特表 2024-540203 ミクログリア機能障害を治療し、代謝機能障害を改善するための方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-31

(54)【発明の名称】ミクログリア機能障害を治療し、代謝機能障害を改善するための方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20241024BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 25/14 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 21/04 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 21/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 31/37 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 38/46 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 45/06 20060101ALI20241024BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P25/00

A61P25/28

A61P25/16

A61P25/14

A61P27/06

A61P21/04

A61P21/00

A61K31/37

A61K38/46

A61K45/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024525791

(86)(22)【出願日】2022-11-08

(85)【翻訳文提出日】2024-06-24

(86)【国際出願番号】 IB2022000668

(87)【国際公開番号】W WO2023079366

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】63/276,996

(32)【優先日】2021-11-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524158896

【氏名又は名称】アルティメット メディシン アーゲー

(71)【出願人】

【識別番号】524154669

【氏名又は名称】アルベルト・ルートヴィヒ大学フライブルク

(74)【代理人】

【識別番号】100080182

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 三彦

(74)【代理人】

【識別番号】100142572

【弁理士】

【氏名又は名称】水内 龍介

(72)【発明者】

【氏名】ザライ アンタル

(72)【発明者】

【氏名】ブランク トーマス

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C084AA02

4C084AA17

4C084AA20

4C084BA44

4C084DC22

4C084MA02

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA57

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4C086AA01

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4C086BA08

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4C086NA05

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4C086ZA02

4C086ZA15

4C086ZA16

4C086ZA18

4C086ZA22

4C086ZA33

4C086ZA94

(57)【要約】

本開示は、それを必要とする被験者において、認知障害、神経変性疾患、または神経機能障害を治療または発症率を低下させるための方法および組成物に関する。本方法は、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む、方法に関する。本開示はまた、そのような被験者を特定する、方法に関する。
【選択図】図１ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

それを必要とする被験者において、ミクログリアにおける酸化ストレスまたはミトコンドリア機能不全、またはミクログリア機能不全の発症率を低下させる方法であって、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を前記被験者に投与することを含む、方法。

【請求項2】

それを必要とする被験者において、認知障害を治療する、または認知障害の発症率または悪化率を低下させる方法であって、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を前記被験者に投与することを含む、方法。

【請求項3】

被験者において、神経変性疾患を治療する、または神経変性疾患の発症率または進行率を低下させる方法であって、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を前記被験者に投与することを含む、方法。

【請求項4】

それを必要とする被験者において、神経機能障害の発症率または悪化率を低下させる方法であって、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を前記被験者に投与することを含む、方法。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか１項に記載の方法であって、
（ｉ）前記被験者が、基準レベルと比較して、被験者の生体試料中のＮ６－カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の上昇したレベルを有すると以前に特定されており；および／または
（ｉｉ）本方法は、基準レベルと比較して、前記被験者の生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体のレベルが上昇しているとして前記被験者を特定することをさらに含む、方法。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載の方法であって、
（ｉ）前記被験者が、基準レベルと比較して、前記腸管バリアの透過性の上昇したレベルを有すると以前に特定されており；および／または
（ｉｉ）本方法は、基準レベルと比較して、前記腸管バリアの透過性の上昇したレベルを有するものとして前記被験者を特定することをさらに含む、方法。

【請求項7】

前記生体試料は、体液（例えば、唾液、尿、血液、血清、血漿、脳脊髄液、または糞便）または組織試料（例えば、脳組織）からなる、請求項５に記載の方法。

【請求項8】

前記被験者が、
（ｉ）認知障害；および／または
（ｉｉ）神経変性疾患
を有すると特定または診断されている、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記被験者が、
（ｉ）認知障害；および／または
（ｉｉ）神経変性疾患
の発症リスクの増大を有すると特定されている、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記被験者のミクログリアにおける細胞内および／またはミトコンドリアの活性酸化種（ＲＯＳ）のレベルの低下をもたらす、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記被験者のミクログリアにおける誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現の減少をもたらす、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｙｂａ、Ｃｙｂｂ、Ｄｕｏｘａ１、Ｉｌ１ｂ、Ｔｇｆｂｒ２、Ｔｌｒ２、Ｔｌｒ４、Ｔｌｒ５、Ａｘｌ、Ｈｉｆ１ａ、Ｌｃｎ２、Ｍｍｐ２、Ｒｅｌａ、Ｔｒｅｘ１、Ｓ１００ａ８、およびＳ１００ａ９からなる群より選択される前記被験者のミクログリアにおける１つ以上の遺伝子の発現の減少をもたらす、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

Ｆｏｘｐ１、Ｎｒｆ１、Ｔｒｐ５３、Ｇ６ｐｄｘ、Ｐｄｋ２、Ｓｔａｔ３、およびＵｃｐ２からなる群より選択される前記被験者のミクログリアにおける１つ以上の遺伝子の発現の増加をもたらす、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記被験者から得られた前記生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体のレベルを決定することをさらに含む、請求項５または７に記載の方法。

【請求項15】

請求項３、８（ｉｉ）および９（ｉｉ）のいずれか１項に記載の方法であって、
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、および血管性認知症、からなる群より選択される、方法。

【請求項16】

被験者の組織中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の蓄積率を低下させる方法であって、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を前記被験者に投与することを含む、方法。

【請求項17】

（ｉ）ミクログリア機能障害の発症、（ｉｉ）認知障害、または（ｉｉｉ）神経変性疾患の発症のリスクの増大を有する被験者を特定する方法であって、基準レベルと比較して、前記被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の上昇したレベルを有する被験者を特定することを含む、方法。

【請求項18】

それを必要とする被験者の血液または脳試料内の、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の濃度を低下させる方法であって、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を前記被験者に投与することを含む、方法。

【請求項19】

それを必要とする被験者において、認知障害または神経変性疾患を予防または治療するために、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の血液または脳試料中の濃度を低下させる方法であって、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を前記被験者に投与することを含む、方法。

【請求項20】

それを必要とする被験者において、認知障害または神経変性疾患を予防または治療するために、腸管透過性を低下させる方法であって、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を前記被験者に投与することを含む、方法。

【請求項21】

前記腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤は、腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）、リポテイコ酸、メトホルミン、エラグ酸（ＥＡ）、ウロリチンＡ、酪酸、グルタミン、オベチコール酸（ＯＣＡ）、ジベルチン、またはクルクミン、またはそれらの誘導体を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤はＩＡＰである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤はＥＡである、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤は、ＩＡＰ、リポテイコ酸、メトホルミン、ＥＡ、ウロリチンＡ、酪酸、グルタミン、ＯＣＡ、ジベルチン、もしくはクルクミン、または薬学的に許容されるそれらの塩を含む医薬組成物として製剤化される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤が、経口投与、経皮投与、吸入、経鼻投与、局所投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、または皮下投与により投与される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤の投与後に、前記被験者が、
（ａ）血液試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の濃度の低下；
（ｂ）脳組織試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の濃度の低下；
（ｃ）腸管透過性の低下；
（ｄ）細菌叢ディスバイオシスの減少；
（ｅ）腸上皮におけるオートファジーのレベルの上昇；
（ｆ）ミクログリアにおける細胞性および／またはミトコンドリアＲＯＳのレベルの減少；
（ｇ）ミクログリアの集団におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレベルの上昇；
（ｈ）ミクログリアにおけるｉＮＯＳの発現の低下；
（ｉ）ミクログリアにおける、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｙｂａ、Ｃｙｂｂ、Ｄｕｏｘａ１、Ｉｌ１ｂ、Ｔｇｆｂｒ２、Ｔｌｒ２、Ｔｌｒ４、Ｔｌｒ５、Ａｘｌ、Ｈｉｆ１ａ、Ｌｃｎ２、Ｍｍｐ２、Ｒｅｌａ、Ｔｒｅｘ１、Ｓ１００ａ８、およびＳ１００ａ９からなる群より選択される、１つ以上の遺伝子の発現の減少；および
（ｊ）Ｆｏｘｐ１、Ｎｒｆ１、Ｔｒｐ５３、Ｇ６ｐｄｘ、Ｐｄｋ２、Ｓｔａｔ３、およびＵｃｐ２からなる群より選択される、ミクログリアにおける１つ以上の遺伝子の発現の増加、
の１つ以上を示す、請求項１～９および１４～１６、１８～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

ミクログリア機能障害を発症するリスクが増大した被験者を特定する方法であって、基準レベルと比較して、前記被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の上昇したレベルを有する被験者を特定することを含み、このようなレベルの上昇は、前記被験者がミクログリア機能障害を発症するリスクが増大したことを示す、方法。

【請求項28】

認知障害のリスクが増大した被験者を特定する方法であって、基準レベルと比較して、前記被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の上昇したレベルを有する被験者を特定することを含み、このようなレベルの上昇は、前記被験者が認知障害を発症するリスクが増大していることを示す、方法。

【請求項29】

神経変性疾患を発症するリスクが増大した被験者を特定する方法であって、基準レベルと比較して、前記被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の上昇したレベルを有する被験者を特定することを含み、このようなレベルの上昇は、前記被験者が神経変性疾患を発症するリスクが増大していることを示す、方法。

【請求項30】

前記生体試料は、組織試料または体液試料である、請求項２８～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記体液試料は、唾液、尿、血液、血清、血漿、脳脊髄液、または糞便である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記組織試料は、脳組織である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の量は、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー）、質量分析、液体クロマトグラフィー質量分析、または核磁気共鳴分光法によって、またはイムノアッセイによって測定される、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０２１年１１月８日に出願された米国仮出願第６３／２７６，９９６号の利益および優先権を主張するものであり、その開示全体は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、被験者における神経変性障害、認知障害、または神経機能障害の発症率を治療または低下させるための方法および組成物に関する。

【背景技術】

【0003】

正常な脳の老化では、ミクログリアはしばしば、神経変性を示す明確な転写プロファイルを示す（非特許文献１）。同時に、老化したヒトの脳のミクログリアは、形態学的変化を示し、他の組織（例えば、ニューロン）を支持する能力が低下し（非特許文献２）、ジストロフィーになる。ミクログリアのホメオスタシスの加齢性変化は、内因性および外因性因子を介したミクログリアホメオスタシスの加齢性変化による可能性が高いことが示唆されている。中枢神経系（ＣＮＳ）と末梢環境との双方向の相互作用を媒介する外的因子が何であるかは、まだ解明されていない。

【0004】

今日までの努力にもかかわらず、神経変性疾患、認知障害、神経機能障害を治療する、あるいはその発症率を低下させるための新たな治療法が依然として必要とされている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｓａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１４）ＣＥＬＬ，１５８：ｌ５－２４

【非特許文献2】Ｓｔｒｅｉｔ ｅｔ ａｌ．（２００４）ＧＬＩＡ ４５：２０８－２１２

【非特許文献3】Ｌｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＮＡＴ．ＧＥＮＥＴ．，４９：５６８－５７８

【非特許文献4】Ｔｒｅｍｂｌａｙ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＧＬＩＡ，６０：５４１－５５８

【非特許文献5】Ｌａｎｇｆｅｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）ＢＭＣ ＢＩＯＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ，９：５５９

【非特許文献6】Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＮＡＴＵＲＥ，４７９：２３２－２３６

【非特許文献7】Ｓｔｅｆａｎａｔｏｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＦＥＢＳ ＬＥＴＴ．，５９２：７４３－７５８

【非特許文献8】Ｓｔｒｅｉｔ（２００６）ＴＲＥＮＤＳ ＮＥＵＲＯＳＣＩ．，２９：５０６－５１０

【非特許文献9】Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＡＲＣＨ．ＢＩＯＣＨＥＭ．ＢＩＯＰＨＹＳ．，４９４：１３０－１３７

【非特許文献10】Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＢＩＯＳＣＩ．ＲＥＰ．，３０：２３３－２４１

【非特許文献11】Ｍｏｓｓａｄ ｅｔ ａｌ．（２０２１）ＮＡＴ．ＡＧＩＮＧ，１：１１２７－１１３６

【非特許文献12】Ｈａｙｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＳＣＩ．ＲＥＰ．，８：１４１８４

【非特許文献13】Ｔｈｅｖａｒａｎｊａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＣＥＬＬ ＨＯＳＴ ＭＩＣＲＯＢＥ，２１：４５５－４６６．ｅ４

【非特許文献14】Ｒａｇｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＦＯＯＤ ＦＵＮＣＴ．，７：１５７４－１５８３

【非特許文献15】Ｋｕｈｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ＪＣＩ ＩＮＳＩＧＨＴ，５：ｅ１３４０４９

【非特許文献16】Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ＳＣＩ．ＲＥＰ．，１０：３１０７

【非特許文献17】Ｙａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２００９）ＡＮＮＵ．ＲＥＶ．ＢＩＯＭＥＤ ＥＮＧ．１１：４９－７９

【非特許文献18】Ａｆｇａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳ．，４６：Ｗ５３７－Ｗ５４４

【非特許文献19】Ｊｏｒｄａｏ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＳＣＩＥＮＣＥ，３６３：ｅａａｔ７５５４

【非特許文献20】Ｙｉｌｍａｚ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＮＡＴ．ＭＥＤ．，２５：３２３－３３６

【非特許文献21】Ｃａｐｏｒａｓｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）ＮＡＴ．ＭＥＴＨＯＤＳ，７：３３５－３３６

【非特許文献22】ＭｃＭｕｒｄｉｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）ＰＡＣ．ＳＹＭＰ．ＢＩＯＣＯＭＰＵＴ．，２３５－２４６

【非特許文献23】Ｃａｌｌａｈａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｆ１０００ＲＥＳ．，５：１４９２

【非特許文献24】Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＡＮＡＬ．ＣＨＥＭ．，８１：６６５６－６６６７

【非特許文献25】Ｈａｒｒｉｓ（２００３）Ｄ．Ｃ．ＱＵＡＮＴＩＴＡＴＩＶＥ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＡＬＹＳＩＳ ６ＴＨ ＥＤＮ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．）

【非特許文献26】Ｇｏｍｅｓ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＣＥＬＬ，１５５：１６２４－１６３８

【非特許文献27】Ｌｏｐｅｚ－Ｏｔｍ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＣＥＬＬ，１５３：１１９４－１２１７

【非特許文献28】Ｔｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１６）ＭＯＬ．ＮＵＴＲ．ＦＯＯＤ ＲＥＳ．，６０：２４４６－２４５６

【非特許文献29】Ｍａｒｉａｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）ＢＭＣ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．，９：１２３

【非特許文献30】Ｖａｉｓｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ＢＭＣ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．，２０：２２１

【非特許文献31】Ｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ＦＯＯＤ ＦＵＮＣＴ．，１０：１７３６－１７４６

【非特許文献32】Ｍｏｓｓａｄ ｅｔ ａｌ．（２０２２）ＮＡＴＵＲＥ ＮＥＵＲＯＳＣＩＥＮＣＥ，２５：２９５－３０５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本開示は、腸内細菌叢によって産生され、加工食品にも含まれる代謝産物Ｎ⁶－カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）が、ミクログリアにおける加齢に関連した酸化ストレスとミトコンドリア障害を促進する可能性があり、加齢に伴って脳内でＣＭＬの量が増加すると、認知障害や神経変性障害を引き起こす可能性があるという発見に、部分的に基づくものである。さらに、加齢に伴う被験者の体液や組織試料中のＣＭＬの増加や蓄積は、加齢の進行に伴う腸管透過性の亢進に起因する可能性があり、その結果、ＣＭＬが腸壁を通過して被験者の体液や組織に移行するレベルが高くなると考えられることが発見された。これらの発見に基づいて、神経変性障害、認知障害、神経機能障害を治療したり、その発症率を低下させたりする治療法を提供することが可能である。

【課題を解決するための手段】

【0007】

一態様において、本開示は、必要な被験者の、ミクログリアにおける酸化ストレスまたはミトコンドリア機能障害の発症率、ミクログリアにおけるミトコンドリア機能障害の発症率、またはミクログリア機能障害の発症率を低下させる方法を提供する。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0008】

別の態様において、本開示は、必要な被験者の、認知障害の治療法または認知障害の発症率または悪化を低下させる方法を提供する。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0009】

別の態様において、本開示は、被験者の、神経変性疾患の治療法または神経変性疾患の発症率または進行率を低下させる方法を提供する。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0010】

別の態様において、本開示は、必要な被験者の、神経機能障害の発症率または悪化を低下させる方法を提供する。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0011】

前述した各態様において、一実施形態では、被験者は、被験者の生体試料中のＮ６－カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物（本明細書では、ＣＭＬ代謝産物およびＣＭＬ分解産物という用語は互換的に使用される）、またはＣＭＬ類似体のレベルが、基準レベルと比較して上昇していることを前もって確認されている。代替的または追加的に、別の実施形態において、本方法は、被験者の生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体のレベルが、基準レベルと比較して上昇しているとして被験者を特定することをさらに含む。状況に応じて、本方法は、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体のレベルを決定することをさらに含む。さらに、状況に応じて、生体試料は、被験者の体液（例えば、唾液、尿、血液、血清、血漿、脳脊髄液、または糞便）または組織試料（例えば、脳組織）を含む。

【0012】

前述の各態様および実施形態において、（ｉ）被検者は、腸管バリアの透過性のレベルが、基準レベルと比較して上昇しているとして、前もって特定される；および／または（ｉｉ）本方法は、腸管バリアの透過性のレベルが、基準レベルと比較して上昇することによって被験者を特定することをさらに含む。

【0013】

前述の各態様および実施形態において、被験者は、（ｉ）認知障害；および／または（ｉｉ）神経変性疾患を有すると、特定または診断される。代替的にまたは追加的に、被験者は（ｉ）認知障害；および／または（ｉｉ）神経変性疾患の発症リスクを有するとして特定される。

【0014】

特定の実施形態において、神経変性疾患はアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調、および血管性認知症から構成される群から選択される。

【0015】

前述の各態様および実施形態において、状況に応じて、本方法は、１つ以上の（ｉ）被験者のミクログリア内の、細胞のおよび／またはミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルの減少、（ｉｉ）被験者のミクログリア内の、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現の減少、（ｉｉｉ）Ｃｄｋｎｌａ、Ｃｙｂａ、Ｃｙｂｂ、Ｄｕｏｘａ１、Ｉｌ１ｂ、Ｔｇｆｂｒ２、Ｔｌｒ２、Ｔｌｒ４、Ｔｌｒ５、Ａｘｌ、Ｈｉｆ１ａ、Ｌｃｎ２、Ｍｍｐ２、Ｒｅｌａ、Ｔｒｅｘｌ、Ｓ１００ａ８、およびＳ１００ａ９から構成される群から選択された、被験者のミクログリア内の１つ以上の遺伝子発現の減少、および（ｉｖ）Ｆｏｘｐ１、Ｎｒｆ１、Ｔｒｐ５３、Ｇ６ｐｄｘ、Ｐｄｋ２、Ｓｔａｔ３、およびＵｃｐ２から構成される群から選択された、被験者のミクログリア内の１つ以上の遺伝子発現の増加、という結果になる。

【0016】

別の態様において、本開示は、被験者の組織内の、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の蓄積率を減少させる方法を提供する。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0017】

別の態様において、本開示は、（ｉ）ミクログリア機能障害の発生、（ｉｉ）認知障害、または（ｉｉｉ）神経変性疾患の発症のリスク増加を含むときに、被験者を特定する方法を提供する。本方法は、被験者から得られた生体試料内の、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体が、基準レベルと比べて上昇したレベルを有する被験者を特定することを含む。

【0018】

別の態様において、本開示は、必要な被験者の血液または脳試料の、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の凝集を軽減させる方法を提供する。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0019】

別の態様において、本開示は、必要な被験者の認知障害または神経変性疾患を抑制するまたは治療するために、血液または脳試料の、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の凝集を軽減させる方法を提供する。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0020】

別の態様において、本開示は、必要な患者の認知障害または神経変性疾患を抑制するまたは治療するために、腸管透過性を軽減させる方法を提供する。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0021】

前述の各態様および実施形態において、腸管バリア機能増強剤は、腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）、ポリフェノール（例えば、エラグ酸（ＥＡ）およびリポタイコ酸）、メトホルミン、ウロリチンＡ、酪酸、グルタミン、オベチコール酸（ＯＣＡ）、ジベルチン、クルクミン、スペルミジン、グルタミン、またはＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ、または誘導体を含む。具体的に、前述の各態様および実施形態において、腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤は、腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）、エラグ酸（ＥＡ）、バイオティクス、プロバイオティクス、プレバイオティクス、ポストバイオティクスを含む。特に好適な実施形態において、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減は除去するための薬剤はＩＡＰである。具体的に、特に好適な実施形態において、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減は除去するための薬剤はＥＡである。前述の各態様および実施形態において、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤は、医薬組成物として処方される。

【0022】

状況に応じて、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤は、経口投与、経皮投与、吸入、経鼻投与、局所投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与によって、投与される。

【0023】

腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を投与する際に、被験者は、１つ以上の（ａ）血液試料内の、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の凝集の軽減；（ｂ）脳組織試料内の、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の凝集の軽減；（ｃ）腸管透過性の軽減；（ｄ）細菌叢ディスバイオシスの軽減；（ｅ）腸管上皮内のオートファジーレベルの増加；（ｆ）ミクログリア内の、細胞のおよび／またはミトコンドリアのＲＯＳのレベルの減少；（ｇ）ミクログリア集団内の、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレベルの増加；（ｈ）ミクログリア内のｉＮＯＳの発現減少；（ｉ）Ｃｄｋｎｌａ、Ｃｙｂａ、Ｃｙｂｂ、Ｄｕｏｘａ１、Ｉｌ１ｂ、Ｔｇｆｂｒ２、Ｔｌｒ２、Ｔｌｒ４、Ｔｌｒ５、Ａｘｌ、Ｈｉｆ１ａ、Ｌｃｎ２、Ｍｍｐ２、Ｒｅｌａ、Ｔｒｅｘｌ、Ｓ１００ａ８、およびＳ１００ａ９からなる群から選ばれたミクログリア内の１つ以上の遺伝子発現の減少；および／または（ｊ）Ｆｏｘｐ１、Ｎｒｆ１、Ｔｒｐ５３、Ｇ６ｐｄｘ、Ｐｄｋ２、Ｓｔａｔ３、およびＵｃｐ２からなる群から選ばれたミクログリア内の１つ以上の遺伝子発現の増加を示す。

【0024】

別の態様において、本開示は、ミクログリア機能障害の発症リスクが増加するときに被験者を特定する方法を提供する。本方法は、被験者から得られた生体試料内の、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体が、基準レベルと比べて上昇したレベルを有する被験者を特定することを含み、そのようなレベルの上昇は被験者がミクログリア機能障害の発症リスクの増加を有することを示す。

【0025】

別の態様において、本開示は、認知障害の発症リスクが増加するときに被験者を特定する方法を提供する。本方法は、被験者から得られた生体試料内の、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体が、基準レベルと比べて上昇したレベルを有する被験者を特定することを含み、そのようなレベルの上昇は被験者が認知障害の発症リスクの増加を有することを示す。

【0026】

別の態様において、本開示は、神経変性疾患の発症リスクが増加するときに被験者を特定する方法を提供する。本方法は、被験者から得られた生体試料内の、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体が、基準レベルと比べて上昇したレベルを有する被験者を特定することを含み、そのようなレベルの上昇は被験者が神経変性疾患の発症リスクの増加を有することを示す。

【0027】

前述の各態様では、生体試料は組織（例えば、脳組織）または体液試料（例えば、唾液、尿、血液、血清、血漿、脳脊髄液、または糞便）である。生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の量は、例えば、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、質量分析法、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣＭＳ）、核磁気共鳴分光法、または免疫測定法を含む、当技術分野で公知の分析技術によって測定できることが予期される。

【図面の簡単な説明】

【0028】

図１ａ－１ｇは、若齢マウスおよび加齢マウスにおけるミクログリア上のトランスクリプトソームに対する細菌叢の相互作用を示す一連の概略図およびグラフを示す。図１ａは、被験者の老化における腸内細菌叢を介したＣＭＬ蓄積の概略図である。ＣＭＬはミクログリアの老化、特に酸化ストレスとミトコンドリア損傷を誘導する。腸－血液バリアの完全性を若返らせることにより、ミクログリアにおけるＣＭＬの蓄積と有害な効果を制限する。

【0029】

図１ｂは、特定の病原体フリー（ＳＰＦ）および細菌フリー（ＧＦ）環境で成長させた若齢成体マウス（６－１０週齢）および加齢マウス（９６－１０４週齢）の脳全体から蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で分離したミクログリアについて、ＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）を行う実験アプローチの概略図である。

