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▶ メモリアル スローン−ケタリング キャンサー センターの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】ＩＬ３３タンパク質及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/20 20060101AFI20241024BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20241024BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241024BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 15/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 1/18 20060101ALI20241024BHJP
C07K 14/54 20060101ALN20241024BHJP
【ＦＩ】
A61K38/20
A61P1/04
A61P29/00
A61P37/06
A61P35/00
A61P17/00
A61P15/00
A61P1/18
C07K14/54 ZNA
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024526673
(86)(22)【出願日】2022-11-04
(85)【翻訳文提出日】2024-06-27
(86)【国際出願番号】 US2022079278
(87)【国際公開番号】W WO2023081802
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】63/275,835
(32)【優先日】2021-11-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500213834
【氏名又は名称】メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100170520
【弁理士】
【氏名又は名称】笹倉 真奈美
(74)【代理人】
【識別番号】100221545
【弁理士】
【氏名又は名称】白江 雄介
(72)【発明者】
【氏名】バラチャンドラン，ビノド
(72)【発明者】
【氏名】メルゴウブ，タハ
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA44
4C084CA18
4C084CA53
4C084DA12
4C084NA14
4C084ZA661
4C084ZA662
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZA891
4C084ZA892
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZB261
4C084ZB262
4H045AA10
4H045AA30
4H045DA02
4H045EA28
(57)【要約】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象において新規三次リンパ構造の形成を誘導するための方法及び組成物を提供する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、対象にＩＬ３３タンパク質を投与することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、がんを有する。いくつかの実施形態では、対象は、慢性炎症状態を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、慢性炎症状態を治療するための方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象において新規三次リンパ構造の形成を誘導する方法であって、前記対象に有効量のＩＬ３３タンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項2】
前記ＩＬ３３タンパク質が、ヒトＩＬ３３である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＩＬ３３タンパク質が、成熟ヒトＩＬ３３である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ＩＬ３３タンパク質が、配列番号１の配列を有する成熟ヒトＩＬ３３タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記対象が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記対象が、がんを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記対象が、膵臓がん、乳がん、又は黒色腫を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記対象が、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記対象が、ＰＤ－１及び／又はＰＤ－Ｌ１阻害剤治療に耐性のあるがんを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
対象が、慢性炎症状態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記対象が、慢性炎症性胃腸状態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記対象が、大腸炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、又はクローン病を有する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／２７５，８３５号の優先権の利益を主張し、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１１月４日に出願された米国仮特許出願第６３／２７５，８３５号の優先権の利益を主張し、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列表
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出されている配列表を含有し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年１１月４日に作成された当該ＸＭＬコピーは、ＳＴ２６＿ＭＳＫＣＣ．０５５．ＷＯ１－Ｎｏｖ ４，２０２２という名称で、２０６５バイトのサイズである。
本出願は、ＸＭＬ形式で電子的に提出されている配列表を含有し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年１１月４日に作成された当該ＸＭＬコピーは、ＳＴ２６＿ＭＳＫＣＣ．０５５．ＷＯ１－Ｎｏｖ ４，２０２２という名称で、２０６５バイトのサイズである。
【0003】
参照による組み込み
本開示で引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる（本特許開示の文章の後に続く括弧内又は上付きの番号は、本特許明細書の「参考文献リスト」セクションに提供される番号付きの参考文献を指す）。加えて、本明細書で引用又は言及される任意の製品の任意の製造業者の説明書又はカタログは、参照により組み込まれる。本文章に参照により組み込まれる文書、又はそれらの中の任意の教示は、本発明の実施で使用され得る。
本開示で引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる（本特許開示の文章の後に続く括弧内又は上付きの番号は、本特許明細書の「参考文献リスト」セクションに提供される番号付きの参考文献を指す）。加えて、本明細書で引用又は言及される任意の製品の任意の製造業者の説明書又はカタログは、参照により組み込まれる。本文章に参照により組み込まれる文書、又はそれらの中の任意の教示は、本発明の実施で使用され得る。
【背景技術】
【0004】
三次リンパ構造（ＴＬＳ）は、がんなどの炎症を起こした組織内に異所的に形成される免疫細胞凝集体である。ＴＬＳは、炎症によって誘導された組織損傷が、ＴＬＳ誘導細胞を刺激して、標準リンパ新生（ｌｙｍｐｈｏｎｅｏｇｅｎｉｃ）タンパク質であるリンホトキシンを発現させて、樹状細胞及びＢ細胞を動員して、炎症部位で抗原特異的Ｔ細胞をプライミングするときに生じる。誘導されるＴＬＳは、慢性炎症及びがんにおける免疫を調節する。例えば、炎症性腸疾患では、ＴＬＳは、病原性腸内微生物を制限する。また、がんでは、ＴＬＳは、抗腫瘍免疫を高め、予後の改善と相関し、免疫チェックポイント阻害剤に対するより高い応答を予測する。ＴＬＳは、がん及び炎症における免疫応答を決定的に調節するが、本発明以前は、ＴＬＳ形成を誘導する分子及び細胞は、未定義のままであった。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、部分的に、本特許明細書の実施例セクションにより詳細に記載されている一連の重要な発見に基づいている。具体的には、インターロイキン－３３（ＩＬ３３）は、２型自然リンパ細胞（ＩＬＣ２）を刺激して、腫瘍において新規三次リンパ構造（ＴＬＳ）の形成を誘導することができ、腫瘍成長の阻害につながり、慢性炎症性大腸炎においては生存率の増加につながることが現在発見されている。
【0006】
これらの発見に基づいて、本発明は、治療用途に有用な様々な新しくかつ改善された方法を提供する。
【0007】
具体的には、いくつかの実施形態では、本発明は、対象において新規三次リンパ構造の形成を誘導する方法を提供し、そのような方法は、それを必要とする対象に、有効量のＩＬ３３タンパク質又はＩＬ３３タンパク質を含む薬学的組成物を投与することを含む。いくつかのそのような実施形態では、対象は、がんを有する。いくつかのそのような実施形態では、対象は、慢性炎症状態を有する。いくつかの実施形態では、方法は、対象においてがんを治療するために使用される。いくつかの実施形態では、方法は、対象において慢性炎症状態を治療するために使用される。
【0008】
本発明のこれら及び他の実施形態は、本特許開示の発明を実施するための形態、実施例、特許請求の範囲、図面、及び図面の簡単な説明のセクションに更に詳細に記載されており、これらのセクションの各々は、本特許開示の他の全てのセクションと併せて、かつそれらの文脈において読まれることが意図される。更に、当業者は、本明細書に記載される本発明の様々な実施形態が、様々な方法で組み合わされ得ること、及びそのような組み合わせが、本発明の範囲内にあることを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1A】ＩＬ３３は、膵臓がんにおいてＴＬＳを誘導する。ヒト膵管腺がん（ＰＤＡＣ）における、三次リンパ構造（ＴＬＳ）転写シグネチャ（Ｃａｂｒｉｔａ５、Ｃｏｐｐｏｌａ９、Ｇｕ－Ｔｒａｎｔｉｅｎ１０）に対する腫瘍ｍＲＮＡ遺伝子発現の不偏相関（上部）。ヒトＰＤＡＣにおけるＴＬＳ転写シグネチャ、及びリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）（ａ、下部）、乳がん（ｂ、上部）、及び黒色腫（図１Ｂ、下部）との腫瘍ＩＬ３３ ｍＲＮＡの発現の相関。ｎ＝腫瘍の数。全てＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）から。腫瘍移植の２～３週間後（細胞株６６９４、５２）、及び３～５週間後（細胞株６４１９、５０、６４９９）にデータを収集し、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。ｎ＝別々に分析した個々のマウスからの個々の腫瘍。水平棒＝中央値。両側ピアソン相関（図１Ａ、上部）、線形回帰（図１Ａ、下部）、及び両側マン－ホイットニー検定（図１Ｃ）によるＰ値。
【図1B】ＩＬ３３は、膵臓がんにおいてＴＬＳを誘導する。ヒトＰＤＡＣにおけるＴＬＳ転写シグネチャ、及びリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）（ａ、下部）、乳がん（ｂ、上部）、及び黒色腫（図１Ｂ、下部）との腫瘍ＩＬ３３ ｍＲＮＡの発現の相関。ｎ＝腫瘍の数。全てＴｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）から。腫瘍移植の２～３週間後（細胞株６６９４、５２）、及び３～５週間後（細胞株６４１９、５０、６４９９）にデータを収集し、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。ｎ＝別々に分析した個々のマウスからの個々の腫瘍。水平棒＝中央値。両側ピアソン相関（図１Ａ、上部）、線形回帰（図１Ａ、下部；図１Ｂ）、及び両側マン－ホイットニー検定（図１Ｃ）によるＰ値。
【図1C】ＩＬ３３は、膵臓がんにおいてＴＬＳを誘導する。ヒトＰＤＡＣのＴＬＳにおけるＩＬ３３＋細胞の代表的な免疫組織化学及び定量化（１５倍の倍率。差し込み図、５０倍の倍率）。腫瘍移植の２～３週間後（細胞株６６９４、５２）、及び３～５週間後（細胞株６４１９、５０、６４９９）にデータを収集し、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。ｎ＝別々に分析した個々のマウスからの個々の腫瘍。水平棒＝中央値。両側ピアソン相関（図１Ａ、上部）、線形回帰（図１Ａ、下部；図１Ｂ）、及び両側マン－ホイットニー検定（図１Ｃ）によるＰ値。
【図1D】ＩＬ３３は、膵臓がんにおいてＴＬＳを誘導する。より少ない（Ｔ細胞低）又はより多い（Ｔ細胞中程度）腫瘍内Ｔ細胞を有するＰＤＡＣマウスモデルにおける腫瘍内ＴＬＳの代表的なヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、免疫蛍光（２０倍の倍率）（上部）、及び定量化（下部）。腫瘍移植の２～３週間後（細胞株６６９４、５２）、及び３～５週間後（細胞株６４１９、５０、６４９９）にデータを収集し、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。ｎ＝別々に分析した個々のマウスからの個々の腫瘍。水平棒＝中央値。両側ピアソン相関（図１Ａ、上部）、線形回帰（図１Ａ、下部；図１Ｂ）、及び両側マン－ホイットニー検定（図１Ｃ）によるＰ値。
【図2A】ＩＬ３３は、炎症性ＩＬＣ２を活性化して、リンホトキシンを発現する。ｒＩＬ３３処置の１０日後のＰＤＡＣマウスからの１，６６８個の精製された腫瘍及び流入領域リンパ節（ＤＬＮ）ＩＬＣ２の単一細胞分析。ＵＭＡＰプロット（２つの上部グラフ）は、クラスター（０、１、２、左上）及び組織（ＤＬＮ、腫瘍、左下）によってグループ化された上位１５個の主成分の非線形表現における単一細胞（ドット）を示す。ｉＩＬＣ２で発現される選択遺伝子のクラスター特異的発現のバイオリンプロット（８個の下部グラフ）。ヒストグラム＝腫瘍ＩＬＣ２。線＝試料内の対応のあるデータ。ｎ＝カテゴリ毎の試料数。腫瘍移植の１０日後にデータを収集し、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。水平棒＝中央値。ホルム検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図2B】ＩＬ３３は、炎症性ＩＬＣ２を活性化して、リンホトキシンを発現する。ｒＩＬ３３－ＰＤＡＣマウスのＫＬＲＧ１＋及びＫＬＲＧ１－ＩＬＣ２におけるゲーティング、頻度、及びリンホトキシン（ＬＴ）発現。ヒストグラム＝腫瘍ＩＬＣ２。線＝試料内の対応のあるデータ。ｎ＝カテゴリ毎の試料数。腫瘍移植の５週間後にデータを収集し、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。水平棒＝中央値。テューキーの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図2C】ＩＬ３３は、炎症性ＩＬＣ２を活性化して、リンホトキシンを発現する。ｒＩＬ３３処置ＷＴ又はＩＬＣ２欠損ＰＤＡＣマウスからの腫瘍及びＤＬＮにおけるＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２のゲーティング、頻度、及び数。ヒストグラム＝腫瘍ＩＬＣ２。線＝試料内の対応のあるデータ。ｎ＝カテゴリ毎の試料数。腫瘍移植の５週間後にデータを収集し、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図2D】ＩＬ３３は、炎症性ＩＬＣ２を活性化して、リンホトキシンを発現する。ｒＩＬ３３－ＰＤＡＣマウスのＫＬＲＧ１＋及びＫＬＲＧ１－ＩＬＣ２におけるゲーティング及び頻度発現。ヒストグラム＝腫瘍ＩＬＣ２。線＝試料内の対応のあるデータ。ｎ＝カテゴリ毎の試料数。腫瘍移植の１５週間後にデータを収集し、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図2E】ＩＬ３３は、炎症性ＩＬＣ２を活性化して、リンホトキシンを発現する。ｒＩＬ３３－ＰＤＡＣマウスのＫＬＲＧ１＋及びＫＬＲＧ１－ＩＬＣ２における頻度及びＳＴ２発現。ヒストグラム＝腫瘍ＩＬＣ２。線＝試料内の対応のあるデータ。ｎ＝カテゴリ毎の試料数。腫瘍移植の４～５週間後にデータを収集し、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図2F】ＩＬ３３は、炎症性ＩＬＣ２を活性化して、リンホトキシンを発現する。がん患者における血液及び腫瘍ＫＬＲＧ１＋及びＫＬＲＧ１－ＩＬＣ２上のＬＴ平均蛍光強度（ＭＦＩ）。ヒストグラム＝腫瘍ＩＬＣ２。線＝試料内の対応のあるデータ。ｎ＝カテゴリ毎の試料数。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図3A】炎症性ＩＬＣ２は、原発性及び遠位腫瘍を制御するために移動する。ＣＤ４５．２ドナー及びＣＤ４５．１レシピエント並体結合マウスのレシピエント膵臓にＰＤＡＣを移植した。ドナーを、ビヒクル、ｒＩＬ３３で処置した。レシピエント膵臓のＰＤＡＣにおけるドナー由来ＩＬＣ２のゲーティング及び頻度。腫瘍移植の２週間後にデータを収集し、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図3B】炎症性ＩＬＣ２は、原発性及び遠位腫瘍を制御するために移動する。ＣＤ４５．２ドナー及びＣＤ４５．１レシピエント並体結合マウスのドナー膵臓及びレシピエント皮下（ＳＱ）組織にＰＤＡＣを移植した。ドナーを、ビヒクル、ｒＩＬ３３、又はｒＩＬ２５で処置した。ＳＱのＰＤＡＣにおけるドナー由来ＩＬＣ２のゲーティング及び頻度。腫瘍移植の２週間後にデータを収集し、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。クラスカル－ウォリス多重比較検定（頻度、数）を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図3C】炎症性ＩＬＣ２は、原発性及び遠位腫瘍を制御するために移動する。ドナーを、ビヒクル、ｒＩＬ３３、又はｒＩＬ２５で処置した。ＳＱのＰＤＡＣにおけるドナー由来ＩＬＣ２のゲーティング及び頻度。腫瘍移植の２週間後にデータを収集し、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。クラスカル－ウォリス多重比較検定（頻度、数）を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図3D】炎症性ＩＬＣ２は、原発性及び遠位腫瘍を制御するために移動する。ＳＱ ＰＤＡＣ単独、又はＳＱ及び膵臓ＰＤＡＣを有するＷＴマウスにおけるＳＱ ＰＤＡＣ成長、ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２頻度、及び数。腫瘍移植の５週間後にデータを収集し、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。クラスカル－ウォリス多重比較検定（頻度、数）又はシダックの多重比較検定（腫瘍重量）を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ、及び両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図3E】炎症性ＩＬＣ２は、原発性及び遠位腫瘍を制御するために移動する。ＳＱ ＰＤＡＣ単独、又はＳＱ及び膵臓ＰＤＡＣを有するＩｌ１ｒｌ１－／－（ＳＴ２欠損）マウスにおけるＳＱ ＰＤＡＣ成長、ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２頻度、及び数。腫瘍移植の３週間後にデータを収集し、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。シダックの多重比較検定（腫瘍重量）を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ、及び両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図3F】炎症性ＩＬＣ２は、原発性及び遠位腫瘍を制御するために移動する。ＳＱ ＰＤＡＣ単独、又はＳＱ及び膵臓ＰＤＡＣを有するＩＬＣ２欠損マウスにおけるＳＱ ＰＤＡＣ成長、ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２頻度、及び数。腫瘍移植の５週間後にデータを収集し、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。シダックの多重比較検定（腫瘍重量）を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ、及び両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図4A】炎症性ＩＬＣ２は、リンホトキシンを利用してＴＬＳを誘導し、がん免疫療法のために利用され得る。ｒＩＬ３３処置野生型（ＷＴ）及びＩＬＣ２欠損膵臓ＰＤＡＣマウスの腫瘍における代表的なＨ＆Ｅ及びＴＬＳ数。データを、移植の４週間後に収集し、１群当たり≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定及びクラスカルウォリス多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図4B】炎症性ＩＬＣ２は、リンホトキシンを利用してＴＬＳを誘導し、がん免疫療法のために利用され得る。ｒＩＬ３３処置ＷＴ並びにＬｔｂｒ－／－膵臓及びＳＱ ＰＤＡＣマウスにおける代表的なＨ＆Ｅ、及びＴＬＳ数（膵臓ＰＤＡＣにおける）、腫瘍成長、及びＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２頻度。データを、移植の４週間後に収集し、１群当たり≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。シダックの多重比較を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ（腫瘍体積）、及びクラスカルウォリス多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図4C】炎症性ＩＬＣ２は、リンホトキシンを利用してＴＬＳを誘導し、がん免疫療法のために利用され得る。腫瘍ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２を、ｒＩＬ３３処置ＷＴ又はＬｔｂ－／－膵臓ＰＤＡＣマウスから選別精製し、ＩＬＣ２欠損膵臓ＰＤＡＣレシピエントに移した。レシピエントＰＤＡＣにおけるＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２頻度及び数、ＴＬＳ数、並びに腫瘍成長。データを、細胞移入の２週間後に収集し、１群当たり≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。クラスカルウォリス多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図4D】炎症性ＩＬＣ２は、リンホトキシンを利用してＴＬＳを誘導し、がん免疫療法のために利用され得る。ｒＩＬ３３処置膵臓ＰＤＡＣマウスにおける腫瘍内ＬＴｂＲ＋ＩＬ３３＋細胞のゲーティング及びＬＴｂＲ発現。データを、移植の４週間後に収集し、１群当たり≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定及びクラスカルウォリス多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図4E】炎症性ＩＬＣ２は、リンホトキシンを利用してＴＬＳを誘導し、がん免疫療法のために利用され得る。ｒＩＬ３３処置膵臓ＰＤＡＣマウスにおける腫瘍内ＬＴｂＲ＋ＩＬ３３＋細胞のゲーティング及び表現型。データを、移植の４週間後に収集し、１群当たり≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定及びクラスカルウォリス多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図4F】炎症性ＩＬＣ２は、リンホトキシンを利用してＴＬＳを誘導し、がん免疫療法のために利用され得る。腫瘍内ＬＴｂＲ＋細胞を、ｒＩＬ３３処置ＷＴ又はＩｌ３３－／－膵臓ＰＤＡＣマウスの腫瘍から選別精製し、Ｉｌ３３－／－レシピエントの膵臓に腫瘍と共移植した（上部）。腫瘍内ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２ＬＴ発現、ＴＬＳ数、及び腫瘍重量（下部）。データを、細胞移入の２週間後に収集し、１群当たり≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定及びクラスカルウォリス多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図4G】炎症性ＩＬＣ２は、リンホトキシンを利用してＴＬＳを誘導し、がん免疫療法のために利用され得る。ｒＩＬ３３処置ＷＴ及びＬｔｂｒ－／－膵臓ＰＤＡＣマウスにおける腫瘍内ＩＬ３３＋ＣＸＣＬ１３＋細胞頻度。データを、移植の４週間後に収集し、１群当たり≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定及びクラスカルウォリス多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図4H】炎症性ＩＬＣ２は、リンホトキシンを利用してＴＬＳを誘導し、がん免疫療法のために利用され得る。腫瘍ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２を、ｒＩＬ３３処置ＷＴ又はＬｔｂ－／－膵臓ＰＤＡＣマウスから選別精製し、ＩＬＣ２欠損膵臓ＰＤＡＣレシピエントに移した。レシピエント膵臓ＰＤＡＣのＩＬ３３＋ＬＴｂＲ＋細胞におけるゲーティング、ＣＸＣＬ１３＋細胞頻度、及び平均蛍光強度（ＭＦＩ）（図４Ｃの実験スキーマ）。データを、細胞移入の２週間後（に収集し、１群当たり≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定及びクラスカルウォリス多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図4I】炎症性ＩＬＣ２は、リンホトキシンを利用してＴＬＳを誘導し、がん免疫療法のために利用され得る。インビトロで、アゴニストＬＴｂＲ－Ｉｇで処置した精製されたＷＴ若しくはＬｔｂｒ－／－骨髄細胞（左）、又はＷＴ骨髄細胞におけるＩＬ３３発現。データを、刺激の２４時間後に収集し、１群当たり≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定及びクラスカルウォリス多重比較検定を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図5A】ＩＬ３３発現は、ＴＬＳシグネチャと相関し、ＩＬ３３発現細胞は、ヒトＰＤＡＣに存在する。前向き研究で収集されたヒトＰＤＡＣコホート（ＭＳＫ、上部）及び以前に公開されたヒトＰＤＡＣコホート（ＩＣＧＣ、下部）における、３つのＴＬＳ転写シグネチャ（Ｃａｂｒｉｔａ５、Ｃｏｐｐｏｌａ９、Ｇｕ－Ｔｒａｎｔｉｅｎ１０）、及びＬＴＢ ｍＲＮＡ発現との腫瘍内ＩＬ３３ ｍＲＮＡ発現の相関。
