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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】ナノ粒子を利用した標的物質の増幅または検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20241024BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20241024BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20241024BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z
C12Q1/6806 Z
C12M1/34 Z
C12N15/11 Z ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024526509
(86)(22)【出願日】2022-11-04
(85)【翻訳文提出日】2024-05-02
(86)【国際出願番号】 KR2022017238
(87)【国際公開番号】W WO2023080710
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】10-2021-0151779
(32)【優先日】2021-11-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0159555
(32)【優先日】2021-11-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509329800
【氏名又は名称】ソウル大学校産学協力団
【氏名又は名称原語表記】ＳＥＯＵＬ ＮＡＴＩＯＮＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ Ｒ＆ＤＢ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パーク，ユンヘ
(72)【発明者】
【氏名】ナム，ジュワ ミン
(72)【発明者】
【氏名】キム，スンギ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029AA21
4B029BB20
4B029CC13
4B029FA12
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR66
4B063QR83
4B063QS15
4B063QS24
4B063QS34
4B063QS36
4B063QX01
4B063QX02
(57)【要約】
本出願は、複数の部分的に二本鎖である（ｐａｒｔｉａｌｌｙｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）プローブを含むナノ粒子、およびこれを利用した、標的物質の増幅、検出、定量化、確認（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）および／または視角化（ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ）のための組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法を提供する。
前記ナノ粒子は、（１）（ｉ）標的オリゴヌクレオチドに対する相補的配列を含む標的クローニング部位（ｔａｒｇｅｔ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）および（ｉｉ）標的核酸断片の一部に対する相補的配列を含む標的結合部位（ｔａｒｇｅｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）を含む鋳型鎖、および（２）前記標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含み、鋳型鎖の標的クローニング部位にハイブリダイズする標的－クローニング鎖を含むことができる。
【選択図】図１ａ
前記ナノ粒子は、（１）（ｉ）標的オリゴヌクレオチドに対する相補的配列を含む標的クローニング部位（ｔａｒｇｅｔ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）および（ｉｉ）標的核酸断片の一部に対する相補的配列を含む標的結合部位（ｔａｒｇｅｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ）を含む鋳型鎖、および（２）前記標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含み、鋳型鎖の標的クローニング部位にハイブリダイズする標的－クローニング鎖を含むことができる。
【選択図】図１ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（１）以下を含む鋳型鎖（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｔｒａｎｄ）：（ｉ）標的オリゴヌクレオチドと相補的な標的－クローニング部位（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部と相補的な標的－結合部位；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む標的－クローニング鎖（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）
を含み、
前記鋳型鎖の標的－クローニング部位と前記標的－クローニング鎖が相補的結合して二本鎖を形成し、前記標的－結合部位は一本鎖である、
部分的二本鎖オリゴヌクレオチド（ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）。
【請求項2】
前記鋳型鎖は１０－１００ｎｔ長さである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
複数の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、それぞれの部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは、
（１）以下を含む鋳型鎖（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｔｒａｎｄ）：
（ｉ）標的オリゴヌクレオチドと相補的な標的－クローニング部位（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部と相補的な標的－結合部位；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む標的－クローニング鎖（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）
を含み、
前記鋳型鎖の標的－クローニング部位と前記標的－クローニング鎖が相補的結合して二本鎖を形成し、前記標的－結合部位は一本鎖であり、
前記鋳型鎖の一末端が表面に固定化された、ナノ粒子。
【請求項4】
前記ナノ粒子は、金、銀、シリカ、白金、銅、または金、銀、白金、銅などからなる群より選択された２種以上の合金である、請求項３に記載のナノ粒子。
【請求項5】
（ａ）標的オリゴヌクレオチドの一部（第１部分）と相補的な複数の標的－捕捉鎖が表面に固定された基質粒子、および（ｂ）複数の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを含むナノ粒子
を含み、
それぞれの部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは、
（１）（ｉ）標的オリゴヌクレオチドと相補的な標的－クローニング部位、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部（第２部分）と相補的な標的－結合部位を含む鋳型鎖；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む標的－クローニング鎖
を含み、
前記鋳型鎖の標的－クローニング部位と前記標的－クローニング鎖が相補的結合して二本鎖を形成し、前記標的－結合部位は一本鎖であり、
前記鋳型鎖の一末端が前記ナノ粒子の表面に固定化されたものであり、
前記標的オリゴヌクレオチドの第１部分と第２部分は重複しないものである、
標的物質の増幅、検出、定量化、または可視化用組成物。
【請求項6】
前記基質粒子およびナノ粒子は、互いに異なる標的オリゴヌクレオチドに対する２種以上のものであり、２種以上の標的物質の増幅、検出、定量化、または可視化に使用するためのものである、請求項５に記載の組成物。
【請求項7】
以下の段階を含む、標的物質の増幅、検出、定量化、または可視化方法：（Ａ）標的オリゴヌクレオチドまたは試料を表面に複数の標的－捕捉鎖を含む基質粒子に添加して、前記標的オリゴヌクレオチドの一部（第１部分）と前記標的－捕捉鎖をハイブリダイズさせる段階；
（Ｂ）前記段階（Ａ）で得られた混合物に複数のナノ粒子を添加して基質粒子とナノ粒子間の複合体を形成する段階であって、それぞれのナノ粒子は、表面に複数の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、それぞれの部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは以下を含み：
（１）（ｉ）標的オリゴヌクレオチドと相補的な標的－クローニング部位、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部（第２部分）と相補的な標的－結合部位を含む鋳型鎖；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む標的－クローニング鎖、
前記鋳型鎖の標的－クローニング部位と前記標的－クローニング鎖が相補的結合して二本鎖を形成し、前記標的－結合部位は一本鎖であり、
前記基質粒子表面に標的－捕捉鎖と部分的にハイブリダイズされた標的オリゴヌクレオチドの他の部分（第２部分）と前記標的－結合部位とのハイブリダイゼーションにより基質粒子とナノ粒子間の複合体が形成される；および
（Ｃ）前記部分的二本鎖オリゴヌクレオチドの脱ハイブリダイゼーション（ｄｅｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）、前記複合体の解離（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）、またはこれら両方を行って、標的オリゴヌクレオチドと同一の核酸配列を有する標的－クローニング鎖を放出する段階。
【請求項8】
前記段階（Ｃ）で放出された標的－クローニング鎖を前記段階（Ａ）の標的オリゴヌクレオチドとして使用して、段階（Ａ）～（Ｃ）を２回以上繰り返すことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記基質粒子およびナノ粒子は、互いに異なる標的オリゴヌクレオチドに対する２種以上のものあり、２種以上の標的物質の増幅、検出、定量化、または可視化することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
ポリメラーゼを使用しないことを特徴とする、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
請求項５または６に記載の組成物を含む、標的物質の増幅、検出、定量化、または可視化用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互引用
本出願は、２０２１年１１月５日付大韓民国特許出願第１０－２０２１－０１５１７７９号および２０２１年１１月１８日付大韓民国特許出願第１０－２０２１－０１５９５５５号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
本出願は、２０２１年１１月５日付大韓民国特許出願第１０－２０２１－０１５１７７９号および２０２１年１１月１８日付大韓民国特許出願第１０－２０２１－０１５９５５５号に基づいた優先権の利益を主張し、当該韓国特許出願の文献に開示された全ての内容は本明細書の一部として含まれる。
【0002】
本出願は、複数の部分的に二本鎖である（ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ）であるプローブを含むナノ粒子、およびこれを利用した、標的物質の増幅、検出、定量化、確認（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）および／または視角化（ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ）のための組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法を提供する。
【背景技術】
【0003】
現場感知（Ｏｎｓｉｔｅ ｓｅｎｓｉｎｇ）および診断方法は、特別な装備なしにまたは最小限の装備で急性疾患、感染、または生物学的および化学的兵器（ｗａｒｆａｒｅ ａｇｅｎｔ）の原因（ｓｏｕｒｃｅｓ）を識別することができる、迅速で、安価で、直接的な手段を提供するという点から利点を有し、特にポータブルプラットフォーム（ｐｏｒｔａｂｌｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上で有用である。このような方法のうち、比色法（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ）は、専門知識や装備なしでも標的を肉眼で探知することができるため、強力かつ広範囲に適用することができる方法である。しかし、大部分の場合、ナノ粒子に基づく比色分析法（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｂａｓｅｄ ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙｓ）は、ナノ物質の光学特性のみに依存し、これは感度、信頼性および定量化能力を制限する要因になる。したがって、比色分析は、一般に実際使用範囲が狭く、信頼度が低く、高い敏感度を要求する分析に適用するには適切でないとの問題点がある。一般に、超高感度検出方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または高度に精巧な増幅、感知およびイメージング技術を基づく。
【0004】
したがって、より簡便ながらも感度に優れた生物学的検出技術の開発が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
感度に優れ、迅速で、安価で、簡便な標的物質の検出手段を提供するために、本出願は、多数の部分的二本鎖プローブを有するナノ粒子およびこれを利用した標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法を提供する。
【0006】
より具体的に、一例は、以下を含む部分的二本鎖オリゴヌクレオチド（ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を提供する：
（１）（ｉ）標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な標的－クローニング部位（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部とハイブリダイズ可能なまたは相補的な標的－結合部位
を含む第１鎖（鋳型鎖）；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む第２鎖（標的－クローニング鎖または標的－増幅鎖）。
（１）（ｉ）標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な標的－クローニング部位（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部とハイブリダイズ可能なまたは相補的な標的－結合部位
を含む第１鎖（鋳型鎖）；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む第２鎖（標的－クローニング鎖または標的－増幅鎖）。
【0007】
他の例は、表面に前記部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを２個以上含むナノ粒子を提供する。
【0008】