【0030】

図１ｃは、ＳＰＦマウス（ｎ＝６，１６）とＧＦマウス（ｎ＝６，８）から分離したミクログリアのトランスクリプトーム（正規化遺伝子数）の主成分分析（ＰＣＡ）である。

【0031】

図１ｄは、ＧＦマウス対ＳＰＦマウスにおいて、年齢群間でアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）の数を示す棒グラフである。図１ｅは、年齢に依存しないＧＦマウス対ＳＰＦマウスにおけるＤＥＧのサブセット（ミクログリアＧＦシグネチャー）のヒートマップである。記号付きの遺伝子リスト（左）は、その機能アノテーション（左上）を示す。各列は生物学的レプリケートであり、各行は遺伝子である。ＤＥＧ（Ｗａｌｄ Ｐ（ａｄｊ）＜０．０５および絶対倍率変化＞１．５）。ｚスコアは正規化遺伝子数から計算した（ハッシュドグレーはアップレギュレーション、非ハッシュドグレーはダウンレギュレーション）。

【0032】

図１ｆは、年齢にわたるモジュール特性相関である。各サブプロットは、加重遺伝子共発現ネットワーク分析（ＷＧＣＮＡ）によって抽出されたすべてのモジュール固有遺伝子（ＭＥ）の描写とともに異なる群を表す（グレースケールは相関係数を表す；半径：スケール ｌｏｇ１０（Ｐａｄｊ）））。

【0033】

図１ｇは、モジュール内に濃縮された有意な遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語を、それぞれのｌｏｇ１０（Ｐａｄｊ）とともに描写する。モジュール（ＭＥ１～ＭＥ１０）あたりの遺伝子数を示す。統計：図１ｆ－ｇ、両側Ｐ値は、Ｗａｌｄ検定によって得られ、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法を用いた多重検定によって補正した。

【0034】

図２ａ－２ｉは、それぞれ、細菌叢がミクログリアにおける加齢に関連した酸化ストレスおよびミトコンドリア機能不全に寄与することを示すグラフおよび顕微鏡写真のセットである。

【0035】

図２ａは、活性酸素種（ＲＯＳ）関連ＭＥ（上からＭＥ１、ＭＥ２、ＭＥ８）を示すグラフである（グレースケール：相関係数；直径：スケール ｌｏｇ１０（Ｐａｄｊ））。

【0036】

図２ｂは、若齢成体および加齢ＳＰＦおよびＧＦマウスのミクログリアにおけるＭＥ（１，２，８）のＲＯＳ関連遺伝子のヒートマップである。各列は生物学的レプリケートである。ヒートマップの右側にリストされた遺伝子は、ヒートマップに続くテキストで上から下へ順にリストされている。

【0037】

図２ｃは、若齢成体ＳＰＦマウスに対する細胞ＲＯＳの定量化を示す棒グラフである。データは、ＳＰＦ（ｎ＝１８，１４）およびＧＦ（ｎ＝１３，１０）を含む３つの独立した実験からの平均値＋ｓｅｍとして示される。

【0038】

図２ｄは、若齢成体ＳＰＦマウスに関するミクログリアのｉＮＯＳ陽性、Ｉｂａ－１陽性領域の定量化を示す棒グラフである。データは、ＳＰＦ（ｎ＝１４，９）およびＧＦ（ｎ＝１０，９）を含み、２つの実験からの平均値＋ｓｅｍとして示される。

【0039】

図２ｅは、加齢ＳＰＦおよびＧＦマウスの大脳皮質におけるＩｂａ－１、ｉＮＯＳ、ＤＡＰＩの免疫蛍光染色を示す画像である。スケールバー、４０μｍ。

【0040】

図２ｆは、代謝関連のＭＥ１０を示す（グレースケール：相関係数；直径：スケール ｌｏｇ１０（Ｐａｄｊ）））。

【0041】

図２ｇは、加齢ＳＰＦおよびＧＦマウスの大脳皮質ミクログリアにおける健常ミトコンドリアと異常ミトコンドリアの割合を示す棒グラフである。各点は、１匹のマウスから採取した３０－３５個の細胞の平均を表す。データは、加齢ＳＰＦマウスとＧＦマウス（それぞれｎ＝８）を含む２つの独立した実験から得られた平均値＋ｓｅｍとして示した。シダックの多重比較検定による二元配置分散分析（＊Ｐ＜０．０５、＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＮＳは有意でない）。正確なＰ値は図中に報告されている。

【0042】

図２ｈは、加齢ＳＰＦおよびＧＦマウスのミクログリアの電子顕微鏡のセットである。灰色の矢頭：健常、白の矢頭：異常。スケールバー２μｍ。ミトコンドリア形態の拡大顕微鏡写真。スケールバー、５００ｎｍ

【0043】

図２ｉは、若齢成体ＳＰＦマウスに関連するミクログリアのミトコンドリア活性を示す棒グラフである。データは、ＳＰＦ（ｎ＝１７，１４）およびＧＦ（ｎ＝９，１３）を含む３つの実験からの平均値＋ｓｅｍとして示される。各点は１匹のマウスを表す。統計：図２ｃ、２ｄおよび２ｉ、テューキーの事後検定による二元配置分散分析。

【0044】

図３ａ－３ｇは、血清および脳代謝産物の細菌叢および加齢に関連した制御を示すグラフおよびチャートのセットである。図３ａは、血清試料中の短鎖脂肪酸（ＳＣＡ）濃度を示す棒グラフである。各点は１匹のマウスを表す。データは、若齢成体および加齢ＳＰＦマウス（ｎ＝５，６）を含む１つの実験からの平均値＋ｓｅｍとして示した。

【0045】

図３ｂは、若齢成体および加齢ＳＰＦマウスの血清（ｎ＝５，６）および脳組織（ｎ＝５，５）試料の、ノンターゲットメタボロミクス分析からの、特異的に豊富な代謝産物の火山プロットのセットである。

【0046】

図３ｃは、血清（１０６）と脳（１６４）から得られた特異的に豊富な代謝産物を示すベン図である。；および重複／交差（１９）を示す。

【0047】

図３ｄは、血清および脳検体の両方について、若齢マウスと比較した場合に、加齢で異なる発現量を示した代謝産物を示すグラフである。生化学的名称：アスタリスクは、基準に基づいて確認されていない化合物を示す。ｘ軸上の０より左側の棒は、若齢マウスと比較して加齢マウスで発現低下した代謝産物を示し、一方でｘ軸の０より右側の棒は、若齢マウスと比較して加齢マウスで発現増加した代謝産物を示す。

【0048】

図３ｅ－３ｆは、ＴｗｉｎｓＵＫのデータバンクからの（検出可能な場合の）ヒト加齢コホートにおける血清のノンターゲットメタボロミクスで、それぞれ定量したＣＭＬ（図３ｅ）とＴＭＡＯ（図３ｆ）のそれぞれの点プロットのセットである。データは、非特許文献３から示される。中央線；傾きと切片のベストフィット値とエラーバー（９５％信頼区間（ＣＩ））、ａ．ｕ．，任意単位。正確なＰ値は図に示されている。

【0049】

図３ｇは、若齢成体マウスおよび加齢ＳＰＦおよびＧＦマウス（若齢成体マウス、ｎ＝５；加齢マウス、各ｎ＝８）の脳のターゲットメタボロミクスによる代謝産物のサブセットを描写したヒートマップである。各列は、１匹の動物からのデータを表し、各行は代謝産物を表す。

【0050】

図４ａ－４ｌは、ＣＭＬが細菌叢を介したミクログリアの老化に寄与していることを示す。それぞれの模式図、グラフのセット、および顕微鏡写真である。図４ａは、若齢成体ＳＰＦマウスにＣＭＬ、ＴＭＡＯ、酢酸ナトリウムまたはプロピオン酸ナトリウムを２週間毎日腹腔内投与した代謝産物処理の概略図である。図４ｂは、ＲＯＳの定量化を示す棒グラフである。図４ｃは、ミトコンドリア活性を示す棒グラフである。図４ｄは、ＡＴＰレベルを示す棒グラフである。図４ｂ－ｄにおいて、各点は１つのミクログリアを表す。図４ｂ―４ｄにおいて、各点は１匹のマウスを表し、ビヒクル処置マウス（ｎ＝４）と比較して描かれた。データは、平均値＋ｓｅｍを表している。

【0051】

図４ｅは、脳におけるターゲットメタボロミクスによるＣＭＬの定量を示す棒グラフである。データは、ＳＰＦおよびＧＦマウス（若齢成体、ｎ＝５：加齢、各ｎ＝８）からの平均値＋ｓｅｍで示される。図４ｆは、ビヒクル処置またはＣＭＬ注入した若齢成体マウス（ｎ＝５）の脳を示す棒グラフである。

【0052】

図４ｇは、ＣＭＬとビヒクル注入マウスのミクログリア内のＤＥＧを表すヒートマップである。各列は生物学的レプリケートであり、各行は遺伝子である。ＤＥＧ（Ｗａｌｄ検定 Ｐａｄｊ＜０．０５ 絶対倍率変化＞１．５）。アップレギュレーションはハッシュドグレーで、ダウンレギュレーションはハッシュドグレー以外で。図４ｈはＣＭＬ特有の（ラベル化された）遺伝子をもつ加齢マウス（点）からのＳＰＦミクログリアとＧＦミクログリア内における火山プロットである。

【0053】

図４ｉは、若齢成体および加齢の、ＳＰＦおよびＧＦマウスのマウス大脳皮質内の、ＣＭＬ、Ｉｂａ－１、およびＤＡＰＩの免疫蛍光染色画像である。スケールバー、５０μｍ（概要）および１０μｍ（挿入図）。

【0054】

図４ｊは、若齢成体および加齢の、ＳＰＦ（ｎ＝９．８）およびＧＦ（ｎ＝９，９）マウスの、マウス大脳皮質内の、ＣＭＬＩｂａ－１陽性細胞の割合を示したグラフである。データは、平均値＋ｓｅｍで示される。

【0055】

図４ｋは、ヒト大脳皮質におけるＣＭＬＩｂａ－１陽性細胞と年齢の割合を、線形回帰で表したグラフである。各点は１個人を表す（ｎ＝４３；ピアソンの相関係数：ｒ＝０．５７９３，Ｒ２＝０．３３５６、Ｐ＜０．００１）。男性、ｎ＝２３、ライトグレー。女性、ｎ＝２０、ダークグレー。年齢、１歳から８８歳。中央線：傾きと切片のベストフィット値。ダークグレー線：９５％信頼区間。

【0056】

図４ｌは、ヒト大脳皮質のＣＭＬ、Ｉｂａ－１、ＤＡＰＩの免疫蛍光染色画像である。スケールバー、５０μｍ（概略）および１０μｍ（挿入図）。白い破線ボックスは細胞体を示す。統計：図４ｆにおいて、マン・ホイットニーのＵ検定による両側検定。図４Ｇにおいて、ピアソンの相関分析による両側検定。図４ｂ－４ｄにおいて、ダネットの事後検定にしたがった一元配置分散分析。図４ｅ、４ｊにおいて、テューキーの事後検定にしたがった二元配置分散分析（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）、またＰ値は図中に示されている。

【0057】

図５ａ－５ｊは、加齢による腸－血液バリアの破綻がＣＭＬの急増を引き起こすことを、それぞれ示す、棒グラフと概略図のセットである。図５ａは加齢ＳＰＦおよびＧＦマウス（ｎ＝５）から得られた新鮮な糞便内における、ターゲットメタボロミクス（ＬＣ－ＭＳ）によるＣＭＬの定量化を示す棒グラフである。図５ｂ－５ｃは、ＳＰＦ（ｎ＝５，５）またはＧＦ（ｎ＝９，４）の条件下で飼育した若齢および加齢マウス（図５ｂ）と、若齢または加齢の糞便細菌叢移植（ＦＭＴ）（ｎ＝８）を受けた若齢および加齢のＧＦマウス（図５ｃ）において、経口摂取後に循環系に移行したＦＩＴＣ蛍光標識デキストラン（４ｋＤａ）の割合によって測定された腸管透過性を示す棒グラフのセットである。図５ｄは、ＳＰＦまたはＧＦ（ｎ＝５）条件下で飼育した若齢成体マウスと加齢マウスにおける、経口投与４時間後に循環系に移行したＣＭＬの違いを示す棒グラフである。

【0058】

図５ｅは、概略図である。：１８カ月のＳＰＦマウスにビヒクル（２０％ヒドロキシプロピル－ｐ－シクロデキストリン、１ｘＰＢＳ）、ＥＡまたはＩＡＰを１０週間にわたり３日おきに経口投与した（ｎ＝４）。図５ｆは、経口投与後に蛍光ＦＩＴＣ－デキストラン（４ｋＤａ）の循環系への移行率によって測定された腸管透過性を示す棒グラフである。図５ｇは、脳内のターゲットメタボロミクス（ＬＣ－ＭＳ）によるＣＭＬの定量化を示す棒グラフである。図５ｈは、ＣｅｌｌＲＯＸプローブシグナルの相対平均蛍光強度の定量化を示す棒グラフである。図５ｉは、相対的細胞ＡＴＰの定量化を示す棒グラフである。統計：図５ａ、５ｃについて、マン・ホイットニーのＵ検定による両側検定。図５ｆ－５ｉについて、ダネットの事後検定にしたがった一元配置分散分析。図５ｂ、５ｄについて、テューキーの事後検定にしたがった二元配置分散分析（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。Ｐ値は図中に示されている。データは平均値＋ｓｅｍで示されている。

【0059】

図６ａ－６ｈは、細菌叢がミクログリアの形態において加齢に関連した差異を引き起こすが、細胞密度には影響を与えないことを示す一連の画像と棒グラフである。図６ａは、若齢成体および加齢のＳＰＦマウスとＧＦマウスの大脳皮質におけるＩｂａ－１陽性ミクログリアの免疫組織学的検出を示す画像を含む。スケールバー、２０μｍ。

【0060】

図６ｂは、大脳皮質におけるミクログリアの密度を要約した棒グラフである。ＳＰＦ（ｎ＝９，８）およびＧＦ（ｎ＝９，８）

【0061】

図６ｃは、全群の大脳皮質ミクログリアの代表的な３次元再構成図である。スケールバー、１０μｍ。

【0062】

図６ｄ－６ｈは、ＩＭＡＲＩＳに基づいた、細胞形態の半自動定量化を示す棒グラフであり、各グラフはそれぞれ、総分枝長（ｇｍ；図６ｄ）、総分枝面積（μｍ²、図６ｅ）、分岐点数（図６ｆ）、細胞体体積（μｍ³、図６ｇ）、および細胞体球形度（図６ｈ）を示す。各シンボルは、マウス１匹につき少なくとも４個の細胞を測定した平均値を示す。データは、若齢成体および加齢マウスを含む、２つの独立した実験を示す。ＳＰＦ（ｎ＝８，８）およびＧＦ（ｎ＝８，８）。統計解析：図６ｂ－６ｈ、テューキーの事後検定にしたがった二元配置分散分析（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意でない）。データは平均値＋ＳＥＭで示される。Ｐ値は、図中に示されている。

【0063】

図７ａ－７ｂは、フローサイトメトリーのためのゲート戦略とＭＡＣＳ分離の純度を示す一連のグラフである。図７ａは、ＲＴ－ｑＰＣＲとＲＮＡ－シークエンシングのための細胞選別戦略を示す一連のグラフで、（１）骨髄系細胞をサイズと粒度でゲーティングした場合の結果を示し、（２）と（３）単一細胞のみを含む場合の結果を示し、および（４）それぞれ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、顆粒球を除くために、生細胞と系統細胞をそれぞれ、ＣＤ３，ＣＤ１９，ＣＤ４５Ｒ，Ｌｙ６ＣおよびＬｙ６Ｇと、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）７８０陰性でゲーティングした結果を示し、および（５）は、ミクログリアをＣＤ４５Ｉｎｔと陽性ＣＤ１１ｂでゲーティングした結果を示す。

【0064】

図７ｂは、細胞のＡＴＰアッセイに使用した細胞の純度を示すグラフである。ミクログリア細胞をパーコール分離（挿入図１）で分離し、ＣＤ１１ｂ ＭＡＣＳ細胞分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、米国；挿入図２）を用いて濃縮し、最終結果を示す（挿入図３）、各点は１匹のマウスを示す。データは、平均値±ＳＥＭで示される。

【0065】

図８ａ－８ｄは、ＧＦおよびＳＰＦマウスのどちらの性別からの、ミクログリアの転写プロファイルを示す。

【0066】

図８ａは、選別化された細胞の純度を示すための様々な種類の免疫細胞に特有の遺伝子（正規化された遺伝子）のヒートマップである。図８ｂは、試料間のＷａｌｄのクラスタリングを示すヒートマップである。図８ｃは、固有遺伝子モジュールにおける全遺伝子のヒートマップである。

【0067】

図８ｄは、代謝産物に関連したモジュール固有遺伝子ＭＥ１０における遺伝子のヒートマップである。Ｚ値は、正規化カウントとして計算された。

【0068】

図９ａ－９ｈはそれぞれ、雌雄ＳＰＦおよびＧＦマウスのミクログリアの、加齢に関連したミトコンドリア生理機能を示す、一連の顕微鏡写真および棒グラフである。図９ａは、大脳皮質ミクログリアの、健常ミトコンドリアと異常ミトコンドリアの代表的な電子顕微鏡写真である。図９ｂはミクログリア毎の、ミトコンドリア領域の定量化を示す棒グラフである。図９ｃは、ミクログリア毎の、ミトコンドリア数を示す棒グラフである。図９ｂおよび図９ｃは加齢ＳＰＦおよびＧＦマウス（ｎ＝８）から生成された一連の棒グラフである。図９ｄは、ＲＮＡシークエンシング解析（正規化された遺伝子を数える）に基づいたミクログリアの、Ｈｉｆｌａ ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。図９ｅは、若齢成体および加齢の、ＳＰＦ（ｎ＝８，８）およびＧＦマウス（ｎ＝７，１０）のミクログリアの、ＲＴ－ｑＰＣＲによるＨｉｆｌａ ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。図９ｆは、若齢成体および加齢のＳＰＦおよびＧＦマウスのミトコンドリア質量（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＭＦＩ）を示す棒グラフである。図９ｇは、若齢成体および加齢のＳＰＦおよびＧＦマウスのミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）（ＴＭＲＭ染色ＭＦＩ）を示す棒グラフである。図９ｈは、雄の若齢成体および加齢のＳＰＦおよびＧＦマウスの細胞ＡＴＰの定量化を示す棒グラフである。データは、若齢成体および加齢マウスから生成された。統計：図９ｆおよび図９ｇについて、ＳＰＦ（ｎ＝１７，１４）およびＧＦ（ｎ＝９，１３）；図９ｈについて、ＳＰＦ（ｎ＝２３，１７）およびＧＦ（ｎ＝１４，１１）；図９ｂ－９ｈについて、データは平均値＋ｓｅｍで示されている。図９ｂおよび図９ｃについての統計解析、マン・ホイットニーのＵ検定（両側）および図９ｅ－９ｈについての統計解析、テューキーの事後検定にしたがった二元配置分散分析（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意でない）。Ｐ値は図中に示されている。

【0069】

図１０ａ－１０ｆは、ＣＭＬがマクロファージの代謝産物を調節することを示す一連の棒グラフである。図１０ａ－１０ｂは、加齢マウスの血清（図１０ａ）および脳（図１０ｂ）内の、十分豊富な代謝産物における経路エンリッチメント解析を示すグラフである（プロットされているものは、上位１５エンリッチ経路である）。カラースケール（黒～ライトグレー）、各径路内で検出された代謝産物のトータル数と重要代謝産物の数との比率。ドットサイズは、各径路の重要な代謝産物の多さを反映する。経路エンリッチメント解析は、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎのクライアントポータルを用いて自動的に行われた。

【0070】

図１０ｃは、ビヒクルまたはＣＭＬをｉ．ｐ．処置した若齢成体マウス（ｎ＝５）の大脳皮質ミクログリアの、トータルのミトコンドリア数における、健常ミトコンドリアと異常ミトコンドリアの割合を示す棒グラフである。

【0071】

図１０ｄおよび１０ｅは、それぞれ、実験６時間前に無血清培地で培養した骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の細胞内ＲＯＳ（図１０ｄ）およびミトコンドリア活性（図１０ｅ）を示す棒グラフである。細胞は、ＣＭＬの濃度を増加させながら４８時間インキュベートした後、採取して測定した。各点は、生物学的レプリケートである（ｎ＝３）。

【0072】

図１０ｄは、ＣｅｌｌＲＯＸプローブシグナルの相対ＭＦＩの定量化を示す棒グラフである。図１０ｅは、ミトコンドリア質量（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＭＦＩ）に対して正規化されたミトコンドリア膜電位（ΔΨｍ）（ＴＭＲＭ染色ＭＦＩ）として表現されたミトコンドリア活性を示す棒グラフである。図１０ｆは、ビヒクルまたはＣＭＬを腹腔内投与処置した若齢成体マウスから単離したミクログリアのトランスクリプトーム（正規化遺伝子数）の主成分分析（ＰＣＡ）である。図１０ｃ－１０ｆについての統計：データは平均値＋ＳＥＭで示されている。各点は１匹のマウスを示す。統計解析：図１０ｃについて、シダックの多重検定にしたがった二元配置分散分析、図１０ｄおよび１０ｅについて、ダネットの事後検定にしたがった一元配置分散分析（＊＊＊ｐ＜０．００１，ｎｓ＝有意でない）。Ｐ値は図中に示されている。

【0073】

図１１ａ－１１ｆは、腸内細菌叢組成の、年齢依存性の変化を示すグラフである。図１１ａは、ＰＣＡプロット（β多様性）であり、図１１ｂは、腸内細菌叢指標のシャノンおよびシンプソンのα多様性プロットである。これが統計的に有意であるかどうかを決定するために、ノンパラメトリックマン・ホイットニーのＵ検定（両側）が、試料を比較するために使用された。；ｖｅｇａｎパッケージのＡｄｏｎｉｓ（距離行列を使用する分散分析）が、β多様性に関する群の効果を評価するために、使用された。

【0074】

図１１ｃは、異なる年齢の雄マウスにおける門レベルでの腸内細菌叢組成プロファイルの相対的存在量を示すグラフである（各色は、１つの細菌門を表す；図のキーは、それぞれの色がグラフ上のその位置に隣接して位置する細菌門を表すように空間的に配置されている）。図１１ｄは、糞便試料中の、ファーミキューテス／バクテロイデーテス比率（Ｆ／Ｒ）を示す棒グラフである。図１１ｅは、ラクノスピラ科の相対的存在量を示す棒グラフである。図１１ｆは、加齢によって発現量の異なる属の相対量を示した一連のグラフである。テスト群間の門レベルおよび属レベルの分類学的差異は、“線形モデルによる多変量解析”（ＭａＡｓＬｉｎ）Ｒパッケージを用いて特定される。統計：図１１ａ－１１ｆはＳＰＦ条件下で飼育された若齢成体および加齢雄マウス（ｎ＝５，１０）からのデータを示す一連のグラフであり、各点は１匹の動物からのデータを示す。図１１ｄおよび１１ｅは、平均値＋ＳＥＭのデータを示す。図１１ｂおよび１１ｆは、箱ひげ図であり、中央の線は中央値を表し、箱の上下の境界線は第１子分数と第３子分数（２５パーセンタイルおよび７５パーセンタイル）に対応する。上ひげは、ヒンジからそれぞれの境界の四分位範囲（ＩＱＲ）の１．５倍以内の最高値まで、下ひげはそれぞれの境界から境界のＩＱＲの１．５倍以内の最低値まで伸びている。ＩＱＲは、第１四分位値と第３四分位値との間の距離である。図１１ｄおよび１１ｅで使用された統計は、マン・ホイットニーのＵ検定（両側）である。

【0075】

図１２ａ－１２ｅは、加齢に関連したミクログリアのＣＭＬの蓄積が腸を介することを示す一連の棒グラフである。図１２ａは、ＳＰＦまたはＧＦ下で飼育された若齢成体および加齢マウス（ｎ＝５）において、経口摂取後４時間後に循環系へ移行したＣＭＬに対するターゲットメタボロミクス（ＬＣ／ＭＳ）を示す棒グラフである。ライトグレー；経口投与前、ダークグレー；経口投与後４時間。各点は１匹のマウスについての個々の測定を示す。

