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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】工学操作ロイシン脱炭酸酵素
(51)【国際特許分類】
C12N 9/04 20060101AFI20241024BHJP
C12N 15/53 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241024BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241024BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241024BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241024BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20241024BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C12N9/04 Z ZNA
C12N15/53
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K38/43
A61P3/00
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024526835
(86)(22)【出願日】2022-11-01
(85)【翻訳文提出日】2024-06-28
(86)【国際出願番号】 US2022079089
(87)【国際公開番号】W WO2023077169
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】63/274,395
(32)【優先日】2021-11-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】324009899
【氏名又は名称】シンティス バイオ，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】ジョナサン ベンジャミン アスファハ
(72)【発明者】
【氏名】サブハモイ ダス
(72)【発明者】
【氏名】フェイ ローン デュ
(72)【発明者】
【氏名】ステファン ジェーン
(72)【発明者】
【氏名】ニッキ ディー．クルーゼ
(72)【発明者】
【氏名】ジョイス リウ
(72)【発明者】
【氏名】ケリン マクルスキー
(72)【発明者】
【氏名】ロアサ メームード
(72)【発明者】
【氏名】アダム ピー．シルバーマン
(72)【発明者】
【氏名】クリステン ジーン バリュー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA02
4C084AA07
4C084BA01
4C084BA02
4C084BA22
4C084DC01
4C084DC23
4C084MA27
4C084MA34
4C084MA35
4C084MA37
4C084MA52
4C084MA55
4C084ZC021
4C084ZC022
4C084ZC211
4C084ZC212
4C084ZC511
4C084ZC512
(57)【要約】
本発明は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）ポリペプチド及びその組成物、並びに工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、強化された触媒活性、並びにタンパク質分解に対する感受性の低下、及び／又は低ｐＨ環境に対する耐容性の上昇を示す。いくつかの実施態様では、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、改良された保存安定性を提供するように最適化される。本発明はまた、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを含む組成物を、治療目的及び産業目的で使用する方法を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドであって、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む、ポリペプチド。
【請求項2】
配列番号８２８に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む、請求項１に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項3】
配列番号８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで，前記アミノ酸配列は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む、請求項１に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項4】
前記アミノ酸配列が、アミノ酸位置５、１９、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１４１、１７０、１７３、１８７、１９８、２００、２０２、２６７、２７０、２７２、２９０、３１２、３５３、３５７、３８３、若しくは３８４、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項5】
前記アミノ酸配列が少なくとも置換５Ｖ、１９Ｌ、３３Ｌ、４１Ｄ、４７Ｆ、５１Ｅ、５５Ｉ、６４Ｓ／Ｎ、１４１Ｐ、１７０Ｐ、１７３Ｉ、１８７Ｌ、１９８Ｇ、２００Ｓ、２０２Ｈ、２６７Ｌ、２７０Ｌ／Ｔ、２７２Ａ、２９０Ｉ、３１２Ｔ、３５３Ｅ、３５７Ｓ／Ｃ、３８３Ｓ、若しくは３８４Ｗ、又はこれらの組み合わせを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項１～４のいずれか１項に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項6】
前記アミノ酸配列が、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、若しくは３５７、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項7】
前記アミノ酸配列が、少なくとも置換３３Ｌ、５５Ｉ、６４Ｎ、１２６Ａ、２７０Ｌ、若しくは３５７Ｓの置換、又はこれらの組み合わせを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項１～３及び６のいずれか１項に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項8】
１～３のいずれか１項に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドであって、ここで、前記アミノ酸配列が、アミノ酸位置１７０／２７０／３８３、２７０、４１／１７３、２７２、５／１４１／２７２／３８３、４１／３８３、４１／１４１／１８７／２７２／２９０、４１／１４１／１７３／２９０、５／２７２／３８３、５／４１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１、１４１／２７２、３５３／３８４、２７２／３８３、４１／１４１／１７３、４１／２７２／３８３、４１／１４１／１８７／２００／２０２／２７２、３３／５５／６４／１２６／２７０／３５７、３３／１２６／３５３／３５７、５５／６４／２６７／３５／３８４、３３／６４／３５７、１２６／２６７、６４／２６７／３５３／３８４、３３／５５／６４／３５７、１９／６４／１２６／２６７、５５／２６７、３３／１２６／２６７／２７０／３１２／３５７、１９／３３／５５／３５３／３５７／３８４、１９／３３／１２６、１２６／３１２、１２６／１９８／２０２／２６７／３１２、１２６／３５３、５５／１２６、１２６／２７０／３８４、３３／６４／３５３／３５７、１９／２６７、５１／５５／２６７／２７０／３５３、３３／１２６／２６７／２７０、１９／５５／６４／１２６／２６７／２７０／３５３、１９／３３／１２６／２７０／３５３／３５７／３８４、１９／３３／６４／２６７／３５３、１２６／３５３／３８４、１２６／２７０／３１２／３５３／３８４、１９／３３／５５／１２６、３３／３５７、４７／５１／６４／１２６／３５３／３８４、１２６、又は１２６／２７０において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである、ポリペプチド。
【請求項9】
請求項１～３及び８のいずれか１項に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット１７０Ｐ／２７０Ｌ／３８３Ｓ、２７０Ｌ、４１Ｄ／１７３Ｉ、２７２Ａ、５Ｖ／１４１Ｐ／２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１８７Ｌ／２７２Ａ／２９０Ｉ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２９０Ｉ、５Ｖ／２７２Ａ／３８３Ｓ、５Ｖ／４１Ｄ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ、１４１Ｐ／２７２Ａ、３５３Ｅ／３８４Ｗ、２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１７３Ｉ、４１Ｄ／２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１８７Ｌ／２００Ｓ／２０２Ｈ／２７２Ａ、３３Ｌ／５５Ｉ／６４Ｎ／１２６Ａ／２７０Ｌ／３５７Ｓ、３３Ｌ／１２６Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｓ、５５Ｉ／６４Ｎ／２６７Ｌ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、３３Ｌ／６４Ｎ／３５７Ｓ、１２６Ａ／２６７Ｌ、６４Ｎ／２６７Ｌ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、３３Ｌ／５５Ｉ／６４Ｎ／３５７Ｓ、１９Ｌ／６４Ｎ／１２６Ａ／２６７Ｌ、５５Ｉ／２６７Ｌ、３３Ｌ／１２６Ａ／２６７Ｌ／２７０Ｔ／３１２Ｔ／３５７Ｓ、１９Ｌ／３３Ｌ／５５Ｉ／３５３Ｅ／３５７Ｓ／３８４Ｗ、１９Ｌ／３３Ｌ／１２６Ａ、１２６Ａ／３１２Ｔ、１２６Ａ／１９８Ｇ／２０２Ｈ／２６７Ｌ／３１２Ｔ、１２６Ａ／３５３Ｅ、５５Ｉ／１２６Ａ、１２６Ａ／２７０Ｔ／３８４Ｗ、３３Ｌ／６４Ｎ／３５３Ｅ／３５７Ｓ、１９Ｌ／２６７Ｌ、５１Ｅ／５５Ｉ／２６７Ｌ／２７０Ｔ／３５３Ｅ、３３Ｌ／１２６Ａ／２６７Ｌ／２７０Ｔ、１９Ｌ／５５Ｉ／６４Ｎ／１２６Ａ／２６７Ｌ／２７０Ｔ／３５３Ｅ、１９Ｌ／３３Ｌ／１２６Ａ／２７０Ｔ／３５３Ｅ／３５７Ｓ／３８４Ｗ、１９Ｌ／３３Ｌ／６４Ｎ／２６７Ｌ／３５３Ｅ、１２６Ａ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、１２６Ａ／２７０Ｔ／３１２Ｔ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、１９Ｌ／３３Ｌ／５５Ｉ／１２６Ａ、３３Ｌ／３５７Ｓ、４７Ｆ／５１Ｅ／６４Ｎ／１２６Ａ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、１２６Ａ、又は１２６Ａ／２７０Ｔを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである、ポリペプチド。
【請求項10】
請求項１～３、８、及び９のいずれか１項に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＡ１７０Ｐ／Ｒ２７０Ｌ／Ａ３８３Ｓ、Ｒ２７０Ｌ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ、Ｔ２７２Ａ、Ｋ５Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｖ１８７Ｌ／Ｔ２７２Ａ／Ｖ２９０Ｉ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｖ２９０Ｉ、Ｋ５Ｖ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ、Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ、Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ、Ｈ４１Ｄ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｖ１８７Ｌ／Ｈ２００Ｓ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ、Ｆ３３Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｌ／Ｃ３５７Ｓ、Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｃ３５７Ｓ、Ｖ５５Ｉ／Ｓ６４Ｎ／Ｉ２６７Ｌ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｆ３３Ｌ／Ｓ６４Ｎ／Ｃ３５７Ｓ、Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ、Ｓ６４Ｎ／Ｉ２６７Ｌ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｆ３３Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｓ６４Ｎ／Ｃ３５７Ｓ、Ｉ１９Ｌ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ、Ｖ５５Ｉ／Ｉ２６７Ｌ、Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ／Ｒ２７０Ｔ／Ａ３１２Ｔ／Ｃ３５７Ｓ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｄ３５３Ｅ／Ｃ３５７Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ａ／Ａ３１２Ｔ、Ｄ１２６Ａ／Ａ１９８Ｇ／Ｓ２０２Ｈ／Ｉ２６７Ｌ／Ａ３１２Ｔ、Ｄ１２６Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｖ５５Ｉ／Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｔ／Ｐ３８４Ｗ、Ｆ３３Ｌ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ３５３Ｅ／Ｃ３５７Ｓ、Ｉ１９Ｌ／Ｉ２６７Ｌ、Ｌ５１Ｅ／Ｖ５５Ｉ／Ｉ２６７Ｌ／Ｒ２７０Ｔ／Ｄ３５３Ｅ、Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ／Ｒ２７０Ｔ、Ｉ１９Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ／Ｒ２７０Ｔ／Ｄ３５３Ｅ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｔ／Ｄ３５３Ｅ／Ｃ３５７Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｓ６４Ｎ／Ｉ２６７Ｌ／Ｄ３５３Ｅ、Ｄ１２６Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｄ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｔ／Ａ３１２Ｔ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｄ１２６Ａ、Ｆ３３Ｌ／Ｃ３５７Ｓ、Ｌ４７Ｆ／Ｌ５１Ｅ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ１２６Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｄ１２６Ａ、又はＤ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｔを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである、ポリペプチド。
【請求項11】
配列番号８８８に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上置換を含む、請求項１に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項12】
前記アミノ酸配列が、アミノ酸位置５、１９、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１４１、１７０、１７３、１８７、１９８、２００、２０２、２６７、２７０、２７２、２９０、３１２、３５３、３５７、３８３、若しくは３８４、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。請求項１１に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項13】
請求項１１又は１２に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、アミノ酸残基５Ｖ、１９Ｌ、３３Ｌ、４１Ｄ、４７Ｆ、５１Ｅ、５５Ｉ、６４Ｓ／Ｎ、１４１Ｐ、１７０Ｐ、１７３Ｉ、１８７Ｌ、１９８Ｇ、２００Ｓ、２０２Ｈ、２６７Ｌ、２７０Ｌ／Ｔ、２７２Ａ、２９０Ｉ、３１２Ｔ、３５３Ｅ、３５７Ｓ／Ｃ、３８３Ｓ、若しくは３８４Ｗ、又はこれらの組み合わせを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである、ポリペプチド。
【請求項14】
請求項１１～１３のいずれか１項に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が、アミノ酸位置６４／１７３／２０２／３５３／３８４、４１／１４１／２７２／３５３、１４１／２０２／２７２／３５３／３５７、１７３／２０２／３５７、２０２／３５３、５／５１／１７３／２７２／３５３／３８４、５１／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２７２、２７２、４１／１７３／３８４、４１／６４／１４１／３５３／３５７／３８３、１４１／１７３／２０２、５／５１／６４／２０２／３５３、３５７、６４、５／４１／１４１、４１／１４１／１７３／２０２／３５３、３５３、２０２／３５７、５１／１４１／２０２／２７２／３５３、２０２、５１／１４１／１７３／３５３／３８４、４１／１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３８３／３８４、６４／２０２／３５７、５／６４／３５３／３８３／３８４、４１／２７２／３５３／３８３、４１／１７３／２７２／３５３／３５７、５１／１４１／２７２／３５３／３５７／３８３／３８４、４１／３５３／３５７、１７３／２７２／３５３／３５７、５／４１／６４／１７３／３５３／３５７、６４／１７３／３５７、５１／２７２、５１／６４／３５７／３８４、５１／１４１／１７３／２７２／３５３、６４／２０２／２７２／３５３／３５７／３８４、５１／２７２／３５７、５１／１７３／２７２／３５３／３８４、３５３／３８４、２０２／２７２／３５７、６４／１４１／１７３／２０２／３５３／３５７、５／４１／５１／２０２／３５７／３８３、５／５１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１／２７２、５１／１７３、５／３５３、４１／６４／１７３／２７２／３５３／３８３、５／６４／１７３／２７２／３５３、５１／６４、４１／３５７／３８３、４１／１７３／３５３／３５７、２０２／２７２／３８３、２０２／２７２、３５３／３５７、４１／１７３／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３５７、６４／１４１／２０２、又は５／１７３／２７２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである、ポリペプチド。
【請求項15】
請求項１４に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が少なくとも置換又は置換セット６４Ｓ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、４１Ｄ／１４１Ｐ／２７２Ａ／３５３Ｅ、１４１Ｐ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、１７３Ｉ／２０２Ｈ／３５７Ｃ、２０２Ｈ／３５３Ｅ、５Ｖ／５１Ｅ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、５１Ｅ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５７Ｃ、１４１Ｐ／１７３Ｉ／２７２Ａ、２７２Ａ、４１Ｄ／１７３Ｉ／３８４Ｗ、４１Ｄ／６４Ｓ／１４１Ｐ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３８３Ｓ、１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ、５Ｖ／５１Ｅ／６４Ｓ／２０２Ｈ／３５３Ｅ、３５７Ｃ、６４Ｓ、５Ｖ／４１Ｄ／１４１Ｐ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／３５３Ｅ、３５３Ｅ、２０２Ｈ／３５７Ｃ、５１Ｅ／１４１Ｐ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ、２０２Ｈ、５１Ｅ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８３Ｓ／３８４Ｗ、６４Ｓ／２０２Ｈ／３５７Ｃ、５Ｖ／６４Ｓ／３５３Ｅ／３８３Ｓ／３８４Ｗ、４１Ｄ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、５１Ｅ／１４１Ｐ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３８３Ｓ／３８４Ｗ、４１Ｄ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、５Ｖ／４１Ｄ／６４Ｓ／１７３Ｉ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、６４Ｓ／１７３Ｉ／３５７Ｃ、５１Ｅ／２７２Ａ、５１Ｅ／６４Ｓ／３５７Ｃ／３８４Ｗ、５１Ｅ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ、６４Ｓ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３８４Ｗ、５１Ｅ／２７２Ａ／３５７Ｃ、５１Ｅ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、３５３Ｅ／３８４Ｗ、２０２Ｈ／２７２Ａ／３５７Ｃ、６４Ｓ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、５Ｖ／４１Ｄ／５１Ｅ／２０２Ｈ／３５７Ｃ／３８３Ｓ、５Ｖ／５１Ｅ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ／２７２Ａ、５１Ｅ／１７３Ｉ、５Ｖ／３５３Ｅ、４１Ｄ／６４Ｓ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８３Ｓ、５Ｖ／６４Ｓ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ、５１Ｅ／６４Ｓ、４１Ｄ／３５７Ｃ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１７３Ｉ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、２０２Ｈ／２７２Ａ／３８３Ｓ、２０２Ｈ／２７２Ａ、３５３Ｅ／３５７Ｃ、４１Ｄ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５７Ｃ、１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、６４Ｓ／１４１Ｐ／２０２Ｈ、又は５Ｖ／１７３Ｉ／２７２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである、ポリペプチド。
【請求項16】
請求項１４に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドであって、前記アミノ酸配列が少なくとも置換又は置換セットＮ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｒ１４１Ｐ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｓ３５７Ｃ、Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ、Ｋ５Ｖ／Ｌ５１Ｅ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｌ５１Ｅ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｓ３５７Ｃ、Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ、Ｔ２７２Ａ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｎ６４Ｓ／Ｒ１４１Ｐ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ／Ａ３８３Ｓ、Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ、Ｋ５Ｖ／Ｌ５１Ｅ／Ｎ６４Ｓ／Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ、Ｓ３５７Ｃ、Ｎ６４Ｓ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ、Ｄ３５３Ｅ、Ｓ２０２Ｈ／Ｓ３５７Ｃ、Ｌ５１Ｅ／Ｒ１４１Ｐ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｓ２０２Ｈ、Ｌ５１Ｅ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ａ３８３Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｎ６４Ｓ／Ｓ２０２Ｈ／Ｓ３５７Ｃ、Ｋ５Ｖ／Ｎ６４Ｓ／Ｄ３５３Ｅ／Ａ３８３Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｌ５１Ｅ／Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ／Ａ３８３Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｎ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｎ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ３５７Ｃ、Ｌ５１Ｅ／Ｔ２７２Ａ、Ｌ５１Ｅ／Ｎ６４Ｓ／Ｓ３５７Ｃ／Ｐ３８４Ｗ、Ｌ５１Ｅ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｎ６４Ｓ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ／Ｐ３８４Ｗ、Ｌ５１Ｅ／Ｔ２７２Ａ／Ｓ３５７Ｃ、Ｌ５１Ｅ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｓ３５７Ｃ、Ｎ６４Ｓ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｌ５１Ｅ／Ｓ２０２Ｈ／Ｓ３５７Ｃ／Ａ３８３Ｓ、Ｋ５Ｖ／Ｌ５１Ｅ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ、Ｌ５１Ｅ／Ｆ１７３Ｉ、Ｋ５Ｖ／Ｄ３５３Ｅ、Ｈ４１Ｄ／Ｎ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ａ３８３Ｓ、Ｋ５Ｖ／Ｎ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｌ５１Ｅ／Ｎ６４Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｓ３５７Ｃ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ、Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｓ３５７Ｃ、Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｎ６４Ｓ／Ｒ１４１Ｐ／Ｓ２０２Ｈ、又はＫ５Ｖ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対する参照配列に対して相対的なものである、ポリペプチド。
【請求項17】
前記アミノ酸配列が表１２－１及び１２－２に提供される変種の置換又は置換セットを含み、ここで、前記置換又は置換セットは配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項１に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項18】
前記アミノ酸配列が表１２－１及び１２－２に提供される少なくとも１つのアミノ酸位置に置換を含む、請求項１に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項19】
前記アミノ酸配列が表１２－１及び１２－２に提供される少なくとも１つの置換を含む、請求項１に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項20】
前記アミノ酸配列が表１２－１及び１２－２に提供される少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記置換又は置換セットは配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項１に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項21】
前記アミノ酸配列が表１２－１及び１２－２に提供される工学操作ロイシン脱炭酸酵素の配列を含む、請求項１に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項22】
前記アミノ酸配列が配列番号８５４～１０６４のうちの偶数の配列番号を含む、請求項１に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項23】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、野生型のプランクトミセス科種のロイシン脱炭酸酵素、又は配列番号１２に対応するアミノ酸配列を有するロイシン脱炭酸酵素と比較して、１つ又はそれ以上の改良された特性を示す、請求項１～２２のいずれか１項に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項24】
請求項２３に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドであって、前記改良された特性が、野生型のプランクトミセス科種のロイシン脱炭酸酵素、又は配列番号１２に対応するアミノ酸配列を有するロイシン脱炭酸酵素と比較して、（ｉ）ロイシンに対する活性の上昇、（ｉｉ）タンパク質分解に対する耐性の上昇、（ｉｉｉ）低ｐＨ環境に対する耐容性の上昇、若しくは（ｉｖ）熱安定性の上昇、又はこれらの任意の組み合わせから選択される、ポリペプチド。
【請求項25】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが精製されている、請求項１～２４のいずれか１項に記載のロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド。
【請求項26】
請求項１～２５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを含む組成物。
【請求項27】
請求項１～２５のいずれか１項に記載の少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項28】
少なくとも１つの医薬的に許容し得る賦形剤及び／又は担体をさらに含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項29】
前記組成物がヒトへの経口投与に適している、請求項２６、２７、又は２８に記載の医薬組成物。
【請求項30】
前記組成物が、丸薬、錠剤、カプセル剤、ジェルキャップ、液剤、又はエマルジョンの形態である、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項31】
前記丸薬、錠剤、カプセル剤、又はジェルキャップが腸内コーティングをさらに含む、請求項３０に記載の医薬組成物。
【請求項32】
前記組成物がヒトへの非経口注射に適している、請求項２７又は２８に記載の医薬組成物。
【請求項33】
請求項１～２４のいずれか１項に記載の少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド。
【請求項34】
配列番号８５３～１０６３のうちの奇数の配列番号に対応する参照ポリペプチド配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項35】
前記ポリヌクレオチド配列がコドン最適化されている、請求項３３又は３４に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項36】
前記ポリヌクレオチド配列が配列番号８５３～１０６３のうちの奇数の配列番号を含む、請求項３３に記載の組換えポリヌクレオチド。
【請求項37】
請求項３３～３６のいずれか１項に記載の少なくとも１つの組換えポリヌクレオチドを含む発現ベクター．
【請求項38】
前記組換えポリヌクレオチドが制御配列に作動可能に連結されている。請求項３７に記載の発現ベクター。
【請求項39】
請求項３３～３６のいずれか１項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド又は請求項３７又は３８に記載の発現ベクターで形質転換されている宿主細胞。
【請求項40】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項41】
前記原核細胞が大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）である、請求項４０に記載の宿主細胞。
【請求項42】
請求項３９～４１のいずれか１項に記載の宿主細胞を、少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが発現されるような条件下で培養することを含む、宿主細胞中で工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを産生する方法。
【請求項43】
培養物及び／又は宿主細胞から工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを回収することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを精製する工程をさらに含む、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項45】
血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態の症状を治療及び／又は予防する方法であって、それを必要とする被験体に、血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルを低下させる工学操作ロイシン脱炭酸酵素の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項46】
血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する前記疾患又は状態がメープルシロップ尿症である、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する前記疾患又は状態がイソ吉草酸血症である、請求項４５に記載の方法。
【請求項48】
血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する前記疾患又は状態が３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症である、請求項４５に記載の方法。
【請求項49】
それを必要とする被験体に工学操作ロイシン脱炭酸酵素の有効量を投与することを含む、前記被験体における血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させる方法。
【請求項50】
前記被験体が、メープルシロップ尿症、イソ吉草酸血症、又は３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素が、１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～４００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇ、又は５ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、請求項４５～５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項52】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素が、１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ未満又は１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で投与される、請求項５１に記載の方法。
【請求項53】
前記投与量が約６．２５ｍｇ／ｋｇ～約１２．５ｍｇ／ｋｇである、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素が、血漿中のロイシン、ケトイソカプロン酸、及びメチオニンのレベルを低下させるのに有効な量で投与される、請求項４５～５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項55】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素が、少なくとも２日又はそれ以上連続して被験体に投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素が、少なくとも３日又はそれ以上連続して被験体に投与される、請求項５４に記載の方法。
【請求項57】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素が、タンパク質を含む食事の摂取直前、摂取と同時、及び／又は摂取直後に投与される、請求項４５～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
それを必要とする前記被験体がメープルシロップ尿症を患っており、及びここで、前記メープルシロップ尿症の症状が改善されている、請求項４５～５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項59】
それを必要とする前記被験体がイソ吉草酸血症を有し、及びここで、前記イソ吉草酸血症の症状が改良されている、請求項４５～５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
それを必要とする前記被験体が３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症を有し、及びここで、前記３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症の症状が改良されている、請求項４５～５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
前記被験体が、前記疾患に罹患している被験者が必要とする食事と比較して、ロイシン、イソロイシン、及び／又はバリン含有量の制限が少ない食事を摂取することができる、請求項４５～６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
前記被験体が、前記疾患に罹患している被験者が必要とする食事と比較して、タンパク質含有量の制限が少ない食事を摂取することができる、請求項４５～６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項63】
前記被験体が、幼児、子供、若者、又は成人である、請求項４５～６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項64】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む、請求項４５～６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号１２、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号１２、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む、請求項４５～６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項66】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号１２、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号１２に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む、請求項４５～６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項67】
工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、アミノ酸位置 ２、３、５、１２、１４、１６、１９、３３、３４、３８、３９、４１、４７、４８、５１、５５、６３、６４、６６、６９、７６、７７、８０、８７、８９、９１、９２、１０２、１０６、１０９、１１８、１２３、１２６、１２７、１３２、１３４、１３５、１３９、１４０、１４１、１５６、１６１、１６４、１６８、１７０、１７３、１８１、１８７、１８９、１９３、１９４、１９６、１９８、２００、２０１、２０２、２１１、２２３、２２８、２４５、２５５、２５６、２５９、２６２、２６３、２６５、２６７、２７０、２７２、２７５、２９０、２９６、２９９、３００、３０３、３０４、３１２、３１７、３１９、３２４、３２８、３３１、３３８、３３９、３４０、３４３、３４９、３５０、３５２、３５３、３５７、３６４、３６５、３６５、３６６、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９０、３９１、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、４０１、４０４、若しくは４０５、又はこれらの組み合わせにおいて、少なくとも置換を含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項６５又は６６に記載の方法。
【請求項68】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、少なくとも置換２Ｅ、３Ｍ、５Ｍ／Ｖ、１２Ｇ、１４Ｉ／Ｔ、１６Ｑ／Ｖ、１９Ｉ／Ｌ、３３Ｌ、３４Ｌ、３８Ｖ、３９Ｎ／Ｓ、４１Ｄ、４７Ｆ、４８Ｌ、５１Ｑ／Ｅ、５５Ｉ、６３Ｃ、６４Ｓ／Ａ／Ｎ／Ｅ、６６Ｓ／Ｎ、６９Ｉ、７６Ｖ、７７Ｌ、８０Ｇ／Ｋ、８７Ｒ、８９Ｐ、９１Ａ／Ｑ、９２Ｋ、１０２Ｓ、１０６Ｍ、１０９Ｇ、１１８Ｔ／Ｄ、１２３Ｆ／Ｍ／Ｖ、１２６Ａ／Ｔ、１２７Ｓ、１３２Ｆ、１３４Ａ／Ｓ、１３５Ｖ、１３９Ｇ、１４０Ｖ、１４１Ｐ、１５６Ａ／Ｓ、１６１Ｖ、１６４Ａ／Ｃ、１６８Ｋ、１７０Ａ／Ｐ、１７３Ａ／Ｉ／Ｔ、１８１Ｋ／Ｒ／Ｖ、１８７Ｌ、１８９Ａ／Ｄ、１９３Ｉ、１９４Ｃ／Ｌ、１９６Ｄ／Ｒ、１９８Ｇ、２００Ｓ、２０１Ｄ／Ｒ、２０２Ｈ、２１１Ｓ、２２３Ｍ、２２８Ｄ、２４５Ｍ、２５５Ｇ／Ｎ／Ｐ／Ｈ、２５６Ｗ、２５９Ｋ／Ｌ／Ｑ、２６２Ｄ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｓ／Ｔ、２６３Ｔ／Ｖ、２６５Ｐ、２６７Ｌ／Ｉ、２７０Ｒ／Ａ／Ｔ／Ｌ、２７２Ａ、２７５Ｓ、２９０Ｉ、２９６Ｄ／Ｅ、２９９Ａ、３００Ｒ／Ｋ、３０３Ｑ、３０４Ｒ、３１２Ａ／Ｔ、３１７Ｑ、３１９Ａ、３２４Ｎ／Ｓ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、３２８Ｎ、３３１Ｖ、３３８Ｓ、３３９Ａ／Ｄ、３４０Ｔ／Ｖ、３４３Ａ／Ｅ、３４９Ｔ、３５０Ｓ／Ｅ、３５２Ａ、３５３Ｉ／Ｌ／Ｄ／Ｎ／Ｓ／Ｗ／Ｅ、３５７Ｓ／Ｃ／Ｍ／Ｖ、３６４Ｋ／Ｒ、３６５Ｅ、３６５Ｅ、３６６Ａ／Ｍ／Ｑ／Ｔ／Ｖ、３７９Ｄ／Ｎ／Ｐ／Ｅ、３８０Ｅ、３８１Ｄ／Ｅ、３８２Ｇ／Ｓ、３８３Ｓ、３８４Ｗ、３８６＊、３８８Ａ、３８９Ｇ／Ｐ／Ｑ、３９０Ａ／Ｓ／Ｅ／＊、３９１Ｅ／＊、３９３Ｔ、３９４Ｅ、３９５Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｓ、３９７Ａ、３９８＊、４０１Ｙ／＊、４０４Ｉ、若しくは４０５Ｄ／Ｈ／Ｌ／Ｅ、又はこれらの組み合わせを含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項６５～６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項69】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素がポリペプチドが、配列番号１２に対して少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置５、１４、１４／３４／３８／３９／１０２／２６７／２７５／３５０／３５７、１４／３９／１０２／１２７／２４５／２６７／２７５／３４９／３５０、３４／３８／３９／１０２／１２７／２７５／３５７、３４／３８／３９／１０２／２７５／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３４９／３５０／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３５０／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２７５／３４９／３５７、３４／３９／１０２／２６４／２７５／３５０／３５７、３４／３９／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６４／２６７／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６７／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３５０、３８／３９／１０２／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／２４５／２６７／３５７、３８／３９／１２７／２６４／２７５、３８／３９／１２７／２６４／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５７、３８／３９／２４５／２７５／３５７、３８／３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３８／３９／２６４／２７５／３５７、３８／３９／２７５、３８／３９／２７５／３５０、３９、３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６７／２７５／３５７、３９／１２７／２４５／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／１２７／２４５／２６４／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２４５／３５７、３９／１２７／２６７／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２６７／３５０／３５７、３９／１２７／３５７、３９／２４５／２６４／２６７／２７５／３５７、３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／２７５／３５０／３５７、４８、１３９、１６４、１９６、２５５、２９９、３１８、３２４、３３９、３４３、３５０、３５３、３５７、３６４、３６５、３７９、３８１、３８６、３８９、３９１、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、及び４０５において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対して番号が付けられている、請求項６５～６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項70】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素がポリペプチドが、配列番号３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項71】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、アミノ酸位置２、３、５、１２、１４、１６、１９、３３、３４、３８、３９、４１、４７、４８、５１、５５、６３、６４、６６、６９、７６、７７、８０、８７、８９、９１、９２、１０２、１０６、１０９、１１８、１２３、１２６、１２７、１３２、１３４、１３５、１３９、１４０、１４１、１５６、１６１、１６４、１６８、１７０、１７３、１８１、１８７、１８９、１９３、１９４、１９６、１９８、２００、２０１、２０２、２１１、２２３、２２８、２４５、２５５、２５６、２５９、２６２、２６３、２６５、２６７、２７０、２７２、２７５、２９０、２９６、２９９、３００、３０３、３０４、３１２、３１７、３１９、３２４、３２８、３３１、３３８、３３９、３４０、３４３、３４９、３５０、３５２、３５３、３５７、３６４、３６５、３６５、３６６、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９０、３９１、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、４０１、４０４、若しくは４０５、又はこれらの組み合わせにおいて、少なくとも置換を含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０に記載の方法。
【請求項72】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号３８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置４８／６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、４８／６４／１６４／３２４／３４３／３６４、４８／６４／１６４／３５３／３５７／３６４、４８／６４／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５７／３６４、６４／１６４／３５３／３５７、６４／３１８／３２４／３５７／３６４、６４／３２４／３５３／３５７／３６４、１３２／２５５／３３９／３７９／３９５、１６４／１９６／３２４／３５７／３６４、１６４／３１８／３２４／３４３／３５３／３５７、１６４／３１８／３２４／３５７／３６４、１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、１６４／３２４／３５７／３６４、１６４／３５３／３５７／３６４、１６４／３６４、１９６／３１８／３２４／３５３／３５７／３６４、３１８／３４３／３５７、３２４／３４３／３５７／３６４、３２４／３５３／３５７／３６４、３２４／３５７／３６４、３３９／３７９／３８９／３９４／３９５、３３９／３８９／３９５、３３９／３９１、３３９／３９４／３９５／４０５、３５７／３６４、３７９／３８６、３７９／３９４／３９５／３９７／４０４／４０５、３７９／３９４／３９５／３９７／４０５、３８９／３９４／３９５／３９７／４０５、又は３９４／３９７において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号３８に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項73】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号２３４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置２、３、３３、４８／６４／２５５、４８／２５５／３３９、４８／２５５／３７９、６４、６４／２５５、６９、１６１、１９３、２５５、２５５／３１８／３７９、２５９、２６３、３１８／３３９／３７９、３２４、３２４／３８９／３９４、３２４／３８９／３９４／３９５、３２４／３８９／３９４／３９７、３２４／３９４、３２４／３９４／３９５、３２４／３９４／３９５／３９７、３２４／３９５、３３９、３４０、３８０、３８２、３８９、３８９／３９４、３８９／３９４／３９５、３８９／３９４／３９５／３９７、３８９／３９４／３９７、３８９／３９５、３８９／３９７、３９０、３９４、３９４／３９５、３９４／３９５／３９７、３９５、３９５／３９７、３９７、４０１、又は４０５において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２３４に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項74】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号２８４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置２／６４／６９／３２４／３８０／３８２／３８８／３８９、３／６４／６９／２６３／３３９／３８０／３８８、３／６４／６９／３８９、３／６４／６９／３９０、３／６４／３７９／３８０／３９０、３／６９／２６３／３８０、３／６９／３２４、３／６９／３２４／３８０／３８２／３８９／３９０、１２／１３５／２５９／２６３、１２／１３５／２６３／３８２、１２／２５９／２６３／３０４、４８／６４／２５５、６４／６９、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、６４／６９／２２３／３８８、６４／６９／２２３／３８８／３８９／３９０、６４／６９／３０４／３７９／３８２、６４／６９／３２４、６４／６９／３２４／３３９／３８０／３８９／３９０、６４／６９／３３９、６４／６９／３３９／３８２／３８８／３８９、６４／６９／３３９／３８９／３９０、６４／６９／３７９／３８０、６４／６９／３８０／３８８／３９０、６４／６９／３８９、６４／６９／３９０、６４／２５５／２６３、６４／２６３、６４／３２４／３３９／３８９／３９０、６９／２２３／２６３／３２４／３８２／３８８／３９０、６９／２２３／３２４／３７９／３８０／３８２／３８８／３９０、６９／２６３、６９／２６３／３２４、６９／２６３／３３９、６９／２６３／３８８、６９／２６３／３８９／３９０、６９／３２４／３７９／３８０／３８８、６９／３２４／３８０、６９／３３９／３９０、６９／３８２／３９０、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、２６３／３３９／３８９／３９０、２６３／３９０、又は３０４／３４０／３７９／３８０／３８２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２８４に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項75】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号４８４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置３／１９４／３０４、３／２５９／２６３／３０４、３／２５９／３０４、３／２５９／３０４／３２４／３３９、３／２５９／３０４／３２４／３８２、３／２５９／３０４／３８２、３／２６３／３０４／３２４、３／２６３／３０４／３２４／３３９、３／２６３／３０４／３２４／３８２、３／３０４、３／３０４／３２４、１６、６３、７７、８０、８７／２７０、８７／２７０／３６５、８７／３２８／３６５、９１、９２、１２６、１４０、１５６、１６８／２７０／３２８／３３８、１８１、１９４、２０１、２５６、２５９、２５９／２６３、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３２４、２５９／２６３／３０４／３２４／３８２、２５９／２６３／３０４／３７９、２５９／２６３／３０４／３８２、２５９／３０４、２５９／３０４／３２４、２５９／３０４／３２４／３３９、２５９／３０４／３２４／３３９／３８２、２５９／３０４／３８２、２６２、２６３／３０４、２６３／３０４／３２４、２６３／３０４／３２４／３３９、２６３／３０４／３２４／３８２、２６３／３２４、２７０、２７０／３１９、２７０／３２８／３３８、２７０／３２８／３３８／３６５、３０４、３０４／３２４、３２４、３２８、３５２、３６５、３６６、又は３８２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号４８４に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項76】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号５９４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１６／６３／８０／１２６／１６８／３６６、１６／６３／８０／１２６／１８１／１９４／２５９／３２４／３２８／３６６、１６／６３／１２６／１６８／２７０／３２８／３６６、１６／８０／１２６／３２４／３６６、１６／８０／１２６／３６６、１６／８０／１６８、１６／８０／１６８／２７０／３６６、１６／８０／１６８／３２４、１６／８０／１６８／３６６、１６／８０／３２４、１６／９１／１２６／１６８／３２４／３６６、１６／１２６／１６８／３６６、１６／１６８／２５９／３６６、１６／１６８／２７０／３２４／３６６、１６／１６８／３２４／３２８／３６６、１６／１６８／３２４／３６６、１６／１６８／３６６、１６／２５９／２６３／３２８、１６／３２４／３２８／３６６、１６／３２８／３６６、８０／１２６／１６８／２７０／３６６、８０／１２６／１６８／３６６、８０／１２６／１８１／２７０／３２４／３６６、８０／１６８／２７０／３６６、又は１６８／３６６において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号５９４に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項77】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号６８６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置６６／７６／１１８／１４１／２０１／３００、６６／７６／１９８／２００／２９６／３０３、６６／７６／１９８／２００／３００、６６／１１８／２００／２９６／３０３／３１７、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／２００、７６／１１８／１４１／２００／２９６、７６／１４１／１９８／２００／２０１／３００、８０／２０１／２７０、８０／２７０、８０／２７０／３２４、８９／１１８／２００、１０６／２７０／３２４／３５２、１１８／１４１／２００、１２６、１２６／２０１／２７０／３２４、１２６／２７０、１４１／１４４／１９８／２００／３００、１５６／２７０、１５６／２７０／３２４、２０１／２７０、２０１／２７０／３５２、２７０、又は２７０／３２４において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項78】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号６８６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１９、１０９、１２３、１３４、１７０、１７３、１８７、２１１、又は３１２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項79】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号６８８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２００／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２１１、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１７０／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１９８／２００／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１７０／１７３／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／２１１／２７０／３１２、１０９／１７０／２１１／２７０／３１２、又は１０９／２１１／２７０／３１２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８８に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項80】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号７６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置５／４１、５／４１／２２８、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１２６、２６５、２６７、２７０、３３１、３５３、３５７、又は３８４において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項81】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号７６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置６６、６６／１１８、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／１１８／３００、６６／２９６、６６／２９６／３００、６６／３００、１１８、１１８／２９６、１１８／２９６／３００、１１８／３００、２９６、２９６／３００、又は３００において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項82】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号８２８の参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１７０／２７０／３８３、２７０、４１／１７３、２７２、５／１４１／２７２／３８３、４１／３８３、４１／１４１／１８７／２７２／２９０、４１／１４１／１７３／２９０、５／２７２／３８３、５／４１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１、１４１／２７２、３５３／３８４、２７２／３８３、４１／１４１／１７３、４１／２７２／３８３、４１／１４１／１８７／２００／２０２／２７２、３３／５５／６４／１２６／２７０／３５７、３３／１２６／３５３／３５７、５５／６４／２６７／３５／３８４、３３／６４／３５７、１２６／２６７、６４／２６７／３５３／３８４、３３／５５／６４／３５７、１９／６４／１２６／２６７、５５／２６７、３３／１２６／２６７／２７０／３１２／３５７、１９／３３／５５／３５３／３５７／３８４、１９／３３／１２６、１２６／３１２、１２６／１９８／２０２／２６７／３１２、１２６／３５３、５５／１２６、１２６／２７０／３８４、３３／６４／３５３／３５７、１９／２６７、５１／５５／２６７／２７０／３５３、３３／１２６／２６７／２７０、１９／５５／６４／１２６／２６７／２７０／３５３、１９／３３／１２６／２７０／３５３／３５７／３８４、１９／３３／６４／２６７／３５３、１２６／３５３／３８４、１２６／２７０／３１２／３５３／３８４、１９／３３／５５／１２６、３３／３５７、４７／５１／６４／１２６／３５３／３８４、１２６、又は１２６／２７０において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項83】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号８８８の参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置６４／１７３／２０２／３５３／３８４、４１／１４１／２７２／３５３、１４１／２０２／２７２／３５３／３５７、１７３／２０２／３５７、２０２／３５３、５／５１／１７３／２７２／３５３／３８４、５１／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２７２、２７２、４１／１７３／３８４、４１／６４／１４１／３５３／３５７／３８３、１４１／１７３／２０２、５／５１／６４／２０２／３５３、３５７、６４、５／４１／１４１、４１／１４１／１７３／２０２／３５３、３５３、２０２／３５７、５１／１４１／２０２／２７２／３５３、２０２、５１／１４１／１７３／３５３／３８４、４１／１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３８３／３８４、６４／２０２／３５７、５／６４／３５３／３８３／３８４、４１／２７２／３５３／３８３、４１／１７３／２７２／３５３／３５７、５１／１４１／２７２／３５３／３５７／３８３／３８４、４１／３５３／３５７、１７３／２７２／３５３／３５７、５／４１／６４／１７３／３５３／３５７、６４／１７３／３５７、５１／２７２、５１／６４／３５７／３８４、５１／１４１／１７３／２７２／３５３、６４／２０２／２７２／３５３／３５７／３８４、５１／２７２／３５７、５１／１７３／２７２／３５３／３８４、３５３／３８４、２０２／２７２／３５７、６４／１４１／１７３／２０２／３５３／３５７、５／４１／５１／２０２／３５７／３８３、５／５１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１／２７２、５１／１７３、５／３５３、４１／６４／１７３／２７２／３５３／３８３、５／６４／１７３／２７２／３５３、５１／６４、４１／３５７／３８３、４１／１７３／３５３／３５７、２０２／２７２／３８３、２０２／２７２、３５３／３５７、４１／１７３／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３５７、６４／１４１／２０２、又は５／１７３／２７２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項84】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素がポリペプチドが、表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、１１－２、１２－１、又は１２－２のいずれかに提供される変種ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドである、請求項４５～６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項85】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素がポリペプチドが、配列番号２～１０６４のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む、請求項４５～６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項86】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、配列番号１６～１０６４のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む、請求項４５～６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項87】