他の例は、（ａ）表面に標的オリゴヌクレオチドと部分的にハイブリダイズする標的－捕捉鎖を含む基質粒子、および／または（ｂ）前記ナノ粒子を含む標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための組成物、アレイ、キット、および／または装置を提供する。
【0009】
他の例は、（ａ）表面に標的オリゴヌクレオチドと部分的にハイブリダイズする標的－捕捉鎖を含む基質粒子、および／または（ｂ）前記ナノ粒子を利用した、標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化方法を提供する。
【0010】
他の例は、（ａ）表面に標的オリゴヌクレオチドと部分的にハイブリダイズする標的－捕捉鎖を含む基質粒子、および／または（ｂ）前記ナノ粒子の、標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための用途を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本明細書では、特定構造のナノ粒子およびこれを使用する「ナノ粒子連鎖反応（Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＮＣＲ）」技術が提供される。前記ＮＣＲ技術は、核酸分子増幅方法の一つであり、ポリメラーゼを代替して特定構造を有するナノ粒子を使用する酵素フリー（ｅｎｚｙｍｅ－ｆｒｅｅ）技術であるという点から既存のＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）とは差別化され、既存技術より簡単ながらも増幅効率が顕著に高いため、核酸分子および核酸分子を通じて増幅可能な多様な標的物質の検出に非常に有用に使用され得る。
【0012】
以下、本出願をより詳しく説明する：
【0013】
用語の定義
本明細書で、用語「標的物質（ｔａｒｇｅｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、本明細書で提供される増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法で最終的に増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化しようとする物質を意味するものであり、生物学的活性を有する全ての物質中で選択されたものであり得る。一例で、前記標的物質は、増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化しようとする有機体（各種真核細胞または原核細胞；例えば、ウイルス、バクテリア、真菌類など）または生物学的活性物質、例えば、核酸分子（例、全ゲノム遺伝体（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、遺伝体断片、遺伝子、遺伝子断片、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、バイオマーカ（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）、その他ＤＮＡまたはＲＮＡ断片など）、蛋白質、ペプチド、高分子、小分子化学物質（例、各種金属イオン、有機化合物などからなる群より選択された１種以上を含む化学薬物など）などからなる群より選択された１種以上であり得るが、これに制限されるのではない。一例で、前記核酸分子、蛋白質、ペプチドなどの生体活性物質は、前記の有機体（例えば、ウイルス、バクテリア、真菌など）に由来するものであり得るが、これに制限されるのではなく、組換え的または化学的に合成されたものであってもよい。
本明細書で、用語「標的物質（ｔａｒｇｅｔ ｍａｔｅｒｉａｌ）」は、本明細書で提供される増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法で最終的に増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化しようとする物質を意味するものであり、生物学的活性を有する全ての物質中で選択されたものであり得る。一例で、前記標的物質は、増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化しようとする有機体（各種真核細胞または原核細胞；例えば、ウイルス、バクテリア、真菌類など）または生物学的活性物質、例えば、核酸分子（例、全ゲノム遺伝体（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、遺伝体断片、遺伝子、遺伝子断片、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、バイオマーカ（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）、その他ＤＮＡまたはＲＮＡ断片など）、蛋白質、ペプチド、高分子、小分子化学物質（例、各種金属イオン、有機化合物などからなる群より選択された１種以上を含む化学薬物など）などからなる群より選択された１種以上であり得るが、これに制限されるのではない。一例で、前記核酸分子、蛋白質、ペプチドなどの生体活性物質は、前記の有機体（例えば、ウイルス、バクテリア、真菌など）に由来するものであり得るが、これに制限されるのではなく、組換え的または化学的に合成されたものであってもよい。
【0014】
本明細書で、用語「試料」は、標的物質の存在有無および／またはレベルを測定しようとする全ての生物学的および／または環境試料を意味するものであり得る。例えば、生物学的試料は、対象（患者）から分離された細胞、組織、血液、リンパ、唾液、痰、鼻水、尿、便、その他体液などからなる群より選択され得るが、これに制限されない。前記対象は、ヒト、家畜（例：ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど）、鳥類（ニワトリ、カモ、ガチョウ、シチメンチョウ、ダチョウ、ウズラなど）などが挙げられるが、これに制限されるのではない。
【0015】
本明細書で、用語「標的オリゴヌクレオチド（ｔａｒｇｅｔ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は、本明細書で提供される連鎖反応により直接的に増幅されるオリゴヌクレオチドを意味するものであり、「標的鎖（ｔａｒｇｅｔ ｓｔｒａｎｄ）」とも称され、二つの用語は同等な意味で互換可能である。一例で、用語の標的オリゴヌクレオチドは、
－前記標的物質が核酸分子である場合、その全部（前記核酸分子がＤＮＡ断片および／またはＲＮＡ断片である場合）またはその一部（増幅対象配列；例えば、前記核酸分子に固有の部分）であり、
－前記標的物質が蛋白質、ペプチド、高分子、または小分子化学物質である場合、後述する標的－クローニング鎖と同一のものと理解され得る。
－前記標的物質が核酸分子である場合、その全部（前記核酸分子がＤＮＡ断片および／またはＲＮＡ断片である場合）またはその一部（増幅対象配列；例えば、前記核酸分子に固有の部分）であり、
－前記標的物質が蛋白質、ペプチド、高分子、または小分子化学物質である場合、後述する標的－クローニング鎖と同一のものと理解され得る。
【0016】
本明細書で、用語「鋳型鎖（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｔｒａｎｄ）」は、本明細書で提供されるＮＣＲ技術で標的オリゴヌクレオチド増幅のためにテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用される一本鎖オリゴヌクレオチドを意味し、標的オリゴヌクレオチドの全ゲノム配列と相補的な核酸配列を有する標的－クローニング部位と前記標的オリゴヌクレオチドの一部と相補的な核酸配列を有する標的－結合部位を含むものであり得る。前記鋳型鎖は、１０－１０００ｎｔ、１０－５００ｎｔ、１０－２００ｎｔ、１０－１００ｎｔ、１０－９０ｎｔ、１０－８０ｎｔ、１０－７０ｎｔ、１０－６０ｎｔ、１０－５５ｎｔ、１０－５０ｎｔ、または１０－４５ｎｔ長さのオリゴヌクレオチドであり得るが、これに制限されるのではない。
【0017】
本明細書で、用語「標的－クローニング鎖（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）」は、標的オリゴヌクレオチドと同一の核酸配列または標的の一部の増幅対象配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味し、鋳型鎖の標的－クローニング部位とハイブリダイズ（相補的結合）が可能である。
【0018】
本明細書で、用語「標的－捕捉鎖（ｔａｒｇｅｔ－ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）」は、標的オリゴヌクレオチドを基質粒子に捕捉するように機能するものであり、標的オリゴヌクレオチドの前記鋳型鎖の標的－結合部位と相補的な部分とは異なる部分と相補的な核酸配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。
【0019】
本明細書で、核酸分子または蛋白質が「特定の核酸配列またはアミノ酸配列を有する」とは、前記配列を含むか、または本質的に前記配列からなることを意味し得る。
【0020】
部分的二本鎖オリゴヌクレオチド（ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）
一例は、以下を含む部分的二本鎖オリゴヌクレオチド（ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を提供する：
（１）以下を含む第１鎖（長い（拡張された）鎖；以下、鋳型鎖（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｔｒａｎｄ）とも称する）：
（ｉ）標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な（相補的な）標的－クローニング部位（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部とハイブリダイズ可能なまたは相補的な標的－結合部位、この時、前記標的－クローニング部位および標的－結合部位は互いに連結される（例えば、標的－クローニング部位の３’－末端と標的－結合部位の５’－末端が結合されるか、または標的－クローニング部位の５’－末端と標的－結合部位の３’－末端が連結され得る）；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む（つまり、前記第１鎖の標的－クローニング部位と相補的な（ハイブリダイズ可能な）配列を含む）第２鎖（短い鎖（第１鎖より短い）；以下、標的－クローニング鎖（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）または標的－増幅鎖（ｔａｒｇｅｔ ａｍｐｌｉｆｉｅｒ ｓｔｒａｎｄ）とも称し、二つの用語は同等な意味で互換可能である）、
この時、前記標的－クローニング鎖は、前記鋳型鎖の標的－クローニング部位とハイブリダイズ（相補的結合）して二本鎖構造（つまり、部分的二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖の部分（部位））を形成し、前記鋳型鎖の標的－結合部位は一本鎖の形態で露出される。
一例は、以下を含む部分的二本鎖オリゴヌクレオチド（ｐａｒｔｉａｌｌｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を提供する：
（１）以下を含む第１鎖（長い（拡張された）鎖；以下、鋳型鎖（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｔｒａｎｄ）とも称する）：
（ｉ）標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な（相補的な）標的－クローニング部位（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部とハイブリダイズ可能なまたは相補的な標的－結合部位、この時、前記標的－クローニング部位および標的－結合部位は互いに連結される（例えば、標的－クローニング部位の３’－末端と標的－結合部位の５’－末端が結合されるか、または標的－クローニング部位の５’－末端と標的－結合部位の３’－末端が連結され得る）；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む（つまり、前記第１鎖の標的－クローニング部位と相補的な（ハイブリダイズ可能な）配列を含む）第２鎖（短い鎖（第１鎖より短い）；以下、標的－クローニング鎖（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）または標的－増幅鎖（ｔａｒｇｅｔ ａｍｐｌｉｆｉｅｒ ｓｔｒａｎｄ）とも称し、二つの用語は同等な意味で互換可能である）、
この時、前記標的－クローニング鎖は、前記鋳型鎖の標的－クローニング部位とハイブリダイズ（相補的結合）して二本鎖構造（つまり、部分的二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖の部分（部位））を形成し、前記鋳型鎖の標的－結合部位は一本鎖の形態で露出される。
【0021】
前記鋳型鎖は、１０－１０００ｎｔ、１０－５００ｎｔ、１０－２００ｎｔ、１０－１００ｎｔ、１０－９０ｎｔ、１０－８０ｎｔ、１０－７０ｎｔ、１０－６０ｎｔ、１０－５５ｎｔ、１０－５０ｎｔ、または１０－４５ｎｔ長さのオリゴヌクレオチドであり得るが、これに制限されるのではない。標的－クローニング鎖は、前記第１鎖の標的－クローニング部位とハイブリダイズし、標的－結合部位を露出させる長さのオリゴヌクレオチドであり得、例えば、標的オリゴヌクレオチドと同一であり得る。
【0022】
ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ＮＣＲプローブ）
他の例は、一つ以上（例えば、２個以上または複数）の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを表面に含むナノ粒子を提供する。前記部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは、前述のとおりである。例えば、前記部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは、鋳型鎖の一末端（例えば、鋳型鎖内の標的－クローニング部位の両末端のうち、標的－結合部位と連結された末端とは異なる末端）で、直接またはリンカー（第１リンカー）を通じて、ナノ粒子表面に固定（付着）されたものであり得る。
他の例は、一つ以上（例えば、２個以上または複数）の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを表面に含むナノ粒子を提供する。前記部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは、前述のとおりである。例えば、前記部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは、鋳型鎖の一末端（例えば、鋳型鎖内の標的－クローニング部位の両末端のうち、標的－結合部位と連結された末端とは異なる末端）で、直接またはリンカー（第１リンカー）を通じて、ナノ粒子表面に固定（付着）されたものであり得る。
【0023】
言い換えると、前記ナノ粒子は、その表面に、
（１）以下を含む鋳型鎖：（ｉ）前記表面に直接またはリンカー（第１リンカー）を通じて固定された標的－クローニング部位、および（ｉｉ）前記標的－クローニング部位の一末端（例えば、ナノ粒子表面に固定された末端とは異なる末端）と連結された標的－結合部位；および
（２）前記鋳型鎖の標的－クローニング部位とハイブリダイズ可能な（相補的な）標的－クローニング鎖
を含むことができる。この時、前記鋳型鎖（第１鎖）の標的－クローニング部位と標的－クローニング鎖（第２鎖）がハイブリダイズして部分的に二本鎖の構造を有する部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを形成し、鋳型鎖の標的－結合部位は露出された形態であり得る。
（１）以下を含む鋳型鎖：（ｉ）前記表面に直接またはリンカー（第１リンカー）を通じて固定された標的－クローニング部位、および（ｉｉ）前記標的－クローニング部位の一末端（例えば、ナノ粒子表面に固定された末端とは異なる末端）と連結された標的－結合部位；および
（２）前記鋳型鎖の標的－クローニング部位とハイブリダイズ可能な（相補的な）標的－クローニング鎖
を含むことができる。この時、前記鋳型鎖（第１鎖）の標的－クローニング部位と標的－クローニング鎖（第２鎖）がハイブリダイズして部分的に二本鎖の構造を有する部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを形成し、鋳型鎖の標的－結合部位は露出された形態であり得る。