【0076】

図１２ｂ－１２ｅは、ビヒクルまたはＣＭＬ（腹腔内投与（ｉ．ｐ．）または経口投与（ｏ．ｇ．）（各ｎ＝４））を注射した若齢成体および加齢マウスのデータのグラフおよび顕微鏡写真である。各点は１匹のマウスを示す。図１２ｂは、大脳皮質内の定量化されたＣＭＬ Ｉｂａ－１陽性細胞の割合を示す棒グラフである。図１２ｃは、マウス大脳皮質内のＣＭＬ、Ｉｂａ－１、およびＤＡＰＩ免疫蛍光標識画像である。スケールバー、５０μｍ（概要）および１０μｍ（挿入図）。図１２ｄは、ＭＦＩを決定することによって、関連細胞ＲＯＳプローブシグナルの定量化を示すグラフである。図１２ｅは、関連細胞ＡＴＰの定量化を示すグラフである。統計：図１２ａ、１２ｂ，１２ｄ，および１２ｅについて、各点は１匹のマウスを示す。データは、平均値＋ＳＥＭで示されている。図１２ｂ、１２ｄ、および１２ｅについての統計解析）テューキーの事後検定にしたがった二元配置分散分析（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ＝有意でない）。Ｐ値は図中に示されている。

【0077】

１．定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および”「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことが支持されない限り、複数の参照言語を含む。したがって、例えば、「腸管バリア機能増強剤」への言及は、２種以上のそのような腸管バリア機能増強剤の混合物を含み得る。

【0078】

本明細書で使用される場合、２つ以上の言及された対象に関連する「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」という表現は、文脈および使用から別様に理解されない限り、言及された対象の各々および２つ以上の言及された対象の様々な組み合わせを個別に含む。本明細書で使用される場合、特に別段の指示がない限り、「または（ｏｒ）」という語は、「どちらか／または（ｅｉｔｈｅｒ／ｏｒ）」という排他的な意味ではなく、「および／または」という包括的な意味で使用される。

【0079】

用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」、または「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」の使用は、その文法的等価物を含め、一般的に、オープンエンドおよび非限定的なものとして理解されるべきであり、例えば、特に明記されない限り、またはその文法的等価物から理解されない限り、追加の未反復要素またはステップを除外しない。

【0080】

用語「約（ａｂｏｕｔ）」は定量的な値の前に使用されている場合、特に別段の記載がない限り、本開示では、特定の定量値自体も含まれる。本明細書で使用される場合、約という用語は、別段の指示または推論がない限り、公称値からの±１０％の変動を指す。

【0081】

本明細書で使用される場合、「投与する（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」および「投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」という用語は、被験者に薬剤（例えば、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤）を提供するあらゆる方法を指す。このような方法は、経口投与、経皮投与、吸入、経鼻投与、局所投与、膣内投与、眼内投与、耳内投与、脳内投与、脊髄投与、脳内液投与、直腸投与、および静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与などの注射可能な投与を含む非経口投与が挙げられるが、これらに限定されない。投与は連続的または断続的に行うことができる。場合により、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を、治療目的で投与できる。他の場合において、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を、被験者における疾患または病態の予防のため、あるいは被験者（例えば被験者の脳）における１つまたは複数の免疫細胞（例えばミクログリア）機能の改善のために投与されるなど、予防的に投与できる。

【0082】

本明細書で使用される場合、「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」または「量効（ａｍｏｕｎｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」または「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」という用語は、所望の結果（例えば治療上の利益）を達成するのに十分な量、または望ましくない状態に効果を及ぼすのに十分な量を指す。例えば、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤の「治療有効量」は、被験者において所望の結果を達成するため、または疾患に影響を及ぼすために十分な量を指す場合がある。代替的に、または追加的に、腸管バリア機能増強剤の「治療有効量」は、被験者の（例えば、被験者から得られた生体試料中）のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物および／またはＣＭＬ類似体のレベルおよび／または活性を低下させるのに十分な、または腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を投与される被験者（例えば、被験者の脳内）の免疫細胞（例えば、ミクログリア）の１つ以上の機能を改善するのに十分な、腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための腸管バリア機能増強剤の量を指す場合がある。特定の被験者に対する特定の治療上有効な用量レベルは、以下を含む様々な要因に依存する。：被験者の年齢、体重、健康全般、性別、食事、民族、および／または、地理的位置；投与時間；投与経路；使用した腸管バリア機能増強剤の排泄率；治療期間；使用された特定の腸管バリア機能増強剤と併用または同時に使用される薬物、および医療技術で公知の同様の因子。例えば、治療薬の投与量を、所望の治療効果を得るのに必要な量よりも低いレベルから開始し、所望の効果が得られるまで徐々に投与量を増加させることは、当業者の技術範囲内である。必要であれば、１日の有効量を複数回に分けて投与することもできる。したがって、単回投与組成物は、１日投与量を構成するために、そのような量またはその約数を含むことができる。投与量は、禁忌がある場合には、個々の医師が調整することができる。投与量はさまざまで、毎日１回または複数回、１日または数日間投与することができる。いくつかの実施態様において、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を予防的に有効な量で投与することができる。

【0083】

所定のパラメータに関して本明細書で使用する場合、「上昇したレベル（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｌｅｖｅｌ）」という用語は、基準レベルと比較して、検出可能に高い（例えば、約５－１０％、１０－２０％、２０－３０％、３０－４０％、４０－５０％、５０－６０％、６０－７０％、７０－８０％、８０－９０％、８５－９５％、またはそれ以上；例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれ以上の）レベルを指す。例えば、本明細書で使用する場合、被験者のＣＭＬ，ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の上昇したレベルとは、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の基準レベルと比較して、検出可能なほど高い（例えば約５～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、または８５～９５％、またはそれ以上；例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれ以上）レベルを指す場合がある。例えば、被験者（例えば、被験者の脳）における免疫細胞（例えば、ミクログリア）の１つ以上の機能の上昇レベルとは、被験者（例えば、被験者の脳）における免疫細胞（例えば、ミクログリア）の１つ以上の機能の基準レベルと比較して、検出可能なほど高い（例えば、約５－１０％、１０－２０％、２０－３０％、３０－４０％、４０－５０％、５０－６０％、６０－７０％、７０－８０％、８０－９０％、８５－９５％、またはそれ以上；例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれ以上）を指す場合がある。特定の実施形態において、腸管バリアの透過性の増加レベルは、対照被験者における腸管バリアの透過性の基準レベルと比較して、検出可能なほど高い（例えば、約５～１０％、１０～２０％、約５～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、または８５～９５％、またはそれ以上；例えば、対照被験者における腸関門の透過性の基準レベルと比較して、被験者における腸関門の透過性の約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれ以上）被験者の腸管バリアの透過性のレベルを指す場合がある。

【0084】

特定の実施形態において、上昇または増加は、基準レベルと比較したパラメータまたは値において、約１％～約３００％、約１％～約２８０％、約１％～約２６０％、約１％～約２４０％、約１％～約２２０％、約１％～約２００％、約１％～約１８０％、約１％～約１６０％、約１％～約１４０％、約１％～約１２０％、約１％～約１００％、約１％～約８０％、約１％～約６０％、約１％～約４０％、約１％～約２０％、約２０％～約３００％、約２０％～約２８０％、約２０％～約２６０％、約２０％～約２４０％、約２０％～約２２０％、約２０％～約２００％、約２０％～約１８０％、約２０％～約１６０％、約２０％～約１４０％、約２０％～約１２０％、約２０％～約１００％、約２０％～約８０％、約２０％～約６０％、約２０％～約４０％、約４０％～約３００％、約４０％～約２８０％、約４０％～約２６０％、約４０％～約２４０％、約４０％～約２２０％、約４０％～約２００％、約４０％～約１８０％、約４０％～約１６０％、約４０％～約１４０％、約４０％～約１２０％、約４０％～約１００％、約４０％～約８０％、約４０％～約６０％、約６０％～約３００％、約６０％～約２８０％、約６０％～約２６０％、約６０％～約２４０％、約６０％～約２２０％、約６０％～約２００％、約６０％～約１８０％、約６０％～約１６０％、約６０％～約１４０％、約６０％～約１２０％、約６０％～約１００％、約６０％～約８０％、約８０％～約３００％、約８０％～約２８０％、約８０％～約２６０％、約８０％～約２４０％、約８０％～約２２０％、約８０％～約２００％、約８０％～約１８０％、約８０％～約１６０％、約８０％～約１４０％、約８０％～約１２０％、約８０％～約１００％、約１００％～約３００％、約１００％～約２８０％、約１００％～約２６０％、約１００％～約２４０％、約１００％～約２２０％、約１００％～約２００％、約１００％～約１８０％、約１００％～約１６０％、約１００％～約１４０％、約１００％～約１２０％、約１２０％～約３００％、約１２０％～約２８０％、約１２０％～約２６０％、約１２０％～約２４０％、約１２０％～約２２０％、約１２０％～約２００％、約１２０％～約１８０％、約１２０％～約１６０％、約１２０％～約１４０％、約１４０％～約３００％、約１４０％～約２８０％、約１４０％～約２６０％、約１４０％～約２４０％、約１４０％～約２２０％、約１４０％～約２００％、約１４０％～約１８０％、約１４０％～約１６０％、約１６０％～約３００％、約１６０％～約２８０％、約１６０％～約２６０％、約１６０％～約２４０％、約１６０％～約２２０％、約１６０％～約２００％、約１６０％～約１８０％、約１８０％～約３００％、約１８％～約２８０％、約１８０％～約２６０％、約１８０％～約２４０％、約１８０％～約２２０％、約１８０％～約２００％、約２００％～約３００％、約２００％～約２８０％、約２００％～約２６０％、約２００％～約２４０％、約２００％～約２２０％、約２２０％～約３００％、約２２０％～約２８０％、約２２０％～約２６０％、約２２０％～約２４０％、約２４０％～約３００％、約２４０％～約２８０％、約２４０％～約２６０％、約２６０％～約３００％、約２６０％～約２８０％、約２８０％～約３００％）の増加で表すことができる。

【0085】

本明細書で使用される、「腸管バリア機能増強剤（ｇｕｔ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｒ）」とは、被験者の腸からのＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、および／またはＣＭＬ類似体の通過、および腸から被験者の組織または体液へのＣＭＬ、ＣＭＬ代謝産物、ＣＭＬ前駆体、および／またはＣＭＬ類似体の蓄積率を、中間体を介して直接的または間接的のどちらかで、時間とともに減少させる薬剤を指す。腸管バリア機能増強剤の非限定的な例は、腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）、ポリフェノール（例えば、エラグ酸（ＥＡ）およびリポテイコ酸）、メトホルミン、ウロリチンＡ、酪酸、グルタミン、オベチコール酸（ＯＣＡ）、ジベルチン、クルクミン、スペルミジン、グルタミン、またはＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ）、またはそれらの誘導体である。例えば、ＩＡＰは、被験者の腸からのＣＭＬ、ＣＭＬ代謝産物、ＣＭＬ前駆体、および／またはＣＭＬ類似体の通過、および腸から被験者の組織または体液へのＣＭＬ、ＣＭＬ代謝産物、ＣＭＬ前駆体、および／またはＣＭＬ類似体の蓄積率を直接低下させる腸管バリア機能増強剤である。ＥＡは、被験者の腸からのＣＭＬ、ＣＭＬ代謝産物、ＣＭＬ前駆体、および／またはＣＭＬ類似体の通過、および腸から被験者の組織または体液へのＣＭＬ、ＣＭＬ代謝産物、ＣＭＬ前駆体、および／またはＣＭＬ類似体の蓄積率を間接的に（例えば、中間体を介して）低下させる腸管バリア機能増強剤の一例である。ＥＡは、ミオシン軽鎖２（ＭＬＣ２）シグナルを介して、細胞孔を形成するクローディン－４、－７、－１５の発現を低下させると考えられているため、間接的に腸のバリア機能を高める。

【0086】

本明細書で使用される、「腸内細菌叢ディスバイオシス（ｇｕｔ ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）」とは、例えば、腹部膨満感、鼓腸、痙攣、腸管透過性の喪失に伴う炎症、粘膜表面の形成不全、および緩衝能のための栄養素の不十分な再利用のうちの１つ以上を含む様々な症状をもたらし得る、被験者の腸内の微生物（例えば、有益微生物および／または病原性微生物）の相対的存在量または存在における不均衡を指す。ディスバイオシスには、有益な微生物の損失、および／または病原性微生物（例えば、ｐａｔｈｏｂｉｏｎｔｓ）の拡大が含まれる。ディスバイオシスは、様々な疾患状態に関連する炎症促進作用および免疫調節異常を誘発すると考えられている。本明細書で使用する「腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤」とは、中間体を介して直接的または間接的のどちらかで、腸内細菌叢ディスバイオシスで生じる腸内細菌叢の調節異常を改善する薬剤を指す。腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための（例えば、直接的または間接的な）薬剤の非限定的な例としては、ＩＡＰおよびＥＡ、バイオティクス、プレバイオティクス、プロバイオティクスおよびポストバイオティクスが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、有益な微生物を消化管に特異的に送達することにより、腸内マイクロバイオームに直接的な影響を与えるので、プロバイオティクスは、腸内細菌叢ディスバイオシスを直接的に軽減または除去するための薬剤である。例示的なプロバイオティクスには、ラクトバチルス属、ビフィドバクテリウム属、およびストレプトコッカス属に属する細菌が含まれる。プレバイオティクスは、健康上の利益を引き出す特定の有益な細菌種の増殖を促進し、例示的なプレバイオティクスとしては、リポテイコ酸およびポリフェノールが挙げられる。ポストバイオティクスは、例えば、マイクロバイオームによってそのライフサイクル中に生成された代謝産物、発酵産物、ミネラル（例えば、亜鉛およびセレン）、微量元素、微量栄養素、細胞表面タンパク質、および有機酸であり、環境ユビオシスに寄与する産物であることが特徴である。ポストバイオティクスは細菌叢の構造を間接的に形成し、それによって腸内細菌叢ディスバイオシスを間接的に軽減または除去する薬剤となる。

【0087】

本明細書において、「神経変性疾患（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）」または「神経変性障害（ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」という用語は、互換的に使用され、中枢神経系または末梢神経系の構造および／または機能の進行性変性によって特徴づけられる障害の異種群の１つ以上の状態を指す。神経変性疾患は、可動性、協調性、筋力、感覚、および認知に不可欠な細胞および神経系の結合に対する進行性の損傷に起因する様々な状態を包含する。一般的な神経変性疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、またはその他の認知症が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0088】

本明細書で使用される、「医薬組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」という用語は、活性剤（例えば、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤）と、不活性または活性な担体との組み合わせを指し、組成物をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでの診断的または治療的使用に特に適したものとする。本明細書で使用される、「医薬組成物」という用語は、被験者への投与に適した形態で、本開示の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を含む製剤であり得る。一実施形態では、医薬組成物は、バルクまたは単位剤形である。単位剤形は、例えば、カプセル、点滴バッグ、錠剤、エアロゾル吸入器のシングルポンプ、またはバイアルを含む、様々な形態のいずれかである。組成物の単位用量中の有効成分（例えば、開示された腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤、またはそれらの塩、水和物、溶媒和物もしくは異性体の製剤）の量は、有効量であり、関係する特定の治療に応じて変化し得る。当業者であれば、被験者の年齢および状態に応じて投与量を日常的に変化させることが必要な場合があることを理解するであろう。投与量も投与経路に依存する。例えば、経口、肺、直腸、非経口、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、頬側、舌下、胸膜内、髄腔内、経鼻など、様々な経路が考えられる。腸管バリア機能増強剤の局所投与または経皮投与のための剤形としては、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤を含む。一実施形態では、腸管バリア機能増強剤は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要な保存剤、緩衝剤、または推進剤と混合される。

【0089】

本明細書で使用される、「薬学的に許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」という用語は、合理的な利益／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した緩衝剤、担体、および賦形剤を指す。薬学的に許容される担体としては、リン酸塩緩衝液、水、エマルション（例えば、油／水または水／油エマルションなど）、および様々な種類の界面活性剤などの標準的な薬学的担体のいずれかが含まれる。組成物はまた、安定剤および保存剤を含み得る。担体、安定剤およびアジュバントの例については、例えば、Ａｄｅｂｏｙｅ Ａｄｅｊａｒｅ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ．Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（２３ｄ ｅｄ．２０２０）を参照のこと。薬学的に許容される担体には、医薬投与と相性が良い緩衝剤、溶媒、分散媒体、コーティング剤、等張および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は当技術分野で知られている。

【0090】

用語「薬学的有効量（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」、「薬理学的有効量（ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」、「生理学的有効量（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」、または腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤の「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、互換的に使用され、本明細書に記載されるような１つまたは複数の医薬組成物中に存在する生物活性薬剤または生物活性薬剤の組み合わせの量を指し、そのような組成物が投与されたときに予想される生理学的応答を与えるために、治療される被験者の血流中または作用部位（例えば、肝系、腎系、循環器系、肺、胃腸系、大腸系など）に所望のレベルの活性薬剤または薬剤を提供するために必要である。

【0091】

本明細書で使用される場合、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔ）」または「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」という用語は、特に事前の行動によって、何かが起こるのを不可能にする、回避する、取り除く、未然に防ぐ、阻止する、または妨げることを指す。本明細書において「軽減（ｒｅｄｕｃｅ）」、「抑制（ｉｎｈｉｂｉｔ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔ）」が使用される場合、特に別段の指示がない限り、他の２つの単語の使用も明示的に意図されていることを理解されたい。「予防」という用語は、ある事象の可能性を１００％排除することを必要としない。むしろ、事象の発生の可能性が、本明細書に記載の化合物または方法の存在下で減少したことを示す。様々な局面において、用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）を含む被験者の任意の処置を対象とし、以下を含む：（ｉ）疾患に罹患する素因を有し得るが、疾患に罹患しているとまだ診断されていない被験者において、疾患の発生を予防すること；（ｉｉ）疾患の発生を抑制するか、または疾患の進行率を低下させるなど、疾患を阻害すること；または（ｉｉｉ）疾患の退行を引き起こすなど、疾患を緩和すること。

【0092】

パラメータまたは割合に関して本明細書で使用される、「軽減（ｒｅｄｕｃｅ）」または「軽減する（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」または「減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」または「減少する（ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ）」または「緩和（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）」または「緩和する（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」という用語は、対照と比較してパラメータまたは割合がより小さくなる（例えば、約５～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、または８５～９５％；例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはそれ以上）ように、パラメータまたは割合の検出可能な変化を指す。

【0093】

本明細書で使用される、文脈に応じた、「対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）」とは、本明細書に記載の組成物および／または方法に曝露されていない試料、または対照被験者を指す。「対照被験者（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｕｂｊｅｃｔ）」は、本明細書に開示される組成物および／または方法を受けていない被験者を指す。本明細書で使用される、「テスト被験者（ｔｅｓｔ ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、本明細書に記載される組成物および方法を受けた、または受ける予定の被験者を指す。パラメータを参照して本明細書で使用される、「適切な対照（ｓｕｉｔａｂｌｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）」は、対照被験者（例えば、本明細書に記載される治療を受ける前のテスト被験者；または本明細書に記載される治療を受けなかった、被験者と異なる被験者または被験者と同様の症状を有する被験者の群）におけるパラメータを指す場合がある。例えば、本明細書においてＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体のレベルに関して使用される、「適切な対照」は、被験者（例えば、本明細書に記載の治療を受ける前の被験者；または本明細書に記載の治療を受けなかった、異なる被験者または被験者と同様の症状を有する被験者群）におけるＣＭＬ、ＣＭＬ類似体、ＣＭＬ前駆体、またはＣＭＬ代謝産物のレベルを指す場合がある。

【0094】

パラメータに関して本明細書で使用される、「基準レベル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｌｅｖｅｌ）」は、そのパラメータの確立された正常レベル、または確立された標準対照を指す場合がある。例えば、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体のレベルに関して本明細書で使用する場合、基準レベルは、神経変性疾患、または認知障害の症状を示さない、および／または神経変性疾患、または認知障害を発症するリスクが増加していない被験者または被験者群におけるＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体のレベルを指す場合がある。

【0095】

用語「被験者（ｓｕｂｊｅｃｔ）」、「個人（ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ）」および「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」は、互換的に使用され、本明細書に記載される方法および／または組成物によって処置される生物を指す。このような生物は、好ましくは、哺乳動物（例えば、ネズミ、類人猿、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）を含むが、これらに限定されず、より好ましくは、ヒトを含む。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。したがって、成人および新生児の被験者は、男性であるか女性であるかにかかわらず、被験者とすることが意図されている。例えば、被験者はヒトであり得る。特に、被験者は、神経変性疾患を有するか、または脳機能障害を発症するリスクが増大したヒトであり、神経機能に障害を有するか、神経変性疾患を有するか（例えば、神経変性疾患を有すると以前に特定または診断された被験者）、または神経変性疾患を発症するリスクが増大したと特定された被験者であり得、認知障害を有するか、または認知障害を発症するリスクが増大したと特定された被験者であり得る。

【0096】

本明細書で使用される、用語「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」には、任意の効果を含み、例えば、状態、疾患、障害などの改善、またはその症状の改善をもたらす、軽減、低減、調節、改善、または除去が含まれる。

【0097】

本明細書で使用される、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、疾患または障害を治癒、改善、安定化、または予防する目的で被験者を医学的に管理することを指す。特定の実施形態において、この用語は、被験者（例えば、被験者の脳内）における１つ以上の免疫細胞（例えば、ミクログリア）の機能の改善を意味する。この用語には、積極的治療、原因治療（例えば、疾患の原因に向けられた治療）、緩和的治療（例えば、疾患に伴う症状または合併症の緩和を目的とした治療）、予防的治療（例えば、疾患または疾患の発症を遅延、最小化、進行率の低下、または部分的もしくは完全に抑制することを目的とした治療）、および支持的治療（例えば、別の治療を補完するために採用される治療）が含まれる。治療には、疾患に関連する１つ以上の症状および／または合併症を治癒、抑制、軽減、緩和、および／または改善することも含まれる。治療には、疾患に関連する症状および／または合併症の、予防および／または進行率の低下および／または発症の遅延も含まれる。治療にはまた、疾患の広がりの縮減；疾患の進行率の遅延または減速または減少；疾患の改善または緩和；および検出可能であるか検出不可能であるかにかかわらず寛解（部分的であるか全体的であるかにかかわらず）も含まれる。疾患の「改善または緩和」とは、治療がない場合の程度または時間経過と比較して、疾患の程度および／または望ましくない臨床症状が軽減されること、および／または進行の時間経過または速度が遅くまたは長くなることを意味する。治療は、疾患に関連する症状または合併症の完全な改善を必要とせず、症状および／または疾患の根本的な危険因子を軽減する実施形態を包含する。治療を必要とするものには、既に疾患を有するもの、疾患を有するリスクのあるもの、または状態もしくは障害が予防されるべきものが含まれる。

【0098】

本明細書を通して、組成物が特定の成分を有する、含む、またはそれからなるとして記載される場合、または工程および方法が特定のステップを有する、含む、またはそれからなるとして記載される場合、さらに、本質的に、または引用された成分からなる本発明の組成物が存在すること、および本質的に、または引用された処理ステップからなる本発明による工程および方法が存在することが企図される。

【0099】

本出願において、ある要素または構成要素が、引用された要素または構成要素のリストに含まれ、および／またはそのリストから選択されると述べられている場合、その要素または構成要素は、引用された要素または構成要素のうちの任意の１つであり得るか、またはその要素または構成要素は、引用された要素または構成要素のうちの２つ以上からなる群から選択され得ることが理解されるべきである。

【0100】

さらに、本明細書に記載される方法の要素および／または特徴は、本明細書において明示的であろうと暗示的であろうと、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な方法で組み合わせることができることを理解すべきである。例えば、特定の化合物への言及がなされる場合、その化合物は、文脈から別様に理解されない限り、本明細書に開示される組成物の種々の実施形態において、および／または本明細書に開示される方法において使用され得る。言い換えれば、本出願内において、実施形態は、明確かつ簡潔な本出願が記載され引用されることを可能にする方法で、記載され引用されてきたが、実施形態は、本教示から離れることなく、様々に組み合わされ、または分離されてもよいことが意図され、理解されるであろう。例えば、本明細書に記載され表現されたあらゆる特徴は、本明細書に記載され表現された本発明の全ての態様に適用可能であることが理解されるであろう。

【0101】

「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｏｆ）」という表現は、文脈および使用から別段理解されない限り、表現の後に記載された対象の各々、および記載された対象の２つ以上の様々な組合せを個別に含むと理解されたい。

【0102】

本発明が動作可能である限り、ステップの順序や特定の動作を実行する順序は重要ではないことを理解されたい。さらに、２つ以上のステップまたは動作を同時に行ってもよい。

【0103】

本明細書におけるあらゆる例、または例示的な言語、例えば「のような（ｓｕｃｈ ａｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図したものであり、請求されない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる文言も、請求されていない要素が本発明の実施に必須であることを示すものとして解釈されるべきではない。
ＩＩ．一般的な発見と考察

