特表 2024-540337 新型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム及びその用途

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-31

(54)【発明の名称】新型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム及びその用途

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/16 20060101AFI20241024BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20241024BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 9/14 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 9/24 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 38/43 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20241024BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20241024BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 3/06 20060101ALI20241024BHJP

【ＦＩ】

C12N9/16 Z ZNA

C12N15/09 110

C07K19/00

C12N9/14

C12N9/24

C12N15/11 Z

C12N5/10

C12N1/21

C12N1/19

C12N1/15

A61K38/43

A61K35/17

A61K35/12

A61P9/00

A61P3/06

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024526749

(86)(22)【出願日】2022-11-02

(85)【翻訳文提出日】2024-07-02

(86)【国際出願番号】 CN2022129376

(87)【国際公開番号】W WO2023078314

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】202111289092.6

(32)【優先日】2021-11-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202210081981.1

(32)【優先日】2022-01-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】PCT/CN2022/089074

(32)【優先日】2022-04-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523300964

【氏名又は名称】フイダージーン・セラピューティクス（シンガポール）プライベート・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100107386

【弁理士】

【氏名又は名称】泉谷 玲子

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ハイナン

(72)【発明者】

【氏名】コング，シャンフォン

(72)【発明者】

【氏名】チェン，キジア

(72)【発明者】

【氏名】チョウ，チンシン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ハオチアン

(72)【発明者】

【氏名】チャン，ウェイホン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA01

4B065CA31

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084AA03

4C084BA44

4C084CA53

4C084DC01

4C084NA14

4C084ZC51

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZC51

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA89

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

Ｃａｓ１２ｉポリペプチド、そのようなＣａｓ１２ｉポリペプチドを含む融合タンパク質、そのようなＣａｓ１２ｉポリペプチド又は融合タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム及びその使用方法を提供した。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｃａｓ１２ｉポリペプチドであって、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つに示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項2】

Ｃａｓ１２ｉポリペプチドであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％）且つ１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、ここで、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの機能（例えば、前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの機能と比べて増加又は低減した修飾機能）
（例えば、
（ａ）前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと複合体を形成できるガイドＲＮＡと複合体を形成する能力、及び／又は、
（ｂ）スペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ切断活性）を有する、
Ｃａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項3】

両方が同じガイドＲＮＡと組み合わせて使用される時、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと比べて、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、増加したスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ切断活性を有し、例えば少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％又はそれ以上増加する、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項4】

両方が同じガイドＲＮＡと組み合わせて使用される時、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと比べて、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、低減したスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ切断活性を有し、例えば少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％低減する、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項5】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、基本的にスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ切断活性を有さず、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの多くとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％のスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ切断活性を有する死Ｃａｓ１２ｉポリペプチドである、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項6】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＤ６５０Ａ、Ｄ７００Ａ、Ｅ８７５ＡとＤ１０４９Ａ又はその組み合わせから選択される置換を含む、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項7】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、スペーサー配列特異的なｓｓＤＮＡ切断活性を有するＣａｓ１２ｉニッカーゼである、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項8】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、表１１～１４におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の突然変異体又はその組み合わせから選択される置換を含む、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項9】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のいずれでもない、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項10】

両方が同じガイドＲＮＡと組み合わせて使用される時、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと比べて、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、低減したスペーサー配列非依存的な（オフターゲット）ｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ切断活性を有し、例えば少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％低減する、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項11】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の一つ又は複数のアミノ酸に対応する、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項12】

前記一つ又は複数の突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドに対応するＰＩドメイン、ＲＥＣ－Ｉドメイン及び／又はＲｕｖＣ－ＩＩドメインのドメイン内にある、請求項１１に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項13】

前記一つ又は複数の突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの位置１７３～２９１における前記ＰＩドメイン、位置４２７～４７３における前記ＲＥＣ－Ｉドメイン及び／又は位置８００～１０８２におけるＲｕｖＣ－ＩＩドメイン内にある、請求項１１に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項14】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の
Ｓ１１８、Ｄ１１９、Ｆ１２１、Ｗ１２３、Ｑ１３６、Ｅ１３８、Ｅ１４３、Ｖ１４６、Ｓ１５５、Ｖ１５８、Ｅ１６１、Ｓ１６２、Ｔ１６３、Ａ１６５、Ｎ１６６、Ｇ１７８、Ｄ１８０、Ｔ１８５、Ｋ１８９、Ａ１９３、Ｄ１９６、Ｎ１９９、Ｎ２００、Ｅ２０２、Ｌ２０３、Ｓ２２１、Ｖ２３３、Ｅ２３５、Ｎ２３６、Ｓ２４１、Ｎ２４３、Ｓ２４５、Ｋ２５１、Ｄ２５５、Ｌ２５７、Ｎ２７３、Ｄ２８７、Ｓ２９５、Ｖ３０２、Ｓ３３２、Ｅ３３６、Ｓ３３８、Ｖ３３９、Ｅ３６２、Ｄ３７５、Ａ３７７、Ｎ３７８、Ｄ３８１、Ｔ３８２、Ｅ３８５、Ｄ３８７、Ｎ３９０、Ｅ３９５、Ｅ３９６、Ｑ３９８、Ｎ３９９、Ｖ４００、Ｄ４０３、Ｅ４０６、Ｑ４０７、Ｖ４０９、Ｄ４１１、Ｃ４１２、Ｎ４１６、Ｎ４１８、Ｌ４４０、Ｌ４４８、Ｖ４５１、Ｑ４５５、Ｅ４６４、Ｓ８０６、Ｓ８１７、Ｖ８１８、Ｓ８１９、Ｓ８３２、Ｍ８３３、Ｆ８３５、Ｔ８３６、Ｆ８３７、Ｃ８３９、Ａ８４０、Ｅ８４２、Ｅ８４３、Ｋ８４４、Ｔ８４６、Ｎ８４７、Ｋ８４８、Ｎ８５４、Ａ８５６、Ｓ８５８、Ｑ８６２、Ｋ８６３、Ｙ８６５、Ｌ８６６、Ｇ８６８、Ｋ８７０、Ｍ８７１、Ｄ８７６、Ｄ８７７、Ｖ８８０、Ｇ８８３、Ｋ８８４、Ｇ８８６、Ｋ８８７、Ａ８８８、Ａ８９１、Ｄ８９２、Ｍ８９４、Ａ９００、Ｋ９０３、Ｋ９０４、Ｎ９０６、Ｖ９１０、Ｍ９１２、Ｓ９１３、Ｃ９１５、Ｙ９１６、Ａ９１８、Ｍ９２３、Ｓ９２５、Ｈ９２６、Ｑ９２７、Ｖ９３１、Ｍ９３３、Ｑ９３４、Ｄ９３５、Ｋ９３６、Ｋ９３７、Ｔ９３８、Ｓ９３９、Ｖ９４０、Ｆ９４５、Ｍ９４６、Ｖ９４８、Ｎ９４９、Ｋ９５０、Ｄ９５１、Ｓ９５２、Ｄ９５５、Ｙ９５６、Ａ９５９、Ｇ９６０、Ｎ９６６、Ｓ９６７、Ｋ９６８、Ｓ９６９、Ｄ９７０、Ａ９７１、Ｇ９７２、Ｓ９７４、Ｖ９７５、Ｙ９７６、Ｑ９７９、Ａ９８０、Ｌ９８２、Ｈ９８３、Ｃ９８５、Ｅ９８６、Ａ９８７、Ｇ９８９、Ｖ９９０、Ｓ９９１、Ｐ９９２、Ｅ９９３、Ｌ９９４、Ｖ９９５、Ｋ９９６、Ｎ９９７、Ｋ９９８、Ｋ９９９、Ｔ１０００、Ｈ１００１、Ａ１００２、Ａ１００３、Ｅ１００４、Ｇ１００６、Ｇ１０１０、Ａ１０１２、Ｍ１０１３、Ｌ１０１４、Ｗ１０１７、Ｖ１０２２、Ｋ１０２８、Ｄ１０３２、Ｋ１０３４、Ｋ１０３７、Ｃ１０３９、Ｇ１０４０、Ｑ１０４５、Ｈ１０４７、Ｃ１０６３とＧ１０６９のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のアミノ酸に対応する、
請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項15】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の
Ｎ２４３、Ｅ３３６、Ｖ８８０、Ｇ８８３、Ｄ８９２とＭ９２３のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のアミノ酸に対応する、
請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項16】

Ｎ２４３における前記置換は、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｋ又はＨで置換される、請求項１５に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項17】

前記一つ又は複数の突然変異は、Ｒで置換される、請求項１５に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項18】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、さらに一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の
Ｖ８８０、Ｇ８８３、Ｄ８９２とＭ９２３のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のアミノ酸に対応する、
請求項１から１７のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項19】

前記一つ又は複数の突然変異は、Ｒで置換される、請求項１８に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項20】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の
Ｋ１０９、Ｌ１１２、Ｄ１２５、１２７、Ｆ１４４、Ｌ１４７、Ａ１４８、Ｌ１５１、Ｌ１５７、Ｖ１９５、Ｙ２２６、Ｆ２５２、Ｉ２５８、Ｍ２９３、Ｗ３０５、Ａ３０８、Ｉ３０９、Ｓ３１２、Ａ３１４、Ｄ３１５、Ｖ３１６、Ａ３１８、Ｌ３２４、Ｉ３２７、Ａ３４８、Ｌ３５２、Ｙ３６５、Ｌ３７２、Ｌ３７６、Ｌ３７９、Ｌ３８３、Ｉ４０５、Ｌ４２４、Ｉ４２７、Ａ４３６、Ｆ４３９、Ａ４４３、Ｖ４４７、Ａ４５７、Ｈ４５８、Ｐ４５９、Ｔ４６０、Ｓ４６３、Ｓ８１４、Ｆ８５９、Ａ８６４、Ｈ８６７、Ｙ９７７、Ｓ１０３１、Ａ１０５３とＦ１０６８のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のアミノ酸に対応する、
請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項21】

前記一つ又は複数の突然変異は、Ｒで置換される、請求項２０に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項22】

前記突然変異は、非極性アミノ酸残基（例えばグリシン（Ｇｌｙ／Ｇ）、アラニン（Ａｌａ／Ａ）、バリン（Ｖａｌ／Ｖ）、システイン（Ｃｙｓ／Ｃ）、プロリン（Ｐｒｏ／Ｐ）、ロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ／Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）、トリプトファン（Ｔｒｐ／Ｗ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ／Ｆ））、極性アミノ酸残基（例えばセリン（Ｓｅｒ／Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ／Ｔ）、チロシン（Ｔｙｒ／Ｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ））、正に荷電したアミノ酸残基（例えばリジン（Ｌｙｓ／Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ））又は負に荷電したアミノ酸残基（例えばアスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕｅ／Ｅ））で行われる置換である、請求項１から２１のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項23】

前記置換は、正に荷電したアミノ酸残基、例えばアルギニン（Ｒ）で置換される、請求項２２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項24】

前記置換は、非極性アミノ酸残基、例えばアラニン（Ａ）で置換される、請求項２２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項25】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、表６におけるいずれか一つの突然変異体又はその組み合わせに対応する置換を含み、且つ、ここで、前記アミノ酸の位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対するものである、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項26】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、表６におけるいずれか一つの突然変異体又はその組み合わせに対応する置換を含み、両方が同じガイドＲＮＡと組み合わせて使用される時、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと比べて、増加したスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ切断活性を有し、例えば少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％又はそれ以上増加し、且つ、ここで、前記アミノ酸の位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対するものである、
請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項27】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ突然変異体である、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項28】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、表８におけるいずれか一つの突然変異体又はその組み合わせに対応する置換を含み、且つ、ここで、前記アミノ酸の位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対するものである、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項29】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｄ８９２Ｒ突然変異体である、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項30】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｇ８８３Ｒ突然変異体である、請求項１又は２に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項31】

Ｃａｓ１２ｉポリペプチドであって、
（１）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ突然変異体のアミノ酸配列に示すとおりであり、
（２）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ突然変異体のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ突然変異体のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
Ｃａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項32】

Ｃａｓ１２ｉポリペプチドであって、
（１）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｄ８９２Ｒ突然変異体のアミノ酸配列に示すとおりであり、
（２）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｄ８９２Ｒ突然変異体のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｄ８９２Ｒ突然変異体のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
Ｃａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項33】

Ｃａｓ１２ｉポリペプチドであって、
（１）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｇ８８３Ｒ突然変異体のアミノ酸配列に示すとおりであり、
（２）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｇ８８３Ｒ突然変異体のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｇ８８３Ｒ突然変異体のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
Ｃａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項34】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、標的ｄｓＤＮＡの非標的鎖上のプロトスペーサー配列５’の隣りにある標的隣接モチーフ（ＴＡＭ）を認識することができ、且つ、ここで、前記ＴＡＭは、５’－ＮＴＴＮ－３’であり、ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣである、請求項１から３３のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド。

【請求項35】

請求項１から３４のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチドと機能ドメインとを含む、融合タンパク質。

【請求項36】

前記機能ドメインは、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドに対してＮ－末端、Ｃ－末端又は内部で融合される、請求項３５に記載の融合タンパク質。

【請求項37】

前記機能ドメインは、リンカーを介して前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドに融合され、前記リンカーは、例えばＸＴＥＮリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４２）、複数のグリシンとセリン残基とを含むＧＳリンカー、複数のグリシンとセリン残基とを含むＧＳリンカー及びＸＴＥＮリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４２）、複数のグリシンとセリン残基とを含むＧＳリンカー及びＢＰ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３）である、
請求項３５又は３６に記載の融合タンパク質。

【請求項38】

前記機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）、デアミナーゼ又はその触媒ドメイン、ウラシルグリコシダーゼ阻害剤（ＵＧＩ）、ウラシルグリコシダーゼ（ＵＮＧ）、メチルプリングリコシダーゼ（ＭＰＧ）、メチラーゼ又はその触媒ドメイン、デメチラーゼ又はその触媒ドメイン、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＶＰＲ）、転写阻害ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ部分又はＳＩＤ部分）、逆転写酵素又はその触媒ドメイン、エキソヌクレアーゼ又はその触媒ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、ヌクレアーゼ触媒ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）、転写修飾因子、光ゲーティング因子、化学誘導因子、クロマチン可視化因子、標的細胞又は標的細胞型上の細胞表面部分との結合を提供するためのターゲッティングポリペプチド、レポーター（例えば、蛍光）ポリペプチド又は検出マーカー（例えば、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）、局在化シグナル、ポリペプチドターゲッティング部分、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＢＰ、Ｌｅｘ Ａ ＤＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＢＤ）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘなど）、転写放出因子、ＨＤＡＣ、ｓｓＲＮＡ切断活性を有する部分、ｄｓＲＮＡ切断活性を有する部分、ｓｓＤＮＡ切断活性を有する部分、ｄｓＤＮＡ切断活性を有する部分、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼ、標的ＤＮＡを修飾する活性を示す機能ドメインとその触媒ドメイン及びその機能断片及びその任意の組み合わせから選択され、前記標的ＤＮＡを修飾する活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、脱酸素活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グリコシダーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ由来）、脱グリコシル化活性から選択される、
請求項１から３７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項39】

前記ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４）、ｂｐＳＶ４０ ＮＬＳ（ＢＰ ＮＬＳ、ｂｐＮＬＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３）又はＮＰ ＮＬＳ（アフリカツメガエル核質タンパク質ＮＬＳ、核質タンパク質ＮＬＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４５）を含むか又はそれである、請求項３８に記載の融合タンパク質。

【請求項40】

前記機能ドメインは、デアミナーゼ又はその触媒ドメインを含む、請求項３８に記載の融合タンパク質。

【請求項41】

前記デアミナーゼ又はその触媒ドメインは、アデニンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ、例えばＴａｄＡ８ｅ、ＴａｄＡ８．１７、ＴａｄＡ８．２０、ＴａｄＡ９）又はその触媒ドメインである、請求項４０に記載の融合タンパク質。

【請求項42】

前記デアミナーゼ又はその触媒ドメインは、シチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ、例えばＡＰＯＢＥＣ３、例えばＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＤｄｄＡ）又はその触媒ドメインである、請求項４０に記載の融合タンパク質。

【請求項43】

前記機能ドメインは、ウラシルグリコシダーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含む、請求項３５に記載の融合タンパク質。

【請求項44】

前記機能ドメインは、ウラシルグリコシダーゼ（ＵＮＧ）を含む、請求項３５に記載の融合タンパク質。

【請求項45】

前記機能ドメインは、メチルプリングリコシダーゼ（ＭＰＧ）を含む、請求項３５に記載の融合タンパク質。

【請求項46】

前記アデニンデアミナーゼドメインは、野生型ＴａｄＡ又はその変異体であり、それは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９に示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項３５に記載の融合タンパク質。

【請求項47】

前記アデニンデアミナーゼドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９のＴａｄＡ８ｅ－Ｖ１０６Ｗであるか又はＴａｄＡ８ｅである、請求項４１に記載の融合タンパク質。

【請求項48】

前記ＵＧＩドメインは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１に示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項４３に記載の融合タンパク質。

【請求項49】

前記シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３又はその変異体であり、それは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０に示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項４２に記載の融合タンパク質。

【請求項50】

前記シチジンデアミナーゼドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０のヒトＡＰＯＢＥＣ３－Ｗ１０４Ａである、請求項４２に記載の融合タンパク質。

【請求項51】

前記機能ドメインは、逆転写酵素又はその触媒ドメインを含む、請求項３５に記載の融合タンパク質。

【請求項52】

前記機能ドメインは、メチラーゼ又はその触媒ドメインを含む、請求項３５に記載の融合タンパク質。

【請求項53】

前記機能ドメインは、転写活性化ドメインを含む、請求項３５に記載の融合タンパク質。

【請求項54】

ガイドＲＮＡであって、
（１）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド、又は前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと機能ドメインとを含む融合タンパク質と複合体を形成できるダイレクトリピート配列と、
（２）標的ｄｓＤＮＡの標的鎖上の標的配列にハイブリダイズすることによって、前記複合体を前記標的ｄｓＤＮＡに導くことができるスペーサー配列とを含む、
ガイドＲＮＡ。

【請求項55】

前記ダイレクトリピート配列は、前記スペーサー配列の５’にある、請求項５４に記載のガイドＲＮＡ。

【請求項56】

前記ダイレクトリピート配列は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つに示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つのポリヌクレオチド配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つのポリヌクレオチド配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、
請求項５４に記載のガイドＲＮＡ。

【請求項57】

前記ダイレクトリピート配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つの二次構造と実質的に同じ二次構造を有する、請求項５４に記載のガイドＲＮＡ。

【請求項58】

前記ダイレクトリピート配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６と２０のいずれでもない、請求項５４に記載のガイドＲＮＡ。

【請求項59】

前記標的配列は、標的遺伝子の少なくとも約１６個の連続したヌクレオチド、例えば、標的遺伝子の約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０個の連続したヌクレオチド、又はいずれか二つの前記値の間の数値範囲を含み、例えば、標的遺伝子の約１６から約５０個の連続したヌクレオチドは、基本的にそれによって構成されるか、又はそれによって構成される、
請求項５４に記載のガイドＲＮＡ。

【請求項60】

前記標的配列の長さは、少なくとも約１６個のヌクレオチドであり、例えば長さは、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０個のヌクレオチドであり、又は長さは、いずれか二つの前記値の間の数値範囲にあり、例えば、長さは、約１６から約５０個のヌクレオチドである、
請求項５４に記載のガイドＲＮＡ。

【請求項61】

前記スペーサー配列の長さは、少なくとも約１６個のヌクレオチドであり、例えば長さは、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０個のヌクレオチドであり、又は長さは、いずれか二つの前記値の間の数値範囲にあり、例えば、長さは、約１６から約５０個のヌクレオチドである、
請求項５４に記載のガイドＲＮＡ。

【請求項62】

前記ガイドＲＮＡは、複数の標的配列とそれぞれハイブリダイズ可能な複数の（例えば、２、３、４、５個又はそれ以上）スペーサー配列を含む、請求項５４に記載のガイドＲＮＡ。

【請求項63】

前記複数の標的配列は、同一のポリヌクレオチド上にあるか、又は単独のポリヌクレオチド上にある、請求項５４に記載のガイドＲＮＡ。

【請求項64】

前記スペーサー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２～１２５、１３０、１３１～３８１、３８２、３９１、３９８～４３８のうちのいずれか一つの少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む、請求項５４に記載のガイドＲＮＡ。

【請求項65】

前記ｄｓＤＮＡは、細胞内にある、請求項５４に記載のガイドＲＮＡ。

【請求項66】

システム（又は組成物）であって、
（１）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド、又は前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと機能ドメインとを含む融合タンパク質、又は前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又は前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（２）ガイドＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」とも呼ばれる）、又は前記ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含み、前記ガイドＲＮＡは、
（ｉ）前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又は前記融合タンパク質と複合体を形成できるダイレクトリピート配列と、
（ｉｉ）標的ｄｓＤＮＡの標的鎖上の標的配列にハイブリダイズすることによって、前記複合体を前記標的ｄｓＤＮＡに導くことができるスペーサー配列とを含む、
システム（又は組成物）。

【請求項67】

前記システムは、天然に存在しない、操作されたシステムである、請求項６６に記載のシステム。

【請求項68】

前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又は前記融合タンパク質は、請求項１から３４のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド又は請求項３５から５３のいずれか１項に記載の融合タンパク質である、請求項６６に記載のシステム。

【請求項69】

前記ガイドＲＮＡは、請求項５４から６５のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡである、請求項６６に記載のシステム。

【請求項70】

標的ｄｓＤＮＡを修飾するための方法であって、前記標的ｄｓＤＮＡを請求項６６から６９のいずれか１項に記載のシステムに接触させることを含み、ここで前記スペーサー配列は、前記標的ｄｓＤＮＡの標的鎖の標的配列にハイブリダイズ可能であり、ここで、前記標的配列は、前記複合体によって修飾される、方法。

【請求項71】

前記標的ｄｓＤＮＡは、ヒトＴＲＡＣ遺伝子である、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

前記スペーサー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１２５のうちのいずれか一つの連続したヌクレオチドを少なくとも含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項73】

請求項１から３４のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド、請求項３５から５３のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項５４から６５のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ、又は請求項６６から６９のいずれか１項に記載のシステムを含む、細胞又はその後代。

【請求項74】

請求項７０から７２のいずれか１項に記載の方法によって修飾される、修飾された細胞又はその後代。

【請求項75】

前記細胞は、インビボ、エクスビボ又はインビトロである、請求項５４から６５のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ又は請求項７３又は７４に記載の細胞。

【請求項76】

前記細胞は、真核細胞（例えば、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非ヒト霊長類動物細胞、げっ歯動物（例えば、マウス又はラット）細胞、ヒト細胞、植物細胞又は酵母細胞）又は原核細胞（例えば、細菌細胞）である、請求項７５に記載のガイドＲＮＡ又は細胞。

【請求項77】

前記細胞は、培養された細胞、単離された初代細胞又は生体内の細胞である、請求項７５に記載のガイドＲＮＡ又は細胞。

【請求項78】

前記細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ－ＮＫ細胞）、又は幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＨＳＣ細胞）である、請求項７５に記載のガイドＲＮＡ又は細胞。

【請求項79】

前記細胞は、被験体に由来するか又は前記被験体とは異種である、請求項７５に記載のガイドＲＮＡ又は細胞。

【請求項80】

請求項７３から７９のいずれか１項に記載の細胞又はその後代を含む、宿主。

【請求項81】

請求項１から３４のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉポリペプチド、請求項３５から５３のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項５４から６５のいずれか１項に記載のガイドＲＮＡ、請求項６６から６９のいずれか１項に記載のシステム、又は請求項７３から７９のいずれか１項に記載の細胞又はその後代を含む、（例えば、医薬）組成物。

【請求項82】

被験体の疾患又は障害を診断、予防又は治療するための方法であって、前記被験体に（例えば、有効量の）請求項６６から６９のいずれか１項に記載のシステム、請求項７３から７９のいずれか１項に記載の細胞又はその後代、又は請求項８１に記載の組成物を投与することを含む、方法。

【請求項83】

前記疾患又は障害は、ＴＴＲ関連疾患又は障害、例えばＡＴＴＲである、請求項８２に記載の方法。

【請求項84】

前記スペーサー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

前記疾患又は障害は、ＰＣＳＫ９関連疾患又は障害である、請求項８２に記載の方法。

【請求項86】

前記スペーサー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む、請求項８５に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月２日に提案された、「ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ１２Ｉ ＳＹＳＴＥＭＳ［新型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム］」と称される中国特許出願番号２０２１１１２８９０９２．６、２０２２年１月２４日に提案された、「ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ１２Ｉ ＳＹＳＴＥＭＳ［新型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム］」と称される中国特許出願番号２０２２１００８１９８１．１及び２０２２年４月２５日に提案された、「ＮＯＶＥＬ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ１２Ｉ ＳＹＳＴＥＭＳ［新型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム］」と称されるＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０２２／０８９０７４の権益と優先権を主張しており、これらの特許出願の内容のすべて（任意の配列表と図面を含む）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子配列表の援用

【0002】

電子配列表（「ｘｘｘ．ｘｍｌ」、サイズがｘｘｘバイト、且つｘｘｘに作成）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列がＲＮＡ配列である場合、該配列におけるＴは、Ｕとみなされるべきである。
［技術分野］

【0003】

本開示は、全体的にＣａｓ１２ｉポリペプチド、そのようなＣａｓ１２ｉポリペプチドを含む融合タンパク質、そのようなＣａｓ１２ｉポリペプチド又は融合タンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステム及びその使用方法に関する。

【背景技術】

【0004】

クラスター化規則的間隔の短鎖回分リピート配列－Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ）システム（ＩＩ型Ｃａｓ９とＶ型Ｃａｓ１２システムとを含み、原核生物のウイルスに対応する適応免疫に役割を果たす）は、既にゲノム編集ツールとして開発された^１－３。ＩＩ型システムと比べて、Ｖ－ＡからＶ－Ｋを含むＶ型システムは、より多くの機能多様性を示す^４，５。ここで、ＳｐＣａｓ９とＣａｓ１２ａと比べて、Ｃａｓ１２ｉは、比較的に小さいサイズ（１０３３－１０９３ａａ）を有し、且つ５’－ＴＴＮプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の好みを有する^{４，６，７}。Ｃａｓ１２ｉの特徴は、前駆体ｃｒＲＮＡ（ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ）を自律的に加工して短い成熟ｃｒＲＮＡを形成できることである。Ｃａｓ１２ｉは、先に非標的鎖を切断し、そして標的鎖を切断することによって単一のＲｕｖＣドメインを有するｄｓＤＮＡの切断を媒介する^８－１０。Ｃａｓ１２ｉのこれらの固有の特徴は、多重高忠実度ゲノム編集を実現することができる。しかしながら、以前のＣａｓ１２ｉ（Ｃａｓ１２ｉ１とＣａｓ１２ｉ２）は、低い編集効率を示し、これは、それらの治療遺伝子編集への効果を制限している。そのため、実用化に向けてより効率的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを開発する必要がある。

【0005】

本出願における任意の文献の引用又は識別は、いずれも該文献が本開示の従来の技術として得られることを認めるものではない。

【発明の概要】

【0006】

以前のＣａｓ１２ｉの限界を解決するために、出願人は、１０種類のＣａｓ１２ｉをスクリーニングし、１種類のｘＣａｓ１２ｉ（本明細書では、「ＳｉＣａｓ１２ｉ」とも呼ばれる）がＨＥＫ２９３Ｔ細胞において頑強で高い活性を有することを発見した。ＰＡＭ相互作用（ＰＩ）ドメイン、ＲＥＣドメインとＲｕｖＣドメインにおけるアルギニン置換によるｘＣａｓ１２ｉの操作により、著しく上昇した編集活性と最小限のオフターゲット切断効率を有する変異体高忠実度Ｃａｓ１２Ｍａｘ（ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ）が産生される。また、出願人は、ｘＣａｓ１２ｉベースの塩基エディタの塩基編集効率を評価し、そのため、ゲノム編集ツールボックスを拡張した。出願人はさらに、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘがそれぞれリボ核タンパク質（ＲＮＰ）と脂質ナノリポソーム（ＬＮＰ）を介してエクスビボとインビボで有効なゲノム編集ツールとなり得ることを証明し、治療性ゲノム編集応用の優れた潜在力を示した。

【0007】

いくつかの態様によれば、本開示は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを提供し、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つに示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0008】

いくつかの態様によれば、本開示は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを提供し、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％）且つ１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、ここで、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの機能（例えば、前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの機能と比べて増加又は低減した修飾機能）
（例えば、
（ａ）前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと複合体を形成できるガイドＲＮＡと複合体を形成する能力、及び／又は、
（ｂ）スペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ切断活性）を有する。

【0009】

いくつかの実施の形態では、両方が同じガイドＲＮＡと組み合わせて使用される時、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと比べて、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、増加したスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ切断活性を有し、例えば少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％又はそれ以上増加する。

【0010】

いくつかの実施の形態では、両方が同じガイドＲＮＡと組み合わせて使用される時、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと比べて、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、低減したスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ切断活性を有し、例えば少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％低減する。

【0011】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、基本的にスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ切断活性を有さず、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの多くとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％のスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ切断活性を有する死Ｃａｓ１２ｉポリペプチドである。

【0012】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のＤ６５０Ａ、Ｄ７００Ａ、Ｅ８７５ＡとＤ１０４９Ａ又はその組み合わせから選択される置換を含む。

【0013】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、スペーサー配列特異的なｓｓＤＮＡ切断活性を有するＣａｓ１２ｉニッカーゼである。

【0014】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、標的ｄｓＤＮＡの標的鎖に対するスペーサー配列特異的なｓｓＤＮＡ切断活性を有するＣａｓ１２ｉニッカーゼである。

【0015】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、標的ｄｓＤＮＡの標的鎖に対するスペーサー配列特異的なｓｓＤＮＡ切断活性を有し、且つ基本的にスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ切断活性を有さず、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの多くとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％又は５０％のスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ切断活性を有するＣａｓ１２ｉニッカーゼである。

【0016】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、表１１－１４におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の突然変異体又はその組み合わせから選択される置換を含む。

【0017】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のいずれでもない。

【0018】

いくつかの実施の形態では、両方が同じガイドＲＮＡと組み合わせて使用される時、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと比べて、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、低減したスペーサー配列非依存的な（オフターゲット）ｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ切断活性を有し、例えば少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％低減する。

【0019】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の一つ又は複数のアミノ酸に対応する。

【0020】

いくつかの実施の形態では、前記一つ又は複数の突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドに対応するＰＩドメイン、ＲＥＣ－Ｉドメイン及び／又はＲｕｖＣ－ＩＩドメインのドメイン内にある。

【0021】

いくつかの実施の形態では、前記一つ又は複数の突然変異は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの位置１７３～２９１における前記ＰＩドメイン、位置４２７～４７３における前記ＲＥＣ－Ｉドメイン及び／又は位置８００～１０８２におけるＲｕｖＣ－ＩＩドメイン内にある。

【0022】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドの位置１から末端のいずれか一つの位置、例えば１０８０、例えば位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、１０００、１００１、１００２、１００３、１００４、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、１０２３、１０２４、１０２５、１０２６、１０２７、１０２８、１０２９、１０３０、１０３１、１０３２、１０３３、１０３４、１０３５、１０３６、１０３７、１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１０５６、１０５７、１０５８、１０５９、１０６０、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６５、１０６６、１０６７、１０６８、１０６９、１０７０、１０７１、１０７２、１０７３、１０７４、１０７５、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、１０８０のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のアミノ酸に対応する。

【0023】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の
位置１から１０８０のうちのいずれか一つの位置、例えば位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、１０００、１００１、１００２、１００３、１００４、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、１０２３、１０２４、１０２５、１０２６、１０２７、１０２８、１０２９、１０３０、１０３１、１０３２、１０３３、１０３４、１０３５、１０３６、１０３７、１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１０５６、１０５７、１０５８、１０５９、１０６０、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６５、１０６６、１０６７、１０６８、１０６９、１０７０、１０７１、１０７２、１０７３、１０７４、１０７５、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、１０８０のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のアミノ酸に対応する。

【0024】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の
Ｋ１０９、Ｎ１１０、Ｙ１１１、Ｌ１１２、Ｍ１１３、Ｓ１１４、Ｎ１１５、Ｉ１１６、Ｄ１１７、Ｓ１１８、Ｄ１１９、Ｆ１２１、Ｖ１２２、Ｗ１２３、Ｖ１２４、Ｄ１２５、Ｃ１２６、１２７、Ｋ１２８、Ｆ１２９、Ａ１３０、Ｋ１３１、Ｄ１３２、Ｆ１３３、Ａ１３４、Ｙ１３５、Ｑ１３６、Ｍ１３７、Ｅ１３８、Ｌ１３９、Ｇ１４０、Ｆ１４１、Ｈ１４２、Ｅ１４３、Ｆ１４４、Ｔ１４５、Ｖ１４６、Ｌ１４７、Ａ１４８、Ｅ１４９、Ｔ１５０、Ｌ１５１、Ｌ１５２、Ａ１５３、Ｎ１５４、Ｓ１５５、Ｉ１５６、Ｌ１５７、Ｖ１５８、Ｌ１５９、Ｎ１６０、Ｅ１６１、Ｓ１６２、Ｔ１６３、Ｋ１６４、Ａ１６５、Ｎ１６６、Ｗ１６７、Ａ１６８、Ｗ１６９、Ｇ１７０、Ｔ１７１、Ｖ１７２、Ｓ１７３、Ａ１７４、Ｌ１７５、Ｙ１７６、Ｇ１７７、Ｇ１７８、Ｇ１７９、Ｄ１８０、Ｋ１８１、Ｅ１８２、Ｄ１８３、Ｓ１８４、Ｔ１８５、Ｌ１８６、Ｋ１８７、Ｓ１８８、Ｋ１８９、Ｉ１９０、Ｌ１９１、Ｌ１９２、Ａ１９３、Ｆ１９４、Ｖ１９５、Ｄ１９６、Ａ１９７、Ｌ１９８、Ｎ１９９、Ｎ２００、Ｈ２０１、Ｅ２０２、Ｌ２０３、Ｋ２０４、Ｔ２０５、Ｋ２０６、Ｅ２０８、Ｉ２０９、Ｌ２１０、Ｎ２１１、Ｑ２１２、Ｖ２１３、Ｃ２１４、Ｅ２１５、Ｓ２１６、Ｌ２１７、Ｋ２１８、Ｙ２１９、Ｑ２２０、Ｓ２２１、Ｙ２２２、Ｑ２２３、Ｄ２２４、Ｍ２２５、Ｙ２２６、Ｖ２２７、Ｄ２２８、Ｆ２２９、Ｓ２３１、Ｖ２３２、Ｖ２３３、Ｄ２３４、Ｅ２３５、Ｎ２３６、Ｇ２３７、Ｎ２３８、Ｋ２３９、Ｋ２４０、Ｓ２４１、Ｐ２４２、Ｎ２４３、Ｇ２４４、Ｓ２４５、Ｍ２４６、Ｐ２４７、Ｉ２４８、Ｖ２４９、Ｔ２５０、Ｋ２５１、Ｆ２５２、Ｅ２５３、Ｔ２５４、Ｄ２５５、Ｄ２５６、Ｌ２５７、Ｉ２５８、Ｓ２５９、Ｄ２６０、Ｎ２６１、Ｑ２６２、Ｋ２６４、Ａ２６５、Ｍ２６６、Ｉ２６７、Ｓ２６８、Ｎ２６９、Ｆ２７０、Ｔ２７１、Ｋ２７２、Ｎ２７３、Ａ２７４、Ａ２７５、Ａ２７６、Ｋ２７７、Ａ２７８、Ａ２７９、Ｋ２８０、Ｋ２８１、Ｐ２８２、Ｉ２８３、Ｐ２８４、Ｙ２８５、Ｌ２８６、Ｄ２８７、２８８、Ｌ２８９、Ｋ２９０、Ｅ２９１、Ｍ２９３、Ｖ２９４、Ｓ２９５、Ｌ２９６、Ｃ２９７、Ｄ２９８、Ｙ３００、Ｎ３０１、Ｖ３０２、Ｙ３０３、Ａ３０４、Ｗ３０５、Ａ３０６、Ａ３０７、Ａ３０８、Ｉ３０９、Ｔ３１０、Ｎ３１１、Ｓ３１２、Ｎ３１３、Ａ３１４、Ｄ３１５、Ｖ３１６、Ｔ３１７、Ａ３１８、Ｎ３２０、Ｔ３２１、Ｌ３２４、Ｔ３２５、Ｆ３２６、Ｉ３２７、Ｇ３２８、Ｅ３２９、Ｑ３３０、Ｎ３３１、Ｓ３３２、Ｋ３３５、Ｅ３３６、Ｌ３３７、Ｓ３３８、Ｖ３３９、Ｌ３４０、Ｑ３４１、Ｔ３４２、Ｔ３４３、Ｔ３４４、Ｎ３４５、Ｅ３４６、Ｋ３４７、Ａ３４８、Ｋ３４９、Ｄ３５０、Ｉ３５１、Ｌ３５２、Ｎ３５３、Ｋ３５４、Ｎ３５６、Ｄ３５７、Ｎ３５８、Ｌ３５９、Ｉ３６０、Ｑ３６１、Ｅ３６２、Ｖ３６３、Ｙ３６５、Ｔ３６６、Ｐ３６７、Ａ３６８、Ｋ３７０、Ｈ３７１、Ｌ３７２、Ｇ３７３、Ｄ３７５、Ｌ３７６、Ａ３７７、Ｎ３７８、Ｌ３７９、Ｆ３８０、Ｄ３８１、Ｔ３８２、Ｌ３８３、Ｋ３８４、Ｅ３８５、Ｋ３８６、Ｄ３８７、Ｉ３８８、Ｎ３８９、Ｎ３９０、Ｉ３９１、Ｅ３９２、Ｎ３９３、Ｅ３９４、Ｅ３９５、Ｅ３９６、Ｋ３９７、Ｑ３９８、Ｎ３９９、Ｖ４００、Ｉ４０１、Ｎ４０２、Ｄ４０３、Ｃ４０４、Ｉ４０５、Ｅ４０６、Ｑ４０７、Ｙ４０８、Ｖ４０９、Ｄ４１０、Ｄ４１１、Ｃ４１２、Ｌ４１５、Ｎ４１６、Ｎ４１８、Ｐ４１９、Ｉ４２０、Ａ４２１、Ａ４２２、Ｌ４２３、Ｌ４２４、Ｋ４２５、Ｈ４２６、Ｉ４２７、Ｓ４２８、Ｙ４３０、Ｙ４３１、Ｅ４３２、Ｄ４３３、Ｆ４３４、Ｓ４３５、Ａ４３６、Ｋ４３７、Ｎ４３８、Ｆ４３９、Ｌ４４０、Ｄ４４１、Ｇ４４２、Ａ４４３、Ｋ４４４、Ｌ４４５、Ｎ４４６、Ｖ４４７、Ｌ４４８、Ｔ４４９、Ｅ４５０、Ｖ４５１、Ｖ４５２、Ｎ４５３、Ｑ４５５、Ｋ４５６、Ａ４５７、Ｈ４５８、Ｐ４５９、Ｔ４６０、Ｉ４６１、Ｗ４６２、Ｓ４６３、Ｅ４６４、Ｉ８００、Ｓ８０１、Ｌ８０２、Ｋ８０３、Ｍ８０４、Ｉ８０５、Ｓ８０６、Ｄ８０７、Ｆ８０８、Ｋ８０９、Ｇ８１０、Ｖ８１１、Ｖ８１２、Ｑ８１３、Ｓ８１４、Ｙ８１５、Ｆ８１６、Ｓ８１７、Ｖ８１８、Ｓ８１９、Ｇ８２０、Ｃ８２１、Ｖ８２２、Ｄ８２３、Ｄ８２４、Ａ８２５、Ｓ８２６、Ｋ８２７、Ｋ８２８、Ａ８２９、Ｈ８３０、Ｄ８３１、Ｓ８３２、Ｍ８３３、Ｌ８３４、Ｆ８３５、Ｔ８３６、Ｆ８３７、Ｍ８３８、Ｃ８３９、Ａ８４０、Ａ８４１、Ｅ８４２、Ｅ８４３、Ｋ８４４、Ｔ８４６、Ｎ８４７、Ｋ８４８、Ｅ８５０、Ｅ８５１、Ｋ８５２、Ｔ８５３、Ｎ８５４、Ａ８５６、Ａ８５７、Ｓ８５８、Ｆ８５９、Ｉ８６０、Ｌ８６１、Ｑ８６２、Ｋ８６３、Ａ８６４、Ｙ８６５、Ｌ８６６、Ｈ８６７、Ｇ８６８、Ｃ８６９、Ｋ８７０、Ｍ８７１、Ｉ８７２、Ｖ８７３、Ｃ８７４、Ｅ８７５、Ｄ８７６、Ｄ８７７、Ｌ８７８、Ｐ８７９、Ｖ８８０、Ａ８８１、Ｄ８８２、Ｇ８８３、Ｋ８８４、Ｔ８８５、Ｇ８８６、Ｋ８８７、Ａ８８８、Ｑ８８９、Ｎ８９０、Ａ８９１、Ｄ８９２、Ｍ８９４、Ｄ８９５、Ｗ８９６、Ｃ８９７、Ａ８９８、Ａ９００、Ｌ９０１、Ａ９０２、Ｋ９０３、Ｋ９０４、Ｖ９０５、Ｎ９０６、Ｄ９０７、Ｇ９０８、Ｃ９０９、Ｖ９１０、Ａ９１１、Ｍ９１２、Ｓ９１３、Ｉ９１４、Ｃ９１５、Ｙ９１６、Ａ９１８、Ｐ９２０、Ａ９２１、Ｙ９２２、Ｍ９２３、Ｓ９２４、Ｓ９２５、Ｈ９２６、Ｑ９２７、Ｄ９２８、Ｐ９２９、Ｆ９３０、Ｖ９３１、Ｈ９３２、Ｍ９３３、Ｑ９３４、Ｄ９３５、Ｋ９３６、Ｋ９３７、Ｔ９３８、Ｓ９３９、Ｖ９４０、Ｌ９４１、Ｐ９４３、Ｆ９４５、Ｍ９４６、Ｅ９４７、Ｖ９４８、Ｎ９４９、Ｋ９５０、Ｄ９５１、Ｓ９５２、Ｉ９５３、Ｄ９５５、Ｙ９５６、Ｈ９５７、Ｖ９５８、Ａ９５９、Ｇ９６０、Ｌ９６１、Ｌ９６５、Ｎ９６６、Ｓ９６７、Ｋ９６８、Ｓ９６９、Ｄ９７０、Ａ９７１、Ｇ９７２、Ｔ９７３、Ｓ９７４、Ｖ９７５、Ｙ９７６、Ｙ９７７、Ｑ９７９、Ａ９８０、Ａ９８１、Ｌ９８２、Ｈ９８３、Ｆ９８４、Ｃ９８５、Ｅ９８６、Ａ９８７、Ｌ９８８、Ｇ９８９、Ｖ９９０、Ｓ９９１、Ｐ９９２、Ｅ９９３、Ｌ９９４、Ｖ９９５、Ｋ９９６、Ｎ９９７、Ｋ９９８、Ｋ９９９、Ｔ１０００、Ｈ１００１、Ａ１００２、Ａ１００３、Ｅ１００４、Ｌ１００５、Ｇ１００６、Ｍ１００９、Ｇ１０１０、Ｓ１０１１、Ａ１０１２、Ｍ１０１３、Ｌ１０１４、Ｍ１０１５、Ｐ１０１６、Ｗ１０１７、Ｇ１０１９、Ｇ１０２０、Ｖ１０２２、Ｙ１０２３、Ｉ１０２４、Ａ１０２５、Ｓ１０２６、Ｋ１０２７、Ｋ１０２８、Ｌ１０２９、Ｔ１０３０、Ｓ１０３１、Ｄ１０３２、Ａ１０３３、Ｋ１０３４、Ｓ１０３５、Ｖ１０３６、Ｋ１０３７、Ｙ１０３８、Ｃ１０３９、Ｇ１０４０、Ｅ１０４１、Ｄ１０４２、Ｍ１０４３、Ｗ１０４４、Ｑ１０４５、Ｙ１０４６、Ｈ１０４７、Ａ１０４８、Ｄ１０４９、Ｅ１０５０、Ｉ１０５１、Ａ１０５２、Ａ１０５３、Ｖ１０５４、Ｎ１０５５、Ｉ１０５６、Ａ１０５７、Ｍ１０５８、Ｙ１０５９、Ｅ１０６０、Ｖ１０６１、Ｃ１０６２、Ｃ１０６３、Ｑ１０６４、Ｔ１０６５、Ｇ１０６６、Ａ１０６７、Ｆ１０６８、Ｇ１０６９、Ｋ１０７０、Ｋ１０７１、Ｑ１０７２、Ｋ１０７３、Ｋ１０７４、Ｓ１０７５、Ｄ１０７６、Ｅ１０７７、Ｌ１０７８、Ｐ１０７９とＧ１０８０のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のアミノ酸に対応する。

