特表 2024-540300 新規な寒天分解細菌由来のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素及びこれを用いたＬ－ＡＨＧの産生方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-31

(54)【発明の名称】新規な寒天分解細菌由来のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素及びこれを用いたＬ－ＡＨＧの産生方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/42 20060101AFI20241024BHJP

   C12P 19/02 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20241024BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20241024BHJP

   C12N 15/56 20060101ALN20241024BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20241024BHJP

【ＦＩ】

C12N9/42 ZNA

C12P19/02

C12N1/20 A

C12N1/21

C12N15/56

C12N15/63 Z

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024526609

(86)(22)【出願日】2022-03-31

(85)【翻訳文提出日】2024-06-28

(86)【国際出願番号】 KR2022004631

(87)【国際公開番号】W WO2023080357

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】10-2021-0148524

(32)【優先日】2021-11-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524162756

【氏名又は名称】キョンプク ナショナル ユニバーシティ インダストリー－アカデミック コオペレーション ファンデイション

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100231902

【弁理士】

【氏名又は名称】吉田 李花

(72)【発明者】

【氏名】キム ヨン ホ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AF02

4B064CA21

4B064CB07

4B064CC06

4B064CC07

4B064CC24

4B064CD02

4B064DA01

4B064DA20

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA26X

4B065AA26Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA31

4B065CA44

4B065CA50

(57)【要約】

本発明は、寄託番号ＫＣＴＣ １３６２９ＢＰにて寄託された新規な寒天分解細菌セルビブリオ属菌（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）ＫＹ－ＧＨ－１由来のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）及び前記酵素を用いた３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（３，６－ａｎｈｙｄｒｏ－Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ， Ｌ－ＡＨＧ）の産生方法に関する。本発明の新規な寒天分解細菌セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１由来のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素は、ネオアガロビオースを基質として温度範囲とｐＨ範囲に大きく制限されることなくＬ－ＡＨＧを高い効率にて産生することができるので、発酵産業、食品産業、医薬品産業などに広範に活用することができるという抜群の効果がある。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１を含む、ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ，α－ＮＡＢＨ）。

【請求項2】

寄託番号ＫＣＴＣ １３６２９ＢＰであるセルビブリオ属菌（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）ＫＹ－ＧＨ－１菌株起源であることを特徴とする、請求項１に記載のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）。

【請求項3】

ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）遺伝子が取り込まれた大腸菌形質転換体から得られることを特徴とする、請求項２に記載のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）。

【請求項4】

前記ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）遺伝子は、発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）にクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）されて大腸菌に取り込まれることを特徴とする、請求項３に記載のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）をネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ， ＮＡ２）に処理して酵素的に分解する、３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（３，６－ａｎｈｙｄｒｏ－Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ， Ｌ－ＡＨＧ）の産生方法。

【請求項6】

前記処理は、２５～４５℃の温度範囲において行われることを特徴とする、請求項５に記載の３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（３，６－ａｎｈｙｄｒｏ－Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ， Ｌ－ＡＨＧ）の産生方法。

【請求項7】

前記処理は、ｐＨ ６．０～１０．０のｐＨ範囲において行われることを特徴とする、請求項５に記載の３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（３，６－ａｎｈｙｄｒｏ－Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ， Ｌ－ＡＨＧ）の産生方法。

【請求項8】

前記処理は、Ｍｎ^２＋をさらに加えて行われることを特徴とする、請求項５に記載の３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（３，６－ａｎｈｙｄｒｏ－Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ， Ｌ－ＡＨＧ）の産生方法。

【請求項9】

前記Ｍｎ^２＋は、ＭｎＣｌ_２、ＭｎＳＯ_４またはこれらの混合物の形態であることを特徴とする、請求項９に記載の３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（３，６－ａｎｈｙｄｒｏ－Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ， Ｌ－ＡＨＧ）の産生方法。

【請求項10】

前記処理は、トリス（２－カルボキシエチル）－ホスフィン（Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）－ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ， ＴＣＥＰ）をさらに加えて行われることを特徴とする、請求項５に記載の３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（３，６－ａｎｈｙｄｒｏ－Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ， Ｌ－ＡＨＧ）の産生方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、寄託番号ＫＣＴＣ １３６２９ＢＰにて寄託された新規な寒天分解細菌セルビブリオ属菌（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）ＫＹ－ＧＨ－１由来のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）及び前記酵素を用いた３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（３，６－ａｎｈｙｄｒｏ－Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ， Ｌ－ＡＨＧ）の産生方法に関する。

【背景技術】

【0002】

寒天は、海洋紅藻類から見つかる細胞壁多糖類であり、アガロースとアガロペクチンの２種類の成分の混合物である。アガロースは、α－１，３－連結された３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（Ｌ－ＡＨＧ）とβ－１，４－連結されたＤ－ガラクトースの交差的な残基から構成される。アガロペクチンは、同じ繰り返し単位を有しているが、Ｌ－ＡＨＧ残基の一部はＬ－ガラクトース硫酸で、かつ、Ｄ－ガラクトース残基の一部はピルビン酸アセタール４，６－Ｏ－（１－カルボキシエチリデン）－Ｄ－ガラクトースで置換されている。寒天は、微生物の分解に強い安定的なゲルマトリックスを形成するため、食品産業及び微生物の培養培地においてゲル化素材として広く用いられている。

【0003】

約１５属の海洋性細菌と７属の非海洋性細菌が寒天分解能を有しており、寒天を唯一の炭素源として用いることができる。寒天を炭素源として資化させるために、寒天分解細菌は、様々な寒天分解酵素の組み合わせ、すなわち、アガラーゼの組み合わせを有しており、これを通じて寒天を単糖類であるＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースとに加水分解する。アガラーゼは、切断方式に応じて２種類の類型に分ける。α－アガラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１５８）は、α－１，３－グリコシド結合を切断するのに対し、β－アガラーゼ（ＥＣ ３．２．１．８１）は、β－１，４－グリコシド結合を切断する。

【0004】

これまで報告されているアガラーゼは、そのほとんどが、アガロースを加水分解してネオアガロオリゴ糖（ｎｅｏａｇａｒｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ， ＮＡＯＳ）を産生するエンド型β－アガラーゼに属する。これに対し、アガロースを加水分解してアガロオリゴ糖（ａｇａｒｏｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ， ＡＯＳ）を生成するα－アガラーゼについての報告はほとんどない。炭水化物活性酵素（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ－Ａｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ， ＣＡＺｙｍｅ）データベースに収録された細菌性アガラーゼの間のアミノ酸配列の類似性を基準として、アガラーゼを互いに異なるグリコシド加水分解酵素（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｈｙｄｒｏｌａｓｅ， ＧＨ）ファミリーに分類することができる。すなわち、β－アガラーゼは、ＧＨ１６、ＧＨ５０、ＧＨ８６及びＧＨ１１８などの様々なＧＨファミリーに分類され、α－アガラーゼは、ＧＨ９６及びＧＨ１１７ファミリーに分類される。ＧＨ１６、ＧＨ８６及びＧＨ１１８β－アガラーゼは、それぞれネオアガロテトラオース（ＮＡ４）／ネオアガロヘキサオース（ＮＡ６）、ＮＡ６／ネオアガロオクタオース（ＮＡ８）及びＮＡ８／ネオアガロデカオース（ＮＡ１０）を産生するためにアガロースをエンド型加水分解方式により切断する。ＧＨ５０ファミリーβ－アガラーゼは、エンド型またはエキソ型アガロース分解活性を通じて最終生成物としてＮＡ２、ＮＡ４またはＮＡ２／ＮＡ４を産生する。ＧＨ９６α－アガラーゼは、アガロースを主としてＡ４に加水分解する。ＧＨ１１７ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）は、ＮＡ２をＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースに加水分解する。

【0005】

抗酸化剤、抗腫瘍、プレバイオティクス、抗炎症剤、抗糖尿病及び抗肥満、肌の補湿及び美白、抗齲蝕活性などのアガロース分解産物の様々な生物学的な活性は、アガロースの構成単糖類であるＬ－ＡＨＧの存在と関連があると推察される。しかしながら、Ｌ－ＡＨＧ生物学的な活性に対する直接的な証拠を提供可能な生体内研究に利用できる十分な量のＬ－ＡＨＧが未だ商業的に供給されていないが故に、Ｌ－ＡＨＧの商用化を可能にする量産技術の開発が切望されているのが現状である。