【0104】

本開示は、部分的には、腸内細菌叢によって産生される代謝産物Ｎ６－カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）が、ミクログリアにおける加齢に関連する酸化ストレスおよびミトコンドリア損傷を駆動し、加齢に伴い脳内で増加するＣＭＬ量が、認知障害、および神経変性障害をもたらし得るという発見に基づいている。さらに、被験者の加齢に伴う体液や組織試料中のＣＭＬの増加または蓄積は、加齢の進行に伴う腸管透過性の亢進に起因する可能性があることが発見されており、その結果、より高レベルのＣＭＬが腸壁を通過して被験者の体液や組織に入ると考えられている。これらの発見に基づき、神経変性疾患、認知障害、神経機能障害を治療したり、その発症率を低下させたりする治療法を提供することが可能である。

【0105】

加齢に伴いミクログリア機能は低下するが、本研究以前には、加齢過程におけるミクログリアと腸内細菌叢の相互作用はよく特徴付けられていなかったようである。本明細書で開示するように、無菌および特定の病原体を含まない条件下で飼育した若齢成体マウスと加齢マウスのミクログリアトランスクリプトームを比較したところ、腸内細菌叢がミクログリア遺伝子発現の加齢に伴う変化に影響していることが判明した。また、腸内細菌叢の不在は、加齢マウスの脳のミクログリアにおける酸化ストレスを減少させ、ミトコンドリア機能障害を改善することも明らかになった。血清と脳組織における偏りのないメタボローム解析から、加齢脳のミクログリアにはＮ６－カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）が蓄積していることが明らかになった。ＣＭＬは活性酸素種のバーストを媒介し、ミクログリアのミトコンドリア活性とＡＴＰ貯蔵を阻害するようである。ヒトの血清と脳におけるＣＭＬレベルの加齢依存的上昇も検証された。さらに、加齢マウスでは、細菌叢に依存した腸管透過性の亢進が、ＣＭＬレベルの上昇を媒介した。本明細書に記載された研究により、加齢マウスのミクログリアの特異的な特徴が、腸内細菌叢によってどのように制御されているのかについての知見が得られる。

【0106】

より具体的には、図１ａに模式的に示すように、特定病原体フリー（ＳＰＦ）条件下で生育したマウスは、無菌（ＧＦ）条件下で生育したマウスに比べて、脳内の腸管由来ＣＭＬのレベルが高いことが発見された。その結果、ＳＰＦマウスの脳はＧＦマウスに比べて活性酸素が多くなり、ＡＴＰが低下した。加齢が進むと、ＳＰＦマウスの方がＧＦマウスよりもミクログリアが活性化する。また、腸管バリア機能を高める薬剤が、加齢過程における腸由来ＣＭＬの放出を遅らせることも発見された。また、加齢に伴う腸内細菌叢ディスバイオシスを除去する薬剤が、加齢過程で産生される腸管由来ＣＭＬの量を減少させることも発見された。これらの薬剤は、認知障害や神経変性疾患の発症を抑制することができる。

【0107】

加齢に伴い腸内細菌叢がミクログリアのトランスクリプトーム・プロファイルを変化させる
大脳皮質では、加齢に伴ってミクログリア細胞密度が高くなることが報告されている（非特許文献４）。若齢成体マウスと加齢マウスとの間で、特異的病原体フリー（ＳＰＦ）動物および細菌フリー（ＧＦ）動物の大脳皮質におけるミクログリア細胞密度の増加が認められたが（参照、図６ａ～６ｂ）、加齢ＳＰＦマウスとＧＦマウスとの間には差は認められなかった（参照、図６ａ～６ｂ）。老化ミクログリアの最も顕著で最初に特定された特徴の一つは、その形態の変化である。ＳＰＦマウスとＧＦマウスのミクログリアにおける潜在的な形態学的変化を決定するために、定量的形態再構築が行われた。ＳＰＦマウスのミクログリアは、細胞体積の増加とともに、総分岐面積、総分岐長、分岐点の数の減少を示したが（図６ｃ－６ｇ参照）、細胞体の球形度は両群間で変化しなかった（図６ｈ参照）。これらのデータは、ＳＰＦマウスでは年齢がミクログリアの形態に影響を及ぼすが、ＧＦマウスではミクログリアは変化せず、高分岐化したことを示している。

【0108】

加齢脳におけるミクログリア生理機能の細菌叢依存性変化をさらに評価するために、ＧＦまたはＳＰＦ条件下で飼育された、若齢成体（６～１０週齢）および加齢（９６～１０４週齢）の雌雄マウスの全脳からＦＡＣＳ精製ミクログリア（図７ａおよび図８ａ参照）に対してＲＮＡ－ｓｅｑを行った（図１ｂおよび図８ｂ参照）。ＧＦマウスとＳＰＦマウスにおける、両年齢群にわたるミクログリアの遺伝子発現プロファイルの違いおよび、ＧＦマウスとＳＰＦマウスから単離されたミクログリア間のトランスクリプトーム上の差異は、高年齢でより顕著であった（図１ｄ参照）。ＳＰＦマウスのミクログリアと比較すると、ＧＦマウスのミクログリアでは年齢に依存しない遺伝子発現パターン（ミクログリアＧＦシグネチャー）が出現し、これには細胞骨格（例えばＳｄｃ３、Ｓｕｌｔ１ａ１、Ｔｕｂａ４ａ）や免疫機能（例えばＣｔｓｅ、Ｅｒｏ１ｌｂ、Ｈｔｒａ３、Ｋｃｎｍａ１、Ｎｏｔｃｈ４、Ｎｒ１ｄ２、Ｒａｂ４ａ、Ｗｄｆｙ１）に関連する遺伝子が含まれていた（図１ｅ参照）。さらに、ミクログリアＧＦシグネチャーには、ミトコンドリア機能の制御に関連する遺伝子（例えば、Ｂ４ｇａｌｎｔ１、Ｇｐｒ１３７ｂ、Ｇｓｔｍ１、Ｍｃｕｒ１、Ｍｔｆｐ１、ＮｎｔおよびＰｌｃｄ３）が含まれており、ミクログリアの代謝プロファイルを制御する細菌叢の能力が示された（図１ｅ参照）。次に、加重遺伝子共発現ネットワーク解析（ＷＧＣＮＡ）を用いて、年齢と細菌叢に関するミクログリアの遺伝子発現の機能的変化を特徴付けた（非特許文献５）。分散の５０％以上を有意に説明した遺伝子（Ｗａｌｄ Ｐａｄｊ＜０．０５）は、共発現パターンに基づいてモジュール固有遺伝子（ＭＥ）に分類された。ＳＰＦまたはＧＦ飼育下の若齢成体群を比較したところ（非特許文献６）、免疫機能とエピジェネティック制御に関連する遺伝子ネットワーク、それぞれＭＥ１、ＭＥ５、ＭＥ６、ＭＥ７にわずかな違いが発見された。しかしながら、２つのモジュールが各年齢群に特徴的であった。加齢ＳＰＦ群のＭＥ１とＭＥ４には、ミトコンドリア代謝や脂質局在化などのプロセスに関連する遺伝子が含まれており、加齢ＧＦ群のＭＥ２とＭＥ６には、免疫応答、ヒストンリシンメチル化、細胞形態形成を制御する遺伝子が含まれていた。

【0109】

次に、加齢に関連したＭＥに対する細菌叢の寄与を調査した。加重遺伝子共発現ネットワーク解析（ＷＧＣＮＡ）により、加齢ＧＦマウスのミクログリアは、ＳＰＦマウスの一般的な加齢傾向を踏襲していたが、その規模は低く（図１ｆ－１ｇ参照）、若齢成体群に近いクラスターを形成していた（図８ｂ参照）。例えば、免疫応答（例えば、Ａｘｌ、Ｃｒｌｆ２、Ｔｎｆｓｆ８、Ｔｎｆｓｆ１０、Ｃｃｌ１２、Ｆｇｒ、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ６ｓｔ、Ｓｐｐ１およびＴｌｒ２）、インターフェロンシグナル伝達（例えば、Ｃｘｃｌ１０／８、Ｉｆｉ２０７、Ｉｆｉｔ２／８およびＳｔａｔ１）、炎症応答（例えば、Ｃｄ１８０、Ｌｄｌｒ、Ｓ１００ａ８およびＳ１００ａ９など）およびミクログリア細胞遊走（Ｃｃｌ１２およびＣｘｃｌ１０など）に関連するＭＥ１およびＭＥ８の遺伝子は、加齢ＳＰＦマウスのミクログリアにおいて特異的なアップレギュレーションを示したが、若齢成体群および加齢ＧＦマウスのいずれにおいても、負の相関または低い相関を示した（図２ａおよび図８ｃ－８ｄ参照）。加齢ＳＰＦ群のＭＥ１とＭＥ４には、ミトコンドリア代謝や脂質局在化などのプロセスに関連する遺伝子が含まれ、一方で加齢ＧＦ群のＭＥ２とＭＥ６には、免疫応答、ヒストンリジンメチル化、細胞形態形成の制御を行う遺伝子が含まれた（図８ｃ）。免疫応答（例えば、Ａｘｌ、Ｃｒｌｆ２、Ｔｎｆｓｆ８、Ｔｎｆｓｆ１０、Ｃｃｌ１２、Ｆｇｒ、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ６ｓｔ、Ｓｐｐ１、およびＴｌｒ２）、インターフェロンシグナル伝達（例えば、Ｃｘｃｌ１０ ８、Ｉｆｉ２０７、Ｉｆｉｔ２ ８、およびＳｔａｔ１）、炎症応答（例えば、Ｃｄ１８０、Ｌｄｌｒ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９など）、ミクログリア細胞遊走（Ｃｃｌ１２、Ｃｘｃｌ１０など）に関連する、ＭＥ１およびＭＥ８の遺伝子は、加齢ＳＰＦマウスのミクログリアにおいて特異的な発現上昇を示したが、若齢成体群および加齢ＧＦマウスではいずれも負の相関または低い相関を示した。ＭＥ１とＭＥ８は、ミトコンドリア代謝過程、過酸化水素代謝過程、活性酸素代謝過程を含み、加齢ＳＰＦ群で強い相関を示した。加齢ＧＦマウスに高度に濃縮されたＭＥ２は、酸素含有化合物に対する反応と関連していた（図８ｃ）。ＭＥ２に含まれる遺伝子には、Ｆｏｘｐ１、Ｎｒｆ１、Ｔｒｐ５３などの細胞内ＲＯＳレベルを調節する遺伝子や、Ｇ６ｐｄｘ、Ｐｄｋ２、Ｓｔａｔ３、Ｕｃｐ２などのミトコンドリアＲＯＳの調節に関与する遺伝子が含まれるが、加齢ＳＰＦマウスのミクログリアでは、年齢をマッチさせたＧＦマウスと比較して発現量が少なく、加齢ＳＰＦマウスのＲＯＳレベルが最適な細胞内範囲に保てないことを示している。加齢脳におけるＲＯＳの蓄積は、ミトコンドリア損傷およびミトコンドリア機能障害と関連している（非特許文献７）。ＭＥ３、ＭＥ５、ＭＥ９では、ミトコンドリアの集合、糖質代謝、酸化的リン酸化に関連する遺伝子に顕著な変化が見られた。これらの遺伝子はＳＰＦマウスでもＧＦマウスでも発現が上昇したが、ここでは保護ＲＯＳ制御遺伝子がダウンレギュレートされたので、ＳＰＦマウスではミトコンドリアの損傷がより顕著であった。さらに、加齢ＧＦマウスでは、ミトコンドリアの構造と機能を維持する遺伝子の発現が上昇した（図８ｄ）。ミクログリアは加齢とともにトランスクリプトームプロファイルに変化を示し、細菌叢に依存した分岐が見られた。

【0110】

加齢ＧＦマウスのミクログリアにおける酸化ストレスの減少
ミクログリアにおける細胞老化の主な特徴は、酸化ストレスの増加であり、これは活性酸素種（ＲＯＳ）の細胞内レベルの上昇を指す（非特許文献８）。加齢関連モジュールのパスウェイを調べると、細菌叢に依存するミクログリアの酸化ストレス制御へのつながりがいくつか見つかった。ミトコンドリア代謝過程、過酸化水素代謝過程、ＲＯＳ代謝過程を含むＭＥ１とＭＥ８は、加齢ＳＰＦ群で強い相関を示した。加齢ＧＦマウスで高度に濃縮されたＭＥ２は、酸素含有化合物に対する反応と関連していた（図１ｆ－１ｇおよび図２ａ参照）。ミクログリアのＲＯＳ関連遺伝子の発現レベルがマウスの年齢と飼育条件によって調節されていることを確認するため、年齢が関係するＭＥ１、ＭＥ２、ＭＥ８のＲＯＳ関連遺伝子を選択的に解析した。加齢ＳＰＦマウスのミクログリアにおいてのみ、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｙｂａ、Ｃｙｂｂ、Ｄｕｏｘａ１、Ｉｌ１ｂ、Ｔｇｆｂｒ２、Ｔｌｒ２、Ｔｌｒ４およびＴｌｒ５のようないくつかの免疫活性化およびＲＯＳ促進遺伝子、ならびにＡｘｌ、Ｈｉｆ１ａ、Ｌｃｎ２、Ｍｍｐ２、Ｒｅｌａ、Ｔｒｅｘ１、Ｓ１００ａ８およびＳ１００ａ９のようなＲＯＳ応答遺伝子の特異的な発現上昇が認められた（図２ｂ参照）。Ｆｏｘｐ１、Ｎｒｆ１、Ｔｒｐ５３のような細胞内ＲＯＳレベルを制御する遺伝子や、Ｇ６ｐｄｘ、Ｐｄｋ２、Ｓｔａｔ３、Ｕｃｐ２のようなミトコンドリアのＲＯＳ制御に関与する遺伝子を含むＭＥ２の遺伝子は、年齢をマッチさせたＧＦマウスと比較して、加齢ＳＰＦマウスのミクログリアでは発現が少なかった（図２ｂ参照）。若齢成体および加齢ＳＰＦマウスから単離したミクログリアにおけるＲＯＳ産生をＣｅｌｌＲＯＸフローサイトメトリーアッセイでモニターしたところ、ＲＯＳの有意な上昇が加齢とともに観察され、加齢ＧＦマウスでは減少していた（図２ｃ参照）。誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の活性化は、過剰ＲＯＳの生成に直接関係しているようである（非特許文献９、非特許文献１０）。免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いると、ＳＰＦ条件下でのミクログリアｉＮＯＳ発現の年齢依存的増加が観察されたが、ＧＦマウスではあまり顕著ではなかった（図２ｄ－２ｅ参照）。

【0111】

ＲＯＳの増加がミクログリアの機能にどのような影響を及ぼすかを調べたところ、ミトコンドリアのアセンブリー、糖代謝および酸化的リン酸化に関連する遺伝子に変化が起こることがわかった（図２ｆ参照）。ミクログリアのミトコンドリアを電子顕微鏡で観察すると、加齢ＳＰＦマウスでは、加齢ＧＦマウスに比べて、ミクログリアあたりのミトコンドリアの質量や数には変化がなかったが、クリステがあまり明瞭でない、あるいは破壊された損傷ミトコンドリアの割合がかなり高いことが明らかになった。加齢ＳＰＦマウスのミクログリアでピークに達した細胞内ＲＯＳの蓄積は、低酸素誘導因子１サブユニットα（Ｈｉｆ１ａ）の発現を誘導するようである。加齢脳におけるミトコンドリア機能障害は代謝シフトを引き起こし、ミクログリアの過度の活性化と関連している。若齢成体マウスは同様のＨｉｆ１ａ発現を示したが、ＲＮＡ－ｓｅｑおよび逆転写による定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）では、加齢ＳＰＦマウスのミクログリアにおけるＨｉｆ１ａ発現がＧＦマウスよりも高いことが示された（図９ｄ－９ｅ参照）。加齢動物の細胞では酸化的リン酸化の効率が低下し、ＡＴＰ産生の減少につながる。ミトコンドリアの膜貫通電位（ΔΨｍ）はＡＴＰ産生の主要な原動力であると思われる。加齢に伴うミトコンドリア質量の増加を考慮し、ミトコンドリア活性をミトコンドリア質量に対するミトコンドリアの膜貫通電位としてプロットした。ミトコンドリア活性は、ＳＰＦマウスでは加齢に伴う低下と細胞内ＡＴＰリザーバーの減少を示したが、ＧＦマウスのミクログリアでは両者ともそれほど顕著ではなかった（図２ｉ、図７ｂ、図９ｈ参照）。これらのデータを総合すると、細菌叢は加齢脳のミクログリアにおける酸化ストレスの増加に寄与しており、それはミトコンドリアへの直接的な損傷と関連していることがわかる。

【0112】

細菌叢に依存したＣＭＬの加齢による蓄積
若齢成体および加齢ＳＰＦマウスの血清試料中の短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）濃度を、標的液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）代謝産物分析を用いて特定した（図３ａ参照）。若齢成体マウスおよび加齢マウスの血清中では酢酸塩が最も多く、若齢成体マウスと比較して加齢マウスの血清中では酢酸塩およびプロピオン酸塩の濃度が高かった。酪酸／イソ酪酸および吉草酸／イソ吉草酸は変化しなかった。偏りのないスクリーニングでは、ノンターゲットメタボロミクスデータセットを使用し、ＳＰＦ条件下で飼育した若齢成体マウスと加齢マウスの血清および脳試料を調査した（図３ｂ～３ｃ参照）（参照、非特許文献１１）。パスウェイの濃縮解析により、いくつかの組織特異的なパスウェイの変化が明らかになった。例えば、ピリミジン、イノシトール、カルニチン、およびアミノ酸代謝に関連するいくつかの経路（例えば、リジン、ポリアミン、チロシン）は、加齢マウスの血清においてより影響を受けていた（図１０ａ参照）。ビタミンＡ、トコフェロール、プリン代謝、セラミド関連経路、ペントースリン酸経路は、加齢マウスの脳で特異的に変化した（図１０ｂ参照）。脂肪酸代謝および終末糖化産物（ＡＧＥｓ）の経路は、加齢マウスの血清および脳試料の両方で共通して変化した（図１０ａ－１０ｂ参照）。加齢マウスの血清と脳組織の両方で有意に発現が上昇した代謝産物から、腸で制御され血流を介して脳に到達した可能性のある代謝産物を特定することができた。これらの代謝産物には、パルミトレイン酸（１６：１ｎ７）、ＴＭＡＯ、１－オレオイル－２－ドコサヘキサエノイル－グリセロホスホリルコリン（１８：１／２２：６）、ＣＭＬおよびスタキドリンが含まれた（図３ｄ参照）。マウスで見られた加齢に関連した濃度変化の一部は、ヒトの血液試料でも確認された。ヒト加齢コホート（ＴｗｉｎｓＵＫデータバンク）の血清／血漿のノンターゲットメタボロミクスでは、マウスで見られたＣＭＬ（図３ｅ参照）およびＴＭＡＯ（図３ｆ参照）の加齢に伴う濃度変化が再現された。若齢成体および加齢のＳＰＦおよびＧＦマウスの脳組織からのターゲットメタボロミクスにより、加齢マウスの脳組織におけるＣＭＬおよびＴＭＡＯの増加には、機能的な腸内細菌叢（例えばＳＰＦマウス）が必要であることが示された。加齢ＧＦマウスは、若齢成体ＧＦマウスと比較してわずかな変化しか示さなかった（図３ｇ参照）。

【0113】

ＣＭＬは加齢に伴うミクログリア機能障害を増強する
次に、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるミクログリアに対するこれらの代謝産物の機能的効果が評価された。ＣＭＬ、ＴＭＡＯ、酢酸塩、およびプロピオン酸塩がさらなる評価のために選択された。加齢ミクログリアにおけるＲＯＳ産生増加の原因となる代謝産物を特定するために、各代謝産物を若齢成体マウスに別々に投与した。腸管から循環系への吸収プロファイルの違いによるアーティファクトの可能性を避けるため、若齢成体マウスにＣＭＬ、ＴＭＡＯ、酢酸ナトリウム、またはプロピオン酸ナトリウムを１日１回、２週間にわたって腹腔内注射した（図４ａ参照）。ＴＭＡＯ、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウムは、細胞内ＲＯＳ産生にもミクログリアの代謝機能にも影響を与えなかった。しかしながら、ＣＭＬ処理は加齢マウスのミクログリアにおいて見られた変化を部分的に再現した。

【0114】

ＣＭＬは酸化ストレスを増加させ、代謝活性を低下させ、細胞のＡＴＰ貯蔵量を減少させた（図４ｂ－４ｄ参照）。さらに、ＣＭＬはミクログリアのミトコンドリア構造に直接損傷を与えることにより、ミトコンドリア機能障害を引き起こした（図１０ｃ参照）。ＣＭＬ治療の影響はミクログリアだけにとどまらず、マクロファージにも悪影響を与えた。特に骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで酸化ストレスの用量依存的増加および代謝活性の低下を示した（図１０ｄ－１０ｅ参照）。循環ＣＭＬは、内因性のメイラード反応、食物、または腸内細菌叢による終末糖化産物（ＡＧＥｓ）の変換に由来する可能性がある。脳内ＣＭＬレベルは、加齢ＳＰＦマウスでは増加したが、加齢ＧＦマウスでは増加しなかった（図４ｅ参照）。ＣＭＬは、若齢成体および加齢ＧＦマウスの脳組織でも、若齢成体ＳＰＦマウスと同程度のレベルで検出可能であった。これらの結果は、腸内細菌叢が加齢脳におけるＣＭＬレベルの上昇には必要であるが、若齢成体マウスに見られるベースラインレベルには必要ないことを示している。したがって、これらの結果はまた、ＣＭＬの腹腔内注射後にみられたミクログリアにおけるミトコンドリア機能の調節不全が、脳のＣＭＬ濃度の上昇に起因しており、加齢脳における設定を再現していることも示している（図４ｆ参照）。ミクログリアのＲＮＡ－ｓｅｑ解析から、ＣＭＬの腹腔内投与は、ＲＯＳ関連遺伝子Ｓ１００ａ９およびＳ１００Ａ８および、Ａ４３００３３Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｃｈｉｃ１、Ｌｔｆ、Ｎｇｐ、Ｐｇｌｙｒｐ１、Ｓｃａｉ、Ｚｋｓｃａｎ２などの他の細菌叢や老化に関連する遺伝子の発現を上昇させることが示された（図４ｇ－４ｈおよび図１０ｆ参照）。

【0115】

大脳皮質ミクログリアにおけるＣＭＬの免疫蛍光染色は、ミクログリアがＣＭＬによって直接標的にされるかどうかに対処し、ＳＰＦおよびＧＦ条件下で飼育されたマウスは、加齢とともにＣＭＬ陽性ミクログリアの割合が増加することを示した。加齢ＳＰＦマウスのミクログリアの約３０％がＣＭＬ陽性であり、加齢ＧＦマウスのミクログリアは加齢によるＣＭＬの蓄積が少なかった（図４ｉ－４ｊ参照）。さらに、マウスの大脳皮質で見られたＣＭＬ陽性ミクログリアの加齢依存的増加は、ヒトの大脳皮質にも存在することが検証された。１歳から８８歳までのヒトの脳組織（合計ｎ＝４３、男性２３、女性２０）が得られ、年齢と、ヒト大脳皮質におけるＣＭＬ陽性ミクログリアの割合との間に正の相関（ｒ＝０．５７９３、Ｒ²＝０．３３５６、Ｐ＜０．００１）が観察された（図４ｋ－４ｌ）。マウスでは、ミクログリアのＲＮＡ－ｓｅｑ解析から、ＣＭＬをｉ．ｐ．注射すると、ＲＯＳ関連遺伝子であるＳ１００ａ９およびＳ１００Ａ８、およびＡ４３００３３ｋ０４Ｒｉｋ、Ｃｈｉｃ１、Ｌｔｆ、Ｎｇｐ、Ｐｇｌｙｒｐ１、Ｓｃａｉ、Ｚｋｓｃａｎ２などの他の細菌や加齢に関連する遺伝子の発現が上昇することが示された。これらの知見は、加齢に伴うＣＭＬの蓄積が、ＲＯＳの増加を含む直接的な形でミクログリアの代謝機能障害を誘導し、脳の恒常性と脳機能を徐々に破壊する可能性があることを示している。