【0024】
前記ナノ粒子１個当たり表面に固定（付着）された部分的二本鎖オリゴヌクレオチドの個数は、１個以上、２個以上、１０個以上、２０個以上、５０個以上、７０個以上、１００個以上、１２０個以上、１５０個以上、または１７０個以上（上限値に特別な制限はなく、ナノ粒子表面に付着可能なオリゴヌクレオチドの最大個数であり得（ナノ粒子の表面積を基準として適切に決定され得る）、例えば、１０，０００個、５，０００個、２，５００個、１，０００個、７５０個，５００個、２５０個、または２００個であり得るが、これに制限されるのではない）であり得るが、これに制限されるのではない。
【0025】
一例で、前記ナノ粒子は、可視化可能（例えば、肉眼検出可能（ｎａｋｅｄ－ｅｙｅ－ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ））および／または生分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅ；例えば、核酸分子、抗体など）接合可能な材質からなるものであり得、例えば、金（例えば、金ナノ粒子）、銀（例えば、銀ナノ粒子）、白金、銅、合金（例えば、金、銀、白金、銅などからなる群より選択された２種以上を含む）などのような金属、シリカ、ヒドロゲル、カーボンナノチューブ、量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）など材質のものであり得るが、これに制限されるのではない。他の例で、前記ナノ粒子は、表面に結合されたオリゴヌクレオチドに含まれている蛍光標識により可視化され得る。前記ナノ粒子のサイズ（平均直径）は、１～１０００ｎｍ、１～５００ｎｍ、１～２００ｎｍ、１～１００ｎｍ、１０～１０００ｎｍ、１０～５００ｎｍ、１０～２００ｎｍ、または１０～１００ｎｍであり得るが、これに制限されるのではない。前記ナノ粒子は、その構造および／または形態に特別な制限がなく、例えば、ソリッド構造、コア－シェル構造、ハロー構造（ｈｏｌｌｏｗ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）などを有するか、および／または円形、楕円形、チューブ状、多角形構造などを有することができるが、これに制限されるのではない。場合によっては、ナノ粒子の種類により生分子結合、増幅および／または可視性レベルを調節することができる。
【0026】
一例で、前記ナノ粒子は、標的オリゴヌクレオチドを検出または増幅するためのプローブ（ＮＣＲプローブ）として使用され得る。
【0027】
前述したような、部分的二本鎖オリゴヌクレオチドまたはこれを表面に付着したナノ粒子は、標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な（相補的配列を有する）部位（標的－結合部位）および前記標的－オリゴヌクレオチドと同一の核酸配列を有する標的－クローニング鎖を含むため、前記標的オリゴヌクレオチドまたは標的物質の検出および／または増幅に有利に使用され得る。
【0028】
一具体例で、標的物質が核酸分子以外の物質である場合、前記ナノ粒子は、前述の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドに加えて、前記標的物質の結合物質をさらに含むことができる。前記標的物質の結合物質は、標的物質が一部と結合（例えば特異的結合）可能な抗体、アプタマー、小分子化学物質などからなる群より選択された一つ以上であり得る。
【0029】
基質粒子（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）
本明細書で、用語「基質粒子（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」は、標的物質の捕捉物質（例えば、オリゴヌクレオチド、抗体、ペプチド、高分子化合物など）を固定させることができる表面を有する全ての形態の粒子を意味する。
本明細書で、用語「基質粒子（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」は、標的物質の捕捉物質（例えば、オリゴヌクレオチド、抗体、ペプチド、高分子化合物など）を固定させることができる表面を有する全ての形態の粒子を意味する。
【0030】
一例で、標的オリゴヌクレオチドの一部とハイブリダイズ可能なまたは相補的配列を有する一つ以上（例えば、２個以上または複数）の標的－捕捉鎖（ｔａｒｇｅｔ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ；または標的－捕捉オリゴヌクレオチド（ｔａｒｇｅｔ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ））が表面に固定（付着、接着）された基質粒子が提供される。前記標的－捕捉鎖は、基質粒子表面に直接またはリンカー（第２リンカー）を通じて固定（付着）されたものであり得る。
【0031】
後述するように、前記基質粒子に、前記ナノ粒子に含まれている標的－クローニング鎖の個数をＮＣＲサイクル回数だけ掛けた個数だけのナノ粒子が結合されるため、前記基質粒子１個当たり表面に固定（付着）された標的－捕捉鎖の個数は前記ナノ粒子の個数をカバーできるほど十分に多くならなければならない。例えば、前記基質粒子１個当たり含まれている標的－捕捉鎖の個数は、１０個以上、５０個以上、１０２個以上、１０３個以上、１０５個以上、１０６個以上、１０７個以上、または１０８個以上（上限値に特別な制限はなく、基質粒子表面に付着可能なオリゴヌクレオチドの最大個数であり得（基質粒子表面積を基準として適切に決定され得る）、例えば、１０１２個、１０１１個、１０１０個または１０９個であり得るが、これに制限されるのではない）であり得るが、これに制限されるのではない。
【0032】
前記基質粒子は固形材質からなるものであり得、前記ナノ粒子と形成する複合体の収集／精製などを容易にするために、磁性粒子、ビード（例、磁性ビードなどからなる群より選択された１種以上であり得るが、これに制限されるのではない。一例で、前記基質粒子は、金（例えば、金ナノ粒子）、銀（例えば、銀ナノ粒子）、白金、銅、合金（例えば、金、銀、白金、銅などからなる群より選択された２種以上含む）などのような金属、シリカ、ヒドロゲル、カーボンナノチューブ、量子ドット（Ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ）など材質のものであり得るが、これに制限されるのではない。また、前記基質粒子のサイズ（平均直径）は、前記ナノ粒子より十分に大きくならなければならず、ナノ粒子のサイズ （平均直径）の２倍以上、５倍以上、１０倍以上、２０倍以上、３０倍以上、４０倍以上、または５０倍以上であり得、例えば、０．１～１００μｍ、０．１～５０μｍ、０．１～２０μｍ、０．１～１０μｍ、０．１～８μｍ、０．１～５μｍ、０．１～３μｍ、０．５～１００μｍ、０．５～５０μｍ、０．５～２０μｍ、０．５～１０μｍ、０．５～８μｍ、０．５～５μｍ、０．５～３μｍ、１～１００μｍ、１～５０μｍ、１～２０μｍ、１～１０μｍ、１～８μｍ、１～５μｍ、または１～３μｍであり得るが、これに制限されるのではない。前記基質粒子は、その構造および／または形態に特別な制限がなく、例えば、ソリッド構造、コア－シェル構造、ハロー構造（ｈｏｌｌｏｗ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）などを有するか、および／または円形、楕円形、チューブ状、多角形構造などを有することができるが、これに制限されるのではない。
【0033】
一具体例で、標的物質が核酸分子以外の物質である場合、前記基質粒子は、前述の標的－捕捉鎖に加えて、前記標的物質の捕捉物質をさらに含むことができる。前記標的物質の捕捉物質は、標的物質が一部と結合（例えば特異的結合）可能な抗体、アプタマー、小分子化学物質などからなる群より選択された一つ以上であり得る。この時、基質粒子に含まれる標的物質の捕捉物質とナノ粒子に含まれる標的物質の結合物質は、標的物質の互いに異なる部位に結合するものであり得る。つまり、標的物質で、前記捕捉物質と結合物質の結合する部位は互いに重複しないものであり得る。
【0034】
本出願で、前記鋳型鎖（標的－クローニング部位）をナノ粒子表面に固定（付着）させるに使用可能なリンカー（第１リンカー）および前記標的－捕捉鎖を基質粒子に固定（付着）させるに使用可能なリンカー（第２リンカー）は、オリゴヌクレオチドを固形の粒子表面に付着させることができる全ての物質の中から適切に選択され得、例えば、化学的官能基（例えば、チオール基（ＳＨ）、アミン基（ＮＨ２など）、結合蛋白質類（例、ビオチンなど）などからなる群より選択された１種以上であり得るが、これに制限されるのではなく、付着粒子の表面材質などにより適切に選択され得る。前記リンカーは、前記鋳型鎖と標的－捕捉鎖がそれぞれナノ粒子および基質粒子表面に結合する末端（例えば、鋳型鎖の場合は３’末端、標的－捕捉鎖の場合は５’末端）に結合されているか、および／またはナノ粒子および／または基質粒子表面に結合されていてもよい。また、前記鋳型鎖および／または標的－捕捉鎖は、ナノ粒子および／または基質粒子表面からの所定の間隔の維持のためにそれぞれナノ粒子および基質粒子表面に結合する末端（例えば、鋳型鎖の場合は３’末端、標的－捕捉鎖の場合は５’末端）にスペーサ（ｓｐａｃｅｒ）をさらに含むことができる（前記鎖がリンカーを含む場合、前記スペーサは鋳型鎖と第１リンカーとの間（第１スペーサ）、および／または標的－捕捉鎖と第２リンカーとの間（第２スペーサ）に含まれ得る）。前記スペーサは所定の間隔を付与することができる長さ／体積を有する全ての物質の中から適切に選択され得、例えば、オリゴヌクレオチド（例えば、Ｐｏｌｙ Ａ（例えば、Ａ２～２０）など）、高分子（例、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）、炭素数１－６のアルキルなどからなる群より選択された一つ以上であり得るが、これに制限されるのではない。一例で、前記スペーサは、ｐｏｌｙ Ａ、ＰＥＧ、またはこれらの組み合わせ（第１スペーサ）、またはｐｏｌｙ Ａ、炭素数１－６のアルキル、またはこれらの組み合わせ（第２スペーサ）であり得るが、これに制限されるのではない。
【0035】
標的物質（核酸分子）の検出および／または増幅
他の例は、前述のような一つ以上の基質粒子および一つ以上のナノ粒子を含む標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための組成物（または用途）、アレイ、キット、および／または装置を提供する。前記組成物、アレイ、キット、および／または装置は、前記基質粒子および／またはナノ粒子を適切な媒質（例えば、液体媒質）内に分散および／または懸濁させた形態で含むものであり得る。
他の例は、前述のような一つ以上の基質粒子および一つ以上のナノ粒子を含む標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための組成物（または用途）、アレイ、キット、および／または装置を提供する。前記組成物、アレイ、キット、および／または装置は、前記基質粒子および／またはナノ粒子を適切な媒質（例えば、液体媒質）内に分散および／または懸濁させた形態で含むものであり得る。
【0036】
具体的に、前記組成物、アレイ、キット、および／または装置は、以下を含むことができる：
（ａ）標的オリゴヌクレオチドの一部とハイブリダイズ可能なまたは相補的な配列を有する一つ以上（例えば、２個以上または複数）の標的－捕捉鎖（ｔａｒｇｅｔ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ；または標的－捕捉オリゴヌクレオチド（ｔａｒｇｅｔ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ））が表面に固定（付着、接着）された一つ以上（例えば、２個以上または複数）の基質粒子、および
（ｂ）一つ以上（例えば、２個以上または複数）のナノ粒子、この時、それぞれのナノ粒子は、表面に一つ以上（例えば、２個以上または複数）の部分的二本鎖オリゴヌクレオチド。この時、前記ナノ粒子および部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは前述のとおりである。
（ａ）標的オリゴヌクレオチドの一部とハイブリダイズ可能なまたは相補的な配列を有する一つ以上（例えば、２個以上または複数）の標的－捕捉鎖（ｔａｒｇｅｔ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ；または標的－捕捉オリゴヌクレオチド（ｔａｒｇｅｔ ｃａｐｔｕｒｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ））が表面に固定（付着、接着）された一つ以上（例えば、２個以上または複数）の基質粒子、および
（ｂ）一つ以上（例えば、２個以上または複数）のナノ粒子、この時、それぞれのナノ粒子は、表面に一つ以上（例えば、２個以上または複数）の部分的二本鎖オリゴヌクレオチド。この時、前記ナノ粒子および部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは前述のとおりである。
【0037】
一具体例で、前記標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための組成物、アレイ、キット、および／または装置は以下を含むことができる：
（ａ）標的オリゴヌクレオチドの一部（第１部分）とハイブリダイズ可能なまたは相補的な配列を有する一つ以上（例えば、２個以上または複数）の標的－捕捉鎖が表面に固定（付着、接着）された基質粒子、および
（ｂ）一つ以上（例えば、２個以上または複数）のナノ粒子、この時、それぞれのナノ粒子は、表面に一つ以上（例えば、２個以上または複数）の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、それぞれの部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは以下を含む：
（１）以下を含む第１鎖（鋳型鎖）：
（ｉ）標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な（相補的な）標的－クローニング部位（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部（第２部分）とハイブリダイズ可能なまたは相補的な標的－結合部位、この時、前記標的－クローニング部位および標的－結合部位は互いに連結される（例えば、標的－クローニング部位の３’－末端と標的－結合部位の５’－末端が結合されるか、または標的－クローニング部位の５’－末端と標的－結合部位の３’－末端が連結され得る）；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む（つまり、前記鋳型鎖の標的－クローニング部位と相補的な（ハイブリダイズ可能な）配列を含む）第２鎖（標的－クローニング鎖）、
この時、前記標的－クローニング鎖は、前記鋳型鎖の標的－クローニング部位とハイブリダイズして二本鎖構造（つまり、部分的二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖の部分（部位））を形成し、前記鋳型鎖の標的－結合部位は一本鎖の形態で露出される。
（ａ）標的オリゴヌクレオチドの一部（第１部分）とハイブリダイズ可能なまたは相補的な配列を有する一つ以上（例えば、２個以上または複数）の標的－捕捉鎖が表面に固定（付着、接着）された基質粒子、および
（ｂ）一つ以上（例えば、２個以上または複数）のナノ粒子、この時、それぞれのナノ粒子は、表面に一つ以上（例えば、２個以上または複数）の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、それぞれの部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは以下を含む：
（１）以下を含む第１鎖（鋳型鎖）：
（ｉ）標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な（相補的な）標的－クローニング部位（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部（第２部分）とハイブリダイズ可能なまたは相補的な標的－結合部位、この時、前記標的－クローニング部位および標的－結合部位は互いに連結される（例えば、標的－クローニング部位の３’－末端と標的－結合部位の５’－末端が結合されるか、または標的－クローニング部位の５’－末端と標的－結合部位の３’－末端が連結され得る）；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む（つまり、前記鋳型鎖の標的－クローニング部位と相補的な（ハイブリダイズ可能な）配列を含む）第２鎖（標的－クローニング鎖）、