前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、野生型のプランクトミセス科種のロイシン脱炭酸酵素又は配列番号１２に対応する配列を有するロイシン脱炭酸酵素と比較して、１つ又はそれ以上の改良された特性を示す、請求項４５～８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項88】
前記改良された特性が、野生型のプランクトミセス科種のロイシン脱炭酸酵素、又は配列番号１２に対応する配列を有するロイシン脱炭酸酵素と比較して、（ｉ）ロイシンＥに対する活性の上昇、（ｉｉ）タンパク質分解に対する耐性の上昇、（ｉｉｉ）低ｐＨ環境に対する耐容性の上昇、及び／又は（ｉｖ）熱安定性の上昇のうちの１つ又はそれ以上である、請求項８７に記載の方法
【請求項89】
血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態を治療するための、請求項１～２５のいずれか１項に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素、又は請求項２６～３２のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項90】
血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態を治療するための薬剤の調製における、請求項１～２５のいずれか１項に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素の使用。
【請求項91】
前記疾患又は状態がメープルシロップ尿症、イソ吉草酸血症、又は３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症である、請求項８９又は９０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）のもとに、２０２１年１１月１日に提出された米国仮出願第６３／２７４，３９５号の利益を主張するものであり、その全文は参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）のもとに、２０２１年１１月１日に提出された米国仮出願第６３／２７４，３９５号の利益を主張するものであり、その全文は参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
配列リスト、表、又はコンピュータプログラムへの参照
ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由でファイル名ＣＸ７－２２１ＷＯ２＿ＳＴ２６．ｘｍｌとして同時に提出された配列リスト（２０２２年１０月３０日に作成され、ファイルサイズは２．０８メガバイトである）は、本明細書の一部であり、参照により本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由でファイル名ＣＸ７－２２１ＷＯ２＿ＳＴ２６．ｘｍｌとして同時に提出された配列リスト（２０２２年１０月３０日に作成され、ファイルサイズは２．０８メガバイトである）は、本明細書の一部であり、参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
技術分野
本開示は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）、その組成物、及び工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本開示はまた、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを治療目的及び産業目的で使用する方法に関する。
本開示は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）、その組成物、及び工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。本開示はまた、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを治療目的及び産業目的で使用する方法に関する。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）は、「ロイシン尿症」、「分岐鎖α－ロイシン脱水素酵素欠損症」、及び「ＢＣＫＤ欠損症」とも呼ばれ、ロイシン、イソロイシン、及びバリン（すなわち、分岐鎖アミノ酸）の異化経路に関与する分岐鎖ケト酸脱水素酵素（ＢＣＫＤＨ）複合体の機能不全に続発するまれな遺伝性アミノ酸代謝異常症である。これは、１９５４年に Ｍｅｎｋｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ， １９５４， １４：４６２－４６７ によって初めて記載され、罹患した新生児の尿が独特の甘い匂いを放つことからこの名前が付けられた。これはまた、哺乳不良、嘔吐、無気力、異常な行動（例えば、筋緊張亢進又は筋緊張低下）、及び発達遅延も特徴とする。この疾患は治療しないと、脳症、発作、昏睡、永久的な神経損傷、及び死亡に進行する可能性がある。後年は、発育遅延、学習障害、発作、運動障害が一般的である。病気の兆候と症状に基づいて、４つの一般的な形態に分類される。最も一般的で重篤なタイプは「古典的」タイプであり、これは、生後２週間以内に明らかになる。その他のタイプは、中間型ＭＳＵＤ、間欠性ＭＳＵＤ、チアミン反応性ＭＳＵＤである。古典的形態では、新生児がタンパク質を含むミルクを摂取した後に病気が明らかになる。その結果、体内のイソロイシン、ロイシン、バリンが増加し、これは脳に毒性を与える。間欠性形態では、脳損傷は身体的なストレス（例えば、感染症、発熱、長期間の断食など）の際に発生し、代謝の代償不全につながる。
メープルシロップ尿症（ＭＳＵＤ）は、「ロイシン尿症」、「分岐鎖α－ロイシン脱水素酵素欠損症」、及び「ＢＣＫＤ欠損症」とも呼ばれ、ロイシン、イソロイシン、及びバリン（すなわち、分岐鎖アミノ酸）の異化経路に関与する分岐鎖ケト酸脱水素酵素（ＢＣＫＤＨ）複合体の機能不全に続発するまれな遺伝性アミノ酸代謝異常症である。これは、１９５４年に Ｍｅｎｋｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ， １９５４， １４：４６２－４６７ によって初めて記載され、罹患した新生児の尿が独特の甘い匂いを放つことからこの名前が付けられた。これはまた、哺乳不良、嘔吐、無気力、異常な行動（例えば、筋緊張亢進又は筋緊張低下）、及び発達遅延も特徴とする。この疾患は治療しないと、脳症、発作、昏睡、永久的な神経損傷、及び死亡に進行する可能性がある。後年は、発育遅延、学習障害、発作、運動障害が一般的である。病気の兆候と症状に基づいて、４つの一般的な形態に分類される。最も一般的で重篤なタイプは「古典的」タイプであり、これは、生後２週間以内に明らかになる。その他のタイプは、中間型ＭＳＵＤ、間欠性ＭＳＵＤ、チアミン反応性ＭＳＵＤである。古典的形態では、新生児がタンパク質を含むミルクを摂取した後に病気が明らかになる。その結果、体内のイソロイシン、ロイシン、バリンが増加し、これは脳に毒性を与える。間欠性形態では、脳損傷は身体的なストレス（例えば、感染症、発熱、長期間の断食など）の際に発生し、代謝の代償不全につながる。
【0005】
新生児のＭＳＵＤの診断検査には、血液と尿のアミノ酸検査が含まれ、これらの体液中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及びバリン濃度が測定される。ＭＳＵＤが確認されると、ケトーシスとアシドーシスの兆候が見られる。診断後及び症状発現中は、治療はタンパク質を含まない食事の摂取及びアミノ酸レベルの上昇に伴う代謝結果の修正を含む。特別な静脈注射用溶液の使用は、ロイシンレベル（最も毒性が高い）を低下させ、エネルギー不足を修正する。
【0006】
ＭＳＵＤに加えて、ロイシン代謝及び分岐アミノ酸の他の障害には、イソ吉草酸血症及び３－メチルクロトニルグリシン尿症（３－メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症とも呼ばれる）などがある。これらのタイプの障害に対する現在の治療法には、ロイシン及びその他の分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の食事制限及び／又はタンパク質摂取制限が含まれる。ＢＣＡＡ代謝に関与する酵素のレベルが不足すると、脳脊髄液、血液、及び組織におけるＢＣＡＡ及びその関連代謝物の毒性蓄積が生じる。治療又は継続的な注意深いケアがなければ、多数の深刻な副作用（例えば、神経機能障害、発作、及び乳児死亡）につながる。ＢＣＡＡの一部は腎クリアランスによって代謝されるが（その結果、罹患患者の尿は典型的な甘いメープルシロップの匂いになる）、体内の毒性アミノ酸レベルの蓄積を軽減するには十分ではない（Ｓｃｈａｄｅｗａｌｔ ａｎｄ Ｗｅｎｄｅｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ．， １９９７， １５６（Ｓｕｐｐｌ． １）： Ｓ６２－６６；及び Ｓｋｖｏｒａｋ， Ｊ． Ｉｎｈｅｒｉｔ． Ｍｅｔａｂ． Ｄｉｓ．， ２００９， ３２（２）：２２９－４６を参照）。
【発明の概要】
【0007】
発明の要約
本発明は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）ポリペプチド及びその組成物、並びに工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施態様において、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、触媒活性の強化、タンパク質分解に対する感受性の低下、及び／又は低ｐＨに対する耐容性の上昇を含む改良された特性を有するように操作される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、改良された保存安定性を示すように工学操作されている。本発明はまた、治療及び産業目的で工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド及びその組成物を使用する方法を提供する。
本発明は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）ポリペプチド及びその組成物、並びに工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施態様において、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、触媒活性の強化、タンパク質分解に対する感受性の低下、及び／又は低ｐＨに対する耐容性の上昇を含む改良された特性を有するように操作される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、改良された保存安定性を示すように工学操作されている。本発明はまた、治療及び産業目的で工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド及びその組成物を使用する方法を提供する。
【0008】
１つの態様において、本発明は、野生型ロイシン脱炭酸酵素又は参照ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドと基本的に同じ条件下で比較したとき、改良された特性を有する工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド並びにその生物活性断片及び類似体に関する。
【0009】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0010】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８２８に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0011】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置５、１９、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１４１、１７０、１７３、１８７、１９８、２００、２０２、２６７、２７０、２７２、２９０、３１２、３５３、３５７、３８３、若しくは３８４、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0012】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、若しくは３５７、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、及び３５７の少なくとも２つアミノ酸位置に置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、及び／又は３５７において置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの実施態様において、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、及び／又は３５７における置換は、３３Ｌ、５５Ｉ、６４Ｎ、１２６Ａ、２７０Ｌ、及び３５７Ｓから選択される。
【0013】
いくつかのさらなる実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、配列番号８２８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、アミノ酸位置１７０／２７０／３８３、２７０、４１／１７３、２７２、５／１４１／２７２／３８３、４１／３８３、４１／１４１／１８７／２７２／２９０、４１／１４１／１７３／２９０、５／２７２／３８３、５／４１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１、１４１／２７２、３５３／３８４、２７２／３８３、４１／１４１／１７３、４１／２７２／３８３、４１／１４１／１８７／２００／２０２／２７２、３３／５５／６４／１２６／２７０／３５７、３３／１２６／３５３／３５７、５５／６４／２６７／３５／３８４、３３／６４／３５７、１２６／２６７、６４／２６７／３５３／３８４、３３／５５／６４／３５７、１９／６４／１２６／２６７、５５／２６７、３３／１２６／２６７／２７０／３１２／３５７、１９／３３／５５／３５３／３５７／３８４、１９／３３／１２６、１２６／３１２、１２６／１９８／２０２／２６７／３１２、１２６／３５３、５５／１２６、１２６／２７０／３８４、３３／６４／３５３／３５７、１９／２６７、５１／５５／２６７／２７０／３５３、３３／１２６／２６７／２７０、１９／５５／６４／１２６／２６７／２７０／３５３、１９／３３／１２６／２７０／３５３／３５７／３８４、１９／３３／６４／２６７／３５３、１２６／３５３／３８４、１２６／２７０／３１２／３５３／３８４、１９／３３／５５／１２６、３３／３５７、４７／５１／６４／１２６／３５３／３８４、１２６、又は１２６／２７０において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0014】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８８８に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0015】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８８８に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0016】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置５、１９、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１４１、１７０、１７３、１８７、１９８、２００、２０２、２６７、２７０、２７２、２９０、３１２、３５３、３５７、３８３、若しくは３８４、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0017】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸残基５Ｖ、１９Ｌ、３３Ｌ、４１Ｄ、４７Ｆ、５１Ｅ、５５Ｉ、６４Ｓ／Ｎ、１４１Ｐ、１７０Ｐ、１７３Ｉ、１８７Ｌ、１９８Ｇ、２００Ｓ、２０２Ｈ、２６７Ｌ、２７０Ｌ／Ｔ、２７２Ａ、２９０Ｉ、３１２Ｔ、３５３Ｅ、３５７Ｓ／Ｃ、３８３Ｓ、若しくは３８４Ｗ、又はこれらの組み合わせを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0018】
さらにいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８８８に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸位置６４／１７３／２０２／３５３／３８４、４１／１４１／２７２／３５３、１４１／２０２／２７２／３５３／３５７、１７３／２０２／３５７、２０２／３５３、５／５１／１７３／２７２／３５３／３８４、５１／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２７２、２７２、４１／１７３／３８４、４１／６４／１４１／３５３／３５７／３８３、１４１／１７３／２０２、５／５１／６４／２０２／３５３、３５７、６４、５／４１／１４１、４１／１４１／１７３／２０２／３５３、３５３、２０２／３５７、５１／１４１／２０２／２７２／３５３、２０２、５１／１４１／１７３／３５３／３８４、４１／１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３８３／３８４、６４／２０２／３５７、５／６４／３５３／３８３／３８４、４１／２７２／３５３／３８３、４１／１７３／２７２／３５３／３５７、５１／１４１／２７２／３５３／３５７／３８３／３８４、４１／３５３／３５７、１７３／２７２／３５３／３５７、５／４１／６４／１７３／３５３／３５７、６４／１７３／３５７、５１／２７２、５１／６４／３５７／３８４、５１／１４１／１７３／２７２／３５３、６４／２０２／２７２／３５３／３５７／３８４、５１／２７２／３５７、５１／１７３／２７２／３５３／３８４、３５３／３８４、２０２／２７２／３５７、６４／１４１／１７３／２０２／３５３／３５７、５／４１／５１／２０２／３５７／３８３、５／５１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１／２７２、５１／１７３、５／３５３、４１／６４／１７３／２７２／３５３／３８３、５／６４／１７３／２７２／３５３、５１／６４、４１／３５７／３８３、４１／１７３／３５３／３５７、２０２／２７２／３８３、２０２／２７２、３５３／３５７、４１／１７３／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３５７、６４／１４１／２０２、又は５／１７３／２７２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0019】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、表１２－１及び１２－２に提供される工学操作ロイシン脱炭酸酵素の少なくとも置換又は置換セットを含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記置換又は置換セットは、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0020】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、表１２－１及び１２－２に提供される工学操作ロイシン脱炭酸酵素の少なくとも置換又は置換セットを含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記置換又は置換セットは、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0021】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、表１２－１及び１２－２に提供される工学操作ロイシン脱炭酸酵素のアミノ酸配列を含む。
【0022】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８５４～１０６４のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。
【0023】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、野生型のプランクトミセス科（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）種のロイシン脱炭酸酵素又は配列番号１２に対応する配列を有する工学操作ロイシン脱炭酸酵素と比較して、１つ又はそれ以上の改良された特性を示す。いくつかの実施態様において、本明細書に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、野生型のプランクトミセス科種のロイシン脱炭酸酵素又は配列番号１２に対応するアミノ酸配列を有するロイシン脱炭酸酵素と比較して、（ｉ）ロイシンに対する活性の上昇、（ｉｉ）タンパク質分解に対する耐性の上昇、（ｉｉｉ）低ｐＨ環境に対する耐容性の上昇、若しくは（ｉｖ）熱安定性の上昇、又はこれらの任意の組み合わせから選択される改良された特性を示す。
【0024】
さらなる態様において、本開示はまた、本明細書に記載の少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドも提供する。いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８５３～１０６３の奇数の配列番号に対応するポリヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を含み、ここで、前記組換えポリヌクレオチドはロイシン脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする。いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号１５～８５１の奇数の配列番号のいずれかを含むポリヌクレオチド配列を含む。
【0025】
いくつかの追加の実施態様において、組換えポリヌクレオチド配列は制御配列に作動可能に連結されている。いくつかの実施態様において、前記組換えポリヌクレオチド配列はコドン最適化されている。
【0026】
別の態様において、本開示はまた、本明細書で提供される少なくとも１つの組換えポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。いくつかの実施態様において、発現ベクターはさらに、少なくとも１つ制御配列を含む。いくつかの実施態様において、制御配列はプロモーターを含む。さらにいくつかの実施態様において、プロモーターは１つの異種のプロモーターである。
【0027】
別の態様において、本発明はさらに、少なくとも１つポリヌクレオチド配列で形質転換され及び／又は本明細書に提供される発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、本明細書に提供されるポリヌクレオチド配列で形質転換されている。いくつかのさらなる実施態様において、宿主細胞は、本明細書で提供される発現ベクターを含む。いくつかの実施態様において、宿主細胞は大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）である。
【0028】
別の態様において、本開示はまた、宿主細胞中で工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、本明細書で提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞を適切な培養条件下で培養して、少なくとも１つのロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを産生させることを含む。いくつかの実施態様において、この方法はさらに、培養物及び／又は宿主細胞から少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを回収することを含む。いくつかの追加の実施態様において、この方法はさらに、前記少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを精製する工程を含む。
【0029】
別の態様において、本開示は、少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施態様において、前記組成物は、少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを含む医薬組成物である。いくつかの実施態様において、前記医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容し得る賦形剤及び／又は担体を含む。いくつかの実施態様において、少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを含む前記医薬組成物は、経口投与又は非経口投与に適している。いくつかの実施態様において、前記組成物は、丸薬、錠剤、カプセル剤、ジェルカプセル剤、液剤、又はエマルジョンの形態である。いくつかの追加の実施態様において、前記組成物は、哺乳動物、特にヒト患者への経口投与に適している。いくつかの実施態様において、前記組成物は、少なくとも１つ追加の治療に有効な化合物を含む。
【0030】
いくつかの実施態様において、本開示はまた、本明細書に開示される工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む組成物も提供し、ここで、前記ポリヌクレオチドは遺伝子治療に使用するのに適している。いくつかの実施態様において、前記組成物は、本明細書に開示される工学操作ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含み、ここで、前記発現ベクターは、血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルの上昇に関連する疾患又は状態の治療に使用するのに適した遺伝子治療ベクターである。いくつかの実施態様において、前記組成物は、ｍＲＮＡ療法に使用するのに適している。
【0031】
さらなる態様において、本開示は、血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態の症状を治療及び／又は予防する方法を提供する。いくつかの実施態様において、血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態の症状を治療及び／又は予防する方法は、それを必要とする被験体に、有効量の工学操作ロイシン脱炭酸酵素を投与して、被験体の血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させることを含む。いくつかの実施態様において、血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態は、メープルシロップ尿症、イソ吉草酸血症、又は３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症である。
【0032】
いくつかの実施態様において、被験体における血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させる方法も本明細書に提供され、この方法は、それを必要とする被験体に、有効量の工学操作ロイシン脱炭酸酵素を投与することを含む。いくつかの実施態様において、それを必要とする被験体は、メープルシロップ尿症、イソ吉草酸血症、又は３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症を患っている。
【0033】
被験体における、血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態の症状を治療及び／又は予防する方法の、又は血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルを低下させる方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ～４００ｍｇ／ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、約６．２５ｍｇ／ｋｇ～約１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【0034】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、それを必要とする被験体に、血漿中のロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させるのに有効な量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、それを必要とする被験体に、血漿中のロイシン、ケトイソカプロン酸、及びメチオニンのレベルを低下させるのに有効な量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、被験体に少なくとも２日間以上連続して投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、被験体に少なくとも３日間以上連続して投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、被験体に必要に応じて連続して投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、タンパク質を含む食事の摂取直前、摂取と同時、及び／又は摂取直後に投与される。
【0035】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素による治療のための被験体はメープルシロップ尿症を患っており、及びここで、前記メープルシロップ尿症の症状が緩和される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素による治療のための被験体はイソ吉草酸血症を患っており、及びここで、前記イソ吉草酸血症の症状が緩和される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素による治療のための被験体は３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症を患っており、及びここで、前記３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症の症状が緩和される。いくつかの実施態様において、被験体は、疾患を煩っている被験体が必要とする食事と比較して、ロイシン、イソロイシン、及び／又はバリン含有量の制限が少ない食事を摂取することができる。いくつかの実施態様において、被験体は、乳児、子供、若年成人、又は成人である。いくつかの実施態様において、被験体は乳児である。いくつかの実施態様において、被験体は子供である。
【0036】
いくつかの実施態様において、ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸の治療法又は血漿レベルを低下させる方法を含む本明細書に記載の方法及び使用のために、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、及び／又は８８８の少なくとも１つに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0037】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８の少なくとも１つに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して、１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0038】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号１２、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号１２、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して、１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0039】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号１２、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号１２に対応する参照配列に対して、１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0040】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置２、３、５、１２、１４、１６、１９、３３、３４、３８、３９、４１、４７、４８、５１、５５、６３、６４、６６、６９、７６、７７、８０、８７、８９、９１、９２、１０２、１０６、１０９、１１８、１２３、１２６、１２７、１３２、１３４、１３５、１３９、１４０、１４１、１５６、１６１、１６４、１６８、１７０、１７３、１８１、１８７、１８９、１９３、１９４、１９６、１９８、２００、２０１、２０２、２１１、２２３、２２８、２４５、２５５、２５６、２５９、２６２、２６３、２６５、２６７、２７０、２７２、２７５、２９０、２９６、２９９、３００、３０３、３０４、３１２、３１７、３１９、３２４、３２８、３３１、３３８、３３９、３４０、３４３、３４９、３５０、３５２、３５３、３５７、３６４、３６５、３６５、３６６、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９０、３９１、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、４０１、４０４、若しくは４０５、又はこれらの組み合わせにおいて、少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0041】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号１２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置５、１４、１４／３４／３８／３９／１０２／２６７／２７５／３５０／３５７、１４／３９／１０２／１２７／２４５／２６７／２７５／３４９／３５０、３４／３８／３９／１０２／１２７／２７５／３５７、３４／３８／３９／１０２／２７５／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３４９／３５０／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３５０／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２７５／３４９／３５７、３４／３９／１０２／２６４／２７５／３５０／３５７、３４／３９／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６４／２６７／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６７／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３５０、３８／３９／１０２／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／２４５／２６７／３５７、３８／３９／１２７／２６４／２７５、３８／３９／１２７／２６４／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５７、３８／３９／２４５／２７５／３５７、３８／３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３８／３９／２６４／２７５／３５７、３８／３９／２７５、３８／３９／２７５／３５０、３９、３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６７／２７５／３５７、３９／１２７／２４５／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／１２７／２４５／２６４／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２４５／３５７、３９／１２７／２６７／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２６７／３５０／３５７、３９／１２７／３５７、３９／２４５／２６４／２６７／２７５／３５７、３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／２７５／３５０／３５７、４８、１３９、１６４、１９６、２５５、２９９、３１８、３２４、３３９、３４３、３５０、３５３、３５７、３６４、３６５、３７９、３８１、３８６、３８９、３９１、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、又は４０５において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0042】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号３８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置４８／６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、４８／６４／１６４／３２４／３４３／３６４、４８／６４／１６４／３５３／３５７／３６４、４８／６４／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５７／３６４、６４／１６４／３５３／３５７、６４／３１８／３２４／３５７／３６４、６４／３２４／３５３／３５７／３６４、１３２／２５５／３３９／３７９／３９５、１６４／１９６／３２４／３５７／３６４、１６４／３１８／３２４／３４３／３５３／３５７、１６４／３１８／３２４／３５７／３６４、１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、１６４／３２４／３５７／３６４、１６４／３５３／３５７／３６４、１６４／３６４、１９６／３１８／３２４／３５３／３５７／３６４、３１８／３４３／３５７、３２４／３４３／３５７／３６４、３２４／３５３／３５７／３６４、３２４／３５７／３６４、３３９／３７９／３８９／３９４／３９５、３３９／３８９／３９５、３３９／３９１、３３９／３９４／３９５／４０５、３５７／３６４、３７９／３８６、３７９／３９４／３９５／３９７／４０４／４０５、３７９／３９４／３９５／３９７／４０５、３８９／３９４／３９５／３９７／４０５、又は３９４／３９７において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号３８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0043】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２３４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置２、３、３３、４８／６４／２５５、４８／２５５／３３９、４８／２５５／３７９、６４、６４／２５５、６９、１６１、１９３、２５５、２５５／３１８／３７９、２５９、２６３、３１８／３３９／３７９、３２４、３２４／３８９／３９４、３２４／３８９／３９４／３９５、３２４／３８９／３９４／３９７、３２４／３９４、３２４／３９４／３９５、３２４／３９４／３９５／３９７、３２４／３９５、３３９、３４０、３８０、３８２、３８９、３８９／３９４、３８９／３９４／３９５、３８９／３９４／３９５／３９７、３８９／３９４／３９７、３８９／３９５、３８９／３９７、３９０、３９４、３９４／３９５、３９４／３９５／３９７、３９５、３９５／３９７、３９７、４０１、又は４０５において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２３４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0044】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２８４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置２／６４／６９／３２４／３８０／３８２／３８８／３８９、３／６４／６９／２６３／３３９／３８０／３８８、３／６４／６９／３８９、３／６４／６９／３９０、３／６４／３７９／３８０／３９０、３／６９／２６３／３８０、３／６９／３２４、３／６９／３２４／３８０／３８２／３８９／３９０、１２／１３５／２５９／２６３、１２／１３５／２６３／３８２、１２／２５９／２６３／３０４、４８／６４／２５５、６４／６９、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、６４／６９／２２３／３８８、６４／６９／２２３／３８８／３８９／３９０、６４／６９／３０４／３７９／３８２、６４／６９／３２４、６４／６９／３２４／３３９／３８０／３８９／３９０、６４／６９／３３９、６４／６９／３３９／３８２／３８８／３８９、６４／６９／３３９／３８９／３９０、６４／６９／３７９／３８０、６４／６９／３８０／３８８／３９０、６４／６９／３８９、６４／６９／３９０、６４／２５５／２６３、６４／２６３、６４／３２４／３３９／３８９／３９０、６９／２２３／２６３／３２４／３８２／３８８／３９０、６９／２２３／３２４／３７９／３８０／３８２／３８８／３９０、６９／２６３、６９／２６３／３２４、６９／２６３／３３９、６９／２６３／３８８、６９／２６３／３８９／３９０、６９／３２４／３７９／３８０／３８８、６９／３２４／３８０、６９／３３９／３９０、６９／３８２／３９０、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、２６３／３３９／３８９／３９０、２６３／３９０、又は３０４／３４０／３７９／３８０／３８２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0045】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号４８４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置３／１９４／３０４、３／２５９／２６３／３０４、３／２５９／３０４、３／２５９／３０４／３２４／３３９、３／２５９／３０４／３２４／３８２、３／２５９／３０４／３８２、３／２６３／３０４／３２４、３／２６３／３０４／３２４／３３９、３／２６３／３０４／３２４／３８２、３／３０４、３／３０４／３２４、１６、６３、７７、８０、８７／２７０、８７／２７０／３６５、８７／３２８／３６５、９１、９２、１２６、１４０、１５６、１６８／２７０／３２８／３３８、１８１、１９４、２０１、２５６、２５９、２５９／２６３、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３２４、２５９／２６３／３０４／３２４／３８２、２５９／２６３／３０４／３７９、２５９／２６３／３０４／３８２、２５９／３０４、２５９／３０４／３２４、２５９／３０４／３２４／３３９、２５９／３０４／３２４／３３９／３８２、２５９／３０４／３８２、２６２、２６３／３０４、２６３／３０４／３２４、２６３／３０４／３２４／３３９、２６３／３０４／３２４／３８２、２６３／３２４、２７０、２７０／３１９、２７０／３２８／３３８、２７０／３２８／３３８／３６５、３０４、３０４／３２４、３２４、３２８、３５２、３６５、３６６、又は３８２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号４８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0046】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号５９４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１６／６３／８０／１２６／１６８／３６６、１６／６３／８０／１２６／１８１／１９４／２５９／３２４／３２８／３６６、１６／６３／１２６／１６８／２７０／３２８／３６６、１６／８０／１２６／３２４／３６６、１６／８０／１２６／３６６、１６／８０／１６８、１６／８０／１６８／２７０／３６６、１６／８０／１６８／３２４、１６／８０／１６８／３６６、１６／８０／３２４、１６／９１／１２６／１６８／３２４／３６６、１６／１２６／１６８／３６６、１６／１６８／２５９／３６６、１６／１６８／２７０／３２４／３６６、１６／１６８／３２４／３２８／３６６、１６／１６８／３２４／３６６、１６／１６８／３６６、１６／２５９／２６３／３２８、１６／３２４／３２８／３６６、１６／３２８／３６６、８０／１２６／１６８／２７０／３６６、８０／１２６／１６８／３６６、８０／１２６／１８１／２７０／３２４／３６６、８０／１６８／２７０／３６６、又は１６８／３６６において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号５９４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0047】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号６８６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置６６／７６／１１８／１４１／２０１／３００、６６／７６／１９８／２００／２９６／３０３、６６／７６／１９８／２００／３００、６６／１１８／２００／２９６／３０３／３１７、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／２００、７６／１１８／１４１／２００／２９６、７６／１４１／１９８／２００／２０１／３００、８０／２０１／２７０、８０／２７０、８０／２７０／３２４、８９／１１８／２００、１０６／２７０／３２４／３５２、１１８／１４１／２００、１２６、１２６／２０１／２７０／３２４、１２６／２７０、１４１／１４４／１９８／２００／３００、１５６／２７０、１５６／２７０／３２４、２０１／２７０、２０１／２７０／３５２、２７０、又は２７０／３２４において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0048】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号６８６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１９、１０９、１２３、１３４、１７０、１７３、１８７、２１１、又は３１２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0049】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号６８８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２００／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２１１、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１７０／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１９８／２００／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１７０／１７３／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／２１１／２７０／３１２、１０９／１７０／２１１／２７０／３１２、又は１０９／２１１／２７０／３１２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0050】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号７６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置５／４１、５／４１／２２８、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１２６、２６５、２６７、２７０、３３１、３５３、３５７、又は３８４において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0051】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号７６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置６６、６６／１１８、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／１１８／３００、６６／２９６、６６／２９６／３００、６６／３００、１１８、１１８／２９６、１１８／２９６／３００、１１８／３００、２９６、２９６／３００、又は３００において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0052】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８２８の参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１７０／２７０／３８３、２７０、４１／１７３、２７２、５／１４１／２７２／３８３、４１／３８３、４１／１４１／１８７／２７２／２９０、４１／１４１／１７３／２９０、５／２７２／３８３、５／４１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１、１４１／２７２、３５３／３８４、２７２／３８３、４１／１４１／１７３、４１／２７２／３８３、４１／１４１／１８７／２００／２０２／２７２、３３／５５／６４／１２６／２７０／３５７、３３／１２６／３５３／３５７、５５／６４／２６７／３５／３８４、３３／６４／３５７、１２６／２６７、６４／２６７／３５３／３８４、３３／５５／６４／３５７、１９／６４／１２６／２６７、５５／２６７、３３／１２６／２６７／２７０／３１２／３５７、１９／３３／５５／３５３／３５７／３８４、１９／３３／１２６、１２６／３１２、１２６／１９８／２０２／２６７／３１２、１２６／３５３、５５／１２６、１２６／２７０／３８４、３３／６４／３５３／３５７、１９／２６７、５１／５５／２６７／２７０／３５３、３３／１２６／２６７／２７０、１９／５５／６４／１２６／２６７／２７０／３５３、１９／３３／１２６／２７０／３５３／３５７／３８４、１９／３３／６４／２６７／３５３、１２６／３５３／３８４、１２６／２７０／３１２／３５３／３８４、１９／３３／５５／１２６、３３／３５７、４７／５１／６４／１２６／３５３／３８４、１２６、又は１２６／２７０において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0053】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８８８の参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及びここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置６４／１７３／２０２／３５３／３８４、４１／１４１／２７２／３５３、１４１／２０２／２７２／３５３／３５７、１７３／２０２／３５７、２０２／３５３、５／５１／１７３／２７２／３５３／３８４、５１／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２７２、２７２、４１／１７３／３８４、４１／６４／１４１／３５３／３５７／３８３、１４１／１７３／２０２、５／５１／６４／２０２／３５３、３５７、６４、５／４１／１４１、４１／１４１／１７３／２０２／３５３、３５３、２０２／３５７、５１／１４１／２０２／２７２／３５３、２０２、５１／１４１／１７３／３５３／３８４、４１／１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３８３／３８４、６４／２０２／３５７、５／６４／３５３／３８３／３８４、４１／２７２／３５３／３８３、４１／１７３／２７２／３５３／３５７、５１／１４１／２７２／３５３／３５７／３８３／３８４、４１／３５３／３５７、１７３／２７２／３５３／３５７、５／４１／６４／１７３／３５３／３５７、６４／１７３／３５７、５１／２７２、５１／６４／３５７／３８４、５１／１４１／１７３／２７２／３５３、６４／２０２／２７２／３５３／３５７／３８４、５１／２７２／３５７、５１／１７３／２７２／３５３／３８４、３５３／３８４、２０２／２７２／３５７、６４／１４１／１７３／２０２／３５３／３５７、５／４１／５１／２０２／３５７／３８３、５／５１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１／２７２、５１／１７３、５／３５３、４１／６４／１７３／２７２／３５３／３８３、５／６４／１７３／２７２／３５３、５１／６４、４１／３５７／３８３、４１／１７３／３５３／３５７、２０２／２７２／３８３、２０２／２７２、３５３／３５７、４１／１７３／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３５７、６４／１４１／２０２、又は５／１７３／２７２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0054】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、野生型のプランクトミセス科種のロイシン脱炭酸酵素又は配列番号１２に対応する配列を有する工学操作ロイシン脱炭酸酵素と比較して、１つ又はそれ以上の改良された特性を示す。いくつかの実施態様において、前記改良された特性は、野生型のプランクトミセス科種又は配列番号１２に対応するアミノ酸配列を有するロイシン脱炭酸酵素と比較して、（ｉ）ロイシンに対する活性の上昇、（ｉｉ）タンパク質分解に対する耐性の上昇、（ｉｉｉ）低ｐＨ環境に対する耐容性の上昇、若しくは（ｉｖ）熱安定性の上昇、又はこれらの任意の組み合わせから選択される。
【0055】
方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、１１－２、１２－１、及び／又は１２－２のいずれかに提供される少なくとも１つのロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを含む。方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２～１０６４のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号１６～１０６４のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【0056】
【図1A】図１Ａ及び１Ｂは、中間型ＭＳＵＤマウスモデルにおける工学操作ロイシン脱炭酸酵素の効果に関する薬力学的（ＰＤ）試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に工学操作ロイシン脱炭酸酵素で処理すると、血漿ロイシンレベルが抑制される。図１Ａは、ビヒクル、配列番号４８４のＬＤＣポリペプチド、配列番号６８６のＬＤＣポリペプチド、又は配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドで処理した動物の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図１Ｂは、血漿ロイシンＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較したチューキー（Ｔｕｋｅｙ）の事後検定を伴う一元配置分散分析：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図1B】図１Ａ及び１Ｂは、中間型ＭＳＵＤマウスモデルにおける工学操作ロイシン脱炭酸酵素の効果に関する薬力学的（ＰＤ）試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に工学操作ロイシン脱炭酸酵素で処理すると、血漿ロイシンレベルが抑制される。図１Ａは、ビヒクル、配列番号４８４のＬＤＣポリペプチド、配列番号６８６のＬＤＣポリペプチド、又は配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドで処理した動物の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図１Ｂは、血漿ロイシンＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較したチューキー（Ｔｕｋｅｙ）の事後検定を伴う一元配置分散分析：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図2A】図２Ａ及び２Ｂは、ｉＭＳＵＤマウスモデルにおける配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドの薬力学的（ＰＤ）用量反応試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの異なる量で処理すると、血漿ロイシンレベルの用量依存的な抑制がもたらされる。図２Ａは、ビヒクル又は３つの異なる用量の配列番号７６６のＬＤＣで処理した動物の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図２Ｂは、血漿ロイシンＡＵＣを示す。ビヒクルと比較した一元配置分散分析：＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図2B】図２Ａ及び２Ｂは、ｉＭＳＵＤマウスモデルにおける配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドの薬力学的（ＰＤ）用量反応試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの異なる量で処理すると、血漿ロイシンレベルの用量依存的な抑制がもたらされる。図２Ａは、ビヒクル又は３つの異なる用量の配列番号７６６のＬＤＣで処理した動物の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図２Ｂは、血漿ロイシンＡＵＣを示す。ビヒクルと比較した一元配置分散分析：＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図3A】図３Ａ及び３Ｂは、ｉＭＳＵＤマウスモデルにおける、配列番号８２８の工学操作ＬＤＣポリペプチドと配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドを比較した薬力学的（ＰＤ）用量反応試験の結果を示す。図３Ａは、ホエータンパク質食後の配列番号７６６のＬＤＣポリペプチド又は配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドによる処理の血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。図３Ｂは、対応する血漿ロイシンＡＵＣを示す；ビヒクルと比較した一元配置分散分析：＊、ｐ＜０．０５。
【図3B】図３Ａ及び３Ｂは、ｉＭＳＵＤマウスモデルにおける、配列番号８２８の工学操作ＬＤＣポリペプチドと配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドを比較した薬力学的（ＰＤ）用量反応試験の結果を示す。図３Ａは、ホエータンパク質食後の配列番号７６６のＬＤＣポリペプチド又は配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドによる処理の血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。図３Ｂは、対応する血漿ロイシンＡＵＣを示す；ビヒクルと比較した一元配置分散分析：＊、ｐ＜０．０５。
【図4A】図４Ａ～４Ｄは、健康なカニクイザルにおける工学操作ロイシン脱炭酸酵素の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験を示す。図４Ａは、配列番号４８４の工学操作ＬＤＣポリペプチドを３つの異なる用量で投与した後の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図４Ｂは、配列番号６８６のＬＤＣポリペプチドを３つの異なる用量で投与した後の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図４Ｃは、配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドを３つの異なる用量で投与した後の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図４Ｄは、異なる用量で投与された工学操作ロイシン脱炭酸酵素の対応する血漿ロイシンＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した一元配置分散分析：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図4B】図４Ａ～４Ｄは、健康なカニクイザルにおける工学操作ロイシン脱炭酸酵素の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験を示す。図４Ａは、配列番号４８４の工学操作ＬＤＣポリペプチドを３つの異なる用量で投与した後の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図４Ｂは、配列番号６８６のＬＤＣポリペプチドを３つの異なる用量で投与した後の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図４Ｃは、配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドを３つの異なる用量で投与した後の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図４Ｄは、異なる用量で投与された工学操作ロイシン脱炭酸酵素の対応する血漿ロイシンＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した一元配置分散分析：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図4C】図４Ａ～４Ｄは、健康なカニクイザルにおける工学操作ロイシン脱炭酸酵素の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験を示す。図４Ａは、配列番号４８４の工学操作ＬＤＣポリペプチドを３つの異なる用量で投与した後の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図４Ｂは、配列番号６８６のＬＤＣポリペプチドを３つの異なる用量で投与した後の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図４Ｃは、配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドを３つの異なる用量で投与した後の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図４Ｄは、異なる用量で投与された工学操作ロイシン脱炭酸酵素の対応する血漿ロイシンＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した一元配置分散分析：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図4D】図４Ａ～４Ｄは、健康なカニクイザルにおける工学操作ロイシン脱炭酸酵素の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験を示す。図４Ａは、配列番号４８４の工学操作ＬＤＣポリペプチドを３つの異なる用量で投与した後の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図４Ｂは、配列番号６８６のＬＤＣポリペプチドを３つの異なる用量で投与した後の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図４Ｃは、配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドを３つの異なる用量で投与した後の血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図４Ｄは、異なる用量で投与された工学操作ロイシン脱炭酸酵素の対応する血漿ロイシンＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した一元配置分散分析：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。
【図5A】図５Ａ～５Ｄは、健康なカニクイザルにおける配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドを用いた薬力学的（ＰＤ）用量反応試験及び３日間反復投与試験の結果を示す。図５Ａは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの３つの異なる用量で処理した後の血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図５Ｂは、対応する血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルに対する一元配置分散分析：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。図５Ｃは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの３つの異なる用量について、血漿ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）の経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。図５Ｄは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの異なる用量について、対応する血漿ＫＩＣ ｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルに対する一元配置分散分析：＊＊、ｐ＜０．０１。
【図5B】図５Ａ～５Ｄは、健康なカニクイザルにおける配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドを用いた薬力学的（ＰＤ）用量反応試験及び３日間反復投与試験の結果を示す。図５Ａは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの３つの異なる用量で処理した後の血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図５Ｂは、対応する血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルに対する一元配置分散分析：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。図５Ｃは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの３つの異なる用量について、血漿ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）の経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。図５Ｄは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの異なる用量について、対応する血漿ＫＩＣ ｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルに対する一元配置分散分析：＊＊、ｐ＜０．０１。