【0006】

アガロースからＬ－ＡＨＧを産生するために開発された最近の酵素工程は、アガロースをＮＡ２に分解した後、これをＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースに最終的に分解する目的で、ＧＨ５０ β－アガラーゼとＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨを共同処理する方法を採択している。このとき、アガロースを糖化させてＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースを産生するためには、アガロースをＮＡ２に効率よく加水分解するエキソ型ＧＨ５０β－アガラーゼのみならず、ＮＡ２に特異的に働いて単糖類Ｌ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに加水分解するＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨの開発が依然として必要であるのが現状である。

【0007】

先行研究において、本発明の発明者らは、セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１（ＫＣＴＣ １３６２９ＢＰ）菌株の全体のゲノム配列を分析して、アガロースをＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースに加水分解するアガラーゼを暗号化させる遺伝情報を探索した。ＫＹ－ＧＨ－１菌株は、～７７ｋｂ領域にわたって存在するアガラーゼ遺伝子クラスター内に３つのＧＨ５０ファミリーβ－アガラーゼ遺伝子（ＧＨ５０Ａ、ＧＨ５０Ｂ及びＧＨ５０Ｃ）と２つのＧＨ１１７ファミリーα－ＮＡＢＨ遺伝子（ＧＨ１１７Ａ及びＧＨ１１７Ｂ）を有していることが確認された。後続研究を行うことで、本発明の発明者らは、ＧＨ５０Ａ β－アガラーゼが３つの同位酵素（ｉｓｏｚｙｍｅｓ）の中で最も高いエキソ型β－アガラーゼ活性を発揮することを明らかにした。しかしながら、２つのＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨ同位酵素のうちのいずれがＮＡ２をＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースに加水分解する活性がさらに強いかについては未だに判明されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、上記のような従来の技術の問題を解決するために案出されたものであって、本発明が解決しようとする課題は、ＮＡ２からＬ－ＡＨＧの産生に必要な効率よいα－ＮＡＢＨを開発し、これを用いてＬ－ＡＨＧを高い効率にて産生する方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0009】

上記のような課題を解決するために、本発明は、配列番号１を含むＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）を提供する。

【0010】

前記ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）は、寄託番号ＫＣＴＣ １３６２９ＢＰであるセルビブリオ属菌（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）ＫＹ－ＧＨ－１菌株起源であることが好ましい。

【0011】

前記ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）は、ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）遺伝子が取り込まれた大腸菌形質転換体から得られることが好ましい。

【0012】

前記ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）遺伝子は、発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）にクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）されて大腸菌に取り込まれることが好ましい。

【0013】

また、本発明は、前記ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）をネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ， ＮＡ２）に処理して酵素的に分解する３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（３，６－ａｎｈｙｄｒｏ－Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ， Ｌ－ＡＨＧ）の産生方法を提供する。

【0014】

前記処理は、２５～４５℃の温度範囲において行われることが好ましい。

【0015】

前記処理は、ｐＨ ６．０～１０．０のｐＨ範囲において行われることが好ましい。

【0016】

前記処理は、Ｍｎ^２＋をさらに加えて行われることが好ましい。

【0017】

前記Ｍｎ^２＋は、ＭｎＣｌ_２、ＭｎＳＯ_４またはこれらの混合物の形態であることが好ましい。

【0018】

前記処理は、トリス（２－カルボキシエチル）－ホスフィン（Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）－ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ， ＴＣＥＰ）をさらに加えて行われることが好ましい。

【発明の効果】

【0019】

本発明の新規な寒天分解細菌セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１由来のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素は、ネオアガロビオースを基質として温度範囲とｐＨ範囲に大きく制限されることなくＬ－ＡＨＧを高い効率にて産生することができるので、発酵産業、食品産業、医薬品産業などに広範に活用することができるという抜群の効果がある。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１のＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ及びＧＨ１１７Ｂ β－ＮＡＢＨのアミノ酸配列を比較したものである。アミノ酸配列は、クラスタルＸ［Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ． ２００７］を用いて同一性が最大限に現れるように「開いた」読み枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を整列しており、このとき、各アミノ酸は、単一の文字の略語にて示した。２つの配列の間の同一の残基は、配列の上端に星印にて目印を付けている。各アミノ酸残基は、クラスタルＸ色構成表を用いて強調している。欠損は、ダッシュにて目印を付けている。

【図2】Ｅ． ｃｏｌｉ発現システムにおいて発現された組換えＨｉｓタグ付きＧＨ１１７Ａ及びＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨのＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動及び薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析によるＮＡ２－加水分解活性を検定した結果である。（Ａ）Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体を０．１２５ｍＭ ＩＰＴＧの存在下で培養して組換えＨｉｓタグ付きＧＨ１１７ＡもしくはＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨ酵素タンパク質の合成を誘導した後、細胞を回収して総分画、可溶性分画及び不溶性分画に分画した。次いで、同一の量の各分画を取って電気泳動した。（Ｂ）精製された組換えＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ及びＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨのＳＤＳ－ＰＡＧＥ。電気泳動レーン；ＳＭ、予め染色されたタンパク質サイズマーカー；Ｃｒｕｄｅ ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ及びＣｒｕｄｅ ＧＨ１１７Ａ β－ＮＡＢＨ、それぞれＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ及びＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨを発現する大腸菌形質転換体から得た可溶性分画；精製されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ及び精製されたＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨ、ニッケル－ニトリロ三酢酸（Ｎｉ－ＮＴＡ）精製システムにより精製された組換えＨｉｓタグ付き酵素。（Ｃ－Ｅ）材料及び方法に記載されているように、それぞれの精製された組換え酵素タンパク質にて０．４％のＮＡ２または１．０％のＮＡＯＳを処理した後、各酵素反応物をＴＬＣにより分析した。図２には、代表的な結果を示しており、２回の追加の実験においてもほとんど同じ結果が示された。

【図3】標準品ＮＡ２、ＮＡ４またはＮＡ６をＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素処理して得た加水分解産物のＴＬＣ分析結果を示す。ＮＡ２（０．４％）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）及び精製されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ（１０μｇ／ｍＬ）を混合して反応させた。同一の量の各個別の酵素反応物を取ってＴＬＣにより分析した。標準品Ｄ－ガラクトースはシグマアルドリッチ社から、かつ、標準品ＮＡ２、ＮＡ４、ＮＡ６などはカルボシンス（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）社（イギリスのバークシャー州）から購入した。Ｌ－ＡＨＧは、ＮＡ２をＧＨ１１７Ａ β－ＮＡＢＨ酵素にて処理して加水分解した後、これから精製して用いた。図３には代表的な結果を示しており、２回の追加の実験においても略同じ結果が示された。

【図4】ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨによる基質ＮＡ２の時間ごとの処理による加水分解生成物のＴＬＣ及び液体クロマトグラフ質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による分析結果を示す。（Ａ）ＮＡ２（０．４％）と５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）において精製されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ（１０μｇ／ｍＬ）とともに混合した後、指定された時間の間に３５℃において反応させた。次いで、同一の量の各酵素反応物をＴＬＣにより分析した。（Ｂ）各酵素反応物のＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる分析は、材料及び方法の欄において解説された通りに行った。図４には代表的な結果を示しており、２回の追加の実験においても略同じ結果が示された。

【図5】セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨのアミノ酸配列とＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて確保した９個のＧＨ１１７ファミリーα－ＮＡＢＨの多重アミノ酸配列を比較したものである。（Ａ）アミノ酸は、クラスタルＸを用いて最大限の同一性が現れるように「開いた」読み枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）を整列しており、このとき、各アミノ酸を単一の文字の略語にて示した［Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ． ２００７］。すべての配列の間の同一の残基は、配列の上端に星印にて目印を付けている。保存的な置換はコロンにて、反保存的な置換は点にて目印をつけており、各残基はクラスタルＸ色構成表にて強調した。欠損はダッシュにて目印を付けている。（Ｂ）セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨと９個の関連するＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨとの間の系統学的な関係は、アミノ酸配列の類似性に基づいている。根付き系統樹は、非加重結合法（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ Ｐａｉｒ Ｇｒｏｕｐ Ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ Ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ｍｅａｎ，ＵＰＧＭＡ）［Ｓｎｅａｔｈ ａｎｄ Ｓｏｋａｌ １９７３］により構成した。ノードの数字は、ブートストラップの発生レベルである。５０％以上の値のみを示した。目盛り付き棒は、５０個のヌクレオチド当たりに１つの置換を示す。

