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特表2024-540197Ｐ５３におけるＲ１７５Ｈ変異を認識するＴ細胞受容体およびその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】Ｐ５３におけるＲ１７５Ｈ変異を認識するＴ細胞受容体およびその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 14/725 20060101AFI20241024BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241024BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241024BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20241024BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20241024BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241024BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20241024BHJP
【ＦＩ】
C07K14/725
C12N15/12 ZNA
C12N5/10
C12N15/63 Z
A61K39/00 H
A61K35/17
A61P35/00
A61P37/04
C12N5/0783
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525767
(86)(22)【出願日】2022-10-28
(85)【翻訳文提出日】2024-06-13
(86)【国際出願番号】 US2022078929
(87)【国際公開番号】W WO2023077100
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/273,372
(32)【優先日】2021-10-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524157822
【氏名又は名称】ホウ，ヤフェイ
(71)【出願人】
【識別番号】524157833
【氏名又は名称】ホウ，デイビッド
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ホウ，ヤフェイ
(72)【発明者】
【氏名】ホウ，デイビッド
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA02
4C085AA02
4C085BB11
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG01
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB64
4C087BB65
4C087CA04
4C087NA14
4C087ZB02
4C087ZB09
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、変異ヒトｐ５３Ｒ１７５Ｈに対する抗原特異性を有する単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。本明細書における本発明のＴＣＲは、ＨＬＡ－Ａ２拘束性変異体ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（ＨＭＴＥＶＶＲＨＣ）を認識できるが、野生型ｐ５３Ｒ１７５ペプチド（ＨＭＴＥＶＶＲＲＣ）を認識できない。本明細書における本発明のＴＣＲはまた、ＨＬＡ－Ａ２において変異されたヒトｐ５３Ｒ１７５Ｈを有する腫瘍細胞により活性化できる。本発明はさらに、本発明のＴＣＲに関連する関連のポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団および医薬組成物を提供する。哺乳動物における癌を処置するまたは予防する方法が、本発明によってさらに提供される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１（α鎖）および第２（β鎖）の鎖を含む単離されたまたは精製されたＴＣＲであって、前記第１および第２の鎖の各１つが、第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、α鎖ＣＤＲ１が、アミノ酸配列：ＤＳＶＮＮ（配列番号７）を含み、α鎖ＣＤＲ２が、アミノ酸配列：ＩＰＳＧＴ（配列番号８）を含み、α鎖ＣＤＲ３が、アミノ酸配列：ＣＡＶＮＱＡＧＴＡＬＩ（配列番号３）を含み、β鎖ＣＤＲ１が、アミノ酸配列：ＳＮＨＬＹ（配列番号９）を含み、β鎖ＣＤＲ２が、アミノ酸配列：ＦＹＮＮＥＩ（配列番号１０）を含み、β鎖ＣＤＲ３が、アミノ酸配列：ＣＡＳＭＧＴＧＤＥＡＦ（配列番号４）を含む、単離されたまたは精製されたＴＣＲ。
【請求項2】
前記第１の鎖が、配列番号１１または配列番号２４のアミノ酸配列を含むα鎖可変領域をさらに含み、かつ前記第２の鎖が、配列番号１２または配列番号２３のアミノ酸配列を含むβ鎖可変領域のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１に記載の単離されたまたは精製されたＴＣＲ。
【請求項3】
配列番号２６、配列番号２８または配列番号４５のアミノ酸配列を含むα鎖定常領域、および配列番号２５、配列番号２７または配列番号４６のアミノ酸配列を含むβ鎖定常領域をさらに含む、請求項１に記載の単離されたまたは精製されたＴＣＲ。
【請求項4】
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含むα鎖および配列番号６のアミノ酸配列を含むβ鎖、（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むα鎖および配列番号４８のアミノ酸配列を含むβ鎖、または（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むα鎖および配列番号５０のアミノ酸配列を含むβ鎖を含む、請求項１に記載の単離されたまたは精製されたＴＣＲ。
【請求項5】
ＨＬＡ－Ａ＊０２分子における変異されたｐ５３Ｒ１７５ＨペプチドＨＭＴＥＶＶＲＨＣ（配列番号１）に対する抗原特異性を有する、請求項１に記載の単離されたまたは精製されたＴＣＲ。
【請求項6】
請求項１に記載のＴＣＲの機能的部分を含む単離されたまたは精製されたポリペプチドであって、前記機能的部分が、（ａ）配列番号１１、（ｂ）配列番号１２、（ｃ）配列番号２３、（ｄ）配列番号２４、（ｅ）配列番号１１および１２の両方、または（ｆ）配列番号２３および２４の両方のアミノ酸配列を含む、単離されたまたは精製されたポリペプチド。
【請求項7】
請求項６に記載のＴＣＲの機能的部分を含む単離されたまたは精製されたポリペプチドであって、前記機能的部分が、（ａ）配列番号５、（ｂ）配列番号６、（ｃ）配列番号４７、（ｄ）配列番号４８、（ｅ）配列番号４９、（ｆ）配列番号５０、（ｇ）配列番号５および６の両方、（ｈ）配列番号４７および４８の両方、または（ｉ）配列番号４９および５０の両方のアミノ酸配列を含む、単離されたまたは精製されたポリペプチド。
【請求項8】
配列番号３、７および８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖、ならびに配列番号４、９および１０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む、請求項１に記載の単離されたまたは精製されたタンパク質。
【請求項9】
（ａ）配列番号１１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と配列番号１２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、または（ｂ）配列番号２３のアミノ酸配列と配列番号２４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む、請求項８に記載の単離されたまたは精製されたタンパク質。
【請求項10】
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド鎖と配列番号６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、（ｂ）配列番号４７のアミノ酸配列と配列番号４８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖、または（ｃ）配列番号４９のアミノ酸配列と配列番号５０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド鎖を含む、請求項８に記載の単離されたまたは精製されたタンパク質。
【請求項11】
請求項１に記載のＴＣＲ、請求項６に記載のポリペプチドまたは請求項８に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離されたまたは精製された核酸。
【請求項12】
配列番号１６、１７、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１および４２からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む請求項１１に記載の単離されたまたは精製された核酸。
【請求項13】
請求項１１に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項14】
請求項１２に記載の核酸を含む請求項１３に記載の組換え発現ベクター。
【請求項15】
ｍＲＮＡ、環状ＲＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＤＮＡ、プラスミド、トランスポゾンまたはウイルスベクターからなる群より選択される、請求項１３に記載の組換え発現ベクター。
【請求項16】
請求項１２に記載の核酸または請求項１５に記載の組換え発現ベクターを含む単離されたまたは精製された宿主細胞であって、前記宿主細胞が、ヒトリンパ球であり、前記リンパ球が、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、または本明細書における細胞由来のＴ細胞株からなる群より選択される、単離されたまたは精製された宿主細胞。
【請求項17】
前記宿主細胞で処置される前記哺乳動物に対し自己由来であるか本明細書において前記宿主細胞で処置される前記哺乳動物と同種である請求項１６に記載の宿主細胞。
【請求項18】
請求項１６に記載の単離されたまたは精製された宿主細胞ならびに薬学的に許容されるものを含む医薬組成物。
【請求項19】
請求項１８に記載の医薬組成物の有効量を使用することにより哺乳動物における癌を処置するまたは予防するための方法であって、前記癌が、ヒトｐ５３におけるＲ１７５Ｈ変異およびＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子を含むことが知られている、方法。
【請求項20】
ＨＬＡ－Ａ＊０２分子における変異されたｐ５３Ｒ１７５ＨペプチドＨＭＴＥＶＶＲＨＣ（配列番号１）に対する抗原特異性を含む請求項１に記載の単離されたまたは精製されたＴＣＲ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０２１年１０月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２７３，３７２号に対する利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
本特許出願は、２０２１年１０月２９日に出願された米国仮特許出願第６３／２７３，３７２号に対する利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【0002】
配列表
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。上記ＸＭＬコピーは、２０２２年１０月２２日に作成され、ファイル名が「ＩＭＳＹＮ００１ＰＣＴ－ｐ５３．ｘｍｌ」であり、サイズが６３，２０７バイトである。
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。上記ＸＭＬコピーは、２０２２年１０月２２日に作成され、ファイル名が「ＩＭＳＹＮ００１ＰＣＴ－ｐ５３．ｘｍｌ」であり、サイズが６３，２０７バイトである。
【0003】
本発明の実施形態は、癌免疫療法における適用のためのペプチド、タンパク質、核酸、および細胞に関する。本発明のいくつかの実施形態は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子を含む、ＨＬＡ－Ａ＊０２分子により提示される変異体ＴＰ５３エピトープを発現する腫瘍を特異的に認識するように設計されたＴ細胞受容体を使用する、ＴＰ５３（ｐ５３）変異を有する癌の免疫療法に基づく予防または処置のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【0004】
新たな有効で安全な癌処置の選択肢に対する一般的な要望がある。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、または遺伝子組換えＴ細胞を用いる養子細胞療法（ＡＣＴ）は、癌に対する最も有望な免疫療法の１つであることが証明されている（Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１７；３７７：２５４５－２５５４）。固形腫瘍を有する患者にＴＩＬから生成されたＴ細胞または腫瘍抗原に対する特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように遺伝子操作されているＴ細胞を養子移入することは、臨床的有用性を示した（Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１３０：２７９－９４）。種々の固形腫瘍のためのＴＣＲベースのＴ療法（ＴＣＲ－Ｔ）の臨床試験は現在、異なる相で実行されている（Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ．２０１９；１－１３）。研究は、ネオアンチゲン特異的Ｔ細胞が、臨床応答に不可欠であることを明らかにした。ネオアンチゲンは、腫瘍における体細胞変異などのゲノムコドン交替により生成され、細胞表面上で主要な組織結合性複合体（ＭＨＣ；ヒトにおけるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）としても既知）により提示され、Ｔリンパ球により認識され得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７；３１８：１１０８－１１１３）。ネオアンチゲンを標的化する養子Ｔ細胞療法は、固形癌を処置するための最も有望な免疫療法アプローチの１つである。癌を有する患者にネオアンチゲン標的免疫療法を転換することにおける１つの課題は、各患者の特有のネオアンチゲンレパートリーである。同様の組織学的癌種を有する患者間であっても、患者間で共通の変異される標的はほとんどない。しかし、共通の免疫原性ネオアンチゲンを標的化する治療レジメン（therapeutic regiments）の同定は、癌を有する患者により幅広く適用できる治療の開発を促進するであろう。
【0005】
変異されたＴＰ５３は、理想的な共通の抗原標的を表す。４つの異なる汎癌配列決定研究の評価において、ＴＰ５３は、肺癌の８９％、結腸直腸癌の７２．７％、および食道癌の７０．７％を含む、幅広い範囲の癌種を示す、配列決定された場合のおよそ５０％で変異されると認められた（Ｎａｔ Ｍｅｄ ２０１７；２３：７０３－１３）。さらに、ＴＰ５３変異を有する癌は頻繁に、アミノ酸のＲ１７５位、Ｇ２４５位、Ｒ２４８位、Ｒ２４９位、Ｒ２７３位、およびＲ２８２位で「ホットスポット」変異を有する。したがって、これらのＴＰ５３変異を特異的に標的にできる免疫原性薬剤は、癌の診断、処置および／または予防において潜在的な有効性を有する。アミノ酸のＲ１７５位は、最も頻繁に変異される残基の１つであり、ＴＰ５３におけるすべての同一の変異のおよそ５％を含む。９４％が、ヒスチジン置換をもたらす（Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１２；２（５）：４０１－４）。この特異的なホットスポット変異は、多数の癌細胞病理にとっての治療標的であり得る。さらに、ＨＬＡ－Ａ＊０２は、およそ１６％のアフリカ系アメリカ人および４８％の白人系アメリカ人患者に見られ、米国において最も優勢なＭＨＣクラスＩ ＨＬＡの１つである（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１５；４３：７８４－８）。
【発明の概要】
【0006】
ＨＬＡ－Ａ＊０２により提示される変異されたＰ５３ ｐ．Ｒ１７５Ｈエピトープを標的とするＴＣＲ－Ｔ療法は、癌を有する多数の患者の処置に適用できる。以下の実施形態およびその態様は、システム、ツールおよび方法と組み合わせて説明され例証され、これらは例示的で例証的であり、範囲を限定するものではない。
【0007】
本発明の実施形態は、ＭＨＣクラスＩ分子により提示される変異されたヒトｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドに対する抗原特異性を含む単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供する。いくつかの実施形態において、変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドは、アミノ酸配列：ＨＭＴＥＶＶＲＨＣ（配列番号１）を含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２である。いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ分子は、配列番号２のアミノ酸配列を含む、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１である。
【0008】
本発明の実施形態は、変異されたヒトｐ５３Ｒ１７５Ｈに対する抗原特異性を含む単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供し、ＴＣＲは、第１および第２の鎖を含み、第１および第２の鎖の各１つは、第１、第２および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。第１の鎖の第３のＣＤＲ（ＣＤＲ３）は、アミノ酸配列：ＣＡＶＮＱＡＧＴＡＬＩ（配列番号３）を含み、第２の鎖の第３のＣＤＲ（ＣＤＲ３）は、アミノ酸配列：ＣＡＳＭＧＴＧＤＥＡＦ（配列番号４）を含む。
【0009】
一実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、ホモ・サピエンスＴＲＡＶ２２＊０１およびホモ・サピエンスＴＲＪ１５＊０１の組み合わせのアミノ酸配列（配列番号１１）を含む第１の鎖を含む。ＴＲＡＶ２２＊０１領域とＴＲＪ１５＊０１領域の間の挟まれた接合領域は、アミノ酸配列：ＣＡＶＮＱＡＧＴＡＬＩＦ（配列番号４３）を含む。
【0010】
一実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、ホモ・サピエンスＴＲＢＶ０２＊０１、ホモ・サピエンスＴＲＪ１－１＊０１およびホモ・サピエンスＴＲＤ１＊０１（配列番号１２）の組み合わせのアミノ酸配列を含む第２の鎖を含む。ＴＲＢＶ０２＊０１領域とＴＲＪ１－１＊０１領域の間の挟まれた接合領域は、アミノ酸配列：ＣＡＳＭＧＴＧＤＥＡＦＦ（配列番号４４）を含む。
【0011】
一実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、アミノ酸配列：ＤＳＶＮＮ（配列番号７）を含む第１のＣＤＲ（ＣＤＲ１）を含む第１の鎖を含む。
【0012】
一実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、アミノ酸配列：ＩＰＳＧＴ（配列番号８）を含む第２のＣＤＲ（ＣＤＲ２）を含む第１の鎖を含む。
【0013】
一実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、アミノ酸配列：ＳＮＨＬＹ（配列番号９）を含む第１のＣＤＲ（ＣＤＲ１）を有する第２の鎖を含む。
【0014】
一実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、アミノ酸配列：ＦＹＮＮＥＩ（配列番号１０を含む第２のＣＤＲ（ＣＤＲ２）を含む第２の鎖を含む。
【0015】
一実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、それぞれ配列番号７、配列番号８および配列番号３のアミノ酸配列を含むその第１、第２および第３のＣＤＲを有する第１の鎖、ならびにそれぞれ配列番号９、配列番号１０および配列番号４のアミノ酸配列を含むその第１、第２および第３のＣＤＲを含む第２の鎖を含む。この点について、ＴＣＲは、例えば、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２３および配列番号２４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【0016】