【図6】腫瘍内Ｔ細胞浸潤は、ＰＤＡＣマウスモデルにおいて異なる。Ｔ細胞低及びＴ細胞中程度の膵臓ＰＤＡＣマウスモデルにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。腫瘍移植の２～３週間後（６６９４、５２）、３～４週間後（６４１９）、及び４～６週間後（６４９９、５０、４６６２）に収集し、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールしたデータ。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図7A】ＩＬ３３は、マウスの血液及びＰＤＡＣにおけるｉＩＬＣ２を拡大する。マウスにおけるＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２を特定するためのゲーティング戦略。データを、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。
【図7B】ＩＬ３３は、マウスの血液及びＰＤＡＣにおけるｉＩＬＣ２を拡大する。ＩＬＣ２上のリンホトキシン（ＬＴ）発現を検出するためのゲーティング戦略。腫瘍移植の４週間後に野生型（ＷＴ）及びＬｔｂ－／－マウスから精製されたＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２上のＬＴ発現。ＦＭＯ（蛍光－１）＝陰性対照。ＭＦＩ＝平均蛍光強度。データを、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図7C】ＩＬ３３は、マウスの血液及びＰＤＡＣにおけるｉＩＬＣ２を拡大する。ＩＬＣ転写因子を示す、１０日間のｒＩＬ３３処置後の膵臓ＰＤＡＣマウスからの１，６６８個の精製された腫瘍及び流入領域リンパ節（ＤＬＮ）ＩＬＣ２の単一細胞分析。データを、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。
【図7D】ＩＬ３３は、マウスの血液及びＰＤＡＣにおけるｉＩＬＣ２を拡大する。表面マーカー及びサイトカインを示す、１０日間のｒＩＬ３３処置後の膵臓ＰＤＡＣマウスからの１，６６８個の精製された腫瘍及び流入領域リンパ節（ＤＬＮ）ＩＬＣ２の単一細胞分析。データを、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。
【図7E】ＩＬ３３は、マウスの血液及びＰＤＡＣにおけるｉＩＬＣ２を拡大する。腫瘍移植の５日後（血液）又は３２日後（ＤＬＮ）に採取したＴ細胞中程度の膵臓ＰＤＡＣマウスモデル（細胞株４６６２）における血液及びＤＬＮ ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２頻度。データを、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図7F】ＩＬ３３は、マウスの血液及びＰＤＡＣにおけるｉＩＬＣ２を拡大する。ビヒクル又はｒＩＬ３３で処置し、図６に記載される時点で収集したＴ細胞低（左）及びＴ細胞中程度（右）の膵臓ＰＤＡＣマウスモデルにおける腫瘍内ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２頻度。データを、１群当たりｎ≧２匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図8】ｉＩＬＣ２は、ヒト腫瘍に浸潤する。ヒトにおける炎症性ＩＬＣ２（ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２として定義されるｉＩＬＣ２）を特定するためのゲーティング戦略。ヒト原発性ＰＤＡＣ腫瘍におけるｉＩＬＣ２が示される。ヒト腫瘍におけるｉＩＬＣ２の定量化が、図２Ｆに示される。
【図9A】ＩＬ３３は、非ＩＬＣ２が並体結合ＰＤＡＣマウスにおいて移動するのを誘導しない。実験スキーマ。腫瘍移植の７日後（血液）又は１４日後（腫瘍）にデータを収集した。データを、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。
【図9B】ＩＬ３３は、非ＩＬＣ２が並体結合ＰＤＡＣマウスにおいて移動するのを誘導しない。レシピエント血液中のドナー（ＣＤ４５．２）及びレシピエント（ＣＤ４５．１）白血球のゲーティング及び定量化。腫瘍移植の７日後（血液）又は１４日後（腫瘍）にデータを収集した。データを、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図9C】ＩＬ３３は、非ＩＬＣ２が並体結合ＰＤＡＣマウスにおいて移動するのを誘導しない。レシピエント血液中のドナー由来ＫＬＲＧ１＋及びＫＬＲＧ１－ＩＬＣ２のゲーティング及び定量化。腫瘍移植の７日後（血液）又は１４日後（腫瘍）にデータを収集した。データを、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。
【図9D】ＩＬ３３は、非ＩＬＣ２が並体結合ＰＤＡＣマウスにおいて移動するのを誘導しない。レシピエント血液及び膵臓ＰＤＡＣにおけるドナー由来の非ＩＬＣのゲーティング及び定量化。腫瘍移植の７日後（血液）又は１４日後（腫瘍）にデータを収集した。データを、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。両側マン－ホイットニー検定によるＰ値。
【図9E】ＩＬ３３は、非ＩＬＣ２が並体結合ＰＤＡＣマウスにおいて移動するのを誘導しない。レシピエントＰＤＡＣにおけるドナー由来ＫＬＲＧ１＋及びＫＬＲＧ１－ＩＬＣ２を特定するためのゲーティング戦略。腫瘍移植の７日後（血液）又は１４日後（腫瘍）にデータを収集した。データを、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。
【図10A】ＩＬ２５は、ＩＬＣ２が並体結合ＰＤＡＣマウスにおいて腫瘍に移動するのを誘導しない。実験スキーマ。
【図10B】ＩＬ２５は、ＩＬＣ２が並体結合ＰＤＡＣマウスにおいて腫瘍に移動するのを誘導しない。ドナー膵臓ＰＤＡＣにおけるドナー（ＣＤ４５．２）ＩＬＣ２のゲーティング及び定量化。腫瘍移植の１４日後にデータを収集し、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。シダックの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。個々のマウス。水平棒＝中央値。シダックの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図10C】ＩＬ２５は、ＩＬＣ２が並体結合ＰＤＡＣマウスにおいて腫瘍に移動するのを誘導しない。レシピエント血液及びにおけるドナー由来ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２の定量化。腫瘍移植の５～９日後にデータを収集し、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。シダックの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。個々のマウス。水平棒＝中央値。シダックの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図10D】ＩＬ２５は、ＩＬＣ２が並体結合ＰＤＡＣマウスにおいて腫瘍に移動するのを誘導しない。レシピエント血液及びＳＱ ＰＤＡＣにおけるドナー由来ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２及び非ＩＬＣの定量化。腫瘍移植の７日後にデータを収集し、１群当たりｎ≧３匹のマウスを用いた２つ以上の独立した実験からプールした。各点は、別々に分析した１匹のマウスを示す。ｎ＝個々のマウスからの腫瘍の数。水平棒＝中央値。シダックの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。個々のマウス。水平棒＝中央値。シダックの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図11A】ｉＩＬＣ２及びＬＴｂＲ＋骨髄細胞は、マウスＰＤＡＣから精製され得る。マウスＰＤＡＣからのＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２の代表的な選別前及び選別後の純度。
【図11B】ｉＩＬＣ２及びＬＴｂＲ＋骨髄細胞は、マウスＰＤＡＣから精製され得る。マウスＰＤＡＣからのＬＴｂＲ＋骨髄細胞の代表的な選別前及び選別後の純度。
【図12】左：炎症によって誘導された大腸三次リンパ構造（ＴＬＳ）のデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）大腸炎モデルの概略図。野生型（ＷＴ）又はＩＬ３３－／－マウスを、飲料水中３％ＤＳＳで７日間処置し、１４日間回復させた（ＤＳＳ曝露なし）。大腸におけるＴＬＳを定量化した。右：マウスＰＤＡＣモデルにおけるαＬＴβＲアゴニスト抗体療法の概略図。ＷＴ又はＩＬ３３－／－同所性ＰＤＡＣマウスを、３日毎にαＬＴβＲアゴニスト抗体で処置した。ＰＤＡＣ腫瘍におけるＴＬＳを移植の１４日後に分析した。データを、１群当たりｎ＝５匹のマウスを用いた２つの独立した実験からプールした。ｎ＝別々に分析した個々のマウスからの個々の腫瘍。水平棒＝中央値。テューキーの多重比較検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡによるＰ値。
【図13】実験概略図（上部）。野生型（ＷＴ）マウスを、飲料水中３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）及びｒＩＬ３３（５００ｎｇ）で毎日７日間処置し、その後、７日間回復させ（ＤＳＳ曝露なし。ｒＩＬ３３を３回／週）、生存を評価した（下部）。ｎ＝個々のマウス。二元配置ログランク検定によるＰ値。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本発明の実施形態のうちのいくつかは、本特許開示の「発明の概要」、「実施例」、「図面の簡単な説明」、及び「図面」のセクションに記載されている。この「発明を実施するための形態」セクションは、本明細書の他の箇所に記載されている実施形態に関連する特定の追加の実施形態並びに特定の追加の説明及び詳細を提供し、本特許開示の他の全てのセクションと併せて読まれることが意図される。
【0011】
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当該技術分野内にある、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技法を用いるであろう。そのような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．（２０１５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ）、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ｅｄ．（２０１３）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｄｓ．（２０１２），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（２０１２）Ｌｅｗｉｎ’ｓ Ｇｅｎｅｓ ＸＩ（１１ｔｈ ｅｄ．，Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０１０）Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（６ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ）、Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＶ（５ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，ｅｄｓ．，（１９９５）ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（２ｎｄ ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１ｓｔ ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、Ｍａｙｅｒ ａｎｄ Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｎｉｓｏｎｏｆｆ（１９８４）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、及びＳｔｅｗａｒｄ（１９８４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｈｅｉｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ（１ｓｔ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を参照されたい。
【0012】
本発明がより容易に理解され得るために、特定の用語が本明細書に定義される。追加の定義は、本開示全体を通して記載されている。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（５ｔｈ ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｌａｃｋｉｅ ｅｄ．，２０１３）、ｔｈｅ Ｏｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ ｅｄ．Ｒ．Ｃａｍｍａｃｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００８）、及びＴｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｄ ｅｄ．Ｐ－Ｓ．Ｊｕｏ，２００２）は、本明細書で使用されるいくつかの用語の一般的な定義を当業者に提供することができる。
【0013】
定義及び略語
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうではない限り、複数の指示対象を含む。「ａ」（又は「ａｎ」）という用語、並びに「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、互換的に使用され得る。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうではない限り、複数の指示対象を含む。「ａ」（又は「ａｎ」）という用語、並びに「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、互換的に使用され得る。
【0014】
更に、「及び／又は」は、他方を伴うか又は伴わない２つの特定の特徴又は構成要素の各々の具体的な開示として理解されるべきである。したがって、「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される「及び／又は」という用語は、Ａ及びＢ、Ａ又はＢ、Ａ（単独）、並びにＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で使用される「及び／又は」という用語は、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＢ；Ａ又はＣ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＢ；Ａ及びＣ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）を含むことが意図される。
【0015】
単位、接頭辞、記号は、国際単位系（ＳＩ）で認められている形式で表記する。本明細書に提供される数値範囲は、範囲を定義する数値を含む。
【0016】
数値の用語に「約」又は「およそ」が先行する場合、その用語は、記載された数及び記載された数の値±１０％を含む。
【0017】
本特許開示の文章の後に続く括弧内又は上付きの番号は、本特許開示の「参考文献リスト」セクションに提供される番号付けされた参考文献を指す。
【0018】
実施形態が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という言語で説明される場合、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／又は「～から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で説明される別様の類似の実施形態が含まれる。
【0019】
アミノ酸は、それらの一般的に知られている３文字の記号によって、又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字の記号によって、本明細書で言及される。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般的に受け入れられている１文字コードによって言及される。
【0020】
本明細書で使用される場合、「ＩＬ３３」という略語は、インターロイキン３３を指す。
【0021】
本明細書で使用される場合、「ＩＬＣ２」という略語は、２型自然リンパ細胞を指す。
【0022】
本明細書で使用される場合、「ＩＰ」又は「ｉ．ｐ．」という略語は、腹腔内を指す。ＩＰ経路を介してマウスに薬剤を投与することが一般的であり、これは、ＩＶ経路によってヒト対象に薬剤を投与することに類似すると考えられる。
【0023】
本明細書で使用される場合、「ＩＴ」という略語は、腫瘍内を指す。例えば、腫瘍に直接注射された薬物は、腫瘍内送達される。
【0024】
本明細書で使用される場合、「ＩＶ」という略語は、静脈内を指す。
【0025】
本明細書で使用される場合、「ＰＤＡＣ」という略語は、膵管腺がんを指す。
【0026】
本明細書で使用される場合、「ＴＩＬＣ２」という略語は、腫瘍ＩＬＣ２を指す。ＩＬＣ２に言及する本明細書に記載される実施形態の全てが、ＴＩＬＣ２も包含することが意図されること、及びＩＬＣ２を伴うと本明細書に記載される方法の全てについて、具体的にＴＩＬＣを対象とする代替案も本発明によって企図されることに留意されたい。
【0027】
本明細書で使用される場合、「ＴＬＳ」という略語は、三次リンパ構造を指す。
【0028】
本明細書で使用される場合、「ＰＤ－１」という略語は、プログラム死タンパク質１又はプログラム細胞死タンパク質１としても知られる、プログラム死１を指す。
【0029】
本明細書で使用される場合、ＰＤ－Ｌ１という略語は、ＰＤ－１のリガンドであるプログラム細胞死リガンド１を指す。
【0030】
２つ以上のアミノ酸配列との関連における「同一の」又は「同一性パーセント」という用語は、配列同一性の一部としていかなる保存的アミノ酸置換も考慮せずに、最大一致性のために比較及びアラインされた場合（必要に応じてギャップを導入する）、同じ（同一）であるか、又は同じである特定のパーセンテージのアミノ酸残基（同一性パーセント）を有する、２つ以上のアミノ酸配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用して、又は目視検査によって測定され得る。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアライメントを得るために使用され得る様々なアルゴリズム及びソフトウェアが、当該技術分野で知られている。
【0031】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明の組成物又は方法を使用した治療が企図され得る個体を指す。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト、家庭用ペット、農業又は食糧生産で使用される動物、スポーツ動物、動物園動物などの哺乳動物対象である。いくつかの実施形態では、対象は、非ヒト霊長類である。いくつかの実施形態では、対象は、げっ歯類である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【0032】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、宿主細胞に核酸分子を送達するための構築物を指す。ベクターの例としては、ウイルス、ウイルス由来ベクター、裸のＤＮＡ又はＲＮＡベクター、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ベクターは、宿主細胞に核酸分子を送達することができ、かつ宿主細胞における核酸分子の発現に必要な要素も含有する「発現ベクター」であり得る。
【0033】
他の用語は、本特許開示の他の箇所で定義されているか、又は当該技術分野におけるそれらの通常の意味に従って使用される。
【0034】
活性剤
本発明の方法及び組成物は、ＩＬ３３タンパク質である活性剤を含む。
本発明の方法及び組成物は、ＩＬ３３タンパク質である活性剤を含む。
【0035】
いくつかの自然発生的な、非自然発生的な、及び／又は組換えのＩＬ３３タンパク質を含む、いくつかのＩＬ３３タンパク質が当該技術分野で知られている。当該技術分野で既知であるＩＬ３３タンパク質の例としては、組換えマウスＩＬ３３（担体含有形態又は担体を含まない形態で、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから市販されている）、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｑ８ＢＶＺ５．１に記載されるアミノ酸配列を有するマウスＩＬ３３、組換えヒトＩＬ３３（担体含有形態又は担体を含まない形態で、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから市販されている）、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｏ９５７６０．１に記載されるアミノ酸配列を有するヒトＩＬ３３が挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野で既知の任意のＩＬ３３タンパク質は、そのようなＩＬ３３タンパク質が以下の特性のうちの少なくとも１つを有することを条件として、本発明の方法又は組成物で使用され得る：（ａ）ＩＬ３３受容体ＳＴ２に結合する能力、（ｂ）ＩＬ３３受容体ＳＴ２を活性化する能力、又は（ｃ）ＴＬＳの形成を誘導する能力。
【0036】
ヒトＩＬ３３の完全長野生型バージョンは、２７０アミノ酸長（ａａ１～２７０）である。野生型ヒトＩＬ３３タンパク質の成熟バージョンは、完全長タンパク質のタンパク質分解切断によって生成され、完全長タンパク質の最後／Ｃ末端１５９アミノ酸、すなわち、ａａ１１２～２７０からなる成熟バージョンを含む。本明細書で使用される場合、「ｒＩＬ３３」は、完全長ヒトＩＬ３３のアミノ酸残基１１２～２７０からなる野生型ヒトＩＬ３３の成熟バージョンを指す。ｒＩＬ３３のアミノ酸配列は、当該技術分野で既知であり、便宜上、配列番号１としても本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本発明の方法又は組成物で使用されるＩＬ３３タンパク質は、ｒＩＬ３３である。
【表1】
【0037】
本明細書に提供されるＩＬ３３タンパク質（例えば、ｒＩＬ３３）の具体例に加えて、それらのＩＬ３３タンパク質と比較して修飾されたか、又はそれらのＩＬ３３タンパク質と比較して異なるアミノ酸配列を有するＩＬ３３タンパク質も、ＩＬ３３タンパク質が以下の特性のうちの少なくとも１つを有することを条件として、本発明の方法及び組成物で使用され得る：（ａ）ＩＬ３３受容体ＳＴ２に結合する能力、（ｂ）ＩＬ３３受容体ＳＴ２を活性化する能力、又は（ｃ）ＴＬＳの形成を誘導する能力。
【0038】
いくつかの実施形態では、使用されるＩＬ３３タンパク質は、ＩＬ３３配列及び１つ以上の追加の部分を含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、そのような追加の部分は、タンパク質／ペプチド部分である。いくつかの実施形態では、そのような追加の部分は、非タンパク質化学部分である。いくつかの実施形態では、そのような追加の部分は、ＩＬ３３配列に対してＮ末端にある。いくつかの実施形態では、そのような追加の部分は、ＩＬ３３配列に対してＣ末端にある。いくつかの実施形態では、そのような追加の部分は、ＩＬ３３配列のＮ末端及びＣ末端の両方にある。
【0040】
いくつかの実施形態では、そのような追加の部分は、ＩＬ３３配列の産生、精製、安定性半減期、バイオアベイラビリティ、製剤化、ＳＴ２結合親和性、又は任意の他の治療上望ましい特性を促進及び／又は改善する。
【0041】
例えば、いくつかの実施形態では、そのような追加の部分は、検出及び／又は精製に有用なタグである。例示的なタグとしては、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓｔｒｅｐ ＩＩタグ、ＦＬＡＧタグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、ヘマグルチニンＡ（ＨＡ）タグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ルシフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｃ－Ｍｙｃタグ、プロテインＡタグ、プロテインＧタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0042】
いくつかの実施形態では、そのような追加の部分は、リーダー配列、前駆体ポリペプチド配列、分泌シグナル、及び／又は局在化シグナルである。
【0043】
いくつかの実施形態では、本発明による修飾ＩＬ３３タンパク質は、１つ以上のＰＥＧ分子を含み得、すなわち、それらは、ペグ化され得る。
【0044】
いくつかの実施形態では、本発明による修飾ＩＬ３３タンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインを含み得る。
【0045】
いくつかの実施形態では、本発明による修飾ＩＬ３３タンパク質は、アルブミン結合ドメインを含み得る。
【0046】
修飾ＩＬ３３タンパク質（すなわち、追加の部分を有する）が以下の特性のうちの少なくとも１つを有することを条件として、当該技術分野で既知の任意の追加の部分が使用され得る：（ａ）ＩＬ３３受容体ＳＴ２に結合する能力、（ｂ）ＩＬ３３受容体ＳＴ２を活性化する能力、又は（ｃ）ＴＬＳの形成を誘導する能力。
【0047】
いくつかの実施形態では、そのような追加の部分は、ＩＬ３３アミノ酸配列に直接（共有結合的又は非共有結合的に）付着されている。いくつかの実施形態では、追加の部分は、ペプチドリンカーなどのリンカーを介してＩＬ３３アミノ酸配列に間接的に付着している。いずれの場合も、追加の部分は、化学的コンジュゲーションによって、又はアミノ酸若しくはペプチド若しくはタンパク質部分の場合には、融合タンパク質としての発現によって、を含む、当該技術分野で既知の任意の好適な手段を使用して（直接的又は間接的にかかわらず）ペプチドに結合され得る。
【0048】