【図6】精製されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの分子体クロマトグラフィー分析結果を示す。（Ａ）精製されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの分子体クロマトグラフィープロファイルは、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含有する４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）により平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標名）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムを用いて行った。このとき、５００μｇ ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨを含有するタンパク質溶液をカラムに注入し、カラムは、０．３ｍＬ／ｍｉｎの流速にて４℃において溶出し、タンパク質溶出プロファイルは、２８０ｎｍにおける吸光度を測定してモニターリングした。（Ｂ）精製されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの分子量の測定のためには、同じカラム溶出条件下で次のような分子量サイズマーカータンパク質を用いた：位置ａ、フェリチン（４４０ｋＤａ）；位置ｂ、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）；位置ｃ、卵アルブミン（４４ｋＤａ）；位置ｄ、リボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）。ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの溶出ピーク位置は矢印にて目印を付けている。

【図7】ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの生化学的な特性を示す。（Ａ，Ｂ）酵素活性に対する温度及びｐＨの影響は、０．４％のＮＡ２及び１０μｇ／ｍＬの精製されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨを用いて測定した。各値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３、各実験当たりに３回繰り返す）にて示した。（Ｃ，Ｄ）精製されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの温度及びｐＨ安定性は、個別のｐＨまたは温度において酵素を４時間かけて処理した後に調べた。各値は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝３、各実験当たりに３回繰り返す）にて示した。（Ｅ）精製されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨのＫｍ及びＶｍａｘ値に対するラインウィーバー・バークプロットは、示された濃度の酵素及び基質ＮＡ２を用いて調べた。図７には代表的な結果を示しており、２回の追加の実験においても略同じ結果が示された。

【図8】ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ活性に対する金属イオン、還元剤及びキレート剤の効果を示す。ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素活性に及ぼす金属イオン、ＳＨ還元剤ＴＣＥＰ（トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）及びキレーターＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）の５ｍＭ濃度における個別の効果（Ａ）及び５ｍＭ ＭｎＳＯ_４／５ｍＭ ＴＣＥＰの共同処理効果または５ｍＭ ＭｎＳＯ_４／１０ｍＭ ＴＣＥＰの共同処理効果を測定するために、精製された酵素（１０μｇ／ｍＬ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）、０．４％のＮＡ２と混合した後、３５℃において３０分間処理した。このとき、色々なイオンと試薬を処理せずに測定した酵素活性を１００％と定義した。各値は、平均±ＳＤ（ｎ＝３、各実験当たりに３回繰り返して測定）にて示した。＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１。

【図9】ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素により触媒されたＮＡ２のＬ－ＡＨＧ／Ｄ－ガラクトースへの完全な加水分解及び加水分解生成物からのＳｅｐｈａｄｅｘ（商標名）Ｇ－１０カラムクロマトグラフィーを用いたＬ－ＡＨＧの精製を示す。（Ａ）ＮＡ２（２．０～５．０％）を最適な反応条件（５ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び１０ｍＭ ＴＣＥＰ、３５℃、ｐＨ ７．５）下でＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ（４０μｇ／ｍｌ）にて１４時間かけて処理した後、ＮＡ２の加水分解によるＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースへの転換を確認するためにＴＬＣ分析を行った。（Ｂ）ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素により触媒されたＮＡ２の加水分解生成物からＬ－ＡＨＧを回収するために、４．０％のＮＡ２（１０ｍｌ）をＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素（２０μｇ／ｍｌ）にて最適な条件下で１４時間かけて処理した後、凍結乾燥させた。凍結乾燥された試料を３次蒸留水に溶かした後、これをＳｅｐｈａｄｅｘ（商標名）Ｇ－１０カラムを用いて分子体クロマトグラフィーにより分画した。各分画中のＬ－ＡＨＧの存否は、ＴＬＣにより分析した。図９には代表的な結果を示しており、２回の追加の実験においても略同じ結果が示された。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、本発明について詳しく説明する。

【0022】

本発明においては、Ｅ． ｃｏｌｉ発現システムとｐＥＴ－３０ａベクタープラスミドを用いて得た組換えタンパク質ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨとＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨの酵素活性を比較した。その結果として、ＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨに比べてＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの方が二糖類であるＮＡ２を単糖類であるＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースに加水分解する酵素活性が遥かに高いことを確認した。また、最適な反応条件下でＮＡ２基質をＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトース生成物に転換するＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素（配列番号１の塩基配列または配列番号２のアミノ酸配列参照）の効率性を調べた。

【0023】

したがって、本発明は、配列番号１を含むＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）を提供する。

【0024】

前記ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）は、寄託番号ＫＣＴＣ １３６２９ＢＰであるセルビブリオ属菌（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）ＫＹ－ＧＨ－１菌株起源であることが好ましい。

【0025】

前記ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）は、ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）遺伝子が取り込まれた大腸菌形質転換体から得られることが好ましい。

【0026】

前記ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）遺伝子は、発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）にクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）されて大腸菌に取り込まれることが好ましい。

【0027】

また、本発明は、前記ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素（ＧＨ１１７Ａ α－ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅ， α－ＮＡＢＨ）をネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ， ＮＡ２）に処理して酵素的に分解する３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトース（３，６－ａｎｈｙｄｒｏ－Ｌ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ， Ｌ－ＡＨＧ）の産生方法を提供する。

【0028】

前記処理は、２５～４５℃の温度範囲において行われることが好ましい。

【0029】

前記処理は、ｐＨ ６．０～１０．０のｐＨ範囲において行われることが好ましい。

【0030】

前記処理は、Ｍｎ^２＋をさらに加えて行われることが好ましい。

【0031】

前記Ｍｎ^２＋は、ＭｎＣｌ_２、ＭｎＳＯ_４またはこれらの混合物の形態であることが好ましい。前記ＭｎＣｌ_２、ＭｎＳＯ_４またはこれらの混合物の濃度は、１～１０ｍＭ、好ましくは、３～８ｍＭ、より好ましくは、４～６ｍＭ、最も好ましくは、５ｍＭであってもよい。

【0032】

前記処理は、トリス（２－カルボキシエチル）－ホスフィン（Ｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）－ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ， ＴＣＥＰ）をさらに加えて行われることが好ましい。前記ＴＣＥＰの濃度は、１～１０ｍＭ、好ましくは、３～８ｍＭ、より好ましくは、４～６ｍＭ、最も好ましくは、５ｍＭであってもよい。

【0033】

以下では、具体的な実施例を挙げて本発明についてさらに詳しく説明する。下記の実施例は、本発明の好適な一つの具体例を記載したものであり、下記の実施例に記載されている事項によって本発明の権利範囲が限定されて解釈されるものではないということは明らかである。

【実施例】

【0034】

１．材料及び方法
１．１．材料
制限酵素（ＮｅｄＩ及びＸｈｏＩ）及びＴ４リガーゼはロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社（スイスバーゼル）から購入した。ナフトレソルシノール、Ｄ－ガラクトース、イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、３，５－ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）Ｒ－２５０、カナマイシンはシグマアルドリッチ社（アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）から購入した。Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ（商標名）キットはピアース（Ｐｉｅｒｃｅ社）（アメリカ合衆国イリノイ州ロックフォード）から購入し、蛍光表示器Ｆ２５４によりコーティングされたシリカゲル６０アルミニウム薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレートはメルク（Ｍｅｒｃｋ）社（ドイツのダルムシュタット）から購入した。ＰａｇｅＲｕｌｅｒ（商標名）Ｐｒｅ－ｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ及びＮｉ－ＮＴＡ ｒｅｓｉｎはサーモフィッシャーサイエンティフィック社（アメリカ合衆国イリノイ州ロックフォード）から購入した。Ｃ－末端６ｘＨｉｓタグ付きタンパク質の発現のためのベクターｐＥＴ－３０ａはＥＭＤミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社（アメリカ合衆国マサチューセッツ州ビレリカ）から購入し、Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）はノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社（アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソン）から購入した。Ｂｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ－２はバイオ・ラッド・ラボラトリーズ社（アメリカ合衆国カリフォルニア州ハーキュリーズ）から購入し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標名）Ｇ－１０はＧＥヘルスケアバイオサイエンスＡＢ（スウェーデンウプサラ）から購入した。ＮＡ２～ＮＡ１８を含むネオアガロオリゴ糖（ＮＡＯＳ）混合物はシンラ（新羅）大学のイ・サンヒョン博士から提供された［Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００８］。先行研究において先に報告した通り、ネオアガロビオース（ｎｅｏａｇａｒｏｂｉｏｓｅ， ＮＡ２）は、組換えＧＨ５０Ａ β－アガラーゼにて処理して生成されたアガロース加水分解物から精製した［Ｋｗｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０２０］。すなわち、加水分解物を凍結乾燥させた後、３次蒸留水に溶かし、Ｂｉｏ－Ｇｅｌ Ｐ－２カラムを用いて分子体クロマトグラフィーを行った。カラムを３次蒸留水（ＤＩ）で溶出させた後、各分画をＴＬＣにより分析してＮＡ２のみを含有する分画のみを回収し、これを凍結乾燥させてＮＡ２粉末を得た。標準品ＮＡ２、ＮＡ４及びＮＡ６は、カルボシンス（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）社（イギリスのバークシャー州）から購入した使用した。