一実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変領域と配列番号２８のアミノ酸配列を含むアルファのマウス定常領域とを有する、配列番号５に示す第１の完全長鎖を含む。別の実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変領域と配列番号２６に示すヒト定常領域とを含む、配列番号４７に示す第１の完全長鎖を含む。別の実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変領域と配列番号４５に示すデルタ鎖のヒト定常領域とを含む、配列番号４９に示す第２の完全長鎖を含む。
【0017】
一実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変領域と配列番号２７のアミノ酸配列を含むベータ鎖のマウス定常領域とを含む、配列番号６に示す第２の完全長鎖を含む。別の実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変領域と配列番号２５に示すベータ鎖のヒト定常領域とを含む、配列番号４８に示す第２の完全長鎖を含む。別の実施形態において、単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変領域と配列番号４６に示すガンマ鎖のヒト定常領域とを含む、配列番号５０に示す第２の完全長鎖を含む。
【0018】
一実施形態において、本発明のＴＣＲの第１の鎖は、可変領域と定常領域との組み合わせを含み、例えば、本発明のＴＣＲの第１の鎖は、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変領域と配列番号２５のアミノ酸配列を含むベータ定常領域とを含み、本発明のＴＣＲの第２の鎖は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む可変領域と配列番号２６のアミノ酸配列を含むアルファ定常領域とを含む。
【0019】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲの機能的部分を含む単離されたまたは精製されたポリペプチドは、配列番号５、６、１１、１２、２３、２４、４７、４８、４９、５０からなる群より選択されるアミノ酸配列または複数の配列を含む。
【0020】
いくつかの実施形態において、１本鎖ポリペプチドは、本発明の単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体の第１の鎖の可変領域（配列番号２３）および第２の鎖の可変領域（配列番号２４）を含むかそれからなり、ＴＣＲの第１の鎖および第２の鎖の可変領域は、リンカーペプチド、例えば、可動性リンカーペプチド、例えば、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）ｎリンカーにより接続され得る。
【0021】
いくつかの実施形態において、タンパク質は、本発明の単離されたまたは精製されたＴ細胞受容体の第１および第２の鎖を含む２つの別個のポリペプチドを含む。
【0022】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質は、本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質に対して実質的または有意な配列同一性または類似性を含み、例えば、ＨＬＡ－Ａ２により提示される変異されたヒトｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（配列番号１）に対する抗原特異性を含む変異体であるかまたは、それに対し親ポリペプチドまたはタンパク質が、親ＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質と同様の程度、同じ程度、またはより高い程度に特異的に結合する、ＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質の生理活性を保持する。この点について、ＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質は、例えば、配列番号３、４、７、８、９、１０、１１、１２、２３、２４の群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つとアミノ酸配列において少なくとも約７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であり得る。
【0023】
本発明の実施形態は、本明細書に記載の本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離されたまたは精製された核酸を提供する。核酸は、合成されるか天然源から得られる（例えば、単離されるおよび／または精製される）、１本鎖または２本鎖であり得る、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。
【0024】
本発明の実施形態は、５’から３’に、（ａ）第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列、または（ｂ）第２のヌクレオチド配列および第１のヌクレオチド配列、を含む単離されたまたは精製された核酸を提供し、第１のヌクレオチド配列は、配列番号５、１１、２４、４７、４９の群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードし、第２のヌクレオチド配列は、配列番号６、１２、２３、４８、５０の群から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードする。
【0025】
本発明の一実施形態において、単離されたまたは精製された核酸はさらに、第１および第２のヌクレオチド配列の間に挟まれた第３のヌクレオチド酸配列を含み、そのため第１および第２の鎖は、２つの別個のポリペプチドへと切断されるか、２つの別個のポリペプチドとして発現される。適切な配列は、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２ＡまたはＩＲＥＳ配列であり得る。本発明の一実施形態において、単離されたまたは精製された核酸は、配列番号１３からなるアミノ酸（ammo acid）配列をコードする。
【0026】
本発明のいくつかの実施形態において、単離されたまたは精製された核酸分子は、配列番号１６、１７および２９～４０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
【0027】
いくつかの実施形態において、本発明のＴＣＲの第１および第２の鎖のそれぞれの３つのＣＤＲ（それぞれ配列番号３、７、８および配列番号４、９、１０）を含む抗原結合ドメインは、１本鎖ポリペプチドとして発現されるように構成される。第１および第２の鎖は、ＨＬＡ－Ａ２においてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（配列番号１）に特異的な抗原結合ドメインを形成するように、可動性リンカーにより結合される。Ｔ細胞共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ２７またはＯＸ４０からの共刺激ドメインおよびＴ細胞活性化シグナル伝達（singling）ドメイン、例えば、ＣＤ３からのＩＴＡＭドメインと結合される本明細書の抗原結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２においてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（配列番号１）に特異的である抗原標的化剤を形成できる。
【0028】
本発明の一実施形態において、本発明で説明される単離されたまたは精製されたＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質は、組換え発現ベクターにより発現され得る。組換え発現ベクターは、プラスミド、環状ＲＮＡ（circulate RNA）、１本鎖ＤＮＡ、トランスポゾンもしくはＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含むベクター、またはウイルス（virial）ベクター例えば、レンチウイルスベクターであり得る。
【0029】
本発明のいくつかの実施形態において、単離されたまたは精製されたＴＣＲ、ポリペプチド、またはタンパク質は、本明細書に記載の核酸またはベクターのいずれかによりコードされるか、細胞での本明細書に記載の核酸またはベクターのいずれかの発現から生じる。
【0030】
本発明の別の実施形態は、ＨＬＡ－Ａ２により提示される配列番号１のペプチドに対する抗原特異性を有するＴＣＲを発現する宿主細胞を生成する方法を提供する。
【0031】
本発明の一実施形態において、宿主細胞は、初代ヒトリンパ球、ヒトリンパ球前駆体またはＴ細胞に分化できる幹細胞を含む。一実施形態において、宿主細胞は、不死化ヒト細胞株である。
【0032】
一実施形態において、宿主細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からなる群より選択される細胞を含む。
【0033】
一実施形態において、本発明は、変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈに対して抗原特異性を有する本明細書に記載のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ベクターおよび宿主細胞のいずれかならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【0034】
本発明の一態様は、哺乳動物において癌を処置することにおける使用のための、本明細書に記載のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換えベクター、宿主細胞、および／または医薬組成物のいずれかを提供する。一実施形態において、癌は、胆管癌、黒色腫、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、食道癌、卵巣癌、子宮内膜癌、骨髄腫、白血病、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膠芽腫、子宮頸癌、頭頸部癌、乳癌、膵臓癌、肉腫、または膀胱癌を含むがこれらに限定されない。本発明の別の態様は、癌に進行する可能性がある哺乳動物における前癌状態および病変を予防することにおける使用のための、本明細書における本発明のＴＣＲのいずれかを提供する。一実施形態において、多種多様の臓器系に影響する前癌状態および病変は、結腸ポリープ、子宮頸部異形成、上皮内癌、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、骨髄異形成症候群または日光角化症を含むがこれらに限定されない。別の実施形態において、本明細書に記載の本発明は、リー・フラウメニ症候群からの癌発生を予防することにおいて使用される。一実施形態において、癌細胞または前癌細胞は、ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子および変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈを保持する。本発明の別の態様は、Ｒ１７５Ｈのミスセンス変異を含むｐ５３の存在を検証するために対象由来の試料を配列決定すること、および対象がＨＬＡ－Ａ＊０２対立遺伝子を有することを検証するためにＨＬＡタイピングすることを含む方法を提供する。
【0035】
本明細書における実施形態では、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、ある特定の実施形態において、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」で置き換えることができる。
【0036】
代表的な実施形態を、図面の参照図で説明する。本明細書で開示される実施形態および図面は、限定的ではなく、むしろ例証的であるとみなされることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】図１は、ＨＬＡ－Ａ２＋の健康なドナーの血液のＰＢＭＣから生成されたｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬおよびＣＴＬクローンの表現型を示す。図１Ａは、変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（配列番号１）を用いて再刺激されインビトロでサイトカインを用いて拡大された細胞培養由来の代表的なフローサイトメトリープロットを示す。細胞を、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８ａおよびＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ２／ｐ５３Ｒ１７５Ｈ四量体で染色し、その後フローサイトメトリー（リンパ球上でリビングゲートした）により分析した。四量体＋ゲートは、対照Ｔ細胞に基づいて設定された。ＣＤ８＋ＨＬＡ－Ａ２／ｐ５３Ｒ１７５Ｈ四量体＋Ｔ細胞の頻度は、リビングゲートしたリンパ球から表された。正方形ゲートした集団は、Ｔ細胞クローニングについて分類されたＣＤ８＋四量体＋Ｔ細胞を表す。図１Ｂは、ＦＡＣＳソーティングにより、続いてＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでのインビトロ刺激により生成された全５８個のＴ細胞クローンからの代表的なフローサイトメトリープロットを示す。全１７個のＣＤ８＋四量体－Ｔ細胞クローンを得（左上のプロットにより表される）、４１個のＣＤ８＋四量体＋Ｔ細胞クローンを得た（他のプロットにより表される）。
【図2A】図２Ａは、本発明のＴＣＲの発現のためのレンチウイルスベクターの概略図を示す。本明細書に記載の変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈエピトープに特異的なＴＣＲをコードするヌクレオチド配列（配列番号１６）は、ｐＣＤＨ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－（ＰＧＫ－ＧＦＰ）双方向レンチウイルスベクターのＭＣＳ領域中にクローン化された。組換えレンチウイルスのヌクレオチド配列（ｐＣＤＨ－ｐ５３）は、本発明のＴＣＲをコードする核酸を含み、ＥＦ１αプロモーターおよびＷＰＲＥ領域が隣接する。Ｕ３領域のエンハンサーにおける欠失（Ｕ３ ｄｅｌ）は、レンチウイルス構築物の自己不活性化を保証する。本明細書に記載のｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＴＣＲは、可変配列（ＴＣＲ－βＶ、配列番号１２）およびマウス定常配列（マウスＴＣＲ－βＣ、配列番号２７）を有するベータ鎖と、可変配列（ＴＣＲ－αＶ、配列番号１１）およびマウス定常配列（マウスＴＣＲ－αＣ、配列番号２８）を有するアルファ鎖と、リンカー配列（配列番号１３）を含む。太字の下線付きのものは、ＡＶ２２＊０１とＴＲＪ１５＊０１の間の本発明のＴＣＲ－αＶの接合領域（配列番号４３）およびＴＲＢＶ０２＊０１とＴＲＪ１－１＊０１の間の本発明のＴＣＲ－βＶの接合領域（配列番号４４）のアミノ酸配列である。
【図2B】図２Ｂは、本発明のＴＣＲをコードする組換えレンチウイルスでトランスフェクトされたＰＢＭＣが、ＨＬＡ－Ａ２／ｐ５３Ｒ１７５Ｈ四量体により検出できる外来性ＴＣＲを発現できたことを示す。ＧＦＰを、ウイルストランスフェクションマーカーとして使用した。形質導入Ｔ細胞を、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８ａ抗体およびＰＥ標識ＨＬＡ－Ａ２／ｐ５３Ｒ１７５Ｈ四量体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。左側のグラフは、組換えレンチウイルスで形質導入されたＴ細胞を表す、リビングゲートしたリンパ球集団におけるＧＦＰ＋Ｔ細胞の割合を示す。右側のグラフは、ゲートされたＣＤ８－ＧＦＰ＋Ｔ細胞集団（左側プロット）およびゲートされたＣＤ８＋ＧＦＰ＋Ｔ細胞集団（右側プロット）におけるＨＬＡ－Ａ２／ｐ５３Ｒ１７５Ｈ四量体＋Ｔ細胞の割合を示す。
【図2C】図２Ｃは、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ特異的ＴＣＲをコードする組換えレンチウイルスでトランスフェクトされたＴ細胞株が、ＨＬＡ－Ａ２／ｐ５３Ｒ１７５Ｈ四量体により検出できる外来性ＴＣＲを発現できたことを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞株由来でありかつ内因性ＴＣＲを発現しないＪ．ＲＴ３－Ｔ３．５（ＪＲＴ）細胞および外来性ヒトＣＤ８を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ８）を、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ特異的ＴＣＲをコードするレンチウイルスで形質導入した。形質導入細胞を、抗ＣＤ８－ＡＰＣおよびＨＬＡ－Ａ２／ｐ５３Ｒ１７５Ｈ四量体－ＰＥで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ゲートされたＧＦＰ＋ＪＲＴ細胞における四量体＋細胞の割合を、左側プロットに示す。ゲートされたＧＦＰ＋Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ８細胞における四量体＋細胞の割合を、右側プロットに示す。
【図3】図３は、ＨＬＡ－Ａ２において変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（配列番号１）に特異的な本発明のＴＣＲを発現するように形質導入された初代Ｔ細胞およびＴ細胞株の機能分析を示す。図３Ａは、ＪＲＴ細胞により発現されたｐ５３Ｒ１７５Ｈ特異的ＴＣＲが、Ｔ２細胞上のＨＬＡ－Ａ２により提示された変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを認識できたことを示す。組換えレンチウイルス（ｐＣＤＨ－ｐ５３）で形質導入されたＪＲＴ細胞を、１６時間１０００ｎｇ／ｍｌから開始する変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドの１０倍希釈系列でパルスされたＴ２細胞と共培養した。細胞を、抗ＣＤ６９抗体で染色して、フローサイトメトリーにより、ゲートされたＧＦＰ＋細胞における活性化ＣＤ６９＋細胞の割合を分析した。Ｘ軸は、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドの濃度であり、Ｙ軸は、ゲートされたＧＦＰ＋ＪＲＴ細胞におけるＣＤ６９＋細胞の割合である。図３Ｂは、ＰＢＭＣから生成された初代Ｔ細胞により発現された本発明のＴＣＲが、変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈエピトープペプチドを認識できたが、Ｔ２細胞上でＨＬＡ－Ａ２により提示された野生型ｐ５３Ｒ１７５ペプチド（配列番号２０）を認識できなかったことを示す。組換えレンチウイルス（ｐＣＤＨ－ｐ５３）で形質導入されたＰＢＭＣ細胞を、２４時間１０００ｎｇ／ｍｌから開始する変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（四角）または１０ｕｇ／ｍｌから開始する野生型ｐ５３Ｒ１７５ペプチド（三角）の１０倍希釈系列でパルスされたＴ２細胞と共培養した。細胞を、ＡＰＣ標識抗ＣＤ８ａおよびＰＥ標識抗ＣＤ１３７抗体で染色して、フローサイトメトリーにより、ゲートされたＧＦＰ＋細胞におけるＣＤ８＋ＣＤ１３７＋細胞の割合を分析した。Ｘ軸は、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドの濃度であり、Ｙ軸は、ゲートされたＧＦＰ＋生存リンパ球におけるＣＤ８＋ＣＤ１３７＋細胞の割合である。
