヌクレオシドの総数を、固有に同定されたサンプル分子の同じセット中の既知の非修飾ヌクレオシドの総数で割ることによって判定することができる。換言すれば、未知の修飾状態を有するヌクレオシドを含む、全サンプル又は分子の変換率は、アダプター配列内の既知の非修飾ヌクレオシドの変換率から推測される。変換率は、サンプルレベル又は分子レベルでの変換率の品質管理尺度として用いることができる。いくつかの場合、準最適な変換率、例えば、所定の閾値を下回る変換率を有する個別の分子又はサンプルは、さらなる分析から除外することができる。他の場合、変換率は、部分的又は準最適であり得るが、分子又はサンプル中の非修飾ヌクレオシドの既知の不完全な変換を考慮して、やはり分析に使用することができる。例えば、スコア又は加重を、判定された変換率に依存している各分子及び／又はサンプルに適用することができる。より高い変換率を有する分子又はサンプルには、より高い加重が割り当てられる、即ち、サンプルＤＮＡの修飾ヌクレオシドプロファイルの下流分析又は判定において、より高い有意性が帰せられる。より低い相対変換率を有する分子又はサンプルには、より低い加重が割り当てられる、即ち、下流分析において、より低い有意性が帰せられる。例えば、ＤＮＡは、がんを有することが疑われる対象から得てもよい。分析は、変更された修飾ヌクレオシドプロファイルががんに関連している場合、複数のエピジェネティック標的領域の修飾ヌクレオシドプロファイルを判定することを含む。開示の方法では、標的領域のそれぞれからのＤＮＡ分子における異なる変換率を判定することができる。より低い変換率を有する領域内の分子を配列決定することによって判定されている修飾ヌクレオシドプロファイルの診断値は、より高い変換率を有する領域内の分子を配列決定することによって判定されている修飾ヌクレオシドプロファイルの診断値と比較して減少する。それ故、より低い変換率領域は、領域の全てからの修飾ヌクレオシドプロファイル分析が、典型的に、がん関連配列突然変異の検出などの他の指標とも組み合わされる場合、より低い加重が割り当てられ、例えばリスクスコアの総和として、全体的な診断判定が提供される。
【0327】
例示的な適用
本明細書で提示される方法は、任意のサンプル中のＤＮＡの正確な修飾ヌクレオシドプロファイルを得ることから利益を得る任意の方法の一部として使用してもよい。
本明細書で提示される方法は、任意のサンプル中のＤＮＡの正確な修飾ヌクレオシドプロファイルを得ることから利益を得る任意の方法の一部として使用してもよい。
【0328】
サンプル
サンプルは、対象から単離されている任意の生体サンプルであり得る。サンプルは、身体サンプルであり得る。サンプルは、身体組織又は体液、例えば、既知の又は疑われた固形腫瘍、全血、血小板、血清、血漿、便、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）又は白血球（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｓ）、内皮細胞、組織生検、脳脊髄液、滑液、リンパ液、腹水、間質又は細胞外液、細胞間の空間内の体液、歯肉溝滲出液、骨髄、胸水液、胸膜液、脳脊髄液、唾液、粘液、痰、精液、汗、及び尿を含み得る。サンプルは、好ましくは、体液、特に血液及びその画分、脳脊髄液、胸膜液、唾液、痰、又は尿である。サンプルは、対象から最初に単離されている形態であり得る、又は細胞などの成分を除去若しくは添加する、若しくは１つの成分を別の成分に対して富化するため、さらなる処理を受けている可能性がある。したがって、分析にとって好ましい体液は、無細胞核酸を含有する血漿又は血清である。
サンプルは、対象から単離されている任意の生体サンプルであり得る。サンプルは、身体サンプルであり得る。サンプルは、身体組織又は体液、例えば、既知の又は疑われた固形腫瘍、全血、血小板、血清、血漿、便、赤血球、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）又は白血球（ｌｅｕｃｏｃｙｔｅｓ）、内皮細胞、組織生検、脳脊髄液、滑液、リンパ液、腹水、間質又は細胞外液、細胞間の空間内の体液、歯肉溝滲出液、骨髄、胸水液、胸膜液、脳脊髄液、唾液、粘液、痰、精液、汗、及び尿を含み得る。サンプルは、好ましくは、体液、特に血液及びその画分、脳脊髄液、胸膜液、唾液、痰、又は尿である。サンプルは、対象から最初に単離されている形態であり得る、又は細胞などの成分を除去若しくは添加する、若しくは１つの成分を別の成分に対して富化するため、さらなる処理を受けている可能性がある。したがって、分析にとって好ましい体液は、無細胞核酸を含有する血漿又は血清である。
【0329】
いくつかの実施形態では、核酸の集団は、新生物、腫瘍、前がん、若しくはがんを有することが疑われる、又は新生物、腫瘍、前がん、若しくはがんと以前に診断されている対象からの血清、血漿又は血液サンプルから得られる。集団は、異なるレベルの配列多様性、エピジェネティック変異、及び／又は複製後修飾若しくは転写修飾を有する核酸を含む。複製後修飾は、特に核酸塩基の５位に、シトシンの修飾、例えば、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、５－ホルミルシトシン及び５－カルボキシルシトシンを含む。
【0330】
サンプルは、対象から単離又は取得し、サンプル分析の場所に輸送することができる。サンプルは、望ましい温度、例えば、室温、４℃、－２０℃、及び／又は－８０℃で保存し、輸送することができる。サンプルは、サンプル分析の場所で、対象から単離又は取得することができる。対象は、ヒト、哺乳動物、動物、コンパニオン動物、サービス動物、又はペットであり得る。対象は、がん、前がん、感染、移植片拒絶、又は免疫系の変化に関連する他の疾患又は障害を有し得る。対象は、がん又は検出可能ながん症状を有しない場合がある。対象は、１つ以上のがん療法、例えば、化学療法、抗体、ワクチン又は生物剤のいずれか１つ以上で治療されている場合がある。対象は、寛解状態であってもよい。対象は、がん又は任意のがん関連遺伝子突然変異／障害に罹りやすいと診断されているか又はされていないかのいずれであってもよい。
【0331】
いくつかの実施形態では、サンプルは、血漿を含む。得られた血漿の体積は、配列決定された領域の所望のリード深度に依存し得る。例示的な体積は、０．４～４０ｍＬ、５～２０ｍＬ、１０～２０ｍＬである。例えば、体積は、０．５ｍＬ、１ｍＬ、５ｍＬ、１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、又は４０ｍＬであり得る。採取された血漿の体積は、５～２０ｍＬであってもよい。
【0332】
サンプルは、様々な量のゲノム等価物を含有する核酸を含み得る。例えば、約３０ｎｇのＤＮＡのサンプルは、約１０，０００（１０４）の一倍体ヒトゲノム等価物、そしてｃｆＤＮＡの場合、約２０００億（２×１０１１）の個別のポリヌクレオチド分子を含有し得る。同様に、約１００ｎｇのＤＮＡのサンプルは、約３０，０００の一倍体ヒトゲノム等価物、そしてｃｆＤＮＡの場合、約６０００億の個別分子を含有し得る。
【0333】
サンプルは、異なる供給源から、例えば、同じ対象の細胞及び無細胞から、異なる対象の細胞及び無細胞からの核酸を含み得る。サンプルは、突然変異を有する核酸を含み得る。例えば、サンプルは、生殖系列突然変異及び／又は体細胞突然変異を有するＤＮＡを含み得る。生殖系列突然変異は、対象の生殖系列ＤＮＡ中に存在する突然変異を指す。体細胞突然変異は、対象の体細胞内、例えば、がん細胞内に起源を持つ突然変異を指す。サンプルは、がん関連突然変異（例えば、がん関連体細胞突然変異）を有するＤＮＡを含み得る。サンプルは、エピジェネティック変異体（即ち、化学又はタンパク質修飾）を含み得て、ここでエピジェネティック変異体は、がん関連突然変異などの遺伝子変異体の存在に関連する。いくつかの実施形態では、サンプルは、遺伝子変異体の存在に関連するエピジェネティック変異体を含み、ここでサンプルは、遺伝子変異体を含まない。
【0334】
増幅前のサンプル中の無細胞核酸の例示的な量は、約１ｆｇ～約１ｐｇ、例えば、１ｐｇ～２００ｎｇ、１ｎｇ～１００ｎｇ、１０ｎｇ～１０００ｎｇの範囲である。例えば、量は、最大で約６００ｎｇ、最大で約５００ｎｇ、最大で約４００ｎｇ、最大で約３００ｎｇ、最大で約２００ｎｇ、最大で約１００ｎｇ、最大で約５０ｎｇ、又は最大で約２０ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。量は、少なくとも１ｆｇ、少なくとも１０ｆｇ、少なくとも１００ｆｇ、少なくとも１ｐｇ、少なくとも１０ｐｇ、少なくとも１００ｐｇ、少なくとも１ｎｇ、少なくとも１０ｎｇ、少なくとも１００ｎｇ、少なくとも１５０ｎｇ、又は少なくとも２００ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。量は、最大で１フェムトグラム（ｆｇ）、１０ｆｇ、１００ｆｇ、１ピコグラム（ｐｇ）、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１５０ｎｇ、又は２００ｎｇの無細胞核酸分子であり得る。方法は、１フェムトグラム（ｆｇ）～２００ｎｇの無細胞核酸分子を得ることを含み得る。
【0335】
無細胞ＤＮＡは、対象からのその単離時に細胞内に含有されていないＤＮＡを指す。例えば、ｃｆＤＮＡは、細胞を溶解せず、又はそうでなければ細胞内ＤＮＡを抽出することなく、無傷細胞を除去した後にサンプル中に残存しているＤＮＡとして、サンプルから単離することができる。無細胞核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそのハイブリッド、例えば、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）、長鎖非翻訳ＲＮＡ（長鎖ｎｃＲＮＡ）、又はこれらのいずれかの断片を含む。無細胞核酸は、二本鎖、一本鎖、又はそのハイブリッドであり得る。無細胞核酸は、分泌又は細胞死プロセス、例えば、細胞壊死及びアポトーシスを通じて体液中に放出され得る。一部の無細胞核酸は、がん細胞から体液中に放出され、例えば、循環腫瘍ＤＮＡ、（ｃｔＤＮＡ）が挙げられる。その他は、健常細胞から放出される。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡは、無細胞胎児ＤＮＡ（ｃｆｆＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、無細胞核酸は、腫瘍細胞によって生成される。いくつかの実施形態では、無細胞核酸は、腫瘍細胞と非腫瘍細胞の混合物によって生成される。
【0336】