【0035】

１．２．Ｅ． ｃｏｌｉ発現システムを用いたＧＨ１１７Ａ及びＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨ遺伝子のクローニング及び発現
セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１の２種類のＧＨ１１７ファミリーα－ＮＡＢＨ遺伝子は、ＮｄｅＩ－順方向プライマー（ＧＨ１１７Ａの場合、５’－ＣＧＣＡＴＡＴＧＧＧＴＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＡ－３’（配列番号３）；ＧＨ１１７Ｂの場合、５’－ＧＡＣＡＴ－ＡＴＧＡＧＣＧＡＣＣＡＡＧＡＴＴＣＴＧ－３’（配列番号４））及びＸｈｏＩ－逆方向プライマー（ＧＨ１１１７Ａの場合、５’－ＡＡＣＴＣＧＡＧＧＧＡＴ－ＧＣＴＡＣＡＴＴＣＴＧＡＡＡＧＧ－３’（配列番号５）；ＧＨ１１７Ｂの場合、５’－ＧＧＣＴＣＧＡＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＴＴＴＴＣＴＡＧＣＴＴ－３’（配列番号６））を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）方法により遺伝体ＤＮＡから増幅させた。増幅されたＰＣＲ産物を精製し、ＮｅｄＩ／ＸｈｏＩにて処理した後、Ｔ４リガーゼを用いてｐＥＴ－３０ａ発現ベクターに連結した。組換えｐＥＴ－３０ａプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。このとき、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ遺伝子またはＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨ遺伝子を含有する形質転換体は、ＬＢ／カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）寒天プレートにおいて３０℃において一晩中培養した後に選び抜いた。組換えＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨもしくはＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨの発現の誘導は、先に説明された通りに行った［Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０］。すなわち、各形質転換体は、２５℃においてＬＢ／カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）培地において培養した後、ＯＤ_６００が０．５～０．６に達したときに０．１５ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－チオガラクトピラノシド）を加え、これを２５℃において３時間かけてさらに培養して組換えＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨタンパク質の合成を誘導した。

【0036】

１．３．シーケンス分析及び系統樹の構成
９個のＧＨ１１７ファミリーα－ＮＡＢＨのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を用いたＢＬＡＳＴ検索により獲得した。個別のオープンリーディングフレームのアミノ酸配列はクラスタルＸ［Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７］。保存されたアミノ酸残基は、クラスタルＸ色構成表を用いて強調表示をした。ＵＰＧＭＡを用いてアミノ酸配列の類似性に基づいて個別のＧＨ１１７ファミリー構成員を含む根付き系統樹を構成した［Ｓｎｅａｔｈ ａｎｄ Ｓｏｋａｌ， １９７３］。

【0037】

１．４．細胞溶解物、タンパク質の定量及びドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）
形質転換体により生成された組換え酵素タンパク質を分離しかつ確認するために、細胞を４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ８．０）に懸濁させ、１０秒間２０回の超音波処理により破砕し、４℃において３０分間抽出した後、総分画、可溶性分画及び不溶性分画の３つの分画に分けた［Ｊｕｎ ｅｔ ａｌ．， １９９６］。細胞溶解物のタンパク質の定量は、Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡ（商標名）キット（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅｓ）社製、アメリカ合衆国イリノイ州ロックフォード）を用いて行った。同一の量の細胞溶解物（１０μｇ）をラエムリ方法［Ｌａｅｍｍｌｉ， １９７０］に準拠して８％のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動した。電気泳動の後にゲルをＣＢＢ Ｒ－２５０（クマシーブリリアントブルーＲ－２５０）により染色してタンパク質バンドを検出した。電気泳動ゲル上において特定の組換えタンパク質の濃度を定量するために、ゲル上の組換えタンパク質バンドの密度を測定した後、その測定された単位を、同一のゲル上において検出される連続して希釈されたウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のバンドの密度測定単位として確保した標準曲線と比較した。このとき、ゲル上のタンパク質バンドの密度の測定は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ（商標名）ＴＬソフトウェア（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社製、アメリカ合衆国イリノイ州アーリントンハイツ）を用いて行った［Ｓｙｒｏｖｙ ａｎｄ Ｈｏｄｎｙ， １９９１］。

【0038】

１．５．組換えＨｉｓタグ付きα－ＮＡＢＨの精製
組換えＨｉｓタグ付きＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨまたはＨｉｓタグ付きＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨを精製するために、まず、可溶性の形態の組換えＨｉｓタグ付きＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨまたは組換えＨｉｓタグ付きＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨを含有するＥ． ｃｏｌｉ形質転換体の細胞溶解物の可溶性分画を確保した。これらの可溶性分画に含有されている組換え酵素タンパク質は、Ｎｉ－ＮＴＡレジンを用いた固定化金属イオン親和性のクロマトグラフィー方法により精製した［Ｓｐｒｉｅｓｔｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１５］。

【0039】

１．６．分子体クロマトグラフィーによるＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの分子量の測定
分子体クロマトグラフィーは、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）及び１５０ｍＭ ＮａＣｌにより平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標名）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社製）を用いて行った。精製されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ（０．５ｍｇ／０．５ｍＬ）をカラムに注入し、分子体クロマトグラフィーの条件下で４℃において０．３ｍＬ／ｍｉｎの流速にて行われ、タンパク質の溶出は、２８０ｎｍの波長において測定した。カラムは、フェリチン（４４０ｋＤａ）、アルドラーゼ（１５８ｋＤａ）、卵アルブミン（４４ｋＤａ）及びリボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）のようなサイズマーカーを用いてタンパク質の分子量に比べての保持容量の標準曲線を確保し、これを基準として精製されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ分子量を測定した。

【0040】

１．７．ＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨの活性分析
ＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨの活性は、ＤＮＳ方法［Ｍｉｌｌｅｒ， １９５９］を用いてＮＡ２から放出された還元糖を検出することにより測定した。ＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨの活性を測定するために、精製された酵素溶液（～２μｇ／１００μｌ）を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）に溶解された同じ体積の０．８％のＮＡ２と混合した。３５℃において３０分間反応させた後、反応混合物において形成された還元糖をＤＮＳ試薬を用いて発色させて測定した。酵素活性の１単位は、１分当たりに１μｍｏｌのＤ－ガラクトースに相当する還元力を生成する酵素の量と定義した。ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの酵素反応速度定数は、ＮＡ２の基質溶液（１～１０ｍｇ／ｍｌ， ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ ７．５）に定められた量の酵素を加えて測定した。Ｋｍ及びＶｍａｘ値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８統計パッケージ（グラフパッドソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）社製、アメリカ合衆国）を用いてラインウィーバー・バーク方程式において計算した。

【0041】

１．８．薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）

【0042】

ＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨを処理したＮＡ２加水分解物のＴＬＣ分析は、ＳｉｌｉｃａＧｅｌ ６０アルミニウムプレートにおいて行われ、ｎ－ブタノール－エタノール－Ｈ_２Ｏ［３：２：２（ｖ／ｖ）］溶媒を用いて展開した。ＴＬＣ上の糖物質の確認のために、エタノールに０．２％（ｗ／ｖ）のナフトレソルシノール（シグマアルドリッチ社製）と１０％（ｖ／ｖ）のＨ_２ＳＯ_４を加えた発色溶液をＴＬＣ板に吹き付けた後、８０℃において加熱して検出した。

【0043】

１．９．サイズ排除カラムクロマトグラフィーによるＬ－ＡＨＧの精製
ＮＡ２加水分解産物からＬ－ＡＨＧを精製するために、ＮＡ２をＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨにより最適な反応条件（５ｍＭ ＭｎＳＯ_４， １０ｍＭ ＴＣＥＰ ３５℃， ｐＨ ７．５）下で１４時間かけて処理した後、酵素反応物を凍結乾燥させた。凍結乾燥された試料を３次蒸留水（ＤＩ）に溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標名）Ｇ－１０カラム（Ｉ．Ｄ．１．３ｘ９０ｃｍ）を用いて分子体クロマトグラフィーを行った。カラムを蒸留水（ＤＩ）に溶出しながら、２ｍＬにて各分画を収集した。Ｌ－ＡＨＧを含有する分画をＴＬＣにより測定して確認して回収し、凍結乾燥させた。

