特表 2024-540180 ＭＳベースのプロテオミクスのためのジスルフィドスクランブルを防止するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-31

(54)【発明の名称】ＭＳベースのプロテオミクスのためのジスルフィドスクランブルを防止するための方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 27/62 20210101AFI20241024BHJP

   G01N 33/68 20060101ALI20241024BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20241024BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20241024BHJP

   G01N 30/06 20060101ALI20241024BHJP

【ＦＩ】

G01N27/62 V ZNA

G01N27/62 X

G01N33/68

G01N30/72 C

G01N30/88 J

G01N30/06 E

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024525647

(86)(22)【出願日】2022-10-28

(85)【翻訳文提出日】2024-05-28

(86)【国際出願番号】 US2022048242

(87)【国際公開番号】W WO2023076612

(87)【国際公開日】2023-05-04

(31)【優先権主張番号】63/274,256

(32)【優先日】2021-11-01

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】507302748

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100188433

【弁理士】

【氏名又は名称】梅村 幸輔

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100214396

【弁理士】

【氏名又は名称】塩田 真紀

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(74)【代理人】

【識別番号】100221741

【弁理士】

【氏名又は名称】酒井 直子

(74)【代理人】

【識別番号】100114926

【弁理士】

【氏名又は名称】枝松 義恵

(72)【発明者】

【氏名】クラインベルク アンドリュー

(72)【発明者】

【氏名】マオ ユアン

(72)【発明者】

【氏名】リー ニン

【テーマコード（参考）】

2G041

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041FA12

2G041FA13

2G041GA09

2G041HA01

2G041JA02

2G041JA14

2G045DA36

2G045FA34

2G045FA36

2G045FB06

(57)【要約】

本発明は、概して、関心対象のタンパク質の非還元液体クロマトグラフィー－質量分析におけるジスルフィドスクランブルを防止する方法に関する。特に、本発明は、ジスルフィドスクランブルを防止するためのタンパク質の非還元液体クロマトグラフィー－質量分析へのマレイミドの添加に関する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の関心対象のタンパク質の非還元ペプチドマッピングを実施するための方法であって、
ａ．前記試料をＮＥＭ類似体に接触させて、関心対象のアルキル化タンパク質を形成することと、
ｂ．前記関心対象のアルキル化タンパク質を少なくとも１つの消化酵素に接触させて、ペプチド消化物を形成することと、
ｃ．前記ペプチド消化物を、液体クロマトグラフィー－質量分析を使用する分析に供して、前記関心対象のタンパク質の前記非還元ペプチドマッピングを得ることと
を含む、方法。

【請求項2】

前記ＮＥＭ類似体が、ＮＥＭよりも疎水性が低い、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＮＥＭ類似体が、ＮＥＭの保持時間未満の保持時間を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記ＮＥＭ類似体が、マレイミドである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記試料を接触させるために使用されるＮＥＭ類似体の濃度が、約１ｍＭ～約１０ｍＭである、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記試料を接触させるために使用されるＮＥＭ類似体の濃度が、約２ｍＭ～約８ｍＭである、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記試料を接触させるために使用されるＮＥＭ類似体の濃度が、約４ｍＭである、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記ＮＥＭ類似体が、５０℃で３０分間、前記試料と接触する、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記関心対象のタンパク質が、抗体である、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記試料を、少なくとも１つの変性剤に接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記少なくとも１つの消化酵素が、トリプシンである、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記少なくとも１つの消化酵素が、Ｌｙｓ－Ｃである、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記少なくとも１つの消化酵素が、Ｌｙｓ－Ｃ及びトリプシンである、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記消化が、約７～約８のｐＨで行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記消化が、約７～約７．５のｐＨで行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項16】

前記消化が、約５～約６のｐＨで行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項17】

前記消化が、約５．３～約７のｐＨで行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

試料中の関心対象のタンパク質を特性評価するための方法であって、
ａ．前記試料をＮＥＭ類似体に接触させて、関心対象のアルキル化タンパク質を形成することと、
ｂ．前記関心対象のアルキル化タンパク質を少なくとも１つの消化酵素に接触させて、ペプチド消化物を形成することと、
ｃ．前記ペプチド消化物を、液体クロマトグラフィー－質量分析を使用する分析に供して、前記関心対象のタンパク質を特性評価するための非還元ペプチドマッピングを得ることと
を含む、方法。

【請求項19】

試料中の関心対象のタンパク質を特性評価するための方法であって、
ａ．前記試料をマレイミドに接触させて、関心対象のアルキル化タンパク質を形成することと、
ｂ．前記関心対象のアルキル化タンパク質を少なくとも１つの消化酵素に接触させて、ペプチド消化物を形成することと、
ｃ．前記ペプチド消化物を、液体クロマトグラフィー－質量分析を使用する分析に供して、前記関心対象のタンパク質を特性評価するための非還元ペプチドマッピングを得ることと
を含む、方法。

【請求項20】

前記試料を接触させるために使用されるマレイミドの濃度が、約４ｍＭである、請求項１９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６３／２７４，２５６号の優先権及び利益を主張するものであり、この仮特許出願は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

分野
本出願は、関心対象のタンパク質の特性評価中に試料誘発ジスルフィドスクランブルを防止するための方法に関する。

【背景技術】

【0003】

背景
質量分析（ＭＳ）は、タンパク質を分析するためのますます重要な技術となっている。一般的なボトムアップＭＳベースのプロテオミクスでは、還元及びアルキル化は、ペプチド同定を容易にするための通常の工程である。しかしながら、副反応が生じる可能性があり、これにより実験結果が損なわれる。

【0004】

試料調製は、ボトムアップＭＳベースのプロテオミクスにおける重要な工程である。ＭＳベースのプロテオミクスの使用における重要な課題の１つは、試料調製中のジスルフィド結合スクランブルの防止である。この課題に対処するために、過去に数多くの方法が開発されている。温度、ｐＨ、及び遊離システインの利用可能性は、非天然ジスルフィド結合の形成を防止するために試料調製中に制御されなければならない重要な要因であることが注目されている。ｐＨが、室温であっても、ジスルフィド結合又はシステイン反応性に非常に影響を及ぼし、試料調製中に慎重に制御されなければならないことが広く受け入れられている。報告された方法は、わずかに酸性のｐＨでの試料調製を教示しており、アルカリ性ｐＨで、遊離チオールが脱プロトン化され、得られたチオレートアニオンが酸化されるか、又は隣接するジスルフィド結合（チオール／ジスルフィド交換）と反応して、新しい非天然ジスルフィド結合を形成することを記述している。

【0005】

低ｐＨタンパク質アルキル化後、ｐＨは、追加の工程を追加するタンパク質消化のために増加させることができるか、又は低ｐＨは、消化条件のために維持することができる。完全に酸性条件下でのタンパク質消化は、ジスルフィドスクランブルを最小化するが、従来の塩基性ｐＨ消化と比較して、有意な違い（例えば、非特異的切断）を有する消化ペプチドプロファイルを生成する。したがって、低ｐＨタンパク質アルキル化を必要とすることなく、タンパク質調製のための効率的な方法に対する長年にわたる必要性がある。

【0006】

試料調製誘発ジスルフィドスクランブルの形成を防止しながら、関心対象のタンパク質を特性評価するための方法が開発されている。この方法は、試料調製中に、天然ジスルフィド破壊を防止するために、新規のアルキル化剤、マレイミドを使用することを含む。マレイミドの使用は、ジスルフィドスクランブルを誘発することなく試料調製を可能にする。マレイミドの使用はまた、共通のペプチドピーク報告ウィンドウを干渉しない試薬ＵＶピークを有することによって、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）よりも疎水性の低いアルキル化剤を提供する。これにより、試料アルキル化後に緩衝液交換工程を使用する必要がなくなり、試料損失が回避される。

【発明の概要】

【0007】

概要
ＮＥＭと同様に、マレイミドは、アルキル化が酸性条件下（ｐＨ＜６）で変性工程と同時に実施される場合、プロトコル誘発ジスルフィドスクランブルを防止することができる。酸性条件下でアルキル化工程を実施した後、更なるジスルフィドスクランブルを誘発することなく、トリプシン及び／又はＬｙｓＣによる効率的な酵素消化のために、ｐＨを安全に（例えば、７．５に）上昇させることができる（すなわち、遊離チオールは、試料調製中のジスルフィドスクランブル形成の主な原因である）。

【0008】

酸性アルキル化後、従来の非還元ペプチドマッピング消化物と同様のｐＨで消化工程を実施する（例えば、システインアルキル化にヨードアセトアミドを使用し、続いてｐＨ７．５で酵素消化）ことで、従来の消化物と非常に類似したペプチドプロファイルが作成される。

【0009】

本開示は、試料中の関心対象のタンパク質の非還元ペプチドマッピングを実施するための方法を提供し、当該方法は、当該試料をＮＥＭ類似体に接触させて、関心対象のアルキル化タンパク質を形成することと、当該関心対象のアルキル化タンパク質を少なくとも１つの消化酵素に接触させて、ペプチド消化物を形成することと、当該ペプチド消化物を液体クロマトグラフィー－質量分析を使用する分析に供して、当該関心対象のタンパク質の当該非還元ペプチドマッピングを得ることとを含む。

【0010】

一態様では、ＮＥＭ類似体は、ＮＥＭよりも疎水性が低い。別の態様では、ＮＥＭ類似体は、ＮＥＭの保持時間未満の保持時間を有する。更に別の態様では、ＮＥＭ類似体は、マレイミドである。

【0011】

一態様では、当該試料を接触させるために使用されるＮＥＭ類似体の濃度は、約１ｍＭ～約１０ｍＭである。別の態様では、当該試料を接触させるために使用されるＮＥＭ類似体の濃度は、約２ｍＭ～約８ｍＭである。更に別の態様では、当該試料を接触させるために使用されるＮＥＭ類似体の濃度は、約４ｍＭである。