この時、前記標的－クローニング鎖は、前記鋳型鎖の標的－クローニング部位とハイブリダイズして二本鎖構造（つまり、部分的二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖の部分（部位））を形成し、前記鋳型鎖の標的－結合部位は一本鎖の形態で露出される。
【0038】
前記標的－捕捉鎖は、標的オリゴヌクレオチドの一部（第１部分）とハイブリダイズ可能な部位を必須で含み、その一末端（例えば５’末端または３’末端）が直接またはリンカー（第２リンカー）を通じて基質粒子表面に固定（付着）されたものであり得る。
【0039】
前記標的オリゴヌクレオチドにおいて、前記基質粒子上の標的－捕捉鎖がハイブリダイズされる部分（第１部分）と、前記ナノ粒子上の第１鎖の標的－結合部位がハイブリダイズされる部分（第２部分）とは、互いに重複しないように設計されたものであり得る。例えば、標的－捕捉鎖が標的オリゴヌクレオチドの５’末端側の一部（第１部分）とハイブリダイズされる場合、標的－結合部位は前記標的オリゴヌクレオチドの３’末端側の一部（第２部分）とハイブリダイズされるものであり得、他の例で、標的－捕捉鎖が標的オリゴヌクレオチドの３’末端側の一部（第１部分）とハイブリダイズされる場合、標的－結合部位は前記標的オリゴヌクレオチドの５’末端側の一部（第２部分）とハイブリダイズされるものであり得る。
【0040】
本出願で提供される組成物、アレイ、キット、および／または装置において、標的オリゴヌクレオチド（一本鎖）またはこれを含む試料が前記基質粒子と接触すると、前記標的オリゴヌクレオチドの一部（第１部分）が基質粒子上の一つ以上の標的－捕捉鎖とハイブリダイズされて、前記標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイズされずに一本鎖の状態で露出された第２部分を一つ以上生成する。このように露出された一つ以上の第２部分は前記ナノ粒子上の鋳型鎖内の標的－結合部位と結合することによって、一つ以上のナノ粒子が基質粒子に結合して基質粒子－ナノ粒子のサンドイッチ複合体を形成する。その後、脱ハイブリダイゼーション処理を通じて、前記それぞれのナノ粒子に標的－クローニング鎖が鋳型鎖の標的－クローニング部位と脱ハイブリダイズされて放出される。このように放出された標的－クローニング鎖は前記標的オリゴヌクレオチドと同一の核酸配列を有するため、再び基質粒子上の標的－捕捉鎖と第１部分でハイブリダイズされて次のサイクルを繰り返すことができる。このような過程により、サイクルが繰り返されるにつれ、基質粒子表面に結合されたナノ粒子の個数が幾何級数的に増加して蓄積（濃縮）される。理論的には、一つの基質粒子を基準として、ナノ粒子に含まれている標的－クローニング鎖の個数をサイクル回数だけ掛けた数のナノ粒子が基質粒子に結合して蓄積（濃縮）される［（ナノ粒子当たりの標的－クローニング鎖の個数）ｎ、ｎはサイクル回数］。これは標的オリゴヌクレオチドの増幅および／またはナノ粒子の検出可能なレベル、例えば肉眼で検出可能なレベルの濃縮効果を示す（つまり、蓄積（濃縮）されたナノ粒子による溶液の色変化などを通じて標的オリゴヌクレオチドの存在有無および／または濃度の検出が容易である）。
【0041】
他の例は、前記基質粒子およびナノ粒子を利用した標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化方法を提供する。前記方法は以下を含むことができる：
（Ａ）標的オリゴヌクレオチドまたは試料を表面に複数の標的－捕捉鎖を含む基質粒子に添加（または適用または接触）して、標的オリゴヌクレオチドの一部（第１部分）と標的－捕捉鎖をハイブリダイズさせる段階；
（Ｂ）前記段階（Ａ）で得られた混合物に複数のナノ粒子を添加（または適用または接触）して基質粒子とナノ粒子間の複合体を形成する段階であって、前記ナノ粒子は、それぞれ表面に複数の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、それぞれの部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは以下を含み：
（１）以下を含む第１鎖（鋳型鎖）：
（ｉ）標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な（相補的な）標的－クローニング部位、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部（第２部分）とハイブリダイズ可能なまたは相補的な標的－結合部位；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む第２鎖（標的－クローニング鎖）、
基質粒子表面に標的－捕捉鎖と部分的にハイブリダイズされた標的オリゴヌクレオチドの他の部分（第２部分）と前記標的－結合部位とのハイブリダイゼーションにより基質粒子とナノ粒子間の複合体が形成される；および
（Ｃ）前記部分的二本鎖オリゴヌクレオチドの脱ハイブリダイゼーション（ｄｅｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）および／または前記複合体の解離（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）を行って、標的オリゴヌクレオチドと同一の核酸配列を有する標的－クローニング鎖を放出する段階。
（Ａ）標的オリゴヌクレオチドまたは試料を表面に複数の標的－捕捉鎖を含む基質粒子に添加（または適用または接触）して、標的オリゴヌクレオチドの一部（第１部分）と標的－捕捉鎖をハイブリダイズさせる段階；
（Ｂ）前記段階（Ａ）で得られた混合物に複数のナノ粒子を添加（または適用または接触）して基質粒子とナノ粒子間の複合体を形成する段階であって、前記ナノ粒子は、それぞれ表面に複数の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、それぞれの部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは以下を含み：
（１）以下を含む第１鎖（鋳型鎖）：
（ｉ）標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な（相補的な）標的－クローニング部位、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部（第２部分）とハイブリダイズ可能なまたは相補的な標的－結合部位；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む第２鎖（標的－クローニング鎖）、
基質粒子表面に標的－捕捉鎖と部分的にハイブリダイズされた標的オリゴヌクレオチドの他の部分（第２部分）と前記標的－結合部位とのハイブリダイゼーションにより基質粒子とナノ粒子間の複合体が形成される；および
（Ｃ）前記部分的二本鎖オリゴヌクレオチドの脱ハイブリダイゼーション（ｄｅｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）および／または前記複合体の解離（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）を行って、標的オリゴヌクレオチドと同一の核酸配列を有する標的－クローニング鎖を放出する段階。
【0042】
前記段階（Ａ）において、標的オリゴヌクレオチドまたは試料を表面に複数の標的－捕捉鎖を含む基質粒子に添加すると、前記標的－捕捉鎖は標的オリゴヌクレオチドの一部（第１部分）にハイブリダイズ可能であり、前記標的オリゴヌクレオチド試料内に存在する標的オリゴヌクレオチド（試料内に存在する場合）を捕捉することができる。
【0043】
前記段階（Ｂ）で使用される複数のナノ粒子は、それぞれ表面に複数の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを含み、それぞれの部分的二本鎖オリゴヌクレオチドは以下を含むことができる：
（１）以下を含む第１鎖（鋳型鎖）：
（ｉ）標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な（相補的な）標的－クローニング部位（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部（第２部分）とハイブリダイズ可能なまたは相補的な標的－結合部位、この時、前記標的－クローニング部位および標的－結合部位は互いに連結される（例えば、標的－クローニング部位の３’－末端と標的－結合部位の５’－末端が結合されるか、または標的－クローニング部位の５’－末端と標的－結合部位の３’－末端が連結され得る）；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む（つまり、前記第１鎖の標的－クローニング部位と相補的な（ハイブリダイズ可能な）配列を含む）第２鎖（標的－クローニング鎖）。
（１）以下を含む第１鎖（鋳型鎖）：
（ｉ）標的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズ可能な（相補的な）標的－クローニング部位（ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｉｔｅ）、および
（ｉｉ）標的オリゴヌクレオチドの一部（第２部分）とハイブリダイズ可能なまたは相補的な標的－結合部位、この時、前記標的－クローニング部位および標的－結合部位は互いに連結される（例えば、標的－クローニング部位の３’－末端と標的－結合部位の５’－末端が結合されるか、または標的－クローニング部位の５’－末端と標的－結合部位の３’－末端が連結され得る）；および
（２）標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を含む（つまり、前記第１鎖の標的－クローニング部位と相補的な（ハイブリダイズ可能な）配列を含む）第２鎖（標的－クローニング鎖）。
【0044】
この時、前記標的－クローニング鎖は、前記鋳型鎖の標的－クローニング部位とハイブリダイズして二本鎖構造（つまり、部分的二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖の部分（部位））を形成し、前記鋳型鎖の標的－結合部位は、一本鎖の形態で露出されて、前記基質粒子上の標的－捕捉鎖と（第１部分で）部分的にハイブリダイズされた標的オリゴヌクレオチドの他の一部（第２部分）と標的－結合部位間にハイブリダイズ可能にして、基質粒子とナノ粒子間のサンドイッチ複合体アセンブリー（ｓａｎｄｗｉｃｈ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓｓｅｍｂｌｙ）を形成するようにすることができる。つまり、標的オリゴヌクレオチド内の第１部分はナノ粒子上の鋳型鎖の標的－結合部位と、第２部分（前記第１部分と重複しない）は基質粒子上の標的－捕捉鎖と結合（ハイブリダイズ）される。
【0045】
前記段階（Ｃ）において、前記部分的二本鎖オリゴヌクレオチドの脱ハイブリダイゼーション（ｄｅｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）および／または前記サンドイッチ複合体アセンブリー（ｓａｎｄｗｉｃｈ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｓｓｅｍｂｌｙ）の解離（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ）（例えば、前記脱ハイブリダイゼーションによるものであり得る）は通常の脱ハイブリダイゼーション手段により行われ得る。例えば、前記脱ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション反応と比較して、ｐＨ増加（例えば、塩基条件）、温度増加（例えば、５０～１００℃、５２～１００℃、５５～１００℃、５０～９０℃、５２～９０℃、５５～９０℃などの範囲に増加）、塩（ｓａｌｔ）濃度減少などからなる群より選択された一つ以上により行われ得、一具体例（本出願の実施例）では、塩溶液を蒸溜水に交替し、温度を低めて行ったが、これに制限されるのではない。これにより、標的－捕捉鎖および標的－結合部位とハイブリダイズされた標的オリゴヌクレオチドおよび／または標的－クローニング部位とハイブリダイズされた標的－クローニング鎖（互いに同一の核酸配列を有する）がそれぞれ脱ハイブリダイズされて一本鎖の形態で放出される。また、前記過程で、脱ハイブリダイゼーションによる標的オリゴヌクレオチドと、ナノ粒子上の鋳型鎖の標的－結合部位および基質粒子上の標的－捕捉鎖間の結合（ハイブリダイゼーション）も解離されて、前記標的オリゴヌクレオチドを通じて複合体を形成していたナノ粒子と基質粒子が分離（放出）される。このように放出された標的－クローニング鎖とナノ粒子は以降のサイクルに使用され得る。
【0046】
前記方法において、段階（Ｂ）の後に、前記複合体を分離、収集、および／または濃縮する段階をさらに含むことができ（Ｂ－１）、ここで分離、収集、および／または濃縮された複合体に対して段階（Ｃ）を行うことができる。前記複合体の分離、収集、および／または濃縮は、磁場印加（例えば、磁石使用など；基質粒子が磁性粒子である場合）、および／または遠心分離などの方法で行うことができるが、これに制限されるのではなく、使用された粒子の材質、特性などを考慮して適切に選択された通常の方法で行うことができる。
【0047】
一例で、前記段階（Ａ）～（Ｃ）は、２回以上繰り返すことができる（段階（Ａ）～（Ｃ）が１サイクル）。この時、前記段階（Ｃ）で一本鎖の形態で放出された、標的オリゴヌクレオチドと同一の配列を有する標的－クローニング鎖は、再び段階（Ａ）の標的オリゴヌクレオチドとして使用され、段階（Ｃ）で放出されたナノ粒子は、ＮＣＲプローブとして使用されて次のサイクルが行われ得る。この時、一つの標的オリゴヌクレオチドが一つのナノ粒子に含まれている標的－クローニング鎖の個数だけ増幅されて、次のサイクルでは一つの基質粒子に前記標的－クローニング鎖の個数だけのナノ粒子が結合されて段階が行われる。したがって、一つの標的オリゴヌクレオチドがナノ粒子当たり含まれている標的－クローニング鎖の個数がサイクル回数だけ掛けられた数だけ増幅されるようになる。つまり、サイクル遂行による標的オリゴヌクレオチドの数は、最初個数のｍｎ倍（ｍはナノ粒子当たりの標的－クローニング鎖の個数（実施例で１７４個が例示される）、ｎはサイクル回数）であり得る。通常のＰＣＲの増幅レベルが最初個数の２ｎ倍であるのと比較すると、本明細書で提供するＮＣＲ技術の増幅レベルは顕著に高い。
【0048】
一例で、前記ナノ粒子当たりの標的－クローニング鎖の個数（ｍ）は、２個以上、１０個以上、２０個以上、５０個以上、７０個以上、１００個以上、１２０個以上、１５０個以上、または１７０個以上（上限値に特別な制限はなく、ナノ粒子表面に付着可能なオリゴヌクレオチドの最大個数であり得（ナノ粒子の表面積を基準として適切に決定され得る）、例えば、１０，０００個、５，０００個、２，５００個、１，０００個、７５０個、５００個、２５０個、または２００個であり得るが、これに制限されるのではない）であり得るが、これに制限されるのではない。例えば、ナノ粒子当たりの標的－クローニング鎖の個数（ｍ）は、２～１，０００個、２～５００個、５０～１，０００個、５０～５００個、１００～１，０００個、または１００～５００であり得るが、これに制限されるのではない。一例で、前記サイクル回数（ｎ）は、１～２０回、１～１５回、１～１０回、１～５回、２～２０回、２～１５回、２～１０回、２～５回、３～２０回、３～１５回、３～１０回、または～３～５回であり得るが、これに制限されるのではない。
【0049】
一具体例で、標的物質が核酸分子以外の生体活性物質である場合、前記標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための組成物、アレイ、キット、装置および／または方法において、
前記（ａ）の基質粒子は、前述の標的－捕捉鎖に加えて、前記標的物質の捕捉物質をさらに含み、
前記（ｂ）のナノ粒子は、前述の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドに加えて、前記標的物質の結合物質をさらに含むものであり得る。
前記（ａ）の基質粒子は、前述の標的－捕捉鎖に加えて、前記標的物質の捕捉物質をさらに含み、
前記（ｂ）のナノ粒子は、前述の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドに加えて、前記標的物質の結合物質をさらに含むものであり得る。
【0050】