【0116】

加齢細菌叢は腸－血液バリアを破壊することによってＣＭＬレベルを促進する
１６Ｓ リボソーム ＲＮＡ－ｓｅｑによる年齢依存的な腸内細菌叢の変化は、特に加齢におけるＣＭＬレベルおよびミクログリア機能の差異が細菌叢の有無に依存するという知見に基づいて特徴付けられた。若齢成体マウスと加齢マウスの細菌叢プロファイルが異なることは、ブレイ・カーティス非類似度指標およびシャノンとシンプソンのα多様性指標を用いたβ多様性解析によって確認された（図１１ａ－１１ｂ参照）。両年齢群の腸内細菌叢は、２つの門（図１１ｃ参照）、すなわちファーミキューテスとバクテロイデーテスに支配されていた。ファーミキューテスとバクテロイデーテスの相対的な存在比は、ヒトでは加齢になるにつれて変化し、異なる年齢段階における細菌プロファイルの全体的な変化と関連づけることができることが注目された。ファーミキューテスとバクテロイデーテスの比率の有意な加齢依存的減少が観察され、ファーミキューテス門、ラクノスピラ科は加齢マウスで有意に減少した（図１１ｄ－１１ｅ参照）。細菌属では、ツリバクター（Ｔｕｒｉｂａｃｔｅｒ）、アロプレボテラ、パラサテレラ、ビフィドバクテリウム、マセリバクテロイデス（Ｍａｃｅｌｌｉｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、アリスティペス センス ストリクト １（Ａｌｉｓｔｉｐｅｓ ｓｅｎｓｕ ｓｔｒｉｃｔｏ １）、ぺプトストレプトコッカセアエ インケルタエセディス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ｉｎｃｅｒｔａｅｓｅｄｉｓ）およびパラバクテロイデスの増加が加齢マウスで観察された。この結果は、パントエア、アノキシバチルス、ラクノスピラセアエ インケルタエ セディス、クルトバクテリウムおよびアセトアチファクター（Ａｃｅｔａｔｉｆａｃｔｏｒ）が加齢マウスで減少したのとは対称的であった（図１１ｆ参照）。これらの結果は、若齢成体マウスと加齢マウスの細菌叢をプロファイリングすると、いくつかの分類学的レベルで変化が見られることを示している。糞便中ＣＭＬのターゲットメタボロミクス（ＬＣ－ＭＳ）により、加齢ＧＦマウスの糞便は加齢ＳＰＦマウスのものよりＣＭＬレベルが高いことが明らかになり、加齢に伴うＣＭＬの脳内蓄積に細菌叢が間接的に関与していることが示された（図５ａ参照）。

【0117】

加齢マウスは、若齢成体マウスと比較して腸管透過性の亢進を示し（非特許文献１２）、現象は細菌叢の存在に依存している（非特許文献１３）。透過性が亢進すると、代謝産物が消化管内から腸管上皮をより自由に通過し、血流に入るようになるため、脳と糞便中のＣＭＬレベルの不一致を説明できるかもしれない。この仮説を検証するため、経口投与後のＦＩＴＣ－デキストラン（４ｋＤａ）の循環への移行を定量化することで腸管透過性を測定した。加齢ＳＰＦマウスでは高い腸管透過性が観察され、加齢ＧＦマウスのバリア機能は若齢成体ＳＰＦおよびＧＦマウスと同等であった（図５ｂ参照）。若齢成体ＧＦマウスに加齢細菌叢をコロニー形成させると、若齢成体ＧＦマウスに若齢腸内細菌叢を投与した後に認められた透過性と比較して、細菌叢依存的に腸管透過性が上昇した（図５ｃ参照）。このことは、経口摂取後のＣＭＬの循環への移行が、加齢ＳＰＦマウスで最も高いという観察結果と一致した（図５ｄおよび図１２ａ参照）。ＣＭＬの投与経路の違いがミクログリアへのＣＭＬの蓄積に影響するかどうかを評価するために、経口投与ではなく腹腔内投与でＣＭＬを投与した若齢成体マウスを調べた。そのようなマウスでは、大脳皮質により多くのＣＭＬ陽性ミクログリアが認められた（図１２ｂ－１２ｃ参照）。加齢マウスでは、ＣＭＬの投与経路はＣＭＬ陽性ミクログリアの割合に影響を及ぼさなかった（図１２ｂ－１２ｃ参照）。腹腔内投与および経口投与の両ルートによるＣＭＬ投与は、加齢マウスのミクログリアにおける加齢に関連した細胞内ＲＯＳの増加と代謝機能の低下を有意に悪化させた。若齢成体マウスでは、このような効果はＣＭＬの腹腔内投与後にのみ検出可能であった（図１２ｄ－１２ｅ参照）。加齢に伴うミクログリアへのＣＭＬの蓄積に腸管バリアが重要な役割を果たしていることを検証するため、加齢ＳＰＦマウス（１８ヵ月齢）に、エラグ酸（ＥＡ）を３日ごとに１０週間経口投与し（非特許文献１４）、エラグ酸は、加齢に伴う細菌叢ディスバイオシスを軽減させ、腸上皮のオートファジーを誘導することにより、腸の漏出性の原因となることが知られているクローディンや、腸管バリア機能の内因性エンハンサーである腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）の発現を亢進させるので、ＣＭＬの蓄積を抑制する（非特許文献１５、非特許文献１６）（図５ｅ参照）。ＥＡは腸管透過性に直接的な影響を及ぼさなかったが、ＩＡＰ処置した加齢マウスは腸の漏出性が低下した（図５ｆ参照）。ＥＡもＩＡＰも、それぞれ間接的または直接的に、脳内のＣＭＬ蓄積を減少させた（図５ｇ参照）。ＥＡ処置およびＩＡＰ処置した加齢マウスのミクログリアは、ビヒクル処置した加齢マウスと比較して、細胞内ＲＯＳの有意な減少およびＡＴＰレベルの増加を示した（図５ｈ－５ｉ参照）。これらの所見は、加齢によって誘発される細菌叢の変化が、腸管バリアの完全性を破壊し、加齢マウスおよびヒトの脳におけるＣＭＬの蓄積を促進することを実証している。

【0118】

これらの観察結果を総合すると、認知障害または神経変性障害を発症するリスクがある、または発症している被験者を特定するためのアプローチが提供される。さらに、これらの観察結果は、認知障害または神経変性障害を発症する、または発症しているリスクのある被験者を治療するためのアプローチを提供する。

【0119】

ＩＩＩ．治療方法
本明細書において提供されるのは、それを必要とする被験者において、ミクログリアにおける酸化ストレスもしくはミトコンドリア機能不全の発症率、ミクログリアにおけるミトコンドリア機能不全の発症率、またはミクログリア機能不全の発症率を低下させる方法である。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含み、それにより、被験者の、ミクログリアにおける酸化ストレスの発症率、またはミクログリアにおけるミトコンドリア機能不全の発症率、またはミクログリア機能不全の発症率を低下させる。

【0120】

また、それを必要とする被験者において、認知障害を治療する、または認知障害の発症率もしくは悪化率を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含み、それにより、被験者において認知障害を治療するか、または認知障害の発症率もしくは悪化率を低下させる。

【0121】

また、被験者における神経変性疾患を治療する、または神経変性疾患の発症率もしくは進行率を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含み、それにより、神経変性疾患を治療するか、または被験者における神経変性疾患の発症率もしくは進行率を低下させる。

【0122】

また、それを必要とする被験者における神経機能障害の発症率または悪化率を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含み、それによって、被験者における神経機能障害の発症率または悪化率を低下させる。

【0123】

また、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤による治療のために被験者を選択する方法であって、以下を含む方法が提供される：（ａ）被験者から得られた生体試料中に、基準レベルと比較して上昇したレベルのＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物（本明細書ではＣＭＬ分解産物とも称する）、またはＣＭＬ類似体を有する被験者を特定する方法；および（ｂ）特定された被験者を、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤による治療のために選択する方法。本方法は、任意選択で、被験者における腸管バリアの透過性を決定すること、および基準レベル（例えば、健康な被験者の腸管バリア透過性のレベル）と比較して、腸管バリア透過性のレベルが増加した被験者を、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤による治療のために選択することをさらに含む。

【0124】

例示的なＣＭＬ前駆体としては、（Ｅ）－Ｎ⁶－（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）－２，３，４，５，６－ペンタヒドロキシヘキシリデン）－Ｌ－リジン、Ｎ⁶－（（３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）－３，４，５，６－テトラヒドロキシ－２－オキソヘキシル）－Ｌ－リジン、Ｌ－リジン、およびオキサルアルデヒドが挙げられる。

【0125】

例示的なＣＭＬ代謝産物としては、カルボキシメチルカダベリン（ＣＭ－ＣＡＤ）、２－アミノ－６－（ホルミルメチルアミノ）ヘキサン酸、５－（カルボキシメチルアミノ）ペンタン酸、カルボキシメチル－カダベリン、カルボキシメチル－エピカテキン、（５－アミノペンチル）グリシン、Ｎ⁶－（カルボキシメチル）－Ｎ⁶－（２，３－ジヒドロキシ－５－（３，５，７－トリヒドロキシクロマン－２－イル）フェニル）－Ｌ－リジン、Ｎ－カルボキシメチル－Δ１－ピペリジニウムが挙げられる。

【0126】

例示的なＣＭＬ類似体としては、Ｎω－（カルボキシメチル）アルギニン（ＣＭＡ）およびＮε－（１－カルボキシエチル）リジン（ＣＥＬ）が挙げられる。

【0127】

また、本明細書には、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体が基準レベルと比較して上昇したレベルを有すると特定された被験者に、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を投与することを含む、被験者を治療する方法が提供される。特定の実施形態において、被験者はまた、基準レベル（例えば、健常被験者における腸管バリア透過性レベル）と比較して、腸管バリア透過性レベルの上昇を有することが特定されている。

【0128】

また、本明細書には、被験者の組織におけるＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の蓄積率を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0129】

また、本明細書には、（ｉ）ミクログリア機能障害、（ｉｉ）認知障害、または（ｉｉｉ）神経変性疾患の発症のリスクが増大した、治療に適した被験者を特定する方法が提供される。本方法は、基準レベルと比較して、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の上昇したレベルを有する被験者を特定することを含む。

【0130】

また、本明細書には、それを必要とする被験者において、ミクログリアにおける酸化ストレスまたは代謝ストレスの発症率を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0131】

また、本明細書には、それを必要とする被験者において、ミクログリアにおけるミトコンドリア機能不全の発症率を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0132】

また、本明細書には、それを必要とする被験者において、ミクログリア機能不全の発症率を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0133】

また、本明細書には、それを必要とする被験者において、ミクログリアの１つ以上の活性または機能を増加させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0134】

また、本明細書には、それを必要とする被験者において、認知障害の発症率または悪化率を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0135】

また、本明細書には、それを必要とする被験者において、認知障害を治療する方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0136】

また、本明細書には、被験者において、神経変性疾患の発症率または進行率を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0137】

また、本明細書には、被験者において、神経変性疾患を治療する方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0138】

また、本明細書には、それを必要とする被験者において、神経機能障害の発症率または悪化率を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0139】

また、本明細書には、それを必要とする被験者において、血液または脳試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の濃度を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0140】

また、本明細書には、それを必要とする被験者において、認知障害または神経変性疾患を予防または治療するために、血液または脳試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の濃度を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含み、それにより、被験者における認知障害または神経変性疾患を予防または治療する。

【0141】

また、本明細書には、それを必要とする被験者において、認知障害または神経変性疾患を予防または治療するために、血液または脳試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の濃度を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含み、それにより被験者における認知障害または神経変性疾患を予防または治療する。

【0142】

また、本明細書には、それを必要とする被験者において、認知障害または神経変性疾患を予防または治療するために、腸の透過性を低下させる方法が提供される。本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含み、それによって、被験者における認知障害または神経変性疾患を予防または治療する。

【0143】

本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態において、被験者は、基準レベルと比較して、被験者の生体試料中にＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の上昇したレベルを有するものとして以前に特定されている。本明細書に記載の方法のいずれかの特定の実施形態において、本方法は、基準レベルと比較して、被験者の生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体のレベルが上昇しているとして被験者を特定することをさらに含む。本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態では、生体試料は組織試料または体液試料である。いくつかの実施形態において、体液試料は、唾液、尿、血液、血清、血漿、脳脊髄液、または糞便である。いくつかの実施形態では、組織試料は脳組織である。

【0144】

本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態において、被験者は、基準レベル（例えば、健常被験者における腸管バリア透過性のレベル）と比較して、腸管バリア透過性の増加したレベルを有するものとして以前に特定されている。本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態において、本方法は、基準レベル（例えば、健常被験者における腸管バリア透過性のレベル）と比較して、腸管バリア透過性の増加したレベルを有するものとして被験者を特定することをさらに含む。本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態において、被験者は、認知障害を有すると特定または診断されている。本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態において、被験者は、認知障害を発症するリスクが増大していると特定されている。本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態において、被験者は、神経変性疾患を有すると特定または診断されている。本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態において、被験者は、神経変性疾患を発症するリスクが増大していると特定されている。

【0145】

腸管バリア透過性の増加レベルを特定するための方法には、当該技術分野で公知の分析技術を含めることができ、例えば、経口摂取された化合物（例えば、標識化合物または非標識化合物）の量を被験者の組織または体液試料中で測定する方法が含まれる。一つのアプローチでは、標識化合物（例えば、それぞれクロム－５１やフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）などの放射性標識または蛍光標識で標識された代謝産物）を被験者が経口摂取する。投与後、被験者から採取した生体試料（血液や尿など）中の標識化合物の取り込みを測定する。標識化合物の量は、被験者の腸管透過性の指標となる。代替的に、または追加的に、ラクチュロース：マンニトール（ＬＭ）排泄試験を用いて腸管透過性を測定することもできる。ＬＭ排泄試験は、２つの非代謝糖分子（ラクチュロースおよびマンニトール）が腸粘膜を透過する能力を直接測定する定量的アッセイであり、それによって腸管バリア透過性を測定する。例示的なＬＭ試験において、結果は摂取したラクチュロースとマンニトールの量と尿中に排泄されたラクチュロースとマンニトールの量の比として表すことができる。これは式を使って測定できる。

【0146】

［化１］時間（ｔ）における累積排泄量＝［ｔにおける糖の排泄濃度（ｍｇ／ｍＬ）］×ｔにおける総尿量（ｍＬ）。

【0147】

そして、時間ｔまでの各糖の累積排泄量（ｍｇ）は、累積排泄量（ｍｇ）×１００を、摂取した糖の総量（ｍｇ）で割ることにより百分率で表される。

【0148】

例えば、摂取したラクチュロースの総量が５グラムであり、摂取したマンニトールの総量が１グラムである場合、健康な被験者の尿中のラクチュロースおよびマンニトールの排泄量の正常値は、ラクチュロースについては約０．３５％（０．０２０％から１．８０３％の範囲）であり、マンニトールについては１２．３％（約１．４８０％から４３．７５％の範囲）である。これらの平均値より高い値は、被験者の腸管透過性が高いことを示している。

【0149】

本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態において、本方法は、被験者のミクログリアにおける細胞内および／またはミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）のレベルの低下をもたらす。本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態において、本方法は、被験者のミクログリアにおける誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現の低下をもたらす。本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態において、本方法は、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｙｂａ、Ｃｙｂｂ、Ｄｕｏｘａ１、Ｉｌ１ｂ、Ｔｇｆｂｒ２、Ｔｌｒ２、Ｔｌｒ４、Ｔｌｒ５、Ａｘｌ、Ｈｉｆ１ａ、Ｌｃｎ２、Ｍｍｐ２、Ｒｅｌａ、Ｔｒｅｘ１、Ｓ１００ａ８、およびＳ１００ａ９からなる群より選択される被験者のミクログリアにおける１つ以上の遺伝子の発現の低下をもたらす。本明細書に記載の方法のいずれかの特定の実施形態において、本方法は、Ｆｏｘｐ１、Ｎｒｆ１、Ｔｒｐ５３、Ｇ６ｐｄｘ、Ｐｄｋ２、Ｓｔａｔ３、およびＵｃｐ２からなる群から選択される被験者のミクログリアにおける１つまたは複数の遺伝子の発現の増加をもたらす。本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態において、本方法は、被験者におけるミクログリアの１つ以上の活性の増加をもたらす。

【0150】

本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態において、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体のレベルを決定することをさらに含む。本明細書に記載のいずれかの方法のいくつかの実施形態は、被験者における腸管バリア透過性のレベルを決定することをさらに含む。

【0151】

本明細書に記載される方法のいずれかの特定の実施形態において、神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、または他の認知症の群から選択されるが、これらに限定されない。

【0152】

本明細書に記載の方法のいずれかの特定の実施形態では、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤の投与後、被験者には、以下のうちの１つ以上が表れる：（ａ）血液試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の濃度の低下；（ｂ）脳組織試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の濃度の低下；（ｃ）腸管透過性の低下；（ｄ）細菌叢ディスバイオシスの減少；（ｅ）腸上皮におけるオートファジーのレベルの増加；（ｆ）ミクログリアにおける細胞および／またはミトコンドリアのＲＯＳレベルの減少；（ｇ）ミクログリア集団におけるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレベルの増加；（ｈ）ミクログリアにおけるｉＮＯＳの発現の減少；（ｉ）ミクログリアにおける、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｙｂａ、Ｃｙｂｂ、Ｄｕｏｘａ１、Ｉｌ１ｂ、Ｔｇｆｂｒ２、Ｔｌｒ２、Ｔｌｒ４、Ｔｌｒ５、Ａｘｌ、Ｈｉｆ１ａ、Ｌｃｎ２、Ｍｍｐ２、Ｒｅｌａ、Ｔｒｅｘ１、Ｓ１００ａ８、およびＳ１００ａ９からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現の減少；および（ｊ）Ｆｏｘｐ１、Ｎｒｆ１、Ｔｒｐ５３、Ｇ６ｐｄｘ、Ｐｄｋ２、Ｓｔａｔ３、およびＵｃｐ２からなる群より選択される、ミクログリアにおける１つ以上の遺伝子の発現の増加。

【0153】

また、本明細書には、ミクログリア機能障害を発症するリスクが増大した被験者を特定する方法が提供される。本方法は、基準レベルと比較して、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体のレベルの上昇を有する被験者を特定することを含み、このようなレベルの上昇は、被験者がミクログリア機能障害を発症するリスクの増加を有することを示す。

【0154】

特定の実施形態において、本方法は、基準レベル（例えば、健常被験者における腸管バリア透過性のレベル）と比較して増加したレベルの腸管バリア透過性を有する被験者を、ミクログリア機能障害を発症するリスクが増加したものとして特定することをさらに含む。

【0155】

また、本明細書には、認知障害のリスクが増加していると被験者を特定する方法が提供される。本方法は、基準レベルと比較して、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の上昇したレベルを有する被験者を特定することを含み、そのような上昇したレベルは、被験者が認知障害を発症するリスクの増加を有することを示す。特定の実施形態において、本方法は、基準レベル（例えば、健常被験者における腸管バリア透過性レベル）と比較して増加した腸管バリア透過性レベルを有する被験者を、認知障害を発症するリスクが増加していると特定することをさらに含む。

【0156】

また、本明細書には、神経変性疾患を発症するリスクが増大した被験者を特定する方法が提供される。本方法は、基準レベルと比較して、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の上昇したレベルを有する被験者を特定することを含み、このような上昇したレベルは、被験者が神経変性疾患を発症するリスクが増加していることを示す。特定の実施形態において、本方法は、基準レベル（例えば、健常被験者における腸管バリア透過性のレベル）と比較して、腸管バリア透過性のレベルが上昇している被験者を、神経変性疾患を発症するリスクが増加していると特定することをさらに含む。

【0157】

ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の存在を特定し、その量を定量するための方法としては、例えば、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、質量分析法、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴分光法、または免疫測定法を含む、当該技術分野において公知の分析技術を挙げることができる。

【0158】

例えば、ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の量は、クロマトグラフィー法、質量分析（ＭＳ）法、クロマトグラフィー法に続くＭＳ法、電気泳動法、電気泳動法に続くＭＳ法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）法、およびそれらの組み合わせの１つ以上によって、組織または体液試料中に検出および／または定量することができる。例示的なクロマトグラフィー法としては、パルスアンペロメトリック検出を用いる強陰イオン交換クロマトグラフィー（ＳＡＸ－ＰＡＤ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、アミドカラムクロマトグラフィー、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な質量分析（ＭＳ）としては、タンデムＭＳ、ＬＣ－ＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、質量分析によるイオン移動度分離（ＩＭＳ－ＭＳ）、電子移動解離（ＥＴＤ－ＭＳ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な電気泳動法には、キャピラリー電気泳動（ＣＥ）、ＣＥ－ＭＳ、ゲル電気泳動、アガロースゲル電気泳動、アクリルアミドゲル電気泳動、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）に続いて特定の糖鎖構造を認識する抗体を用いたウェスタンブロッティング、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な核磁気共鳴（ＮＭＲ）としては、一次元ＮＭＲ（１Ｄ－ＮＭＲ）、二次元ＮＭＲ（２Ｄ－ＮＭＲ）、相関分光法磁気角スピニングＮＭＲ（ＣＯＳＹ－ＮＭＲ）、全相関分光法ＮＭＲ（ＴＯＣＳＹ－ＮＭＲ）、異核単量子コヒーレンスＮＭＲ（ＨＳＱＣ－ＮＭ Ｒ）、異核多重量子コヒーレンス（ＨＭＱＣ－ＮＭＲ）、回転核オーバーハウザー効果分光法ＮＭＲ（ＲＯＥＳＹ－ＮＭＲ）、核オーバーハウザー効果分光法（ＮＯＥＳＹ－ＮＭＲ）、およびこれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、または目的のＣＭＬ類似体を決定、検出、および／または測定するために、当該技術分野で公知のＭＳの任意の方法を使用することができ、例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ、ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ－ＭＳ、タンデムＭＳ等が挙げられる。質量分析計は一般に、イオン源と光学系、質量分析器、データ処理エレクトロニクスを含む。質量分析器には、飛行時間型（ＴＯＦ）や四重極型（Ｑ）などの走査型質量分析計やイオンビーム質量分析計、イオントラップ（ＩＴ）、オービトラップ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ）、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴ－ＩＣＲ）などのトラップ型質量分析計が含まれ、本明細書に記載の方法で使用されてもよい。様々なＭＳ法の詳細は文献に記載されている（参照：非特許文献１７）．

【0159】

例示的なイムノアッセイとしては、これらに限定されないが、免疫組織化学的および／またはウェスタンブロット分析、免疫沈降、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫濾過アッセイ（ＥＬＩＦＡ）が挙げられる。

【0160】

例えば、いくつかの実施形態では、抗体－標的複合体が形成されるのに十分な条件下で、試料を標的分析物（例えば、ＣＭＬ）に特異的な抗体と接触させ、複合体を検出する。分析物の存在は、血漿や血清を含む多種多様な組織や試料のいずれかを用いたウェスタンブロット法またはＥＬＩＳＡ法など、様々な方法で検出してもよい。このようなアッセイ形式を用いる広範なイムノアッセイ技術が利用可能であり、例えば、参照は、米国特許第４，０１６，０４３号、同第４，４２４，２７９号、同第４，０１８，６５３号である。これらには、従来の競合的結合アッセイと同様に、非競合的タイプのシングルサイトおよび２サイトまたは“サンドイッチ”アッセイの両方が含まれる。これらのアッセイには、標識抗体と標的分析物との直接結合も含まれる。得られた複合体は、例えば酵素、蛍光標識、発色標識、放射性核種を含む分子（すなわち放射性同位元素）、または化学発光分子などの標識によって放出されるシグナルによって検出することができる。

【0161】

様々な実施形態において、ＣＭＬは、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ（カタログ番号ＩＣＰ２１８８）、Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（カタログ番号ＤＭＡＢＴ－Ｚ５９３４８）、Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＢｉｏＬａｂｓ（カタログ番号ＡＧＭ－２３３ＹＪ）、Ｈｙｃｕｌｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（カタログ番号ＨＭ５０１３）、Ａｂｃａｍ（カタログ番号ａｂ１２５１４５、ａｂ２７６８３、ａｂ２７６８５、ａｂ２７６８４、またはａｂ３０９２２）、ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ（カタログ番号ＭＢＳ３９００３３またはＭＢＳ３９００３４）、Ｋｅｒａｆａｓｔ（カタログ番号ＥＭＳ３０２）、およびＢｉｏｔｅｃｈｎｅ（カタログ番号ＭＡＢ３２４７－ＳＰまたはＭＡＢ３２４７）、または現在知られているまたは後に特定される抗ＣＭＬ抗体のような、抗ＣＭＬ抗体で検出される。

【0162】

様々な実施形態において、ＣＭＬは、ＣＧＹＪ１０７、ＣＭＬ２６、６Ｃ７、ＭＡＢ３２４７、またはＣＭＳ－１０抗ＣＭＬ抗体クローンを用いて検出される。

【0163】

種々の実施形態において、Ｎ（６）－（１－カルボキシエチル）－Ｌ－リジン（ＣＥＬ）などのＣＭＬ類似体は、Ａｂｃａｍ（カタログ番号ａｂ１４５０９５）またはＣｏｓｍｏ Ｂｉｏ（カタログ番号ＣＡＣ－ＡＧＥ－Ｍ０２）からの抗ＣＥＬ抗体などの抗ＣＥＬ抗体で検出される。様々な実施形態において、ＣＥＬはＣＥＬ－ＳＰ抗ＣＥＬ抗体クローンで検出される。