【0012】

一態様では、当該ＮＥＭ類似体は、５０℃で３０分間、当該試料と接触する。

【0013】

一態様では、当該関心対象のタンパク質は、抗体である。特定の態様では、当該関心対象のタンパク質は、モノクローナル抗体又は二重特異性抗体である。

【0014】

一態様では、本方法は、当該試料を、少なくとも１つの変性剤に接触させることを更に含む。特定の態様では、当該少なくとも１つの変性剤は、尿素である。別の特定の態様では、当該尿素は、約６Ｍ～約１０Ｍで存在し、任意選択的に、当該尿素は、約８Ｍで存在する。別の特定の態様では、当該変性は、約３７℃又は約５０℃で行われる。

【0015】

一態様では、当該少なくとも１つの消化酵素は、トリプシンである。別の態様では、当該少なくとも１つの消化酵素は、Ｌｙｓ－Ｃである。更に別の態様では、当該少なくとも１つの消化酵素は、Ｌｙｓ－Ｃ及びトリプシンである。

【0016】

一態様では、当該消化は、約７～約８のｐＨで行われる。特定の態様では、当該消化は、約７～約７．５のｐＨで行われる。別の態様では、当該消化は、約５～約６のｐＨで行われる。特定の態様では、当該消化は、約５．３～約７のｐＨで行われる。

【0017】

一態様では、当該クロマトグラフィー工程は、逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む。

【0018】

一態様では、当該質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、又はＯｒｂｉｔｒａｐベース質量分析計であり、当該質量分析計は、当該液体クロマトグラフィーシステムに結合される。

【0019】

本開示は、試料中の関心対象のタンパク質を特性評価するための方法を提供し、当該方法は、当該試料をＮＥＭ類似体に接触させて、関心対象のアルキル化タンパク質を形成することと、当該関心対象のアルキル化タンパク質を少なくとも１つの消化酵素に接触させて、ペプチド消化物を形成することと、当該ペプチド消化物を液体クロマトグラフィー－質量分析を使用する分析に供して、当該関心対象のタンパク質の当該非還元ペプチドマッピングを得ることとを含む。

【0020】

一態様では、ＮＥＭ類似体は、ＮＥＭよりも疎水性が低い。別の態様では、ＮＥＭ類似体は、ＮＥＭの保持時間未満の保持時間を有する。更に別の態様では、ＮＥＭ類似体は、マレイミドである。

【0021】

一態様では、当該試料を接触させるために使用されるＮＥＭ類似体の濃度は、約１ｍＭ～約１０ｍＭである。別の態様では、当該試料を接触させるために使用されるＮＥＭ類似体の濃度は、約２ｍＭ～約８ｍＭである。更に別の態様では、当該試料を接触させるために使用されるＮＥＭ類似体の濃度は、約４ｍＭである。

【0022】

一態様では、当該ＮＥＭ類似体は、５０℃で３０分間、当該試料と接触する。

【0023】

一態様では、当該関心対象のタンパク質は、抗体である。特定の態様では、当該関心対象のタンパク質は、モノクローナル抗体又は二重特異性抗体である。

【0024】

一態様では、当該試料を、少なくとも１つの変性剤に接触させることを更に含む本方法。特定の態様では、当該少なくとも１つの変性剤は、尿素である。別の特定の態様では、当該尿素は、約６Ｍ～約１０Ｍで存在し、任意選択的に、当該尿素は、約８Ｍで存在する。別の特定の態様では、当該変性は、約３℃又は約５０℃で行われる。

【0025】

一態様では、当該少なくとも１つの消化酵素は、トリプシンである。別の態様では、当該少なくとも１つの消化酵素は、Ｌｙｓ－Ｃである。更に別の態様では、当該少なくとも１つの消化酵素は、Ｌｙｓ－Ｃ及びトリプシンである。

【0026】

一態様では、当該消化は、約７～約８のｐＨで行われる。特定の態様では、当該消化は、約７～約７．５のｐＨで行われる。別の態様では、当該消化は、約５～約６のｐＨで行われる。特定の態様では、当該消化は、約５．３～約７のｐＨで行われる。

【0027】

一態様では、当該クロマトグラフィー工程は、逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む。

【0028】

一態様では、当該質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、又はＯｒｂｉｔｒａｐベース質量分析計であり、当該質量分析計は、当該液体クロマトグラフィーシステムに結合される。

【0029】

本開示は、試料中の関心対象のタンパク質を特性評価するための方法を提供し、当該方法は、当該試料をマレイミド類似体に接触させて、関心対象のアルキル化タンパク質を形成することと、当該関心対象のアルキル化タンパク質を少なくとも１つの消化酵素に接触させて、ペプチド消化物を形成することと、当該ペプチド消化物を液体クロマトグラフィー－質量分析を使用する分析に供して、当該関心対象のタンパク質の当該非還元ペプチドマッピングを得ることとを含む。

【0030】

一態様では、当該試料を接触させるために使用されるマレイミドの濃度は、約１ｍＭ～約１０ｍＭである。別の態様では、当該試料を接触させるために使用されるマレイミドの濃度は、約２ｍＭ～約８ｍＭである。更に別の態様では、当該試料を接触させるために使用されるマレイミドの濃度は、約４ｍＭである。

【0031】

一態様では、当該マレイミドは、５０℃で３０分間、当該試料と接触する。

【0032】

一態様では、当該関心対象のタンパク質は、抗体である。特定の態様では、当該関心対象のタンパク質は、モノクローナル抗体又は二重特異性抗体である。

【0033】

一態様では、本方法は、当該試料を、少なくとも１つの変性剤に接触させることを更に含む。特定の態様では、当該少なくとも１つの変性剤は、尿素である。別の特定の態様では、当該尿素は、約６Ｍ～約１０Ｍで存在し、任意選択的に、当該尿素は、約８Ｍで存在する。別の特定の態様では、当該変性は、約３７℃又は約５０℃で行われる。

【0034】

一態様では、当該少なくとも１つの消化酵素は、トリプシンである。別の態様では、当該少なくとも１つの消化酵素は、Ｌｙｓ－Ｃである。更に別の態様では、当該少なくとも１つの消化酵素は、Ｌｙｓ－Ｃ及びトリプシンである。

【0035】

一態様では、当該消化は、約７～約８のｐＨで行われる。特定の態様では、当該消化は、約７～約７．５のｐＨで行われる。別の態様では、当該消化は、約５～約６のｐＨで行われる。特定の態様では、当該消化は、約５．３～約７のｐＨで行われる。

【0036】

一態様では、当該クロマトグラフィー工程は、逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせを含む。

【0037】

一態様では、当該質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化質量分析計、ナノエレクトロスプレーイオン化質量分析計、又はＯｒｂｉｔｒａｐベース質量分析計であり、当該質量分析計は、当該液体クロマトグラフィーシステムに結合される。

【図面の簡単な説明】

【0038】

（図１）例示的な実施形態による、低ｐＨ非還元ペプチドマッピング条件で調製されたｍＡｂ１の非還元ペプチドマッピング分析から得られたｍＡｂ１のＵＶクロマトグラムを示す。
（図２）例示的な実施形態による、低ｐＨ非還元ペプチドマッピング条件で調製されたｍＡｂ２の低ｐＨ非還元ペプチドマッピング分析から得られたｍＡｂ１のＵＶクロマトグラムを示す。
（図３）例示的な実施形態による、ＩｇＧ１ジスルフィドを同定する低ｐＨ非還元ペプチドマッピング条件で調製されたｍＡｂ１の低ｐＨ非還元ペプチドマッピング分析から得られたｍＡｂ１のＵＶクロマトグラムを示す。
（図４）例示的な実施形態による、ＮＥＭ類似体、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシマレイミド、及びマレアミドの構造を示す。
（図５）例示的な実施形態による、ＮＥＭ、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシマレイミド、及びマレアミドを使用するｍＡｂ１の低ｐＨ非還元ペプチドマッピング分析のＵＶクロマトグラムを示す。
（図６Ａ）例示的な実施形態による、ＮＥＭ、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシマレイミド、及びマレアミドを使用するｍＡｂ３の低ｐＨ非還元ペプチドマッピング分析からのアルキル化遊離チオール

の正規化されたピーク面積を示す。
（図６Ｂ）例示的な実施形態による、ＮＥＭ、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシマレイミド、及びマレアミドを使用するｍＡｂ３の低ｐＨ非還元ペプチドマッピング分析からの非アルキル化遊離チオール

の正規化されたピーク面積を示す。
（図６Ｃ）例示的な実施形態による、ＮＥＭ、マレイミド、Ｎ－ヒドロキシマレイミド、及びマレアミドを使用するｍＡｂ３の低ｐＨ非還元ペプチドマッピング分析からのジスルフィドのジスルフィドスクランブル（Ｃ１３７Ｈ～Ｃ１５０Ｈ）の正規化されたピーク面積を示す。
（図７）例示的な実施形態による、ＮＥＭ及びマレイミドを使用するｍＡｂ３の低ｐＨ非還元ペプチドマッピング分析のＵＶクロマトグラムを示す。
（図８Ａ）例示的な実施形態による、対照、１ｍＭのマレイミド、２ｍＭのマレイミド、４ｍＭのマレイミド、及び８ｍＭのマレイミドを使用するｍＡｂ３の非還元ペプチドマッピング分析からのアルキル化遊離チオール

の正規化されたピーク面積を示す。
（図８Ｂ）例示的な実施形態による、対照、１ｍＭのマレイミド、２ｍＭのマレイミド、４ｍＭのマレイミド、及び８ｍＭのマレイミドを使用するｍＡｂ３の非還元ペプチドマッピング分析からの非アルキル化遊離チオール