前記標的物質の結合物質は、標的物質が一部と結合（例えば特異的結合）可能な抗体、アプタマー、小分子化学物質などからなる群より選択された一つ以上であり得る。この時、基質粒子に含まれる標的物質の捕捉物質とナノ粒子に含まれる標的物質の結合物質は、標的物質の互いに異なる部位に結合するものであり得る。つまり、標的物質において、前記捕捉物質と結合物質の結合する部位は互いに重複しないものであり得る。
【0051】
標的物質が核酸分子以外の生体活性物質である場合、前記標的物質または試料を前記標的物質の捕捉物質が固定化された基質粒子と接触させると、前記標的物質の一部が前記捕捉物質と結合し、ここに標的物質の結合物質が含まれているナノ粒子を処理すると、前記結合物質が前記捕捉物質との結合部位とは異なる部位で標的物質と結合することによって基質粒子とナノ粒子の複合体を形成する。このように複合体が形成されると、前記ナノ粒子上の部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを脱ハイブリダイズさせて、標的－クローニング鎖を放出させる。前記放出された標的－クローニング鎖は標的オリゴヌクレオチドと同一の核酸配列を有するため、その一部が前記基質粒子表面の標的－捕捉鎖とハイブリダイズし、その後の過程は前述の（Ａ）～（Ｃ）と同一の過程を経ることによって、核酸分子以外の生体活性物質が標的－クローニング鎖により増幅および／または検出され得る。つまり、試料内の前記生体活性物質の存在有無および／またはレベルを前記のように増幅された標的－クローニング鎖および／または蓄積（濃縮）されたナノ粒子を通じて測定することができる。
【0052】
本出願で提供される標的核酸分子または標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法において、ナノ粒子が基質粒子表面に濃縮されるようにするために、ナノ粒子を基質粒子より十分に多量（個数）で使用することができ、理論的には、基質粒子１個当たりナノ粒子の最小個数を２個～基質粒子１個当たり標的－捕捉鎖の個数の中から適切に選択することができるが、これに制限されるのではない。一例で、ナノ粒子と基質粒子の使用量は、検出条件、標的配列の特性などにより適切に調節することができる（例えば、標的配列がハイブリダイゼーション（結合）強度が強い核酸配列（例えば、「ＧＣ－ｒｉｃｈ」配列）を有する場合、ナノ粒子の使用量を比較的に小量にすることができ、ハイブリダイゼーション程度が弱い配列（例えば、「ＡＴ－ｒｉｃｈ」配列）を有する場合、ナノ粒子の使用量を比較的に多量にすることができるが、これに制限されるのではない）。
【0053】
本出願で提供される標的核酸分子または標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法は、ポリメラーゼの使用を伴わないものであり得る（ｅｎｚｙｍｅ－ｆｒｅｅまたはｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ－ｆｒｅｅ）。
【0054】
また、本出願で提供される標的核酸分子または標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための方法は、液状で行われるものであり得る。
【0055】
一例で、可視化可能なナノ粒子を使用することによるナノ粒子自体による検出／定量／可視化に追加したりこれを代替して、前記標的－クローニング（標的－増幅）鎖をラベリングして検出／定量／可視化することができる。例えば、前記標的－クローニング（標的－増幅）鎖は通常の標識物質でラベリングされ得る。使用可能な標識物質に特別な制限がなく、オリゴヌクレオチドのラベリングに使用可能な全ての標識物質の中から選択して使用することができ、例えば、蛍光物質（例、蛍光染料および／または蛍光蛋白質）であり得るが、これに制限されるのではない。
【0056】
本明細書で提供されるＮＣＲ技術は、互いに異なる標的物質に対する２種以上のナノ粒子を使用することによって、互いに異なる２種以上の標的物質の多重検出（ｂｉｏｎｓｅｎｓｉｎｇ）および／または増幅に適用され得る（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）。
【0057】
より具体的に、本明細書で提供される標的物質の増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化のための組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法は、互いに異なる標的物質（標的核酸分子）に対する鋳型鎖および標的－クローニング鎖を含む２種以上のナノ粒子および／または互いに異なる標的物質（標的核酸分子に対する標的－捕捉鎖を含む２種以上の基質粒子を使用することによって、２種以上の標的物質（標的核酸分子）を同時に増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化することができる、組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法を提供する。前記多重検出／増幅において、２種以上の標的物質の中の一つ以上が核酸分子以外の物質である場合、前記ナノ粒子は前記核酸分子以外の標的物質に対する結合物質をさらに含むものであり得る。
【0058】
前記多重検出／増幅において、各標的物質別に標的－クローニング鎖に異なる標識をすることによって、２種以上の標的物質を一度に増幅、検出、定量化、確認、および／または可視化することができる。
【0059】
本明細書で提供される組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法により、標的物質に対する相当高い検出感度を達成することができる。例えば、本明細書で提供される組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法の標的物質の検出感度は、試料内の標的物質（例えばＤＮＡ（例えば、ｇＤＮＡ）またはＲＮＡ）の量を基準として、１０－７ｎｇ以上、１０－６ｎｇ以上、１０－５ｎｇ以上、１０－４ｎｇ以上、または１０－３ｎｇ以上であり得る（つまり、検出可能な試料内の標的物質の量の下限値（検出限界）は、１０－７ｎｇ、１０－６ｎｇ、１０－５ｎｇ、１０－４ｎｇまたは１０－３ｎｇであり得る）。これはポリメラーゼを使用した通常のＰＣＲよりも顕著に高い（例えば、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１，０００倍、または少なくとも１０，０００倍）の検出感度を示す（図１２ｂ参照）。一具体例で、ナノ粒子一つ当たり１７４個の標的－クローニング鎖がローディングされたＮＣＲプローブを使用して、３回のＮＣＲサイクル後、溶液の色変化（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｌｏｒ ｃｈａｎｇｅ）またはＵＶ－Ｖｉｓ吸光度変化（ＵＶ－Ｖｉｓ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｃｈａｎｇｅ）（例えば、４００～６５０ｎｍ波長で測定）に基づく標的物質（ＤＮＡ）の動的範囲（ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ）は１００ｚＭ～１００ｐＭ程度に現れた。また、ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル（ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）統合領域で確認された検出限界（Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、ＬｏＤ）は、ＮＣＲの場合、ＰＣＲと比較して、約２倍以上、約１０倍以上、約５０倍以上、約１００倍以上、約５００倍以上、約１，０００倍以上、約５，０００倍以上、または約１０，０００倍以上高いことが確認された（図１２ｃ参照）。
【0060】
本明細書で提供されるＮＣＲ技術（組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法）は、定量化診断プラットホーム（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ）に適用可能である。本明細書で提供される組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法は、既存の通常のＰＣＲ技術を代替／拡張して多様な標的物質の増幅／検出／定量に適用され得、前記標的物質と関連した疾病および／または症状の診断にも適用され得る。また、本明細書で提供される組成物、アレイ、キット、装置、および／または方法は、ＬＦＡ（Ｌａｔｅｒａｌ Ｆｌｏｗ Ａｓｓａｙ）のような迅速診断技術にも適用され得、例えば、ストリップセンサーのような迅速診断キットに適用され得るが、これに制限されるのではない。
【0061】
前述の通り、本出願では、ｅｎｚｙｍｅ－ｂａｓｅｄ ｔａｒｇｅｔ－ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｓを繰り返すＰＣＲを変形して、可視化可能なナノ粒子を利用して標的物質を検出（例、ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）するナノ粒子連鎖反応技法（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＮＣＲ）を開発した。以下、標的物質がＤＮＡであり、ナノ粒子が金ナノ粒子（ＡｕＮＰｓ）である場合を例に挙げて図面を参照して本出願をより具体的に説明すると以下のとおりである：
【0062】
標的ＤＮＡと同一の配列（標的－クローニングＤＮＡ；ｔａｒｇｅｔ－ｃｌｏｎｉｎｇ ＤＮＡ）および相補的配列が部分的に二本鎖を形成するＤＮＡが結合されたナノ粒子（ＤＮＡ－ＡｕＮＰｓ）で放出される多数のハイブリダイズされた標的－クローニングＤＮＡを通じて標的ＤＮＡを増幅する。前記増幅は、ＤＮＡ変調（結合）磁性粒子を使用して標的ＤＮＡサンドイッチ複合体を形成および分離し、脱塩プロセス（ｄｅｓａｌｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ）を通じて前記ナノ粒子から標的ＤＮＡ鎖と共に標的クローニングＤＮＡ鎖を放出させることによって行われ得る。本明細書で提供されるＮＣＲ技法は（ナノ粒子当たりの標的－クローニングＤＮＡの数）ｎだけ標的ＤＮＡを幾何級数的に増加させることができ、ここでｎはサイクル回数である。また、ＮＣＲ技法は、溶液でナノ粒子の数を劇的に増加させることによってプラズモンナノ粒子により誘導された明確な溶液の色変化は肉眼で感知することができるようにする。ＮＣＲは蓄積されたＤＮＡ－ナノ粒子の数が肉眼に基づく比色検出またはＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計に基づく定量化を行うのにおいて、十分に高いレベルになる時までサイクルを繰り返すことができる。
【0063】
より具体的に、磁場を印加してサンドイッチ複合体を分離した後、標的－クローニングＤＮＡローディングＡｕＮＰ（ＮＣＲプローブ）が脱ハイブリダイゼーションにより前記複合体から放出される。標的－クローニングＤＮＡ配列は標的ＤＮＡの標的部位配列と正確に同一であり、アッセイ（ａｓｓａｙ）前にＮＣＲプローブ表面にプリローディング（ｐｒｅｌｏａｄｉｎｇ）されている。この過程で標的配列と共に多数の標的－クローニングＤＮＡ鎖も共に放出される。放出された標的－クローニング鎖は後続サイクルでＮＣＲプローブ－磁性粒子（磁性プローブ）間のサンドイッチ複合体の形成に使用されて、ＮＣＲプローブ－磁性粒子の複合体の形成の機会を高いレベルに誘導する（図１ａ）。一旦標的－クローニング鎖がローディングされたＮＣＲプローブが標的－クローニング鎖を放出（ｄｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）すると、ＮＣＲプローブは標的－クローニング鎖がないｕｎｌｏａｄｅｄ ＮＣＲプローブとなる（図３参照）。図３はローディングされたＮＣＲプローブから標的－クローニング鎖の放出を模式的に示すものであり、ローディングされたＮＣＲプローブには予めハイブリッド化された標的－クローニング鎖（緑色）と鋳型鎖（赤色）の標的結合部位が含まれており、ローディングされたＮＣＲプローブが脱ハイブリダイズされると予めハイブリッド化された標的－クローニング鎖が放出されることによって、ローディングされたＮＣＲプローブはｕｎｌｏａｄｅｄ ＮＣＲプローブになり、標的増幅のための次のサイクルに使用されることを示す。
【0064】
ＮＣＲサイクルが繰り返されるにつれ、ＮＣＲプローブも高いレベルに蓄積され、これによりプラズモンＡｕＮＰの濃度が高くなって溶液が前記濃度に比例して赤色を帯びるようになり、反応溶液で標的鎖と捕捉されたＮＣＲプローブの総数は幾何級数的に増加する（図１ｂ）。ＮＣＲプローブ－磁性粒子のサンドイッチ複合体の走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）イメージを通じてＮＣＲサイクルが繰り返されるにつれ、磁性粒子表面に捕捉されたＮＣＲプローブの数が増加し、溶液の赤色の色強度が増加することを確認できる（図１ｃ、２ｄおよび４）。
【0065】
前記の内容を実験的に証明するために、本出願で提供されるＮＣＲ技術を使用して炭疽菌致死因子（ａｎｔｈｒａｘ ｌｅｔｈａｌ ｆａｃｔｏｒ）ＤＮＡ塩基配列を検出した。感染性病原体の検出において、特別な装備なしに迅速かつ敏感に検出することができる現場感知技術の重要性が高いため、このような感染性病原体の代表例として炭疽菌関連遺伝子を試験した。
【0066】
実施例１．３に例示されるように、ＮＣＲプローブは金ナノ粒子（ＡｕＮＰｓ）にチオール化された鋳型鎖を付着（接合）させた後、過量の標的－クローニング鎖を添加して、前記標的－クローニング鎖が鋳型鎖に部分的にハイブリダイズされるようにして生成することができる。
【0067】
この場合、鋳型鎖に含まれている標的－結合部位が標的－クローニング鎖の一部と相補的であるため、標的－クローニング鎖と前記標的－結合部位間の所望しないハイブリダイゼーションがあり得、これは不活性ＮＣＲプローブを生成して本来の機能を果たすことができなくなり、ＮＣＲアッセイの選択性および感度を深刻に低下させることがある。したがって、標的相補体（ｔａｒｇｅｔ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｓ；ｔｏｅｈｏｌｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を添加してトーホールド媒介変位（ｔｏｅｈｏｌｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）を誘発させることによって、鋳型鎖の標的－結合部位に所望せずにハイブリダイズされた標的－クローニング鎖を除去し、鋳型鎖の標的－結合部位を完全に露出させて標的配列との結合のための標的－結合部位をオープンさせることによって、活性ＮＣＲプローブを形成することができる（図１ｄ）。不活性ＮＣＲプローブおよびＮＣＲプローブ（ｔｏｅｈｏｌｄ配列添加）のゲル電気泳動結果を図２ａに示した。図２ａに示されているように、ｔｏｅｈｏｌｄ配列の添加により標的－結合部位を露出させる意図したトーホールド媒介変位（ｔｏｅｈｏｌｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が起こったことを確認できる。また、不活性ＮＣＲプローブと活性ＮＣＲプローブの動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）測定結果を図８に示した。図８で確認されるように、不活性ＮＣＲプローブが活性ＮＣＲプローブより直径が大きく、ｕｎｌｏａｄｅｄ ＮＣＲプローブが最も大きい直径を示した。また、ゼータ電位測定結果を図９に示した。図９のゼータ電位結果はＮＣＲプローブ表面に接合されたＤＮＡによる表面負電荷状態を示し、図１０はＡｕＮＰ、鋳型鎖－変調（接合）ＡｕＮＰ、不活性ＮＣＲプローブ、および活性ＮＣＲプローブが多様なＵＶ－Ｖｉｓスペクトルを生成することを示す。特に２６０ｎｍではＤＮＡによる吸収ピーク、５３２ｎｍでは金ナノ粒子による吸収ピークが確認された。重要なことに、２回のＮＣＲサイクル後、不活性および活性ＮＣＲプローブ間の比較により、活性ＮＣＲプローブの改善された選択性が立証された（図２ｂ、８）。活性ＮＣＲプローブは、標的配列でのみ赤色を示す反面、非標的および１塩基ミスマッチ配列（ｓｉｎｇｌｅ－ｂａｓｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）に対しては検出可能な色がほとんど観察されなかった。反面、不活性ＮＣＲプローブは、標的、非標的および１塩基ミスマッチ配列の全てに対して強い赤色を示して、標的配列に対して非常に低い選択性が示された。
【0068】