【図4】図４は、腫瘍細胞株に対する変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドに特異的な本発明のＴＣＲを発現する初代Ｔ細胞の機能分析を示すグラフである。図４Ａは、標的腫瘍細胞上でのＨＬＡ－Ａ２発現のプロットを示すグラフである。細胞を、ＰＥで標識された抗ＨＬＡ－Ａ２抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。左側のグラフは、３種の腫瘍細胞株によるＨＬＡ－Ａ２発現を示す。ライトグレーの線は、陰性対照であり、ミディアムグレーの線は、ＩＦＮ－ガンマで前処理されていない腫瘍株を表し、ダークグレーの線は、２４時間２００ｕ／ｍｌでＩＦＮ－ガンマを用いて前処理された腫瘍細胞株を表した。右側のグラフは、外来性ＨＬＡ－Ａ２を発現するように形質導入された腫瘍細胞株によるＨＬＡ－Ａ２発現を示す。ライトグレーの線は、陰性対照であり、ミディアムグレーの線は、ＨＬＡ－Ａ２を発現するように形質導入された腫瘍株を表し、ダークグレーの線は、ＨＬＡ－Ａ２を発現するように形質導入された腫瘍細胞株を表す。図４Ｂは、本発明のＴＣＲを発現するように形質導入されたＰＢＬが、内因性変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈを有するＨＬＡ－Ａ２＋腫瘍細胞を認識できたことを示すグラフである。活性化ＰＢＭＣを、ＨＬＡ－Ａ２における変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドに特異的な本発明のＴＣＲを発現するように組換えレンチウイルス（ｐＣＤＨ－ｐ５３）で形質導入し、ＨＬＡ－Ａ２とＲ１７５Ｈ変異を有するｐ５３タンパク質との両方を発現する腫瘍細胞株（ＫＭＳ２６、ＫＬＥ、ＳＫＵＴ１－Ａ２ＢＭ、ＳＫＵＴ１－Ａ２、２９３Ｔ－Ａ２－ｍｐ５３およびＫ５６２－Ａ２－ｍｐ５３）、Ｒ１７５Ｈ変異のみを有するｐ５３タンパク質を発現する標的細胞（ＳＫＵＴ１）またはＨＬＡ－Ａ２のみを発現する標的細胞（２９３Ｔ－Ａ２、ＳＫＯＶ３－Ａ２）を含む、種々の標的細胞と共培養した。２９３Ｔ－Ａ２、ＳＫＯＶ３－Ａ２、ＳＫＵＴ１－Ａ２およびＳＫＯＶ３－Ａ２は、外因的にＨＬＡ－Ａ２を発現するように形質導入された細胞株である。ＳＫＵＴ１－Ａ２ＢＭは、外因的にＨＬＡ－Ａ２およびベータ２－ミクログロブリン（beta2-microgluboine）を発現するように形質導入された細胞株である。２９３Ｔ－Ａ２－ｍｐ５３およびＫ５６２－Ａ２－ｍｐ５３は、外因的にＨＬＡ－Ａ２およびＲ１７５Ｈ変異を有するｐ５３タンパク質の両方を発現するように形質導入される。標的細胞は、処理されなかった（塗りつぶした棒）か、２４時間２００ｎｇ／ｍｌでＩＦＮ－ガンマを用いて処理された（破線の棒）。いくつかの混合培養物を、２ｕｇ／ｍｌで抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体を用いて処理した（白色の棒）。陰性対照として形質導入されたＰＢＭＣ単独を使用する。陽性対照として１００ｎｇ／ｍｌで変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（Ｔ２＋ｍｔ－ｐ５３ペプチド）を用いてパルスされたＴ２細胞を使用する。２４時間インキュベートした後、細胞を、抗ＣＤ８ａ－ＡＰＣおよび抗ＣＤ１３７－ＰＥ抗体で染色して、フローサイトメトリーにより、ゲートされたＧＦＰ＋生存リンパ球におけるＣＤ８＋ＣＤ１３７＋細胞の割合を分析した。ＣＤ１３７は、Ｔ細胞活性化マーカーである。Ｘ軸は、標的であり、Ｙ軸は、ゲートされたＧＦＰ＋生存リンパ球におけるＣＤ８＋ＣＤ１３７＋細胞の割合である。
【発明を実施するための形態】
【0038】
以下は、特定の実施形態を詳細に説明し、本開示の図面を参照するが、本発明を限定するものではない。本開示の基本原則に基づいて、当該技術分野の技術担当者によりなされる変更または改善は、本開示の基本原則にしたがう限り、本発明の範囲内である。
【0039】
本明細書で使用されるように、用語「ＣＴＬ」は、ＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を指す。ＣＤ８＋ＣＴＬは、標的細胞の表面上のＭＨＣクラスＩ分子により提示された抗原エピトープを認識できる。同様に、「ＣＤ４＋Ｔｈ」は、ＣＤ４陽性のＴヘルパー細胞（T help cell）を指す。
【0040】
本明細書で使用されるように、用語「抗原」は、免疫応答を誘導できる分子を指す。用語「エピトープ」は、免疫応答を刺激できる抗原の一部を指す。例えば、エピトープは、ＭＨＣクラスＩ分子に結合され、それによってＭＨＣ－Ｉ／ペプチド複合体を形成する、ペプチドであり得る。ＭＨＣ－Ｉ／ペプチド複合体は、細胞傷害性Ｔ細胞の特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）により選択的に認識され得る。
【0041】
本明細書で使用されるように、用語「Ｔ細胞応答」は、エフェクターＴ細胞のＴＣＲが同種抗原により活性化される場合のエフェクターＴ細胞の増殖および活性化を意味する。例えば、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬのＴ細胞応答は、標的細胞の溶解、サイトカインの分泌、またはエフェクター分子（例えば、ＣＤ６９および／または４－１ＢＢ）の発現を含み得る。本明細書において、エフェクター分子は、バイオマーカーとして使用されて、同種抗原刺激に対するＴ細胞応答を誘導できる。ＴＣＲは、ＴＣＲを発現するＴ細胞の数の少なくとも２倍が、ＨＡＬクラスＩ分子により提示される変異エピトープペプチドを発現する標的細胞との共培養時にエフェクター分子（例えば、ＣＤ６９および／または４－１ＢＢ）を発現する場合、活性化されるまたは変異標的に対する「抗原特異性」を有するとみなすことができる。
【0042】
本発明のＴＣＲ、ポリペプチド、タンパク質、核酸、組換え発現ベクター、および宿主細胞（それらの集団を含む）は、単離されおよび／または精製され得る。本明細書で使用される用語「単離された」は、その自然環境から取り除かれていることを意味する。本明細書で使用される用語「精製された」は、純度が高められていることを意味し、「純度」は、相対的な用語であり、必ずしも絶対純度として解釈されるものではない。例えば、純度は、少なくとも約５０％であり得、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％であり得るか、それより大きい可能性があるか、１００％であり得る。
【0043】
本明細書で使用されるように、用語「変異体」は、タンパク質またはポリペプチドにおいて、アミノ酸残基の１個または２個またはそれより多くが、他のアミノ酸残基で置換されることを意味し、一方で変異体は、変更されないタンパク質と実質的に同じ生物学的機能を保持する。
【0044】
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、望ましい臨床結果を得るためのアプローチを指す。望ましい臨床結果は、疾患の少なくとも１つの症状の低減または軽減を含み得るがこれらに限定されない。例えば、処置は、疾患の少なくとも１つの症状の減弱、疾患の程度の減弱、病状の安定化、疾患の拡大の予防、疾患の進行の延期もしくは遅延、疾患の寛解、疾患の再発の減弱、疾患の鎮静、疾患を伴う生存期間の延長、または疾患の完全な根絶であり得る。用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」および「予防している（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、それにより個人が、特に、疾患の危険因子を有する、例えば、ｐ５３遺伝子におけるミスセンス変異を有する個人が、疾患の発生または進行を予防するために処置される、手順を指す。
【0045】
腫瘍タンパク質ｐ５３（「ＴＰ５３」または「ｐ５３」とも呼ばれる）は、例えば、細胞分割を調節することにより腫瘍抑制因子として機能する。ｐ５３タンパク質は、細胞の核内に位置し、そこでそれは、ＤＮＡに直接結合する。野生型ｐ５３（この後は、ＷＴ ｐ５３、配列番号１８）。ｐ５３の変異は、完全長ＷＴ ｐ５３のアミノ酸配列を参照して本明細書で定義され、特定の位置に存在するアミノ酸残基、続いてその位置番号、続いてこれによりその残基が検討中の特定の変異において置換されているアミノ酸、を参照して本明細書で記載される。ｐ５３は、９個の既知のスプライスバリアントを含む。本明細書に記載のｐ５３変異は、全９個のｐ５３スプライスバリアントすべてにわたって保存されている。変異は、配列番号１８の３９３－アミノ酸配列の示された位置に対応するｐ５３の特定のスプライスバリアントのアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の置換を指し、スプライスバリアントにおける実際の位置が異なっている場合があることが理解される。
【0046】
本明細書で使用されるように、用語「ｐ５３Ｒ１７５Ｈ」または「Ｒ１７５Ｈ」は、ｐ５３のコドンの１７５位でのミスセンス変異体を指し、野生型のアルギニン残基は、ヒスチジン残基に変異される（配列番号１９）。用語「ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド」または「ｐ５３Ｒ１７５Ｈエピトープペプチド」は、もともとｐ５３のコドンの１７５位でのミスセンス変異を含有するペプチドを指し、野生型のアルギニン残基は、ヒスチジン残基に変異される（配列番号１）。用語「野生型ｐ５３Ｒ１７５ペプチド」または「ｐ５３Ｒ１７５エピトープペプチド」は、ＷＴ ｐ５３由来のペプチドを指し、アルギニン残基は、ｐ５３のコドンの１７５位にある。
【0047】
本明細書で使用されるように、用語「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、特に指定されない限り、Ｔ細胞受容体の機能的部分および機能的変異体を指す。ＴＣＲは、２つのポリペプチド（すなわち、ポリペプチド鎖）、例えばＴＣＲのアルファ（α）鎖、ＴＣＲのベータ（β）鎖、ＴＣＲのガンマ（γ）鎖、ＴＣＲのデルタ（δ）鎖、またはそれらの組み合わせを含む。本発明のＴＣＲは、養子細胞移植に使用されるエフェクター細胞により発現される場合を含む、多くの利点を提供する。変異されたｐ５３は癌細胞により発現され正常細胞により発現されないので、本発明のＴＣＲを発現するように変更されたエフェクター細胞は、癌細胞を特異的に破壊するが、正常細胞の破壊を最小化するまたは排除する。
【0048】
本発明の一実施形態において、ＴＣＲは、配列番号１９により定義されるように、１７５位で変異を有するヒトｐ５３に対する抗原特異性を含む。１７５位でのｐ５３変異は、任意のミスセンス変異であり得る。本発明の一実施形態において、ＴＣＲは、Ｒ１７５Ｈ変異を有するヒトｐ５３に対する抗原特異性を含む。他の実施形態において、ＴＣＲは、Ｒ１７５Ｇ変異、Ｒ１７５Ｌ変異、Ｒ１７５Ａ変異、Ｒ１７５Ｃ変異またはＲ１７５Ｄ変異を有するヒトｐ５３に対する抗原特異性を含む。変異されたｐ５３は、本明細書において、任意の変異されたｐ５３タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを指す。本発明の好ましい実施形態において、ＴＣＲは、ＨＭＴＥＶＶＲＨＣ（配列番号１）のアミノ酸配列を含むかそれからなる変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドに対する抗原特異性を含む。ＴＣＲは、ＨＭＴＥＶＶＲＲＣ（配列番号２０）のアミノ酸配列を含むかそれからなる、対応する野生型ｐ５３ペプチドを認識できない。ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドの長さは、ペプチドが本発明のＴＣＲにより認識され得る限り変化してよく、いくつかの実施形態において、配列番号１のアミノ末端またはカルボキシル末端に１～５個の追加のアミノ酸を含む可能性がある。
【0049】
本発明の一実施形態において、ＴＣＲは、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）分子により提示される変異ｐ５３ペプチドを認識できる可能性がある。この点について、ＴＣＲは、ＨＬＡクラスＩ分子において変異体ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを認識する可能性がある。本発明の一実施形態において、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ分子である。ＨＬＡ－Ａ分子のα鎖、ベータ２－ミクログロブリンおよび変異体ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドは、標的細胞の表面上で発現され本発明のＴＣＲにより特異的に認識されるＨＬＡ／ペプチド複合体を形成する。本発明の一実施形態において、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ２分子である。ＨＬＡ－Ａ２分子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０３、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０５、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０７、またはＨＬＡ－Ａ＊０２：１１、ＨＬＡ－Ａ＊６８：０２を含むがこれらに限定されない、ＨＬＡ－Ａ２分子またはＨＬＡ－Ａ２スーパータイプのいずれかであり得る。好ましくは、ＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１分子である。
【0050】
本発明のＴＣＲは、特異性を有するＨＬＡ－Ａ２において変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを認識できる。ＴＣＲは、初代Ｔ細胞またはＴＣＲを発現するＴ細胞株が低濃度の変異されたｐ５３ペプチド（例えば、約０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１０００ｎｇ／ｍｌまたは上記値のいずれか２つにより定義される範囲）でパルスされたＨＬＡ－Ａ２陽性標的細胞との共培養時にＴ細胞活性化マーカー、例えば、ＣＤ１３７またはＣＤ６９の発現をアップレギュレートする（活性化Ｔ細胞）場合、変異されたｐ５３に対する抗原特異性を有するとみなされてよい。Ｔ細胞活性化マーカーを発現する活性化Ｔ細胞の頻度は、陰性対照の量と比較して少なくとも２倍であるべきである。さらに、ＴＣＲは、ＴＣＲを発現するＴ細胞が配列番号１の配列を有するエピトープペプチドを含む変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈタンパク質を内因的に発現するＨＬＡ－Ａ２陽性標的細胞、または変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈを発現するように核酸で形質導入されるＨＬＡ－Ａ２陽性標的細胞との共培養時にＴ細胞活性化マーカーの発現をアップレギュレートする場合、変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈに対する抗原特異性を有するとみなされてよい。Ｔ細胞活性化マーカーの発現は、上述の標的細胞での刺激後、例えば、フローサイトメトリーにより測定できる。あるいは、ＴＣＲは、本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞が陰性対照により生成されるＩＦＮ－γまたはＧＭ－ＣＳＦの量と比較して変異されたｐ５３ペプチドでパルスされたＨＬＡ－Ａ２陽性標的細胞、または変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈを内因的に発現するＨＬＡ－Ａ２陽性標的細胞、または変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈを発現するようにヌクレオチド酸で形質導入される標的細胞との共培養時に少なくとも２倍多くＩＦＮ－ガンマまたはＧＭ－ＣＳＦを生成する場合、変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈに対する抗原特異性を有するとみなされてよい。ＩＦＮ－γまたはＧＭ－ＣＳＦ分泌は、例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＯＴ）アッセイなどの当該技術分野で既知の方法により測定できる。
【0051】
本発明の一実施形態において、本発明のＴＣＲは、そのそれぞれが相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む可変領域を含む、２本のポリペプチド鎖を含む。本発明の一実施形態において、ＴＣＲは、α鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ１α）、α鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ２α）、およびα鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ３α）を含む第１のポリペプチド鎖と、β鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲ１β）、β鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲ２β）、および鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲ３β）を含む第２のポリペプチド鎖とを含む。本発明の一実施形態において、本発明のＴＣＲは、それぞれ、本発明のＴＣＲのＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３βに相当する、変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈに対して特異的なＴＣＲの６個のＣＤＲ領域である配列番号７、８、３、９、１０、４のアミノ酸配列を含む。
【0052】
本発明の一実施形態において、本発明のＴＣＲは、ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２αおよびＣＤＲ３α（それぞれ配列番号７、８、３）を含むα鎖可変領域、またはＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３β（それぞれ配列番号９、１０、４）を含むβ鎖可変領域を含む。一実施形態において、本発明のＴＣＲは、２つのアミノ酸配列がそれぞれ本発明のＴＣＲのα鎖の可変領域およびβ鎖の可変領域に相当する、配列番号１１および１２のアミノ酸配列の両方を含む。本明細書に記載の本発明のＴＣＲは、変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈに対する抗原特異性を有する。
【0053】
本発明の一実施形態において、本発明のＴＣＲは、それぞれ天然のシグナルペプチド（配列番号２２）または天然のシグナルペプチド（配列番号２１）を含むα鎖またはβ鎖を含む。別の実施形態において、本発明のＴＣＲは、別の分泌されるタンパク質または膜に結合されるタンパク質のシグナルペプチドを含むα鎖またはβ鎖を含む。別の実施形態において、本発明のＴＣＲは、シグナルペプチド（配列番号２４）がない成熟Ｖα鎖またはシグナルペプチド（配列番号２３）がない成熟Ｖβ鎖を含む。
【0054】
本発明の一実施形態において、ＴＣＲは、定常領域を含む。ＴＣＲ定常領域は、例えば、ヒトまたはマウスなどの他の種に由来する可能性がある。一実施形態において、ＴＣＲは、ヒトα鎖定常領域（配列番号２６）およびヒトβ鎖定常領域（配列番号２５）を含む。一実施形態において、ＴＣＲは、マウスα鎖定常領域（配列番号２８）およびマウスβ鎖定常領域（配列番号２７）を含む。マウス定常領域を使用する利点は、外来性ＴＣＲ鎖、例えば、アルファ鎖およびベータ鎖と、内因性ＴＣＲ鎖、例えば、アルファ鎖およびベータ鎖との誤対合を制限することである。本発明のＴＣＲは、α鎖可変領域およびβ鎖定常領域を含む鎖、もしくはβ鎖可変領域およびα鎖定常領域を含む鎖、またはα鎖可変領域およびβ鎖定常領域ならびにβ鎖可変領域およびα鎖定常領域を含む２本の鎖の両方を含み得る。
【0055】
本発明のいくつかの実施形態において、ＴＣＲは、本発明の親ＴＣＲのＴＣＲ変異体であり得る。本明細書に記載のＴＣＲ変異体は、親ＴＣＲに対して実質的もしくは有意な配列同一性または類似性を有するＴＣＲを指し、親ＴＣＲの生理活性を保持する可能性がある、例えば、ｐ５３Ｒ１７５Ｈに対する抗原特異性を有するか、親ＴＣＲと同様の程度、同じ程度、もしくはより高い程度に変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈと特異的に反応できる可能性がある。親ＴＣＲならびにＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３β（それぞれ配列番号７、８、３、９、１０、４）を含むその６個のＣＤＲ領域と比較して、本発明のＴＣＲ変異体およびその６個のＣＤＲ領域は、例えば、それぞれ親ＴＣＲおよびその６個の各ＣＤＲ領域に対しアミノ酸配列において少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％またはそれより多く同一である。
【0056】
本明細書に記載の本発明のＴＣＲ変異体は、例えば、親ＴＣＲならびに少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有するＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２β、およびＣＤＲ３β（それぞれ配列番号７、８、３、９、１０、４）を含むその６個のＣＤＲ領域のアミノ酸配列を含むことができる。保存的アミノ酸置換は、当該技術分野で既知であり、ある特定の物理的特性および／または化学的特性を有する１個のアミノ酸が同じ化学的特性または物理的特性を有する別のアミノ酸と交換される、アミノ酸置換を含む。
【0057】
本明細書に記載の本発明のＴＣＲ変異体は、例えば、少なくとも１つの置換されたアミノ酸を含む３個のＣＤＲ（配列番号７、８、３）を有するα鎖、および少なくとも１つの置換されたアミノ酸を含む３個のＣＤＲ（配列番号９、１０、４）を有するβ鎖を含むことができる。そのようなＴＣＲ変異体の生物活性は、親ＴＣＲと比較して上昇されてよい。一実施形態において、ＴＣＲ変異体は、置換されたＣＤＲを有するα鎖、β鎖のいずれか１つまたはその両方を含み、例えば、α鎖は、アミノ酸配列：ＸＳＶＮＮ、ＤＸＶＮＮ、ＤＳＸＮＮ、ＤＳＶＸＮもしくはＤＳＶＮＸのいずれか１つを有する置換されたＣＤＲ１α；アミノ酸配列：ＸＰＳＧＴ、ＩＸＳＧＴ、ＩＰＸＧＴ、ＩＰＳＸＴもしくはＩＰＳＧＸのいずれか１つを有する置換されたＣＤＲ２α；またはアミノ酸配列：ＸＶＮＱＡＧＴＡＬＩ、ＡＸＮＱＡＧＴＡＬＩ、ＡＶＸＱＡＧＴＡＬＩ、ＡＶＮＸＡＧＴＡＬＩ、ＡＶＮＱＸＧＴＡＬＩ、ＡＶＮＱＡＸＴＡＬＩ、ＡＶＮＱＡＧＸＡＬＩ、ＡＶＮＱＡＧＴＸＬＩ、ＡＶＮＱＡＧＴＡＸＩもしくはＡＶＮＱＡＧＴＡＬＸのいずれか１つを有する置換されたＣＤＲ３αを含む。β鎖は、アミノ酸配列：ＸＮＨＬＹ、ＳＮＨＬＹ、ＳＮＸＬＹ、ＳＮＨＸＹもしくはＳＮＨＬＸのいずれか１つを有する置換されたＣＤＲ１β；アミノ酸配列：ＸＹＮＮＥＩ、ＦＸＮＮＥＩ、ＦＹＸＮＥＩ、ＦＹＮＸＥＩ、ＦＹＮＮＸＩもしくはＦＹＮＮＥＸのいずれか１つを有する置換されたＣＤＲ２β；またはアミノ酸配列：ＸＳＭＧＴＧＤＥＡＦ、ＡＸＭＧＴＧＤＥＡＦ、ＡＳＸＧＴＧＤＥＡＦ、ＡＳＭＸＴＧＤＥＡＦ、ＡＳＭＧＸＧＤＥＡＦ、ＡＳＭＧＴＸＤＥＡＦ、ＡＳＭＧＴＧＸＥＡＦ、ＡＳＭＧＴＧＤＸＡＦ、ＡＳＭＧＴＧＤＥＸＦもしくはＡＳＭＧＴＧＤＥＡＸのいずれか１つを有する置換されたＣＤＲ３βを含む。ここで、Ｘは、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンである。本明細書に記載のＴＣＲ変異体の各置換されたＣＤＲは、それぞれ配列番号７、８、３、９、１０、４で示される親ＣＤＲ１α、ＣＤＲ２α、ＣＤＲ３α、ＣＤＲ１β、ＣＤＲ２βまたはＣＤＲ３βの対応するアミノ酸配列を含まない。