の正規化されたピーク面積を示す。
（図８Ｃ）例示的な実施形態による、対照、１ｍＭのマレイミド、２ｍＭのマレイミド、４ｍＭのマレイミド、及び８ｍＭのマレイミドを使用するｍＡｂ３の非還元ペプチドマッピング分析からのジスルフィドのジスルフィドスクランブル（Ｃ１３７Ｈ～Ｃ１５０Ｈ）の正規化されたピーク面積を示す。
（図９）例示的な実施形態による、マレイミドを使用するｍＡｂ４の低ｐＨ非還元ペプチドマッピング分析及びｍＡｂ４の従来の非還元ペプチドマッピング分析のＵＶクロマトグラムを示す。
（図１０）例示的な実施形態による、マレイミドを使用するｍＡｂ４の「半酸性」非還元ペプチドマッピング分析及びｍＡｂ４の従来の非還元ペプチドマッピング分析のＵＶクロマトグラムを示す。
（図１１）例示的な実施形態による、マレイミドを使用するｍＡｂ５の低ｐＨ非還元ペプチドマッピング分析及びｍＡｂ４の従来の非還元ペプチドマッピング分析のＵＶクロマトグラムを示す。
（図１２）例示的な実施形態による、マレイミドを使用するｍＡｂ５の「半酸性」非還元ペプチドマッピング分析及びｍＡｂ４の従来の非還元ペプチドマッピング分析のＵＶクロマトグラムを示す。
（図１３）例示的な実施形態による、（１）アルキル化しない、塩基性消化、（２）塩基性アルキル化（ＩＡＭ）、塩基性消化、（３）酸性アルキル化（マレイミド）、酸性消化、及び（４）酸性アルキル化（マレイミド）、塩基性消化である、ｍＡｂ４及びｍＡｂ５のペプチドのジスルフィドスクランブルに対する消化条件の影響を示す。

【発明を実施するための形態】

【0039】

詳細な説明
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の製品品質属性（ＰＱＡ）の特性評価は、このますます人気が高まる治療薬のクラスの大規模で複雑な不均一性のために重要である。そのような１つのＰＱＡは、古典的なジスルフィド結合構造の適切な形成である。非古典的なジスルフィド結合（スクランブル）を含む正規のＩｇＧジスルフィド配座からの逸脱は、ｍＡｂの構造、安定性、及び生物学的有効性に悪影響を及ぼし得る（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｄｖ，２９（６）：９２３－９、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１２，ＭＡｂｓ，４（１）：１７－２３、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ，２９（１１）：６１１－２２、Ｂｒｙｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ，９９（２）：７６４－８１；Ｍａｍａｔｈａｍｂｉｋａ ａｎｄ Ｂａｒｄｗｅｌｌ，２００８，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ，２４：２１１－３５、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，８４（１６）：７１１２－２３、Ｖａｎ Ｂｕｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ，９８（９）：３０１３－３０、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１９，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ，１６４：１０５４５９）。

【0040】

ジスルフィド結合配座は、各ＩｇＧサブクラスに従って高度に保存される（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９６６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，１０１（２）：３３８－５１、Ｐｉｎｃｋ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９６７，Ｎａｔｕｒｅ，２１６（５１１８）：９４１－２、Ｆｒａｎｇｉｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９６８，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，３３（３）：８９３－９０６、Ｆｒａｎｇｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｎａｔｕｒｅ，２２１（５１７６）：１４５－８）。例えば、ＩｇＧ１分子は、図１Ａに示されるように、鎖間ジスルフィド結合によって共有結合した２つの重鎖（ＨＣ）及び２つの軽鎖（ＬＣ）からなる４本鎖構造を有する。鎖間ジスルフィド結合に加えて、１つの鎖内ジスルフィド結合が存在し、ＨＣポリペプチド及びＬＣポリペプチドの各βバレルドメイン内でシールドされる（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，３１１（１）：１－９）。ヒンジ領域では、２つのＨＣは、２つの鎖間ジスルフィド結合によって共有結合される。

【0041】

典型的な治療用ｍＡｂは、約１４０ｋＤａの分子量を有し、ＮＭＲ（Ｋｌａｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２３２（３）：８９７－９０６）、Ｘ線結晶学（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，２７７：１７３－２０８）、及びＥｄｍａｎ配列決定（Ｈａｎｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ，４３（１）：８１－６）などの従来のジスルフィド結合マッピング方法の適用性を低下させる。液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）の急速な進化、及び生体分子分析におけるその成功した実施は、ジスルフィド結合スクランブル、遊離チオール、及びトリスルフィド結合形成のような非古典的なジスルフィド特徴の正規のジスルフィド結合形成及び同定を含む、ｍＡｂ ＰＱＡの詳細なプロファイリングを可能にした。非還元ペプチドマッピングとして既知の、ｍＡｂジスルフィド結合を研究するための最も一般的なＬＣ－ＭＳアプローチは、ジスルフィド還元工程がなく、チオールアルキル化剤の量が少ない従来の還元ペプチドマッピングアプローチの修正版である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｔａｔｅ－ｏｆ－ｔｈｅ－Ａｒｔ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ ２．Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ ＮＩＳＴｍＡｂ Ｃａｓｅ Ｓｔｕｄｙ，ｐｐ．１１９－１８３、Ｆｏｒｍｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｓｔａｔｅ－ｏｆ－ｔｈｅ－Ａｒｔ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｖｏｌｕｍｅ ２．Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ｔｈｅ ＮＩＳＴｍＡｂ Ｃａｓｅ Ｓｔｕｄｙ，ｐｐ．１－６２）。トリプシンは、その高い特異性、効率、及びＭＳ分析のための適切な長さのペプチドを生成する傾向により、最も一般的に使用される消化酵素である。得られた方法は、いかなる潜在的なジスルフィド結合も無傷のままで、ｍＡｂをペプチド種に酵素的に切断する。次いで、全てのペプチドをＬＣ－ＭＳによって分析し、ＵＶ検出器は、それらの保持時間に従って溶出分析物のＵＶ吸光度を測定することによって「ペプチドフィンガープリント」を生成し、質量分析計は、これらの分析物をイオン化し、それらの質量対電荷比（ｍ／ｚ）を記録する。Ｂｙｏｎｉｃのような高度なタンパク質／ペプチド同定アルゴリズムに結合されたタンデム質量分析（ＭＳ^２）機能を有する高分解能精密質量（ＨＲＡＭ）質量分析計は、ペプチドマッピング分析を簡素化したため、ジスルフィド連結ペプチドの敏感な同定及び遊離チオールの部位特異的な同定さえも今や日常的である。

【0042】

非還元ペプチドマッピングの高い選択性及び感度は、還元ペプチドマッピングに関連する欠点を継承し、実験条件及び試薬は、方法が完全に最適化され、注意深く開発されていない場合、ペプチド配列への交絡化学修飾を誘発することがある。非還元ペプチドマッピングの場合、スクランブルジスルフィド人工物は、アルカリ性ｐＨでの加熱及び／又は酵素消化条件による変性などの試料調製工程に関連していることが判明した。これらの実験的に導入されたスクランブルジスルフィド人工物は、天然の治療用ｍＡｂにおけるそれらの既存のレベルに関する誤った解釈又は結論をもたらし得る（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，３１１（１）：１－９、Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ，６（２）：３９１－８）。

【0043】

非還元分析中のジスルフィドスクランブル人工物を減少させるために、いくつかの戦略が開発されている。最も簡単なアプローチは、過剰な量のヨードアセトアミドを使用して遊離システインをアルキル化することであり、これは、いかなるスクランブルも起こり得る前に、本質的に全ての内因性遊離チオール及び人工チオールをキャップする。しかしながら、この方法は、望ましくないジスルフィド破壊を防止することができず、大過剰のヨードアセトアミドは、ＵＶクロマトグラムで見えることがある他の残基の非特異的標識を引き起こす（Ｂｏｊａ ａｎｄ Ｆａｌｅｓ，２００１，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，７３（１５）：３５７６－８２；Ｍｕｌｌｅｒ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，２０１７，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１６（７）：１１７３－１１８７）。

【0044】

ジスルフィドスクランブルを最小化するための別の戦略は、酸性条件下での反応性が高いため、遊離チオールをＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）でキャッピングしながら、酸性ｐＨで変性及び消化を行うことである（Ｒｙｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９５５、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，６０（４）：５４１－５６、Ｒｏｂｏｔｈａｍ ａｎｄ Ｋｅｌｌｙ，２０１９，ＭＡｂｓ，１１（４）：７５７－７６６）。酸性ｐＨにおけるトリプシンの低活性を回避し、消化効率を高めるために、低ｐＨで許容される活性を有するペプシンのような代替酵素が使用されているが、非特異的な不規則な切断は、ジスルフィド結合の割り当てをかなり複雑にする。

【0045】

Ｐｒｏｍｅｇａ（商標）によって開拓され、ＡｃｃｕＭＡＰ（商標）と呼ばれる消化キットとして産生された別の溶液は、酸性ｐＨでｒＬｙｓ－Ｃ及びトリプシンを利用して、スクランブルを最小化しながらアルギニン及びリジン残基を効率的に切断する。ペプチドマッピング試料調製で一般的に使用されるトリプシン及び他のプロテアーゼは、タンパク質を効率的に消化するためにアルカリ性ｐＨを好むため、ＡｃｃｕＭＡＰ（商標）消化キットであるキットは、特別な、低ｐＨ耐性の組換えＬｙｓ－Ｃ（ｒＬｙｓ－Ｃ）プロテアーゼでトリプシンを補充する。しかしながら、消化特異性及び効率性は依然として損なわれており、アッセイの再現性及びロバスト性を確保するために、トリプシンの高い消化特異性及び効率性を有するジスルフィドスクランブルを最小化する単一酵素アプローチが望ましい。

【0046】

本明細書の開示は、非還元トリプシン消化条件中にタンパク質中のジスルフィド結合がスクランブルするのを防止するための見事な解決策を提供する。標準的なペプチドマッピングプロトコルを、ＮＥＭの類似体（ＮＥＭ）を使用して、天然遊離チオールのアルキル化に修正した。従来の非還元ペプチドマッピングプロトコルが実施されたとき、相対的に高いレベルのスクランブルジスルフィド結合が試料中で同定されたため、５つの自社のＩｇＧ１及びＩｇＧ４ ｍＡｂがこの研究で選択された。これらのｍＡｂを使用して、非還元ペプチドマッピングプロトコルにマレイミド（疎水性が低いＮＥＭ類似体）を添加することが、ジスルフィドスクランブル人工物を排除することを実証した。本開示はまた、酸性条件でのマレイミドの使用と塩基性条件での消化を組み合わせた「半酸性」消化物条件についても考察する。これらの方法は、トリプシン消化の利点を維持しながら、タンパク質の確信した分析を可能にする。