捕捉されたＮＣＲプローブの増加された個数はＮＣＲサイクル反復による標的核酸の増幅された数に対応する。重要なことに、ＮＣＲサイクル回数が増加するにつれ、ＮＣＲアッセイ産物のＡｕＮＰ誘導赤色強度が増加する（図２ｃ）。肉眼によるＮＣＲアッセイの検出限界は１回、２回および３回のＮＣＲサイクル後に、それぞれ１ｐＭ、１ｆＭおよび１００ｚＭ程度の低いレベルを示すと確認された。全般的にＮＣＲアッセイ産物の赤色強度は標的ＤＮＡ濃度が増加するにつれて次第に増加した。比較のためにＮＣＲアッセイを通じて１０ｐＭの非標的および１塩基ミスマッチ配列検出を行い、その結果、二つの場合共に感知可能な溶液の色変化がなかった。ＡｕＮＰに基づくスペクトル変化を統合して標的ＤＮＡの量をより正確に定量するためにＵＶ－Ｖｉｓ測定も行い、ＡｕＮＰ－誘導スペクトル変化を広範囲に含むために、ＡｕＮＰｓの量は４００～６５０ｎｍ波長でＵＶ－Ｖｉｓスペクトル領域を積分して求めた（図２ｄ）。重要なことに、ＮＣＲサイクルの回収が増加するにつれて標的濃度が増加することによる検出信号強度のより明らかな増加が観察されており、３回のＮＣＲサイクル後、１００ｚＭ～１００ｐＭの標的濃度までの非常に広い動的範囲（ｄｙｎａｍｉｃ ｒａｎｇｅ）が得られた。
【0069】
その後、Ｃｙ３－標識鋳型鎖とＣｙ５－標識標的－クローニング鎖で蛍光信号を測定してＮＣＲサイクルの増加が標的ＤＮＡの量に及ぼす影響を定量化した。前記蛍光団－変調（標識）鎖を使用してＮＣＲプローブを形成し、ＡｕＮＰを最終的にＫＣＮで溶解して、オリゴヌクレオチドの蛍光に基づく定量化のためにＤＮＡ鎖を完全に放出した。図２ｅはＮＣＲサイクル回数が５回目のサイクルまで増加するにつれ、非常に広い動的範囲にわたってより急激に標的－クローニング鎖の数が増加することを示す。ナノ粒子は高い表面積対体積比（ｓｕｒｆａｃｅ－ｔｏ－ｖｏｌｕｍｅ ｒａｔｉｏ）を提供して多数の核酸分子がＡｕＮＰの表面に接合され得る。本実施例の場合、鋳型鎖の平均数はＡｕＮＰ当たり４３０個であり、予めハイブリダイズされた（ｐｒｅ－ｈｙｂｒｉｄｉｚｅｄ）標的－クローニング鎖の数はＡｕＮＰ当たり１７４個である（図９、１０）。したがって、単一のＮＣＲプローブはＮＣＲサイクル当たり最大１７４個の標的－クローニング鎖を放出することができる。原則的にＰＣＲは標的配列を２ｎ倍に増幅する反面、本出願で提供されるＮＣＲは理論的に一つのナノ粒子に結合された標的－クローニング鎖の数である１７４のｎ乗（１７４ｎ）倍に標的鎖を増幅することができる（ｎはサイクル回数を示す）。しかし、蓄積されたｕｎｌｏａｄｅｄ ＮＣＲプローブはｌｏａｄｅｄ ＮＣＲプローブとＤＮＡ－接合された磁性粒子間の標的媒介ハイブリダイゼーションを妨害することがあるという点に留意しなければならない。本実施例での分析結果は、ｕｎｌｏａｄｅｄ ＮＣＲプローブが標的結合においてｌｏａｄｅｄ ＮＣＲプローブよりも好まれることを示した（図１１）。したがって、ＮＣＲサイクルの増幅効率は現在アッセイで最大化されておらず、追加の最適化が必要である。それにもかかわらず、ＮＣＲアッセイは単に３回のＮＣＲサイクル後に、ｚｅｐｔｏｍｏｌａｒ標的濃度の肉眼検出を可能にした。
【発明の効果】
【0070】
新たなナノ粒子連鎖反応（ＮＣＲ）技術を利用して、極少量の標的物質も安定的に増幅／検出／可視化することができる検出および／または診断技術を提供する。前記ＮＣＲ技術は酵素を使用しないため、別途の装備を不要とすると共に、非常に優れた検出感度を達成することができるため、現場検出／診断手段として適用可能であり、既存のＰＣＲと比較してより長いＤＮＡ（例：ゲノムＤＮＡなど）を非常に高い感度に検出することができるため、検出限界を改善することができる。また、本明細書で提供するＮＣＲは、現場感知のためのラテラルフローアッセイ（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ａｓｓａｙ）（迅速キット）の検出限界の改善に寄与するため、ラテラルフローアッセイ（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ａｓｓａｙ）（迅速キット）にも有用に適用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0071】
【図1c】図１ｃは標的分析物の１０ｐＭ濃度により始まったＮＣＲプローブと磁性基質粒子のサンドイッチ複合体のＳＥＭイメージであり（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ、２００ｎｍ；挿入図はアンローディングされたＮＣＲプローブの数が増加するにつれて肉眼で感知できる色の見え（ｃｏｌｏｒ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）である）。
【図2a】図２は比色ＮＣＲアッセイ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＮＣＲ ａｓｓａｙ）結果を示すものであり、図２ａは所望のＮＣＲプローブ準備過程を示すためにゲル電気泳動を行った結果であり、ＮＣＲプローブ準備の各段階には異なるＤＮＡ長さが得られることを示し、
【図2b】図２ｂは多様な濃度の分析物質（標的物質）に対するＮＣＲ結果（ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル（ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ））を示すグラフであり、非標的配列（Ｎ；ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および１塩基ミスマッチ配列（Ｓ：ｓｉｎｇｌｅ－ｂａｓｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は検出しない反面、標的物質は高い感度（１００ｚＭ以上）に検出し、検出能はサイクル回数に比例することを示し、
【図4】図４はＮＣＲアッセイの間のサンドイッチ複合体のＳＥＭイメージを示すものであり、ＮＣＲアッセイは標的配列濃度１０ｐＭで行われ、ＮＣＲサイクル回数が増加するほどサンドイッチ複合体の生成が増加することを示す（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：１μｍ）。
【図11】図１１はローディング（標的－クローニング鎖とハイブリダイズされた部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む）およびアンローディング（鋳型鎖だけを含む）ＮＣＲプローブの標的鎖の捕捉の程度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0072】
以下、本発明を実施例に基づいてより詳しく説明する。しかし、下記の実施例は本発明の内容を例示するものに過ぎず、下記の実施例により本発明の権利範囲が制限されない。
【0073】
実施例１
１．１．材料準備
５０－ｎｍクエン酸塩－安定化金ナノ粒子をＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ、ＵＫ）から購入した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－２７０カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。全ての化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入し、入手された状態で追加の精製なしに使用した。下記の実施例で使用されたオリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手した。蒸溜水はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ｓｙｓｔｅｍ（＞１８．０ＭΩ、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）から入手し、全ての実験に使用した。Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ（商標名）Ｐｌｕｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１ｘ ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒを１：３の比率で混合した混合溶液をＮＣＲアッセイのハイブリダイゼーション緩衝液（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）として使用した。
１．１．材料準備
５０－ｎｍクエン酸塩－安定化金ナノ粒子をＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｃａｒｄｉｆｆ、ＵＫ）から購入した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ－２７０カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）はＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。全ての化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入し、入手された状態で追加の精製なしに使用した。下記の実施例で使用されたオリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．から入手した。蒸溜水はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ｓｙｓｔｅｍ（＞１８．０ＭΩ、Ｍｉｌｌｉ－Ｑ）から入手し、全ての実験に使用した。Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｈｙｂ（商標名）Ｐｌｕｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１ｘ ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒを１：３の比率で混合した混合溶液をＮＣＲアッセイのハイブリダイゼーション緩衝液（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）として使用した。
【0074】
本出願の効果を実験的に証明するために、検出対象の標的オリゴヌクレオチド（以下、標的鎖または標的配列とも記載される）は、炭疽菌致死因子（ａｎｔｈｒａｘ ｌｅｔｈａｌ ｆａｃｔｏｒ）のＤＮＡ塩基配列（ＧＡＧ ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＧＡＴ；配列番号１）を選択して、以降の試験を進行した。感染性病原体の検出において、特別な装備なしに迅速かつ敏感に検出できる現場感知技術の重要性が高いため、検出対象として感染性病原体の代表例である炭疽菌関連遺伝子を選択した。
【0075】
１．２．基質粒子（磁性プローブ）の作製
カルボン酸－官能化された磁性粒子（直径２．８μｍ）は使用前に１０分間完全にボルテックスした。磁性粒子２００μｌを新たなチューブに移した。前記磁性粒子を２５ｍＭの２－［Ｎ－モルホリノ］エタンスルホン酸（２－［Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ ｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ４．８）で２回洗浄し、同一の緩衝液２０μｌに再懸濁させた。１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ４．８）に溶解されたＮ－エチル－Ｎ’－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（１００ｍｇ／ｍｌ）８μｌおよび５’－アミン化オリゴヌクレオチド（標的－捕捉鎖）（１０ｎｍｏｌ；５’－ＮＨ２－（ＣＨ２）３－Ａ１０－ＡＴＣ ＣＴＴ ＡＴＣ ＡＡＴ ＡＴＴ－３’：ＮＨ２－（ＣＨ２）３－Ａ１０－［配列番号３］）の混合物を前記洗浄された磁性粒子溶液に添加した。室温で４時間ボルテックスしながらインキュベーションした後、磁性粒子を３回洗浄し、ハイブリダイゼーション緩衝液に分散させた。前記で得られた磁性粒子は下記の実施例で標的物質検出のための基質粒子として使用した。
カルボン酸－官能化された磁性粒子（直径２．８μｍ）は使用前に１０分間完全にボルテックスした。磁性粒子２００μｌを新たなチューブに移した。前記磁性粒子を２５ｍＭの２－［Ｎ－モルホリノ］エタンスルホン酸（２－［Ｎ－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ］ ｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ；ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ４．８）で２回洗浄し、同一の緩衝液２０μｌに再懸濁させた。１００ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ４．８）に溶解されたＮ－エチル－Ｎ’－［３－ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（１００ｍｇ／ｍｌ）８μｌおよび５’－アミン化オリゴヌクレオチド（標的－捕捉鎖）（１０ｎｍｏｌ；５’－ＮＨ２－（ＣＨ２）３－Ａ１０－ＡＴＣ ＣＴＴ ＡＴＣ ＡＡＴ ＡＴＴ－３’：ＮＨ２－（ＣＨ２）３－Ａ１０－［配列番号３］）の混合物を前記洗浄された磁性粒子溶液に添加した。室温で４時間ボルテックスしながらインキュベーションした後、磁性粒子を３回洗浄し、ハイブリダイゼーション緩衝液に分散させた。前記で得られた磁性粒子は下記の実施例で標的物質検出のための基質粒子として使用した。
【0076】
１．３．ＮＣＲプローブの作製
ジスルフィド－変調された鋳型鎖（５’－ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＡＡ ＴＣＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＣＴＴ ＡＴＣ ＡＡＴ ＡＴＴ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＡＡ ＴＣＣ ＣＴＣ （Ａ）１０－３’；［配列番号２］－（Ａ）１０）は、室温で２時間インキュベーションを通じて１００ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ８）に溶解された１００ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；ＤＴＴ）を使用して還元させて、３’－チオール化鋳型鎖（５’－［配列番号２］－ＰＥＧ６－Ａ１０－ＳＨ－３’）を準備した。還元後、ＮＡＰ－５カラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して過量のＤＴＴを除去した。新たに還元されたチオール（ｔｈｉｏｌ）化鋳型鎖を１０３ｐｍｏｌｅの量で０．１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）および平均直径５０ｎｍの金ナノ粒子（ＡｕＮＰｓ）５．１７ｍｏｌｅが含まれている蒸溜水溶液に添加した。このように得られた混合溶液を室温で２時間インキュベーションした後、最終のリン酸塩濃度が１００ｍＭ（ｐＨ７．４）になるように調整した。０．０１％ＳＤＳが含まれている２Ｍ ＮａＣｌの６個の分取量を３０分間隔で添加して、最終の塩濃度が０．３Ｍになるようにした。前記で得られた混合物を各塩添加後、１０分間８０℃で加熱した。最終の混合物を室温で徐々に冷却させて一晩中インキュベーションして、表面に多数の鋳型鎖が結合（接合）された金ナノ粒子懸濁液を得た。懸濁液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分）を通じて洗浄し、得られた粒子溶液を蒸溜水に再分散させた。鋳型鎖－接合された金ナノ粒子を３００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で過量の標的－クローニング鎖（５’－ＧＡＧ ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＧＡＴ－３’；配列番号１）と共に５５℃で１０分間インキュベーションした後、室温で１時間 冷却させた。過量の標的－クローニング鎖を遠心分離（１１０００ｒｐｍ、２分）で除去した。０．１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳが含まれている４０－ｍＭ ＭｇＣｌ２緩衝液にある過量のｔｏｅｈｏｌｄ ＤＮＡ（配列番号４）を同一のチューブに添加し、４３℃で３０分間インキュベーションした後、３時間室温で冷却して、表面に鋳型鎖が結合され、前記鋳型鎖に標的－クローニング鎖が部分的にハイブリダイズされている形態のＮＣＲプローブを得た。連続的なハイブリダイゼーション後、得られたＮＣＲプローブを遠心分離（１１０００ｒｐｍ、２分）を通じて４回洗浄し、ハイブリダイゼーション緩衝液に再分散させた。