本明細書に記載されるＩＬ３３タンパク質は、当該技術分野で既知の任意の好適な手段を使用して調製され得る。例えば、ＩＬ３３タンパク質は、組換えＤＮＡ法を使用して調製され得る。例えば、ＩＬ３３タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好適な発現ベクターにクローニングされ得る。発現ベクターを用いた宿主細胞のトランスフェクションは、宿主細胞による操作されたＩＬ３３タンパク質の生成をもたらす。いくつかの実施形態では、ＩＬ３３は、合成的に産生される。
【0049】
本発明の方法で使用されるＩＬ３３タンパク質は、組成物、例えば、ＩＬ３３タンパク質を含む薬学的組成物中で提供され得る。本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、活性剤（例えば、ＩＬ３３タンパク質）の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態にあり、かつ組成物が投与され得る対象に対して許容できないほど毒性を有する追加の成分を含有しない調製物を指す。そのような組成物は、滅菌であり得る。典型的には、そのような組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的に許容される賦形剤の例としては、水、生理食塩水、塩、緩衝液（例えば、酢酸、リン酸、又はクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、安定剤（例えば、ヒトアルブミン）、可溶化剤、分散剤、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【0050】
方法
いくつかの実施形態では、本発明は、対象において新規三次リンパ構造の形成を誘導する方法を提供する。そのような方法は、対象に有効量のＩＬ３３タンパク質（又はＩＬ３３タンパク質を含む薬学的組成物などの組成物）を投与することを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、対象において新規三次リンパ構造の形成を誘導する方法を提供する。そのような方法は、対象に有効量のＩＬ３３タンパク質（又はＩＬ３３タンパク質を含む薬学的組成物などの組成物）を投与することを含む。
【0051】
いくつかの実施形態では、本発明は、様々な治療方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、対象に有効量のＩＬ３３タンパク質を投与することを含む治療方法を提供する。
【0052】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、及び「治療」という用語は、所与の疾患、症候群、若しくは状態に関連する１つ以上の臨床指標若しくは症状の検出可能な改善を達成すること、並びに／又は達成する方法を実施すること包含する（「疾患」、「症候群」、及び「状態」という用語は、本明細書で互換的に使用され得る）。例えば、疾患又は状態ががんである場合、そのような用語には、腫瘍（又は腫瘍細胞）の成長速度を低減すること、腫瘍（又は腫瘍細胞）の成長を停止すること、腫瘍（又は腫瘍細胞）の退縮の引き起こすこと、腫瘍のサイズ（例えば、腫瘍体積又は腫瘍量の観点から測定される）を低減すること、腫瘍の悪性度を低減すること、腫瘍（又は腫瘍細胞）を除去すること、腫瘍の再発（リバウンド）の予防、遅延、又は減速すること、腫瘍に関連する症状を改善すること、腫瘍からの生存を改善すること、腫瘍の広がり（例えば、転移）を阻害又は低減することなどが含まれるが、これらに限定されない。治療方法に言及する本明細書に記載される実施形態の各々において、上記に列挙される特定のパラメータのうちのいずれか１つ以上を達成する方法も企図される。例えば、腫瘍を治療する方法に言及する本明細書に記載される実施形態の各々について、以下の方法も企図及び意図され、本発明の範囲内にある：（ａ）腫瘍の成長速度を低減する方法、（ｂ）腫瘍の成長を停止する方法、（ｃ）腫瘍の退縮を引き起こす方法、（ｄ）腫瘍のサイズを低減する方法、（ｅ）腫瘍の悪性度を低減する方法、（ｆ）腫瘍を除去する方法、（ｇ）腫瘍の再発（リバウンド）を予防、遅延、又は減速する方法、（ｈ）腫瘍の症状を改善する方法、（ｉ）腫瘍からの生存を改善する方法、及び（ｊ）腫瘍の広がり（例えば、転移）を阻害又は低減する方法。同様に、疾患又は状態が慢性炎症性疾患である場合、そのような治療という用語には、疾患の重症度を低減すること、疾患の期間を低減すること、疾患からの生存を改善すること、疾患の１つ以上の症状を改善することなどが含まれるが、これらに限定されない。
【0053】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類（ラット、マウス、及びモルモットなど）、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどを含むがこれらに限定されない、全ての哺乳動物種を包含し、畜産業で使用される全ての哺乳動物種、並びにペットとして及び動物園で飼育される動物などを含む。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【0054】
いくつかの実施形態では、対象は、がんを有する。いくつかの実施形態では、対象は、膵臓がんを有する。いくつかの実施形態では、対象は、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）を有する。いくつかの実施形態では、対象は、乳がんを有する。いくつかの実施形態では、対象は、黒色腫を有する。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物は、腫瘍又はがんの治療を必要とする対象においてそれを行うために使用され得る。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物は、膵臓腫瘍の治療を必要とする対象（すなわち、膵臓がんを有する対象）においてそれを行うために使用され得る。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物は、膵管腺がん（ＰＤＡＣ）の治療を必要とする対象（すなわち、ＰＤＡＣを有する対象）においてそれを行うために使用され得る。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物は、乳がんの治療を必要とする対象（すなわち、乳がんを有する対象）においてそれを行うために使用され得る。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物は、黒色腫の治療を必要とする対象（すなわち、黒色腫を有する対象）においてそれを行うために使用され得る。いくつかの実施形態では、対象は、他の方法論及び／又は組成物を使用した治療に耐性である腫瘍を有する。本明細書で使用される場合、「耐性の」及び「耐性」という用語は、当該技術分野におけるそれらの通常の使用と一致して、かつがんを治療する医師（例えば、腫瘍医）によるそれらの用語の理解と一致して使用される。例えば、当該技術分野におけるその通常の意味と一致して、腫瘍又は対象は、特定の薬剤（又は薬剤の組み合わせ）を用いた特定の治療方法又は治療に対して、その方法を使用するか又はその薬剤（若しくは薬剤の組み合わせ）を投与しているにもかかわらず、対象の腫瘍（又は腫瘍細胞）が成長、及び／又は進行、及び／又は拡大、及び／又は転移、及び／又は再発する場合、「耐性」とみなされ得る。場合によっては、腫瘍は、当初、特定の方法又は薬剤（又は薬剤の組み合わせ）を用いた治療に感受性であり得るが、後にそのような治療に耐性になった。
【0055】
いくつかの実施形態では、本方法及び組成物は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤耐性腫瘍／がんの治療を必要とする対象（すなわち、ＰＤ－１及び／又はＰＤ－Ｌ１阻害剤耐性腫瘍／がんを有する対象）においてそれを行うために使用され得る。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤耐性ＰＤＡＣの治療を必要とする対象（すなわち、ＰＤ－１及び／又はＰＤ－Ｌ１阻害剤耐性ＰＤＡＣを有する対象）においてそれを行うために使用され得る。
【0056】
いくつかの実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、若しくは外科的切除、又はそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、他の組成物又は方法を用いた以前の治療の後に再発した腫瘍／がんを有する。いくつかの実施形態では、対象は、以前に治療されていない膵臓腫瘍を有する。
【0057】
いくつかの実施形態では、対象は、慢性炎症状態を有する。いくつかの実施形態では、対象は、慢性胃腸炎症状態を有する。いくつかの実施形態では、対象は、大腸炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、及びクローン病から選択される慢性胃腸炎症状態を有する。
【0058】
いくつかの実施形態では、本方法及び組成物は、対象において慢性炎症状態を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物は、慢性胃腸炎症状態を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本方法及び組成物は、大腸炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、及びクローン病から選択される慢性胃腸炎症状態を治療するために使用され得る。
【0059】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、対象において三次リンパ構造の形成を誘導するのに十分である、本明細書に記載される活性剤（すなわち、ＩＬ３３タンパク質）又は薬学的組成物の量を指す。任意の個々の症例における適切な「有効」量は、用量漸増研究などの当該技術分野で既知の標準的な技法を使用して決定され得、所望の投与経路（例えば、全身対腫瘍内）、所望の投与頻度などの要因を考慮して決定され得る。更に、「有効量」は、使用される任意の同時投与方法との関連で決定され得る。当業者は、そのような投与研究を（単剤又は薬剤の組み合わせを使用するかどうかにかかわらず）容易に実施して、例えば、本特許出願の実施例セクションに記載されるものなどのアッセイを使用して、使用する適切な用量を決定することができ、これは、本明細書に記載される薬剤を対象（投与研究を実施するために薬学で日常的に使用される動物対象など）に投与することを伴う。
【0060】
例えば、いくつかの実施形態では、本発明の活性剤の用量は、活性剤の有効性及び／又は有効量を決定するために行われるヒト又は他の哺乳動物における研究に基づいて計算されてもよい。用量は、当該技術分野で既知の方法によって決定され得、活性剤の薬学的形態、投与経路、１つの活性剤のみが使用されるか、又は複数の活性剤が使用されるかどうか（例えば、必要とされる第１の活性剤の用量は、そのような薬剤が第２の活性剤と組み合わせて使用される場合により低くなり得る）、及び年齢、体重、又は薬物代謝に影響を与える任意の医学的状態の存在を含む患者特徴などの要因に依存し得る。
【0061】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な活性剤の好適な用量は、用量漸増研究などの当該技術分野で標準的である投与研究を実施することによって、例えば、本特許出願の実施例セクションでマウスにおいて有効であることが示される投与量を出発点として使用することによって、決定され得る。
【0062】
いくつかの実施形態では、活性剤のうちの１つ以上は、例えば、第Ｉ相臨床試験及び／又は用量漸増研究で決定されるように、その最大耐用量で使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性剤は、その最大耐用量の約９０％で使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性剤は、その最大耐用量の約８０％で使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性剤は、その最大耐用量の約７０％で使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性剤は、その最大耐用量の約６０％で使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性剤は、その最大耐用量の約５０％で使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性剤は、その最大耐用量の約５０％で使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性剤は、その最大耐用量の約４０％で使用される。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性剤は、その最大耐用量の約３０％で使用される。
【0063】
本明細書に記載される方法を行う際に、任意の好適な投与の方法又は経路が、活性剤（すなわち、ＩＬ３３タンパク質）又は薬学的組成物を対象に投与するために使用され得る。いくつかの実施形態では、全身投与、例えば、経口若しくは静脈内（ＩＶ）投与、又は当該技術分野で既知の任意の他の好適な全身投与の方法若しくは経路が、用いられ得る。いくつかの実施形態では、腫瘍内（ＩＴ）送達が、用いられ得る。いくつかの実施形態では、腹腔内（ＩＰ）送達が、用いられ得る。例えば、本明細書に記載される活性剤は、注射によって、カテーテルを通した注入によって、埋め込み可能な薬物送達デバイスを使用して、又は当該技術分野で既知の任意の他の手段によって、全身的又は局所的のいずれかで投与され得る。
【0064】
特定の実施形態では、本明細書に提供される薬学的組成物及び方法は、外科的方法（例えば、腫瘍切除のための）、放射線療法の方法、化学療法剤を用いた治療、抗血管新生剤を用いた治療、チロシンキナーゼ阻害剤を用いた治療、又は免疫チェックポイント阻害剤を用いた治療を含むがこれらに限定されない、がん治療に有用であることが知られている他の薬学的組成物及び方法とともに用いられ得る。同様に、特定の実施形態では、本明細書に提供される方法は、生検方法及び診断方法（例えば、ＭＲＩ方法若しくは他の撮像方法）などの、疾患状態／進行を監視するために使用される手順とともに用いられ得る。
【0065】
例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、腫瘍の外科的切除を実施する前に、例えば、外科的切除の前の腫瘍を縮小するために実施され得る。他の実施形態では、本明細書に記載される方法は、腫瘍の外科的切除を実施する前及び後の両方で実施され得る。
【0066】
特定の実施形態では、本明細書に提供される薬学的組成物及び方法は、慢性炎症状態の治療に有用であることが知られている他の薬学的組成物及び方法とともに用いられ得る。
【0067】
本発明は、以下の非限定的な実施例、並びにその中で参照される図面によって更に説明され、かつそれらを参照して理解される。
【実施例】
【0068】
ＩＬ３３活性化移動性ＩＬＣ２は、膵臓がんにおいて三次リンパ構造を誘導する
本明細書の文章の終わり又は以下の様々な文の括弧内の番号は、本特許出願の参考文献リストセクションの番号付けされた参考文献を指す。
本明細書の文章の終わり又は以下の様々な文の括弧内の番号は、本特許出願の参考文献リストセクションの番号付けされた参考文献を指す。
【0069】
三次リンパ構造（ＴＬＳ）は、慢性炎症及びがんにおける免疫を調節するために、損傷組織において異所的に生じる特定の新規リンパ器官である（１）。それにもかかわらず、ＴＬＳは、慢性組織損傷における宿主防御を決定的に強化する普遍的な構造であるが、ＴＬＳを開始する分子及び細胞は、依然として捕捉しがたいままである。ここで、我々は、損傷組織によって放出されるアラーミン（２）であるインターロイキン－３３（ＩＬ３３）が、２型自然リンパ細胞（ＩＬＣ２）を刺激して、がんにおいてＴＬＳを誘導することを発見する。我々は、ＩＬ３３を、ヒト膵管腺がん（ＰＤＡＣ）、乳がん、及び黒色腫においてＴＬＳ転写シグネチャと最も高度に相関した遺伝子のうちの１つとして特定する。更に、ヒトがんにおいて、ＴＬＳ内の希少なＩＬ３３発現細胞、及びＴＬＳ誘導サイトカインであるリンホトキシン（ＬＴ）を発現するＩＬ３３応答性炎症性ＩＬＣ２（ｉＩＬＣ２）を発見する（３）。マウスにおいて、ＩＬ３３は予想外に、ｉＩＬＣ２がＰＤＡＣ中に移動して、新規ＴＬＳを生成するように誘導する。機構的に、ＩＬ３３は、ｉＩＬＣ２を刺激して、新規ＬＴｂ受容体（ＬＴｂＲ）＋骨髄細胞を活性化して、腫瘍において標準リンパケモカインＣＸＣＬ１３を産生するＬＴを発現させる。ｉＩＬＣ２はまた、ＬＴを利用して、ＬＴｂＲ＋骨髄細胞がＩＬ３３を産生するように誘導し、これが、ｉＩＬＣ２がフィードバックループにおいてＬＴを発現するように相互に誘導する。我々はまた、ヒト組換えＩＬ３３（Ｈ－ｒＩＬ３３）が、ｉＩＬＣ２及びＴＬＳを拡大して、マウスにおいてＰＤＡＣを制御し、ヒトにおいてＬＴ＋ＩＬＣ２を拡大することを示す。したがって、要約すると、ＩＬ３３によって開始され、ＩＬＣ２によって誘導され、骨髄細胞によって組織化された、これまで知られていなかったリンパ新生経路を発見する。更に、我々は、がん免疫療法のためにこの経路を利用し、ＴＬＳを調節してがん及び他の慢性組織病理を治療することができる新しい標的として、ＩＬ３３及びＩＬＣ２を特定する。我々はまた、ＩＬＣ２が組織における異所性リンパ新生を開始するための、これまで認識されていなかった機能を特定する。
【0070】
二次リンパ器官（ＳＬＯ）は、出生前に決定された戦略的な解剖学的部位で免疫細胞を組織化する、哺乳動物における重要な構造（４）である。ＳＬＯは、特定の組織から抗原を排出し、これらの抗原をサンプリングする細胞を、その後に続く免疫応答を実行する細胞と共局在化させ、それによって効率的に組織を巡回し、脅威を取り除く。しかしながら、慢性感染又は腫瘍のように脅威が持続する場合、宿主は、免疫応答の強度及び近接性の両方を高めるために、組織内で異所的に直接的にリンパ器官を発達させなければならない。三次リンパ構造（ＴＬＳ）と呼ばれるこれらの異所性リンパ器官は、感染、炎症、及び新生物を含む、慢性組織病理における遍在的な特徴であり（１）、免疫を調節する役割を果たす。がんにおいて、宿主は表面的には、組織で生じるいかなる腫瘍においてもＴＬＳを発達させ（１）、これらのＴＬＳは、ヒト及びマウスにおいて内因性の抗腫瘍免疫（１）及び治療的な抗腫瘍免疫（５～７）の両方を高める。したがって、ほとんどのヒト腫瘍は、効果的にそれらを現在の免疫療法に耐性の状態にするベースライン免疫細胞（「冷たい」腫瘍）をほとんど有しないため、抗腫瘍免疫を増強するための手段としてＴＬＳを誘導するための新しいがん免疫療法を開発することは、魅力的な目標である。
【0071】
ＩＬ３３は、膵臓がんにおいて三次リンパ構造を誘導する
腫瘍においてＴＬＳを誘導する候補シグナルを特定するために、我々は、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）（８）において、より高い腫瘍内ＴＬＳ密度が免疫を高め（１）１、より長い生存と相関する（１２）、古典的な冷たい腫瘍である膵管腺がん（ＰＤＡＣ）においてＴＬＳ転写シグネチャ（５、９、１０）と発現が正に相関した遺伝子を検索した。ＴＬＳは、それらの独自の誘導ケモカイン（標準ＣＸＣＬ１３１３を含む）、並びに集合細胞（活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び骨髄細胞（１））によって特定され得るため、我々は、そのようなケモカイン（９）、細胞（１０）、及び他の免疫療法促進因子（５）に基づいてＴＬＳを特定する、３つの大部分は重複していない転写シグネチャを選択した。興味深いことに、我々は、損傷組織によって細胞外に急速に放出されるアラーミンをコードするインターロイキン－３３（ＩＬ３３）（２）が、３つ全てのＴＬＳシグネチャの発現、及び標準リンパ組織（１４）及びＴＬＳ誘導サイトカイン（３）ＬＴｂをコードするリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）と最も高度に相関した遺伝子のうちの１つであったことを見出した（図１Ａ）。これを確認するために、我々は、ＩＬ３３が、ＰＤＡＣ患者の第２の前向きに収集されたコホート（図５Ａ、上部）、及び第３の独立して公開された（１５）コホート（図５Ａ、下部）において、ＴＬＳ転写シグネチャ及びＬＴＢと相関したかを試験した。両方のコホートにおいて、我々は、ＩＬ３３発現が、３つ全てのＴＬＳ転写シグネチャの発現及びＬＴＢと強く相関したことを見出した（図５Ａ）。この発見が他のヒト腫瘍にまで及んだかどうかを理解するために、我々は、別の免疫学的に冷たい腫瘍（乳房）、並びに免疫学的に「厚い」（より多くのベースライン免疫細胞）腫瘍（黒色腫）においてＩＬ３３、ＴＬＳ転写シグネチャ、及びＬＴＢ発現を調べた（図１Ｂ）。ＰＤＡＣと同様に、我々は、腫瘍におけるＩＬ３３発現が、両方の腫瘍型においてＴＬＳ転写シグネチャ及びＬＴＢ発現と強く相関したことを見出した（図１Ｂ）。我々は次に、ヒトＰＤＡＣのＴＬＳ内のＩＬ３３＋細胞を検索して、ＩＬ３３が実際にＴＬＳにおいて発現されたかを調べた。一貫して、我々は、ＴＬＳ内の全ての免疫細胞の約２％を占める（図１Ｃ）、全ての観察されたＴＬＳにおけるＩＬ３３＋細胞を見出した（図１Ｃ、図５Ｂ）。これらの結果は、ＩＬ３３を、ヒト腫瘍においてＴＬＳを誘導する新規の候補シグナルとして特定した。
腫瘍においてＴＬＳを誘導する候補シグナルを特定するために、我々は、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）（８）において、より高い腫瘍内ＴＬＳ密度が免疫を高め（１）１、より長い生存と相関する（１２）、古典的な冷たい腫瘍である膵管腺がん（ＰＤＡＣ）においてＴＬＳ転写シグネチャ（５、９、１０）と発現が正に相関した遺伝子を検索した。ＴＬＳは、それらの独自の誘導ケモカイン（標準ＣＸＣＬ１３１３を含む）、並びに集合細胞（活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び骨髄細胞（１））によって特定され得るため、我々は、そのようなケモカイン（９）、細胞（１０）、及び他の免疫療法促進因子（５）に基づいてＴＬＳを特定する、３つの大部分は重複していない転写シグネチャを選択した。興味深いことに、我々は、損傷組織によって細胞外に急速に放出されるアラーミンをコードするインターロイキン－３３（ＩＬ３３）（２）が、３つ全てのＴＬＳシグネチャの発現、及び標準リンパ組織（１４）及びＴＬＳ誘導サイトカイン（３）ＬＴｂをコードするリンホトキシンベータ（ＬＴＢ）と最も高度に相関した遺伝子のうちの１つであったことを見出した（図１Ａ）。これを確認するために、我々は、ＩＬ３３が、ＰＤＡＣ患者の第２の前向きに収集されたコホート（図５Ａ、上部）、及び第３の独立して公開された（１５）コホート（図５Ａ、下部）において、ＴＬＳ転写シグネチャ及びＬＴＢと相関したかを試験した。両方のコホートにおいて、我々は、ＩＬ３３発現が、３つ全てのＴＬＳ転写シグネチャの発現及びＬＴＢと強く相関したことを見出した（図５Ａ）。この発見が他のヒト腫瘍にまで及んだかどうかを理解するために、我々は、別の免疫学的に冷たい腫瘍（乳房）、並びに免疫学的に「厚い」（より多くのベースライン免疫細胞）腫瘍（黒色腫）においてＩＬ３３、ＴＬＳ転写シグネチャ、及びＬＴＢ発現を調べた（図１Ｂ）。ＰＤＡＣと同様に、我々は、腫瘍におけるＩＬ３３発現が、両方の腫瘍型においてＴＬＳ転写シグネチャ及びＬＴＢ発現と強く相関したことを見出した（図１Ｂ）。我々は次に、ヒトＰＤＡＣのＴＬＳ内のＩＬ３３＋細胞を検索して、ＩＬ３３が実際にＴＬＳにおいて発現されたかを調べた。一貫して、我々は、ＴＬＳ内の全ての免疫細胞の約２％を占める（図１Ｃ）、全ての観察されたＴＬＳにおけるＩＬ３３＋細胞を見出した（図１Ｃ、図５Ｂ）。これらの結果は、ＩＬ３３を、ヒト腫瘍においてＴＬＳを誘導する新規の候補シグナルとして特定した。
【0072】
腫瘍におけるＩＬ３３とＴＬＳとの間の相関が原因となったかを調査するために、我々は、ＩＬ３３がＴＬＳを誘導した場合、これが、受容体ＳＴ２に結合することによってそのアラーミン機能を調整するために、細胞外に放出されるＩＬ３３のドメインによって媒介される可能性が高いと仮定した（１６）。これを試験するために、我々は、ＩＬ３３のアラーミンドメイン（すなわち、本明細書で組換えＩＬ３３又は「ｒＩＬ３３」と称されるＩＬ３３のアミノ酸１１２～２７０）を、様々な腫瘍内Ｔ細胞頻度を有するＫｒａｓ及びｐ５３駆動の同所性ＰＤＡＣマウスモデル（ＰＤＡＣマウス）に投与して（図６）（１７）、ヒトＰＤＡＣにおいて観察される可変Ｔ細胞密度をモデル化した（１８）。一貫して、我々は、ｒＩＬ３３が、試験した５つ全てのＰＤＡＣマウスモデルにおいて新規ＴＬＳを誘導したことを見出した（図１Ｄ）。したがって、これらのデータは、ＩＬ３３が、がんにおいてＴＬＳを誘導する新規のアラーミンであることを示唆した。
【0073】
ＩＬ３３は、腫瘍において炎症性ＩＬＣ２を活性化して、リンホトキシンを発現する
我々は次に、ＴＬＳを誘導するためにｒＩＬ３３によって活性化された細胞を特定しようとした。我々は、ＰＤＡＣにおけるｒＩＬ３３の優位な細胞標的としてＳＴ２＋ＩＬＣ２を以前に検出したため（１９）、我々は、前述（１９）のように、ｒＩＬ３３処置ＰＤＡＣマウス（図２Ａ）からの腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節（ＤＬＮ）から精製されたＳＴ２＋ＩＬＣ２の単一細胞トランスクリプトームを調べた。我々は、リンパ球活性化マーカーＫＬＲＧ１、並びにリンパ器官形成１（４、２０、２１）及び新生（３、２２）に不可欠な遺伝子－Ｌｔｂ及びＩｌ７ｒ（図２Ａのクラスター０。拡張データ図３ａ）を高度に共発現した腫瘍及びＤＬＮにおける優勢なＩＬＣ２集団を検出した。ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２（図７Ｂ）は、リンパ組織がＳＬＯを誘導する標準リンパ組織誘導因子ＩＬＣ（ＬＴｉ細胞）に機能的に類似するように誘導するヘテロ三量体サイトカインである、ＬＴａ１ｂ２（リンホトキシン［ＬＴ］）（図２Ｂ）の発現及び誘導的な上方調節の両方を顕著に行った（２３）。しかしながら、転写因子ＲＯＲｇｔ２４を発生的に必要とするＬＴｉ細胞及びＬＴｉ様ＩＬＣ３とは異なり、これらの推定リンパ組織を誘導するＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２は、ＩＬＣ２系統に明らかに由来し、それらは、標準ＩＬＣ２マーカーを発現し（図７Ｃ及びＤ）、ＩＬＣ２転写因子Ｒｏｒａ２５（ＩＬＣ２欠損）の系統特異的欠失を伴う腫瘍及びＤＬＮにおいて枯渇していた（図２Ｃ）。腫瘍及びＤＬＮにおけるＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２はまた、興味深いことに、急性感染組織に血行性に移動する炎症性ＩＬＣ２（ｉＩＬＣ２）（２６，２７）に特徴的な遺伝子（図２Ａ、右－Ｋｌｒｇ１、Ｎｍｕｒ１、Ｐｄｃｄ１、Ａｒｇ１、Ｇａｔａ３）を過剰発現した２（６～２９）。潜在的な移動能力と一致して、ｒＩＬ３３は、血液及びＤＬＮの両方において（図３Ｅ）、並びに６つのマウスモデルからのＰＤＡＣのパネルにおいて（図２Ｄ、図３Ｆ）、ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２を拡大し、更に、ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２がＳＴ２２６を上方制御するように誘導した（図２Ｅ）。重要なことに、我々はまた、マウスにおけるＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２のように、ＬＴを過剰発現した複数のヒト腫瘍に浸潤する希少なＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２も検出した（図２Ｆ、図８）。要約すると、ｒＩＬ３３が、ＬＴを発現する推定移動能力を有するＩＬＣ２を活性化したため、我々は、ＩＬ３３が、ＩＬＣ２が腫瘍に移動するように誘導し、ＬＴ経路を利用してＴＬＳを誘導し得ると仮定した。