無細胞核酸は、約１００～５００ヌクレオチドの代表的なサイズ分布を有し、１１０～約２３０ヌクレオチドの分子は分子の約９０％を表し、約１６８ヌクレオチドのモードと２４０～４４０ヌクレオチドの範囲内に２番目のマイナーピークとを有する。
【0337】
無細胞核酸は、溶液中で見出される無細胞核酸が体液の無傷細胞及び他の非可溶性成分から分離される場合の分画又は分割ステップを通じて、体液から単離することができる。分割は、遠心分離又は濾過などの技術を含んでもよい。或いは、体液中の細胞を溶解させ、無細胞及び細胞核酸を一緒に処理することができる。一般に、緩衝液の添加及び洗浄ステップ後、核酸をアルコールで沈殿させることができる。さらに、シリカベースのカラムなど、クリーンアップステップを使用して、汚染物質又は塩を除去することができる。非特異的な大量の担体の核酸、例えば、ニシン精子ＤＮＡを、反応全体を通じて添加して、収率などの手順の特定の態様を最適化することができる。
【0338】
このような処理後、サンプルは、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＲＮＡを含む、核酸の様々な形態を含み得る。いくつかの実施形態では、一本鎖ＤＮＡ及びＲＮＡは、後の処理及び分析ステップに含められるように、二本鎖形態に変換することができる。
【0339】
サンプル中の二本鎖ＤＮＡ分子及び二本鎖ＤＮＡ分子に変換されている一本鎖核酸分子は、一方の末端又は両方の末端のいずれかでアダプターに連結することができる。典型的に、二本鎖分子は、全部で４つの標準ヌクレオチドの存在下で、５’－３’ポリメラーゼ及び３’－５’エキソヌクレアーゼ（又はプルーフリーディング機能）を有するポリメラーゼによる処理によって平滑末端化される。クレノウ大断片及びＴ４ポリメラーゼは、好適なポリメラーゼの例である。平滑末端化ＤＮＡ分子は、少なくとも部分的に、二本鎖アダプター（例えば、Ｙ形状又は釣鐘状のアダプター）とライゲートすることができる。或いは、相補的なヌクレオチドをサンプル核酸及びアダプターの平滑末端に付加して、ライゲーションを促進することができる。本明細書で企図されるのは、平滑末端ライゲーションと粘着末端ライゲーションの両方である。平滑末端ライゲーションでは、核酸分子とアダプタータグの両方が平滑末端を有する。粘着末端ライゲーションでは、典型的に、核酸分子は、「Ａ」オーバーハングを有し、アダプターは、「Ｔ」オーバーハングを有する。
【0340】
アダプターを含むＤＮＡの増幅
アダプターによって隣接されているサンプル核酸は、ＰＣＲ及び他の増幅方法によって増幅することができる。こうした増幅を用いて、配列決定などの後続ステップに利用可能なＤＮＡの量を増加させることができる。例えば、この種の増幅は、ライブラリー調製の一部として、及び／又は標的化ライブラリーの調製後、実施することができる。増幅は、変換手順後に実施することができる。増幅は、増幅対象のＤＮＡ分子に隣接するアダプター内のプライマー結合部位に結合するプライマーによって刺激することができる。増幅方法は、サーモサイクリングから得られる、変性、アニーリング及び伸長のサイクルを含み得る、又は転写媒介性増幅などの場合、等温であり得る。他の増幅方法は、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸配列に基づく増幅、及び自己持続的配列に基づく複製を含む。
アダプターによって隣接されているサンプル核酸は、ＰＣＲ及び他の増幅方法によって増幅することができる。こうした増幅を用いて、配列決定などの後続ステップに利用可能なＤＮＡの量を増加させることができる。例えば、この種の増幅は、ライブラリー調製の一部として、及び／又は標的化ライブラリーの調製後、実施することができる。増幅は、変換手順後に実施することができる。増幅は、増幅対象のＤＮＡ分子に隣接するアダプター内のプライマー結合部位に結合するプライマーによって刺激することができる。増幅方法は、サーモサイクリングから得られる、変性、アニーリング及び伸長のサイクルを含み得る、又は転写媒介性増幅などの場合、等温であり得る。他の増幅方法は、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、核酸配列に基づく増幅、及び自己持続的配列に基づく複製を含む。
【0341】
いくつかの実施形態では、本方法では、アダプターへの連結前に二本鎖核酸の少なくとも５０、６０、７０又は８０％の増幅をもたらす、Ｔテールアダプター及びＣテールアダプターとのｄｓＤＮＡライゲーションが実施される。好ましくは、本方法は、増幅された分子の量又は数を、Ｔテールアダプター単独によって実施される対照方法と比較して、少なくとも１０、１５又は２０％増加させる。
【0342】
適用
開示の方法の１つの重要な例示的な適用は、がん又は他の遺伝的疾患若しくは症状の診断及び予後における修飾ヌクレオシドプロファイルの使用である。
開示の方法の１つの重要な例示的な適用は、がん又は他の遺伝的疾患若しくは症状の診断及び予後における修飾ヌクレオシドプロファイルの使用である。
【0343】
それ故、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、腫瘍（又は新生細胞、又はがん細胞）によって生成されているＤＮＡの存在若しくは不在を同定若しくは予測すること、試験対象が腫瘍若しくはがんを有する確率を判定すること、及び／又は本明細書に記載される腫瘍、新生細胞若しくはがんを特徴づけることを含む。
【0344】
本方法を用いて、対象における病態、特にがんの存在又は不在を診断して、病態を特徴づけて（例えば、がんをステージ分類する、又はがんの異質性を判定する）、病態の治療に対する応答を監視して、病態又はその後の病態の経過を発現する予後リスクをもたらすことができる。本開示はまた、特定の治療オプションの有効性の判定に有用であり得る。より多くのがんが死滅し、ＤＮＡを排出し得ることで、治療が成功している場合、治療オプションの成功により、対象の血液中で検出されているコピー数多型又は希少突然変異の量が増加し得る。他の例では、これが生じることはない。別の例では、おそらく特定の治療オプションが、がんの遺伝的プロファイルと経時的に相関し得る。この相関は、治療法を選択するのに有用であり得る。いくつかの実施形態では、高メチル化可変エピジェネティック標的領域を分析して、それらが腫瘍細胞若しくは通常はｃｆＤＮＡに有意に寄与することがない細胞の特徴を持つ高メチル化を示すか否かが判定され、且つ／又は低メチル化可変エピジェネティック標的領域を分析して、それらが腫瘍細胞若しくは通常はｃｆＤＮＡに有意に寄与することがない細胞の特徴を持つ低メチル化を示すか否かが判定される。
【0345】
いくつかの実施形態では、本方法は、がんについてスクリーニングするため、又はがんをスクリーニングするための方法において使用される。例えば、サンプルは、以前にがんと診断されていない対象から得ることができる。いくつかの実施形態では、対象は、がんを有するか又は有しないかのいずれでもよい。いくつかの実施形態では、対象は、初期がんを有するか又は有しないかのいずれでもよい。いくつかの実施形態では、対象は、タバコ使用（例えば、喫煙）、過体重若しくは肥満であること、高い肥満度指数（ＢＭＩ）を有すること、高齢であること、栄養不良、高いアルコール消費、又はがんの家族歴など、１つ以上のがんのリスク因子を有する。
【0346】
いくつかの実施形態では、対象は、例えば、少なくとも１、５、１０、又は１５年間、タバコを使用している。いくつかの実施形態では、対象は、高いＢＭＩ、例えば、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、又は３０以上のＢＭＩを有する。いくつかの実施形態では、対象は、少なくとも４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０歳である。いくつかの実施形態では、対象は、栄養不良、例えば、レッドミート及び／若しくは加工肉、トランス脂肪、飽和脂肪、及び精製糖の１つ以上の高消費、並びに／又は果実及び野菜、複合炭水化物、及び／若しくは不飽和脂肪の低消費を有する。高消費及び低消費は、例えば、それぞれ、以下、ｗｗｗ．ｄｉｅｔａｒｙｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｄｅｆａｕｌｔ／ｆｉｌｅｓ／２０２１－０３／Ｄｉｅｔａｒｙ＿Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ＿ｆｏｒ＿Ａｍｅｒｉｃａｎｓ－２０２０－２０２５．ｐｄｆで入手可能な米国民向け食事ガイドライン２０２０－２０２５（Ｄｉｅｔａｒｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ａｍｅｒｉｃａｎｓ ２０２０－２０２５）における推奨を上回ること又は下回ることとして定義することができる。いくつかの実施形態では、対象は、例えば、平均で１日に少なくとも３回、４回、又は５回の飲酒（飲料が約１オンス又は３０ｍＬの８０－プルーフハードリカー又は相当物である場合）といった高いアルコール消費を有する。いくつかの実施形態では、対象は、がんの家族歴を有し、例えば、少なくとも１名、２名、又は３名の血縁者が以前にがんと診断された。いくつかの実施形態では、近親者は、少なくとも第三度近親者（例えば、高祖父母、大叔母又は大叔父、第１のいとこ）、少なくとも第二度近親者（例えば、祖父母、叔母又は叔父、又は半同胞）、又は第一度近親者（例えば、親又は全同胞）である。
【0347】
加えて、がんが治療後に寛解状態であることが認められる場合、本方法を用いて、残存疾患又は疾患の再発を監視することができる。
【0348】
典型的に、検討中の疾患は、例えば、本明細書で参照されるいずれかのがんのタイプである。検出可能であるがんのタイプ及び数は、血液がん、脳がん、肺がん、皮膚がん、鼻がん、咽頭がん、肝がん、骨がん、リンパ腫、膵がん、皮膚がん、腸がん、直腸がん、甲状腺がん、膀胱がん、腎がん、口がん、胃がん、固形腫瘍、異質性腫瘍、均質性腫瘍などを含んでもよい。こうしたがんの具体例としては、胆道がん、膀胱がん、移行上皮がん、尿路上皮がん、脳がん、神経膠腫、星状細胞腫、乳がん、化生がん、子宮頸がん、子宮頸部扁平上皮がん、直腸がん、結腸直腸がん、結腸がん、遺伝性非ポリープ性結腸直腸がん、結腸直腸腺がん、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜がん、子宮内膜間質肉腫、食道がん、食道扁平上皮がん、食道腺がん、眼内黒色腫、ぶどう膜黒色腫、胆嚢がん、胆嚢腺がん、腎細胞がん、明細胞腎細胞がん、移行上皮がん、尿路上皮がん、ウィルムス腫瘍、白血病、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、肝臓がん、肝がん、肝腫瘍、肝細胞がん、胆管細胞がん、肝芽腫、肺がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん（ＮＰＣ）、神経芽細胞腫、中咽頭がん、口腔扁平上皮がん、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、膵管腺癌、偽乳頭状新生物、腺房細胞がん、前立腺がん、前立腺腺がん、皮膚がん、メラノーマ、悪性メラノーマ、皮膚メラノーマ、小腸がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮がん、又は子宮肉腫が挙げられる。