ジスルフィド－変調された鋳型鎖（５’－ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＡＡ ＴＣＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＣＴＴ ＡＴＣ ＡＡＴ ＡＴＴ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＡＡ ＴＣＣ ＣＴＣ （Ａ）１０－３’；［配列番号２］－（Ａ）１０）は、室温で２時間インキュベーションを通じて１００ｍＭホスフェート緩衝液（ｐＨ８）に溶解された１００ｍＭジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；ＤＴＴ）を使用して還元させて、３’－チオール化鋳型鎖（５’－［配列番号２］－ＰＥＧ６－Ａ１０－ＳＨ－３’）を準備した。還元後、ＮＡＰ－５カラム（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して過量のＤＴＴを除去した。新たに還元されたチオール（ｔｈｉｏｌ）化鋳型鎖を１０３ｐｍｏｌｅの量で０．１％（ｖ／ｖ）のＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌ Ｓｕｌｆａｔｅ）および平均直径５０ｎｍの金ナノ粒子（ＡｕＮＰｓ）５．１７ｍｏｌｅが含まれている蒸溜水溶液に添加した。このように得られた混合溶液を室温で２時間インキュベーションした後、最終のリン酸塩濃度が１００ｍＭ（ｐＨ７．４）になるように調整した。０．０１％ＳＤＳが含まれている２Ｍ ＮａＣｌの６個の分取量を３０分間隔で添加して、最終の塩濃度が０．３Ｍになるようにした。前記で得られた混合物を各塩添加後、１０分間８０℃で加熱した。最終の混合物を室温で徐々に冷却させて一晩中インキュベーションして、表面に多数の鋳型鎖が結合（接合）された金ナノ粒子懸濁液を得た。懸濁液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分）を通じて洗浄し、得られた粒子溶液を蒸溜水に再分散させた。鋳型鎖－接合された金ナノ粒子を３００ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液で過量の標的－クローニング鎖（５’－ＧＡＧ ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＧＡＴ－３’；配列番号１）と共に５５℃で１０分間インキュベーションした後、室温で１時間 冷却させた。過量の標的－クローニング鎖を遠心分離（１１０００ｒｐｍ、２分）で除去した。０．１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳが含まれている４０－ｍＭ ＭｇＣｌ２緩衝液にある過量のｔｏｅｈｏｌｄ ＤＮＡ（配列番号４）を同一のチューブに添加し、４３℃で３０分間インキュベーションした後、３時間室温で冷却して、表面に鋳型鎖が結合され、前記鋳型鎖に標的－クローニング鎖が部分的にハイブリダイズされている形態のＮＣＲプローブを得た。連続的なハイブリダイゼーション後、得られたＮＣＲプローブを遠心分離（１１０００ｒｐｍ、２分）を通じて４回洗浄し、ハイブリダイゼーション緩衝液に再分散させた。
【0077】
前記実施例１．２および１．３に使用されたオリゴヌクレオチドの配列を下記の表１に整理した：
【0078】
【表1】
【0079】
１．４．ＮＣＲアッセイ
増幅前に、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（商標名）Ｐｌｕｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｘ ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒと１：３の比率で混合して準備した。ハイブリダイゼーションのために、標的配列（ＧＡＧ ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＧＡＴ；配列番号１）１００μｌと磁性基質粒子（実施例１．２）１０μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）をチューブに入れて混合した後、１０分間インキュベーションした。前記チューブにＮＣＲプローブ（実施例１．３）１５μｌ（１ＯＤ）（５．１７ｘ１０－２ｐｍｏｌｅ／ｍｌ）（７７５ａｍｏｌｅ）を添加した後、２０分間インキュベーションした。磁性分離機を通じて磁性基質粒子をハイブリダイゼーション緩衝液で３回洗浄した後、３０ｕｌの蒸溜水に分散させて８０℃で２分間インキュベーションして脱ハイブリダイズさせた。次のサイクルのアッセイのために、ハイブリダイゼーション緩衝液を添加して塩濃度を増加させた後、１０分間インキュベーションした。ＮＣＲプローブ１５μｌ（１ＯＤ）（５．１７ｘ１０－２ｐｍｏｌｅ／ｍｌ）（７７５ａｍｏｌｅ）添加、２０分間インキュベーション、核酸の洗浄および放出過程を繰り返してアッセイ産物（ａｓｓａｙ ｐｒｏｄｕｃｔ）がより高い赤色強度を示すようにした。
増幅前に、ＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ（商標名）Ｐｌｕｓ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｘ ＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒと１：３の比率で混合して準備した。ハイブリダイゼーションのために、標的配列（ＧＡＧ ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＧＡＴ；配列番号１）１００μｌと磁性基質粒子（実施例１．２）１０μｌ（５ｍｇ／ｍｌ）をチューブに入れて混合した後、１０分間インキュベーションした。前記チューブにＮＣＲプローブ（実施例１．３）１５μｌ（１ＯＤ）（５．１７ｘ１０－２ｐｍｏｌｅ／ｍｌ）（７７５ａｍｏｌｅ）を添加した後、２０分間インキュベーションした。磁性分離機を通じて磁性基質粒子をハイブリダイゼーション緩衝液で３回洗浄した後、３０ｕｌの蒸溜水に分散させて８０℃で２分間インキュベーションして脱ハイブリダイズさせた。次のサイクルのアッセイのために、ハイブリダイゼーション緩衝液を添加して塩濃度を増加させた後、１０分間インキュベーションした。ＮＣＲプローブ１５μｌ（１ＯＤ）（５．１７ｘ１０－２ｐｍｏｌｅ／ｍｌ）（７７５ａｍｏｌｅ）添加、２０分間インキュベーション、核酸の洗浄および放出過程を繰り返してアッセイ産物（ａｓｓａｙ ｐｒｏｄｕｃｔ）がより高い赤色強度を示すようにした。
【0080】
１．５．ＮＣＲアッセイ産物のＵＶ－Ｖｉｓ測定
ＮＣＲアッセイ産物を磁気分離機を通じて即時分離し、ＵＶ－Ｖｉｓ測定前に核酸放出のために８０℃で培養した。それぞれの放出されたＮＣＲアッセイ産物の吸光度スペクトルはｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ－ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｓ－３１００、ＳＣＩＮＣＯ）を使用して測定した。金ナノ粒子プローブ（ＮＣＲプローブ）から測定された赤色ＵＶ－Ｖｉｓ強度を５３２ｎｍで測定した。
ＮＣＲアッセイ産物を磁気分離機を通じて即時分離し、ＵＶ－Ｖｉｓ測定前に核酸放出のために８０℃で培養した。それぞれの放出されたＮＣＲアッセイ産物の吸光度スペクトルはｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ－ｖｉｓｉｂｌｅ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（Ｓ－３１００、ＳＣＩＮＣＯ）を使用して測定した。金ナノ粒子プローブ（ＮＣＲプローブ）から測定された赤色ＵＶ－Ｖｉｓ強度を５３２ｎｍで測定した。
【0081】
１．６．ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
ｔｏｅｈｏｌｄ－媒介変位反応を含む活性ＮＣＲプローブ作製過程を検証するためにポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。３０％（ｗ／ｖ）ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／Ｂｉｓ溶液、脱イオン水、５Ｘ ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ－Ｂｏｒａｔｅ－ＥＤＴＡ）緩衝液、過硫酸アンモニウム、およびＴＥＭＥＤ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）を使用して１５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを製造した。ＤＮＡが結合された金ナノ粒子（実施例１．３）を０．１Ｍ ＫＣＮ溶液で処理して溶解した。ローディング染料が含まれている金－溶解されたＤＮＡサンプルを１．５ｍｍ厚さのゲルの各ウェルに添加した。ゲル上でのＤＮＡ分子量の確認のために、２０ｂｐＤＮＡラダー（ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ）を他のウェルにローディングした。電源供給装置を使用して前記ゲルに電場（１３０Ｖ）を７０分間印加して電気泳動した。電気泳動後、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｌｏｎｚａ）を使用してゲルを１０分間染色し、ゲルイメージャー（ｇｅｌ ｉｍａｇｅｒ）により３０６ｎｍでＵＶ光励起を使用してゲルを映像化した。
ｔｏｅｈｏｌｄ－媒介変位反応を含む活性ＮＣＲプローブ作製過程を検証するためにポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。３０％（ｗ／ｖ）ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／Ｂｉｓ溶液、脱イオン水、５Ｘ ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ－Ｂｏｒａｔｅ－ＥＤＴＡ）緩衝液、過硫酸アンモニウム、およびＴＥＭＥＤ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）を使用して１５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドゲルを製造した。ＤＮＡが結合された金ナノ粒子（実施例１．３）を０．１Ｍ ＫＣＮ溶液で処理して溶解した。ローディング染料が含まれている金－溶解されたＤＮＡサンプルを１．５ｍｍ厚さのゲルの各ウェルに添加した。ゲル上でのＤＮＡ分子量の確認のために、２０ｂｐＤＮＡラダー（ＤＮＡ ｌａｄｄｅｒ）を他のウェルにローディングした。電源供給装置を使用して前記ゲルに電場（１３０Ｖ）を７０分間印加して電気泳動した。電気泳動後、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（Ｌｏｎｚａ）を使用してゲルを１０分間染色し、ゲルイメージャー（ｇｅｌ ｉｍａｇｅｒ）により３０６ｎｍでＵＶ光励起を使用してゲルを映像化した。
【0082】
１．７．走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＥＭ）
各サイクルでの標的配列（配列番号１）の存在下の磁性基質粒子とＮＣＲプローブのサンドイッチ複合体を電界放出型走査電子顕微鏡（Ｆｉｅｌｄ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＦＥ－ＳＥＭ；ＳＵＰＲＡ ５５ＶＰ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。サンドイッチ複合体の構造粒子を銅グリッドにローディングし、Ｐｔコーティング（ＥＭ ＡＣＥ２００、Ｌｅｉｃａ、Ａｕｓｔｒｉａ）処理し、イメージ化した。ＦＥ－ＳＥＭイメージングは、ＮＩＣＥＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ；Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｅｏｕｌ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）で行った。
各サイクルでの標的配列（配列番号１）の存在下の磁性基質粒子とＮＣＲプローブのサンドイッチ複合体を電界放出型走査電子顕微鏡（Ｆｉｅｌｄ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＦＥ－ＳＥＭ；ＳＵＰＲＡ ５５ＶＰ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で観察した。サンドイッチ複合体の構造粒子を銅グリッドにローディングし、Ｐｔコーティング（ＥＭ ＡＣＥ２００、Ｌｅｉｃａ、Ａｕｓｔｒｉａ）処理し、イメージ化した。ＦＥ－ＳＥＭイメージングは、ＮＩＣＥＭ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ；Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｅｏｕｌ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）で行った。
【0083】
１．８．オリゴヌクレオチドの定量化
標的オリゴヌクレオチドの定量化のために蛍光染料付着された（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ）オリゴヌクレオチドを使用してＡｕＮＰに基づくＰＣＲプローブを作製した。蛍光光度計（Ｆ２００ Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ）を利用して蛍光信号を測定した。鋳型鎖と標的－クローニング鎖は５’末端にそれぞれＣｙ３染料（鋳型鎖）とＣｙ５染料（標的－クローニング鎖）を使用して標識した。塩処理（ｓａｌｔｉｎｇ）およびＮＣＲアッセイ後、金ナノ粒子を１０ｍＭ ＫＣＮに溶解した。残存する蛍光－標識オリゴヌクレオチドを使用して蛍光強度を測定した。染料サンプルの知られた濃度の検量線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）を定量化に使用した。
標的オリゴヌクレオチドの定量化のために蛍光染料付着された（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ）オリゴヌクレオチドを使用してＡｕＮＰに基づくＰＣＲプローブを作製した。蛍光光度計（Ｆ２００ Ｐｒｏ、ＴＥＣＡＮ）を利用して蛍光信号を測定した。鋳型鎖と標的－クローニング鎖は５’末端にそれぞれＣｙ３染料（鋳型鎖）とＣｙ５染料（標的－クローニング鎖）を使用して標識した。塩処理（ｓａｌｔｉｎｇ）およびＮＣＲアッセイ後、金ナノ粒子を１０ｍＭ ＫＣＮに溶解した。残存する蛍光－標識オリゴヌクレオチドを使用して蛍光強度を測定した。染料サンプルの知られた濃度の検量線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ）を定量化に使用した。
【0084】
１．９．動的光散乱法（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＤＬＳ）およびゼータ電位測定を通じた粒子特性の分析
ＮＣＲプローブと磁性基質粒子のサイズ特性および表面電荷特性の分析のために、前記ＮＣＲプローブおよび／または磁性基質粒子を蒸溜水溶液に分散させた後、動的光散乱光度計（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｍａｌｖｅｒｎ）を利用して粒子サイズおよび電荷を測定し、３回の測定後に平均値を利用した。
ＮＣＲプローブと磁性基質粒子のサイズ特性および表面電荷特性の分析のために、前記ＮＣＲプローブおよび／または磁性基質粒子を蒸溜水溶液に分散させた後、動的光散乱光度計（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｍａｌｖｅｒｎ）を利用して粒子サイズおよび電荷を測定し、３回の測定後に平均値を利用した。
【0085】
データの利用可能性（Ｄａｔａ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ）