我々は次に、ＴＬＳを誘導するためにｒＩＬ３３によって活性化された細胞を特定しようとした。我々は、ＰＤＡＣにおけるｒＩＬ３３の優位な細胞標的としてＳＴ２＋ＩＬＣ２を以前に検出したため（１９）、我々は、前述（１９）のように、ｒＩＬ３３処置ＰＤＡＣマウス（図２Ａ）からの腫瘍及び腫瘍流入領域リンパ節（ＤＬＮ）から精製されたＳＴ２＋ＩＬＣ２の単一細胞トランスクリプトームを調べた。我々は、リンパ球活性化マーカーＫＬＲＧ１、並びにリンパ器官形成１（４、２０、２１）及び新生（３、２２）に不可欠な遺伝子－Ｌｔｂ及びＩｌ７ｒ（図２Ａのクラスター０。拡張データ図３ａ）を高度に共発現した腫瘍及びＤＬＮにおける優勢なＩＬＣ２集団を検出した。ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２（図７Ｂ）は、リンパ組織がＳＬＯを誘導する標準リンパ組織誘導因子ＩＬＣ（ＬＴｉ細胞）に機能的に類似するように誘導するヘテロ三量体サイトカインである、ＬＴａ１ｂ２（リンホトキシン［ＬＴ］）（図２Ｂ）の発現及び誘導的な上方調節の両方を顕著に行った（２３）。しかしながら、転写因子ＲＯＲｇｔ２４を発生的に必要とするＬＴｉ細胞及びＬＴｉ様ＩＬＣ３とは異なり、これらの推定リンパ組織を誘導するＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２は、ＩＬＣ２系統に明らかに由来し、それらは、標準ＩＬＣ２マーカーを発現し（図７Ｃ及びＤ）、ＩＬＣ２転写因子Ｒｏｒａ２５（ＩＬＣ２欠損）の系統特異的欠失を伴う腫瘍及びＤＬＮにおいて枯渇していた（図２Ｃ）。腫瘍及びＤＬＮにおけるＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２はまた、興味深いことに、急性感染組織に血行性に移動する炎症性ＩＬＣ２（ｉＩＬＣ２）（２６，２７）に特徴的な遺伝子（図２Ａ、右－Ｋｌｒｇ１、Ｎｍｕｒ１、Ｐｄｃｄ１、Ａｒｇ１、Ｇａｔａ３）を過剰発現した２（６～２９）。潜在的な移動能力と一致して、ｒＩＬ３３は、血液及びＤＬＮの両方において（図３Ｅ）、並びに６つのマウスモデルからのＰＤＡＣのパネルにおいて（図２Ｄ、図３Ｆ）、ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２を拡大し、更に、ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２がＳＴ２２６を上方制御するように誘導した（図２Ｅ）。重要なことに、我々はまた、マウスにおけるＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２のように、ＬＴを過剰発現した複数のヒト腫瘍に浸潤する希少なＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２も検出した（図２Ｆ、図８）。要約すると、ｒＩＬ３３が、ＬＴを発現する推定移動能力を有するＩＬＣ２を活性化したため、我々は、ＩＬ３３が、ＩＬＣ２が腫瘍に移動するように誘導し、ＬＴ経路を利用してＴＬＳを誘導し得ると仮定した。
【0074】
炎症性ＩＬＣ２は、腫瘍を制御するために移動する。
この仮説を試験するために、我々は、並体結合マウスを使用して、現在の推定（１９）に反して、ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２が実際に、局所的な組織源から生じるのではなく腫瘍に血行性に移動したかを調査した。我々は、コンジェニックＣＤ４５．２ドナーマウスをＣＤ４５．１ ＰＤＡＣレシピエントに外科的に接続し、ドナーにｒＩＬ３３を投与し、レシピエントの血液及び腫瘍においてドナー由来ＩＬＣ２を検索した（図３Ａ）。我々は、レシピエント血液中でドナー及びレシピエント由来のＣＤ４５＋免疫細胞を約１：１の比で見出した（図９Ａ及びＢ）。しかしながら、ｒＩＬ３３は、レシピエント血液（図９Ｃ及びＤ）及び腫瘍（図３Ａ、図９Ｄ及びＥ）において、ＫＬＲＧ１－ＩＬＣ２又は非ＩＬＣ免疫細胞ではなく、ドナー由来ＫＬＲＧ１＋を選択的に拡大した。したがって、現在推定されているのとは異なり、腫瘍におけるＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２は、血行性の源に由来する真正な移動性ｉＩＬＣ２を含有する。
この仮説を試験するために、我々は、並体結合マウスを使用して、現在の推定（１９）に反して、ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２が実際に、局所的な組織源から生じるのではなく腫瘍に血行性に移動したかを調査した。我々は、コンジェニックＣＤ４５．２ドナーマウスをＣＤ４５．１ ＰＤＡＣレシピエントに外科的に接続し、ドナーにｒＩＬ３３を投与し、レシピエントの血液及び腫瘍においてドナー由来ＩＬＣ２を検索した（図３Ａ）。我々は、レシピエント血液中でドナー及びレシピエント由来のＣＤ４５＋免疫細胞を約１：１の比で見出した（図９Ａ及びＢ）。しかしながら、ｒＩＬ３３は、レシピエント血液（図９Ｃ及びＤ）及び腫瘍（図３Ａ、図９Ｄ及びＥ）において、ＫＬＲＧ１－ＩＬＣ２又は非ＩＬＣ免疫細胞ではなく、ドナー由来ＫＬＲＧ１＋を選択的に拡大した。したがって、現在推定されているのとは異なり、腫瘍におけるＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２は、血行性の源に由来する真正な移動性ｉＩＬＣ２を含有する。
【0075】
最近の証拠は、急性局所組織損傷が、局所損傷の変動レベルに対する全身組織保護の対合及び切り替えの両方への適応として、ｉＩＬＣ２を全身的に遠隔組織に押し出すことを示す（３０）。我々は、ｉＩＬＣ２が、慢性的に炎症を起こした「遠隔腫瘍」における免疫を高めるために同様の移動能力を利用する可能性が高い、すなわち、局所腫瘍が、遠隔腫瘍へのｉＩＬＣ２の移動を増幅すると仮定した。この仮説を試験するために、我々は、並体結合マウスを確立し、ＰＤＡＣをドナーマウスの膵臓に移植して局所腫瘍をモデル化し、レシピエントマウスの皮膚（皮下［ＳＱ］）に移植して遠隔腫瘍をモデル化した。我々は次に、ドナーＰＤＡＣマウスをｒＩＬ３３で処置し、レシピエント血液（図１０）及びＳＱ ＰＤＡＣ（図３Ｂ）におけるドナー由来ｉＩＬＣ２を測定した。ドナーｉＩＬＣ２は、レシピエント膵臓ＰＤＡＣ（図３Ａ）だけでなく、レシピエントＳＱ ＰＤＡＣ（図３Ｂ）にも移動して、ｉＩＬＣ２が多様な組織における腫瘍に移動することができたことを示した。興味深いことに、ドナーにおける膵臓ＰＤＡＣの存在は、レシピエントＳＱ ＰＤＡＣへのｒＩＬ３３によって誘導されたｉＩＬＣ２移動を増加させた（図３Ｂ）。遠隔腫瘍へのこのｉＩＬＣ２移動挙動は、ｒＩＬ３３３１及びｒＩＬ２５２６、２７の両方が、ドナーＰＤＡＣにおいてｉＩＬＣ２を拡大したが（図１０Ａ及びＢ）ｒＩＬ２５２３ではなくｒＩＬ３３のみが、ドナーからレシピエント血液（図１０Ｃ）及びＳＱ ＰＤＡＣ（図３Ｃ）にｉＩＬＣ２を播種したため、急性感染に関与するものとは異なるサイトカインを必要とした。ｒＩＬ３３もｒＩＬ２５も、非ＩＬＣ免疫細胞をドナーからレシピエントに移動するように誘導せず（図１０Ｄ）、腫瘍へのｉＩＬＣ２の移動が、他の免疫細胞の移動の結果として生じなかったことを示した。したがって、局所腫瘍は、ｉＩＬＣ２を刺激して遠隔腫瘍に移動させる。これらの結果は、ｉＩＬＣ２が、急性的に炎症を起こした組織だけでなく慢性的に炎症を起こした組織にも移動し、したがって、組織損傷部位に移動するための保存機能を有することを実証した。
【0076】
我々は次に、ｉＩＬＣ２が免疫を高めるために遠隔腫瘍に移動したかを調査した。我々は、膵臓（局所）及び／又はＳＱ（遠隔）ＰＤＡＣをマウスに移植し、これらのマウスをｒＩＬ３３で処置し、ＳＱ ＰＤＡＣ成長を調べた（図３Ｄ）。ＳＱ ＰＤＡＣマウスにおいて、ｒＩＬ３３は、腫瘍内ｉＩＬＣ２密度を最小限に拡大し、以前の結果と一致して、ＳＱ ＰＤＡＣ成長を有意に制限することに失敗した（図３Ｄ、左）（１９）。しかしながら、二重ＰＤＡＣマウスにおいて、並体結合マウスにおけるＩＬＣ２拡大と同様に（図３Ｂ）、ｒＩＬ３３は、腫瘍内ｉＩＬＣ２を拡大し、ＳＱ ＰＤＡＣ成長を制限した（図３Ｄ、右）。特に、ｒＩＬ３３は、Ｉｌ１ｒｌ１－／－（図３Ｅ）又はＩＬＣ２欠損（図３Ｆ）の二重ＰＤＡＣマウスのいずれにおいても、ＳＱ ＰＤＡＣ成長を制御せず、ｒＩＬ３３が、遠隔腫瘍を制御するために、その受容体Ｉｌ１ｒｌ１（ＳＴ２）及びＩＬＣ２を通したインタクトなシグナル伝達を必要としたことを示した。したがって、これらのデータは、ｉＩＬＣ２が、遠隔腫瘍に移動して腫瘍成長を制限することを示した。
【0077】
炎症性ＩＬＣ２は、リンホトキシンを利用して腫瘍における三次リンパ構造を誘導する
ｒＩＬ３３が、ｉＩＬＣ２が腫瘍において拡大し（図３Ａ、Ｂ）、ＬＴを上方制御するように誘導したため（図２Ｂ）、我々は、ｉＩＬＣ２が、ＴＬＳを開始し、腫瘍を抑制するための誘導細胞としての役割を果たし得ると推論した。これを試験するために、我々は、ＩＬＣ２、又はリンパ組織発達を媒介するＬＴ経路の必須受容体であるＬＴｂＲのいずれかが欠損した二重ＰＤＡＣマウスに、ｒＩＬ３３を投与した。（３２）ｒＩＬ３３は、ＩＬＣ２欠損（図４Ａ）及びＬｔｂｒ－／－二重ＰＤＡＣマウス（図４Ｂ、左）の両方で、膵臓ＰＤＡＣにおいてＴＬＳを誘導することに失敗し、また、これらのマウスにおいて原発腫瘍又は遠隔腫瘍のいずれも制限しなかった（図３Ｆ、図４Ｂ中央）。したがって、ｒＩＬ３３は、ＴＬＳを誘導し、腫瘍を制御するために、ＩＬＣ２及び機能的ＬＴ経路を必要とした。
ｒＩＬ３３が、ｉＩＬＣ２が腫瘍において拡大し（図３Ａ、Ｂ）、ＬＴを上方制御するように誘導したため（図２Ｂ）、我々は、ｉＩＬＣ２が、ＴＬＳを開始し、腫瘍を抑制するための誘導細胞としての役割を果たし得ると推論した。これを試験するために、我々は、ＩＬＣ２、又はリンパ組織発達を媒介するＬＴ経路の必須受容体であるＬＴｂＲのいずれかが欠損した二重ＰＤＡＣマウスに、ｒＩＬ３３を投与した。（３２）ｒＩＬ３３は、ＩＬＣ２欠損（図４Ａ）及びＬｔｂｒ－／－二重ＰＤＡＣマウス（図４Ｂ、左）の両方で、膵臓ＰＤＡＣにおいてＴＬＳを誘導することに失敗し、また、これらのマウスにおいて原発腫瘍又は遠隔腫瘍のいずれも制限しなかった（図３Ｆ、図４Ｂ中央）。したがって、ｒＩＬ３３は、ＴＬＳを誘導し、腫瘍を制御するために、ＩＬＣ２及び機能的ＬＴ経路を必要とした。
【0078】
ｉＩＬＣ２が、ＬＴを利用してＴＬＳを直接誘導したかを調べるために、我々は、ｒＩＬ３３処置Ｌｔｂｒ－／－腫瘍におけるｉＩＬＣ２頻度を調べて、機能的ＬＴシグナル伝達がなかったときにｉＩＬＣ２頻度が変化したかを評価した。興味深いことに、ｉＩＬＣ２は、Ｌｔｂｒ－／－マウスの腫瘍において有意に低減されて（図４Ｂ、右）、ｉＩＬＣ２が、ＬＴ－ＬＴｂＲ経路を利用して腫瘍内に蓄積して、ＴＬＳを誘導する可能性があることを示唆した。これを試験するために、我々は、野生型（ＷＴ）又はＬｔｂ－／－マウスにおけるＰＤＡＣから単離したｉＩＬＣ２を、ＩＬＣ２欠損ＰＤＡＣレシピエントに移した（図４Ｃ、図１１Ａ）。一貫して、Ｌｔｂ欠損は、腫瘍内に蓄積し、ＴＬＳを誘導し、腫瘍成長を制御するｉＩＬＣ２能力を損なった（図４Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ｉＩＬＣ２がＬＴを利用して、腫瘍内に蓄積し、ＴＬＳを誘導し、成長を制限することを実証した。
【0079】
ＳＬＯ及びＴＬＳにおいて、誘導細胞上のＬＴは、間質オーガナイザー細胞上のＬＴｂＲに結合して、ＬＴを誘導するリガンド発現を刺激して、それによって、フィードフォワードループを通したリンパ新生を調整する。（３３）ｉＩＬＣ２は一見したところ、新規のＴＬＳ経路において誘導細胞として機能したため、我々は、パートナーのＬＴｂＲ＋オーガナイザー細胞を検索した。我々は、ＰＤＡＣにおいて、ＩＬ３３＋免疫細胞が、ＬＴｂＲを最も高度に発現することを興味深いことに見出した（図４Ｄ）。これらのＬＴｂＲ＋ＩＬ３３＋細胞は、骨髄由来骨髄細胞のマーカーを発現し３４（図４Ｅ）、重要なことに、標準リンパ組織組織化サイトカインであるＣＸＣＬ１３及びＣＣＬ２１も発現した３５（図４Ｅ）。したがって、我々は、ＰＤＡＣ患者のＴＬＳ内で同様のＩＬ３３＋免疫細胞も検出したため（図１Ｃ）、我々は、これらのＩＬ３３＋ＬＴｂＲ＋骨髄細胞が、腫瘍におけるｉＩＬＣ２及びＴＬＳを増幅するために局所的なＩＬ３３産生を機能的に高める候補ＴＬＳオーガナイザー細胞であると仮定した。
【0080】
ＬＴｂＲ＋骨髄細胞が、ＴＬＳオーガナイザー細胞として機能したかを試験するために、我々は最初に、骨髄細胞由来ＩＬ３３が、腫瘍におけるＬＴ又はＴＬＳを誘導するｉＩＬＣ２の能力を調節したかを調査した。Ｉｌ３３－／－ＰＤＡＣマウスの腫瘍に、ＩＬ３３の欠損がないか、又はＩＬ３３が欠損しているかのいずれかのＬＴｂＲ＋骨髄細胞を移植し、ｉＩＬＣ２及びＴＬＳを調べた（図４Ｆ、図１１Ｂ）。興味深いことに、ＬＴｂＲ＋骨髄細胞由来ＩＬ３３は、腫瘍におけるｉＩＬＣ２がＬＴを上方制御し、ＴＬＳを誘導し、ＰＤＡＣを制御するように誘導するのに十分であり（図４Ｆ）、ＬＴｂＲ＋ＩＬ３３＋細胞が、腫瘍におけるＴＬＳオーガナイザー細胞として機能し得ることを示した。実際、ｉＩＬＣ２のように、我々が、Ｌｔｂｒ－／－ＰＤＡＣにおいてより少ないＩＬ３３＋ＣＸＣＬ１３＋を検出したとおり、ＬＴｂＲ＋ＩＬ３３＋細胞は、ＬＴ－ＬＴｂＲ経路を利用して腫瘍にとどまり（図４Ｇ）、したがって、ｉＩＬＣ２（図４Ｂ）と同様に、腫瘍に蓄積するために機能的なＬＴシグナル伝達が必要であった。ｉＩＬＣ２由来のＬＴが、腫瘍においてＩＬ３３＋細胞上のＬＴｂＲに結合してＣＸＣＬ１３を産生したかを試験するために、我々は、ＷＴ又はＬｔｂ－／－ｉＩＬＣ２をＩＬＣ２欠損ＰＤＡＣレシピエントに移した。ｉＩＬＣ２細胞固有ＬＴは、腫瘍において、ＰＤＡＣにおけるＩＬ３３＋ＬＴｂＲ＋細胞を刺激して、ＣＸＣＬ１３の１細胞当たりの産生を有意に増加させ、かつそれより低い程度まで、ＣＸＣＬ１３＋細胞頻度を増加させるのに十分であった（図４Ｈ）。ＬＴｂＲシグナル伝達が、骨髄細胞においてＩＬ３３発現を誘導したかを調べるために、我々は、ＷＴ及びＬｔｂｒ－／－骨髄細胞におけるＩＬ３３発現を調べて、ＬＴｂＲ欠損が、ＩＬ３３発現を減少させたことを見出した（図４Ｉ、左）。一貫して、インビトロでアゴニストＬＴｂＲ－Ｉｇを用いて骨髄細胞上のＬＴｂＲを刺激することにより、骨髄細胞がＩＬ３３を用量依存的に上方制御するように誘導した（図４Ｉ、右）。まとめると、これらのデータは、ｉＩＬＣ２及び骨髄細胞が、ＬＴ－ＬＴｂＲ経路を利用して、腫瘍においてそれらの細胞頻度を相互に維持し、ＣＸＣＬ１３を産生し、ＴＬＳを誘導することを示した。したがって、我々は、腫瘍における新規のＴＬＳ誘導細胞及びオーガナイザー細胞として、ｉＩＬＣ２及び骨髄細胞を特定する。
【0081】
ＩＬ３３－ＴＬＳ経路は、がん免疫療法のために操作され得る
我々は、ＩＬ３３がＳＴ２＋ｉＩＬＣ２を活性化して（図２Ｄ）、ＴＬＳを誘導し（図４Ａ、Ｃ）、ＳＴ２依存的に腫瘍を制御する（図３Ｅ）ことを見出したため、我々は、ＩＬ３３－ＳＴ２経路が、がん免疫療法のために操作され得ると推論した。我々は、マウスｒＩＬ３３のヒト等価量（Ｈ－ｒＩＬ３３）を合成した、
我々は、ＩＬ３３がＳＴ２＋ｉＩＬＣ２を活性化して（図２Ｄ）、ＴＬＳを誘導し（図４Ａ、Ｃ）、ＳＴ２依存的に腫瘍を制御する（図３Ｅ）ことを見出したため、我々は、ＩＬ３３－ＳＴ２経路が、がん免疫療法のために操作され得ると推論した。我々は、マウスｒＩＬ３３のヒト等価量（Ｈ－ｒＩＬ３３）を合成した、
【0082】
慢性炎症状態における効果
我々は、ＩＬ３３が、慢性炎症及びがんの両方のマウスモデルにおいてＴＬＳを生成するかを判断するための実験を実施した。
我々は、ＩＬ３３が、慢性炎症及びがんの両方のマウスモデルにおいてＴＬＳを生成するかを判断するための実験を実施した。
【0083】
大腸ＴＬＳを誘導するデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘導性の炎症性大腸炎のマウスモデルでは、ＩＬ３３－／－マウスは、ＤＳＳ処置ＷＴマウス（Ｐ＝０．０００１）と比較して、有意により少ない大腸ＴＬＳを有し（Ｐ＝０．００９）、生存が悪化した。図１２は、炎症によって誘導された大腸三次リンパ構造（ＴＬＳ）のＤＳＳ大腸炎モデルの概略図を提供する。簡潔に述べると、野生型（ＷＴ）又はＩＬ３３－／－マウスを、飲料水中３％ＤＳＳで７日間処置し、１４日間回復させた（ＤＳＳ曝露なし）。大腸におけるＴＬＳを定量化した。このモデルにおけるｒＩＬ３３を用いたマウスの処置は、生存の改善につながる。図１３は、野生型（ＷＴ）マウスを、飲料水中３％デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）及びｒＩＬ３３（５００ｎｇ）で毎日７日間処置し、その後、７日間回復させ（ＤＳＳ曝露なし。ｒＩＬ３３を３回／週）、生存を評価した（下部）研究からの結果を提供する。
【0084】
したがって、ＩＬ３３は、慢性炎症状態及びがんの両方においてＴＬＳ形成を誘導し、転帰の改善につながる。
【0085】
考察
我々の結果は、危険シグナルが組織における移動性細胞のリンパ性応答を活性化する新しい経路を明らかにする。新規のＴＬＳ経路の特定は、がん免疫療法及び慢性炎症性疾患の両方に影響がある。ＩＬ３３－ＳＴ２経路がＴＬＳを誘導するこれまで知られていなかったこの機能にもかかわらず、我々はまた、ＩＬＣ２及び骨髄細胞を、ＴＬＳを生成する新規の誘導細胞及びオーガナイザー細胞として特定し、それによって、ＩＬＣ２が腫瘍を制御する、認識されていない作用機構を明らかにする。要約すると、我々は、慢性的に炎症を起こした組織においてリンパ新生を誘導する新しい分子及び細胞を発見する。
我々の結果は、危険シグナルが組織における移動性細胞のリンパ性応答を活性化する新しい経路を明らかにする。新規のＴＬＳ経路の特定は、がん免疫療法及び慢性炎症性疾患の両方に影響がある。ＩＬ３３－ＳＴ２経路がＴＬＳを誘導するこれまで知られていなかったこの機能にもかかわらず、我々はまた、ＩＬＣ２及び骨髄細胞を、ＴＬＳを生成する新規の誘導細胞及びオーガナイザー細胞として特定し、それによって、ＩＬＣ２が腫瘍を制御する、認識されていない作用機構を明らかにする。要約すると、我々は、慢性的に炎症を起こした組織においてリンパ新生を誘導する新しい分子及び細胞を発見する。
【0086】
方法
Ｃ５７ＢＬ／６（野生型、ＷＴ、ＣＤ４５．２）及びＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．１マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。全ての実験について、６～１２週齢のマウスを年齢及び性別によって対応させ、特定の処置群に無作為に割り当て、全体を通して少なくとも２つの独立した実験を実施した。実験のための試料サイズを、正式な出力計算なしで決定した。動物を、特定の病原体のない動物施設で繁殖させ、維持し、全ての実験を、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）承認プロトコルに従って、かつ全ての関連する倫理規制を順守して行った。
Ｃ５７ＢＬ／６（野生型、ＷＴ、ＣＤ４５．２）及びＣ５７ＢＬ／６ ＣＤ４５．１マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。全ての実験について、６～１２週齢のマウスを年齢及び性別によって対応させ、特定の処置群に無作為に割り当て、全体を通して少なくとも２つの独立した実験を実施した。実験のための試料サイズを、正式な出力計算なしで決定した。動物を、特定の病原体のない動物施設で繁殖させ、維持し、全ての実験を、Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＫＣＣ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）承認プロトコルに従って、かつ全ての関連する倫理規制を順守して行った。
【0087】
細胞株及び動物の処置
全ての腫瘍細胞株は、ＫＰＣ（Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋、ＬＳＬ－Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋）又はＫＰＣＹ（Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋、ＬＳＬ－Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋、Ｒｏｓａ２６ＹＦＰ／ＹＦＰ）に由来した。全ての細胞株は、専任の膵臓がん病理学者による組織病理学的検証に基づいて、真正なＰＤＡＣ細胞株として認証された。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ＩＬ３３細胞株（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及び１００μｇ／ｍｌのノルモシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）中で、３７℃、５％ＣＯ２において培養した。全ての他の細胞株を、１０％ＦＢＳ及びグルタミン（２ｍＭ）を含むＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２において培養した。全ての細胞株を、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を使用して定期的に試験した。
全ての腫瘍細胞株は、ＫＰＣ（Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋、ＬＳＬ－Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋）又はＫＰＣＹ（Ｐｄｘ１－Ｃｒｅ、ＬＳＬ－ＫｒａｓＧ１２Ｄ／＋、ＬＳＬ－Ｔｒｐ５３Ｒ１７２Ｈ／＋、Ｒｏｓａ２６ＹＦＰ／ＹＦＰ）に由来した。全ての細胞株は、専任の膵臓がん病理学者による組織病理学的検証に基づいて、真正なＰＤＡＣ細胞株として認証された。ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ－ＩＬ３３細胞株（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及び１００μｇ／ｍｌのノルモシン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）中で、３７℃、５％ＣＯ２において培養した。全ての他の細胞株を、１０％ＦＢＳ及びグルタミン（２ｍＭ）を含むＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２において培養した。全ての細胞株を、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ）を使用して定期的に試験した。
【0088】
腫瘍を、前述（１９）のように同所的（膵臓、「ＰＤＡＣ」マウス）又は皮下（ＳＱ）に確立した。簡潔に述べると、同所移植のために、ケタミン／キシラジンカクテルを使用してマウスを麻酔し、小さな（７ｍｍ）左脇腹切開を行った。腫瘍細胞（ＫＰＣ－４６６２については１０６個の細胞。他の全てについては１０５個の細胞）を、マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に懸濁し、５０ｍｌの総体積の冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて１：１で希釈し、２６ゲージの針を使用して膵臓の尾部に注射した。注射の成功を、腹腔内漏出のない流体泡の出現によって検証した。腹壁を吸収性Ｖｉｃｒｙｌ ＲＡＰＩＤＥ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ）で閉じ、皮膚を創傷クリップ（Ｒｏｂｏｚ）で閉じた。ＳＱ移植について、腫瘍細胞（ＫＰＣ－４６６２については５×１０５個の細胞、他の全てについては５×１０４個の細胞）を、滅菌ＰＢＳ中に再懸濁し、皮下移植した。全ての腫瘍を、特に明記しない限り、ＫＰＣ－４６６２を用いて確立した。同所性腫瘍について、前述（２５）のように、連続超音波（Ｖｅｖｏ ２１００ Ｌｉｎｅａｒ Ａｒｒａｙ Ｉｍａｇｉｎｇ及びＶｉｖｏ ＬＡＢ Ｖｅｒｓｉｏｎ３．１．１、Ｆｕｊｉ Ｆｉｌｍ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｏｎｉｃｓ）を使用して、腫瘍体積を測定した。腫瘍を指示された時点で採取した。異なる細胞株に由来するＰＤＡＣにおけるＴ細胞浸潤を評価するために（図６）、腫瘍を、それらが等価体積であった時点で採取した。ＳＱ腫瘍について、腫瘍の長さ及び幅を２～３日毎にキャリパーで測定し、腫瘍体積を体積＝１／２長さ×幅２として計算した。マウスを指示された時点で屠殺し、組織学又はフローサイトメトリーのために処理した。生存分析のために、生存を、施設のＩＡＣＵＣガイドラインによって定義されるように、３５００ｍｍ３の腫瘍体積又は安楽死を必要とするマウスの健康によって決定した。どのマウス腫瘍も、ＩＡＣＵＣによって定義された３２ｃｍ３の最大腫瘍体積を超えなかった。処置群の知識が必要とされたため、実験マウス介入では盲検化を実施しなかった。
【0089】
並体結合
前述（２７）のように、６週齢の雌のコンジェニックＣＤ４５．１及びＣＤ４５．２マウスを外科的に接続した。簡潔に述べると、同様の体重のマウスを、手術の２週間前に共同収容し、手術の前日に始まって予防的抗生物質（Ｓｕｌａｆｔｒｉｍ ｄｉｅｔ、ＷＦ Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．）で処置した。各マウスの肘から膝に対応する側方皮膚切開を行い、前肢及び後肢を縫合し、皮膚切開を閉じた。手術後、マウスを、予防的スルファメトキサゾールを補充した食事で２週間、続いて通常の食事で維持した。並体結合手術の４週間後に血液キメラを確認した後、上記のように膵臓及び／又はＳＱ ＰＤＡＣを移植した。腫瘍移植の５、７、及び９日後に、Ｇｏｌｄｅｎ ｒｏｄアニマルランセット（Ｍｅｄｉｐｏｉｎｔ，Ｉｎｃ．）を使用して、レシピエントマウスの顎下静脈から末梢血を採取した。腫瘍移植の１４日後に、並体結合体を安楽死させ、器官を採取した。
前述（２７）のように、６週齢の雌のコンジェニックＣＤ４５．１及びＣＤ４５．２マウスを外科的に接続した。簡潔に述べると、同様の体重のマウスを、手術の２週間前に共同収容し、手術の前日に始まって予防的抗生物質（Ｓｕｌａｆｔｒｉｍ ｄｉｅｔ、ＷＦ Ｆｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｓｏｎ，Ｉｎｃ．）で処置した。各マウスの肘から膝に対応する側方皮膚切開を行い、前肢及び後肢を縫合し、皮膚切開を閉じた。手術後、マウスを、予防的スルファメトキサゾールを補充した食事で２週間、続いて通常の食事で維持した。並体結合手術の４週間後に血液キメラを確認した後、上記のように膵臓及び／又はＳＱ ＰＤＡＣを移植した。腫瘍移植の５、７、及び９日後に、Ｇｏｌｄｅｎ ｒｏｄアニマルランセット（Ｍｅｄｉｐｏｉｎｔ，Ｉｎｃ．）を使用して、レシピエントマウスの顎下静脈から末梢血を採取した。腫瘍移植の１４日後に、並体結合体を安楽死させ、器官を採取した。
【0090】
組換えＨ－ｒＩＬ３３
Ｈ－ｒＩＬ３３タンパク質を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で生成した。簡潔に述べると、ヒトＩＬ２シグナルペプチド配列に続いて、標的ＤＮＡ配列をコドン最適化し、合成し、サイトメガロウイルスプロモーター駆動型発現ベクターにサブクローニングした。タンパク質をＨＤ ＣＨＯ細胞において一過性トランスフェクトによって発現し、親和性クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製して、所望の純度を得た。精製されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、及びＨＰＬＣ分析によって分析して、分子量及び純度を決定した