【0349】
がんのタイプ及び／又はステージは、突然変異、希少突然変異、インデル、コピー数多型、トランスバージョン、転位、反転、欠失、異数性、部分的異数性、倍数性、染色体不安定性、染色体構造変化、遺伝子融合、染色体融合、遺伝子トランケーション、遺伝子増幅、遺伝子重複、染色体病変、ＤＮＡ病変、核酸化学修飾の異常な変化、エピジェネティックパターンの異常な変化、及び核酸５－メチルシトシンの異常な変化を含む遺伝的変異から検出することができる。それ故、本方法は、いくつかの場合、例えば、がんを検出するか若しくは特徴づける方法又は本明細書に記載の他の方法における、他の遺伝的／エピジェネティック変異を検出するために用いられる方法と組み合わせて用いることができる。
【0350】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、腫瘍（又は新生細胞、又はがん細胞）によって、又は前がん細胞によって生成されている標的領域及び／又はＤＮＡの存在を同定することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、標的領域のレベルを判定し、且つ／又は腫瘍（又は新生細胞、又はがん細胞）によって、若しくは前がん細胞によって生成されているＤＮＡの存在を同定することを含む。いくつかの実施形態では、標的領域のレベルの判定は、標的領域の増加レベル又は減少レベルのいずれかを判定することを含み、ここで標的領域の増加又は低下レベルは、標的領域のレベルを閾値レベル／値と比較することによって判定される。
【0351】
また、遺伝的及び／又はエピジェネティックデータは、がんの特定の形態を特徴づけるために使用することができる。がんは、組成物及びステージングの両方において異質性であることが多い。遺伝的及び／又はエピジェネティックプロファイルデータは、がんの特定のサブタイプの特徴づけ（その特定のサブタイプの診断又は治療において重要であり得る）を可能にし得る。また、この情報は、対象又は施術者に、がんの特定タイプの予後に関する手がかりを提供し、対象又は施術者のいずれかが疾患の進行に応じて治療オプションを適応させ得る場合がある。一部のがんは、進行して、より侵襲的に、そして遺伝的に不安定になり得る。他のがんは、良性、不活性又は休止状態を維持し得る。本開示のシステム及び方法は、疾患進行を判定するのに有用であり得る。
【0352】
さらに、本開示の方法を用いて、対象における異常な状態の異質性を特徴づけることができる。こうした方法は、例えば、対象由来の細胞外ポリヌクレオチドの遺伝的及び／又はエピジェネティックプロファイルを作成することを含むことができ、ここで遺伝的及び／又はエピジェネティックプロファイルは、コピー数多型及び希少突然変異分析から得られた複数のデータを含む。いくつかの実施形態では、異常な状態は、例えば本明細書に記載されるがんである。いくつかの実施形態では、異常な状態は、異質ゲノム集団をもたらすものであり得る。がんの例において、一部の腫瘍は、がんの異なるステージにある腫瘍細胞を含むことは既知である。他の例において、異質性は、疾患の複数の病巣を含んでもよい。再び、がんの例において、複数の腫瘍病巣が存在することがあり、その場合、おそらくは、１つ以上の病巣は、原発性部位から伝播している転移の結果である。
【0353】
本方法を用いて、異質性疾患における異なる細胞から得られた遺伝的及び／又はエピジェネティック情報の総和であるプロファイル、フィンガープリント又はデータセットを作成することができる。このデータセットは、コピー数多型、エピジェネティック変異、及び突然変異分析を単独で又は組み合わせて含んでもよい。
【0354】
本方法を用いて、がん、又は他の疾患を診断、予後、監視又は観察することができる。いくつかの実施形態では、本明細書中の方法は、胎児を診断、予後又は監視することを含まず、それ故、非侵襲的な出生前検査を対象としない。他の実施形態では、これらの方法を妊娠対象に用いて、ＤＮＡ及び他のポリヌクレオチドが母体分子と共循環し得る胎児対象におけるがん又は他の疾患を診断、予後、監視又は観察することができる。
【0355】
任意選択的に、本明細書で開示される方法及びシステムを用いて評価されている他の遺伝子ベースの疾患、障害、又は病態の非限定例としては、軟骨無形成症、α－１アンチトリプシン欠乏、抗リン脂質症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患、シャルコー・マリー・トゥース（ＣＭＴ）、クリ・デュ・チャット、クローン病、嚢胞性線維症、ダーカム病、ダウン症候群、デュアン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、第Ｖ因子ライデン栓友病、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、血友病、全前脳症、ハンチントン病、クラインフェルター症候群、マルファン症候群、筋緊張性ジストロフィー、神経線維腫症、ヌーナン症候群、骨形成不全症、パーキンソン病、フェニルケトン尿症、ポーランド異常、ポルフィリン症、早老症、網膜色素変性症、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮、テイ・サックス、サラセミア、トリメチルアミン尿症、ターナー症候群、口蓋心臓顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、ウィルソン病などが挙げられる。
【0356】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、対象におけるがん再発のリスクを判定する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法は、対象を後のがん治療の候補であるとして分類する方法である。
【0357】
こうした方法のいずれかは、対象に対する１つ以上の以前のがん治療後の１つ以上の前選択された時点で、がんと診断されている対象からサンプルを収集することを含んでもよい。対象は、本明細書に記載の対象のいずれかであってもよい。サンプルは、ＤＮＡ、例えば、ｃｆＤＮＡを含んでもよい。ＤＮＡは、組織サンプル又は液体サンプルから得てもよい。
【0358】
こうした方法のいずれかは、本明細書に記載される実施形態のいずれかに従い、サンプル又はそのサブサンプルを複数のプライマーと接触させて、捕捉プローブを生成して、少なくとも１つの構造変異の存在又はレベルを捕捉及び検出することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載される実施形態のいずれかに従い、サンプル又はそのサブサンプルを、エピジェネティック標的領域セットのメンバーに特異的な複数の捕捉プローブと接触させることを含んでもよい。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、より早い時点で同じ対象から得られたサンプルを用いて生成されている捕捉プローブを含む。方法は、対象からのＤＮＡからの複数の標的領域セットを捕捉することをさらに含んでもよく、ここで複数の標的領域セットは、それによってＤＮＡ分子の捕捉されたセットが生成される、配列可変標的領域セット、及び／又はエピジェネティック標的領域セットを含む。１つ又は複数の捕捉ステップは、本明細書中の他の箇所に記載される実施形態のいずれかに従って実施することができる。こうした方法のいずれかは、それによって配列情報のセットが生成される、捕捉されたＤＮＡ分子を配列決定することを含んでもよい。配列可変標的領域セットの捕捉されたＤＮＡ分子は、エピジェネティック標的領域セットの捕捉されたＤＮＡ分子よりも配列決定の大きい深度まで配列決定することができる。こうした方法のいずれかは、配列情報のセットを使用して、腫瘍細胞が起源であるか又はそれに由来するＤＮＡの存在又は不在を前選択された時点で検出することを含んでもよい。腫瘍細胞が起源であるか又はそれに由来するＤＮＡの存在又は不在の検出は、本明細書中の他の箇所に記載されるその実施形態のいずれかに従って実施することができる。
【0359】
こうした方法のいずれかにおいて、以前のがん治療は、手術、治療組成物の投与、及び／又は化学療法を含んでもよい。
【0360】
対象におけるがん再発のリスクを判定する方法は、少なくとも１つの再構成されたＤＮＡ配列、型特異的な標的領域、及び／又は対象における腫瘍細胞が起源であるか若しくはそれに由来するＤＮＡの存在若しくは不在、又は量を意味するがん再発スコアを判定することを含んでもよい。がん再発スコアをさらに使用して、がん再発状態を判定することができる。がん再発状態は、例えば、がん再発スコアが所定の閾値を上回るとき、がん再発のリスクであり得る。がん再発状態は、例えば、がん再発スコアが所定の閾値を上回るとき、がん再発の低い又はより低いリスクであり得る。特定の実施形態では、所定の閾値に等しいがん再発スコアは、がん再発のリスク、又はがん再発の低い若しくはより低いリスクのいずれかであるがん再発状態をもたらし得る。
【0361】
後のがん治療の候補であるとして対象を分類する方法は、対象のがん再発スコアを所定のがん再発閾値と比較して、それにより、がん再発スコアががん再発閾値を上回るときに後のがん治療の候補として、又はがん再発スコアががん再発閾値を下回るときに治療法の候補でないとして対象を分類することを含んでもよい。特定の実施形態では、がん再発閾値に等しいがん再発スコアは、後のがん治療の候補であるか、又は治療法の候補でないかのいずれかの分類をもたらし得る。いくつかの実施形態では、後のがん治療は、化学療法又は治療組成物の投与を含む。
【0362】
こうした方法のいずれかは、がん再発スコアに基づき、対象の無疾患生存（ＤＦＳ）期間を判定することを含んでもよく；例えば、ＤＦＳ期間は、１年、２年、３年、４年、５年、又は１０年であってもよい。
【0363】