【0025】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の
Ｓ１１８、Ｄ１１９、Ｆ１２１、Ｗ１２３、Ｑ１３６、Ｅ１３８、Ｅ１４３、Ｖ１４６、Ｓ１５５、Ｖ１５８、Ｅ１６１、Ｓ１６２、Ｔ１６３、Ａ１６５、Ｎ１６６、Ｇ１７８、Ｄ１８０、Ｔ１８５、Ｋ１８９、Ａ１９３、Ｄ１９６、Ｎ１９９、Ｎ２００、Ｅ２０２、Ｌ２０３、Ｓ２２１、Ｖ２３３、Ｅ２３５、Ｎ２３６、Ｓ２４１、Ｎ２４３、Ｓ２４５、Ｋ２５１、Ｄ２５５、Ｌ２５７、Ｎ２７３、Ｄ２８７、Ｓ２９５、Ｖ３０２、Ｓ３３２、Ｅ３３６、Ｓ３３８、Ｖ３３９、Ｅ３６２、Ｄ３７５、Ａ３７７、Ｎ３７８、Ｄ３８１、Ｔ３８２、Ｅ３８５、Ｄ３８７、Ｎ３９０、Ｅ３９５、Ｅ３９６、Ｑ３９８、Ｎ３９９、Ｖ４００、Ｄ４０３、Ｅ４０６、Ｑ４０７、Ｖ４０９、Ｄ４１１、Ｃ４１２、Ｎ４１６、Ｎ４１８、Ｌ４４０、Ｌ４４８、Ｖ４５１、Ｑ４５５、Ｅ４６４、Ｓ８０６、Ｓ８１７、Ｖ８１８、Ｓ８１９、Ｓ８３２、Ｍ８３３、Ｆ８３５、Ｔ８３６、Ｆ８３７、Ｃ８３９、Ａ８４０、Ｅ８４２、Ｅ８４３、Ｋ８４４、Ｔ８４６、Ｎ８４７、Ｋ８４８、Ｎ８５４、Ａ８５６、Ｓ８５８、Ｑ８６２、Ｋ８６３、Ｙ８６５、Ｌ８６６、Ｇ８６８、Ｋ８７０、Ｍ８７１、Ｄ８７６、Ｄ８７７、Ｖ８８０、Ｇ８８３、Ｋ８８４、Ｇ８８６、Ｋ８８７、Ａ８８８、Ａ８９１、Ｄ８９２、Ｍ８９４、Ａ９００、Ｋ９０３、Ｋ９０４、Ｎ９０６、Ｖ９１０、Ｍ９１２、Ｓ９１３、Ｃ９１５、Ｙ９１６、Ａ９１８、Ｍ９２３、Ｓ９２５、Ｈ９２６、Ｑ９２７、Ｖ９３１、Ｍ９３３、Ｑ９３４、Ｄ９３５、Ｋ９３６、Ｋ９３７、Ｔ９３８、Ｓ９３９、Ｖ９４０、Ｆ９４５、Ｍ９４６、Ｖ９４８、Ｎ９４９、Ｋ９５０、Ｄ９５１、Ｓ９５２、Ｄ９５５、Ｙ９５６、Ａ９５９、Ｇ９６０、Ｎ９６６、Ｓ９６７、Ｋ９６８、Ｓ９６９、Ｄ９７０、Ａ９７１、Ｇ９７２、Ｓ９７４、Ｖ９７５、Ｙ９７６、Ｑ９７９、Ａ９８０、Ｌ９８２、Ｈ９８３、Ｃ９８５、Ｅ９８６、Ａ９８７、Ｇ９８９、Ｖ９９０、Ｓ９９１、Ｐ９９２、Ｅ９９３、Ｌ９９４、Ｖ９９５、Ｋ９９６、Ｎ９９７、Ｋ９９８、Ｋ９９９、Ｔ１０００、Ｈ１００１、Ａ１００２、Ａ１００３、Ｅ１００４、Ｇ１００６、Ｇ１０１０、Ａ１０１２、Ｍ１０１３、Ｌ１０１４、Ｗ１０１７、Ｖ１０２２、Ｋ１０２８、Ｄ１０３２、Ｋ１０３４、Ｋ１０３７、Ｃ１０３９、Ｇ１０４０、Ｑ１０４５、Ｈ１０４７、Ｃ１０６３とＧ１０６９のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のアミノ酸に対応する。

【0026】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の
Ｎ２４３、Ｅ３３６、Ｖ８８０、Ｇ８８３、Ｄ８９２とＭ９２３のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のアミノ酸に対応する。

【0027】

いくつかの実施の形態では、前記一つ又は複数の突然変異は、Ｒで置換される。

【0028】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、さらに一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の
Ｖ８８０、Ｇ８８３、Ｄ８９２とＭ９２３のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のアミノ酸に対応する。

【0029】

いくつかの実施の形態では、前記一つ又は複数の突然変異は、Ｒで置換される。

【0030】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸に一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのアミノ酸配列の
Ｋ１０９、Ｌ１１２、Ｄ１２５、１２７、Ｆ１４４、Ｌ１４７、Ａ１４８、Ｌ１５１、Ｌ１５７、Ｖ１９５、Ｙ２２６、Ｆ２５２、Ｉ２５８、Ｍ２９３、Ｗ３０５、Ａ３０８、Ｉ３０９、Ｓ３１２、Ａ３１４、Ｄ３１５、Ｖ３１６、Ａ３１８、Ｌ３２４、Ｉ３２７、Ａ３４８、Ｌ３５２、Ｙ３６５、Ｌ３７２、Ｌ３７６、Ｌ３７９、Ｌ３８３、Ｉ４０５、Ｌ４２４、Ｉ４２７、Ａ４３６、Ｆ４３９、Ａ４４３、Ｖ４４７、Ａ４５７、Ｈ４５８、Ｐ４５９、Ｔ４６０、Ｓ４６３、Ｓ８１４、Ｆ８５９、Ａ８６４、Ｈ８６７、Ｙ９７７、Ｓ１０３１、Ａ１０５３とＦ１０６８のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のアミノ酸に対応する。

【0031】

いくつかの実施の形態では、前記一つ又は複数の突然変異は、Ｒで置換される。

【0032】

いくつかの実施の形態では、Ｎ２４３における前記置換は、Ｒ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｋ又はＨで置換される。

【0033】

いくつかの実施の形態では、前記突然変異は、置換である。

【0034】

いくつかの実施の形態では、前記置換は、非極性アミノ酸残基（例えばグリシン（Ｇｌｙ／Ｇ）、アラニン（Ａｌａ／Ａ）、バリン（Ｖａｌ／Ｖ）、システイン（Ｃｙｓ／Ｃ）、プロリン（Ｐｒｏ／Ｐ）、ロイシン（Ｌｅｕ／Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ／Ｉ）、メチオニン（Ｍｅｔ／Ｍ）、トリプトファン（Ｔｒｐ／Ｗ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ／Ｆ））、極性アミノ酸残基（例えばセリン（Ｓｅｒ／Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ／Ｔ）、チロシン（Ｔｙｒ／Ｙ）、アスパラギン（Ａｓｎ／Ｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ／Ｑ））、正に荷電したアミノ酸残基（例えばリジン（Ｌｙｓ／Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ／Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ／Ｈ））又は負に荷電したアミノ酸残基（例えばアスパラギン酸（Ａｓｐ／Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕｅ／Ｅ））で行われる置換である。

【0035】

いくつかの実施の形態では、前記置換は、正に荷電したアミノ酸残基、例えばアルギニン（Ｒ）で置換される。

【0036】

いくつかの実施の形態では、前記置換は、非極性アミノ酸残基、例えばアラニン（Ａ）で置換される。

【0037】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、表６におけるいずれか一つの突然変異体又はその組み合わせに対応する置換を含み、且つ、ここで、前記アミノ酸の位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対するものである。

【0038】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、表６におけるいずれか一つの突然変異体又はその組み合わせに対応する置換を含み、両方が同じガイドＲＮＡと組み合わせて使用される時、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記参照Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと比べて、増加したスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ切断活性を有し、例えば少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％又はそれ以上増加し、且つ、ここで、前記アミノ酸の位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対するものである。

【0039】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ突然変異体である。

【0040】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、表８におけるいずれか一つの突然変異体又はその組み合わせに対応する置換を含み、且つ、ここで、前記アミノ酸の位置は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対するものである。

【0041】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｄ８９２Ｒ突然変異体である。

【0042】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｇ８８３Ｒ突然変異体である。

【0043】

ある態様によれば、本開示は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを提供し、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、
（１）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ突然変異体のアミノ酸配列に示すとおりであり、
（２）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ突然変異体のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ突然変異体のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0044】

ある態様によれば、本開示は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを提供し、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、
（１）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｄ８９２Ｒ突然変異体のアミノ酸配列に示すとおりであり、
（２）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｄ８９２Ｒ突然変異体のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｄ８９２Ｒ突然変異体のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0045】

ある態様によれば、本開示は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドを提供し、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、
（１）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｇ８８３Ｒ突然変異体のアミノ酸配列に示すとおりであり、
（２）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｇ８８３Ｒ突然変異体のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｇ８８３Ｒ突然変異体のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0046】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、標的ｄｓＤＮＡの非標的鎖上のプロトスペーサー配列５’の隣りにある標的隣接モチーフ（ＴＡＭ）を認識することができ、且つ、ここで、前記ＴＡＭは、５’－ＮＴＴＮ－３’であり、ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣである。

【0047】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドに関連する機能ドメインをさらに含む。

【0048】

いくつかの実施の形態では、機能ドメインは、トランスポザーゼ活性、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、翻訳活性化活性、翻訳阻害活性、転写活性化活性、転写阻害活性、転写放出因子活性、クロマチン修飾又はリモデリング活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖ＲＮＡ切断活性、二本鎖ＲＮＡ切断活性、一本鎖ＤＮＡ切断活性、二本鎖ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性、検出可能活性又はそれらの任意の組み合わせを有する。

【0049】

ある態様によれば、本開示は、融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチドと機能ドメインとを含む。

【0050】

いくつかの実施の形態では、前記機能ドメインは、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドに対してＮ－末端、Ｃ－末端又は内部で融合される。

【0051】

いくつかの実施の形態では、前記機能ドメインは、リンカーを介して前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドに融合され、前記リンカーは、例えばＸＴＥＮリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４２）、複数のグリシンとセリン残基とを含むＧＳリンカー、複数のグリシンとセリン残基とを含むＧＳリンカー及びＸＴＥＮリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４２）、複数のグリシンとセリン残基とを含むＧＳリンカー及びＢＰ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３）である。

【0052】

いくつかの実施の形態では、前記機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）、デアミナーゼ又はその触媒ドメイン、ウラシルグリコシダーゼ阻害剤（ＵＧＩ）、ウラシルグリコシダーゼ（ＵＮＧ）、メチルプリングリコシダーゼ（ＭＰＧ）、メチラーゼ又はその触媒ドメイン、デメチラーゼ又はその触媒ドメイン、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４又はＶＰＲ）、転写阻害ドメイン（例えば、ＫＲＡＢ部分又はＳＩＤ部分）、逆転写酵素又はその触媒ドメイン、エキソヌクレアーゼ又はその触媒ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、ヌクレアーゼ触媒ドメイン（例えば、ＦｏｋＩ）、転写修飾因子、光ゲーティング因子（ｌｉｇｈｔ ｇａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）、化学誘導因子、クロマチン可視化因子、標的細胞又は標的細胞型上の細胞表面部分との結合を提供するためのターゲッティングポリペプチド、レポーター（例えば、蛍光）ポリペプチド又は検出マーカー（例えば、ＧＳＴ、ＨＲＰ、ＣＡＴ、ＧＦＰ、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、ＢＦＰ）、局在化シグナル、ポリペプチドターゲッティング部分、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＭＢＰ、Ｌｅｘ Ａ ＤＢＤ、Ｇａｌ４ ＤＢＤ）、エピトープタグ（例えば、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｖ５、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＶＳＶ－Ｇ、Ｔｒｘなど）、転写放出因子、ＨＤＡＣ、ｓｓＲＮＡ切断活性を有する部分、ｄｓＲＮＡ切断活性を有する部分、ｓｓＤＮＡ切断活性を有する部分、ｄｓＤＮＡ切断活性を有する部分、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼ、標的ＤＮＡを修飾する活性を示す機能ドメインとその触媒ドメイン及びその機能断片及びその任意の組み合わせから選択され、前記標的ＤＮＡを修飾する活性は、メチルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、脱酸素活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グリコシダーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ由来）、脱グリコシル化活性から選択される。

【0053】

いくつかの実施の形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４）、ｂｐＳＶ４０ ＮＬＳ（ＢＰ ＮＬＳ、ｂｐＮＬＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３）又はＮＰ ＮＬＳ（アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）核質タンパク質ＮＬＳ、核質タンパク質ＮＬＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４５）を含むか又はそれである。

【0054】

いくつかの実施の形態では、前記機能ドメインは、デアミナーゼ又はその触媒ドメインを含む。

【0055】

いくつかの実施の形態では、前記デアミナーゼ又はその触媒ドメインは、アデニンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ、例えばＴａｄＡ８ｅ、ＴａｄＡ８．１７、ＴａｄＡ８．２０、ＴａｄＡ９）又はその触媒ドメインである。

【0056】

いくつかの実施の形態では、デアミナーゼ又はその触媒ドメインは、シチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ、例えばＡＰＯＢＥＣ３、例えばＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＤｄｄＡ）又はその触媒ドメインである。

【0057】

いくつかの実施の形態では、前記機能ドメインは、ウラシルグリコシダーゼ阻害剤（ＵＧＩ）を含む。

【0058】

いくつかの実施の形態では、前記機能ドメインは、ウラシルグリコシダーゼ（ＵＮＧ）を含む。

【0059】

いくつかの実施の形態では、前記機能ドメインは、メチルプリングリコシダーゼ（ＭＰＧ）を含む。

【0060】

いくつかの実施の形態では、前記アデニンデアミナーゼドメインは、野生型ＴａｄＡ又はその変異体であり、それは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９に示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0061】

いくつかの実施の形態では、前記アデニンデアミナーゼドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９のＴａｄＡ８ｅ－Ｖ１０６Ｗであるか又はＴａｄＡ８ｅである。

【0062】

いくつかの実施の形態では、ＵＧＩドメインは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１に示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％或１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0063】

いくつかの実施の形態では、前記シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３又はその変異体であり、それは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０に示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0064】

いくつかの実施の形態では、前記シチジンデアミナーゼドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０のヒトＡＰＯＢＥＣ３－Ｗ１０４Ａである。

【0065】

いくつかの実施の形態では、前記機能ドメインは、逆転写酵素又はその触媒ドメインを含む。

【0066】

いくつかの実施の形態では、前記機能ドメインは、メチラーゼ又はその触媒ドメインを含む。

【0067】

いくつかの実施の形態では、前記機能ドメインは、転写活性化ドメインを含む。

【0068】

いくつかの実施の形態では、前記機能ドメインは、エキソヌクレアーゼ又はその触媒ドメイン、例えばＴ５エキソヌクレアーゼ（Ｔ５Ｅ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４９）を含む。

【0069】

いくつかの実施の形態では、エキソヌクレアーゼは、Ｎ－末端又はＣ－末端でＣａｓ１２ｉポリペプチドに融合される。

【0070】

いくつかの実施の形態では、エキソヌクレアーゼは、Ｃ－末端でＣａｓ１２ｉポリペプチドに融合される。

【0071】

いくつかの実施の形態では、Ｔ５エキソヌクレアーゼは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４９に示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４９のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４９のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0072】

ある態様によれば、本開示は、融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、
（１）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド、及び
（２）アデニンデアミナーゼドメインを含む。

【0073】

いくつかの実施の形態では、前記アデニンデアミナーゼドメインは、アデニンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ、例えばＴａｄＡ８ｅ、ＴａｄＡ８．１７、ＴａｄＡ８．２０、ＴａｄＡ９）又はその触媒ドメインである。

【0074】

いくつかの実施の形態では、前記アデニンデアミナーゼドメインは、野生型ＴａｄＡ又はその変異体であり、それは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９に示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0075】

いくつかの実施の形態では、前記アデニンデアミナーゼドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９のＴａｄＡ８ｅ－Ｖ１０６Ｗであるか又はＴａｄＡ８ｅである。

【0076】

ある態様によれば、本開示は、融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、
（１）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド、及び
（２）シチジンデアミナーゼドメインを含む。

【0077】

いくつかの実施の形態では、前記融合タンパク質は、ウラシルグリコシダーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインをさらに含む。

【0078】

いくつかの実施の形態では、ＵＧＩドメインは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１に示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％或１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0079】

いくつかの実施の形態では、前記シチジンデアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ（アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集触媒ポリペプチド様）、例えばＡＰＯＢＥＣ３、例えばＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＤｄｄＡ）又はその触媒ドメインである。

【0080】

いくつかの実施の形態では、前記シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３又はその変異体であり、それは、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０に示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０のアミノ酸配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０のアミノ酸配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0081】

いくつかの実施の形態では、前記シチジンデアミナーゼドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０のヒトＡＰＯＢＥＣ３－Ｗ１０４Ａである。

【0082】

いくつかの実施の形態では、前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５又は１８４のアミノ酸配列を含む。

【0083】

ある態様によれば、本開示は、融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、
（１）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド、及び
（２）非ＬＴＲ逆転写トランスポゾンドメインを含む。

【0084】

ある態様によれば、本開示は、融合タンパク質を提供し、前記融合タンパク質は、
（１）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド、及び
（２）転写活性化ドメインを含む。

【0085】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチドである。

【0086】

いくつかの実施の形態では、前記アデニンデアミナーゼドメインは、Ｎ－末端又はＣ－末端でＣａｓ１２ｉポリペプチドに融合される。

【0087】

いくつかの実施の形態では、前記シチジンデアミナーゼドメインは、Ｎ－末端又はＣ－末端でＣａｓ１２ｉポリペプチドに融合される。

【0088】

いくつかの実施の形態では、前記ウラシルグリコシダーゼ阻害剤ドメインは、Ｎ－末端又はＣ－末端でＣａｓ１２ｉポリペプチドに融合される。

【0089】

いくつかの実施の形態では、前記ウラシルグリコシダーゼ阻害剤ドメインは、Ｎ－末端又はＣ－末端で前記シチジンデアミナーゼドメインに融合される。

【0090】

いくつかの実施の形態では、非ＬＴＲ逆転写トランスポゾンドメインは、Ｎ－末端又はＣ－末端でＣａｓ１２ｉポリペプチドに融合される。

【0091】

いくつかの実施の形態では、前記融合タンパク質は、一つ、二つ、三つ又はそれ以上ＵＧＩドメインを含む。

【0092】

いくつかの実施の形態では、前記融合タンパク質は、リンカーを介し又はリンカーを介さずに直列連結される一つ、二つ、三つ又はそれ以上のＵＧＩドメインを含む。

【0093】

いくつかの実施の形態では、前記融合タンパク質は、一つ、二つ、三つ、四つ又はそれ以上のＮＬＳ及び／又はＮＥＳを含む。

【0094】

いくつかの実施の形態では、前記融合タンパク質は、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドのＮ－末端及び／又はＣ－末端にＮＬＳ又はＮＥＳを含む。

【0095】

いくつかの実施の形態では、前記融合タンパク質は、アデニンデアミナーゼドメインのＮ－末端及び／又はＣ－末端にＮＬＳ又はＮＥＳを含む。

【0096】

いくつかの実施の形態では、前記融合タンパク質は、シチジンデアミナーゼドメインのＮ－末端及び／又はＣ－末端にＮＬＳ又はＮＥＳを含む。

【0097】

いくつかの実施の形態では、前記融合タンパク質は、ＵＧＩドメインのＮ－末端及び／又はＣ－末端にＮＬＳ又はＮＥＳを含む。

【0098】

いくつかの実施の形態では、前記融合タンパク質は、逆転写酵素ドメインのＮ－末端及び／又はＣ－末端にＮＬＳ又はＮＥＳを含む。

【0099】

いくつかの実施の形態では、前記融合タンパク質は、非ＬＴＲ逆転写トランスポゾンドメインのＮ－末端及び／又はＣ－末端にＮＬＳ又はＮＥＳを含む。

【0100】

いくつかの実施の形態では、前記融合は、リンカーを介して行われる。

【0101】

いくつかの実施の形態では、前記リンカーは、ＧＳリンカー、ＸＴＥＮリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４２）、ＸＴＥＮを含むリンカー、ＮＬＳ又はＮＥＳを含むリンカー、ＸＴＥＮを含むＧＳリンカー、ＮＬＳ又はＮＥＳを含むＧＳリンカーである。

【0102】

いくつかの実施の形態では、前記融合タンパク質は、誘導的要素、例えば誘導的ポリペプチドを含む。

【0103】

いくつかの実施の形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４）、ｂｐＳＶ４０ ＮＬＳ（ＢＰ ＮＬＳ、ｂｐＮＬＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３）又はＮＰ ＮＬＳ（アフリカツメガエル核質タンパク質ＮＬＳ、核質タンパク質ＮＬＳ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４５）を含むか又はそれである。

【0104】

ある態様によれば、本開示は、ベクターを提供し、ここで、前記ベクターは、ＡＡＶベクターゲノムであり、前記ＡＡＶベクターゲノムは、
（１）プロモーターに動作可能に連結された本開示の融合タンパク質をコードして含むポリヌクレオチドと、
（２）プロモーターに動作可能に連結されたガイドＲＮＡのポリヌクレオチドとを含み、前記ガイドＲＮＡは、
（ｉ）前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又は前記融合タンパク質と複合体を形成できるダイレクトリピート配列と、
（ｉｉ）標的ｄｓＤＮＡの標的鎖上の標的配列にハイブリダイズすることによって、前記複合体を前記標的ｄｓＤＮＡに導くことができるスペーサー配列とを含む。

【0105】

いくつかの実施の形態では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つの参照ポリペプチドを含む、他の方面が同じである対照融合タンパク質又は対照複合体又は対照融合タンパク質と比べて、前記融合タンパク質は、増加した効率（例えば、塩基編集効率、メチル化効率、転写活性化効率）を有し、例えば、効率が少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％又はそれ以上増加する。

【0106】

ある態様によれば、本開示は、ガイドＲＮＡを提供し、前記ガイドＲＮＡは、
（１）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド、又は前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと機能ドメインとを含む融合タンパク質と複合体を形成できるダイレクトリピート配列と、
（２）標的ｄｓＤＮＡの標的鎖上の標的配列にハイブリダイズすることによって、前記複合体を前記標的ｄｓＤＮＡに導くことができるスペーサー配列とを含む。

【0107】

いくつかの実施の形態では、ダイレクトリピート配列は、スペーサー配列の５’末端にある。

【0108】

いくつかの実施の形態では、前記ガイドＲＮＡは、アプタマーをさらに含む。

【0109】

いくつかの実施の形態では、前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡテンプレートを付加するための伸長をさらに含む。

【0110】

いくつかの実施の形態では、前記ガイドＲＮＡは、標的ｄｓＤＮＡに挿入するためのドナー配列をさらに含む。

【0111】

いくつかの実施の形態では、前記ダイレクトリピート配列は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つに示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つのポリヌクレオチド配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つのポリヌクレオチド配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

【0112】

いくつかの実施の形態では、前記ダイレクトリピート配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つのポリヌクレオチド配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％又は９９．９％）且つ１００％未満の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むダイレクトリピート配列である。

【0113】

いくつかの実施の形態では、前記ダイレクトリピート配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つの二次構造と実質的に同じ二次構造を有する。

【0114】

いくつかの実施の形態では、前記ダイレクトリピート配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６と２０のいずれでもない。

【0115】

いくつかの実施の形態では、ガイドＲＮＡがＣａｓ１２ｉポリペプチド（例えば、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド）と組み合わせて使用される時、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと組み合わせて使用される、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つを含む、他の方面が同じである対照ガイドＲＮＡと比べて、増加したスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ切断活性を示し、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％又はそれ以上増加する。

【0116】

いくつかの実施の形態では、ガイドＲＮＡがＣａｓ１２ｉポリペプチド（例えば、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド）と組み合わせて使用される時、Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと組み合わせて使用される、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つを含む、他の方面が同じである対照ガイドＲＮＡと比べて、低減したスペーサー配列特異的なｄｓＤＮＡ及び／又はｓｓＤＮＡ切断活性を示し、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％低減する。

【0117】

いくつかの実施の形態では、ガイドＲＮＡが、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド（例えば、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド）と機能ドメイン（例えば、本開示の機能ドメイン）とを含む融合タンパク質（例えば、本開示の融合タンパク質）と組み合わせて使用される時、融合タンパク質と組み合わせて使用される、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つを含む、他の方面が同じである対照ガイドＲＮＡと比べて、増加した効率（例えば、塩基編集効率、メチル化効率、転写活性化効率）を示し、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２１０％、２２０％、２３０％、２４０％、２５０％、２６０％、２７０％、２８０％、２９０％、３００％又はそれ以上増加する。

【0118】

いくつかの実施の形態では、ダイレクトリピート配列は、一つ又は複数のヌクレオチドに一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つのポリヌクレオチド配列の一つ又は複数のヌクレオチドに対応する。

【0119】

いくつかの実施の形態では、前記一つ又は複数の突然変異は、ステムループ領域内にあり、前記ステムループ領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つのポリヌクレオチド配列のステムループ領域（例えば、Ｒ１領域、Ｒ２領域、Ｒ３領域、Ｒ４領域）に対応する。

【0120】

いくつかの実施の形態では、ダイレクトリピート配列は、一つ又は複数のヌクレオチドに一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つのポリヌクレオチド配列の
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～１３、１６、２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つの位置１から末端のいずれか一つの位置、例えば３６、例えば位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のヌクレオチドに対応する。

【0121】

いくつかの実施の形態では、ダイレクトリピート配列は、一つ又は複数のヌクレオチドに一つ又は複数の突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を含み、前記一つ又は複数のヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１のポリヌクレオチド配列の
位置１から３６のいずれか一つの位置、例えば位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６のうちの一つ又は複数の位置における一つ又は複数のヌクレオチドに対応する。

【0122】

いくつかの実施の形態では、前記突然変異は、欠失である。

【0123】

いくつかの実施の形態では、前記突然変異は、置換である。

【0124】

いくつかの実施の形態では、前記突然変異は、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣで置換される。

【0125】

いくつかの実施の形態では、ダイレクトリピート配列は、欠失を含む。

【0126】

いくつかの実施の形態では、欠失は、ダイレクトリピート配列のステムループ領域（例えば、Ｒ１領域、Ｒ２領域、Ｒ３領域、Ｒ４領域、Ｒ５領域）内にある。

【0127】

いくつかの実施の形態では、欠失は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００個のヌクレオチドを含む。

【0128】

いくつかの実施の形態では、欠失を含むステムループ領域は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の塩基対を保持する。

【0129】

いくつかの実施の形態では、欠失を含むステムループ領域は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の塩基対を保持する。

【0130】

いくつかの実施の形態では、欠失を含むステムループ領域は、多くとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０個の非Ａ－Ｕ又は非Ｇ－Ｃミスマッチを含有する。

【0131】

いくつかの実施の形態では、ダイレクトリピート配列は、一つ又は複数のＧ－Ｃ又はＣ－Ｇ塩基対で一つ又は複数の熱力学的に不安定な塩基対を置換することを含む。

【0132】

いくつかの実施の形態では、熱力学的に不安定な塩基対は、Ａ－Ｕ又はＵ－Ａ塩基対、Ａ－Ｇ又はＧ－Ａ塩基対、又はＵ－Ｇ又はＧ－Ｕ塩基対である。

【0133】

いくつかの実施の形態では、熱力学的に不安定な塩基対は、ダイレクトリピート配列のステムループ領域のステム内にある。

【0134】

いくつかの実施の形態では、熱力学的に不安定な塩基対は、ステムループ領域のステムとループの両方に共通する塩基対から始まり、且つ前記塩基対の１番目、２番目、３番目、４番目、５番目、６番目、７番目、８番目、９番目、１０番目、１１番目、１２番目、１３番目、１４番目、１５番目、１６番目、１７番目、１８番目、１９番目、２０番目、２１番目、２２番目、２３番目、２４番目、２５番目、２６番目、２７番目、２８番目、２９番目又は３０番目の塩基対を含む。

【0135】

いくつかの実施の形態では、前記ダイレクトリピート配列は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０１～５０７のうちのいずれか一つに示すとおりであり、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０１～５０７のうちのいずれか一つのポリヌクレオチド配列を含み、又は、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０１～５０７のうちのいずれか一つのポリヌクレオチド配列と少なくとも約６０％（例えば、少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％）の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

【0136】

いくつかの実施の形態では、前記標的配列は、標的遺伝子の少なくとも約１６個の連続したヌクレオチド、例えば、標的遺伝子の約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０個の連続したヌクレオチド、又はいずれか二つの前記値の間の数値範囲を含み、例えば、標的遺伝子の約１６から約５０個の連続したヌクレオチドは、基本的にそれによって構成されるか、又はそれによって構成される。

【0137】

いくつかの実施の形態では、前記標的配列の長さは、少なくとも約１６個のヌクレオチドであり、例えば長さは、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０個のヌクレオチドであり、又は長さは、いずれか二つの前記値の間の数値範囲にあり、例えば、長さは、約１６から約５０個のヌクレオチドである。

【0138】

いくつかの実施の形態では、前記プロトスペーサー配列は、標的遺伝子の少なくとも約１６個の連続したヌクレオチド、例えば、標的遺伝子の約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０個の連続したヌクレオチド、又はいずれか二つの前記値の間の数値範囲を含み、例えば、標的遺伝子の約１６から約５０個の連続したヌクレオチドは、基本的にそれによって構成されるか、又はそれによって構成される。

【0139】

いくつかの実施の形態では、前記プロトスペーサー配列の長さは、少なくとも約１６個のヌクレオチドであり、例えば長さは、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０個のヌクレオチドであり、又は長さは、いずれか二つの前記値の間の数値範囲にあり、例えば、長さは、約１６から約５０個のヌクレオチドである。

【0140】

いくつかの実施の形態では、前記標的配列は、前記標的配列５’にあるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。

【0141】

いくつかの実施の形態では、前記標的配列は、標的配列と逆相補的なプロトスペーサー配列５’のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。

【0142】

いくつかの実施の形態では、前記スペーサー配列の長さは、少なくとも約１６個のヌクレオチドであり、例えば長さは、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９又は７０個のヌクレオチドであり、又は長さは、いずれか二つの前記値の間の数値範囲にあり、例えば、長さは、約１６から約５０個のヌクレオチドである。

【0143】

いくつかの実施の形態では、スペーサー配列は、標的配列に対して約９０％～１００％相補的であり、及び／又は標的配列に対して１、２、３、４又は５個を超えないミスマッチを含む。

【0144】

いくつかの実施の形態では、前記ガイドＲＮＡは、複数の標的配列とそれぞれハイブリダイズ可能な複数の（例えば、２、３、４、５個又はそれ以上）スペーサー配列を含む。

【0145】

いくつかの実施の形態では、前記複数の標的配列は、同一のポリヌクレオチド上にあるか、又は単独のポリヌクレオチド上にある。

【0146】

いくつかの実施の形態では、前記スペーサー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２～１２５、１３０、１３１～３８１、３８２、３９１、３９８～４３８のうちのいずれか一つの少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む。

【0147】

いくつかの実施の形態では、ｄｓＤＮＡは、細胞内にある。

【0148】

ある態様によれば、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド又は融合タンパク質をコードする。

【0149】

ある態様によれば、本開示は、ポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、本開示のガイドＲＮＡをコードする。

【0150】

いくつかの実施の形態では、前記ポリヌクレオチドは、真核（例えば、哺乳動物、例えばヒト）細胞において発現するようにコドンによって最適化される。

【0151】

いくつかの実施の形態では、前記ポリヌクレオチドは、ポリデオキシリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドである。

【0152】

いくつかの実施の形態では、前記ポリヌクレオチドの一つ又は複数のヌクレオチドは、修飾されている。

【0153】

ある態様によれば、本開示は、システム又は組成物を提供し、前記システム又は組成物は、
（１）Ｃａｓ１２ｉポリペプチド、又は前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドと機能ドメインとを含む融合タンパク質、又は前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又は前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及び
（２）ガイドＲＮＡ（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」とも呼ばれる）、又は前記ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含み、前記ガイドＲＮＡは、
（ｉ）前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又は前記融合タンパク質と複合体を形成できるダイレクトリピート配列と、
（ｉｉ）標的ｄｓＤＮＡの標的鎖上の標的配列にハイブリダイズすることによって、前記複合体を前記標的ｄｓＤＮＡに導くことができるスペーサー配列とを含む。

【0154】

いくつかの実施の形態では、前記システム又は組成物は、天然に存在しない、操作されたシステム又は組成物である。

【0155】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又は前記融合タンパク質は、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド又は融合タンパク質である。

【0156】

いくつかの実施の形態では、前記ガイドＲＮＡは、本開示のガイドＲＮＡである。

【0157】

いくつかの実施の形態では、前記ダイレクトリピート配列は、本開示のダイレクトリピート配列である。

【0158】

いくつかの実施の形態では、前記スペーサー配列は、本開示のスペーサー配列である。

【0159】

いくつかの実施の形態では、前記システム又は組成物は、誘導システム、例えばＴＭＰ、ＤＯＸ、Ｄｅｇｒｏｎをさらに含む。

【0160】

いくつかの実施の形態では、前記誘導システムは、誘導要素を含む融合タンパク質を活性化することができる誘導剤を含む。

【0161】

いくつかの実施の形態では、前記誘導システムは、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド、又は誘導要素を含む融合タンパク質の発現を活性化することができる誘導剤を含む。

【0162】

いくつかの実施の形態では、前記システム又は組成物は、転写活性化ドメインを含む融合タンパク質を活性化することができる活性化剤を含む。

【0163】

いくつかの実施の形態では、コード配列は、ＤＮＡコード配列又はＲＮＡコード配列である。

【0164】

いくつかの実施の形態では、前記システム又は組成物は、セリン又はチロシンリコンビナーゼをさらに含む。

【0165】

いくつかの実施の形態では、前記システム又は組成物は、ドナー構築体をさらに含み、前記ドナー構築体は、標的ｄｓＤＮＡに挿入するためのドナーポリヌクレオチドを含み、且つ非ＬＴＲ逆転写トランスポゾンタンパク質と複合体を形成できる二つの結合要素の間に位置する。

【0166】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、非ＬＴＲ逆転写トランスポゾンタンパク質のＮ－末端に融合される。

【0167】

いくつかの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ニッカーゼである。

【0168】

いくつかの実施の形態では、前記ガイドＲＮＡは、融合タンパク質をターゲッティング挿入部位５’の標的配列に導き、且つ、ここで、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ターゲッティング挿入部位に二本鎖切断を生成する。

【0169】

いくつかの実施の形態では、前記ガイドＲＮＡは、融合タンパク質をターゲッティング挿入部位５’又は３’の標的配列に導き、且つ、ここで、前記Ｃａｓ１２ｉポリペプチドは、ターゲッティング挿入部位に二本鎖切断を生成する。

【0170】

いくつかの実施の形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ドナーポリヌクレオチド配列の５’末端又は３’末端の加工を促進するためのポリメラーゼ加工要素をさらに含む。

【0171】

いくつかの実施の形態では、ドナーポリヌクレオチドは、ドナー構築体の５’末端、ドナー構築体の３’末端又は両末端上の標的配列の相同領域をさらに含む。

【0172】

いくつかの実施の形態では、相同領域は、８から２５個の塩基対である。

【0173】

ある態様によれば、本開示は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。

【0174】

いくつかの実施の形態では、前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結される。

【0175】

ある態様によれば、本開示は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本開示のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0176】

いくつかの実施の形態では、前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結される。

【0177】

ある態様によれば、本開示は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、本開示のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む。

【0178】

いくつかの実施の形態では、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド、又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び本開示のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、同一のプロモーターに動作可能に連結される。

【0179】

いくつかの実施の形態では、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び本開示のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、それぞれプロモーターに動作可能に連結される。

【0180】

いくつかの実施の形態では、プロモーターは、広域スペクトルプロモーター、組織特異的プロモーター、細胞種特異的プロモーター、構成的プロモーターと誘導的プロモーターから選択される。

【0181】

いくつかの実施の形態では、プロモーターは、（ヒト）Ｕ６プロモーター（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４６）、エロンゲーションファクター１αショート（ＥＦＳ）プロモーター、（ヒト）Ｃｂｈプロモーター、ＭＨＣＫ７プロモーター、Ｃｂａプロモーター、ｐｏｌ Ｉプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｈ１プロモーター、レトロウイルスラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター、（ヒト）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４７）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β－アクチンプロモーター、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（Ｉｅ）エンハンサー及び／又はプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター又はその誘導体、例えばＣＡＧプロモーター（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５００）、ＣＢプロモーター、（ヒト）エロンゲーションファクター１α－サブユニット（ＥＦ１α）プロモーター、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、プリオンプロモーター、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）プロモーター、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦＨ）プロモーター、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）プロモーター、血小板由来増殖因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ－β）プロモーター、シナプシン（Ｓｙｎ）プロモーター、シナプシン１（Ｓｙｎ１）プロモーター、メチル－ＣｐＧ結合ポリペプチド２（ＭｅＣＰ２）プロモーター、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性ポリペプチドキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）プロモーター、代謝型グルタミン酸受容体２（ｍＧｌｕＲ２）プロモーター、β－グロビン ミニ遺伝子ｎβ２プロモーター、プレプロエンケファリン（ＰＰＥ）プロモーター、エンケファリン（Ｅｎｋ）プロモーター、興奮性アミノ酸トランスポーター２（ＥＡＡＴ２）プロモーター、グリア原線維酸性ポリペプチド（ＧＦＡＰ）プロモーターとミエリン塩基性ポリペプチド（ＭＢＰ）プロモーターから選択されるプロモーターを含むか又はそれである。

【0182】

いくつかの実施の形態では、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本開示のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの５’又は３’にある。

【0183】

いくつかの実施の形態では、前記ベクターは、プラスミドである。

【0184】

いくつかの実施の形態では、前記ベクターは、ウイルスベクターである。

【0185】

いくつかの実施の形態では、前記ベクターは、レトロウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、ＡＡＶベクター又はレンチウイルスベクターである。

【0186】

いくつかの実施の形態では、ＡＡＶベクターは、ＤＮＡカプシド化ＡＡＶベクター又はＲＮＡカプシド化ＡＡＶベクターである。

【0187】

いくつかの実施の形態では、ＡＡＶベクターは、カプシドを含み、カプシドの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ（ＡＡＶ１－ＡＡＶ１３のうちのいずれか一つが属するクレードのメンバー）又はその機能切断変異体又は機能突然変異体である。

【0188】

ある態様によれば、本開示は、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子を提供し、前記ｒＡＡＶ粒子は、本開示のベクターを含む。

【0189】

いくつかの実施の形態では、ｒＡＡＶ粒子は、カプシドを含み、カプシドの血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ａ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ．ＰＨＰ．ｅＢ（ＡＡＶ１－ＡＡＶ１３のうちのいずれか一つが属するクレードのメンバー）、その機能切断変異体又はその機能突然変異体であり、それによってベクターをカプシド化する。

【0190】

ある態様によれば、本開示は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を提供し、前記脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド、又は融合タンパク質と本開示のガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。

【0191】

いくつかの実施の形態では、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡ形式である。

【0192】

いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、５’ＵＴＲを含む。

【0193】

いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉポリペプチド又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、３’ｐｏｌｙＡ尾部を含む。

【0194】

ある態様によれば、本開示は、標的ｄｓＤＮＡを修飾するための方法を提供し、前記方法は、標的ｄｓＤＮＡを本開示のシステム、ベクター、ｒＡＡＶ粒子又はＬＮＰに接触させることを含み、ここで、前記スペーサー配列は、前記標的ｄｓＤＮＡの標的鎖の標的配列にハイブリダイズ可能であり、ここで、前記標的配列は、前記複合体によって修飾される。

【0195】

ある態様によれば、本開示は、本開示のシステム、ベクター、ｒＡＡＶ粒子又はＬＮＰの、標的ｄｓＤＮＡを修飾するための薬剤の製造における用途を提供し、ここで、前記スペーサー配列は、前記標的ｄｓＤＮＡの標的鎖の標的配列にハイブリダイズ可能であり、ここで、前記標的配列は、前記複合体によって修飾される。

【0196】

ある態様によれば、本開示は、標的ｄｓＤＮＡの修飾に使用される本開示のシステム、ベクター、ｒＡＡＶ粒子又はＬＮＰを提供し、ここで、前記スペーサー配列は、前記標的ｄｓＤＮＡの標的鎖の標的配列にハイブリダイズ可能であり、ここで、前記標的配列は、前記複合体によって修飾される。

【0197】

いくつかの実施の形態では、前記標的ｄｓＤＮＡは、ヒトＴＲＡＣ遺伝子である。

【0198】

いくつかの実施の形態では、前記スペーサー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３～１２５のうちのいずれか一つの連続したヌクレオチドを少なくとも含む。

【0199】

ある態様によれば、本開示は、細胞又はその後代を提供し、前記細胞又はその後代は、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド、融合タンパク質、ガイドＲＮＡ、システム、ポリヌクレオチド、ベクター、ｒＡＡＶ粒子及び／又はＬＮＰを含む。

【0200】

ある態様によれば、本開示は、修飾された細胞又はその後代を提供し、ここで、前記修飾された細胞は、本開示の方法によって修飾される。

【0201】

いくつかの実施の形態では、前記細胞は、インビボ、エクスビボ又はインビトロである。

【0202】

いくつかの実施の形態では、細胞は、真核細胞（例えば、動物細胞、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、非ヒト霊長類動物細胞、げっ歯動物（例えば、マウス又はラット）細胞、ヒト細胞、植物細胞又は酵母細胞）又は原核細胞（例えば、細菌細胞）である。

【0203】

いくつかの実施の形態では、前記細胞は、培養された細胞、単離された初代細胞又は生体内の細胞である。

【0204】

いくつかの実施の形態では、前記細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲ－ＮＫ細胞）、又は幹細胞（例えば、ｉＰＳ細胞、ＨＳＣ細胞）である。

【0205】

いくつかの実施の形態では、前記細胞は、被験体に由来するか又は前記被験体とは異種である。

【0206】

ある態様によれば、本開示は、宿主を提供し、前記宿主は、本開示の細胞又はその後代を含む。

【0207】

いくつかの実施の形態では、前記宿主は、非ヒト動物又は植物である。

【0208】

いくつかの実施の形態では、前記非ヒト動物は、ヒト遺伝性障害に対する動物（例えば、げっ歯動物又は非ヒト霊長類動物）モデルである。

【0209】

いくつかの態様によれば、本開示は、（例えば、医薬）組成物を提供し、前記組成物は、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド、融合タンパク質、ガイドＲＮＡ、ポリヌクレオチド、システム、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、ＬＮＰ及び／又は細胞又はその後代を含む。

【0210】

いくつかの実施の形態では、前記組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤を含む。

【0211】

いくつかの実施の形態では、前記組成物は、ナノ粒子、例えば脂質ナノ微粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、核酸（例えば、ＤＮＡ）ナノアセンブリ、遺伝子銃又は植え込み可能な装置を介して送達するために調製される。