【0164】

代替的な方法では、免疫組織化学（“ＩＨＣ”）および染色プロトコルを用いて、試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の発現を調べることができる。組織切片のＩＨＣ染色は、試料中の標的の存在を評価または検出する信頼性の高い方法であることが示されている。ＩＨＣおよび免疫蛍光法は、一般に発色法または蛍光法により、その場で細胞抗原をプローブし可視化するために抗体を使用する。組織試料は、従来の方法論により固定（すなわち、保存）することができる（例えば、“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ”第３版（１９６０）Ｌｅｅ Ｇ．Ｌｕｎａ，ＨＴ（ＡＳＣＰ）Ｅｄｉｔｏｒ，Ｔｈｅ Ｂｌａｋｓｔｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ Ｂｏｏｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｔｈｅ Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（１９９４）Ｕｌｒｅｋａ Ｖ．Ｍｉｋｅｌ，Ｅｄｉｔｏｒ，Ａｒｍｅｄ Ｆｏｒｃｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．を参照のこと）。一般に、試料はまず固定され、次いで一連のアルコールで脱水され、パラフィンまたは他の切片用媒体で浸潤・包埋され、組織試料が切片化される。代替的に、組織を切片化し、得られた切片を固定してもよい。免疫組織化学に使用される一次抗体および／または二次抗体は通常、放射性同位元素、コロイド金粒子、蛍光標識、発色標識、酵素基質標識などの検出可能な部分で標識される。

【0165】

ＩＶ．医薬組成物、医薬品および投与経路
本明細書に記載の方法は、１種以上の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物、および少なくとも１種の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物または医薬品を使用する。

【0166】

腸管バリア機能増強剤は、被験者の組織または体液中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の濃度を低下させるために使用され得る。典型的な腸管バリア機能増強剤としては、例えば、腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）（典型的なＣＡＳ番号 ９００１－７８－９（仔牛））、ポリフェノール（例えば、エラグ酸（ＥＡ）（典型的なＣＡＳ番号 ４７６－６６－４）またはリポテイコ酸）、メトホルミン（典型的なＣＡＳ番号 ６５７－２４－９）、ウロリチンＡ（典型的なＣＡＳ番号 １１４３－７０－０）、酪酸（典型的なＣＡＳ番号 １５６－５４－７）、グルタミン（典型的なＣＡＳ番号 ５６－８５－９）、オベチコール酸（ＯＣＡ）（典型的なＣＡＳ番号 ４５９７８９－９９－２）、ジベルチン、またはクルクミン（典型的なＣＡＳ番号 ４５８－３７－７）、またはそれらの誘導体を含む。

【0167】

腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤は、被験者内のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の濃度を低下させるために使用され得る。腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための典型的な薬剤としては、例えば、ＩＡＰ、ＥＡ、バイオティクス、プロバイオティクス（例えば、Ｂｉｏｈｍ Ｈｅａｌｔｈ社のＢｉｏｈｍ Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ ＢｏｏｓｔおよびＢｉｏｈｍ Ｃｏｌｏｎ Ｃｌｅａｎｓｅ）、プレバイオティクスおよびポストバイオティクスが挙げられる。典型的なプロバイオティクスには、ラクトバチルス属（例えば、ラクトバチルス アシドフィルスまたはラクトバチルス ラムノサス）、ビフィドバクテリウム属（例えば、ビフィドバクテリウム ブレーべ）、サッカロミケス属（例えば、サッカロミケス セレビシエ）およびストレプトコッカス属（例えば、ストレプトコッカス サーモフィルス）に属する細菌が含まれる。プレバイオティクスは、健康上の利益をもたらす特定の有益な細菌種の増殖を促進し、典型的なプレバイオティクスとしては、リポテイコ酸およびポリフェノールが挙げられる。ポストバイオティクスは、例えば、代謝産物、発酵産物、ミネラル（例えば、亜鉛およびセレン）、微量元素、微量栄養素、細胞表面タンパク質、およびマイクロバイオームによってそのライフサイクル間に生成される有機酸である。

【0168】

本明細書に記載される方法にしたがって、記載される腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤、またはそれらの塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグは、選択される投与経路に応じて、種々の形態で被験者に投与されてもよい。したがって、本明細書に記載の組成物は、例えば、経口投与、非経口投与、およびそれに応じて製剤化された医薬組成物による投与のために製剤化されてもよい。非経口投与には、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、鼻腔内投与、肺内投与、髄腔内投与、脳室内投与、胸膜内投与、直腸内投与、および局所投与が含まれる。

【0169】

特定の実施形態によれば、本発明の実施に有用な薬学的に許容される組成物の担体は、経口投与または静脈内投与のために製剤化される。

【0170】

本明細書に記載の化合物を含有する医薬組成物は、一般に公知の方法、例えば、従来の混合、溶解、造粒、賦形、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥工程によって製造されてもよい。医薬組成物は、薬学的に使用され得る製剤への化合物の加工を容易にする賦形剤および／または補助剤を含む１つ以上の薬学的に許容される担体を用いて、従来の方法で製剤化されてもよい。適切な製剤は、選択された投与経路に依存することが理解される。

【0171】

経口組成物は一般に、不活性希釈剤または食用薬学的に許容される担体を含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入され得るか、または錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的のために、本明細書に記載の化合物は、賦形剤と組み込んで、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用することができる。経口組成物はまた、洗口剤として使用するために流体担体を用いて調製することもでき、この場合、流体担体中の化合物は経口的に適用され、そして振り混ぜられ、去痰されるか、または嚥下される。薬学的に適合性のある結合剤、および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分、活性成分（例えば、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤）のうちのいずれかを含むことができる。；微結晶セルロース、トラガントガムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたは乳糖などの賦形剤、アルギン酸、プリモジェルまたはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素のような滑沢剤；スクロースまたはサッカリンのような甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、オレンジ香料のような香味剤。

【0172】

注射用に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液を即座に調製するための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、非限定的に適切な担体としては、生理的食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合も、組成物は無菌でなければならず、容易に注射できる程度に流動性がなければならない。組成物は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌や真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒体とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散液の場合の必要な粒子径の維持および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトールやソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムなどを組成物内に含めることが好ましい。注射用組成物の吸収の延長は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを含有させることによってもたらすことができる。

【0173】

無菌注射液は、必要に応じて上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに、適切な溶媒中に必要量の活性成分を取り込み、次いで濾過滅菌することにより調製され得る。一般的に、分散液は、基本的な分散媒と上記に列挙した成分の中から必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに活性成分を組み込むことによって調製される。無菌注射液を調製するための無菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥と凍結乾燥であり、あらかじめ無菌ろ過した溶液から活性成分と任意の追加所望成分の粉末を得る。

【0174】

吸入による投与の場合、腸管バリア機能増強剤は、適切な推進剤、例えば二酸化炭素のような気体、またはネブライザーを含む、加圧容器またはディスペンサーからエアロゾルスプレーの形態で送達される。

【0175】

全身投与は、経粘膜または経皮によることもできる。経粘膜または経皮投与の場合、浸透させるバリアに適切な浸透剤が製剤中で使用される。このような浸透剤は、一般的に当該技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与のためには、洗浄剤、および胆汁酸塩が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐薬の使用により達成され得る。経皮投与の場合、活性腸管バリア機能増強剤は、当技術分野で一般的に知られているように、軟膏、軟膏、ゲル、またはクリームに製剤化される。

【0176】

活性腸管バリア機能増強剤は、インプラントやマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤など、体内からの急速な排泄から腸管バリア機能増強剤を保護する薬学的に許容される担体とともに調製され得る。生分解性で生体適合性のあるポリマーとしては、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸などが使用され得る。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかであろう。これらの材料は、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体で感染細胞を標的としたリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用できる。これらは、当業者に公知の方法、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されている方法にしたがって調製することができる。

【0177】

経口または非経口組成物を投与単位形態で製剤化することは、投与の容易性および投与量の均一性から有利である。本明細書で使用される投与単位形態とは、治療される被験者に対する単位投与量として適した物理的に離散した単位を指し；各単位が、必要な医薬担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性腸管バリア機能増強剤を含む。投与単位形態の仕様は、活性腸管バリア機能増強剤の固有の特性および達成されるべき特定の治療効果によって決定され、それに直接依存する。

【0178】

治療的適用において、本開示にしたがって使用される医薬組成物の投与量は、選択される投与量に影響を及ぼす他の要因の中でも、薬剤、年齢、体重、およびレシピエント被験者の臨床状態、および治療を実施する臨床医または開業医の経験および判断によって変化する。一般的に、用量は、本明細書に開示される疾患または障害の症状を遅らせ、好ましくは退行させ、そして好ましくは疾患または障害の完全な退行を引き起こすのに十分であるべきである。医薬品の有効量は、臨床医または他の適格な観察者によって指摘されるような客観的に特定可能な改善をもたらすものである。

【0179】

医薬組成物は、投与のための説明書とともに、容器、パック、またはディスペンサーに含まれ得ることを理解されたい。

【0180】

Ｖ．腸管バリア機能増強剤のスクリーニング方法
また、本明細書には、被験者の組織または体液試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の蓄積率を低下させるための候補薬剤のスクリーニング方法であって、以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および哺乳動物において第二の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者の組織におけるＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の蓄積率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0181】

また、本明細書には、被験者におけるミクログリアの酸化ストレスまたは代謝ストレスの発現率を低下させるための候補薬剤のスクリーニング方法であって、以下を含む：第一の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および第二の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ類似体、ＣＭＬ前駆体、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者のミクログリアにおける酸化ストレスまたは代謝ストレスの発現率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0182】

また、本明細書には、被験者におけるミクログリアのミトコンドリア機能不全の発症率を低下させるための候補薬剤のスクリーニング方法であって、以下を含む：第一の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および第二の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者におけるミクログリアのミトコンドリア機能不全の発症率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0183】

また、本明細書には、被験体におけるミクログリア機能不全の発症率を低下させるための候補薬剤のスクリーニング方法であって、以下を含む：第一の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および第二の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験体におけるミクログリア機能不全の発症率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0184】

また、本明細書には、被験者におけるミクログリアの１つ以上の機能を増加させるための候補薬剤のスクリーニング方法であって、以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および哺乳動物において第二の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者においてミクログリアの１つ以上の機能を増加させるための候補薬剤として特定される。

【0185】

また、本明細書には、被験者における認知障害の発症率または悪化率を低下させるための候補薬剤のスクリーニング方法であって、以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および哺乳動物において第二の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、ＣＭＬ類似体の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者における認知障害の発症率または悪化率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0186】

特定の実施形態では、生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の量が測定される。このような薬剤の量を測定するための方法は、セクションＩＩＩにおいて上述されており、例えば、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、質量分析法、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）、核磁気共鳴分光法、または免疫測定法が挙げられる。

【0187】

これらのスクリーニング方法の特定の実施形態において、本方法は、候補薬剤を動物モデルで試験することをさらに含む。

【0188】

実施例
以下に、本発明を実施するための具体的な実施形態の例である。実施例は、例示のみを目的として提供されるものであり、本発明の範囲を何ら限定することを意図するものではない。

【0189】

実施例１．腸内細菌叢は、Ｎ６－カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）を介してミクログリアにおける加齢関連酸化ストレスおよびミトコンドリア損傷を駆動する
本実施例では、若齢成体マウスおよび加齢マウスにおいて、腸内細菌叢と脳を連絡するメッセンジャーとしてＣＭＬが発見されたことを記載する。

【0190】

無菌および特定の病原体を含まない条件下で飼育された若齢成体マウスおよび加齢マウスのミクログリアトランスクリプトームを比較したところ、ミクログリア遺伝子発現の加齢に伴う変化に細菌叢が影響していることが判明した。腸内細菌叢の欠如は、加齢マウスの脳のミクログリアにおける酸化ストレスを減少させ、ミトコンドリア機能障害を改善した。血清と脳組織の偏りのないメタボローム解析により、加齢脳のミクログリアにおけるＮ６－カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）の蓄積が明らかになった。ＣＭＬは活性酸素種のバーストを媒介し、ミクログリアのミトコンドリア活性とＡＴＰレベルを阻害した。ヒトの血清と脳におけるＣＭＬレベルの加齢依存的上昇が検証され、加齢マウスの細菌叢依存的な腸管透過性の上昇がＣＭＬレベルの上昇を媒介することが判明した。これらの結果は、腸内細菌叢が加齢脳のミクログリアのホメオスタシスにどのような影響を及ぼすかを示すとともに、代謝産物レベルでの分子表現型解析により、主要な先進糖化最終産物（ＡＧＥ）であるＣＭＬが、加齢に関連したミクログリア機能不全を引き起こす重要な化合物であることが特定された。

【0191】

方法
ヒト組織
ドイツのフライブルク大学病院神経病理学研究所で、４３人（１～８８歳の女性２０人、男性２３人；８側頭葉、２５前頭葉）の健康な脳のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）大脳皮質組織を、十分な訓練を受けた神経病理学者により検査した（対照組織またはＢｒａａｋステージＩおよびＩＩ）。

【0192】

マウス
特定病原体フリー（ＳＰＦ）および無菌（ＧＦ）飼育のＣ５７ＢＬ／６マウスを、６～１０週齢（若齢成体）および９６～１０４週齢（加齢）で分析した。非標的メタボローム解析における加齢群のマウスは１７～１８ヶ月齢であった。非標的メタボロミクスおよび細菌叢プロファイリングでは雄マウスのみを用いた以外は、すべての群に雌雄のマウスを含めた。マウスは１２時間明期／１２時間暗期サイクル、温度１８～２３℃、湿度４０～６０％の条件下で飼育され、餌と水は自由摂取とした。ケージの影響を避けるため、１実験群につき少なくとも３つの異なるケージのマウスを分析した。治療には、若齢成体マウス（８週齢）にＣＭＬ（０．７３５ｍｇ／ｋｇ；Ｉｒｉｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、トリメチルアミンＮ－オキシド（ＴＭＡＯ）（３．９５ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、酢酸ナトリウム（５９ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、プロピオン酸ナトリウム（４．６１ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１４日間、毎日腹腔内または経口投与した。加齢動物におけるＣＭＬの調節のために、１８ヶ月齢のＳＰＦ飼育Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ビヒクル（２０％ヒドロキシプロピル－ｐ－シクロデキストリン ｉｎ １ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、１０ｍｇ／ｋｇエラグ酸（ＥＡ）、または３，０００Ｕ／ｋｇ腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）を１０週間にわたり３日ごとに経口投与した。ｉｎ ｖｉｖｏでの腸管透過性を評価するため、トレーサーとしてフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識デキストラン（４ｋＤａ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた。簡単に説明すると、マウスは８０ｍｇ／ｍｌ ＦＩＴＣ－デキストラン２００ｐｌを経口投与する４時間前に餌を奪われ、４時間後に餌も水も奪われた。血液は４時間後に後眼窩で採血し、励起波長４９３ｎｍ、発光波長５１８ｎｍの蛍光プレートで蛍光強度を測定した。ＣＭＬに対するｉｎ ｖｉｖｏ腸管透過性を評価するため、マウスを２００ｐｌのＣＭＬ（０．３６ｍＭ）で処置した。処置直前と処置後４時間に後眼窩で採血を行った。循環系に移行したＣＭＬは液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ－ＭＳ）で測定した。すべての動物実験は、ドイツの地方行政当局（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇｓｐｒａｓｉｄｉｕｍ Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）の承認を得ており、それぞれの国、連邦、および施設の規則ならびに欧州実験動物科学連盟のガイドラインにしたがって実施された。

【0193】

マウス組織試料の調製
マウスを、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ体重）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）で致死的に麻酔し、次に左心室から１ｘＰＢＳで灌流した。組織検査のため、脳は４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で一晩保存した。フローサイトメトリーおよび磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）ビーズ細胞選別のために、脳を解剖し、均質化し、７０ｐｍのメッシュで濾過した。遠心分離（２２０ｇ、５分間、４℃）後、ペレットを３７％パーコールに懸濁し、その後３０分間、８００ｇ、４℃で遠心分離した。上層からミエリンを除去し、細胞ペレットを１ｘＰＢＳで１回洗浄した後、抗体染色を行った。

【0194】

免疫組織化学
脳を４％ＰＦＡで一晩固定し、パラフィンに包埋した。ミクログリア細胞密度を評価するために、３μｍ厚の傍矢状切片を抗Ｉｂａ－１抗体（１：５００希釈、カタログ番号０１９－１９７４１；ＷＡＫＯ）で染色した。免疫組織化学（ＩＨＣ）については、エピトープをｐＨ６で熱による抗原回収によりアンマスクした。一次抗体を一晩（４℃）インキュベートした後、ビオチン標識ヤギ抗ウサギ二次抗体（１：１，０００希釈；ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）と室温で４５分間インキュベートした。その後、ストレプトアビジン－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）が、室温で４５分間に加えられた。３，３‘－ジアモンベンジジン褐色発色剤（Ｄａｋｏ）を用いて抗体のシグナルを分解した。核はヘマトキシリンで対比染色した。画像はＢＺ－９０００ Ｂｉｏｒｅｖｏ顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ）で取得し、ＩｍａｇｅＪ ｖ．１．５３ｆ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）ソフトウェアで解析した。

【0195】

免疫蛍光
脳を４％ＰＦＡで固定し、３０％スクロースで脱水し、ティシュ―・テック ＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ）に包埋した。クライオスタット（ＳＭ２０００Ｒ； Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて１４μｍ厚の凍結切片を得た。マウスとヒトの脳のＦＦＰＥ組織をミクロトームで切開し、５ｐｍの切片を得た。切片は、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳでブロックし、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ブロッキング溶液で透過処理した。以下の一次抗体を４℃で一晩インキュベートした：ウサギ抗Ｉｂａ－１（１：５００希釈；ＷＡＫＯ）；モルモット抗Ｉｂａ－１（１：１，０００希釈；Ｓｙｎａｐｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）；抗ｉＮＯＳ（１：５００希釈；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）または抗ＣＭＬ（１：５００；Ａｂｃａｍ）。二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、５６８、６４７標識、１：５００希釈）を室温で２時間インキュベートした。ミクログリアの三次元（３Ｄ）再構築のために、脳組織からのフリーフローティング３０ｐｍ凍結切片を抗Ｉｂａ－１（１：５００希釈）で、４℃で４８時間標識し、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７標識二次抗体を１：５００希釈で、４℃で一晩インキュベートした。加齢マウスおよびヒトの組織における自家蛍光を除去するため、スライドをＴｒｕｅＢｌａｃｋ Ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎ Ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒで処理した。核を４‘，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。カバースリップはＰｒｏＬｏｎｇ Ｄｉａｍｏｎｄ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてマウントした。画像は、２０ｘ／０．７５開口数（ＮＡ）対物レンズを用いたＢＺ－９０００ Ｂｉｏｒｅｖｏ顕微鏡、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｆｌｕｏｖｉｅｗ １０００共焦点レーザー顕微鏡、または２０ｘ／０．７５ ＮＡ対物レンズ（ＨＣ ＰＬ ＡＰＯ ２０ｘ／０．７５ ＮＡ ＩＭＭ ＣＯＲＲ ＣＳ２）を用いたＴＣＳ ＳＰ８ Ｘ（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて取得した。ミクログリアの３Ｄ再構成には、Ｉｍａｒｉｓ ｖ．８．０２（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を用い、マウス１匹につき少なくとも５個の細胞を用いて画像を解析した。その他の画像はすべて、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＣ ２０１５（Ａｄｏｂｅ）またはＩｍａｇｅＪ ｖ．１．５３ｆ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を用いて処理・解析した。

【0196】

電子顕微鏡検査
大脳皮質から採取した脳標本を、まず３％グルタルアルデヒドで４℃、一晩固定し、ソレンセン緩衝液で洗浄した後、１％四酸化オスミウムに移し、室温で２時間処理した。次に、試料を、エタノール（３０－１００％）、１００％プロピレンオキシド、樹脂／プロピレンオキシド（１：２（ｖ／ｖ））、樹脂／プロピレンオキシド（２：１（ｖ／ｖ））の順で段階的に脱水した。試料は７５℃で２４時間重合して樹脂に包埋した。その後、７００ｎｍの半切片を切り出し、２％トルイジンブルーで染色して関心領域を定め、酢酸ウラニルとクエン酸鉛（Ｌｅｉｃａ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕｌｔｒａｓｔａｉｎｅｒ）で切片を造影した後、ウルトラミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｒｅｉｃｈｅｒｔ Ｕｌｔｒａｃｕｔ Ｓ）を用いて７０ｎｍの超薄切片をさらに作製した。ミクログリアのミトコンドリア表現型を評価するために、ＣＭ１００電子顕微鏡（Ｐｈｉｌｉｐｓ）を用いて、７，９００倍または４６，０００倍の画像を取得した。ｉＴＥＭソフトウェア２０１２（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて、マウス１匹あたり３０～３５細胞の画像を処理・解析した。

【0197】

骨髄由来マクロファージ細胞培養
細胞は３７℃、５％ＣＯ２、加湿インキュベーターで培養した。マウスＢＭＤＭは、脛骨および大腿骨骨髄吸引液から分化させた。組換えマウスマクロファージコロニー刺激因子（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）を２０ｎｇ／ｍｌで使用した。分化７日後、ＢＭＤＭを２４ウェルプレートに３連で１ウェルあたり５×１０⁵個播種した。培地は実験の６時間前に無血清培地に切り替えた。細胞は、濃度の上がるＣＭＬ（未処理、０．１ｐＭ、１ｐＭ、１０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｍＭ）と４８時間インキュベートした後、測定用に回収した。

【0198】

フローサイトメトリー
ＲＴ－ｑＰＣＲおよびＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ－ｓｅｑ）のための細胞選別は、ＭｏＦｌｏ Ａｓｔｒｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ；図７ａ）を用いて行った。表面染色の前に、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ７８０（１：１，０００希釈；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて死細胞を排除し、続いてＦｃレセプターブロッキング抗体ＣＤ１６／ＣＤ３２（１：２００希釈、クローン２．４Ｇ２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とインキュベートした。表面染色には以下の抗体を用いた：抗ＣＤ４５（１：２００希釈、クローン３０－Ｆ１１；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；抗ＣＤ１１ｂ（１：２００希釈、クローンＭ１／７０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。以下の系統抗体を用いた（すべて１：３００希釈）：抗ＣＤ３（クローン１７Ａ２；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；抗ＣＤ１９（クローン６Ｄ５；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）；抗ＣＤ４５Ｒ（クローンＲＡ３－６Ｂ２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；Ｌｙ６Ｃ（クローンＡＬ－２１；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；Ｌｙ６Ｇ（クローン１Ａ８；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ミクログリア細胞の反応性酸化種（ＲＯＳ）を評価するために、ＣｅｌｌＲＯＸ ＤｅｅｐＲｅｄ試薬（５ｐＭ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。ミトコンドリア活性の評価には、テトラメチルローダミンメチルエステル過塩素酸塩、メチルエステル，過塩素酸塩（５０ｎＭ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ ＦＭ（２０ｎＭ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。死細胞は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたフローサイトメトリー解析の前に、ＤＡＰＩで短時間インキュベートすることにより除外した。データはＦＡＣＳＤｉｖａ ｖ．６ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で取得した。取得後の解析はＦｌｏｗＪｏ ｖ．１０（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を用いて行った。

【0199】

細胞内ＡＴＰ測定
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）の細胞内ストレスを回避するために、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ；図７ｂ）を用いてミクログリア細胞を分離した。この細胞懸濁液を、Ｆｃレセプターブロッキング抗体ＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびビオチン化抗ＣＤ１１ｂ抗体（クローンＭ１／７０；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベートした。その後、抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を細胞懸濁液に添加し、製造者の指示にしたがってポジティブセレクションを行った。各試料から、１ウェルあたり１０，０００個の細胞を９６ウェルプレートに３連でプレーティングした。細胞内ＡＴＰは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、製造者の指示にしたがって測定した。

【0200】

ＲＮＡ－Ｓｅｑ
ＦＡＣＳ選別したＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ４５ｉｎｔＬｉｎ陰性ミクログリア（試料あたり１０，０００細胞）から、Ａｒｃｔｕｒｕｓ ＰｉｃｏＰｕｒｅ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者のプロトコルにしたがって全ＲＮＡを抽出した。ＳＭＡＲＴｅｒ ｖ４ Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｉｎｐｕｔ ＲＮＡ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて一本鎖の相補的ＤＮＡを作成した。二本鎖ｃＤＮＡは長距離ＰＣＲ（１１サイクル）で増幅し、磁気ビーズクリーンアップで精製した。ライブラリー調製は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ試料調製ガイド（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の記載にしたがって行った。シーケンスランは、ＨｉＳｅｑ １０００システムユーザーガイドにしたがい、インデックス付き５０サイクルシングルリードプロトコルとＴｒｕＳｅｑ ＳＢＳ ｖ３ Ｒｅａｇｅｎｔｓを用いてＨｉＳｅｑ １０００装置（イルミナ）で行った。ＢＣＬファイルはＣＡＳＡＶＡ１．８．２ソフトウェアでＦＡＳＴＱファイルに変換した。ライブラリー調製とＲＮＡ－ｓｅｑは、ドイツ、レーゲンスブルク大学のＧｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ‘Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ ｆｏｒ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ’で実施した。