いくつかの実施形態では、配列情報のセットは、配列可変標的領域配列を含み、がん再発スコアの判定は、配列可変標的領域配列内に存在する特定の免疫細胞型、ＳＮＶ、挿入／欠失、ＣＮＶ及び／又は融合のレベルを意味する、少なくとも第１のサブスコアを判定することを含んでもよい。
【0364】
いくつかの実施形態では、１、２、３、４、又は５から選択される、配列可変標的領域内の突然変異の数は、第１のサブスコアが、がん再発について陽性と分類されているがん再発スコアをもたらすのに十分である。いくつかの実施形態では、突然変異の数は、１、２、又は３から選択される。
【0365】
いくつかの実施形態では、配列情報のセットは、エピジェネティック標的領域配列を含み、がん再発スコアの判定は、健常対象からの対応するサンプル中で見出されるＤＮＡ（例えば、健常対象からの血液サンプル中で見出されるｃｆＤＮＡ、又は組織サンプルが試験対象から得られた場合と同じタイプの組織である場合、健常対象からの組織サンプル中で見出されるＤＮＡ）と異なるエピジェネティック状態を表す（エピジェネティック標的領域配列から得られた）分子の量を意味する第２のサブスコアを判定することを含む。これらの異常な分子（即ち、健常対象からの対応するサンプル中で見出されるＤＮＡと異なるエピジェネティック状態を有する分子）は、がんに関連するエピジェネティック変化、例えば、高メチル化可変標的領域のメチル化及び／又は断片化可変標的領域の摂動した断片化に一致することがあり、ここで「摂動した」は、健常対象からの対応するサンプル中で見出されるＤＮＡと異なることを意味する。
【0366】
いくつかの実施形態では、高メチル化可変標的領域セットにおける高メチル化及び／又は断片化可変標的領域セットにおける異常な断片化を示す、高メチル化可変標的領域セット及び／又は断片化可変標的領域セットに対応する分子の、０．００１％～１０％の範囲内の値以上の割合は、第２のサブスコアががん再発について陽性と分類されるのに十分である。範囲は、０．００１％～ｌ％、０．００５％～ｌ％、０．０１％～５％、０．０１％～２％、又は０．０１％～ｌ％であってもよい。
【0367】
いくつかの実施形態では、こうした方法のいずれかは、腫瘍ＤＮＡの画分を、腫瘍細胞に起源を持つことを意味する１つ以上の特徴を示す配列情報のセットにおける分子の画分から判定することを含んでもよい。これは、例えば、高メチル化可変標的領域及び断片化可変標的領域の一方又は両方を含む、エピジェネティック標的領域の一部又は全部に対応する分子について行うことができる（高メチル化可変標的領域の高メチル化及び／又は断片化可変標的領域の異常な断片化は、腫瘍細胞に起源を持つことを意味すると考えることができる）。これは、配列可変標的領域に対応する分子、例えば、ＳＮＶ、インデル、ＣＮＶ、及び／又は融合などのがんに合致する変更を含む分子について行うことができる。腫瘍ＤＮＡの画分は、エピジェネティック標的領域に対応する分子と配列可変標的領域に対応する分子との組み合わせに基づいて判定することができる。
【0368】
がん再発スコアの判定は、少なくとも部分的に、腫瘍ＤＮＡの画分に基づいてもよく、ここで１０－１１～１又は１０－１０～１の範囲内の閾値より大きい腫瘍ＤＮＡの画分は、がん再発スコアががん再発について陽性と分類されるのに十分である。いくつかの実施形態では、１０－１０～１０－９、１０－９～１０－８、１０－８～１０－７、１０－７～１０－６、１０－６～１０－５、１０－５～１０－４、１０－５～１０－３、１０－５～１０－２、又は１０－２～１０－１の範囲内の閾値以上の腫瘍ＤＮＡの画分は、がん再発スコアががん再発について陽性と分類されるのに十分である。いくつかの実施形態では、少なくとも１０－７の閾値より大きい腫瘍ＤＮＡの画分は、がん再発スコアががん再発について陽性と分類されるのに十分である。腫瘍ＤＮＡの画分が閾値、例えば、前述の実施形態のいずれかに対応する閾値より大きいという判定は、累積確率に基づいてなされてもよい。例えば、サンプルは、腫瘍画分が前述の範囲のいずれかにおける閾値より大きかったという累積確率が、少なくとも０．５、０．７５、０．９、０．９５、０．９８、０．９９、０．９９５、又は０．９９９の確率閾値を超える場合、陽性とみなされた。いくつかの実施形態では、確率閾値は、少なくとも０．９５、例えば０．９９である。
【0369】
いくつかの実施形態では、配列情報のセットは、配列可変標的領域配列及びエピジェネティック標的領域配列を含み、がん再発スコアの判定は、配列可変標的領域配列内に存在するＳＮＶ、挿入／欠失、ＣＮＶ及び／又は融合の量を意味する第１のサブスコア、並びにエピジェネティック標的領域配列内の異常な分子の量を意味する第２のサブスコアを判定することと、第１のサブスコア及び第２のサブスコアを組み合わせて、がん再発スコアを提供することと、を含む。第１のサブスコア及び第２のサブスコアが組み合わされる場合、それらは、閾値を各サブスコアに独立して適用する（例えば、配列可変標的領域において突然変異の所定の数より大きい（例えば、＞１）、及びエピジェネティック標的領域において異常な分子（即ち、健常対象からの対応するサンプル中に見出されるＤＮＡと異なるエピジェネティックな状態を有する分子；例えば、腫瘍）の所定の画分より大きい）、又は機械学習の分類子を訓練して、複数の陽性及び陰性の訓練サンプルに基づいて状態を判定することによって組み合わせることができる。
【0370】
いくつかの実施形態では、－４～２又は－３～１の範囲内の組み合わせスコアの値は、がん再発スコアががん再発について陽性と分類されるのに十分である。
【0371】
いずれかの実施形態では、がん再発スコアががん再発について陽性と分類される場合、対象のがん再発状態は、がん再発のリスクの可能性があり、且つ／又は対象は、後のがん治療の候補として分類され得る。
【0372】
いくつかの実施形態では、がんは、本明細書中の他の箇所に記載のがんのタイプのいずれか１つ、例えば、結腸直腸がんである。
【0373】
特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、患者に対するカスタマイズされた治療法を特定し、施すことに関連する。いくつかの実施形態では、特定の核酸のレベルの決定により、適切な治療の選択が容易になる。いくつかの実施形態では、患者又は対象は、所与の疾患、障害、又は病態を有する。本質的に任意のがん療法（例えば、外科的療法、放射線療法、化学療法など）は、これらの方法の一部に含めてもよい。特定の実施形態では、対象に施される治療法は、少なくとも１つの化学療法薬を含む。いくつかの実施形態では、化学療法薬は、アルキル化剤（例えば、限定はされないが、クロラムブシル、シクロホスファミド、シスプラチン及びカルボプラチン）、ニトロソウレア（例えば、限定はされないが、カルムスチン及びロムスチン）、抗代謝産物（例えば、限定はされないが、フルオロウラシル（Ｆｌｕｏｒａｕｒａｃｉｌ）、メトトレキサート及びフルダラビン）、植物アルカロイド及び天然物（例えば、限定はされないが、ビンクリスチン、パクリタキセル及びトポテカン）、抗腫瘍抗生物質（例えば、限定はされないが、ブレオマイシン、ドキソルビシン及びミトキサントロン）、ホルモン剤（例えば、限定はされないが、プレドニゾン、デキサメタゾン、タモキシフェン及びリュープロリド）及び生物学的応答修飾因子（例えば、限定はされないが、ハーセプチン及びアバスチン、アービタックス及びリツキサン）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、対象に投与される化学療法は、ＦＯＬＦＯＸ又はＦＯＬＦＩＲＩを含んでもよい。特定の実施形態では、少なくとも１つのＰＡＲＰ阻害剤を含む療法が対象に投与されてもよい。特定の実施形態では、ＰＡＲＰ阻害剤は、特に、オラパリブ、タラゾパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ（商品名ゼジューラ）を含んでもよい。典型的に、治療法は、少なくとも１つの免疫療法（又は免疫療法剤）を含む。免疫療法は、一般に、所与のがんタイプに対する免疫応答を増強する方法を指す。特定の実施形態では、免疫療法は、腫瘍又はがんに対するＴ細胞応答を増強する方法を指す。
【0374】
いくつかの実施形態では、治療法は、体細胞又は生殖系列が起源であるような核酸変異体の状態に基づいてカスタマイズされる。いくつかの実施形態では、本質的に任意のがん療法（例えば、外科的療法、放射線療法、化学療法など）は、これらの方法の一部として含めてもよい。
【0375】
いくつかの実施形態では、免疫療法又は免疫療法剤は、免疫チェックポイント分子を標的にする。特定の腫瘍は、免疫チェックポイント経路を利用することによって免疫系を回避することができる。したがって、免疫チェックポイントの標的化は、腫瘍の免疫系を回避する能力に対抗し、特定のがんに対する抗腫瘍免疫を活性化させるための有効な手法として認められている。Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ，２０１２，１２：２５２－２６４。
【0376】
特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、抗原に対するＴ細胞応答に関与するシグナルを低減する阻害分子である。例えば、ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞上で発現され、抗原提示細胞上のＣＤ８０（別名Ｂ７．１）又はＣＤ８６（別名Ｂ７．２）に結合することによって、Ｔ細胞活性化の下方制御における役割を発揮する。ＰＤ－１は、Ｔ細胞上で発現される別の阻害チェックポイント分子である。ＰＤ－１は、炎症性応答中、末梢組織内でのＴ細胞の活性を制限する。さらに、ＰＤ－１に対するリガンド（ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２）は、一般に多種の腫瘍の表面上で上方制御され、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答の下方制御をもたらす。特定の実施形態では、阻害免疫チェックポイント分子は、ＣＴＬＡ４又はＰＤ－１である。他の実施形態では、阻害免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２などのＰＤ－１に対するリガンドである。他の実施形態では、阻害免疫チェックポイント分子は、ＣＤ８０又はＣＤ８６などのＣＴＬＡ４に対するリガンドである。他の実施形態では、阻害免疫チェックポイント分子は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）、ガレクチン９（ＧＡＬ９）、又はアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）である。