【0212】

ある態様によれば、本開示は、送達システムを提供し、前記送達システムは、
（１）送達媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）と、
（２）本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド、融合タンパク質、ガイドＲＮＡ、ポリヌクレオチド、システム、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、ＬＮＰ、細胞又はその後代、及び／又は組成物とを含む。

【0213】

いくつかの実施の形態では、送達媒体は、ナノ粒子、例えば脂質ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞、核酸（例えば、ＤＮＡ）ナノアセンブリ、遺伝子銃又は植え込み可能な装置である。

【0214】

ある態様によれば、本開示は、キットを提供し、前記キットは、本開示のＣａｓ１２ｉポリペプチド、融合タンパク質、ガイドＲＮＡ、ポリヌクレオチド、システム、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、ＬＮＰ、細胞又はその後代、組成物及び／又は送達システムを含む。

【0215】

いくつかの実施の形態では、前記キットは、標的ｄｓＤＮＡを修飾するための説明書をさらに含む。

【0216】

ある態様によれば、本開示は、被験体の疾患又は障害を診断、予防又は治療するための方法を提供し、前記方法は、被験体に（例えば、有効量の）本開示のシステム、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、ＬＮＰ、細胞又はその後代、組成物、送達システム、及び／又はキットを投与することを含む。

【0217】

ある態様によれば、本開示は、（例えば、有効量の）本開示のシステム、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、ＬＮＰ、細胞又はその後代、組成物、送達システム、及び／又はキットの、被験体の疾患又は障害を診断、予防又は治療するための薬物又はキットの製造における用途を提供する。

【0218】

ある態様によれば、本開示は、（例えば、有効量の）本開示のシステム、ベクター、ｒＡＡＶ粒子、ＬＮＰ、細胞又はその後代、組成物、送達システム、及び／又はキットの、被験体の疾患又は障害の診断、予防又は治療における使用を提供する。

【0219】

いくつかの実施の形態では、前記疾患又は障害は、被験体における標的ｄｓＤＮＡの歪みに関連する。

【0220】

いくつかの実施の形態では、前記スペーサー配列は、標的ｄｓＤＮＡの標的鎖の標的配列にハイブリダイズ可能であり、ここで、標的ｄｓＤＮＡの歪みは、前記複合体によって修飾される。

【0221】

いくつかの実施の形態では、前記方法又は用途は、被験体に有効量の同じ組換えドナーテンプレートを投与することをさらに含み、前記同じ組換えドナーテンプレートは、標的ｄｓＤＮＡに挿入するためのドナー配列を含み、ここで、前記ドナー配列の挿入は、標的ｄｓＤＮＡの歪みを修正する。

【0222】

いくつかの実施の形態では、修飾された細胞又はその後代によって疾患又は障害を予防又は治療する。

【0223】

いくつかの実施の形態では、前記疾患又は障害は、ＴＴＲ関連疾患又は障害、例えばＡＴＴＲである。

【0224】

いくつかの実施の形態では、前記スペーサー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む。

【0225】

いくつかの実施の形態では、前記疾患又は障害は、ＰＣＳＫ９関連疾患又は障害である。

【0226】

いくつかの実施の形態では、前記スペーサー配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドを含む。

【0227】

いくつかの実施の形態では、前記システムは、同じ組換えドナーテンプレートをさらに含み、前記同じ組換えドナーテンプレートは、標的ｄｓＤＮＡに挿入するためのドナー配列を含む。

【0228】

いくつかの実施の形態では、前記の、複合体を標的ｄｓＤＮＡに導くことは、複合体と標的ｄｓＤＮＡとの結合を引き起こす。

【0229】

いくつかの実施の形態では、前記の、複合体を標的ｄｓＤＮＡに導くことは、標的ｄｓＤＮＡの修飾を引き起こす。

【0230】

いくつかの実施の形態では、標的ｄｓＤＮＡの修飾は、標的ｄｓＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）を含む。

【0231】

いくつかの実施の形態では、ＤＳＢは、欠失及び／又は挿入突然変異（挿入欠失突然変異）を生じる。

【0232】

いくつかの実施の形態では、挿入欠失突然変異は、標的ｄｓＤＮＡの転写及び／又は発現を修飾する。

【0233】

いくつかの実施の形態では、ドナーＤＮＡテンプレートは、ＤＳＢの部位に挿入される。

【0234】

いくつかの実施の形態では、標的ｄｓＤＮＡの修飾は、標的ｄｓＤＮＡの標的鎖の標的配列の一本鎖切断（ＳＳＢ）を含む。

【0235】

いくつかの実施の形態では、ｄｓＤＮＡの修飾は、標的配列と逆相補的なプロトスペーサー配列の一つ又は複数のヌクレオチドの置換を含む。

【0236】

いくつかの実施の形態では、置換は、ＡからＴへの置換、ＡからＧへの置換、ＡからＣへの置換、ＣからＡへの置換、ＣからＴへの置換、ＣからＧへの置換、ＴからＡへの置換、ＴからＧへの置換、ＴからＣへの置換、ＧからＡへの置換、ＧからＴへの置換及び／又はＧからＣへの置換である。

【0237】

いくつかの実施の形態では、ｄｓＤＮＡの修飾は、標的ｄｓＤＮＡの非標的鎖の一本鎖切断（ＳＳＢ）を含む。

【0238】

いくつかの実施の形態では、ｄｓＤＮＡの修飾は、非標的鎖の一つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失及び／又は置換を含む。

【0239】

いくつかの実施の形態では、前記修飾は、ａ．一つ又は複数の塩基編集を導入すること、ｂ．早期停止コドンを修正又は導入すること、ｃ．スプライス部位を破壊すること、ｄ．スプライス部位を挿入又は回復すること、ｅ．標的ポリヌクレオチドの一つ又は二つの対立遺伝子に遺伝子又は遺伝子断片を挿入すること、又はｆ．その組み合わせである。

【0240】

いくつかの実施の形態では、前記複合体は、逆転写酵素ドメインを標的配列に導き、且つ逆転写酵素は、ドナー配列のガイドＲＮＡから標的ｄｓＤＮＡへの挿入を促進する。

【0241】

いくつかの実施の形態では、前記ドナー配列の挿入は、ａ．一つ又は複数の塩基編集を導入すること、ｂ．早期停止コドンを修正又は導入すること、ｃ．スプライス部位を破壊すること、ｄ．スプライス部位を挿入又は回復すること、ｅ．標的ポリヌクレオチドの一つ又は二つの対立遺伝子に遺伝子又は遺伝子断片を挿入すること、又はｆ．その組み合わせである。

【0242】

いくつかの実施の形態では、前記複合体は、非ＬＴＲ逆転写トランスポゾンタンパク質を標的配列に導き、且つ非ＬＴＲ逆転写トランスポゾンタンパク質は、ドナーポリヌクレオチド配列のドナー構築体から標的ｄｓＤＮＡへの挿入を促進する。

【0243】

いくつかの実施の形態では、前記ドナー配列の挿入は、ａ．一つ又は複数の塩基編集を導入すること、ｂ．早期停止コドンを修正又は導入すること、ｃ．スプライス部位を破壊すること、ｄ．スプライス部位を挿入又は回復すること、ｅ．標的ポリヌクレオチドの一つ又は二つの対立遺伝子に遺伝子又は遺伝子断片を挿入すること、又はｆ．その組み合わせである。

【0244】

いくつかの実施の形態では、前記の、複合体を標的ｄｓＤＮＡに導くことは、標的ｄｓＤＮＡの転写修飾を引き起こす。

【0245】

いくつかの実施の形態では、転写された修飾は、上方制御された転写、下方制御された転写、活性化された転写又は阻害された転写である。

【0246】

いくつかの実施の形態では、標的ｄｓＤＮＡの修飾は、標的ｄｓＤＮＡの一つ又は複数のヌクレオチドのメチル化又は脱メチル化を含む。

【0247】

提示される例示的な実施の形態の以下の詳細な記述を考慮することによって、当業者にとって、例示的な実施の形態のこれらと他の態様、目的、特徴と利点は、明らかになる。

【0248】

理解すべきこととして、本明細書に記述されている本開示のいずれか一つの実施の形態は、実施例もしくは特許請求の範囲のみ、又は以下の一つの態様／部分のみに記述されているそれらの実施の形態を含み、明示的に否定され、又は不当であるとみなされない限り、本開示の他の任意の一つ又は複数の実施の形態と組み合わせることができる。
以下の詳細な記述と図面を参照することにより、本開示のいくつかの特徴と利点に対する理解を得、以下の詳細な記述は、本開示の原理を利用し得る説明的実施の形態を述べており、且つこれらの図面において以下を示す。

【図面の簡単な説明】

【0249】

【図1】図１は、ｘＣａｓ１２ｉの操作された変異体ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘが、効率的かつ高度に特異的なゲノム編集を媒介し、且つｄＣａｓ１２ｉ塩基エディタが哺乳動物細胞において高い塩基編集活性を示した、ことを示す。Ａ、フローサイトメトリーによって決定されるｘＣａｓ１２ｉ媒介性ＥＧＦＰ活性化効率である。ＮＣは、非特異性（非ターゲッティング）対照を表す。Ｂ、オンターゲットとオフターゲットｃｒＲＮＡを有する活性化可能なＥＧＦＰレポータースクリーニングシステムを用いて、高効率と高忠実度で突然変異体に対して行ったタンパク質操作戦略の概略図である。Ｃ－Ｄ、Ｃａｓ１２Ｍａｘは、レポータープラスミド（Ｃ）又は様々なゲノム（Ｄ）標的部位にｘＣａｓ１２ｉよりも著しく増加した切断活性を示す。各点は、一つのターゲッティング部位における平均挿入欠失頻度（ｎ＝３）を表す。Ｅ、ＮＧＳ分析により、ｈｆＣａｓ１２ＭａｘがＴＴＲ．２－ＯＮターゲットでＣａｓ１２Ｍａｘと同等な活性を保持し、且つ６個のＯＴ部位でほとんど活性がないことを示す。Ｆ、Ｃａｓ１２ＭａｘとｈｆＣａｓ１２Ｍａｘの両方は、いずれも他のＣａｓタンパク質よりも広いＰＡＭ認識スペクトルを示し、５’－ＴＮと５’－ＴＮＮ ＰＡＭとを含む。Ｇ、ＴＴＲ遺伝子座におけるＣａｓ１２Ｍａｘ、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｕｌｔｒａ ＡｓＣａｓ１２ａ、ＳｐＣａｓ９とＫＫＨ－ｓａＣａｓ９の挿入欠失活性の比較である。ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘは、Ｃａｓ１２Ｍａｘと同等な活性を保持し、且つ他のＣａｓタンパク質よりも高い遺伝子編集効率を保持する。各点は、単一の標的部位の三つの繰り返しの一つを表す。Ｈ、異なるバージョンのｄｘＣａｓ１２ｉアデニン塩基エディタの概略図である。Ｉ、ＴａｄＡ８ｅ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ１．２、ｖ２．２とｖ４．３の、ＫＬＦ４部位におけるＡからＧ編集頻度と生成物純度の比較であり、ｖ４．３は、８０％の高い編集活性を示す。ＴａｄＡ８ｅ－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ４．３は、ＡＢＥ－ｄＣａｓ１２Ｍａｘと命名される。ＴａｄＡ８ｅ．１は、ＴａｄＡ８ｅ Ｖ１０６Ｗを表す。Ｊ、異なるバージョンのｄｘＣａｓ１２ｉシトシン塩基エディタの概略図である。Ｋ、ｈＡ３Ａ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ１．２、ｖ２．２とｖ３．１の、ＤＹＲＫ１Ａ部位におけるＣからＴ編集頻度と生成物純度の比較であり、ｖ３．１は、５０％の高い編集活性を示す。ｈＡ３Ａ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ３．１は、ＣＢＥ－ｄＣａｓ１２Ｍａｘと命名される。ｈＡ３Ａ．１は、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａ Ｗ１０４Ａを表す。

【図2】図２は、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘがエクスビボとインビボの高効率遺伝子編集を媒介することを示す。Ａ、初代ヒト細胞におけるｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ遺伝子編集の概略図である。Ｂ、それぞれ１．６μＭと３．２μＭで三種類の異なるターゲッティングＴＲＡＣを有するｃｒＲＮＡのｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ ＲＮＰを送達した後のヒトＣＤ３＋ Ｔ細胞の活力と挿入欠失活性（ｎ＝２又は３）である。ＮＣは、ＲＮＰで処理されていないブランク対照を表す。Ｃ、ＲＮＰ送達から５日後の編集されたＣＤ３＋ Ｔ細胞の代表的なフローサイトメトリー分析である。ＮＣは、ＲＮＰで処理されていないブランク対照を表す。Ｄ、ＩＶＴ－ｍＲＮＡを含有するインビボ非リポソーム送達、ＬＮＰパッケージングプロセスの概略図である。Ｅ、Ｎ２ａ細胞に濃度を増加させるｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ ｍＲＮＡとＴｔｒ ｃｒＲＮＡを標的とするＬＮＰがパッケージングされている編集効率（ｎ＝８）である。Ｆ、Ｔｔｒ遺伝子座の概略図である。Ｇ、Ｃ５７マウスに三つの投与量（０．１、０．３と０．５ｍｐｋ）のｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ ｍＲＮＡとＴｔｒ ｃｒＲＮＡを標的とするＬＮＰがパッケージングされている挿入欠失率（ｎ＝６）である。Ｈ、Ｃ５７マウスに３ｍｐｋのｄＣａｓ１２ｉ－ＡＢＥ ｍＲＮＡとＴｔｒ ｃｒＲＮＡを標的とするＬＮＰがパッケージングされているＡからＧ編集百分率（ｎ＝２）である。

【図3】図３は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における機能性Ｃａｓ１２ｉのスクリーニングを示す。Ａ、Ｃａｓ１２ｉとｃｒＲＮＡをコードするプラスミドのトランスフェクションは、ＥＧＦＰ活性化を媒介する。Ｂ、１０種類のＣａｓ１２ｉヌクレアーゼのうちの５種類は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ活性化効率を媒介する。

【図4】図４は、Ｖ－Ｉ型システムの同定と特徴付けを示す。Ａ、ＳｐＣａｓ９、ＬｂＣａｓ１２ａとｘＣａｓ１２ｉのヌクレアーゼドメイン組織である。Ｂ、ｘＣａｓ１２ｉの有効スペーサー配列長さである。Ｃ、ＬｂＣａｓ１２ａとｘＣａｓ１２ｉのＰＡＭ範囲の比較である。ｘＣａｓ１２ｉは、５’－ＴＴＮ ＰＡＭにおいてＣａｓ１２ａよりも高いｄｓＤＮＡ切断活性を示す。Ｄ、ｘＣａｓ１２ｉとターゲッティングｇＲＮＡを含有する一体化プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、次にＦＡＣＳとＮＧＳ分析を行うことによってゲノム切断活性を検出するフローチャートである。Ｅ－Ｆ、ｘＣａｓ１２ｉは、Ｎ２ａ細胞におけるＴｔｒ遺伝子座及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＴＲとＰＣＳＫ９において頑強なゲノム切断を媒介する（９０％と高い）。

【図5】図５は、増加したｄｓＤＮＡ切断活性を有する、操作されたｘＣａｓ１２ｉ突然変異体のスクリーニングを示す。Ａ、５００種類を超える、合理的に操作されたｘＣａｓ１２ｉ突然変異体の相対的なｄｓＤＮＡ切断活性である。ｖ１．１は、Ｎ２４３Ｒを有するｘＣａｓ１２ｉを表し、Ｃａｓ１２Ｍａｘと命名される。

【図6】図６は、他の突然変異体によって媒介される高効率編集を示す。Ａ、Ｎ２４３の飽和突然変異体において、Ｎ２４３Ｒは、ＥＧＦＰ活性化の蛍光を最も多く増加させる。Ｂ－Ｃ、Ｎ２４３Ｒを有するｘＣａｓ１２ｉ突然変異体は、ＤＭＤ．１、ＤＭＤ．２とＤＭＤ．３遺伝子座において１．２、５、２０倍の活性を増加させた。Ｄ、Ｃａｓ１２Ｍａｘ（ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ）とＣａｓ１２Ｍａｘ－Ｅ３３６Ｒとの両方は、異なるＰＡＭ認識部位においてＥＧＦＰ活性化蛍光を上昇させる。

【図7】図７は、Ｃａｓ１２Ｍａｘがレポーターシステム（Ａ）とターゲッティングディープ配列（Ｂ）を用いて、ミスマッチを有する部位においてオフターゲットｄｓＤＮＡ切断活性を誘導した、ことを示す。

【図8】図８は、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘが効率的で高度に特異的な編集を媒介することを示す。Ａ、高忠実度Ｃａｓ１２Ｍａｘの２００種類を超える突然変異体の合理的なタンパク質操作されたスクリーニングである。４種類の突然変異体は、ＯＴ（オフターゲット）部位において著しく低減させた活性を示し、ＯＮ．１（オンターゲット）部位において活性を維持する。Ｂ、異なるバージョンのｘＣａｓ１２ｉ突然変異体である。Ｃ、ｖ１．１－Ｃａｓ１２Ｍａｘと比べて、ｖ６．３は、ＯＴ．１、ＯＴ．２とＯＴ．３部位におけるオフターゲットを減少させ、且つＴＴＲ－ＯＮターゲットにおける挿入欠失活性を保持する。Ｄ、ｖ６．３は、ＤＭＤ．１、ＤＭＤ．２遺伝子座においてｖ１．１－Ｃａｓ１２Ｍａｘと同等な挿入欠失活性を示し、且つＤＭＤ．３遺伝子座においてより高い挿入欠失活性を示す。ｖ１．１は、Ｃａｓ１２Ｍａｘと命名される。ｖ６．３は、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘと命名される。

【図9】図９は、ｈｆＣａｓ１２ＭａｘとＬｂＣａｓ１２ａ、Ｕｌｔｒａ ＡｓＣａｓ１２ａ、ＳｐＣａｓ９とＫＫＨ－ｓａＣａｓ９の、ＴＴＲ遺伝子座における遺伝子編集効率の比較を示す。

【図10】図１０は、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘが効率的で高度に特異的な編集を媒介したことを示す。Ａ－Ｂ、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ、ＬｂＣａｓ１２ａとＵｌｔｒａＡｓＣａｓ１２ａのコンピュータによって予測されるオフターゲット部位におけるオフターゲット効率は、ターゲッティングディープシーケンシングによって決定される。オンターゲット部位と予測オフターゲット部位の配列を示しており、ＰＡＭ配列は、青色を呈し、且つミスマッチ塩基は、赤色を呈する。

【図12】図１２は、Ｃａｓ１２ｉの保存的切断部位を示す。Ａ、ｘＣａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｉ１とＣａｓ１２ｉ２の配列比較は、Ｄ６５０、Ｄ７００、Ｅ８７５とＤ１０４９がＲｕｖＣドメインにおいて保存的切断部位であることを示す。Ｂ、Ｄ６５０Ａ、Ｅ８７５ＡとＤ１０４９Ａの点突然変異を導入することにより、ｘＣａｓ１２ｉの活性が消失される。

【図13-1】図１３は、効率的なｄｘＣａｓ１２ｉ－ＡＢＥを操作することを示す。Ａ、ＴａｄＡ８ｅ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉの操作された概略図である。操作された四つの部分を指示した。

【図13-2】図１３は、効率的なｄｘＣａｓ１２ｉ－ＡＢＥを操作することを示す。Ａ、ＴａｄＡ８ｅ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉの操作された概略図である。操作された四つの部分を指示した。Ｂ、様々な変異体において、ＴａｄＡ８ｅ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ１．２とｖ１．３は、ゲノムのＫＬＫＦ４部位において著しく増加したＡからＧ編集活性を示す。Ｃ、ｖ１．２とｖ１．３を組み合わせることにより、ＴａｄＡ８ｅ－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ２．２のＡからＧ編集活性を増加させる。Ｄ、Ｎ末端に異なるＮＬＳを担持する様々なｄＣａｓ１２－ＡＢＥと比べて編集活性が改変していないか又はひいては低減している。Ｅ、ｖ２．２、ＮＬＳ改変リンカーと高活性Ｔａｄｅ８ｅを組み合わせることにより、ＴａｄＡ８ｅ－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ４．３のＡからＧ編集活性を増加させる。

【図14】図１４は、効率的なｄｘＣａｓ１２ｉ－ＡＢＥの他の戦略を示す。Ａ、異なるバージョンのｄｘＣａｓ１２ｉアデニン塩基エディタの概略図である。Ｂ、ｄＣａｓ１２のＣ末端にＴａｄＡを結合したｄｘＣａｓ１２ｉ－ＡＢＥ－Ｎは、わずかに編集活性を増加させる。

【図15】図１５は、異なるゲノム標的部位において様々なｄＣａｓ１２－ＡＢＥによって誘導される編集頻度の比較を示す。Ａ－Ｂ、ＰＣＳＫ９とＴＴＲ遺伝子座において指示されるＴａｄＡ８ｅ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ１．２、ｖ２．２とＴａｄＡ８ｅ．１－ｄＬｂＣａｓ１２ａによって導入されるＡからＧ編集頻度の比較である。

【図16】図１６は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｄｘＣａｓ１２ｉ－ＡＢＥの特徴付けを示す。Ａ－Ｃ、ＴＴＮ（Ａ）、ＡＴＮ（Ｂ）とＣＴＮ（Ｃ）ＰＡＭを有する各標的部位のｄＣａｓ１２Ｍａｘ－ＡＢＥ塩基編集である。Ｄ、ＡのＴＴＮ ＰＡＭを有する各標的部位のｄＣａｓ１２Ｍａｘ－ＡＢＥ塩基編集生成物純度である。標的部位を指示しており、各標的プロトスペーサー領域とＰＡＭの配列は、補足表４に示される。

【図17】図１７は、異なるゲノム標的部位において様々なｄＣａｓ１２－ＣＢＥによって誘導される編集頻度の比較を示す。Ａ－Ｂ、ＤＹＲＫ１Ａと部位４遺伝子座において指示されるｈＡ３Ａ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉ、ｖ１．２、ｖ２．２とｈＡ３Ａ．１－ｄＣａｓ１２ａによって誘導されるＣからＴ編集頻度と生成物純度の比較である。ｈＡ３Ａ．１は、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａ－Ｗ１０４Ａを表す。

【図18】図１８は、ｈｆＣａｓ１２ＭａｘがＨＥＫ２９３細胞において高い編集効率を媒介することを示す。Ａ－Ｃ、増加濃度下でターゲッティングＴＴＲ又はＴＲＡＣ ｃｒＲＮＡを有するｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ ＲＮＰを送達した後のＨＥＫ２９３細胞の活力と増殖が改変しておらず、且つ挿入欠失活性が増加する（ｎ＝１）。

【図19】図１９は、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘがマウス胚盤胞において高い編集効率を媒介することを示す。Ａ、マウス胚盤胞におけるｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ遺伝子編集の概略図である。ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ ｍＲＮＡとターゲッティングＴｔｒ ｃｒＲＮＡをマウス受精卵に注射し、注射された受精卵を胚盤胞段階まで培養し、ターゲッティングディープシーケンシングによる遺伝子型分析に用いる。Ｂ、マウス胚盤胞におけるＴｔｒ．３とＴｔｒ．１２を標的とするｈｆＣａｓ１２Ｍａｘの挿入欠失率（ｎ＝１２）である。

【図20】図２０は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのガイドＲＮＡと標的ｄｓＤＮＡとの相互作用を示す。

【図21】図２１は、様々なＤＲ配列変異体を用いた時のｘＣａｓ１２ｉのｄｓＤＮＡ切断活性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0250】

本明細書の図面は、説明のみを目的としており、且つ必ずしも比例して描かれているわけではない。
概要
本研究では、出願人は、Ｖ－Ｉ型Ｃａｓ１２ｉシステムが哺乳動物細胞において多用途かつ効率的なゲノム編集を実現できることを証明した。出願人は、ＴＴＮ－ＰＡＭ部位において高い編集効率を示すＣａｓ１２ｉ、ｘＣａｓ１２ｉ（本明細書で「ＳｉＣａｓ１２ｉ」とも呼ばれる）を発見した。そのＰＩ、ＲＥＣ、ＲｕｖＣドメインの半合理的設計とタンパク質工学化により、出願人は、Ｎ２４３Ｒ、Ｅ３３６ＲとＤ８９２Ｒ置換を含有する高効率、高忠実度の変異体ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘを取得した。重要な部位にアルギニンを導入することでＣａｓとＤＮＡとの間の結合を補強できるという仮説と一致して、ＰＩドメインにＮ２４３Ｒを導入し、ＲＥＣドメインにＥ３３６Ｒを導入することで、編集活性が著しく増加し、ＰＡＭ認識が拡大された。興味深いことに、ＲｕｖＣドメインにおけるＤ８９２Ｒ又はＧ８８３Ｒ置換は、オフターゲットを低減させ、オンターゲット切断活性を保持したが、オフターゲット活性を低減させるためのアラニン置換^{２８，２９}は、そうではなかった（図Ｓ６Ｃ）。Ｄ８９２Ｒ置換ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘは、ミスマッチに対して明らかにより敏感であり、これは、Ｄ８９２Ｒ又はＧ８８３ＲがｓｇＲＮＡ結合特異性を改善したことを示す。ｘＣａｓ１２ｉとＣａｓ１２ｉ２の配列比較と予測構造によると、アスパラギン８９２をＮＵＣドメイン上に位置させ、ＲｕｖＣドメインとともに裂け目を形成し、ｃｒＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二本鎖は、該裂け目に位置する。Ｄ８９２Ｒを有する変異体は、オンターゲット活性を改変しないが、アスパラギンのアルギニン置換が非標的ｃｒＲＮＡの結合に影響を与えている可能性があるため、オフターゲット活性を除去した。我々のデータは、ＥＧＦＰ活性化レポーターシステムに基づいてアルギニン置換の半合理的工学戦略は、ＣＲＩＳＰＲ編集ツール活性を改善する汎用方法として利用できることを示している。

【0251】

工学化により、本開示のＣａｓ１２ｉシステムは、高い編集活性、高い特異性と広いＰＡＭ範囲を実現しており、ＳｐＣａｓ９と同等であり、且つ他のＣａｓ１２システムよりも優れている。その比較的小さい寸法、比較的短いｃｒＲＮＡガイドと自己加工特徴^{４，８，１０}を考慮すると、Ｖ－Ｉ型Ｃａｓ１２ｉシステムは、ＡＡＶ^３０又はＬＮＰ^{１２，１３}を含むインビボ多重遺伝子編集応用に適している。実際に、本開示のデータは、Ｖ－Ｉ型Ｃａｓ１２ｉシステムがそれぞれリボ核タンパク質（ＲＮＰ）送達と脂質ナノリポソーム（ＬＮＰ）送達を介して頑強なエクスビボ又はインビボゲノム編集効率を媒介することを指示し、それによって治療性ゲノム編集応用の巨大な潜在力を証明している。

【0252】

また、出願人は、すでにＶ－Ｉ型Ｃａｓ１２ｉシステムが塩基編集応用に利用できることを確認した。塩基エディタについて、ｄＣａｓ１２ｉシステムは、ＫＬＦ遺伝子座のＡ９－Ａ１１部位ひいてはＡ１９部位においてＡからＧまでの高い編集を示し、且つＡ７－Ａ１０部位においてＣからＴまでの高い編集を示し、これは、ｄＣａｓ１２ａシステムに類似するが、ｄＣａｓ９／ｎＣａｓ９システムと異なる。ｄＣａｓ１２ａと同等にし、ｄＣａｓ１２ｉ－ＢＥは、ＫＬＦ４、ＰＣＳＫ９とＤＹＲＫ１Ａ遺伝子座においてより高い塩基編集活性（図１Ｋ、図Ｓ１３Ａ、図Ｓ１５Ａ）を示し、それによってそれが塩基エディタとしてより大きな潜在力を有することができることを示す。これは、ｄＣａｓ１２ｉシステムが、エピゲノム編集、ゲノム活性化とクロマチンイメージングを含む広いゲノム工学応用に用いられてもよいことを示す^{１，３１－３４}。

【0253】

まとめると、ここで記述されるＣａｓ１２ｉシステムは、頑強な編集活性と高い特異性を有し、哺乳動物細胞におけるゲノム編集又は塩基編集の多用途プラットフォームであり、且つ将来的にはインビボ又はエクスビボ治療性応用に利用可能である。

【0254】

Ｃａｓ１２ｉは、プログラマブルＲＮＡによってガイドされるｄｓＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、それは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれる、スペーサー配列とダイレクトリピート配列とを含むプログラマブルＲＮＡによってガイドされるように、標的ｄｓＤＮＡ上で二本鎖切断（ＤＳＢ）を産生することができる。理論に束縛されることは望ましくないが、ダイレクトリピート配列は、Ｃａｓ１２ｉと複合体を形成することを担当し、且つスペーサー配列は、標的ｄｓＤＮＡの標的配列にハイブリダイズすることによって、ｇＲＮＡとＣａｓ１２ｉの複合体を標的ｄｓＤＮＡに導くことを担当すると考えられる。

【0255】

図２０を参照すると、標的ｄｓＤＮＡは、５’から３’の上向き鎖と３’から５’の下向き鎖とを含むように描かれる。ガイドＲＮＡは、緑色のスペーサー配列とオレンジ色のダイレクトリピート配列とを含むように描かれる。スペーサー配列は、一部の下向き鎖にハイブリダイズするように設計されるため、スペーサー配列は、下向き鎖の一部を「標的とする」。そのため、下向き鎖は、標的ｄｓＤＮＡの「標的ＤＮＡ鎖」又は「標的鎖（ＴＳ）」と呼ばれるが、上向き鎖は、標的ｄｓＤＮＡの「非標的ＤＮＡ鎖」又は「非標的鎖（ＮＴＳ）」と呼ばれる。スペーサー配列を設計する時に根拠となり、且つスペーサー配列がハイブリダイズできる標的鎖の部分は、「標的配列」と呼ばれるが、非標的鎖上の該部分の対応する部分は、「標的配列の逆相補配列」又は「逆相補配列」又は「プロトスペーサー配列」と呼ばれる。本開示の他の箇所と矛盾する場合、本段落の定義が優先される。

【0256】

特に明記しない限り、本発明は、当分野における化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、細胞生物学、幹細胞方案、細胞培養とトランスジェニック生物学の従来の方法を使用して実施され、これらの多くの方法は、説明の目的のために以下で説明される。そのような技術は、文献に十分に記述されている。

【0257】

本明細書で引用されるすべての出版物、特許と特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0258】

特に断りのない限り、本明細書で使用されるすべての技術と科学用語は、いずれも本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解する意味を有する。本発明の目的のために、以下の用語は、当分野で一般的に理解される意味に適合するものとして定義される。

【0259】

冠詞「一つ／種（ａ／ａｎ）」と「該（ｔｈｅ）」は、本明細書において一つ／種又は一つ／種よりも多い（即ち、少なくとも一つ／種）該冠詞の文法上の目的語を指すためのものである。例えば、「要素」とは、一つの要素又は一つよりも多い要素を指す。

【0260】

代替方案（例えば「又は」）の使用は、両方のいずれか一つ、両方又はそれらの任意の組み合わせを意味するものとして理解されるべきである。

【0261】

用語である「及び／又は」は、これらの代替方案のうちのいずれか一つ又は両方を意味するものとして理解されるべきである。

【0262】

本明細書で使用されるように、用語である「約」又は「およそ」とは、基準量、レベル、値、数量、頻度、百分率、寸法、サイズ、質量、重量又は長さと比べて、最大１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％変化する量、レベル、値、数量、頻度、百分率、寸法、サイズ、質量、重量又は長さを指す。一つの実施の形態では、用語である「約」又は「およそ」とは、基準量、レベル、値、頻度、百分率、スケール、サイズ、質量、数量、重量又は長さの±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％又は±１％程度の量、レベル、値、数量、頻度、百分率、寸法、サイズ、質量、重量又は長さの範囲を指す。

【0263】

本明細書で使用されるように、用語である「基本的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ／ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ」とは、基準の程度、量、レベル、値、数量、頻度、百分率、寸法、サイズ、質量、重量又は長さの約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％又はそれ以上の程度、量、レベル、値、数量、頻度、百分率、寸法、サイズ、質量、重量又は長さを指す。

【0264】

数値範囲は、範囲のエンドバリューと該範囲内の各特定値を含み、例えば、「１６～１００個のヌクレオチド」は、１６と１００及び１６～１００の間の各特定値を含む。

【0265】

本説明書全体では、文脈上別段の要求がない限り、用語である「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「包括（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含有（ｃｏｎｔａｉｎ）」と「有する（ｈａｖｅ）」は、説明されるステップ又は要素又は１組のステップ又は要素を含むことを示唆するものとして理解されるが、任意の他のステップ又は要素又は他の組のステップ又は要素を除外するものではない。いくつかの実施の形態では、用語である「含む」、「包括」、「含有」と「有する」は、同義で使用される。

【0266】

「……からなる」とは、「……からなる」という語句のうちの任意の要素を含むが、それらに限らないことを意味する。そのため、「……からなる」という語句は、列挙される要素が必須又は不可欠であり、且つ他の要素が存在してはならないことを指示する。

【0267】

「基本的に……からなる」は、「基本的に……からなる」という語句に列挙される任意の要素を含むことを意図しており、且つ列挙される要素の本開示で指定される活性又は作用を妨げないか又はそれに寄与する他の要素に限定される。そのため、「基本的に…からなる」という語句は、列挙される要素が必須又は不可欠であるが、それらが列挙される要素の活性又は作用に影響を与えるかどうかに応じて、他の要素が任意選択的ではなく且つ存在しても存在しなくてもよいことを指示する。

【0268】

明細書全体では、「一つの実施の形態」、「実施の形態」、「一つの特定の実施の形態」、「一つの関連する実施の形態」、「一つの実施の形態」、「別の実施の形態（ａｎｏｔｈｅｒ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又は「別の実施の形態（ａ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又はその組み合わせの言及は、該実施の形態に関連して記述される特定の特徴、構造又は特性が本発明の少なくとも一つの実施の形態に含まれることを意味する。そのため、明細書全体の異なる場所に出現する前述の語句は、必ずしもすべてが同じ実施の形態を指すとは限らない。さらに、特定の特徴、構造又は特性は、一つ又は複数の実施の形態において任意の適切な方式で組み合わされてもよい。

【0269】

二つのポリペプチド又は核酸配列の間の「配列同一性」とは、配列の間の同じ残基の数の総残基数に対する百分率を指し、且つ総残基数の計算は、突然変異のタイプに基づいて決定される。突然変異のタイプは、配列のいずれか一端又は両端での挿入（伸長）、配列のいずれか一端又は両端での欠失（切断）、一つ又は複数のアミノ酸／ヌクレオチドの置換／置き換え、配列内の挿入、配列内の欠失を含む。ポリペプチドを例にすると（ヌクレオチドも同様）、突然変異タイプが、一つ又は複数のアミノ酸／ヌクレオチドの置換／置き換え、配列内の挿入と配列内の欠失のうちの一つ又は複数である場合、比較される分子のうち大きい方の分子の残基数を総残基数とみなす。突然変異タイプが、配列のいずれか一端又は両端での挿入（伸長）又は配列のいずれか一端又は両端での欠失（切断）をさらに含む場合、いずれか一端又は両端で挿入又は欠失されるアミノ酸数（例えば、両端で２０個未満の挿入又は欠失）を総残基数に計上しない。同一性百分率を計算する時、配列の間で最大の一致が生じる方式で比較される配列を比較し、且つ特定のアルゴリズムによって比較におけるギャップ （存在する場合）を解析する。

【0270】

重要でないアミノ酸の保存的置換は、タンパク質の正常な機能に影響を与えることなく行うことができる。保存的置換とは、化学的又は機能的に類似するアミノ酸でアミノ酸を置換することを指す。類似するアミノ酸の保存的置換表を提供することは、当分野で周知のものである。例えば、いくつかの実施の形態では、以下に提供されるアミノ酸基は、相互の保存的置換と考えられる。

【0271】

いくつかの実施の形態では、互いに保存的に置換されると考えられる選定アミノ酸群は、以下のとおりである。

【0272】

【表1】

【0273】

いくつかの実施の形態では、互いに保存的に置換されると考えられる他の選定アミノ酸群は、以下のとおりである。

【0274】

【表2】

【0275】

いくつかの実施の形態では、互いに保存的に置換されると考えられる他の選定アミノ酸群は、以下のとおりである。

【0276】

【表3】

【0277】

用語である「アミノ酸」とは、２０種類の一般的な、天然に存在するアミノ酸を意味する。天然に存在するアミノ酸は、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）とバリン（Ｖａｌ、Ｖ）を含む。

【0278】

本明細書で使用されるように、用語である「Ｃａｓ１２ｉタンパク質」は、その最も広い意味で使用され、親又は参照Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つを含むＣａｓ１２ｉタンパク質）、その誘導体又は変異体及び機能断片、例えばそのオリゴヌクレオチド結合断片を含む。

【0279】

本明細書で使用されるように、用語である「ｃｒＲＮＡ」は、ガイド分子、ｇＲＮＡ及びガイドＲＮＡと互換的に使用されることができ、且つ核酸ベースの分子を指し、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、本明細書に記載の任意のＣａｓ１２ｉタンパク質）と複合体（例えば、ダイレクトリピート配列、ＤＲを介して）を形成できるＲＮＡベースの分子を含むが、それに限らず、且つ標的核酸配列にハイブリダイズするように標的核酸配列に十分に相補的であり、複合体と標的核酸配列との配列特異的結合をガイドする配列（例えば、スペーサー領域）を含む。

【0280】

本明細書で使用されるように、用語である「ＣＲＩＳＰＲアレイ」とは、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とスペーサー領域の核酸（例えば、ＤＮＡ）断片を含み、それは、第１のＣＲＩＳＰＲ反復配列の最初のヌクレオチドから始まり、且つ最後（末端）のＣＲＩＳＰＲ反復配列の最後のヌクレオチドで終わる。一般的には、ＣＲＩＳＰＲアレイにおける各スペーサー領域は、二つの反復配列の間に位置する。本明細書で使用されるように、用語である「ＣＲＩＳＰＲ反復配列」又は「ＣＲＩＳＰＲダイレクトリピート配列」又は「ダイレクトリピート配列」とは、ＣＲＩＳＰＲアレイにおいて配列変化をほとんど又は全く示さない複数の短いダイレクトリピート配列である。適当に、Ｖ－Ｉダイレクトリピート配列は、ステム－ループ構造を形成することができる。

【0281】

「ステム－ループ構造」とは、二次構造を有する核酸であり、該二次構造は、主に一本鎖ヌクレオチドである領域（ループ）を介して片側が連結された二本鎖（ステム）を形成することが知られている、又は予測されているヌクレオチド領域を含む。用語である「ヘアピン」と「ターンバック」構造は、本明細書においてステム－ループ構造を指すためにも用いられる。そのような構造は、当分野においてよく知られており、且つこれらの用語は、当分野でよく知られている意味に従って使用される。当分野で知られているように、ステム－ループ構造は、正確な塩基対を必要としない。そのため、ステムは、一つ又は複数の塩基ミスマッチを含んでもよい。代替的に、塩基対は、正確で、即ちミスマッチを含まなくてもよい。

【0282】

本明細書で使用されるように、標的核酸は、ｃｒＲＮＡにおけるスペーサー領域の全部又は一部に相補的な核酸配列を含む特定の核酸を指すために、標的配列又は標的核酸配列と互換的に使用されることができる。いくつかの例では、標的核酸は、遺伝子又は遺伝子内の配列を含む。いくつかの例では、標的核酸は、非コード領域（例えば、プロモーター）を含む。いくつかの例では、標的核酸は、一本鎖である。いくつかの例では、標的核酸は、二本鎖である。

【0283】

本明細書で使用されるように、「ドナーテンプレート核酸」又は「ドナーテンプレート」は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ酵素が標的核酸を改変した後に一つ又は複数の細胞タンパク質によって標的核酸の構造を改変するために用いられる核酸分子を指すために、互換的に使用されることができる。いくつかの例では、ドナーテンプレート核酸は、二本鎖核酸である。いくつかの例では、ドナーテンプレート核酸は、一本鎖核酸である。いくつかの例では、ドナーテンプレート核酸は、線状である。いくつかの例では、ドナーテンプレート核酸は、環状（例えば、プラスミド）である。いくつかの例では、ドナーテンプレート核酸は、外因性核酸分子である。いくつかの例では、ドナーテンプレート核酸は、内在性核酸分子（例えば、染色体）である。

【0284】

標的核酸は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）、即ち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列に関連付けられるべきである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の性質に応じて、ＤＮＡ二本鎖におけるその相補の配列（標的配列の相補の配列）がＰＡＭの上流又は下流になるように標的配列を選択すべきである。本発明の一つの実施の形態では、標的配列の相補の配列は、ＰＡＭの下流又は３’にある。ＰＡＭの正確な配列と長さの要求は、使用するＣａｓ１２ｉタンパク質によって異なる。

【0285】

当業者であれば理解するように、ウラシルが「ｕ」で表され、チミンが「ｔ」で表されるのではなく、ウラシルとチミンとも「ｔ」で表されてもよく、リボ核酸の文脈では、別段の指示がない限り、「ｔ」がウラシルを表すために用いられることを理解すべきである。

【0286】

本明細書で使用されるように、用語である「切断」とは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲシステムのヌクレアーゼによって産生される標的核酸におけるＤＮＡ切断である。いくつかの例では、切断は、二本鎖ＤＮＡ切断である。いくつかの例では、切断は、一本鎖ＤＮＡ切断である。

【0287】

本明細書で使用されるように、「標的核酸を切断する」又は「標的核酸を修飾する」の意味は、重複してもよい。標的核酸を修飾することは、単一ヌクレオチドの修飾を含むだけでなく、核酸断片の挿入又は欠失をさらに含む。

【0288】

本出願は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のような一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ切断活性を有するＣａｓ１２ｉタンパク質を提供する。本明細書に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質は、他の既知のＣａｓ１２ｉと約５０％未満の配列同一性を有し、他のＣａｓ、例えばＣａｓ９又はＣａｓ１２よりも小さく、且つより良い送達効率を有する。いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つの配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０のうちのいずれか一つ又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を含む。いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、単離されたものである。いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、操作されたものである。いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、人工的なものである。

【0289】

本明細書に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質、例えばＳｉＣａｓ１２ｉ、Ｓｉ２Ｃａｓ１２ｉ、ＷｉＣａｓ１２ｉとＳａＣａｓ１２ｉは、インビトロ又は細胞レベルで外因性又は内在性遺伝子に対して優れた切断活性を有し、ＳｐＣａｓ９、ＬｂＣａｓ１２ａとＣａｓ１２ｉ．３の切断活性と同等又はそれ以上である。本明細書に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質、例えばＳｉＣａｓ１２ｉ、Ｓｉ２Ｃａｓ１２ｉ、ＷｉＣａｓ１２ｉとＳａＣａｓ１２ｉは、外因性又は内在性遺伝子の特定の標的配列に対する切断活性が、細胞レベルで約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はひいては９９％よりも大きい値のうちのいずれか一つよりも大きくてもよい。一般的には、本明細書に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質は、細胞レベルで外因性又は内在性遺伝子の特定の標的配列に対する切断活性が、Ｃａｓ１２ｉ．３よりも優れている。

【0290】

ＳｉＣａｓ１２ｉは、インビトロ又は細胞レベルで外因性又は内在性遺伝子に対する切断活性が、ＳｐＣａｓ９又はＬｂＣａｓ１２ａに同等であり、又はひいてはそれ以上であり、且つＣａｓ１２ｉ．３よりも著しく優れている。それは、細胞レベルで外因性又は内在性遺伝子の特定の標的配列に対する切断活性は、約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はひいては９９％よりも大きい値のうちのいずれか一つよりも大きくてもよい。一般的には、ＳｉＣａｓ１２ｉは、細胞レベルで外因性又は内在性遺伝子の特定の標的配列に対する切断活性が、Ｃａｓ１２ｉ．３よりも著しく優れている。

【0291】

上記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、Ｃａｓ１２ｉの触媒活性（エンドヌクレアーゼ切断活性）又は核酸結合機能（例えば、約５％、４％、３％、２％、１％又はより小さい値のうちのいずれか一つ以下の影響）に基本的に影響を及ぼさないアミノ酸突然変異をさらに含んでもよい。