Ｈ－ｒＩＬ３３タンパク質を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で生成した。簡潔に述べると、ヒトＩＬ２シグナルペプチド配列に続いて、標的ＤＮＡ配列をコドン最適化し、合成し、サイトメガロウイルスプロモーター駆動型発現ベクターにサブクローニングした。タンパク質をＨＤ ＣＨＯ細胞において一過性トランスフェクトによって発現し、親和性クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィーによって精製して、所望の純度を得た。精製されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、及びＨＰＬＣ分析によって分析して、分子量及び純度を決定した
【0091】
組換えＩＬ３３、ＩＬ２５、及びＨ－ｒＩＬ３３処置
腫瘍移植後、マウスを、５００ｎｇの担体を含まない組換えマウスＩＬ３３１９、ＩＬ２５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、又は組換えヒトＩＬ３３（Ｈ－ｒＩＬ３３、Ｐｒｏｔｅｏｓ，Ｉｎｃ．）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で、７日間毎日、次いでその後２日毎に処置した。
腫瘍移植後、マウスを、５００ｎｇの担体を含まない組換えマウスＩＬ３３１９、ＩＬ２５（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、又は組換えヒトＩＬ３３（Ｈ－ｒＩＬ３３、Ｐｒｏｔｅｏｓ，Ｉｎｃ．）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射で、７日間毎日、次いでその後２日毎に処置した。
【0092】
ヒト試料
ＭＳＫＣＣ治験審査委員会による研究プロトコルの承認後に、全ての組織をＭＳＫＣＣで採取した。全ての患者について、インフォームドコンセントを得た。全ての施設の倫理規制を厳密に順守して、研究を実施した。全ての腫瘍試料は、外科的に切除された一次ＰＤＡＣ（腫瘍トランスクリプトームプロファイリング用）、又は外科的に切除された一次ヒトＰＤＡＣ若しくは大腸直腸肝転移（フローサイトメトリー用）であった。使用したヒトＰＤＡＣ組織マイクロアレイは、以前に記載されている（１９）。
ＭＳＫＣＣ治験審査委員会による研究プロトコルの承認後に、全ての組織をＭＳＫＣＣで採取した。全ての患者について、インフォームドコンセントを得た。全ての施設の倫理規制を厳密に順守して、研究を実施した。全ての腫瘍試料は、外科的に切除された一次ＰＤＡＣ（腫瘍トランスクリプトームプロファイリング用）、又は外科的に切除された一次ヒトＰＤＡＣ若しくは大腸直腸肝転移（フローサイトメトリー用）であった。使用したヒトＰＤＡＣ組織マイクロアレイは、以前に記載されている（１９）。
【0093】
腫瘍トランスクリプトームプロファイリング：外科的に切除されたＰＤＡＣ患者からの一次ＰＤＡＣを、前述（１９）のように、トランスクリプトームプロファイリングを受けるように無作為に選択した。簡潔に述べると、新鮮な凍結ＯＣＴ包埋腫瘍からの総ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓ（１５５９６－０２６、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抽出し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒで適格とし、蛍光光度法（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ）によって定量化し、ＷＴ Ｐｉｃｏ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用して全トランスクリプトーム発現分析のために調製した。次いで、低サイクルＰＣＲを使用してＲＮＡを増幅し、続いてＴ７インビトロ転写技術を使用して線形増幅した。次いで、ｃＲＮＡをビオチン化センス鎖ＤＮＡハイブリダイゼーション標的に変換し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｈｕｍａｎ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ａｒｒａｙ２．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイズし、ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｓｃａｎｎｅｒ３０００を使用してスキャンした。データを、Ｒ（バージョン４．０．３）を使用して分析した。
【0094】
細胞単離
マウス及びヒトＰＤＡＣを機械的に解離し、コラゲナーゼ（マウス腫瘍についてはコラゲナーゼＩＩ、ヒト腫瘍についてはコラゲナーゼＩＶ、両方とも５ｍｇ／ｍｌ。Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＮＡｓｅ Ｉ（０．５ｍｇ／ｍｌ。Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、及びハンクス平衡塩液（Ｇｉｂｃｏ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、３０分間、３７℃においてインキュベートした。次いで、消化をウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でクエンチした。次いで、消化された腫瘍及びＤＬＮを機械的に解離し、５％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰＢＳを使用して、１００ｍｍ及び４０ｍｍのナイロンセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して濾過した。脾臓を機械的に解離し、５％ＦＢＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ、続いてＲＢＣ溶解（ＲＢＣ溶解緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、７０ｍｍ及び４０ｍｍのナイロンセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して濾過した。末梢血をＲＢＣ溶解で処理し、４０ｍｍのナイロンセルストレーナーを通して濾過した。マウスＦｃ受容体を、ＦｃｅＲＩＩＩ／ＩＩ特異的抗体（１×１０６個の細胞当たり１μｇ。クローン２．４Ｇ２、Ｂｉｏ ＸＣｅｌｌ）で遮断した。
マウス及びヒトＰＤＡＣを機械的に解離し、コラゲナーゼ（マウス腫瘍についてはコラゲナーゼＩＩ、ヒト腫瘍についてはコラゲナーゼＩＶ、両方とも５ｍｇ／ｍｌ。Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＮＡｓｅ Ｉ（０．５ｍｇ／ｍｌ。Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、及びハンクス平衡塩液（Ｇｉｂｃｏ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、３０分間、３７℃においてインキュベートした。次いで、消化をウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でクエンチした。次いで、消化された腫瘍及びＤＬＮを機械的に解離し、５％ＦＢＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰＢＳを使用して、１００ｍｍ及び４０ｍｍのナイロンセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して濾過した。脾臓を機械的に解離し、５％ＦＢＳ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ、続いてＲＢＣ溶解（ＲＢＣ溶解緩衝液、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、７０ｍｍ及び４０ｍｍのナイロンセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して濾過した。末梢血をＲＢＣ溶解で処理し、４０ｍｍのナイロンセルストレーナーを通して濾過した。マウスＦｃ受容体を、ＦｃｅＲＩＩＩ／ＩＩ特異的抗体（１×１０６個の細胞当たり１μｇ。クローン２．４Ｇ２、Ｂｉｏ ＸＣｅｌｌ）で遮断した。
【0095】
ＩＬＣ２及び骨髄細胞養子移入
ＣＤ４５．１ Ｃ５７Ｂｌ／６、Ｌｔｂ－／－、又はＩｌ３３－／－同所性ＰＤＡＣマウスを、滅菌ＰＢＳ中の５００ｎｇの担体を含まない組換えマウスＩＬ３３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で１０日間毎日処置した。ＩＬＣ２移入について、腫瘍からの生、ＣＤ４５＋、系統－、ＣＤ９０＋、ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２を、Ａｒｉａ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、移植後１０日目に９８％の純度に選別精製した（図１１Ａ）。腫瘍移植の３日後に、ｉ．ｐ．注射を介して、５×１０５個のＩＬＣ２を直ちに同所性ＰＤＡＣ腫瘍保有Ｉｌ７ｒＣｒｅ／＋Ｒｏｒａｆｌ／ｆｌ ＣＤ４５．２マウスに移した。骨髄細胞移入のために、Ａｒｉａ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒを使用して、生、ＣＤ４５＋、ＮＫ１．１－、ＣＤ１１ｂ＋、ＬＴｂＲ＋細胞を、９０％の純度に選別精製した（拡張データ図７ｂ）。養子移入のために、５×１０５個のＣＤ１１ｂ＋、ＬＴｂＲ＋細胞を腫瘍細胞懸濁液と混合し、２６ゲージの針を使用して膵臓の尾部に注射した。ｒＩＬ３３処置（上記のようにマウス当たり５００ｎｇ）を、ＩＬＣ２又は骨髄細胞移入の日にレシピエントマウスにおいて開始し、組織採取の日まで行った。組織を指示された時点で採取した。
ＣＤ４５．１ Ｃ５７Ｂｌ／６、Ｌｔｂ－／－、又はＩｌ３３－／－同所性ＰＤＡＣマウスを、滅菌ＰＢＳ中の５００ｎｇの担体を含まない組換えマウスＩＬ３３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で１０日間毎日処置した。ＩＬＣ２移入について、腫瘍からの生、ＣＤ４５＋、系統－、ＣＤ９０＋、ＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２を、Ａｒｉａ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、移植後１０日目に９８％の純度に選別精製した（図１１Ａ）。腫瘍移植の３日後に、ｉ．ｐ．注射を介して、５×１０５個のＩＬＣ２を直ちに同所性ＰＤＡＣ腫瘍保有Ｉｌ７ｒＣｒｅ／＋Ｒｏｒａｆｌ／ｆｌ ＣＤ４５．２マウスに移した。骨髄細胞移入のために、Ａｒｉａ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒを使用して、生、ＣＤ４５＋、ＮＫ１．１－、ＣＤ１１ｂ＋、ＬＴｂＲ＋細胞を、９０％の純度に選別精製した（拡張データ図７ｂ）。養子移入のために、５×１０５個のＣＤ１１ｂ＋、ＬＴｂＲ＋細胞を腫瘍細胞懸濁液と混合し、２６ゲージの針を使用して膵臓の尾部に注射した。ｒＩＬ３３処置（上記のようにマウス当たり５００ｎｇ）を、ＩＬＣ２又は骨髄細胞移入の日にレシピエントマウスにおいて開始し、組織採取の日まで行った。組織を指示された時点で採取した。
【0096】
フローサイトメトリー
全ての試料をＦＡＣＳ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。マウスＩＬＣ２を、生、ＣＤ４５＋、系統－（ＣＤ３、ＣＤ５、ＮＫ１．１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＦｃｅＲ１）、ＣＤ９０＋として定義した。全ての生、ＣＤ４５＋、系統－、ＣＤ９０＋細胞は、ＧＡＴＡ３＋であった（拡張データ図３ａ）。マウスｉＩＬＣ２を、生、ＣＤ４５＋、系統－（ＣＤ３、ＣＤ５、ＮＫ１．１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＦｃｅＲ１）、ＣＤ９０＋、ＫＬＲＧ１＋として定義した。ヒトＩＬＣ２を、生、ＣＤ４５＋、系統－（ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＴＣＲａ／ｂ、ＦｃｅＲ１）、ＣＤ１２７＋、ＣＲＴＨ２＋として定義した。ヒトＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２を、生、ＣＤ４５＋、系統－（ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＴＣＲａ／ｂ、ＦｃｅＲ１）、ＣＤ１２７＋、ＣＲＴＨ２＋、ＫＬＲＧ１＋として定義した。マウス細胞を、以下の抗体で染色した：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製のＣＤ３（クローン１４５－２Ｃ１１、ＢＶ７１１）、ＣＤ４（クローンＲＭ４－５、ＢＶ７１１及びＢＶ７８６）、ＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、ＣＤ４５．１（クローンＡ２０、ＢＶ７１１及びＡＰＣ－Ｃｙ７）、ＣＤ４５．２（クローン１０４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、ＢＶ５１０）、ＫＬＲＧ１（クローン２Ｆ１／ＫＬＲＧ１、ＢＶ５１０）、ＬＴＢＲ（クローン５Ｇ１１、ＰＥ－Ｃｙ７）、並びにＺｏｍｂｉｅ Ｒｅｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素（カタログ番号４２３１１０）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、ＡＰＣ、及びＡＰＣ－Ｃｙ７）、ＣＤ５（クローン５３－７．３、ＡＰＣ）、ＣＤ１１ｃ（クローンＨＬ３、ＡＰＣ）、ＣＤ９０．２（クローン５３－２．１、ＢＶ７８６）、Ｇａｔａ３（クローンＬ５０－８２３、ＢＶ７１１及びＰＥ）、Ｇｒ－１（クローンＲＢ６－８Ｃ５、ＢＶ６０５）、ＮＫ１．１（クローンＰＫ１３６、ＢＶ６５０及びＡＰＣ）、ＤＲＡＱ７（カタログ番号５１－９０１１１７２）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＣＤ１９（クローンｅＢｉｏ１Ｄ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００）、ＣＤ３（クローン１７Ａ２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００）、ＣＸＣＬ１３（クローンＤＳ８ＣＸ１３、ＡＰＣ）、Ｆ４／８０（クローンＢＭ８、ＰＥ－Ｃｙ５）、ＦｃｅＲ１（クローンＭＡＲ－１、ＡＰＣ）、ＩＬ３３（クローン３９６１１８、ＰＥ）、及びＴＣＲＶｂ（クローンＭＲ－９－４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００）。
全ての試料をＦＡＣＳ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。マウスＩＬＣ２を、生、ＣＤ４５＋、系統－（ＣＤ３、ＣＤ５、ＮＫ１．１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＦｃｅＲ１）、ＣＤ９０＋として定義した。全ての生、ＣＤ４５＋、系統－、ＣＤ９０＋細胞は、ＧＡＴＡ３＋であった（拡張データ図３ａ）。マウスｉＩＬＣ２を、生、ＣＤ４５＋、系統－（ＣＤ３、ＣＤ５、ＮＫ１．１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＦｃｅＲ１）、ＣＤ９０＋、ＫＬＲＧ１＋として定義した。ヒトＩＬＣ２を、生、ＣＤ４５＋、系統－（ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＴＣＲａ／ｂ、ＦｃｅＲ１）、ＣＤ１２７＋、ＣＲＴＨ２＋として定義した。ヒトＫＬＲＧ１＋ＩＬＣ２を、生、ＣＤ４５＋、系統－（ＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ５６、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＴＣＲａ／ｂ、ＦｃｅＲ１）、ＣＤ１２７＋、ＣＲＴＨ２＋、ＫＬＲＧ１＋として定義した。マウス細胞を、以下の抗体で染色した：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製のＣＤ３（クローン１４５－２Ｃ１１、ＢＶ７１１）、ＣＤ４（クローンＲＭ４－５、ＢＶ７１１及びＢＶ７８６）、ＣＤ４５（クローン３０－Ｆ１１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、ＣＤ４５．１（クローンＡ２０、ＢＶ７１１及びＡＰＣ－Ｃｙ７）、ＣＤ４５．２（クローン１０４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、ＢＶ５１０）、ＫＬＲＧ１（クローン２Ｆ１／ＫＬＲＧ１、ＢＶ５１０）、ＬＴＢＲ（クローン５Ｇ１１、ＰＥ－Ｃｙ７）、並びにＺｏｍｂｉｅ Ｒｅｄ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素（カタログ番号４２３１１０）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＣＤ１１ｂ（クローンＭ１／７０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、ＡＰＣ、及びＡＰＣ－Ｃｙ７）、ＣＤ５（クローン５３－７．３、ＡＰＣ）、ＣＤ１１ｃ（クローンＨＬ３、ＡＰＣ）、ＣＤ９０．２（クローン５３－２．１、ＢＶ７８６）、Ｇａｔａ３（クローンＬ５０－８２３、ＢＶ７１１及びＰＥ）、Ｇｒ－１（クローンＲＢ６－８Ｃ５、ＢＶ６０５）、ＮＫ１．１（クローンＰＫ１３６、ＢＶ６５０及びＡＰＣ）、ＤＲＡＱ７（カタログ番号５１－９０１１１７２）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＣＤ１９（クローンｅＢｉｏ１Ｄ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００）、ＣＤ３（クローン１７Ａ２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００）、ＣＤ８（クローン５３－６．７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００）、ＣＸＣＬ１３（クローンＤＳ８ＣＸ１３、ＡＰＣ）、Ｆ４／８０（クローンＢＭ８、ＰＥ－Ｃｙ５）、ＦｃｅＲ１（クローンＭＡＲ－１、ＡＰＣ）、ＩＬ３３（クローン３９６１１８、ＰＥ）、及びＴＣＲＶｂ（クローンＭＲ－９－４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００）。
【0097】
マウスＬＴ発現を検出するために、単一細胞懸濁液を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び４ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で、４℃の暗所において３０分間、組換えマウスＬＴｂＲ－Ｆｃキメラタンパク質（１μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）とインキュベートし、次いでその後に４℃の暗所で３０分間、二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａコンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした。ＣＣＬ２１検出のために、固定及び透過処理された単一細胞懸濁液を、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｓｔａｉｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中で、４℃の暗所において３０分間、抗ＣＣＬ２１抗体（カタログ番号ＰＡ５－４７０１６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートし、続いて４℃の暗所で３０分間、二次抗体（ウサギ抗ヤギＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした。
【0098】
ヒト細胞を、以下の抗体で染色した：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＧＡＴＡ３（クローンＬ５０－８２３、ＰＥ）、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ製のＣＤ１１ｂ（クローンＩＣＲＦ４４、ＡＰＣ）、ＣＤ４５（クローンＨＩ３０、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）、ＣＤ５６（クローンＨＣＤ５６、ＢＶ６０５）、ＣＲＴＨ２（クローンＢＭ１６、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５及びＰＥ）、ＦｃｅＲ１（クローンＡＥＲ－３７、ＡＰＣ）、ＫＬＲＧ１（クローン２Ｆ１／ＫＬＲＧ１、ＢＶ５１０）、ＴＢＥＴ（クローン４Ｂ１０、ＢＶ７１１）、並びにＴＣＲａ／ｂ（クローンＩＰ２６、ＡＰＣ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＣＤ１４（クローン６１Ｄ３、ＡＰＣ）、ＣＤ１６（クローンＣＢ１６、ＡＰＣ）、ＣＤ１１ｃ（クローン３．９、ＡＰＣ）、ＣＤ１２７（クローンＲＤＲ５、ＦＩＴＣ）、ＣＤ３（クローンＯＫＴ３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００）、ＣＤ５（クローンＬ１７Ｆ１２、ＡＰＣ）、及びＣＤ１９（クローンＨＩＢ１９、ＡＦ７００）。
【0099】
ヒトＬＴ発現を検出するために、単一細胞懸濁液を、１％ＦＢＳ及び０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰＢＳ中で、４℃の暗所において３０分間、組換えヒトＬＴｂＲ－Ｆｃキメラタンパク質（２μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、６２９－ＬＲ）とインキュベートし、続いて４℃の暗所で３０分間、二次抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした。フローサイトメトリー用の全ての試料は、前向きに採取された、選択されていない患者からのものであった。
【0100】
ヘマトキシリン及びエオシン染色
膵臓腫瘍を２ｍｍ厚のスライスに切断し、４％パラホルムアルデヒド溶液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）で固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、２０倍／０．８ＮＡの対物レンズを用いてＰａｎｏｒａｍｉｃ Ｓｃａｎｎｅｒ（３ＤＨｉｓｔｅｃｈ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）でスキャンした。ＴＬＳの数を、ＱｕＰａｔｈ（ｖｅｒ．０．２．３。ｈｔｔｐｓ：／／ｑｕｐａｔｈ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／）を使用して少なくとも３つの切片で決定した。５，０００μｍ２を超えるリンパ球のコンパクトな凝集体をＴＬＳとみなした４７。
膵臓腫瘍を２ｍｍ厚のスライスに切断し、４％パラホルムアルデヒド溶液（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）で固定し、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、２０倍／０．８ＮＡの対物レンズを用いてＰａｎｏｒａｍｉｃ Ｓｃａｎｎｅｒ（３ＤＨｉｓｔｅｃｈ、Ｂｕｄａｐｅｓｔ，Ｈｕｎｇａｒｙ）でスキャンした。ＴＬＳの数を、ＱｕＰａｔｈ（ｖｅｒ．０．２．３。ｈｔｔｐｓ：／／ｑｕｐａｔｈ．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／）を使用して少なくとも３つの切片で決定した。５，０００μｍ２を超えるリンパ球のコンパクトな凝集体をＴＬＳとみなした４７。
【0101】
免疫組織化学
前述のヒトＰＤＡＣ組織マイクロアレイに対して免疫組織化学を実施した（１９）。簡潔に述べると、パラフィン包埋組織切片を、ＥＺＰｒｅｐ緩衝液（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で脱パラフィン化した。抗原回収を、ＣＣ１緩衝液（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、続いてＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｂｕｓｔｅｒ溶液（Ｉｎｎｏｖｅｘ）を用いて実施した。次いで、アビジン－ビオチン遮断溶液（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、３０分間組織切片を遮断した。切片を抗ヒトＩＬ３３抗体（ＡＦ３６２５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）で４時間、続いて１：２００希釈のビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ）で６０分間インキュベートした。ＩＬ３３陽性を、ＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出した。細胞質又は核ＩＬ３３陽性を示す任意の細胞は、陽性染色を有するように指定された。ＴＬＳにおける有核細胞を測定し、ＩｍａｇｅＪ（ｖｅｒ．２．３．０、ＮＨＩ、ＵＳＡ）のＡｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ関数を使用してカウントした。ＴＬＳにおけるＩＬ３３＋細胞を手動でカウントした。
前述のヒトＰＤＡＣ組織マイクロアレイに対して免疫組織化学を実施した（１９）。簡潔に述べると、パラフィン包埋組織切片を、ＥＺＰｒｅｐ緩衝液（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で脱パラフィン化した。抗原回収を、ＣＣ１緩衝液（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、続いてＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ Ｂｕｓｔｅｒ溶液（Ｉｎｎｏｖｅｘ）を用いて実施した。次いで、アビジン－ビオチン遮断溶液（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、３０分間組織切片を遮断した。切片を抗ヒトＩＬ３３抗体（ＡＦ３６２５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）で４時間、続いて１：２００希釈のビオチン化ウサギ抗ヤギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓ）で６０分間インキュベートした。ＩＬ３３陽性を、ＤＡＢ検出キット（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて検出した。細胞質又は核ＩＬ３３陽性を示す任意の細胞は、陽性染色を有するように指定された。ＴＬＳにおける有核細胞を測定し、ＩｍａｇｅＪ（ｖｅｒ．２．３．０、ＮＨＩ、ＵＳＡ）のＡｎａｌｙｚｅ Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ関数を使用してカウントした。ＴＬＳにおけるＩＬ３３＋細胞を手動でカウントした。