【図5C】図５Ａ～５Ｄは、健康なカニクイザルにおける配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドを用いた薬力学的（ＰＤ）用量反応試験及び３日間反復投与試験の結果を示す。図５Ａは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの３つの異なる用量で処理した後の血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図５Ｂは、対応する血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルに対する一元配置分散分析：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。図５Ｃは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの３つの異なる用量について、血漿ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）の経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。図５Ｄは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの異なる用量について、対応する血漿ＫＩＣ ｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルに対する一元配置分散分析：＊＊、ｐ＜０．０１。
【図5D】図５Ａ～５Ｄは、健康なカニクイザルにおける配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドを用いた薬力学的（ＰＤ）用量反応試験及び３日間反復投与試験の結果を示す。図５Ａは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの３つの異なる用量で処理した後の血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５。図５Ｂは、対応する血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルに対する一元配置分散分析：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。図５Ｃは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの３つの異なる用量について、血漿ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）の経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較した多重ｔ検定：＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。図５Ｄは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの異なる用量について、対応する血漿ＫＩＣ ｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルに対する一元配置分散分析：＊＊、ｐ＜０．０１。
【図6A】図６Ａ及び６Ｂは、連続３日間の刺激投与で健康なカニクイザルにおけるホエータンパク質食中のロイシンに対する配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの有効性を調べた試験の結果を示す。図６Ａは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドによる処理後の血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。多重ｔ検定＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図６Ｂは、対応する血漿ロイシンＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。対応のないｔ検定；ビヒクル対処理 ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。図６Ｃは、ベースラインを差し引いた血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。多重ｔ検定＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図６Ｄは、対応する血漿ロイシンｉＡＵＣ（ベースラインを差し引いたもの）を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。対応のないｔ検定、ビヒクル対処理 ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図6B】図６Ａ及び６Ｂは、連続３日間の刺激投与で健康なカニクイザルにおけるホエータンパク質食中のロイシンに対する配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの有効性を調べた試験の結果を示す。図６Ａは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドによる処理後の血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。多重ｔ検定＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図６Ｂは、対応する血漿ロイシンＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。対応のないｔ検定；ビヒクル対処理 ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。図６Ｃは、ベースラインを差し引いた血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。多重ｔ検定＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図６Ｄは、対応する血漿ロイシンｉＡＵＣ（ベースラインを差し引いたもの）を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。対応のないｔ検定、ビヒクル対処理 ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図6C】図６Ａ及び６Ｂは、連続３日間の刺激投与で健康なカニクイザルにおけるホエータンパク質食中のロイシンに対する配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの有効性を調べた試験の結果を示す。図６Ａは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドによる処理後の血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。多重ｔ検定＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図６Ｂは、対応する血漿ロイシンＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。対応のないｔ検定；ビヒクル対処理 ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。図６Ｃは、ベースラインを差し引いた血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。多重ｔ検定＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図６Ｄは、対応する血漿ロイシンｉＡＵＣ（ベースラインを差し引いたもの）を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。対応のないｔ検定、ビヒクル対処理 ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図6D】図６Ａ及び６Ｂは、連続３日間の刺激投与で健康なカニクイザルにおけるホエータンパク質食中のロイシンに対する配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの有効性を調べた試験の結果を示す。図６Ａは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドによる処理後の血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。多重ｔ検定＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図６Ｂは、対応する血漿ロイシンＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。対応のないｔ検定；ビヒクル対処理 ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。図６Ｃは、ベースラインを差し引いた血漿ロイシンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。多重ｔ検定＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。図６Ｄは、対応する血漿ロイシンｉＡＵＣ（ベースラインを差し引いたもの）を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。対応のないｔ検定、ビヒクル対処理 ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図7A】図７Ａ及び７Ｂは、連続３日間の刺激投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）で、健康なカニクイザルにホエータンパク質食中のメチオニンに対する配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの有効性を調べた試験の結果を示す。図７Ａは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドによる処理後のベースラインを差し引いた血漿メチオニンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。多重ｔ検定 ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。図７Ｂは、対応する血漿メチオニンｉＡＵＣ（ベースラインを差し引いたもの）を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。対応のないｔ検定；ビヒクル対処理 ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図7B】図７Ａ及び７Ｂは、連続３日間の刺激投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）で、健康なカニクイザルにホエータンパク質食中のメチオニンに対する配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドの有効性を調べた試験の結果を示す。図７Ａは、配列番号７６６の工学操作ＬＤＣポリペプチドによる処理後のベースラインを差し引いた血漿メチオニンの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。多重ｔ検定 ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。図７Ｂは、対応する血漿メチオニンｉＡＵＣ（ベースラインを差し引いたもの）を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。対応のないｔ検定；ビヒクル対処理 ＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１。
【図8A】図８Ａ及び８Ｂは、中間型ＭＳＵＤマウスモデルにおける工学操作ＬＤＣポリペプチドの効果の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に３用量の工学操作ＬＤＣ（配列番号８２８）で処理すると、血漿ロイシンレベルが抑制される。図８Ａは、ビヒクル並びに２５、５０、及び１００ｍｇ／ｋｇの配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドで処理したマウスにおける正規化された血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ウェルチの補正による対応のない多重ｔ検定（ビヒクルと比較）：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図８Ｂは、血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較したチューキー事後検定を伴う一元配置分散分析：＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図8B】図８Ａ及び８Ｂは、中間型ＭＳＵＤマウスモデルにおける工学操作ＬＤＣポリペプチドの効果の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に３用量の工学操作ＬＤＣ（配列番号８２８）で処理すると、血漿ロイシンレベルが抑制される。図８Ａは、ビヒクル並びに２５、５０、及び１００ｍｇ／ｋｇの配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドで処理したマウスにおける正規化された血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ウェルチの補正による対応のない多重ｔ検定（ビヒクルと比較）：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図８Ｂは、血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較したチューキー事後検定を伴う一元配置分散分析：＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図9A】図９Ａ及び９Ｂは、健康なカニクイザルにおける工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）の効果の薬力学的（ＰＤ）試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に３用量の工学操作ＬＤＣ（配列番号８２８）で処理すると、血漿ロイシンレベルが抑制される。図９Ａは、ビヒクル並びに６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇの配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドで処理したサルの正規化された血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ウェルチの補正による対応のない多重ｔ検定（ビヒクルと比較）：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。図９Ｂは、血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較したチューキー事後検定を伴う一元配置分散分析：＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図9B】図９Ａ及び９Ｂは、健康なカニクイザルにおける工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）の効果の薬力学的（ＰＤ）試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に３用量の工学操作ＬＤＣ（配列番号８２８）で処理すると、血漿ロイシンレベルが抑制される。図９Ａは、ビヒクル並びに６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇの配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドで処理したサルの正規化された血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ウェルチの補正による対応のない多重ｔ検定（ビヒクルと比較）：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。図９Ｂは、血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較したチューキー事後検定を伴う一元配置分散分析：＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図10A】図１０Ａ、１０Ｂ、及び１０Ｃは、健康なカニクイザルにおける工学操作ＬＤＣの効果の薬力学的（ＰＤ）試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に３用量の工学操作ＬＤＣ（配列番号８２８）で処理すると、血漿ロイシン及びＫＩＣレベルが抑制される。図１０Ａは、ビヒクル並びに３．１２５、６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇの配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドで処理したサルの正規化された血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ウェルチの補正による対応のない多重ｔ検定（ビヒクルと比較）：＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図１０Ｂは、血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。テューキー事後検定を伴う一元配置分散分析（ビヒクルと比較）：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。図１０Ｃは血漿ＫＩＣ ｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較したテューキー事後検定を伴う一元配置分散分析：＊ｐ＜０．０５。
【図10B】図１０Ａ、１０Ｂ、及び１０Ｃは、健康なカニクイザルにおける工学操作ＬＤＣの効果の薬力学的（ＰＤ）試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に３用量の工学操作ＬＤＣ（配列番号８２８）で処理すると、血漿ロイシン及びＫＩＣレベルが抑制される。図１０Ａは、ビヒクル並びに３．１２５、６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇの配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドで処理したサルの正規化された血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ウェルチの補正による対応のない多重ｔ検定（ビヒクルと比較）：＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図１０Ｂは、血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。テューキー事後検定を伴う一元配置分散分析（ビヒクルと比較）：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。図１０Ｃは血漿ＫＩＣ ｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較したテューキー事後検定を伴う一元配置分散分析：＊ｐ＜０．０５。
【図11A】図１１Ａ、１１Ｂ、及び１１Ｃは、健康なカニクイザルにおける工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）の効果の薬力学的（ＰＤ）３日間反復投与試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に低用量（６．２５ｍｇ／ｋｇ）の工学操作ＬＤＣ（配列番号８２８）で処理すると、血漿ロイシン及びＫＩＣレベルが抑制される。図１１Ａは、ビヒクル及び６．２５ｍｇ／ｋｇの配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドで処理したサルの正規化された血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ウェルチの補正による対応のない多重ｔ検定（ビヒクルと比較）。図１１Ｂは、血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。テューキー事後検定を伴う一元配置分散分析（ビヒクルと比較）：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。図１１Ｃは血漿ＫＩＣ ｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較したチューキー事後検定を伴う一元配置分散分析：＊ｐ＜０．０５。
【図11B】図１１Ａ、１１Ｂ、及び１１Ｃは、健康なカニクイザルにおける工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）の効果の薬力学的（ＰＤ）３日間反復投与試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に低用量（６．２５ｍｇ／ｋｇ）の工学操作ＬＤＣ（配列番号８２８）で処理すると、血漿ロイシン及びＫＩＣレベルが抑制される。図１１Ａは、ビヒクル及び６．２５ｍｇ／ｋｇの配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドで処理したサルの正規化された血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ウェルチの補正による対応のない多重ｔ検定（ビヒクルと比較）。図１１Ｂは、血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。テューキー事後検定を伴う一元配置分散分析（ビヒクルと比較）：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。図１１Ｃは血漿ＫＩＣ ｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較したチューキー事後検定を伴う一元配置分散分析：＊ｐ＜０．０５。
【図11C】図１１Ａ、１１Ｂ、及び１１Ｃは、健康なカニクイザルにおける工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）の効果の薬力学的（ＰＤ）３日間反復投与試験の結果を示す。ホエータンパク質食の投与後に低用量（６．２５ｍｇ／ｋｇ）の工学操作ＬＤＣ（配列番号８２８）で処理すると、血漿ロイシン及びＫＩＣレベルが抑制される。図１１Ａは、ビヒクル及び６．２５ｍｇ／ｋｇの配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドで処理したサルの正規化された血漿ロイシンレベルの経時変化を示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ウェルチの補正による対応のない多重ｔ検定（ビヒクルと比較）。図１１Ｂは、血漿ロイシンｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。テューキー事後検定を伴う一元配置分散分析（ビヒクルと比較）：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。図１１Ｃは血漿ＫＩＣ ｉＡＵＣを示す。データは平均±ＳＥＭとして示されている。ビヒクルと比較したチューキー事後検定を伴う一元配置分散分析：＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【0057】
発明の説明
本開示は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）ポリペプチド及びその組成物、並びに工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、触媒活性の強化、並びにタンパク質分解に対する感受性の低下、低ｐＨ環境に対する耐容性の上昇、及び／又は耐熱性の上昇を提供するように工学操作される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、改良された保存安定性を提供するように進化される。本開示はまた、治療及び産業目的のための、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド及びその組成物の使用方法を提供する。
本開示は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）ポリペプチド及びその組成物、並びに工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、触媒活性の強化、並びにタンパク質分解に対する感受性の低下、低ｐＨ環境に対する耐容性の上昇、及び／又は耐熱性の上昇を提供するように工学操作される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、改良された保存安定性を提供するように進化される。本開示はまた、治療及び産業目的のための、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド及びその組成物の使用方法を提供する。
【0058】
略語と定義
他に定義されない限り、本明細書で使用されているすべての技術用語及び科学用語は一般に、本発明が関係する技術分野の通常の技術者が一般的に理解している意味と同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用されている命名法、及び以下で説明する細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学、及び核酸化学の実験操作は、当該技術分野でよく知られており、一般的に使用されているものである。このような技術はよく知られており、当業者によく知られている多数の教科書及び参考文献に記載されている。化学合成及び化学分析には、標準技術又はその修正版が使用される。本明細書で言及されている上記及び下記のすべての特許、特許出願、論文、及び刊行物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
他に定義されない限り、本明細書で使用されているすべての技術用語及び科学用語は一般に、本発明が関係する技術分野の通常の技術者が一般的に理解している意味と同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用されている命名法、及び以下で説明する細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学、及び核酸化学の実験操作は、当該技術分野でよく知られており、一般的に使用されているものである。このような技術はよく知られており、当業者によく知られている多数の教科書及び参考文献に記載されている。化学合成及び化学分析には、標準技術又はその修正版が使用される。本明細書で言及されている上記及び下記のすべての特許、特許出願、論文、及び刊行物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0059】
本明細書に記載のものと類似又は同等の適切な方法及び材料はいずれも本発明の実施に使用できるが、本明細書ではいくつかの方法及び材料について説明する。本発明は、記載された特定の方法、プロトコール、及び試薬に限定されないことを理解されたい。これらは、当業者が使用する状況に応じて変化する可能性があるからである。従って、すぐ下に定義される用語は、出願全体を参照することにより、より完全に定義される。本明細書で言及される上記及び下記すべての特許、特許出願、論文、及び刊行物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【0060】
また、本明細書で使用される単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈から明らかに別の意味が示されていない限り、複数形の参照も含む。
【0061】
数値範囲には、範囲を定義する数値が含まれる。従って、ここで開示されるすべての数値範囲は、その広い数値範囲内に含まれるすべての狭い数値範囲を、あたかもそのような狭い数値範囲がすべて本明細書に明示的に記載されているかのように包含することを意図している。また、ここで開示されるすべての最大（又は最小）の数値制限は、すべてのより低い（又はより高い）数値制限を、あたかもそのようなより低い（又はより高い）数値制限が本明細書に明示的に記載されているかのように包含することを意図している。
【0062】
用語「約」という用語は、特定の値に対する許容誤差を意味する。場合によっては、「約」は、特定の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％、又は２．０％以内を意味する。場合によっては、「約」は、特定の値の１、２、３、又は４標準偏差以内を意味する。
【0063】
さらに、本明細書で提供される見出しは、出願全体を参照して得られる本発明のさまざまな態様又は実施態様を制限するものではない。従って、すぐ下で定義される用語は、出願全体を参照してより完全に定義される。それでも、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【0064】
特に明記しない限り、核酸は５’から３’の方向で左から右に記述され、アミノ酸配列はそれぞれアミノからカルボキシの方向で左から右に記述される。
【0065】
本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及びその同義語は、包括的な意味で使用される（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語及びその対応する同義語と同等である）。
【0066】
「ＥＣ」番号は、国際生化学及び分子生物学連合命名委員会（ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づいた酵素の数値分類システムである。
【0067】
「ＡＴＣＣ」とは、遺伝子や菌株を含む生物貯蔵品（ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を保有するアメリカタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を指す。
【0068】
「ＮＣＢＩ」とは、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及びそこで提供される配列データベースを指す。
【0069】
本明細書で使用される用語「ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド」又は「ＬＤＣ」は、バリン脱炭酸酵素クラス（ＥＣ４．１．１．１４）のメンバーを指す。これらの酵素は、ピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）補助因子を使用して、バリンやロイシンなどのアミノ酸を脱炭酸し、それぞれ２－メチルプロパンアミンとイソペンチルアミンを生成し、同時に二酸化炭素を放出する。
【0070】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」は、本明細書では、長さや翻訳後修飾（例えば、グリコシル化又はリン酸化）に関係なく、アミド結合によって共有結合した少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表すために互換的に使用される。
【0071】
本明細書において、「ポリヌクレオチド」は、少なくとも２つのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれか）を含むポリマーを指すために使用される。
【0072】
本書では、「アミノ酸」は、一般に知られている３文字の記号、又はＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ生化学命名委員会が推奨する１文字の記号で表される。同様に、ヌクレオチドは、示されているように、一般に受け入れられている１文字のコードで参照される場合がある。遺伝的にコード化されたアミノ酸に使用される略語は慣例的なものであり、次のとおりである：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）。
【0073】
用語「工学操作」、「組み換え」、「非天然」、及び「変種」は、細胞、ポリヌクレオチド、又はポリペプチドに関して使用される場合、本来は自然界には存在しないかような方法で修飾された自然の若しくは本来の形態に対応する物質、又はそれと同一であるが、合成材料から及び／若しくは組み換え技術を使用する操作によって生成された材料を指す。いくつかの実施態様において、「組み換えＬＤＣポリペプチド」（本明細書では「工学操作ＬＤＣポリペプチド」、「変種ＬＤＣ酵素」、及び「ＬＤＣ変種」とも呼ぶ）は、組み換え技術を使用して作成されたロイシン脱炭酸酵素である。
【0074】
ここで使用される「野生型」及び「天然に存在する」は、自然界で見られる形態を指す。例えば、野生型のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、自然界の供給源から単離することができ、人間の操作によって意図的に修飾されていない生物に存在する配列である。
【0075】
「コード配列」とは、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（遺伝子など）の部分を指す。
【0076】
用語「パーセント（％）配列同一性」は、本明細書では、ポリヌクレオチド間及びポリペプチド間の比較を指すために使用され、比較ウィンドウにわたって最適に整列された２つの配列を比較することによって決定され、比ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の較ウィンドウ内の部分は、２つの配列の最適整列のための参照配列と比較して、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含むことができる。パーセントは、両方の配列で同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を算出し、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性パーセントを算出することによって計算することができる。あるいは、パーセントは、両方の配列で同一の核酸塩基若しくはアミノ酸残基が存在するか、又は核酸塩基若しくはアミノ酸残基がギャップと整列される位置の数を決定して一致した位置の数を算出し、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性パーセントを算出することによって計算することができる。当業者であれば、２つの配列を整列させるために利用可能な確立されたアルゴリズムが多数あることを理解している。比較のための配列の最適な整列は、（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎのローカル相同性アルゴリズム；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．， １９８１， ２：４８２ により）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈの相同整列アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９７０， ４８：４４３）により、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎの類似性検索法（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８８， ８５：２４４４）により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、又は当技術分野で知られている目視検査によって実行することができる。パーセント配列同一性及び配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例には、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９０， ２１５： ４０３－４１０；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９７７， ３３８９－３４０２ を参照）が含まれる。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＷｅｂサイトから公開されている。このアルゴリズムでは、まずデータベース配列内の同じ長さの単語と並べた場合に、いくつかの正の値の閾値スコア「Ｔ」と一致するかそれを満たすクエリ配列内の長さの短い単語「Ｗ」を特定することにより、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、近傍単語スコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、前出、を参照）。これらの最初の近傍単語ヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシード（ｓｅｅｄ）として機能する。次に、累積整列スコアを増やせる限り、各配列に沿って両方向に単語ヒットが拡張される。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメーター「Ｍ」（一致する残基の対に対する報酬スコア；常に＞０）と「Ｎ」（不一致残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して累積スコアが計算される。各方向の単語ヒットの拡張は、次の場合に停止される：累積整列スコアが最大達成値から量「Ｘ」だけ減少した場合；１つ又はそれ以上の負のスコアの残基整列の蓄積のために、累積スコアが０以下になった場合；又は、いずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、及び両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８９， ８９：１０９１５ を参照）を使用する。配列の整列及び％配列同一性の例示的な決定には、提供されるデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧウィスコンシンソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴプログラム又はＧＡＰプログラムを使用することができる。
【0077】
「参照配列」とは、配列比較の基礎として使用される定義済みの配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、全長遺伝子又はアミノ酸配列のセグメントであってもよい。一般に参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド又はアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５残基の長さ、少なくとも５０残基の長さ、少なくとも１００残基の長さ、又は核酸又はポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドはそれぞれ、（１）２つの配列間で類似する配列（すなわち、完全な配列の一部）を含み、（２）２つの配列間で異なる配列をさらに含む可能性があるため、２つ（又はそれ以上）のポリヌクレオチド又はポリペプチド間の配列比較は、通常、２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較し、配列類似性の局所領域を識別して比較することによって実行される。いくつかの実施態様において、「参照配列」は一次アミノ酸配列に基づくことができ、ここで、前記参照配列は一次配列に１つ又はそれ以上の変化を有し得る配列である。例えば、「「Ｘ１２３」に対応する残基にバリンを有する配列番号６８６に基づく参照配列」という語句は、配列番号６８６の位置Ｘ１２３の対応する残基（例えば、チロシン）がバリンに変更された参照配列を指す。
【0078】
「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約２０個の連続したヌクレオチド位置又はアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、ここで、ある配列が少なくとも２０個の連続したヌクレオチド又はアミノ酸の参照配列と比較され、及びここで、前記比較ウィンドウ内の配列の部分は、２つの配列を最適に整列させるために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下の付加又は欠失（つまりギャップ）を含むことができる。比較ウィンドウは２０個の連続した残基よりも長くてもよく、任意選択的に３０、４０、５０、１００、又はそれ以上のウィンドウが含まれる。
【0079】
所定のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用される「に対応する」、「を参照」、及び「に関して」は、所定のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合の、指定された参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所定のポリマーの残基番号又は残基位置は、所定のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値位置ではなく、参照配列をに関連して指定される。例えば、工学操作ロイシン脱炭酸酵素のアミノ酸配列などの所定のアミノ酸配列は、ギャップを導入して２つの配列間の残基の一致を最適化することにより、参照配列と整列させることができる。これらの場合、ギャップは存在するが、所定のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列内の残基の番号付けは、それが整列された参照配列に関して行われる。
【0080】
「アミノ酸の相違」及び「残基の相違」とは、あるアミノ酸配列のある位置のアミノ酸残基を、参照配列の対応する位置のアミノ酸残基と比較したときの相違を指す。アミノ酸の相違の位置は、一般に本明細書では「Ｘｎ」と呼ばれ、ｎは残基の相違の根拠となる参照配列の対応する位置を指す。例えば、「配列番号６８６と比較した位置Ｘ１２３の残基の相違」は、配列番号６８６の位置１２３に対応するポリペプチド位置のアミノ酸残基の相違を指す。従って、配列番号６８６の参照ポリペプチドが位置１２３にチロシンを有する場合、「配列番号６８６と比較した位置Ｘ１２３の残基の相違」は、配列番号６８６の位置１２３に対応するポリペプチドの位置におけるチロシン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書のほとんどの場合、ある位置の特定のアミノ酸残基の相違は「ＸｎＹ」として示され、「Ｘｎ」は参照ポリペプチドの対応する残基及び位置を指定し（上記のとおり）、「Ｙ」は、工学操作されたポリペプチドで見つかったアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドとは異なる残基）の１文字識別子である。場合によっては、元のアミノ酸は示されない（例えば、１２３Ｆ）。いくつかの例（例えば、表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、１１－２、１２－１、及び１２－２）では、本開示は、従来の表記「ＡｎＢ」で示される特定のアミノ酸の差異も提供し、ここで、Ａは参照配列中の残基の１文字識別子、「ｎ」は参照配列中の残基位置の番号、及びＢは工学操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の１文字識別子である。いくつかの例では、本開示のポリペプチドは、参照配列に対する１つ又はそれ以上のアミノ酸残基の差異を含むことができ、これは、参照配列に対する残基の差異が存在する特定の位置のリストによって示される。いくつかの実施態様において、ポリペプチドの特定の残基位置に２つ又はそれ以上のアミノ酸を使用できる場合、使用できるさまざまなアミノ酸残基は「／」で区切られる（例えば、Ｘ１２３Ｆ／Ｘ１２３Ｍ／Ｘ１２３Ｖ又はＸ１２３Ｆ／Ｍ／Ｖ又は１２３Ｆ／Ｍ／Ｖ）。本開示は、保存的アミノ酸置換及び非保存的アミノ酸置換のいずれか又は両方を含む１つ又はそれ以上のアミノ酸差異を含む工学操作されたポリペプチド配列を含む。
【0081】
用語「アミノ酸置換セット」及び「置換セット」は、アミノ酸配列内のアミノ酸置換のグループを指す。いくつかの実施態様において、置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又はそれ以上のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施態様において、置換セットは、実施例及び付録中の表のいずれかに列挙された変種ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す（すなわち、表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、１１－２、１２－１、及び１２－１）。
【0082】
「保存的アミノ酸置換」とは、残基を類似の側鎖を有する異なる残基で置換することを指し、従って、典型的にはポリペプチド中のアミノ酸を、同じ又は類似の定義されたアミノ酸クラス内のアミノ酸で置換することを含む。例として、限定されるものではないが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン）で置換することができ；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸はヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリン及びスレオニン）で置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、及びヒスチジン）で置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リジン及びアルギニン）で置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）で置換され；及び疎水性又は親水性アミノ酸はそれぞれ別の疎水性又は親水性アミノ酸で置換される。例示的な保存的置換には、Ａ、Ｌ、Ｖ、又はＩを他の脂肪族残基（例えば、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ）又は他の非極性残基（例えば、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｍ）で置換；Ｇ又はＭを他の非極性残基（例えば、Ａ、Ｌ、Ｖ、Ｉ、Ｇ、Ｍ）で置換；Ｄ又はＥを他の酸性残基（例えば、Ｄ、Ｅ）で置換；Ｋ又はＲを他の塩基性残基（例えば、Ｋ、Ｒ）で置換；Ｎ、Ｑ、Ｓ、又はＴを他の極性残基（例えば、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ）で置換；Ｈ、Ｙ、Ｗ、又はＦを他の芳香族残基（例えば、Ｈ、Ｙ、Ｗ、Ｆ）で置換；又は、Ｃ又はＰを他の非極性残基（例えば、Ｃ、Ｐ）で置換が含まれる。
【0083】
「非保存的置換」とは、ポリペプチド中のアミノ酸を、側鎖特性が著しく異なるアミノ酸で置換することをいう。非保存的置換は、定義されたグループ内ではなく、グループ間のアミノ酸を使用し、（ａ）置換領域のペプチド骨格の構造（例えば、グリシンをプロリンに）、（ｂ）電荷又は疎水性、及び／又は（ｃ）側鎖の嵩に影響を与える。例として、限定されるものではないが、非保存的置換の例には、塩基性又は脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸；小さなアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸；及び疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸が含まれる。
【0084】
「欠失」とは、参照ポリペプチドから１つ又はそれ以上のアミノ酸を除去することによってポリペプチドを修飾することを指す。欠失は、参照酵素を構成する１つ又はそれ以上のアミノ酸、２つ又はそれ以上のアミノ酸、５つ又はそれ以上のアミノ酸、１０又はそれ以上のアミノ酸、１５又はそれ以上のアミノ酸、又は２０又はそれ以上のアミノ酸、アミノ酸総数の最大１０％、又はアミノ酸総数の最大２０％の除去を含むことができ、一方、工学操作ロイシン脱炭酸酵素の酵素活性を維持し及び／又は改良された特性を維持する。欠失は、ポリペプチドの内部部分及び／又は末端部分に向けることができる。さまざまな実施態様において、欠失は連続セグメントを含むことができるか、又は不連続であることができる。
【0085】
「挿入」とは、参照ポリペプチドから１つ又はそれ以上のアミノ酸を追加することによってポリペプチドを修飾することを指す。挿入は、ポリペプチドの内部、又はカルボキシ末端若しくはアミノ末端に行うことができる。ここで使用される挿入には、当技術分野で知られている融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続したセグメントである場合もあれば、天然ポリペプチド内の１つ又はそれ以上のアミノ酸によって分離されている場合もある。
【0086】
本明細書において用語「機能性断片」及び「生物活性断片」は互換的に使用され、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失及び／又は内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は比較される配列内の対応する位置と同一であり（例えば、本発明の全長工学操作ＬＤＣ）、及び全長ポリペプチドの実質的にすべての活性を保持するポリペプチドを指す。いくつかの実施態様において、全長ポリペプチドの活性のほぼすべてとは、それが由来する組換えポリペプチドの少なくとも９０％の活性を指す。
【0087】
「単離されたポリペプチド」とは、自然に付随する他の汚染物質（例えば、タンパク質、脂質、及びポリヌクレオチド）から実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境又は発現システム（例えば、宿主細胞又はインビトロ合成）から取り出し又は精製されたポリペプチドを包含する。組換えロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、細胞内に存在するか、細胞培地に存在するか、又は溶解物若しくは単離された調製物などのさまざまな形態で調製され得る。従って、いくつかの実施態様において、本明細書で提供される組換えロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。
【0088】
「実質的に純粋なポリペプチド」とは、その中にポリペプチド種が主に存在する分子種である（すなわち、モル又は重量ベースで、ポリペプチド種が組成物中の他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、対象分子種が、存在する高分子種のモル又は重量％で少なくとも約５０パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なロイシン脱炭酸酵素組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種のモル又は重量％で、約６０パーセント又はそれ以上、約７０パーセント又はそれ以上、約８０パーセント又はそれ以上、約９０パーセント又はそれ以上、約９５パーセント又はそれ以上、及び約９８パーセント又はそれ以上を構成する。いくつかの実施態様において、対象分子種は、本質的に均一になるまで精製され（すなわち、従来の検出方法では組成物中に汚染分子種を検出できない）、組成物は本質的に単一の高分子種からなる。溶媒分子種、小分子（＜５００ダルトン）、及び元素イオン分子種は、高分子種とは見なされない。いくつかの実施態様において、単離された組換えロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【0089】
工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの文脈において「改良された酵素特性」とは、野生型ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド（例えば、配列番号２を有する野生型ＬＤＣ）又は別の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドなどの参照ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドと比較して、なんらかの酵素特性の改良を指す。改良された特性には、限定されるものではないが、タンパク質生成の増加、血清安定性の上昇、生体内血清半減期の延長、熱活性の上昇、熱安定性の上昇、ｐＨ活性の上昇、安定性の上昇、酵素活性の上昇、基質特異性及び／又は親和性の上昇、比活性の上昇、基質及び／又は最終生成物阻害に対する活性の上昇、化学的安定性の上昇、化学選択性の改良、溶媒安定性の改良、酸性ｐＨに対する耐容性の上昇、タンパク質分解活性に対する耐容性の上昇（すなわち、タンパク質分解に対する感受性の低下）、凝集の減少、溶解性の上昇、免疫原性の減少（すなわち、免疫応答を誘導及び／又は誘発する能力の低下）、及び温度プロフィールの変更などの特性が含まれる。
【0090】
「酵素活性の上昇」及び「触媒活性の強化」は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの改良された特性を指し、これは、参照ロイシン脱炭酸酵素（例えば、野生型ロイシン脱炭酸酵素及び／又は別の工学操作ロイシン脱炭酸酵素）と比較して、比活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質重量）の上昇、及び／又は基質から生成物への変換率の上昇（例えば、指定量のロイシン脱炭酸酵素を使用した指定時間内の開始量の基質から生成物への変換率）によって表され得る。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に提供されている。酵素活性に関連するいずれの特性も影響を受ける可能性があり、この特性には、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、又はｋｃａｔの古典的な酵素特性が含まれ、これらが変化することで酵素活性が上昇する可能性がある。酵素活性の改良は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、天然のロイシン脱炭酸酵素又はロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの由来となった他の工学操作ロイシン脱炭酸酵素の酵素活性の２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、又はそれ以上にまで及ぶ可能性がある。
【0091】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、少なくとも０．０１μｍｏｌ／分－ｍｇ、少なくとも０．０２／μｍｏｌ／分－ｍｇ、少なくとも０．０３／μｍｏｌ／分－ｍｇ、少なくとも０．０５／μｍｏｌ／分－ｍｇ、少なくとも１．０／μｍｏｌ／分－ｍｇの比活性を有し、いくつかの好ましい実施態様において、２．０／μｍｏｌ／分－ｍｇを超える。いくつかの実施態様において、Ｋｍは約１μｍ～約５ｍＭの範囲、約５μｍ～約２ｍＭの範囲、約１０μｍ～約２ｍＭの範囲、又は約１０μｍ～約１ｍＭの範囲である。いくつかの特定の実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、参照ロイシン脱炭酸酵素の１．５～１０倍、１．５～２５倍、１．５～５０倍、１．５～１００倍又はそれ以上の範囲で酵素活性が向上している。ロイシン脱炭酸酵素活性は、当該技術分野で既知の任意の標準アッセイによって測定することができる（例えば、反応物の枯渇又は生成物の生成を追跡することによって）。いくつかの実施態様において、生成された生成物の量又は消費された基質の量は、ＵＶ吸収又は質量スペクトル検出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離によって測定される。いくつかの実施態様において、酵素活性の比較は、本明細書でさらに詳細に説明されているように、定義された酵素調製物、設定された条件下での定義されたアッセイ、及び１つ又はそれ以上の定義された基質を使用して行われる。一般に溶解物を比較する場合、宿主細胞によって生成され溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小限に抑えるために、細胞数とアッセイされるタンパク質の量が決定され、並びに同一の発現システムと同一の宿主細胞が使用される。
【0092】
「保存安定性の向上」という語句は、本発明の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが、乾燥形態（例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥）で製造され、室温を超える温度（例えば、３０℃、３７℃、４５℃、５５℃など）で数日から数か月間の期間保存された後、標準アッセイ（例えば、実施例に記載されるような）において参照ロイシン脱炭酸酵素と比較してより多くの活性を保持することを意味する。
【0093】
「変換」とは、基質から対応する生成物への酵素変換（又は生体内変換）を指す。「変換パーセント」とは、特定の条件下で一定期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。従って、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの「酵素活性」又は「活性」は、特定の時間内に基質から生成物に変換される「変換パーセント」として表すことができる。
【0094】
「ハイブリダイゼーションの厳密性」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低い厳密性条件下で行われ、その後、変動するがより高厳密性の洗浄が行われる。用語「中厳密性ハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡに対して約６０％、好ましくは約７５％、約８５％の同一性を有し、標的ポリヌクレオチドに対して約９０％を超える同一性を有する相補核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中厳密性条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で４２℃でハイブリダイゼーションに続いて、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で４２℃で洗浄することに相当する条件である。「厳密性ハイブリダイゼーション」は、一般に、定義されたポリヌクレオチド配列の溶液条件下で決定される熱融解温度Ｔｍから約１０℃以下の条件を指す。いくつかの実施態様において、高厳密性条件とは、０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが０．０１８Ｍ ＮａＣｌ中、６５℃で安定でない場合は、本明細書で想定されるように高厳密性条件下で安定ではない）。高厳密性条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×デンハルツ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで４２℃に相当する条件でハイブリダイゼーションし、その後０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で洗浄することによって提供することができる。別の高厳密性条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ中で６５℃でハイブリダイズし、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中で６５℃で洗浄するのに相当する条件でハイブリダイズすることである。他の高厳密性ハイブリダイゼーション条件、並びに中厳密性条件は、上記で引用した参考文献に記載されている。いくつかの実施態様において、ロイシン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドは、工学操作脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする本明細書に開示された組換えポリヌクレオチドに、高厳密性条件下でハイブリダイズする。
【0095】
「コドン最適化」とは、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを、特定の生物で優先的に使用されるコドンに変更し、こうして、コードされたタンパク質がその生物でより効率的に発現されるようにすることを指す。遺伝子コードは縮重しており、ほとんどのアミノ酸は「同義語」コドン又は「同義」コドンと呼ばれる複数のコドンで表されるが、特定の生物によるコドンの使用はランダムではなく、特定のコドントリプレットに偏っていることはよく知られている。このコドン使用の偏りは、特定の遺伝子、共通機能又は祖先起源の遺伝子、高発現タンパク質対低コピー数タンパク質、及び生物のゲノムの集合タンパク質コード領域に関して高くなる可能性がある。いくつかの実施態様において、ロイシン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化されている。「制御配列」とは、本明細書において、本開示のポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの発現に必要又は有利なすべての成分を含むことを意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して固有又は外来であってもよい。このような制御配列には、限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列、及び転写ターミネーターが含まれる。制御配列には、少なくともプロモーター、転写及び翻訳停止シグナルが含まれる。いくつかの実施態様において、制御配列には、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域と制御配列との連結を容易にする特定の制限部位を導入する目的でリンカーが設けられている。
【0096】
「作動可能に連結された」とは、本明細書では、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対する位置に適切に（すなわち、機能的な関係で）配置され、こうして、制御配列が、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を指示又は制御する構成として定義される。
【0097】
「プロモーター配列」とは、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列には、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列が含まれる。プロモーターは、変異体、末端切断型、ハイブリッドプロモーターなどの、選択した宿主細胞で転写活性を示す任意の核酸配列であり、宿主細胞に対して相同的又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から取得することができる。
【0098】
酵素変換反応プロセスにおける「基質」とは、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが作用する化合物又は分子を指す。酵素変換プロセスにおける「生成物」とは、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが基質に作用して生じる化合物又は分子を指す。
【0099】
本明細書において使用される用語「培養する」は、任意の適切な培地（例えば、液体、ゲル、又は固体）を使用して適切な条件下で細胞集団を増殖させることを指す。
【0100】
組み換えポリペプチド（例えば、ＬＤＣ酵素変種）は、当該技術分野で既知の任意の適切な方法を使用して生成することができる。例えば、当業者によく知られている多種多様な突然変異誘発技術がある。さらに、多くの商業的な分子生物学サプライヤーから突然変異誘発キットも入手可能である。特定のアミノ酸で特定の置換を行う方法（部位特異的）、遺伝子の局所領域で特異的又はランダム突然変異を行う方法（領域特異的）、又は遺伝子全体にわたるランダム突然変異誘発（例えば、飽和突然変異誘発）が利用可能である。酵素変種を生成するための多数の適切な方法が当業者に知られており、限定されるものではないが、ＰＣＲを使用する一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡの部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、及び化学的飽和突然変異誘発、又は当該技術分野で知られている他の適切な方法が含まれる。ＤＮＡ及びタンパク質工学に使用される方法の非限定的な例は、以下の特許で提供されている：米国特許第６，１１７，６７９号、米国特許第６，４２０，１７５号、米国特許第６，３７６，２４６号、米国特許第６，５８６，１８２号、米国特許第７，７４７，３９１号、米国特許第７，７４７，３９３号、米国特許第７，７８３，４２８号、及び米国特許第８，３８３，３４６号。変種が生成された後に、これらは、任意の所望の特性（例えば、高い又は上昇した活性、又は低い又は低下した活性、上昇した熱活性、上昇した熱安定性、及び／又は酸性ｐＨ安定性など）についてスクリーニングすることができる。
【0101】
本明細書で使用される用語「適切な反応条件」は、本出願のロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが基質を所望の生成物化合物に変換することができる酵素変換反応溶液中の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒の範囲）を指す。例示的な「適切な反応条件」は、本出願に提供され、実施例によって説明される。「化合物負荷」又は「酵素負荷」などの「負荷」は、反応開始時の反応混合物中の成分の濃度又は量を指す。酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドによって作用される化合物又は分子を指す。酵素変換プロセスの文脈における「生成物」は、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが基質に作用して生じる化合物又は分子を指す。
【0102】
本明細書で使用される「ベクター」とは、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。いくつかの実施態様において、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされているポリペプチドを適切な宿主で発現させることができる適切な制御配列に作動可能に連結された発現ベクターである。いくつかの実施態様において、「発現ベクター」は、宿主細胞で発現を駆動するためにＤＮＡ配列（例えば、トランス遺伝子）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、いくつかの実施態様において、転写ターミネーター配列も含む。
【0103】