【0044】

１．１０．タンダム質量分析法（液体クロマトグラフ質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ））を用いた液体クロマトグラフィーによる酵素反応生成物の確認
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、超高速高分離液体クロマトグラフ（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓ）コアシステム（ウォーターズ社製、アメリカ合衆国マサチューセッツ州ミルフォード）付きエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）イオンソースと接続したＸｅｖｏ ＴＱ－Ｓマイクロ質量分析計を用いて行った［Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１６； Ｋｏｔｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１３］。試料の溶出は、溶媒流速２００μＬ／ｍｉｎ及び４０℃に保持したＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ ａｍｉｎｏカラム（２ｍｍ×１００ｍｍ、３μｍ粒子径）を用いて行った。ＬＣシステムは、（Ａ）０．１％のホルム酸水溶液と（Ｂ）０．１％のアセトニトリルから構成した。基質ＮＡ２の酵素加水分解物においてＤ－ガラクトースとＬ－ＡＨＧを確認するために、まず、クロマトグラフィーは、Ａ：Ｂを９５：５の割合にて混合した溶媒から開始して３分間行い、Ａ：Ｂの勾配を漸進的に変更してクロマトグラフィーの開始後の１３分には７５：２５の割合になるようにし、１５分に至るまではＡ：Ｂの７５：２５の割合を保持した。次いで、Ａ：Ｂの割合がクロマトグラフィーの開始後の１６分には再び初期状態である９５：５に変更されるようにしてクロマトグラフィーの開始後の３０分でクロマトグラフィーを止めるまでこの割合を保持した。注入量は５μＬであり、サンプルマネージャーの温度は５℃に設定した。質量分析計検出器の条件は、次のように設定した：毛細管電圧、２．０ｋＶ；コーン電圧、２０Ｖ；ソース温度、１５０℃；脱溶媒温度、２５０℃；脱溶媒ガスの流れ、５５０ｍ／ｈ；コーンガスの流れ、５Ｌ／ｈ；質量範囲、１００～８００。

【0045】

１．１１．統計分析
別に断りのない限り、データは、最小限に３回の独立した実験を用いて示した。すべてのデータは、平均±標準偏差（ＳＤ、各グループｎ≦３に対して）にて書き表わした。統計分析は、スチューデントのｔ検定を用いて２つのグループの間の差と一元分散分析の有意性を評価した後、ダネットの多重比較事後テストを用いて３つ以上のグループを比較した。Ｐ値＜０．０５は、統計的な有意性を示す。統計分析は、ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓバージョン２３（ＩＢＭ社製、アメリカ合衆国ニューヨーク州アーモンク）を用いて行った。

【0046】

２．結果
２．１．セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１由来ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨｓ及びＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨ酵素のＥ． ｃｏｌｉ及びｐＥＴ－３０ａベクターシステムを用いたＣ－末端Ｈｉｓタグ付き組換えタンパク質としての発現
本発明の発明者らは、先行研究においてセルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１の全体のゲノム配列の分析を行うことで、２つのＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨ遺伝子（α－ＣｖＮａｂｈ１１７Ａ及びα－ＣｖＮａｂｈ１１７Ｂ）の存在を確認した。図１に示されているように、α－ＣｖＮａｂｈ１１７Ａは、４０．９ｋＤａタンパク質（ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ）を構成する３６４個のアミノ酸を暗号化させる「開いた」読み枠（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ；ＯＲＦ）を有しているのに対し、α－ＣｖＮａｂｈ１１７Ｂは、４４．２ｋＤａタンパク質（ＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨ）を構成する３９２個のアミノ酸を暗号化させる「開いた」読み枠（ＯＲＦ）を有していることが示された。このとき、α－ＣｖＮａｂｈ１１７ＡのＯＲＦ塩基配列は、α－ＣｖＮａｂｈ１１７Ｂのものと５３％の類似性を示し、アミノ酸配列は、相互間に３５％の類似性を示した。このことは、セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１菌株が有している２つのＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨｓの間には、相同性が高くないことを示す。一方、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨとＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨ酵素タンパク質の両方には、Ｎ－末端信号ペプチド配列が存在しないため、このことは、２つの酵素が両方ともセルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１菌株の細胞の内部、すなわち、細胞質において機能することができることを示唆する。

【0047】

本発明においては、このようなデータに基づいて２つの酵素を大腸菌発現システムを用いて組換えＨｉｓタグ付き酵素タンパク質として過発現させかつ精製し、これらの精製された組換えＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨまたは組換えＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨのうちのどちらがＮＡ２に対してさらに高い酵素活性を有するか、かつ、さらに選択的な酵素活性を有するかを調べた。組換えＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨまたはＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨを発現する各Ｅ． ｃｏｌｉ形質転換体の酵素タンパク質の発現をＩＰＴＧ処理により誘導した後、細胞を回収し、超音波破砕して総分画、可溶性分画及び不溶性分画を得た。各分画の同一の量を取って８％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルにおいて電気泳動した後、ゲルをＣＢＢにより染色してタンパク質バンドを確認することにより各組換え酵素の可溶性／不溶性の割合を調べた。図２のａに示されているように、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ及びＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨは、両方とも形質転換細胞の可溶性分画において優勢的に検出され、不溶性封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ）分画において検出される各組換え酵素の量は有意ではなかった。Ｎｉ－ＮＴＡ精製システムを用いてＨｉｓタグ付きＧＨ１１７Ａ及びＧＨ１１７Ｂ酵素を細胞可溶性分画において精製したとき、８％のＳＤＳ－ＰＡＧＥにおいて単一のタンパク質バンドとして検出された（図２のｂ）。精製された組換えＧＨ１１７Ａ及びＧＨ１１７Ｂ酵素タンパク質の分子量（ＭＷ）を電気泳動ゲル上のサイズマーカーと比較したとき、組換えＧＨ１１７Ａ酵素タンパク質は～３９．０ｋＤａ、そしてＧＨ１１７Ｂ酵素タンパク質は～４４．８ｋＤａであることが確認された。

【0048】

ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨとＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨのＮＡ２加水分解活性をＴＬＣにより調べたとき、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨは、ＮＡ２をＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに完全に加水分解するのに対し、ＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨは、ＮＡ２の加水分解に失敗した（図２のｃ）。ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨとＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨの基質特異性の差をさらに調べるために、基質（ＮＡ２～ＮＡ１８のＮＡＯＳ混合物）を各酵素により時間ごとに処理しながら、反応時間に伴う分解生成物をＴＬＣにより分析した。その結果、ＮＡ２～ＮＡ１８のＮＡＯＳ混合物のうち、ＮＡ２の場合にのみＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ処理により加水分解されてＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに転換され、ＮＡ２加水分解は、酵素反応が開始される時点から始まってＬ－ＡＨＧの生成量が６０分の反応期間の間に増え続けた（図２のｄ）。しかしながら、同じ条件下でＮＡ４～ＮＡ１８は、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨにより分解されなかった。このことは、ＮＡＯＳ（ＮＡ２～ＮＡ１８）のうち、ＮＡ２がＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ加水分解作用に特化した唯一の基質であることを示す。一方、ＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨは、ＮＡＯＳ（ＮＡ２～ＮＡ１８）混合物のうちのいずれも加水分解することができないことが示された（図２のｅ）。ＮＡ２がＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ加水分解作用の唯一の基質であることを確認するために、標準品ＮＡ２、ＮＡ４またはＮＡ６をそれぞれ酵素にて処理し、個別の加水分解物をＴＬＣにより分析した。その結果、ＮＡ２は、Ｌ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに完全に分解されたが、ＮＡ４とＮＡ６は分解されなかったことが示され、ＮＡ２がＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ触媒作用の唯一の基質であることを確定した（図３）。

【0049】

また、ＴＬＣ分析の結果、０．４％のＮＡ２を精製された組換えＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨ（１０μｇ／ｍｌ）をもって５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ ７．５）、３５℃において処理したとき、ＮＡ２の加水分解が反応時間に正比例して増加し、反応時間６０分には単糖類に完全に転換されることが確認された（図４のａ）。併せて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで、酵素の加水分解作用により時間依存的にＮＡ２がＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに転換されることをさらに証明した（図４のｂ）。これらの結果は、ＫＹ－ＧＨ－１菌株においてＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨがアガロース糖化の最終の酵素段階であるＮＡ２のＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースへの加水分解に欠かせない必須的な酵素であることを裏付ける。