【0102】
免疫蛍光
パラフィン包埋組織を７μｍの切片にスライスした。マルチプレックス免疫蛍光染色を、記載されるように２９、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴプロセッサ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。
パラフィン包埋組織を７μｍの切片にスライスした。マルチプレックス免疫蛍光染色を、記載されるように２９、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＸＴプロセッサ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。
【0103】
Ｂ２２０：最初に、切片を抗Ｂ２２０（クローンＲＡ３－６Ｂ２、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と６時間インキュベートし、続いて１：２００希釈のビオチン化ウマ抗ヤギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と６０分間インキュベートした。検出を、ストレプトアビジン－ＨＲＰ Ｄ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施し、続いて、所定の希釈で製造業者の指示に従って調製したＴｙｒａｍｉｄｅ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした。
【0104】
ＣＤ３：次に、切片を抗ＣＤ３（カタログ番号Ａ０４５２、ＤＡＫＯ）と６時間インキュベートし、続いて１：２００希釈のビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と６０分間インキュベートした。検出を、ストレプトアビジン－ＨＲＰ Ｄ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施し、続いて、所定の希釈で製造業者の指示に従って調製したＴｙｒａｍｉｄｅ Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした。
【0105】
Ｌｙｖｅ－１：最後に、切片を抗Ｌｙｖｉｅ－１（カタログ番号ＡＦ２１２５、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）と６時間インキュベートし、続いて１：２００希釈のビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と６０分間インキュベートした。検出を、ストレプトアビジン－ＨＲＰ Ｄ（Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて実施し、続いて、所定の希釈で製造業者の指示に従って調製したＴｙｒａｍｉｄｅ Ａｌｅｘａ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とインキュベートした。染色後、スライドをＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間対比染色し、Ｍｏｗｉｏｌでカバースリップした。
【0106】
単一細胞ＲＮＡ配列決定
単一細胞免疫プロファイリングのためのライブラリ調製、配列決定、及び後処理は、以前に報告されている１９。簡潔に述べると、ＳＴ２＋ＩＬＣ２細胞を、ｒＩＬ３３で１０日間処置したマウスからの膵臓ＫＰＣ腫瘍及びＤＬＮから精製した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを、製造業者の推奨（Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｖ（Ｄ）Ｊ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ＰＮ－１０００００６、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）に基づいて調製した。９０～２００個の細胞／μｌの濃度の細胞懸濁液（８５～９０％生存可能）を１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォームに充填して、Ｇｅｌ Ｂｅａｄｓ－ｉｎＥｍｕｌｓｉｏｎ（ＧＥＭ）を生成し、１試料当たり約２，０００個の単一細胞を標的とした。ＧＥＭ生成後、試料を、９６－Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＢｉｏＲａｄ）を備えたＣ１０００ Ｔｏｕｃｈサーマルサイクラー中で、５３℃において４５分間インキュベートして、細胞バーコード及び固有の分子識別子（ＵＭＩ）に連結されたテンプレートスイッチオリゴ（ＴＳＯ）を付加することによって、５’末端でバーコード化されたｐｏｌｙＡ ｃＤＮＡを生成した。ＧＥＭを破壊した後、一本鎖ｃＤＮＡをＤｙｎａＢｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｉｌａｎｅ Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄した。次いで、ｃＤＮＡを１６サイクル（９８℃で４５秒間；９８℃で２０秒間、６７℃で３０秒間、７２℃で１時間）増幅し、その後、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００を使用してｃＤＮＡ品質を評価し、約１，２００ｂｐの生成物を得た。ｃＤＮＡ（５０ｎｇ）を酵素的に断片化し、末端修復し、Ａテール化され、ＳＰＲＩ選択ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた両側サイズ選択に供し、キットで提供されるアダプターにライゲーションした。各ライブラリ内に、キットで提供されるインデックスを使用して、ＰＣＲ増幅の１４サイクルを通して独自の試料キットを導入した（９８℃で４５秒間；９８℃で２０秒間、５４℃で３０秒間、７２℃で２０秒間×１４サイクル；７２℃で１分間；４℃で保持）。次いで、第２の両側選択をインデックス付きライブラリ上で実施し、その後、ライブラリを、Ｑｕｂｉｔ蛍光定量化（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００を使用して品質（平均ライブラリサイズ４５０ｂｐ）を評価し、その後、ｃＤＮＡを１８サイクルで増幅し、試料インデックスを１６サイクルで増幅した。次いで、希釈したライブラリを、ペアエンドリードフローセル上のＮｏｖａＳｅｑ６００を使用してクラスター化し、Ｒ１（１０Ｘバーコード及びＵＭＩ）上で２８サイクル、続いて１７インデックス（試料インデックス）の８サイクルにわたって、及びＲ２転写産物上の８９塩基にわたって配列決定し、１試料当たり約１億個のクラスターを得た。配列決定画像の一次処理を、ＩｌｌｕｍｉｎａのＲｅａｌ Ｔｉｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＲＴＡ）を使用して行った。１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅスイートｖ３．０．２（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｕｐｐｏｒｔ．１０ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－ｇｅｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ／ｌａｔｅｓｔ／ｗｈａｔ－ｉｓ－ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ）を使用して、試料を逆多重化し、マウスゲノム参照ｍｍ１０にアラインし、フィルタリングし、ＵＭＩ、単一細胞５’末端遺伝子をカウントし、製造業者のパラメータに従って品質を管理した。次いで、処理されたデータをＲ（バージョン４．０．３）で分析した。
単一細胞免疫プロファイリングのためのライブラリ調製、配列決定、及び後処理は、以前に報告されている１９。簡潔に述べると、ＳＴ２＋ＩＬＣ２細胞を、ｒＩＬ３３で１０日間処置したマウスからの膵臓ＫＰＣ腫瘍及びＤＬＮから精製した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリを、製造業者の推奨（Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｖ（Ｄ）Ｊ Ｕｓｅｒ Ｇｕｉｄｅ ＰＮ－１０００００６、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）に基づいて調製した。９０～２００個の細胞／μｌの濃度の細胞懸濁液（８５～９０％生存可能）を１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｈｒｏｍｉｕｍプラットフォームに充填して、Ｇｅｌ Ｂｅａｄｓ－ｉｎＥｍｕｌｓｉｏｎ（ＧＥＭ）を生成し、１試料当たり約２，０００個の単一細胞を標的とした。ＧＥＭ生成後、試料を、９６－Ｄｅｅｐ Ｗｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｕｌｅ（ＢｉｏＲａｄ）を備えたＣ１０００ Ｔｏｕｃｈサーマルサイクラー中で、５３℃において４５分間インキュベートして、細胞バーコード及び固有の分子識別子（ＵＭＩ）に連結されたテンプレートスイッチオリゴ（ＴＳＯ）を付加することによって、５’末端でバーコード化されたｐｏｌｙＡ ｃＤＮＡを生成した。ＧＥＭを破壊した後、一本鎖ｃＤＮＡをＤｙｎａＢｅａｄｓ ＭｙＯｎｅ Ｓｉｌａｎｅ Ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄した。次いで、ｃＤＮＡを１６サイクル（９８℃で４５秒間；９８℃で２０秒間、６７℃で３０秒間、７２℃で１時間）増幅し、その後、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００を使用してｃＤＮＡ品質を評価し、約１，２００ｂｐの生成物を得た。ｃＤＮＡ（５０ｎｇ）を酵素的に断片化し、末端修復し、Ａテール化され、ＳＰＲＩ選択ビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いた両側サイズ選択に供し、キットで提供されるアダプターにライゲーションした。各ライブラリ内に、キットで提供されるインデックスを使用して、ＰＣＲ増幅の１４サイクルを通して独自の試料キットを導入した（９８℃で４５秒間；９８℃で２０秒間、５４℃で３０秒間、７２℃で２０秒間×１４サイクル；７２℃で１分間；４℃で保持）。次いで、第２の両側選択をインデックス付きライブラリ上で実施し、その後、ライブラリを、Ｑｕｂｉｔ蛍光定量化（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ２１００を使用して品質（平均ライブラリサイズ４５０ｂｐ）を評価し、その後、ｃＤＮＡを１８サイクルで増幅し、試料インデックスを１６サイクルで増幅した。次いで、希釈したライブラリを、ペアエンドリードフローセル上のＮｏｖａＳｅｑ６００を使用してクラスター化し、Ｒ１（１０Ｘバーコード及びＵＭＩ）上で２８サイクル、続いて１７インデックス（試料インデックス）の８サイクルにわたって、及びＲ２転写産物上の８９塩基にわたって配列決定し、１試料当たり約１億個のクラスターを得た。配列決定画像の一次処理を、ＩｌｌｕｍｉｎａのＲｅａｌ Ｔｉｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（ＲＴＡ）を使用して行った。１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｒａｎｇｅｒ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅスイートｖ３．０．２（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｕｐｐｏｒｔ．１０ｘｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－ｇｅｎｅ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｉｐｅｌｉｎｅｓ／ｌａｔｅｓｔ／ｗｈａｔ－ｉｓ－ｃｅｌｌｒａｎｇｅｒ）を使用して、試料を逆多重化し、マウスゲノム参照ｍｍ１０にアラインし、フィルタリングし、ＵＭＩ、単一細胞５’末端遺伝子をカウントし、製造業者のパラメータに従って品質を管理した。次いで、処理されたデータをＲ（バージョン４．０．３）で分析した。
【0107】
ＴＬＳ転写シグネチャ分析
ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｄｃ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／及びｈｔｔｐｓ：／／ｄｃｃ．ｉｃｇｃ．ｏｒｇ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ／から、ＴＣＧＡ－ＰＡＡＤ４８、ＴＣＧＡ－ＢＲＣＡ４９、ＴＣＴＡ－ＳＫＣＭ５０、及びＰＡＣＡ－ＡＵ１５の識別子で得た。ＴＣＧＡ－ＰＡＡＤデータセットについて、ＰＤＡＣと組織学的に診断された１５０名の患者を含んだ。データをｌｏｇ－２変換し、既知のＴＬＳ遺伝子シグネチャ５、９、１０を各データセットから抽出した。簡潔に述べると、これらのシグネチャは、Ｃａｂｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．５のＣＤ７９Ｂ、ＥＩＦ１ＡＹ、ＰＴＧＤＳ、ＣＣＲ６、ＳＫＡＰ１、ＣＥＴＰ、ＣＤ１Ｄ、Ｃｏｐｐｏｌａ ｅｔ ａｌ．９のＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＣＸＣＬ１３、並びにＧｕ－Ｔｒａｎｔｉｅｎ ｅｔ ａｌ．１０のＣＸＣＬ１３、ＣＤ２００、ＦＢＬＮ７、ＩＣＯＳ、ＳＧＰＰ２、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＴＩＧＩＴ、及びＰＤＣＤ１の遺伝子を含んだ。シグネチャスコアを、記載されているように３、平均遺伝子発現として計算した。Ｒ（バージョン４．０．３）のＨｍｉｓｃパッケージ（バージョン４．５）の「ｒｃｏｒｒ」関数を使用して、ピアソンの相関検定を実施した。
ＲＮＡ－ｓｅｑデータセットを、ｈｔｔｐｓ：／／ｇｄｃ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／及びｈｔｔｐｓ：／／ｄｃｃ．ｉｃｇｃ．ｏｒｇ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｉｅｓ／から、ＴＣＧＡ－ＰＡＡＤ４８、ＴＣＧＡ－ＢＲＣＡ４９、ＴＣＴＡ－ＳＫＣＭ５０、及びＰＡＣＡ－ＡＵ１５の識別子で得た。ＴＣＧＡ－ＰＡＡＤデータセットについて、ＰＤＡＣと組織学的に診断された１５０名の患者を含んだ。データをｌｏｇ－２変換し、既知のＴＬＳ遺伝子シグネチャ５、９、１０を各データセットから抽出した。簡潔に述べると、これらのシグネチャは、Ｃａｂｒｉｔａ ｅｔ ａｌ．５のＣＤ７９Ｂ、ＥＩＦ１ＡＹ、ＰＴＧＤＳ、ＣＣＲ６、ＳＫＡＰ１、ＣＥＴＰ、ＣＤ１Ｄ、Ｃｏｐｐｏｌａ ｅｔ ａｌ．９のＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＣＸＣＬ１３、並びにＧｕ－Ｔｒａｎｔｉｅｎ ｅｔ ａｌ．１０のＣＸＣＬ１３、ＣＤ２００、ＦＢＬＮ７、ＩＣＯＳ、ＳＧＰＰ２、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＴＩＧＩＴ、及びＰＤＣＤ１の遺伝子を含んだ。シグネチャスコアを、記載されているように３、平均遺伝子発現として計算した。Ｒ（バージョン４．０．３）のＨｍｉｓｃパッケージ（バージョン４．５）の「ｒｃｏｒｒ」関数を使用して、ピアソンの相関検定を実施した。
【0108】
インビトロアッセイ
Ｉｌ３３Ｃｉｔ／＋マウスの脾臓を、上記のように単一細胞懸濁液に処理した。生、ＣＤ４５＋、ＮＫ１．１－、ＣＤ１１ｂ＋細胞を、ＳＨ８００ Ｓｏｎｙソーター（Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して９０％の純度に選別精製した。５×１０５個の骨髄細胞を、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びＧＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）中で、３７℃において７２時間、超低付着９６ウェルプレート上で培養した。細胞を様々な濃度のアゴニストＬＴｂＲ－Ｉｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処置し、ＩＬ３３発現を７２時間後にフローサイトメトリーによって検出した。
Ｉｌ３３Ｃｉｔ／＋マウスの脾臓を、上記のように単一細胞懸濁液に処理した。生、ＣＤ４５＋、ＮＫ１．１－、ＣＤ１１ｂ＋細胞を、ＳＨ８００ Ｓｏｎｙソーター（Ｓｏｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して９０％の純度に選別精製した。５×１０５個の骨髄細胞を、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びＧＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）中で、３７℃において７２時間、超低付着９６ウェルプレート上で培養した。細胞を様々な濃度のアゴニストＬＴｂＲ－Ｉｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処置し、ＩＬ３３発現を７２時間後にフローサイトメトリーによって検出した。
【0109】
ＷＴ及びＬｔｂｒ－／－マウスの脾臓からの骨髄細胞を上記のように得た。５×１０５個の骨髄細胞を、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、及びＧＭ－ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）中で、３７℃において２４時間、超低付着９６ウェルプレート上で培養した。細胞を０．２５μｇ／ｍｌのアゴニストＬＴｂＲ－Ｉｇ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処置し、ＩＬ３３発現を２４時間後にフローサイトメトリーによって検出した。
【0110】
ＳＴ２レポーター細胞株活性化アッセイ：５×１０４個のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ３３細胞（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を有する９６ウェルプレート上に播種した。細胞を、指定された濃度のＨ－ｒＩＬ３３（Ｐｒｏｔｅｏｓ，Ｉｎｃ．）、Ｈ－ｅ－ｒＩＬ３３、又はＨ－ｅ－ｒＩＬ３３－Ｆｃとともに、５％ＣＯ２中３７℃で２４時間インキュベートした。インキュベーション後、平底９６ウェルプレート中１ウェル当たり、１８０μｌのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ溶液（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に２０μｌの上清を添加した。プレートを、５％ＣＯ２中３７℃で２時間インキュベートし、続いて、Ｃｙｔａｔｉｏｎ３リーダー（ＢｉｏＴｅｋ）で６３０ｎｍの波長吸光度検出を行った。
【0111】
ヒトＩＬＣ２培養：生、ＣＤ４５＋、系統（ＣＤ５、ＣＤ１４、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＦｃｅＲＩａ、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＴＣＲａ／ｂ、ＣＤ５６）－、ＣＲＴＨ２＋として定義したヒトＩＬＣ２を、消化されたヒト腫瘍、リンパ節、及びＰＢＭＣから選別精製した。１０００個のＩＬＣ２を、Ｕ底９６ウェルプレートにおけるＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン、ストレプトマイシン、ヒトＩＬ２（１００ＩＵ／ｍｌ）、ヒトＩＬ７（１０μｇ／ｍｌ）、及びヒトＩＬ１５（１０μｇ／ｍｌ）中、３７℃で７２時間培養した。細胞を様々な濃度のＨ－ｅ－ｒＩＬ３３－Ｆｃタンパク質で処置した。ＬＴ発現を検出するために、Ｈ－ｅ－ｒＩＬ３３－ＦｃのＦｃ部分を抗ヒトＩｇＧ抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ。カタログ番号５５５７８７）で遮断し、上記の染色プロトコルに従ってヒトＬＴを検出した。
【0112】
統計
２群間の比較は、複数の時点の比較（両側）のために、ベンジャミニ、クリーガー、イェクティエリ偽発見アプローチを用いた対応のないマン－ホイットニー検定を使用して実施した。複数の群間の比較を、一元配置ＡＮＯＶＡ検定、続いてクラスカルウォリス多重比較事後検定を使用して実施した。複数の時点にわたる複数の群間の比較を、二元配置ＡＮＯＶＡ検定、続いてシダックの多重比較事後検定を使用して実施した。ＥＣ５０曲線を、余分平方和Ｆ検定を使用して比較した。２つの変数間の相関を、線形回帰を使用して計算した。全てのアルファレベルは、０．０５であり、０．０５未満のＰを有意差とみなした。統計分析を、Ｒ（バージョン４．０．３、単一細胞ＲＮＡ配列決定）及びＰｒｉｓｍ９．２．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、他の全て）を使用して実施した。
２群間の比較は、複数の時点の比較（両側）のために、ベンジャミニ、クリーガー、イェクティエリ偽発見アプローチを用いた対応のないマン－ホイットニー検定を使用して実施した。複数の群間の比較を、一元配置ＡＮＯＶＡ検定、続いてクラスカルウォリス多重比較事後検定を使用して実施した。複数の時点にわたる複数の群間の比較を、二元配置ＡＮＯＶＡ検定、続いてシダックの多重比較事後検定を使用して実施した。ＥＣ５０曲線を、余分平方和Ｆ検定を使用して比較した。２つの変数間の相関を、線形回帰を使用して計算した。全てのアルファレベルは、０．０５であり、０．０５未満のＰを有意差とみなした。統計分析を、Ｒ（バージョン４．０．３、単一細胞ＲＮＡ配列決定）及びＰｒｉｓｍ９．２．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、他の全て）を使用して実施した。
【0113】
参考文献
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３．Ｄｒａｙｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｙｉｎｇ，Ｘ．，Ｌｅｅ，Ｊ．，Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ，Ｗ．＆Ｒｕｄｄｌｅ，Ｎ．Ｈ．Ｅｃｔｏｐｉｃ ＬＴαβ Ｄｉｒｅｃｔｓ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｏｒｇａｎ Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｏｄｅ Ａｄｄｒｅｓｓｉｎ ａｎｄ ａ ＨＥＶ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９７，１１５３－１１６３（２００３）．
４．Ｂｏｅｈｍ，Ｔ．＆Ｂｌｅｕｌ，Ｃ．Ｃ．Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒｇａｎｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８，１３１－１３５（２００７）．
５．Ｃａｂｒｉｔａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｔｅｒｔｉａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ５７７，５６１－５６５（２０２０）．
６．Ｐｅｔｉｔｐｒｅｚ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｂ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ５７７，５５６－５６０（２０２０）．
７．Ｈｅｌｍｉｎｋ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５７７，５４９－５５５（２０２０）．
８．Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＴＣＧＡ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄａｔａ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｔｏ Ｄｒｉｖｅ Ｈｉｇｈ－Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ．Ｃｅｌｌ １７３，４００－４１６．ｅ１１（２０１８）．
９．Ｃｏｐｐｏｌａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｑｕｅ Ｅｃｔｏｐｉｃ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ－Ｌｉｋｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａｒｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｉｍｍｕｎｅ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １７９，３７－４５（２０１１）．
１０．Ｇｕ－Ｔｒａｎｔｉｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．ＣＤ４＋ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３，２８７３－２８９２（２０１３）．
１１．Ｇｏｃ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｅｒｔｉａｒｙ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｓｉｇｎａｌ ａ Ｔｈ１ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｎｔｅｘｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌｉｃｅｎｓｅ ｔｈｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ＣＤ８＋Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４，７０５－７１５（２０１４）．
１２．Ｈｉｒａｏｋａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒｇａｎ ｉｓ ａ ｆａｖｏｕｒａｂｌｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｔｏｒ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ １１２，１７８２－１７９０（２０１５）．