本明細書で使用される用語「発現」には、限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、及び翻訳後修飾を含む、ポリペプチドの生成に関与するあらゆる工程が含まれる。いくつかの実施態様において、この用語には細胞からのポリペプチドの分泌も含まれる。
【0104】
本明細書で使用される場合、アミノ酸又はヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列）は、２つの配列が自然界で関連付けられていない場合、それが作動可能に連結されている別の配列に対して「異種」である。
【0105】
本明細書で使用される用語「宿主細胞」及び「宿主株」は、本明細書で提供されるＤＮＡ（例えば、少なくとも１つのＬＤＣ変種をコードするポリヌクレオチド配列）を含む発現ベクターに適した宿主を指す。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、当該技術分野で知られている組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターで形質転換又はトランスフェクトされた原核細胞又は真核細胞である。
【0106】
用語「類似体」は、参照ポリペプチドとの配列同一性が７０％超であるが、１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。いくつかの実施態様において、類似体とは、限定されるものではないが、ホモアルギニン、オルニチン、ノルバリンを含む非天然アミノ酸残基並びに天然アミノ酸を指す。いくつかの実施態様において、類似体には、１つ又はそれ以上のＤアミノ酸残基、及び２つ又はそれ以上のアミノ酸残基間の非ペプチド結合も含まれる。
【0107】
用語「治療用」は、病状の兆候又は症状を示す被験体に投与され、有益又は望ましい医学的効果をもたらす化合物を指す。
【0108】
用語「医薬組成物」は、医薬的有効量の本発明に包含される工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドと許容し得る担体とを含む、哺乳動物被験体（例えば、ヒト）における医薬用途に適した組成物を指す。
【0109】
用語「遺伝子治療」は、哺乳動物被験体（例えば、ヒト）の疾患を治療及び／又は予防するための遺伝子（すなわち、遺伝物質）の使用を指すために使用される。いくつかの実施態様において、遺伝物質は哺乳動物被験体の少なくとも一部の細胞に直接導入される。本発明は、遺伝子治療に有用な特定の方法又は組成物に限定されることを意図していない。
【0110】
用語「ｍＲＮＡ療法」は、哺乳動物被験体（例えば、ヒト）の疾患を治療及び／又は予防するためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を使用に関して使用される。いくつかの実施態様において、遺伝物質は哺乳動物被験体の少なくとも一部の細胞に直接導入される。本発明は、ｍＲＮＡ療法に有用な特定の方法又は組成物に限定されることを意図していない。
【0111】
用語「有効量」は、所望の結果を生み出すのに十分な量を意味する。当業者であれば、明細書の指針を考慮して有効量を決定することができる。
【0112】
用語「単離された」及び「精製された」は、自然に関連する少なくとも１つの他の成分から分離された分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど）、又はその他の成分を指すために使用される。用語「精製された」は絶対的な純度を要求するものではなく、相対的な定義として意図されている。
【0113】
用語「被験体」には、哺乳動物、例えばヒト、ヒト以外の霊長類、家畜、ペット動物、実験動物（例えば、げっ歯類やウサギ類）が含まれる。この用語には、雄も雌も含まれることを意図している。
【0114】
本明細書において用語「患者」は、疾患の評価を受けている、疾患の治療を受けている、又は疾患を経験しているあらゆる被験体を意味する。
【0115】
用語「乳児」は、生後１か月からおよそ１歳までの子供を指す。本明細書で使用される用語「新生児」は、出生から生後２８日目までの子供を指す。用語「未熟児」は、妊娠２０週目以降に生まれたが満期前に生まれ、出生時の体重が通常約５００グラム～約２４９９グラムの乳児を指す。「極低出生体重児」は、出生時の体重が１５００グラム未満の乳児である。
【0116】
本明細書において使用される用語「子供」は、治療又は研究方法に同意できる法定年齢に達していない人を指す。いくつかの実施態様において、この用語は出生時から青年期までの人を指す。
【0117】
本明細書で使用されている用語「成人」は、関連する法域の法定年齢（例えば、米国では１８歳）に達した人を指す。いくつかの実施態様において、この用語は完全に成長した成熟した成体を指す。いくつかの実施態様において、用語「若年成人」は、１８歳未満であるが性的に成熟した人を指す。
【0118】
本明細書において使用される「組成物」及び「製剤」は、本発明の少なくとも１つの本発明の工学操作ロイシン脱炭酸酵素を含み、任意の適切な用途を意図した生成物（例えば、医薬組成物、食事／栄養補助食品、飼料など）を包含する。
【0119】
組成物を「投与」及び「投与する」という用語、本発明の組成物を被験体（例えば、ＭＳＵＤの影響に苦しんでいる人）に提供することを意味する。
【0120】
医薬組成物に関して使用される用語「担体」は、標準的な医薬担体、緩衝剤、賦形剤、例えば安定剤、保存剤、補助剤などのいずれかを意味する。
【0121】
用語「医薬的に許容し得る」は、望ましくない生物学的影響を引き起こすことなく、又は含まれる成分のいずれかと有害な方法で相互作用することなく被験体に投与することができ、かつ所望の生物学的活性を有する物質を意味する。
【0122】
本明細書において使用される用語「賦形剤」は、医薬有効成分（ＡＰＩ、例えば本発明の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド）以外の、医薬的に許容し得る添加剤、担体、希釈剤、補助剤、又はその他の成分を指す。賦形剤は、通常、製剤化及び／又は投与の目的で含まれる。
【0123】
疾患／状態の症状に関して使用される用語「治療有効量」は、疾患／状態の１つ又はそれ以上の症状を緩和、軽減、又は排除するか、又は症状（例えば、ＭＳＵＤ）の発生を予防又は遅延させる化合物（例えば、工学操作されたＬＤＣポリペプチド）の量及び／又は濃度を指す。いくつかの実施態様において、この用語は、研究者、医師、獣医、又はその他の臨床家が求める組織、系、若しくは動物被験体による生物学的（例えば、医学的）反応を誘発する組成物の量に関して使用される。
【0124】
疾患／状態に関して使用される用語「治療有効量」は、疾患／状態を緩和、軽減、又は排除する組成物の量及び／又は濃度を指す。
【0125】
用語「治療している」、「治療する」、及び「治療」は、予防的（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）（例えば、予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ））治療及び緩和的治療も含むことを意図している。
【0126】
本明細書で使用される用語「少なくとも１つ」は、本発明を特定の数の項目に限定するものではない。必要に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上の項目を包含することを意図している。
【0127】
工学操作ＬＤＣポリペプチド
本開示は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）並びにこれらの医薬、栄養補助食品、及び／又は産業用途としての使用を提供する。本開示において、特定のロイシン脱炭酸酵素変種（すなわち、工学操作されたＬＤＣポリペプチド）が、野生型ロイシン脱炭酸酵素又は参照ロイシン脱炭酸酵素の配列中の特定のアミノ酸残基の修飾に関連して言及される場合、同等の位置（各アミノ酸配列間のアミノ酸配列の整列から決定される）で修飾された別のロイシン脱炭酸酵素の変種も本明細書に含まれることが理解される。
本開示は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）並びにこれらの医薬、栄養補助食品、及び／又は産業用途としての使用を提供する。本開示において、特定のロイシン脱炭酸酵素変種（すなわち、工学操作されたＬＤＣポリペプチド）が、野生型ロイシン脱炭酸酵素又は参照ロイシン脱炭酸酵素の配列中の特定のアミノ酸残基の修飾に関連して言及される場合、同等の位置（各アミノ酸配列間のアミノ酸配列の整列から決定される）で修飾された別のロイシン脱炭酸酵素の変種も本明細書に含まれることが理解される。
【0128】
いくつかの実施態様において、本発明の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドが由来する親のロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドには、プランクトミセス科細菌などの細菌株が含まれる。本明細書での使用に適用可能な、さまざまな供給源からのロイシン脱炭酸酵素を表１－２に示す。
【0129】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む細胞又は微生物を、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの産生に適した条件下で培養することによって産生される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、その後、得られた培養培地及び／又は細胞から回収される。
【0130】
いくつかの実施態様において、本開示の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８２８又は８８８の参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、そのアミノ酸配列中に１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0131】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８２８に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0132】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0133】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置５、１９、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１４１、１７０、１７３、１８７、１９８、２００、２０２、２６７、２７０、２７２、２９０、３１２、３５３、３５７、３８３、若しくは３８４、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0134】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも置換５Ｖ、１９Ｌ、３３Ｌ、４１Ｄ、４７Ｆ、５１Ｅ、５５Ｉ、６４Ｓ／Ｎ、１４１Ｐ、１７０Ｐ、１７３Ｉ、１８７Ｌ、１９８Ｇ、２００Ｓ、２０２Ｈ、２６７Ｌ、２７０Ｌ／Ｔ、２７２Ａ、２９０Ｉ、３１２Ｔ、３５３Ｅ、３５７Ｓ／Ｃ、３８３Ｓ、若しくは３８４Ｗ、又はこれらの組み合わせを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0135】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、位置３３、５５、６４、１２６、２７０、若しくは３５７、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0136】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも置換３３Ｌ、５５Ｉ、６４Ｎ、１２６Ａ、２７０Ｌ、又は３５７Ｓ、又はこれらの組み合わせを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0137】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、位置３３、５５、６４、１２６、２７０、及び３５７、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0138】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも置換３３Ｌ、５５Ｉ、６４Ｎ、１２６Ａ、２７０Ｌ、及び３５７Ｓ、又はこれらの組み合わせを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0139】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置１７０／２７０／３８３、２７０、４１／１７３、２７２、５／１４１／２７２／３８３、４１／３８３、４１／１４１／１８７／２７２／２９０、４１／１４１／１７３／２９０、５／２７２／３８３、５／４１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１、１４１／２７２、３５３／３８４、２７２／３８３、４１／１４１／１７３、４１／２７２／３８３、４１／１４１／１８７／２００／２０２／２７２、３３／５５／６４／１２６／２７０／３５７、３３／１２６／３５３／３５７、５５／６４／２６７／３５／３８４、３３／６４／３５７、１２６／２６７、６４／２６７／３５３／３８４、３３／５５／６４／３５７、１９／６４／１２６／２６７、５５／２６７、３３／１２６／２６７／２７０／３１２／３５７、１９／３３／５５／３５３／３５７／３８４、１９／３３／１２６、１２６／３１２、１２６／１９８／２０２／２６７／３１２、１２６／３５３、５５／１２６、１２６／２７０／３８４、３３／６４／３５３／３５７、１９／２６７、５１／５５／２６７／２７０／３５３、３３／１２６／２６７／２７０、１９／５５／６４／１２６／２６７／２７０／３５３、１９／３３／１２６／２７０／３５３／３５７／３８４、１９／３３／６４／２６７／３５３、１２６／３５３／３８４、１２６／２７０／３１２／３５３／３８４、１９／３３／５５／１２６、３３／３５７、４７／５１／６４／１２６／３５３／３８４、１２６、又は１２６／２７０において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0140】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも置換又は置換セット１７０Ｐ／２７０Ｌ／３８３Ｓ、２７０Ｌ、４１Ｄ／１７３Ｉ、２７２Ａ、５Ｖ／１４１Ｐ／２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１８７Ｌ／２７２Ａ／２９０Ｉ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２９０Ｉ、５Ｖ／２７２Ａ／３８３Ｓ、５Ｖ／４１Ｄ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ、１４１Ｐ／２７２Ａ、３５３Ｅ／３８４Ｗ、２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１７３Ｉ、４１Ｄ／２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１８７Ｌ／２００Ｓ／２０２Ｈ／２７２Ａ、３３Ｌ／５５Ｉ／６４Ｎ／１２６Ａ／２７０Ｌ／３５７Ｓ、３３Ｌ／１２６Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｓ、５５Ｉ／６４Ｎ／２６７Ｌ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、３３Ｌ／６４Ｎ／３５７Ｓ、１２６Ａ／２６７Ｌ、６４Ｎ／２６７Ｌ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、３３Ｌ／５５Ｉ／６４Ｎ／３５７Ｓ、１９Ｌ／６４Ｎ／１２６Ａ／２６７Ｌ、５５Ｉ／２６７Ｌ、３３Ｌ／１２６Ａ／２６７Ｌ／２７０Ｔ／３１２Ｔ／３５７Ｓ、１９Ｌ／３３Ｌ／５５Ｉ／３５３Ｅ／３５７Ｓ／３８４Ｗ、１９Ｌ／３３Ｌ／１２６Ａ、１２６Ａ／３１２Ｔ、１２６Ａ／１９８Ｇ／２０２Ｈ／２６７Ｌ／３１２Ｔ、１２６Ａ／３５３Ｅ、５５Ｉ／１２６Ａ、１２６Ａ／２７０Ｔ／３８４Ｗ、３３Ｌ／６４Ｎ／３５３Ｅ／３５７Ｓ、１９Ｌ／２６７Ｌ、５１Ｅ／５５Ｉ／２６７Ｌ／２７０Ｔ／３５３Ｅ、３３Ｌ／１２６Ａ／２６７Ｌ／２７０Ｔ、１９Ｌ／５５Ｉ／６４Ｎ／１２６Ａ／２６７Ｌ／２７０Ｔ／３５３Ｅ、１９Ｌ／３３Ｌ／１２６Ａ／２７０Ｔ／３５３Ｅ／３５７Ｓ／３８４Ｗ、１９Ｌ／３３Ｌ／６４Ｎ／２６７Ｌ／３５３Ｅ、１２６Ａ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、１２６Ａ／２７０Ｔ／３１２Ｔ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、１９Ｌ／３３Ｌ／５５Ｉ／１２６Ａ、３３Ｌ／３５７Ｓ、４７Ｆ／５１Ｅ／６４Ｎ／１２６Ａ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、１２６Ａ、又は１２６Ａ／２７０Ｔを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0141】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも置換又は置換セットＡ１７０Ｐ／Ｒ２７０Ｌ／Ａ３８３Ｓ、Ｒ２７０Ｌ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ、Ｔ２７２Ａ、Ｋ５Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｖ１８７Ｌ／Ｔ２７２Ａ／Ｖ２９０Ｉ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｖ２９０Ｉ、Ｋ５Ｖ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ、Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ、Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ、Ｈ４１Ｄ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｖ１８７Ｌ／Ｈ２００Ｓ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ、Ｆ３３Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｌ／Ｃ３５７Ｓ、Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｃ３５７Ｓ、Ｖ５５Ｉ／Ｓ６４Ｎ／Ｉ２６７Ｌ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｆ３３Ｌ／Ｓ６４Ｎ／Ｃ３５７Ｓ、Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ、Ｓ６４Ｎ／Ｉ２６７Ｌ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｆ３３Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｓ６４Ｎ／Ｃ３５７Ｓ、Ｉ１９Ｌ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ、Ｖ５５Ｉ／Ｉ２６７Ｌ、Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ／Ｒ２７０Ｔ／Ａ３１２Ｔ／Ｃ３５７Ｓ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｄ３５３Ｅ／Ｃ３５７Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ａ／Ａ３１２Ｔ、Ｄ１２６Ａ／Ａ１９８Ｇ／Ｓ２０２Ｈ／Ｉ２６７Ｌ／Ａ３１２Ｔ、Ｄ１２６Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｖ５５Ｉ／Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｔ／Ｐ３８４Ｗ、Ｆ３３Ｌ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ３５３Ｅ／Ｃ３５７Ｓ、Ｉ１９Ｌ／Ｉ２６７Ｌ、Ｌ５１Ｅ／Ｖ５５Ｉ／Ｉ２６７Ｌ／Ｒ２７０Ｔ／Ｄ３５３Ｅ、Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ／Ｒ２７０Ｔ、Ｉ１９Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ／Ｒ２７０Ｔ／Ｄ３５３Ｅ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｔ／Ｄ３５３Ｅ／Ｃ３５７Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｓ６４Ｎ／Ｉ２６７Ｌ／Ｄ３５３Ｅ、Ｄ１２６Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｄ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｔ／Ａ３１２Ｔ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｄ１２６Ａ、Ｆ３３Ｌ／Ｃ３５７Ｓ、Ｌ４７Ｆ／Ｌ５１Ｅ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ１２６Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｄ１２６Ａ、又はＤ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｔを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0142】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、配列番号８８８に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0143】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置５、１９、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１４１、１７０、１７３、１８７、１９８、２００、２０２、２６７、２７０、２７２、２９０、３１２、３５３、３５７、３８３、若しくは３８４、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0144】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸残基５Ｖ、１９Ｌ、３３Ｌ、４１Ｄ、４７Ｆ、５１Ｅ、５５Ｉ、６４Ｓ／Ｎ、１４１Ｐ、１７０Ｐ、１７３Ｉ、１８７Ｌ、１９８Ｇ、２００Ｓ、２０２Ｈ、２６７Ｌ、２７０Ｌ／Ｔ、２７２Ａ、２９０Ｉ、３１２Ｔ、３５３Ｅ、３５７Ｓ／Ｃ、３８３Ｓ、若しくは３８４Ｗ、又はこれらの組み合わせを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0145】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置６４／１７３／２０２／３５３／３８４、４１／１４１／２７２／３５３、１４１／２０２／２７２／３５３／３５７、１７３／２０２／３５７、２０２／３５３、５／５１／１７３／２７２／３５３／３８４、５１／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２７２、２７２、４１／１７３／３８４、４１／６４／１４１／３５３／３５７／３８３、１４１／１７３／２０２、５／５１／６４／２０２／３５３、３５７、６４、５／４１／１４１、４１／１４１／１７３／２０２／３５３、３５３、２０２／３５７、５１／１４１／２０２／２７２／３５３、２０２、５１／１４１／１７３／３５３／３８４、４１／１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３８３／３８４、６４／２０２／３５７、５／６４／３５３／３８３／３８４、４１／２７２／３５３／３８３、４１／１７３／２７２／３５３／３５７、５１／１４１／２７２／３５３／３５７／３８３／３８４、４１／３５３／３５７、１７３／２７２／３５３／３５７、５／４１／６４／１７３／３５３／３５７、６４／１７３／３５７、５１／２７２、５１／６４／３５７／３８４、５１／１４１／１７３／２７２／３５３、６４／２０２／２７２／３５３／３５７／３８４、５１／２７２／３５７、５１／１７３／２７２／３５３／３８４、３５３／３８４、２０２／２７２／３５７、６４／１４１／１７３／２０２／３５３／３５７、５／４１／５１／２０２／３５７／３８３、５／５１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１／２７２、５１／１７３、５／３５３、４１／６４／１７３／２７２／３５３／３８３、５／６４／１７３／２７２／３５３、５１／６４、４１／３５７／３８３、４１／１７３／３５３／３５７、２０２／２７２／３８３、２０２／２７２、３５３／３５７、４１／１７３／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３５７、６４／１４１／２０２、又は５／１７３／２７２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0146】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも置換又は置換セット６４Ｓ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、４１Ｄ／１４１Ｐ／２７２Ａ／３５３Ｅ、１４１Ｐ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、１７３Ｉ／２０２Ｈ／３５７Ｃ、２０２Ｈ／３５３Ｅ、５Ｖ／５１Ｅ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、５１Ｅ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５７Ｃ、１４１Ｐ／１７３Ｉ／２７２Ａ、２７２Ａ、４１Ｄ／１７３Ｉ／３８４Ｗ、４１Ｄ／６４Ｓ／１４１Ｐ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３８３Ｓ、１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ、５Ｖ／５１Ｅ／６４Ｓ／２０２Ｈ／３５３Ｅ、３５７Ｃ、６４Ｓ、５Ｖ／４１Ｄ／１４１Ｐ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／３５３Ｅ、３５３Ｅ、２０２Ｈ／３５７Ｃ、５１Ｅ／１４１Ｐ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ、２０２Ｈ、５１Ｅ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８３Ｓ／３８４Ｗ、６４Ｓ／２０２Ｈ／３５７Ｃ、５Ｖ／６４Ｓ／３５３Ｅ／３８３Ｓ／３８４Ｗ、４１Ｄ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、５１Ｅ／１４１Ｐ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３８３Ｓ／３８４Ｗ、４１Ｄ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、５Ｖ／４１Ｄ／６４Ｓ／１７３Ｉ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、６４Ｓ／１７３Ｉ／３５７Ｃ、５１Ｅ／２７２Ａ、５１Ｅ／６４Ｓ／３５７Ｃ／３８４Ｗ、５１Ｅ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ、６４Ｓ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３８４Ｗ、５１Ｅ／２７２Ａ／３５７Ｃ、５１Ｅ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、３５３Ｅ／３８４Ｗ、２０２Ｈ／２７２Ａ／３５７Ｃ、６４Ｓ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、５Ｖ／４１Ｄ／５１Ｅ／２０２Ｈ／３５７Ｃ／３８３Ｓ、５Ｖ／５１Ｅ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ／２７２Ａ、５１Ｅ／１７３Ｉ、５Ｖ／３５３Ｅ、４１Ｄ／６４Ｓ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８３Ｓ、５Ｖ／６４Ｓ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ、５１Ｅ／６４Ｓ、４１Ｄ／３５７Ｃ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１７３Ｉ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、２０２Ｈ／２７２Ａ／３８３Ｓ、２０２Ｈ／２７２Ａ、３５３Ｅ／３５７Ｃ、４１Ｄ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５７Ｃ、１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、６４Ｓ／１４１Ｐ／２０２Ｈ、５Ｖ／１７３Ｉ／２７２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0147】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも置換又は置換セットＮ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｒ１４１Ｐ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｓ３５７Ｃ、Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ、Ｋ５Ｖ／Ｌ５１Ｅ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｌ５１Ｅ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｓ３５７Ｃ、Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ、Ｔ２７２Ａ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｎ６４Ｓ／Ｒ１４１Ｐ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ／Ａ３８３Ｓ、Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ、Ｋ５Ｖ／Ｌ５１Ｅ／Ｎ６４Ｓ／Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ、Ｓ３５７Ｃ、Ｎ６４Ｓ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ、Ｄ３５３Ｅ、Ｓ２０２Ｈ／Ｓ３５７Ｃ、Ｌ５１Ｅ／Ｒ１４１Ｐ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｓ２０２Ｈ、Ｌ５１Ｅ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ａ３８３Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｎ６４Ｓ／Ｓ２０２Ｈ／Ｓ３５７Ｃ、Ｋ５Ｖ／Ｎ６４Ｓ／Ｄ３５３Ｅ／Ａ３８３Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｌ５１Ｅ／Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ／Ａ３８３Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｎ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｎ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ３５７Ｃ、Ｌ５１Ｅ／Ｔ２７２Ａ、Ｌ５１Ｅ／Ｎ６４Ｓ／Ｓ３５７Ｃ／Ｐ３８４Ｗ、Ｌ５１Ｅ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｎ６４Ｓ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ／Ｐ３８４Ｗ、Ｌ５１Ｅ／Ｔ２７２Ａ／Ｓ３５７Ｃ、Ｌ５１Ｅ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｓ３５７Ｃ、Ｎ６４Ｓ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｌ５１Ｅ／Ｓ２０２Ｈ／Ｓ３５７Ｃ／Ａ３８３Ｓ、Ｋ５Ｖ／Ｌ５１Ｅ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ、Ｌ５１Ｅ／Ｆ１７３Ｉ、Ｋ５Ｖ／Ｄ３５３Ｅ、Ｈ４１Ｄ／Ｎ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ａ３８３Ｓ、Ｋ５Ｖ／Ｎ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｌ５１Ｅ／Ｎ６４Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｓ３５７Ｃ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ、Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｓ３５７Ｃ、Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｎ６４Ｓ／Ｒ１４１Ｐ／Ｓ２０２Ｈ、Ｋ５Ｖ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0148】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、表１２－１及び１２－２に提供される変種の置換又は置換セットを含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記置換又は置換セットは、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0149】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、表１２－１及び１２－２に提供される少なくとも１つのアミノ酸位置に置換を含むアミノ酸配列を含む。
【0150】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、表１２－１及び１２－２に提供される少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含む。
【0151】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、表１２－１及び１２－２に提供される変種の少なくとも置換又は置換セットを含むアミノ酸配列を含み、ここで、前記置換又は置換セットは、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0152】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、表１２－１及び１２－２に提供される工学操作ロイシン脱炭酸酵素の配列を含むアミノ酸配列を含む。
【0153】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８５４～１０６４のうちの偶数の配列番号（例えば８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３４、９３６、９３８、９４０、９４２、９４４、９４６、９４８、９５０、９５２、９５４、９５６、９５８、９６０、９６２、９６４、９６６、９６８、９７０、９７２、９７４、９７６、９７８、９８０、９８２、９８４、９８６、９８８、９９０、９９２、９９４、９９６、９９８、１０００、１００２、１００４、１００６、１００８、１０１０、１０１２、１０１４、１０１６、１０１８、１０２０、１０２２、１０２４、１０２６、１０２８、１０３０、１０３２、１０３４、１０３６、１０３８、１０４０、１０４２、１０４４、１０４６、１０４８、１０５０、１０５２、１０５４、１０５６、１０５８、１０６０、１０６２、又は１０６４）に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８５４～９４８のうちの偶数の配列番号に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号９５０～１６０４のうちの偶数の配列番号に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0154】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８５４～１０６４のうちの偶数の配列番号を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素はリペプチドは、配列番号８５４～１０６４のうちの偶数の配列番号を有するアミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は、任意選択的に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は最大１０個の置換を有する。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８５４～９４８のうちの偶数の配列番号を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８５４～９４８のうちの偶数の配列番号を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記ポリペプチドは、任意選択的にアミノ酸配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は最大１０個の置換を有する。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号９５０～１６０４のうちの偶数の配列番号を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、ポリペプチドは、配列番号９５０～１６０４のうちの偶数の配列番号を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記ポリペプチドは、任意選択的にアミノ酸配列中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は最大１０個の置換を有する。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、アミノ酸配列中に１、２、３、４、又は最大５個の置換を有する。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、アミノ酸配列中に１、２、３、又は４個の置換を有する。いくつかの実施態様において、置換は、非保存的置換又は保存的置換を含む。いくつかの実施態様において、置換は、保存的置換を含む。いくつかの実施態様において、置換は、非保存的置換及び保存的置換を含む。いくつかの実施態様において、非保存的置換及び保存的置換に関する指針は、本明細書に開示される変種によって提供される。
【0155】
いくつかの実施態様において、本開示の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、野生型プランクトミセス科種のロイシン脱炭酸酵素又は配列番号１２に対応する配列を有するロイシン脱炭酸酵素と比較して、１つ又はそれ以上の改良された特性を示す。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、野生型プランクトミセス科種のロイシン脱炭酸酵素又は配列番号１２に対応する配列を有するロイシン脱炭酸酵素と比較して、（ｉ）ロイシンに対する活性の上昇、（ｉｉ）タンパク質分解に対する耐性の上昇、低ｐＨ環境に対する耐容性の上昇、及び（ｉｉｉ）熱安定性の上昇、から選択される改良された特性を示す。
【0156】
表１２－１及び１２－２、並びに表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、及び１１－２に提供される実施例、並びに国際公開第ＷＯ２０２１１５８６８６号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されて関連活性は、特定のアミノ酸配列の特徴と工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの機能活性とを相関させる配列／構造情報を提供することは明白であるはずである。この構造－機能相関情報は、配列番号１２の参照工学操作ポリペプチドに対する特定のアミノ酸残基の差異の形で、並びに例示的な工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの関連する実験的に決定された活性データの形で提供され、それによって本明細書に記載の酵素特性を有する工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの調製に関する指針を提供する。
【0157】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは精製される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、特に本明細書に記載の改良又は強化された特性を有するロイシン脱炭酸酵素活性を有する。
【0158】
いくつかの実施態様において、本発明は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの機能性断片又は生物活性断片を提供する。いくつかの実施態様において、機能性断片は、それが由来する工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド（すなわち、親の工学操作されたＬＤＣ）の活性の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％を含む。いくつかの実施態様において、前記機能性断片は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素の親配列の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％を含む。いくつかの実施態様において、前記機能性断片は、５未満、１０未満、１５未満、１０未満、２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、４５未満、及び５０未満のアミノ酸が末端切断される。
【0159】
いくつかの実施態様において、前記機能性断片は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素の親配列の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％を含む。いくつかの実施態様において、前記機能性断片は、５未満、１０未満、１５未満、１０未満、２５未満、３０未満、３５未満、４０未満、４５未満、５０未満、５５未満、６０未満、６５未満、又は７０未満のアミノ酸が末端切断される。
【0160】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの機能性断片又は生物活性断片には、本明細書に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素のアミノ酸配列において少なくとも１つの変異又は変異セットが含まれる。従って、いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素の機能性断片又は生物活性断片は、親ロイシン脱炭酸酵素において変異又は変異セットに関連する強化又は改良された特性を示す。
【0161】
工学操作ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、及び宿主細胞
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする工学操作又は組み換えポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施態様において、前記ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御してポリペプチドを発現することができる１つ又はそれ以上の異種調節配列に作動可能に連結される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物が、適切な宿主細胞に導入されて、対応するロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを発現する。
別の態様において、本開示は、本明細書に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする工学操作又は組み換えポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施態様において、前記ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御してポリペプチドを発現することができる１つ又はそれ以上の異種調節配列に作動可能に連結される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物が、適切な宿主細胞に導入されて、対応するロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを発現する。
【0162】
当業者には明らかなように、タンパク質配列の利用可能性及び様々なアミノ酸に対応するコドンの知識は、対象のポリペプチドをコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの説明を提供する。同じアミノ酸が代替コドン又は同義コドンによってコードされる遺伝コードの縮重により、極めて多数の核酸の作製が可能になり、これらのすべてが工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする。従って本発明は、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって、本明細書に記載のロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする、作製され得るロイシン脱炭酸酵素ポリヌクレオチドのありとあらゆるバリエーションのそれぞれを産生するための方法及び組成物を提供し、そしてポリヌクレオチドのそのようなバリエーションはすべて、実施例（例えば、表１２－１及び／又は１２－２）に示されるアミノ酸配列を含めて、本明細書に記載の任意のポリペプチドについて具体的に開示されていると見なされる。
【0163】
いくつかの実施態様において、コドンは、タンパク質産生のために選択された宿主細胞によって利用されるように最適化されることが好ましい。例えば、細菌で使用される好ましいコドンは、通常、細菌での発現に使用される。その結果、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域内のコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９０％を超える位置に好ましいコドンを含む。
【0164】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示された特性を有するロイシン脱炭酸酵素活性を有する工学操作ポリペプチドをコードし、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列又は実施例に開示される任意の変種のアミノ酸配列に対して、１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0165】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、本明細書に開示された特性を有するロイシン脱炭酸酵素活性を有する工学操作ポリペプチドをコードし、ここで、前記ポリペプチドは、参照配列である配列番号８８８に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0166】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、参照配列である配列番号８２８に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードし、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0167】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードし、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0168】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置５、１９、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１４１、１７０、１７３、１８７、１９８、２００、２０２、２６７、２７０、２７２、２９０、３１２、３５３、３５７、３８３、若しくは３８４、又はこれらの組み合わせに少なくとも置換を含むアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードし、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0169】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、若しくは３５７、又はこれらの組み合わせに少なくとも置換を含むアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードし、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0170】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置１７０／２７０／３８３、２７０、４１／１７３、２７２、５／１４１／２７２／３８３、４１／３８３、４１／１４１／１８７／２７２／２９０、４１／１４１／１７３／２９０、５／２７２／３８３、５／４１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１、１４１／２７２、３５３／３８４、２７２／３８３、４１／１４１／１７３、４１／２７２／３８３、４１／１４１／１８７／２００／２０２／２７２、３３／５５／６４／１２６／２７０／３５７、３３／１２６／３５３／３５７、５５／６４／２６７／３５／３８４、３３／６４／３５７、１２６／２６７、６４／２６７／３５３／３８４、３３／５５／６４／３５７、１９／６４／１２６／２６７、５５／２６７、３３／１２６／２６７／２７０／３１２／３５７、１９／３３／５５／３５３／３５７／３８４、１９／３３／１２６、１２６／３１２、１２６／１９８／２０２／２６７／３１２、１２６／３５３、５５／１２６、１２６／２７０／３８４、３３／６４／３５３／３５７、１９／２６７、５１／５５／２６７／２７０／３５３、３３／１２６／２６７／２７０、１９／５５／６４／１２６／２６７／２７０／３５３、１９／３３／１２６／２７０／３５３／３５７／３８４、１９／３３／６４／２６７／３５３、１２６／３５３／３８４、１２６／２７０／３１２／３５３／３８４、１９／３３／５５／１２６、３３／３５７、４７／５１／６４／１２６／３５３／３８４、１２６、又は１２６／２７０において、少なくとも置換又は置換セットを有するアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードし、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0171】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８８８に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素をコードし、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0172】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置５、１９、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１４１、１７０、１７３、１８７、１９８、２００、２０２、２６７、２７０、２７２、２９０、３１２、３５３、３５７、３８３、若しくは３８４、又はこれらの組み合わせに、少なくとも置換を含むアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素をコードし、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0173】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、アミノ酸位置６４／１７３／２０２／３５３／３８４、４１／１４１／２７２／３５３、１４１／２０２／２７２／３５３／３５７、１７３／２０２／３５７、２０２／３５３、５／５１／１７３／２７２／３５３／３８４、５１／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２７２、２７２、４１／１７３／３８４、４１／６４／１４１／３５３／３５７／３８３、１４１／１７３／２０２、５／５１／６４／２０２／３５３、３５７、６４、５／４１／１４１、４１／１４１／１７３／２０２／３５３、３５３、２０２／３５７、５１／１４１／２０２／２７２／３５３、２０２、５１／１４１／１７３／３５３／３８４、４１／１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３８３／３８４、６４／２０２／３５７、５／６４／３５３／３８３／３８４、４１／２７２／３５３／３８３、４１／１７３／２７２／３５３／３５７、５１／１４１／２７２／３５３／３５７／３８３／３８４、４１／３５３／３５７、１７３／２７２／３５３／３５７、５／４１／６４／１７３／３５３／３５７、６４／１７３／３５７、５１／２７２、５１／６４／３５７／３８４、５１／１４１／１７３／２７２／３５３、６４／２０２／２７２／３５３／３５７／３８４、５１／２７２／３５７、５１／１７３／２７２／３５３／３８４、３５３／３８４、２０２／２７２／３５７、６４／１４１／１７３／２０２／３５３／３５７、５／４１／５１／２０２／３５７／３８３、５／５１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１／２７２、５１／１７３、５／３５３、４１／６４／１７３／２７２／３５３／３８３、５／６４／１７３／２７２／３５３、５１／６４、４１／３５７／３８３、４１／１７３／３５３／３５７、２０２／２７２／３８３、２０２／２７２、３５３／３５７、４１／１７３／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３５７、６４／１４１／２０２、又は５／１７３／２７２において、少なくとも置換又は置換セットを有するアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードし、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0174】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、表１２－１及び１２－２に提供される変種の置換又は置換セットを含むアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードし、ここで、前記置換又は置換セットは、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0175】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、表１２－１及び１２－２に提供される少なくとも１つのアミノ酸位置に置換を含むアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする。
【0176】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、表１２－１及び１２－２に提供される少なくとも１つの置換を含むアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする。
【0177】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、表１２－１及び１２－２に提供される少なくとも置換又は置換セットを含むアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードし、ここで、前記置換又は置換セットは、配列番号８２８又は８８８に対して相対的なものである。
【0178】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、表１２－１及び１２－２に提供される工学操作ロイシン脱炭酸酵素の配列を含むアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする。
【0179】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８５４～１０６４のうちの偶数の配列番号（例えば、８５４、８５６、８５８、８６０、８６２、８６４、８６８、８７０、８７２、８７４、８７６、８７８、８８０、８８２、８８４、８８６、８８８、８９０、８９２、８９４、８９６、８９８、９００、９０２、９０４、９０６、９０８、９１０、９１２、９１４、９１６、９１８、９２０、９２２、９２４、９２６、９２８、９３０、９３２、９３４、９３６、９３８、９４０、９４２、９４４、９４６、９４８、９５０、９５２、９５４、９５６、９５８、９６０、９６２、９６４、９６６、９６８、９７０、９７２、９７４、９７６、９７８、９８０、９８２、９８４、９８６、９８８、９９０、９９２、９９４、９９６、９９８、１０００、１００２、１００４、１００６、１００８、１０１０、１０１２、１０１４、１０１６、１０１８、１０２０、１０２２、１０２４、１０２６、１０２８、１０３０、１０３２、１０３４、１０３６、１０３８、１０４０、１０４２、１０４４、１０４６、１０４８、１０５０、１０５２、１０５４、１０５６、１０５８、１０６０、１０６２、又は１０６４）に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする。
【0180】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８２７又は８８７に対応する参照ポリペプチド配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、ここで、前記組換えポリヌクレオチドはロイシン脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
【0181】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８５３～１０６３のうちの奇数の配列番号（例えば、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９３３、９３５、９３７、９３９、９４１、９４３、９４５、９４７、９４９、９５１、９５３、９５５、９５７、９５９、９６１、９６３、９６５、９６７、９６９、９７１、９７３、９７５、９７７、９７９、９８１、９８３、９８５、９８７、９８９、９９１、９９３、９９５、９９７、９９９、１００１、１００３、１００５、１００７、１００９、１０１１、１０１３、１０１５、１０１７、１０１９、１０２１、１０２３、１０２５、１０２７、１０２９、１０３１、１０３３、１０３５、１０３７、１０３９、１０４１、１０４３、１０４５、１０４７、１０４９、１０５１、１０５３、１０５５、１０５７、１０５９、１０６１、又は１０６３）に対応する参照配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、ここで、前記ポリヌクレオチドは、ロイシン脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
【0182】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、配列番号８５３～１０６３のうちの奇数の配列番号（例えば、８５３、８５５、８５７、８５９、８６１、８６３、８６７、８６９、８７１、８７３、８７５、８７７、８７９、８８１、８８３、８８５、８８７、８８９、８９１、８９３、８９５、８９７、８９９、９０１、９０３、９０５、９０７、９０９、９１１、９１３、９１５、９１７、９１９、９２１、９２３、９２５、９２７、９２９、９３１、９３３、９３５、９３７、９３９、９４１、９４３、９４５、９４７、９４９、９５１、９５３、９５５、９５７、９５９、９６１、９６３、９６５、９６７、９６９、９７１、９７３、９７５、９７７、９７９、９８１、９８３、９８５、９８７、９８９、９９１、９９３、９９５、９９７、９９９、１００１、１００３、１００５、１００７、１００９、１０１１、１０１３、１０１５、１０１７、１０１９、１０２１、１０２３、１０２５、１０２７、１０２９、１０３１、１０３３、１０３５、１０３７、１０３９、１０４１、１０４３、１０４５、１０４７、１０４９、１０５１、１０５３、１０５５、１０５７、１０５９、１０６１、又は１０６３）を含む核酸配列を含む。
【0183】
いくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする参照ポリペプチド配列に、高厳密性条件下でハイブリダイズすることができる。いくつかの実施態様において、参照配列は、配列番号８２７又は８８７、又はその相補体配列、又は本明細書で提供される工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列から選択される。いくつかの実施態様において、高厳密性条件下でハイブリダイズすることができる組換えポリヌクレオチドは、表１２－１及び１２－２に記載される任意の位置から選択される残基位置において、配列番号８２８又は８８８と比較して１つ又はそれ以上の残基の相違を有するアミノ酸配列を含む工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする。さらにいくつかの実施態様において、組換えポリヌクレオチドは、表１２－１及び１２－２に提供されるものから選択される参照組換えポリヌクレオチドに、高厳密性条件下でハイブリダイズすることができるか、又は配列番号８２７若しくは８８７に対応する参照核酸配列に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。いくつかの追加の実施態様において、高厳密性条件下でハイブリダイズする組換えポリヌクレオチドは、表１２－１及び表１２－２に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド参照配列（例えば、配列番号８５３～１０６３のうちの奇数の配列番号を含む核酸配列）に対して、少なくとも７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含み、ここで、前記前記組換えポリヌクレオチドはロイシン脱炭酸酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
【0184】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの発現を促進するために様々な方法で操作される。いくつかの実施態様において、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ロイシン脱炭酸酵素ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの発現を調節するための１つ又はそれ以上の制御配列が存在する発現ベクターを含む。ベクターに挿入される前の単離されたポリヌクレオチドの操作は、使用される発現ベクターに応じて望ましいか又は必要であり得る。組み換えＤＮＡ法を使用してポリヌクレオチド及び核酸配列を修飾する技術は、当技術分野で周知である。いくつかの実施態様において、制御配列には、特に、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが含まれる。いくつかの実施態様において、適切なプロモーターは宿主細胞の選択に基づいて選択される。細菌宿主細胞の場合、本開示の核酸構築物の転写を指令するための適切なプロモーターには、限定されるものではないが、大腸菌のｌａｃオペロン、ストレプトミセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、リケニフォルミス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ）のアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のマルトースアミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、リケニフォルミス菌のペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、枯草菌のｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子、及び原核生物のベータ－ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９７８， ７５：３７２７－３７３１ を参照）、並びにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９８３， ８０： ２１－２５ を参照）から得られるプロモーターが挙げられる。糸状菌宿主細胞用の例示的なプロモーターとしては、限定されるものではないが、麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）のＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、黒カビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）の中性アルファ－アミラーゼ、黒カビの酸安定性アルファ－アミラーゼ、黒カビ又は黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ａｗａｍｏｒｉ）のグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、リゾムコール・ミエヘイのリパーゼ、麹菌のアルカリプロテアーゼ、麹菌のトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）のアセトアミダーゼ、及びフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）のトリプシン様プロテアーゼ（例えば、国際公開第９６／００７８７号を参照）、並びにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（黒カビの中性アルファ－アミラーゼと麹菌のトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子の遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、並びにこれらの変異体、末端切断型、及びハイブリッドプロモーターが挙げられる。酵母細胞プロモーターの例は、サッカロミセス・セレビッシェのエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、サッカロミセス・セレビシエのガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエのアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエの３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞用の他の有用なプロモーターは、当該技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ， １９９２， ８：４２３－４８８ を参照）。