【0292】

いくつかの実施の形態では、本発明のＣａｓ１２ｉタンパク質（変異体、ｄＣａｓ、ニッカーゼなどを含む）、例えばＳｉＣａｓ１２ｉは、そのＮ－末端及び／又はＣ－末端に一つ又は複数の核局在化配列（ＮＬＳ）を含み、好ましくは、そのＮ－末端に一つのＮＬＳを含み、且つＣ－末端に一つのＮＬＳを含む。いくつかの実施の形態では、ＮＬＳは、ＳＶ４０ ＮＬＳ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４に示す）であり、好ましくは、Ｃａｓ１２ｉタンパク質が切断に用いられる時である。いくつかの実施の形態では、ＮＬＳは、ＢＰ ＮＬＳであり、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３に示すとおりであり、好ましくは、Ｃａｓ１２ｉタンパク質が塩基編集に用いられる時であり、より好ましくは、Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、そのＮ－末端にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３のＢＰ ＮＬＳを融合し、そのＣ－末端にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３のＢＰ ＮＬＳを融合する。

【0293】

本発明は、本明細書に記載の任意のＣａｓ１２ｉタンパク質の変異体、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つ（好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０、より好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又はそれ以上のうちのいずれか一つ）であるが１００％未満の同一性を有する配列を有するＣａｓ１２ｉ変異体をさらに提供する。いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉ変異体は、参照Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含むＣａｓ１２ｉタンパク質）のアミノ酸配列に対して一つ又は複数の置換、挿入、欠失又は切断を含む。

【0294】

本明細書で使用されるように、「変異体」とは、それぞれ参照（例えば、親）ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるが、必要な特性を保持するポリヌクレオチド又はポリペプチドである。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、参照ポリヌクレオチドとは核酸配列が異なる。ヌクレオチド変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変しても、改変しなくてもよい。ヌクレオチド変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失又は切断を引き起こすことができる。ポリペプチドの典型的な変異体は、参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的には、このような異なりは、参照ポリペプチドと変異体ポリペプチドの配列が多くの領域で一般的に非常に類似しており、同じであるように限定されている。変異体ポリペプチドと参照ポリペプチドのアミノ酸配列は、置換、付加、欠失又は切断のうちの一つ又は複数の任意の組み合わせによって異なってもよい。置換又は挿入されるアミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸残基であっても、ではなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、天然に存在するもの（例えば対立遺伝子変異体）であってもよく、又は天然に存在しないものであってもよい。ポリヌクレオチドとポリペプチドの天然に存在しない変異体は、突然変異誘発技術、直接合成又は当業者に既知の他の組換え方法によって製造されてもよい。

【0295】

本明細書で使用されるように、用語である「野生型」は、当業者が一般的に理解する意味を有し、且つ生物、株、遺伝子又は形質の典型的な形態を意味する。それは、自然界の資源から単離されることができ、且つ意図的に装飾されていない。

【0296】

本明細書で使用されるように、用語である「天然に存在しない」と「操作された」は、互換的に使用されることができ、且つ人間の関与を指す。これらの用語が核酸分子又はポリペプチドを記述するために用いられる場合、それは、該核酸分子又はポリペプチドが、それが自然に関連するか又は自然界に一緒に存在する少なくとも一つの他の成分を少なくとも基本的に含まないことを意味する。

【0297】

いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉ変異体は、単離されている。いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉ変異体は、操作されたか又は天然に存在しない。いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉ変異体は、人工的に合成される。いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉ変異体は、参照Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、親Ｃａｓ１２ｉタンパク質）に対して一つ又は複数のドメイン、例えばＰＩドメイン、螺旋ドメイン、ＲｕｖＣドメイン、ＷＥＤドメイン、Ｎｕｃドメインなどに一つ又は複数のアミノ酸突然変異（例えば、挿入、欠失又は置換）を有する。

【0298】

いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉ変異体は、ＳｉＣａｓ１２ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対する変異体である。これは、Ｃａｓ１２ｉ変異体（例えば、Ｓｉ２Ｃａｓ１２ｉの変異体）がその元の配列（例えば、Ｓｉ２Ｃａｓ１２ｉ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）において元のＳｉＣａｓ１２ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と比較することができ、且つアミノ酸突然変異（例えば挿入、欠失又は置換）を有する一つ又は複数の位置を同定することができることを意味する。いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉ変異体は、操作されたＳｉＣａｓ１２ｉである。

【0299】

いくつかの実施の形態では、該当する参照Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つを含むＣａｓ１２ｉタンパク質）と比べて、Ｃａｓ１２ｉ変異体（例えば、ＳｉＣａｓ１２ｉ変異体）は、ガイド配列に相補的な標的ＤＮＡの標的配列に対してより高いスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性を有し、例えば該当する参照Ｃａｓ１２ｉタンパク質の少なくとも約１．２倍（例えば、少なくとも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、５、１０、２０、５０倍又はそれ以上のうちのいずれか一つ）である。

【0300】

いくつかの実施の形態では、該当するＣａｓ１２ｉ変異体（例えば、ＳｉＣａｓ１２ｉ変異体）と比べて、元の参照Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つを含むＣａｓ１２ｉタンパク質）は、ガイド配列に相補的な標的ＤＮＡの標的配列に対してより高いスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性を有し、例えばＣａｓ１２ｉ変異体の少なくとも約１．２倍（例えば、少なくとも約１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、５、１０、２０、５０倍又はそれ以上のうちのいずれか一つ）である。

【0301】

いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉ変異体（例えば、ＳｉＣａｓ１２ｉ変異体）の、ガイド配列に相補的な標的ＤＮＡの標的配列に対するスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性は、該当する元のＣａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つを含むＣａｓ１２ｉタンパク質）と同じである又は著しく異なっていない（例えば、約１．２倍以内）。例えば、いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉ変異体の、ガイド配列に相補的な標的ＤＮＡの標的配列に対するスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性は、該当する元のＣａｓ１２ｉタンパク質と同じである。いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉ変異体の、ガイド配列に相補的な標的ＤＮＡの標的配列に対するスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性は、該当する元のＣａｓ１２ｉタンパク質の約１．２倍以下（例えば、約１．２、１．１９、１．１５、１．１、１．０１、１．００１倍以下などのうちのいずれか一つ）である。いくつかの実施の形態では、元のＣａｓ１２ｉタンパク質の、ガイド配列に相補的な標的ＤＮＡの標的配列に対するスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性は、該当するＣａｓ１２ｉ変異体の約１．２倍以下（例えば、約１．２、１．１９、１．１５、１．１、１．０１、１．００１倍以下などのうちのいずれか一つ）である。

【0302】

本発明は、触媒活性を有しないか又は基本的に有さない死Ｃａｓ１２ｉ（ｄＣａｓ１２ｉ）タンパク質をさらに提供する。例えば、いくつかの実施の形態では、ｄＣａｓ１２ｉタンパク質は、該当する親Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つを含むＣａｓ１２ｉタンパク質）の、ガイド配列に相補的な標的ＤＮＡの標的配列に対するスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性の約５０％未満（例えば、約４０％、３５％、３０％、２７．５％、２５％、２２．５％、２０％、１７．５％、１５％、１２．５％、１０％、７．５％、５％、４％、３％、２．５％、２％、１％未満又はそれ以下のうちのいずれか一つ）を保持する。いくつかの実施の形態では、ｄＣａｓ１２ｉタンパク質は、ＲｕｖＣドメイン（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つを含むＣａｓ１２ｉタンパク質のＲｕｖＣドメイン）に一つ又は複数のアミノ酸置換を含むことにより、触媒活性を基本的に有さない。いくつかの実施の形態では、非突然変異のＣａｓ１２ｉ形式と比べて、ｄＣａｓ１２ｉのＤＮＡ切断活性は、ゼロであるか又は無視できる。いくつかの実施の形態では、ｄＣａｓ１２ｉは、触媒活性のないＣａｓ１２ｉタンパク質であり、それは、ＲｕｖＣドメインに突然変異を含有し、該突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成及び標的核酸との成功した結合を許可するが、成功したヌクレアーゼ活性（触媒／切断活性）を許可しない。

【0303】

いくつかの実施の形態では、ｄＣａｓ１２ｉは、触媒活性を基本的に有さないｄＳｉＣａｓ１２ｉである。いくつかの実施の形態では、ｄＳｉＣａｓ１２ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対するアミノ酸残基６５０、７００、８７５及び／又は１０４９において、一つ又は複数の置換を含む。いくつかの実施の形態では、ｄＳｉＣａｓ１２ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して、Ｄ７００Ａ、Ｄ７００Ｖ、Ｄ６５０Ａ、Ｄ６５０Ｖ、Ｅ８７５Ａ、Ｅ８７５Ｖ、Ｄ１０４９ＡとＤ１０４９Ｖから選択される一つ又は複数の置換を含む。一つの実施の形態では、ｄＳｉＣａｓ１２ｉは、それぞれｄＳｉＣａｓ１２ｉ－Ｄ７００Ａ、ｄＳｉＣａｓ１２ｉ－Ｄ６５０Ａ、ｄＳｉＣａｓ１２ｉ－Ｅ８５７ＡとｄＳｉＣａｓ１２ｉ－Ｄ１０４９Ａのうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施の形態では、ｄＳｉＣａｓ１２ｉは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対して、Ｄ６５０Ａ、Ｄ７００Ａ、Ｅ８７５Ａ、Ｄ１０４９Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｄ７００Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｅ８７５Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｄ７００Ａ＋Ｅ８７５Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｄ７００Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９ＡとＤ６５０Ａ＋Ｄ７００Ａ＋Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９Ａから選択される一つ又は複数の置換を含む。

【0304】

また、ｄＣａｓ１２ｉは、以前に記述されたそれら以外の突然変異を含有してもよく、これらの突然変異は、ｄＣａｓ１２ｉタンパク質の触媒活性又は核酸結合機能に基本的に影響を及ぼさない（例えば、約５％、４％、３％、２％、１％以下又はより小さい値のうちのいずれか一つの影響）。触媒活性を基本的に有さないｄＣａｓ１２ｉタンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質として用いられてもよい。

【0305】

いくつかの実施の形態では、本明細書に記載のｄＣａｓ１２ｉは、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）又はシチジンデアミナーゼ（ＣＤＡ）又はその触媒ドメインに融合して、一塩基編集を実現することができる。いくつかの実施の形態では、本明細書に記載の任意のｄＣａｓ１２ｉタンパク質とＡＤＡ又はＣＤＡ（又はその触媒ドメイン）とを含む融合タンパク質の一塩基編集効率は、本発明に由来しないｄＣａｓ１２ｉと健全なＡＤＡ又はＣＤＡ（又はその触媒ドメイン）とを含む融合タンパク質よりも少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％ ９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％、５００％、１０００％又はそれ以上のうちのいずれか一つ）高い。

【0306】

上記任意のＣａｓ１２ｉ又はｄＣａｓ１２ｉタンパク質の全長配列におけるアミノ酸数は、他のタイプのＣａｓ１２タンパク質のアミノ酸数よりも明らかに少なく、且つそれらの分子サイズが小さいことにより、Ｃａｓシステムのインビボでの後続の組立と送達を促進する。

【0307】

いくつかの実施の形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ８ｅ、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９の配列を含むＴａｄＡ８ｅである。

【0308】

いくつかの実施の形態では、デアミナーゼ（例えばアデノシンデアミナーゼ）のＣ’末端は、任意選択的なペプチドリンカー（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４２を含むペプチドリンカー）を介してｄＣａｓ１２ｉのＮ’末端に融合される。いくつかの実施の形態では、デアミナーゼ（例えばアデノシンデアミナーゼ）のＮ’末端は、任意選択的なペプチドリンカー（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４２を含むペプチドリンカー）を介してｄＣａｓ１２ｉのＣ’末端に融合される。いくつかの実施の形態では、ｄＳｉＣａｓ１２ｉとアデノシンデアミナーゼ（例えば、ＴａｄＡ８ｅ）とを含む融合タンパク質、例えば融合タンパク質ＴａｄＡ８ｅ－ｄＳｉＣａｓ１２ｉ－Ｄ１０４９Ａ、又は融合タンパク質ＴａｄＡ８ｅ－ｄＳｉＣａｓ１２ｉ－Ｅ８７５Ａを提供する。

【0309】

特に断りのない限り、本明細書に記載の「Ｃａｓ１２ｉ」又は「Ｃａｓ１２ｉタンパク質」は、本発明に記述の任意のＣａｓ１２ｉタンパク質及びその変異体（例えば突然変異体）、誘導体（例えばＣａｓ１２ｉ融合タンパク質）、及び触媒活性を基本的に有さないｄＣａｓ１２ｉタンパク質及びその誘導体（例えばｄＣａｓ１２ｉ融合タンパク質、例えばｄＣａｓ１２ｉ－ＴａｄＡ）を含む。本発明は、任意のＣａｓ１２ｉタンパク質及びその変異体と誘導体をコードするヌクレオチド配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：２１～４０のうちのいずれか一つのポリヌクレオチド配列をさらに提供する。

【0310】

一般的には、本明細書に記載のｃｒＲＮＡ（ガイドＲＮＡ／ｇＲＮＡと交換可能）は、ダイレクトリピート配列（ＤＲ）とスペーサー領域とを含み、基本的にダイレクトリピート配列（ＤＲ）とスペーサー領域によって構成されるか、又はダイレクトリピート配列（ＤＲ）とスペーサー領域によって構成される。いくつかの実施の形態では、ｃｒＲＮＡは、スペーサー領域に連結されるＤＲを含み、基本的にそれによって構成されるか、又はそれによって構成される。いくつかの実施の形態では、ｃｒＲＮＡは、ＤＲ、スペーサー領域とＤＲ（ＤＲ－スペーサー領域－ＤＲ）を含む。これは、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの典型的な配置である。いくつかの実施の形態では、ｃｒＲＮＡは、ＤＲ、スペーサー領域、ＤＲとスペーサー領域（ＤＲ－スペーサー領域－ＤＲ－スペーサー領域）を含む。いくつかの実施の形態では、ｃｒＲＮＡは、２つ又はそれ以上のＤＲと２つ又はそれ以上のスペーサー領域を含む。いくつかの実施の形態では、ｃｒＲＮＡは、切断されたＤＲとスペーサー領域とを含む。これは、加工された又は成熟したｃｒＲＮＡに典型的である。いくつかの実施の形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉエフェクタータンパク質は、ｃｒＲＮＡと複合体を形成し、且つスペーサー領域は、複合体をスペーサー領域に相補的な標的核酸に導いて配列特異的結合を行う。

【0311】

いくつかの実施の形態では、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムは、一つ又は複数のｃｒＲＮＡ（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５種類又はそれ以上）又はそのコード核酸を含む。いくつかの実施の形態では、この２種類又はそれ以上のｃｒＲＮＡは、異なる標的部位、例えば、同一の標的ＤＮＡ又は遺伝子の２つの標的部位、又は２つの異なる標的ＤＮＡ又は遺伝子の２つの標的部位を標的とする。

【0312】

本明細書に記載のｃｒＲＮＡの配列と長さを最適化することができる。いくつかの実施の形態では、ｃｒＲＮＡの最適な長さは、ｃｒＲＮＡの加工形式を同定することによって、又はｃｒＲＮＡの経験的な長さ研究によって決定されてもよい。いくつかの実施の形態では、ｃｒＲＮＡは、塩基修飾を含む。
ダイレクトリピート配列（ＤＲ）

【0313】

表Ａは、本発明の該当するＣａｓ１２ｉタンパク質のＤＲ配列例を示した。例えば、ＳｉＣａｓ１２ｉ（又はその変異体又は誘導体、又はｄＳｉＣａｓ１２ｉ又はその融合タンパク質）に対応するＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すヌクレオチド配列又はその機能変異体を含んでもよい。本明細書に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質と該当するｃｒＲＮＡとの結合を媒介できる任意のＤＲ配列は、いずれも本発明に用いられてもよい。いくつかの実施の形態では、ＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つのＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施の形態では、ＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～２０の任意のＲＮＡ配列の「機能変異体」、例えば「機能切断バージョン」、「機能伸長バージョン」又は「機能置換バージョン」である。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０１又は５０２のＤＲ配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（切断形式）の一部であり、それは、実施例に示すように、依然としてＤＲ機能を有するため、機能的変異体又は機能的に切断されたＤＲ変異体である。ＤＲの「機能変異体」は、参照ＤＲ（例えば、親ＤＲ）の５’及び／又は３’が伸長（機能伸長バージョン）又は切断された（機能切断バージョン）変異体であり、又は参照ＤＲ（例えば、親ＤＲ）に対して一つ又は複数のヌクレオチドの一つ又は複数の挿入、欠失及び／又は置換（機能置換バージョン）を含み、同時に依然として参照ＤＲの少なくとも約２０％（例えば少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上のうちのいずれか一つ）の機能性、即ち、Ｃａｓ１２ｉタンパク質と該当するｃｒＲＮＡとの結合を媒介する機能を保持する。ＤＲ機能変異体は、一般的にＣａｓ１２ｉタンパク質の結合に使用できるステムループ様二次構造又はその部分を保持する。図２１に示すように、ＤＲ－Ｔ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０２）は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すＤＲの機能切断バージョンの一つである。いくつかの実施の形態では、ＤＲ又はその機能変異体は、Ｃａｓ１２ｉタンパク質の結合に使用できるステムループ様二次構造又はその部分を含む。いくつかの実施の形態では、ＤＲ又はその機能変異体は、Ｃａｓ１２ｉタンパク質の結合に使用できる、少なくとも二つ（例えば、２、３、４、５つ又はそれ以上）のステムループ様二次構造又はその部分を含む。

【0314】

いくつかの実施の形態では、ＤＲ又はその機能変異体は、少なくとも約１６個のヌクレオチド（ｎｔ）、例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０又はそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施の形態では、ＤＲは、約２０ｎｔから約４０ｎｔ、例えば約２０ｎｔから約３０ｎｔ、約２２ｎｔから約４０ｎｔ、約２３ｎｔから約３８ｎｔ、約２３ｎｔから約３６ｎｔ、又は約３０ｎｔから約４０ｎｔを含む。いくつかの実施の形態では、ＤＲは、２２ｎｔ、２３ｎｔ又は２４ｎｔを含む。いくつかの実施の形態では、ＤＲは、３５ｎｔ、３６ｎｔ又は３７ｎｔを含む。

【0315】

いくつかの実施の形態では、ＤＲ配列は、３’末端付近（スペーサー配列のすぐ隣）にステム－ループ構造を含む。「ステム－ループ構造」とは、二次構造を有する核酸であり、該二次構造は、二本鎖（ステム）部分を形成することが知られている、又は予測されている、基本的に一本鎖ヌクレオチドである連結領域（ループ）を介して一端が連結されたヌクレオチド領域を含む。用語である「ヘアピン」構造は、本明細書においてステム－ループ構造を指すためにも用いられる。そのような構造は、当分野においてよく知られており、且つこれらの用語は、当分野で一般的に知られている意味に従って使用される。ステム－ループ構造は、正確な塩基対を必要としない。そのため、ステムは、一つ又は複数の塩基ミスマッチを含んでもよい。代替的に、塩基対は、正確で、即ち任意のミスマッチを含まなくてもよい。

【0316】

本発明のｃｒＲＮＡは、ＤＲ配列の３’末端付近にステム－ループ構造を含むＤＲを含む。ＳｉＣａｓ１２ｉのＤＲステム－ループ構造は、図１１に示すとおりである。いくつかの実施の形態では、ＤＲに含まれるステムは、互いにハイブリダイズする５対の相補的塩基からなり、且つループ長さは、６、７、８又は９個のヌクレオチドである。いくつかの実施の形態では、ループ長さは、７個のヌクレオチドである。いくつかの実施の形態では、ステムは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ又は少なくとも５つの塩基対を含んでもよい。いくつかの実施の形態では、ＤＲは、長さが約５個のヌクレオチドであり、約７個のヌクレオチドから離間している２つの相補的ヌクレオチドセグメントを含む。いくつかの実施の形態では、ステム－ループ構造は、長さが５個のヌクレオチドである第１のステムヌクレオチド鎖と、長さが５個のヌクレオチドである第２のステムヌクレオチド鎖であって、第１のステムヌクレオチド鎖と第２のステムヌクレオチド鎖とが互いにハイブリダイズできる第２のステムヌクレオチド鎖と、第１のステムヌクレオチド鎖と第２のステムヌクレオチド鎖との間に並べられ、６、７又は８個のヌクレオチドを含む環状ヌクレオチド鎖とを含む。

【0317】

本明細書で使用されるように、２つ又はそれ以上のｃｒＲＮＡの二次構造が基本的に同じであるか又は実質的な差異がないことは、これらのｃｒＲＮＡが、長さの差が１、２又は３個のヌクレオチド以下のステム及び／又はループを含有することを意味し、ヌクレオチドタイプ（Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣ）に関して、配列比較により比較する時、これらのｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列の差は、１、２、３、４、５、６、７又は８個のヌクレオチド以下である。いくつかの実施の形態では、２つ又はそれ以上のｃｒＲＮＡの二次構造が基本的に同じであるか又は実質的な差異がないことは、ｃｒＲＮＡが、長さの差が多くとも１対の相補的塩基であるステム、及び／又は長さの差が多くとも１つのヌクレオチドであるループを含有し、及び／又は同じ長さを有するがミスマッチ塩基を有するステムを含有することを意味する。いくつかの実施の形態では、ステム－ループ構造は、５’－Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５ＮＮＮｎＮＮＮＸ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０－３’を含み、ここで、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９とＸ_１０は、任意の塩基であってもよく、ｎは、任意の塩基又は欠失であってもよく、且つＮは、任意の塩基であってもよく、ここで、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５とＸ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０は、互いにハイブリダイズしてステムを形成し、且つＮＮＮｎＮＮＮにループを形成させることができる。いくつかの実施の形態では、ステム－ループ構造は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０３～５０７のうちのいずれか一つの配列を含む。

【0318】

いくつかの実施の形態では、本発明の任意のＣａｓ１２ｉを標的部位に導くことができるＤＲ配列は、ヌクレオチド付加、挿入、欠失と置換から選択される一つ又は複数のヌクレオチド変化を含み、これらのヌクレオチド変化は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～２０と５０１～５０７のうちのいずれか一つに示すＤＲ配列又はその機能的に短縮されたバージョンと比べて二次構造の実質的な差異を引き起こさない。
スペーサー領域

【0319】

いくつかの実施の形態では、スペーサー配列の長さは、少なくとも約１６個のヌクレオチドであり、好ましくは約１６から約１００個のヌクレオチド、より好ましくは約１６から約５０個のヌクレオチド（例えば、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個のヌクレオチドのうちのいずれか一つ）である。いくつかの実施の形態では、スペーサー領域は、約１６から約２７個のヌクレオチド、例えば約１７から約２４個のヌクレオチド、約１８から約２４個のヌクレオチド又は約１８から約２２個のヌクレオチドのうちのいずれか一つである。

【0320】

いくつかの実施の形態では、スペーサー領域は、標的配列と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のうちのいずれか一つ）相補的である。いくつかの実施の形態では、スペーサー配列と標的核酸（例えば、ＤＮＡ）の標的配列との間には、少なくとも約１５個（例えば、少なくとも約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０個又はそれ以上のうちのいずれか一つ）存在する。

【0321】

ｃｒＲＮＡが十分な相補性を有して機能を発揮する（即ち、Ｃａｓ１２ｉタンパク質を標的部位に導く）ことを条件として、スペーサー領域にとって完全な相補性を必要としない。ｃｒＲＮＡによって媒介されるＣａｓ１２ｉの切断効率は、一つ又は複数のミスマッチ（例えば、スペーサー領域／標的配列に沿うミスマッチの位置を含む、スペーサー配列と標的配列との間の１つ又は２つのミスマッチ）を導入することによって調節することができる。ミスマッチ（例えば二重ミスマッチ）がスペーサー領域のより中央に位置する（即ち、スペーサー領域の３’末端又は５’末端にない）場合、切断効率により大きな影響を与える。そのため、スペーサー配列に沿うミスマッチの位置を選択することにより、Ｃａｓ１２ｉの切断効率を調節することができる。例えば、標的配列の切断が１００％未満であることが望ましい場合（例えば、細胞集団において）、スペーサー配列と標的配列との間の１つ又は２つのミスマッチをスペーサー配列に導入することができる。

【0322】

いくつかの実施の形態では、本発明のＣａｓ１２ｉタンパク質は、ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ、ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ ａｄｊａｃｅｎｔ ｍｏｔｉｆ）を認識して標的配列に作用することができる。いくつかの実施の形態では、ＰＡＭは、５’－ＮＴＴＮ－３’を含むか又はそれによって構成される（ここで、Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ又はＣである）。いくつかの実施の形態では、ＰＡＭは、５’－ＴＴＣ－３’、５’－ＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴ－３’、５’－ＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＡ－３’又は５’－ＡＴＧ－３’を含むか又はそれらによって構成される。いくつかの実施の形態では、ＰＡＭは、５’－ＴＴＣ－３’を含むか又はそれによって構成される。

【0323】

１． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０（好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０、且つより好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のうちのいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ１２ｉタンパク質。
前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、Ｃａｓ１２ｉの触媒活性（エンドヌクレアーゼ切断活性）又は核酸結合機能に基本的に影響を及ぼさないアミノ酸突然変異をさらに含有してもよい。

【0324】

２． 前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、該当する親Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つを含むＣａｓ１２ｉタンパク質）の、ガイド配列に相補的な標的ＤＮＡの標的配列に対するスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性（例えば、５０％、４０％、３５％、３０％、２７．５％、２５％、２２．５％、２０％、１７．５％、１５％、１２．５％、１０％、７．５％、５％、４％、３％、２．５％、２％、１％よりも少なく又はそれ以下を保持する）を基本的に有さない、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。
一つの実施の形態では、前記Ｃａｓ１２ｉは、該当する親Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つを含むＣａｓ１２ｉタンパク質）のスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性又はスペーサー領域非特異性バイパス活性（例えば、５０％、４０％、３５％、３０％、２７．５％、２５％、２２．５％、２０％、１７．５％、１５％、１２．５％、１０％、７．５％、５％、４％、３％、２．５％、２％、１％よりも少なく又はそれ以下を保持する）を基本的に有さない。

【0325】

３． 前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質が、該当する親Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つを含むＣａｓ１２ｉタンパク質）の、ガイド配列に相補的な標的ＤＮＡの標的配列に対するスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性（例えば、５０％、４０％、３５％、３０％、２７．５％、２５％、２２．５％、２０％、１７．５％、１５％、１２．５％、１０％、７．５％、５％、４％、３％、２．５％、２％、１％よりも少なく又はそれ以下を保持する）を基本的に有さないように、そのＲｕｖＣドメインに一つ又は複数のアミノ酸変異が含まれる、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0326】

４． 前記アミノ酸変異は、アミノ酸の付加、挿入、欠失と置換から選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0327】

５． 前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す配列の位置７００（Ｄ７００）、６５０（Ｄ６５０）、８７５（Ｅ８７５）又は１０４９（Ｄ１０４９）に対応する一つ又は複数の位置にアミノ酸置換を含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。
上記アミノ酸部位（Ｄ７００、Ｄ６５０、Ｅ８７５又はＤ１０４９）におけるアミノ酸は、エンドヌクレアーゼ切断活性を基本的に喪失するように、親配列（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つを含む親Ｃａｓ１２ｉタンパク質）上の該当するアミノ酸とは異なる別のアミノ酸に突然変異してもよい。
前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、Ｃａｓ１２ｉの触媒活性又は核酸結合機能に実質的な影響を及ぼさない他の突然変異をさらに含有してもよい。

【0328】

６． 前記アミノ酸置換は、Ｄ７００Ａ／Ｖ、Ｄ６５０Ａ／Ｖ、Ｅ８７５Ａ／ＶとＤ１０４９Ａ／Ｖから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0329】

７． 前記アミノ酸置換は、Ｄ７００Ａ、Ｄ６５０Ａ、Ｅ８７５ＡとＤ１０４９Ａから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0330】

８． 前記アミノ酸置換は、Ｄ７００Ａ、Ｄ６５０Ａ、Ｅ８７５Ａ、Ｄ１０４９Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ６５０Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｅ８７５Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ６５０Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９ＡとＤ７００Ａ＋Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９Ａから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0331】

１０． 前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、一つ又は複数の機能ドメインに連結される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0332】

１１． 前記機能ドメインは、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質のＮ－末端及び／又はＣ－末端に連結される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。
前記連結は、直接連結又はリンカーを介した間接連結であってもよい。

【0333】

１２． 前記機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼ）触媒ドメイン、ＤＮＡメチル化触媒ドメイン、ＤＮＡ脱メチル化触媒ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、ヌクレアーゼ触媒ドメイン、蛍光タンパク質、転写修飾因子（例えば、転写活性化触媒ドメイン、転写阻害触媒ドメイン）、光ゲーティング因子、化学誘導因子、クロマチン可視化因子、標的細胞又は標的細胞型上の細胞表面部分との結合を提供するためのターゲッティングポリペプチドから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0334】

１３． 前記機能ドメインは、標的ＤＮＡを修飾する活性を示し、前記活性は、ヌクレアーゼ活性、メチル化活性、脱メチル化活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グリコシダーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、肉ミリストイル化活性、脱肉ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ由来）、脱グリコシル化活性、転写阻害活性、転写活性化活性から選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0335】

１４． 前記機能ドメインは、アデノシンデアミナーゼ触媒ドメイン又はシチジンデアミナーゼ触媒ドメインから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0336】

１５． 前記機能ドメインは、ＴａｄＡ８ｅの全長又は機能断片である、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0337】

１７． 前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、スペーサー領域非特異性エンドヌクレアーゼバイパス活性を低減又は消失させるように修飾される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0338】

１８． 前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。

【0339】

１９． 前記ポリヌクレオチドは、真核細胞において発現するようにコドンによって最適化されている、前述実施の形態のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【0340】

２０． 前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～４０のうちのいずれか一つに示すヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【0341】

２１． 前述実施の形態のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【0342】

２２． 前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のベクター。

【0343】

２３． 前記プロモーターは、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、広域スペクトルプロモーター、細胞種特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターである、前述実施の形態のいずれか１項に記載のベクター。

【0344】

２４． 前記ベクターは、プラスミドである、前述実施の形態のいずれか１項に記載のベクター。

【0345】

２５． 前記ベクターは、レトロウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターである、前述実施の形態のいずれか１項に記載のベクター。

【0346】

２６． 前記ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２とＡＡＶ１３の組換えＡＡＶベクターから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のベクター。

【0347】

２７． （１）送達媒体と、（２）前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質、ポリヌクレオチド又はベクターとを含む、送達システム。

【0348】

２８． 前記送達媒体は、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞又は遺伝子銃である、前述実施の形態のいずれか１項に記載の送達システム。

【0349】

２９． 操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであって、
前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質、又は前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含み、前記ｃｒＲＮＡは、
標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズ可能なスペーサー領域と、
前記スペーサー領域に連結され且つ前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質と前記ｃｒＲＮＡとの結合をガイドして前記標的配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成することができるダイレクトリピート配列（ＤＲ）とを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。
前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、前記ｃｒＲＮＡに結合して前記標的配列を標的とすることができ、ここで、前記標的配列は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡである。

【0350】

３０． 一つ又は複数のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであって、前記一つ又は複数のベクターは、
前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結される第１の調節要素と、
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結される第２の調節要素とを含み、前記ｃｒＲＮＡは、
標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズ可能なスペーサー領域と、
前記スペーサー領域に連結される、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質と前記ｃｒＲＮＡとの結合をガイドして前記標的配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成することができるダイレクトリピート配列（ＤＲ）とを含み、
ここで、前記第１の調節要素と前記第２の調節要素は、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムの同じ又は異なるベクター上に位置する、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0351】

３１． 操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体であって、
上記実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質と、
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とを含み、前記ｃｒＲＮＡは、
標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズ可能なスペーサー領域と、
前記スペーサー領域に連結されるダイレクトリピート配列（ＤＲ）とを含み、前記ＤＲは、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質と前記ｃｒＲＮＡとの結合をガイドする、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。

【0352】

３２． 前記スペーサー領域の長さは、１６個のヌクレオチドよりも大きく、好ましくは１６から１００個のヌクレオチド、より好ましくは１６から５０個のヌクレオチド（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個のヌクレオチド）、より好ましくは１６から２７個のヌクレオチド、より好ましくは１７から２４個のヌクレオチド、より好ましくは１８から２４個のヌクレオチド、且つ最も好ましくは１８から２２個のヌクレオチドである、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0353】

３３． 前記ＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～２０のうちのいずれか一つに示すＤＲの二次構造と実質的に同じ二次構造を有する、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0354】

３４． 前記ＤＲは、ヌクレオチド付加、挿入、欠失又は置換を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～２０のうちのいずれか一つに示すＤＲと比べて二次構造の実質的な差異を生じない、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0355】

３５． 前記ＤＲは、前記ＤＲの３’末端近傍のステム－ループ構造を含み、
ここで、前記ステム－ループ構造は、５’－Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５ＮＮＮｎＮＮＮＸ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０－３’（Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９とＸ_１０は、任意の塩基であり、ｎは、任意の核塩基又は欠失であり、Ｎは、任意の核塩基である）を含み、ここで、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５とＸ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０は、互いにハイブリダイズ可能である、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0356】

３６． 前記ＤＲは、以下のいずれかから選択されるステム－ループ構造を含み、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’－ＣＵＣＣＣＮＮＮＮＮＮＵＧＧＧＡＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’－ＣＵＣＣＵＮＮＮＮＮＮＵＧＧＧＡＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’－ＧＵＣＣＣＮＮＮＮＮＮＵＧＧＧＡＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’－ＧＵＧＵＣＮＮＮＮＮＮＵＧＡＣＡＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’－ＧＵＧＣＣＮＮＮＮＮＮＵＧＧＣＡＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’－ＵＧＵＧＵＮＮＮＮＮＮＵＣＡＣＡＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’－ＣＣＧＵＣＮＮＮＮＮＮＵＧＡＣＧＧ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’－ＧＵＵＵＣＮＮＮＮＮＮＵＧＡＡＡＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’－ＧＵＧＵＵＮＮＮＮＮＮＵＡＡＣＡＣ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、及び
前記ＤＲの３’末端近傍の５’－ＵＵＧＵＣＮＮＮＮＮＮＵＧＡＣＡＡ－３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：）、ここで、Ｎは、任意の核塩基である、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0357】

３７． 前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体は、前記スペーサー領域にハイブリダイズ可能な標的ＤＮＡをさらに含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0358】

３８． 前記標的ＤＮＡは、真核ＤＮＡである、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0359】

３９． 前記標的ＤＮＡは、細胞にあり、好ましくは前記細胞は、原核細胞、真核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、げっ歯動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類動物細胞、非ヒト霊長類動物細胞とヒト細胞から選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0360】

４０． 前記ｃｒＲＮＡは、前記標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズして複合体を形成し、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質による前記標的配列の切断を引き起こす、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0361】

４１． 前記標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’末端にある、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0362】

４２． 前記ＰＡＭは、５’－Ｔに富むモチーフを含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0363】

４３． 前記ＰＡＭは、５’－ＴＴＡ、５’－ＴＴＴ、５’－ＴＴＧ、５’－ＴＴＣ、５’－ＡＴＡ又は５’－ＡＴＧである、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0364】

４４． 前記一つ又は複数のベクターは、一つ又は複数のレトロウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又はレンチウイルスベクターを含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0365】

４５． 前記ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２とＡＡＶ１３の組換えＡＡＶベクターから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0366】

４６． 前記調節要素は、プロモーターを含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0367】

４７． 前記プロモーターは、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、広域スペクトルプロモーター、細胞種特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0368】

４８． 前記プロモーターは、真核細胞に機能を有する、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0369】

４９． 前記真核細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、げっ歯動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類動物細胞、非ヒト霊長類動物細胞とヒト細胞を含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0370】

５０． 前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体は、任意選択的に、相同性指向修復（ＨＤＲ）によって関心のある遺伝子座に挿入されるＤＮＡドナーテンプレートをさらに含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0371】

５１． 細胞又はその子孫であって、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、送達システム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体を含み、ここで、好ましくは、前記細胞は、原核細胞、真核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、げっ歯動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類動物細胞、非ヒト霊長類動物細胞とヒト細胞から選択される、細胞又はその子孫。

【0372】

５２． 非ヒト多細胞生物であって、前述実施の形態のいずれか１項に記載の細胞又はその子孫を含み、好ましくは、前記非ヒト多細胞生物は、ヒト遺伝子関連疾患の動物（例えば、げっ歯動物又は非ヒト霊長類動物）モデルである、非ヒト多細胞生物。

【0373】

５３． 標的ＤＮＡを修飾する方法であって、標的ＤＮＡを前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体に接触させることを含み、前記接触は、前記標的ＤＮＡのＣａｓ１２ｉタンパク質による修飾を引き起こす、方法。

【0374】

５４． 前記修飾は、インビトロ細胞外部で発生する、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0375】

５５． 前記修飾は、インビトロ細胞内部で発生する、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0376】

５６． 前記修飾は、インビボ細胞内部で発生する、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0377】

５７． 前記細胞は、真核細胞である、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0378】

５８． 前記真核細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、げっ歯動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類動物細胞、非ヒト霊長類動物細胞とヒト細胞から選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0379】

５９． 前記修飾は、前記標的ＤＮＡを切断することであり、
任意選択的に、前記切断は、一本鎖ＤＮＡを切断する方式で行われ、又は任意選択的に、二本鎖ＤＮＡの同じ部位又は異なる部位を順次切断する方式で行われる、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0380】

６０． 前記切断は、ヌクレオチド配列の欠失及び／又はヌクレオチド配列の挿入を引き起こす、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0381】

６１． 前記切断は、二つの部位で前記標的核酸を切断し、前記二つの部位の間の配列の欠失又は反転を引き起こすことを含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0382】

６２． 前記修飾は、塩基変異であり、好ましくはＡ→Ｇ又はＣ→Ｔ塩基変異である、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0383】

６３． 前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法からの細胞又はその子孫であって、前記方法を受けていない細胞に存在しない修飾を含む、細胞又はその子孫。

【0384】

６４． 前記方法を受けていない細胞は、異常を含み且つ前記方法による前記細胞における異常は、既に解決又は修正されている、前述実施の形態のいずれか１項に記載の細胞又はその子孫。

【0385】

６５． 前述実施の形態のいずれか１項に記載の細胞又はその子孫からの細胞生成物であって、前記方法を受けていない細胞からの細胞生成物の性質又は量に対して、修飾されている、細胞生成物。

【0386】

６６． 前記方法を受けていない細胞は、異常を含み、且つ前記細胞生成物は、前記異常が既に前記方法によって解決又は修正されていることを反映する、前述実施の形態のいずれか１項に記載の細胞生成物。

【0387】

６７． 非標的ＤＮＡを非特異的に切断する方法であって、前記標的ＤＮＡを前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体と接触させることによって、前記スペーサー領域と前記標的ＤＮＡの標的配列とのハイブリダイズ及び前記標的配列の前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質による切断により、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質がスペーサー領域非特異性エンドヌクレアーゼバイパス活性によって前記非標的ＤＮＡを切断することを含む、方法。

【0388】

６８． サンプルにおける標的ＤＮＡを検出する方法であって、
前記サンプルを、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体及び切断後に検出可能なシグナルを放出することができるレポーター核酸と接触させることによって、前記スペーサー領域と前記標的ＤＮＡの標的配列とのハイブリダイズ及び前記標的配列の前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質による切断により、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質がスペーサー領域非特異性エンドヌクレアーゼバイパス活性によって前記レポーター核酸を切断することと、
前記レポーター核酸の切断によって産生される検出可能なシグナルを測定することによって、前記サンプルにおける前記標的ＤＮＡの存在を検出することとを含む、方法。

【0389】

６９． 前記方法は、前記検出可能なシグナルのレベルと参照シグナルのレベルとを比較し、前記検出可能なシグナルのレベルに基づいて前記サンプルにおける前記標的ＤＮＡのレベルを決定することをさらに含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0390】

７０． 前記測定は、金ナノ粒子検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学の検出又は半導体ベースの検知を用いて行われる、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0391】

７１． 前記レポーター核酸は、蛍光発光色素対、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）対又はクエンチャ／蛍石対を含み、且つ前記レポーター核酸の前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質による切断により、前記レポーター核酸の切断によって産生される前記検出可能なシグナルのレベルが増加するか又は低減する、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0392】

７２． それを必要とする被験体の病症又は疾患を治療する方法であって、前記被験体に前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを投与することを含む、方法。

【0393】

７３． 前記病症又は疾患は、癌又は感染性疾患又は神経疾患であり、
任意選択的に、前記癌は、
ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮体癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、髄様甲状腺癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄瘤、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫と膀胱癌から選択され、
任意選択的に、前記感染性疾患は、
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ１）と単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ２）によって引き起こされ、
任意選択的に、前記神経障害は、
緑内障、加齢に伴うＲＧＣの喪失、視神経損傷、網膜虚血、レーベル遺伝性視神経症、ＲＧＣニューロンの変性に関連する神経疾患、それを必要とする被験者の線条体の機能性ニューロン変性に関連する神経疾患、パーキンソン病（Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、アルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、ハンチントン病（Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、統合失調症、うつ病、薬物依存症、運動障害（例えば舞踏病、舞踏病様症状と運動障害）、双極性障害、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）又は機能不全から選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0394】

７４． 前記病症又は疾患は、嚢胞性線維症、進行性偽肥大性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー（Ｂｅｃｋｅｒ ｍｕｓｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、α－１－アンチトリプシン欠乏症、ポンペ病（Ｐｏｍｐｅ ｄｉｓｅａｓｅ）、筋強直性ジストロフィー、ハンチントン病、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ失調症（Ｆｒｉｅｄｒｅｉｃｈ ａｔａｘｉａ）、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、遺伝性慢性腎臓病、高脂血症、高コレステロール血症、レーベル先天性黒内障（Ｌｅｂｅｒ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ａｍａｕｒｏｓｉｓ）、鎌状赤血球症とβサラセミアから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0395】

７５． 前記病症又は疾患は、病原性点突然変異の存在によって引き起こされる、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0396】

７６． 前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み、好ましくは、前記システムの成分は、同の一容器又は単独の容器にある、キット。

【0397】

７７． 前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み、好ましくは、前記無菌容器は、注射器である、無菌容器。

【0398】

７８． 前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み、好ましくは、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、リザーバーに保存される、植え込み可能な装置。
バイパス活性

【0399】

Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、バイパス活性を有してもよく、即ち、いくつかの条件下で、活性化されたＣａｓ１２ｉタンパク質は、標的配列に結合した後に活性を維持し、非標的オリゴヌクレオチドを非特異的に切断し続けるこのようなバイパス活性は、Ｃａｓ１２ｉシステムを用いて特定の標的オリゴヌクレオチドの存在を検出することを可能にする。一つの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉシステムは、ｓｓＤＮＡ又は転写物を非特異的に切断するように操作される。いくつかの実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉは、インビトロ系又は細胞において一時的又は安定的に提供又は発現され、細胞核酸、例えばｓｓＤＮＡ、例えばウイルスｓｓＤＮＡを非特異的に切断するようにターゲッティング又は誘発される。いくつかの実施の形態では、本明細書に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質は、スペーサー領域非特異性エンドヌクレアーゼ切断活性を低減（例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又はそれ以上のうちのいずれか一つほど低減）又は消失させるように修飾される。いくつかの実施の形態では、本明細書に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質は、（例えば、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％のうちのいずれか一つほどない）親／参照Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つのＣａｓ１２ｉタンパク質）の、非標的ＤＮＡに対するスペーサー領域非特異性エンドヌクレアーゼバイパス活性を基本的に有さない。

【0400】

バイパス活性は最近、ＳＨＥＲＬＯＣＫと呼ばれる高感度且つ特異的な核酸検出プラットフォームに利用されており、該プラットフォームは、多くの臨床診断に用いられてもよい（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２．［ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２による核酸検出］Ｓｃｉｅｎｃｅ［サイエンス］３５６，４３８－４４２（２０１７））。
レポーター核酸