１３．Ｌｕｔｈｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ａｎｓｅｌ，Ｋ．Ｍ．＆Ｃｙｓｔｅｒ，Ｊ．Ｇ．Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＣＸＣＬ１３，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ７ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ α，ａｎｄ ＣＣＲ７ Ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９７，１１９１－１１９８（２００３）．
１４．Ｋｏｎｉ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｒｏｌｅｓ ｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆｏｒ Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎｓ α ａｎｄ β Ｒｅｖｅａｌｅｄ ｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ β－Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｉｃｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６，４９１－５００（１９９７）．
１５．Ｂａｉｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５３１，４７－５２（２０１６）．
１６．Ｌｉｅｗ，Ｆ．Ｙ．，Ｇｉｒａｒｄ，Ｊ．－Ｐ．＆Ｔｕｒｎｑｕｉｓｔ，Ｈ．Ｒ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６，（２０１６）．
１７．Ｌｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ－Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｕｎｄｅｒｌｉｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４９，１７８－１９３．ｅ７（２０１８）．
１８．Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｖ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｑｕｅ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｑｕａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５５１，５１２－５１６（２０１７）．
１９．Ｍｏｒａｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＩＬＣ２ｓ ａｍｐｌｉｆｙ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ５７９，７９０－６（２０２０）．
２０．Ａｌｉｍｚｈａｎｏｖ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ａｂｎｏｒｍａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ β－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９４，９３０２－９３０７（１９９７）．
２１．Ｆｕｅｔｔｅｒｅｒ，Ａ．，Ｍｉｎｋ，Ｋ．，Ｌｕｚ，Ａ．，Ｋｏｓｃｏ－Ｖｉｌｂｏｉｓ，Ｍ．Ｈ．＆Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｋ．Ｔｈｅ Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ β Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９，５９－７０（１９９８）．
２２．Ｍｅｉｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｅｃｔｏｐｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ－Ｏｒｇａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｏｃｃｕｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ７－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ－Ｔｉｓｓｕｅ－Ｉｎｄｕｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２６，６４３－６５４（２００７）．
２３．Ｍｅｂｉｕｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｒｅｎｎｅｒｔ，Ｐ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔ ＣＤ４＋ＣＤ３－ＬＴｂｅｔａ＋ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｔｏ ＡＰＣ，ＮＫ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ ｎｏｔ Ｔ ｏｒ Ｂ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７，４９３－５０４（１９９７）．
２４．Ｓｈｉｋｈａｇａｉｅ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１ Ｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｉｄｉｎｇ ＬＴｉ－ｌｉｋｅ Ｇｒｏｕｐ３ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｃｔｏｐｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １８，１７６１－１７７３（２０１７）．
２５．Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＲＯＲα ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｎｕｏｃｙｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３，２２９－２３６（２０１２）．
２６．Ｈｕａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＩＬ－２５－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ，ｌｉｎｅａｇｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ＫＬＲＧ１（ｈｉ）ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ“ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ”ｔｙｐｅ２ ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６，１６１－１６９（２０１５）．
２７．Ｈｕａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｓ１Ｐ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｔｅｒｏｒｇａｎ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ｇｒｏｕｐ２ ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３５９，１１４－１１９（２０１８）．
２８．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＢＡＴＦ ａｃｔｓ ａｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ＩＬ－２５－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ＩＬＣ２ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，ｅａａｙ３９９４（２０２０）．
２９．Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＰＤ－１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＫＬＲＧ１（＋）ｇｒｏｕｐ２ ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１４，１６６３－１６７８（２０１７）．
３０．Ｒｉｃａｒｄｏ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｅｘｔｒｕｄｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＩＬＣ２ｓ ｔｏ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅ ｔｙｐｅ２ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１７，１７１（２０２０）．
３１．Ｆｌａｍａｒ，Ａ．－Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３ Ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ １ ｔｏ Ｐｒｏｍｏｔｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｇｒｏｕｐ２ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０２０）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０２０．０２．００９．
３２．Ｆｕｅｔｔｅｒｅｒ，Ａ．，Ｍｉｎｋ，Ｋ．，Ｌｕｚ，Ａ．，Ｋｏｓｃｏ－Ｖｉｌｂｏｉｓ，Ｍ．Ｈ．＆Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｋ．Ｔｈｅ Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ β Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９，５９－７０（１９９８）．
３３．Ｐａｖｅｒｔ，Ｓ．Ａ．ｖａｎ ｄｅ＆Ｍｅｂｉｕｓ，Ｒ．Ｅ．Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０，６６４－６７４（２０１０）．
３４．Ｗｅｇｅ，Ａ．Ｋ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｂ．，Ｗｉｍｍｅｒ，Ｎ．，Ｍａｎｎｅｌ，Ｄ．Ｎ．＆Ｈｅｈｌｇａｎｓ，Ｔ．ＬＴβＲ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｃｕｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎ ２０，４６１－４７０（２０１３）．
３５．Ｌｕｔｈｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ａｎｓｅｌ，Ｋ．Ｍ．＆Ｃｙｓｔｅｒ，Ｊ．Ｇ．Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＣＸＣＬ１３，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ７ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ α，ａｎｄ ＣＣＲ７ Ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９７，１１９１－１１９８（２００３）．
３６．Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＩＬ－１ Ｆａｍｉｌｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｕｓｅ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ Ｓｉｇｎａｌ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｔｈｅｉｒ Ｓｈａｒｅｄ Ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４７，５１０－５２３．ｅ４（２０１７）．
３７．Ｓａｗａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｌｉｎｅａｇｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＯＲγｔ＋Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０，６６５－６６９（２０１０）．
３８．Ｉｋｅｄａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ＮＫｐ４４＋Ｇｒｏｕｐ３ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ Ｔｕｍｏｒ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｅｒｔｉａｒｙ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ８，７２４－７３１（２０２０）．
３９．Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈ１７ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅ ｅｃｔｏｐｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ ｉｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３５，９８６－９６（２０１１）．
４０．Ｌｏｃｈｎｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｇｇｒａｖａｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＲＯＲγｔ ａｎｄ ＬＴｉ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０８，１２５－１３４（２０１０）．
４１．Ｂｏｎｉｌｌａ，Ｗ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｌａｒｍｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３ ｄｒｉｖｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３３５，９８４－９８９（２０１２）．
４２．Ｈｕａｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＩＢＦ１ ｂｙ ｄｅｃｉｄｕａｌ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３，１２８－１３５（２０１６）．
４３．Ｑｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅ ＩＬ－３３ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｄｕｒｉｎｇ ＲＳＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８７，２８４－２９２（２０１７）．
４４．Ｋａｂａｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ－ｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２，４３９－４５０（２００５）．
４５．Ｈｕｎｇ，Ｌ．－Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ ＩＬ－３３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｉｃｔａｔｅｓ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ａｎｔｉ－ｈｅｌｍｉｎｔｈ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５，ｅａｂｃ６２５９（２０２０）．
４６．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １８１，６３７－６５２．ｅ１５（２０２０）．４７．Ｇａｏ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｙａｎｇ Ｑ，ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ－３３ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＤ８＋Ｔ ａｎｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（１）：４３８－４４５．
４８．Ｋｉｍ Ｊ，Ｋｉｍ Ｗ，Ｍｏｏｎ ＵＪ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｔｙｐｅ２ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ Ｂｌｏｃｋｓ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１９６（５）：２４１０－２４２３．
４９．Ｌｕｃａｒｉｎｉ Ｖ，Ｚｉｃｃｈｅｄｄｕ Ｇ，Ｍａｃｃｈｉａ Ｉ，ｅｔ ａｌ．ＩＬ－３３ ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ－ｂｅａｒｉｎｇ ｍｉｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１７；６（６）：ｅ１３１７４２０．
５０．Ｓａｒａｎｃｈｏｖａ Ｉ，Ｈａｎ Ｊ，Ｚａｍａｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｔｙｐｅ２ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ａｃｔｕａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｕｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｌｉｍｉｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１８；８（１）：２９２４．
５１．Ｈｏｌｌａｎｄｅ Ｃ，Ｂｏｕｓｓｉｅｒ Ｊ，Ｚｉａｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＤＰＰ４（ＣＤ２６）ｒｅｖｅａｌｓ ＩＬ－３３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；２０（３）：２５７－２６４．
５２．Ｅｉｓｓｍａｎｎ ＭＦ，Ｄｉｊｋｓｔｒａ Ｃ，Ｗｏｕｔｅｒｓ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３３ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｒｅｓｔｒａｉｎｓ Ｓｐｏｒａｄｉｃ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｎｎｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１８；６（４）：４０９－４２１．
５３．Ｑｉｎ Ｌ，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ Ｄ，Ｃｈｅｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＩＬ－３３ ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６；７（３８）：６１０６９－６１０８０．
５４．Ｎａｍ ＫＴ，Ｌｅｅ ＨＪ，Ｍｏｋ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐ ｓｐａｓｍｏｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔａｐｌａｓｉａ ａｎｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｅｔａｐｌａｓｉａ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００９；１３６（４）：１２８８－１２９６．
５５．Ｓｅｋｉｙａ Ａ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｓ，Ｔａｎａｋａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｔｏｓｉｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．２０１９；５５（３）：７５５－７６５．
５６．Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ Ａ，Ｓｖｏｒｏｎｏｓ Ｎ，Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ ＤＯ，ｅｔ ａｌ．ＩＬ－３３ ｄｅｌａｙｓ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｎ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１９；８（１）：ｅ１５１５０５８．
５７．ＷＯ２０２１／００３１３８Ａ１；Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ；Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ．
１．Ｓａｕｔｅｓ－Ｆｒｉｄｍａｎ，Ｃ．，Ｐｅｔｉｔｐｒｅｚ，Ｆ．，Ｃａｌｄｅｒａｒｏ，Ｊ．＆Ｆｒｉｄｍａｎ，Ｗ．Ｈ．Ｔｅｒｔｉａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｅｒａ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １９，３０７－３２５（２０１９）．
２．Ｓｃｏｔｔ，Ｉ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３ ｉｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ａｌｌｅｒｇｅｎ－ａｎｄ ｎｅｃｒｏｓｉｓ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｉｔｓ ａｌａｒｍｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｄｕｒｉｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｄａｍａｇｅ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ－ｕｋ ８，３３６３（２０１８）．
３．Ｄｒａｙｔｏｎ，Ｄ．Ｌ．，Ｙｉｎｇ，Ｘ．，Ｌｅｅ，Ｊ．，Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ，Ｗ．＆Ｒｕｄｄｌｅ，Ｎ．Ｈ．Ｅｃｔｏｐｉｃ ＬＴαβ Ｄｉｒｅｃｔｓ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｏｒｇａｎ Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈ Ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｎｏｄｅ Ａｄｄｒｅｓｓｉｎ ａｎｄ ａ ＨＥＶ－ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｓｕｌｆｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９７，１１５３－１１６３（２００３）．
４．Ｂｏｅｈｍ，Ｔ．＆Ｂｌｅｕｌ，Ｃ．Ｃ．Ｔｈｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒｇａｎｓ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８，１３１－１３５（２００７）．
５．Ｃａｂｒｉｔａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｔｅｒｔｉａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ５７７，５６１－５６５（２０２０）．
６．Ｐｅｔｉｔｐｒｅｚ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｂ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ｓａｒｃｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ ５７７，５５６－５６０（２０２０）．
７．Ｈｅｌｍｉｎｋ，Ｂ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｂ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｐｒｏｍｏｔｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ ５７７，５４９－５５５（２０２０）．
８．Ｌｉｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＴＣＧＡ Ｐａｎ－Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄａｔａ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ ｔｏ Ｄｒｉｖｅ Ｈｉｇｈ－Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｏｕｔｃｏｍｅ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ．Ｃｅｌｌ １７３，４００－４１６．ｅ１１（２０１８）．
９．Ｃｏｐｐｏｌａ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｕｎｉｑｕｅ Ｅｃｔｏｐｉｃ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ－Ｌｉｋｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｐｒｅｓｅｎｔ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ａｒｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｉｍｍｕｎｅ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １７９，３７－４５（２０１１）．