【0201】

ＦＡＳＴＱファイルに保存されたシーケンシングリードの品質をＦａｓｔＱＣ ｖ．０．６７で評価し、Ｔｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅ！ ｖ．０．４．３でトリミングした。ＳＴＡＲ ａｌｉｇｎｅｒ ｖ．２．５．２を用いて、ＲｅｆＧｅｎｅアノテーションを行い、リードをマウスゲノムｍｍ１０（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）上にマッピングした。ＦｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔ ｖ．１．５．３を用いてＢＡＭファイルから各遺伝子にマップされたリード数（カウント数）を抽出した。ＦＡＳＴＱファイルから遺伝子カウントを抽出するプロセスは、Ｇａｌａｘｙプラットフォーム上で実行した（非特許文献１８）。マッピング率が低い（７５％未満）３試料を除去した。

【0202】

差分発現解析はＤＥＳｅｑ２ ｖ．１．３２．０を用いて行った。ＤＥＳｅｑ２によって生成された正規化カウントを、アーティファクトまたは他の細胞型による汚染について評価した。使用した遺伝子のリストは、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑデータ（非特許文献１９）に基づいている。Ｒ ｖ．４．１．０を使用して、Ｗａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｓｕｍ ｏｆ ｓｑｕａｒｅｓ階層的クラスタリング法とＰＣＡを実行した。ＤＥＳｅｑ２モデルを用いて、調整Ｐ＜０．０５（Ｗａｌｄ検定）および絶対変化量＞１．５の差次的発現遺伝子（ＤＥＧ）を特定した。ヒートマップは、Ｒパッケージｐｈｅａｔｍａｐ ｖ．１．０．８を用いて、ＤＥＧのスケール（ｚスコア）正規化リードカウントから、行の階層的クラスタリング（完全法）を用いて計算した。正規化された発現データに対して、ＲパッケージＷＧＣＮＡ ｖ．１．６９を用いてＷＧＣＮＡを行った。計算効率のため、分散の５０％以上を説明する遺伝子のみを残すように遺伝子をフィルターした（１０，８４８遺伝子を残し、７，２６５遺伝子を削除）。モジュール－形質相関分析は、ＷＧＣＮＡパッケージを使用して、各変数のペア間のＰｅａｓｏｎ相関と相関のスチューデント漸近Ｐ値を計算することにより、モジュール固有遺伝子（ＭＥ）と異なる形質（細菌叢と年齢の組み合わせ）の間で行われた。マウスのゲノムワイドアノテーション（ｏｒｇ．Ｍｍ．ｅｇ．ｄｂ ｖ．３．１３．０）とＷａｌｌｅｎｉｕｓ近似を用いて、ｇｏｓｅｑ ｖ．１．４４．０を用いて異なるＭＥ中の遺伝子のジーンオントロジー（ＧＯ）濃縮解析を行った。

【0203】

０．０５誤発見率（ＦＤＲ）カットオフを用いて、過剰濃縮ＧＯカテゴリーを抽出した。ＲＯＳ関連遺伝子のリストは、ＧＯ：００００３０２、ＧＯ：２０００３７７、酸化ストレス（ＷｉｋｉＰａｔｈｗａｙｓ）から抽出した。

【0204】

ＲＴ－ｑＰＣＲ
Ｈｉｆｌａ遺伝子発現は、ＴａｑＭａｎアッセイ（Ｍｍ００４６８８６９＿ｍ１）を用いて測定した。データは、ホメオスタシスにおける若齢成人ＳＰＦ雄群のミクログリアから得られた値に対して正規化し、相対的遺伝子発現レベルを△△ＣＴ法により決定した。ＣＴ値が３５サイクル以下の場合、遺伝子発現は検出されないとした。

【0205】

マイクロバイオームプロファイリング
全ＤＮＡを、変更された製造者の説明書にしたがいＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｓｔｏｏｌ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて糞便試料から単離した（非特許文献２０）。簡単に述べると、１００－２００ｍｇを５００ｐｌのＡＳＬバッファー中で、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒを用いたビーズビーティングステップにより３０Ｈｚで３分間ホモジナイズし、続いて９５℃で２回の追加溶解ステップを行った。その後、試料を２００ｐｌのグラム陽性菌用溶解バッファー（２０ｍｇ／ｍｌ リゾチーム、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１．２％ Ｔｒｉｔｏｎ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でインキュベートした。ＤＮＡを精製し、２６ｐＭの濃度でプールし、プールしたライブラリーを、製造者の説明書にしたがって、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ ＰＧＭシステムで１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＶ５／Ｖ６領域の塩基配列を決定した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。

【0206】

試料あたり平均３８，２０９の高品質リードをマイクロバイオームプロファイリングに使用した。リードは、類似度９７％の操作的分類単位（ＯＴＵ）にクラスタリングされた。データは、ＱＩＩＭＥ ｖ．１．９．１パイプラインを使用して、低品質（塩基コール精度；ｑ＜２５）試料をフィルタリングした後、さらに解析した；４，５００リードを超える試料は、さらなる解析のために保持した（非特許文献２１）。ＯＴＵは、９７％の配列同一性閾値でＵＣＬＵＳＴを使用して選択し、その後ＳＩＬＶＡデータベースリリース１１９を使用して分類法を割り当てた。αおよびβ多様性はＲ ｖ．３．４のｐｈｙｌｏｓｅｑパイプラインを用いて計算した。ノンパラメトリックマン・ホイットニーのＵ検定を用いて試料間のα多様性を比較し、ｖｅｇａｎ Ｒパッケージｖ２．５－７のＡｄｏｎｉｓを用いてｐｈｙｌｏｓｅｑによるβ多様性の群の影響を評価した（非特許文献２２、非特許文献２３）。被検群間の門レベルおよび属レベルの分類学的差異は、「線形モデルによる多変量解析」Ｒパッケージｖ０．０．４を用いて特定した。プロットはｐｈｙｌｏｓｅｑオブジェクトを用いてｇｇｐｌｏｔ２ ｖ．３．３．５で作成した。少なくとも３０％の試料に存在する分類群と、総カウント数の０．０００１％以上を含むＯＴＵのみを考慮した。Ａ Ｐ＜０．０５およびｑ＜０．０５のＦＤＲ（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ補正）が有意性のカットオフ値として用いられた。

【0207】

ノンターゲットメタボロミクス
若齢成体マウス群および加齢マウス群の血清および脳の生データを採掘した。ノンターゲットＭＳ解析は、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎで行われた（非特許文献２４）。ピークは曲線下面積を用いて定量した。各試料の各代謝産物の生の面積カウントは、装置の日間チューニングの違いによるばらつきを補正するために、各実行日の中央値で正規化し、各実行の中央値を１．０に設定した。これにより、試料間のばらつきは保持されたが、生のピーク面積が大きく異なる代謝産物を同様のグラフスケールで比較することができた。欠損値は、正規化後に観測された最小値でインプットされた。

【0208】

ＬＣ－ＭＳによるターゲットメタボロミクス
試料は、事前冷却した（－８０°Ｃ）抽出溶液（８０：２０ メタノール ＬＣ－ＭＳ グレード：Ｍｉｌｌｉ－Ｑ Ｈ２Ｏ）で抽出した。ＬＣ－ＭＳによる標的代謝産物の定量は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで動作するＡｇｉｌｅｎｔ ６４９５ ＱＱＱ－ＭＳと連動したＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＵＨＰＬＣ システムを使用して実施した。ＭＲＭ設定は、純粋な標準物質を使用して、すべての化合物に対して個別に最適化した。ＬＣ分離は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ プロピルアミンカラム（５０ｘ２ｍｍ、３－ｐｍ パーティクル）を用いて、１００％バッファー Ｂ （９０％ アセトニトリル中 ５ｍＭ 炭酸アンモニウム）から９０％バッファー Ａ （水中 １０ｍＭ ＮＨ４）の溶媒グラジエントで行った。流速は１，０００から７５０ｐｌ／ｍｉｎであった。オートサンプラーの温度は５度、注入量は２ｐｌであった。ピーク面積は各代謝産物の標準物質に基づいて特定し、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ ｖ．Ｂ．０８．０２（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して算出した。ＳＣＦＡについては、マウス血清中の酢酸塩（Ｃ２、５９．０４ｇ／ｍｏｌ）、プロピオン酸塩（Ｃ３、７３．０７ｇ／ｍｏｌ）、酪酸（およびイソ酪酸、Ｃ４、８７）、吉草酸（およびイソ吉草酸、１０１）を定量した。代謝産物を抽出するため、各試料１０ｐｌを４本のチューブに加え、９０ｐｌのアセトニトリルを加え、標準物質を連続希釈（４段階）した。Ｃ２（ｍｇ／ｍｌ）（Ｌ１：０；Ｌ２：０．００２；Ｌ３：０．００４；Ｌ４：０．００６）、Ｃ３（ｍｇ／ｍｌ）（Ｌ１：０；Ｌ２：０．０００２；Ｌ３：０．０００４；Ｌ４：０．０００６）、Ｃ４（ｍｇ／ｍｌ）（Ｌ１：０；Ｌ２：０．０００５；Ｌ３：０．００１；Ｌ４：０．００１５）、Ｃ５（％）（Ｌ１：０；Ｌ２：０．０００２；Ｌ３：０．０００４；Ｌ４：０．０００６）、Ｃ４（ｍｇ／ｍｌ）（Ｌ１：０；Ｌ２：０．００００２５％；Ｌ３：０．００００５％；Ｌ４：０．００００７５％）であった。試料を２０，０００ｇ、１０分間、４℃で遠心分離し、上清５０ｐｌを新しいチューブに移した。高性能ＬＣ－四重極飛行時間分析法では、各試料２ｐｌを注入した。酪酸とイソ酪酸のピーク、および吉草酸とイソ吉草酸のピークは頑健に区別できなかった；そのため、各組の濃度値は両方の部位に対応する。各試料は２回分析し、平均値を回帰直線の作成に使用した。；濃度は標準添加法（非特許文献２５）で計算した。

【0209】

ヒトのメタボロミクスデータ
ＴｗｉｎｓＵＫ成人双生児登録には、主に女性で、英国の一般集団と同様の疾患や生活習慣を持つ約１４，０００人が登録されている。Ｓｔ．Ｔｈｏｍａｓ‘Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅはこの研究を承認し、すべての双子はインフォームド・コンセントを文書で得た。ＣＭＬとＴＭＡＯについては、加齢コホートを含む血液メタボローム研究からデータを抽出し、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎプラットフォームで実行した。簡単に説明すると、代謝産物比率は、アンターゲット超高性能ＬＣ－ＭＳ／ＭＳプラットフォームを使用して、Ｍｅｔａｂｏｌｏｎによって血液試料から測定された。代謝産物は実行日の中央値でスケーリングされ、対数変換された。

【0210】

統計
試料サイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかった。データの分布は正規分布と仮定した。該当する場合、動物は無作為に異なる実験群に割り付けられた。実験者は群の割り当てに関して盲検であった。ＲＮＡ－ｓｅｑ、ノンターゲットメタボロミクス、微生物プロファイリング以外の統計解析は、Ｐｒｉｓｍ ９．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて行った。

【0211】

研究結果
腸内細菌叢が加齢におけるミクログリアのトランスクリプトームプロファイルを変化させる
大脳皮質では、加齢に伴ってミクログリア細胞密度が高くなることが以前に報告されている。

【0212】

若齢成体マウスと加齢マウスとの間で、特異的細菌非存在（ＳＰＦ）動物および細菌非存在（ＧＦ）動物の大脳皮質におけるミクログリア細胞密度の増加が確認されたが（参照、図６ａ―６ｂ）、加齢ＳＰＦマウスとＧＦマウスとの間に差は認められなかった（参照、図６ａ―６ｂ）。ＳＰＦマウスおよびＧＦマウスのミクログリアにおける潜在的な形態学的変化を決定するために、定量的形態学的再構成を行った。ＳＰＦマウスのミクログリアは、細胞体積の増加とともに、総分岐面積、総分岐長および分岐点数の減少を示した（図６ｃ－６ｇ参照）。細胞体の球形度は群間で変化しなかった（図６ｈ参照）。これらのデータは、ＳＰＦマウスでは年齢がミクログリアの形態に影響を及ぼしたが、ＧＦマウスではミクログリアは変化せず、高ｒａｍ化したことを示している。

【0213】

加齢脳におけるミクログリア生理の細菌叢依存性変化をさらに評価するために、ＧＦまたはＳＰＦ条件下で飼育された、若齢成体（６～１０週齢）および加齢（９６～１０４週齢）雌雄マウスの全脳からＦＡＣＳ精製ミクログリア（参照、図７ａおよび図８ａ）に対してＲＮＡ－ｓｅｑを行った（参照、図１ｂおよび図８ｂ）。ＰＣＡにより、ＧＦマウスとＳＰＦマウスの両年齢群におけるミクログリアの遺伝子発現プロファイルが明らかになった（図１ｃ参照）。ＧＦマウスとＳＰＦマウスから単離されたミクログリア間のトランスクリプトームの違いは、年齢が高いほど顕著であった（図１ｄ参照）。ＳＰＦマウスのミクログリアと比較すると、ＧＦマウスのミクログリアでは、細胞骨格（例えば、Ｓｄｃ３、Ｓｕｌｔ１ａ１、Ｔｕｂａ４ａ）や免疫機能（例えば、Ｃｔｓｅ、Ｅｒｏ１ｌｂ、Ｈｔｒａ３、Ｋｃｎｍａ１、Ｎｏｔｃｈ４、Ｎｒ１ｄ２、Ｒａｂ４ａ、Ｗｄｆｙ１）に関連する遺伝子を含む、年齢に依存しない遺伝子発現パターン（ミクログリアＧＦシグネチャー）が出現した（図１ｅ参照）。さらに、ミクログリアのＧＦシグネチャーには、ミトコンドリア機能の制御に関連する遺伝子（例えば、Ｂ４ｇａｌｎｔ１、Ｇｐｒ１３７ｂ、Ｇｓｔｍ１、Ｍｃｕｒ１、Ｍｔｆｐ１、ＮｎｔおよびＰｌｃｄ３）が含まれており、ミクログリアの代謝プロファイルを制御する細菌叢の能力が示された（図１ｅ参照）。次に、加重遺伝子共発現ネットワーク解析（ＷＧＣＮＡ）を用いて、年齢と細菌叢に関するミクログリアにおける遺伝子発現の機能的変化を特徴付けた（図１ｆ－１ｇおよび図８ｃ参照）。有意に（Ｗａｌｄ Ｐａｄｊ＜０．０５）分散の５０％以上を説明した遺伝子は、その共発現パターンに基づいてモジュール固有遺伝子（ＭＥ）に入れられた。ＳＰＦ群とＧＦ群の比較では、免疫機能とエピジェネティック制御に関連する遺伝子ネットワーク、それぞれ、ＭＥ１、ＭＥ５、ＭＥ６、ＭＥ７、にわずかな違いが認められた。２つのモジュールが各年齢群に特徴的であった。加齢のＳＰＦ群のＭＥ１とＭＥ４には、ミトコンドリア代謝や脂質局在化などのプロセスに関連する遺伝子が含まれており、加齢のＧＦ群のＭＥ２とＭＥ６には、免疫応答、ヒストンリジンメチル化、細胞形態形成を制御する遺伝子が含まれていた（図８ｄ参照）。加齢ＳＰＦ群のＭＥ１とＭＥ４には、ミトコンドリア代謝や脂質局在化などのプロセスに関連する遺伝子が含まれ、加齢ＧＦ群のＭＥ２とＭＥ６には、免疫応答、ヒストンリジンメチル化、細胞形態形成を制御する遺伝子が含まれた（図８ｃ）。ＭＥ１およびＭＥ８に含まれる、免疫応答（例えば、Ａｘｌ、Ｃｒｌｆ２、Ｔｎｆｓｆ８、Ｔｎｆｓｆ１０、Ｃｃｌ１２、Ｆｇｒ、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ６ｓｔ、Ｓｐｐ１、Ｔｌｒ２）、インターフェロンシグナル伝達（例えば、Ｃｘｃｌ１０ ８、Ｉｆｉ２０７、Ｉｆｉｔ２ ８、Ｓｔａｔ１）、炎症応答（例えば、Ｃｄ１８０、Ｌｄｌｒ、Ｓ１００ａ８、Ｓ１００ａ９）、ミクログリア細胞遊走（例えば、Ｃｃｌ１２、Ｃｘｃｌ１０）に関連する遺伝子は、加齢ＳＰＦマウスのミクログリアにおいて特異的な発現上昇を示したが、若齢成体群および加齢ＧＦマウスではいずれも陰性または低い相関を示した。ＭＥ１とＭＥ８は、ミトコンドリア代謝過程、過酸化水素代謝過程、活性酸素代謝過程を含み、加齢ＳＰＦ群で強い相関を示した。加齢ＧＦマウスに高度に濃縮されたＭＥ２は、酸素含有化合物に対する反応と関連していた（図８ｃ）。ＭＥ２に含まれる遺伝子には、Ｆｏｘｐ１、Ｎｒｆ１、Ｔｒｐ５３のような細胞内ＲＯＳレベルを制御する遺伝子や、Ｇ６ｐｄｘ、Ｐｄｋ２、Ｓｔａｔ３、Ｕｃｐ２のようなミトコンドリアのＲＯＳ制御に関与する遺伝子が含まれるが、加齢ＳＰＦマウスのミクログリアでは、年齢をマッチさせたＧＦマウスと比較して発現量が少なく、加齢ＳＰＦマウスのＲＯＳレベルが細胞の最適範囲に保たれていないことを示している。加齢脳におけるＲＯＳの蓄積は、ミトコンドリアの損傷やミトコンドリア機能障害と関連している。実際、ＭＥ３、ＭＥ５、ＭＥ９では、ミトコンドリアのアセンブリー、糖代謝、酸化的リン酸化に関連する遺伝子に顕著な変化が見られた。これらの遺伝子はＳＰＦマウスでもＧＦマウスでも発現が上昇したが、ここではＲＯＳを制御する保護遺伝子がダウンレギュレートされていたので、ＳＰＦマウスではミトコンドリアの損傷がより顕著であった。さらに、加齢のＧＦマウスでは、ミトコンドリアの構造と機能を維持する遺伝子がアップレギュレートされた（図８ｄ）。

【0214】

次に、加齢に関連したＭＥに対する細菌叢の寄与を調べた。ＷＧＣＮＡの結果、加齢ＧＦマウスのミクログリアは、ＳＰＦマウスの一般的な加齢傾向にしたがったが、その程度は低く（図１ｆ－１ｇ参照）、若齢成体群に近いクラスターを形成していた（図８ｂ参照）。例えば、免疫応答（例えば、Ａｘｌ、Ｃｒｌｆ２、Ｔｎｆｓｆ８、Ｔｎｆｓｆ１０、Ｃｃｌ１２、Ｆｇｒ、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ６ｓｔ、Ｓｐｐ１およびＴｌｒ２）、インターフェロンシグナル伝達（例えば、Ｃｘｃｌ１０／８、Ｉｆｉ２０７、Ｉｆｉｔ２／８およびＳｔａｔ１）、炎症応答（例えば、Ｃｄ１８０、Ｌｄｌｒ、Ｓ１００ａ８およびＳ１００ａ９）およびミクログリア細胞遊走（例えば、Ｃｃｌ１２およびＣｘｃｌ１０）に関連するＭＥ１およびＭＥ８の遺伝子は、加齢ＳＰＦマウスのミクログリアにおいて特異的なアップレギュレーションを示し、若齢成体群および加齢ＧＦマウスで負の相関または低い相関を示した（図２ａおよび図８ｃ－８ｄ参照）。ミクログリアは、細菌叢に依存した乖離を伴って、加齢に伴うトランスクリプトーム・プロファイルの変化を示した。

【0215】

加齢ＧＦマウスのミクログリアにおける酸化ストレスの減少
加齢関連モジュールのパスウェイを調べると、細菌叢に依存するミクログリアにおける酸化ストレスの制御との関連がいくつか見つかった。ＭＥ１およびＭＥ８は、ミトコンドリア代謝過程、過酸化水素代謝過程およびＲＯＳ代謝過程を含む、加齢ＳＰＦ群において強い相関を示した。加齢のＧＦマウスで高度に濃縮されたＭＥ２は、酸素含有化合物に対する反応と関連していた（図１ｆ－１ｇおよび図２ａ参照）。ミクログリアＲＯＳ関連遺伝子の発現レベルがマウスの年齢および飼育条件によって調節されていることを確認するために、加齢に関連するＭＥ１、ＭＥ２およびＭＥ８のＲＯＳ関連遺伝子を選択的に解析した（図２ｂ参照）。加齢ＳＰＦマウスのミクログリアにおいてのみ、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｙｂａ、Ｃｙｂｂ、Ｄｕｏｘａ１、Ｉｌ１ｂ、Ｔｇ ｆｂｒ２、Ｔｌｒ２、Ｔｌｒ４およびＴｌｒ５のようないくつかの免疫活性化およびＲＯＳ促進遺伝子、ならびにＡｘｌ、Ｈｉｆ１ａ、Ｌｃｎ２、Ｍｍｐ２、Ｒｅｌａ、Ｔｒｅｘ１、Ｓ１００ａ８およびＳ１００ａ９のようなＲＯＳ応答遺伝子の特異的な発現上昇が認められた（図２ｂ参照）。Ｆｏｘｐ１、Ｎｒｆ１、Ｔｒｐ５３のような細胞内ＲＯＳレベルを制御する遺伝子や、Ｇ６ｐｄｘ、Ｐｄｋ２、Ｓｔａｔ３、Ｕｃｐ２のようなミトコンドリアのＲＯＳ制御に関与する遺伝子を含むＭＥ２の遺伝子は、年齢をマッチさせたＧＦマウスと比較して、加齢ＳＰＦマウスのミクログリアでは発現が少なかった（図２ｂ参照）。ＣｅｌｌＲＯＸフローサイトメトリーアッセイを用いて、若齢成体および加齢ＳＰＦマウスから単離したミクログリアにおけるＲＯＳ産生をモニターしたところ、加齢とともにＲＯＳの有意な上昇が観察され、加齢ＧＦマウスではその上昇が抑制された（図２ｃ参照）。誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の活性化は、過剰なＲＯＳの生成に直接関連している。免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いると、ＳＰＦ条件下でミクログリアｉＮＯＳ発現の加齢依存的増加が観察されたが、ＧＦマウスではあまり顕著ではなかった（図２ｄ－２ｅ参照）。

【0216】

どれだけＲＯＳが増加したかを調べることは、ミクログリア機能に影響を与える。ＭＥ３、ＭＥ５およびＭＥ９を観察した。ミトコンドリアのアセンブリー、糖代謝および酸化的リン酸化に関連する遺伝子の変化が見られた（図２ｆ参照）。ミクログリアのミトコンドリアを電子顕微鏡で観察すると、ＧＦマウスと比較してＳＰＦマウスでは、ミクログリアあたりのミトコンドリアの質量や数に変化はなかったが、損傷したミトコンドリアの割合がかなり高く、クリステがあまり明瞭でない、あるいは破壊されていることさえ明らかになった（図２ｇ－２ｈおよび図９ａ－９ｃ参照）。加齢ＳＰＦマウスのミクログリアにおいてピークに達した細胞内ＲＯＳの蓄積は、低酸素誘導因子１サブユニットα（Ｈｉｆ１ａ）の発現を誘導し得る。ＨＩＦ１ａは、脳の擬似低酸素状態におけるＲＯＳと関連しており、ミトコンドリア代謝を直接変化させることができる（非特許文献２６）。加齢脳におけるミトコンドリアの機能不全は、ミクログリアの誇張された活性化に関連する代謝シフトを引き起こす。若齢成体マウスは同様のＨｉｆ１ａ発現を示したが、ＲＮＡ－ｓｅｑおよび逆転写による定量的ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）は、加齢ＳＰＦマウスのミクログリアにおけるＨｉｆ１ａ発現がＧＦマウスよりも高いことを示した（図９ｄ－９ｅ参照）。加齢動物の細胞では、酸化的リン酸化の効率が低下し、ＡＴＰ産生の減少につながる（非特許文献２７）。ミトコンドリアの膜貫通電位（ΔΨｍ）は、ＡＴＰ産生の主要な原動力である。加齢に伴うミトコンドリア量の増加を考慮し（図９ｆ－９ｇ参照）、ミトコンドリア活性を、ミトコンドリア量に対するミトコンドリアの膜貫通電位としてプロットした。ミトコンドリア活性は、ＳＰＦマウスでは加齢に伴う低下と細胞内ＡＴＰリザーバーの減少を示したが、ＧＦマウスのミクログリアでは両者ともそれほど顕著ではなかった（図２ｉ、図７ｂ、図９ｈ参照）。これらのデータを総合すると、細菌叢は加齢脳のミクログリアにおける酸化ストレスの増加に寄与しており、それはミトコンドリアへの直接的な損傷と関連していることがわかる。