【0401】

「レポーター核酸」とは、本明細書に記載の活性化されたＣＲＩＳＰＲシステムタンパク質によって切断又は不活性化され得る分子である。レポーター核酸は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質によって切断され得る核酸要素を含む。核酸要素の切断は、薬剤を放出するか、又はコンホメーション変化を生じ、それによって検出可能なシグナルを産生する。レポーター核酸は、切断前又はレポーター核酸が「活性」状態にある時に陽性の検出可能なシグナルの産生又は検出を防止する。理解すべきこととして、いくつかの例示的な実施の形態では、活性レポーター核酸の存在下で最小限のバックグラウンドシグナルが産生され得る。陽性の検出可能なシグナルは、光学、蛍光、化学発光、電気化学的方法又は当分野において既知の他の検出方法を使用して検出可能な任意のシグナルであってもよい。例えば、いくつかの実施の形態では、レポーター核酸が存在する時、第１のシグナル（即ち、陰性の検出可能なシグナル）を検出することができるとともに、そして、標的分子を検出し、且つレポーター核酸が、活性化されたＣＲＩＳＰＲタンパク質によって切断又は不活性化される時、第１のシグナルは、第２のシグナル（例えば、陽性の検出可能なシグナル）に変換される。
機能ドメイン

【0402】

機能ドメインは、その最も広い意味で使用され、タンパク質、例えば酵素又は因子自体又はその特定の機能断片（ドメイン）を含む。

【0403】

Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ｄＣａｓ１２ｉ）は、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼ）触媒ドメイン、ＤＮＡメチル化触媒ドメイン、ＤＮＡ脱メチル化触媒ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、ヌクレアーゼ触媒ドメイン、蛍光タンパク質、転写修飾因子（例えば、転写活性化触媒ドメイン、転写阻害触媒ドメイン）、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）、光ゲーティング因子、化学誘導因子又はクロマチン可視化因子から選択される一つ又は複数の機能ドメインに関連し、好ましくは、該機能ドメインは、アデノシンデアミナーゼ触媒ドメイン又はシチジンデアミナーゼ触媒ドメインから選択される。

【0404】

いくつかの実施の形態では、該機能ドメインは、転写活性化ドメインであってもよい。いくつかの実施の形態では、該機能ドメインは、転写阻害ドメインである。いくつかの実施の形態では、該機能ドメインは、エピジェネティック修飾ドメインであり、それによってエピジェネティック修飾酵素を提供する。いくつかの実施の形態では、該機能ドメインは、活性化ドメインである。いくつかの実施の形態では、該Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、一つ又は複数の機能ドメインに関連し、且つ該Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、ＲｕｖＣドメイン内に一つ又は複数の突然変異を含有し、且つ得られたＣＲＩＳＰＲ複合体は、エピジェネティック修飾物を送達するか、又は活性化シグナル又は阻害シグナルを転写又は翻訳することができる。

【0405】

いくつかの実施の形態では、該機能ドメインは、標的ＤＮＡ、又は標的ＤＮＡに関連するタンパク質を修飾する活性を示し、ここで、該活性は、ヌクレアーゼ活性（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼ、ＲｕｖＣヌクレアーゼ、Ｔｒｅｘ１ヌクレアーゼ、Ｔｒｅｘ２ヌクレアーゼ）、メチル化活性、脱メチル化活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グリコシダーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、肉ミリストイル化活性、脱肉ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ由来）、脱グリコシル化活性、転写阻害活性と転写活性化活性から選択される一つ又は複数である。標的ＤＮＡ関連タンパク質は、標的ＤＮＡに結合可能なタンパク質、又は標的ＤＮＡに結合されるタンパク質に結合可能なタンパク質、例えばヒストン、転写因子、メディエーターなどを含むが、それらに限らない。

【0406】

該機能ドメインは、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写阻害活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、核酸結合活性と分子スイッチ（例えば、光誘導）から選択される一つ又は複数を有するドメインであってもよい。一つ以上の機能ドメインを含む場合、これらの機能ドメインは、同じであっても異なってもよい。
塩基編集

【0407】

いくつかの例示的な実施の形態では、Ｃａｓ１２ｉ（例えば、ｄＣａｓ１２ｉ）は、塩基編集目的のためにアデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼに融合されてもよい。
アデノシンデアミナーゼ

【0408】

本明細書で使用されるように、用語である「アデノシンデアミナーゼ」又は「アデノシンデアミナーゼタンパク質」とは、以下に示すように、アデニン（又は分子のアデニン部分）をヒポキサンチン（又は分子のヒポキサンチン部分）に変換するために水解脱アミノ反応を触媒することができるタンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質又はポリペプチドの一つ又は複数の機能ドメインである。いくつかの実施の形態では、アデニン含有分子は、アデノシン（Ａ）であり、且つヒポキサンチン含有分子は、イノシン（Ｉ）である。アデニン含有分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）であってもよい。

【0409】

本開示によれば、本開示と組み合わせて使用され得るアデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）と呼ばれる酵素ファミリーメンバー、ｔＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）と呼ばれる酵素ファミリーメンバー、及びアデノシンデアミナーゼドメイン（ＡＤＡＤ）を含む他のファミリーメンバーを含むが、それらに限らない。本開示によれば、アデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡ／ＤＮＡとＲＮＡ二本鎖におけるアデニンを標的とすることができる。事実的に、Ｚｈｅｎｇら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．［核酸研究］２０１７，４５（６）：３３６９－３３７７）は、ＡＤＡＲがＲＮＡ／ＤＮＡとＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖においてアデノシンをイノシンに編集できることを証明した。特定の実施の形態では、以下に詳細に記述するように、アデノシンデアミナーゼは、それがＲＮＡ二本鎖のＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるＤＮＡを編集する能力を増加させるように修飾されている。

【0410】

いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、一つ又は複数の後生動物種に由来し、哺乳動物、鳥類、カエル類、イカ、魚類、ハエとワームを含むが、それらに限らない。いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ヒト、イカ又はショウジョウバエのアデノシンデアミナーゼである。

【0411】

いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２とｈＡＤＡＲ３を含むヒトＡＤＡＲである。いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ＡＤＲ－１とＡＤＲ－２とを含むカエノラブディティス・エレガンスＡＤＡＲタンパク質である。いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ｄＡｄａｒを含むショウジョウバエＡＤＡＲタンパク質である。いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ｓｑＡＤＡＲ２ａとｓｑＡＤＡＲ２ｂとを含むイカ（ロリゴペアリ（Ｌｏｌｉｇｏ ｐｅａｌｅｉｉ））ＡＤＡＲタンパク質である。いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ショウジョウバエＡＤＡＴタンパク質である。いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ＴＥＮＲ（ｈＡＤＡＤ１）とＴＥＮＲＬ（ｈＡＤＡＤ２）とを含むヒトＡＤＡＤタンパク質である。

【0412】

いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡタンパク質、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＴａｄＡである。Ｋｉｍら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ［生化学］４５：６４０７－６４１６（２００６）、Ｗｏｌｆら，ＥＭＢＯ Ｊ．［欧州分子生物学機構ジャーナル］２１：３８４１－３８５１（２００２）を参照する。いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、マウスＡＤＡである。Ｇｒｕｎｅｂａｕｍら，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．［アレルギーと臨床免疫学の最新の観点］１３：６３０－６３８（２０１３）を参照する。いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＴ２である。Ｆｕｋｕｉら，Ｊ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ［核酸ジャーナル］２０１０：２６０５１２（２０１０）を参照する。いくつかの実施の形態では、該デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼ）は、以下の文献Ｃｏｘら，Ｓｃｉｅｎｃｅ．［サイエンス］２０１７年１１月２４日；３５８（６３６６）：１０１９－１０２７、Ｋｏｍｏｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ．［ネイチャー］２０１６年５月１９日；５３３（７６０３）：４２０－４、とＧａｕｄｅｌｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ．［ネイチャー］２０１７年１１月２３日；５５１（７６８１）：４６４－４７１に記述されるそれらのデアミナーゼのうちの一つ又は複数である。

【0413】

いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖核酸基質における一つ又は複数の標的アデノシン残基を認識し、それらをイノシン残基に変換する。いくつかの実施の形態では、二本鎖核酸基質は、ＲＮＡ－ＤＮＡヘテロ二本鎖である。いくつかの実施の形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖基質上の結合窓を認識する。いくつかの実施の形態では、結合窓は、少なくとも一つの標的アデノシン残基を含む。いくつかの実施の形態では、結合窓は、約３ｂｐから約１００ｂｐの範囲内にある。いくつかの実施の形態では、結合窓は、約５ｂｐから約５０ｂｐの範囲内にある。いくつかの実施の形態では、結合窓は、約１０ｂｐから約３０ｂｐの範囲内にある。いくつかの実施の形態では、結合窓は、約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、５ｂｐ、７ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ又は１００ｂｐである。

【0414】

いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼタンパク質は、一つ又は複数のデアミナーゼドメインを含む。特定の理論に束縛されることは望ましくないが、該デアミナーゼドメインが二本鎖核酸基質に含まれる一つ又は複数の標的アデノシン（Ａ）残基を認識、それらをイノシン（Ｉ）残基に変換するために用いられることを考慮する。いくつかの実施の形態では、該デアミナーゼドメインは、活性中心を含む。いくつかの実施の形態では、活性中心は、亜鉛イオンを含む。いくつかの実施の形態では、Ａ－Ｉ編集期間に、標的アデノシン残基における塩基対が破壊され、且つ標的アデノシン残基が二重螺旋から「反転」してアデノシンデアミナーゼによって近接可能になる。いくつかの実施の形態では、活性中心における又は付近のアミノ酸残基は、標的アデノシン残基５’の一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する。いくつかの実施の形態では、活性中心における又は付近のアミノ酸残基は、標的アデノシン残基３’の一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する。いくつかの実施の形態では、活性中心における又は付近のアミノ酸残基は、反対鎖上の標的アデノシン残基に相補的なヌクレオチドとも相互作用する。いくつかの実施の形態では、アミノ酸残基は、ヌクレオチドの２’水酸基と水素結合を形成する。

【0415】

いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ヒトＡＤＡＲ２全タンパク質（ｈＡＤＡＲ２）又はそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＤＡＲ２－Ｄ）を含む。いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２又はｈＡＤＡＲ２－Ｄに相同なＡＤＡＲファミリーのメンバーである。

【0416】

具体的には、いくつかの実施の形態では、相同ＡＤＡＲタンパク質は、ヒトＡＤＡＲ１（ｈＡＤＡＲ１）又はそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＤＡＲ１－Ｄ）である。いくつかの実施の形態では、ｈＡＤＡＲ１－Ｄのグリシン１００７は、グリシン４８７ｈＡＤＡＲ２－Ｄに対応し、且つｈＡＤＡＲ１－Ｄのグルタミン酸１００８は、ｈＡＤＡＲ２－Ｄのグルタミン酸４８８に対応する。

【0417】

いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄの野生型アミノ酸配列を含む。いくつかの実施の形態では、該アデノシンデアミナーゼは、ｈＡＤＡＲ２－Ｄの編集効率及び／又は基質編集の好みが必要に応じて変化するように、ｈＡＤＡＲ２－Ｄ配列に一つ又は複数の突然変異を含む。

【0418】

いくつかの実施の形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＴａｄＡ８ｅ、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８２の配列を含むＴａｄＡ８ｅである。いくつかの実施の形態では、本明細書に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ｄＣａｓ１２ｉ）は、ＴａｄＡ８ｅ又はその機能性断片に融合している（即ち、ＡからＩの一塩基編集が可能である）。
シチジンデアミナーゼ

【0419】

いくつかの実施の形態では、該デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼである。本明細書で使用されるように、用語である「シチジンデアミナーゼ」又は「シチジンデアミナーゼタンパク質」とは、以下に示すように、シトシン（又は分子のシトシン部分）をウラシル（又は分子のウラシル部分）に変換するために水解脱アミノ反応を触媒することができるタンパク質、ポリペプチド、又はタンパク質又はポリペプチドの一つ又は複数の機能ドメインである。いくつかの実施の形態では、シトシン含有分子は、シチジン（Ｃ）であり、且つウラシル含有分子は、ウリジン（Ｕ）である。シトシン含有分子は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）であってもよい。

【0420】

本開示によれば、本開示と組み合わせて使用され得るシチジンデアミナーゼは、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼ、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）又はシチジンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）と呼ばれる酵素ファミリーのメンバーを含むが、それらに限らず、且つ発明を実施するための形態では、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３ＣデアミナーゼとＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼ又はＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼのうちのデアミナーゼである。

【0421】

本発明の方法とシステムでは、シチジンデアミナーゼは、ＤＮＡ一本鎖におけるシトシンを標的とすることができる。いくつかの例示的な実施の形態では、シチジンデアミナーゼは、結合成分の外部に存在する一本鎖上で編集されてもよく、例えばＣａｓ１３に結合される。他の例示的な実施の形態では、シチジンデアミナーゼは、局所バブルで編集されてもよく、例えば標的編集部位に形成されるがガイド配列ミスマッチを有するバブルで編集される。いくつかの例示的な実施の形態では、該シチジンデアミナーゼは、集束活性に寄与する突然変異、例えばＫｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［ネイチャー・バイオテクノロジー］（２０１７）３５（４）：３７１－３７７（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３８０３）に記述されるそれらの突然変異を含んでもよい。

【0422】

いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼは、一つ又は複数の後生動物種に由来し、哺乳動物、鳥類、カエル類、イカ、魚類、ハエとワームを含むが、それらに限らない。いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ラット又はマウスシチジンデアミナーゼである。

【0423】

いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ１又はｈＡＰＯＢＥＣ３を含むヒトＡＰＯＢＥＣである。いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＩＤである。

【0424】

いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼタンパク質は、ＲＮＡ二本鎖の一本鎖バブルにおける一つ又は複数の標的シトシン残基を認識し、それらをウラシル残基に変換する。いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼタンパク質は、ＲＮＡ二本鎖の一本鎖バブル上の結合窓を認識する。いくつかの実施の形態では、結合窓は、少なくとも一つの標的シトシン残基を含む。いくつかの実施の形態では、結合窓は、約３ｂｐから約１００ｂｐの範囲内にある。いくつかの実施の形態では、結合窓は、約５ｂｐから約５０ｂｐの範囲内にある。いくつかの実施の形態では、結合窓は、約１０ｂｐから約３０ｂｐの範囲内にある。いくつかの実施の形態では、結合窓は、約１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、５ｂｐ、７ｂｐ、１０ｂｐ、１５ｂｐ、２０ｂｐ、２５ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、４５ｂｐ、５０ｂｐ、５５ｂｐ、６０ｂｐ、６５ｂｐ、７０ｂｐ、７５ｂｐ、８０ｂｐ、８５ｂｐ、９０ｂｐ、９５ｂｐ又は１００ｂｐである。

【0425】

いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼタンパク質は、一つ又は複数のデアミナーゼドメインを含む。理論に束縛されることは望ましくないが、デアミナーゼドメインがＲＮＡ二本鎖の一本鎖バブルに含まれる一つ又は複数の標的シトシン（Ｃ）残基を認識し、それらをウラシル（Ｕ）残基に変換するために用いられることを考慮する。いくつかの実施の形態では、該デアミナーゼドメインは、活性中心を含む。いくつかの実施の形態では、活性中心は、亜鉛イオンを含む。いくつかの実施の形態では、活性中心における又は付近のアミノ酸残基は、標的シトシン残基５’における一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する。いくつかの実施の形態では、活性中心における又は付近のアミノ酸残基は、標的シトシン残基３’における一つ又は複数のヌクレオチドと相互作用する。

【0426】

いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＰＯＢＥＣ１全タンパク質（ｈＡＰＯＢＥＣ１）又はそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＰＯＢＥＣ１－Ｄ）又はそのＣ－末端切断形式（ｈＡＰＯＢＥＣ－Ｔ）を含む。いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼは、ｈＡＰＯＢＥＣ１、ｈＡＰＯＢＥＣ－Ｄ又はｈＡＰＯＢＥＣ－Ｔに相同なＡＰＯＢＥＣファミリーのメンバーである。いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼは、ヒトＡＩＤ１全タンパク質（ｈＡＩＤ）又はそのデアミナーゼドメイン（ｈＡＩＤ－Ｄ）又はそのＣ－末端切断形式（ｈＡＩＤ－Ｔ）を含む。いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼは、ｈＡＩＤ、ｈＡＩＤ－Ｄ又はｈＡＩＤ－Ｔに相同なＡＩＤファミリーのメンバーである。いくつかの実施の形態では、ｈＡＩＤ－Ｔは、Ｃ－末端の約２０個のアミノ酸が切断されたｈＡＩＤである。

【0427】

いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼは、シトシンデアミナーゼの野生型アミノ酸配列を含む。いくつかの実施の形態では、該シチジンデアミナーゼは、シトシンデアミナーゼの編集効率及び／又は基質編集の好みが必要に応じて変化するように、シトシンデアミナーゼ配列に一つ又は複数の突然変異を含む。

【0428】

本明細書で使用されるように、「関連」は、その最も広い意味で使用され、且つそのうちの二つの機能モジュールが直接的又は間接的に（リンカーを介して）融合タンパク質を形成する状況、及びそのうちの二つの機能モジュールがそれぞれ独立して共有結合（例えば、ジスルフィド結合）又は非共有結合によって結合される状況をカバーする。

【0429】

用語である「ベクター」とは、それに連結される別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。それは、レプリコン、例えばプラスミド、ファージ又はコスミドであり、その中に別のＤＮＡセグメントを挿入して、挿入されたセグメントの複製を実現することができる。一般的には、適切な制御要素と組み合わせると、ベクターは、複製可能である。

【0430】

場合によっては、ベクターシステムは、単一のベクターを含む。代替的に、ベクターシステムは、複数のベクターを含む。ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。

【0431】

ベクターは、一本鎖、二本鎖又は部分的に二本鎖の核酸分子と、一つ又は複数の自由端を含むか、又は自由端（例えば、環状）がない核酸分子と、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は両方を含む核酸分子と、当分野において既知の他のポリヌクレオチド変異体とを含むが、それらに限らない。一つのタイプのベクターは、「プラスミド」であり、それは、環状二本鎖ＤＮＡ環を指し、その中に他のＤＮＡセグメントを挿入することができ、例えば標準分子クローニング技術によって挿入される。別のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、その中にウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損型レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損型アデノウイルスとアデノ随伴ウイルス）にパッケージングするためのウイルス由来のＤＮＡ又はＲＮＡ配列が存在している。ウイルスベクターは、宿主細胞にトランスフェクションするためにウイルスによって担持されるポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかのベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律的に複製可能である（例えば、細菌複製始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター）。これらのベクターを宿主細胞に導入した後、他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞のゲノムに組み込まれて宿主ゲノムと共に複製される。また、いくつかのベクターは、それに操作可能に連結される遺伝子の発現をガイドすることができる。このようなベクターは、本明細書において、「発現ベクター」と呼ばれる。真核細胞において発現するベクターと、真核細胞において発現を引き起こすベクターとは、本明細書において「真核発現ベクター」と呼ばれてもよい。組換えＤＮＡ技術に使用され得る一般的な発現ベクターは、通常、プラスミド形式である。

【0432】

組換え発現ベクターは、宿主細胞における発現に適した形式の本発明の核酸を含んでもよく、これは、組換え発現ベクターが、一つ又は複数の調節要素を含み、該調節要素が、発現のための宿主細胞に従って選択され得、且つ核酸が、発現すべき核酸配列に動作可能に連結されることを意味する。組換え発現ベクター内で、「動作可能に連結される」とは、関心のあるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、インビトロ転写／翻訳系において発現するか、又はベクターを宿主細胞に導入する時に宿主細胞において発現する）を可能にする方式で調節要素に連結されることを意味することを意図する。有利なベクターは、レンチウイルスとアデノ随伴ウイルスとを含み、且つこれらのベクターのタイプを選択して特定のタイプの細胞を標的とすることもできる。

【0433】

用語である「調節要素」は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）と他の発現制御要素（例えば、転写終結シグナル、例えばポリアデニル化シグナルとｐｏｌｙ－Ｕ配列）を含むことを意図する。そのような調節要素は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ［遺伝子発現技術：酵素学方法］１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（カリフォルニア州サンディエゴ、学術出版社）（１９９０）（１９９０）に記述されている。調節要素は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現をガイドするそれらの要素、及びいくつかの宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現をガイドするそれらの要素（例えば、組織特異的調節配列）を含む。組織特異的プロモーターは、主に所望の標的組織、例えば筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば、肝臓、膵臓腺）又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）における発現をガイドすることができる。調節要素は、時間依存性方式、例えば細胞周期依存性又は発生段階依存性方式で発現をガイドすることもでき、それは、組織又は細胞型特異的であってもよく、そうではなくてもよい。

【0434】

いくつかの実施の形態では、ベクターは、一つ又は複数の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のＮＬＳを含むＣａｓ１２ｉタンパク質をコードする。より具体的に、ベクターは、Ｃａｓ１２ｉタンパク質に天然に存在しない一つ又は複数のＮＬＳを含む。最も特に、ＮＬＳは、Ｃａｓ１２ｉタンパク質配列のベクターの５’及び／又は３’に存在する。いくつかの実施の形態では、ターゲッティングＲＮＡのタンパク質は、アミノ末端又は付近に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のＮＬＳを含み、且つカルボキシル末端又は付近に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のＮＬＳ、又はこれらの組み合わせを含む（例えば、アミノ末端に０個又は少なくとも一つ又は複数のＮＬＳを含み、且つカルボキシル末端に０個又は一つ又は複数のＮＬＳを含む）。一つ以上のＮＬＳが存在する場合、それらのうちの各ＮＬＳは、単一のＮＬＳが一つ以上のコピーで存在し、及び／又は一つ又は複数の他のＮＬＳと組み合わせて一つ又は複数のコピーで存在できるように、他から独立して選択されてもよい。いくつかの実施の形態では、ＮＬＳに最も近いアミノ酸が、Ｎ－末端又はＣ－末端からポリペプチド鎖に沿って約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０個又はそれ以上のアミノ酸以内である場合、ＮＬＳがＮ－末端又はＣ－末端に付属しているとみなされる。

【0435】

「コドン最適化」とは、天然のアミノ酸配列を維持すると同時に、以下の方式で標的宿主細胞における核酸配列を修飾して発現を補強する方法であり、該宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に使用されるか又は最も頻繁に使用されるコドンで、天然配列の少なくとも一つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個又はそれ以上のコドン）を代替する。複数の種は、特定のアミノ酸のいくつかのコドンに対して特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物体におけるコドン使用の違い）は通常、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と関係があり、翻訳効率が特に翻訳されたコドンの特徴と特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞において選択されたｔＲＮＡの優位性は通常、ペプチド合成において最も一般的に使用されているコドンを反映している。そのため、コドン最適化に基づいて所定の生物における遺伝子発現を最適化するように、遺伝子をカスタマイズすることができる。コドン使用テーブルは、取得しやすく、例えばｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／の「コドン使用データベース」から取得され、且つ様々な方式で変更することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．ら”Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００［国際ＤＮＡ配列データベースから作成されたコドン使用テーブル：２０００年の状況］” Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．［核酸研究］２８：２９２（２０００）を参照する。特定の宿主細胞において発現する特定の配列コドン最適化のためのコンピュータアルゴリズム、例えばＧｅｎｅ Ｆｏｒｇｅも取得可能である（Ａｐｔａｇｅｎ、Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ（ペンシルベニア州ジェイコブス））。いくつかの実施の形態では、Ｃａｓタンパク質を標的とするＤＮＡ／ＲＮＡをコードする配列における一つ又は複数のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個又はそれ以上又はすべてコドン）は、特定のアミノ酸の最一般的に使用されているコドンに対応する。酵母におけるコドン使用については、ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／ｃｏｄｏｎ＿ｕｓａｇｅ．ｓｈｔｍｌから入手可能なオンライン酵母ゲノムデータベース、又はＣｏｄｏｎ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ［酵母におけるコドン選択］，ＢｅｎｎｅｔｚｅｎとＨａｌｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．［生化学ジャーナル］１９８２年３月２５日；２５７（６）：３０２６－３１を参照されたい。植物（藻類を含む）におけるコドン使用については、Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｈｉｇｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ，ｇｒｅｅｎ ａｌｇａｅ，ａｎｄ ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ［高等植物、緑藻と藍藻におけるコドン使用］，ＣａｍｐｂｅｌｌとＧｏｗｒｉ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．［植物生理学］，１９９０年１月；９２（１）：１－１１．、とＣｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅｓ［植物遺伝子におけるコドン使用］，Ｍｕｒｒａｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．［核酸研究］１９８９年１月２５日；１７（２）：４７７－９８、又はＳｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ａｎｄ ｃｙａｎｅｌｌｅ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｌａｎｔ ａｎｄ ａｌｇａｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ［異なる植物と藻類系統における葉緑体とシアネル遺伝子コドンバイアスの選択］，Ｍｏｒｔｏｎ ＢＲ，Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ．［分子進化ジャーナル］１９９８年４月；４６（４）：４４９－５９を参照する。
送達システム

【0436】

いくつかの実施の形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの成分は、様々な形式、例えばＤＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＲＮＡ又はタンパク質ＲＮＡの組み合わせで送達されてもよい。例えば、Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、ＤＮＡをコードするポリヌクレオチド又はＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとして、又はタンパク質として送達されてもよい。該ガイドは、ＤＮＡ又はＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとして送達されてもよい。混合送達形式を含むすべての可能な組み合わせが考慮されている。

【0437】

いくつかの態様によれば、本発明は、一つ又は複数のポリヌクレオチド、例えば本明細書に記載の一つ又は複数のベクター、その一つ又は複数の転写物、及び／又はそれから転写された一つ又は複数のタンパク質を宿主細胞に送達するための方法を提供する。

【0438】

いくつかの実施の形態では、核酸ターゲッティングシステムの一つ又は複数の要素の発現を駆動する一つ又は複数のベクターを宿主細胞に導入することによって、核酸ターゲッティングシステムの要素の発現は、核酸ターゲッティング複合体が一つ又は複数の標的部位において形成されるようにガイドする。例えば、エフェクター酵素をコードする核酸及びガイドＲＮＡをコードする核酸は、それぞれ単独のベクター上の単独の調節要素に動作可能に連結され得る。核酸ターゲッティングシステムのＲＮＡをトランスジェニック核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質動物又は哺乳動物、例えば構成的又は誘導的又は条件的に核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質を発現する動物又は哺乳動物、又は他の方式で核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質を発現し、又は、核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質を含有する細胞を有する動物又は哺乳動物に送達してもよく、例えば前記送達は、インビボ核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質をコードし発現する一つ又は複数のベクターをそれに事前に投与することである。代替的に、同じ又は異なる調節要素によって調節される２つ又はそれ以上の要素は、単一のベクターで組み合わされてもよいが、一つ又は複数の別のベクターは、第１のベクターに含まれない核酸ターゲッティングシステムの任意の成分を提供する。単一のベクターに組み合わされた核酸ターゲッティングシステムの要素は、任意の適切な配向で並べられてもよく、例えば、一つの要素は、第２の要素に対して５’（「上流」）に位置するか、又は第２の要素に対して３’（「下流」）に位置する。一つの要素のコード配列は、第２の要素のコード配列の同じ又は反対の鎖上にあり、且つ同じ又は逆の方向で配向されてもよい。いくつかの実施の形態では、単一のプロモーターは、核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質と核酸ターゲッティングガイドＲＮＡをコードする転写物の発現を駆動し、且つ転写物は、一つ又は複数のイントロン配列に埋め込まれる（例えば、それぞれ単独のイントロンにあり、２つ又はそれ以上が少なくとも一つのイントロンにあるか、又はすべて単一のイントロンにある）。いくつかの実施の形態では、核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質と核酸ターゲッティングガイドＲＮＡは、同一のプロモーターに動作可能に連結され、同一のプロモーターによって発現されてもよい。核酸ターゲッティングシステムの一つ又は複数の要素を発現するための送達媒体、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤及びその成分は、以前の文書、例えばＷＯ２０１４／０９３６２２に使用されるようになる（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施の形態では、ベクターは、一つ又は複数の挿入部位、例えば制限的エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）を含む。いくつかの実施の形態では、一つ又は複数の挿入部位（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上の挿入部位）は、一つ又は複数のベクターの一つ又は複数の配列要素の上流及び／又は下流に位置する。複数の異なるガイド配列を使用する場合、単一の発現構築体は、活性標的細胞内の様々な該当する標的配列に核酸を標的とするために用いられてもよい。例えば、単一のベクターは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０個又はそれ以上のガイド配列を含んでもよい。いくつかの実施の形態では、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれ以上のそのようなガイド配列を含有するベクターを提供し、且つ任意選択的に、それを細胞に送達してもよい。いくつかの実施の形態では、ベクターは、核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列に動作可能に連結される調節要素を含む。該核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質又は一つ又は複数の核酸ターゲッティングガイドＲＮＡは、単独で送達されてもよく、且つ、有利には、これらのうちの少なくとも一つは、粒子複合体を介して送達される。核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡは、核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質の発現時間を確保するために、核酸ターゲッティングガイドＲＮＡの前に送達されてもよい。核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡは、核酸ターゲッティングガイドＲＮＡを投与する１～１２時間（好ましくは約２～６時間）前に投与されてもよい。代替的に、核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡと核酸ターゲッティングガイドＲＮＡは、一緒に投与されてもよい。有利には、第２の増強投与量のガイドＲＮＡは、核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの最初の投与から１～１２時間（好ましくは約２～６時間）後に投与されてもよい。核酸ターゲッティングエフェクタータンパク質ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加投与は、最も効果的なレベルのゲノム修飾を実現するために用いられてもよい。

【0439】

一般的なウイルス又は非ウイルスに基づく遺伝子導入法は、哺乳動物細胞又は標的組織に核酸を導入するために用いられてもよい。そのような方法は、核酸ターゲッティングシステムの成分をコードする核酸を培養物又は宿主生体内の細胞に投与するために用いられてもよい。非ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載のベクターの転写物）、ネイキッド核酸及び、送達媒体、例えばリポソームと複合化される核酸を含む。ウイルスベクター送達システムは、ＤＮＡとＲＮＡウイルスとを含み、これらのウイルスを細胞に送達した後、エピソーム又は整合ゲノムを有する。遺伝子治療手順の総説について、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ［サイエンス］２５６：８０８－８１３（１９９２）、ＮａｂｅｌとＦｅｌｇｎｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ［バイオテクノロジートレンド］１１：２１１－２１７（１９９３）、ＭｉｔａｎｉとＣａｓｋｅｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ［バイオテクノロジートレンド］１１：１６２－１６６（１９９３）、Ｄｉｌｌｏｎ，ＴＩＢＴＥＣＨ［バイオテクノロジートレンド］１１：１６７－１７５（１９９３）、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ［ネイチャー］３５７：４５５－４６０（１９９２）、Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［バイオテクノロジー］６（１０）：１１４９－１１５４（１９８８）、Ｖｉｇｎｅ，Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ［回復神経学と神経科学］８：３５－３６（１９９５）、ＫｒｅｍｅｒとＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ［英国医学公報］５１（１）：３１－４４（１９９５）、Ｈａｄｄａｄａら，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ［微生物学と免疫学の現在のトピックス］，ＤｏｅｒｆｌｅｒとＢoｈｍ（編集）（１９９５）、及び、Ｙｕら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ［遺伝子療法］１：１３－２６（１９９４）を参照する。

【0440】

核酸の非ウイルス送達方法は、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、ビリオン、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸複合体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン及び試薬によって補強されるＤＮＡ取り込みを含む。リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号と第４，８９７，３５５号に記述されており、且つリポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）とＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効果的な受容体認識リポフェクションに適切なカチオンと中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものを含み、これらの脂質は、細胞（例えば、インビトロ又はエクスビボ投与）又は標的組織（例えば、インビボ投与）に送達されてもよいと考慮される。

【0441】

プラスミド送達は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質を発現するプラスミドにガイドＲＮＡをクローニングし、細胞培養物においてＤＮＡをトランスフェクションすることに関する。プラスミドバックボーンは、市販されており、且つ特定の機器を必要としない。有利には、それらは、モジュール化されており、且つ異なるサイズのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓコード配列（より大きなサイズをコードするタンパク質の配列を含む）、及び選択マーカーを担持することができる。また、プラスミドは、一時的であるが連続的な発現を確保するため、有利である。しかしながら、プラスミドの送達は、直接的ではなく、通常は低いインビボ効率を引き起こす。連続的な発現は、オフターゲット編集を増やすことがあるため、不利になる可能性もある。また、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の過剰な蓄積は、細胞に有毒である可能性がある。最後に、プラスミドは、常にｄｓＤＮＡを宿主ゲノムにランダムに組み込むリスクを有し、より具体的に、二本鎖切断（オンターゲットとオフターゲット）のリスクを考慮している。

【0442】

脂質：核酸複合体（ターゲッティングリポソーム、例えば免疫脂複合体を含む）の製造は、当業者によく知っており（例えばＣｒｙｓｔａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ［サイエンス］２７０：４０４－４１０（１９９５）、Ｂｌａｅｓｅら，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．［癌遺伝子療法］２：２９１－２９７（１９９５）、Ｂｅｈｒら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．［生物複合体化学］５：３８２－３８９（１９９４）、Ｒｅｍｙら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．［生物複合体化学］５：６４７－６５４（１９９４）、Ｇａｏら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ［遺伝子療法］２：７１０－７２２（１９９５）、Ａｈｍａｄら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．［癌研究］５２：４８１７－４８２０（１９９２）、米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号と第４，９４６，７８７号を参照する）、以下により詳細に検討する。

【0443】

ＲＮＡ又はＤＮＡウイルスベースのシステムを用いて核酸を送達することは、ウイルスをインビボの特定の細胞にターゲッティングし、ウイルスペイロードを細胞核に輸送する高度に進化したプロセスを利用している。ウイルスベクターは、患者（インビボ）に直接投与されてもよく、又はそれらは、インビトロで細胞を治療するために用いられてもよく、且つ任意選択的に、患者に修飾された細胞（エクスビボ）を投与してもよい。一般的なウイルスベースのシステムは、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスと単純ヘルペスウイルスベクターを含んでもよい。レトロウイルス、レンチウイルスとアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法による宿主ゲノムへの組み込みは、常に挿入されたトランスジェニックの長期発現を引き起こす。また、多くの異なる細胞型と標的組織において高い形質導入効率が観察される。

【0444】

レトロウイルスの指向性は、外因性エンベロープタンパク質の組み込みによって改変されて、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大してもよい。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するか又は感染させ、通常、高いウイルス力価を産生するレトロウイルスベクターである。そのため、レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６～１０ｋｂのパッケージング能力を有する外来配列のシス作用性長末端反復配列からなる。最小限のシス作用ＬＴＲは、ベクターの複製とパッケージングに十分であり、そして該ベクターは、恒久的なトランスジェニック発現を提供するために治療遺伝子を標的細胞に組み込むために用いられる。広く使用されているレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びその組み合わせに基づくベクターを含む（例えばＢｕｃｈｓｃｈｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．［ウイルス学ジャーナル］６６：２７３１－２７３９（１９９２）、Ｊｏｈａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．［ウイルス学ジャーナル］６６：１６３５－１６４０（１９９２）、Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔら，Ｖｉｒｏｌ．［ウイルス学］１７６：５８－５９（１９９０）、Ｗｉｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．［ウイルス学ジャーナル］６３：２３７４－２３７８（１９８９）、Ｍｉｌｌｅｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．［ウイルス学ジャーナル］６５：２２２０－２２２４（１９９１）、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照する）。

【0445】

好ましくは、一時的発現の応用では、アデノウイルスベースのシステムを使用することができる。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において高い形質導入効率を提供し、且つ細胞分裂を必要としない。そのようなベクターを使用することで、すでに高い力価と高い発現レベルを実現した。ベクターは、比較的簡単なシステムで大量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば核酸とペプチドのインビトロ産生において、及びインビボとエクスビボ遺伝子治療手順において標的核酸を細胞に形質導入するために用いられてもよい（例えば、Ｗｅｓｔら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ［ウイルス学］１６０：３８－４７（１９８７）、米国特許第４，７９７，３６８号、ＷＯ９３／２４６４１、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ［ヒト遺伝子療法］５：７９３－８０１（１９９４）、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．［臨床研究ジャーナル］９４：１３５１（１９９４）を参照する）。組換えＡＡＶベクターの構築は、多くの出版物に記述されており、米国特許第５，１７３，４１４号、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．［分子と細胞生物学］５：３２５１－３２６０（１９８５）、Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．［分子と細胞生物学］４：２０７２－２０８１（１９８４）、ＨｅｒｍｏｎａｔとＭｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ［米国国家科学院院刊］８１：６４６６－６４７０（１９８４）、とＳａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．［ウイルス学ジャーナル］６３：０３８２２－３８２８（１９８９）を含む。

【0446】

本発明は、ＡＡＶを提供し、該ＡＡＶは、ＣＲＩＳＰＲシステムをコードする外因性核酸分子を含むか又は基本的にそれらによって構成され、該外因性核酸分子は、例えば以下のカセットを含むか又は以下のカセットによって構成される複数のカセットであり、プロモーター、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（推定されるヌクレアーゼ又はヘリカーゼタンパク質）（例えば、Ｃａｓ１２ｉ）をコードする核酸分子とターミネーター又はそれらによって構成される第１のカセット、及び一つ又は複数のカセット、有利には多くともベクターのパッケージングサイズ限界、例えば合計五つのカセットを含み（第１のカセットを含み）、これらのカセットは、プロモーター、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子とターミネーターを含むか又は基本的にそれらによって構成され（例えば、各カセットは、プロモーター－ｇＲＮＡ１－ターミネーター、プロモーター－ｇＲＮＡ２－ターミネーター．．．プロモーター－ｇＲＮＡ（Ｎ）－ターミネーターとして概略的に表され、ここで、Ｎは、挿入可能なベクターのパッケージングサイズ限界の上限である）、又は本発明は、２つ又はそれ以上の単独のｒＡＡＶを提供し、ここで、各ｒＡＡＶは、いずれもＣＲＩＳＰＲシステムの一つ又は複数のカセットを含有し、例えば、第１のｒＡＡＶは、第１のカセットを含有し、該第１のカセットは、プロモーター、Ｃａｓをコードする核酸分子、例えばＣａｓ（Ｃａｓ１２ｉ）とターミネーターを含むか又は基本的にそれらによって構成され、且つ第２のｒＡＡＶは、一つ又は複数のカセットを含有し、各カセットは、プロモーター、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする核酸分子とターミネーターを含むか又は基本的にそれらによって構成される（例えば、各カセットは、プロモーター－ｇＲＮＡ１－ターミネーター、プロモーター－ｇＲＮＡ２－ターミネーター．．．プロモーター－ｇＲＮＡ（Ｎ）－ターミネーターとして概略的に表され、ここで、Ｎは、挿入可能なベクターのパッケージングサイズ限界の上限である）。代替的に、Ｃａｓ１２ｉがその自体のｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡを加工できるため、単一のｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡアレイは、多重遺伝子編集に用いられてもよい。そのため、ｇＲＮＡを送達するための複数のカセットを含むことではなく、ｒＡＡＶは、プロモーターと、複数のｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡと、ターミネーターとを含むかそれらによって構成される単一のカセットを含有してもよい（例えば、プロモーター－ｇＲＮＡ１－ｇＲＮＡ２．．．ｇＲＮＡ（Ｎ）－ターミネーターとして概略的に表され、ここで、Ｎは、挿入可能なベクターのパッケージングサイズ限界の上限である）。Ｚｅｔｓｃｈｅら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ［ネイチャー・バイオテクノロジー］３５，３１－３４（２０１７）を参照すると、それは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ｒＡＡＶがＤＮＡウイルスであるため、本明細書のＡＡＶ又はｒＡＡＶに関する検討における核酸分子は、有利にはＤＮＡである。いくつかの実施の形態では、該プロモーターは、有利にはヒトシナプトフィジンＩプロモーター（ｈＳｙｎ）である。核酸を細胞に送達する他の方法は、当業者に既知のものである。例えば、ＵＳ２００３００８７８１７を参照すると、それは、引用により本明細書に組み込まれる。

【0447】

別の実施の形態では、コカル水疱ウイルス（ｃｏｃａｌ ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）エンベロープの擬似レトロウイルスベクター粒子が考慮されている（例えば、フレッドハッチンソン癌研究センター（Ｆｒｅｄ Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に譲渡された米国特許開示第２０１２０１６４１１８号を参照する）。コカルウイルスは、水疱ウイルス属に属し、且つ哺乳動物の水疱性口内炎の病原体である。コカルウイルスは、もともとトリニダードのダニから単離され（Ｊｏｎｋｅｒｓら、Ａｍ． Ｊ． Ｖｅｔ． Ｒｅｓ．［米国獣医研究ジャーナル］２５：２３６－２４２（１９６４））、且つすでにトリニダード島、ブラジル、アルゼンチンの昆虫、ウシとウマにコカルウイルス感染が同定された。哺乳動物に感染する多くの水疱ウイルスは、すでに自然に感染した節足動物から単離されており、それらが媒介性に伝染することを示す。水疱ウイルス抗体は、現地でウイルスを取得した農村地域及び実験室に広く存在しており、それらのヒトへの感染は、通常、インフルエンザ様症状を引き起こす。コカルウイルスのエンベロープ糖タンパク質は、アミノ酸レベル上でＶＳＶ－Ｇインディアナ株と７１．５％の同一性を有し、且つ水疱ウイルスエンベロープ遺伝子の系統学的発育の比較により、コカルウイルスは、血清学的に水疱ウイルスのＶＳＶ－Ｇインディアナ株と異なるが、それと最も密接に関連していることが示された。Ｊｏｎｋｅｒｓら，Ａｍ． Ｊ． Ｖｅｔ． Ｒｅｓ．［米国獣医研究ジャーナル］２５：２３６－２４２（１９６４）とＴｒａｖａｓｓｏｓ ｄａ Ｒｏｓａら，ＡＭ． Ｊ． Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｍｅｄ． ＆ Ｈｙｇｉｅｎｅ［米国熱帯医学と衛生ジャーナル］３３：９９９－１００６（１９８４）。コカル水疱ウイルスエンベロープ擬似レトロウイルスベクター粒子は、例えばレンチウイルス、αレトロウイルス、βレトロウイルス、γレトロウイルス、δレトロウイルスとεレトロウイルスベクター粒子を含んでもよく、これらの粒子は、レトロウイルスＧａｇ、Ｐｏｌ及び／又は一つ又は複数のアクセサリータンパク質とコカル水疱ウイルスエンベロープタンパク質を含んでもよい。これらの実施の形態のいくつかの態様では、Ｇａｇ、Ｐｏｌとアクセサリータンパク質は、レンチウイルス及び／又はγレトロウイルスである。

【0448】

いくつかの実施の形態では、本明細書に記載の一つ又は複数のベクターで一時的又は非一時的に宿主細胞をトランスフェクションする。いくつかの実施の形態では、細胞が被験体に天然に存在する場合、細胞をトランスフェクションし、任意選択的にその中に再導入する。いくつかの実施の形態では、トランスフェクションされた細胞は、被験体から採取される。いくつかの実施の形態では、これらの細胞は、被験体からの細胞、例えば細胞株に由来する。組織培養に用いられる様々な細胞株は、当分野において既知のものである。細胞株の例は、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ－３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａ－Ｓ３、Ｈｕｈ１、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｃ１、ＰＣ－３、ＴＦ１、ＣＴＬＬ－２、Ｃ１Ｒ、Ｒａｔ６、ＣＶ１、ＲＰＴＥ、Ａ１０、Ｔ２４、Ｊ８２、Ａ３７５、ＡＲＨ－７７、Ｃａｌｕ１、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ－ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄ１、ＳＥＭ－Ｋ２、ＷＥＨＩ－２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊ４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ－１、ＢＣ－３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ－５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４、ＣＯＳ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－６、ＣＯＳ－Ｍ６Ａ、ＢＳ－Ｃ－１サル腎臓上皮細胞、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胎児線維芽細胞、３Ｔ３ Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３－Ｌ１、１３２－ｄ５ヒト胎児線維芽細胞、１０．１マウス線維芽細胞、２９３－Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ－５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ－１細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ－２１、ＢＲ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ－１０Ｔ１／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ－２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ－７、ＣＨＯ－ＩＲ、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ－Ｋ２、ＣＨＯ－Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ－／－、ＣＯＲ－Ｌ２３、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ－Ｌ２３／５０１０、ＣＯＲ－Ｌ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ－７、ＣＯＶ－４３４、ＣＭＬ Ｔ１、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａ１ｃ１ｃ７、ＨＬ－６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ－２９、Ｊｕｒｋａｔ、ＪＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧ１、ＫＹＯ１、ＬＮＣａｐ、Ｍａ－Ｍｅｌ １－４８、ＭＣ－３８、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－１０Ａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＤＣＫ ＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ ６、ＭＴＤ－１Ａ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＮＡＬＭ－１、ＮＷ－１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞株、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ－１Ａ／ＰＮＴ ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ－５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｓｆ－９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰ１細胞株、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ－４９、Ｘ６３、ＹＡＣ－１、ＹＡＲ及びそのトランスジェニック品種を含むが、それらに限らない。細胞株は、当業者に知られている様々な供給源（例えば、米国典型培養物寄託センター（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓｕｓ，Ｖａ．））を参照する）から入手可能である。

