▶ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズの特許一覧
特表2024-540360グリピカン－３（ＧＰＣ３）を標的にするＩｇＧ４ヒンジ含有キメラ抗原受容体およびその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】グリピカン－３（ＧＰＣ３）を標的にするＩｇＧ４ヒンジ含有キメラ抗原受容体およびその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241024BHJP
C07K 14/725 20060101ALI20241024BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241024BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20241024BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241024BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241024BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20241024BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20241024BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241024BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20241024BHJP
A61P 35/04 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28
C07K14/725 ZNA
C07K19/00
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N5/10
C12N15/867 Z
A61P35/00
A61K39/395 E
A61K39/395 T
A61K35/17
A61K35/76
A61K48/00
A61K31/7088
A61P35/04
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024526841
(86)(22)【出願日】2022-11-09
(85)【翻訳文提出日】2024-07-04
(86)【国際出願番号】 US2022079554
(87)【国際公開番号】W WO2023086829
(87)【国際公開日】2023-05-19
(31)【優先権主張番号】63/277,287
(32)【優先日】2021-11-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514144836
【氏名又は名称】ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ホー， ミッチェル
(72)【発明者】
【氏名】コルーリ， アーティ
(72)【発明者】
【氏名】リー， ナン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AA94X
4B065AA97Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA13
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB26
4C085AA13
4C085AA14
4C085CC01
4C085CC08
4C085DD62
4C085EE01
4C085EE03
4C085GG01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA03
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087BC83
4C087MA02
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB26
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA50
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
グリピカン－３（ＧＰＣ３）を標的にし、かつヒトＩｇＧ４由来の１２－アミノ酸ヒンジ領域を有する、最適化されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を記載する。また、最適化されたＣＡＲは、ＣＤ８またはＣＤ２８のいずれか由来の膜貫通ドメイン、細胞内共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。最適化されたＣＡＲを発現する免疫細胞または誘導多能性幹細胞を使用して、ＧＰＣ３陽性固形腫瘍を処置することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、グリピカン－３（ＧＰＣ３）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメイン；
配列番号４３または配列番号５２に記載のＩｇＧ４ヒンジ領域からなるヒンジ領域；
膜貫通ドメイン；
細胞内共刺激ドメイン；および
細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項2】