【0050】

２．２．ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨのアミノ酸配列と他の菌株由来の関連酵素のアミノ酸配列との比較
ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨのアミノ酸配列をクラスタルＸプログラムを用いて他の寒天分解細菌由来のＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨのアミノ酸配列と比較分析した［Ｌａｒｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， ２００７］。図５のａに示されているように、セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿１５１０３０３１９．１）は、セルビブリオ属菌ＫＹ－ＹＪ－３ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿１５１０５７２７６．１）と９７．５％の類似性を示した。また、ＫＹ－ＧＨ－１ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨは、セルビブリオ属菌パールリバー（ｐｅａｌｒｉｖｅｒ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０４９６２９４１２．１）［Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．， ２０１７］、セルビブリオ属菌ＢＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿００７６４０７３８．１）及びセルビブリオ属菌ＯＡ－２００７（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０６２０６５０１５．１）［Ｓｙａｚｎｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１５］と９７．３％、９７．３％、９６．７％の類似性を示した。このことは、セルビブリオ属菌ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの間には高いレベルの相同性があることを示す。

【0051】

一方、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨのアミノ酸配列は、アグロバクテリウム・ハリオティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｉｏｔｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０９６０８５２１５．１）、ギルビマリヌス・ポリサッカロリティカス（Ｇｉｌｖｉｍａｒｉｎｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０４９７２０９８０．１）、ギルビマリヌス・チネンシス（Ｇｉｌｖｉｍａｒｉｎｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０２０２０８６８０．１）、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿１７１９３４１５０．１）及びビブリオ属菌ＥＪＹ３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号０１４２３２１９４．１）のＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨのアミノ酸配列とは、それぞれ７７．５％、７７．４％、７７．２％、７６．８％及び７６．５％の類似性を示した。

【0052】

個別のＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの根付きの系統樹において、セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨは、海洋性アグロバクテリウム・ハリオティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｉｏｔｉｓ）、ギルビマリヌス・ポリサッカロリティカス（Ｇｉｌｖｉｍａｒｉｎｕｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ギルビマリヌス・チネンシス（Ｇｉｌｖｉｍａｒｉｎｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）及びビブリオ属菌ＥＪＹ３由来のＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨに比べて非海洋性環境下で分離されたセルビブリオ属菌ＫＹ－ＹＪ－３、セルビブリオ属菌パールリバー、セルビブリオ属菌ＢＲ及びセルビブリオ属菌ＯＡ－２００７のＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨｓとさらに密接にグループ化された（図５のｂ）。

【0053】

ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨｓの同族体（ｈｏｍｏｌｏｇｓ）が高いレベルのアミノ酸配列の相同性にてすべての寒天分解細菌に存在するということを示す現在の分析結果は、ＮＡ２基質のα－１，３－結合を加水分解して単糖類であるＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースを産生する酵素であるＧＨ１１７Ａ β－ＮＡＢＨが寒天分解細菌が有しているアガロースの糖化工程において欠かせない必須的な構成酵素であることを示唆する。

【0054】

２．３．ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの酵素学的特性
いくつかのＧＨ１１７ファミリーα－ネオアガロオリゴ糖加水分解酵素（α－ＮＡＯＳＨ）とα－ＮＡＢＨが細胞質の内部に存在せよ、細胞の外部に存在せよ、いずれにせよ、二量体の形態で存在しながら酵素機能を行うことが報告された。この研究において、Ｅ． ｃｏｌｉ発現システムを用いて産生した組換えＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの場合であっても、二量体の形態でＮＡ２をＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに加水分解するか否かを確認するために、精製された組換えＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの分子量をＳｕｐｅｒｄｅｘ（商標名）２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラムを用いた分子体クロマトグラフィーにより測定した。

【0055】

その結果、測定されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの分子量は、９２．１ｋＤａであることが示された（図６）。３６４個のアミノ酸から構成されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの計算された分子量は４０．９ｋＤａであり、これは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により推定されるＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ分子量（～３９．０ｋＤａ）と一致するため、分子体クロマトグラフィーデータは、精製されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨが二量体として存在することを示す。

【0056】

ＮＡ２からＬ－ＡＨＧを量産するに当たって、組換えＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの有効性をきわめるために、酵素特性を調べた。ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素活性に及ぼす温度の影響を調べたとき、３５℃において最も高い活性を示した（図７のａ）。２５～４５℃の範囲を外れた温度において最大の活性度の５０％未満が保持された。酵素は、６．０～１０．０（最適なｐＨ ７．５）のかなり広いｐＨ範囲において活性を示した（図７のｂ）。酵素は、３５℃まで安定的であった。しかしながら、４０℃において４時間かけて処理した後、最大の活性の４０％しか保持されず、４５℃以上の温度において４時間かけて処理した後には、ほとんどの酵素活性を失った（図７のｃ）。ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨは、７．０～７．５のｐＨ範囲において安定的であったものの、６．０未満の酸性ｐＨにおいては速やかに不活性となり、ｐＨ ８．０～１０．０においては４時間かけての処理の後に５０～６０％の活性を保持した。このような観察結果は、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨが酸性ｐＨよりもアルカリ性ｐＨにおいてさらに安定していることを示す（図７のｄ）。基質ＮＡ２に対するＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの酵素反応速度定数であるＫｍ、Ｖｍａｘ、Ｋｃａｔ及びＫｃａｔ／Ｋｍ値は、それぞれ１６．０ｍＭ、２０．８Ｕ／ｍｇ、１４．２ｓ^－１及び８．９×１０^２ｓ^－１・Ｍ^－１であった（図７のｅ）。

【0057】

ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ活性は、５ｍＭ ＭｎＣｌ_２、５ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び５ｍＭ ＴＣＥＰが存在する場合にそれぞれ１．４倍、１．５倍及び１．２倍向上したが、５ｍＭ ＥＤＴＡの存在下では酵素活性の８５％を抑制した（図８のａ）。酵素活性に対するＭｎ^２＋及びＴＣＥＰの強化効果は、容量依存的な方式により、５ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び１０ｍＭ ＴＣＥＰは、酵素活性をそれぞれ最大のレベルである１．５倍及び１．７倍に増加させた（図８のｂ）。また、５ｍＭ ＭｎＳＯ_４と１０ｍＭ ＴＣＥＰが同時に存在する場合には、酵素活性が約２．４倍まで格段に上昇してＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ活性に対するＭｎ^２＋及びＴＣＥＰの相乗効果を確認した。

【0058】

このような結果は、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨが適切な酵素活性を示すためにマンガンイオンを必要とする可能性があるが、マンガンイオンとの相互作用が５ｍＭ ＥＤＴＡのキレート作用に抵抗できるほどには強くない可能性があることを示唆する。

【0059】

２．４．最適な条件下でＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨによるＮＡ２処理により産生可能なＬ－ＡＨＧの歩留まり
ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨがＮＡ２からのＬ－ＡＨＧの産生に効率よい酵素であるか否かを調べるために、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨがＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに完全に加水分解し得るＮＡ２の最大の濃度を調べた。様々な濃度（２．０％、３．０％、４．０％及び５．０％）のＮＡ２を最適な反応条件（５ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び１０ｍＭ ＴＣＥＰ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、３５℃）下でＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ（４０μｇ／ｍｌ）と１４時間かけて反応させた後、各加水分解産物をＴＬＣにより分析した。その結果、酵素の触媒作用によるＮＡ２基質のＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースへの完全な加水分解は、２．０～５．０％の濃度のＮＡ２においていずれも観察された（図９のａ）。しかしながら、６．０％以上のＮＡ２濃度においては、不完全な加水分解が観察された（データ省略）。

【0060】

一方、５％のＮＡ２（８ｍｌ）をＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ（４０μｇ／ｍＬ）にて最適な反応条件下で１４時間かけて処理した後、酵素反応物を凍結乾燥させた。乾燥された試料を３次蒸留水に溶解し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標名）Ｇ－１０カラムを用いた分子体クロマトグラフィーにより分画した。各分画のＴＬＣ分析を行った結果、３０～３１分画においてはＤ－ガラクトースが、３３～３９分画においてはＬ－ＡＨＧが確認された（図９のｂ）。分画３３～３９を回収し、凍結乾燥させて粉末の状態のＬ－ＡＨＧを得た。酵素処理により確保した４００ｍｇのＮＡ２の加水分解物を２回にわたってＳｅｐｈａｄｅｘ（商標名）Ｇ－１０カラムクロマトグラフィーにより分画した結果、理論的な最大の歩留まりの～９２％に相当する総～１９２ｍｇのＬ－ＡＨＧを回収した。