【0449】

特定の実施の形態では、ＡＤ官能化のＣＲＩＳＰＲシステムの一つ又は複数の成分の一時的発現及び／又は存在は、例えば、オフターゲット効果を減少させるために関心のあるものであってもよい。いくつかの実施の形態では、本明細書に記載の一つ又は複数のベクターでトランスフェクションされた細胞は、一つ又は複数のベクターに由来する配列を含む新型細胞株の確立に用いられる。いくつかの実施の形態では、本明細書に記載のＡＤ官能化のＣＲＩＳＰＲシステムの成分で一時的にトランスフェクションされ（例えば、一つ又は複数のベクターで一時的にトランスフェクションされ、又はＲＮＡでトランスフェクションされ）、且つＣＲＩＳＰＲ複合体の活性によって修飾された細胞は、これらの修飾を含有するが任意の他の外来配列のない細胞を含む新細胞株の確立に用いられる。いくつかの実施の形態では、本明細書に記載の一つ又は複数のベクターで一時的又は非一時的にトランスフェクションされる細胞又はそのような細胞に由来する細胞株は、一つ又は複数の試験化合物を評価するために用いられる。

【0450】

いくつかの実施の形態では、ＲＮＡ及び／又はタンパク質を宿主細胞に直接導入することが考慮される。例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、コードされたｍＲＮＡとしてインビトロ転写からのガイドＲＮＡとともに送達されてもよい。そのような方法は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質の作用時間を減少させて確保し、且つＣＲＩＳＰＲシステムの成分の長期発現をさらに防止することができる。

【0451】

いくつかの実施の形態では、本発明のＲＮＡ分子は、リポソーム又はｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ製剤などとして送達され、且つ当業者がよく知っている方法で製造することができる。そのような方法は、例えば米国特許第５，５９３，９７２号、第５，５８９，４６６号と第５，５８０，８５９号に記述されており、これらの特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。哺乳動物細胞へのｓｉＲＮＡ送達を補強・改善するために特別に設計された送達システムが開発されており（例えばＳｈｅｎら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．［欧州生化学連合速報］２００３，５３９：１１１－１１４、Ｘｉａら，Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ．［ネイチャー・バイオテクノロジー］２００２，２０：１００６－１０１０、Ｒｅｉｃｈら，Ｍｏｌ． Ｖｉｓｉｏｎ．［分子視覚］２００３，９：２１０－２１６、Ｓｏｒｅｎｓｅｎら，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．［分子生物学ジャーナル］２００３，３２７：７６１－７６６、Ｌｅｗｉｓら，Ｎａｔ． Ｇｅｎ．［自然遺伝学］２００２，３２：１０７－１０８、とＳｉｍｅｏｎｉら，ＮＡＲ［核酸研究］２００３，３１，１１：２７１７－２７２４を参照する）、且つ本発明に応用可能である。ｓｉＲＮＡは、最近、霊長類動物における遺伝子発現を阻害するために使用することに成功しており（例えば、Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏら，Ｒｅｔｉｎａ［網膜］２４（４）：６６０を参照する）、それも、本発明に応用可能である。

【0452】

事実的に、ＲＮＡ送達は、有用なインビボ送達方法である。リポソーム又は粒子を用いてＣａｓ１２ｉ、アデノシンデアミナーゼとガイドＲＮＡを細胞に送達することができる。そのため、本発明のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ｉ）の送達、アデノシンデアミナーゼ（それは、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質又はアダプタータンパク質に融合可能である）の送達及び／又はＲＮＡの送達は、ＲＮＡの形式であり、且つ微小胞、リポソーム又は粒子又はナノ粒子を介して行うことができる。例えば、インビボ送達のために、Ｃａｓ１２ｉ ｍＲＮＡ、アデノシンデアミナーゼｍＲＮＡとガイドＲＮＡをリポソーム粒子にパッケージングする。リポソームトランスフェクション試薬、例えばライフテクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅと市場上の他の試薬は、ＲＮＡ分子を肝臓に効率的に送達することができる。いくつかの実施の形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、５０ｍＭ：５０ｍＭ：１０ｍＭ：２０ｍＭのモル比でＡＬＣ－０３１５：コレステロール：ＰＥＧ－ＤＭＧ：ＤＯＰＥを含む。いくつかの実施の形態では、ＬＮＰは、Ｃａｓ１２ｉ及びその該当するｃｒＲＮＡ（例えば、ＳｉＣａｓ１２ｉ：ｃｒＲＮＡ、重量比１：１）又はそのコード核酸をカプセル化する。いくつかの実施の形態では、静脈内注入によって個体（例えば、ヒト）にＣａｓ１２ｉ及び／又はｃｒＲＮＡ（又はそのコード核酸）を含むＬＮＰを投与する。

【0453】

ＲＮＡの送達は、また、好ましくは、粒子（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．とＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ［内皮細胞に低分子干渉ＲＮＡを送達するための脂質様ナノ粒子］，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ［先進機能材料］，１９：３１１２－３１１８，２０１０）を介して、又はエキソソーム（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．とＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ－ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ［ｓｉＲＮＡ送達のための脂質ベースナノ治療剤］，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ［内科医学ジャーナル］，２６７：９－２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）を介してＲＮＡを送達することを含む 。事実的に、エキソソームがｓｉＲＮＡ送達に特に有用であり、且つ該システムがＣＲＩＳＰＲシステムと若干類似していることを示した。例えば、Ｅｌ－Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓら（「Ｅｘｏｓｏｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．［インビトロとインビボエキソソーム媒介性ｓｉＲＮＡ送達］」 Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．［自然実験ハンドブック］２０１２年１２月；７（１２）：２１１２－２６． ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．２０１２年１１月１５日に電子開示）は、エキソソームが、どのように薬物送達が異なる生物障壁を通過するため及びインビトロとインビボにおけるｓｉＲＮＡ送達のための有望なツールとなるかを記述した。彼らの方法は、ペプチド配体に融合するエキソソームタンパク質を含む発現ベクターをトランスフェクションすることによってターゲッティングエキソソームを産生することに関する。そして、トランスフェクションされた細胞上清からエキソソームを精製して特徴付け、ＲＮＡをエキソソームにロードする。本発明による送達又は投与は、エキソソーム、特に脳（それに限らない）を用いて行うことができる。ビタミンＥ（α－トコフェロール）は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓと合体して高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）とともに脳に送達されることができ、例えば、Ｕｎｏら（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ［ヒト遺伝子療法］２２：７１１－７１９（２０１１年６月））が短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を脳に送達する方式に類似する。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は遊離ＴｏｃｓｉＢＡＣＥ又はＴｏｃ－ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬが充填されており、脳注入キット３（アルゼット社（Ａｌｚｅｔ））に連結される浸透圧ミニポンプ（型番１００７Ｄ、アルゼット社、カリフォルニア州クパチーノ（Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ））を介してマウスへの注入を行う。第３脳室の背側に注入するために、正中線のブレグマの後方約０．５ｍｍに脳注入カニューレを置く。Ｕｎｏらは、同じＩＣＶ注入方法によって、３ｎｍｏｌまで低いＨＤＬを含有するＴｏｃ－ｓｉＲＮＡが標的低減を大きく誘導できることを発見した。本発明では、ヒトにとって、α－トコフェロールに合体し、且つ脳を標的とするＨＤＬと共に投与される、似ている投与量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを考慮することができ、例えば、脳を標的とする約３ｎｍｏｌから約３μＭｏｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを考慮することができる。Ｚｏｕら（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ［ヒト遺伝子療法］２２：４６５－４７５（２０１１年４月））は、ラット脊髓におけるインビボ遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的とする短ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介性送達方法を記述した。Ｚｏｕらは、鞘内カテーテルを介して約１０μｌの組換えレンチウイルスを投与し、力価は、１×１０^９個の形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌである。本発明では、ヒトにとって、脳を標的とするレンチウイルスベクターにおいて発現する、似ている投与量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを考慮することができ、例えば、レンチウイルスにおいて脳を標的とする約１０～５０ｍのｌＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを考慮することができ、力価は、１×１０^９個の形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌである。

【0454】

本明細書に記載の本発明の方法の他の適切な修正と変化は、当業者にとって明らかであり、且つ本発明又は本明細書に開示される実施の形態の範囲から逸脱することなく、適切な等価物を使用して行うことができる。
例示的な実施の形態

【0455】

実施の形態１．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０（好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３、６と１０、且つより好ましくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）のうちのいずれか一つに示すアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、Ｃａｓ１２ｉタンパク質。

【0456】

実施の形態２．前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、該当する親Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つを含むＣａｓ１２ｉタンパク質）の、ガイド配列に相補的な標的ＤＮＡの標的配列に対するスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性（例えば、５０％、４０％、３５％、３０％、２７．５％、２５％、２２．５％、２０％、１７．５％、１５％、１２．５％、１０％、７．５％、５％、４％、３％、２．５％、２％、１％よりも少なく又はそれ以下を保持する）を基本的に有さない、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0457】

実施の形態３．前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質が、該当する親Ｃａｓ１２ｉタンパク質（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０のうちのいずれか一つを含むＣａｓ１２ｉタンパク質）の、ガイド配列に相補的な標的ＤＮＡの標的配列に対するスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性（例えば、５０％、４０％、３５％、３０％、２７．５％、２５％、２２．５％、２０％、１７．５％、１５％、１２．５％、１０％、７．５％、５％、４％、３％、２．５％、２％、１％よりも少なく又はそれ以下を保持する）を基本的に有さないように、そのＲｕｖＣドメインに一つ又は複数のアミノ酸変異が含まれる、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0458】

実施の形態４．前記アミノ酸変異は、アミノ酸の付加、挿入、欠失と置換から選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0459】

実施の形態５．前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す配列の位置７００（Ｄ７００）、６５０（Ｄ６５０）、８７５（Ｅ８７５）又は１０４９（Ｄ１０４９）に対応する一つ又は複数の位置にアミノ酸置換を含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0460】

実施の形態６．前記アミノ酸置換は、Ｄ７００Ａ／Ｖ、Ｄ６５０Ａ／Ｖ、Ｅ８７５Ａ／ＶとＤ１０４９Ａ／Ｖから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0461】

実施の形態７．前記アミノ酸置換は、Ｄ７００Ａ、Ｄ６５０Ａ、Ｅ８７５ＡとＤ１０４９Ａから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0462】

実施の形態８．前記アミノ酸置換は、Ｄ７００Ａ、Ｄ６５０Ａ、Ｅ８７５Ａ、Ｄ１０４９Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ６５０Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｅ８７５Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ６５０Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９ＡとＤ７００Ａ＋Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９Ａから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0463】

実施の形態１０．前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、一つ又は複数の機能ドメインに連結される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0464】

実施の形態１１．前記機能ドメインは、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質のＮ－末端及び／又はＣ－末端に連結される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0465】

実施の形態１２．前記機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）、デアミナーゼ（例えば、アデノシンデアミナーゼ又はシチジンデアミナーゼ）触媒ドメイン、ＤＮＡメチル化触媒ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、ヌクレアーゼ触媒ドメイン、蛍光タンパク質、転写修飾因子、光ゲーティング因子、化学誘導因子、クロマチン可視化因子、標的細胞又は標的細胞型上の細胞表面部分との結合を提供するためのターゲッティングポリペプチドから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0466】

実施の形態１３．前記機能ドメインは、標的ＤＮＡを修飾する活性を示し、前記活性は、ヌクレアーゼ活性、メチル化活性、脱メチル化活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、グリコシダーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、肉ミリストイル化活性、脱肉ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ由来）、脱グリコシル化活性、転写阻害活性、転写活性化活性から選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0467】

実施の形態１４．前記機能ドメインは、アデノシンデアミナーゼ触媒ドメイン又はシチジンデアミナーゼ触媒ドメインから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0468】

実施の形態１５．前記機能ドメインは、ＴａｄＡ８ｅの全長又は機能断片である、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0469】

実施の形態１７．前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、スペーサー領域非特異性エンドヌクレアーゼバイパス活性を低減又は消失させるように修飾される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質。

【0470】

実施の形態１８．前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。

【0471】

実施の形態１９．前記ポリヌクレオチドは、真核細胞において発現するようにコドンによって最適化されている、前述実施の形態のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【0472】

実施の形態２０．前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～４０に示すいずれか一ヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９％、９９．５％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。

【0473】

実施の形態２１．前述実施の形態のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【0474】

実施の形態２２．前記ポリヌクレオチドは、プロモーターに動作可能に連結される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のベクター。

【0475】

実施の形態２３．前記プロモーターは、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、広域スペクトルプロモーター、細胞種特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターである、前述実施の形態のいずれか１項に記載のベクター。

【0476】

実施の形態２４．前記ベクターは、プラスミドである、前述実施の形態のいずれか１項に記載のベクター。

【0477】

実施の形態２５．前記ベクターは、レトロウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターである、前述実施の形態のいずれか１項に記載のベクター。

【0478】

実施の形態２６．前記ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２とＡＡＶ１３の組換えＡＡＶベクターから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のベクター。

【0479】

実施の形態２７．（１）送達媒体と、（２）前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質、ポリヌクレオチド又はベクターとを含む、送達システム。

【0480】

実施の形態２８．前記送達媒体は、ナノ粒子、リポソーム、エキソソーム、微小胞又は遺伝子銃である、前述実施の形態のいずれか１項に記載の送達システム。

【0481】

実施の形態２９．操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであって、
前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質、又は前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含み、前記ｃｒＲＮＡは、
標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズ可能なスペーサー領域と、
前記スペーサー領域に連結され且つ前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質と前記ｃｒＲＮＡとの結合をガイドして前記標的配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成することができるダイレクトリピート配列（ＤＲ）とを含む、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0482】

実施の形態３０．一つ又は複数のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであって、前記一つ又は複数のベクターは、
前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質をコードするヌクレオチド配列に動作可能に連結される第１の調節要素と、
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結される第２の調節要素とを含み、前記ｃｒＲＮＡは、
標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズ可能なスペーサー領域と、
前記スペーサー領域に連結され且つ前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質と前記ｃｒＲＮＡとの結合をガイドして前記標的配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成することができるダイレクトリピート配列（ＤＲ）とを含み、
ここで、前記第１の調節要素と前記第２の調節要素は、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓベクターシステムの同じ又は異なるベクター上に位置する、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0483】

実施の形態３１．操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体であって、
前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質と、
ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）とを含み、前記ｃｒＲＮＡは、
標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズ可能なスペーサー領域と、
前記スペーサー領域に連結されるダイレクトリピート配列（ＤＲ）とを含み、前記ＤＲは、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質と前記ｃｒＲＮＡとの結合をガイドする、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体。

【0484】

実施の形態３２．前記スペーサー領域の長さは、１６個のヌクレオチドよりも大きく、好ましくは１６から１００個のヌクレオチド、より好ましくは１６から５０個のヌクレオチド、より好ましくは１６から２７個のヌクレオチド、より好ましくは１７から２４個のヌクレオチド、より好ましくは１８から２４個のヌクレオチド、且つ最も好ましくは１８から２２個のヌクレオチドである、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0485】

実施の形態３３．前記ＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～２０のうちのいずれか一つに示すＤＲの二次構造と実質的に同じ二次構造を有する、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0486】

実施の形態３４．前記ＤＲは、ヌクレオチド付加、挿入、欠失又は置換を有し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～２０のうちのいずれか一つに示すＤＲと比べて二次構造の実質的な差異を生じない、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0487】

実施の形態３５．前記ＤＲは、前記ＤＲの３’末端近傍のステム－ループ構造を含み、
ここで、前記ステム－ループ構造は、５’－Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５ＮＮＮｎＮＮＮＸ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０－３’（Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、Ｘ_７、Ｘ_８、Ｘ_９とＸ_１０は、任意の塩基であり、ｎは、任意の核塩基又は欠失であり、Ｎは、任意の核塩基である）を含み、ここで、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５とＸ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０は、互いにハイブリダイズ可能である、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0488】

実施の形態３６．前記ＤＲは、以下のいずれか一つから選択されるステム－ループ構造を含み、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’ ＣＵＣＣＣＮＮＮＮＮＮＵＧＧＧＡＧ ３’、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’ ＣＵＣＣＵＮＮＮＮＮＮＵＧＧＧＡＧ ３’、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’ ＧＵＣＣＣＮＮＮＮＮＮＵＧＧＧＡＣ ３’、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’ ＧＵＧＵＣＮＮＮＮＮＮＵＧＡＣＡＣ ３’、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’ ＧＵＧＣＣＮＮＮＮＮＮＵＧＧＣＡＣ ３’、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’ ＵＧＵＧＵＮＮＮＮＮＮＵＣＡＣＡＣ ３’、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、及び
前記ＤＲの３’末端近傍の５’ ＣＣＧＵＣＮＮＮＮＮＮＵＧＡＣＧＧ ３’、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’ ＧＴＴＴＣＮＮＮＮＮＮＵＧＡＡＡＣ ３’、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’ ＧＴＧＴＴＮＮＮＮＮＮＵＡＡＣＡＣ ３’、ここで、Ｎは、任意の核塩基であり、
前記ＤＲの３’末端近傍の５’ ＴＴＧＴＣＮＮＮＮＮＮＵＧＡＣＡＡ ３’、ここで、Ｎは、任意の核塩基である、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0489】

実施の形態３７．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体は、前記スペーサー領域にハイブリダイズ可能な標的ＤＮＡをさらに含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0490】

実施の形態３８．前記標的ＤＮＡは、真核ＤＮＡである、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0491】

実施の形態３９．前記標的ＤＮＡは、細胞にあり、好ましくは前記細胞は、原核細胞、真核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、げっ歯動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類動物細胞、非ヒト霊長類動物細胞とヒト細胞から選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0492】

実施の形態４０．前記ｃｒＲＮＡは、前記標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズして複合体を形成し、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質による前記標的配列の切断を引き起こす、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0493】

実施の形態４１．前記標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’末端にある、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0494】

実施の形態４２．前記ＰＡＭは、５’－Ｔに富むモチーフを含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0495】

実施の形態４３．前記ＰＡＭは、５’－ＴＴＡ、５’－ＴＴＴ、５’－ＴＴＧ、５’－ＴＴＣ、５’－ＡＴＡ又は５’－ＡＴＧである、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0496】

実施の形態４４．前記一つ又は複数のベクターは、一つ又は複数のレトロウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、又はレンチウイルスベクターを含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0497】

実施の形態４５．前記ＡＡＶベクターは、血清型ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２とＡＡＶ１３の組換えＡＡＶベクターから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0498】

実施の形態４６．前記調節要素は、プロモーターを含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0499】

実施の形態４７．前記プロモーターは、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、広域スペクトルプロモーター、細胞種特異的プロモーター又は組織特異的プロモーターから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0500】

実施の形態４８．前記プロモーターは、真核細胞に機能を有する、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0501】

実施の形態４９．前記真核細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、げっ歯動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類動物細胞、非ヒト霊長類動物細胞とヒト細胞を含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0502】

実施の形態５０．前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体は、任意選択的に、相同性指向修復（ＨＤＲ）によって関心のある遺伝子座に挿入されるＤＮＡドナーテンプレートをさらに含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体。

【0503】

実施の形態５１．細胞又はその子孫であって、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣａｓ１２ｉタンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、送達システム、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体を含み、ここで、好ましくは、前記細胞は、原核細胞、真核細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、げっ歯動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類動物細胞、非ヒト霊長類動物細胞とヒト細胞から選択される、細胞又はその子孫。

【0504】

実施の形態５２．非ヒト多細胞生物であって、前述実施の形態のいずれか１項に記載の細胞又はその子孫を含み、好ましくは、前記非ヒト多細胞生物は、ヒト遺伝子関連疾患の動物（例えば、げっ歯動物又は非ヒト霊長類動物）モデルである、非ヒト多細胞生物。

【0505】

実施の形態５３．標的ＤＮＡを修飾する方法であって、標的ＤＮＡを前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体に接触させることを含み、前記接触は、前記標的ＤＮＡのＣａｓ１２ｉタンパク質による修飾を引き起こす、方法。

【0506】

実施の形態５４．前記修飾は、インビトロ細胞外部で発生する、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0507】

実施の形態５５．前記修飾は、インビトロ細胞内部で発生する、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0508】

実施の形態５６．前記修飾は、インビボ細胞内部で発生する、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0509】

実施の形態５７．前記細胞は、真核細胞である、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0510】

実施の形態５８．前記真核細胞は、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞、げっ歯動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類動物細胞、非ヒト霊長類動物細胞とヒト細胞から選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0511】

実施の形態５９．前記修飾は、前記標的ＤＮＡを切断することである、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0512】

実施の形態６０．前記切断は、ヌクレオチド配列の欠失及び／又はヌクレオチド配列の挿入を引き起こす、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0513】

実施の形態６１．前記切断は、二つの部位で前記標的核酸を切断し、前記二つの部位の間の配列の欠失又は反転を引き起こすことを含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0514】

実施の形態６２．前記修飾は、塩基変異であり、好ましくはＡ→Ｇ又はＣ→Ｔ塩基変異である、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0515】

実施の形態６３．前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法からの細胞又はその子孫であって、前記方法を受けていない細胞に存在しない修飾を含む、細胞又はその子孫。

【0516】

実施の形態６４．前記方法を受けていない細胞は、異常を含み且つ前記方法による前記細胞における異常は、既に解決又は修正されている、前述実施の形態のいずれか１項に記載の細胞又はその子孫。

【0517】

実施の形態６５．前述実施の形態のいずれか１項に記載の細胞又はその子孫からの細胞生成物であって、前記方法を受けていない細胞からの細胞生成物の性質又は量に対して、修飾されている、細胞生成物。

【0518】

実施の形態６６．前記方法を受けていない細胞は、異常を含み、且つ前記細胞生成物は、前記異常が既に前記方法によって解決又は修正されていることを反映する、前述実施の形態のいずれか１項に記載の細胞生成物。

【0519】

実施の形態６７．非標的ＤＮＡを非特異的に切断する方法であって、前記標的ＤＮＡを前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体と接触させることによって、前記スペーサー領域と前記標的ＤＮＡの標的配列とのハイブリダイズ及び前記標的配列の前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質による切断により、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質がスペーサー領域非特異性エンドヌクレアーゼバイパス活性によって前記非標的ＤＮＡを切断することを含む、方法。

【0520】

実施の形態６８．サンプルにおける標的ＤＮＡを検出する方法であって、
（１）前記サンプルを、前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム又は複合体及び切断後に検出可能なシグナルを放出することができるレポーター核酸と接触させることによって、前記スペーサー領域と前記標的ＤＮＡの標的配列とのハイブリダイズ及び前記標的配列の前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質による切断により、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質がスペーサー領域非特異性エンドヌクレアーゼバイパス活性によって前記レポーター核酸を切断することと、
（２）前記レポーター核酸の切断によって産生される検出可能なシグナルを測定することによって、前記サンプルにおける前記標的ＤＮＡの存在を検出することとを含む、方法。

【0521】

実施の形態６９．前記方法は、前記検出可能なシグナルのレベルと参照シグナルのレベルとを比較し、前記検出可能なシグナルのレベルに基づいて前記サンプルにおける前記標的ＤＮＡの含有量を決定することをさらに含む、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0522】

実施の形態７０．前記測定は、金ナノ粒子検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学の検出又は半導体ベースの検知を用いて行われる、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0523】

実施の形態７１．前記レポーター核酸は、蛍光発光色素対、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）対又はクエンチャ／蛍石対を含み、且つ前記レポーター核酸の前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質による切断により、前記レポーター核酸の切断によって産生される前記検出可能なシグナルのレベルが増加するか又は低減する、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0524】

実施の形態７２．それを必要とする被験体の病症又は疾患を治療する方法であって、前記被験体に前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを投与することを含む、方法。

【0525】

実施の形態７３．前記病症又は疾患は、癌又は感染性疾患又は神経疾患であり、
任意選択的に、前記癌は、
ウィルムス腫瘍、ユーイング肉腫、神経内分泌腫瘍、神経膠芽腫、神経芽細胞腫、黒色腫、皮膚癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、前立腺癌、肝癌、腎癌、膵癌、肺癌、胆道癌、子宮頸癌、子宮体癌、食道癌、胃癌、頭頚部癌、髄様甲状腺癌、卵巣癌、神経膠腫、リンパ腫、白血病、骨髄瘤、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫と膀胱癌から選択され、
任意選択的に、前記感染性疾患は、
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス－１（ＨＳＶ１）と単純ヘルペスウイルス－２（ＨＳＶ２）によって引き起こされ、
任意選択的に、前記神経疾患は、
緑内障、加齢に伴うＲＧＣの喪失、視神経損傷、網膜虚血、レーベル遺伝性視神経症、ＲＧＣニューロンの変性に関連する神経疾患、それを必要とする被験者の線条体の機能性ニューロン変性に関連する神経疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、統合失調症、うつ病、薬物依存症、運動障害（例えば舞踏病、舞踏病様症状と運動障害）、双極性障害、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）又は機能不全から選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0526】

実施の形態７４．前記病症又は疾患は、嚢胞性線維症、進行性偽肥大性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、α－１－アンチトリプシン欠乏症、ポンペ病、筋強直性ジストロフィー、ハンチントン病、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ失調症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、遺伝性慢性腎臓病、高脂血症、高コレステロール血症、レーベル先天性黒内障、鎌状赤血球症とβサラセミアから選択される、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0527】

実施の形態７５．前記病症又は疾患は、病原性点突然変異の存在によって引き起こされる、前述実施の形態のいずれか１項に記載の方法。

【0528】

実施の形態７６．前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み、好ましくは、前記システムの成分は、同の一容器又は単独の容器にある、キット。

【0529】

実施の形態７７．前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み、好ましくは、前記無菌容器は、注射器である、無菌容器。

【0530】

実施の形態７８．前述実施の形態のいずれか１項に記載のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを含み、好ましくは、前記ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、リザーバーに保存される、植え込み可能な装置。

【0531】

本開示は、以下の実施の形態をさらに提供する。

【0532】

項目１．操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムであって、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３と６のうちのいずれか一つと少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣａｓ１２ｉタンパク質、又は前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、
（２）ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含み、前記ｃｒＲＮＡは、
（ｉ）標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズ可能なスペーサー領域と、
（ｉｉ）前記スペーサー領域に連結され且つ前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質と前記ｃｒＲＮＡとの結合をガイドして前記標的配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成することができるダイレクトリピート配列（ＤＲ）とを含む、操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0533】

項目２．前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３と６のうちのいずれか一つの該当する親Ｃａｓ１２ｉタンパク質の、前記標的ＤＮＡの標的配列に対するスペーサー領域特異的エンドヌクレアーゼ切断活性を基本的に有さない、項目１に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0534】

項目３．前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の前記親Ｃａｓ１２ｉタンパク質配列のＤ７００、Ｄ６５０、Ｅ８７５とＤ１０４９の一つ又は複数から選択される位置にアミノ酸置換を含む、項目２に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0535】

項目４．前記アミノ酸置換は、Ｄ７００Ａ、Ｄ７００Ｖ、Ｄ６５０Ａ、Ｄ６５０Ｖ、Ｅ８７５Ａ、Ｅ８７５Ｖ、Ｄ１０４９Ａ、Ｄ１０４９Ｖ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ６５０Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｅ８７５Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ、Ｄ７００Ａ＋Ｄ６５０Ａ＋Ｄ１０４９Ａ、Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９ＡとＤ７００Ａ＋Ｄ６５０Ａ＋Ｅ８７５Ａ＋Ｄ１０４９Ａから選択される、項目３に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0536】

項目５．前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９～８２のうちのいずれか一つのアミノ酸配列を含む、項目３に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0537】

項目６．前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、一つ又は複数の機能ドメインに融合して融合タンパク質を形成する、項目２に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0538】

項目７．前記機能ドメインは、アデノシンデアミナーゼ触媒ドメイン、シチジンデアミナーゼ触媒ドメイン、ＤＮＡメチル化触媒ドメイン、ＤＮＡ脱メチル化触媒ドメイン、転写活性化触媒ドメイン、転写阻害触媒ドメイン、核外輸送シグナルと核局在化シグナルから選択される、項目６に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0539】

項目８．前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、ＴａｄＡ８ｅ又はその機能断片に融合して前記融合タンパク質を形成する、項目７に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0540】

項目９．前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５又は１８４のアミノ酸配列を含む、項目８に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0541】

項目１０．前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～３と６のうちのいずれか一つの前記親Ｃａｓ１２ｉタンパク質の、非標的ＤＮＡに対するスペーサー領域非特異性エンドヌクレアーゼバイパス活性を基本的に有さない、項目１に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0542】

項目１１．前記ＤＲは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１～２３、２６と１０１～１０６のうちのいずれか一つの前記ＤＲの二次構造と実質的に同じ二次構造を有する、項目１に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0543】

項目１２．前記ＤＲは、前記ＤＲの３’末端付近の、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４～１２３のうちのいずれか一つから選択されるステム－ループ構造を含み、ここで、Ｎは、任意の核塩基である、項目１１に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0544】

項目１３．前記標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３’末端にある、項目１に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0545】

項目１４．前記ＰＡＭは、５’－ＴＴＡ、５’－ＴＴＴ、５’－ＴＴＧ、５’－ＴＴＣ、５’－ＡＴＡと５’－ＡＴＧから選択される、項目１３に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0546】

項目１５．前記操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、同じ又は異なるベクター上に位置する、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとを含む、項目１に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0547】

項目１６．同じベクター上に位置する、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、前記ｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドとは、それぞれ調節要素に動作可能に連結される、項目１５に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0548】

項目１７．前記スペーサー領域の長さは、少なくとも約１６個のヌクレオチドである、項目１に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム。

【0549】

項目１８．標的ＤＮＡを修飾する方法であって、前記標的ＤＮＡを、項目１に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムと接触させることを含み、ここで、前記ｃｒＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡのスペーサー領域を介して前記標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズし、且つ、ここで、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、前記ｃｒＲＮＡに結合してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成し、前記標的ＤＮＡの標的配列を修飾する、方法。

【0550】

項目１９．前記修飾は、前記標的ＤＮＡの切断と、一塩基編集と、修復とのうちの一つ又は複数を含む、項目１８に記載の方法。

【0551】

項目２０．前記修飾は、前記標的ＤＮＡの修復を含み、且つ、ここで、前記方法は、修復テンプレートＤＮＡを導入することをさらに含む、項目１９に記載の方法。

【0552】

項目２１．前記修飾は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで発生する、項目１８に記載の方法。

【0553】

項目２２．項目１８に記載の方法から得られる細胞又はその子孫。

【0554】

項目２３．項目２２に記載の細胞又はその子孫を含む、非ヒト多細胞生物。

【0555】

項目２４．それを必要とする被験体の病症又は疾患を治療する方法であって、前記被験体に有効量の項目１に記載の操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを投与することを含み、ここで、前記病症又は疾患は、標的ＤＮＡにおける突然変異に関連し、ここで、前記ｃｒＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡのスペーサー領域を介して前記標的ＤＮＡの突然変異を含む標的配列にハイブリダイズし、ここで、前記Ｃａｓ１２ｉタンパク質は、前記ｃｒＲＮＡに結合してＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ複合体を形成し、前記標的ＤＮＡの標的配列を修飾し、且つ、ここで、前記標的ＤＮＡにおける前記突然変異の修飾は、前記病症又は疾患を治療する、方法。

【0556】

項目２５．前記病症又は疾患は、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、嚢胞性線維症、遺伝性血管浮腫、糖尿病、進行性偽肥大性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、α－１－アンチトリプシン欠乏症、ポンペ病、筋強直性ジストロフィー、ハンチントン病、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ失調症、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、遺伝性慢性腎臓病、高脂血症、高コレステロール血症、レーベル先天性黒内障、鎌状赤血球症とβサラセミアから選択される、項目２４に記載の方法。

【0557】

項目２６．前記病症又は疾患は、ＡＴＴＲである、項目２５に記載の方法。

【0558】

項目２７．前記操作された、天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、脂質ナノ粒子において投与される、項目２４に記載の方法。

【0559】

さらなる実施の形態を以下の実施例に説明しているが、これらの実施例は、説明のみを目的としており、本開示の範囲を制限することを意図するものではない。

【実施例】

【0560】

実施例
材料と方法
別段の指定がない限り、実施例で使用される実験方法は、一般的なものである。

【0561】

別段の指定がない限り、実施例で使用される材料、試薬などは、市販から入手可能である。

【0562】

別段の指定がない限り、実施例で以下の材料と実験方法を使用する。

【0563】

プラスミドベクターの構築。
金斯瑞有限責任公司（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）によってヒトコドン最適化されたＣａｓ１２ｉ、ＴａｄＡ８ｅとヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａ遺伝子を合成し、且つＧｉｂｓｏｎアセンブリによってクローニングしてｐＣＡＧ＿ＮＬＳ－Ｃａｓ１２ｉ－ＮＬＳ＿ｐＡ＿ｐＵ６＿ＢｐｉＩ＿ｐＣＭＶ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｐＡを生成した。ＨｕａＧｅｎｅ有限責任公司（ＨｕａＧｅｎｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）によってｃｒＲＮＡオリゴマーを合成し、アニーリングし、ＢｐｉＩ部位に産生してｐＣＡＧ＿ＮＬＳ－Ｃａｓ１２ｉ－ＮＬＳ＿ｐＡ＿ｐＵ６＿ｃｒＲＮＡ＿ｐＣＭＶ＿ｍＣｈｅｒｒｙ＿ｐＡを生成した。

【0564】

細胞培養、トランスフェクションとフローサイトメトリー分析。
この研究で使用された哺乳動物細胞株は、ＨＥＫ２９３ＴとＮ２Ａである。細胞を１０％ ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンとＧｌｕｔＭＡＸを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）を用いてトランスフェクションを行った。変異体スクリーニングについて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレートで培養し、且つ１２時間後、４μＬ ＰＥＩで２μｇのプラスミド（１μｇの発現プラスミドと１μｇのレポータープラスミド）をこれらの細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーターを用いてＢＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙとＥＧＦＰ蛍光を分析した。内在性遺伝子の標的部位における突然変異のアッセイについて、１μｇの発現プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ又はＮ２Ａ細胞にトランスフェクションし、そしてトランスフェクションの４８時間後にＢＤ ＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ Ｘ－２０フローサイトメーターを用いてそれを選別した。

【0565】

遺伝子編集頻度の検出。
２０μｌの開裂緩衝液（バザイム社（Ｖａｚｙｍｅ））において６０００個の選別細胞を開裂した。Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ超高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ（バザイム社）によってターゲッティング配列プライマーを合成し、ネステッドＰＣＲ増幅に使用した。ターゲッティングディープ配列分析を用いて挿入欠失頻度を決定した。ターゲッティングディープ配列分析又はＳａｎｇｅｒシーケンシングとＥｄｉｔＲによってＡからＧ又はＣからＴ編集頻度を計算した。ＡからＧ編集純度をＡからＧ編集効率／（ＡからＴ編集効率＋ＡからＣ編集効率＋ＡからＧ編集効率）として計算した。ＣからＴ編集純度をＣからＴ編集効率／（ＣからＡ編集効率＋ＣからＧ編集効率＋ＣからＴ編集効率）として計算した。

【0566】

ＰＥＭ－ｓｅｑ。
前述のように、ＨＥＫ２９３細胞においてＰＥＭ－ｓｅｑ^２３を行った。簡単に言えば、ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｕｌｔｒａ－ＡｓＣａｓ１２ａ、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ、ＡＢＲ００１又はＣａｓ１２ｉ２ＨｉＦｉ及び、ＴＴＲ．２を標的とするｃｒＲＮＡを含有する一体化プラスミドを、ＰＥＩを介してそれぞれＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、且つ４８時間後に陽性細胞を採取してＤＮＡ抽出を行った。Ｃｏｖａｒｉｓ超音波処理によって２０μｇのゲノムＤＮＡを断片化し、ピーク長は、３００－７００ｂｐである。５’末端において一輪のビオチン化プライマー伸長によってビオチンでＤＮＡ断片を標識し、そしてＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズによってプライマーを除去し、ストレプトアビジンビーズによって精製した。ストレプトアビジンビーズ上の一本鎖ＤＮＡを、１４－ｂｐ ＲＭＢを含有するブリッジアダプターに連結し、且つＰＣＲ生成物をネステッドＰＣＲしてベイトＤＳＢを含有するＤＮＡ断片を濃縮し、ｉｌｌｕｍｉｎｅアダプター配列で標識した。Ｈｉ－ｓｅｑ ２５００上において２ｘ１５０ｂｐで、製造されたシーケンシングライブラリをシーケンシングした。

【0567】

ＲＮＰ送達とエクスビボ編集。
１Ｘ ＰＢＳにおいて１：２のモル比で、精製されたｈｆＣａｓ１２Ｍａｘタンパク質と、化学合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチド（金斯瑞社）とを混合することによってＲＮＰを複合化した。ＲＮＰを室温下で１５ｍｉｎ以上インキュベートし、そしてＬｏｎｚａ(R) ４Ｄ－Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）でエレクトロポレーションを行った。０．２×１０^６個の細胞を２０μＬのＬｏｎｚａ緩衝液に再懸濁し、且つＬｏｎｚａ規範に基づいてエレクトロポレーションした異なる濃度の５μＬのＲＮＰと混合した。エレクトロポレーションの７２時間後にＨＥＫ２９３又はＣＤ３＋Ｔ細胞を採取し、ターゲッティングディープ配列分析を行った。

【0568】

ＬＮＰ送達とインビボ編集。
１００％エタノールにおいてＡＬＣ０３１５、コレステロール、ＤＭＧ－ＰＥＧ２ｋ、ＤＳＰＣでＬＮＰを調製し、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡと化学合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチド（金斯瑞社）とを担持し、重量比は、１：１である。製造業者の方案に従って、精密ナノシステムＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒベンチトップ計器を用いて脂質とＲＮＡ溶液マイクロ流体とを混合してＬＮＰを形成した。ＰＢＳで希釈したＬＮＰ以０．１、０．３、０．５、１μｇ ＲＮＡをＮ２ａ細胞にトランスフェクションし、又は尾静脈内注射により異なる投与量でＣ５７マウスに送達した。トランスフェクションの４８時間後に細胞を採取し、開裂とターゲッティングディープ配列分析を行った。インビボ編集について、注射の７日後に各マウスの左葉又は正中葉から肝臓組織を収集し、ＤＮＡ抽出とターゲッティングディープ配列分析に用いた。

【0569】

受精卵注射と胚培養。
５ＩＵ妊馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）を注射し、次いで４８時間後に５ＩＵヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を注射した、過剰排卵された雌Ｃ５７マウス（７－８週齢）をＢ６Ｄ２Ｆ１雄と交配させ、且つｈＣＧ注射の２０時間後に卵管から受精胚を採取した。受精卵注射について、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ ｍＲＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）とｓｇＲＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）とを混合し、且つ一定流量設定を有するＦｅｍｔｏＪｅｔマイクロシリンジ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、５ｍｇ／ｍｌのサイトカラシンＢ（ＣＢ）を含有するＨＥＰＥＳ－ＣＺＢ培地液滴における受精卵の細胞質に注射した。注射された受精卵を、しアミノ酸を有するＫＳＯＭ培地において３７℃で、５％ ＣＯ_２下で空気において胚盤胞まで培養し、採取してターゲッティングディープ配列分析を行った。

【0570】

実施例１ Ｃａｓ１２ｉタンパク質の同定及びＣａｓ１２ｉタンパク質を含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムのｄｓＤＮＡ切断活性の評価
より多くのＣａｓ１２ｉを同定するために、出願人は、Ｃａｓ１２ｉタンパク質、ＣＲＩＳＰＲアレイと予測されたＰＡＭの好みを注釈するバイオインフォマティクスパイプラインを開発して採用し、且つ次の表１における１０種類のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを同定した。

【0571】

【表4】

【0572】

これらのＣａｓ１２ｉの哺乳動物細胞における活性を評価するために、出願人は、Ｃａｓ媒介性ｄｓＤＮＡ切断又は二本鎖切断によって活性化された改良型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）シグナル強度の増加を検出するデュアルプラスミド蛍光レポーターシステムを設計した（図３Ａ）。このシステムは、ｍＣｈｅｒｒｙをコードする発現プラスミド、核局在化シグナル（ＮＬＳ）標識のＣａｓタンパク質及びそのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）又はｃｒＲＮＡ及びＢＦＰと活性化可能なＥＧｘｘＦＰカセットをコードするレポータープラスミド（即ち、ＥＧｘｘ－標的部位－ｘｘＦＰ）のコトランスフェクション ^１１に依存した。Ｃａｓ媒介性ＤＳＢと一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）媒介性修復によってＥＧＦＰ活性化を行った。

【0573】

特に、図３Ａを参照すると、レポータープラスミドは、ポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドは、５’から３’にＢＦＰ－Ｐ２Ａ－活性化可能なＥＧｘｘｘｘＦＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）（ＥＧｘｘ－挿入配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）（５’から３’にＣａｓ１２ｉのＴＴＣが含有されるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、プロトスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）（それが標的配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）の逆相補配列である）とＣａｓ９のＧＧＧのプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ））－ｘｘＦＰ）をコードし、次はｂＧＨ ｐｏｌｙＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８）コード配列であり、それは、ヒトＣＭＶプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４７）に動作可能に連結された。プロトスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）は、ＥＧＦＰ発現を阻止し、且つそのため、緑色蛍光シグナル放出を阻止する早期停止コドンＴＡＧを含有した。ＢＦＰコード配列は、青色蛍光によってレポータープラスミドの宿主細胞へのトランスフェクションの成功を指示するためにＢＦＰを発現した。

【0574】

ほとんどの既知のＣａｓ１２ｉタンパク質は、ｄｓＤＮＡにおける５’－Ｔに富むＰＡＭを認識したが、Ｃａｓ９は、ｄｓＤＮＡにおける３’－Ｇに富むＰＡＭを認識した。Ｃａｓ１２ｉのＴＴＣの５’ ＰＡＭ及びプロトスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）が側接するＣａｓ９のＧＧＧの３’ ＰＡＭの共存により、Ｃａｓ１２ｉとＣａｓ９のｄｓＤＮＡ切断活性の同時比較が可能となった。