【0217】

細菌叢に依存したＣＭＬの加齢に伴う蓄積
若齢成体および加齢ＳＰＦマウスの血清試料中の短鎖脂肪酸濃度を、標的液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）代謝産物分析を用いて特定した（図３ａ参照）。若齢成体マウスおよび加齢マウスの血清中では酢酸塩が最も多く、若齢成体マウスと比較して加齢マウスの血清中では酢酸塩およびプロピオン酸塩の濃度が高かった。酪酸／イソ酪酸および吉草酸／イソ吉草酸は変化しなかった（図３ａ参照）。偏りのないスクリーニングでは、ノンターゲットメタボロミクスデータセットを使用し、ＳＰＦ条件下で飼育した若齢成体マウスと加齢マウスの血清および脳試料を調査した（図３ｂ～３ｃ参照）。パスウェイの濃縮解析により、いくつかの組織特異的なパスウェイの変化が明らかになった。例えば、ピリミジン、イノシトール、カルニチン、およびアミノ酸代謝に関連するいくつかのパスウェイ（例えば、リジン、ポリアミンおよびチロシン）は、加齢マウスの血清においてより影響を受けた（図１０ａ参照）。ビタミンＡ、トコフェロール、プリン代謝、セラミド関連経路、ペントースリン酸経路は、加齢マウスの脳で特異的に変化した（図１０ｂ参照）。脂肪酸代謝および終末糖化産物（ＡＧＥｓ）のパスウェイは、加齢マウスの血清および脳試料の両方で共通して変化した（図１０ａ－１０ｂ参照）。加齢マウスの血清と脳組織の両方で有意に発現が上昇した代謝産物から、腸で制御され血流を介して脳に到達する可能性のある代謝産物を特定することができた。これらの代謝産物には、パルミトレイン酸（１６：１ｎ７）、ＴＭＡＯ、１－オレオイル－２－ドコサヘキサエノイル－グリセロホスホリルコリン（１８：１／２２：６）、ＣＭＬおよびスタキドリンが含まれた（図３ｄ参照）。マウスで見られた加齢に関連した濃度変化の一部は、ヒトの血液試料でも確認された。ヒト加齢コホート（ＴｗｉｎｓＵＫデータバンク）の血清／血漿のノンターゲットメタボロミクスでは、マウスで見られたＣＭＬ（図３ｅ参照）とＴＭＡＯ（図３ｆ参照）の加齢に伴う濃度変化が再現された。若齢および加齢のＳＰＦおよびＧＦマウスの脳組織からのターゲットメタボロミクスにより、加齢マウスの脳組織におけるＣＭＬおよびＴＭＡＯの増加には、機能的な腸内細菌叢（例えばＳＰＦマウス）が必要であることが示された。加齢のＧＦマウスは、若いＧＦマウスと比較してわずかな変化しか示さなかった（図３ｇ参照）。

【0218】

ＣＭＬは加齢に伴うミクログリア機能障害を増強する
次に、ｉｎ ｖｉｖｏでのミクログリアに対するこれらの代謝産物の機能的効果を評価した。次の候補代謝産物がさらなる評価のために選択された：ＣＭＬ、ＴＭＡＯ、酢酸塩、およびプロピオン酸塩である。加齢ミクログリアにおけるＲＯＳ産生増加の原因となる代謝産物を特定するため、各代謝産物を若齢成体マウスに別々に投与した。腸管から循環系への吸収プロファイルの違いによる潜在的なアーティファクトを避けるため、若齢成体マウスにＣＭＬ、ＴＭＡＯ、酢酸ナトリウム、またはプロピオン酸ナトリウムを１日１回、２週間にわたって腹腔内注射した（図４ａ参照）。ＴＭＡＯ、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウムは、細胞内ＲＯＳ産生にもミクログリアの代謝機能にも影響を及ぼさなかった。しかしながら、ＣＭＬ処置は加齢マウスのミクログリアにおいて見られた変化を部分的に再現することができた。

【0219】

ＣＭＬは酸化ストレスを増加させ、代謝活性を低下させ、細胞内のＡＴＰ貯蔵量を減少させた（図４ｂ－４ｄ参照）。さらに、ＣＭＬはミクログリアのミトコンドリア構造に直接損傷を与えることにより、ミトコンドリア機能障害を引き起こした（図１０ｃ参照）。ＣＭＬ治療の影響はミクログリアだけにとどまらず、マクロファージにも悪影響を与えた。骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで酸化ストレスの用量依存的増加と代謝活性の低下を示した（図１０ｄ－１０ｅ参照）。循環ＣＭＬは、内因性メイラード反応、食物、または腸内細菌叢によるＡＧＥｓの変換に由来し得る（非特許文献２８）。脳内ＣＭＬ濃度は、加齢ＳＰＦマウスでは増加したが、加齢ＧＦマウスでは増加しなかった（図４ｅ参照）。ＣＭＬは、若齢成体および加齢ＧＦマウスの脳組織においても、若齢成体ＳＰＦマウスと同程度のレベルで検出可能であった。これらの結果は、腸内細菌叢が加齢脳におけるＣＭＬレベルの上昇には必要であるが、若齢成体マウスに見られるベースラインレベルには必要ないことを示している。したがって、これらの結果は、ＣＭＬの腹腔内注射後にみられたミクログリアにおけるミトコンドリア機能の調節不全が、脳のＣＭＬ濃度の上昇に起因しており、加齢脳における設定を再現していることも示している（図４ｆ参照）。ミクログリアのＲＮＡ－ｓｅｑ解析から、ＣＭＬの腹腔内投与は、ＲＯＳ関連遺伝子Ｓ１００ａ９とＳ１００Ａ８、およびＡ４３００３３Ｋ０４Ｒｉｋ、Ｃｈｉｃ１、Ｌｔｆ、Ｎｇｐ、Ｐｇｌｙｒｐ１、Ｓｃａｉ、Ｚｋｓｃａｎ２などの微生物や加齢に関連する遺伝子の発現を上昇させることが示された（図４ｇ－４ｈおよび図１０ｆ参照）。

【0220】

大脳皮質ミクログリアにおけるＣＭＬの免疫蛍光染色は、ミクログリアがＣＭＬによって直接標的にされるかどうかを調べ、ＳＰＦおよびＧＦ条件下で飼育されたマウスでは、加齢とともにＣＭＬ陽性ミクログリアの割合が増加することを示した。加齢ＳＰＦマウスのミクログリアの約３０％がＣＭＬ陽性であり、加齢ＧＦマウスのミクログリアは加齢によるＣＭＬの蓄積が少なかった（図４－ｉ－４ｊ参照）。さらに、マウスの大脳皮質で見られたＣＭＬ陽性ミクログリアの加齢依存的増加は、ヒトの大脳皮質にも存在することが検証された。１歳から８８歳までのヒトの脳組織（合計ｎ＝４３、男性２３、女性２０）が得られ、年齢とヒト大脳皮質におけるＣＭＬ陽性ミクログリアの割合との間に正の相関（ｒ＝０．５７９３、Ｒ²＝０．３３５６、Ｐ＜０．００１）が観察された（図４ｋ－４ｌ参照）。マウスでは、ミクログリアのＲＮＡ－ｓｅｑ解析から、ＣＭＬをｉ．ｐ．注射すると、ＲＯＳ関連遺伝子であるＳ１００ａ９とＳ１００Ａ８、およびＡ４３００３３ｋ０４Ｒｉｋ、Ｃｈｉｃ１、Ｌｔｆ、Ｎｇｐ、Ｐｇｌｙｒｐ１、Ｓｃａｉ、Ｚｋｓｃａｎ２のような他の微生物や加齢に関連する遺伝子の発現が上昇することが示された。これらの知見は、加齢に伴うＣＭＬの蓄積が、ＲＯＳの増加を含む直接的な形でミクログリアの代謝機能障害を誘導し、脳の恒常性と脳機能を徐々に破壊する可能性があることを示している。

【0221】

加齢細菌叢は腸血液関門を破壊することによってＣＭＬレベルを駆動する
１６ＳリボソームＲＮＡ－ｓｅｑによる年齢依存的な腸内細菌叢の変化は、特に加齢期におけるＣＭＬレベルおよびミクログリア機能の差異が細菌叢の有無に依存するという知見に基づいて特徴づけられた。若齢成体マウスと加齢マウスの細菌叢プロファイルが異なることは、ブレイ・カーティス非類似度指標とシャノンおよびシンプソンα多様性指標を用いたβ多様性解析によって確認された（図１１ａ－１１ｂ参照）。両年齢群の腸内細菌叢は、２つの門、すなわちファーミキューテス門とバクテロイデーテス門に支配されていた（図１１ｃ参照）。ファーミキューテス門とバクテロイデーテス門の相対存在比は、ヒトでは加齢になるにつれて変化し、異なる年齢段階における細菌プロファイルの全体的な変化と関連づけることができる（非特許文献２９）。ファーミキューテス門とバクテロイデーテス門の比率における有意な加齢依存性の減少が観察され（非特許文献３０）、ファーミキューテス門、ラクノスピラ科は加齢マウスにおいて有意に減少した（図１１ｄ－１１ｅ参照）。細菌属では、ツリバクター（Ｔｕｒｉｂａｃｔｅｒ）属、アロプレボテラ（Ａｌｌｏｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、パラステラ属、ビフィドバクテリウム属、マセリバクテロイデス（Ｍａｃｅｌｌｉｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）属、アリスティペス センス ストリクト １属、ペプトストレプトコッカセアエ インケルタエ セディス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ ｉｎｃｅｒｔａｅ ｓｅｄｉｓ）属、パラバクテロイデス属の増加が加齢マウスで観察された。この発見は、パントネア、アノキシバチルス、ラクノスピラセアエ インケルタエ セディス、クルトバクテリウム、アセトアチファクター（Ａｃｅｔａｔｉｆａｃｔｏｒ）の存在量が加齢マウスで減少したのとは対照的であった（非特許文献３１）（参照、図１１ｆ）。これらの知見は、若齢成体マウスと加齢マウスの細菌叢をプロファイリングすると、いくつかの分類学的レベルで変化が見られることを示している。糞便ペレット中のＣＭＬのターゲットメタボロミクス（ＬＣ－ＭＳ）測定により、加齢ＧＦマウスの糞便ペレットは加齢ＳＰＦマウスのものよりもＣＭＬレベルが高いことが明らかになり、加齢に伴う脳内ＣＭＬ蓄積における細菌叢の間接的役割が実証された（図５ａ参照）。

【0222】

加齢マウスは若齢成体マウスに比べて腸管透過性が亢進しており、この現象は細菌叢の存在に依存している。透過性の亢進により、代謝産物が消化管内から腸上皮をより自由に通過し、血流に入ることが可能となり、脳内と糞便中のＣＭＬレベルの不一致を説明できる可能性がある。この仮説を検証するため、経口投与後のＦＩＴＣ－デキストラン（４ｋＤａ）の循環への移行を定量化することで腸管透過性を測定した。加齢ＳＰＦマウスでは高い腸管透過性が観察され、加齢ＧＦマウスのバリア機能は若齢成体ＳＰＦマウスおよびＧＦマウスと同等であった（図５ｂ参照）。若齢ＧＦマウスに加齢細菌叢をコロニー形成させると、若齢ＧＦマウスに若齢腸内細菌叢を投与した後に認められた透過性と比較して、細菌叢依存的に腸管透過性が上昇した（図５ｃ参照）。このことは、経口摂取後のＣＭＬの循環への移行が、加齢ＳＰＦマウスで最も高いという観察結果と一致した（図５ｄおよび図１２ａ参照）。ＣＭＬの適用経路の違いがミクログリアへのＣＭＬの蓄積に影響するかどうかを評価するために、経口投与ではなく腹腔内投与でＣＭＬを受けた若齢成体マウスを研究した。このようなマウスは、大脳皮質でより多くのＣＭＬ陽性ミクログリアを示した（図１２ｂ－１２ｃ参照）。加齢マウスでは、ＣＭＬの投与経路はＣＭＬ陽性ミクログリアの割合に影響を及ぼさなかった（図１２ｂ－１２ｃ参照）。腹腔内投与および経口投与の両ルートによるＣＭＬ投与は、加齢マウスのミクログリアにおける加齢に関連した細胞内ＲＯＳの増加と代謝機能の低下を有意に悪化させた。若齢成体マウスでは、このような効果はＣＭＬの腹腔内投与後にのみ検出可能であった（図１２ｄ－１２ｅ参照）。加齢に伴うミクログリアへのＣＭＬの蓄積に対する腸管バリアの重要な役割を検証するために、加齢ＳＰＦマウス（１８ヶ月齢）に、加齢に伴う細菌叢ディスバイオシスを軽減し、腸上皮のオートファジーを誘導することによって、ＣＭＬの蓄積を防ぐエラグ酸（ＥＡ）、または腸管バリア機能の内因性増強因子である腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）を３日ごとに１０週間経口投与した（図５ｅ参照）。ＥＡは腸管透過性に影響を及ぼさなかったが、ＩＡＰを投与した加齢マウスは腸管漏出性が低下した（図５ｆ参照）。ＥＡもＩＡＰも、それぞれ間接的または直接的に、脳内のＣＭＬ蓄積を減少させた（図５ｇ参照）。ＥＡおよびＩＡＰ処置した加齢マウスのミクログリアは、ビヒクル処置した加齢マウスと比較して、細胞内ＲＯＳの有意な減少およびＡＴＰレベルの増加を示した（図５ｈ－５ｉ参照）。これらの知見は、加齢による細菌叢の変化が、腸関門の完全性を破壊し、加齢マウスやヒトの脳でＣＭＬの蓄積を促進していることを示している（図１ａ参照）。

【0223】

例２．認知障害または神経変性疾患を発症するリスクが増大した被験者の特定
被験者は、例えば、ミクログリア機能障害を発症するリスクの増大、認知障害のリスクの増大、または神経変性疾患を発症するリスクの増大を有することを、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体のレベルが基準レベルと比較して上昇している被験者を特定することを含む方法によって特定することができる。生体試料は、例えば、血液、血清、または血漿であり得る。

【0224】

いくつかの実施形態では、生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体の量は、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー）、質量分析、液体クロマトグラフィー質量分析、または核磁気共鳴分光法によって測定される。生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ代謝産物、またはＣＭＬ類似体のレベルの上昇が観察された場合、被験者は、例えば、ミクログリア機能障害を発症するリスクの上昇、認知障害のリスクの上昇、または神経変性疾患を発症するリスクの上昇を有すると特定することができる。

【0225】

実施形態
本明細書において、特定の実施形態では、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤による治療のために被験者を選択する方法が記載され、本方法は以下を含む。：（ａ）被験者から得られた生体試料中に、基準レベルと比較して上昇したレベルのＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物を有する被験者を特定する；および（ｂ）特定された被験者を、腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤による治療のために選択する。

【0226】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物のレベルが基準レベルと比較して上昇していると特定された被験者に、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を投与することを含む、被験者を治療する方法が記載される。

【0227】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者の組織または体液試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の蓄積率を低下させる方法であって、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む方法が記載される。

【0228】

本明細書において、特定の実施形態では、それを必要とする被験者において、ミクログリアにおける酸化ストレスまたは代謝ストレスの発現率を低下させる方法が記載され、本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0229】

本明細書において、特定の実施形態では、それを必要とする被験者において、ミクログリアにおけるミトコンドリア機能不全の発症率を低下させる方法が記載され、本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0230】

本明細書において、特定の実施形態では、それを必要とする被験者において、ミクログリア機能不全の発症率を低下させる方法が記載され、本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0231】

本明細書において、特定の実施形態では、それを必要とする被験者において、ミクログリアの１つ以上の機能を増加させる方法が記載され、本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0232】

本明細書において、特定の実施形態では、それを必要とする被験者において、認知障害の発症率または悪化率を低下させる方法が記載され、本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0233】

本明細書において、特定の実施形態では、それを必要とする被験者において、認知障害を治療する方法が記載され、本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0234】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者における神経変性疾患の発症率または進行率を低下させる方法が記載され、本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0235】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者における神経変性疾患を治療する方法であって、本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0236】

本明細書において、特定の実施形態では、それを必要とする被験者において、神経機能障害の発症率または悪化率を低下させる方法が記載され、本方法は、治療有効量の腸管バリア機能増強剤および／または腸内細菌叢ディスバイオシスを軽減または除去するための薬剤を被験者に投与することを含む。

【0237】

特定の実施形態において、被験者は、基準レベルと比較して、被験者の生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物のレベルが上昇していることが以前に特定されている。

【0238】

特定の実施形態において、本方法は、被験者の生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物のレベルが基準レベルと比較して上昇しているとして被験者を特定することをさらに含む。

【0239】

特定の実施形態において、被験者は、基準レベルと比較して上昇したレベルの腸関門の透過性を有すると以前に特定されている。

【0240】

特定の実施形態において、本方法は、基準レベルと比較して上昇したレベルの腸関門の透過性を有するものとして被験者を特定することをさらに含む。

【0241】

特定の実施形態において、生体試料は、唾液、尿、血液、血清、血漿、脳脊髄液、脳組織、または糞便を含む。

【0242】

特定の実施形態において、被験者は、認知障害を有すると特定または診断されている。

【0243】

特定の実施形態において、被験者は、認知障害を発症するリスクが増大していると特定されている。

【0244】

特定の実施形態において、被験者は、神経変性疾患を有すると特定または診断されている。

【0245】

特定の実施形態において、被験者は、神経変性疾患を発症するリスクが増大していると特定されている。

【0246】

特定の実施形態において、本方法は、被験者のミクログリアにおける細胞内および／またはミトコンドリアＲＯＳのレベルの低下をもたらす。

【0247】

特定の実施形態において、本方法は、被験者のミクログリアにおけるｉＮＯＳの発現の低下をもたらす。

【0248】

特定の実施形態において、本方法は、被験者のミクログリアにおいて、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｃｙｂａ、Ｃｙｂｂ、Ｄｕｏｘａ１、Ｉｌ１ｂ、Ｔｇｆｂｒ２、Ｔｌｒ２、Ｔｌｒ４、Ｔｌｒ５、Ａｘｌ、Ｈｉｆ１ａ、Ｌｃｎ２、Ｍｍｐ２、Ｒｅｌａ、Ｔｒｅｘ１、Ｓ１００ａ８、およびＳ１００ａ９からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現の低下をもたらす。

【0249】

特定の実施形態において、本方法は、被験者のミクログリアにおいて、被験者のＦｏｘｐ１、Ｎｒｆ１、Ｔｒｐ５３、Ｇ６ｐｄｘ、Ｐｄｋ２、Ｓｔａｔ３、およびＵｃｐ２からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の発現の増加をもたらす。

【0250】

特定の実施形態において、本方法は、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物のレベルを決定することをさらに含む。

【0251】

特定の実施形態において、神経変性疾患は、以下からなる群より選択される：アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、緑内障、筋強直性ジストロフィー、進行性核上性麻痺、脊髄性筋萎縮症、多系統萎縮症、運動失調症、血管性認知症、または他の認知症。

【0252】

本明細書において、特定の実施形態では、ミクログリア機能不全を発症するリスクが増大しているとして被験者を特定する方法であって、本方法は、基準レベルと比較して、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物のレベルが上昇している被験者を特定することを含み、このような上昇したレベルは、被験者がミクログリア機能不全を発症するリスクが増大していることを示す。

【0253】

本明細書において、特定の実施形態では、認知障害のリスクが増大しているとして被験者を特定する方法であって、本方法は、基準レベルと比較して、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物のレベルが上昇している被験者を特定することを含み、このような上昇したレベルは、被験者が認知障害を発症するリスクが増大していることを示す。

【0254】

本明細書において、特定の実施形態では、神経変性疾患を発症するリスクが増大しているとして被験者を特定する方法であって、本方法は、基準レベルと比較して、被験者から得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物のレベルが上昇している被験者を特定することを含み、このような上昇したレベルは、被験者が神経変性疾患を発症するリスクが増大していることを示す。

【0255】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者の組織試料または体液試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の蓄積率を減少させるための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、本方法は以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および哺乳動物において第二の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者の組織におけるＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の蓄積率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0256】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者におけるミクログリアの酸化ストレスまたは代謝ストレスの発現率を低下させるための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、本方法は以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および哺乳動物において第二の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者のミクログリアにおける酸化ストレスまたは代謝ストレスの発現率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0257】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者におけるミクログリアの酸化ストレスまたは代謝ストレスの発現率を低下させるための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、本方法は以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および哺乳動物において第二の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者のミクログリアにおける酸化ストレスまたは代謝ストレスの発現率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0258】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者におけるミクログリアのミトコンドリア機能不全の発症率を低下させるための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、本方法は以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および第二の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者におけるミクログリアのミトコンドリア機能不全の発症率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0259】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者におけるミクログリア機能不全の発症率を減少させるための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、本方法は以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および第二の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者におけるミクログリア機能不全の発症率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0260】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者におけるミクログリアの１つ以上の活性を増加させるための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、本方法は以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および第二の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者におけるミクログリアの１つ以上の活性を増加させるための候補薬剤として特定される。

【0261】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者における認知障害の発症率または悪化率を低下させるための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、本方法は以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および第二の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者における認知障害の発症率または悪化率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0262】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者において認知障害を治療するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、本方法は以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および第二の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者において認知障害を治療するための候補薬剤として特定される。

【0263】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者における神経変性疾患の発症率または進行率を低下させるための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、本方法は以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第１のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および第二の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者における神経変性疾患の発症率または進行率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0264】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者における神経変性疾患を治療するための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、本方法は以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および第二の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者における神経変性疾患を治療するための候補薬剤として特定される。

【0265】

本明細書において、特定の実施形態では、被験者における神経機能障害の発症率または悪化率を低下させるための候補薬剤をスクリーニングする方法であって、本方法は以下を含む：哺乳動物において第一の時点で得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第一のレベルを決定すること；被験者に薬剤を投与すること；および第二の時点で哺乳動物において得られた生体試料中のＣＭＬ、ＣＭＬ前駆体、ＣＭＬ分解産物、またはＣＭＬ代謝産物の第二のレベルを決定すること；ここで、第一のレベルと比較して第二のレベルの減少をもたらす薬剤が、被験者における神経機能障害の発症率または悪化率を減少させるための候補薬剤として特定される。

【0266】

特定の実施形態において、本方法は、候補薬剤を動物モデルで試験することをさらに含む。

【0267】

参照による援用
本明細書の本文を通じて引用されるすべての刊行物および特許（すべての特許、特許出願、科学刊行物（例えば、非特許文献３２）、製造者の仕様書、説明書などを含む）は、上述または下述にかかわらず、あらゆる目的のためにその全体が参照により援用される。参照により援用される資料が本明細書と矛盾または矛盾する範囲においては、本明細書があらゆるそのような資料に優先する。

【0268】

均等物
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具体化してもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載された発明を限定するよりもむしろ、あらゆる点で例示的であると考えられる。したがって、本発明の範囲は、前述の説明によるものよりむしろ、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味および均等物の範囲内に入るあらゆる変更は、そこに包含されることが意図される。

【図1a】

【図1b】

【図1c】

【図1d】

【図1e】

【図1f】

【図1g】

【図2a】

【図2b1】

【図2b2】

【図2c】

【図2d】

【図2e】

【図2f】

【図2g】

【図2h】

【図2i】

【図3a】

【図3b1】

【図3b2】

【図3c】

【図3d】

【図3e】

【図3f】

【図3g】

【図4a】

【図4b】

【図4c】

【図4d】

【図4e】

【図4f】

【図4g】

【図4h】

【図4i】

【図4j】

【図4k】

【図4l】

【図5a】

【図5b】

【図5c】

【図5d】

【図5e】

【図5f】

【図5g】

【図5h】

【図5i】

【図6a】

【図6b】

【図6c】

【図6d】

【図6e】

【図6f】

【図6g】

【図6h】

【図7a】

【図7b】

【図8a】

【図8b】

【図8c】

【図8d1】

【図8d2】

【図9a】

【図9b】

【図9c】

【図9d】

【図9e】

【図9f】

【図9g】

【図9h】

【図10a】

【図10b】

【図10c】

【図10d】

【図10e】

【図10f】

【図11a】

【図11b】

【図11c】

【図11d】

【図11e】

【図11f】

【図12a】

【図12b】

【図12c】

【図12d】

【図12e】

【国際調査報告】