【0061】

３．議論
本発明においては、淡水由来の寒天分解細菌であるセルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１由来のＧＨ１１７Ａ β－ＮＡＢＨ酵素をＥ． ｃｏｌｉ発現システムを用いて可溶性のＨｉｓタグ付き組換えタンパク質として産生し、産生された組換えＧＨ１１７Ａ β－ＮＡＢＨ酵素の基質特異性を調べた結果として、二糖類であるＮＡ２のα－１，３－結合は、加水分解して単糖類であるＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに転換するものの、ＮＡ４～ＮＡ１８などの様々なＤＰｓのＮＡＯＳが有しているα－１，３－結合に対しては、加水分解能を全く発揮することができないことを確認した。また、５．０％のＮＡ２基質を組換えＧＨ１１７Ａ β－ＮＡＢＨ酵素にて最適な反応条件下で処理して完全にＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに加水分解した後、加水分解物からＬ－ＡＨＧをＳｅｐｈａｄｅｘ（商標名）Ｇ－１０カラムを用いた分子体クロマトグラフィーにより精製したとき、４００ｍｇのＮＡ２から産生可能なＬ－ＡＨＧの理論上の最大の歩留まりの～９２％に相当する～１９２ｍｇのＬ－ＡＨＧを回収した。

【0062】

先行研究において、本発明の発明者らは、寒天分解細菌であるセルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１菌株の全体の遺伝体の塩基配列を分析した結果、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ（３６４個のアミノ酸、４０．９ｋＤａ）及びＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨ（３９２個のアミノ酸、４４．２ｋＤａ）を暗号化させる２つの暫定的なＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨ遺伝子（α－ＣｖＮａｂｈ１１７Ａ及びα－ＣｖＮａｂｈ１１７Ｂ）を含有していると推察したが、ＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨ酵素は、二糖類ＮＡ２を単糖類であるＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに加水分解する機能を用いて、アガロースの酵素的な糖化の最後の段階に寄与することが知られている。たとえ２種類の組換えＨｉｓタグ付きＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨ酵素が両方ともＥ． ｃｏｌｉ形質転換体内において可溶性の形態で発現されたとはいえ、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨのみがＮＡ２を単糖類に加水分解する機能を示している。このことは、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨがセルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１菌株におけるアガロース分解の最終の酵素段階に欠かせない必須的な酵素であることを示す。色々な研究文献において、α－ＮＡＢＨを含むＧＨ１１７ファミリーα－ＮＡＯＳＨは、ＮＡ２を基質として認識し、これをＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースに加水分解することが報告されているが、このようなα－ＮＡＯＳＨは、ＮＡ２基質にのみ特異的なものではなく、ＮＡ４にも働いてＬ－ＡＨＧの生成とともにアガロトリオース（Ａ３）を生成して残存させ、かつ、ＮＡ６にも働いてＬ－ＡＨＧの生成とともにアガロペンタオース（Ａ５）を生成して残存させることが報告されている。特に、最近に研究されたストレプトミセス・コエリカラーＡ３のα－ＮＡＯＳＨは、２～１４の様々な重合度（ＤＰｓ）のＮＡＯＳに働いてこれらの非還元性の末端において最初のα－１，３－グリコシド結合のみを加水分解することが報告されている。本発明において、組換えＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素タンパク質をＥ． ｃｏｌｉ発現システムにより産生しかつ精製して確保した後、様々なＤＰｓのＮＡ２～ＮＡ１８を含有するＮＡＯＳ混合物を基質として用いてその基質特異性を調べた結果、ＮＡ２は、Ｌ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに加水分解されるのに対し、残りのＮＡ４～ＮＡ１８などは、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの酵素活性により全く影響を受けないことが確認された。のみならず、標準品ＮＡ２、ＮＡ４またはＮＡ６を用いたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの基質特異性に関する追加の調査においても、ＮＡ２がＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢの唯一の基質であり、Ｌ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースに完全に加水分解されることが判明された。このような結果は、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨがＮＡ２の加水分解に特化した酵素であり、このようなＮＡ２基質特異性を有している側面からみて、既存に報告されている酵素とははっきりと区別されるということを示す。一方、ＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨのアミノ酸配列がＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨのアミノ酸配列と３５％の類似性を共有するものの、ＮＡ２～ＮＡ１８のうちのいずれも加水分解することができず、ＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨの酵素機能がＮＡＯＳ（ＮＡ２～ＮＡ１８）からのＬ－ＡＨＧの産生には寄与しないことを確認した。セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１菌株におけるＧＨ１１７Ｂ α－ＮＡＢＨの役割は、未だに判明されておらず、未判明のままで残っている。

【0063】

ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨのアミノ酸配列をＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において見つけた上位９個の同族体とともにクラスタルＸプログラムを用いて整列したとき、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ同族体は、海洋性及び非海洋性のあらゆる寒天分解細菌に存在し、高いレベルの配列相同性（７６．５～９７．５％）を有していることが確認された。このことは、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨが細菌性寒天分解酵素系の必須的な構成員であることを示唆する。また、このような９個のＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨｓの中で、ビブリオ属菌ＥＪＹ３菌株のＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨは、唯一に酵素特性が調べられてＮＡ２及びＮＡ４を基質として分解することが報告されている。したがって、本発明において報告するＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨに関する現在のデータは、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨとかなりの相同性を示すＧＨ１１７ファミリーα－ＮＡＢＨｓに対する洞察力を提供することができる。

【0064】

また、このような９個のＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨのうちのいずれも、これまで酵素特性に対して調べなかったため、この研究において報告されたＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨに関する現在のデータは、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨとかなりの相同性を示すＧＨ１１７ファミリーα－ＮＡＢＨｓに対する洞察力を提供することができる。

【0065】

ＮＡ２に対するＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの酵素反応速度定数であるＫｍ及びＶｍａｘ値（１６．０ｍＭ及び２０．８Ｕ／ｍｇ）は、ビブリオ属菌ＪＴ０１０７のα－ＮＡＯＳＨ（５．３７ｍＭ及び９２Ｕ／ｍｇ）を含んで他に報告されているα－ＮＡＢＨｓ、すなわち、セルビブリオ属菌ＯＡ－２００７のα－ＮＡＯＳＨ（６ｍＭ及び１９Ｕ／ｍｇ）、セルビブリオ属菌ＷＵ－０６０１のα－ＮＡＯＳＨ（５．８ｍＭ及び６０Ｕ／ｍｇ）、アガロボランス・ギルバス（Ａｇａｒｏｖｏｒａｎｓ ｇｉｌｖｕｓ）ＷＨ０８０１のα－ＮＡＢＨ（６．４５ｍＭ及び６．９８Ｕ／ｍｇ）、ガヤドモナス・ジュービニエゲ（Ｇａｙａｄｏｍｏｎａｓ ｊｏｏｂｉｎｉｅｇｅ）Ｇ７のα－ＮＡＢＨ（４．５ｍＭ及び１．３３Ｕ／ｍｇ）及びストレプトマイセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）Ａ３のα－ＮＡＯＳＨ（１１．５７ｍＭ及びデータ無し）などと比較すべきものであった。また、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨは、ＮＡ２に対するＶｍａｘ及びＫｃａｔ値（２０．８Ｕ／ｍｇ及び１４．２ｓ^－１）に関しては、他の比較される酵素よりもさらに触媒的なものであることが示された。また、これまで報告されているα－ＮＡＯＳＨのうちのいずれも、ＮＡ２のα－１，３－グリコシド結合のみを加水分解するＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨのＮＡ２に特化した酵素作用とは対照的に、ＮＡ２に対する基質特異性を示さなかったという点で注目すべきである。

【0066】

一般に、Ｍｇ^２＋及びＮａ^＋の存在に依存すると報告されている海洋性β－アガラーゼとは異なり、セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１菌株由来のＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素活性は、ＭｇＣｌ_２またはＮａＣｌにより大きく影響を受けなかった。その代わりに、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素活性は、Ｍｎ^２＋または還元剤ＴＣＥＰの存在下で濃度依存的に格段に向上した。ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素活性に対するＭｎ^２＋及びＴＣＥＰの相乗効果が観察されて、５ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び１０ｍＭ ＴＣＥＰが共存する場合には、酵素活性が２．４倍まで向上することが示された。これと同時に、ＮＡ２基質に対するＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの酵素反応速度定数であるＫｍ、Ｖｍａｘ、Ｋｃａｔ及びＫｃａｔ／Ｋｍ値は、それぞれ５．８ｍＭ、３３．７Ｕ／ｍｇ、２３．０ｓ^－１及び４．０×１０^３ｓ^－１・Ｍ^－１であることが示された（データ省略）。このような研究結果は、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素活性がＭｎ^２＋／ＴＣＥＰの存在により濃度依存的に増進されることがこの酵素のユニークな酵素学的特性であることを示す。