【0047】

別段記載されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様又は同等の任意の方法及び材料は、実施又は試験において使用され得るが、特定の方法及び材料が、これより記載される。言及されている全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0048】

「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきであり、「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解されるように標準的な変動を可能にすると理解されるべきであり、範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。

【0049】

いくつかの例示的な実施形態では、本開示は、関心対象のタンパク質を特性評価するための方法を提供する。

【0050】

本明細書中で使用される場合、「タンパク質」又は「関心対象のタンパク質」という用語は、共有結合したアミド結合を有する任意のアミノ酸ポリマーを含む。タンパク質は、一般に「ポリペプチド」として当該技術分野で既知の１つ以上のアミノ酸ポリマー鎖を含む。「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結されたアミノ酸残基、関連する天然に存在する構造変異体、及びその合成非天然に存在する類似体、関連する天然に存在する構造変異体、及びその合成非天然に存在する類似体から構成されるポリマーを指す。「合成ペプチド又はポリペプチド」は、非天然に存在するペプチド又はポリペプチドを指す。合成ペプチド又はポリペプチドは、例えば、自動ポリペプチド合成装置を使用して合成することができる。様々な固相ペプチド合成法が既知である。タンパク質は、単一の機能性生体分子を形成するために１つ以上のポリペプチドを含有し得る。タンパク質は、生物治療用タンパク質、研究又は治療に使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質及び他のキメラ受容体Ｆｃ融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、及び二重特異性抗体のいずれかを含み得る。別の例示的な態様では、タンパク質は、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、サイトカイン、ケモカイン、ペプチドホルモンなどを含み得る。タンパク質は、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えば、ピキア種）、哺乳類系（例えば、ＣＨＯ細胞及びＣＨＯ－Ｋ１細胞のようなＣＨＯ誘導体）などの組換え細胞ベースの生産系を使用して産生できる。生物治療用タンパク質及びその産生について考察する総説については、Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｉｍｐａｃｔ，ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｏｆ ｎｏｎ－ｈｕｍａｎ ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ，”（ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＧＥＮＥＴ．ＥＮＧ．ＲＥＶ．１４７－１７５（２０１２））を参照されたい。いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、修飾、付加物、及び他の共有結合で連結された部分を含む。それらの修飾、付加物、及び部分には、例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、グリカン（例えば、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ガラクトース、ニューラミン酸、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、マンノース、及び他の単糖類）、ＰＥＧ、ポリヒスチジン、ＦＬＡＧタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ｍｙｃ－エピトープ、蛍光標識及び他の染料などが含まれる。タンパク質は組成物と溶解度に基づいて分類できるため、球状タンパク質、繊維状タンパク質などの単純タンパク質、核タンパク質、糖タンパク質、ムコタンパク質、色素タンパク質、リンタンパク質、金属タンパク質、リポタンパク質などの複合タンパク質、及び一次派生タンパク質、二次派生タンパク質などの派生タンパク質を含む。

【0051】

いくつかの例示的な実施形態では、タンパク質は、抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体断片、モノクローナル抗体、又はＦｃ融合タンパク質であり得る。

【0052】

本明細書で使用される「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互連結された４本のポリペプチド鎖、２本の重（Ｈ）鎖及び２本の軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子、並びにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲ又はＶ_Ｈと略す）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２、及びＣ_Ｈ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲ又はＶ_Ｌと略す）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（Ｃ_Ｌ１）を含む。Ｖ_Ｈ領域及びＶ_Ｌ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が点在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域へと更に細分することができる。各Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。異なる例示的な実施形態では、抗ｂｉｇ－ＥＴ－１抗体（又はその抗原結合部分）のＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であり得、又は天然若しくは人工的に修飾され得る。アミノ酸コンセンサス配列は、２つ以上のＣＤＲの並列分析に基づいて定義することができる。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、完全な抗体分子の抗原結合断片も含む。本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合断片」などの用語は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、任意の天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成、又は遺伝子操作されたポリペプチド若しくは糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合断片は、例えば、抗体可変ドメイン及び任意選択的に抗体定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現に関与するタンパク質分解消化技法又は組換え遺伝子操作技法などの任意の好適な標準的な技法を使用して、完全抗体分子から得られ得る。そのようなＤＮＡは既知であり、かつ／又は例えば、商業的供給元、ＤＮＡライブラリ（例えば、ファージ抗体ライブラリを含む）から容易に入手可能であるか、若しくは合成され得る。ＤＮＡは、化学的又は分子生物学技術を使用して配列決定及び操作され、例えば、１つ以上の可変ドメイン及び／又は定常ドメインを好適な配置に配置すること、又はコドンを導入すること、システイン残基を作成すること、アミノ酸を修飾、追加、若しくは削除することができる。

【0053】

本明細書で使用される場合、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域などの、無傷の抗体の一部を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｃ断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域、並びにトリアボディ、テトラボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域の組み合わせであり、ＳｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖と重鎖の可変領域がペプチドリンカーによって接続される組換え一本鎖ポリペプチド分子である。抗体断片は、様々な手段によって産生され得る。例えば、抗体断片は、無傷の抗体の断片化によって酵素的又は化学的に産生することができる、及び／又は部分的な抗体配列をコードする遺伝子から組換え的に産生することができる。代替的に、又は更に、抗体断片は、全体又は部分的に合成的に産生され得る。抗体断片は、任意選択的に、一本鎖抗体断片を含み得る。代替的に、又は更に、抗体断片は、例えば、ジスルフィド結合によって一緒に連結された複数の鎖を含み得る。抗体断片は、任意選択的に、多分子複合体を含み得る。

【0054】

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。モノクローナル抗体は、当該技術分野で利用可能な又は公知の任意の手段によって、任意の真核生物、原核生物、又はファージクローンを含む単一クローンに由来することができる。本開示で有用なモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、及びファージディスプレイ技術、又はそれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野で既知の広範な技術を使用して調製することができる。

【0055】

本明細書で使用される「Ｆｃ融合タンパク質」という用語は、天然の状態で融合していない２つ以上のタンパク質のうちの一部又は全部を含み、そのうちの１つは、免疫グロブリン分子のＦｃ部分である。抗体由来ポリペプチド（Ｆｃドメインを含む）の様々な部分に融合したある特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ ＵＳＡ ８８：１０５３５，１９９１、Ｂｙｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６７７，１９９０、及びＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌ．４，ｐａｇｅｓ １０．１９．１－１０．１９．１１，１９９２によって記載されている。「受容体Ｆｃ融合タンパク質」は、Ｆｃ部分に連結した受容体の１つ以上の細胞外ドメインのうちの１つ以上を含み、これは、いくつかの実施形態では、ヒンジ領域、続いて免疫グロブリンのＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合タンパク質は、単一リガンド又は１つを超えるリガンドに結合する２つ以上の明確に異なる受容体鎖を含有する。例えば、Ｆｃ融合タンパク質は、例えば、ＩＬ－１トラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＩＬ－１Ｒ１細胞外領域に融合したＩＬ－１ＲＡｃＰリガンド結合領域を含有するＲｉｌｏｎａｃｅｐｔ、米国特許第６，９２７，００４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）、又はＶＥＧＦトラップ（例えば、ｈＩｇＧ１のＦｃに融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３に融合したＶＥＧＦ受容体Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２を含有するＡｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ、例えば、米国特許第７，０８７，４１１号及び同第７，２７９，１５９号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）などのトラップである。

【0056】

本明細書で使用される場合、「翻訳後修飾」又は「ＰＴＭ」という一般用語は、ポリペプチドがリボソーム合成中（翻訳時修飾）又は合成後（翻訳後修飾）のいずれかで受ける共有結合修飾を指す。ＰＴＭは、一般に、特定の酵素又は酵素経路によって導入される。多くは、タンパク質骨格内の特定の特徴的なタンパク質配列（シグネチャー配列）の部位で生じる。数百のＰＴＭが記録されており、これらの修飾は必然的に、タンパク質の構造又は機能の一部の態様に影響を与える（Ｗａｌｓｈ，Ｇ．“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”（２０１４）ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ＩＳＢＮ：９７８０４７０６６９８５３）。様々な翻訳後修飾としては、切断、Ｎ末端伸長、タンパク質分解、Ｎ末端のアシル化、ビオチン化（ビオチンによるリジン残基のアシル化）、Ｃ末端のアミド化、グリコシル化、ヨード化、補欠分子基の共有結合、アセチル化（通常、タンパク質のＮ末端でのアセチル基の付加）、アルキル化（通常、リジン又はアルギニン残基でのアルキル基（例えば、メチル、エチル、プロピル）の付加）、メチル化、アデニル化、ＡＤＰ－リボシル化、ポリペプチド鎖内又はポリペプチド鎖間の共有架橋、スルホン化、プレニル化、ビタミンＣ依存性修飾（プロリン及びリジンヒドロキシル化及びカルボキシ末端アミド化）、ビタミンＫ依存性修飾（ビタミンＫは、γ－カルボキシグルタメート（グルー残基）の形成をもたらすグルタミン酸残基のカルボキシル化における補因子である）、グルタミル化（グルタミン酸残基の共有結合）、グリシル化（共有結合グリシン残基）、グリコシル化（糖タンパク質をもたらす、アスパラギン、ヒドロキシリシン、セリン、又はトレオニンのいずれかへのグリコシル基の付加）、イソプレニル化（ファルネゾール及びゲラニルゲラノールなどのイソプレノイド基の付加）、リポイル化（リポエート官能基の付加）、ホスホパンテイニル化（脂肪酸、ポリケチド、非リボソームペプチド及びロイシン生合成におけるように、４′－ホスホパンテイニル部分の補酵素Ａからの付加）、リン酸化（通常はセリン、チロシン、トレオニン、又はヒスチジンへのリン酸基の付加）、及び硫酸化（通常はチロシン残基への硫酸基の付加）を含むが、これらに限定されない。アミノ酸の化学的性質を変化させる翻訳後修飾には、シトルリン化（脱イミノ化によるアルギニンからシトルリンへの変換）、及び脱アミド化（グルタミンからグルタミン酸へ又はアスパラギンからアスパラギン酸への変換）が含まれるが、これらに限定されない。構造変化を伴う翻訳後修飾には、ジスルフィド架橋の形成（２つのシステインアミノ酸の共有結合）及びタンパク質分解切断（タンパク質のペプチド結合における切断）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の翻訳後修飾は、他のタンパク質又はペプチドの付加、例えば、ＩＳＧ化（ＩＳＧ１５タンパク質への共有結合（インターフェロン刺激遺伝子））、ＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯタンパク質への共有結合（低分子ユビキチン様修飾因子））、及びユビキチン化（タンパク質ユビキチンへの共有結合）を伴う。ＵｎｉＰｒｏｔによって精選されたＰＴＭのより詳細な統制語彙については、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＲｅｓｏｕｒｃｅＳＩＢ Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，ＥＵＲＯＰＥＡＮ ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＤＲＳ－ＤＲＯＳＯＭＹＣＩＮ ＰＲＥＣＵＲＳＯＲ－ＤＲＯＳＯＰＨＩＬＡ ＭＥＬＡＮＯＧＡＳＴＥＲ（ＦＲＵＩＴ ＦＬＹ）－ＤＲＳ ＧＥＮＥ＆ＰＲＯＴＥＩＮ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ｐｔｍｌｉｓｔ（最終訪問：２０１９年１月１５日）を参照されたい。