【0575】

活性化可能なＥＧｘｘｘｘＦＰコード配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１
ａｔｇａｇｃｇａｇｃｔｇａｔｔａａｇｇａｇａａｃａｔｇｃａｃａｔｇａａｇｃｔｇｔａｔａｔｇｇａｇｇｇｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｃｃａｔｃａｃｔｔｃａａｇｔｇｃａｃａｔｃｃｇａｇｇｇｃｇａａｇｇｃａａｇｃｃｃｔａｃｇａｇｇｇｃａｃｃｃａｇａｃｃａｔｇａｇａａｔｃａａｇｇｔｇｇｔｃｇａｇｇｇｃｇｇｃｃｃｔｃｔｃｃｃｃｔｔｃｇｃｃｔｔｃｇａｃａｔｃｃｔｇｇｃｔａｃｔａｇｃｔｔｃｃｔｃｔａｃｇｇｃａｇｃａａｇａｃｃｔｔｃａｔｃａａｃｃａｃａｃｃｃａｇｇｇｃａｔｃｃｃｃｇａｃｔｔｃｔｔｃａａｇｃａｇｔｃｃｔｔｃｃｃｔｇａｇｇｇｃｔｔｃａｃａｔｇｇｇａｇａｇａｇｔｃａｃｃａｃａｔａｃｇａｇｇａｃｇｇｇｇｇｃｇｔｇｃｔｇａｃｃｇｃｔａｃｃｃａｇｇａｃａｃｃａｇｃｃｔｃｃａｇｇａｃｇｇｃｔｇｃｃｔｃａｔｃｔａｃａａｃｇｔｃａａｇａｔｃａｇａｇｇｇｇｔｇａａｃｔｔｃａｃａｔｃｃａａｃｇｇｃｃｃｔｇｔｇａｔｇｃａｇａａｇａａａａｃａｃｔｃｇｇｃｔｇｇｇａｇｇｃｃｔｔｃａｃｃｇａｇａｃａｃｔｇｔａｃｃｃｃｇｃｔｇａｃｇｇｃｇｇｃｃｔｇｇａａｇｇｃａｇａａａｃｇａｃａｔｇｇｃｃｃｔｇａａｇｃｔｃｇｔｇｇｇｃｇｇｇａｇｃｃａｔｃｔｇａｔｃｇｃａａａｃａｔｃａａｇａｃｃａｃａｔａｔａｇａｔｃｃａａｇａａａｃｃｃｇｃｔａａｇａａｃｃｔｃａａｇａｔｇｃｃｔｇｇｃｇｔｃｔａｃｔａｔｇｔｇｇａｃｔａｃａｇａｃｔｇｇａａａｇａａｔｃａａｇｇａｇｇｃｃａａｃａａｃｇａｇａｃａｔａｃｇｔｃｇａｇｃａｇｃａｃｇａｇｇｔｇｇｃａｇｔｇｇｃｃａｇａｔａｃｔｇｃｇａｃｃｔｃｃｃｔａｇｃａａａｃｔｇｇｇｇｃａｃａａｇｃｔｇａａｔｇａａｔｔｃｇａｇｇｇｃａｇｇｇｇｃａｇｃｃｔｇｃｔｇａｃｃｔｇｃｇｇｃｇａｃｇｔｇｇａｇｇａｇａａｃｃｃｃｇｇｃｃｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇｃｔｇｔｔｃａｃｃｇｇｇｇｔｇｇｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｇｔｃｇａｇｃｔｇｇａｃｇｇｃｇａｃｇｔａａａｃｇｇｃｃａｃａａｇｔｔｃａｇｃｇｔｇｔｃｃｇｇｃｇａｇｇｇｃｇａｇｇｇｃｇａｔｇｃｃａｃｃｔａｃｇｇｃａａｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａｃｃｇｇｃａａｇｃｔｇｃｃｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｃａｃｃｃｔｃｇｔｇａｃｃａｃｃｃｔｇａｃｃｔａｃｇｇｃｇｔｇｃａｇｔｇｃｔｔｃａｇｃｃｇｃｔａｃｃｃｃｇａｃｃａｃａｔｇａａｇｃａｇｃａｃｇａｃｔｔｃｔｔｃａａｇｔｃｃｇｃｃａｔｇｃｃｃｇａａｇｇｃｔａｃｇｔｃｃａｇｇａｇｃｇｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｔｃａａｇｇａｃｇａｃｇｇｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃｃｇｃｇｃｃｇａｇｇｔｇａａｇｔｔｃｇａｇｇｇｃｇａｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａａｃｃｇｃａｔｃｇａｇｃｔｇａａｇｇｇｃａｔｃｇａｃｔｔｃａａｇｇａｇｇａｃｇｇｃａａｃａｔｃｃｔｇｇｇｇｃａｃａａｇｃｔｇｇａｇｔａｃａａｃｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａｃｇｔｃｔａｔａｔｃａｔｇｇｃｃｇａｃａａｇｃａｇａａｇａａｃｇｇｃａｔｃａａｇｇｔｇａａｃｔｔｃａａｇａｔｃｃｇｃｃａｃａａｃａｔｃｇａｇｇａｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃａｇｃｔｃｇｃｃｇａｃｃａｃｔａｃｃａｇｃａｇａａｃａｃｃＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧｇｃｃａｃｃｔａｃｇｇｃａａｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａｃｃｇｇｃａａｇｃｔｇｃｃｃｇｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｃａｃｃｃｔｃｇｔｇａｃｃａｃｃｃｔｇａｃｃｔａｃｇｇｃｇｔｇｃａｇｔｇｃｔｔｃａｇｃｃｇｃｔａｃｃｃｃｇａｃｃａｃａｔｇａａｇｃａｇｃａｃｇａｃｔｔｃｔｔｃａａｇｔｃｃｇｃｃａｔｇｃｃｃｇａａｇｇｃｔａｃｇｔｃｃａｇｇａｇｃｇｃａｃｃａｔｃｔｔｃｔｔｃａａｇｇａｃｇａｃｇｇｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃｃｇｃｇｃｃｇａｇｇｔｇａａｇｔｔｃｇａｇｇｇｃｇａｃａｃｃｃｔｇｇｔｇａａｃｃｇｃａｔｃｇａｇｃｔｇａａｇｇｇｃａｔｃｇａｃｔｔｃａａｇｇａｇｇａｃｇｇｃａａｃａｔｃｃｔｇｇｇｇｃａｃａａｇｃｔｇｇａｇｔａｃａａｃｔａｃａａｃａｇｃｃａｃａａｃｇｔｃｔａｔａｔｃａｔｇｇｃｃｇａｃａａｇｃａｇａａｇａａｃｇｇｃａｔｃａａｇｇｔｇａａｃｔｔｃａａｇａｔｃｃｇｃｃａｃａａｃａｔｃｇａｇｇａｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃａｇｃｔｃｇｃｃｇａｃｃａｃｔａｃｃａｇｃａｇａａｃａｃｃｃｃｃａｔｃｇｇｃｇａｃｇｇｃｃｃｃｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃｇａｃａａｃｃａｃｔａｃｃｔｇａｇｃａｃｃｃａｇｔｃｃｇｃｃｃｔｇａｇｃａａａｇａｃｃｃｃａａｃｇａｇａａｇｃｇｃｇａｔｃａｃａｔｇｇｔｃｃｔｇｃｔｇｇａｇｔｔｃｇｔｇａｃｃｇｃｃｇｃｃｇｇｇａｔｃａｃｔｃｔｃｇｇｃａｔｇｇａｃｇａｇｃｔｇｔａｃａａｇｔａａ
挿入配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２
ＧＧＡＴＣＣＧＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧ
プロトスペーサー配列（標的配列の逆相補配列）、２０ｂｐ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３
ＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ
Ｃａｓ１２ｉの標的配列、２０ｎｔ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４
ＧＴＡＴＧＣＴＣＣＴＡＣＴＧＴＡＡＴＧＧ
ＥＧｘｘｘｘＦＰターゲッティングスペーサー配列、２０ｎｔ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５
ＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ
非ターゲッティング（「ＮＴ」）スペーサー配列、２０ｎｔ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６
ＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴＡＡＧＡＡＧＡＣＣＴ
Ｃａｓ１２ｉのＰＡＭ
ＴＴＣ
Ｃａｓ９のＰＡＭ
ＧＧＧ

【0576】

図３Ａをさらに参照すると、発現プラスミドは、５’から３’まで、ｉ）コドン最適化されいて哺乳動物細胞において発現するためのＣａｓ１２ｉコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１－４０）であって、それは、５’末端においてＳＶ４０ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４）コード配列に側接し、且つ３’末端においてＮＰ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４５）コード配列に側接し、次いでＣＡＧプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５００）に動作可能に連結されるｂＧＨ ｐｏｌｙＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８）コード配列であるＣａｓ１２ｉコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１－４０）と、ｉｉ）５’－ＤＲ配列－スペーサー配列－３’に構成され且つヒトＵ６プロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４６）に動作可能に連結される、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする配列と、ｉｉｉ）ｍＣｈｅｒｒｙのコード配列であって、次いでヒトＣＭＶプロモーター（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４７）に動作可能に連結されるｂＧＨ ｐｏｌｙＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８）コード配列であるｍＣｈｅｒｒｙのコード配列とを含んだ。ｍＣｈｅｒｒｙコード配列は、赤色蛍光によってプラスミドの宿主細胞へのトランスフェクションの成功を発現することを指示するためにｍＣｈｅｒｒｙを発現した。

【0577】

標的ｄｓＤＮＡの標的鎖上の標的配列と非標的鎖上のプロトスペーサー配列がいずれもｇＲＮＡガイドのＣａｓ１２ｉポリペプチドによって切断されて二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することに成功した場合、その後のＤＮＡ修復（例えば、ＤＳＢによって誘発された一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によって媒介される修復）は、ＥＧＦＰを発現するためにＥＧＦＰコード配列を回復し、緑色蛍光発光は、ｄｓＤＮＡ切断活性を指示した。

【0578】

テスト群について、ｇＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１－６０）に含まれる、各テストＣａｓ１２ｉポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０）用のスペーサー配列は、ＥＧｘｘｘｘＦＰターゲッティングスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）であり、該スペーサー配列は、標的配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）を標的とし、且つそれにハイブリダイズするように設計され、且つｇＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１－６０）におけるＤＲ配列は、各テストＣａｓ１２ｉポリペプチド（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１～１０）に対応するＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１～２０）であり、表２に示すとおりである。

【0579】

【表5】

【0580】

各テストＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（Ｃａｓ１２ｉ、ＳｐＣａｓ９、ＬｂＣａｓ１２ａ）の陰性対照（「ＮＴ」）について、標的配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）にハイブリダイズできない非ターゲッティングスペーサー配列（「ＮＴ」、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）でＥＧｘｘｘｘＦＰターゲッティングスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）を代替し、同時に各ＣＲＩＳＰＲシステムの他の要素を保持した。

【0581】

陽性対照について、次の表３に示すＣＲＩＳＰＲ－ＳｐＣａｓ９とＣＲＩＳＰＲ－ＬｂＣａｓ１２ａシステムでテストしたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ｉシステムを代替し、ここで、同じＥＧｘｘｘｘＦＰターゲッティングスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）と該当するｃｒＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８又は５０）を用いた。また、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｐＣａｓ９システムについて、ｇＲＮＡは、５’－スペーサー配列－足場配列－３’の配置を呈した。

【0582】

【表6】

【0583】

標準方法に従ってＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ウェル組織培養プレートにおいて１２時間培養し、そして標準ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションを用いてレポータープラスミドと発現プラスミドコを細胞にトランスフェクションした。そして、トランスフェクションされた細胞を３７℃で、５％ ＣＯ_２下で４８時間培養した。そして、フローサイトメトリーによって培養細胞のＢＦＰ、ＥＧＦＰとｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナルを分析した。「ブランク」対照群も設定しており、ここで、レポータープラスミドのみをトランスフェクションし、且つ発現プラスミドを導入しなかった。

【0584】

Ｃａｓタンパク質のｄｓＤＮＡ切断活性をＢＦＰとｍＣｈｅｒｒｙ二重陽性細胞におけるＥＧＦＰ陽性細胞の百分率（「ＥＧＦＰ^＋」、レポータープラスミド上の指示標的部位におけるｄｓＤＮＡ切断を指示し、「ｍＣｈｅｒｒｙ^＋ ＢＦＰ^＋」、発現プラスミドとレポータープラスミドのコトランスフェクションと共発現の成功を指示した）として計算した。％ＥＧＦＰ^＋／ｍＣｈｅｒｒｙ^＋ ＢＦＰ^＋が高いほど、ｄｓＤＮＡ切断活性が高くなった。

【0585】

このデュアルプラスミド蛍光レポーターシステムを用いて、五種類のＣａｓ１２ｉ（Ｃａｓ１２ｉ３、Ｃａｓ１２ｉ７、Ｃａｓ１２ｉ１０、Ｃａｓ１２ｉ１１とＣａｓ１２ｉ１２）が、ターゲッティングｇＲＮＡ誘導によるＥＧＦＰ発現の著しい活性化を示すことが観察され、それによって著しいｄｓＤＮＡ切断を指示し（図１Ａ、図３Ｂ）、ここで、Ｃａｓ１２ｉ１２（本明細書においてＳｉＣａｓ１２ｉ又はｘＣａｓ１２ｉとも呼ばれる）は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって決定されるように、ＬｂＣａｓ１２ａ又はＳｐＣａｓ９よりも高いｄｓＤＮＡ切断を示した（図１Ａ）。ＳｐＣａｓ９及びＬｂＣａｓ１２ａと比べて、ｘＣａｓ１２ｉの寸法がより小さかった（図４Ａ）。

【0586】

実施例２ ｘＣａｓ１２ｉの有効スペーサー配列長さの評価
実施例１におけるデュアルプラスミド蛍光レポーターシステムを用いて、ｘＣａｓ１２ｉの有効スペーサー配列長さをテストするために、実施例１におけるＧＦｘｘｘｘＦＰレポータープラスミドの挿入配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）の該当するプロトスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１－８１でもある）の逆相補配列を標的とし、それにハイブリダイズし、且つ２０ｎｔスペーサー配列がちょうど実施例１におけるＥＧｘｘｘｘＦＰターゲッティングスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）となるように、１０～５０ｎｔの範囲を有する異なる長さのスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５と６１－８１、以下の表４に示す）を設計した。別のスペーサー領域の長さを評価するために、レポータープラスミドにおけるＥＧｘｘｘｘＦＰターゲッティングスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）を該当する長さのスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１－８１）に置き換え、同時にデュアルプラスミド蛍光レポーターシステムの他の要素を保持した。

【0587】

【表7】

【0588】

実施例１における実験手順を使用することにより、少なくとも１６個のヌクレオチドのスペーサー配列長さ範囲がｘＣａｓ１２ｉの活性に有効であり、且つこの範囲内において、１７－２２ｎｔが最適であることが観察された（図４Ｂ）。

【0589】

実施例３ ｘＣａｓ１２ｉのＰＡＭ認識の評価
Ｃａｓ１２ｉの５’－ＴＴＮ ＰＡＭの好みを考慮すると、出願人は、実施例１におけるデュアルプラスミド蛍光レポーターシステムを用いてＮＴＴＮ ＰＡＭ同定アッセイを行い、ここで、様々な５’ ＰＡＭでＴＴＣの元の５’ ＰＡＭを代替し、同時にデュアルプラスミド蛍光レポーターシステムの他の要素を保持した。

【0590】

実施例１における実験手順を使用することにより、ｘＣａｓ１２ｉが、５’－ＮＴＴＮ ＰＡＭ配列を有する標的部位において一貫して高いＥＧＦＰ活性化頻度を示し、ここで、ＮがＡ、Ｔ、Ｃ又はＧであり、ＬｂＣａｓ１２ａが５’－ＴＴＴＮ ＰＡＭにおいて同等な活性を有することがそれぞれ観察された（図４Ｃ）。

【0591】

実施例４ ＤＲ配列のｘＣａｓ１２ｉのｄｓＤＮＡ切断活性に対する影響
ｘＣａｓ１２ｉの元のＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）が突然変異に耐えられるかどうかをテストするために、出願人は、元のＤＲ配列の二次構造を破壊することなく、元のＤＲ配列を切断してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０１と５０２の二つの機能断片ＤＲ－Ｔ１とＤＲ－Ｔ２をそれぞれ生成し、且つそしてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：５０３～５０７のＤＲ－Ａ、ＤＲ－Ｂ、ＤＲ－Ｃ、ＤＲ－ＤとＤＲ－Ｅ配列をそれぞれ生成するように、ＤＲ－Ｔ２の五種類のＤＲ変異体を設計し、各配列は、元のＤＲ配列の二次構造を破壊することなく（即ちＤＲ変異体の二次構造は、元のＤＲ配列の二次構造と基本的に同じである）、ステムループ領域に５％～３０％の突然変異を含有した。

【0592】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０１ ＤＲ－Ｔ１、３０ｎｔ
ＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＣＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０２ ＤＲ－Ｔ２配列、２３ｎｔ
ＡＧＡＡＡＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＣＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０３ ＤＲ－Ａ配列、２３ｎｔ
ＡＧＡＡＡＴＣＣＧＴＣＣＴＴＡＧＴＴＧＡＣＧＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０４ ＤＲ－Ｂ配列、２２ｎｔ
ＡＧＡＣＡＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０５ ＤＲ－Ｃ配列、２３ｎｔ
ＡＧＡＡＡＴＧＴＴＴＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＡＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０６ ＤＲ－Ｄ配列、２３ｎｔ
ＡＧＡＡＡＴＧＴＧＴＴＣＣＣＡＧＴＴＡＡＣＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０７ ＤＲ－Ｅ配列、２３ｎｔ
ＡＧＡＡＡＴＴＴＧＴＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＣＡＡ

【0593】

実施例１におけるｘＣａｓ１２ｉのデュアルプラスミド蛍光レポーターシステムを使用することにより、元のＤＲ配列をＤＲ変異体（ＤＲ－Ｔ１、ＤＲ－Ｔ２、ＤＲ－Ａ、ＤＲ－Ｂ、ＤＲ－Ｃ、ＤＲ－ＤとＤＲ－Ｅ）の各種に置き換え、同時にレポーターシステムの他の要素を保持した結果（図２１）、ｘＣａｓ１２ｉが依然として様々なＤＲ配列変異体を有するｇＲＮＡによって媒介される高いｄｓＤＮＡ切断活性を示すことが示された。上記から分かるように、ＤＲ配列の二次構造を維持することを条件とし（即ち、ＤＲ変異体の二次構造は、元のＤＲ配列の二次構造と基本的に同じである）、ＣＲＩＳＰＲ－ＳｉＣａｓ１２ｉシステムは、ｄｓＤＮＡ切断活性に損失がなく、ＤＲ配列上のミスマッチ又は欠失に耐えられ、且つＤＲ配列変化に対して広い適応性を有した。これらのデータは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（３６ｎｔ）の元のｘＣａｓ１２ｉ ＤＲ配列の二つの機能切断バージョン、即ちＤＲ－Ｔ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０１、３０ｎｔ）とＤＲ－Ｔ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０２、２３ｎｔ）が、依然としてｘＣａｓ１２ｉを媒介できる高いｄｓＤＮＡ切断活性をさらに証明した。

【0594】

実施例５ 内在性遺伝子におけるｘＣａｓ１２ｉのｄｓＤＮＡ切断活性の評価
哺乳動物細胞における内在性遺伝子におけるｘＣａｓ１２ｉのｄｓＤＮＡ切断活性（ゲノム切断）をさらに検証するために、出願人は、ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚腎２９３細胞）におけるヒトＴＴＲ^１２遺伝子とヒトＰＣＳＫ９^１３遺伝子又はＮ２ａ細胞（快速生長するマウス神経芽腫細胞株であるＮｅｕｒｏ２ａ細胞）におけるマウスＴｔｒ遺伝子を標的とする３７部位のｇＲＮＡで、実施例１においてＮＬＳ標識のｘＣａｓ１２ｉをコードする発現プラスミドをトランスフェクションした（図３Ａ、図４Ｄ）。実施例１におけるＥＧｘｘｘｘＦＰターゲッティングスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）を該当する遺伝子ターゲッティングスペーサー配列（表５におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２－１２６）に置き換え、ＤＲ－Ｔ１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０１）で元のＤＲ配列を代替し（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）（且つ別段の指定がない限り、以下の実施例においても同様）、同時に実施例１におけるＣＲＩＳＰＲ－ｘＣａｓ１２ｉシステムの他の要素を保持した。トランスフェクションの４８時間後にＦＡＣＳとターゲッティングディープシーケンシングで、これらの遺伝子座におけるｄｓＤＮＡ切断活性、即ち挿入欠失（挿入及び／又は欠失）の形成を測定した。

【0595】

ｘＣａｓ１２ｉが、Ｔｔｒ、ＴＴＲとＰＣＳＫ９由来のほとんどの部位において高頻度（最大９０％）の挿入欠失形成を媒介し、平均挿入欠失形成率が５０％を超えたことが観察された（図４Ｅ－Ｆ）。これらのデータは、ｘＣａｓ１２ｉが哺乳動物細胞において頑強なゲノム編集効率を示すことを指示し、それによってそれが治療性ゲノム編集応用において優れた潜在力を有することを示した。

【0596】

【表8-1】

【表8-2】

【0597】

実施例６ ｘＣａｓ１２ｉ突然変異体の開発及びそのｄｓＤＮＡ切断活性の評価
ｘＣａｓ１２ｉの活性を改変し、そのＰＡＭ部位認識範囲を拡大するために、出願人は、突然変異誘発によってｘＣａｓ１２ｉタンパク質を操作し、且つ、実施例１におけるデュアルプラスミド蛍光レポーターシステムに類似するデュアルプラスミド蛍光レポーターシステムを用いて、より効率かつ広範なＰＡＭを有する変異体をスクリーニングし、相違点は、ＥＧｘｘｘｘＦＰターゲッティングガイドＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１）コード配列がｘＣａｓ１２ｉコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）とともに発現プラスミド上に位置するのではなく、ＢＦＰ－Ｐ２Ａ－ＥＧｘｘｘｘＦＰコード配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）とともにレポータープラスミド上に位置することである（図１Ｂにおける「オンターゲットレポーター遺伝子」を参照する）。ｘＣａｓ１２ｉの予測性構造分析と組み合わせて、出願人は、ｘＣａｓ１２ｉのＰＩドメイン（アミノ酸残基位置１７３～２９１）、ＲＥＣ－Ｉドメイン（アミノ酸残基位置４２７～４７３）とＲｕｖＣ－ＩＩドメイン（アミノ酸残基位置８００～１０８２）においてアルギニン（Ｒ）スキャニング突然変異誘発方法を行うことによって、５００種類以上のｘＣａｓ１２ｉ突然変異体のライブラリを生成し、ここで、Ｒで単一の非Ｒアミノ酸置換を行った。発現プラスミド上のｘＣａｓ１２ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）コード配列を各種類のｘＣａｓ１２ｉ突然変異体をコードする配列に置き換え、ＤＲ－Ｔ１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０１）で元のＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）を代替し、同時にレポーターシステムの他の要素を保持した。そして、出願人は、発現プラスミドとレポータープラスミドを単独でＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、ＦＡＣＳによってそれを分析した（図１Ｂ）。

【0598】

陰性対照（「ＮＴ」）について、標的配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）にハイブリダイズできない非ターゲッティングスペーサー配列（「ＮＴ」、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）でＥＧｘｘｘｘＦＰターゲッティングスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）を代替し、且つｘＣａｓ１２ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）と組み合わせて使用し、同時にレポーターシステムの他の要素を保持した。

【0599】

陽性対照（「ＷＴ」）について、元のｘＣａｓ１２ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を使用した。

【0600】

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【表9-4】

【0601】

ＥＧＦＰを活性化した細胞を有する蛍光強度に基づいて、１９２種類のｘＣａｓ１２ｉ突然変異体が野生型（ＷＴ）ｘＣａｓ１２ｉ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）に対して増加したｄｓＤＮＡ切断活性（図５Ａ、表６）を示し、且つ、そのうちの１種類である突然変異体ｘＣａｓ１２ｉ－Ｎ２４３Ｒ（Ｃａｓ１２Ｍａｘと呼ばれる）が約３．６倍の改善を示したことが観察された（図５Ａ）。また、５１種類のｘＣａｓ１２ｉ突然変異体は、ＷＴ ｘＣａｓ１２ｉに対して５％以下のｄｓＤＮＡ切断活性（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を有した。

【0602】

そして、出願人は、Ｎ２４３に対して飽和突然変異誘発を行い、且つＲへの突然変異が確かに最も高いｄｓＤＮＡ切断活性を示したことが観察された（図６Ａ）。

【0603】

次に、出願人は、蛍光レポーターシステムを用いてＤＭＤ又はＴｔｒ部位（ＤＭＤ又はＴｔｒプロトスペーサーを含有する挿入配列及び表５に列挙された該当する５’ ＰＡＭで挿入配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２）を代替する）を標的とし、且つＷＴ ｘＣａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２Ｍａｘに対して明らかに増加したＥＧＦＰ活性化頻度を提示したことが観察された（図１Ｃ、図６Ｂ－Ｃ）。

【0604】

Ｃａｓ１２Ｍａｘのターゲッティング遺伝子座における効能をさらにテストするために、出願人は、合計８個のｇＲＮＡを設計してＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＴＲとＰＣＳＫ９部位を標的とし、且つ別の三つのｇＲＮＡを設計してＮ２ａ細胞におけるＴｔｒ（表５）を標的とし、且つＤＲ－Ｔ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０２）を使用した。以前の結果と一致して、ＷＴ ｘＣａｓ１２ｉと比べて、Ｃａｓ１２Ｍａｘは、著しく増加した挿入欠失頻度を示した（図１Ｄ）。

【0605】

実施例７ Ｃａｓ１２Ｍａｘに基づく突然変異体のさらなる開発及びそのオフターゲットｄｓＤＮＡ切断活性の評価
Ｃａｓ１２Ｍａｘの特異性を検査するために、出願人は、ＴＴＲ^１２を標的とするｇＲＮＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０を有するＴＴＲターゲッティング（オンターゲット）スペーサー配列）で、Ｃａｓ１２Ｍａｘを発現するために設計された構築体をトランスフェクションし、且つＣａｓ－ＯＦＦｉｎｄｅｒ^１７によって予測されたオンターゲットとオフターゲット（ＯＴ）部位の挿入欠失頻度分析を行った。

【0606】

【表10】

【0607】

オフターゲットｄｓＤＮＡ切断活性を評価するためのデュアルプラスミド蛍光レポーターシステム（オフターゲットレポーターシステムであって、図１Ｂにおける「オフターゲットレポーター遺伝子」を参照する）を確立し、それは、実施例５におけるｄｓＤＮＡ切断活性を評価するためのデュアルプラスミド蛍光レポーターシステムに類似し、相違点は、ＥＧｘｘｘｘＦＰコード配列の挿入配列がＴＴＲオフターゲットプロトスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７－１２９）を含有し、該プロトスペーサー配列が、ＴＴＲプロトスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０でもある）を含有することではなく、ＴＴＲターゲッティングスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）との一つ又は複数のミスマッチ（太字、下線）を含有し、且つＤＲ－Ｔ１配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０１）を使用したことである。

【0608】

オフターゲットレポーターシステム（図７Ａ）又は内在性遺伝子のターゲッティングディープ配列分析（図７Ｂ）を用いて、出願人は、Ｃａｓ１２Ｍａｘが標的部位（「ＯＮ．１」）を効果的に編集し、同時に３つの予測オフターゲット部位（「ＯＴ．１」、「ＯＴ．２」と「ＯＴ．３」）の２つ（「ＯＴ．１」と「ＯＴ．２」）において挿入欠失形成を引き起こすことによって、オフターゲットｄｓＤＮＡ切断活性を指示したことが観察された。

【0609】

Ｃａｓ１２Ｍａｘのオフターゲット活性を消失させるために、出願人は、実施例５においてＲＥＣとＲｕｖＣドメインに単一の突然変異^１８を有し、且つオンターゲット切断活性が弱まっていない（ＷＴに相当する）それらの突然変異体を選択し、且つそしてそれぞれＴＴＲ ＯＴ１とＯＴ２を有する上記二つのオフターゲットレポーターシステムを用いてそのオフターゲットｄｓＤＮＡ切断活性をテストした（図１Ｂ）。

【0610】

四つのｘＣａｓ１２ｉ突然変異体（ｘＣａｓ１２ｉ－Ｖ８８０Ｒ（ｖ４．１）、ｘＣａｓ１２ｉ－Ｍ９２３Ｒ（ｖ４．２）、ｘＣａｓ１２ｉ－Ｄ８９２Ｒ（ｖ４．３）とｘＣａｓ１２ｉ－Ｇ８８３Ｒ（ｖ４．４））が高レベルのオンターゲットｄｓＤＮＡ切断活性を維持し、且つＴＴＲ ＯＴ１とＯＴ２の二箇所においてオフターゲットｄｓＤＮＡ切断活性を基本的に有さないように示したことが観察された（図８Ａ）。

【0611】

出願人は、さらにこの４種類のアミノ酸置換のうちの一つ又は複数をＮ２４３Ｒ又はＮ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒと組み合わせて（図８Ｂ）、且つ変異体ｖ６．３（Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｄ８９２Ｒ）がＯＴ．１とＯＴ．２部位において最も低いオフターゲットＥＧＦＰ活性化を示したが、ＯＮ．１部位において高いオンターゲットを示したことが観察された（図８Ｂ－Ｃ）。ＨＥＫ２９３Ｔにおける内在性ＴＴＲ．２部位及びそのオフターゲット部位のターゲッティングディープシーケンシング分析により、Ｃａｓ１２Ｍａｘと比べて、ｖ６．３（Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｄ８９２Ｒ）が６つのＯＴ部位においてオフターゲット挿入欠失頻度を著しく低減させ、且つＯＮ部位においてオンターゲットを保持したことが示された（図１Ｅ）。また、Ｃａｓ１２Ｍａｘ（ｖ１．１）、ｖ６．３（Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ＋Ｄ８９２Ｒ）に対してＤＭＤ．１、ＤＭＤ．２とＤＭＤ．３部位において同等又はひいてはより高いオンターゲット活性を保持した（図８Ｄ）。そのため、出願人は、ｖ６．３を高忠実度Ｃａｓ１２Ｍａｘ（ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ）と命名した。

【0612】

【表11】

【0613】

また、ｈｆＣａｓ１２ＭａｘのＰＡＭの好みを研究するために、出願人は、実施例３に類似しており、同じ標的配列を有するが異なるＰＡＭを有するレポータープラスミドを設計することによって５’－ＮＮＮ ＰＡＭ認識アッセイを行った。５’－ＴＴＮ ＰＡＭを有する部位において一致するか又はそれ以上の切断活性を示すことに加えて、一般的に使用されているＣａｓ１２^７，１９（ＬｂＣａｓ１２ａ、Ｕｌｔｒａ－ＡｓＣａｓ１２ａ）及び最近報告された改良されたＣａｓ１２ｉ２^{２０，２１}（ＡＢＲ００１、Ｃａｓ１２ｉ２^ＨｉＦｉ）と比べて、ｈｆＣａｓ１２ＭａｘとＣａｓ１２ＭａｘがＴＮＮ、ＡＴＮ、ＧＴＮとＣＴＮ ＰＡＭ部位を有するターゲットに対して類似した高い切断活性を示した（図１Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘが高度に柔軟な５’－ＴＮ又は５’－ＴＮＮ ＰＡＭ認識を有する効率的な編集活性を示したことを証明した。

【0614】

実施例８ ＴＴＲ遺伝子におけるｈｆＣａｓ１２ＭａｘのオンターゲットとオフターゲットｄｓＤＮＡ切断活性の検証と比較
ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘのヒト細胞における性能を全面的に評価するために、出願人は、様々なＣａｓヌクレアーゼを対象にＴＴＲのエクソンに多数の標的部位を設計した。別段の指定がない限り、本実施例と後続の実施例でＤＲ－Ｔ２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０２）を使用した。

【0615】

ＴＴＮ ＰＡＭを有するｈｆＣａｓ１２Ｍａｘの４３部位、ＴＴＮ ＰＡＭを有するＡＢＲ００１（ＺＨＡＮＧ Ｆｅｎｇ教授の操作されたＣａｓ１２ｉ２由来）の４３部位、ＴＴＮ ＰＡＭを有するＣａｓ１２ｉ２^ＨｉＦｉ（ＬＩ Ｗｅｉ教授）の４３部位、ＮＧＧ ＰＡＭを有するＳｐＣａｓ９の４５部位、は、ＴＴＴＮ ＰＡＭを有するＬｂＣａｓ１２ａの１２部位、ＴＴＴＮ ＰＡＭを有するＵｌｔｒａ ＡｓＣａｓ１２ａの１２部位及びＮＮＮＲＲＴ ＰＡＭを有するＫＫＨ－ｓａＣａｓ９の２０部位における編集活性を合計でモニタリングした（表９）。挿入欠失分析により、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘが他のＣａｓヌクレアーゼとＣａｓ１２Ｍａｘよりも７０％ほど高い平均オンターゲットｄｓＤＮＡ切断活性を示したことが示された（図１Ｇ、図９）。

【0616】

【表12-1】

【表12-2】

【表12-3】

【表12-4】

【表12-5】

【表12-6】

【表12-7】

【0617】

ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘのヒト細胞における内在性遺伝子に対する特異性をさらに評価するために、出願人は、Ｐ２ＲＸ５とＮＬＲＣ４オンターゲット部位及びそのコンピュータによって予測される該当するオフターゲット部位の挿入欠失頻度^２２を決定した。ターゲッティングディープ配列分析により、Ｕｌｔｒａ ＡｓＣａｓ１２ａ及びＬｂＣａｓ１２ａと比べて、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘが、より高いオンターゲット編集効率を有し、且つ類似して潜在的なオフターゲット部位においてほとんど挿入欠失活性がないことが示された（図１０Ａ－Ｂ、図１０Ａにおいて上側から下側へＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８２－３９０のプロトスペーサー配列／スペーサー配列、図１０Ｂにおいて上側から下側へＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９１－３９７のプロトスペーサー配列／スペーサー配列）。

【0618】

ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘのオフターゲットを十分に検出し、他のＣａｓタンパク質と比較するために、出願人は、ＰＥＭ－ｓｅｑ^２３を用いて、ＴＴＲ．２ライブラリの挿入欠失と転座イベント生殖系列イベント（未切断又は完全な再結合）と編集イベントを定量化した。まとめると、これらの結果は、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘが高い効率と特異性を有し、且つＳｐＣａｓ９と他のＣａｓ１２ヌクレアーゼよりも優れていることを証明した。

【0619】

実施例９ デッドｘＣａｓ１２ｉに基づく塩基エディタの開発と評価
出願人は、ヌクレアーゼが不活性化されたｘＣａｓ１２ｉ（デッドｘＣａｓ１２ｉ、ｄｘＣａｓ１２ｉ）を生成することによってｘＣａｓ１２ｉの塩基編集をさらに探求した。これは、まずＣａｓ１２ｉ１^８及びＣａｓ１２ｉ２^１０の比較に基づいてｘＣａｓ１２ｉの保存的活性部位に単一の突然変異（Ｄ６５０Ａ、Ｄ７００Ａ、Ｅ８７５Ａ又はＤ１０４９Ａ）を導入することによって完了された（図１２Ａ－Ｂ）。

【0620】

そして、ｄｘＣａｓ１２ｉ－Ｄ１０４９Ａは、ＸＴＥＮリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４２）を含有するＧＳリンカー又はＢＰ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３）を含有するＧＳリンカーを介してＣ－末端においてＴａｄＡ８ｅ^{Ｖ１０６Ｗ}（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９、ＴａｄＡ８ｅ．１）に融合されてアデニン塩基エディタＴａｄＡ８ｅ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉを形成し、且つｄｘＣａｓ１２ｉ－Ｄ１０４９Ａは、ＸＴＥＮリンカー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４２）を含有するＧＳリンカー又はＢＰ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３）を含有するＧＳリンカーと一つのＵＧＩ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１）を介してＣ－末端においてヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａ^{Ｗ１０４Ａ}（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０、ｈＡ３Ａ．１）に融合されて、シチジン塩基エディタｈＡ３Ａ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉ^{２４－２６}（図１Ｈと図１Ｊ）を形成した。アデニン塩基エディタについて、それは、Ｎ－末端ＳＶ４０ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４）とＣ－末端ＢＰ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３）とを含有した。シチジン塩基エディタについて、それは、Ｎ－末端ＢＰ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３）とＣ－末端ＢＰ ＮＬＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３）とを含有した。

【0621】

ＴａｄＡ８ｅ^{Ｖ１０６Ｗ}、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３９
ＳＥＶＥＦＳＨＥＹＷＭＲＨＡＬＴＬＡＫＲＡＲＤＥＲＥＶＰＶＧＡＶＬＶＬＮＮＲＶＩＧＥＧＷＮＲＡＩＧＬＨＤＰＴＡＨＡＥＩＭＡＬＲＱＧＧＬＶＭＱＮＹＲＬＩＤＡＴＬＹＶＴＦＥＰＣＶＭＣＡＧＡＭＩＨＳＲＩＧＲＶＶＦＧＷＲＮＳＫＲＧＡＡＧＳＬＭＮＶＬＮＹＰＧＭＮＨＲＶＥＩＴＥＧＩＬＡＤＥＣＡＡＬＬＣＤＦＹＲＭＰＲＱＶＦＮＡＱＫＫＡＱＳＳＩＮ
ｈＡＰＯＢＥＣ３^{Ｗ１０４Ａ}、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４０
ＭＥＡＳＰＡＳＧＰＲＨＬＭＤＰＨＩＦＴＳＮＦＮＮＧＩＧＲＨＫＴＹＬＣＹＥＶＥＲＬＤＮＧＴＳＶＫＭＤＱＨＲＧＦＬＨＮＱＡＫＮＬＬＣＧＦＹＧＲＨＡＥＬＲＦＬＤＬＶＰＳＬＱＬＤＰＡＱＩＹＲＶＴＷＦＩＳＹＳＰＣＦＳＡＧＣＡＧＥＶＲＡＦＬＱＥＮＴＨＶＲＬＲＩＦＡＡＲＩＦＤＹＤＰＬＹＫＥＡＬＱＭＬＲＤＡＧＡＱＶＳＩＭＴＹＤＥＦＫＨＣＷＤＴＦＶＤＨＱＧＣＰＦＱＰＷＤＧＬＤＥＨＳＱＡＬＳＧＲＬＲＡＩＬＱＮＱＧＮ
ＵＧＩ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４１
ＴＮＬＳＤＩＩＥＫＥＴＧＫＱＬＶＩＱＥＳＩＬＭＬＰＥＥＶＥＥＶＩＧＮＫＰＥＳＤＩＬＶＨＴＡＹＤＥＳＴＤＥＮＶＭＬＬＴＳＤＡＰＥＹＫＰＷＡＬＶＩＱＤＳＮＧＥＮＫＩＫＭＬ
ＸＴＥＮリンカー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４２
ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ
ｂｐＮＬＳ（ＢＰ ＮＬＳ又はｂｐＳＶ４０ ＮＬＳとも呼ばれる）、（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ２０５６５．）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４３
ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ
ＳＶ４０ ＮＬＳ、アカゲザルβポリオーマウイルス由来（Ｂｅｔａｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ ｍａｃａｃａｅ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４４
ＰＫＫＫＲＫＶ
ＮＰ ＮＬＳ（アフリカツメガエル核質タンパク質ＮＬＳ又は核質タンパク質ＮＬＳとも呼ばれる）、（ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａｂｊ６８５６．）、二成分ＮＬＳでもあり、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４５
ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ
ヒトＵ６プロモーター、２４１ｂｐ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４６
ｇａｇｇｇｃｃｔａｔｔｔｃｃｃａｔｇａｔｔｃｃｔｔｃａｔａｔｔｔｇｃａｔａｔａｃｇａｔａｃａａｇｇｃｔｇｔｔａｇａｇａｇａｔａａｔｔｇｇａａｔｔａａｔｔｔｇａｃｔｇｔａａａｃａｃａａａｇａｔａｔｔａｇｔａｃａａａａｔａｃｇｔｇａｃｇｔａｇａａａｇｔａａｔａａｔｔｔｃｔｔｇｇｇｔａｇｔｔｔｇｃａｇｔｔｔｔａａａａｔｔａｔｇｔｔｔｔａａａａｔｇｇａｃｔａｔｃａｔａｔｇｃｔｔａｃｃｇｔａａｃｔｔｇａａａｇｔａｔｔｔｃｇａｔｔｔｃｔｔｇｇｃｔｔｔａｔａｔａｔｃｔｔｇｔｇｇａａａｇｇａｃ
ヒトＣＭＶプロモーター、２０４ｂｐ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４７
ｇｔｇａｔｇｃｇｇｔｔｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｔｇｇｇｃｇｔｇｇａｔａｇｃｇｇｔｔｔｇａｃｔｃａｃｇｇｇｇａｔｔｔｃｃａａｇｔｃｔｃｃａｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇａｇｔｔｔｇｔｔｔｔｇｇｃａｃｃａａａａｔｃａａｃｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａａａａｔｇｔｃｇｔａａｃａａｃｔｃｃｇｃｃｃｃａｔｔｇａｃｇｃａａａｔｇｇｇｃｇｇｔａｇｇｃｇｔｇｔａｃｇｇｔｇｇｇａｇｇｔｃｔａｔａｔａａｇｃａｇａｇｃｔ
ｂＧＨ ｐｏｌｙＡシグナル、２０８ｂｐ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４８
ｃｔｇｔｇｃｃｔｔｃｔａｇｔｔｇｃｃａｇｃｃａｔｃｔｇｔｔｇｔｔｔｇｃｃｃｃｔｃｃｃｃｃｇｔｇｃｃｔｔｃｃｔｔｇａｃｃｃｔｇｇａａｇｇｔｇｃｃａｃｔｃｃｃａｃｔｇｔｃｃｔｔｔｃｃｔａａｔａａａａｔｇａｇｇａａａｔｔｇｃａｔｃｇｃａｔｔｇｔｃｔｇａｇｔａｇｇｔｇｔｃａｔｔｃｔａｔｔｃｔｇｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇｔｇｇｇｇｃａｇｇａｃａｇｃａａｇｇｇｇｇａｇｇａｔｔｇｇｇａａｇａｇａａｔａｇｃａｇｇｃａｔｇｃｔｇｇｇｇａ
Ｔ５ ＥＸＯ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４９
ＭＳＫＳＷＧＫＦＩＥＥＥＥＡＥＭＡＳＲＲＮＬＭＩＶＤＧＴＮＬＧＦＲＦＫＨＮＮＳＫＫＰＦＡＳＳＹＶＳＴＩＱＳＬＡＫＳＹＳＡＲＴＴＩＶＬＧＤＫＧＫＳＶＦＲＬＥＨＬＰＥＹＫＧＮＲＤＥＫＹＡＱＲＴＥＥＥＫＡＬＤＥＱＦＦＥＹＬＫＤＡＦＥＬＣＫＴＴＦＰＴＦＴＩＲＧＶＥＡＤＤＭＡＡＹＩＶＫＬＩＧＨＬＹＤＨＶＷＬＩＳＴＤＧＤＷＤＴＬＬＴＤＫＶＳＲＦＳＦＴＴＲＲＥＹＨＬＲＤＭＹＥＨＨＮＶＤＤＶＥＱＦＩＳＬＫＡＩＭＧＤＬＧＤＮＩＲＧＶＥＧＩＧＡＫＲＧＹＮＩＩＲＥＦＧＮＶＬＤＩＩＤＱＬＰＬＰＧＫＱＫＹＩＱＮＬＮＡＳＥＥＬＬＦＲＮＬＩＬＶＤＬＰＴＹＣＶＤＡＩＡＡＶＧＱＤＶＬＤＫＦＴＫＤＩＬＥＩＡＥＱ
ＣＡＧプロモーター（ヒトＣＭＶエンハンサー ＋ ニワトリβ－アクチンプロモーター）（ハイブリッドイントロン含有）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５００
ｃｇｔｔａｃａｔａａｃｔｔａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃｔｇａｃｃｇｃｃｃａａｃｇａｃｃｃｃｃｇｃｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔａｇｔａａｃｇｃｃａａｔａｇｇｇａｃｔｔｔｃｃａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇｇｇｔｇｇａｇｔａｔｔｔａｃｇｇｔａａａｃｔｇｃｃｃａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃａａｇｔｇｔａｔｃａｔａｔｇｃｃａａｇｔａｃｇｃｃｃｃｃｔａｔｔｇａｃｇｔｃａａｔｇａｃｇｇｔａａａｔｇｇｃｃｃｇｃｃｔｇｇｃａｔｔＧｔｇｃｃｃａｇｔａｃａｔｇａｃｃｔｔａｔｇｇｇａｃｔｔｔｃｃｔａｃｔｔｇｇｃａｇｔａｃａｔｃｔａｃｇｔａｔｔａｇｔｃａｔｃｇｃｔａｔｔａｃｃａｔｇｇｔｃｇａｇｇｔｇａｇｃｃｃｃａｃｇｔｔｃｔｇｃｔｔｃａｃｔｃｔｃｃｃｃａｔｃｔｃｃｃｃｃｃｃｃｔｃｃｃｃａｃｃｃｃｃａａｔｔｔｔｇｔａｔｔｔａｔｔｔａｔｔｔｔｔｔａａｔｔａｔｔｔｔｇｔｇｃａｇｃｇａｔｇｇｇｇｇｃｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｇｃｇｃｇｃｇｃｃａｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇａｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇｇｇｇｃｇａｇｇｃｇｇａｇａｇｇｔｇｃｇｇｃｇｇｃａｇｃｃａａｔｃａｇａｇｃｇｇｃｇｃｇｃｔｃｃｇａａａｇｔｔｔｃｃｔｔｔｔａｔｇｇｃｇａｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｇｇｃｃｃｔａｔａａａａａｇｃｇａａｇｃｇｃｇｃｇｇｃｇｇｇｃｇｇｇａｇｔｃｇｃｔｇｃｇａｃｇｃｔｇｃｃｔｔｃｇｃｃｃｃｇｔｇｃｃｃｃｇｃｔｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃｔｃｇｃｇｃｃｇｃｃｃｇｃｃｃｃｇｇｃｔｃｔｇａｃｔｇａｃｃｇｃｇｔｔａｃｔｃｃｃａｃａｇｇｔｇａｇｃｇｇｇｃｇｇｇａｃｇｇｃｃｃｔｔｃｔｃｃｔｃｃｇｇｇｃｔｇｔａａｔｔａｇｃｔｇａｇｃａａｇａｇｇｔａａｇｇｇｔｔｔａａｇｇｇａｔｇｇｔｔｇｇｔｔｇｇｔｇｇｇｇｔａｔｔａａｔｇｔｔｔａａｔｔａｃｃｔｇｇａｇｃａｃｃｔｇｃｃｔｇａａａｔｃａｃｔｔｔｔｔｔｔｃａｇ