【0185】
いくつかの実施態様において、制御配列はまた、適切な転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列）でもある。いくつかの実施態様において、ターミネーター配列は、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結されている。選択された宿主細胞で機能する任意の適切なターミネーターは本発明で使用される。細菌での発現の場合、転写ターミネーターは、Ｒｈｏ転写因子に依存するＲｈｏ依存性ターミネーター、又は転写因子を必要としないＲｈｏ非依存性若しくは内因性ターミネーターであり得る。例示的な細菌転写ターミネーターは、Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．， ２０１１， ４１２（５）：７９３－８１３ に記載されている。糸状菌宿主細胞用の転写ターミネーターの例は、麹菌のＴＡＫＡアミラーゼ、黒カビのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスのアントラニル酸シンターゼ、黒カビのアルファグルコシダーゼ、及びフザリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞用のターミネーターの例は、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエのシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、及びサッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素の遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞用の他の有用なターミネーターは、当該技術分野で既知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．、前述、を参照）。
【0186】
いくつかの実施態様において、制御配列は適切なリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）でもある。いくつかの実施態様において、リーダー配列は、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結されている。選択された宿主細胞で機能する任意の適切なリーダー配列が本発明で使用される。糸状菌宿主細胞用の例示的なリーダーは、麹菌のＴＡＫＡアミラーゼ、及びアスペルギルス・ニデュランスのトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に適したリーダーは、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、サッカロミセス・セレビシエの３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエのアルファ因子、及びサッカロミセス・セレビシエのアルコール脱水素酵素／グリセルアルデヒド－３－リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【0187】
いくつかの実施態様において、制御配列はまたポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結されており、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）でもある。選択された宿主細胞で機能する任意の適切なポリアデニル化配列が本発明で使用される。糸状菌宿主細胞の例示的なポリアデニル化配列には、限定されるものではないが、麹菌のＴＡＫＡアミラーゼ、黒カビのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスのアントラニル酸シンターゼ、フザリウムオキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼ、及び黒カビのアルファグルコシダーゼの遺伝子が含まれる。酵母宿主細胞に有用なポリアデニル化配列は既知である（例えば、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏ．， １９９５， １５：５９８３－５９９０ を参照）。
【0188】
いくつかの実施態様において、制御配列はシグナルペプチドでもある（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コード化されたポリペプチドを細胞の分泌経路に導くコード領域）。いくつかの実施態様において、核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと、翻訳リーディングフレームで自然に連結されたシグナルペプチドコード領域を本質的に含む。あるいは、いくつかの実施態様において、コード配列の５’末端は、コード配列とは無関係なシグナルペプチドコード領域を含む。選択された宿主細胞の分泌経路に、発現されたポリペプチドを導く任意の適切なシグナルペプチドコード領域は、工学操作されたポリペプチドの発現に使用される。細菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード領域は、限定されるものではないが、バチルスＮＣｌＢ１１８３７のマルトース生成アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスのアルファアミラーゼ、バチルス・リケニフォルミスのサブチリシン、バチルス・リケニフォルミスのベータラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスの中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、及び枯草菌のｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域を含む。さらなるシグナルペプチドは、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．， １９９３， ５７：１０９－１３７ を参照）。いくつかの実施態様において、糸状菌宿主細胞に有効なシグナルペプチドコード領域は、限定されるものではないが、麹菌のＴＡＫＡアミラーゼ、黒カビの中性アミラーゼ、黒カビのグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイのアパラギン酸プロテイナーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）のセルラーゼ、及びフミコラ・ラヌギノーサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）のリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が含まれる。酵母宿主細胞に有用なシグナルペプチドには、限定されるものではないが、サッカロミセス・セレビシエのアルファ因子及びサッカロミセス・セレビシエのインベルターゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドが含まれる。
【0189】
いくつかの実施態様において、制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもある。結果として得られるポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」、又は「チモーゲン」と呼ばれる。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからプロペプチドを触媒又は自己触媒的に切断することによって、成熟した活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域は、限定されるものではないが、枯草菌のアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、枯草菌の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、サッカロミセス・セレビシエのアルファ因子、リゾムコール・ミエヘイのアパラギン酸プロテアーゼ、及びミセリオフトラ・サーモフィラのラクターゼの遺伝子を含む、任意の適切な供給源から取得することができる（例えば、国際公開第９５／３３８３６号を参照）。シグナルペプチド領域とプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域はポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域はプロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【0190】
いくつかの実施態様において、調節配列も利用される。これらの配列は、宿主細胞の増殖に対するポリペプチドの発現の調節を促進する。調節システムの例としては、調節化合物の存在を含む化学的又は物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオン又はオフにするものがある。原核生物宿主細胞では、適切な調節配列には、限定されるものではないが、ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｐオペレーターシステムが含まれる。酵母宿主細胞では、適切な調節配列は、限定されるものではないが、ＡＤＨ２システム又はＧＡＬ１システムを含む。糸状菌では、適切な調節配列は、限定されるものではないが、ＴＡＫＡアルファアミラーゼプロモーター、黒カビのグルコアミラーゼプロモーター、及び麹菌のグルコアミラーゼプロモーターを含む。
【0191】
別の態様において、本発明は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び導入される宿主の種類に応じてプロモーター及びターミネーター、複製開始点などの１つ又はそれ以上の発現調節領域を含む組み換え発現ベクターに関する。いくつかの実施態様において、本明細書に記載されるさまざまな核酸及び制御配列が一緒に結合されて、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする核酸配列をそのような部位に挿入又は置換することを可能にする１つ又はそれ以上の便利な制限部位を含む組み換え発現ベクターが産生される。あるいは、いくつかの実施態様において、本発明の核酸配列は、核酸配列又は配列を含む核酸構築物を、発現のための適切な発現ベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターの作成を伴ういくつかの実施態様において、コード配列はベクター内に配置されるため、コード配列は、適切な発現制御配列と作動可能に連結される。
【0192】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ操作に都合よく適用でき、ロイシン脱炭酸酵素ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意の適切なベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）である。ベクターの選択は、通常、ベクターとベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状又は閉環状プラスミドであり得る。
【0193】
いくつかの実施態様において、発現ベクターは、自律複製ベクター（すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体の複製に依存しないベクター、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は工学操作染色体）である。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含んでもよい。いくつかの別の実施態様において、ベクターは、宿主細胞に導入されるとゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体とともに複製されるベクターである。さらに、いくつかの実施態様において、単一のベクター若しくはプラスミド、又は宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含む２つ又はそれ以上のベクター又はプラスミド、及び／又はトランスポゾンが使用される。
【0194】
いくつかの実施態様において、発現ベクターは、形質転換細胞を容易に選択できる１つ又はそれ以上の選択マーカーを含む。「選択マーカー」とは、その生成物が殺生物剤耐性又はウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌性選択マーカーの例には、限定されるものではないが、枯草菌の又はバチルス・リケニフォルミスのｄａｌ遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、若しくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが含まれる。酵母宿主細胞に適したマーカーには、限定されるものではないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３が含まれる。糸状菌宿主細胞で使用される選択マーカーとしては、限定されるものではないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ、例えば、黒カビ又は麹菌由来）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、例えば、エス・ヒグロスコピクス（Ｓ． ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）由来）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸脱炭酸酵素、例えば黒カビ又は麹菌由来）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、並びにこれらの同等物が挙げられる。
【0195】
別の態様において、本発明は、本発明の少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内で工学操作ロイシン脱炭酸酵素を発現するための１つ又はそれ以上の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現に使用するのに適した宿主細胞は当該技術分野で周知であり、限定されるものではないが、細菌細胞、例えば大腸菌、ビブリオ・フルビアリス（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及びサルモネラ・チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエ又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２細胞及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、及びボウズ黒色腫細胞；及び植物細胞が含まれる。例示的な宿主細胞にはまた、様々な大腸菌株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）及びＢＬ２１）も含まれる。
【0196】
従って、別の態様において、本発明は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を、前記ポリペプチドの発現に適した条件下で培養することを含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、培養物及び／又は宿主細胞から工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを回収することをさらに含む。いくつかの実施態様において、前記方法は、本明細書に記載のロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを単離及び／又は精製する工程をさらに含む。
【0197】
宿主細胞に適した培養培地及び増殖条件は、当該技術分野でよく知られている。ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの発現のためにポリヌクレオチドを細胞に導入するあらゆる適切な方法が本発明で利用されると考えられる。適切な技術には、限定されるものではないが、電気穿孔法、微粒子銃法、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、及びプロトプラスト融合が含まれる。
【0198】
本明細書に開示された特性を有する工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、天然又は工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当該技術分野で既知の及び／又は本明細書に記載の任意の適切な突然変異誘発及び／又は指向性進化法に供することによって得ることができる。例示的な指向性進化技術は、突然変異誘発及び／又はＤＮＡシャッフリングである（例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９４， ９１：１０７４７－１０７５１；国際公開第９５／２２６２５号；国際公開第９７／００７８号；国際公開第９７／３５９６６号；国際公開第９８／２７２３０号；国際公開第００／４２６５１号；国際公開第０１／７５７６７号；及び米国特許第６，５３７，７４６号を参照）。使用できる他の指向性進化手順としては、特に、スタッガード伸長プロセス（ＳｔＥＰ）、インビトロ組換え（例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９８， １６：２５８－２６１ を参照）、変異誘発ＰＣＲ（例えば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．， １９９４， ３：Ｓ１３６－Ｓ１４０ を参照）、及びカセット変異誘発（例えば、Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９６， ９３：３５２５－３５２９ を参照）などがある。
【0199】
突然変異誘発法と指向性進化法は、ロイシン脱炭酸酵素をコードするポリヌクレオチドに容易に適用でき、発現、スクリーニング、アッセイが可能な変種ライブラリを生成することができる。任意の適切な突然変異誘発法及び指向性進化法が、本発明で使用され、当該技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、第５，８１１，２３８号、第５，８３０，７２１号、第５，８３４，２５２号、第５，８３７，４５８号、第５，９２８，９０５号、第６，０９６，５４８号、第６，１１７，６７９号、第６，１３２，９７０号、第６，１６５，７９３号、第６，１８０，４０６号、第６，２５１，６７４号、第６，２６５，２０１号、第６，２７７，６３８号、第６，２８７，８６１号、第６，２８７，８６２号、第６，２９１，２４２号、第６，２９７，０５３号、第６，３０３，３４４号、第６，３０９，８８３号、第６，３１９，７１３号、第６，３１９，７１４号、第６，３２３，０３０号、第６，３２６，２０４号、第６，３３５，１６０号、第６，３３５，１９８号、第６，３４４，３５６号、第６，３５２，８５９号、第６，３５５，４８４号、第６，３５８，７４０号、第６，３５８，７４２号、第６，３６５，３７７号、第６，３６５，４０８号、第６，３６８，８６１号、第６，３７２，４９７号、第６，３３７，１８６号、第６，３７６，２４６号、第６，３７９，９６４号、第６，３８７，７０２号、第６，３９１，５５２号、第６，３９１，６４０号、第６，３９５，５４７号、第６，４０６，８５５号、第６，４０６，９１０号、第６，４１３，７４５号、第６，４１３，７７４号、第６，４２０，１７５号、第６，４２３，５４２号、第６，４２６，２２４号、第６，４３６，６７５号、第６，４４４，４６８号、第６，４５５，２５３号、第６，４７９，６５２号、第６，４８２，６４７号、第６，４８３，０１１号、第６，４８４，１０５号、第６，４８９，１４６号、第６，５００，６１７号、第６，５００，６３９号、第６，５０６，６０２号、第６，５０６，６０３号、第６，５１８，０６５号、第６，５１９，０６５号、第６，５２１，４５３号、第６，５２８，３１１号、第６，５３７，７４６号、第６，５７３，０９８号、第６，５７６，４６７号、第６，５７９，６７８号、第６，５８６，１８２号、第６，６０２，９８６号、第６，６０５，４３０号、第６，６１３，５１４号、第６，６５３，０７２号、第６，６８６，５１５号、第６，７０３，２４０号、第６，７１６，６３１号、第６，８２５，００１号、第６，９０２，９２２号、第６，９１７，８８２号、第６，９４６，２９６号、第６，９６１，６６４号、第６，９９５，０１７号、第７，０２４，３１２号、第７，０５８，５１５号、第７，１０５，２９７号、第７，１４８，０５４号、第７，２２０，５６６号、第７，２８８，３７５号、第７，３８４，３８７号、第７，４２１，３４７号、第７，４３０，４７７号、第７，４６２，４６９号、第７，５３４，５６４号、第７，６２０，５００号、第７，６２０，５０２号、第７，６２９，１７０号、第７，７０２，４６４号、第７，７４７，３９１号、第７，７４７，３９３号、第７，７５１，９８６号、第７，７７６，５９８号、第７，７８３，４２８号、第７，７９５，０３０号、第７，８５３，４１０号、第７，８６８，１３８号、第７，７８３，４２８号、第７，８７３，４７７号、第７，８７３，４９９号、第７，９０４，２４９号、第７，９５７，９１２号、第７，９８１，６１４号、第８，０１４，９６１号、第８，０２９，９８８号、第８，０４８，６７４号、第８，０５８，００１号、第８，０７６，１３８号、第８，１０８，１５０号、第８，１７０，８０６号、第８，２２４，５８０号、第８，３７７，６８１号、第８，３８３，３４６号、第８，４５７，９０３号、第８，５０４，４９８号、第８，５８９，０８５号、第８，７６２，０６６号、第８，７６８，８７１号、第９，５９３，３２６号、第９，６６５，６９４号、第９，６８４，７７１号、及び、全ての関連する米国及び米国以外の対応特許；Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９７， ２５４（２）：１５７－７８； Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９６， ５７：３６９－７４； Ｓｍｉｔｈ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， １９８５， １９：４２３－４６２； Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８５， ２２９：１１９３－１２０１； Ｃａｒｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， １９８６， ２３７：１－７； Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ， １９８４， ３８：８７９－８８７； Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １９８５， ３４：３１５－３２３； Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， １９９９， ３：２８４－２９０； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９９， １７：２５９－２６４； Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， １９９８， ３９１：２８８－２９１； Ｃｒａｍｅｒｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９７， １５：４３６－４３８； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９９７， ９４：４５０４－４５０９； Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １９９６， １４：３１５－３１９； Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ， １９９４， ３７０：３８９－３９１； Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９４， ９１：１０７４７－１０７５１；国際公開第９５／２２６２５号；国際公開第９７／００７８号；国際公開第９７／３５９６６号；国際公開第９８／２７２３０号；国際公開第００／４２６５１号；国際公開第０１／７５７６７号；国際公開第２００９／１５２３３６号；及び米国特許出願公開第２０１１／００８２０５５号、２０１４／０００５０５７号、２０１４／０２１４３９１号、２０１４／０２２１２１６号号、２０１５／０１３３３０７号、２０１５／０１３４３１５号、及び２０１５／００５０６５８号；これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。
【0200】
いくつかの実施態様において、突然変異誘発処理後に得られる酵素クローンは、酵素調製物を規定の温度（又は他のアッセイ条件）に供し、熱処理又は他の適切なアッセイ条件後に残存する酵素活性の量を測定することによってスクリーニングされる。次に、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むクローンを遺伝子から単離し、配列決定してヌクレオチド配列の変化（ある場合）を識別し、これを使用して宿主細胞内で酵素が発現される。発現ライブラリからの酵素活性の測定は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法（例えば、ＨＰＬＣ分析などの標準的な生化学技術）を使用して実行することができる。
【0201】
既知の配列の工学操作ポリペプチドの場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、既知の合成方法に従う標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施態様において、最大約１００塩基の断片を個別に合成し、次に結合して（例えば、酵素的又は化学的連結法、又はポリメラーゼ媒介法によって）、任意の所望の連続配列を形成することができる。例えば、本明細書に開示されるポリヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドは、古典的なホスホラミダイト法自動化合成法で調製することができ（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ．， １９８１， ２２：１８５９－６９； 及び Ｍａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９８４， ３：８０１－０５を参照）、これは、典型的には自動合成法で実施されている。オリゴヌクレオチドはホスホラミダイト法に従って合成される（例えば、自動ＤＮＡ合成装置、精製、アニーリング、連結、及び適切なベクター中のクローニング）。
【0202】
従って、いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを調製する方法は、（ａ）本明細書に記載の任意の変種のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成すること、及び（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされるロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを発現することを含み得る。前記方法のいくつかの実施態様において、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、任意選択的に、１つ又は複数（例えば、最大３、４、５、又は最大１０）のアミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は置換を有し得る。いくつかの実施態様において、アミノ酸配列は、任意選択的に、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～２１、１～２２、１～２３、１～２４、１～２５、１～３０、１～３５、１～４０、１～４５、又は１～５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は置換を有する。いくつかの実施態様において、アミノ酸配列は、任意選択的に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３０、３５、４０、４５、又は５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は置換を有する。いくつかの実施態様において、アミノ酸配列は、任意選択的に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入、及び／又は置換を有する。いくつかの実施態様において、置換は保存的置換又は非保存的置換である。
【0203】
いくつかの実施態様において、発現された工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、限定されるものではないが、本明細書に記載のアッセイ及び条件を含む当該技術分野で既知の任意の適切なアッセイを使用して、任意の所望の改良された特性又は特性の組み合わせ（例えば、活性、選択性、安定性など）について評価することができる。
【0204】
いくつかの実施態様において、宿主細胞で発現された任意の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、細胞及び／又は培養培地から、タンパク質精製のためのよく知られた技術の１つ又はそれ以上、例えば、特にリゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、クロマトグラフィーを使用して回収される。
【0205】
ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技術には、特に、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、及び親和性クロマトグラフィーが含まれる。特定の酵素を精製するための条件は、部分的には、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの要因に依存し、当業者には明らかである。いくつかの実施態様において、親和性技術を使用して、改良されたロイシン脱炭酸酵素を単離することができる。親和性クロマトグラフィー精製には、目的のロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体を産生するために、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む様々な宿主動物は、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド又はその断片の注射により免疫化される。いくつかの実施態様において、ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド又は断片は、ＢＳＡなどの適切な担体に、側鎖官能基又は側鎖官能基に結合したリンカーによって結合される。
【0206】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、本明細書に記載の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞（例えば、大腸菌株）を、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの産生につながる条件下で培養し、前記細胞及び／又は培養培地から工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを回収することを含む方法によって、宿主細胞内で産生される。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、２つ以上の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを産生する。
【0207】
組成物
別の態様において、本開示の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、様々な用途の組成物として調製される。これらの組成物は、限定されるものではないが、医薬品、食事／栄養補助食品、食品、飼料、及びファインケミカル製造を含む多くの分野で使用されている。例えば、いくつかの実施態様において、本発明は、少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素変種及び／又は少なくとも１つのロイシン脱炭酸酵素変種をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む食品及び／又は飼料を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素変種を含む飲料を提供する。いくつかの実施態様において、組成物は、有効量の補酵素、例えばピリドキサール５’リン酸をさらに含む。
別の態様において、本開示の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、様々な用途の組成物として調製される。これらの組成物は、限定されるものではないが、医薬品、食事／栄養補助食品、食品、飼料、及びファインケミカル製造を含む多くの分野で使用されている。例えば、いくつかの実施態様において、本発明は、少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素変種及び／又は少なくとも１つのロイシン脱炭酸酵素変種をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む食品及び／又は飼料を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、少なくとも１つの工学操作ロイシン脱炭酸酵素変種を含む飲料を提供する。いくつかの実施態様において、組成物は、有効量の補酵素、例えばピリドキサール５’リン酸をさらに含む。
【0208】
いくつかの実施態様において、食品、飼料、及び／又は栄養／食事補助食品中の工学操作ロイシン脱炭酸酵素変異体はグリコシル化されている。さらに、工学操作ロイシン脱炭酸酵素変種は、任意の適切な食用酵素送達マトリックスで使用することができる。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素変種は、変種を摂取すると動物の消化管内でロイシン脱炭酸酵素変種が迅速に分散するように設計された食用酵素送達マトリックスに存在する。
【0209】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、ファインケミカル及びその他の産業上重要な化合物の製造に使用される（例えば、米国特許出願第２０１３／０３４０１１９号、第２０１３／０００５０１２号、及び第２００５／０２６０７２４号、並びに国際公開第２０１２／１２２３３３号を参照）。
【0210】
医薬品及び他の組成物
本発明はまた、医薬品及び食事／栄養補助食品などの他の組成物に使用するのに適した、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを提供する。
本発明はまた、医薬品及び食事／栄養補助食品などの他の組成物に使用するのに適した、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを提供する。
【0211】
投与方法に応じて、本発明に従って工学操作ロイシン脱炭酸酵素の治療有効量を含むこれらの組成物は、固体、半固体、又は液体である。いくつかの実施態様において、組成物は、他の医薬的に許容し得る成分、例えば希釈剤、緩衝剤、賦形剤、塩、乳化剤、防腐剤、安定剤、充填剤、及びその他の成分を含む。製剤化及び投与の技術の詳細は、当技術分野でよく知られており、文献に記載されている。
【0212】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、経口医薬組成物で使用するために配合される。本発明では、限定されるものではないが、丸剤、錠剤、ゲルタブ、カプセル剤、ロゼンジ、糖衣錠、粉末、ソフトゲル、ゾルゲル、ゲル剤、乳剤、インプラント、パッチ、噴霧剤、軟膏、塗布剤、クリーム、ペースト、ゼリー、ペイント、エアロゾル、チューイングガム、粘滑剤、スティック、懸濁剤（限定されるものではないが、油性懸濁剤、水中油乳剤などを含む）、スラリー、シロップ、放出制御製剤、坐剤などを含む、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを送達するために使用するのに適した任意の形式が使用される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、注射に適した形式（すなわち、注射可能な製剤）で提供される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、シリカ系（例えばオキシシラン）ゾルゲルを含むゾルゲルなどの生体適合性マトリックス中に提供される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドはカプセル化される。いくつかの代替実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドはナノ構造体（例えばナノチューブ、小ナノチューブ、ナノカプセル、又はマイクロカプセル、ミクロスフェア、リポソームなど）中にカプセル化される。実際、本発明は、特定の送達処方及び／又は送達手段に限定されることを意図していない。工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、限定されるものではないが、非経口、経口、局所、経皮、鼻腔内、眼内、髄腔内、インプラントなどを含む当該技術分野で既知の任意の適切な手段によって投与されることを意図している。
【0213】
いくつかのさらなる実施態様において、医薬組成物は、補酵素ピリドキサール－５－リン酸をさらに含む。いくつかの実施態様において、ピリドキサール－５－リン酸は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素とともに安定な組成物として配合されるか、又は投与直前に調製され得る。
【0214】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、グリコシル化、ＰＥＧ化（すなわち、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ］又は活性化ＰＥＧなどで修飾）、又は他の化合物によって化学的に修飾される（例えば、Ｉｋｅｄａ， Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ， ２００５， ２９：２８３－２８７；米国特許第７，５３１，３４１号、第７，５３４，５９５号、第７，５６０，２６３号、及び第７，５５３，６５３号；米国特許出願公開第２０１３／００３９８９８号、第２０１２／０１７７７２２号などを参照）。実際、本発明は、特定の送達方法及び／又はメカニズムに限定されることを意図していない。
【0215】
いくつかの追加の実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、マトリックス安定化酵素結晶を含む製剤で提供される。いくつかの実施態様において、前記製剤は、架橋された結晶性工学操作ロイシン脱炭酸酵素と、酵素結晶に付着する反応性部分を有するポリマーとを含む。本発明はまた、ポリマー中の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドも提供する。
【0216】
いくつかの実施態様において、本発明の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを含む組成物には、１つ又はそれ以上の一般的に使用される担体化合物が含まれ、そこれらは、限定されるものではないが、糖類（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、及び／又はソルビトール）、デンプン（例えば、トウモロコシ、小麦、米、ジャガイモ、又はその他の植物デンプン）、セルロース（例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム）、ゴム（例えば、アラビアゴム、トラガカントゴム、グアーゴムなど）、及び／又はタンパク質（例えば、ゼラチン、コラーゲンなど）を含む。経口製剤中の追加の成分には、着色剤及び／又は甘味剤（例えば、グルコース、スクロース、及びマンニトール）、及び潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、並びに腸溶性コーティング（例えば、メタクリレートポリマー、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及び／又は当該技術分野で知られている他の任意の適切な腸溶性コーティング）が含まれ得る。いくつかの実施態様において、崩壊剤又は可溶化剤（例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はその塩、例えばアルギン酸ナトリウム）が含まれる。
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、特に液体製剤において、さまざまな追加成分、限定されるものではないが、防腐剤、懸濁剤、増粘剤、湿潤剤、アルコール、脂肪酸、及び／又は乳化剤と組み合わされる。
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、特に液体製剤において、さまざまな追加成分、限定されるものではないが、防腐剤、懸濁剤、増粘剤、湿潤剤、アルコール、脂肪酸、及び／又は乳化剤と組み合わされる。
【0217】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、特に液体製剤において、さまざまな追加成分、限定されるものではないが、防腐剤、懸濁剤、増粘剤、湿潤剤、アルコール、脂肪酸、及び／又は乳化剤と組み合わされる。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、ＭＳＵＤの治療に使用される他の化合物、並びに他の任意の適切な化合物と組み合わせて被験体に投与される。
【0218】
いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書に記載のように、ＭＳＵＤの兆候及び／又は症状の軽減、改善、又は排除に使用するのに適した、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドを提供する。患者に投与される工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの用量は、患者の遺伝子型、患者の全身状態、及び当業者に知られている他の要因に依存する。いくつかの実施態様において、組成物は、患者への単回又は反復投与を意図している。いくつかの実施態様において、患者に投与される組成物中の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの濃度は、疾患の症状を効果的に治療、改善、及び／又は予防するのに十分であることが意図されている。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、他の医薬組成物及び／又は食事組成物と組み合わせて投与される。
【0219】
産業用組成物
本発明の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、食品香料（チーズなど）などの分野を含む産業用組成物における用途を見いだすことが考えられる。
本発明の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、食品香料（チーズなど）などの分野を含む産業用組成物における用途を見いだすことが考えられる。
【0220】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは食品及び／又は飼料産業における用途のために製剤化されている。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは顆粒又はペレット生成物として製剤化され、これらは追加の酵素（例えば、セルラーゼ、ラッカーゼ、及びアミラーゼ）などの動物飼料成分と混合される。いくつかの代替実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、液体動物飼料組成物（例えば、水性又は油性スラリー）で使用される。従って、いくつかの実施態様において、本発明の工学操作ロイシン脱炭酸酵素変種は、充分に耐熱性及び熱安定性であり、ペレットやその他飼料／食品を製造するために使用される処理に耐える。
【0221】
治療用途と方法
別の態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、ロイシン、イソロイシン、及び／又はアロイソロイシン代謝の機能不全に関連する状態の症状の治療及び／又は予防に使用される。いくつかの実施態様において、血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させる治療のための被験体は、有機酸血症又はアミノ酸代謝先天異常を有する。いくつかの実施態様において、血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させる治療のための被験体は、原因不明の病因によりロイシンレベルが上昇している。
別の態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、ロイシン、イソロイシン、及び／又はアロイソロイシン代謝の機能不全に関連する状態の症状の治療及び／又は予防に使用される。いくつかの実施態様において、血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させる治療のための被験体は、有機酸血症又はアミノ酸代謝先天異常を有する。いくつかの実施態様において、血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させる治療のための被験体は、原因不明の病因によりロイシンレベルが上昇している。
【0222】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態の症状を治療及び／又は予防するために使用される。いくつかの実施態様において、血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態の症状を治療及び／又は予防する方法は、被験体の血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させるのに有効な量の工学操作ロイシン脱炭酸酵素を、それを必要とする被験体に投与することを含む。
【0223】
いくつかの実施態様において、血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態は、メープルシロップ尿症である。いくつかの実施態様において、血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態は、イソ吉草酸血症である。いくつかの実施態様において、血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態は、３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症である。
【0224】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、被験体の血漿中のロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させるために使用される。いくつかの実施態様において、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルは、例えばアミノ酸代謝の機能不全に関連する疾患又は状態の指標として、及び／又は工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドによる治療の有効性のマーカーとして使用することができる。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、被験体における血漿中のロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させるために使用され、その方法は、それを必要とする被験体に、工学操作ロイシン脱炭酸酵素の有効量を投与することを含む。
【0225】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、被験体における血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルを低下させるために使用され、その方法は、それを必要とする被験体に、工学操作ロイシン脱炭酸酵素の有効量を投与することを含む。いくつかの実施態様において、血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルを低下させるための治療のための被験体は、メープルシロップ尿症である。いくつかの実施態様において、血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルを低下させるための治療のための被験体は、イソ吉草酸血症である。いくつかの実施態様において、血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルを低下させるための治療のための被験体は、３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症を有する。
【0226】
いくつかの実施態様において、被験体におけるロイシン、イソロイシン、及び／又はアロイソロイシン代謝の機能不全に関連する状態の症状の治療及び／又は予防のために、又は血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させるために、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは有効用量で投与される。
【0227】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、１ｍｇ／ｋｇ～４００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、約１ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、約２ｍｇ／ｋｇ～約３００ｍｇ／ｋｇ、又は約５ｍｇ／ｋｇ～約２００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１２０ｍｇ／ｋｇ、約１４０ｍｇ／ｋｇ、約１６０ｍｇ／ｋｇ、約１８０ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、約２５０ｍｇ／ｋｇ、約３００ｍｇ／ｋｇ、約３５０ｍｇ／ｋｇ、又は約４００ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、約６．２５ｍｇ／ｋｇ～約１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、約６．２５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、約１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【0228】
メープルシロップ尿症の治療のためのいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で投与される。メープルシロップ尿症の治療のためのいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、５ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇ未満の用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、約６．２５ｍｇ／ｋｇ～約１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、約６．２５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、約１２．５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【0229】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、被験体における血漿中のロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させるために使用される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、それを必要とする被験体における血漿中のロイシン、ケトイソカプロン酸、及びメチオニンのレベルを低下させるのに有効な量で投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、少なくとも２日又はそれ以上連続して被験体に投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、少なくとも３日又はそれ以上連続して被験体に投与される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、それを必要とする被験体を治療するために、例えば数週間、数ヶ月、数年、及び／又は必要に応じて連続して投与される。
【0230】
いくつかの実施態様において、ロイシン、イソロイシン、及び／又はアロイソロイシン代謝の機能不全に関連する状態の症状の治療及び／又は予防のために、又は被験体における血漿ロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させるために、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、疾患又は障害を有する未治療の被験体におけるベースラインのロイシンレベルと比較して、血漿又は血清ロイシンレベルを約５％又はそれ以上、１０％又はそれ以上、１５％又はそれ以上、２０％又はそれ以上、２５％又はそれ以上、３０％又はそれ以上、４０％又はそれ以上、及び／又は５０％又はそれ以上低下させる用量で投与される。
【0231】
いくつかの実施態様において、ロイシン、イソロイシン、及び／又はアロイソロイシン代謝の機能不全に関連する状態の症状の治療及び／又は予防のために、又は被験体における血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸のレベルを低下させるために、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、タンパク質を含む食事の摂取直前、摂取と同時、及び／又は摂取直後に投与される。
【0232】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載の方法のいずれにおいても、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、補酵素ピリドキサール－５－リン酸と組み合わせて投与することができる。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、投与前にピリドキサール－５－リン酸と配合することができる。いくつかの実施態様において、ピリドキサール－５－リン酸は、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドの投与と同時に投与される。
【0233】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドで治療される被験体はメープルシロップ尿症を患っており、ここで、メープルシロップ尿症の症状が緩和される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドで治療される被験体はイソ吉草酸血症を患っており、ここで、イソ吉草酸血症の症状が緩和される。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドで治療される被験体は３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症を患っており、ここで、３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症の症状が緩和される。いくつかの実施態様において、被験体は、疾患に罹患している被験体が要求する食事と比較して、ロイシン、イソロイシン、及び／又はバリン含有量の制限が少ない食事を摂取することができる。いくつかの実施態様において、被験体は、乳児、子供、若年成人、又は成人である。
【0234】
いくつかの実施態様において、本明細書の治療方法及び使用に有用な工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、上記の工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチド、並びに国際特許公開ＷＯ２０２１１５８６８６号及びその対応する配列表に記載されているもの（これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含む。これらの工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、付録（表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、及び１１－２）、及び本開示の組み込まれた配列リストにも示されている。
【0235】
治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、及び／又は８８８の少なくとも１つに対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８の参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0236】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、及び／又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0237】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0238】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0239】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0240】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0241】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号１０に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0242】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号１４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0243】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号１２、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号１２、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0244】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号１２、３８、２３４、２８４、４８４、５９４、６８６、６８８、７６６、８２８、又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号１２に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0245】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素のアミノ酸配列は、アミノ酸位置２、３、５、１２、１４、１６、１９、３３、３４、３８、３９、４１、４７、４８、５１、５５、６３、６４、６６、６９、７６、７７、８０、８７、８９、９１、９２、１０２、１０６、１０９、１１８、１２３、１２６、１２７、１３２、１３４、１３５、１３９、１４０、１４１、１５６、１６１、１６４、１６８、１７０、１７３、１８１、１８７、１８９、１９３、１９４、１９６、１９８、２００、２０１、２０２、２１１、２２３、２２８、２４５、２５５、２５６、２５９、２６２、２６３、２６５、２６７、２７０、２７２、２７５、２９０、２９６、２９９、３００、３０３、３０４、３１２、３１７、３１９、３２４、３２８、３３１、３３８、３３９、３４０、３４３、３４９、３５０、３５２、３５３、３５７、３６４、３６５、３６５、３６６、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８６、３８８、３８９、３９０、３９１、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、４０１、４０４、若しくは４０５、又はこれらの組み合わせに、少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0246】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素のアミノ酸配列は、少なくとも置換２Ｅ、３Ｍ、５Ｍ／Ｖ、１２Ｇ、１４Ｉ／Ｔ、１６Ｑ／Ｖ、１９Ｉ／Ｌ、３３Ｌ、３４Ｌ、３８Ｖ、３９Ｎ／Ｓ、４１Ｄ、４７Ｆ、４８Ｌ、５１Ｑ／Ｅ、５５Ｉ、６３Ｃ、６４Ｓ／Ａ／Ｎ／Ｅ、６６Ｓ／Ｎ、６９Ｉ、７６Ｖ、７７Ｌ、８０Ｇ／Ｋ、８７Ｒ、８９Ｐ、９１Ａ／Ｑ、９２Ｋ、１０２Ｓ、１０６Ｍ、１０９Ｇ、１１８Ｔ／Ｄ、１２３Ｆ／Ｍ／Ｖ、１２６Ａ／Ｔ、１２７Ｓ、１３２Ｆ、１３４Ａ／Ｓ、１３５Ｖ、１３９Ｇ、１４０Ｖ、１４１Ｐ、１５６Ａ／Ｓ、１６１Ｖ、１６４Ａ／Ｃ、１６８Ｋ、１７０Ａ／Ｐ、１７３Ａ／Ｉ／Ｔ、１８１Ｋ／Ｒ／Ｖ、１８７Ｌ、１８９Ａ／Ｄ、１９３Ｉ、１９４Ｃ／Ｌ、１９６Ｄ／Ｒ、１９８Ｇ、２００Ｓ、２０１Ｄ／Ｒ、２０２Ｈ、２１１Ｓ、２２３Ｍ、２２８Ｄ、２４５Ｍ、２５５Ｇ／Ｎ／Ｐ／Ｈ、２５６Ｗ、２５９Ｋ／Ｌ／Ｑ、２６２Ｄ／Ｇ／Ｈ／Ｉ／Ｓ／Ｔ、２６３Ｔ／Ｖ、２６５Ｐ、２６７Ｌ／Ｉ、２７０Ｒ／Ａ／Ｔ／Ｌ、２７２Ａ、２７５Ｓ、２９０Ｉ、２９６Ｄ／Ｅ、２９９Ａ、３００Ｒ／Ｋ、３０３Ｑ、３０４Ｒ、３１２Ａ／Ｔ、３１７Ｑ、３１９Ａ、３２４Ｎ／Ｓ／Ｍ／Ｎ／Ｔ、３２８Ｎ、３３１Ｖ、３３８Ｓ、３３９Ａ／Ｄ、３４０Ｔ／Ｖ、３４３Ａ／Ｅ、３４９Ｔ、３５０Ｓ／Ｅ、３５２Ａ、３５３Ｉ／Ｌ／Ｄ／Ｎ／Ｓ／Ｗ／Ｅ、３５７Ｓ／Ｃ／Ｍ／Ｖ、３６４Ｋ／Ｒ、３６５Ｅ、３６５Ｅ、３６６Ａ／Ｍ／Ｑ／Ｔ／Ｖ、３７９Ｄ／Ｎ／Ｐ／Ｅ、３８０Ｅ、３８１Ｄ／Ｅ、３８２Ｇ／Ｓ、３８３Ｓ、３８４Ｗ、３８６＊、３８８Ａ、３８９Ｇ／Ｐ／Ｑ、３９０Ａ／Ｓ／Ｅ／＊、３９１Ｅ／＊、３９３Ｔ、３９４Ｅ、３９５Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｓ、３９７Ａ、３９８＊、４０１Ｙ／＊、４０４Ｉ、若しくは４０５Ｄ／Ｈ／Ｌ／Ｅ、又はこれらの組み合わせを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0247】