前記細胞外抗原結合ドメインが、ＧＰＣ３特異的単一ドメイン抗体を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項3】
前記単一ドメイン抗体が、配列番号１８の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む、請求項２に記載のＣＡＲ。
【請求項4】
前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号１８の残基３１～３５、５０～６５、および９６～１０５；または
配列番号１８の残基２６～３３、５１～５７、および９６～１０５
を含む、請求項３に記載のＣＡＲ。
【請求項5】
前記単一ドメイン抗体のアミノ酸配列が、配列番号１８に対して少なくとも９０％同一であり、かつ配列番号１８の前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む、請求項３または請求項４に記載のＣＡＲ。
【請求項6】
前記単一ドメイン抗体のアミノ酸配列が、配列番号１８を含むか、配列番号１８からなる、請求項２～５のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項7】
前記抗原結合ドメインがＧＰＣ３特異的ｓｃＦｖを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
【請求項8】
前記ｓｃＦｖが、重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、前記ＶＨドメインが、配列番号２０の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、前記ＶＬドメインが、配列番号２２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む、請求項７に記載のＣＡＲ。
【請求項9】
前記ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２０の残基３１～３５、５０～６８、および１０１～１０６を含み、前記ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２２の残基２４～４０、５６～６２、および９５～１０３を含む；あるいは、前記ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２０の残基２６～３３、５１～６０、および９９～１０６を含み、前記ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列が、それぞれ、配列番号２２の残基２７～３８、５６～５８、および９５～１０３を含む、請求項８に記載のＣＡＲ。
【請求項10】
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号２０に対して少なくとも９０％同一であり、かつ配列番号２０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む；そして前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号２２に対して少なくとも９０％同一であり、かつ配列番号２２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む、請求項８または請求項９に記載のＣＡＲ。
【請求項11】
前記ＶＨドメインのアミノ酸配列が、配列番号２０を含むか、配列番号２０からなる；そして前記ＶＬドメインのアミノ酸配列が、配列番号２２を含むか、配列番号２２からなる、請求項８～１０のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項12】
前記ｓｃＦｖのアミノ酸配列が、配列番号１４の残基１～２４５を含む、請求項８～１１のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項13】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項14】
前記共刺激ドメインが、４－１ＢＢシグナル伝達部分を含む、請求項１～１３のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項15】
前記シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載のＣＡＲ。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか１項に記載のＣＡＲを発現する単離された細胞。
【請求項17】
免疫細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１６に記載の単離された細胞。
【請求項18】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはマクロファージである、請求項１７に記載の単離された細胞。
【請求項19】
請求項１～１５のいずれか１項に記載のＣＡＲをコードする核酸分子。
【請求項20】
プロモーターに作動可能に連結された請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項21】
５’から３’への方向に、第１の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体シグナル配列（ＧＭＣＳＦＲｓｓ）をコードする核酸；
前記抗原結合ドメインをコードする核酸；
前記ＩｇＧ４ヒンジ領域をコードする核酸；
前記膜貫通ドメインをコードする核酸；