【0057】

本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、液体又は気体によって運ばれる化学的混合物が、静止した液相又は固相の周りを又はそれを超えて流れる際の化学物質の分布の差の結果として、成分に分離することができるプロセスを指す。クロマトグラフィーの非限定的な例としては、従来の逆相（ＲＰ）クロマトグラフィー、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、及び順相クロマトグラフィー（ＮＰ）が挙げられる。

【0058】

本明細書で使用される場合、「質量分析計」という用語は、具体的な分子種を同定し、それらの正確な質量を測定することができる装置を含む。当該用語は、ポリペプチド又はペプチドが検出及び／又は特性評価のために溶出され得る任意の分子検出器を含むことを意味する。質量分析計は、イオン源、質量分析器、検出器という３つの主要な部分を含むことができる。イオン源の役割は、気相イオンを生成することである。分析物の原子、分子、クラスタは気相に移送され、同時に（エレクトロスプレーイオン化のように）イオン化される。イオン源の選択は、用途に大きく依存する。

【0059】

本明細書で使用される場合、「質量分析器」という用語は、質量に応じて種、つまり原子、分子、又はクラスタを分離できる装置を含む。高速のタンパク質配列決定に使用され得る質量分析器の非限定的例は、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁気／電気セクタ、四重極質量フィルタ（Ｑ）、四重極イオントラップ（ＱＩＴ）、オービトラップ、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＩＣＲ）及び加速器質量分析（ＡＭＳ）の技術である。

【0060】

いくつかの例示的な実施形態では、自動反復ＭＳ／ＭＳは、ネイティブな条件下で実施され得る。本明細書で使用される場合、「ネイティブな条件」という用語は、分析物中の非共有結合相互作用を保存する条件下で質量分析を実施することを含み得る。ネイティブＭＳの詳細な総説については、総説：Ｅｌｉｓａｂｅｔｔａ Ｂｏｅｒｉ Ｅｒｂａ＆Ｃａｒｌｏ Ｐｅ－ｔｏｓａ，Ｔｈｅ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ，２４ ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ１１７６－１１９２（２０１５）を参照されたい。

【0061】

いくつかの例示的な実施形態では、質量分析計は、タンデム質量分析計であり得る。

【0062】

本明細書で使用される場合、「タンデム質量分析」という用語は、複数段階の質量選択と質量分離を使用して試料分子の構造情報を取得する技術を含む。前提条件は、試料分子を気相に移し、無傷でイオン化できること、及び第１の質量選択工程の後、ある程度の予測可能かつ制御可能な様式でバラバラになるように誘導できることである。多段階ＭＳ／ＭＳ又はＭＳ^ｎは、有意義な情報が得られ、又は断片イオン信号が検出可能である限り、先ず前駆体イオンを選択して分離し（ＭＳ^２）、断片化し、一次断片イオンを分離し（ＭＳ^３）、断片化し、二次断片を分離し（ＭＳ^４）、などによって実施することができる。タンデムＭＳは、様々な分析器の組み合わせで成功裏に実施される。ある特定の用途にどの分析器を組み合わせるかは、感度、選択性、速度だけでなく、サイズ、コスト、可用性など、様々な要因によって決定される。タンデムＭＳ法の２つの主要なカテゴリは、タンデムインスペース及びタンデムインタイムであるが、タンデムインタイム分析器が空間内で結合されるか、又はタンデムインスペース分析器と結合されたハイブリッドも存在する。タンデムインスペース質量分析計は、イオン源、前駆体イオン活性化装置、及び少なくとも２つの非トラップ型質量分析器を含む。特定のｍ／ｚ分離機能は、機器の１つのセクションでイオンが選択され、中間領域で解離され、生成イオンがｍ／ｚ分離とデータ収集のために別の分析器に送信されるように設計することができる。タンデムインタイムでは、イオン源で産生された質量分析計イオンを同じ物理装置内で捕捉、分離、断片化し、ｍ／ｚ分離することができる。

【0063】

質量分析計によって同定されたペプチドは、無傷のタンパク質及びそれらの翻訳後修飾の代理標本（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ）として使用することができる。実験及び理論的なＭＳ／ＭＳデータを相関させることによってそれらをタンパク質の特性評価に使用し得、後者は、タンパク質配列データベースにおける可能性のあるペプチドから生成される。特性評価は、限定されないが、タンパク質断片のアミノ酸配列決定、タンパク質配列決定、タンパク質デノボ配列決定、翻訳後修飾の位置特定、若しくは翻訳後修飾の同定、若しくは比較可能性分析、又はそれらの組み合わせを含むことができる。

【0064】

本明細書で使用される場合、「データベース」という用語は、例えば、ＦＡＳＴＡ形式のファイルの形態で、試料中に存在し得る可能性のあるタンパク質配列の編集されたコレクションを指す。関連するタンパク質配列は、研究される種のｃＤＮＡ配列に由来し得る。関連するタンパク質配列を検索するために使用され得る公開データベースには、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ又はＳｗｉｓｓ－ｐｒｏｔによってホストされているデータベースが含まれた。データベースは、本明細書で「バイオインフォマティクスツール」と称されるデータベースを使用して検索され得る。バイオインフォマティクスツールは、データベース（複数可）内の全ての可能な配列に対して解釈されていないＭＳ／ＭＳスペクトルを検索する能力を提供し、解釈された（注釈付けられた）ＭＳ／ＭＳスペクトルを出力として提供する。そのようなツールの非限定的な例は、Ｍａｓｃｏｔ（ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｍ）、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｉｌｌ（ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ）、ＰＬＧＳ（ｗｗｗ．ｗａｔｅｒｓ．ｃｏｍ）、ＰＥＡＫＳ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．ｃｏｍ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ（ｄｏｗｎｌｏａｄ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／／ｐｒｏｔｅｉｎｐｉｌｏｔ）、Ｐｈｅｎｙｘ（ｗｗｗ．ｐｈｅｎｙｘ－ｍｓ．ｃｏｍ）、Ｓｏｒｃｅｒｅｒ（ｗｗｗ．ｓａｇｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）、ＯＭＳＳＡ（ｗｗｗ．ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｓｓａ／）、Ｘ！Ｔａｎｄｅｍ（ｗｗｗ．ｔｈｅｇｐｍ．ｏｒｇ／ＴＡＮＤＥＭ／）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ（ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ／ｍｓｈｏｍｅ．ｈｔｍ）、Ｂｙｏｎｉｃ（ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎｍｅｔｒｉｃｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｂｙｏｎｉｃ）、又はＳｅｑｕｅｓｔ（ｆｉｅｌｄｓ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｓｔ）である。

【0065】

本明細書で使用される場合、「タンパク質アルキル化剤」又は「アルキル化剤」という用語は、タンパク質中のある特定の遊離アミノ酸残基をアルキル化するために使用される薬剤を指す。市販のタンパク質アルキル化剤の非限定的な例は、ヨードアセトアミド（ＩＯＡ／ＩＡＡ）、クロロアセトアミド（ＣＡＡ）、アクリルアミド（ＡＡ）、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）、メタンチオスルホン酸メチル（ＭＭＴＳ）、及び４－ビニルピリジン、又はそれらの組み合わせである。

【0066】

いくつかの実施形態では、試料中の関心対象のタンパク質を含む試料は、還元剤を試料に添加することによって処理することができる。

【0067】

本明細書で使用される場合、「タンパク質変性」又は「変性」は、分子の三次元形状をその天然の状態から変化させるプロセスを指し得る。タンパク質変性は、タンパク質変性剤を使用して実行することができる。タンパク質変性剤の非限定的な例としては、熱、高ｐＨ又は低ｐＨ、ＤＴＴなどの還元剤、又はカオトロピック剤への曝露が挙げられる。いくつかのカオトロピック剤をタンパク質変性剤として使用することができる。カオトロピック溶質は、水素結合、ファンデルワールス力、及び疎水性効果などの非共有結合力によって媒介される分子内相互作用を妨げることによって、系のエントロピーを増加させる。カオトロピック剤の非限定的な例には、ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム、酢酸リチウム、塩化マグネシウム、フェノール、プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、Ｎ－ラウロイルサルコシン、尿素、及びそれらの塩が挙げられる。