【0058】
いくつかの実施形態において、本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体は、本発明のＴＣＲ ＣＤＲのいずれかの機能的部分または配列番号３～１２、２１～２８および４３～５０に記載の本発明のＴＣＲのいずれか一部もしくはフラグメントを含むポリペプチドまたはタンパク質（例えば、１本または複数本のポリペプチド鎖を含む分子）であり得、例えば、機能的部分は、親ＴＣＲ ＣＤＲの約１０％、約２５％、約３０％、約５０％、約６８％、約８０％、約９０％、約９５％、もしくはそれより多くを含むことができる。機能的部分は、変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈに対する抗原特異性を有するか、親ＴＣＲと同様の程度、同じ程度、またはより高い程度に癌を検出、処置、または予防することを意味する。適切な変異体は、本発明のＴ細胞受容体の機能的部分のドメインを含む、例えば、本発明のＴＣＲのα鎖可変領域、本発明のＴＣＲのβ鎖可変領域またはその両方を含む、１本鎖ポリペプチドであり得る。一実施形態において、本明細書に記載の１本鎖ポリペプチドは、生理活性を有する、例えば、変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈに対する抗原特異性を有しエフェクター分子を送達できる、例えば、二重特異性のＴ細胞エンゲージャーとして抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ鎖を送達する、または薬物コンジュゲートとして変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈを有する腫瘍細胞に当該技術分野で既知の癌細胞毒性ペイロードを送達する、可溶性分子の一部として作られ得る。別の実施形態において、本明細書に記載の１本鎖ポリペプチドは、典型的な抗体ｓｃＦｖフラグメントの代わりにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物に挿入でき、そのため本明細書に記載の１本鎖ポリペプチドは、ＣＡＲ構築物のシグナル伝達ドメインと相互作用して、癌細胞に向けての望ましい細胞傷害性活性を引き起こす。シグナル伝達ドメインは、適切な共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ、０Ｘ４０、ＭＹＤ８８、ＩＬ１－Ｒ１、ＣＤ７０）、ならびにＣＡＲ構築物の特徴を強化することを意図した任意の他のドメイン、例えば、ＩＴＡＭドメインを有するＣＤ３ζまたはＣＤ３εセグメントを含む。
【0059】
いくつかの実施形態において、本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体は、例えば、当該技術分野で既知の方法、例えば、ジスルフィド架橋、または重合、またはコンジュゲートにより、グリコシル化される、アミド化される、カルボキシル化される、リン酸化されるように修飾され得る。
【0060】
本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体は、当該技術分野で既知の方法により合成される合成の、組換えの、単離された、および／もしくは精製されたポリペプチド、ならびに／またはタンパク質であり得るか、当該技術分野で既知の標準組換え法を使用して組換え技術で生成できるか、企業により商業的に合成できる。
【0061】
本発明のいくつかの実施形態は、上述の本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体をコードする、それに組み込むまたはそれに関連する核酸、組換えベクター、宿主細胞、細胞の集団および医薬組成物に関する。
【0062】
本発明の実施形態は、本明細書に記載の本発明のＴＣＲ、ＴＣＲ変異体またはそのＣＤＲのいずれかを含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。「核酸」は、本明細書で使用されるように一般的に、１本鎖または２本鎖の、合成されたか、天然源から得られた（例えば、単離されたおよび／または精製された）ものであり得るＤＮＡまたはＲＮＡのポリマーを意味する。本明細書に記載の核酸は、組換え型であり得る。用語「組換え型」は、生存細胞で複製できる核酸分子に天然または合成の核酸セグメントを結合させることにより生存細胞の外側で構築される分子を指す。
【0063】
本発明の一実施形態において、本発明の核酸は、配列番号２９のヌクレオチド配列；配列番号３０のヌクレオチド配列；配列番号３１のヌクレオチド配列；配列番号３２のヌクレオチド配列；配列番号３３のヌクレオチド配列；配列番号３４のヌクレオチド配列に示される、本発明のＴＣＲのＣＤＲのヌクレオチド配列のいずれか１つを含む可能性がある。一実施形態において、核酸は、配列番号２９～３１のすべて；配列番号３２～３４のすべて；配列番号２９～３４のすべてのヌクレオチド配列を含む。本発明の一実施形態において、核酸は、配列番号３５；配列番号３６；または配列番号３５および３６の両方のヌクレオチド配列を含む可能性がある。本発明の一実施形態において、核酸は、配列番号４１、配列番号４２、または配列番号４１および４２の両方のヌクレオチド配列を含む可能性がある。本発明の別の実施形態において、核酸は、ヒト由来の定常領域を有する完全長ＴＣＲをコードでき、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３７および３８の両方のヌクレオチド配列を含む。本発明の別の実施形態において、核酸は、例えば、マウスなどの他の種由来の定常領域を有する完全長ＴＣＲをコードするヌクレオチド配列を含む可能性がある。この点について、核酸は、配列番号３９；配列番号４０；または配列番号３９および４０の両方のヌクレオチド配列を含む可能性がある。
【0064】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明の核酸は、例えば、スキッピング配列またはｍＲＮＡ分子の５’末端以外の部位での翻訳の開始を可能にする配列、例えば、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２ＡもしくはＩＲＥＳ配列；または２つの別個のポリペプチドが１本鎖ｍＲＮＡ、例えば、最小の切断部位Ａｒｇ－Ｘ－Ｘ－Ａｒｇなどを有するフーリン切断配列から翻訳されることを可能にする任意の他の配列などのリンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む可能性がある。切断配列は、本発明のＴＣＲの第１および第２の鎖の間に挟まれており、そのため、第１および第２の鎖は、１本鎖ポリペプチドとして発現され、その後、２つの別個のポリペプチドに切断または翻訳される。別の実施形態において、核酸は、配列番号１３に示されるリンカーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む可能性がある。
【0065】
本発明の一実施形態において、本発明の核酸は、本明細書に記載のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体およびそのＣＤＲのいずれかをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列のコドン最適化は、天然のコドンを、同じアミノ酸をコードするが宿主細胞中でより効率的に翻訳され得る別のコドンに置換することを伴う可能性がある。
【0066】
本発明の一実施形態において、ヌクレオチド配列を含む本発明の核酸は、本明細書に記載のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体およびそのＣＤＲのいずれかをコードする本発明の核酸のいずれかと少なくとも約６０％またはそれより多い、例えば、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％同一である。
【0067】
本発明の一実施形態において、ヌクレオチド配列を含む核酸は、本明細書に記載のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体およびそのＣＤＲのいずれかをコードする本発明の核酸のいずれかのヌクレオチド配列と相補的である。
【0068】
本発明の核酸は、組換え発現ベクター中に組み込まれ得る。本発明の組換え発現ベクターは本明細書において、本明細書に記載のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体およびそのＣＤＲのいずれかをコードする核酸のいずれかを含む。本発明の組換え発現ベクターは、合成されたか一部が天然源から得られた、１本鎖または２本鎖であり得、かつ天然の、非天然の、または変更されたヌクレオチドを含有できるＤＮＡおよびＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）を含むがこれらに限定されない任意の種類の核酸を含むことができる。本発明の組換え発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得、プラスミドまたはウイルスを含むがこれらに限定されない任意の適切な宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするために使用できる。ウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクター（モロニーマウス白血病ウイルス由来）、レンチウイルスベクター（ヒト免疫不全Ｉ型ウイルス（ＨＩＶ）由来）を含むがこれらに限定されない。組換え発現ベクターは、宿主細胞の種類に特異的である転写および翻訳の開始および終止コドンなどの、調節配列を含む。組換え発現ベクターは、一過性発現、安定な発現のいずれか、またはその両方のために設計され得る。また、組換え発現ベクターは、恒常的発現のため、または誘導的発現のために作られてよい。一態様において、本発明のＴＣＲ遺伝子を含む上記組換え発現ベクターは、当該技術分野における従来の組換え技術で生成できる。
【0069】
いくつかの実施形態において、組換え発現ベクターは、本明細書に記載の本発明のＴＣＲ、ＴＣＲ変異体およびそのＣＤＲのアミノ酸配列に加えて、他の機能性分子をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、他の機能性分子は、インビボでのＴ細胞の追跡のための蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰタンパク質など）である。別の実施形態において、組換え発現ベクターは、養子Ｔ細胞療法の安全性を改善するために自殺遺伝子を含む。自殺遺伝子は、養子移植された細胞の選択的破壊を可能にする遺伝的にコードされた分子である（Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２０１４；５（２５４）：１－２２）。自殺遺伝子でコードされる分子は、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ガンシクロビル、シトシンデアミナーゼ、５－フルオロシトシン、５－フルオロウラシル、誘導性ＦＡＳ、誘導性カスパーゼ９、トランケートされたＣＤ２０、ＥＧＦＲ、ｃ－ｍｙｃまたはＲＱＲ８を含む。自殺遺伝子をコードするヌクレオチド配列および本発明のＴＣＲをコードするヌクレオチド配列は、異なるプロモーターにより；または同じプロモーターにより独立して制御されるが、ＴＣＲ遺伝子および自殺遺伝子は、上述の自己切断リンカーペプチドと接続される。
【0070】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ変異体、および他の機能性分子を含む本発明のＴＣＲの発現は、２つの異なるプロモーターにより駆動され得る。プロモーターは、強力なプロモーター、弱いプロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または分化特異的プロモーターを含む。プロモーターは、ＰＧＫ１プロモーター、ＥＦ－１ａプロモーター、ＣＭＶ最初期エンハンサーおよびプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、Ｕｂｃプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＴＲＥプロモーター、ＣａｍＫＩＩａプロモーター、ヒトベータアクチンプロモーターなどのウイルス源または非ウイルス源（例えば、真核生物プロモーター）由来であり得る。いくつかの実施形態において、２つのプロモーターが２つの遺伝子を駆動する場合、デュアルプロモーターは、反対方向または同じ方向に配置される。
【0071】
本発明の実施形態はさらに、本明細書に記載の本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体、ポリペプチド、タンパク質、または核酸のいずれかを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、真核細胞、例えば、動物細胞であり得るか、原核細胞、例えば、細菌細胞であり得る。宿主細胞は、培養細胞または例えば、生物、例えば、ヒトから直接単離された初代細胞であり得る。宿主細胞は本明細書において、遺伝子ベクター（例えば、大腸菌（E. coli））を増幅するため、または組換えＴＣＲポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ＶＥＲＯ、ＣＯＳ、またはＨＥＫ２９３）を生成するために使用できる。最も好ましくは、宿主細胞は、例えば、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などのヒト細胞である。より好ましくは、宿主細胞は、Ｔ細胞である。
【0072】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＴ細胞は、初代Ｔ細胞、Ｔ細胞株由来のＴ細胞、またはＴ細胞前駆体もしくは幹細胞（例えば、造血性幹細胞または人工多能性幹細胞）から分化されるＴ細胞を含む任意のＴ細胞であり得る。Ｔ細胞は、例えば、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、もしくは腫瘍組織または体液を含む多種多様の資源から得ることができる。Ｔ細胞は本明細書において、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、アルファ／ベータＴ細胞、ガンマ／デルタＴ細胞、ＮＫＴ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞などを含むＴ細胞の任意の種類であり得る。
【0073】
哺乳動物細胞のインビトロ培養の通常の方法にしたがって、Ｔ細胞は、培養され、適切な培養条件下で増殖される。例えば、細胞は、それらが７０％を超えるコンフルエンスに到達すると継代でき、培地は通常、２～３日で新鮮な培地に入れ替えられる。細胞が一定の数に達すると、直接使用するか、または当該技術分野のプロトコルにしたがって凍結する。インビトロ培養時間は、２４時間内であり得るか、１４日以上である可能性がある。凍結された細胞は、解凍後に次のステップで使用できる。
【0074】
一実施形態において、Ｔ細胞は、数時間～１４日間、またはその間の任意の時間の間インビトロで培養できる。Ｔ細胞の培養条件は、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α－ＭＥＭ（a-MEM）、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５およびＸ－Ｖｉｖｏを含むがこれらに限定されない基本培地の使用を含む。細胞生存および増殖に必要とされる他の条件は、血清（ヒトまたはウシ胎児血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＧＦ－ベータおよびＴＮＦ－ａ、他の培養添加物（アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ビタミンＣ、２－メルカプトエタノール、成長ホルモン、成長因子を含む）の使用を含むがこれらに限定されない。Ｔ細胞は、適切な培養条件、例えば、温度が３７℃、３２℃、３０℃、または室温であり得、空気条件が、例えば、５％ＣＯ２を含有する空気であり得る条件に置くことができる。
【0075】
任意のポリペプチド、タンパク質、核酸および組換え発現ベクターを含む本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体、ならびに本明細書に記載の宿主細胞は、医薬組成物などの組成物に配合できる。一実施形態において、本発明は、変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈに対する抗原特異性を有する本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、任意のポリペプチド、タンパク質、核酸および組換え発現ベクターを含む本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体と、本明細書に記載の宿主細胞とを、化学療法剤、免疫調節剤（例えば、免疫チェックポイント阻害剤、サイトカインなど）などの別の薬学的に活性がある薬剤または薬物、または治療用抗体またはワクチンなどの他の薬剤と組み合わせて含むことができる。
【0076】
医薬組成物を調製するための方法は、当該技術分野において既知である。薬学的に許容される担体は、使用の条件下で有害な副作用または毒性がないものであることが好ましい。当該分野の技術担当者は、本発明の治療薬が、薬学的または生理学的媒体、賦形剤、希釈剤（生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水を含む）を含む創薬可能な賦形剤および添加物も含む可能性があることを理解できる；添加物は、炭水化物、脂質、ペプチド、アミノ酸、抗酸化剤、アジュバント、保存剤および当該分野で既知の他のものを含む。
【0077】
本発明の医薬組成物は、配合され、以下の経路：動脈内、静脈内、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ内、脊髄内、脳脊髄内、骨髄内、筋肉内または腹腔内の投与、を通じて提供できる。
【0078】
一実施形態において、対象（例えば、ヒト）に投与される本明細書に記載の本発明の医薬組成物（例えば、ＴＣＲもしくはＴＣＲ変異体、ポリペプチド、またはタンパク質、核酸、組換え発現ベクター、宿主細胞、細胞の集団）の量または投与量は、合理的な時間枠にわたって対象において、例えば、治療的または予防的応答といった影響を及ぼすのに十分であるはずである。用量は、本明細書に記載の特定の本発明の医薬組成物の有効性、および対象の状態、例えば、処置される対象の体重によって決定される。本発明の医薬組成物の投与量は、特定の本発明の医薬組成物の投与に付随する可能性がある任意の有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。典型的に、担当医師は、年齢、体重、全身健康状態、食事、性別、投与される本発明の医薬組成物、投与経路、および処置されている癌の重症度などの多種多様の要因を考慮して、個々の患者をそれぞれ処置するための本発明のＴＣＲ医薬組成物の投与量を決定する。一実施形態において、本発明の医薬組成物は、細胞の集団（例えば、本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体を含むＴ細胞）であり、１回の注入で投与される細胞の数は、例えば、約１×１０６～約１×１０１２個の細胞またはそれより多くで変わる可能性がある。ある特定の実施形態において、１×１０６個の細胞より少ない数を投与できる。
【0079】
一実施形態において、任意のポリペプチド、タンパク質、核酸および組換え発現ベクターを含む本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体、本明細書に記載の宿主細胞および医薬組成物は、癌を処置または予防する方法で使用できる。この点について、本発明は、哺乳動物における癌を処置または予防するのに有効な量で、任意のポリペプチド、タンパク質、核酸および組換え発現ベクターを含む本発明のＴＣＲまたはＴＣＲ変異体、本明細書に記載の宿主細胞および医薬組成物のいずれかを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌を処置または予防する方法を提供する。
【0080】