１０．Ｇｕ－Ｔｒａｎｔｉｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．ＣＤ４＋ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３，２８７３－２８９２（２０１３）．
１１．Ｇｏｃ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｅｒｔｉａｒｙ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ Ｓｉｇｎａｌ ａ Ｔｈ１ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｎｔｅｘｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌｉｃｅｎｓｅ ｔｈｅ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ Ｖａｌｕｅ ｏｆ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ＣＤ８＋Ｔ Ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７４，７０５－７１５（２０１４）．
１２．Ｈｉｒａｏｋａ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｏｒｇａｎ ｉｓ ａ ｆａｖｏｕｒａｂｌｅ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃａｔｏｒ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ １１２，１７８２－１７９０（２０１５）．
１３．Ｌｕｔｈｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ａｎｓｅｌ，Ｋ．Ｍ．＆Ｃｙｓｔｅｒ，Ｊ．Ｇ．Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＣＸＣＬ１３，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ７ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ α，ａｎｄ ＣＣＲ７ Ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９７，１１９１－１１９８（２００３）．
１４．Ｋｏｎｉ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｒｏｌｅｓ ｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆｏｒ Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎｓ α ａｎｄ β Ｒｅｖｅａｌｅｄ ｉｎ Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ β－Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｍｉｃｅ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６，４９１－５００（１９９７）．
１５．Ｂａｉｌｅｙ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５３１，４７－５２（２０１６）．
１６．Ｌｉｅｗ，Ｆ．Ｙ．，Ｇｉｒａｒｄ，Ｊ．－Ｐ．＆Ｔｕｒｎｑｕｉｓｔ，Ｈ．Ｒ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６，（２０１６）．
１７．Ｌｉ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ－Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ Ｕｎｄｅｒｌｉｅ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４９，１７８－１９３．ｅ７（２０１８）．
１８．Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｖ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｑｕｅ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｑｕａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ ｏｆ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔｕｒｅ ５５１，５１２－５１６（２０１７）．
１９．Ｍｏｒａｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＩＬＣ２ｓ ａｍｐｌｉｆｙ ＰＤ－１ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ ５７９，７９０－６（２０２０）．
２０．Ａｌｉｍｚｈａｎｏｖ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ａｂｎｏｒｍａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ β－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９４，９３０２－９３０７（１９９７）．
２１．Ｆｕｅｔｔｅｒｅｒ，Ａ．，Ｍｉｎｋ，Ｋ．，Ｌｕｚ，Ａ．，Ｋｏｓｃｏ－Ｖｉｌｂｏｉｓ，Ｍ．Ｈ．＆Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｋ．Ｔｈｅ Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ β Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９，５９－７０（１９９８）．
２２．Ｍｅｉｅｒ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｅｃｔｏｐｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ－Ｏｒｇａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｏｃｃｕｒｓ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ７－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ－Ｔｉｓｓｕｅ－Ｉｎｄｕｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２６，６４３－６５４（２００７）．
２３．Ｍｅｂｉｕｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｒｅｎｎｅｒｔ，Ｐ．＆Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｉ．Ｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｌｙｍｐｈ ｎｏｄｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔ ＣＤ４＋ＣＤ３－ＬＴｂｅｔａ＋ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｃａｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｔｏ ＡＰＣ，ＮＫ ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌｓ ｂｕｔ ｎｏｔ Ｔ ｏｒ Ｂ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ７，４９３－５０４（１９９７）．
２４．Ｓｈｉｋｈａｇａｉｅ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ－１ Ｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｎ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓｉｄｉｎｇ ＬＴｉ－ｌｉｋｅ Ｇｒｏｕｐ３ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｅｃｔｏｐｉｃ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １８，１７６１－１７７３（２０１７）．
２５．Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＲＯＲα ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｎｕｏｃｙｔｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３，２２９－２３６（２０１２）．
２６．Ｈｕａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．ＩＬ－２５－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ，ｌｉｎｅａｇｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ＫＬＲＧ１（ｈｉ）ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔｉａｌ“ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ”ｔｙｐｅ２ ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６，１６１－１６９（２０１５）．
２７．Ｈｕａｎｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｓ１Ｐ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｉｎｔｅｒｏｒｇａｎ ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ ｏｆ ｇｒｏｕｐ２ ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３５９，１１４－１１９（２０１８）．
２８．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＢＡＴＦ ａｃｔｓ ａｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｏｆ ＩＬ－２５－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ＩＬＣ２ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５，ｅａａｙ３９９４（２０２０）．
２９．Ｔａｙｌｏｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＰＤ－１ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ＫＬＲＧ１（＋）ｇｒｏｕｐ２ ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１４，１６６３－１６７８（２０１７）．
３０．Ｒｉｃａｒｄｏ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｅｘｔｒｕｄｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＩＬＣ２ｓ ｔｏ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅ ｔｙｐｅ２ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２１７，１７１（２０２０）．
３１．Ｆｌａｍａｒ，Ａ．－Ｌ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３ Ｉｎｄｕｃｅｓ ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ １ ｔｏ Ｐｒｏｍｏｔｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｇｒｏｕｐ２ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２０２０）ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０２０．０２．００９．
３２．Ｆｕｅｔｔｅｒｅｒ，Ａ．，Ｍｉｎｋ，Ｋ．，Ｌｕｚ，Ａ．，Ｋｏｓｃｏ－Ｖｉｌｂｏｉｓ，Ｍ．Ｈ．＆Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｋ．Ｔｈｅ Ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ β Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ Ｏｒｇａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ９，５９－７０（１９９８）．
３３．Ｐａｖｅｒｔ，Ｓ．Ａ．ｖａｎ ｄｅ＆Ｍｅｂｉｕｓ，Ｒ．Ｅ．Ｎｅｗ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０，６６４－６７４（２０１０）．
３４．Ｗｅｇｅ，Ａ．Ｋ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｂ．，Ｗｉｍｍｅｒ，Ｎ．，Ｍａｎｎｅｌ，Ｄ．Ｎ．＆Ｈｅｈｌｇａｎｓ，Ｔ．ＬＴβＲ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａｃｕｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｉｎｎａｔｅ Ｉｍｍｕｎ ２０，４６１－４７０（２０１３）．
３５．Ｌｕｔｈｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ａｎｓｅｌ，Ｋ．Ｍ．＆Ｃｙｓｔｅｒ，Ｊ．Ｇ．Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ ＣＸＣＬ１３，Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ７ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ α，ａｎｄ ＣＣＲ７ Ｌｉｇａｎｄｓ ｉｎ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９７，１１９１－１１９８（２００３）．
３６．Ｇｕｅｎｔｈｅｒ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＩＬ－１ Ｆａｍｉｌｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ Ｕｓｅ Ｄｉｓｔｉｎｃｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ Ｓｉｇｎａｌ ｔｈｒｏｕｇｈ Ｔｈｅｉｒ Ｓｈａｒｅｄ Ｃｏ－ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４７，５１０－５２３．ｅ４（２０１７）．
３７．Ｓａｗａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｌｉｎｅａｇｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＯＲγｔ＋Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０，６６５－６６９（２０１０）．
３８．Ｉｋｅｄａ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ ＮＫｐ４４＋Ｇｒｏｕｐ３ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｗｉｔｈ Ｔｕｍｏｒ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｅｒｔｉａｒｙ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ８，７２４－７３１（２０２０）．
３９．Ｐｅｔｅｒｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈ１７ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅ ｅｃｔｏｐｉｃ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｆｏｌｌｉｃｌｅｓ ｉｎ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３５，９８６－９６（２０１１）．
４０．Ｌｏｃｈｎｅｒ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｅｒｔｉａｒｙ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｇｇｒａｖａｔｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ＲＯＲγｔ ａｎｄ ＬＴｉ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０８，１２５－１３４（２０１０）．
４１．Ｂｏｎｉｌｌａ，Ｗ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ａｌａｒｍｉｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３ ｄｒｉｖｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ＣＤ８＋Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）３３５，９８４－９８９（２０１２）．
４２．Ｈｕａｎｇ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－３３－ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＰＩＢＦ１ ｂｙ ｄｅｃｉｄｕａｌ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ａｇａｉｎｓｔ ｐｒｅｔｅｒｍ ｌａｂｏｒ．Ｎａｔ Ｍｅｄ ２３，１２８－１３５（２０１６）．
４３．Ｑｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ｐｒｏｄｕｃｅ ＩＬ－３３ ｂｙ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＭＡＰＫ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｄｕｒｉｎｇ ＲＳＶ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８７，２８４－２９２（２０１７）．
４４．Ｋａｂａｓｈｉｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ－ｂｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２２，４３９－４５０（２００５）．
４５．Ｈｕｎｇ，Ｌ．－Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ ＩＬ－３３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｉｃｔａｔｅｓ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ａｎｔｉ－ｈｅｌｍｉｎｔｈ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉ Ｉｍｍｕｎｏｌ ５，ｅａｂｃ６２５９（２０２０）．
４６．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａ Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ Ｐａｔｈｗａｙ ｆｏｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １８１，６３７－６５２．ｅ１５（２０２０）．４７．Ｇａｏ Ｘ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｙａｎｇ Ｑ，ｅｔ ａｌ．Ｔｕｍｏｒａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＩＬ－３３ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ＣＤ８＋Ｔ ａｎｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１５；１９４（１）：４３８－４４５．
４８．Ｋｉｍ Ｊ，Ｋｉｍ Ｗ，Ｍｏｏｎ ＵＪ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｔｙｐｅ２ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌｓ Ｂｌｏｃｋｓ Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１９６（５）：２４１０－２４２３．
４９．Ｌｕｃａｒｉｎｉ Ｖ，Ｚｉｃｃｈｅｄｄｕ Ｇ，Ｍａｃｃｈｉａ Ｉ，ｅｔ ａｌ．ＩＬ－３３ ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ－ｂｅａｒｉｎｇ ｍｉｃｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１７；６（６）：ｅ１３１７４２０．
５０．Ｓａｒａｎｃｈｏｖａ Ｉ，Ｈａｎ Ｊ，Ｚａｍａｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｔｙｐｅ２ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ａｃｔｕａｔｅ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ Ａｇａｉｎｓｔ Ｔｕｍｏｕｒｓ ａｎｄ Ｌｉｍｉｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１８；８（１）：２９２４．
５１．Ｈｏｌｌａｎｄｅ Ｃ，Ｂｏｕｓｓｉｅｒ Ｊ，Ｚｉａｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＤＰＰ４（ＣＤ２６）ｒｅｖｅａｌｓ ＩＬ－３３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ．Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；２０（３）：２５７－２６４．
５２．Ｅｉｓｓｍａｎｎ ＭＦ，Ｄｉｊｋｓｔｒａ Ｃ，Ｗｏｕｔｅｒｓ ＭＡ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ３３ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｒｅｓｔｒａｉｎｓ Ｓｐｏｒａｄｉｃ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ａｎ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍａｎｎｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１８；６（４）：４０９－４２１．
５３．Ｑｉｎ Ｌ，Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ Ｄ，Ｃｈｅｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ＩＬ－３３ ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６；７（３８）：６１０６９－６１０８０．
５４．Ｎａｍ ＫＴ，Ｌｅｅ ＨＪ，Ｍｏｋ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ－ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐ ｓｐａｓｍｏｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｍｅｔａｐｌａｓｉａ ａｎｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｅｔａｐｌａｓｉａ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００９；１３６（４）：１２８８－１２９６．
５５．Ｓｅｋｉｙａ Ａ，Ｓｕｚｕｋｉ Ｓ，Ｔａｎａｋａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｏｖａｒｉａｎ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｔｏｓｉｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．２０１９；５５（３）：７５５－７６５．
５６．Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ Ａ，Ｓｖｏｒｏｎｏｓ Ｎ，Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ ＤＯ，ｅｔ ａｌ．ＩＬ－３３ ｄｅｌａｙｓ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｎ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１９；８（１）：ｅ１５１５０５８．
５７．ＷＯ２０２１／００３１３８Ａ１；Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｓｌｏａｎ Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ；Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ Ｃａｎｃｅｒ．
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図2F】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図4H】
【図4I】
【図5A】
【図5B】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図7E】
【図7F】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】