いくつかのさらなる実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号１２に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置５、１４、１４／３４／３８／３９／１０２／２６７／２７５／３５０／３５７、１４／３９／１０２／１２７／２４５／２６７／２７５／３４９／３５０、３４／３８／３９／１０２／１２７／２７５／３５７、３４／３８／３９／１０２／２７５／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３４９／３５０／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３５０／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２７５／３４９／３５７、３４／３９／１０２／２６４／２７５／３５０／３５７、３４／３９／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６４／２６７／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６７／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３５０、３８／３９／１０２／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／２４５／２６７／３５７、３８／３９／１２７／２６４／２７５、３８／３９／１２７／２６４／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５７、３８／３９／２４５／２７５／３５７、３８／３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３８／３９／２６４／２７５／３５７、３８／３９／２７５、３８／３９／２７５／３５０、３９、３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６７／２７５／３５７、３９／１２７／２４５／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／１２７／２４５／２６４／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２４５／３５７、３９／１２７／２６７／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２６７／３５０／３５７、３９／１２７／３５７、３９／２４５／２６４／２６７／２７５／３５７、３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／２７５／３５０／３５７、４８、１３９、１６４、１９６、２５５、２９９、３１８、３２４、３３９、３４３、３５０、３５３、３５７、３６４、３６５、３７９、３８１、３８６、３８９、３９１、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、又は４０５において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット５Ｍ、１４Ｉ、１４Ｔ／３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、１４Ｔ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／１０２Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／３５０Ｅ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６７Ｉ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／２４５Ｍ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３８Ｖ／３９Ｎ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／２７５Ｓ、３８Ｖ／３９Ｎ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１０２Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１０２Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２６７Ｉ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／２４５Ｍ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３９Ｎ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｓ、４８Ｆ、１３９Ｇ、１６４Ａ、１６４Ｃ、１９６Ｄ、１９６Ｒ、２５５Ｇ、２５５Ｎ、２５５Ｐ、２９９Ａ、２９９Ｖ、３１８Ｋ、３２４Ｍ、３２４Ｓ、３２４Ｔ、３３９Ａ、３３９Ｄ、３４３Ａ、３４３Ｅ、３５０Ｓ、３５３Ｄ、３５３Ｅ、３５３Ｌ、３５３Ｎ、３５３Ｓ、３５３Ｗ、３５７Ｃ、３５７Ｍ、３６４Ｋ、３６４Ｒ、３６５Ｅ、３７９Ｄ、３７９Ｐ、３８１Ｄ、３８１Ｅ、３８６＊、３８９Ｅ、３８９Ｇ、３８９Ｐ、３８９Ｑ、３９１＊、３９１Ｅ、３９３Ｔ、３９４Ｅ、３９５Ａ、３９５Ｄ、３９５Ｇ、３９５Ｋ、３９５Ｓ、３９７Ａ、３９８＊、４０５Ｄ、４０５Ｅ、４０５Ｈ、又は４０５Ｌを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＫ５Ｍ、Ｈ１４Ｉ、Ｈ１４Ｔ／Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｈ１４Ｔ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｖ２６７Ｉ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｉ２４５Ｍ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｓ、Ｌ４８Ｆ、Ｎ１３９Ｇ、Ｉ１６４Ａ、Ｉ１６４Ｃ、Ｋ１９６Ｄ、Ｋ１９６Ｒ、Ｈ２５５Ｇ、Ｈ２５５Ｎ、Ｈ２５５Ｐ、Ｋ２９９Ａ、Ｋ２９９Ｖ、Ｒ３１８Ｋ、Ｒ３２４Ｍ、Ｒ３２４Ｓ、Ｒ３２４Ｔ、Ｑ３３９Ａ、Ｑ３３９Ｄ、Ｈ３４３Ａ、Ｈ３４３Ｅ、Ｎ３５０Ｓ、Ｒ３５３Ｄ、Ｒ３５３Ｅ、Ｒ３５３Ｌ、Ｒ３５３Ｎ、Ｒ３５３Ｓ、Ｒ３５３Ｗ、Ｉ３５７Ｃ、Ｉ３５７Ｍ、Ｌ３６４Ｋ、Ｌ３６４Ｒ、Ｑ３６５Ｅ、Ｋ３７９Ｄ、Ｋ３７９Ｐ、Ａ３８１Ｄ、Ａ３８１Ｅ、Ｄ３８６＊、Ｋ３８９Ｅ、Ｋ３８９Ｇ、Ｋ３８９Ｐ、Ｋ３８９Ｑ、Ａ３９１＊、Ａ３９１Ｅ、Ｋ３９３Ｔ、Ｋ３９４Ｅ、Ｒ３９５Ａ、Ｒ３９５Ｄ、Ｒ３９５Ｇ、Ｒ３９５Ｋ、Ｒ３９５Ｓ、Ｔ３９７Ａ、Ｐ３９８＊、Ｔ４０５Ｄ、Ｔ４０５Ｅ、Ｔ４０５Ｈ、又はＴ４０５Ｌを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0248】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号３８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素のアミノ酸配列は、アミノ酸位置４８／６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、４８／６４／１６４／３２４／３４３／３６４、４８／６４／１６４／３５３／３５７／３６４、４８／６４／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５７／３６４、６４／１６４／３５３／３５７、６４／３１８／３２４／３５７／３６４、６４／３２４／３５３／３５７／３６４、１３２／２５５／３３９／３７９／３９５、１６４／１９６／３２４／３５７／３６４、１６４／３１８／３２４／３４３／３５３／３５７、１６４／３１８／３２４／３５７／３６４、１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、１６４／３２４／３５７／３６４、１６４／３５３／３５７／３６４、１６４／３６４、１９６／３１８／３２４／３５３／３５７／３６４、３１８／３４３／３５７、３２４／３４３／３５７／３６４、３２４／３５３／３５７／３６４、３２４／３５７／３６４、３３９／３７９／３８９／３９４／３９５、３３９／３８９／３９５、３３９／３９１、３３９／３９４／３９５／４０５、３５７／３６４、３７９／３８６、３７９／３９４／３９５／３９７／４０４／４０５、３７９／３９４／３９５／３９７／４０５、３８９／３９４／３９５／３９７／４０５、及び３９４／３９７において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号３８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット４８Ｆ／６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、４８Ｆ／６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３６４Ｒ、４８Ｆ／６４Ｅ／１６４Ｃ／３５３Ｎ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、４８Ｆ／６４Ｅ／３５７Ｍ／３６４Ｋ、６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｋ、６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、６４Ｅ／１６４Ｃ／３５３Ｄ／３５７Ｖ、６４Ｅ／３１８Ｋ／３２４Ｓ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、６４Ｅ／３２４Ｍ／３５３Ｎ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１３２Ｆ／２５５Ｐ／３３９Ａ／３７９Ｄ／３９５Ｄ、１６４Ａ／１９６Ｄ／３２４Ｍ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、１６４Ａ／３１８Ｋ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｄ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１６４Ａ／３２４Ｍ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、１６４Ａ／３５３Ｗ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１６４Ａ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３１８Ｋ／３２４Ｓ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｋ、１６４Ｃ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３５３Ｗ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１９６Ｄ／３１８Ｋ／３２４Ｍ／３５３Ｎ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、３１８Ｋ／３４３Ｅ／３５７Ｃ、３１８Ｋ／３４３Ｅ／３５７Ｍ、３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５７Ｖ／３６４Ｋ、３２４Ｍ／３５７Ｍ／３６４Ｒ、３２４Ｎ／３５３Ｗ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、３３９Ａ／３７９Ｄ／３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ、３３９Ａ／３８９Ｇ／３９５Ｋ、３３９Ａ／３９１＊、３３９Ａ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／４０５Ｄ、３５７Ｖ／３６４Ｒ、３７９Ｄ／３８６＊、３７９Ｄ／３９４Ｅ／３９５Ｄ／３９７Ａ／４０４Ｉ／４０５Ｈ、３７９Ｄ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ／４０５Ｄ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ／３９７Ａ／４０５Ｄ、又は３９４Ｅ／３９７Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号３８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＬ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｌ３６４Ｒ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｎ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ３５７Ｍ／Ｌ３６４Ｋ、Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｋ、Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ、Ａ６４Ｅ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｓ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ａ６４Ｅ／Ｒ３２４Ｍ／Ｒ３５３Ｎ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｙ１３２Ｆ／Ｈ２５５Ｐ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３７９Ｄ／Ｒ３９５Ｄ、Ｉ１６４Ａ／Ｋ１９６Ｄ／Ｒ３２４Ｍ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３５３Ｗ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ａ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｓ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｋ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｗ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｋ１９６Ｄ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｍ／Ｒ３５３Ｎ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｒ３１８Ｋ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ、Ｒ３１８Ｋ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｍ、Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｋ、Ｒ３２４Ｍ／Ｉ３５７Ｍ／Ｌ３６４Ｒ、Ｒ３２４Ｎ／Ｒ３５３Ｗ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｑ３３９Ａ／Ｋ３７９Ｄ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｒ３９５Ｋ、Ｑ３３９Ａ／Ａ３９１＊、Ｑ３３９Ａ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ４０５Ｄ、Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｋ３７９Ｄ／Ｄ３８６＊、Ｋ３７９Ｄ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ／Ｒ４０４Ｉ／Ｔ４０５Ｈ、Ｋ３７９Ｄ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ／Ｔ４０５Ｄ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ／Ｔ４０５Ｄ、又はＫ３９４Ｅ／Ｔ３９７Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号３８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0249】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２３４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素のアミノ酸配列は、アミノ酸位置２、３、３３、４８／６４／２５５、４８／２５５／３３９、４８／２５５／３７９、６４、６４／２５５、６９、１６１、１９３、２５５、２５５／３１８／３７９、２５９、２６３、３１８／３３９／３７９、３２４、３２４／３８９／３９４、３２４／３８９／３９４／３９５、３２４／３８９／３９４／３９７、３２４／３９４、３２４／３９４／３９５、３２４／３９４／３９５／３９７、３２４／３９５、３３９、３４０、３８０、３８２、３８９、３８９／３９４、３８９／３９４／３９５、３８９／３９４／３９５／３９７、３８９／３９４／３９７、３８９／３９５、３８９／３９７、３９０、３９４、３９４／３９５、３９４／３９５／３９７、３９５、３９５／３９７、３９７、４０１、又は４０５において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２３４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット２Ｅ、３Ｍ、３３Ｌ、４８Ｆ／６４Ｅ／２５５Ｐ、４８Ｆ／２５５Ｐ／３３９Ａ、４８Ｆ／２５５Ｐ／３７９Ｄ、６４Ｅ、６４Ｅ／２５５Ｐ、６４Ｓ、６９Ｉ、１６１Ｖ、１９３Ｉ、２５５Ｐ、２５５Ｐ／３１８Ｋ／３７９Ｄ、２５９Ｌ、２６３Ｔ、２６３Ｖ、３１８Ｋ／３３９Ａ／３７９Ｄ、３２４Ｎ、３２４Ｎ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３２４Ｎ／３９５Ｄ、３２４Ｓ／３８９Ｇ／３９４Ｅ、３２４Ｓ／３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ、３２４Ｓ／３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９７Ａ、３２４Ｓ／３９４Ｅ、３２４Ｓ／３９４Ｅ／３９５Ｋ、３２４Ｓ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３２４Ｓ／３９５Ｋ、３３９Ａ、３４０Ｔ、３４０Ｖ、３８０Ｅ、３８２Ｓ、３８９Ｇ、３８９Ｇ／３９４Ｅ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ／３９７Ａ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｋ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９７Ａ、３８９Ｇ／３９５Ｄ、３８９Ｇ／３９５Ｋ、３８９Ｇ／３９７Ａ、３９０＊、３９０Ａ、３９０Ｅ、３９０Ｓ、３９４Ｅ、３９４Ｅ／３９５Ｄ、３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３９５Ｄ／３９７Ａ、３９５Ｋ、３９７Ａ、４０１＊、４０１Ｙ、又は４０５Ｈを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２３４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＧ２Ｅ、Ｎ３Ｍ、Ｆ３３Ｌ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｈ２５５Ｐ、Ｌ４８Ｆ／Ｈ２５５Ｐ／Ｑ３３９Ａ、Ｌ４８Ｆ／Ｈ２５５Ｐ／Ｋ３７９Ｄ、Ａ６４Ｅ、Ａ６４Ｅ／Ｈ２５５Ｐ、Ａ６４Ｓ、Ｖ６９Ｉ、Ｔ１６１Ｖ、Ｍ１９３Ｉ、Ｈ２５５Ｐ、Ｈ２５５Ｐ／Ｒ３１８Ｋ／Ｋ３７９Ｄ、Ｒ２５９Ｌ、Ｓ２６３Ｔ、Ｓ２６３Ｖ、Ｒ３１８Ｋ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３７９Ｄ、Ｍ３２４Ｎ、Ｍ３２４Ｎ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｍ３２４Ｎ／Ｒ３９５Ｄ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｔ３９７Ａ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３９４Ｅ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｍ３２４Ｓ／Ｒ３９５Ｋ、Ｑ３３９Ａ、Ｓ３４０Ｔ、Ｓ３４０Ｖ、Ａ３８０Ｅ、Ａ３８２Ｓ、Ｋ３８９Ｇ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｔ３９７Ａ、Ｋ３８９Ｇ／Ｒ３９５Ｄ、Ｋ３８９Ｇ／Ｒ３９５Ｋ、Ｋ３８９Ｇ／Ｔ３９７Ａ、Ｐ３９０＊、Ｐ３９０Ａ、Ｐ３９０Ｅ、Ｐ３９０Ｓ、Ｋ３９４Ｅ、Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ、Ｒ３９５Ｋ、Ｔ３９７Ａ、Ａ４０１＊、Ａ４０１Ｙ、又はＴ４０５Ｈを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２３４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0250】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２８４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置２／６４／６９／３２４／３８０／３８２／３８８／３８９、３／６４／６９／２６３／３３９／３８０／３８８、３／６４／６９／３８９、３／６４／６９／３９０、３／６４／３７９／３８０／３９０、３／６９／２６３／３８０、３／６９／３２４、３／６９／３２４／３８０／３８２／３８９／３９０、１２／１３５／２５９／２６３、１２／１３５／２６３／３８２、１２／２５９／２６３／３０４、４８／６４／２５５、６４／６９、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、６４／６９／２２３／３８８、６４／６９／２２３／３８８／３８９／３９０、６４／６９／３０４／３７９／３８２、６４／６９／３２４、６４／６９／３２４／３３９／３８０／３８９／３９０、６４／６９／３３９、６４／６９／３３９／３８２／３８８／３８９、６４／６９／３３９／３８９／３９０、６４／６９／３７９／３８０、６４／６９／３８０／３８８／３９０、６４／６９／３８９、６４／６９／３９０、６４／２５５／２６３、６４／２６３、６４／３２４／３３９／３８９／３９０、６９／２２３／２６３／３２４／３８２／３８８／３９０、６９／２２３／３２４／３７９／３８０／３８２／３８８／３９０、６９／２６３、６９／２６３／３２４、６９／２６３／３３９、６９／２６３／３８８、６９／２６３／３８９／３９０、６９／３２４／３７９／３８０／３８８、６９／３２４／３８０、６９／３３９／３９０、６９／３８２／３９０、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、２６３／３３９／３８９／３９０、２６３／３９０、又は３０４／３４０／３７９／３８０／３８２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット２Ｅ／６４Ｓ／６９Ｉ／３２４Ｓ／３８０Ｅ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３８９Ｇ、３Ｍ／６４Ｓ／６９Ｉ／２６３Ｔ／３３９Ａ／３８０Ｅ／３８８Ａ、３Ｍ／６４Ｓ／６９Ｉ／３８９Ｇ、３Ｍ／６４Ｓ／６９Ｉ／３９０＊、３Ｍ／６４Ｓ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３９０＊、３Ｍ／６９Ｉ／２６３Ｔ／３８０Ｅ、３Ｍ／６９Ｉ／３２４Ｓ、３Ｍ／６９Ｉ／３２４Ｓ／３８０Ｅ／３８２Ｓ／３８９Ｇ／３９０＊、１２Ｇ／１３５Ｖ／２５９Ｋ／２６３Ｔ、１２Ｇ／１３５Ｖ／２６３Ｔ／３８２Ｇ、１２Ｇ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、４８Ｌ／６４Ａ／２５５Ｈ、６４Ａ／２５５Ｈ／２６３Ｔ、６４Ｓ／６９Ｉ、６４Ｓ／６９Ｉ／１８９Ａ／２５９Ｑ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３３９Ａ／３４０Ｔ／３７９Ｎ、６４Ｓ／６９Ｉ／１８９Ｄ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、６４Ｓ／６９Ｉ／２２３Ｍ／３８８Ａ、６４Ｓ／６９Ｉ／２２３Ｍ／３８８Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３０４Ｒ／３７９Ｅ／３８２Ｇ、６４Ｓ／６９Ｉ／３２４Ｓ、６４Ｓ／６９Ｉ／３２４Ｓ／３３９Ａ／３８０Ｅ／３８９Ｇ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３３９Ａ、６４Ｓ／６９Ｉ／３３９Ａ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３８９Ｇ、６４Ｓ／６９Ｉ／３３９Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３７９Ｄ／３８０Ｅ、６４Ｓ／６９Ｉ／３８０Ｅ／３８８Ａ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３８９Ｇ、６４Ｓ／６９Ｉ／３９０＊、６４Ｓ／２６３Ｔ、６４Ｓ／３２４Ｓ／３３９Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、６９Ｉ／２２３Ｍ／２６３Ｔ／３２４Ｓ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３９０＊、６９Ｉ／２２３Ｍ／３２４Ｓ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３９０＊、６９Ｉ／２６３Ｔ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３２４Ｓ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３３９Ａ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３８８Ａ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３８９Ｇ／３９０＊、６９Ｉ／３２４Ｓ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３８８Ａ、６９Ｉ／３２４Ｓ／３８０Ｅ、６９Ｉ／３３９Ａ／３９０＊、６９Ｉ／３８２Ｓ／３９０＊、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３３９Ａ／３４０Ｔ／３７９Ｎ、２６３Ｔ／３３９Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、２６３Ｔ／３９０＊、又は３０４Ｒ／３４０Ｔ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３８２Ｇを有し、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＧ２Ｅ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｋ３８９Ｇ、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８０Ｅ／Ｑ３８８Ａ、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｋ３８９Ｇ、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｐ３９０＊、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ｐ３９０＊、Ｎ３Ｍ／Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３８０Ｅ、Ｎ３Ｍ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｓ１２Ｇ／Ｌ１３５Ｖ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ、Ｓ１２Ｇ／Ｌ１３５Ｖ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３８２Ｇ、Ｓ１２Ｇ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｆ４８Ｌ／Ｅ６４Ａ／Ｐ２５５Ｈ、Ｅ６４Ａ／Ｐ２５５Ｈ／Ｓ２６３Ｔ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｔ１８９Ａ／Ｒ２５９Ｑ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｑ３３９Ａ／Ｓ３４０Ｔ／Ｋ３７９Ｎ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｔ１８９Ｄ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｑ３８８Ａ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｑ３８８Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ３０４Ｒ／Ｋ３７９Ｅ／Ａ３８２Ｇ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８０Ｅ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｋ３８９Ｇ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ３８０Ｅ／Ｑ３８８Ａ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｋ３８９Ｇ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｓ２６３Ｔ、Ｅ６４Ｓ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｍ３２４Ｓ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３３９Ａ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３８８Ａ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ｑ３８８Ａ、Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８０Ｅ、Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ａ３８２Ｓ／Ｐ３９０＊、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｑ３３９Ａ／Ｓ３４０Ｔ／Ｋ３７９Ｎ、Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｓ２６３Ｔ／Ｐ３９０＊、又はＡ３０４Ｒ／Ｓ３４０Ｔ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｇを有し、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0251】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号４８４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置３／１９４／３０４、３／２５９／２６３／３０４、３／２５９／３０４、３／２５９／３０４／３２４／３３９、３／２５９／３０４／３２４／３８２、３／２５９／３０４／３８２、３／２６３／３０４／３２４、３／２６３／３０４／３２４／３３９、３／２６３／３０４／３２４／３８２、３／３０４、３／３０４／３２４、１６、６３、７７、８０、８７／２７０、８７／２７０／３６５、８７／３２８／３６５、９１、９２、１２６、１４０、１５６、１６８／２７０／３２８／３３８、１８１、１９４、２０１、２５６、２５９、２５９／２６３、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３２４、２５９／２６３／３０４／３２４／３８２、２５９／２６３／３０４／３７９、２５９／２６３／３０４／３８２、２５９／３０４、２５９／３０４／３２４、２５９／３０４／３２４／３３９、２５９／３０４／３２４／３３９／３８２、２５９／３０４／３８２、２６２、２６３／３０４、２６３／３０４／３２４、２６３／３０４／３２４／３３９、２６３／３０４／３２４／３８２、２６３／３２４、２７０、２７０／３１９、２７０／３２８／３３８、２７０／３２８／３３８／３６５、３０４、３０４／３２４、３２４、３２８、３５２、３６５、３６６、又は３８２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号４８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット３Ｍ／１９４Ｌ／３０４Ｒ、３Ｍ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ／３８２Ｓ、３Ｍ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、３Ｍ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、３Ｍ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、３Ｍ／３０４Ｒ、３Ｍ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、１６Ｑ、１６Ｖ、６３Ｃ、７７Ｌ、８０Ｇ、８０Ｋ、８７Ｒ／２７０Ｒ、８７Ｒ／２７０Ｒ／３６５Ｅ、８７Ｒ／３２８Ｎ／３６５Ｅ、９１Ａ、９１Ｑ、９２Ｋ、１２６Ａ、１２６Ｔ、１４０Ｖ、１５６Ａ、１５６Ｓ、１６８Ｋ／２７０Ｒ／３２８Ｎ／３３８Ｓ、１８１Ｋ、１８１Ｒ、１８１Ｖ、１９４Ｃ、１９４Ｌ、２０１Ｄ、２５６Ｗ、２５９Ｋ、２５９Ｋ／２６３Ｔ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３７９Ｄ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３８２Ｓ、２５９Ｋ／３０４Ｒ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ／３８２Ｓ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３８２Ｓ、２６２Ｄ、２６２Ｇ、２６２Ｈ、２６２Ｉ、２６２Ｓ、２６２Ｔ、２６３Ｔ／３０４Ｒ、２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、２６３Ｔ／３２４Ｓ、２７０Ｒ、２７０Ｒ／３１９Ａ、２７０Ｒ／３２８Ｎ／３３８Ｓ、２７０Ｒ／３２８Ｎ／３３８Ｓ／３６５Ｅ、３０４Ｒ、３０４Ｒ／３２４Ｓ、３２４Ｓ、３２８Ｎ、３５２Ａ、３６５Ｅ、３６６Ａ、３６６Ｌ、３６６Ｍ、３６６Ｑ、３６６Ｔ、３６６Ｖ、又は３８２Ｓを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号４８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＮ３Ｍ／Ｆ１９４Ｌ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ａ３８２Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｎ３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ、Ｒ１６Ｖ、Ａ６３Ｃ、Ｅ７７Ｌ、Ａ８０Ｇ、Ａ８０Ｋ、Ｈ８７Ｒ／Ｌ２７０Ｒ、Ｈ８７Ｒ／Ｌ２７０Ｒ／Ｑ３６５Ｅ、Ｈ８７Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｑ３６５Ｅ、Ｅ９１Ａ、Ｅ９１Ｑ、Ｅ９２Ｋ、Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ｔ、Ｍ１４０Ｖ、Ｇ１５６Ａ、Ｇ１５６Ｓ、Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｐ３３８Ｓ、Ｔ１８１Ｋ、Ｔ１８１Ｒ、Ｔ１８１Ｖ、Ｆ１９４Ｃ、Ｆ１９４Ｌ、Ｅ２０１Ｄ、Ｙ２５６Ｗ、Ｒ２５９Ｋ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｋ３７９Ｄ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２６２Ｄ、Ｒ２６２Ｇ、Ｒ２６２Ｈ、Ｒ２６２Ｉ、Ｒ２６２Ｓ、Ｒ２６２Ｔ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｓ２６３Ｔ／Ｍ３２４Ｓ、Ｌ２７０Ｒ、Ｌ２７０Ｒ／Ｉ３１９Ａ、Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｐ３３８Ｓ、Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｐ３３８Ｓ／Ｑ３６５Ｅ、Ａ３０４Ｒ、Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｍ３２４Ｓ、Ｃ３２８Ｎ、Ｄ３５２Ａ、Ｑ３６５Ｅ、Ｈ３６６Ａ、Ｈ３６６Ｌ、Ｈ３６６Ｍ、Ｈ３６６Ｑ、Ｈ３６６Ｔ、Ｈ３６６Ｖ、又はＡ３８２Ｓを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号４８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0252】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号５９４に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１６／６３／８０／１２６／１６８／３６６、１６／６３／８０／１２６／１８１／１９４／２５９／３２４／３２８／３６６、１６／６３／１２６／１６８／２７０／３２８／３６６、１６／８０／１２６／３２４／３６６、１６／８０／１２６／３６６、１６／８０／１６８、１６／８０／１６８／２７０／３６６、１６／８０／１６８／３２４、１６／８０／１６８／３６６、１６／８０／３２４、１６／９１／１２６／１６８／３２４／３６６、１６／１２６／１６８／３６６、１６／１６８／２５９／３６６、１６／１６８／２７０／３２４／３６６、１６／１６８／３２４／３２８／３６６、１６／１６８／３２４／３６６、１６／１６８／３６６、１６／２５９／２６３／３２８、１６／３２４／３２８／３６６、１６／３２８／３６６、８０／１２６／１６８／２７０／３６６、８０／１２６／１６８／３６６、８０／１２６／１８１／２７０／３２４／３６６、８０／１６８／２７０／３６６、又は１６８／３６６に、少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号５９４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット１６Ｑ／６３Ｃ／８０Ｋ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／６３Ｃ／８０Ｋ／１２６Ｔ／１８１Ｒ／１９４Ｃ／２５９Ｋ／３２４Ｓ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／６３Ｃ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１２６Ｔ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１２６Ｔ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ／３２４Ｓ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／３２４Ｓ、１６Ｑ／９１Ａ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／２５９Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／３２４Ｓ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３２８Ｎ、１６Ｑ／３２４Ｓ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１２６Ｔ／１８１Ｒ／２７０Ｒ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３６６Ｍ、又は１６８Ｋ／３６６Ｍを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号５９４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＲ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、
Ｒ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｔ１８１Ｒ／Ｆ１９４Ｃ／Ｒ２５９Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ／Ｅ９１Ａ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｒ２５９Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、
Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ｃ３２８Ｎ、Ｒ１６Ｑ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｔ１８１Ｒ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、又はＣ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号５９４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
Ｒ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｔ１８１Ｒ／Ｆ１９４Ｃ／Ｒ２５９Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ／Ｅ９１Ａ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｒ２５９Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、
Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ｃ３２８Ｎ、Ｒ１６Ｑ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｔ１８１Ｒ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、又はＣ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号５９４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0253】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号６８６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置は６６／７６／１１８／１４１／２０１／３００、６６／７６／１９８／２００／２９６／３０３、６６／７６／１９８／２００／３００、６６／１１８／２００／２９６／３０３／３１７、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／２００、７６／１１８／１４１／２００／２９６、７６／１４１／１９８／２００／２０１／３００、８０／２０１／２７０、８０／２７０、８０／２７０／３２４、８９／１１８／２００、１０６／２７０／３２４／３５２、１１８／１４１／２００、１２６、１２６／２０１／２７０／３２４、１２６／２７０、１４１／１４４／１９８／２００／３００、１５６／２７０、１５６／２７０／３２４、２０１／２７０、２０１／２７０／３５２、２７０、又は２７０／３２４において、少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット６６Ｎ／７６Ｖ／１１８Ｄ／１４１Ｐ／２０１Ｒ／３００Ｋ、６６Ｎ／７６Ｖ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２９６Ｅ／３０３Ｑ、６６Ｎ／７６Ｖ／１９８Ｇ／２００Ｓ／３００Ｋ、６６Ｎ／１１８Ｄ／２００Ｓ／２９６Ｅ／３０３Ｑ／３１７Ｑ、６６Ｎ／１１８Ｄ／２９６Ｅ、６６Ｎ／１１８Ｄ／２９６Ｅ／３００Ｋ、６６Ｎ／２００Ｓ、７６Ｖ／１１８Ｄ／１４１Ｐ／２００Ｓ／２９６Ｅ、７６Ｖ／１４１Ｐ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２０１Ｒ／３００Ｋ、８０Ｋ／２０１Ｄ／２７０Ｒ、８０Ｋ／２７０Ｒ、８０Ｋ／２７０Ｒ／３２４Ｓ、８９Ｐ／１１８Ｄ／２００Ｓ、１０６Ｍ／２７０Ｒ／３２４Ｓ／３５２Ａ、１１８Ｄ／１４１Ｐ／２００Ｓ、１２６Ｔ、１２６Ｔ／２０１Ｄ／２７０Ｒ／３２４Ｓ、１２６Ｔ／２７０Ｒ、１４１Ｐ／１４４Ｖ／１９８Ｇ／２００Ｓ／３００Ｋ、１５６Ａ／２７０Ｒ、１５６Ａ／２７０Ｒ／３２４Ｓ、２０１Ｄ／２７０Ｒ、２０１Ｄ／２７０Ｒ／３５２Ａ、２７０Ｒ、又は２７０Ｒ／３２４Ｓを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＳ６６Ｎ／Ｒ７６Ｖ／Ｔ１１８Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｅ２０１Ｒ／Ｒ３００Ｋ、Ｓ６６Ｎ／Ｒ７６Ｖ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｄ２９６Ｅ／Ａ３０３Ｑ、Ｓ６６Ｎ／Ｒ７６Ｖ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｒ３００Ｋ、Ｓ６６Ｎ／Ｔ１１８Ｄ／Ｈ２００Ｓ／Ｄ２９６Ｅ／Ａ３０３Ｑ／Ｋ３１７Ｑ、Ｓ６６Ｎ／Ｔ１１８Ｄ／Ｄ２９６Ｅ、Ｓ６６Ｎ／Ｔ１１８Ｄ／Ｄ２９６Ｅ／Ｒ３００Ｋ、Ｓ６６Ｎ／Ｈ２００Ｓ、Ｒ７６Ｖ／Ｔ１１８Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｈ２００Ｓ／Ｄ２９６Ｅ、Ｒ７６Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｅ２０１Ｒ／Ｒ３００Ｋ、Ａ８０Ｋ／Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ、Ａ８０Ｋ／Ｌ２７０Ｒ、Ａ８０Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ａ８９Ｐ／Ｔ１１８Ｄ／Ｈ２００Ｓ、Ｌ１０６Ｍ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｄ３５２Ａ、Ｔ１１８Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｈ２００Ｓ、Ｄ１２６Ｔ、Ｄ１２６Ｔ／Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｄ１２６Ｔ／Ｌ２７０Ｒ、Ｒ１４１Ｐ／Ｍ１４４Ｖ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｒ３００Ｋ、Ｇ１５６Ａ／Ｌ２７０Ｒ、Ｇ１５６Ａ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ、Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ／Ｄ３５２Ａ、Ｌ２７０Ｒ、又はＬ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0254】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号６８６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１９、１０９、１２３、１３４、１７０、１７３、１８７、２１１、又は３１２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット１９Ｉ、１０９Ｇ、１２３Ｆ、１２３Ｍ、１２３Ｖ、１３４Ａ、１３４Ｓ、１７０Ａ、１７３Ａ、１７３Ｉ、１７３Ｔ、１８７Ｌ、２１１Ｓ、又は３１２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＬ１９Ｉ、Ｌ１０９Ｇ、Ｙ１２３Ｆ、Ｙ１２３Ｍ、Ｙ１２３Ｖ、Ｎ１３４Ａ、Ｎ１３４Ｓ、Ｐ１７０Ａ、Ｆ１７３Ａ、Ｆ１７３Ｉ、Ｆ１７３Ｔ、Ｖ１８７Ｌ、Ａ２１１Ｓ、又はＴ３１２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0255】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号６８８に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２００／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２１１、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１７０／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１９８／２００／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１７０／１７３／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／２１１／２７０／３１２、１０９／１７０／２１１／２７０／３１２、又は１０９／２１１／２７０／３１２において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｆ／１７０Ａ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｆ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｖ／１４１Ｐ／１７０Ａ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｖ／１４１Ｐ／１７０Ａ／１９８Ｇ／２１１Ｓ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｖ／１４１Ｐ／１７０Ａ／１９８Ｇ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１７０Ａ／１７３Ｉ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１０９Ｇ／１７０Ａ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、又は１０９Ｇ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＬ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｆ／Ｐ１７０Ａ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｆ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ｐ１７０Ａ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ｐ１７０Ａ／Ａ１９８Ｇ／Ａ２１１Ｓ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ｐ１７０Ａ／Ａ１９８Ｇ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｐ１７０Ａ／Ｆ１７３Ｉ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１０９Ｇ／Ｐ１７０Ａ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、又はＬ１０９Ｇ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0256】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号７６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置５／４１、５／４１／２２８、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１２６、２６５、２６７、２７０、３３１、３５３、３５７、又は３８４において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット５Ｖ／４１Ｄ、５Ｖ／４１Ｄ／２２８Ｄ、３３Ｌ、４１Ｄ、４７Ｆ、５１Ｅ、５１Ｑ、５５Ｉ、６４Ｎ、１２６Ａ、１２６Ｔ、２６５Ｐ、２６７Ｌ、２７０Ａ、２７０Ｔ、３３１Ｖ、３５３Ｅ、３５３Ｉ、３５３Ｌ、３５７Ｓ、又は３８４Ｗを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＫ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｔ２２８Ｄ、Ｆ３３Ｌ、Ｈ４１Ｄ、Ｌ４７Ｆ、Ｌ５１Ｅ、Ｌ５１Ｑ、Ｖ５５Ｉ、Ｓ６４Ｎ、Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ｔ、Ｅ２６５Ｐ、Ｉ２６７Ｌ、Ｒ２７０Ａ、Ｒ２７０Ｔ、Ｔ３３１Ｖ、Ｄ３５３Ｅ、Ｄ３５３Ｉ、Ｄ３５３Ｌ、Ｃ３５７Ｓ、又はＰ３８４Ｗを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0257】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号７６６に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置６６、６６／１１８、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／１１８／３００、６６／２９６、６６／２９６／３００、６６／３００、１１８、１１８／２９６、１１８／２９６／３００、１１８／３００、２９６、２９６／３００、又は３００において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット６６Ｓ、６６Ｓ／１１８Ｔ、６６Ｓ／１１８Ｔ／２９６Ｄ、６６Ｓ／１１８Ｔ／２９６Ｄ／３００Ｒ、６６Ｓ／１１８Ｔ／３００Ｒ、６６Ｓ／２９６Ｄ、６６Ｓ／２９６Ｄ／３００Ｒ、６６Ｓ／３００Ｒ、１１８Ｔ、１１８Ｔ／２９６Ｄ、１１８Ｔ／２９６Ｄ／３００Ｒ、１１８Ｔ／３００Ｒ、２９６Ｄ、２９６Ｄ／３００Ｒ、又は３００Ｒを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＮ６６Ｓ、Ｎ６６Ｓ／Ｄ１１８Ｔ、Ｎ６６Ｓ／Ｄ１１８Ｔ／Ｅ２９６Ｄ、Ｎ６６Ｓ／Ｄ１１８Ｔ／Ｅ２９６Ｄ／Ｋ３００Ｒ、Ｎ６６Ｓ／Ｄ１１８Ｔ／Ｋ３００Ｒ、Ｎ６６Ｓ／Ｅ２９６Ｄ、Ｎ６６Ｓ／Ｅ２９６Ｄ／Ｋ３００Ｒ、Ｎ６６Ｓ／Ｋ３００Ｒ、Ｄ１１８Ｔ、Ｄ１１８Ｔ／Ｅ２９６Ｄ、Ｄ１１８Ｔ／Ｅ２９６Ｄ／Ｋ３００Ｒ、Ｄ１１８Ｔ／Ｋ３００Ｒ、Ｅ２９６Ｄ、Ｅ２９６Ｄ／Ｋ３００Ｒ、又はＫ３００Ｒを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0258】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、アミノ酸位置５、１４、１４／３４／３８／３９／１０２／２６７／２７５／３５０／３５７、１４／３９／１０２／１２７／２４５／２６７／２７５／３４９／３５０、３４／３８／３９／１０２／１２７／２７５／３５７、３４／３８／３９／１０２／２７５／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３４９／３５０／３５７、３４／３８／３９／１２７／２４５／３５０／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３４／３９／１０２／１２７／２７５／３４９／３５７、３４／３９／１０２／２６４／２７５／３５０／３５７、３４／３９／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６４／２６７／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／２６７／２７５／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３４９／３５０／３５７、３８／３９／１０２／１２７／３５０、３８／３９／１０２／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／２４５／２６７／３５７、３８／３９／１２７／２６４／２７５、３８／３９／１２７／２６４／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５０／３５７、３８／３９／１２７／３５７、３８／３９／２４５／２７５／３５７、３８／３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３８／３９／２６４／２７５／３５７、３８／３９／２７５、３８／３９／２７５／３５０、３９、３９／１０２／１２７／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６４／２７５／３５７、３９／１０２／２６７／２７５／３５７、３９／１２７／２４５／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／１２７／２４５／２６４／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２４５／３５７、３９／１２７／２６７／２７５／３５０／３５７、３９／１２７／２６７／３５０／３５７、３９／１２７／３５７、３９／２４５／２６４／２６７／２７５／３５７、３９／２６４／２６７／２７５／３５０、３９／２７５／３５０／３５７、４８、１３９、１６４、１９６、２５５、２９９、３１８、３２４、３３９、３４３、３５０、３５３、３５７、３６４、３６５、３７９、３８１、３８６、３８９、３９１、３９３、３９４、３９５、３９７、３９８、又は４０５において、少なくとも置換又は置換セットを有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット５Ｍ、１４Ｉ、１４Ｔ／３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、１４Ｔ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／１０２Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３４Ｌ／３９Ｎ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／３４９Ｔ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／３５０Ｅ、３８Ｖ／３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６７Ｉ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／１２７Ｓ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／２４５Ｍ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３８Ｖ／３９Ｎ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３８Ｖ／３９Ｎ／２７５Ｓ、３８Ｖ／３９Ｎ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３９Ｎ／１０２Ｓ／１２７Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１０２Ｓ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１０２Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／２６４Ｖ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２４５Ｍ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／２６７Ｉ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｎ／１２７Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／２４５Ｍ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５７Ｖ、３９Ｎ／２６４Ｖ／２６７Ｉ／２７５Ｓ／３５０Ｅ、３９Ｎ／２７５Ｓ／３５０Ｅ／３５７Ｖ、３９Ｓ、４８Ｆ、１３９Ｇ、１６４Ａ、１６４Ｃ、１９６Ｄ、１９６Ｒ、２５５Ｇ、２５５Ｎ、２５５Ｐ、２９９Ａ、２９９Ｖ、３１８Ｋ、３２４Ｍ、３２４Ｓ、３２４Ｔ、３３９Ａ、３３９Ｄ、３４３Ａ、３４３Ｅ、３５０Ｓ、３５３Ｄ、３５３Ｅ、３５３Ｌ、３５３Ｎ、３５３Ｓ、３５３Ｗ、３５７Ｃ、３５７Ｍ、３６４Ｋ、３６４Ｒ、３６５Ｅ、３７９Ｄ、３７９Ｐ、３８１Ｄ、３８１Ｅ、３８６＊、３８９Ｅ、３８９Ｇ、３８９Ｐ、３８９Ｑ、３９１＊、３９１Ｅ、３９３Ｔ、３９４Ｅ、３９５Ａ、３９５Ｄ、３９５Ｇ、３９５Ｋ、３９５Ｓ、３９７Ａ、３９８＊、４０５Ｄ、４０５Ｅ、４０５Ｈ、又は４０５Ｌを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＫ５Ｍ、Ｈ１４Ｉ、Ｈ１４Ｔ／Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｈ１４Ｔ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｉ３４Ｌ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ３４９Ｔ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｖ２６７Ｉ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｉ２４５Ｍ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ、Ｃ３８Ｖ／Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１０２Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ２６４Ｖ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｖ２６７Ｉ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ１２７Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｉ２４５Ｍ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｎ／Ｉ２６４Ｖ／Ｖ２６７Ｉ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ、Ｔ３９Ｎ／Ｔ２７５Ｓ／Ｎ３５０Ｅ／Ｉ３５７Ｖ、Ｔ３９Ｓ、Ｌ４８Ｆ、Ｎ１３９Ｇ、Ｉ１６４Ａ、Ｉ１６４Ｃ、Ｋ１９６Ｄ、Ｋ１９６Ｒ、Ｈ２５５Ｇ、Ｈ２５５Ｎ、Ｈ２５５Ｐ、Ｋ２９９Ａ、Ｋ２９９Ｖ、Ｒ３１８Ｋ、Ｒ３２４Ｍ、Ｒ３２４Ｓ、Ｒ３２４Ｔ、Ｑ３３９Ａ、Ｑ３３９Ｄ、Ｈ３４３Ａ、Ｈ３４３Ｅ、Ｎ３５０Ｓ、Ｒ３５３Ｄ、Ｒ３５３Ｅ、Ｒ３５３Ｌ、Ｒ３５３Ｎ、Ｒ３５３Ｓ、Ｒ３５３Ｗ、Ｉ３５７Ｃ、Ｉ３５７Ｍ、Ｌ３６４Ｋ、Ｌ３６４Ｒ、Ｑ３６５Ｅ、Ｋ３７９Ｄ、Ｋ３７９Ｐ、Ａ３８１Ｄ、Ａ３８１Ｅ、Ｄ３８６＊、Ｋ３８９Ｅ、Ｋ３８９Ｇ、Ｋ３８９Ｐ、Ｋ３８９Ｑ、Ａ３９１＊、Ａ３９１Ｅ、Ｋ３９３Ｔ、Ｋ３９４Ｅ、Ｒ３９５Ａ、Ｒ３９５Ｄ、Ｒ３９５Ｇ、Ｒ３９５Ｋ、Ｒ３９５Ｓ、Ｔ３９７Ａ、Ｐ３９８＊、Ｔ４０５Ｄ、Ｔ４０５Ｅ、Ｔ４０５Ｈ、又はＴ４０５Ｌを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号１２に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0259】
いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置４８／６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、４８／６４／１６４／３２４／３４３／３６４、４８／６４／１６４／３５３／３５７／３６４、４８／６４／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、６４／１６４／３２４／３４３／３５７／３６４、６４／１６４／３５３／３５７、６４／３１８／３２４／３５７／３６４、６４／３２４／３５３／３５７／３６４、１３２／２５５／３３９／３７９／３９５、１６４／１９６／３２４／３５７／３６４、１６４／３１８／３２４／３４３／３５３／３５７、１６４／３１８／３２４／３５７／３６４、１６４／３２４／３４３／３５３／３５７／３６４、１６４／３２４／３５７／３６４、１６４／３５３／３５７／３６４、１６４／３６４、１９６／３１８／３２４／３５３／３５７／３６４、３１８／３４３／３５７、３２４／３４３／３５７／３６４、３２４／３５３／３５７／３６４、３２４／３５７／３６４、３３９／３７９／３８９／３９４／３９５、３３９／３８９／３９５、３３９／３９１、３３９／３９４／３９５／４０５、３５７／３６４、３７９／３８６、３７９／３９４／３９５／３９７／４０４／４０５、３７９／３９４／３９５／３９７／４０５、３８９／３９４／３９５／３９７／４０５、又は３９４／３９７において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号３８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット４８Ｆ／６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、４８Ｆ／６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３６４Ｒ、４８Ｆ／６４Ｅ／１６４Ｃ／３５３Ｎ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、４８Ｆ／６４Ｅ／３５７Ｍ／３６４Ｋ、６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｋ、６４Ｅ／１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、６４Ｅ／１６４Ｃ／３５３Ｄ／３５７Ｖ、６４Ｅ／３１８Ｋ／３２４Ｓ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、６４Ｅ／３２４Ｍ／３５３Ｎ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１３２Ｆ／２５５Ｐ／３３９Ａ／３７９Ｄ／３９５Ｄ、１６４Ａ／１９６Ｄ／３２４Ｍ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、１６４Ａ／３１８Ｋ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、１６４Ａ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｄ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１６４Ａ／３２４Ｍ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、１６４Ａ／３５３Ｗ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１６４Ａ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３１８Ｋ／３２４Ｓ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｋ、１６４Ｃ／３５３Ｄ／３５７Ｖ／３６４Ｒ、１６４Ｃ／３５３Ｗ／３５７Ｃ／３６４Ｒ、１９６Ｄ／３１８Ｋ／３２４Ｍ／３５３Ｎ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、３１８Ｋ／３４３Ｅ／３５７Ｃ、３１８Ｋ／３４３Ｅ／３５７Ｍ、３２４Ｍ／３４３Ｅ／３５７Ｖ／３６４Ｋ、３２４Ｍ／３５７Ｍ／３６４Ｒ、３２４Ｎ／３５３Ｗ／３５７Ｃ／３６４Ｋ、３３９Ａ／３７９Ｄ／３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ、３３９Ａ／３８９Ｇ／３９５Ｋ、３３９Ａ／３９１＊、３３９Ａ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／４０５Ｄ、３５７Ｖ／３６４Ｒ、３７９Ｄ／３８６＊、３７９Ｄ／３９４Ｅ／３９５Ｄ／３９７Ａ／４０４Ｉ／４０５Ｈ、３７９Ｄ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ／４０５Ｄ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ／３９７Ａ／４０５Ｄ、又は３９４Ｅ／３９７Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号３８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＬ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｌ３６４Ｒ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｎ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｉ３５７Ｍ／Ｌ３６４Ｋ、Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｋ、Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ａ６４Ｅ／Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ、Ａ６４Ｅ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｓ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ａ６４Ｅ／Ｒ３２４Ｍ／Ｒ３５３Ｎ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｙ１３２Ｆ／Ｈ２５５Ｐ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３７９Ｄ／Ｒ３９５Ｄ、Ｉ１６４Ａ／Ｋ１９６Ｄ／Ｒ３２４Ｍ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３２４Ｍ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｉ１６４Ａ／Ｒ３５３Ｗ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ａ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｓ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｋ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｄ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｉ１６４Ｃ／Ｒ３５３Ｗ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｒ、Ｋ１９６Ｄ／Ｒ３１８Ｋ／Ｒ３２４Ｍ／Ｒ３５３Ｎ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｒ３１８Ｋ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｃ、Ｒ３１８Ｋ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｍ、Ｒ３２４Ｍ／Ｈ３４３Ｅ／Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｋ、Ｒ３２４Ｍ／Ｉ３５７Ｍ／Ｌ３６４Ｒ、Ｒ３２４Ｎ／Ｒ３５３Ｗ／Ｉ３５７Ｃ／Ｌ３６４Ｋ、Ｑ３３９Ａ／Ｋ３７９Ｄ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｒ３９５Ｋ、Ｑ３３９Ａ／Ａ３９１＊、Ｑ３３９Ａ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ４０５Ｄ、Ｉ３５７Ｖ／Ｌ３６４Ｒ、Ｋ３７９Ｄ／Ｄ３８６＊、Ｋ３７９Ｄ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ／Ｒ４０４Ｉ／Ｔ４０５Ｈ、Ｋ３７９Ｄ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ／Ｔ４０５Ｄ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ／Ｔ４０５Ｄ、又はＫ３９４Ｅ／Ｔ３９７Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号３８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0260】
いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置２、３、３３、４８／６４／２５５、４８／２５５／３３９、４８／２５５／３７９、６４、６４／２５５、６９、１６１、１９３、２５５、２５５／３１８／３７９、２５９、２６３、３１８／３３９／３７９、３２４、３２４／３８９／３９４、３２４／３８９／３９４／３９５、３２４／３８９／３９４／３９７、３２４／３９４、３２４／３９４／３９５、３２４／３９４／３９５／３９７、３２４／３９５、３３９、３４０、３８０、３８２、３８９、３８９／３９４、３８９／３９４／３９５、３８９／３９４／３９５／３９７、３８９／３９４／３９７、３８９／３９５、３８９／３９７、３９０、３９４、３９４／３９５、３９４／３９５／３９７、３９５、３９５／３９７、３９７、４０１、又は４０５において、少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２３４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット２Ｅ、３Ｍ、３３Ｌ、４８Ｆ／６４Ｅ／２５５Ｐ、４８Ｆ／２５５Ｐ／３３９Ａ、４８Ｆ／２５５Ｐ／３７９Ｄ、６４Ｅ、６４Ｅ／２５５Ｐ、６４Ｓ、６９Ｉ、１６１Ｖ、１９３Ｉ、２５５Ｐ、２５５Ｐ／３１８Ｋ／３７９Ｄ、２５９Ｌ、２６３Ｔ、２６３Ｖ、３１８Ｋ／３３９Ａ／３７９Ｄ、３２４Ｎ、３２４Ｎ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３２４Ｎ／３９５Ｄ、３２４Ｓ／３８９Ｇ／３９４Ｅ、３２４Ｓ／３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ、３２４Ｓ／３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９７Ａ、３２４Ｓ／３９４Ｅ、３２４Ｓ／３９４Ｅ／３９５Ｋ、３２４Ｓ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３２４Ｓ／３９５Ｋ、３３９Ａ、３４０Ｔ、３４０Ｖ、３８０Ｅ、３８２Ｓ、３８９Ｇ、３８９Ｇ／３９４Ｅ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｄ／３９７Ａ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｋ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３８９Ｇ／３９４Ｅ／３９７Ａ、３８９Ｇ／３９５Ｄ、３８９Ｇ／３９５Ｋ、３８９Ｇ／３９７Ａ、３９０＊、３９０Ａ、３９０Ｅ、３９０Ｓ、３９４Ｅ、３９４Ｅ／３９５Ｄ、３９４Ｅ／３９５Ｋ／３９７Ａ、３９５Ｄ／３９７Ａ、３９５Ｋ、３９７Ａ、４０１＊、４０１Ｙ、又は４０５Ｈを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２３４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＧ２Ｅ、Ｎ３Ｍ、Ｆ３３Ｌ、Ｌ４８Ｆ／Ａ６４Ｅ／Ｈ２５５Ｐ、Ｌ４８Ｆ／Ｈ２５５Ｐ／Ｑ３３９Ａ、Ｌ４８Ｆ／Ｈ２５５Ｐ／Ｋ３７９Ｄ、Ａ６４Ｅ、Ａ６４Ｅ／Ｈ２５５Ｐ、Ａ６４Ｓ、Ｖ６９Ｉ、Ｔ１６１Ｖ、Ｍ１９３Ｉ、Ｈ２５５Ｐ、Ｈ２５５Ｐ／Ｒ３１８Ｋ／Ｋ３７９Ｄ、Ｒ２５９Ｌ、Ｓ２６３Ｔ、Ｓ２６３Ｖ、Ｒ３１８Ｋ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３７９Ｄ、Ｍ３２４Ｎ、Ｍ３２４Ｎ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｍ３２４Ｎ／Ｒ３９５Ｄ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｔ３９７Ａ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３９４Ｅ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ、Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｍ３２４Ｓ／Ｒ３９５Ｋ、Ｑ３３９Ａ、Ｓ３４０Ｔ、Ｓ３４０Ｖ、Ａ３８０Ｅ、Ａ３８２Ｓ、Ｋ３８９Ｇ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｋ３８９Ｇ／Ｋ３９４Ｅ／Ｔ３９７Ａ、Ｋ３８９Ｇ／Ｒ３９５Ｄ、Ｋ３８９Ｇ／Ｒ３９５Ｋ、Ｋ３８９Ｇ／Ｔ３９７Ａ、Ｐ３９０＊、Ｐ３９０Ａ、Ｐ３９０Ｅ、Ｐ３９０Ｓ、Ｋ３９４Ｅ、Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｄ、Ｋ３９４Ｅ／Ｒ３９５Ｋ／Ｔ３９７Ａ、Ｒ３９５Ｄ／Ｔ３９７Ａ、Ｒ３９５Ｋ、Ｔ３９７Ａ、Ａ４０１＊、Ａ４０１Ｙ、又はＴ４０５Ｈを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２３４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0261】
いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置２／６４／６９／３２４／３８０／３８２／３８８／３８９、３／６４／６９／２６３／３３９／３８０／３８８、３／６４／６９／３８９、３／６４／６９／３９０、３／６４／３７９／３８０／３９０、３／６９／２６３／３８０、３／６９／３２４、３／６９／３２４／３８０／３８２／３８９／３９０、１２／１３５／２５９／２６３、１２／１３５／２６３／３８２、１２／２５９／２６３／３０４、４８／６４／２５５、６４／６９、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４、６４／６９／１８９／２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、６４／６９／２２３／３８８、６４／６９／２２３／３８８／３８９／３９０、６４／６９／３０４／３７９／３８２、６４／６９／３２４、６４／６９／３２４／３３９／３８０／３８９／３９０、６４／６９／３３９、６４／６９／３３９／３８２／３８８／３８９、６４／６９／３３９／３８９／３９０、６４／６９／３７９／３８０、６４／６９／３８０／３８８／３９０、６４／６９／３８９、６４／６９／３９０、６４／２５５／２６３、６４／２６３、６４／３２４／３３９／３８９／３９０、６９／２２３／２６３／３２４／３８２／３８８／３９０、６９／２２３／３２４／３７９／３８０／３８２／３８８／３９０、６９／２６３、６９／２６３／３２４、６９／２６３／３３９、６９／２６３／３８８、６９／２６３／３８９／３９０、６９／３２４／３７９／３８０／３８８、６９／３２４／３８０、６９／３３９／３９０、６９／３８２／３９０、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３３９／３４０／３７９、２６３／３３９／３８９／３９０、２６３／３９０、又は３０４／３４０／３７９／３８０／３８２において、少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット２Ｅ／６４Ｓ／６９Ｉ／３２４Ｓ／３８０Ｅ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３８９Ｇ、３Ｍ／６４Ｓ／６９Ｉ／２６３Ｔ／３３９Ａ／３８０Ｅ／３８８Ａ、３Ｍ／６４Ｓ／６９Ｉ／３８９Ｇ、３Ｍ／６４Ｓ／６９Ｉ／３９０＊、３Ｍ／６４Ｓ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３９０＊、３Ｍ／６９Ｉ／２６３Ｔ／３８０Ｅ、３Ｍ／６９Ｉ／３２４Ｓ、３Ｍ／６９Ｉ／３２４Ｓ／３８０Ｅ／３８２Ｓ／３８９Ｇ／３９０＊、１２Ｇ／１３５Ｖ／２５９Ｋ／２６３Ｔ、１２Ｇ／１３５Ｖ／２６３Ｔ／３８２Ｇ、１２Ｇ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、４８Ｌ／６４Ａ／２５５Ｈ、６４Ａ／２５５Ｈ／２６３Ｔ、６４Ｓ／６９Ｉ、６４Ｓ／６９Ｉ／１８９Ａ／２５９Ｑ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３３９Ａ／３４０Ｔ／３７９Ｎ、６４Ｓ／６９Ｉ／１８９Ｄ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、６４Ｓ／６９Ｉ／２２３Ｍ／３８８Ａ、６４Ｓ／６９Ｉ／２２３Ｍ／３８８Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３０４Ｒ／３７９Ｅ／３８２Ｇ、６４Ｓ／６９Ｉ／３２４Ｓ、６４Ｓ／６９Ｉ／３２４Ｓ／３３９Ａ／３８０Ｅ／３８９Ｇ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３３９Ａ、６４Ｓ／６９Ｉ／３３９Ａ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３８９Ｇ、６４Ｓ／６９Ｉ／３３９Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３７９Ｄ／３８０Ｅ、６４Ｓ／６９Ｉ／３８０Ｅ／３８８Ａ／３９０＊、６４Ｓ／６９Ｉ／３８９Ｇ、６４Ｓ／６９Ｉ／３９０＊、６４Ｓ／２６３Ｔ、６４Ｓ／３２４Ｓ／３３９Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、６９Ｉ／２２３Ｍ／２６３Ｔ／３２４Ｓ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３９０＊、６９Ｉ／２２３Ｍ／３２４Ｓ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３８２Ｓ／３８８Ａ／３９０＊、６９Ｉ／２６３Ｔ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３２４Ｓ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３３９Ａ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３８８Ａ、６９Ｉ／２６３Ｔ／３８９Ｇ／３９０＊、６９Ｉ／３２４Ｓ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３８８Ａ、６９Ｉ／３２４Ｓ／３８０Ｅ、６９Ｉ／３３９Ａ／３９０＊、６９Ｉ／３８２Ｓ／３９０＊、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３３９Ａ／３４０Ｔ／３７９Ｎ、２６３Ｔ／３３９Ａ／３８９Ｇ／３９０＊、２６３Ｔ／３９０＊、又は３０４Ｒ／３４０Ｔ／３７９Ｄ／３８０Ｅ／３８２Ｇを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＧ２Ｅ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｋ３８９Ｇ、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８０Ｅ／Ｑ３８８Ａ、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｋ３８９Ｇ、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｐ３９０＊、Ｎ３Ｍ／Ｅ６４Ｓ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ｐ３９０＊、Ｎ３Ｍ／Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３８０Ｅ、Ｎ３Ｍ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｓ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｓ１２Ｇ／Ｌ１３５Ｖ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ、Ｓ１２Ｇ／Ｌ１３５Ｖ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３８２Ｇ、Ｓ１２Ｇ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｆ４８Ｌ／Ｅ６４Ａ／Ｐ２５５Ｈ、Ｅ６４Ａ／Ｐ２５５Ｈ／Ｓ２６３Ｔ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｔ１８９Ａ／Ｒ２５９Ｑ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｑ３３９Ａ／Ｓ３４０Ｔ／Ｋ３７９Ｎ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｔ１８９Ｄ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｑ３８８Ａ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｑ３８８Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ３０４Ｒ／Ｋ３７９Ｅ／Ａ３８２Ｇ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８０Ｅ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｋ３８９Ｇ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ａ３８０Ｅ／Ｑ３８８Ａ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｋ３８９Ｇ、Ｅ６４Ｓ／Ｖ６９Ｉ／Ｐ３９０＊、Ｅ６４Ｓ／Ｓ２６３Ｔ、Ｅ６４Ｓ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ａ２２３Ｍ／Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｓ／Ｑ３８８Ａ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｍ３２４Ｓ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３３９Ａ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３８８Ａ、Ｖ６９Ｉ／Ｓ２６３Ｔ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ｑ３８８Ａ、Ｖ６９Ｉ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８０Ｅ、Ｖ６９Ｉ／Ｑ３３９Ａ／Ｐ３９０＊、Ｖ６９Ｉ／Ａ３８２Ｓ／Ｐ３９０＊、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｑ３３９Ａ／Ｓ３４０Ｔ／Ｋ３７９Ｎ、Ｓ２６３Ｔ／Ｑ３３９Ａ／Ｋ３８９Ｇ／Ｐ３９０＊、Ｓ２６３Ｔ／Ｐ３９０＊、又はＡ３０４Ｒ／Ｓ３４０Ｔ／Ｋ３７９Ｄ／Ａ３８０Ｅ／Ａ３８２Ｇを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号２８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0262】
いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置３／１９４／３０４、３／２５９／２６３／３０４、３／２５９／３０４、３／２５９／３０４／３２４／３３９、３／２５９／３０４／３２４／３８２、３／２５９／３０４／３８２、３／２６３／３０４／３２４、３／２６３／３０４／３２４／３３９、３／２６３／３０４／３２４／３８２、３／３０４、３／３０４／３２４、１６、６３、７７、８０、８７／２７０、８７／２７０／３６５、８７／３２８／３６５、９１、９２、１２６、１４０、１５６、１６８／２７０／３２８／３３８、１８１、１９４、２０１、２５６、２５９、２５９／２６３、２５９／２６３／３０４、２５９／２６３／３０４／３２４、２５９／２６３／３０４／３２４／３８２、２５９／２６３／３０４／３７９、２５９／２６３／３０４／３８２、２５９／３０４、２５９／３０４／３２４、２５９／３０４／３２４／３３９、２５９／３０４／３２４／３３９／３８２、２５９／３０４／３８２、２６２、２６３／３０４、２６３／３０４／３２４、２６３／３０４／３２４／３３９、２６３／３０４／３２４／３８２、２６３／３２４、２７０、２７０／３１９、２７０／３２８／３３８、２７０／３２８／３３８／３６５、３０４、３０４／３２４、３２４、３２８、３５２、３６５、３６６、又は３８２において、少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号４８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット３Ｍ／１９４Ｌ／３０４Ｒ、３Ｍ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、３Ｍ／２５９Ｋ／３０４Ｒ／３８２Ｓ、３Ｍ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、３Ｍ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、３Ｍ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、３Ｍ／３０４Ｒ、３Ｍ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、１６Ｑ、１６Ｖ、６３Ｃ、７７Ｌ、８０Ｇ、８０Ｋ、８７Ｒ／２７０Ｒ、８７Ｒ／２７０Ｒ／３６５Ｅ、８７Ｒ／３２８Ｎ／３６５Ｅ、９１Ａ、９１Ｑ、９２Ｋ、１２６Ａ、１２６Ｔ、１４０Ｖ、１５６Ａ、１５６Ｓ、１６８Ｋ／２７０Ｒ／３２８Ｎ／３３８Ｓ、１８１Ｋ、１８１Ｒ、１８１Ｖ、１９４Ｃ、１９４Ｌ、２０１Ｄ、２５６Ｗ、２５９Ｋ、２５９Ｋ／２６３Ｔ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３７９Ｄ、２５９Ｋ／２６３Ｔ／３０４Ｒ／３８２Ｓ、２５９Ｋ／３０４Ｒ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ／３８２Ｓ、２５９Ｋ／３０４Ｒ／３８２Ｓ、２６２Ｄ、２６２Ｇ、２６２Ｈ、２６２Ｉ、２６２Ｓ、２６２Ｔ、２６３Ｔ／３０４Ｒ、２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ、２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３３９Ａ、２６３Ｔ／３０４Ｒ／３２４Ｓ／３８２Ｓ、２６３Ｔ／３２４Ｓ、２７０Ｒ、２７０Ｒ／３１９Ａ、２７０Ｒ／３２８Ｎ／３３８Ｓ、２７０Ｒ／３２８Ｎ／３３８Ｓ／３６５Ｅ、３０４Ｒ、３０４Ｒ／３２４Ｓ、３２４Ｓ、３２８Ｎ、３５２Ａ、３６５Ｅ、３６６Ａ、３６６Ｌ、３６６Ｍ、３６６Ｑ、３６６Ｔ、３６６Ｖ、又は３８２Ｓを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号４８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＮ３Ｍ／Ｆ１９４Ｌ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ａ３８２Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｎ３Ｍ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｎ３Ｍ／Ａ３０４Ｒ、Ｎ３Ｍ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ、Ｒ１６Ｖ、Ａ６３Ｃ、Ｅ７７Ｌ、Ａ８０Ｇ、Ａ８０Ｋ、Ｈ８７Ｒ／Ｌ２７０Ｒ、Ｈ８７Ｒ／Ｌ２７０Ｒ／Ｑ３６５Ｅ、Ｈ８７Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｑ３６５Ｅ、Ｅ９１Ａ、Ｅ９１Ｑ、Ｅ９２Ｋ、Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ｔ、Ｍ１４０Ｖ、Ｇ１５６Ａ、Ｇ１５６Ｓ、Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｐ３３８Ｓ、Ｔ１８１Ｋ、Ｔ１８１Ｒ、Ｔ１８１Ｖ、Ｆ１９４Ｃ、Ｆ１９４Ｌ、Ｅ２０１Ｄ、Ｙ２５６Ｗ、Ｒ２５９Ｋ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｋ３７９Ｄ、Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２５９Ｋ／Ａ３０４Ｒ／Ａ３８２Ｓ、Ｒ２６２Ｄ、Ｒ２６２Ｇ、Ｒ２６２Ｈ、Ｒ２６２Ｉ、Ｒ２６２Ｓ、Ｒ２６２Ｔ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｑ３３９Ａ、Ｓ２６３Ｔ／Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ａ３８２Ｓ、Ｓ２６３Ｔ／Ｍ３２４Ｓ、Ｌ２７０Ｒ、Ｌ２７０Ｒ／Ｉ３１９Ａ、Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｐ３３８Ｓ、Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｐ３３８Ｓ／Ｑ３６５Ｅ、Ａ３０４Ｒ、Ａ３０４Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｍ３２４Ｓ、Ｃ３２８Ｎ、Ｄ３５２Ａ、Ｑ３６５Ｅ、Ｈ３６６Ａ、Ｈ３６６Ｌ、Ｈ３６６Ｍ、Ｈ３６６Ｑ、Ｈ３６６Ｔ、Ｈ３６６Ｖ、又はＡ３８２Ｓを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号４８４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0263】
いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１６／６３／８０／１２６／１６８／３６６、１６／６３／８０／１２６／１８１／１９４／２５９／３２４／３２８／３６６、１６／６３／１２６／１６８／２７０／３２８／３６６、１６／８０／１２６／３２４／３６６、１６／８０／１２６／３６６、１６／８０／１６８、１６／８０／１６８／２７０／３６６、１６／８０／１６８／３２４、１６／８０／１６８／３６６、１６／８０／３２４、１６／９１／１２６／１６８／３２４／３６６、１６／１２６／１６８／３６６、１６／１６８／２５９／３６６、１６／１６８／２７０／３２４／３６６、１６／１６８／３２４／３２８／３６６、１６／１６８／３２４／３６６、１６／１６８／３６６、１６／２５９／２６３／３２８、１６／３２４／３２８／３６６、１６／３２８／３６６、８０／１２６／１６８／２７０／３６６、８０／１２６／１６８／３６６、８０／１２６／１８１／２７０／３２４／３６６、８０／１６８／２７０／３６６、又は１６８／３６６において、少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号５９４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット１６Ｑ／６３Ｃ／８０Ｋ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／６３Ｃ／８０Ｋ／１２６Ｔ／１８１Ｒ／１９４Ｃ／２５９Ｋ／３２４Ｓ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／６３Ｃ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１２６Ｔ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１２６Ｔ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ／３２４Ｓ、１６Ｑ／８０Ｋ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／８０Ｋ／３２４Ｓ、１６Ｑ／９１Ａ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／２５９Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／３２４Ｓ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、１６Ｑ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、１６Ｑ／２５９Ｋ／２６３Ｔ／３２８Ｎ、１６Ｑ／３２４Ｓ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、１６Ｑ／３２８Ｎ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１２６Ｔ／１６８Ｋ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１２６Ｔ／１８１Ｒ／２７０Ｒ／３２４Ｓ／３６６Ｍ、８０Ｋ／１６８Ｋ／２７０Ｒ／３６６Ｍ、又は１６８Ｋ／３６６Ｍを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号５９４に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＲ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｔ１８１Ｒ／Ｆ１９４Ｃ／Ｒ２５９Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ６３Ｃ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ａ８０Ｋ／Ｍ３２４Ｓ、Ｒ１６Ｑ／Ｅ９１Ａ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｒ２５９Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｒ２５９Ｋ／Ｓ２６３Ｔ／Ｃ３２８Ｎ、Ｒ１６Ｑ／Ｍ３２４Ｓ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ｒ１６Ｑ／Ｃ３２８Ｎ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｃ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｄ１２６Ｔ／Ｔ１８１Ｒ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｈ３６６Ｍ、Ａ８０Ｋ／Ｃ１６８Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｈ３６６Ｍ、又はＣ１６８Ｋ／Ｈ３６６Ｍを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号５９４に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0264】
いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置６６／７６／１１８／１４１／２０１／３００、６６／７６／１９８／２００／２９６／３０３、６６／７６／１９８／２００／３００、６６／１１８／２００／２９６／３０３／３１７、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／２００、７６／１１８／１４１／２００／２９６、７６／１４１／１９８／２００／２０１／３００、８０／２０１／２７０、８０／２７０、８０／２７０／３２４、８９／１１８／２００、１０６／２７０／３２４／３５２、１１８／１４１／２００、１２６、１２６／２０１／２７０／３２４、１２６／２７０、１４１／１４４／１９８／２００／３００、１５６／２７０、１５６／２７０／３２４、２０１／２７０、２０１／２７０／３５２、２７０、又は２７０／３２４において、少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット６６Ｎ／７６Ｖ／１１８Ｄ／１４１Ｐ／２０１Ｒ／３００Ｋ、６６Ｎ／７６Ｖ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２９６Ｅ／３０３Ｑ、６６Ｎ／７６Ｖ／１９８Ｇ／２００Ｓ／３００Ｋ、６６Ｎ／１１８Ｄ／２００Ｓ／２９６Ｅ／３０３Ｑ／３１７Ｑ、６６Ｎ／１１８Ｄ／２９６Ｅ、６６Ｎ／１１８Ｄ／２９６Ｅ／３００Ｋ、６６Ｎ／２００Ｓ、７６Ｖ／１１８Ｄ／１４１Ｐ／２００Ｓ／２９６Ｅ、７６Ｖ／１４１Ｐ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２０１Ｒ／３００Ｋ、８０Ｋ／２０１Ｄ／２７０Ｒ、８０Ｋ／２７０Ｒ、８０Ｋ／２７０Ｒ／３２４Ｓ、８９Ｐ／１１８Ｄ／２００Ｓ、１０６Ｍ／２７０Ｒ／３２４Ｓ／３５２Ａ、１１８Ｄ／１４１Ｐ／２００Ｓ、１２６Ｔ、１２６Ｔ／２０１Ｄ／２７０Ｒ／３２４Ｓ、１２６Ｔ／２７０Ｒ、１４１Ｐ／１４４Ｖ／１９８Ｇ／２００Ｓ／３００Ｋ、１５６Ａ／２７０Ｒ、１５６Ａ／２７０Ｒ／３２４Ｓ、２０１Ｄ／２７０Ｒ、２０１Ｄ／２７０Ｒ／３５２Ａ、２７０Ｒ、又は２７０Ｒ／３２４Ｓを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＳ６６Ｎ／Ｒ７６Ｖ／Ｔ１１８Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｅ２０１Ｒ／Ｒ３００Ｋ、Ｓ６６Ｎ／Ｒ７６Ｖ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｄ２９６Ｅ／Ａ３０３Ｑ、Ｓ６６Ｎ／Ｒ７６Ｖ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｒ３００Ｋ、Ｓ６６Ｎ／Ｔ１１８Ｄ／Ｈ２００Ｓ／Ｄ２９６Ｅ／Ａ３０３Ｑ／Ｋ３１７Ｑ、Ｓ６６Ｎ／Ｔ１１８Ｄ／Ｄ２９６Ｅ、Ｓ６６Ｎ／Ｔ１１８Ｄ／Ｄ２９６Ｅ／Ｒ３００Ｋ、Ｓ６６Ｎ／Ｈ２００Ｓ、Ｒ７６Ｖ／Ｔ１１８Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｈ２００Ｓ／Ｄ２９６Ｅ、Ｒ７６Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｅ２０１Ｒ／Ｒ３００Ｋ、Ａ８０Ｋ／Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ、Ａ８０Ｋ／Ｌ２７０Ｒ、Ａ８０Ｋ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ａ８９Ｐ／Ｔ１１８Ｄ／Ｈ２００Ｓ、Ｌ１０６Ｍ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ／Ｄ３５２Ａ、Ｔ１１８Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｈ２００Ｓ、Ｄ１２６Ｔ、Ｄ１２６Ｔ／Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｄ１２６Ｔ／Ｌ２７０Ｒ、Ｒ１４１Ｐ／Ｍ１４４Ｖ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ｒ３００Ｋ、Ｇ１５６Ａ／Ｌ２７０Ｒ、Ｇ１５６Ａ／Ｌ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓ、Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ、Ｅ２０１Ｄ／Ｌ２７０Ｒ／Ｄ３５２Ａ、Ｌ２７０Ｒ、又はＬ２７０Ｒ／Ｍ３２４Ｓを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0265】
いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１９、１０９、１２３、１３４、１７０、１７３、１８７、２１１、又は３１２において、少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット１９Ｉ、１０９Ｇ、１２３Ｆ、１２３Ｍ、１２３Ｖ、１３４Ａ、１３４Ｓ、１７０Ａ、１７３Ａ、１７３Ｉ、１７３Ｔ、１８７Ｌ、２１１Ｓ、又は３１２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＬ１９Ｉ、Ｌ１０９Ｇ、Ｙ１２３Ｆ、Ｙ１２３Ｍ、Ｙ１２３Ｖ、Ｎ１３４Ａ、Ｎ１３４Ｓ、Ｐ１７０Ａ、Ｆ１７３Ａ、Ｆ１７３Ｉ、Ｆ１７３Ｔ、Ｖ１８７Ｌ、Ａ２１１Ｓ、及びＴ３１２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８６に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0266】
いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２００／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２１１、１９／１０９／１２３／１４１／１７０／１９８／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１７０／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１２３／１９８／２００／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／１７０／１７３／２１１／２７０／３１２、１９／１０９／２１１／２７０／３１２、１０９／１７０／２１１／２７０／３１２、又は１０９／２１１／２７０／３１２において、少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｆ／１７０Ａ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｆ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｖ／１４１Ｐ／１７０Ａ／１９８Ｇ／２００Ｓ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｖ／１４１Ｐ／１７０Ａ／１９８Ｇ／２１１Ｓ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１２３Ｖ／１４１Ｐ／１７０Ａ／１９８Ｇ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／１７０Ａ／１７３Ｉ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１９Ｉ／１０９Ｇ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、１０９Ｇ／１７０Ａ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａ、又は１０９Ｇ／２１１Ｓ／２７０Ｒ／３１２Ａを含み、ここで 前記アミノ酸位置は、配列番号６８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＬ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｆ／Ｐ１７０Ａ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｆ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ｐ１７０Ａ／Ａ１９８Ｇ／Ｈ２００Ｓ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ｐ１７０Ａ／Ａ１９８Ｇ／Ａ２１１Ｓ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｙ１２３Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ｐ１７０Ａ／Ａ１９８Ｇ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ｐ１７０Ａ／Ｆ１７３Ｉ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１９Ｉ／Ｌ１０９Ｇ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、Ｌ１０９Ｇ／Ｐ１７０Ａ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａ、又はＬ１０９Ｇ／Ａ２１１Ｓ／Ｌ２７０Ｒ／Ｔ３１２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号６８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0267】
いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置５／４１、５／４１／２２８、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１２６、２６５、２６７、２７０、３３１、３５３、３５７、又は３８４において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット５Ｖ／４１Ｄ、５Ｖ／４１Ｄ／２２８Ｄ、３３Ｌ、４１Ｄ、４７Ｆ、５１Ｅ、５１Ｑ、５５Ｉ、６４Ｎ、１２６Ａ、１２６Ｔ、２６５Ｐ、２６７Ｌ、２７０Ａ、２７０Ｔ、３３１Ｖ、３５３Ｅ、３５３Ｉ、３５３Ｌ、３５７Ｓ、又は３８４Ｗを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＫ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｔ２２８Ｄ、Ｆ３３Ｌ、Ｈ４１Ｄ、Ｌ４７Ｆ、Ｌ５１Ｅ、Ｌ５１Ｑ、Ｖ５５Ｉ、Ｓ６４Ｎ、Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ｔ、Ｅ２６５Ｐ、Ｉ２６７Ｌ、Ｒ２７０Ａ、Ｒ２７０Ｔ、Ｔ３３１Ｖ、Ｄ３５３Ｅ、Ｄ３５３Ｉ、Ｄ３５３Ｌ、Ｃ３５７Ｓ、又はＰ３８４Ｗを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0268】
いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、アミノ酸位置６６、６６／１１８、６６／１１８／２９６、６６／１１８／２９６／３００、６６／１１８／３００、６６／２９６、６６／２９６／３００、６６／３００、１１８、１１８／２９６、１１８／２９６／３００、１１８／３００、２９６、２９６／３００、又は３００において少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット６６Ｓ、６６Ｓ／１１８Ｔ、６６Ｓ／１１８Ｔ／２９６Ｄ、６６Ｓ／１１８Ｔ／２９６Ｄ／３００Ｒ、６６Ｓ／１１８Ｔ／３００Ｒ、６６Ｓ／２９６Ｄ、６６Ｓ／２９６Ｄ／３００Ｒ、６６Ｓ／３００Ｒ、１１８Ｔ、１１８Ｔ／２９６Ｄ、１１８Ｔ／２９６Ｄ／３００Ｒ、１１８Ｔ／３００Ｒ、２９６Ｄ、２９６Ｄ／３００Ｒ、又は３００Ｒを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セットＮ６６Ｓ、Ｎ６６Ｓ／Ｄ１１８Ｔ、Ｎ６６Ｓ／Ｄ１１８Ｔ／Ｅ２９６Ｄ、Ｎ６６Ｓ／Ｄ１１８Ｔ／Ｅ２９６Ｄ／Ｋ３００Ｒ、Ｎ６６Ｓ／Ｄ１１８Ｔ／Ｋ３００Ｒ、Ｎ６６Ｓ／Ｅ２９６Ｄ、Ｎ６６Ｓ／Ｅ２９６Ｄ／Ｋ３００Ｒ、Ｎ６６Ｓ／Ｋ３００Ｒ、Ｄ１１８Ｔ、Ｄ１１８Ｔ／Ｅ２９６Ｄ、Ｄ１１８Ｔ／Ｅ２９６Ｄ／Ｋ３００Ｒ、Ｄ１１８Ｔ／Ｋ３００Ｒ、Ｅ２９６Ｄ、Ｅ２９６Ｄ／Ｋ３００Ｒ、又はＫ３００Ｒを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号７６６に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0269】
いくつかの実施態様において、本明細書の治療用途及び治療方法のための工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、上記及び本明細書に開示された工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドである。
【0270】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８２８又は８８８の参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0271】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0272】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８２８に対応する参照配列に対して、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0273】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置５、１９、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１４１、１７０、１７３、１８７、１９８、２００、２０２、２６７、２７０、２７２、２９０、３１２、３５３、３５７、３８３、若しくは３８４、又はこれらの組み合わせにおいて、少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0274】
いくつかのの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、若しくは３５７、又はこれらの組み合わせにおいて、少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0275】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８２８の参照配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、アミノ酸位置１７０／２７０／３８３、２７０、４１／１７３、２７２、５／１４１／２７２／３８３、４１／３８３、４１／１４１／１８７／２７２／２９０、４１／１４１／１７３／２９０、５／２７２／３８３、５／４１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１、１４１／２７２、３５３／３８４、２７２／３８３、４１／１４１／１７３、４１／２７２／３８３、４１／１４１／１８７／２００／２０２／２７２、３３／５５／６４／１２６／２７０／３５７、３３／１２６／３５３／３５７、５５／６４／２６７／３５／３８４、３３／６４／３５７、１２６／２６７、６４／２６７／３５３／３８４、３３／５５／６４／３５７、１９／６４／１２６／２６７、５５／２６７、３３／１２６／２６７／２７０／３１２／３５７、１９／３３／５５／３５３／３５７／３８４、１９／３３／１２６、１２６／３１２、１２６／１９８／２０２／２６７／３１２、１２６／３５３、５５／１２６、１２６／２７０／３８４、３３／６４／３５３／３５７、１９／２６７、５１／５５／２６７／２７０／３５３、３３／１２６／２６７／２７０、１９／５５／６４／１２６／２６７／２７０／３５３、１９／３３／１２６／２７０／３５３／３５７／３８４、１９／３３／６４／２６７／３５３、１２６／３５３／３８４、１２６／２７０／３１２／３５３／３８４、１９／３３／５５／１２６、３３／３５７、４７／５１／６４／１２６／３５３／３８４、１２６、又は１２６／２７０において、少なくとも置換又は置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの追加の実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列が、少なくとも置換又は置換セット１７０Ｐ／２７０Ｌ／３８３Ｓ、２７０Ｌ、４１Ｄ／１７３Ｉ、２７２Ａ、５Ｖ／１４１Ｐ／２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１８７Ｌ／２７２Ａ／２９０Ｉ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２９０Ｉ、５Ｖ／２７２Ａ／３８３Ｓ、５Ｖ／４１Ｄ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ、１４１Ｐ／２７２Ａ、３５３Ｅ／３８４Ｗ、２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１７３Ｉ、４１Ｄ／２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１８７Ｌ／２００Ｓ／２０２Ｈ／２７２Ａ、３３Ｌ／５５Ｉ／６４Ｎ／１２６Ａ／２７０Ｌ／３５７Ｓ、３３Ｌ／１２６Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｓ、５５Ｉ／６４Ｎ／２６７Ｌ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、３３Ｌ／６４Ｎ／３５７Ｓ、１２６Ａ／２６７Ｌ、６４Ｎ／２６７Ｌ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、３３Ｌ／５５Ｉ／６４Ｎ／３５７Ｓ、１９Ｌ／６４Ｎ／１２６Ａ／２６７Ｌ、５５Ｉ／２６７Ｌ、３３Ｌ／１２６Ａ／２６７Ｌ／２７０Ｔ／３１２Ｔ／３５７Ｓ、１９Ｌ／３３Ｌ／５５Ｉ／３５３Ｅ／３５７Ｓ／３８４Ｗ、１９Ｌ／３３Ｌ／１２６Ａ、１２６Ａ／３１２Ｔ、１２６Ａ／１９８Ｇ／２０２Ｈ／２６７Ｌ／３１２Ｔ、１２６Ａ／３５３Ｅ、５５Ｉ／１２６Ａ、１２６Ａ／２７０Ｔ／３８４Ｗ、３３Ｌ／６４Ｎ／３５３Ｅ／３５７Ｓ、１９Ｌ／２６７Ｌ、５１Ｅ／５５Ｉ／２６７Ｌ／２７０Ｔ／３５３Ｅ、３３Ｌ／１２６Ａ／２６７Ｌ／２７０Ｔ、１９Ｌ／５５Ｉ／６４Ｎ／１２６Ａ／２６７Ｌ／２７０Ｔ／３５３Ｅ、１９Ｌ／３３Ｌ／１２６Ａ／２７０Ｔ／３５３Ｅ／３５７Ｓ／３８４Ｗ、１９Ｌ／３３Ｌ／６４Ｎ／２６７Ｌ／３５３Ｅ、１２６Ａ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、１２６Ａ／２７０Ｔ／３１２Ｔ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、１９Ｌ／３３Ｌ／５５Ｉ／１２６Ａ、３３Ｌ／３５７Ｓ、４７Ｆ／５１Ｅ／６４Ｎ／１２６Ａ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、又は１２６Ａ、１２６Ａ／２７０Ｔを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも置換又は置換セットＡ１７０Ｐ／Ｒ２７０Ｌ／Ａ３８３Ｓ、Ｒ２７０Ｌ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ、Ｔ２７２Ａ、Ｋ５Ｖ／Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｖ１８７Ｌ／Ｔ２７２Ａ／Ｖ２９０Ｉ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｖ２９０Ｉ、Ｋ５Ｖ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ、Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ、Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ、Ｈ４１Ｄ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｖ１８７Ｌ／Ｈ２００Ｓ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ、Ｆ３３Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｌ／Ｃ３５７Ｓ、Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｃ３５７Ｓ、Ｖ５５Ｉ／Ｓ６４Ｎ／Ｉ２６７Ｌ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｆ３３Ｌ／Ｓ６４Ｎ／Ｃ３５７Ｓ、Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ、Ｓ６４Ｎ／Ｉ２６７Ｌ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｆ３３Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｓ６４Ｎ／Ｃ３５７Ｓ、Ｉ１９Ｌ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ、Ｖ５５Ｉ／Ｉ２６７Ｌ、Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ／Ｒ２７０Ｔ／Ａ３１２Ｔ／Ｃ３５７Ｓ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｄ３５３Ｅ／Ｃ３５７Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ａ／Ａ３１２Ｔ、Ｄ１２６Ａ／Ａ１９８Ｇ／Ｓ２０２Ｈ／Ｉ２６７Ｌ／Ａ３１２Ｔ、Ｄ１２６Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｖ５５Ｉ／Ｄ１２６Ａ、Ｄ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｔ／Ｐ３８４Ｗ，、Ｆ３３Ｌ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ３５３Ｅ／Ｃ３５７Ｓ、Ｉ１９Ｌ／Ｉ２６７Ｌ、Ｌ５１Ｅ／Ｖ５５Ｉ／Ｉ２６７Ｌ／Ｒ２７０Ｔ／Ｄ３５３Ｅ、Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ／Ｒ２７０Ｔ、Ｉ１９Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ１２６Ａ／Ｉ２６７Ｌ／Ｒ２７０Ｔ／Ｄ３５３Ｅ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｄ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｔ／Ｄ３５３Ｅ／Ｃ３５７Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｓ６４Ｎ／Ｉ２６７Ｌ／Ｄ３５３Ｅ、Ｄ１２６Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｄ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｔ／Ａ３１２Ｔ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｉ１９Ｌ／Ｆ３３Ｌ／Ｖ５５Ｉ／Ｄ１２６Ａ、Ｆ３３Ｌ／Ｃ３５７Ｓ、Ｌ４７Ｆ／Ｌ５１Ｅ／Ｓ６４Ｎ／Ｄ１２６Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｄ１２６Ａ、又はＤ１２６Ａ／Ｒ２７０Ｔを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0276】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、若しくは３５７、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、及び３５７の少なくとも２つ又はそれ以上の置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、及び３５７の少なくとも３つ又はそれ以上の置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置３３／５５、３３／６４、３３／１２６、３３／２７０、３３／３５７、５５／６４、５５／１２６、５５／２７０、５５／３５７、６４／１２６、６４／２７０、６４／３５７、１２６／２７０、１２６／３５７、又は２７０／３５７に少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、アミノ酸位置３３／５５／６４、３３／５５／１２６、３３／６４／１２６、５５／６４／２７０、５５／６４／３５７、又は６４／１２６／２７０に少なくとも置換セットを含み、ここで、前記アミノ酸は配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、及び３５７に少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８２８又は８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの実施態様において、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、及び３５７の置換は、３３Ｌ、５５Ｉ、６４Ｎ、１２６Ａ、２７０Ｌ、及び３５７Ｓから選択される。いくつかの実施態様において、アミノ酸位置３３、５５、６４、１２６、２７０、及び３５７における置換は、Ｆ３３Ｌ、Ｖ５５Ｉ、Ｓ６４Ｎ、Ｄ１２６Ａ、Ｒ２７０Ｌ、及びＣ３５７Ｓから選択される。
【0277】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素は、配列番号８８８に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、前記アミノ酸配列は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して１つ又はそれ以上の置換を含む。
【0278】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素のアミノ酸配列は、アミノ酸位置５、１９、３３、４１、４７、５１、５５、６４、１４１、１７０、１７３、１８７、１９８、２００、２０２、２６７、２７０、２７２、２９０、３１２、３５３、３５７、３８３、若しくは３８４、又はこれらの組み合わせにおいて少なくとも置換を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0279】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素のアミノ酸配列は、アミノ酸残基５Ｖ、１９Ｌ、３３Ｌ、４１Ｄ、４７Ｆ、５１Ｅ、５５Ｉ、６４Ｓ／Ｎ、１４１Ｐ、１７０Ｐ、１７３Ｉ、１８７Ｌ、１９８Ｇ、２００Ｓ、２０２Ｈ、２６７Ｌ、２７０Ｌ／Ｔ、２７２Ａ、２９０Ｉ、３１２Ｔ、３５３Ｅ、３５７Ｓ／Ｃ、３８３Ｓ、若しくは３８４Ｗ、又はこれらの組み合わせを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0280】
いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも置換又は置換セット６４／１７３／２０２／３５３／３８４、４１／１４１／２７２／３５３、１４１／２０２／２７２／３５３／３５７、１７３／２０２／３５７、２０２／３５３、５／５１／１７３／２７２／３５３／３８４、５１／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２７２、２７２、４１／１７３／３８４、４１／６４／１４１／３５３／３５７／３８３、１４１／１７３／２０２、５／５１／６４／２０２／３５３、３５７、６４、５／４１／１４１、４１／１４１／１７３／２０２／３５３、３５３、２０２／３５７、５１／１４１／２０２／２７２／３５３、２０２、５１／１４１／１７３／３５３／３８４、４１／１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３８３／３８４、６４／２０２／３５７、５／６４／３５３／３８３／３８４、４１／２７２／３５３／３８３、４１／１７３／２７２／３５３／３５７、５１／１４１／２７２／３５３／３５７／３８３／３８４、４１／３５３／３５７、１７３／２７２／３５３／３５７、５／４１／６４／１７３／３５３／３５７、６４／１７３／３５７、５１／２７２、５１／６４／３５７／３８４、５１／１４１／１７３／２７２／３５３、６４／２０２／２７２／３５３／３５７／３８４、５１／２７２／３５７、５１／１７３／２７２／３５３／３８４、３５３／３８４、２０２／２７２／３５７、６４／１４１／１７３／２０２／３５３／３５７、５／４１／５１／２０２／３５７／３８３、５／５１／１７３／２７２／３８３、４１／１４１／２７２、５１／１７３、５／３５３、４１／６４／１７３／２７２／３５３／３８３、５／６４／１７３／２７２／３５３、５１／６４、４１／３５７／３８３、４１／１７３／３５３／３５７、２０２／２７２／３８３、２０２／２７２、３５３／３５７、４１／１７３／２０２／２７２／３５７、１４１／１７３／２０２／２７２／３５３／３５７、６４／１４１／２０２、又は５／１７３／２７２を含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも置換又は置換セット６４Ｓ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、４１Ｄ／１４１Ｐ／２７２Ａ／３５３Ｅ、１４１Ｐ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、１７３Ｉ／２０２Ｈ／３５７Ｃ、２０２Ｈ／３５３Ｅ、５Ｖ／５１Ｅ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、５１Ｅ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５７Ｃ、１４１Ｐ／１７３Ｉ／２７２Ａ、２７２Ａ、４１Ｄ／１７３Ｉ／３８４Ｗ、４１Ｄ／６４Ｓ／１４１Ｐ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３８３Ｓ、１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ、５Ｖ／５１Ｅ／６４Ｓ／２０２Ｈ／３５３Ｅ、３５７Ｃ、６４Ｓ、５Ｖ／４１Ｄ／１４１Ｐ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／３５３Ｅ、３５３Ｅ、２０２Ｈ／３５７Ｃ、５１Ｅ／１４１Ｐ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ、２０２Ｈ、５１Ｅ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、４１Ｄ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８３Ｓ／３８４Ｗ、６４Ｓ／２０２Ｈ／３５７Ｃ、５Ｖ／６４Ｓ／３５３Ｅ／３８３Ｓ／３８４Ｗ、４１Ｄ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、５１Ｅ／１４１Ｐ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３８３Ｓ／３８４Ｗ、４１Ｄ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、５Ｖ／４１Ｄ／６４Ｓ／１７３Ｉ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、６４Ｓ／１７３Ｉ／３５７Ｃ、５１Ｅ／２７２Ａ、５１Ｅ／６４Ｓ／３５７Ｃ／３８４Ｗ、５１Ｅ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ、６４Ｓ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ／３８４Ｗ、５１Ｅ／２７２Ａ／３５７Ｃ、５１Ｅ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８４Ｗ、３５３Ｅ／３８４Ｗ、２０２Ｈ／２７２Ａ／３５７Ｃ、６４Ｓ／１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、５Ｖ／４１Ｄ／５１Ｅ／２０２Ｈ／３５７Ｃ／３８３Ｓ、５Ｖ／５１Ｅ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１４１Ｐ／２７２Ａ、５１Ｅ／１７３Ｉ、５Ｖ／３５３Ｅ、４１Ｄ／６４Ｓ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３８３Ｓ、５Ｖ／６４Ｓ／１７３Ｉ／２７２Ａ／３５３Ｅ、５１Ｅ／６４Ｓ、４１Ｄ／３５７Ｃ／３８３Ｓ、４１Ｄ／１７３Ｉ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、２０２Ｈ／２７２Ａ／３８３Ｓ、２０２Ｈ／２７２Ａ、３５３Ｅ／３５７Ｃ、４１Ｄ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５７Ｃ、１４１Ｐ／１７３Ｉ／２０２Ｈ／２７２Ａ／３５３Ｅ／３５７Ｃ、６４Ｓ／１４１Ｐ／２０２Ｈ、又は５Ｖ／１７３Ｉ／２７２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも置換又は置換セットＮ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｒ１４１Ｐ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｓ３５７Ｃ、Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ、Ｋ５Ｖ／Ｌ５１Ｅ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｌ５１Ｅ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｓ３５７Ｃ、Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ、Ｔ２７２Ａ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｎ６４Ｓ／Ｒ１４１Ｐ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ／Ａ３８３Ｓ、Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ、Ｋ５Ｖ／Ｌ５１Ｅ／Ｎ６４Ｓ／Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ、Ｓ３５７Ｃ、Ｎ６４Ｓ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ、Ｄ３５３Ｅ、Ｓ２０２Ｈ／Ｓ３５７Ｃ、Ｌ５１Ｅ／Ｒ１４１Ｐ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｓ２０２Ｈ、Ｌ５１Ｅ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ａ３８３Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｎ６４Ｓ／Ｓ２０２Ｈ／Ｓ３５７Ｃ、Ｋ５Ｖ／Ｎ６４Ｓ／Ｄ３５３Ｅ／Ａ３８３Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｌ５１Ｅ／Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ／Ａ３８３Ｓ／Ｐ３８４Ｗ、Ｈ４１Ｄ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｎ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｎ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ３５７Ｃ、Ｌ５１Ｅ／Ｔ２７２Ａ、Ｌ５１Ｅ／Ｎ６４Ｓ／Ｓ３５７Ｃ／Ｐ３８４Ｗ、Ｌ５１Ｅ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｎ６４Ｓ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ／Ｐ３８４Ｗ、Ｌ５１Ｅ／Ｔ２７２Ａ／Ｓ３５７Ｃ、Ｌ５１Ｅ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｄ３５３Ｅ／Ｐ３８４Ｗ、Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｓ３５７Ｃ、Ｎ６４Ｓ／Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｋ５Ｖ／Ｈ４１Ｄ／Ｌ５１Ｅ／Ｓ２０２Ｈ／Ｓ３５７Ｃ／Ａ３８３Ｓ、Ｋ５Ｖ／Ｌ５１Ｅ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｒ１４１Ｐ／Ｔ２７２Ａ、Ｌ５１Ｅ／Ｆ１７３Ｉ、Ｋ５Ｖ／Ｄ３５３Ｅ、Ｈ４１Ｄ／Ｎ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ａ３８３Ｓ、Ｋ５Ｖ／Ｎ６４Ｓ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ、Ｌ５１Ｅ／Ｎ６４Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｓ３５７Ｃ／Ａ３８３Ｓ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ａ３８３Ｓ、Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ、Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｈ４１Ｄ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｓ３５７Ｃ、Ｒ１４１Ｐ／Ｆ１７３Ｉ／Ｓ２０２Ｈ／Ｔ２７２Ａ／Ｄ３５３Ｅ／Ｓ３５７Ｃ、Ｎ６４Ｓ／Ｒ１４１Ｐ／Ｓ２０２Ｈ、又はＫ５Ｖ／Ｆ１７３Ｉ／Ｔ２７２Ａを含み、ここで、前記アミノ酸位置は、配列番号８８８に対応する参照配列に対して相対的なものである。
【0281】
治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、１１－２、１２－１、及び／又は１２－２のいずれかに提供される工学操作ロイシン脱炭酸酵素の置換又は置換セットを含む。
【0282】
治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、表１－２、２－１、３－２、４－１、５－１、６－１、７－１、８－１、８－２、１０－１、１１－１、１１－２、１２－１、及び／又は１２－２のいずれかに提供される工学操作ロイシン脱炭酸酵素のアミノ酸配列を含む。
【0283】
治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２～１０６４のうちの偶数の配列番号に対応する配列に対して、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２～１０６４のうちの偶数の配列番号を有するアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号１６～１０６４のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。
【0284】