本明細書に記載の腫瘍および／または癌は、例えば、乳癌、頭頸部癌、膠芽腫、滑膜肉腫、腎臓癌、肉腫、黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、神経内分泌腫瘍、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管細胞癌、膀胱癌、尿道癌、神経膠腫、神経芽腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨腫瘍、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明の癌、カルチノイド腫瘍、間葉系腫瘍、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部肉腫、網膜芽細胞腫、腸腫瘍、胃癌／胃癌（stomach/gastric cancer）、胸腺癌腫、妊娠性絨毛性腫瘍、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓肉腫、髄膜癌腫瘍、原発性腹膜癌および悪性胸膜中皮腫を含む。
【0081】
一実施形態において、癌は、変異されたｐ５３を発現する癌である。癌は、１７５位で変異を有する、より好ましくは、変異されたｐ５３Ｒ１７５Ｈを有するｐ５３を発現する。別の実施形態において、本発明のＴＣＲでの処置に供されるヒトのＨＬＡ－Ｉ型は、ＨＬＡ－Ａ２ホモ接合性またはヘテロ接合性である。より好ましくは、処置される対象のＨＬＡ－Ｉ型は、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１である。
【0082】
本明細書における実施形態では、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、ある特定の実施形態において、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」で置き換えることができる。
【0083】
実施例
以下の実施例は、本発明をさらに説明するものであるが、もちろん、いかなる方法であってもその範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。特に明示しない限り、以下の実施例で使用される実験方法は、当該技術分野の技術担当者によって理解され、日常的に実行されている実験手順、操作、材料、および条件を使用して実行される。例えば、組換えプラスミドおよびウイルスベクター、またはポリペプチドおよびタンパク質は、標準組換え法（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１２）を使用する本明細書に記載の核酸を使用して組換え技術により生成できる。
以下の実施例は、本発明をさらに説明するものであるが、もちろん、いかなる方法であってもその範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。特に明示しない限り、以下の実施例で使用される実験方法は、当該技術分野の技術担当者によって理解され、日常的に実行されている実験手順、操作、材料、および条件を使用して実行される。例えば、組換えプラスミドおよびウイルスベクター、またはポリペプチドおよびタンパク質は、標準組換え法（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１２）を使用する本明細書に記載の核酸を使用して組換え技術により生成できる。
【0084】
実施例１～５に記載の実験では、以下の材料および方法を使用した。
【0085】
材料と方法
１．細胞株：
レンチウイルス粒子を調製するために使用した細胞株は、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）である。抗原提示細胞株は、１７４ｘＣＥＭ．Ｔ２細胞（Ｔ２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９９２）である。外来性ＴＣＲ遺伝子発現および機能分析のための細胞株は、Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５（ＪＲＴ細胞、ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５３）である。標的細胞として使用された腫瘍細胞株は、ヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ２６（ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ１１８７）、ヒト子宮腺癌細胞株ＫＬＥ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６２２）、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－７７）、ヒト子宮平滑筋肉腫細胞株ＳＫＵＴ１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１１４）、およびヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４３）を含む。外来性ＨＬＡ－Ａ２を安定に発現するＳＫＯＶ３、ＳＫＵＴ１－Ａ２、２９３Ｔ－Ａ２およびＫ５６２－Ａ２細胞株を、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１をコードする組換えレンチウイルスベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣＤ８１１Ａ－Ａ２）を有するこれらの細胞株をトランスフェクトすることにより生成した。ＳＫＵＴ１－Ａ２ＢＭ細胞株を、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１およびベータ－２マクログロブリン（ＣＤ８１１Ａ－Ａ２ＢＭ）の両方をコードするレンチウイルスベクターでＳＫＵＴ１細胞をトランスフェクトすることにより生成した。２９３Ｔ－Ａ２－ｍｐ５３およびＫ５６２－Ａ２－ｍｐ５３細胞株を、変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈタンパク質（配列番号１９）をコードする組換えｐＣＤＮＡ３．３プラスミド（サーモフィッシャーＫ８３０００１）で２９３Ｔ－Ａ２およびＫ５６２－Ａ２細胞をトランスフェクトすることにより生成した。
１．細胞株：
レンチウイルス粒子を調製するために使用した細胞株は、２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）である。抗原提示細胞株は、１７４ｘＣＥＭ．Ｔ２細胞（Ｔ２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１９９２）である。外来性ＴＣＲ遺伝子発現および機能分析のための細胞株は、Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５（ＪＲＴ細胞、ＡＴＣＣ ＴＩＢ－１５３）である。標的細胞として使用された腫瘍細胞株は、ヒト骨髄腫細胞株ＫＭＳ２６（ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ１１８７）、ヒト子宮腺癌細胞株ＫＬＥ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１６２２）、ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－７７）、ヒト子宮平滑筋肉腫細胞株ＳＫＵＴ１（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１１４）、およびヒト骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２４３）を含む。外来性ＨＬＡ－Ａ２を安定に発現するＳＫＯＶ３、ＳＫＵＴ１－Ａ２、２９３Ｔ－Ａ２およびＫ５６２－Ａ２細胞株を、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１をコードする組換えレンチウイルスベクター（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＣＤ８１１Ａ－Ａ２）を有するこれらの細胞株をトランスフェクトすることにより生成した。ＳＫＵＴ１－Ａ２ＢＭ細胞株を、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１およびベータ－２マクログロブリン（ＣＤ８１１Ａ－Ａ２ＢＭ）の両方をコードするレンチウイルスベクターでＳＫＵＴ１細胞をトランスフェクトすることにより生成した。２９３Ｔ－Ａ２－ｍｐ５３およびＫ５６２－Ａ２－ｍｐ５３細胞株を、変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈタンパク質（配列番号１９）をコードする組換えｐＣＤＮＡ３．３プラスミド（サーモフィッシャーＫ８３０００１）で２９３Ｔ－Ａ２およびＫ５６２－Ａ２細胞をトランスフェクトすることにより生成した。
【0086】
２．細胞培養培地：
ＫＬＥ、ＳＫＵＴ１、２９３Ｔおよびそれらの形質導入細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミンが補充された高グルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＶＷＲ ｃａｔ＃ＶＷＲＬ０１０１－０５００）で培養した。他の細胞株を、ウシ胎児血清（ＡＴＣＣ ３０－２０２０）、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン酸、１×必須アミノ酸５０倍濃縮（インビトロジェン１１１３０－０５１）、１×ストレプトマイシン／ペニシリン１００倍濃縮（インビトロジェン１５１４０－１２２）、１×ピルビン酸ナトリウム１００倍濃縮（インビトロジェン１１３６０－０７０）、および１×２－メルカプトエタノール１０００倍濃縮（サーモフィッシャー２１９８５０２３）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０完全培地（ロンザ、ｃａｔ＃１２－１１５Ｆ）で培養する。
ＫＬＥ、ＳＫＵＴ１、２９３Ｔおよびそれらの形質導入細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミンが補充された高グルコースを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＶＷＲ ｃａｔ＃ＶＷＲＬ０１０１－０５００）で培養した。他の細胞株を、ウシ胎児血清（ＡＴＣＣ ３０－２０２０）、２ｍｍｏｌ／Ｌ Ｌ－グルタミン酸、１×必須アミノ酸５０倍濃縮（インビトロジェン１１１３０－０５１）、１×ストレプトマイシン／ペニシリン１００倍濃縮（インビトロジェン１５１４０－１２２）、１×ピルビン酸ナトリウム１００倍濃縮（インビトロジェン１１３６０－０７０）、および１×２－メルカプトエタノール１０００倍濃縮（サーモフィッシャー２１９８５０２３）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０完全培地（ロンザ、ｃａｔ＃１２－１１５Ｆ）で培養する。
【0087】
３．末梢血：
健康なドナーのヒト末梢血製剤を、スタンフォード血液センターから購入した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、メーカーの説明書にしたがって、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ密度勾配溶液（ＧＥヘルスケアｃａｔ＃１７１４４００２）を用いるフェレーシス（ＬＲＳチャンバ）を介して残留白血球から生成した。ＰＢＭＣを、新鮮なまま使用するか、５０％ＦＣＳ血清および１０％ＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ培地中で凍結保存し、－８０℃で穏やかに、または－１９６℃で保管した。
健康なドナーのヒト末梢血製剤を、スタンフォード血液センターから購入した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、メーカーの説明書にしたがって、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ密度勾配溶液（ＧＥヘルスケアｃａｔ＃１７１４４００２）を用いるフェレーシス（ＬＲＳチャンバ）を介して残留白血球から生成した。ＰＢＭＣを、新鮮なまま使用するか、５０％ＦＣＳ血清および１０％ＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ培地中で凍結保存し、－８０℃で穏やかに、または－１９６℃で保管した。
【0088】
４．ＴＣＲ抗原特異性機能を試験するための標的細胞の調製：
ＳＫＯＶ３－Ａ２、ＳＫＵＴ１－Ａ２、２９３Ｔ－Ａ２およびＫ５６２－Ａ２細胞を、メーカーの説明書にしたがって、リポフェクタミン３０００（サーモフィッシャーＬ３００００１５）を用いてＨＬＡ－Ａ＊０２０１のためのｃＤＮＡをコードする組換えレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより生成した。レンチウイルスベクター中のＨＬＡ－Ａ＊０２０１配列を、配列決定により検証した。細胞を、抗ＨＬＡ－Ａ２－ＰＥ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＢＢ７．２、ｃａｔ＃３４３３０５）で染色し、ＳＨ８００Ｓセルソーター（ソニーバイオテクノロジー）でソートした。完全長の変異ｐ５３Ｒ１７５ＨをコードするｃＤＮＡを、メーカー推奨のプロトコルにしたがって、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素ＲＴ－ＰＣＲキット（サーモフィッシャーｃａｔ＃１８０６４０１４）を用いてＫＭＳ２６細胞から生成しｐＣＤＮＡ３．３ベクター（ｐＣＤＮＡ３．３－ｍｐ５３）中にクローン化した。ｐ５３Ｒ１７５Ｈを、配列決定により検証した。２９３Ｔ－Ａ２およびＫ５６２－Ａ２細胞を、ｐＣＤＮＡ３．３－ｍｐ５３でトランスフェクトして、外来性ｐ５３Ｒ１７５Ｈを一時的に発現させた。Ｔ２＋ｍｔ－ｐ５３ペプチドは、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（配列番号１）でパルスされたＴ細胞であった。
ＳＫＯＶ３－Ａ２、ＳＫＵＴ１－Ａ２、２９３Ｔ－Ａ２およびＫ５６２－Ａ２細胞を、メーカーの説明書にしたがって、リポフェクタミン３０００（サーモフィッシャーＬ３００００１５）を用いてＨＬＡ－Ａ＊０２０１のためのｃＤＮＡをコードする組換えレンチウイルスベクターをトランスフェクトすることにより生成した。レンチウイルスベクター中のＨＬＡ－Ａ＊０２０１配列を、配列決定により検証した。細胞を、抗ＨＬＡ－Ａ２－ＰＥ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＢＢ７．２、ｃａｔ＃３４３３０５）で染色し、ＳＨ８００Ｓセルソーター（ソニーバイオテクノロジー）でソートした。完全長の変異ｐ５３Ｒ１７５ＨをコードするｃＤＮＡを、メーカー推奨のプロトコルにしたがって、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素ＲＴ－ＰＣＲキット（サーモフィッシャーｃａｔ＃１８０６４０１４）を用いてＫＭＳ２６細胞から生成しｐＣＤＮＡ３．３ベクター（ｐＣＤＮＡ３．３－ｍｐ５３）中にクローン化した。ｐ５３Ｒ１７５Ｈを、配列決定により検証した。２９３Ｔ－Ａ２およびＫ５６２－Ａ２細胞を、ｐＣＤＮＡ３．３－ｍｐ５３でトランスフェクトして、外来性ｐ５３Ｒ１７５Ｈを一時的に発現させた。Ｔ２＋ｍｔ－ｐ５３ペプチドは、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（配列番号１）でパルスされたＴ細胞であった。
【0089】
５．ペプチド：
変異ｐ５３Ｒ１７５ＨペプチドＨＭＴＥＶＶＲＨＣ（配列番号１）および野生型ｐ５３Ｒ１７５ペプチドＨＭＴＥＶＶＲＲＣ（配列番号２０）を、ペプチド２．０（ｐｅｐｔｉｄｅ２．ｃｏｍ）により合成した。ペプチドは、分析用高速液体クロマトグラフィおよび質量分析により示されるように、純度が＞９５％であった。ペプチドを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水に溶解し、使用するまで－８０℃で保管した。
変異ｐ５３Ｒ１７５ＨペプチドＨＭＴＥＶＶＲＨＣ（配列番号１）および野生型ｐ５３Ｒ１７５ペプチドＨＭＴＥＶＶＲＲＣ（配列番号２０）を、ペプチド２．０（ｐｅｐｔｉｄｅ２．ｃｏｍ）により合成した。ペプチドは、分析用高速液体クロマトグラフィおよび質量分析により示されるように、純度が＞９５％であった。ペプチドを１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水に溶解し、使用するまで－８０℃で保管した。
【0090】
６．インビトロでのｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬの誘導：
ＰＢＭＣを、メーカーの説明書にしたがって、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ（シグマ－アルドリッチｃａｔ＃ＧＥ－１７－５４４２－０２）を用いて末梢血から精製した。ＰＢＭＣ調製物の一部を、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３４３３０３）で染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザー１０（ミルテニーバイオテク）により分析した。ＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣを使用して、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬを生成した。最初に、樹状細胞を、当該技術分野のプロトコルにしたがって生成した。簡潔に言うと、ＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣ由来のプラスチック接着細胞を、１，０００単位／ｍＬの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃３００－０３）および５００単位／ｍＬのヒトＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃２００－０４）が補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地で７日間培養し、未熟な樹状細胞をその後、１０ｎｇ／ｍｌでヒトＴＮＦ－アルファ（サーモフィッシャーｃａｔ＃ＰＨＣ３０１５）を用いて４８時間刺激した。１ウェルあたり１０５個の成熟樹状細胞および２×１０６個の自己由来ＰＢＭＣを、終濃度５ｕｇ／ｍｌで２４ウェルプレート中にてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドと共培養した。１００ｕ／ｍｌのヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃２００－０７）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃２００－１５）および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃２００－２１）を、５％ＣＯ２および３７℃でのインキュベーションの１６～２４時間後に培養物に添加した。培地の半分を、３日ごとに上述のサイトカインカクテルを含有する新しい培地と交換した。１０～１４日目に、ＣＤ８＋細胞を、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニーバイオテクｃａｔ＃１３０－０９６－４９５）を使用して濃縮し、ペプチド抗原を用いて再刺激した。簡潔に言うと、１０６個の精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を、マイトマイシンＣ（サンタクルーズバイオテクノロジーｃａｔ＃ｓｃ－３５１４）を用いて２５μｇ／ｍｌで２時間、５％ＣＯ２および３７℃のインキュベーションで前処理された２×１０６個のＨＬＡ－Ａ２＋自己由来ＰＢＭＣと共培養した。１ｕｇ／ｍｌのｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドおよび上述のサイトカインカクテルを、第１の抗原刺激として手順にしたがい培養物に添加した。抗原刺激の２サイクル後に、増殖したＴ細胞を、分析およびＴ細胞クローンの作成のために回収した。