【0068】

本明細書で使用される場合、「消化」という用語は、タンパク質の１つ以上のペプチド結合の加水分解を指す。適切な加水分解剤、例えば、酵素消化又は非酵素消化を使用して、試料中のタンパク質の消化を実行するためのいくつかのアプローチがある。タンパク質の構成ペプチドへの消化は、「ペプチド消化物」を産生することができ、これは、ペプチドマッピング分析を使用して更に分析することができる。

【0069】

本明細書で使用される場合、「消化酵素」という用語は、タンパク質の消化を実施することができる多数の異なる薬剤のうちのいずれかを指す。酵素消化を実行することができる加水分解剤の非限定的な例としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｓａｉｔｏｉからのプロテアーゼ、エラスターゼ、サブチリシン、プロテアーゼＸＩＩＩ、ペプシン、トリプシン、Ｔｒｙｐ－Ｎ、キモトリプシン、アスペルギロペプシンＩ、ＬｙｓＮプロテアーゼ（Ｌｙｓ－Ｎ）、ＬｙｓＣエンドプロテイナーゼ（Ｌｙｓ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＡｓｐ－Ｎ（Ａｓｐ－Ｎ）、エンドプロテイナーゼＡｒｇ－Ｃ（Ａｒｇ－Ｃ）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃ（Ｇｌｕ－Ｃ）、又は外膜タンパク質Ｔ（ＯｍｐＴ）、化膿レンサ球菌の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ）、サーモリシン、パパイン、プロナーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、若しくは生物活性断片、若しくはそれらのホモログ、又はそれらの組み合わせが挙げられる。タンパク質消化のための利用可能な技術を考察する最近の総説については、Ｓｗｉｔａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ”（Ｌｉｎｄａ Ｓｗｉｔｚａｒ，Ｍａｒｔｉｎ Ｇｉｅｒａ＆Ｗｉｌｆｒｉｅｄ Ｍ．Ａ．Ｎｉｅｓｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ：Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ａｖａｉｌａｂｌｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｎｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ，１２ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＰＲＯＴＥＯＭＥ ＲＥＳＥＡＲＣＨ １０６７－１０７７（２０１３））を参照されたい。

【0070】

本明細書で使用される場合、「試料」は、細胞培養液（ＣＣＦ）、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）、下流処理における任意の工程、原薬（ＤＳ）、又は最終的に製剤化された製品を含む医薬品（ＤＰ）などのバイオプロセスの任意の工程から得ることができる。いくつかの特定の例示的な実施形態では、試料は、清澄化、クロマトグラフィー産生、又は濾過の下流プロセスの任意の工程から選択され得る。

【0071】

本発明の方法は、ジスルフィド結合を特徴とする任意のタンパク質に適用され得る。いくつかの例示的な実施形態では、特定の用途は、抗体である関心対象のタンパク質の分析を伴う。いくつかの例示的な実施形態では、関心対象のタンパク質は、モノクローナル抗体である。いくつかの例示的な実施形態では、関心対象のタンパク質は、二重特異性抗体である。いくつかの例示的な実施形態では、関心対象のタンパク質は、組換えタンパク質である。

【0072】

本発明の方法の試料調製工程には、様々な変性剤、例えば、塩酸グアニジン又は尿素が使用され得る。いくつかの例示的な実施形態では、変性剤は、尿素である。尿素は、約６Ｍ、約６．１Ｍ、約６．２Ｍ、約６．３Ｍ、約６．４Ｍ、約６．５Ｍ、約６．６Ｍ、約６．７Ｍ、約６．８Ｍ、約６．９Ｍ、約７Ｍ、約７．１Ｍ、約７．２Ｍ、約７．３Ｍ、約７．４Ｍ、約７．５Ｍ、約７．６Ｍ、約７．７Ｍ、約７．８Ｍ、約７．９Ｍ、約８Ｍ、約８．１Ｍ、約８．２Ｍ、約８．３Ｍ、約８．４Ｍ、約８．５Ｍ、約８．６Ｍ、約８．７Ｍ、約８．８Ｍ、約８．９Ｍ、約９Ｍ、約９．１Ｍ、約９．２Ｍ、約９．３Ｍ、約９．４Ｍ、約９．５Ｍ、約９．６Ｍ、約９．７Ｍ、約９．８Ｍ、約９．９Ｍ、又は約１０Ｍの濃度で使用され得る。いくつかの例示的な実施形態では、尿素の最適な濃度は、約８Ｍである。

【0073】

変性は、様々な条件で行われ得る。酸性ｐＨ条件は、ジスルフィドスクランブルを低減するために使用されている。

【0074】

いくつかの例示的な実施形態では、使用されるアルキル化剤は、マレイミドなどのＮＥＭ類似体である。マレイミドは、相対的に幅広い濃度で使用することができる。マレイミドの濃度は、約１ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．４ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．６ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．８ｍＭ、約１．９ｍＭ、約２ｍＭ、約２．１ｍＭ、約２．２ｍＭ、約２．３ｍＭ、約２．４ｍＭ、約２．５ｍＭ、約２．６ｍＭ、約２．７ｍＭ、約２．８ｍＭ、約２．９ｍＭ、約３ｍＭ、約３．１ｍＭ、約３．２ｍＭ、約３．３ｍＭ、約３．４ｍＭ、約３．５ｍＭ、約３．６ｍＭ、約３．７ｍＭ、約３．８ｍＭ、約３．９ｍＭ、約４ｍＭ、約４．５ｍＭ、約５ｍＭ、約５．５ｍＭ、約６ｍＭ、約６．５ｍＭ、約７ｍＭ、約７．５ｍＭ、約８ｍＭ、約８．５ｍＭ、約９ｍＭ、約９．５ｍＭ、又は約１０ｍＭであり得る。いくつかの例示的な実施形態では、マレイミドの最適な濃度は、約４．０ｍＭである。

【0075】

非還元ペプチドマッピングに使用される消化酵素には、例えば、トリプシン、ペプシン、又はＬｙｓＣのうちの１つ以上が含まれ得る。いくつかの例示的な実施形態では、消化酵素は、トリプシンである。トリプシンは、約１：５、約１：５．５、約１：６、約１：６．５、約１：７、約１：７．５、約１：８、約１：８．５、約１：９、約１：９．５、約１：１０、約１：１０．５、約１：１１、約１：１１．５、約１：１２、約１：１２．５、約１：１３、約１：１３．５、約１：１４、約１：１４．５、約１：１５、約１：１６、約１：１７、約１：１８、約１：１９、又は約１：２０の酵素：基質比で使用され得る。いくつかの例示的な実施形態では、トリプシンの最適な酵素：基質比は、約１：１０である。

【0076】

消化は、約５、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、又は約８．０のｐＨで行われ得る。いくつかの例示的な実施形態では、消化のための最適なｐＨは、約７．５である。

【0077】

上記の方法は、関心対象のタンパク質の少なくとも１つのジスルフィド結合の特性評価を列挙しているが、この方法が様々な用途に拡張され得ることを理解されたい。少なくとも１つの関心対象のタンパク質を「特性評価すること」は、例えば、当該少なくとも１つの関心対象のタンパク質を同定すること、定量化すること、及び／又は比較することを含み得ることが更に理解される。

【0078】

本発明は、限定されないが、前述のタンパク質（複数可）、関心対象のタンパク質（複数可）、抗体（複数可）、タンパク質アルキル化剤（複数可）、タンパク質変性剤（複数可）、タンパク質還元剤（複数可）、消化酵素（複数可）、試料（複数可）、クロマトグラフィー方法（複数可）、質量分析計（複数可）、データベース（複数可）、バイオインフォマティクスツール（複数可）、ｐＨ、温度（複数可）、又は濃度（複数可）のうちのいずれか、並びに任意のタンパク質（複数可）、関心対象のタンパク質（複数可）、抗体（複数可）、タンパク質アルキル化剤（複数可）、タンパク質変性剤（複数可）、タンパク質還元剤（複数可）、消化酵素（複数可）、試料（複数可）、クロマトグラフィー方法（複数可）、質量分析計（複数可）、データベース（複数可）、バイオインフォマティクスツール（複数可）、ｐＨ、温度（複数可）、又は濃度（複数可）が、任意の好適な手段によって選択することができることを理解されたい。

【0079】

本明細書で提供される方法工程の数字及び／又は文字での連続した標識は、方法又はその任意の実施形態を特定の示された順序に限定することを意味しない。

【0080】

特許、特許出願、公開特許出願、受入番号、技術論文、及び学術論文を含む様々な刊行物が、本明細書全体を通して引用される。これらの引用される参考文献の各々は、参照によって、その全体が全ての目的のために、本明細書に組み込まれる。

【0081】

本開示は、本開示をより詳細に説明するために提供される以下の実施例を参照することによって、より完全に理解されるであろう。それらは、実施例を例示することを意図しており、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0082】

材料。
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）及びアセトニトリルは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）から購入した。尿素、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ－ＨＣｌ）及びシスタミン二塩酸塩は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＡｃｃｕＭａｐ低ｐＨタンパク質消化キット及び質量分析グレードのトリプシンプラチナは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から購入した。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から得た。精製されたモノクローナル抗体は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）によって内部的に産生された。

【0083】

通常の非還元ペプチドマッピング法。
通常の非還元ペプチドマッピング試料調製のために、各ｍＡｂ試料の２００μｇのアリコートを、１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ溶液中に８Ｍの尿素を添加することによって約３．３μｇ／μＬに希釈した。試料希釈後、ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ）ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計を使用して、タンパク質濃度を測定した。各試料１００μｇのアリコートを、２．５ｍＭのヨードアセトアミドでアルキル化し、暗所で３０分間、５０℃でインキュベーションした。次いで、各試料を１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で８回希釈し、トリプシン＋ＬｙｓＣで、３７℃で３時間消化した。ＴＦＡを０．３％の最終濃度に添加することによって消化をクエンチした。