【0377】
これらの免疫チェックポイント分子を標的にするアンタゴニストを使用して、特定のがんに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を増強することができる。したがって、特定の実施形態では、免疫療法又は免疫療法剤は、阻害免疫チェックポイント分子のアンタゴニストである。特定の実施形態では、阻害免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１である。特定の実施形態では、阻害免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－Ｌ１である。特定の実施形態では、阻害免疫チェックポイント分子のアンタゴニストは、抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。特定の実施形態では、抗体又はモノクローナル抗体は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、又は抗ＰＤ－Ｌ２抗体である。特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗ＰＤ－１抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、抗ＣＴＬＡ４抗体及び抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体、又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び抗ＰＤ－１抗体の組み合わせである。特定の実施形態では、抗ＰＤ－１抗体は、ペンブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））又はニボルマブ（オプジーボ（登録商標））の１つ以上である。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブ（ヤーボイ（登録商標））である。特定の実施形態では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（テセントリク（登録商標））、アベルマブ（バベンチオ（登録商標））、又はデュルバルマブ（イミフィンジ（登録商標））の１つ以上である。
【0378】
特定の実施形態では、免疫療法又は免疫療法剤は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＡＧ３、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、又はＡ２ａＲに対するアンタゴニスト（例えば、抗体）である。他の実施形態では、アンタゴニストは、阻害免疫チェックポイント分子の可溶性バージョン、例えば、阻害免疫チェックポイント分子の細胞外ドメイン及び抗体のＦｃドメインを含む可溶性融合タンパク質である。特定の実施形態では、可溶性融合タンパク質は、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、又はＰＤ－Ｌ２の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、可溶性融合タンパク質は、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＡＧ３、ＫＩＲ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、又はＡ２ａＲの細胞外ドメインを含む。一実施形態では、可溶性融合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ２又はＬＡＧ３の細胞外ドメインを含む。
【0379】
特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、抗原に対するＴ細胞応答に関与するシグナルを増幅する共刺激分子である。例えば、ＣＤ２８は、Ｔ細胞上に発現される共刺激受容体である。Ｔ細胞がそのＴ細胞受容体を通じて抗原に結合する場合、ＣＤ２８は、抗原提示細胞上のＣＤ８０（別名Ｂ７．１）又はＣＤ８６（別名Ｂ７．２）に結合して、Ｔ細胞受容体シグナル伝達を増幅し、Ｔ細胞活性化を促進する。ＣＤ２８がＣＴＬＡ４と同じリガンド（ＣＤ８０及びＣＤ８６）に結合することから、ＣＴＬＡ４は、ＣＤ２８によって媒介される共刺激シグナル伝達に対抗するか又はそれを調節することができる。特定の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、ＣＤ２８、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ１３７、０Ｘ４０、又はＣＤ２７から選択される共刺激分子である。他の実施形態では、免疫チェックポイント分子は、例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、又はＣＤ７０を含む、共刺激分子のリガンドである。
【0380】
これらの共刺激チェックポイント分子を標的にするアゴニストを使用して、特定のがんに対する抗原特異的Ｔ細胞応答を増強することができる。したがって、特定の実施形態では、免疫療法又は免疫療法剤は、共刺激チェックポイント分子のアゴニストである。特定の実施形態では、共刺激チェックポイント分子のアゴニストは、アゴニスト抗体であり、好ましくは、モノクローナル抗体である。特定の実施形態では、アゴニスト抗体又はモノクローナル抗体は、抗ＣＤ２８抗体である。他の実施形態では、アゴニスト抗体又はモノクローナル抗体は、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ１３７、抗ＯＸ４０、又は抗ＣＤ２７抗体である。他の実施形態では、アゴニスト抗体又はモノクローナル抗体は、抗ＣＤ８０、抗ＣＤ８６、抗Ｂ７ＲＰｌ、抗Ｂ７－Ｈ３、抗Ｂ７－Ｈ４、抗ＣＤ１３７Ｌ、抗ＯＸ４０Ｌ、又は抗ＣＤ７０抗体である。
【0381】
特定の実施形態では、体細胞又は生殖系列が起源である、対象からのサンプルからの核酸変異体の状態を、参照集団からのコンパレータの結果のデータベースと比較して、その対象に対するカスタマイズされた又は標的化された治療法を特定することができる。典型的に、参照集団は、対象と同じ治療法を受けている、又は受けてきている対象及び／又は患者と同じがん又は疾患タイプを有する患者を含む。カスタマイズされた又は標的化された治療法（ｔｈｅｒａｐｙ）（又は治療法（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ））は、核酸変異体（ｎｕｃｌｅｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）及びコンパレータの結果が特定の分類基準を満たす（例えば、実質的に又は概ね一致する）場合、特定することができる。
【0382】
特定の実施形態では、本明細書に記載のカスタマイズされた治療法は、典型的に非経口的に（例えば、静脈内又は皮下に）投与される。免疫療法剤を含有する医薬組成物は、典型的に静脈内に投与される。特定の治療薬は、経口的に投与される。しかし、カスタマイズされた治療法（例えば、免疫療法剤など）はまた、例えば、頬側、舌下、直腸、膣、尿道内、局所、眼内、鼻腔内、及び／又は耳介内といった当該技術分野で公知の任意の方法によって投与されてもよく、投与は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、水性懸濁液、ゲル剤、噴霧剤、坐剤、軟膏、軟膏剤などを含んでもよい。
【0383】
がん以外の特定の遺伝子ベースの疾患、障害、又は病態を治療するための治療選択肢は、一般に当業者に周知であり、検討中の特定の疾患、障害、又は病態を仮定すれば、明らかであろう。
【0384】
いくつかの実施形態では、例えば、遺伝子変異体が検出される場合、治療法は、体細胞又は生殖系列が起源である核酸変異体の状態に基づいてカスタマイズされる。いくつかの実施形態では、本質的に任意のがん療法（例えば、外科的療法、放射線療法、化学療法など）は、これらの方法の一部として含めてもよい。典型的に、カスタマイズされた治療法は、少なくとも１つの免疫療法（又は免疫療法剤）を含む。免疫療法は、一般に所与のがんタイプに対する免疫応答を増強する方法を指す。特定の実施形態では、免疫療法は、腫瘍又はがんに対するＴ細胞応答を増強する方法を指す。
【0385】
特定の実施形態では、体細胞又は生殖系列が起源である、対象からのサンプルからの核酸変異体の状態を、参照集団からのコンパレータの結果のデータベースと比較して、その対象に対するカスタマイズされた又は標的化された治療法を特定することができる。典型的に、参照集団は、対象と同じ治療法を受けている、又は受けてきている対象及び／又は患者と同じがん又は疾患タイプを有する患者を含む。カスタマイズされた又は標的化された治療法（ｔｈｅｒａｐｙ）（又は治療法（ｔｈｅｒａｐｉｅｓ））は、核酸変異体（ｎｕｃｌｅｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）及びコンパレータの結果が特定の分類基準を満たす（例えば、実質的に又は概ね一致する）場合、特定することができる。
【0386】
特定の実施形態では、本明細書に記載のカスタマイズされた治療法は、典型的に非経口的に（例えば、静脈内又は皮下に）投与される。免疫療法剤を含有する医薬組成物は、典型的に静脈内に投与される。特定の治療薬は、経口的に投与される。しかし、カスタマイズされた治療法（例えば、免疫療法剤など）はまた、例えば、頬側、舌下、直腸、膣、尿道内、局所、眼内、鼻腔内、及び／又は耳介内などの方法によって投与されてもよく、投与は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、水性懸濁液、ゲル剤、噴霧剤、坐剤、軟膏、軟膏剤などを含んでもよい。
【0387】
キット
また提供されるのは、本明細書に記載されるアダプターを含むキットである。アダプターは、品質管理ヌクレオシドを含む。キットは、本明細書に記載される方法の実施における使用を意図することができる。いくつかの実施形態では、キットは、複数のアダプターを含む。
また提供されるのは、本明細書に記載されるアダプターを含むキットである。アダプターは、品質管理ヌクレオシドを含む。キットは、本明細書に記載される方法の実施における使用を意図することができる。いくつかの実施形態では、キットは、複数のアダプターを含む。
【0388】
いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の変換試薬を含む。いくつかの実施形態では、変換試薬は、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する。いくつかの実施形態では、変換試薬は、品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性を変更しない。いくつかの実施形態では、キットは、バイサルファイト変換、酸化バイサルファイト変換、Ｔｅｔ補助（ＴＡＢ）変換、置換されたボラン還元剤によるＴｅｔ補助変換、ＡＰＯＢＥＣ連結エピジェネティック（ＡＣＥ）変換、又は核酸塩基の酵素変換において使用される変換試薬を含む。ｈｍＣを保護するための試薬（例えば、βＧＴ）は、変換試薬、例えば、Ｔｅｔ酵素及び／又は置換されたボラン還元剤と組み合わせ可能である。いくつかの実施形態では、１つ以上の変換試薬は、Ｔｅｔ酵素及び／又は置換されたボラン還元剤、例えば、本明細書中の他の箇所に記載のもののいずれかを含む。
【0389】
いくつかの実施形態では、キットは、複数のプライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、複数の捕捉プローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、キットは、デオキシヌクレオシド三リン酸を含む。いくつかの実施形態では、キットは、キットに含まれるアダプターにアニールするＰＣＲプライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書中の他の箇所に記載の追加的要素を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法を実施するための使用説明書を含む。
【0390】
いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡ中のメチルシトシンを認識する薬剤をさらに含む。いくつかのそのような実施形態では、薬剤は、抗体又はメチル結合タンパク質又はメチル結合ドメインである。いくつかの実施形態では、キットは、エピジェネティック及び／又は配列可変標的領域セットに特異的に結合する捕捉プローブを含む。いくつかのそのような実施形態では、捕捉プローブは、捕捉部分を含む。いくつかの実施形態では、キットは、捕捉部分の結合パートナーに連結されている固体支持体を含む。
【0391】
キットは、ＡＬＫ、ＡＰＣ、ＢＲＡＦ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＦＢＸＷ７、ＫＲＡＳ、ＭＹＣ、ＮＯＴＣＨ１、ＮＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＥＮ、ＲＢＩ、ＴＰ５３、ＭＥＴ、ＡＲ、ＡＢＬ１、ＡＫＴ１、ＡＴＭ、ＣＤＨ１、ＣＳＦＩＲ、ＣＴＮＮＢ１、ＥＲＢＢ４、ＥＺＨ２、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＬＴ３、ＧＮＡ１１、ＧＮＡＱ、ＧＮＡＳ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＲＡＳ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＫＤＲ、ＫＩＴ、ＭＬＨ１、ＭＰＬ、ＮＰＭ１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＲＯＣ、ＰＴＰＮ１１、ＲＥＴ、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＢ１、ＳＭＯ、ＳＲＣ、ＳＴＫ１１、ＶＨＬ、ＴＥＲＴ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＲＡＦ１、ＢＲＣＡ１、ＣＣＮＤ２、ＣＤＫ６、ＮＦ１、ＴＰ５３、ＡＲＩＤ１Ａ、ＢＲＣＡ２、ＣＣＮＥ１、ＥＳＲ１、ＲＩＴ１、ＧＡＴＡ３、ＭＡＰ２Ｋ１、ＲＨＥＢ、ＲＯＳ１、ＡＲＡＦ、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＦＥ２Ｌ２、ＲＨＯＡ、及びＮＴＲＫ１からなる群から選択される少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０又は全ての遺伝子と選択的にハイブリダイズする複数のオリゴヌクレオチドプローブをさらに含んでもよい。オリゴヌクレオチドプローブが選択的にハイブリダイズし得る対象の遺伝子の数は、変動し得る。例えば、遺伝子の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、又は５４を含み得る。キットは、本明細書に記載の方法のいずれかを実施するための複数のオリゴヌクレオチドプローブを含む容器及び使用説明書を含み得る。
【0392】
キットは、異なる分子バーコード及び同一のサンプルバーコードを有する、少なくとも４、５、６、７、又は８つの異なるライブラリーアダプターを含み得る。サンプルバーコードは、５ｍＣなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。ライブラリーアダプターは、配列決定アダプターでなくてもよい。例えば、ライブラリーアダプターは、フローセル配列又は配列決定のためのヘアピンループの形成を可能にする配列を含まない。分子バーコード及びサンプルバーコードの異なるバリエーション及び組み合わせは、全体を通じて記載され、キットに適用可能である。さらに、いくつかの場合、アダプターは、配列決定アダプターでない。加えて、キットとともに提供されるアダプターは、配列決定アダプターも含み得る。配列決定アダプターは、１つ以上の配列決定プライマーにハイブリダイズする配列を含み得る。配列決定アダプターは、固体支持体にハイブリダイズする配列、例えばフローセル配列をさらに含み得る。例えば、配列決定アダプターは、フローセルアダプターであり得る。配列決定アダプターは、ポリヌクレオチド断片の一方又は両方の末端に付着され得る。いくつかの場合、キットは、異なる分子バーコード及び同一のサンプルバーコードを有する少なくとも８つの異なるライブラリーアダプターを含み得る。ライブラリーアダプターは、配列決定アダプターでなくてもよい。キットは、ライブラリーアダプターに選択的にハイブリダイズする第１の配列及びフローセル配列に選択的にハイブリダイズする第２の配列を有する配列決定アダプターをさらに含み得る。別の例では、配列決定アダプターは、ヘアピン形状であり得る。例えば、ヘアピン形状のアダプターは、相補的な二本鎖部分及びループ部分を含み得て、ここで二本鎖部分は、二本鎖ポリヌクレオチドに付着（例えば、ライゲート）され得る。ヘアピン形状の配列決定アダプターは、ポリヌクレオチド断片の両方の末端に付着され、環状分子を生成することができ、それは複数回配列決定され得る。配列決定アダプターは、１つ以上のバーコードを含み得る。例えば、配列決定アダプターは、サンプルバーコードを含み得る。サンプルバーコードは、所定の配列を含み得る。サンプルバーコードを使用して、ポリヌクレオチドの供給源を同定することができる。サンプルバーコードは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又はそれ以上（又は全体を通じて記載される任意の長さ）の核酸塩基、例えば、少なくとも８塩基であり得る。バーコードは、上記のような隣接又は非隣接配列であり得る。
【0393】
ライブラリーアダプターは、平滑末端及びＹ形状であり得て、長さが４０以下の核酸塩基長であり得る。ライブラリーアダプターの他のバリエーションは、全体を通じて見出すことができ、キットに適用可能である。いくつかの実施形態では、アダプターは、品質管理ヌクレオシドを含む。
【0394】
コンピュータシステム
本開示の方法は、コンピュータシステムを使用して、又はその支援によって実行することができる。図２は、本開示の方法を実行するようにプログラムされている、又はそうでなければ設計されているコンピュータシステム２０１を示す。コンピュータシステム２０１は、様々な態様としてサンプル調製、配列決定、及び／又は分析を制御することができる。いくつかの例では、コンピュータシステム２０１は、例えば、本明細書で開示される方法のいずれかに従い、（適用可能である場合）核酸配列決定を含む、サンプル調製及びサンプル分析を実施するように設計されている。
本開示の方法は、コンピュータシステムを使用して、又はその支援によって実行することができる。図２は、本開示の方法を実行するようにプログラムされている、又はそうでなければ設計されているコンピュータシステム２０１を示す。コンピュータシステム２０１は、様々な態様としてサンプル調製、配列決定、及び／又は分析を制御することができる。いくつかの例では、コンピュータシステム２０１は、例えば、本明細書で開示される方法のいずれかに従い、（適用可能である場合）核酸配列決定を含む、サンプル調製及びサンプル分析を実施するように設計されている。
【0395】
コンピュータシステム２０１は、中央処理ユニット（ＣＰＵ、本明細書中では「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」でもある）２０５を含み、それはシングルコア若しくはマルチコアプロセッサ、又は並列処理用の複数のプロセッサであり得る。コンピュータシステム２０１はまた、メモリー又はメモリーロケーション２１０（例えば、ランダムアクセスメモリー、リードオンリーメモリー、フラッシュメモリー）、電子ストレージユニット２１５（例えば、ハードディスク）、１つ以上の他のシステムと通信するための通信インタフェース２２０（例えば、ネットワークアダプター）、及び周辺装置２２５、例えば、キャッシュ、その他のメモリー、データストレージ、及び／又は電子ディスプレイアダプターを含む。メモリー２１０、ストレージユニット２１５、インタフェース２２０、及び周辺装置２２５は、マザーボードなどの通信ネットワーク又はバス（実線）を通じてＣＰＵ２０５と通信する。ストレージユニット２１５は、データを記憶するためのデータストレージユニット（又はデータリポジトリー）であり得る。コンピュータシステム２０１は、通信インタフェース２２０の支援によってコンピュータネットワーク２３０と動作可能に連携され得る。コンピュータネットワーク２３０は、インターネット、インターネット及び／若しくはエクストラネット、又はインターネットと通信するイントラネット及び／若しくはエクストラネットであり得る。コンピュータネットワーク２３０は、いくつかの場合、電気通信及び／又はデータネットワークである。コンピュータネットワーク２３０は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にし得る１つ以上のコンピュータサーバーを含み得る。コンピュータネットワーク２３０は、いくつかの場合、コンピュータシステム２０１の支援によって、ピアツーピアネットワークを実行することができ、コンピュータシステム２０１と連携した装置がクライアント又はサーバーとして機能することを可能にし得る。