前記共刺激ドメインをコードする核酸；
前記シグナル伝達ドメインをコードする核酸；
自己切断２Ａペプチドをコードする核酸；
第２のＧＭＣＳＦＲｓｓをコードする核酸；および
短縮ヒト上皮増殖因子受容体（ｈｕＥＧＦＲｔ）をコードする核酸
を含む、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項22】
前記第１のＧＭＣＳＦＲｓｓをコードする前記核酸の５’側にヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター配列をさらに含む、請求項２１に記載の核酸分子。
【請求項23】
請求項１９～２２のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項24】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２３に記載のベクター。
【請求項25】
請求項１９～２２のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項２３もしくは請求項２４に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項26】
免疫細胞または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項２５に記載の単離された細胞。
【請求項27】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージである、請求項２６に記載の単離された細胞。
【請求項28】
薬学的に許容され得る担体および請求項１～１５のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項１６～１８および２５～２７のいずれか１項に記載の細胞、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項２３もしくは請求項２４に記載のベクターを含む組成物。
【請求項29】
被験体におけるＧＰＣ３陽性癌を処置する方法であって、治療有効量の請求項１～１５のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項１６～１８および２５～２７のいずれか１項に記載の細胞、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項２３もしくは請求項２４に記載のベクター、または請求項２８に記載の組成物を前記被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項30】
被験体におけるＧＰＣ３陽性癌の腫瘍成長または転移を阻害する方法であって、治療有効量の請求項１～１５のいずれか１項に記載のＣＡＲ、請求項１６～１８および２５～２７のいずれか１項に記載の細胞、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項２３もしくは請求項２４に記載のベクター、または請求項２８に記載の組成物を前記被験体に投与する工程を含む、方法。
【請求項31】
前記ＧＰＣ３陽性癌が固形腫瘍である、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記ＧＰＣ３陽性癌が、肝細胞癌（ＨＣＣ）、黒色腫、卵巣明細胞癌、卵黄嚢腫瘍（ＹＳＴ）、神経芽細胞腫、肝芽腫、ウィルムス腫瘍、肺の扁平上皮癌、精巣非セミノーマ性胚細胞腫瘍、脂肪肉腫、子宮頸部上皮内新形成、副腎の腺腫、シュワン細胞腫、または胎児性腫瘍である、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記ＧＰＣ３陽性癌がＨＣＣである、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年１１月９日出願の米国仮出願第６３／２７７，２８７号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に基づく利益を主張している。
本出願は、２０２１年１１月９日出願の米国仮出願第６３／２７７，２８７号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に基づく利益を主張している。
【0002】
分野
本開示は、ＩｇＧ４由来のヒンジ領域を含む腫瘍抗原グリピカン－３（ＧＰＣ３）に特異的な最適化されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。本開示は、さらに、固形腫瘍の処置のためなどのＧＰＣ３標的化ＩｇＧ４ヒンジ含有ＣＡＲの使用に関する。
本開示は、ＩｇＧ４由来のヒンジ領域を含む腫瘍抗原グリピカン－３（ＧＰＣ３）に特異的な最適化されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。本開示は、さらに、固形腫瘍の処置のためなどのＧＰＣ３標的化ＩｇＧ４ヒンジ含有ＣＡＲの使用に関する。
【0003】
政府支援の謝辞
本発明を、国立衛生研究所によって授与されたプロジェクト番号Ｚ０１ ＢＣ０１０８９１の下で政府支援を受けて実施した。政府は、本発明において一定の権利を有する。
本発明を、国立衛生研究所によって授与されたプロジェクト番号Ｚ０１ ＢＣ０１０８９１の下で政府支援を受けて実施した。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【0004】
背景