【0084】

低ｐＨ非還元ペプチドマッピング法。
ＰｒｏｍｅｇａからのＡｃｃｕＭＡＰ低ｐＨタンパク質消化キットを、低ｐＨペプチドマッピング試料調製に使用した。プロトコルは、わずかな修正を加えて製造元の技術マニュアルに従った。

【0085】

（１）遊離システインのブロック：５μｌのタンパク質溶液（５０μｇのタンパク質）を２０μｌのＡｃｃｕＭＡＰ（商標）変性溶液に添加した。これに、６μｌのＡｃｃｕＭＡＰ（商標）１０Ｘ低ｐＨ反応緩衝液及び２μｌの２００ｍＭ ＮＥＭを混合し、３７℃で３０分間インキュベーションした。（２）消化前：２５μｌのＡｃｃｕＭＡＰ（商標）低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃを添加し、混合し、３７℃で４時間インキュベーションした。これらの工程中のｐＨは、５．７当たりに維持した。（３）消化：３０μｌのＡｃｃｕＭＡＰ（商標）１０Ｘ低ｐＨ反応緩衝液を添加した。これに、ＡｃｃｕＭＡＰ（商標）低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃ又はＡｃｃｕＭＡＰ（商標）修飾トリプシン及びＡｃｃｕＭＡＰ（商標）低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃを以下のように添加した：ＡｃｃｕＭＡＰ（商標）低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃによる消化；２０７μｌのＮＡＮＯｐｕｒｅ（登録商標）水及び２５μｌのＡｃｃｕＭＡＰ（商標）低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃを添加し、混合し、３７℃で一晩インキュベートした。ＡｃｃｕＭＡＰ（商標）修飾トリプシン及びＡｃｃｕＭＡＰ（商標）低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃによる消化：１８７μｌのＮＡＮＯｐｕｒｅ（登録商標）水及び２５μｌのＡｃｃｕＭＡＰ（商標）低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃを添加し、混合し、３７℃で一晩インキュベートした。午前中、２０μｌのＡｃｃｕＭＡＰ（商標）修飾トリプシンを添加し、混合し、３７℃で３時間インキュベートした（トリプシンとのより長いインキュベートは、トリプシンがベースラインノイズに寄与する半トリプシン性ペプチドを生成する可能性があるため、推奨されない）。（４）反応の終了：ＴＦＡを２％の最終濃度に添加した。少量の試料をｐＨ紙でチェックして、反応が適切に酸性化されていることを確認した。これらの工程中のｐＨは、５．３当たりに維持した。

【0086】

ＬＣ／ＵＶ－ＭＳ分析：
Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計に結合されたＷａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｉ－Ｃｌａｓｓシステムを使用して、非還元消化試料を分析した。トリプシンペプチド混合物を、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ（登録商標）１３０ Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ）によって、０．２５ｍＬ／分の流量で分離した。移動相Ａは水中０．０５％ＴＦＡ、移動相Ｂはアセトニトリル中０．０４５％ＴＦＡであった。勾配を最初の５分間０．１％Ｂで維持し、次いで５５分間で２６％Ｂに増加させ、続いて３５分間で３４．５％Ｂに更に増加させた。試料注入前に、カラム温度を４０℃に維持した状態で、カラムを９９．９％移動相Ａで平衡化した。ＭＳデータをｍ／ｚ３００～２０００のＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ質量分析計で７０ｋ（ｍ／ｚ４００）の分解能で取得し、続いて１７．５ｋの分解能で５回のデータ依存性ＭＳ／ＭＳスキャンを行った。ＭＳフルスキャンを、１×１０^６自動利得制御（ＡＧＣ）、及び最大注入時間５０ｍｓに設定した。ＭＳ^２断片化は、１×１０^５ＡＧＣで正規化衝突エネルギーが２８％であり、最大注入時間が１００ｍｓであるＨＣＤを使用して実施した。動的排除期間を１５秒に設定し、反復回数は一回であった。

【0087】

データ分析。
ｍＡｂタンパク質配列に対して生ファイルを検索することによって、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｒｉｃｓ Ｂｙｏｎｉｃ（商標）（バージョン３．１１．３）を使用して、全てのペプチド同一性割り当て及び翻訳後修飾同定を実施した。１％ＦＤＲに対してフィルタリングすることにより、ユニークペプチドの予備リストを生成した。次いで、フルスキャン（ＭＳ^１）ベースの最終ＩＤ検証のために、前駆体のリスト及びスペクトルライブラリとしての元の検索結果をＳｋｙｌｉｎｅ Ｄａｉｌｙソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＷＡ）にインポートした。ピーク面積は、Ｓｋｙｌｉｎｅソフトウェアを通じて全ての電荷状態を合計することによって抽出された。

【0088】

実施例１．低ｐＨ消化プロトコルを使用する非還元ペプチドマッピング
ｍＡｂ１（ＩｇＧ１抗体）及びｍＡｂ２（ＩｇＧ４抗体）のタンパク質特性評価は、ＰｒｏｍｅｇａのＡｃｃｕＭＡＰ低ｐＨ消化産生物によって公開されている低ｐＨ消化プロトコルを使用して実行された。

【0089】

ｍＡｂ１のペプチドマッピング分析のＵＶクロマトグラムを図１に示す。ＮＥＭの２つのＵＶピークは、１５分及び２０分当たりに現れる。これらのＵＶピークは、ｍＡｂ１のペプチドピーク報告ウィンドウに干渉するように見える。同様に、ｍＡｂ２については、ＮＥＭピークは、そのペプチドピーク報告ウィンドウに干渉するように見える（図２）。

【0090】

酸性ｐＨが、試料調製中のジスルフィドスクランブルを効果的に防止することができることは周知である（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，４９５：２１－８、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，１３（１０）：２７７６－８６、Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８６４（９）：１１８８－１１９４）。図１に示すように、最も豊富なジスルフィドスクランブルペプチドは、低ｐＨ条件下では観察されなかった。しかしながら、ｍＡｂ１報告ウィンドウは、５分当たりでＵＶ報告可能なピークを有する、ＨＣ－ＬＣジスルフィドのピークを含む（図３を参照されたい、配列番号１）。これは、タンパク質特性評価が、５分当たりからのより広いＵＶ報告ウィンドウを含むことを必要とする。

【0091】

低ｐＨ消化法による複雑な問題は、酸性ｐＨ法が、試料調製中のジスルフィドスクランブルを効果的に防止することができるが、図３に示されるように、１５分及び２０分の保持時間で強力な干渉ピークがＵＶクロマトグラムを支配することである。ＮＥＭは、各アルキル化システイン（４）について立体異性体を生成し、結果として、ＮＥＭ－アルキル化ペプチドは、ＬＣ／ＭＳ及びＵＶ ＨＰＬＣにおいて二重ピークを産生する。このピークは、Ｎ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）アルキル化試薬ピークによるものである。ＵＶクロマトグラムの品質へのその負の影響に加えて、この強力な試薬ピークは、ｍＡｂ消化からの他のトリプシンペプチドピークをマスクし得る。また、ＮＥＭはＲＰ－ＨＰＬＣ勾配の初期にそのような優勢なピークを形成するため、親水性ペプチドの分析に干渉する可能性がある。

【0092】

更に、酸性ｐＨは、最も一般的に使用される酵素にとって理想的ではないため、低ｐＨ法の潜在的に低下した消化効率は、２つの消化酵素が使用された場合であっても、方法の再現性及び精度を損なう可能性がある。酸性ｐＨ条件下での誤って切断された部位の数の増加は、クロマトグラムに無関係な特徴を付加し、ジスルフィドペプチドの割り当てを混乱させる。これらの有害因子の全ては、ＵＶベースのペプチドマッピング法適格性評価のための低ｐＨ法に悪影響を及ぼす。したがって、塩基性ｐＨ条件で試料調製中にジスルフィドスクランブルを制限することができる方法の必要性が存在する。

【0093】

実施例２．非還元ペプチドマッピング法のためのＮＥＭ様アルキル化剤
ＮＥＭは、アルキル化剤として業界で広く使用されている。それは、ひずんだ環構造の高反応性に起因して、高速かつ完全なアルキル化を実施する。更に、任意のプロトコル誘発ジスルフィドスクランブルは、酸性ｐＨでほぼ完全にブロックされる。しかしながら、上記実施例１のｍＡｂ１及びｍＡｂ２に見られるように、保持時間が２０分かつ強いＵＶ信号を有するＮＥＭ優性ピークは、クロマトグラムと干渉するため、懸念を提起する。

【0094】

低ｐＨでの試料調製中にアルキル化剤としての高い反応性及び安定性を維持しながら、ＮＥＭの疎水性を低減することによって、２０分間の保持時間を理論的に短縮することができる。

【0095】

ｍＡｂ１のタンパク質特性評価は、ＰｒｏｍｅｇａのＡｃｃｕＭＡＰ低ｐＨ消化産生物によって公開されている低ｐＨ消化プロトコルを使用して実行された。しかし、このプロトコルは、ＮＥＭを（ａ）マレイミド、（ｂ）マレアミド、及び（ｃ）Ｎ－ヒドロキシマレイミド（その構造を図４に示す）に置き換えるように修正された。これらの類似体は全て、ＮＥＭよりも親水性が高い。

【0096】

（ａ）マレイミド、（ｂ）マレアミド、及び（ｃ）Ｎ－ヒドロキシマレイミドを使用するｍＡｂ１のペプチドマッピング分析のＵＶクロマトグラムを、ＮＥＭを使用するｍＡｂ１のペプチドマッピング分析のＵＶクロマトグラム上に重ねたものとして、図５に示す。（ａ）マレイミド、（ｂ）マレアミド、及び（ｃ）Ｎ－ヒドロキシマレイミドのＵＶピークのうち、マレイミド及びマレアミドのＵＶピークは、５分の保持時間の前に現れる。したがって、これらのピークは、ｍＡｂ１及び概してほとんどのタンパク質のペプチドピーク報告ウィンドウにいかなる干渉ももたらさない場合がある。