ＰＢＭＣを、メーカーの説明書にしたがって、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｒｅｍｉｕｍ（シグマ－アルドリッチｃａｔ＃ＧＥ－１７－５４４２－０２）を用いて末梢血から精製した。ＰＢＭＣ調製物の一部を、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３４３３０３）で染色し、ＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザー１０（ミルテニーバイオテク）により分析した。ＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣを使用して、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬを生成した。最初に、樹状細胞を、当該技術分野のプロトコルにしたがって生成した。簡潔に言うと、ＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣ由来のプラスチック接着細胞を、１，０００単位／ｍＬの組換えヒトＧＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃３００－０３）および５００単位／ｍＬのヒトＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃２００－０４）が補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地で７日間培養し、未熟な樹状細胞をその後、１０ｎｇ／ｍｌでヒトＴＮＦ－アルファ（サーモフィッシャーｃａｔ＃ＰＨＣ３０１５）を用いて４８時間刺激した。１ウェルあたり１０５個の成熟樹状細胞および２×１０６個の自己由来ＰＢＭＣを、終濃度５ｕｇ／ｍｌで２４ウェルプレート中にてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドと共培養した。１００ｕ／ｍｌのヒトＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃２００－０２）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃２００－０７）、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃２００－１５）および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ ｃａｔ＃２００－２１）を、５％ＣＯ２および３７℃でのインキュベーションの１６～２４時間後に培養物に添加した。培地の半分を、３日ごとに上述のサイトカインカクテルを含有する新しい培地と交換した。１０～１４日目に、ＣＤ８＋細胞を、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニーバイオテクｃａｔ＃１３０－０９６－４９５）を使用して濃縮し、ペプチド抗原を用いて再刺激した。簡潔に言うと、１０６個の精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を、マイトマイシンＣ（サンタクルーズバイオテクノロジーｃａｔ＃ｓｃ－３５１４）を用いて２５μｇ／ｍｌで２時間、５％ＣＯ２および３７℃のインキュベーションで前処理された２×１０６個のＨＬＡ－Ａ２＋自己由来ＰＢＭＣと共培養した。１ｕｇ／ｍｌのｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドおよび上述のサイトカインカクテルを、第１の抗原刺激として手順にしたがい培養物に添加した。抗原刺激の２サイクル後に、増殖したＴ細胞を、分析およびＴ細胞クローンの作成のために回収した。
【0091】
７．ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬクローンの作成
ｐ５３Ｒ１７５Ｈ特異的ＣＴＬクローンを分析し単離するため、ＰＥで標識されたｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体を、メーカーの説明書にしたがいｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（配列番号１）およびＦｌｅｘ－Ｔ（商標）ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１モノマー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃２８０００３）を使用して生成した。Ｔ細胞を、回収し、ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３００９１２）で標識された抗ヒトＣＤ８抗体１ｕｌおよびＰＥで標識されたｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体１ｕｌを含有するＤＰＢＳ緩衝液５０ｕｌに懸濁した。４℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞をフローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザー１０）により分析し、データをＦｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｆｌｏｗｊｏ、ＬＬＣ）により分析した。Ｔ細胞クローンを、ＦＡＣＳソーターを用いてシングルセルソーティングを行うことにより生成した。ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬを、抗ＣＤ８－ＡＰＣおよびｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体－ＰＥで染色し、１％ＦＢＳを有するＤＰＢＳ４００ｕｌに再懸濁し、シングルセルソーティングを、メーカーの説明書にしたがいソニーＳＨ８００セルソーターで実行した。細胞を、４℃で一晩２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＯＫＴ３ ｃａｔ＃３１７３０３）および２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３０２９１４）で前処理した９６ウェルＵ底プレートにソートした。２５μｇ／ｍｌでマイトマイシンＣ（Ｃａｙｍａｎ、ｃａｔ＃１１４３５）を用いて２時間前処理されたＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣを、フィーダー細胞として使用した。ソートしたシングルセルを、１００ｕ／ｍｌのＩＬ－２、５ｕｇ／ｍｌのＩＬ－７、１５および２１が補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中でフィーダー細胞（１ウェルあたり１０４個のフィーダー細胞）と共培養した。培地の半分を、Ｔ細胞がＣＤ８抗体およびｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体を用いて分析されＴＣＲ遺伝子を単離するのに十分な数に増殖するまで、３日ごとに上述のサイトカインカクテルを含有する新しい培地と交換した。
ｐ５３Ｒ１７５Ｈ特異的ＣＴＬクローンを分析し単離するため、ＰＥで標識されたｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体を、メーカーの説明書にしたがいｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（配列番号１）およびＦｌｅｘ－Ｔ（商標）ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１モノマー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃２８０００３）を使用して生成した。Ｔ細胞を、回収し、ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３００９１２）で標識された抗ヒトＣＤ８抗体１ｕｌおよびＰＥで標識されたｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体１ｕｌを含有するＤＰＢＳ緩衝液５０ｕｌに懸濁した。４℃で３０分間のインキュベーションの後、細胞をフローサイトメトリー（ＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザー１０）により分析し、データをＦｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｆｌｏｗｊｏ、ＬＬＣ）により分析した。Ｔ細胞クローンを、ＦＡＣＳソーターを用いてシングルセルソーティングを行うことにより生成した。ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬを、抗ＣＤ８－ＡＰＣおよびｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体－ＰＥで染色し、１％ＦＢＳを有するＤＰＢＳ４００ｕｌに再懸濁し、シングルセルソーティングを、メーカーの説明書にしたがいソニーＳＨ８００セルソーターで実行した。細胞を、４℃で一晩２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＯＫＴ３ ｃａｔ＃３１７３０３）および２ｕｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３０２９１４）で前処理した９６ウェルＵ底プレートにソートした。２５μｇ／ｍｌでマイトマイシンＣ（Ｃａｙｍａｎ、ｃａｔ＃１１４３５）を用いて２時間前処理されたＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣを、フィーダー細胞として使用した。ソートしたシングルセルを、１００ｕ／ｍｌのＩＬ－２、５ｕｇ／ｍｌのＩＬ－７、１５および２１が補充された完全ＲＰＭＩ１６４０培地中でフィーダー細胞（１ウェルあたり１０４個のフィーダー細胞）と共培養した。培地の半分を、Ｔ細胞がＣＤ８抗体およびｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体を用いて分析されＴＣＲ遺伝子を単離するのに十分な数に増殖するまで、３日ごとに上述のサイトカインカクテルを含有する新しい培地と交換した。
【0092】
８．ＴＣＲ遺伝子のクローニング：
全ＲＮＡを、メーカーの説明書にしたがって、Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃａｔ＃Ｒ１０５０）を用いてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬクローンから精製した。ｃＤＮＡを、Ｓｍａｒｔｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’キット（タカラバイオｃａｔ＃６３４８５８）を用いるＲＴ－ＰＣＲを通じて生成した。キットにより提供された５’－ＣＤＳプライマーおよびＴＣＲベータ鎖３’プライマー５’－ＧＧＣ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＣＣ ＴＴＧ ＣＴＧ Ｇ－３’（配列番号１４）またはＴＣＲアルファ鎖３’プライマー５’－ＣＴＴ ＴＴＣ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＧＣ ＴＴＧ ＡＣＡ ＴＣＡ－３’（配列番号１５）を使用して、メーカーの説明書にしたがいＱ５ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボｃａｔ＃Ｍ０４９１）を用いてＰＣＲを実行した。ＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖の得られたＰＣＲ産物を、精製し、Ｓｍａｒｔｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’キットにより提供されたｐＲＡＣＥベクターにライゲートした。プラスミドを、ＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖のライゲーション物で形質転換されたＳｔｅｌｌａｒコンピテントセル（タカラバイオ、ｃａｔ＃６３４８５８）から精製した。プラスミド上のインサートの遺伝子配列決定を実行して、ＴＣＲＶ－アルファおよびＶ－ベータの配列を得た。
全ＲＮＡを、メーカーの説明書にしたがって、Ｚｙｍｏ Ｑｕｉｃｋ－ＲＮＡ Ｍｉｃｒｏｐｒｅｐキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃａｔ＃Ｒ１０５０）を用いてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬクローンから精製した。ｃＤＮＡを、Ｓｍａｒｔｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’キット（タカラバイオｃａｔ＃６３４８５８）を用いるＲＴ－ＰＣＲを通じて生成した。キットにより提供された５’－ＣＤＳプライマーおよびＴＣＲベータ鎖３’プライマー５’－ＧＧＣ ＡＧＡ ＣＡＧ ＧＡＣ ＣＣＣ ＴＴＧ ＣＴＧ Ｇ－３’（配列番号１４）またはＴＣＲアルファ鎖３’プライマー５’－ＣＴＴ ＴＴＣ ＴＣＧ ＡＣＣ ＡＧＣ ＴＴＧ ＡＣＡ ＴＣＡ－３’（配列番号１５）を使用して、メーカーの説明書にしたがいＱ５ハイフィデリティＤＮＡポリメラーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボｃａｔ＃Ｍ０４９１）を用いてＰＣＲを実行した。ＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖の得られたＰＣＲ産物を、精製し、Ｓｍａｒｔｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’キットにより提供されたｐＲＡＣＥベクターにライゲートした。プラスミドを、ＴＣＲアルファ鎖およびベータ鎖のライゲーション物で形質転換されたＳｔｅｌｌａｒコンピテントセル（タカラバイオ、ｃａｔ＃６３４８５８）から精製した。プラスミド上のインサートの遺伝子配列決定を実行して、ＴＣＲＶ－アルファおよびＶ－ベータの配列を得た。
【0093】
９．組換えＴＣＲレンチウイルスベクターの調製：
本発明のＴＣＲ遺伝子を、複製欠損性レンチウイルスベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－ＰＧＫ－ＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｃａｔ＃ＣＤ８１１Ａ－１）中にクローン化した。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０におけるｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドに特異的な本発明のＴＣＲのＴＣＲ－アルファのＶ－Ｊ領域の配列およびＴＣＲ－ベータのＶ－Ｄ－Ｊ領域を、各ｐ５３Ｒ１７５Ｈ特異的ＣＴＬクローンから生成されたＴＣＲＶ－アルファおよびＶ－ベータの配列にしたがい決定した。マウスＴＣＲ－アルファ定常鎖およびマウスＴＣＲ－ベータ定常鎖の配列を、参照配列にしたがって決定した（それぞれジェンバンクＫＵ２５４５６２およびＥＦ１５４５１４．１）。ＴＣＲ Ｖβ鎖（配列番号３６）を含むヌクレオイド配列を有する核酸、マウスＴＣＲ－ベータ定常鎖（配列番号２７）、ＴＣＲ Ｖα鎖（配列番号３５）をコードする核酸、マウスＴＣＲ－アルファ定常鎖（配列番号２８）をコードする核酸ならびにＴＣＲアルファとベータ鎖の間のフーリン酵素切断ペプチドおよびＦ２Ａペプチド（配列番号１３）をコードするリンカー核酸を、合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。合成された核酸（配列番号１６）を、メーカーの説明書にしたがって、レンチウイルスベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－ＰＧＫ－ＧＦＰのＥＦ－１αプロモーターの下流でマルチクローニングサイト中にクローン化した。ＧＦＰの発現を駆動するＰＧＫプロモーターは、逆向きである。発現カセットのヌクレオチド配列を、配列番号１７に示す。ｐ５３Ｒ１７５Ｈエピトープに特異的なＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターを、ｐＣＤＨ－ｐ５３として示す。挿入された核酸を配列決定し、エラーや変異は認められない。レンチウイルスベクタープラスミドを、ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細菌（タカラバイオｃａｔ＃６３６７６３）中に形質転換して、レンチウイルス粒子を作るためのプラスミドストックを調製した。
本発明のＴＣＲ遺伝子を、複製欠損性レンチウイルスベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－ＰＧＫ－ＧＦＰ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ｃａｔ＃ＣＤ８１１Ａ－１）中にクローン化した。ＨＬＡ－Ａ＊０２：０におけるｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドに特異的な本発明のＴＣＲのＴＣＲ－アルファのＶ－Ｊ領域の配列およびＴＣＲ－ベータのＶ－Ｄ－Ｊ領域を、各ｐ５３Ｒ１７５Ｈ特異的ＣＴＬクローンから生成されたＴＣＲＶ－アルファおよびＶ－ベータの配列にしたがい決定した。マウスＴＣＲ－アルファ定常鎖およびマウスＴＣＲ－ベータ定常鎖の配列を、参照配列にしたがって決定した（それぞれジェンバンクＫＵ２５４５６２およびＥＦ１５４５１４．１）。ＴＣＲ Ｖβ鎖（配列番号３６）を含むヌクレオイド配列を有する核酸、マウスＴＣＲ－ベータ定常鎖（配列番号２７）、ＴＣＲ Ｖα鎖（配列番号３５）をコードする核酸、マウスＴＣＲ－アルファ定常鎖（配列番号２８）をコードする核酸ならびにＴＣＲアルファとベータ鎖の間のフーリン酵素切断ペプチドおよびＦ２Ａペプチド（配列番号１３）をコードするリンカー核酸を、合成した（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。合成された核酸（配列番号１６）を、メーカーの説明書にしたがって、レンチウイルスベクターｐＣＤＨ－ＥＦ１α－ＭＣＳ－ＰＧＫ－ＧＦＰのＥＦ－１αプロモーターの下流でマルチクローニングサイト中にクローン化した。ＧＦＰの発現を駆動するＰＧＫプロモーターは、逆向きである。発現カセットのヌクレオチド配列を、配列番号１７に示す。ｐ５３Ｒ１７５Ｈエピトープに特異的なＴＣＲを発現するレンチウイルスベクターを、ｐＣＤＨ－ｐ５３として示す。挿入された核酸を配列決定し、エラーや変異は認められない。レンチウイルスベクタープラスミドを、ｓｔｅｌｌａｒコンピテント細菌（タカラバイオｃａｔ＃６３６７６３）中に形質転換して、レンチウイルス粒子を作るためのプラスミドストックを調製した。
【0094】
１０．組換えＴＣＲレンチウイルス粒子の調製：
ＴＣＲレンチウイルス粒子を、レンチウイルスベクターｐＣＤＨ－ｐ５３でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から生成した。簡潔に言うと、６ウェルプレートで増殖した２９３Ｔ細胞を、メーカーの説明書にしたがってリポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（インビトロジェンｃａｔ＃１１６６８０１９）を使用することにより、ｐＣＤＨ－ｐ５３プラスミドおよびｐＰＡＣＫＨ１－ｌｅｎｔｉｖｅｃｔｏｒパッケージングキット（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＶ５００Ａ－１）を用いて共トランスフェクトした。５％ＣＯ２および３７℃でのインキュベーションの４８時間後、上清を回収し、０．４μｍの濾過膜に通して濾過した。ウイルス上清を、メーカーの説明書にしたがってＬｅｎｔｉ－Ｘ（商標）濃縮試薬（タカラ、ｃａｔ＃６３１２３１）を用いて濃縮した。作りたてのＴＣＲ－レンチウイルスを使用して、ＪＲＴ細胞または活性化ＰＢＭＣを感染させた。
ＴＣＲレンチウイルス粒子を、レンチウイルスベクターｐＣＤＨ－ｐ５３でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞から生成した。簡潔に言うと、６ウェルプレートで増殖した２９３Ｔ細胞を、メーカーの説明書にしたがってリポフェクタミン３０００トランスフェクション試薬（インビトロジェンｃａｔ＃１１６６８０１９）を使用することにより、ｐＣＤＨ－ｐ５３プラスミドおよびｐＰＡＣＫＨ１－ｌｅｎｔｉｖｅｃｔｏｒパッケージングキット（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＬＶ５００Ａ－１）を用いて共トランスフェクトした。５％ＣＯ２および３７℃でのインキュベーションの４８時間後、上清を回収し、０．４μｍの濾過膜に通して濾過した。ウイルス上清を、メーカーの説明書にしたがってＬｅｎｔｉ－Ｘ（商標）濃縮試薬（タカラ、ｃａｔ＃６３１２３１）を用いて濃縮した。作りたてのＴＣＲ－レンチウイルスを使用して、ＪＲＴ細胞または活性化ＰＢＭＣを感染させた。
【0095】
１１．本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞の調製：