治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号１６～８５２のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号１６～２０４のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２０６～２７８のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号２８０～３９０のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号３９２～４８４のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号４８６～６３６のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号６３８～６８６のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号６８８～７３６のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号７３８～７６２のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号７６４～７８０のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号７８２～８２２のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８２４～８５２のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。治療用途及び治療方法のいくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、配列番号８５４～１０６４のうちの偶数の配列番号を含むアミノ酸配列を含む。
【0285】
いくつかの実施態様において、本明細書の治療用途及び治療方法のためのロイシン脱炭酸酵素は、野生型のプランクトミセス科細菌種のロイシン脱炭酸酵素と比較して、少なくとも１つの改良された特性を示す。いくつかの実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、ロイシンに対して、野生型のプランクトミセス科種のロイシン脱炭酸酵素又は配列番号１２に対応するアミノ酸配列を有するロイシン脱炭酸酵素よりも高い活性を示す。いくつかの実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、野生型のプランクトミセス科細菌種のロイシン脱炭酸酵素又は配列番号１２に対応するアミノ酸配列を有するロイシン脱炭酸酵素よりも安定である。いくつかの実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、タンパク質分解に対して、野生型のプランクトミセス科細菌種又は配列番号１２に対応するアミノ酸配列を有するロイシン脱炭酸酵素よりも耐性が高い。いくつかの実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、低ｐＨ環境に対して、野生型のプランクトミセス科細菌種のロイシン脱炭酸酵素又は配列番号１２に対応するアミノ酸配列を有するロイシン脱炭酸酵素よりも耐容性が高い。いくつかの実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、野生型のプランクトミセス科細菌種のロイシン脱炭酸酵素又は配列番号１２に対応するアミノ酸配列を有するロイシン脱炭酸酵素よりも免疫原性が低い。いくつかの実施態様において、前記工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドは、野生型のプランクトミセス科細菌種のロイシン脱炭酸酵素又は配列番号１２に対応するアミノ酸配列を有するロイシン脱炭酸酵素よりも血清安定性が高い。
【0286】
いくつかの追加の実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ロイシン、イソロイシン、及び／又はアロイソロイシン代謝の機能不全に関連する疾患又は状態の症状を治療及び／又は予防するための遺伝子治療に使用することができる。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは、血漿中のロイシン、イソロイシン、アロイソロイシン、及び／又はケトイソカプロン酸レベルの上昇に関連する疾患又は状態の症状を治療及び／又は予防するための遺伝子治療に使用することができる。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは、メープルシロップ尿症、イソ吉草酸血症、又は３－メチルクロトニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ欠損症を有する被験体を治療するための遺伝子治療に使用することができる。いくつかの実施態様において、工学操作ロイシン脱炭酸酵素ポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチドは、ヒト患者における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施態様において、遺伝子治療に使用するための前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡである。いくつかの実施態様において、遺伝子治療用のための前記ポリヌクレオチド又はその組成物は、ｍＲＮＡを含む。
【0287】
本発明の上記及びその他の態様は、以下の非限定的な実施例と関連してよりよく理解され得る。実施例は、例示目的のみで提供されており、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
実験例
実験例
【0288】
実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、説明目的のみで提供されており、本発明を制限するものとして解釈されるべきではない。
【0289】
以下の実験開示では、次の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分の一）；Ｍ（モル）；ｍＭ（ミリモル）；μＭ及びμＭ（マイクロモル）；ｎＭ（ナノモル）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍ及びｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ及びμｇ（マイクログラム）；Ｌ及びｌ（リットル）；ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μＭ及びμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（ｓ）（分）；ｈ（ｓ）及びｈｒ（ｓ）（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｐｓｉ及びＰＳＩ（平方インチあたりのポンド重量）；℃（摂氏度）；ＲＴ及びｒｔ（室温）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＡＵＣ（曲線下面積）；定量限界（ＬＯＱ）；Ｅ． ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（一般的に使用されている実験室用大腸菌株、Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ［ＣＧＳＣ］， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴ から入手可能）；ｉＭＳＵＤ（中間型メープルシロップ尿症）；ＨＴＰ（高速処理）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＬＣ（液体クロマトグラフィー）；ＭＳ（質量分析）；ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（２つの質量分析計と組合わされて液体クロマトグラフィー）；ＳＰＥ（固相抽出）；ＫＩＣ（ケトイソカプロン酸）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）；ＰＬＰ（ピリドキサール５’－リン酸）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＢＷ（体重）；ＭＳＵＤ（メープルシロップ尿症）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する改良倍数）；ＬＢ（ルリアブロス）；ＴＢ（テリフィックブロス）；Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｎｏｖｉ， ＭＩ）； Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ （Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｃｏｒｐ．， Ｎｅｗｔｏｎ， ＭＡ）； Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ （Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ， Ｈｏｌｌａｎｄ， ＭＩ）； Ｗａｔｅｒｓ （Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．， Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ）； Ｉｎｆｏｒｓ （Ｉｎｆｏｒｓ ＡＧ， Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）； Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ， ＭＡ）； Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ （Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）； Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃｏｒｐ．の一部， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）， Ａｇｉｌｅｎｔ （Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）； Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）； Ｇｉｂｃｏ （Ｇｉｂｃｏ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ の一部， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）； Ｋｈｕｎｅｒ （Ｋｈｕｎｅｒ Ｓｈａｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， ＣＡ）； ＢＮ Ｌａｂｓ （Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎｓ， ＬＬＣ， Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ）； ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ （ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）； 及び Ｃｏｒｎｉｎｇ （Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ｉｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）。
【0290】
実施例１
ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）変種を発現する大腸菌の高速（ＨＴＰ）増殖とＬＤＣスクリーニング条件
ＬＤＣ変種を発現する大腸菌のＨＴＰ増殖
形質転換された大腸菌細胞を、１％グルコースを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングして厳選した。３７℃で一晩インキュベーション後、１％グルコースを補足した１８０μｌ／ウェルのＬＢを充填した９６ウェルの浅い平底プレート（Ｎｕｎｃ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに入れ、選択した。培養物をシェーカー（２００ｒｐｍ、３０℃、８５％相対湿度；Ｋｕｌｎｅｒ）で一晩（１８～２０時間）増殖させた。一晩培養した試料（２０μＬ）を、選択化合物を補足したテリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）３８０μＬを充填した Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェル深底プレート （Ｃｏｒｎｉｎｇ） に移した。プレートをシェーカー（２５０ｒｐｍ、３０℃、相対湿度８５％、Ｋｕｈｎｅｒ） 中で約２時間インキュベートした。次に、細胞を４０μＬの１０ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、シェーカー（２５０ｒｐｍ、３０℃、相対湿度８５％、Ｋｕｈｎｅｒ）で一晩（２０～２４時間）インキュベートした。細胞をペレット化し（４０００ｒｐｍ×２０分）、上清を捨てて、細胞を－８０℃で凍結後、溶解した。
ロイシン脱炭酸酵素（ＬＤＣ）変種を発現する大腸菌の高速（ＨＴＰ）増殖とＬＤＣスクリーニング条件
ＬＤＣ変種を発現する大腸菌のＨＴＰ増殖
形質転換された大腸菌細胞を、１％グルコースを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングして厳選した。３７℃で一晩インキュベーション後、１％グルコースを補足した１８０μｌ／ウェルのＬＢを充填した９６ウェルの浅い平底プレート（Ｎｕｎｃ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに入れ、選択した。培養物をシェーカー（２００ｒｐｍ、３０℃、８５％相対湿度；Ｋｕｌｎｅｒ）で一晩（１８～２０時間）増殖させた。一晩培養した試料（２０μＬ）を、選択化合物を補足したテリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）３８０μＬを充填した Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェル深底プレート （Ｃｏｒｎｉｎｇ） に移した。プレートをシェーカー（２５０ｒｐｍ、３０℃、相対湿度８５％、Ｋｕｈｎｅｒ） 中で約２時間インキュベートした。次に、細胞を４０μＬの１０ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、シェーカー（２５０ｒｐｍ、３０℃、相対湿度８５％、Ｋｕｈｎｅｒ）で一晩（２０～２４時間）インキュベートした。細胞をペレット化し（４０００ｒｐｍ×２０分）、上清を捨てて、細胞を－８０℃で凍結後、溶解した。
【0291】
ＨＴＰペレットの溶解
大腸菌細胞のペレットを４００μＬの溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム （ｐＨ７）、０．０４ｍＭピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．５ｇ／ＬポリミキシンＢ硫酸塩（ＰＭＢＳ））で溶解した。混合物を室温で１．５時間撹拌し、ペレット化（４０００ｒｐｍｘ１０分）した後、清澄化した溶解物をＭｕｌｔｉｔｒｏｎプレートシェーカー（２５０又は４００ｒｐｍ、Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）中で６０℃で１時間プレインキュベートした。熱処理した溶解物をペレット化（４０００ｒｐｍｘ１０分）し、上清をＨＴＰアッセイに使用した。
大腸菌細胞のペレットを４００μＬの溶解緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム （ｐＨ７）、０．０４ｍＭピリドキサール５’－リン酸（ＰＬＰ）、１ｍｇ／ｍｌリゾチーム、０．５ｇ／ＬポリミキシンＢ硫酸塩（ＰＭＢＳ））で溶解した。混合物を室温で１．５時間撹拌し、ペレット化（４０００ｒｐｍｘ１０分）した後、清澄化した溶解物をＭｕｌｔｉｔｒｏｎプレートシェーカー（２５０又は４００ｒｐｍ、Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）中で６０℃で１時間プレインキュベートした。熱処理した溶解物をペレット化（４０００ｒｐｍｘ１０分）し、上清をＨＴＰアッセイに使用した。
【0292】
清澄化溶解物のＬＤＣ活性のＨＴＰ分析
２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中又は模擬腸液塩の混合物中の最終濃度が３ｍＭのロイシンとなるように、希釈した熱処理済み清澄化溶解物を反応混合物に加えてＬＤＣ活性を評価した。一部の実験では、最終濃度が３ｍＭのロイシン、イソロイシン－ｄ１０、バリン、メチオニン、及びシステイン（５ＡＡ混合物）となる反応混合物を使用した。反応物を、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎプレートシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）で３７℃、２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、０．１％ギ酸を含む３倍容量のアセトニトリルでクエンチし、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして水で５０倍希釈した。得られた試料を、ロイシンの脱炭酸生成物であるイソペンチルアミンについて ＲａｐｉｄＦｉｒｅ（登録商標）－ＭＳ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ）により分析し、試料のイソペンチルアミンピーク面積を主鎖のイソペンチルアミンピーク面積で割って、ＦＩＯＰ（親化合物に対する改良倍数）値を計算することにより、相対活性を決定した。
２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中又は模擬腸液塩の混合物中の最終濃度が３ｍＭのロイシンとなるように、希釈した熱処理済み清澄化溶解物を反応混合物に加えてＬＤＣ活性を評価した。一部の実験では、最終濃度が３ｍＭのロイシン、イソロイシン－ｄ１０、バリン、メチオニン、及びシステイン（５ＡＡ混合物）となる反応混合物を使用した。反応物を、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎプレートシェーカー（Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）で３７℃、２５０ｒｐｍで１時間インキュベートした後、０．１％ギ酸を含む３倍容量のアセトニトリルでクエンチし、４℃、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして水で５０倍希釈した。得られた試料を、ロイシンの脱炭酸生成物であるイソペンチルアミンについて ＲａｐｉｄＦｉｒｅ（登録商標）－ＭＳ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ）により分析し、試料のイソペンチルアミンピーク面積を主鎖のイソペンチルアミンピーク面積で割って、ＦＩＯＰ（親化合物に対する改良倍数）値を計算することにより、相対活性を決定した。
【0293】
胃及び腸の状態を模擬して前処理した清澄化溶解物のＨＴＰ分析
ＬＤＣ変種を含む熱処理済み溶解物に、ペプシンを含む酸性緩衝液を刺激投与して胃の環境を模擬した。具体的には、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、熱処理した清澄化溶解物をＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ２．８～３）及び最終濃度０．８ｇ／Ｌのペプシンと１：１でプレインキュベートした。プレートを密封し、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎプレートシェーカー（２５０ｒｐｍ、Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）中で３７℃で２時間インキュベートした。続いて、模擬胃液刺激投与溶解物を、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎプレートシェーカー（２５０ｒｐｍ、Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）中で、最終濃度４ｇ／Ｌのトリプシン及び１．５ｇ／Ｌのキモトリプシンと１：１で３７℃で２時間プレインキュベートして、腸の環境を模擬した。このインキュベーション後、試料を遠心分離し、４０μＬの試料を６０μＬの反応混合物に加え、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）又は模擬腸液塩の混合物中で最終濃度３ｍＭロイシンになるようにした。一部の実験では、最終濃度３ｍＭのロイシン、イソロイシン－ｄ１０、バリン、メチオニン、及びシステイン（５ＡＡ混合物）を与える反応混合物が使用された。次に、ＬＤＣ変種の活性を上記実施例１．３で説明したように測定した。
ＬＤＣ変種を含む熱処理済み溶解物に、ペプシンを含む酸性緩衝液を刺激投与して胃の環境を模擬した。具体的には、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、熱処理した清澄化溶解物をＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ２．８～３）及び最終濃度０．８ｇ／Ｌのペプシンと１：１でプレインキュベートした。プレートを密封し、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎプレートシェーカー（２５０ｒｐｍ、Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）中で３７℃で２時間インキュベートした。続いて、模擬胃液刺激投与溶解物を、Ｍｕｌｔｉｔｒｏｎプレートシェーカー（２５０ｒｐｍ、Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ）中で、最終濃度４ｇ／Ｌのトリプシン及び１．５ｇ／Ｌのキモトリプシンと１：１で３７℃で２時間プレインキュベートして、腸の環境を模擬した。このインキュベーション後、試料を遠心分離し、４０μＬの試料を６０μＬの反応混合物に加え、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）又は模擬腸液塩の混合物中で最終濃度３ｍＭロイシンになるようにした。一部の実験では、最終濃度３ｍＭのロイシン、イソロイシン－ｄ１０、バリン、メチオニン、及びシステイン（５ＡＡ混合物）を与える反応混合物が使用された。次に、ＬＤＣ変種の活性を上記実施例１．３で説明したように測定した。
【0294】
実施例２
ＬＤＣ変種のスクリーニング結果
配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドに有益な突然変異を組み換えることによって、ライブラリー変種が生成された。ＬＤＣ変種を発現する大腸菌細胞のＨＴＰ増殖及び溶解は、実施例１に記載のとおりに実施した。変種を、２時間の模擬胃液刺激投与（５０％ ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ３）、０．８ｇ／Ｌペプシン）及び２時間の腸液刺激投与（２００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、４ｇ／Ｌトリプシン、１．５ｇ／Ｌキモトリプシン）後に、模擬腸液塩溶液に溶解した５ＡＡ混合物中のＬＤＣ活性についてスクリーニングした。ＬＤＣ活性は実施例１に記載のとおり測定し、配列番号８２８に対するデータの解析を表１２－１に列記する。
ＬＤＣ変種のスクリーニング結果
配列番号８２８のＬＤＣポリペプチドに有益な突然変異を組み換えることによって、ライブラリー変種が生成された。ＬＤＣ変種を発現する大腸菌細胞のＨＴＰ増殖及び溶解は、実施例１に記載のとおりに実施した。変種を、２時間の模擬胃液刺激投与（５０％ ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（ｐＨ３）、０．８ｇ／Ｌペプシン）及び２時間の腸液刺激投与（２００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、４ｇ／Ｌトリプシン、１．５ｇ／Ｌキモトリプシン）後に、模擬腸液塩溶液に溶解した５ＡＡ混合物中のＬＤＣ活性についてスクリーニングした。ＬＤＣ活性は実施例１に記載のとおり測定し、配列番号８２８に対するデータの解析を表１２－１に列記する。
【表12.1-1】
【表12.1-2】
【表12.1-3】
【表12.1-4】
【表12.1-5】
【表12.1-6】
【表12.1-7】
【0295】
表１２－２の結果に基づいて、配列番号８８８を主鎖として選択した。表１２－１で特定された有益な突然変異を主鎖に組み込んだ。得られた変種は、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）中の最終濃度が３ｍＭロイシン及び０．０１ｍＭ ＰＬＰになるように、８０倍希釈の熱処理済み清澄化溶解物２０μＬをの８０μＬの反応混合物とインキュベートし、ロイシンに対する無刺激投与の活性についてスクリーニングされた。変種はまた、２時間の模擬胃液刺激投与（５０％ ＭｃＩｌｖａｉｎｅ 緩衝液（ｐＨ２．８）、０．８ｇ／Ｌペプシン）及び２時間の模擬腸液刺激投与（２００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ８）、４ｇ／Ｌトリプシン、１．５ｇ／Ｌキモトリプシン）の後、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７）に溶解した０．０１ｍＭ ＰＬＰを含む５ＡＡ混合物でＬＤＣ活性についてスクリーニングされた。ＬＤＣ活性は実施例１に記載のとおり測定し、配列番号８８８に関するデータの解析を表１２－２に列記する。
【表12.2-1】
【表12.2-2】
【表12.2-3】
【表12.2-4】
【表12.2-5】
【表12.2-6】
【表12.2-7】
【表12.2-8】
【表12.2-9】
【表12.2-10】
【0296】
実施例３
中間型ＭＳＵＤマウスモデルにおけるＬＤＣ変種の薬力学的（ＰＤ）試験
中間型メープルシロップ尿症（ｉＭＳＵＤ；Ｄｂｔｔｍ１Ｇｅｈ）Ｔｇ（Ｃｅｂｐｂ－ｔＴＡ）５Ｂｊｄ Ｔｇ（ｔｅｔＯ－ＤＢＴ）Ａ１Ｇｅｈ／Ｊ、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ ＃００６９９９）マウスを、健康を増進し、生存期間を延ばすために、離乳時にロイシン制限（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ ＃Ａ０５０８０２０２ｉ、５．７５ｇ／Ｌロイシンを補足したロイシンを含まない食事、Ｓｉｇｍａ ＃Ｌ８９１２）に供した。ｉＭＳＵＤマウスが体重（ＢＷ）約２０ｇに達したとき、１８匹の未治療のマウスが無作為に試験グループに分けられた（雌雄混合、２～３．５か月齢）。試験期間中、マウスはロイシンを含まない食事とロイシン補足水を自由に摂取できた。１００μＬの水に懸濁された約４５ｍｇのホエー（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｕ０６３７ＡＬ、８．５７％ｗ／ｗのロイシンを含むホエータンパク質粉末）を、各マウスに強制経口投与した。ホエータンパク質食後、マウスにビヒクル（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．２）又は酵素（配列番号４８４、配列番号６８６、又は配列番号７６６のＬＤＣ、ビヒクルで希釈した２００ｍｇ／ｋｇで投与）のいずれかを強制経口投与（１００μＬ／マウス）した。血液を、予定された時点（投与前、及び投与後１５、３０、６０、１２０、及び２４０分）で尾静脈から採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳで分析し、標準曲線（範囲：２～３０５０ｍＭ、ＬＯＱ：２μＭ）を使用してロイシン濃度を決定した。
中間型ＭＳＵＤマウスモデルにおけるＬＤＣ変種の薬力学的（ＰＤ）試験
中間型メープルシロップ尿症（ｉＭＳＵＤ；Ｄｂｔｔｍ１Ｇｅｈ）Ｔｇ（Ｃｅｂｐｂ－ｔＴＡ）５Ｂｊｄ Ｔｇ（ｔｅｔＯ－ＤＢＴ）Ａ１Ｇｅｈ／Ｊ、ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｓ ＃００６９９９）マウスを、健康を増進し、生存期間を延ばすために、離乳時にロイシン制限（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ ＃Ａ０５０８０２０２ｉ、５．７５ｇ／Ｌロイシンを補足したロイシンを含まない食事、Ｓｉｇｍａ ＃Ｌ８９１２）に供した。ｉＭＳＵＤマウスが体重（ＢＷ）約２０ｇに達したとき、１８匹の未治療のマウスが無作為に試験グループに分けられた（雌雄混合、２～３．５か月齢）。試験期間中、マウスはロイシンを含まない食事とロイシン補足水を自由に摂取できた。１００μＬの水に懸濁された約４５ｍｇのホエー（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｕ０６３７ＡＬ、８．５７％ｗ／ｗのロイシンを含むホエータンパク質粉末）を、各マウスに強制経口投与した。ホエータンパク質食後、マウスにビヒクル（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．２）又は酵素（配列番号４８４、配列番号６８６、又は配列番号７６６のＬＤＣ、ビヒクルで希釈した２００ｍｇ／ｋｇで投与）のいずれかを強制経口投与（１００μＬ／マウス）した。血液を、予定された時点（投与前、及び投与後１５、３０、６０、１２０、及び２４０分）で尾静脈から採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳで分析し、標準曲線（範囲：２～３０５０ｍＭ、ＬＯＱ：２μＭ）を使用してロイシン濃度を決定した。
【0297】
ホエータンパク質食及びビヒクルの投与後、マウスの血漿ロイシンが有意に増加した。ホエー食直後に工学操作ロイシン脱炭酸酵素で処理すると、ロイシンの急上昇が有意に抑制され、経時変化データ（図１Ａ）及び曲線下面積（ＡＵＣ、図１Ｂ；ビヒクルと比較して、配列番号４８４、配列番号６８６、及び配列番号７６６のＬＤＣで、それぞれ２１％（ｐ＜０．０５）、３０％（ｐ＜０．０１）、又は３９％（ｐ＜０．００１）の抑制）の両方で、より進化した変種で抑制が強化された。
【0298】
実施例４
ｉＭＳＵＤマウスモデルにおける配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドの薬力学的（ＰＤ）用量反応試験
前の試験からの１３匹の投薬経験済みのｉＭＳＵＤマウスを、最低２週間のウォッシュアウト後、無作為にグループ分けした（雌雄混合、２．５～４か月齢、体重約２０ｇ）。マウスは、試験期間中、ロイシンを含まない食事とロイシン補足水（ロイシン５．７５ｇ／Ｌ）を自由に摂取できた。１００μＬの水に懸濁された約４５ｍｇのホエー（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｕ０６３７ＡＬ；８．５７％ｗ／ｗのロイシンを含むホエータンパク質粉末）を各マウスに強制経口投与した。ホエータンパク質食後、マウスに、ビヒクル（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．２）又は配列番号７６６のＬＤＣ（５０、１００、又は２００ｍｇ／ｋｇ、ビヒクルで希釈）を強制経口投与（１００μＬ／マウス）した。血液を、予定された時点（投与前、及び投与後１５、３０、６０、１２０、及び２４０分）で尾静脈から採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳで分析し、それぞれの標準曲線（ＬＯＱ：２μＭ）を使用してロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、及びメチオニンのレベルを決定した。マウス間の高いベースライン変動を補正するために、バックグラウンド（投与前）を差し引いた。
ｉＭＳＵＤマウスモデルにおける配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドの薬力学的（ＰＤ）用量反応試験
前の試験からの１３匹の投薬経験済みのｉＭＳＵＤマウスを、最低２週間のウォッシュアウト後、無作為にグループ分けした（雌雄混合、２．５～４か月齢、体重約２０ｇ）。マウスは、試験期間中、ロイシンを含まない食事とロイシン補足水（ロイシン５．７５ｇ／Ｌ）を自由に摂取できた。１００μＬの水に懸濁された約４５ｍｇのホエー（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｕ０６３７ＡＬ；８．５７％ｗ／ｗのロイシンを含むホエータンパク質粉末）を各マウスに強制経口投与した。ホエータンパク質食後、マウスに、ビヒクル（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．２）又は配列番号７６６のＬＤＣ（５０、１００、又は２００ｍｇ／ｋｇ、ビヒクルで希釈）を強制経口投与（１００μＬ／マウス）した。血液を、予定された時点（投与前、及び投与後１５、３０、６０、１２０、及び２４０分）で尾静脈から採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳで分析し、それぞれの標準曲線（ＬＯＱ：２μＭ）を使用してロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、及びメチオニンのレベルを決定した。マウス間の高いベースライン変動を補正するために、バックグラウンド（投与前）を差し引いた。
【0299】
ホエータンパク質食及びビヒクルの投与後、血漿ロイシンの有意な増加が観察された。ホエー直後に配列番号７６６のＬＤＣの全用量で処理すると、バックグラウンドを差し引いた経時変化データ（図２Ａ）、及びバックグラウンドを差し引いた経時変化データを使用して計算されたＡＵＣである増分ＡＵＣ（ｉＡＵＣ）（図２Ｂ；ビヒクルと比較して、５０、１００、及び２００ｍｇ／ｋｇの配列番号７６６のＬＤＣで、それぞれ４０％（ｐ＜０．０１）、５７％（ｐ＜０．００１）、又は９２％（ｐ＜０．０００１）の抑制）の両方において、用量依存的にロイシンの急上昇が有意に抑制された。ホエータンパク質食は評価した他のアミノ酸の急上昇をもたらしたが、ＬＤＣはどの用量でも抑制を誘導しなかった。検査したいくつかのアミノ酸の平均ｉＡＵＣ±ＳＥＭのデータを以下の表１３－１に示す。
【表13-1】
【0300】
実施例５
ｉＭＳＵＤマウスモデルにおける、配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドと比較した進化したＬＤＣ変種の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験
投薬未経験のｉＭＳＵＤマウスを、健康を増進し、生存期間を延ばすために、離乳時にロイシン制限（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ ＃Ａ０５０８０２０２ｉ、５．７５ｇ／Ｌロイシンを補足したロイシンを含まない食餌；Ｓｉｇｍａ ＃Ｌ８９１２）に供した。体重２０ｇ以上の２４匹のｉＭＳＵＤマウスが無作為に試験グループに分けられた（雌雄混合、２．５～６か月齢）。ロイシン補足水（５．７５ｇ／Ｌ）を、最初の採血の約４０～６０分前に通常の水に交換し、最後の採血後に交換した。試験期間中、マウスにはロイシンを含まない食事と水を自由に摂取させた。約４５ｍｇのホエー（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｕ０６３７ＡＬ、８．５７％ｗ／ｗのロイシンを含むホエータンパク質粉末）を１００μＬの水に懸濁し、各マウスに強制経口投与した。ホエータンパク質食後、マウスにビヒクル（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．２）又は工学操作ロイシン脱炭酸酵素（配列番号７６６又は配列番号８２８、ビヒクルで希釈した１００ｍｇ／ｋｇ投与）を強制経口投与（１００μＬ／マウス）した。血液を、予定された時点（投与前、及び投与後１５、３０、６０、１２０、２４０分）で尾静脈から採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳで分析し、それぞれの標準曲線（ＬＯＱ：２μＭ）を使用してロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、及びメチオニンのレベルを決定した。
ｉＭＳＵＤマウスモデルにおける、配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドと比較した進化したＬＤＣ変種の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験
投薬未経験のｉＭＳＵＤマウスを、健康を増進し、生存期間を延ばすために、離乳時にロイシン制限（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ ＃Ａ０５０８０２０２ｉ、５．７５ｇ／Ｌロイシンを補足したロイシンを含まない食餌；Ｓｉｇｍａ ＃Ｌ８９１２）に供した。体重２０ｇ以上の２４匹のｉＭＳＵＤマウスが無作為に試験グループに分けられた（雌雄混合、２．５～６か月齢）。ロイシン補足水（５．７５ｇ／Ｌ）を、最初の採血の約４０～６０分前に通常の水に交換し、最後の採血後に交換した。試験期間中、マウスにはロイシンを含まない食事と水を自由に摂取させた。約４５ｍｇのホエー（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｕ０６３７ＡＬ、８．５７％ｗ／ｗのロイシンを含むホエータンパク質粉末）を１００μＬの水に懸濁し、各マウスに強制経口投与した。ホエータンパク質食後、マウスにビヒクル（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．２）又は工学操作ロイシン脱炭酸酵素（配列番号７６６又は配列番号８２８、ビヒクルで希釈した１００ｍｇ／ｋｇ投与）を強制経口投与（１００μＬ／マウス）した。血液を、予定された時点（投与前、及び投与後１５、３０、６０、１２０、２４０分）で尾静脈から採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳで分析し、それぞれの標準曲線（ＬＯＱ：２μＭ）を使用してロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、及びメチオニンのレベルを決定した。
【0301】
ホエータンパク質食及びビヒクルの投与後、血清ロイシンの有意な増加が観察された。ホエー直後に工学操作ロイシン脱炭酸酵素で処理すると、経時的データ（図３Ａ）及びＡＵＣ（図３Ｂ；ビヒクルと比較して２８％（配列番号７６６）及び４５％（配列番号８２８、ｐ＜０．０５）の抑制）の両方で、ロイシンの急上昇が有意に抑制された。ホエータンパク質食は評価した他のアミノ酸の急上昇を引き起こしたが、ＬＤＣはどちらのロイシン脱炭酸酵素変種でも抑制を誘導しなかった。検査したいくつかのアミノ酸の平均ｉＡＵＣ±ＳＥＭのデータを以下の表１４－１に示す。
【表14-1】
【0302】
実施例６
健康なカニクイザルにおけるＬＤＣ変種の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験
１３匹の雄カニクイザルを投与前に一晩絶食させた。２０ｍＬの水に懸濁された約１０ｇのホエー（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｕ０６３７ＡＬ；８．５７％ｗ／ｗロイシンを含むホエータンパク質粉末）を各サルに強制経口投与した。カニクイザルに、ビヒクル（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．２）又は工学操作ロイシン脱炭酸酵素（配列番号４８４、配列番号６８６、又は配列番号７６６、ビヒクルで希釈した２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇで投与）を、懸濁液（２．５ｍＬ／ｋｇ、７．５～１０ｍＬ／サル）として強制経口投与した。標準食（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｃｈｏｗ ２０５５Ｃ； Ｅｎｖｉｇｏ）を、処理の約８時間後にすべてのサルに与えた。血液を大腿静脈から、投与前に２回（－１．５時間及び－３０分）と投与後５、１５、３０分、及び１、２、４、８、１２、及び２４時間に採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳで、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、及びチロシンのレベルをそれぞれの標準曲線（ＬＯＱ：それぞれ４、８、８．５、６、７、及び１１μＭ）に対して分析した。
健康なカニクイザルにおけるＬＤＣ変種の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験
１３匹の雄カニクイザルを投与前に一晩絶食させた。２０ｍＬの水に懸濁された約１０ｇのホエー（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｕ０６３７ＡＬ；８．５７％ｗ／ｗロイシンを含むホエータンパク質粉末）を各サルに強制経口投与した。カニクイザルに、ビヒクル（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．２）又は工学操作ロイシン脱炭酸酵素（配列番号４８４、配列番号６８６、又は配列番号７６６、ビヒクルで希釈した２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇで投与）を、懸濁液（２．５ｍＬ／ｋｇ、７．５～１０ｍＬ／サル）として強制経口投与した。標準食（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｃｈｏｗ ２０５５Ｃ； Ｅｎｖｉｇｏ）を、処理の約８時間後にすべてのサルに与えた。血液を大腿静脈から、投与前に２回（－１．５時間及び－３０分）と投与後５、１５、３０分、及び１、２、４、８、１２、及び２４時間に採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳで、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニン、及びチロシンのレベルをそれぞれの標準曲線（ＬＯＱ：それぞれ４、８、８．５、６、７、及び１１μＭ）に対して分析した。
【0303】
ホエー食を強制経口投与し、その直後にビヒクルを投与すると、ロイシン濃度が上昇し、４時間の時点で最大値約１１６５μＭに達した。ホエータンパク質食直後にＬＤＣで処理すると、すべての変種で血漿ロイシンの急上昇が抑制され、経時的データ（図４Ａ～４Ｃ）とＡＵＣ（図４Ｄ）の両方で、より進化した変種において抑制が強化されることが示された。ＬＤＣ変種の血漿ロイシンの減少も表１５－１に示されている。
【表15-1】
【0304】
ホエータンパク質食は評価した他のアミノ酸の急上昇を引き起こしたが、ＬＤＣはどの用量でも抑制を引き起こさなかった。検査したいくつかの追加のアミノ酸の平均ＡＵＣ±ＳＥＭのデータは、表１５－２、１５－３、及び１５－４に示されている。
【表15-2】
【表15-3】
【表15-4】
【0305】
実施例７
健康なカニクイザルにおける配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドを用いた薬力学的（ＰＤ）用量反応さらに及び３日間の反復投与試験
１０匹の雄カニクイザルを投与前に一晩絶食させた。２０ｍＬの水に懸濁された約１０ｇのホエー（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｕ０６３７ＡＬ；８．５７％ｗ／ｗロイシンを含むホエータンパク質粉末）を各サルに強制経口投与した。カニクイザルに、ビヒクル（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．２）又は配列番号７６６のＬＤＣ（６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇ、ビヒクルで希釈）を懸濁液（２．５ｍＬ／ｋｇ、７．５～１０ｍＬ／サル）として強制経口投与した。標準食（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ５０４８； ＰＭＩ）は、投与の約８時間後にすべてのサルに与えた。血液を大腿静脈から、投与前、及び次に、投与後５、１５、３０分、１、２、４、８、１２、及び２４時間に採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳにより、ロイシン、ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニンのレベルをそれぞれの標準曲線（ＬＯＱ：それぞれ１５、１０、１０、１５、５、１０μＭ）に対して分析した。
健康なカニクイザルにおける配列番号７６６のＬＤＣポリペプチドを用いた薬力学的（ＰＤ）用量反応さらに及び３日間の反復投与試験
１０匹の雄カニクイザルを投与前に一晩絶食させた。２０ｍＬの水に懸濁された約１０ｇのホエー（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｕ０６３７ＡＬ；８．５７％ｗ／ｗロイシンを含むホエータンパク質粉末）を各サルに強制経口投与した。カニクイザルに、ビヒクル（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．２）又は配列番号７６６のＬＤＣ（６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇ、ビヒクルで希釈）を懸濁液（２．５ｍＬ／ｋｇ、７．５～１０ｍＬ／サル）として強制経口投与した。標準食（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ５０４８； ＰＭＩ）は、投与の約８時間後にすべてのサルに与えた。血液を大腿静脈から、投与前、及び次に、投与後５、１５、３０分、１、２、４、８、１２、及び２４時間に採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳにより、ロイシン、ケトイソカプロン酸（ＫＩＣ）、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニンのレベルをそれぞれの標準曲線（ＬＯＱ：それぞれ１５、１０、１０、１５、５、１０μＭ）に対して分析した。
【0306】
ホエー食を強制経口投与し、その直後にビヒクルを投与すると、ロイシンとＫＩＣレベルが上昇し、２時間の時点でそれぞれ最大約８７７と７７μＭになった。ホエータンパク質食直後に配列番号７６６のＬＤＣを処理すると、バックグラウンドを差し引いた経時的データ（図５Ａと５Ｃ）とｉＡＵＣ（図５Ｂと５Ｄ及び表１６－１）の両方において、血漿ロイシンとＫＩＣの急上昇がすべての用量で有意に抑制された。
【表16-1】
【0307】
タンパク質食は評価した他のアミノ酸の増加をもたらしたが、ＬＤＣはどの用量でも抑制を誘導しなかった。検査したいくつかのアミノ酸の平均ｉＡＵＣは表１６－２に示されている。
【表16-2】
【0308】
３週間のウォッシュアウト後、１０匹のカニクイザルすべてを再度、無作為に２つのグループに分け、毎日の投与の前に一晩絶食させた。２０ｍＬの水に懸濁された約１０ｇのホエータンパク質食を各サルに強制経口投与した。カニクイザルに、ビヒクル（２０ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．２）又は配列番号７６６のＬＤＣ（２５ｍｇ／ｋｇ、ビヒクルで希釈）を懸濁液（２．５ｍＬ／ｋｇ、７．５～１０ｍＬ／サル）として強制経口投与した。処理の約８時間後に、標準食（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ５０４８； ＰＭＩ）をすべてのサルに与えた。このプロトコールは３日間連続して繰り返され、カニクイザルは試験全体を通じて同じグループの指定を維持した。各投与日には、投与前、投与後１、２、４、８、１２、及び２４時間（３日目のみ）に大腿静脈から血液を採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳにより分析し、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、及びフェニルアラニンのレベルをそれぞれの標準曲線（ＬＯＱ：それぞれ１５、１０、１５、５、及び１０μＭ）に対して分析した。
【0309】
ホエー食を強制経口投与し、その直後にビヒクルを投与すると、各日の投与後２時間にロイシンが同様に増加した（図６Ａ）。ホエータンパク質食の直後に配列番号７６６のＬＤＣで処理すると、すべての日に血漿ロイシンが有意に抑制された。反復投与により、ビヒクルと処理ベースラインとの分離が拡大することが観察され（２日目と３日目の投与前の値、図６Ａ）、相加効果を示唆していた。ＡＵＣデータ（図６Ｂ）も処理の相加効果を裏付けており、最大の減少は３日目（４７％）に観察されたのに対し、１日目と２日目にはそれぞれ３２％と３４％であった。反復食事刺激投与によるベースラインの違いをより適切に評価するために、毎日のデータを、１日目の食事前の値をベースラインとして差し引くことによって再分析した（図６Ｃと６Ｄ）。正規化により、ビヒクル群では食事刺激投与を繰り返すとベースラインが上昇するが、処理群のベースラインは１日目の食事前ベースラインに向かって減少し続けることがより明確になった（図６Ｃ）。処理の最大の効果は、食事刺激投与の３日目に再び見られた（図６Ｄ）。表１６－３には、ビヒクルと比較して血漿ロイシンの減少％も示される。
【表16-3】
【0310】
タンパク質食は３日間すべてで評価した他のアミノ酸の増加をもたらしたが、ＬＤＣは連続投与の３日目にのみ有意な抑制を引き起こした（図７Ａ及び７Ｂ）。検査した追加のアミノ酸の平均ｉＡＵＣ±ＳＥＭは表１６－４に示される。
【表16-4】
【0311】
実施例８
中間型ＭＳＵＤマウスモデルにおける配列番号８２８のＬＤＣの薬力学的（ＰＤ）用量反応試験
中間型メープルシロップ尿症（ｉＭＳＵＤ；Ｄｂｔｔｍ１ＧｅｈＴｇ（Ｃｅｂｐｂ－ｔＴＡ）５Ｂｊｄ Ｔｇ（ｔｅｔＯ－ＤＢＴ）Ａ１Ｇｅｈ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ ＃００６９９９）マウスを、健康を増進し、生存期間を延ばすために、離乳時にロイシン制限（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ ＃Ａ０５０８０２０２ｉ、５．７５ｇ／Ｌロイシンを補足したロイシンを含まない食事、Ｓｉｇｍａ ＃Ｌ８９１２）に供した。ｉＭＳＵＤマウスが体重（ＢＷ）約２０ｇに達したとき、１４匹のマウスは無作為に試験グループに分けられた（雌雄混合、２～４．７か月齢）。試験期間中、マウスはロイシンを含まない食事とロイシン補足水を自由に摂取できた。１００μＬの水に懸濁された約４５ｍｇのホエー（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｘ０１０１０ＡＬ０Ｒ；８．６１３％ｗ／ｗのロイシン、０％の遊離アミノ酸を含む）を、各マウスに強制経口投与した。ホエータンパク質食後、マウスに、ビヒクル（１ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．５）又は酵素（配列番号８２８、２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇで投与、ＰＬＰなしのビヒクルで希釈）のいずれかを強制経口投与した。試験計画は、間に２週間のウォッシュアウトを挟んだ２相クロスオーバーに従った。血液は、予定された時点（投与前３０分、投与後３０、６０、１２０、及び２４０分）で尾静脈から採取された。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析し、標準曲線（範囲：２～３０５０ｍＭ；ＬＯＱ：２μＭ）を使用してロイシンレベルを測定し、有効性を評価した。
中間型ＭＳＵＤマウスモデルにおける配列番号８２８のＬＤＣの薬力学的（ＰＤ）用量反応試験
中間型メープルシロップ尿症（ｉＭＳＵＤ；Ｄｂｔｔｍ１ＧｅｈＴｇ（Ｃｅｂｐｂ－ｔＴＡ）５Ｂｊｄ Ｔｇ（ｔｅｔＯ－ＤＢＴ）Ａ１Ｇｅｈ／Ｊ、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ ＃００６９９９）マウスを、健康を増進し、生存期間を延ばすために、離乳時にロイシン制限（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ ＃Ａ０５０８０２０２ｉ、５．７５ｇ／Ｌロイシンを補足したロイシンを含まない食事、Ｓｉｇｍａ ＃Ｌ８９１２）に供した。ｉＭＳＵＤマウスが体重（ＢＷ）約２０ｇに達したとき、１４匹のマウスは無作為に試験グループに分けられた（雌雄混合、２～４．７か月齢）。試験期間中、マウスはロイシンを含まない食事とロイシン補足水を自由に摂取できた。１００μＬの水に懸濁された約４５ｍｇのホエー（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｘ０１０１０ＡＬ０Ｒ；８．６１３％ｗ／ｗのロイシン、０％の遊離アミノ酸を含む）を、各マウスに強制経口投与した。ホエータンパク質食後、マウスに、ビヒクル（１ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．５）又は酵素（配列番号８２８、２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇで投与、ＰＬＰなしのビヒクルで希釈）のいずれかを強制経口投与した。試験計画は、間に２週間のウォッシュアウトを挟んだ２相クロスオーバーに従った。血液は、予定された時点（投与前３０分、投与後３０、６０、１２０、及び２４０分）で尾静脈から採取された。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析し、標準曲線（範囲：２～３０５０ｍＭ；ＬＯＱ：２μＭ）を使用してロイシンレベルを測定し、有効性を評価した。
【0312】
ホエータンパク質食及びビヒクルの投与後、血漿ロイシンレベルの有意な増加が観察された。ホエー食直後のＬＤＣによる処理は、経時的データ及び曲線下面積の両方において、用量依存的にロイシンの急上昇を有意に抑制した。具体的には、投与後のすべての時点で、ビヒクルと比較して１００ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇの用量で統計的に有意な抑制があった（図８Ａ）。同様に、曲線下面積の漸増（ｉＡＵＣ）データは、配列番号８２８の５０及び１００ｍｇ／ｋｇの処理でそれぞれ４０％及び５４％の血漿ロイシンの有意な抑制を示した（図８Ｂ、表１７）。イソロイシン、バリン、メチオニン、又はフェニルアラニンの血漿レベルには、処理の統計的に有意な効果（ｉＡＵＣ）は観察されなかった（表１７）。統計計算と有意性はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用して決定された。
【表17】
【0313】
実施例９
健康なカニクイザルにおける配列番号８２８の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験
１２匹の雄カニクイザルを投与前に一晩絶食させた。２０ｍＬの水に懸濁された約１０ｇのホエータンパク質粉末（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｕ０６３７６ＡＬ；８．６３％ｗ／ｗロイシンを含む）を各サルに強制経口投与した。カニクイザルに、ビヒクル（１ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．５）又は酵素（配列番号８２８、ＰＬＰなしのビヒクルで希釈した６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇで投与）を懸濁液（２．５ｍＬ／ｋｇ）として強制経口投与した。この試験計画は、間に１週間のウォッシュアウトを挟んだ２段階のクロスオーバーとした。標準食（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ５０４８， ＰＭＩ Ｉｎｃ．）は、処理の約８時間後にすべてのカニクイザルに与えた。血液を大腿静脈から、投与前に２回（１時間及び２時間）、及び次に投与後５、１５、及び３０分、並びに投与後１、２、４、８、及び２４時間に採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、及びメチオニンのレベルをそれぞれの標準曲線（ＬＯＱ：それぞれ４、８、８．５、６、及び７μＭ）に対して分析した。
健康なカニクイザルにおける配列番号８２８の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験
１２匹の雄カニクイザルを投与前に一晩絶食させた。２０ｍＬの水に懸濁された約１０ｇのホエータンパク質粉末（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｕ０６３７６ＡＬ；８．６３％ｗ／ｗロイシンを含む）を各サルに強制経口投与した。カニクイザルに、ビヒクル（１ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．５）又は酵素（配列番号８２８、ＰＬＰなしのビヒクルで希釈した６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇで投与）を懸濁液（２．５ｍＬ／ｋｇ）として強制経口投与した。この試験計画は、間に１週間のウォッシュアウトを挟んだ２段階のクロスオーバーとした。標準食（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ５０４８， ＰＭＩ Ｉｎｃ．）は、処理の約８時間後にすべてのカニクイザルに与えた。血液を大腿静脈から、投与前に２回（１時間及び２時間）、及び次に投与後５、１５、及び３０分、並びに投与後１、２、４、８、及び２４時間に採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、及びメチオニンのレベルをそれぞれの標準曲線（ＬＯＱ：それぞれ４、８、８．５、６、及び７μＭ）に対して分析した。
【0314】
ホエー食を強制経口投与し、その直後にビヒクルを投与すると、ロイシン濃度が上昇した。ホエータンパク質食直後にＬＤＣで処理すると、用量依存的に血漿ロイシンの急上昇が抑制され、経時的データでは２５ｍｇ／ｋｇで統計的に有意な抑制が示された（図９Ａ）。これはまた、１２．５ｍｇ／ｋｇ（２４％）及び２５ｍｇ／ｋｇ（３７％）で血漿ロイシンｉＡＵＣが統計的に有意に抑制された（図９Ｂ）。ホエータンパク質食は評価した他のアミノ酸の急上昇を引き起こしたが、ＬＤＣは、イソロイシン、バリン、メチオニン、又はフェニルアラニンの血漿レベルのｉＡＵＣに統計的に有意な影響を誘導しなかった（表１８）。統計計算及び有意性はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用して決定した。
【表18】
【0315】
実施例１０
健康なカニクイザルにおける配列番号８２８の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験の確認
１５匹の雄カニクイザルを投与前に一晩絶食させた。２０ｍＬの水に懸濁された約１０ｇのホエータンパク質粉末（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｘ０１０１０ＡＬ０Ｒ；８．６３％ｗ／ｗロイシンを含む）を各サルに強制経口投与した。カニクイザルに、ビヒクル（１ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．５）又は酵素（配列番号８２８、ＰＬＰなしのビヒクルで希釈した３．１２５、６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇで投与）を懸濁液（２．５ｍＬ／ｋｇ）として強制経口投与した。この試験計画は、間に１週間のウォッシュアウトを挟んだ２段階のクロスオーバーとした。標準食（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ５０４８， ＰＭＩ Ｉｎｃ．）は、処理の約８時間後にすべてのサルに与えた。血液を大腿静脈から、投与前に２回（１時間及び２時間）、及び次に投与後５、１５、及び３０分、並びに投与後１、２、４、８、及び２４時間に採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、及びメチオニンのレベルをそれぞれの標準曲線（ＬＯＱ：それぞれ４、８、８．５、６、及び７μＭ）に対して分析した。
健康なカニクイザルにおける配列番号８２８の薬力学的（ＰＤ）用量反応試験の確認
１５匹の雄カニクイザルを投与前に一晩絶食させた。２０ｍＬの水に懸濁された約１０ｇのホエータンパク質粉末（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｘ０１０１０ＡＬ０Ｒ；８．６３％ｗ／ｗロイシンを含む）を各サルに強制経口投与した。カニクイザルに、ビヒクル（１ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．５）又は酵素（配列番号８２８、ＰＬＰなしのビヒクルで希釈した３．１２５、６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇで投与）を懸濁液（２．５ｍＬ／ｋｇ）として強制経口投与した。この試験計画は、間に１週間のウォッシュアウトを挟んだ２段階のクロスオーバーとした。標準食（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ５０４８， ＰＭＩ Ｉｎｃ．）は、処理の約８時間後にすべてのサルに与えた。血液を大腿静脈から、投与前に２回（１時間及び２時間）、及び次に投与後５、１５、及び３０分、並びに投与後１、２、４、８、及び２４時間に採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、及びメチオニンのレベルをそれぞれの標準曲線（ＬＯＱ：それぞれ４、８、８．５、６、及び７μＭ）に対して分析した。
【0316】
ホエー食を強制経口投与し、その直後にビヒクルを投与すると、ロイシン濃度が上昇した。ホエータンパク質食直後にＬＤＣで処理すると、用量依存的に血漿ロイシンの急上昇が抑制され、投与後１時間及び２時間の経時的データでは６．２５、１２．５、及び２５ｍｇ／ｋｇで統計的に有意な抑制が示された（図１０Ａ）。同様に、これは、６．２５ｍｇ／ｋｇ（３８％）、１２．５ｍｇ／ｋｇ（３５％）、及び２５ｍｇ／ｋｇ（４３％）で、血漿ロイシンｉＡＵＣの統計的に有意な抑制をもたらした（図１０Ｂ）。ＬＤＣ処理は、ＫＩＣも用量依存的に抑制し、２５ｍｇ／ｋｇ用量で統計的有意に達した（図１０Ｃ）。ホエータンパク質食は評価した他のアミノ酸の急上昇を引き起こしたが、ＬＤＣは、処理によるイソロイシン、バリン、メチオニン、又はフェニルアラニンのｉＡＵＣに統計的に有意な影響を及ぼさなかった（表１９）。統計計算と有意性はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用して決定した。
【表19】
【0317】
実施例１１
健康なカニクイザルにおける配列番号８２８による３日間の薬力学的（ＰＤ）反復投与試験
１２匹の雄カニクイザルを２つのグループ（ｎ＝６）に分け、３日間反復投与試験計画で、毎日の投与の前に一晩絶食させた。２０ｍＬの水に懸濁された約１０ｇのホエータンパク質食（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｘ０１０１０ＡＬ０Ｒ；８．６３％ｗ／ｗロイシンを含む）を各サルに強制経口投与した。カニクイザルに、ビヒクル（１ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．５）又は配列番号８２８（ＰＬＰなしのビヒクルで希釈した６．２５ｍｇ／ｋｇ）を懸濁液（２．５ｍＬ／ｋｇ）として強制経口投与した。標準食（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ５０４８， ＰＭＩ Ｉｎｃ．）は、処理の約８時間後にすべてのサルに与えた。このプロトコールは３日間連続して繰り返され、カニクイザルは試験中ずっと同じグループの指定を維持した。各投与日に、投与前１時間、並びに次に投与後１、２、４、８、１２、及び２４時間（３日目のみ）に、血液を大腿静脈から採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、及びフェニルアラニンのレベルをそれぞれの標準曲線（ＬＯＱ：それぞれ１５、１０、１５、５、及び１０μＭ）に対して分析した。
健康なカニクイザルにおける配列番号８２８による３日間の薬力学的（ＰＤ）反復投与試験
１２匹の雄カニクイザルを２つのグループ（ｎ＝６）に分け、３日間反復投与試験計画で、毎日の投与の前に一晩絶食させた。２０ｍＬの水に懸濁された約１０ｇのホエータンパク質食（Ｇｒａｓｓ Ｆｅｄ Ｗｈｅｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ； ＢＮ Ｌａｂｓ ロット番号Ｘ０１０１０ＡＬ０Ｒ；８．６３％ｗ／ｗロイシンを含む）を各サルに強制経口投与した。カニクイザルに、ビヒクル（１ｍＭリン酸ナトリウム＋０．４ｍＭ ＰＬＰ、ｐＨ７．５）又は配列番号８２８（ＰＬＰなしのビヒクルで希釈した６．２５ｍｇ／ｋｇ）を懸濁液（２．５ｍＬ／ｋｇ）として強制経口投与した。標準食（Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｄｉｅｔ ５０４８， ＰＭＩ Ｉｎｃ．）は、処理の約８時間後にすべてのサルに与えた。このプロトコールは３日間連続して繰り返され、カニクイザルは試験中ずっと同じグループの指定を維持した。各投与日に、投与前１時間、並びに次に投与後１、２、４、８、１２、及び２４時間（３日目のみ）に、血液を大腿静脈から採取した。採取した血液試料から血漿を抽出し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、及びフェニルアラニンのレベルをそれぞれの標準曲線（ＬＯＱ：それぞれ１５、１０、１５、５、及び１０μＭ）に対して分析した。
【0318】
ホエー食を強制経口投与し、その直後にビヒクルを投与すると、各日とも投与後１～２時間にロイシンが同様に増加した（図１１Ａ）。ホエータンパク質食直後に配列番号８２８で処理すると、同様にすべての日に時間の経過とともに血漿ロイシンが抑制されたが、統計的有意には達しなかった。ＬＤＣは、２日目にｉＡＵＣデータで血漿ロイシンとＫＩＣの有意な抑制を引き起こした（表２０、図１１Ｂ及び図１１Ｃ）。ホエータンパク質食は評価した他のアミノ酸の急上昇を引き起こしたが、ＬＤＣは、イソロイシン、バリン、メチオニン、又はフェニルアラニンのｉＡＵＣに統計的に有意な影響を及ぼさなかった（表２１）。統計計算と有意性はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を使用して決定した。
【表20】
【表21】
【0319】
本発明は特定の実施態様を参照して説明されているが、特定の状況、材料、組成物、プロセス、プロセス工程に適応するために、さまざまな変更を加えたり、同等のものを置き換えたりすることができ、それによって、請求の範囲から逸脱することなく、本発明の利点を達成することができる。
【0320】
あらゆる目的のために、本開示で引用されているすべての刊行物及び特許文書は、そのような各刊行物又は文書は具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれていかのように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物及び特許文献の引用は、そのような文書が、関連する先行技術であることを、またその内容又は日付の承認を構成することを示すことを意図するものではない。
付録
付録
【表1-2】
【表2.1-1】
【表2.1-2】
【表2.1-3】
【表3-2-1】
【表3-2-2】
【表4-1-1】
【表4-1-2】
【表4-1-3】
【表4-1-4】
【表5-1-1】
【表5-1-2】
【表5-1-3】
【表6-1-1】
【表6-1-2】
【表6-1-3】
【表6-1-4】
【表6-1-5】
【表6-1-6】
【表7-1-1】
【表7-1-2】
【表8-1-1】
【表8-1-2】
【表8-1-3】
【表8-2-1】
【表8-2-2】
【表10-1】
【表11-1-1】
【表11-1-2】
【表11-1-3】
【表11-2-1】
【表11-2-2】
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【配列表】
【国際調査報告】