【0097】

実施例３．ＮＥＭ代替物によるジスルフィドスクランブルの防止
ｍＡｂ３（ＩｇＧ４抗体）のタンパク質特性評価は、低ｐＨ非還元消化法によって公開されている低ｐＨ消化プロトコルを使用して実行された。加えて、プロトコルは、ＮＥＭを（ａ）マレイミド、（ｂ）マレアミド、及び（ｃ）Ｎ－ヒドロキシマレイミドに置き換えることによって繰り返された。

【0098】

ＰｒｏｍｅｇａからのＡｃｃｕＭＡＰ低ｐＨタンパク質消化キットを、低ｐＨ非還元ペプチドマッピング試料調製に使用した。プロトコルは、わずかな修正を加えて製造元の技術マニュアルに従った。簡潔に述べると、試料（１００μｇ）を、８Ｍの塩酸グアニジン、ｐＨ約５．６溶液を使用して約５μｇ／μＬに希釈した。希釈した試料を８ｍＭのＮ－エチルマレイミド（ＮＥＭ）中でアルキル化し、５０℃で３０分間、５．７のｐＨでインキュベートした。アルキル化された試料を、キットからの低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃを使用して、３７℃で１時間予め消化した。次いで、試料を低ｐＨ反応緩衝液で５倍に希釈し、製造元によって指定された酵素：基質の比率に従って、修飾トリプシン及び低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃを添加することによって更に３時間消化した。消化を、ＬＣ－ＭＳ分析の前に、ＴＦＡを０．３％の最終濃度に添加することによってクエンチした。

【0099】

（ａ）マレイミド、（ｂ）マレアミド、及び（ｃ）Ｎ－ヒドロキシマレイミドの添加がジスルフィドスクランブルを防止する程度を試験するために、２つのジスルフィドスクランブルペプチドをｍＡｂ３：

について評価した。

【0100】

図６Ａ及び図６Ｂに示されるように、最良の結果は、ＮＥＭ、マレイミド、及びＮ－ヒドロキシマレイミドを使用した場合に得られ、アルキル化遊離チオールとしての２つのペプチドのピーク面積は、非アルキル化遊離チオールと比較して有意であった（図６Ｂ）。最後に、スクランブルペプチドは、ＮＥＭ、マレイミド、及びＮ－ヒドロキシマレイミドによって、無視できるレベルに有意に低減された。したがって、ＮＥＭの代わりにマレイミド及びＮ－ヒドロキシマレイミドを使用することは、ジスルフィド（Ｃ１３７Ｈ～Ｃ１５０Ｈ）のジスルフィドスクランブルを同程度に防止することができる（図６Ｃを参照されたい）。しかしながら、マレアミドはゆっくりと反応し、マレイミド及びＮ－ヒドロキシマレイミドと同様のアルキル化プロファイルを産生しなかった（図６Ａ～図６Ｃ）。

【0101】

マレイミドは、スクランブルジスルフィドペプチドの完全ブロックを伴うＮＥＭと同じくらい反応性であることが判明したため、ＮＥＭの貴重な代替物を提供した。ＮＥＭ及びマレイミドによる消化プロファイルは同等である。これらの間の唯一の有意差は、試薬のピークによるものである（図７）。また、４分（１５０ｍｍ Ｃ１８カラム）の保持時間を有し、したがって、ＵＶペプチド報告ウィンドウ（５～８０分）がない。最後に、それはまた、日常的なタンパク質の特性評価に使用される安価な代替物を提供する。

【0102】

実施例４．非還元ペプチドマッピング消化法に対する異なる濃度のマレイミドの影響。
ｍＡｂ３（ＩｇＧ４抗体）のタンパク質特性評価）を、アルキル化剤を使用せず（対照）、１ｍＭマレイミド、２ｍＭマレイミド、及び４ｍＭマレイミドを使用して、実施例３に記載される低ｐＨ消化プロトコルにより更に実行した。

【0103】

マレイミドの濃度がジスルフィドスクランブルを防止することができる程度を試験するために、２つのジスルフィドスクランブルペプチドを、ｍＡｂ３：

について評価した。図８Ａ及び８Ｂに示されるように、最良の結果は、４ｍＭ及び８ｍＭのマレイミドを使用した場合に得られ、アルキル化遊離チオール（図７Ａ）としての２つのペプチドのピーク面積は、非アルキル化遊離チオール（図８Ｂ）と比較して有意であった。≧１ｍＭのマレイミドの使用は、ほぼ９９％のアルキル化効率を提供した。最後に、スクランブルペプチドを、２ｍＭ、４ｍＭ、及び８ｍＭのマレイミドを使用することによって、無視できるレベルに還元した。したがって、４ｍＭ以上のマレイミドの使用は、ジスルフィド（Ｃ１３７Ｈ～Ｃ１５０Ｈ）のジスルフィドスクランブルを完全にブロックすることができる（図７Ｃを参照されたい）。しかしながら、マレアミドはゆっくりと反応し、マレイミド及びＮ－ヒドロキシマレイミドと同様のアルキル化プロファイルを産生しなかった（図８Ａ～図８Ｃ）。

【0104】

実施例５．マレイミドを使用する半酸性消化法
ＰｒｏｍｅｇａからのＡｃｃｕＭＡＰ低ｐＨタンパク質消化キットは、「一般的な還元剤及びアルキル化剤はアルカリ性ｐＨを好む。アルカリ性ｐＨは脱アミド化及びジスルフィド結合スクランブルを誘発するため、［修正された手順］は低ｐＨに適合させられる。」という推定に基づいている。しかしながら、この方法は、図９に見られるように（アスタリスクでマークされた）ユニークペプチド切断を同定しない消化物プロファイルをもたらす可能性がある。

【0105】

ｍＡｂ４（ＩｇＧ１抗体）のタンパク質特性評価は、実施例２で実施されるように、８ｍＭのマレイミドを使用する低ｐＨ非還元タンパク質マッピング消化方法によって公開されている低ｐＨ消化プロトコルを使用して実行された。これは、任意のスクランブルが起こり得る前に、全ての内因性遊離チオール及び人工チオールを本質的にキャップするヨードアセトアミドを使用する従来の消化物（通常の非還元ペプチドマッピング法による）と比較された。この方法は、７．５のｐＨで実施される。

【0106】

マレイミドを使用する非還元ペプチドマッピング方法を、５．３のｐＨで低ｐＨ修飾トリプシン及び／又は低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃを使用する代わりに、従来の方法で使用される消化プロトコルを適合させるように修正し、１：２０Ｅ／Ｓのトリプシン、１：５０Ｅ／ＳのｒＬｙｓＣを使用して、７．５のｐＨで消化を実行した。そのような半酸性プロトコル（酸性条件でのアルキル化及び非酸性条件での消化）の結果として得られたペプチドマッピングは、従来の消化物によるマッピングと同等であった（通常の非還元ペプチドマッピング法による）（図１０を参照）。半酸性法は、従来の非還元ペプチドマッピング法では観察されなかった３つの異なるペプチドを同定することができる（５２分、５５．５分、及び６９．８分におけるペプチドを参照されたい）。

【0107】

実施例６．マレイミドを使用する半酸性消化法の再現性
ＩｇＧ４抗体、ｍＡｂ５の半酸性消化物プロファイル及び従来の消化物プロファイルを評価した。ｍＡｂ５のタンパク質特性評価は、実施例２で実施されるように、８ｍＭのマレイミドを使用する低ｐＨ非還元タンパク質マッピング消化法によって公開されている低ｐＨ消化プロトコルを使用して実行された。これを、トリプシン＋ＬｙｓＣ（７．５のｐＨで）の代わりにトリプシンのみを使用する従来の消化物（通常の非還元ペプチドマッピング方法による）と比較した。ｍＡｂ４について見られるように、低ｐＨ非還元ペプチドマッピングを使用して得られた消化物プロファイルと従来のペプチドマッピングとは一致しない（図１１を参照して、非還元ペプチドマッピングによって同定されないユニークペプチドは、アスタリスクでマークされる）。

【0108】

マレイミドを使用する非還元ペプチドマッピング方法を、５．３のｐＨで低ｐＨ修飾トリプシン及び／又は低ｐＨ耐性ｒＬｙｓ－Ｃを使用する代わりに、従来の方法によって使用される消化プロトコルを適合させるように修正し、１：２０のＥ／Ｓトリプシンを使用して、７．５のｐＨで消化を実行した。そのような半酸性プロトコルの結果として得られたペプチドマッピングは、従来の消化物によるマッピングと同等であった（通常の非還元ペプチドマッピング法による）（図１２を参照されたい）。半酸性法は、低ｐＨ非還元ペプチドマッピング法では観察されなかった別個のペプチドを同定することができる（５２．６分でのペプチドを参照されたい。

【0109】

最後に、ジスルフィドスクランブルに対する消化条件の影響を比較するために、条件の各々から得られた、ｍＡｂ４からのジスルフィドスクランブルペプチドの正規化されたピーク面積と、ｍＡｂ５からのジスルフィドスクランブルペプチドの正規化されたピーク面積とを比較することによって、異なる消化条件からの結果を比較した。図１３は、酸性及び塩基性消化を伴うマレイミドの使用が、無視できるレベルのジスルフィドスクランブルをもたらすことを示している。

【0110】

本明細書で開発される方法は、Ｐｒｏｍｅｇａの「低ｐＨ消化キット」などの市販のキットよりもいくつかの利点を提供し、これは、独自の緩衝液／試薬を使用して、完全に酸性条件下で消化を実施し、ジスルフィドスクランブル及びいくつかの他のＰＴＭを最小化するように開発され、従来の塩基性ｐＨ消化と比較して有意差（非特異的切断）を有する消化ペプチドプロファイルを作成する。そのような市販キットは、本明細書に記載の方法開発後、非還元ペプチドマッピングアッセイのためにもはや旧式となっている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図8C】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【手続補正書】

【提出日】2024-07-02

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

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【国際調査報告】