本発明のＴＣＲを発現させるための活性化ヒトＴ細胞を生成するため、ＰＢＭＣ細胞（１ウェルあたり２×１０６個）を、ＰＢＳ中一晩４℃で２μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３１７３０３）および２μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３０２９１４）を用いて前処理された２４ウェルプレートで培養した。２４時間のインキュベーション後、培地を、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１のサイトカインカクテルが補充された完全ＲＰＭＩ－１６４０培地と交換した。本発明のＴＣＲを発現させるためのＴ細胞株を生成するため、Ｊｕｒｋａｔ細胞株由来のベータ鎖欠損変異体であるＪＲＴ（Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５）細胞株およびヒトＣＤ８（Ｊｕｒｋａｒｔ－ＣＤ８）を発現させるために形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞を、使用した。本発明のＴＣＲをコードするレンチウイルスでＴ細胞をトランスフェクトするため、活性化ＰＢＭＣ、ＪＲＴ細胞またはＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８細胞を、作りたてのレンチウイルス上清１ｍｌまたは濃縮ウイルスを含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌを含む２４ウェルプレート中で再懸濁した。ポリブレン（サンタクルーズバイオテクノロジーｃａｔ＃ｓｃ－１３４２２０）を、終濃度１０μｇ／ｍｌで添加した。細胞を、３２℃で２時間、１０００ｇで遠心分離した。５％ＣＯ２および３７℃で４～６時間のインキュベーション後、培地を、サイトカインカクテルが補充された完全ＲＰＭＩ－１６４０培地と交換した。培地の半分を、サイトカインカクテルが補充された新しい培地と３日ごとに交換した。細胞をまた、メーカーの説明書にしたがいＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎディッシュ（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎプレコートディッシュ、３５ｍｍ）（タカラＴ１１０Ａ）を使用することによりトランスフェクトできた。一般的に、表現型および機能分析を、７２時間後に実行できた。ウイルスベクターがＧＦＰを有した場合、ＧＦＰ陽性細胞は一般的に、トランスフェクション後４８～７２時間、蛍光顕微鏡下で観察できた。より抗原特異的なＴ細胞を得るために、トランスフェクトされたＴ細胞は、マイトマイシンＣで再度処理されかつ１ｕｇ／ｍｌのｐ５３Ｒ１７５ＨペプチドでパルスされたＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣを含有する培養物中にてペプチド抗原で再刺激できた。サイトカインカクテルを用いた増殖後、Ｔ細胞を、さらなる研究のために回収した。
本発明のＴＣＲを発現させるための活性化ヒトＴ細胞を生成するため、ＰＢＭＣ細胞（１ウェルあたり２×１０６個）を、ＰＢＳ中一晩４℃で２μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ３抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３１７３０３）および２μｇ／ｍｌの抗ヒトＣＤ２８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３０２９１４）を用いて前処理された２４ウェルプレートで培養した。２４時間のインキュベーション後、培地を、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－１５および５ｎｇ／ｍｌのＩＬ－２１のサイトカインカクテルが補充された完全ＲＰＭＩ－１６４０培地と交換した。本発明のＴＣＲを発現させるためのＴ細胞株を生成するため、Ｊｕｒｋａｔ細胞株由来のベータ鎖欠損変異体であるＪＲＴ（Ｊ．ＲＴ３－Ｔ３．５）細胞株およびヒトＣＤ８（Ｊｕｒｋａｒｔ－ＣＤ８）を発現させるために形質導入されたＪｕｒｋａｔ細胞を、使用した。本発明のＴＣＲをコードするレンチウイルスでＴ細胞をトランスフェクトするため、活性化ＰＢＭＣ、ＪＲＴ細胞またはＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８細胞を、作りたてのレンチウイルス上清１ｍｌまたは濃縮ウイルスを含有する完全ＲＰＭＩ１６４０培地１ｍｌを含む２４ウェルプレート中で再懸濁した。ポリブレン（サンタクルーズバイオテクノロジーｃａｔ＃ｓｃ－１３４２２０）を、終濃度１０μｇ／ｍｌで添加した。細胞を、３２℃で２時間、１０００ｇで遠心分離した。５％ＣＯ２および３７℃で４～６時間のインキュベーション後、培地を、サイトカインカクテルが補充された完全ＲＰＭＩ－１６４０培地と交換した。培地の半分を、サイトカインカクテルが補充された新しい培地と３日ごとに交換した。細胞をまた、メーカーの説明書にしたがいＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎディッシュ（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎプレコートディッシュ、３５ｍｍ）（タカラＴ１１０Ａ）を使用することによりトランスフェクトできた。一般的に、表現型および機能分析を、７２時間後に実行できた。ウイルスベクターがＧＦＰを有した場合、ＧＦＰ陽性細胞は一般的に、トランスフェクション後４８～７２時間、蛍光顕微鏡下で観察できた。より抗原特異的なＴ細胞を得るために、トランスフェクトされたＴ細胞は、マイトマイシンＣで再度処理されかつ１ｕｇ／ｍｌのｐ５３Ｒ１７５ＨペプチドでパルスされたＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣを含有する培養物中にてペプチド抗原で再刺激できた。サイトカインカクテルを用いた増殖後、Ｔ細胞を、さらなる研究のために回収した。
【0096】
１２．フローサイトメトリーによる細胞表現型分析：
ＰＢＭＣによる外来性ＴＣＲの発現を分析するため、ＪＲＴ細胞またはＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８細胞を、本発明のＴＣＲをコードするレンチウイルスでトランスフェクトし、細胞を、１％ＦＢＳを有するＤＰＢＳ緩衝液（２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３６．９ｍＭ ＮａＣｌ、８．９ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３００９１２）および上述したように生成されたＰＥ標識ｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体で染色する。フローサイトメーターは、ＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザー１０（ミルテニーバイオテク社）であり、結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｆｌｏｗｊｏ社）により分析される。標的細胞によるＨＬＡ－Ａ２の発現を分析するため、細胞を、ＦＩＴＣ抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４３３０３）で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。
ＰＢＭＣによる外来性ＴＣＲの発現を分析するため、ＪＲＴ細胞またはＪｕｒｋａｔ－ＣＤ８細胞を、本発明のＴＣＲをコードするレンチウイルスでトランスフェクトし、細胞を、１％ＦＢＳを有するＤＰＢＳ緩衝液（２．７ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３６．９ｍＭ ＮａＣｌ、８．９ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３００９１２）および上述したように生成されたＰＥ標識ｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体で染色する。フローサイトメーターは、ＭＡＣＳＱｕａｎｔアナライザー１０（ミルテニーバイオテク社）であり、結果は、Ｆｌｏｗｊｏソフトウェア（Ｆｌｏｗｊｏ社）により分析される。標的細胞によるＨＬＡ－Ａ２の発現を分析するため、細胞を、ＦＩＴＣ抗ヒトＨＬＡ－Ａ２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３４３３０３）で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。
【0097】
１３．Ｔ細胞機能分析：
ＪＲＴ細胞により発現された本発明のＴＣＲの特異性および機能を評価するため、抗原刺激後のＪＲＴ細胞上の活性化マーカーとしてＣＤ６９の発現を、当該技術分野の方法（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．１９９６；２６（４）：３０５－１０）にしたがって、フローサイトメトリーにより分析した。簡潔に言うと、９６ウェルプレートで、ｐＣＤＨ－ｐ５３レンチウイルスで形質導入されたＪＲＴ細胞を、標的細胞と１６時間共培養した、例えば、種々の濃度で変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを用いてパルスされたＴ２細胞と混合培養した（Ｅ：Ｔ比は１：１であった）。インキュベーション後、細胞を、ＰＥ標識抗ＣＤ６９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３１０９０５）で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＪＲＴ細胞により発現されたＴＣＲがＨＬＡ－Ａ２においてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを特異的に認識できた場合、ＪＲＴ細胞は、活性化され、表面上でＣＤ６９を発現する。ＧＦＰ＋ＪＲＴ細胞は、本発明のＴＣＲおよびＧＦＰの両方をコードするレンチウイルスベクターにより形質導入された細胞を表した。ＧＦＰ＋ＣＤ６９＋ＪＲＴの頻度は、本発明のＴＣＲを発現する活性化Ｔ細胞集団を表した。ＰＢＭＣにおける初代Ｔ細胞により発現された本発明のＴＣＲの特異性および機能を評価するため、抗原刺激後のＴ細胞によるＣＤ１３７の特異的発現を、当該技術分野の方法にしたがってフローサイトメトリーにより測定した。研究は、ＣＤ１３７＋腫瘍浸潤性Ｔリンパ球がインビトロで腫瘍反応性を保持しかつインビボで優れた抗腫瘍効果を媒介したことを示す（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１４；２０（１）４４－５５）。ＣＤ１３７アッセイは、活性化Ｔ細胞によるＩＦＮｇまたはＴＮＦａの分泌を評価するためのサイトカインフローサイトメトリーアッセイとの、および活性化Ｔ細胞の脱顆粒（細胞傷害）を評価するためのＣＤ１０７ａ動員シフトアッセイとの優れた相関を有する（Ｂｌｏｏｄ ２００７；１１０（１）：２０１－２１０）。簡潔に言うと、９６ウェルプレートで、組換えレンチウイルスベクター（ｐＣＤＨ－ｐ５３）で形質導入されたＰＢＭＣを、標的細胞と２４時間共培養し（Ｅ：Ｔ比は５：１であった）、インキュベーション後、細胞を、ＰＥ標識抗ＣＤ１３７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０９８０３）およびＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。Ｔ細胞により発現されたＴＣＲがＨＬＡ－Ａ２においてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを特異的に認識できた場合、Ｔ細胞は、活性化され、表面上でＣＤ１３７を発現する。ＧＦＰ＋ＣＤ８＋細胞は、本発明のＴＣＲおよびＧＦＰの両方をコードするレンチウイルスベクターにより形質導入された細胞傷害性Ｔ細胞を表した。ＧＦＰ＋ＣＤ８＋ＣＤ１３７＋Ｔ細胞の頻度は、本発明のＴＣＲを発現し、抗原刺激により活性化したＣＴＬ集団を表した。
ＪＲＴ細胞により発現された本発明のＴＣＲの特異性および機能を評価するため、抗原刺激後のＪＲＴ細胞上の活性化マーカーとしてＣＤ６９の発現を、当該技術分野の方法（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．１９９６；２６（４）：３０５－１０）にしたがって、フローサイトメトリーにより分析した。簡潔に言うと、９６ウェルプレートで、ｐＣＤＨ－ｐ５３レンチウイルスで形質導入されたＪＲＴ細胞を、標的細胞と１６時間共培養した、例えば、種々の濃度で変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを用いてパルスされたＴ２細胞と混合培養した（Ｅ：Ｔ比は１：１であった）。インキュベーション後、細胞を、ＰＥ標識抗ＣＤ６９抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３１０９０５）で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＪＲＴ細胞により発現されたＴＣＲがＨＬＡ－Ａ２においてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを特異的に認識できた場合、ＪＲＴ細胞は、活性化され、表面上でＣＤ６９を発現する。ＧＦＰ＋ＪＲＴ細胞は、本発明のＴＣＲおよびＧＦＰの両方をコードするレンチウイルスベクターにより形質導入された細胞を表した。ＧＦＰ＋ＣＤ６９＋ＪＲＴの頻度は、本発明のＴＣＲを発現する活性化Ｔ細胞集団を表した。ＰＢＭＣにおける初代Ｔ細胞により発現された本発明のＴＣＲの特異性および機能を評価するため、抗原刺激後のＴ細胞によるＣＤ１３７の特異的発現を、当該技術分野の方法にしたがってフローサイトメトリーにより測定した。研究は、ＣＤ１３７＋腫瘍浸潤性Ｔリンパ球がインビトロで腫瘍反応性を保持しかつインビボで優れた抗腫瘍効果を媒介したことを示す（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１４；２０（１）４４－５５）。ＣＤ１３７アッセイは、活性化Ｔ細胞によるＩＦＮｇまたはＴＮＦａの分泌を評価するためのサイトカインフローサイトメトリーアッセイとの、および活性化Ｔ細胞の脱顆粒（細胞傷害）を評価するためのＣＤ１０７ａ動員シフトアッセイとの優れた相関を有する（Ｂｌｏｏｄ ２００７；１１０（１）：２０１－２１０）。簡潔に言うと、９６ウェルプレートで、組換えレンチウイルスベクター（ｐＣＤＨ－ｐ５３）で形質導入されたＰＢＭＣを、標的細胞と２４時間共培養し（Ｅ：Ｔ比は５：１であった）、インキュベーション後、細胞を、ＰＥ標識抗ＣＤ１３７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ３０９８０３）およびＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。Ｔ細胞により発現されたＴＣＲがＨＬＡ－Ａ２においてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを特異的に認識できた場合、Ｔ細胞は、活性化され、表面上でＣＤ１３７を発現する。ＧＦＰ＋ＣＤ８＋細胞は、本発明のＴＣＲおよびＧＦＰの両方をコードするレンチウイルスベクターにより形質導入された細胞傷害性Ｔ細胞を表した。ＧＦＰ＋ＣＤ８＋ＣＤ１３７＋Ｔ細胞の頻度は、本発明のＴＣＲを発現し、抗原刺激により活性化したＣＴＬ集団を表した。
【0098】
実施例１
この実施例は、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、健康なドナーの血液から精製されるＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣから誘導され得、抗原特異的ＣＴＬクローンが、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬから生成され得ることを示す。
この実施例は、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が、健康なドナーの血液から精製されるＨＬＡ－Ａ２＋ＰＢＭＣから誘導され得、抗原特異的ＣＴＬクローンが、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬから生成され得ることを示す。
【0099】
上述の方法を使用して、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬを、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド（ＨＭＴＥＶＶＲＨＣ、配列番号１）での抗原刺激の２サイクル後にＰＢＭＣから誘導した。得られたＴ細胞を、フローサイトメトリーにより分析した。
【0100】
図１Ａは、リビングゲートされたリンパ球の０．１０６％が、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体（ｐ５３Ｒ１７５Ｈ－四量体）を結合できるＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞であったことを示す。結果は、健康なドナーの天然のＴ細胞レパートリーにおいて、ＨＬＡ－Ａ２においてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを認識できる特異的Ｔ細胞が存在するが、このＴ細胞集団の頻度が非常に低いことを示す。ＨＬＡ－Ａ２＋正常人の末梢Ｔ細胞レパートリーにｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＴＣＲが予め存在することは、正常細胞に対する交差反応や、本発明のＴＣＲを有するＴ細胞集団により自己免疫反応を引き起こす安全性リスクが低いことを示唆し、このことは本発明のＴＣＲを有するＴ細胞を養子Ｔ細胞療法に適したものにする。ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＣＴＬを、樹状細胞により提示されＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５およびＩＬ－２１を含むサイトカインを用いて増殖されたｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド抗原を用いてインビトロで生成できた。さらに、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体の蛍光強度に基づき、ＣＤ８＋四量体＋Ｔ細胞は、様々なＴＣＲ結合親和性を有する多様なＴ細胞集団を含んだ。高親和性Ｔ細胞を有する支配的な集団が、誘導され、増殖された。このＴ細胞集団を、ゲートし、ＣＴＬクローンを生成するためにシングルセルソーティングに供した。
【0101】
ゲートされたＣＤ８＋四量体＋Ｔ細胞からのシングルセルを、ソニーＳＨ８００ ＦＡＣＳソーターを使用して９６ウェルプレートの各ウェルにソートした。全２８８個のＣＤ８＋四量体＋単一Ｔ細胞を、各ウェルにソートし、上記方法で説明された条件下で培養した。サイトカインを用いる抗原再刺激および増殖の後、全５８個のＴ細胞クローンは、ＴＣＲ遺伝子の分析および単離に十分な数に到達するまで増殖した。各Ｔ細胞クローンの細胞の一部を、回収し、フローサイトメトリーにより分析した。５８個の分析されたクローンのうち４１個のクローンは、ＣＤ８＋ｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体＋であり、このことは、これらのＴ細胞クローンがＨＬＡ－Ａ２においてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを認識できたことを示唆した。図１Ｂは、抗ＣＤ８抗体およびｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体で染色された全Ｔ細胞クローンを表した４個のクローンのフロー分析を示す。左上のプロットは、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体を結合できなかったＴ細胞クローンを示す。このＴ細胞クローンは、培養条件下で非特異的に増殖される可能性がある。他の３つのプロットは、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体を結合できた３個のＴ細胞クローンを示す。
【0102】
全ＲＮＡを、３個のＣＤ８＋ｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体＋Ｔ細胞クローンから精製した。ＴＣＲＶ－アルファおよびＶ－ベータの可変領域を、この方法で説明された方法を使用してクローン化し、それらの配列を、遺伝子配列決定により同定した。ＴＣＲＶ－アルファのヌクレオイド配列を、配列番号３５として示す。ＴＣＲＶ－ベータのヌクレオイド配列を、配列番号３６として示す。３つの異なるクローン由来のＴＣＲは、同一であると判明し、このことは、このｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチド特異的ＴＣＲを有するＴ細胞クローンが、この方法で説明された培養条件下でＰＢＭＢから優勢に増殖したことを示した。
【0103】
実施例２
Ｔ細胞により発現された本発明のＴＣＲの抗原特異性および機能を評価するため、本発明のＴＣＲのα鎖およびβ鎖の核酸を、複製欠損性レンチウイルス発現ベクター中にクローン化した。図２Ａは、本発明のＴＣＲをコードする組換えレンチウイルスベクターの模式図を示す。ヒトＴＣＲα鎖およびβ鎖の定常領域を、それぞれマウスα鎖およびマウスβ鎖の定常領域と置き換えた。ＴＣＲβ鎖およびα鎖をコードする核酸を、切断可能な連結ポリペプチドをコードする核酸（配列番号１３）により連結した。本発明のＴＣＲα鎖およびβ鎖（配列番号１６）の発現を、ＥＦ－１αプロモーターにより駆動した。このプロモーターは、真核細胞における高発現プロモーターであり、機能の喪失を引き起こす可能性があるメチル化および他の要因の影響を受けず、したがってインビボでの外来遺伝子の長期発現に適している。ＴＣＲα鎖およびβ鎖を、Ｆ２Ａ配列により連結し、それによってＴＣＲα鎖およびβ鎖遺伝子を同時に転写でき、続いてリボソームスキッピングを介して翻訳して、別個のＴＣＲα鎖ポリペプチドおよびβ鎖ポリペプチドを生成できた。この設計は、等しい量のＴＣＲα鎖およびβ鎖を確実にして、ＴＣＲ二量体の形成を促進する。ＴＣＲのＴＣＲα鎖とβ鎖の間のフーリン制限部位は、β鎖のＣ末端で過剰のペプチドを除去できる。