【0396】
ＣＰＵ２０５は、プログラム又はソフトウェアに実装され得る、機械可読命令のシーケンスを実行することができる。命令は、メモリー２１０などのメモリーロケーションに記憶され得る。ＣＰＵ２０５によって実施される演算の例は、フェッチ、デコード、実行、及びライトバックを含み得る。
【0397】
ストレージユニット２１５は、ドライバー、ライブラリー、及び保存されたプログラムなどのファイルを記憶することができる。ストレージユニット２１５は、ユーザによって作成されたプログラム及び記録されたセッション、並びにプログラムに関連する出力を記憶することができる。ストレージユニット２１５は、ユーザデータ、例えば、ユーザの好み及びユーザプログラムを記憶することができる。コンピュータシステム２０１は、いくつかの場合、例えば、イントラネット又はインターネットを通じてコンピュータシステム２０１と通信するリモートサーバー上に位置する、コンピュータシステム２０１に対して外部である１つ以上の追加的なデータストレージユニットを含み得る。データは、例えば、通信ネットワーク又は物理的なデータ移動を用いて（例えば、ハードドライブ、サムドライブ、又はその他のデータ記憶機構を使用して）、１つのロケーションから別のロケーションに移動され得る。
【0398】
コンピュータシステム２０１は、ネットワーク２３０を通じて、１つ以上の遠隔コンピュータシステムと通信することができる。実装として、コンピュータシステム２０１は、ユーザ（例えば、オペレーター）の遠隔コンピュータシステムと通信することができる。遠隔コンピュータシステムの例として、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレート若しくはタブレットＰＣ（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰａｄ（登録商標）、Ｓａｍｓｕｎｇ（登録商標）Ｇａｌａｘｙ Ｔａｂ）、電話、スマートフォン（例えば、Ａｐｐｌｅ（登録商標）ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、アンドロイド（登録商標）対応機器、Ｂｌａｃｋｂｅｒｒｙ（登録商標））、又はパーソナルデジタルアシスタントが挙げられる。ユーザは、ネットワーク２３０を介して、コンピュータシステム２０１にアクセスすることができる。
【0399】
本明細書に記載される方法は、コンピュータシステム２０１の電子記憶ロケーション、例えば、メモリー２１０又は電子ストレージユニット２１５などに記憶されているマシン（例えば、コンピュータプロセッサ）で実行可能なコードを用いて実行することができる。機械実行可能又は機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用中、コードは、プロセッサ２０５によって実行することができる。いくつかの場合、コードは、ストレージユニット２１５から検索し、プロセッサ２０５による迅速なアクセスのためにメモリー２１０に記憶することができる。いくつかの状況では、電子ストレージユニット２１５は、排除される可能性があり、機械実行可能命令は、メモリー２１０に記憶される。
【0400】
ある態様では、本開示は、少なくとも１つの電子プロセッサによって実行されるとき、本明細書に記載の方法の少なくとも一部分を実施する、コンピュータで実行可能な命令を含む非一時的なコンピュータ可読媒体を提供する。例えば、方法は、ＤＮＡをオリゴヌクレオチドアダプターにライゲートすることと；適応したＤＮＡ、又はそのサブサンプルに変換手順を施すことと；変換ステップ後に適応したＤＮＡを配列決定することと；配列データを使用して、アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性変換を判定することと；アダプター内の品質管理ヌクレオシドの塩基対特異性変換を変換ステップについての品質管理尺度として使用することと、を含んでもよく、ここでアダプターは、修飾ヌクレオシドを含む品質管理ヌクレオシドを含み、品質管理ヌクレオシドは、ＤＮＡ中の検出対象の修飾ヌクレオシドと同じヌクレオシド同一性及び同じ又は異なる修飾状態を有し、且つ品質管理ヌクレオシドの修飾状態は既知である。
【0401】
コードは、コードを実行するように適応させたプロセッサを有するマシンによる使用のため、プリコンパイルし、設計することができ、又は実行中にコンパイルすることができる。コードは、コードがプリコンパイルされた、又はコンパイルされたような様式で実行できるように選択され得るプログラミング言語で供与することができる。
【0402】
コンピュータシステム２０１などの本明細書に提供されるシステム及び方法の態様は、プログラミングで実装することができる。技術の様々な態様は、典型的に、機械可読媒体のタイプで実行又は実装されている、マシン（又はプロセッサ）で実行可能なコード及び／又は関連データの形態における「製品」又は「製造品」として考えることができる。マシンで実行可能なコードは、メモリー（例えば、リードオンリーメモリー、ランダムアクセスメモリー、フラッシュメモリー）又はハードディスクのような電子ストレージユニットに記憶させることができる。「記憶」型媒体は、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリーのいずれか又は全て、或いはソフトウェアプログラミング用に随時非一時的記憶を提供可能である、様々な半導体メモリー、テープドライブ、ディスクドライブなどのその関連モジュールを含み得る。
【0403】
ソフトウェアの全部又は一部は、時としてインターネット又は様々な他の電気通信ネットワークを通じて通信されることがある。例えば、こうした通信では、一方のコンピュータ又はプロセッサをもう一方へ、例えば、管理サーバー又はホストコンピュータをアプリケーションサーバーのコンピュータプラットフォームへ、ソフトウェアをロードすることが可能な場合がある。したがって、ソフトウェアエレメントを有し得る媒体の別タイプは、光波、電波、及び電磁波、例えば、有線及び光回線ネットワークを通じた、及び様々なエアリンクに及ぶ、ローカルデバイス間の物理的なインタフェースを通じて使用されるものを含む。こうした波を運ぶ物理エレメント、例えば、有線又は無線リンク、光リンク、又はそれに類するものは、ソフトウェアを有する媒体と考えることもできる。本明細書で使用する場合、非一時的な有形の「記憶」媒体に制限しない限り、コンピュータ又はマシンの「可読媒体」などの用語は、命令を実行用プロセッサに提供することに関与する任意の媒体を指す。
【0404】
それ故、コンピュータで実行可能なコードなどの機械可読媒体は、限定はされないが、有形の記憶媒体、搬送波媒体又は物理的伝達媒体を含む、多くの形態をなすことがある。非揮発性記憶媒体は、例えば、図面に示される、例えば、データベースなどを実行するために使用可能である、光又は磁気ディスク、例えば、任意のコンピュータ又はそれに類するものにおける記憶デバイスのいずれかを含む。揮発性記憶媒体は、動的メモリー、例えば、こうしたコンピュータプラットフォームのメインメモリーを含む。有形の伝達媒体は、同軸ケーブル；銅ワイヤー及び光ファイバー、例えば、コンピュータシステム内のバスを含むワイヤーを含む。搬送波伝達媒体は、電気若しくは電磁気シグナル、又は高周波（ＲＦ）及び赤外（ＩＲ）データ通信の間に生成されるような音波若しくは光波の形態をなし得る。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的形態として、例えば、フロッピーディスク（登録商標）、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ若しくはＤＶＤ－ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的な記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ（登録商標）－ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリーチップ若しくはカートリッジ、搬送波輸送データ若しくは命令、こうした搬送波を輸送するケーブル若しくはリンク、又はコンピュータがプログラミングコード及び／若しくはデータを読み取ることができる元となる任意の他の媒体が挙げられる。コンピュータ可読媒体のこれらの形態の多くは、１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスの実行用プロセッサへの運搬に関与し得る。
【0405】
コンピュータシステム２０１は、例えば、サンプル分析の１つ以上の結果を提供するため、ユーザーインターフェース（ＵＩ）を含む電子ディスプレイを含み得る、又はそれと通信することができる。ＵＩの例としては、限定はされないが、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）及びウェブベースのユーザーインターフェースが挙げられる。
【0406】
また、コンピュータシステム及びネットワーク、データベース、及びコンピュータプログラムプロダクトに関するさらなる詳細は、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ：Ａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍｏｒｇａｎ Ｋａｕｆｍａｎｎ，５ｔｈ Ｅｄ．（２０１１），Ｋｕｒｏｓｅ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋｉｎｇ：Ａ Ｔｏｐ－Ｄｏｗｎ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｅａｒｓｏｎ，７ｔｈＥｄ．（２０１６），Ｅｌｍａｓｒｉ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｅｙ，６ｔｈ Ｅｄ．（２０１０），Ｃｏｒｏｎｅｌ，Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ，＆ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，Ｃｅｎｇａｇｅ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，１１ｔｈＥｄ．（２０１４），Ｔｕｃｋｅｒ，Ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｌａｎｇｕａｇｅｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ／Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｍａｔｈ，２ｎｄ Ｅｄ．（２００６），及びＲｈｏｔｏｎ，Ｃｌｏｕｄ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｅｄ：Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｐｒｅｓｓ（２０１１）（これらのそれぞれはその全体が参照により本明細書に援用される）に提供されている。