【0067】

最適な反応条件（５ｍＭ ＭｎＳＯ_４、１０ｍＭ ＴＣＥＰ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、３５℃）下で、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ（４０μｇ／ｍｌ）酵素は、最大で５．０％のＮＡ２を単糖類であるＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに完全に加水分解することができた。ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素処理によりＮＡ２基質から生成されたＬ－ＡＨＧは、酵素反応物をＳｅｐｈａｄｅｘ（商標名）Ｇ－１０カラムを用いて分子体クロマトグラフィーを行って分画したときに容易に精製することができた。このような方法により、ＧＨ１１７Ａ酵素処理により得られる５％のＮＡ２の加水分解物からＬ－ＡＨＧを精製したとき、Ｌ－ＡＨＧの回収率は、理論的な最大の歩留まりの～９２％であることが示された。

【0068】

最近、多糖類であるアガロースからの構成単糖類であるＬ－ＡＨＧの量産と関連して、エキソ型β－アガラーゼによるアガロース分解を用いたＮＡ２産生段階及び後続するＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨによるＮＡ２のＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースへの加水分解段階を進める２段階の酵素工程が提案されている。また、β－アガラーゼとα－ＮＡＢＨ酵素を共同－固定化した後、アガロースをＬ－ＡＨＧにより加水分解するのに活用する方法に関しても報告されている。しかしながら、このような先行研究において提案された酵素処理工程は、使用された酵素の酵素学的特性によって改善されるべき非効率的な側面があると推察される。すなわち、使用されたエキソ型β－アガラーゼは、アガロースからＮＡ２の他にも色々なＤＰｓのＮＡＯＳを生成し、かつ、使用されたＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨは、ＮＡ２に特化した酵素ではなく、ＮＡ４とＮＡ６にも働いてそれぞれＬ－ＡＨＧ／アガロトリオース（Ａ３）及びＬ－ＡＨＧ／アガロペンタオース（Ａ５）を生成することができて、多糖類であるアガロースが単糖類であるＬ－ＡＨＧとＤ－ガラクトースに分解される効率が低下するという欠点を有する酵素であった。

【0069】

したがって、アガロースからＮＡ２を主な生成物として産生可能な効果的なエキソ型ＧＨ５０β－アガラーゼのみならず、ＮＡ２基質に対してのみ特異的にα－１，３－グリコシド結合を加水分解可能なＮＡ２に特化したＧＨ１１７ α－ＮＡＢＨの開発が、アガロースの酵素的な糖化を用いて単糖類を産生する効率よい酵素工程のために切望されているのが現状であるといえる。

【0070】

本発明において開示されたＧＨ１１７Ａ β－ＮＡＢＨ酵素特性に基づいて、ＮＡ２の加水分解に特化したＧＨ１１７Ａ β－ＮＡＢＨを用いると、ＮＡ２からＬ－ＡＨＧを生成する１段階の酵素工程がＬ－ＡＨＧの量産の標準になる筈であり、かつ、Ｌ－ＡＨＧの量産の加速化にも大きく寄与できることが期待される。併せて、アガロースをＮＡ２に効率よく転換可能な強力なエキソ型ＧＨ５０Ａ β－アガラーゼとＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨを複合処理する方法もまた、Ｌ－ＡＨＧの産生のためにアガロースを糖化させる工程として有用になる筈であると確信するところである。

【0071】

４．まとめ
本発明の結果は、寒天分解セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１菌株由来の組換えＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨは、最大で５％のＮＡ２を単糖類であるＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースに完全に加水分解することができることを示す。基質であるＮＡ２を除いては、ＮＡ４～ＮＡ１８のうちのいずれもＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの加水分解作用を受けないことを確認したため、このことから、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素作用は、ＮＡ２に特化していることを明らかにした。基質ＮＡ２に対するＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素の加水分解作用の最適な温度とｐＨは、それぞれ３５℃と７．５であった。ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素は３５℃まで、そしてｐＨ ７．０～７．５の範囲においては安定しているのに対し、３５℃以上及びｐＨ ７．０～７．５の範囲を超えては不安定であることが示された。ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素活性は、５ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び１０ｍＭ ＴＣＥＰの存在下で２．４倍向上した。ＮＡ２に対するＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素の反応速度定数、すなわち、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、Ｋｃａｔ及びＫｃａｔ／Ｋｍ値は、それぞれ１６．０ｍＭ、２０．８Ｕ／ｍｇ、１４．２ｓ^－１及び８．９×１０^２ｓ^－１・Ｍ^－１であった。特に、５ｍＭ ＭｎＳＯ_４及び１０ｍＭ ＴＣＥＰが共存する場合には、ＮＡ２基質に対するＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨのＫｍ、Ｖｍａｘ、Ｋｃａｔ及びＫｃａｔ／Ｋｍ値がそれぞれ５．８ｍＭ、３３．７Ｕ／ｍｇ、２３．０ｓ^－１及び４．０×１０^３ｓ^－１・Ｍ^－１であることが示された。このような組換えα－ＮＡＢＨの酵素学的な特性は、二糖類であるＮＡ２を単糖類であるＬ－ＡＨＧ及びＤ－ガラクトースに分解する１段階酵素工程を用いたＬ－ＡＨＧの量産に有用になる可能性があることを示唆する。代案としては、このような糖化過程を、エキソ型加水分解方式によりアガロースをＮＡ２に効率よく分解可能な強力なＧＨ５０ファミリーβ－アガラーゼと併合する工程も有用になる可能性があることを示唆する。

【0072】

最後に、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨとアミノ酸配列において、７６．５～９７．５％の類似性を共有する９個のα－ＮＡＢＨの中で、７６．８％の類似性を有するビブリオ属菌ＥＪＹ３菌株由来のＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨの酵素特性の他には、これまで調べられたことがなかったため、本発明において開示する寒天分解細菌セルビブリオ属菌ＫＹ－ＧＨ－１のＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨ酵素に関する研究結果は、他の寒天分解細菌由来であるものの、ＧＨ１１７Ａ α－ＮＡＢＨと類似性を有するα－ＮＡＢＨ酵素に対する洞察力を提供することができる。

【受託番号】

【0073】

寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ １３６２９ＢＰ
受託日：２０１８年８月２７日

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

2024540300000001.app

【手続補正書】

【提出日】2024-06-28

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１の塩基配列によりコードされるアミノ酸配列、又は配列番号２のアミノ酸配列を有する、ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素。

【請求項2】

寄託番号ＫＣＴＣ １３６２９ＢＰであるセルビブリオ属菌（Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．）ＫＹ－ＧＨ－１菌株起源であることを特徴とする、請求項１に記載のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素。

【請求項3】

ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素遺伝子が取り込まれた大腸菌形質転換体から得られることを特徴とする、請求項２に記載のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素。

【請求項4】

前記ＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素遺伝子は、発現ベクターにクローニングされて大腸菌に取り込まれることを特徴とする、請求項３に記載のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素。

【請求項5】

請求項１～４のいずれか一項に記載のＧＨ１１７Ａ α－ネオアガロビオース加水分解酵素をネオアガロビオースに処理して酵素的に分解する、３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースの産生方法。

【請求項6】

前記処理は、２５～４５℃の温度範囲において行われることを特徴とする、請求項５に記載の３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースの産生方法。

【請求項7】

前記処理は、ｐＨ ６．０～１０．０のｐＨ範囲において行われることを特徴とする、請求項５に記載の３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースの産生方法。

【請求項8】

前記処理は、Ｍｎ^２＋をさらに加えて行われることを特徴とする、請求項５に記載の３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースの産生方法。

【請求項9】

前記Ｍｎ^２＋は、ＭｎＣｌ_２、ＭｎＳＯ_４またはこれらの混合物の形態であることを特徴とする、請求項５に記載の３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースの産生方法。

【請求項10】

前記処理は、トリス（２－カルボキシエチル）－ホスフィンをさらに加えて行われることを特徴とする、請求項５に記載の３，６－アンヒドロ－Ｌ－ガラクトースの産生方法。

【国際調査報告】