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、予後が不良な高侵襲型の腫瘍である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）操作Ｔリンパ球を使用した免疫療法は、造血性悪性疾患において顕著に応答している。しかしながら、固形腫瘍の場合、臨床的な成功には大きな障壁がある。ほとんどの固形腫瘍における主な障壁は、癌細胞上および正常組織上の両方のバイオマーカー発現が広範であるために、毒性が高いことである。最も特徴づけられている腫瘍関連抗原の１つであるグリピカン３（ＧＰＣ３）はＨＣＣに高度に特異的であるため、これはＨＣＣには当てはまらない。ＧＰＣ３（細胞表面腫瘍胎児性タンパク質）は、ＨＣＣで高度に上方制御されるが、正常組織中で発現されないか、低レベルで発現される。したがって、ＧＰＣ３を標的にすると、治療薬を正常組織ではなくＨＣＣ部位に排他的に送達させることが独自に可能である。
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、予後が不良な高侵襲型の腫瘍である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）操作Ｔリンパ球を使用した免疫療法は、造血性悪性疾患において顕著に応答している。しかしながら、固形腫瘍の場合、臨床的な成功には大きな障壁がある。ほとんどの固形腫瘍における主な障壁は、癌細胞上および正常組織上の両方のバイオマーカー発現が広範であるために、毒性が高いことである。最も特徴づけられている腫瘍関連抗原の１つであるグリピカン３（ＧＰＣ３）はＨＣＣに高度に特異的であるため、これはＨＣＣには当てはまらない。ＧＰＣ３（細胞表面腫瘍胎児性タンパク質）は、ＨＣＣで高度に上方制御されるが、正常組織中で発現されないか、低レベルで発現される。したがって、ＧＰＣ３を標的にすると、治療薬を正常組織ではなくＨＣＣ部位に排他的に送達させることが独自に可能である。
【0005】
ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞は、第１相臨床試験において有効性が制限されることが実証されており、これは、適切な腫瘍浸潤の欠如および腫瘍の範囲内で持続的で強力な免疫応答を誘導できないことの両方に起因する可能性が高い。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける効力が改善されたＣＡＲ Ｔ細胞を開発する必要がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
要旨
ヒトＩｇＧ４由来のヒンジ領域およびヒトＣＤ８またはヒトＣＤ２８のいずれかに由来する膜貫通ドメインを含む最適化されたＧＰＣ３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を本明細書中に開示する。ＧＰＣ３を標的にするＩｇＧ４－ヒンジ含有ＣＡＲがＧＰＣ３陽性細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に溶解し、動物モデルにおいてＧＰＣ３陽性腫瘍の根絶に非常に有効であることを本明細書中に実証する。
ヒトＩｇＧ４由来のヒンジ領域およびヒトＣＤ８またはヒトＣＤ２８のいずれかに由来する膜貫通ドメインを含む最適化されたＧＰＣ３特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を本明細書中に開示する。ＧＰＣ３を標的にするＩｇＧ４－ヒンジ含有ＣＡＲがＧＰＣ３陽性細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に溶解し、動物モデルにおいてＧＰＣ３陽性腫瘍の根絶に非常に有効であることを本明細書中に実証する。
【0007】
ＧＰＣ３に特異的な細胞外抗原結合ドメイン；ＩｇＧ４ヒンジ領域；膜貫通ドメイン；細胞内共刺激ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを本明細書中に提供する。いくつかの態様では、ＣＡＲは、配列番号４３に記載の改変されたＩｇＧ４ヒンジ配列からなるヒンジ領域を含む。他の態様では、ＣＡＲは、配列番号５２に記載の野生型ＩｇＧ４配列からなるヒンジ領域を含む。いくつかの態様では、抗原結合ドメインは、ＧＰＣ３特異的単一ドメイン抗体ＨＮ３のＣＤＲ配列またはＧＰＣ３特異的抗体ｈＹＰ７、ＹＰ７、ＹＰ９、ＹＰ８、ＹＰ６、ＹＰ９．１、もしくはＨＳ２０のＶＨおよびＶＬのＣＤＲ配列を含む。いくつかの例では、ＣＡＲの膜貫通ドメインはＣＤ２８膜貫通ドメインである。他の例では、ＣＡＲの膜貫通ドメインはＣＤ８膜貫通ドメインである。
【0008】
開示のＣＡＲをコードする核酸分子をさらに提供する。いくつかの態様では、核酸分子は、５’から３’方向に、第１の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体シグナル配列（ＧＭＣＳＦＲｓｓ）をコードする核酸；抗原結合ドメインをコードする核酸；ＩｇＧ４ヒンジ領域をコードする核酸；膜貫通ドメインをコードする核酸；共刺激ドメインをコードする核酸；シグナル伝達ドメインをコードする核酸；自己切断２Ａペプチドをコードする核酸；第２のＧＭＣＳＦＲｓｓをコードする核酸；および短縮ヒト上皮増殖因子受容体（ｈｕＥＧＦＲｔ）をコードする核酸を含む。いくつかの例では、核酸分子は、第１のＧＭＣＳＦＲｓｓをコードする核酸の５’側にヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター配列をさらに含む。開示の核酸分子を含むベクター（レンチウイルスベクターなど）をさらに開示する。
【0009】