Ｔ細胞により発現された本発明のＴＣＲの抗原特異性および機能を評価するため、本発明のＴＣＲのα鎖およびβ鎖の核酸を、複製欠損性レンチウイルス発現ベクター中にクローン化した。図２Ａは、本発明のＴＣＲをコードする組換えレンチウイルスベクターの模式図を示す。ヒトＴＣＲα鎖およびβ鎖の定常領域を、それぞれマウスα鎖およびマウスβ鎖の定常領域と置き換えた。ＴＣＲβ鎖およびα鎖をコードする核酸を、切断可能な連結ポリペプチドをコードする核酸（配列番号１３）により連結した。本発明のＴＣＲα鎖およびβ鎖（配列番号１６）の発現を、ＥＦ－１αプロモーターにより駆動した。このプロモーターは、真核細胞における高発現プロモーターであり、機能の喪失を引き起こす可能性があるメチル化および他の要因の影響を受けず、したがってインビボでの外来遺伝子の長期発現に適している。ＴＣＲα鎖およびβ鎖を、Ｆ２Ａ配列により連結し、それによってＴＣＲα鎖およびβ鎖遺伝子を同時に転写でき、続いてリボソームスキッピングを介して翻訳して、別個のＴＣＲα鎖ポリペプチドおよびβ鎖ポリペプチドを生成できた。この設計は、等しい量のＴＣＲα鎖およびβ鎖を確実にして、ＴＣＲ二量体の形成を促進する。ＴＣＲのＴＣＲα鎖とβ鎖の間のフーリン制限部位は、β鎖のＣ末端で過剰のペプチドを除去できる。
【0104】
実施例３
この実施例は、変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈに特異的な本発明のＴＣＲを発現する健康なドナー由来の初代Ｔ細胞が、ＨＬＡ－Ａ２においてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを認識できることを示す。
この実施例は、変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈに特異的な本発明のＴＣＲを発現する健康なドナー由来の初代Ｔ細胞が、ＨＬＡ－Ａ２においてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを認識できることを示す。
【0105】
本発明のＴＣＲが本発明のＴＣＲおよびＧＦＰをコードする組換えレンチウイルス（ｐＣＤＨ－ｐ５３）でトランスフェクトされた後に初代Ｔ細胞で発現され得るかどうかを評価するため、健康なドナー由来のＰＢＭＣ細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で処理し、活性化されたＴ細胞を、この方法で説明された方法を使用して、本発明のＴＣＲ遺伝子を保持する組換えレンチウイルス粒子でトランスフェクトした。細胞を、抗原再刺激およびサイトカインカクテルを用いる増殖の後に回収した。抗ＣＤ８およびｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体染色を、実行した。図２Ｂの左側のグラフは、リビングゲートのリンパ球の１５．５％が、組換えレンチウイルスで形質導入されたＴ細胞集団を表すＣＤ８＋ＧＦＰ＋ＣＴＬであったことを示す。ＧＦＰ＋細胞がリンパ球集団からリビングゲートされたので、ＣＤ８－ＧＦＰ＋細胞の１．２３％は、組換えレンチウイルスで形質導入されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団である可能性が最も高かった。
【0106】
初代Ｔ細胞により発現された本発明のＴＣＲがＨＬＡ－Ａ２において変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを認識できたかどうかを評価するため、ＧＦＰ＋細胞を、ゲートし、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体の結合について分析した。図２Ｂの右側のグラフは、ゲートされたＣＤ８－ＧＦＰ＋集団（左側プロット）およびゲートされたＣＤ８＋ＧＦＰ＋集団（右側プロット）におけるｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体＋細胞の頻度を示す。結果は、形質導入されたＣＤ８＋ＣＴＬの８２．９％が、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体を結合できたことを示し、このことは、このＣＤ８＋ＣＴＬ集団により発現された本発明のＴＣＲが、ＨＬＡ－Ａ２において変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを認識できたことを示す。しかし、ＣＤ４ Ｔ細胞を表すＣＤ８－ＧＦＰ＋Ｔ細胞の一部のみが、ｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体を結合でき、このことは、本発明のＴＣＲによるｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体の結合が、ＣＤ８の存在に依存していることを示唆する。
【0107】
本発明のＴＣＲのｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体への結合がＣＤ８依存性（CD8-depandant）であったかどうかをさらに評価するため、Ｊｕｒｋａｔ株由来のＣＤ８陰性ＪＲＴ細胞および外来性ＣＤ８ａを発現するように形質導入されたＣＤ８陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ８）を、本発明のＴＣＲを発現するように形質導入し、抗ＣＤ８抗体およびｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体で染色した。ＧＦＰ＋形質導入細胞を、ゲートして、Ｔ細胞によるｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体の結合を分析した。図２Ｃの左側プロットは、ＣＤ８発現がないと、ＪＲＴ細胞により発現された本発明のＴＣＲは、四量体を結合できなかったことを示す。しかし、ＣＤ８の助けにより、Ｊｕｒｋａｔ－ＣＤ８細胞により発現された本発明のＴＣＲは、四量体を結合できた（図２Ｃの右側プロット）。この結果は、本発明のＴＣＲが、可溶性のｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体を結合するためにＴ細胞上でＣＤ８を共受容体として必要とすることを示す。ＣＤ８非依存性ＨＬＡ／ペプチド四量体結合を行うＴＣＲの正確な親和性閾値はまだ定義されていないが、研究は、ＣＤ８非依存性のためのＴＣＲ親和性の最小ＫＤ閾値が、およそ３～６μＭの範囲であることを示し(Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００９；１２６（２）：１６５－１７６)、このことは、本発明のＴＣＲが、３～６μＭのＫＤ値を有するＴＣＲよりも高くないＨＬＡ－Ａ２におけるｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドに対する結合親和性を有している可能性があることを示唆する。
【0108】
実施例４
この実施例における本発明のＴＣＲの機能分析は、Ｔ細胞により発現された本発明のＴＣＲが、ＨＬＡ－Ａ２においてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを高いアビディティーで認識できることを示す。
この実施例における本発明のＴＣＲの機能分析は、Ｔ細胞により発現された本発明のＴＣＲが、ＨＬＡ－Ａ２においてｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを高いアビディティーで認識できることを示す。
【0109】
ＪＲＴ細胞により発現された本発明のＴＣＲの機能を評価するため、ＪＲＴ細胞を、本発明のＴＣＲをコードする組換えレンチウイルス（ｐＣＤＨ－ｐ５３）で形質導入し、１ｕｇ／ｍｌから開始するｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドの１０倍希釈系列でパルスされたＴ２細胞と共培養した。１６時間の抗原刺激後、ＧＦＰ＋細胞を、ゲートし、ＣＤ６９＋ＪＲＴ細胞の割合を、フローサイトメトリーにより分析した。図３Ａは、ｐＣＤＨ－ｐ５３で形質導入されたＪＲＴ細胞が、抗原性ペプチドでの刺激後にＣＤ６９を発現したことを示し、このことは、ＪＲＴ細胞がＨＬＡ－Ａ２により提示されるｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドにより活性化され、その活性化は、ペプチド用量依存的反応であったことを示す。ＪＲＴ細胞は、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドの添加がない対照群と比較して、ＣＤ６９＋細胞の頻度の２倍の増加に基づいて、１０ｎｇ／ｍｌの濃度と同程度に低い濃度で、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドにより活性化できた。結果は、共受容体ＣＤ８なしに、Ｔ細胞上の本発明のＴＣＲが、低濃度でｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを効果的に認識できることを示す。その同種抗原性ペプチドに対する本発明のＴＣＲのアビディティーは、他の研究で報告されたネオエピトープに対して特異的なＴＣＲの高いアビディティー（Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ．２０１９；７（４）：５３４－５４３）に匹敵する。
【0110】
初代Ｔ細胞により発現された本発明のＴＣＲの機能を評価するため、活性化されたＰＢＭＣ細胞を、本発明のＴＣＲをコードする組換えレンチウイルス（ｐＣＤＨ－ｐ５３）で形質導入し、１ｕｇ／ｍｌから開始する変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドの１０倍希釈系列、または１０ｕｇ／ｍｌから開始する野生型ｐ５３Ｒ１７５ペプチドの１０倍希釈系列を用いてパルスされたＴ２細胞と共培養した。２４時間の抗原刺激後、ＧＦＰ＋細胞を、ゲートし、ＣＤ８＋ＣＤ１３７＋Ｔ細胞の割合を、フローサイトメトリーにより分析した。図３Ｂは、ＴＣＲ－遺伝子形質導入ＣＴＬが、ＨＬＡ－Ａ２により提示される変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドでの刺激により活性化され得たことを示す。活性化は、ペプチド用量依存的応答であった。形質導入されたＴ細胞は、ｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを添加していない対照群と比較して、ＣＤ８＋ＣＤ１３７＋細胞の頻度が２倍増加したことに基づき、１ｎｇ／ｍｌといった低い濃度でｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドにより活性化され得た。形質導入されたＴ細胞により発現された本発明のＴＣＲは、１０ｕｇ／ｍｌの高濃度であっても野生型ｐ５３Ｒ１７５ペプチドを認識できなかった。この結果は、本発明のＴＣＲはＨＬＡ－Ａ２により提示された変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈエピトープペプチドを特異的に認識できるが、高濃度でのＨＬＡ－Ａ２における野生型の対応するエピトープを無視することを示す。Ｔ細胞上の共受容体ＣＤ８は、ＣＤ８陰性ＪＲＴ細胞上のＴＣＲと比較して１０倍の増加により、本発明のＴＣＲのアビディティーを促進する。
【0111】
ＴＣＲ機能的効力が、ＴＣＲ親和性のみによって決定されるのではなく、ＴＣＲおよびＣＤ８の複合的な寄与によって決定されるアビディティーにより決定されることを示す研究があった。ＴＣＲ親和性は、１０μＭの閾値までアビディティーに寄与し、その後、さらなる増加は、より高いアビディティーと、その結果としてより強力なＴ細胞機能には繋がらない（ＰＮＡＳ ２０１３；１１０（１７）：６９７３－６９７８）。本発明のＴＣＲは、ＣＤ８の助けなしにｐ５３Ｒ１７５Ｈ／ＨＬＡ－Ａ２四量体を結合することを可能にするような超高親和性を有しない可能性があるが、他の報告された高いアビディティーのＴＣＲと比較して高いアビディティーでｐ５３Ｒ１７５Ｈペプチドを依然として認識できた。さらに、本発明のＴＣＲの適切な親和性は、超高親和性を有するＴＣＲにより引き起こされる潜在的な交差反応性自己免疫に関連する安全への懸念を回避できる。実施例で示された本発明のＴＣＲの高いアビディティーは、それが変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈを有する癌細胞などの標的細胞上のＨＬＡ－２により提示されるｐ５３Ｒ１７５Ｈエピトープペプチドの非常に低い発現を検出することを可能にする。
【0112】
実施例５
この実施例は、変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈを有するＨＬＡ－Ａ２＋腫瘍細胞が、本発明のＴＣＲを発現するように形質導入される初代Ｔ細胞により認識され得ることを示す。
この実施例は、変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈを有するＨＬＡ－Ａ２＋腫瘍細胞が、本発明のＴＣＲを発現するように形質導入される初代Ｔ細胞により認識され得ることを示す。
【0113】
腫瘍細胞株上のＨＬＡ－Ａ２の発現を、ＰＥ標識抗ＨＬＡ－Ａ２抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３４３３０５）で評価した。腫瘍細胞株ＫＬＥ、ＫＭＳ２６およびＳＫＵＴ１を、５％ＣＯ２および３７℃のインキュベーションで２４時間ヒトＩＦＮ－ガンマ（２００ｕ／ｍｌ）で前処理した。ＩＦＮ－ガンマで前処理した、または前処理していない腫瘍細胞を、抗ＨＬＡ－Ａ２抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。図４Ａの左側のグラフは、ＰＥ標識アイソタイプ抗体で染色された対照群（ライトグレーの線）、ＩＦＮ－ガンマで処理されなかった腫瘍細胞（ミディアムグレーの線）およびＩＦＮ－ガンマで前処理された腫瘍細胞（ダークグレーの線）を含む、腫瘍細胞株によるＨＬＡ－Ａ２の発現を示す。結果は、腫瘍細胞株ＫＬＥおよびＫＭＳ２６が、細胞表面上でＨＬＡ－Ａ２を発現し、ＨＬＡ－Ａ２の発現が、ＩＦＮ－ガンマ刺激により、特にＫＬＥ細胞で促進され得ることを示す。ＳＫＵＴ１細胞株は表面上でＨＬＡ－Ａ２を発現しないが、この細胞株は、ＴＲＯＮ細胞株ポータルによるヘテロ接合型のＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子を有する。ＩＦＮ－ガンマ処理は、ＳＫＵＴ１細胞上でのＨＬＡ－Ａ２発現をアップレギュレートできない。ＨＬＡ－Ａ２＋ＳＫＵＴ１細胞を生成するため、ＳＫＵＴ１細胞を、ＨＬＡ－Ａ２またはＨＬＡ－Ａ２／ベータ２－ミクログロブリン（beta2-microglubine）をコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。右側プロットは、ＨＬＡ－Ａ２単独（ミディアムグレーの線）またはベータ２－ミクログロブリン（beta2-microglubine）と共にＨＬＡ－Ａ２（ダークグレーの線）で形質導入されたＳＫＵＴ１細胞が、表面上でＨＬＡ－Ａ２を発現できることを示す。ＳＫＵＴ１細胞株のほかに、ＳＫＯＶ３、２９３ＴおよびＫ５６２細胞株もまた、外来性ＨＬＡ－Ａ２を発現するように形質導入した。
【0114】
ＴＲＯＮ細胞株ポータルによれば、ＫＬＥ、ＫＭＳ２６およびＳＫＵＴ１細胞株は、変異ｐ５３ｐ．Ｒ１７５Ｈを保持している。「１００万個のマップされたリードあたりの、転写物のキロベースあたりのリード」（ＲＰＫＭ）として与えられるこれらの細胞株におけるｐ５３の転写産物発現を、以下のように報告する：ＫＭＳ２６株は、１８７．２ＲＰＫＭでｐ５３を発現し、ＫＬＥ株は、２３２．４ＲＰＫＭでｐ５３を発現し、ＳＫＵＴ１は、３１０．２ＲＰＫＭでｐ５３を発現する。
【0115】
腫瘍細胞を認識するように初代Ｔ細胞により発現された本発明のＴＣＲの機能を評価するため、活性化ＰＢＭＣ細胞を、本発明のＴＣＲをコードする組換えレンチウイルス（ｐＣＤＨ－ｐ５３）で形質導入し、ＨＬＡ－Ａ２のみ、変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈのみ、またはＨＬＡ－Ａ２と変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈとの両方を発現する腫瘍細胞を含む多種多様の標的細胞株と共培養した。１００ｎｇ／ｍｌのｐ５３Ｒ１７５ＨペプチドでパルスされたＴ２細胞は、陽性対照であった。標的細胞なしに形質導入されたＰＢＭＣは、陰性対照であった。２４時間の抗原刺激後、ＧＦＰ＋細胞をゲートし、ＣＤ８＋ＣＤ１３７＋Ｔ細胞の割合を、フローサイトメトリーにより分析した。図４Ｂは、原発性ＣＴＬ細胞により発現された本発明のＴＣＲが、外来性ＨＬＡ－Ａ２を発現するように形質導入されたＫＭＳ２６、ＫＬＥ、ＳＫＵＴ１、変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈを発現するように形質導入された２９３Ｔ－Ａ２および変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈを発現するように形質導入されたＫ５６２－Ａ２を含むＨＬＡ－Ａ２＋ｐ５３Ｒ１７５Ｈ＋標的細胞（塗りつぶした棒）を認識することにより活性化され得たことを示す。ＨＬＡ－Ａ２のみ（２９３Ｔ－Ａ２およびＳＫＯＶ３－Ａ２）を発現する標的細胞は、本発明のＴＣＲを有するＴ細胞を活性化できなかった。ＨＬＡ－Ａ２陰性ＳＫＵＴ１は、ＩＦＮ－ガンマで刺激しても本発明のＴＣＲを有するＴ細胞を活性化できなかったが、外来性ＨＬＡ－Ａ２を発現するＳＫＵＴ１－Ａ２は、本発明のＴＣＲを有するＴ細胞を活性化でき、このことは、内因性ｐ５３Ｒ１７５ＨエピトープペプチドがＳＫＵＴ１－Ａ２細胞上で外来性ＨＬＡ－Ａ２により提示され得、かつ本発明のＴＣＲにより認識され得ることを示す。抗ＨＬＡ－ＡＢＣ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ｃａｔ＃３１１４２７）を、混合培養中に添加し、ＨＬＡ－Ｉをブロックすることが、本発明のＴＣＲを有するＣＴＬ上でＣＤ１３７の発現を阻害できた（白色の棒）ことを示し、このことは、本発明のＴＣＲが、ＨＬＡクラスＩ分子により提示される抗原性ペプチドにより活性化されたことをさらに説明した。ＩＦＮ－ガンマでの前処理は、ＫＬＥ細胞上でＨＬＡ－Ａ２発現を促進でき、これは、ＩＦＮ－ガンマで前処理されたＫＬＥ細胞がより高レベルで本発明のＴＣＲを活性化した、という結果を説明できる可能性がある。しかし、ＩＦＮ－ガンマで前処理されたＫＭＳ２６細胞は、本発明のＴＣＲを有するＴ細胞をより低レベルで活性化した。この理由は、不明のままであるが、ＩＦＮ－ガンマ刺激後におそらくアップレギュレートされたＫＭＳ２６上でのＰＤ－Ｌ１が推測され得る。この実施例は、初代Ｔ細胞により発現された本発明のＴＣＲが、腫瘍細胞上でＨＬＡ－Ａ２により提示された内因性ｐ５３Ｒ１７５Ｈエピトープペプチドの低発現を検出するのに十分高い感度を有することを示す。
【0116】
実施例６
この実施例は、実施例２で構築されたＴＣＲを含む、本発明のＴＣＲのアミノ酸配列を示す。これらのＴＣＲのＴＣＲアルファおよびベータ鎖のアミノ酸配列を、表１に示す。ＣＤＲは、太字であり、下線をつけている。
この実施例は、実施例２で構築されたＴＣＲを含む、本発明のＴＣＲのアミノ酸配列を示す。これらのＴＣＲのＴＣＲアルファおよびベータ鎖のアミノ酸配列を、表１に示す。ＣＤＲは、太字であり、下線をつけている。
【0117】
【表1】
【0118】
結論
本発明において、ＨＬＡ－Ａ２における変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈエピトープペプチド（配列番号１）に特異的である新規のＴＣＲが、同定され、健康なヒトドナーから生成された。本発明のＴＣＲは、標的細胞上でＨＬＡ－Ａ２により提示される外来性および内因性ｐ５３Ｒ１７５Ｈエピトープペプチドを認識する高いアビディティーを有するが、対応する野生型ｐ５３Ｒ１７５ペプチドに応答しない。ｐ５３Ｒ１７５Ｈに対する抗原特異性および高いアビディティーは、本発明のＴＣＲを、ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子および変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈを保持する癌を特異的に標的化する免疫療法レジメン（regiments）の開発に適切なものにする。本発明のＴＣＲを外因的に発現するように形質導入されたＴ細胞は、癌を有する患者を処置するための養子Ｔ細胞療法に適用できる。
本発明において、ＨＬＡ－Ａ２における変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈエピトープペプチド（配列番号１）に特異的である新規のＴＣＲが、同定され、健康なヒトドナーから生成された。本発明のＴＣＲは、標的細胞上でＨＬＡ－Ａ２により提示される外来性および内因性ｐ５３Ｒ１７５Ｈエピトープペプチドを認識する高いアビディティーを有するが、対応する野生型ｐ５３Ｒ１７５ペプチドに応答しない。ｐ５３Ｒ１７５Ｈに対する抗原特異性および高いアビディティーは、本発明のＴＣＲを、ＨＬＡ－Ａ２対立遺伝子および変異ｐ５３Ｒ１７５Ｈを保持する癌を特異的に標的化する免疫療法レジメン（regiments）の開発に適切なものにする。本発明のＴＣＲを外因的に発現するように形質導入されたＴ細胞は、癌を有する患者を処置するための養子Ｔ細胞療法に適用できる。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-02
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
【国際調査報告】