【0622】

ＴａｄＡ８ｅ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉとｈＡ３Ａ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉの初始バージョンは、低塩基編集活性を示し、頻度は、それぞれ約８％のＡからＧと約２％のＣからＴである（図１ｌ、図１Ｋ）。この問題を解決するために、出願人は、ｄｘＣａｓ１２ｉのＰＩとＲｅｃドメインに高い切断活性のための単一と組み合わせ突然変異を導入し、これにより、ＡからＧまでの編集活性が著しく増加した（図１３Ａ）。改良された変異体において、ＴａｄＡ８ｅ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ２．２（Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ）は、ＫＬＦ４遺伝子座のＡ９とＡ１１部位において５０％の活性を実現し、明らかにＴａｄＡ８ｅ．１－ｄＬｂＣａｓ１２ａの３０％の活性よりも高かった（図１ｌ、図１３Ｂ－Ｃ）。ＰＣＳＫ９とＴＴＲ内の標的部位において、ＴａｄＡ８ｅ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ２．２は、ＡからＧへの転換の媒介に類似した効率増加を示し、且つＰＣＳＫ９部位においてＴａｄＡ８ｅ．１－ｄＬｂＣａｓ１２ａよりも高かった（図１５）。デアミナーゼ融合の配向が塩基編集効率に影響を与えるかどうかをテストするために、出願人は、ＴａｄＡ８ｅ．１をｄｘＣａｓ１２ｉのＮ末端又はＣ末端に融合させることでｄｘＣａｓ１２ｉ－ＡＢＥを構築し、且つｄｘＣａｓ１２ｉのＣ末端におけるＴａｄＡ８ｅ．１がＮ末端よりわずかに高い活性を示したことを発見した（図１４）。そして、出願人は、ＮＬＳ、リンカーとＴａｄＡ８ｅ．１タンパク質をさらに操作（ＴａｄＡ８ｅに回復）して（図１３Ａ）ｖ３．１－ｖ３．８とｖ４．１－ｖ４．４を産生し、ここで、ＴａｄＡ８ｅ－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ４．３は、８０％に近いＡからＧまでの編集効率と＞９５％の編集純度を示したが、他のｄｘＣａｓ１２ｉ－ＡＢＥバージョンの編集活性は、変わらなかった（図１Ｈ－Ｉ、図１３Ｄ－Ｅ）。出願人は、ＴａｄＡ８ｅ－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ４．３をｄＣａｓ１２Ｍａｘ－ＡＢＥと命名した。

【0623】

ｄＣａｓ１２Ｍａｘ－ＡＢＥの塩基編集活性をさらに特徴付けるために、出願人は、ＴＴＮ ＰＡＭを有する２１部位、ＡＴＮ ＰＡＭを有する１３部位及びＣＴＮ ＰＡＭを有する１３部位に対して実験を行った（表１０）。ｄＣａｓ１２Ｍａｘ－ＡＢＥがＴＴＮ ＰＡＭを有する部位においてＡからＧまでの著しい活性を示したことが観察された（図１６）。

【0624】

また、ｈＡ３Ａ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ１．２（Ｎ２４３Ｒ）、ｈＡ３Ａ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ２．２（Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ）とｈＡ３Ａ．１－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ４．３（Ｎ２４３Ｒ＋Ｅ３３６Ｒ－ｂｐＮＬＳ）は、ＲＵＮＸ１、ＤＹＲＫ１Ａと部位４遺伝子座のＣ７とＣ１０部位において、持続的に上昇したＣからＴまでの編集効率及び＞９５％の編集純度を示し、ひいてはＲＵＮＸ１とＤＹＲＫ１ＡにおけるｈＡ３Ａ．１－ｄＬｂＣａｓ１２ａよりも高かった（図１Ｊ－Ｋ）。

【0625】

これらの結果は、ｄｘＣａｓ１２ｉに基づく操作されたエディタは、哺乳動物細胞において高い塩基編集活性を示したことを共同で証明した。

【0626】

【表13-1】

【表13-2】

【0627】

実施例１０ Ｔ細胞におけるｈｆＣａｓ１２ＭａｘのＲＮＰ送達の評価
ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘの治療潜在力応用を探求するために、出願人は、ＣＤ３＋Ｔ細胞においてＴＲＡＣを標的とするｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ ＲＮＰ^１９を送達した（図２Ａ）。出願人は、事前にＨＥＫ２９３細胞においてＴＴＲとＴＲＡＣを標的とするｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ ＲＮＰをテストし、且つＲＮＰ投与量を増加させた後、遺伝子編集効率も増加し、細胞活力と増殖が影響を受けないことを発見した（図１８Ａ－Ｃ）。出願人は、ＨＥＫ２９３細胞において３．２μＭの投与量でＴＲＡＣに対して約９０％のｄｓＤＮＡ切断活性と＞９５％の活力を実現した（図１８Ａ－Ｃ）。三つのガイド配列を設計してＴＲＡＣを標的とし（表５）、且つＴＲＡＣ ｓｇ．２とｓｇ．３の両方は、ＣＤ３＋Ｔ細胞において１．６μＭと３．２μＭの投与量で～９０％の編集及び～８０％の活力を生成した（図２Ｂ）。フローサイトメトリー分析により、未処理細胞の９６．６％と比べて、ｓｇ．２又はｓｇ．３を標的とするＲＮＰによるエレクトロポレーション処理の５日後、ＣＤ３＋ Ｔ細胞におけるＴＲＡＣ発現が２％～３％のレベルまで低減したことを検出したことが示された（図２Ｃ）。本実施例で使用されるガイドＲＮＡは、５’ ＤＲ－Ｔ１－スペーサー配列－ＤＲ－Ｔ２－スペーサー配列－３’の配置を呈した。

【0628】

実施例１１ インビボｈｆＣａｓ１２ＭａｘのＬＮＰ送達の評価
ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ又はその塩基エディタインビボ遺伝子編集の実行可能性を評価するために、出願人は、ＬＮＰパッケージングによりガイドＲＮＡとコードｈｆＣａｓ１２ＭａｘのｍＲＮＡを、尾静脈内注射を介してＣ５７マウスの肝臓に送達した^２７（図２Ｄ）。出願人は、遺伝子編集（ｄｓＤＮＡ切断）と塩基編集により、マウストランスサイレチン（Ｔｔｒ）遺伝子（表５におけるＴｔｒ＿ｓｇ１２）におけるエクソン３を標的とした（図２Ｅ）。Ｎ２ａ細胞において、４種類の濃度下で頑強な編集効率を検出し、且つ１μｇの投与量で接近１００％に近い編集効率を検出した（図２Ｆ）。類似的に、ターゲッティングディープ配列分析により、飽和した０．３と０．５ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）に相当する投与量下で、マウス肝臓の編集効率が約７０％であることを指示した（図２Ｇ）。さらに、ＬＮＰパッケージングにより送達され、ＴａｄＡ８ｅ－ｄｘＣａｓ１２ｉ－ｖ４．３（ｄＣａｓ１２Ｍａｘ－ＡＢＥ）は、３ｍｐｋの投与量下でマウス肝臓におけるＴｔｒ遺伝子座においてＡ１３の約２５％のＡからＧ効率を実現した（図２Ｈ）。本実施例で使用されるガイドＲＮＡは、５’ ＤＲ－Ｔ１－スペーサー配列－ＤＲ－Ｔ２－スペーサー配列－３’の配置を呈した。

【0629】

また、出願人は、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘ ｍＲＮＡと、Ｔｔｒ遺伝子を標的とする二つのｇＲＮＡ（表５におけるＴｔｒ＿ｓｇ３と１２）をマウス受精卵に注射し、それを胚盤胞段階まで培養して遺伝子型分析を行った（図１９Ａ）。ターゲッティングディープ配列分析により、ほとんどの受精卵が編集され、且ついくつかが１００％に達したことが示された（図１９Ｂ）。これらの結果は、ｈｆＣａｓ１２Ｍａｘが頑強なエクスビボとインビボ遺伝子編集を媒介することによって、疾患モデリングと療法に用いられる巨大な潜在力を示すことを指示した。

【0630】

トランスサイレチン（ＴＴＲ）のミスフォールディングと凝集は、トランスサイレチン関連野生型アミロイドーシス（ＡＴＴＲｗｔ）、トランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシス（ＡＴＴＲｍ）、家族性アミロイドポリニューロパチー（ＦＡＰ）と家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）を含むアミロイド疾患に関連した。ＴＴＲ遺伝子をサイレンシングしてＴＴＲタンパク質の産生を減少させることは、ＴＴＲに関連するアミロイド疾患に治療作用を有する可能性がある。本実施例では、マウスにおけるＴＴＲ標的部位の高効率切断は、本発明のＳｉＣａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡシステムが、ＴＴＲ関連アミロイド疾患、例えばＡＴＴＲ（例えば、ＡＴＴＲｗｔ又はＡＴＴＲｍ）の治療において非常に有望な見通しを有することを証明した。

【0631】

実施例１２：ニッカーゼ活性を有するｘＣａｓ１２ｉ突然変異体のスクリーニング
ニッカーゼ活性（即ち、ｓｓＤＮＡ切断活性を有し且つ基本的にｄｓＤＮＡ切断活性を欠く）を有するｘＣａｓ１２ｉ突然変異体をスクリーニングするために、実施例１におけるｄｓＤＮＡ切断活性を有するレポーターシステムと、実施例１におけるｄｓＤＮＡ切断活性を有するレポーターシステムに基づいて確立された、ニッカーゼ活性を有するレポーターシステムとを用いて、表１１－１４におけるｘＣａｓ１２ｉ突然変異体を設計し、そのニッカーゼ活性とｄｓＤＮＡ切断活性をテストし、ここで、挿入配列を、５’から３’に５’ ＰＡＭ、プロトスペーサー配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、リンカー、標的配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、５’ ＰＡＭが含有される逆相補配列の挿入配列に置き換えた。

【0632】

ｘＣａｓ１２ｉ突然変異体がニッカーゼ活性のみを有する時、ｄｓＤＮＡ切断活性を有するレポーターシステムの場合に、それは、緑色蛍光を生成しかなったが、ニッカーゼ活性を有するレポーターシステムの場合に、緑色蛍光を生成することができた。ｘＣａｓ１２ｉ突然変異体がｄｓＤＮＡ切断活性を有する時、それは、ニッカーゼ活性とｄｓＤＮＡ切断活性を有するレポーターシステムの場合にいずれも緑色蛍光を生成することができた。そのため、ニッカーゼ活性を有するレポーターシステムは、ｄｓＤＮＡ切断活性とニッカーゼ活性との合計を指示した。ニッカーゼ活性を、ニッカーゼ活性を有するレポーターシステムからの緑色蛍光から、ｄｓＤＮＡ切断活性を有するレポーターシステムからの緑色蛍光を差し引いたものとして計算した。ニッカーゼ百分率をニッカーゼ活性／ｄｓＤＮＡ切断活性として計算した。

【0633】

ｘＣａｓ１２ｉ－Ｗ８９６Ｒ、ｘＣａｓ１２ｉ－Ｓ９２４ＲとｘＣａｓ１２ｉ－Ｓ９２５ＲがＷＴ ｘＣａｓ１２ｉに対して著しいニッカーゼ活性を示すことが観察された。

【0634】

【表14】

【0635】

ｘＣａｓ１２ｉのＷ８９６、Ｓ９２４又はＳ９２５において、表１２－１４における突然変異体を生成するためにさらなる誘発を行った。８種類のｘＣａｓ１２ｉ突然変異体Ｗ８９６Ｒ、Ｗ８９６Ｐ、Ｗ８９６Ｋ、Ｓ９２４Ｆ、Ｓ９２４Ｄ、Ｓ９２４Ｅ、Ｓ９２４ＨとＳ９２５Ｔが、より著しくいニッカーゼの好み（ニッカーゼ活性／ｄｓＤＮＡ切断活性＞１．０）とより高いニッカーゼ活性（２０％より高い）を実現したことが観察された。

【0636】

【表15】

【0637】

【表16】

【0638】

【表17】

【0639】

本開示の範囲と精神から逸脱することなく、本開示の前記生成物、方法と用途の様々な修正と変化は、当業者にとって明らかである。特定の実施の形態と結び付けて本開示を記述したが、理解すべきこととして、さらなる修正が可能であり、且つ請求項に係る本開示は、そのような特定の実施の形態に不当に限定されるべきではない。実は、当業者にとって明らかな、本開示に記述される方式を実行するための様々な修正は、本開示の範囲内に含まれることが意図されている。本出願は、一般的に本開示の原理に従う本開示の任意の変化、用途又は改作をカバーすることを意図しており、且つ、それが、本開示が属する分野の既知の慣習的な操作内にあり、且つ以前に示された基本的な特徴に適用可能であるという本開示の内容から逸脱するような内容を含む。

【0640】

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例示的な配列
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ＞ＳｉＣａｓ１２ｉタンパク質
ＭＳＳＤＶＶＲＰＹＮＴＫＬＬＰＤＮＲＫＨＮＭＦＬＱＴＦＫＲＬＮＳＩＳＬＮＨＦＤＬＬＩＣＬＹＡＡＩＴＮＫＫＡＥＥＹＫＳＥＫＥＡＨＶＴＡＤＳＬＣＡＩＮＷＦＲＰＭＳＫＲＹＳＫＹＡＴＴＴＦＮＭＬＥＬＦＫＥＹＳＧＨＥＰＤＡＹＳＫＮＹＬＭＳＮＩＤＳＤＲＦＶＷＶＤＣＲＫＦＡＫＤＦＡＹＱＭＥＬＧＦＨＥＦＴＶＬＡＥＴＬＬＡＮＳＩＬＶＬＮＥＳＴＫＡＮＷＡＷＧＴＶＳＡＬＹＧＧＧＤＫＥＤＳＴＬＫＳＫＩＬＬＡＦＶＤＡＬＮＮＨＥＬＫＴＫＲＥＩＬＮＱＶＣＥＳＬＫＹＱＳＹＱＤＭＹＶＤＦＲＳＶＶＤＥＮＧＮＫＫＳＰＮＧＳＭＰＩＶＴＫＦＥＴＤＤＬＩＳＤＮＱＲＫＡＭＩＳＮＦＴＫＮＡＡＡＫＡＡＫＫＰＩＰＹＬＤＲＬＫＥＨＭＶＳＬＣＤＥＹＮＶＹＡＷＡＡＡＩＴＮＳＮＡＤＶＴＡＲＮＴＲＮＬＴＦＩＧＥＱＮＳＲＲＫＥＬＳＶＬＱＴＴＴＮＥＫＡＫＤＩＬＮＫＩＮＤＮＬＩＱＥＶＲＹＴＰＡＰＫＨＬＧＲＤＬＡＮＬＦＤＴＬＫＥＫＤＩＮＮＩＥＮＥＥＥＫＱＮＶＩＮＤＣＩＥＱＹＶＤＤＣＲＳＬＮＲＮＰＩＡＡＬＬＫＨＩＳＲＹＹＥＤＦＳＡＫＮＦＬＤＧＡＫＬＮＶＬＴＥＶＶＮＲＱＫＡＨＰＴＩＷＳＥＫＡＹＴＷＩＳＫＦＤＫＮＲＲＱＡＮＳＳＬＶＧＷＶＶＰＰＥＥＶＨＫＥＫＩＡＧＱＱＳＭＭＷＶＴＬＴＬＬＤＤＧＫＷＶＫＨＨＩＰＦＳＤＳＲＹＹＳＥＶＹＡＹＮＰＮＬＰＹＬＤＧＧＩＰＲＱＳＫＦＧＮＫＰＴＴＮＬＴＡＥＳＱＡＬＬＡＮＳＫＹＫＫＡＮＫＳＦＬＲＡＫＥＮＡＴＨＮＶＲＶＳＰＮＴＳＬＣＩＲＬＬＫＤＳＡＧＮＱＭＦＤＫＩＧＮＶＬＦＧＭＱＩＮＨＫＩＴＶＧＫＰＮＹＫＩＥＶＧＤＲＦＬＧＦＤＱＮＱＳＥＮＨＴＹＡＶＬＱＲＶＳＥＳＳＨＤＴＨＨＦＮＧＷＤＶＫＶＬＥＫＧＫＶＴＳＤＶＩＶＲＤＥＶＹＤＱＬＳＹＥＧＶＰＹＤＳＳＫＦＡＥＷＲＤＫＲＲＲＦＶＬＥＮＬＳＩＱＬＥＥＧＫＴＦＬＴＥＦＤＫＬＮＫＤＳＬＹＲＷＮＭＮＹＬＫＬＬＲＫＡＩＲＡＧＧＫＥＦＡＫＩＡＫＴＥＩＦＥＬＡＶＥＲＦＧＰＩＮＬＧＳＬＳＱＩＳＬＫＭＩＡＳＦＫＧＶＶＱＳＹＦＳＶＳＧＣＶＤＤＡＳＫＫＡＨＤＳＭＬＦＴＦＭＣＡＡＥＥＫＲＴＮＫＲＥＥＫＴＮＲＡＡＳＦＩＬＱＫＡＹＬＨＧＣＫＭＩＶＣＥＤＤＬＰＶＡＤＧＫＴＧＫＡＱＮＡＤＲＭＤＷＣＡＲＡＬＡＫＫＶＮＤＧＣＶＡＭＳＩＣＹＲＡＩＰＡＹＭＳＳＨＱＤＰＦＶＨＭＱＤＫＫＴＳＶＬＲＰＲＦＭＥＶＮＫＤＳＩＲＤＹＨＶＡＧＬＲＲＭＬＮＳＫＳＤＡＧＴＳＶＹＹＲＱＡＡＬＨＦＣＥＡＬＧＶＳＰＥＬＶＫＮＫＫＴＨＡＡＥＬＧＫＨＭＧＳＡＭＬＭＰＷＲＧＧＲＶＹＩＡＳＫＫＬＴＳＤＡＫＳＶＫＹＣＧＥＤＭＷＱＹＨＡＤＥＩＡＡＶＮＩＡＭＹＥＶＣＣＱＴＧＡＦＧＫＫＱＫＫＳＤＥＬＰＧ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ＞Ｓｉ２Ｃａｓ１２ｉタンパク質
ＭＳＳＤＶＶＲＰＹＮＴＫＬＬＰＤＮＲＫＹＮＭＦＬＱＴＦＫＲＬＮＬＩＳＳＮＨＦＤＬＬＶＣＬＹＡＡＩＴＮＫＫＡＥＥＹＫＳＥＫＥＤＨＶＴＡＤＳＬＣＡＩＮＷＦＲＰＭＳＫＲＹＩＫＹＡＴＴＴＦＫＭＬＥＬＦＫＥＹＳＧＨＥＰＤＴＹＳＫＮＹＬＭＳＮＩＶＳＤＲＦＶＷＶＤＣＲＫＦＡＫＤＦＡＮＱＭＥＬＳＦＨＥＦＴＴＬＳＥＴＬＬＡＮＳＩＬＶＬＮＥＳＴＫＡＮＷＡＷＧＡＶＳＡＬＹＧＧＧＤＫＥＤＳＴＬＫＳＫＩＬＬＡＦＶＤＡＬＮＮＰＥＬＫＴＲＲＥＩＬＮＨＶＣＥＳＬＫＹＱＳＹＱＤＭＹＶＤＦＲＳＶＶＤＤＫＧＮＫＫＳＰＮＧＳＭＰＩＶＴＫＦＥＳＤＤＬＩＧＤＮＱＲＫＴＭＩＳＳＦＴＫＮＡＡＡＫＡＳＫＫＰＩＰＹＬＤＩＬＫＤＨＭＩＳＬＣＥＥＹＮＶＹＡＷＡＡＡＩＴＮＳＮＡＤＶＴＡＲＮＴＲＮＬＴＦＩＧＥＱＮＴＲＲＫＥＬＳＶＬＱＴＳＴＮＥＫＡＫＤＩＬＮＫＩＮＤＮＬＩＰＥＶＲＹＴＰＡＰＫＨＬＧＲＤＬＡＮＬＦＥＭＦＫＥＫＤＩＮＱＩＧＮＥＥＥＫＱＮＶＩＮＤＣＩＥＱＹＶＤＤＣＲＳＬＮＲＮＰＶＡＡＬＬＫＨＩＳＧＹＹＥＤＦＳＡＫＮＦＬＤＧＡＫＬＮＶＬＴＥＶＶＮＲＱＫＡＨＰＴＩＣＳＥＫＡＹＴＷＩＳＫＩＤＫＮＲＲＱＡＮＳＳＬＶＧＷＶＶＰＰＥＥＶＨＫＥＫＩＡＧＱＱＳＭＭＷＶＴＬＴＬＬＤＤＧＫＷＶＫＨＨＩＰＦＡＤＳＲＹＹＳＥＶＹＡＹＮＰＮＬＰＹＬＥＧＧＩＰＲＱＳＫＦＧＮＫＰＴＴＮＬＴＡＥＳＱＡＬＬＡＮＳＫＨＫＫＡＮＫＴＦＬＲＡＫＥＮＩＴＨＮＶＲＶＳＰＮＴＳＬＣＩＲＰＬＫＤＳＡＧＮＱＭＦＤＮＩＧＮＭＬＦＧＭＱＩＮＨＲＩＴＶＧＫＰＮＹＫＩＥＶＧＤＲＦＬＧＦＤＱＮＱＳＥＮＨＴＹＡＶＬＱＲＶＳＥＳＳＨＧＴＨＨＦＮＧＷＤＶＫＶＩＥＫＧＫＶＴＳＤＶＶＶＲＤＥＶＹＤＱＬＳＹＥＧＶＰＹＤＳＰＫＦＴＥＷＲＥＫＲＲＫＦＶＬＥＮＭＳＩＱＩＥＥＧＫＴＦＬＴＥＦＤＫＬＮＫＤＳＬＹＲＷＮＭＮＹＭＫＬＬＲＫＡＩＲＡＧＧＫＥＦＡＫＩＴＫＡＥＩＦＥＬＧＶＭＲＦＧＰＭＮＬＧＳＬＳＱＶＳＬＫＭＩＡＡＦＫＧＶＩＱＳＹＦＳＶＳＧＣＩＤＤＡＳＫＫＡＨＤＳＭＬＦＡＦＬＣＳＡＤＥＫＲＴＮＫＲＥＥＫＴＮＲＡＡＳＦＩＬＱＫＡＹＳＨＧＣＫＭＩＶＣＥＤＤＬＰＩＡＤＧＫＶＧＫＡＱＮＡＤＲＭＤＷＣＡＲＳＬＡＫＫＶＮＤＧＣＶＡＭＳＩＣＹＲＡＩＰＡＹＭＳＳＨＱＤＰＦＴＨＭＱＤＫＫＴＳＶＬＲＰＲＦＭＥＶＧＫＤＳＩＲＤＨＨＶＡＧＬＲＲＭＬＮＳＫＧＮＴＧＴＳＶＹＹＲＥＡＡＬＲＦＣＥＡＬＧＶＬＰＥＬＶＫＮＫＫＴＨＡＳＥＬＧＫＨＭＧＳＡＭＬＭＰＷＲＧＧＲＩＹＶＡＳＫＫＬＴＳＤＡＫＳＩＫＹＣＧＥＤＭＷＱＹＨＡＤＥＩＡＡＩＮＩＡＭＹＥＶ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ＞ＷｉＣａｓ１２ｉタンパク質
ＭＧＩＳＩＳＲＰＹＧＴＫＬＲＰＤＡＲＫＫＥＭＬＤＫＦＦＴＴＬＡＫＧＱＲＶＦＡＤＬＧＬＣＩＹＧＳＬＴＬＥＭＶＫＲＬＥＰＥＳＤＳＥＬＶＣＡＩＧＷＦＲＬＶＤＫＶＴＷＳＥＮＥＩＫＱＥＮＬＶＲＱＹＥＴＹＳＧＫＥＡＳＥＶＩＫＴＹＬＳＳＰＳＳＤＫＹＶＷＩＤＣＲＱＫＦＬＲＦＱＲＤＬＧＴＲＮＬＳＥＤＦＥＣＭＬＦＥＱＹＬＲＬＴＫＧＥＬＤＧＨＴＡＭＳＮＭＦＧＴＫＴＫＥＤＲＡＴＫＬＲＹＡＡＲＭＫＥＷＬＥＡＮＥＥＩＴＷＥＱＹＨＱＡＬＱＤＫＬＤＡＮＴＬＥＥＡＶＤＮＹＫＧＫＡＧＧＳＮＰＦＦＳＹＴＬＬＮＲＧＱＩＤＫＫＴＨＥＱＱＬＫＫＦＮＫＶＬＫＴＫＳＫＮＬＮＦＰＮＫＥＫＬＫＱＹＬＥＴＡＩＧＩＰＶＤＡＱＶＹＧＱＭＦＮＮＧＶＳＥＶＱＰＫＴＴＲＮＭＳＦＳＭＥＫＬＥＬＬＮＥＬＫＳＬＮＫＴＤＧＦＥＲＡＮＥＶＬＮＧＦＦＤＳＥＬＨＴＴＥＤＫＦＮＩＴＳＲＹＬＧＧＤＲＮＮＲＬＰＫＬＹＥＬＷＫＫＥＧＶＤＲＥＥＧＩＱＱＦＳＱＡＩＱＤＫＭＧＱＩＰＶＫＮＶＬＲＹＩＷＥＦＲＥＴＶＳＡＥＤＦＥＡＡＡＫＡＮＱＬＥＥＫＩＴＲＴＫＡＨＰＶＶＩＳＮＲＹＷＴＦＧＳＳＡＬＶＧＮＩＭＰＡＤＫＭＨＫＤＱＹＡＧＱＳＦＫＭＷＬＥＡＥＬＨＹＤＧＫＫＶＫＨＨＬＰＦＹＮＡＲＦＦＥＥＶＹＣＹＨＰＳＶＡＥＶＴＰＦＫＴＫＱＦＧＹＡＩＧＫＤＩＰＡＤＶＳＶＶＬＫＤＮＰＹＫＫＡＴＫＲＦＬＲＡＩＳＮＰＶＡＮＴＶＤＶＮＫＰＴＶＣＳＦＭＩＫＲＥＮＤＥＹＫＬＶＩＮＲＫＩＧＶＤＲＰＫＲＩＫＶＧＲＫＶＭＧＹＤＲＮＱＴＡＳＤＴＹＷＩＧＥＬＶＰＨＧＴＴＧＡＹＲＩＧＥＷＳＶＱＹＩＫＳＧＰＶＬＳＳＴＱＧＶＮＤＳＴＴＤＱＬＩＹＮＧＭＰＳＳＳＥＲＦＫＡＷＫＫＳＲＭＳＦＩＲＫＬＩＲＱＬＮＡＥＧＬＥＳＫＧＱＤＹＶＰＥＮＰＳＳＦＤＶＲＧＥＴＬＹＶＦＮＳＮＹＭＫＡＬＶＳＫＨＲＫＡＫＫＰＶＥＧＩＬＥＥＩＥＡＬＴＳＫＡＫＤＳＣＳＬＭＲＬＳＳＬＳＤＡＡＭＱＧＩＡＳＬＫＳＬＩＮＳＹＦＮＫＮＧＣＫＴＩＥＤＫＥＫＦＮＰＤＬＹＶＫＬＶＥＶＥＱＫＲＴＮＫＲＫＥＫＶＧＲＩＡＧＳＬＥＱＬＡＬＬＮＧＶＤＶＶＩＧＥＡＤＬＧＥＶＫＫＧＫＳＫＫＱＮＳＲＮＭＤＷＣＡＫＱＶＡＥＲＬＥＹＫＬＴＦＨＣＩＧＹＦＧＶＮＰＭＹＴＳＨＱＤＰＦＥＨＲＲＶＡＤＨＬＶＭＲＡＲＦＥＥＶＮＶＳＮＶＳＥＷＨＭＲＮＦＳＮＹＬＲＡＤＳＧＴＧＬＹＹＫＱＡＴＬＤＦＬＫＨＹＤＬＥＥＨＡＤＤＬＥＫＱＮＩＫＦＹＤＦＲＫＩＬＥＤＫＱＬＴＳＶＩＶＰＫＲＧＧＲＩＹＭＡＴＮＰＶＴＳＤＳＴＰＶＴＹＡＧＫＴＹＮＲＣＮＡＤＥＶＡＡＡＮＩＡＩＳＶＬＡＰＨＳＫＫＥＥＫＥＤＫＩＰＩＩＳＫＫＰＫＳＫＮＴＰＫＡＲＫＮＬＫＴＳＱＬＰＱＫ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ＞Ｗｉ２Ｃａｓ１２ｉタンパク質
ＭＡＳＫＨＶＶＲＰＦＮＧＫＶＴＡＴＧＫＲＬＡＹＬＥＥＴＦＨＹＬＥＫＡＡＧＧＶＳＴＬＦＡＡＬＧＳＹＬＤＡＴＴＩＳＮＬＩＮＫＮＱＤＬＡＶＶＩＦＲＹＨＶＶＰＫＧＥＡＨＴＬＰＶＧＴＤＭＶＳＲＦＶＡＤＹＧＭＥＰＮＥＦＱＲＡＹＬＤＳＰＩＤＱＥＫＹＣＷＱＤＮＲＤＶＧＣＷＬＧＥＱＬＧＶＳＥＡＤＭＲＡＩＡＶＴＦＹＮＮＱＭＬＹＤＣＶＫＧＴＧＳＧＮＡＶＳＬＬＦＧＳＧＫＫＳＤＹＳＭＫＧＶＩＡＧＫＡＡＳＶＬＡＫＹＲＰＡＴＹＱＤＡＲＫＭＩＬＥＡＮＧＦＴＳＶＫＤＬＶＴＳＹＧＩＴＧＲＳＳＡＬＱＩＦＭＥＧＩＥＳＧＰＩＳＳＫＴＬＤＡＲＩＫＫＦＴＥＤＳＥＲＮＧＲＫＮＬＶＰＨＡＧＡＩＲＮＷＬＩＥＱＡＧＳＳＶＥＮＹＱＭＡＷＣＥＶＹＧＮＶＳＡＤＷＮＡＫＶＥＳＮＦＮＦＶＡＥＫＶＫＡＬＴＥＬＳＮＩＱＫＳＴＰＤＬＧＫＡＬＫＬＦＥＥＹＬＴＴＣＱＤＥＦＡＩＡＰＹＨＦＳＶＭＥＥＶＲＭＥＭＡＴＧＲＥＦＮＤＡＹＤＤＡＬＮＳＬＤＭＥＳＫＱＰＩＱＰＬＣＫＦＬＩＥＲＧＧＳＩＳＦＤＴＦＫＳＡＡＫＹＬＫＴＱＳＫＩＡＧＲＹＰＨＰＦＶＫＧＮＱＧＦＴＦＧＳＫＮＩＷＡＡＩＮＤＰＭＭＥＹＡＤＧＲＩＡＧＧＳＡＭＭＷＶＴＡＴＬＬＤＧＫＫＷＶＲＨＨＩＰＦＡＮＴＲＹＦＥＥＶＹＡＳＫＫＧＬＰＶＬＰＣＡＲＤＧＫＨＳＦＫＬＧＮＮＬＳＶＥＲＶＥＫＶＫＥＧＧＲＴＫＡＴＫＡＱＥＲＩＬＳＮＬＴＨＮＶＱＦＤＳＳＴＴＦＩＩＲＲＱＥＥＳＦＶＩＣＶＮＨＲＨＰＡＰＬＭＫＫＥＭＥＶＧＤＫＩＩＧＩＤＱＮＶＴＡＰＴＴＹＡＩＶＥＲＶＡＳＧＧＩＥＲＮＧＫＱＹＫＶＴＡＭＧＡＩＳＳＶＱＫＴＲＧＧＥＶＤＶＬＳＹＭＧＶＥＬＳＤＳＫＮＧＦＱＳＬＷＮＫＣＬＤＦＶＴＫＨＧＴＥＮＤＶＫＹＹＮＮＴＡＶＷＡＮＫＬＹＶＷＨＫＭＹＦＲＬＬＫＱＬＭＲＲＡＫＤＬＫＰＦＲＤＨＬＱＨＬＬＦＨＰＮＬＳＰＬＱＲＨＳＬＳＬＴＳＬＥＡＴＫＩＶＲＮＣＩＨＳＹＦＳＬＬＧＬＫＴＬＤＥＲＫＡＡＤＩＮＬＬＥＶＬＥＫＬＹＡＧＬＶＥＲＲＫＥＲＴＫＬＴＡＧＬＬＶＲＬＣＮＥＨＧＩＳＦＡＡＩＥＧＤＬＰＶＶＧＥＧＫＳＫＡＡＮＮＴＱＱＤＷＴＡＲＥＬＥＫＲＬＳＥＭＡＥＶＶＧＩＫＶＩＡＶＬＰＨＹＴＳＨＱＤＰＦＶＹＳＫＮＴＫＫＭＲＣＲＷＮＷＲＴＴＫＴＦＴＤＲＤＡＬＳＩＲＲＩＬＳＫＰＥＴＧＴＮＬＹＹＱＫＧＬＫＡＦＡＥＫＨＧＬＤＬＡＥＭＫＫＲＫＤＡＱＷＹＬＥＲＩＱＤＫＮＦＬＶＰＭＮＧＧＲＶＹＬＳＳＶＫＬＡＧＫＥＴＩＤＭＧＧＥＩＬＹＬＮＤＡＤＱＶＡＡＬＮＶＬＬＶＫＩ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ＞Ｗｉ３Ｃａｓ１２ｉタンパク質
ＭＡＫＫＥＨＩＩＲＰＦＫＧＴＬＰＬＲＧＤＲＬＲＹＬＱＤＴＭＫＹＭＫＫＶＥＤＴＩＴＥＬＣＡＡＶＩＡＹＡＫＰＴＩＩＱＱＩＬＧＥＥＩＥＴＴＳＴＦＣＳＦＲＬＶＧＩＨＥＮＦＴＭＰＬＴＴＮＭＩＫＨＦＱＫＴＦＮＩＮＰＳＥＫＱＡＩＹＬＳＳＧＦＤＳＤＫＹＲＷＱＤＴＳＥＶＳＲＮＦＡＮＫＣＲＬＴＮＱＥＦＱＥＦＡＥＱＡＬＬＮＭＣＦＩＧＣＳＧＳＰＧＡＴＮＡＶＳＱＩＦＧＴＧＥＫＳＤＹＱＲＫＳＱＩＡＫＩＡＡＤＴＬＥＮＨＫＰＳＴＹＥＳＡＲＬＭＶＬＮＴＬＧＨＫＴＩＥＤＣＶＮＤＹＧＡＩＧＡＫＳＡＦＲＬＦＭＥＳＫＥＩＧＰＩＴＳＥＱＬＴＴＫＩＫＫＦＲＥＤＨＫＫＮＳＩＫＫＱＬＰＨＶＥＫＶＲＮＡＬＬＳＱＦＫＥＱＹＬＰＳＡＷＡＥＡＷＣＮＩＭＧＥＦＮＳＫＬＳＮＮＮＮＦＩＤＱＫＴＫＭＶＮＤＣＤＮＩＫＫＳＮＰＱＬＤＫＡＶＮＭＬＤＥＷＫＹＫＮＷＤＤＮＳＡＩＨＰＹＨＩＧＤＬＫＫＬＭＡＩＦＮＩＮＮＥＧＴＦＤＥＲＦＳＡＳＷＥＱＦＳＴＳＬＥＹＧＥＫＰＰＶＲＤＬＬＡＨＩＩＫＮＭＮＤＬＴＹＴＤＶＩＮＡＡＫＦＬＫＬＱＤＮＩＲＮＫＹＰＨＰＦＶＭＰＮＫＧＣＴＦＧＫＤＮＬＷＧＥＩＮＤＰＴＡＫＩＫＳＴＥＥＶＡＧＱＲＰＭＭＷＬＴＡＫＬＬＤＮＧＫＷＶＥＨＨＩＰＦＡＳＳＲＹＦＡＥＶＹＹＴＮＰＡＬＰＴＬＰＩＡＲＤＧＫＨＳＹＫＬＴＫＴＩＤＡＮＴＡＫＴＬＶＮＮＰＲＤＫＡＡＫＬＩＡＲＴＫＡＮＴＴＨＮＶＫＷＩＫＰＴＹＲＩＱＫＥＮＮＱＦＶＩＴＩＮＨＲＨＰＣＩＴＰＰＫＥＩＩＬＧＤＲＩＬＳＦＤＱＮＥＴＡＰＴＡＦＳＩＬＥＫＴＴＫＧＴＥＦＣＧＨＨＩＫＶＬＫＴＧＭＬＥＡＫＩＫＴＳＫＫＳＩＤＡＦＴＹＭＧＰＭＥＤＤＨＡＳＧＦＰＴＬＬＮＩＣＥＫＦＩＳＥＮＧＤＥＫＤＫＳＦＳＳＲＫＬＰＦＫＲＳＬＹＦＦＨＧＳＨＦＤＬＬＫＫＭＩＲＫＡＫＮＤＰＫＫＬＫＬＶＲＩＨＩＮＥＩＬＦＮＳＮＬＳＰＩＫＬＨＳＬＳＩＨＳＭＥＮＴＫＫＶＩＡＡＩＳＣＹＭＮＶＨＥＷＫＴＩＤＥＱＫＮＡＤＩＴＬＹＮＡＫＥＫＬＹＮＮＬＶＮＲＲＫＥＲＶＫＶＴＡＧＭＬＩＲＬＡＲＥＮＮＣＲＦＭＶＧＥＡＥＬＰＴＱＱＱＧＫＳＫＫＮＮＮＳＫＱＤＷＣＡＲＤＩＡＱＲＣＥＤＭＣＥＶＶＧＩＫＷＮＧＶＴＰＨＮＴＳＨＱＮＰＦＩＹＫＮＴＳＧＱＱＭＲＣＲＹＳＬＶＫＫＳＥＭＴＤＫＭＡＥＫＩＲＮＩＬＨＡＥＰＶＧＴＴＡＹＹＲＥＧＩＬＥＦＡＫＨＨＧＬＤＬＧＭＭＫＫＲＲＤＡＫＹＹＤＮＬＰＤＥＦＬＬＰＴＲＧＧＲＩＹＬＳＥＮＱＬＧＧＮＥＴＩＶＩＮＧＫＫＹＦＶＮＱＡＤＱＶＡＡＶＮＩＧＬＬＹＬＬＰＫＫＮＱＳ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ ＞ＳａＣａｓ１２ｉタンパク質
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ ＞Ｓａ２Ｃａｓ１２ｉタンパク質
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ ＞Ｓａ３Ｃａｓ１２ｉタンパク質
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ＞ＷａＣａｓ１２ｉタンパク質
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ ＞Ｗａ２Ｃａｓ１２ｉタンパク質
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ ＞ＳｉＣａｓ１２ｉダイレクトリピート配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ ＞Ｓｉ２Ｃａｓ１２ｉダイレクトリピート配列
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ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ ＞ＷｉＣａｓ１２ｉダイレクトリピート配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４ ＞Ｗｉ２Ｃａｓ１２ｉダイレクトリピート配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５ ＞Ｗｉ３Ｃａｓ１２ｉダイレクトリピート配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６ ＞ＳａＣａｓ１２ｉダイレクトリピート配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７ ＞Ｓａ２Ｃａｓ１２ｉダイレクトリピート配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８ ＞Ｓａ３Ｃａｓ１２ｉダイレクトリピート配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９ ＞ＷａＣａｓ１２ｉダイレクトリピート配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０ ＞Ｗａ２Ｃａｓ１２ｉダイレクトリピート配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１ ＞ＳｉＣａｓ１２ｉコード配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０ ＞Ｗａ２Ｃａｓ１２ｉコード配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１ ＞ＳｉＣａｓ１２ｉコドン最適化コード配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２ ＞Ｓｉ２Ｃａｓ１２ｉコドン最適化コード配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３ ＞ＷｉＣａｓ１２ｉコドン最適化コード配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４ ＞Ｗｉ２Ｃａｓ１２ｉコドン最適化コード配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５ ＞Ｗｉ３Ｃａｓ１２ｉコドン最適化コード配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６ ＞ＳａＣａｓ１２ｉコドン最適化コード配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７ ＞Ｓａ２Ｃａｓ１２ｉコドン最適化コード配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９ ＞ＷａＣａｓ１２ｉコドン最適化コード配列
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ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０ ＞Ｗａ２Ｃａｓ１２ｉコドン最適化コード配列
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ＳｐＣａｓ９タンパク質、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７
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ＳｐＣａｓ９足場配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８
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ＬｂＣａｓ１２ａタンパク質、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９
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ＬｂＣａｓ１２ａ ＤＲ配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０
ＴＡＡＴＴＴＣＴＡＣＴＡＡＧＴＧＴＡＧＡＴＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１ ＞ＳｉＣａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ
ＣＴＡＧＣＡＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＴＴＧＡＣＡＣＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２ ＞Ｓｉ２Ｃａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ
ＡＴＣＧＣＡＡＣＡＴＣＴＴＡＧＡＡＡＴＣＣＧＴＣＣＴＴＡＧＴＴＧＡＣＧＧＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３ ＞ＷｉＣａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ
ＴＣＴＣＡＡＣＧＡＴＡＧＴＣＡＧＡＣＡＴＧＴＧＴＣＣＣＣＡＧＴＧＡＣＡＣＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４ ＞Ｗｉ２Ｃａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ
ＣＴＣＡＡＡＧＴＧＴＣＡＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＣＣＴＧＣＴＡＡＴＧＧＧＡＣＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５ ＞Ｗｉ３Ｃａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ
ＴＣＣＣＡＡＡＧＴＧＧＣＡＡＡＡＧＡＡＴＣＴＣＣＣＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６ ＞ＳａＣａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ
ＧＴＣＴＡＡＣＴＧＣＣＡＴＡＧＡＡＴＣＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＴＴＧＧＣＡＣＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７ ＞Ｓａ２Ｃａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ
ＴＣＧＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＣＴＣＣＴＴＧＧＴＡＡＴＧＧＧＡＧＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８ ＞Ｓａ３Ｃａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ
ＣＣＡＣＡＡＣＡＡＣＣＡＡＡＡＧＡＡＴＧＴＣＣＣＴＧＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９ ＞ＷａＣａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ
ＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＴＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＴＧＡＣＡＣＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０ ＞Ｗａ２Ｃａｓ１２ｉ－ｃｒＲＮＡ
ＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＧＴＧＣＡＡＡＧＴＣＡＣＡＣＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＧＣＡＴＡＣ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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【国際調査報告】