この論文内のプロットを裏付けるデータおよびこの研究のその他結果は、合理的な要求により責任著者から入手できます。（Ｔｈｅ ｄａｔａ ｔｈａｔ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｐｌｏｔｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｒｅ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ ｕｐｏｎ ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ ｒｅｑｕｅｓｔ．）
この論文内のプロットを裏付けるデータおよびこの研究のその他結果は、合理的な要求により責任著者から入手できます。（Ｔｈｅ ｄａｔａ ｔｈａｔ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｐｌｏｔｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ａｒｅ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ ｕｐｏｎ ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ ｒｅｑｕｅｓｔ．）
【0086】
実施例２．比色ＮＣＲアッセイ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＮＣＲ ａｓｓａｙ）
実施例１．２および１．３でそれぞれ作製された磁性プローブとＮＣＲプローブに１０ｐＭ濃度の標的オリゴヌクレオチド（ＧＡＧ ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＧＡＴ；配列番号１）を処理した後、各サイクルでのＮＣＲプローブと磁性プローブ間に形成されたサンドイッチ複合体を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察し（実施例１．７参照）、反応液の色変化を肉眼で観察した。このように得られたＳＥＭイメージおよび溶液の色変化を図１ｃ（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ、２００ｎｍ；挿入図はアンローディングされたＮＣＲプローブの数が増加するにつれて肉眼で感知できる色の見え（ｃｏｌｏｒ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）である）および図４（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：１μｍ）に示した。これら結果に示されているように、ＮＣＲサイクルが繰り返されるにつれ、磁性プローブ表面に捕捉されたＮＣＲプローブの数が増加し、溶液の赤色の色強度が増加することを確認できる。
実施例１．２および１．３でそれぞれ作製された磁性プローブとＮＣＲプローブに１０ｐＭ濃度の標的オリゴヌクレオチド（ＧＡＧ ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＴＧ ＴＴＡ ＡＡＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＡＡＧ ＧＡＴ；配列番号１）を処理した後、各サイクルでのＮＣＲプローブと磁性プローブ間に形成されたサンドイッチ複合体を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察し（実施例１．７参照）、反応液の色変化を肉眼で観察した。このように得られたＳＥＭイメージおよび溶液の色変化を図１ｃ（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ、２００ｎｍ；挿入図はアンローディングされたＮＣＲプローブの数が増加するにつれて肉眼で感知できる色の見え（ｃｏｌｏｒ ａｐｐｅａｒａｎｃｅ）である）および図４（Ｓｃａｌｅ ｂａｒ：１μｍ）に示した。これら結果に示されているように、ＮＣＲサイクルが繰り返されるにつれ、磁性プローブ表面に捕捉されたＮＣＲプローブの数が増加し、溶液の赤色の色強度が増加することを確認できる。
【0087】
また、実施例１．３でのように、ｔｏｅｈｏｌｄ配列（配列番号４）を添加して作製されたＮＣＲプローブで、鋳型鎖の標的－結合部位と標的－クローニング鎖間の所望しない結合が起こるか否かを確認するために、実施例１．６を参照してゲル電気泳動を行った。比較のために、ｔｏｅｈｏｌｄ ＤＮＡを処理していないＮＣＲプローブに対して同一の試験を行った。前記で得られたゲル電気泳動結果を図２ａに示した。図２ａに示されているように、実施例１．３でのようにｔｏｅｈｏｌｄ配列が添加された場合、鋳型鎖の標的－結合部位と標的－クローニング鎖間の結合なしに、鋳型鎖の標的－クローニング部位と標的－クローニング鎖間の適した結合が行われ、標的－結合部位が一本鎖で露出された活性化（ａｃｔｉｖｅ）状態のＮＣＲプローブが得られる反面、ｔｏｅｈｏｌｄ配列が添加されていない場合には鋳型鎖の標的－結合部位と標的－クローニング鎖間の結合が起きて標的－結合部位が露出されない不活性化（ｉｎａｃｔｉｖｅ）状態のＮＣＲプローブが得られることを確認できる。このような結果は、ｔｏｅｈｏｌｄ配列の添加により標的－結合部位を露出させる意図したトーホールド媒介変位（ｔｏｅｈｏｌｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）が起こったことを示す。
【0088】
実施例３．ＮＣＲ ａｓｓａｙ（ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル）
標的オリゴヌクレオチド濃度またはｔｏｅｈｏｌｄ配列の使用有無によるＮＣＲアッセイ結果をＵＶ－Ｖｉｓスペクトル（ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）で確認した（実施例１．４および１．５参照）。
標的オリゴヌクレオチド濃度またはｔｏｅｈｏｌｄ配列の使用有無によるＮＣＲアッセイ結果をＵＶ－Ｖｉｓスペクトル（ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ）で確認した（実施例１．４および１．５参照）。
【0089】
標的特異性の確認のために、比較例として、非標的配列（Ｎ；ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；配列番号６）および１塩基ミスマッチ配列（Ｓ：ｓｉｎｇｌｅ－ｂａｓｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；配列番号５）を使用して同一の試験を行った。
【0090】
前記で得られた結果を図２ｂ～２ｄに示した。
【0091】
図２ｂは多様な濃度の標的配列に対するＮＣＲ結果（ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル（ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ））を示すグラフであり、非標的配列（Ｎ；ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および１塩基ミスマッチ配列（Ｓ：ｓｉｎｇｌｅ－ｂａｓｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は検出しない反面、標的配列は高い感度（検出限界：１００ｚＭ以上）に検出し、検出能はサイクル回数に比例することを示す。図２ｃ（１サイクル遂行）および２ｄ（１～３サイクル遂行）はＮＣＲアッセイ結果を肉眼で確認した結果を示すものであり、これも、ＮＣＲアッセイが非標的配列および１塩基ミスマッチ配列は検出しない反面、標的配列は高い感度に検出できることを示す。このような結果は本出願で提供されるＮＣＲアッセイが標的－特異的であると共に、高い感度に標的物質を増幅／検出／可視化できることを示す。また、図２ｃは鋳型鎖の標的－結合部位が露出された活性化ＮＣＲプローブがＮおよびＳ配列と標的配列を肉眼で明確に区分可能であることを示す。
【0092】
また、２回のＮＣＲアッセイサイクル後のＵＶ－Ｖｉｓ吸光度領域を測定して、図５に示した。図５で、初期標的配列濃度は１０ｐＭにし、ＮとＳはそれぞれｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅとｓｉｎｇｌｅ－ｂａｓｅ ｍｉｓｍａｔｃｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅを示し、ｏｐｔｉｃａｌ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ値は５３２ｎｍで測定した（Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ｓ．ｄ． ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｖａｌｕｅｓ ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）。図５に示されているように、鋳型鎖の標的－結合部位が露出された活性化ＮＣＲプローブがＮおよびＳ配列と標的配列を肉眼で明確に区分可能なようにすることを示す。
【0093】
【0094】
図６はＮＣＲプローブ上の標的－クローニング鎖を定量した結果を示す。ＡｕＮＰ上の標的クローニング鎖の数は蛍光強度を測定して計算した。Ｃｙ５染料で標識された標的－クローニング鎖を使用して作製されたＮＣＲプローブを試験に使用した。Ｃｙ５染料の知られた濃度と連続希釈されたサンプルは標準曲線を準備した。ＮＣＲプローブ（ＡｕＮＰ）は１０ｍＭ ＫＣＮに溶解して使用し、標準曲線の青色の三角形表示がＮＣＲプローブ溶液で測定された蛍光強度を示す。
【0095】
図７はＮＣＲプローブ上の鋳型鎖を定量した結果を示す。ＡｕＮＰ当たり鋳型鎖の数は蛍光強度を測定して計算した。Ｃｙ３染料で標識された鋳型鎖をＡｕＮＰに接合させて得られたＮＣＲプローブを試験に使用した。希釈された試料およびＣｙ３染料の知られた濃度により標準曲線を準備した。ＮＣＲプローブ（ＡｕＮＰ）は１０ｍＭ ＫＣＮに溶解して使用した。標準曲線の赤色の三角形表示は鋳型鎖－結合ＡｕＮＰで測定された蛍光強度である。
【0096】
実施例５．動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＤＬＳ）測定結果
実施例１．９を参照してＮＣＲプローブの動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＤＬＳ）測定を行い、その結果を図８～１１に示した。
実施例１．９を参照してＮＣＲプローブの動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＤＬＳ）測定を行い、その結果を図８～１１に示した。
【0097】
図８はＮＣＲプローブの動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＤＬＳ）測定結果を示す。ＮＣＲプローブ製造過程中の粒子サイズの変化をＤＬＳで測定した。鋳型鎖で変形（結合）された金ナノ粒子は７８．８２ｎｍのＺ－平均サイズを示す。標的－クローニング鎖のハイブリダイゼーションを通じて製造された不活性ＮＣＲプローブは Ｚ－平均サイズ（Ｚ－ａｖｅｒａｇｅ ｓｉｚｅ）が９１．２８ｎｍに測定されて、鋳型鎖結合された金ナノ粒子よりＤＮＡ長さが長く現れた。Ｔｏｅｈｏｌｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅを通じて過量の標的－クローニング鎖を除去した後の活性ＮＣＲプローブは、Ｚ－平均サイズ（Ｚ－ａｖｅｒａｇｅ ｓｉｚｅ）が６９．５１ｎｍに測定されて、減少されたＤＮＡ長さを有することを確認した。鋳型鎖変形ＡｕＮＰとＮＣＲプローブの塩基数は同一であるが、活性ＮＣＲプローブは二本鎖螺旋構造のＤＮＡを含むため、Ｚ－平均サイズがより小さく測定された。
【0098】
図９はＮＣＲプローブのゼータ電位測定結果を示す。ＮＣＲプローブ作製過程中の表面電荷変化はゼータ電位で測定され得る。
【0099】
図１０はＮＣＲプローブのＵＶ－Ｖｉｓスペクトル測定結果を示す。ＮＣＲプローブ作製中の多様な段階のＵＶ－Ｖｉｓ吸光度スペクトルを測定した。ＮＣＲプローブはＤＮＡ鎖が金ナノ粒子の表面に接合されることによってＵＶ－Ｖｉｓデータが青色移動することを示す。
【0100】
図１１はローディング（標的－クローニング鎖とハイブリダイズされた部分的二本鎖オリゴヌクレオチドを含む）およびアンローディング（鋳型鎖だけを含む）ＮＣＲプローブの標的配列の捕捉の程度を示すグラフである。アンローディングＮＣＲプローブはＮＣＲアッセイ中に生成され、次のサイクルで所望するサンドイッチ複合体の形成を妨害する。ＮＣＲアッセイの間にアンローディングされたＮＣＲプローブの影響を決定するために、アンローディングされたＮＣＲプローブとローディングされたＮＣＲプローブの動力学を単一サイクルＮＣＲアッセイを通じて測定した。比較のために、二つのプローブ共に標的配列と同一の濃度、つまり、１０ｐＭに対してそれぞれ添加された混合物に対して同一の試験を行った。ローディングされたＮＣＲプローブとアンローディングＮＣＲプローブの混合物は１：１比率で準備した。アンローディングＮＣＲプローブがローディングＮＣＲプローブに比べて良好な反応を示すと確認された。
【0101】
実施例６．比色ＮＣＲアッセイ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＮＣＲ ａｓｓａｙ）とＰＣＲとの比較
バクテリア（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）の遺伝体ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を本出願の比色ＮＣＲアッセイ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＮＣＲ ａｓｓａｙ）および既存のＰＣＲで検出して、その結果を比較した。
バクテリア（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）の遺伝体ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を本出願の比色ＮＣＲアッセイ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＮＣＲ ａｓｓａｙ）および既存のＰＣＲで検出して、その結果を比較した。
【0102】
前記バクテリアは、実施例１．１～１．３で標的として使用された配列番号１を共有するため、前記ＮＣＲアッセイ（ＮＣＲ ａｓｓａｙ）は実施例１．１～１．３で準備された磁性プローブおよびＮＣＲプローブを使用して、実施例１．４の方法で行った。
【0103】
ＰＣＲは下記のプライマ－配列および条件で行った：
Ｆ－ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣＧＣ－３’（配列番号７）
Ｒ－ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＣＧＡＣＴＴＣＧＧＧＴＧＴＴＡＣＡＡ－３’（配列番号８）
Ｆ－ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＣＴＧＧＣＴＣＡＧＧＡＴＧＡＡＣＧＣ－３’（配列番号７）
Ｒ－ｐｒｉｍｅｒ：５’－ＣＧＡＣＴＴＣＧＧＧＴＧＴＴＡＣＡＡ－３’（配列番号８）
【0104】
ＰＣＲ条件：９５Ｃで１分、５３Ｃで３０秒、７２Ｃで１分３０秒の３段階を３５サイクル繰り返す。
【0105】
前記で得られた 比色ＮＣＲアッセイ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ＮＣＲ ａｓｓａｙ）およびＰＣＲの比較結果を図１２ａ～１２ｃに示した。図１２ａはＮＣＲとＰＣＲ間のｇＤＮＡ検出過程の比較概略図であり、ＮＣＲアッセイ（ＮＣＲ ａｓｓａｙ）の場合、検出のための装備が不要であり、ＰＣＲより短時間に遂行可能である。図１２ｂはバクテリアで抽出したｇＤＮＡをＮＣＲまたはＰＣＲで検出した結果を示すものであり、ＮＣＲアッセイは肉眼検出可能であるが（検出限界：１０－７ｎｇ）、ＰＣＲはゲル電気泳動結果を通じて確認可能であることを示す（検出限界：１０－３ｎｇ）。図１２ｃはＮＣＲおよびＰＣＲ分析結果（ＵＶ－Ｖｉｓスペクトル（ＵＶ－Ｖｉｓ ｓｐｅｃｔｒｕｍ））を比較して示すグラフであり、ＮＣＲアッセイ（ＮＣＲ ａｓｓａｙ）がＰＣＲアッセイ（ＰＣＲ ａｓｓａｙ）よりほぼ１０４倍高い感度を示すことを確認できる。
【図1a】
【図1b】
【図1c】
【図1d】
【図1e】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12a】
【図12b】
【図12c】
【配列表】
【国際調査報告】