【0407】
本発明の好ましい実施形態が本明細書で示され、記載されている一方で、そのような実施形態があくまで例として提供されることは当業者にとって明白であろう。本発明が本明細書内に提供されている具体例によって限定されることは意図されない。本発明が前述の明細書に関連して記載されている一方で、本明細書中の実施形態の説明及び例示は、限定的意味で解釈されることは意図されていない。ここで当業者は、多数のバリエーション、変更、及び置換を本発明から逸脱することなく設けることになる。さらに、本発明の全ての態様が、種々の条件及び変数に依存する、本明細書に記載される具体的な描写、立体配置又は相対的比率に限定されないことは理解されるべきである。本明細書に記載されている本開示の実施形態に対する様々な代替物が本発明の実施において利用できることは理解されるべきである。したがって、本開示が任意のそのような代替物、修飾、バリエーション又は均等物も包含することが企図される。以下の請求項が本発明の範囲を定義し、且つこれら請求項の範囲内の方法及び構造並びにそれらの等価物がそれによって包含されることが意図される。
【0408】
前述の開示が、明確さや理解を目的として、図面及び実施例を用いてある程度詳細に説明されている一方で、形態及び詳細における様々な変更が、本開示の真の範囲から逸脱することなく設けることができ、添付の請求項の範囲内で実施できることは、当業者にとって本開示を通読することから明白となろう。例えば、全ての方法、システム、コンピュータ可読媒体、及び／又は成分特徴、ステップ、要素、又はそれらの他の態様は、様々な組み合わせで使用することができる。
【0409】
本明細書中で引用される全ての特許、特許出願、ウェブサイト、その他の出版物又は文書、受入番号などは、あらゆる目的でそれら全体が参照により援用されるが、それは各個別の項目が具体的且つ個別に参照によりそのように援用されることが示された場合と同程度である。配列の異なるバージョンが異なる時点での受入番号を伴う場合、本願の有効出願日での受入番号を伴うバージョンが意図される。有効出願日は、適用可能である場合、受入番号を参照する実際の出願日又は優先権出願の出願日より早期であることを意味する。同様に、出版物、ウェブサイト又はそれに類するものの異なるバージョンが異なる時点で公開される場合、別段の指示がない限り、出願の有効出願日にごく最近公開されたバージョンが意図される。
【実施例】
【0410】
サンプル及びライブラリー調製における核酸の修飾ヌクレオシドプロファイルを分析するための例示的なワークフローが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、分割及びライブラリー調製ワークフローの一部又は全部の特徴は、組み合わせて用いてもよい。
【0411】
例示的な方法は、以下のとおりである：
１．例えば、下流処理のためのプロセスからの全ての溶出物を保存する、メチル結合ドメインタンパク質－ビーズ精製キットを使用する、抽出されたＤＮＡサンプル（例えば、任意選択的に本明細書に記載される標的捕捉を受けている、ヒトサンプルからの抽出された血漿ＤＮＡ）の任意選択的な物理的分割。
２．差次的な分子タグ及びＮＧＳを可能にするアダプター配列のサンプルＤＮＡ又は各画分への（並行）適用。例えば、高メチル化、残留メチル化（「洗浄」）、及び低メチル化画分を、分子タグとともにＮＧＳ－アダプターにライゲートする。サンプル、又はサンプルの少なくとも１つの画分、例えば、高メチル化画分に対するアダプターは、既知のヌクレオシド同一性及び既知の修飾状態を有する、本明細書に記載される、１つ以上の品質管理ヌクレオシドを含む；
３．サンプル、又はサンプルの少なくとも１つの画分、例えば、高メチル化画分に、アダプター内の既知の修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順を施す；
４．適用可能な場合、全ての分子タグ付け画分の再結合、及びアダプターに特異的なＤＮＡプライマー配列を使用する任意選択的なその後の増幅。
５．目的のゲノム領域（例えば、がん特異的な遺伝子変異体及び／又は差次的メチル化領域）を標的にする、（再結合及び／又は増幅された）全ライブラリーの捕捉／ハイブリダイゼーション。
６．サンプルタグを付加している、捕捉されたＤＮＡライブラリーの任意選択的な再増幅。異なるサンプルをプールし、ＮＧＳ機器で多重にアッセイする。
７．分子タグを任意選択的に使用して固有の分子が同定される、ＮＧＳデータのバイオインフォマティクス解析、及び差次的に分割された分子へのサンプルのデコンボリューション。遺伝子配列決定／変異体検出では、正確に変換されているか又は変換されていないアダプター領域内の品質管理ヌクレオシドを同定する。サンプル又は分子レベルの変換率を判定し、分析のための品質管理尺度として使用する。
８．任意選択的に、スコア又は加重をそれぞれの同定された固有の分子に、アダプター領域内の既知の修飾ヌクレオシドの変換率に応じて適用する。スコア又は加重を、例えば、診断又は予後において使用されるとき、サンプルデータからの下流の分析又は推測において適用する。
１．例えば、下流処理のためのプロセスからの全ての溶出物を保存する、メチル結合ドメインタンパク質－ビーズ精製キットを使用する、抽出されたＤＮＡサンプル（例えば、任意選択的に本明細書に記載される標的捕捉を受けている、ヒトサンプルからの抽出された血漿ＤＮＡ）の任意選択的な物理的分割。
２．差次的な分子タグ及びＮＧＳを可能にするアダプター配列のサンプルＤＮＡ又は各画分への（並行）適用。例えば、高メチル化、残留メチル化（「洗浄」）、及び低メチル化画分を、分子タグとともにＮＧＳ－アダプターにライゲートする。サンプル、又はサンプルの少なくとも１つの画分、例えば、高メチル化画分に対するアダプターは、既知のヌクレオシド同一性及び既知の修飾状態を有する、本明細書に記載される、１つ以上の品質管理ヌクレオシドを含む；
３．サンプル、又はサンプルの少なくとも１つの画分、例えば、高メチル化画分に、アダプター内の既知の修飾ヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順を施す；
４．適用可能な場合、全ての分子タグ付け画分の再結合、及びアダプターに特異的なＤＮＡプライマー配列を使用する任意選択的なその後の増幅。
５．目的のゲノム領域（例えば、がん特異的な遺伝子変異体及び／又は差次的メチル化領域）を標的にする、（再結合及び／又は増幅された）全ライブラリーの捕捉／ハイブリダイゼーション。
６．サンプルタグを付加している、捕捉されたＤＮＡライブラリーの任意選択的な再増幅。異なるサンプルをプールし、ＮＧＳ機器で多重にアッセイする。
７．分子タグを任意選択的に使用して固有の分子が同定される、ＮＧＳデータのバイオインフォマティクス解析、及び差次的に分割された分子へのサンプルのデコンボリューション。遺伝子配列決定／変異体検出では、正確に変換されているか又は変換されていないアダプター領域内の品質管理ヌクレオシドを同定する。サンプル又は分子レベルの変換率を判定し、分析のための品質管理尺度として使用する。
８．任意選択的に、スコア又は加重をそれぞれの同定された固有の分子に、アダプター領域内の既知の修飾ヌクレオシドの変換率に応じて適用する。スコア又は加重を、例えば、診断又は予後において使用されるとき、サンプルデータからの下流の分析又は推測において適用する。
【0412】
任意選択的に、ＤＮＡを分割及び／又は濃縮した後、例えば、ＤＮＡ分子の末端オーバーハングを伸長し、そしてアデノシン残基を断片の３’末端に付加し、各ＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化することによって、ＤＮＡをライゲート可能にすることができる。ＤＮＡリガーゼ及びアダプターを付加して、分割された各ＤＮＡ分子を一方の末端又は両方の末端でアダプターとライゲートする。これらのアダプターは、他の画分において使用されるアダプター内の分割タグと区別可能である分割タグ（例えば、非無作為な非固有のバーコード）を含有してもよい。ＤＮＡをライゲート可能にして、ライゲーションを実施した後、サンプル、又はその画分（例えば、高メチル化画分）は、本明細書に記載のとおり、例えば、ＴＡＰＳ法を用いて、修飾状態に依存しているアダプター内のヌクレオシドの塩基対特異性を変更する変換手順を受ける。サンプルが分割されている場合、画分は、増幅前に一緒にプールすることができる。増幅は、アダプターに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって行ってもよい。
【0413】
増幅後、ＤＮＡは、富化前に、洗浄し、濃縮することができる。増幅されたＤＮＡは、目的の特定領域を標的にする、例えば本明細書に記載される、プローブの収集物（例えば、ビオチン化ＲＮＡプローブであってもよい）と接触させることができる。混合物は、例えば一晩、例えば塩緩衝液中でインキュベートすることができる。プローブは、（例えば、ストレプトアビジン磁気ビーズを使用して）捕捉し、例えば一連の塩洗浄によって、捕捉されなかった増幅されたＤＮＡから分離し、それによりサンプルを富化することができる。富化後、富化されたサンプルは、例えばＰＣＲによって（さらに）増幅することができる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、サンプルタグを含有し、それにより、サンプルタグをＤＮＡ分子に取り込ませる。いくつかの実施形態では、異なるサンプルからのＤＮＡを一緒にプールし、次に例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑシークエンサーを使用して多重配列決定する。
【図1】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】