本明細書中に開示のＣＡＲを発現し、そして／あるいは本明細書中に開示の単離された核酸分子またはベクターを含む単離された免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）および誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）も提供する。
【0010】
本明細書中に開示の薬学的に許容され得る担体およびＣＡＲ、核酸分子、ベクター、または細胞を含む組成物をさらに提供する。
【0011】
被験体におけるＧＰＣ３陽性癌を処置するか、あるいは、ＧＰＣ３陽性癌の腫瘍成長または転移を阻害する方法も提供する。いくつかの態様では、この方法は、治療有効量の本明細書中に開示のＣＡＲ、核酸分子、ベクター、細胞、または組成物を被験体に投与する工程を含む。いくつかの例では、ＧＰＣ３陽性癌は、肝細胞癌（ＨＣＣ）などの固形腫瘍である。
【0012】
本開示の前述および他の目的および特徴は、添付の図面を参照して進めていく以下の詳細な説明からより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【図1A】図１Ａ～１Ｂ：Ｊｕｒｋａｔ結合アッセイ。ｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、またはＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ２８ＴＭのＣＡＲを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ＧＰＣ３－ｈＦｃ（図１Ａ）またはＧＰＣ１－ｈＦｃ（図１Ｂ）に曝露した。全てのｈＹＰ７およびＨＮ３ ＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＧＰＣ３－ｈＦｃに特異的に結合した。
【図1B】同上。
【図2A】図２Ａ～２Ｄ：（図２Ａ）ＣＡＲ Ｔ細胞構築物の略図。構築物は、ＣＤ８またはＩｇＧ４のヒンジ（Ｈ）、およびＣＤ８またはＣＤ２８の膜貫通（ＴＭ）ドメインを有するＨＮ３またはｈＹＰ７のいずれかを含んでいた。（図２Ｂ）細胞膜中のＣＡＲ Ｔ細胞構築物の描写。（図２Ｃ）１１日間にわたってモニタリングされたＣＡＲ発現細胞の細胞カウント。（図２Ｄ）８日目にＣＡＲ陽性細胞によって測定した場合のＣＡＲ構築物の形質導入効率。これらの結果は、操作されたＣＡＲをドナーＴ細胞中で発現することができることを実証している。
【図2B-C】同上。
【図2D】同上。
【図2E-F】図２Ｅ～２Ｈ：ＧＰＣ３発現ＨＣＣ細胞株Ｈｅｐ３Ｂ（図２Ｅ）、Ｈｕｈ７（図２Ｇ）、およびＨｅｐＧ２（図２Ｈ）またはＧＰＣ３陰性Ｈｅｐ３Ｂ－ＧＰＣ３－ＫＯ－Ｃ３細胞（図２Ｆ）と共に培養したＣＡＲ Ｔ細胞によって誘導された細胞死滅を示すグラフ。特異的溶解を、異なるエフェクター対標的比で測定した。操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞、Ｈｕｈ７細胞、およびＨｅｐＧ２細胞を強力に死滅させたが、Ｈｅｐ３Ｂ ＧＰＣ３ノックアウト（ＫＯ）細胞はそうではなく、これは、抗原特異的死滅であることを実証している。
【図2G-H】同上。
【図3A-B】図３Ａ～３Ｄ：（図３Ａ）ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ガンマ（ＮＳＧ）マウスモデルを使用した実験研究デザインの略図。Ｈｅｐ３Ｂ ＧＦＰ／ルシフェラーゼ発現細胞（３００万個）をＮＳＧマウスにＩＰ注射し、１２日間生着させた。マウスを、０日目に５００万個のｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、ｈＹＰ７－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、またはＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＥ２８ＴＭのＣＡＲ Ｔ細胞で処置し、定期的に画像化した。（図３Ｂ）腫瘍サイズを示す生物発光画像。（図３Ｃ）３５日間にわたる画像化の結果の生物発光定量。（図３Ｄ）研究の全過程にわたる生存曲線。結果は、１０日以内にＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍を完全に根絶し、マウスが研究の全過程にわたって腫瘍を担持しない状態を維持したことを示した。
【図3C-D】同上。
【図4A-B】図４Ａ～４Ｄ：（図４Ａ）ＮＳＧマウスモデルを使用した実験研究デザインの略図。Ｈｅｐ３Ｂ ＧＦＰ／ルシフェラーゼ発現細胞（３００万個）をＮＳＧマウスにＩＰ注射し、１２日間生着させた。マウスを、０日目に５００万個のＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ－Ｍ、またはＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ－ＬのＣＡＲ Ｔ細胞で処置し、定期的に画像化した。（図４Ｂ）腫瘍サイズを示す生物発光画像化の結果。（図４Ｃ）１５日間にわたる画像化の結果の生物発光定量。（図４Ｄ）研究の全過程（６７日間）にわたる生存曲線。結果は、７日以内にＨＮ３－ＩｇＧ４－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍を消失させ、処置マウスが研究期間にわたって腫瘍を担持しない状態を維持したことを示した。さらに、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、最も高い生存率を示し、この群のおよそ４０％のマウスが少なくとも６７日間の研究期間にわたって生存し、腫瘍を担持しない状態を維持した。
【図4C-D】同上。
【図5A-B】図５Ａ～５Ｆ：（図５Ａ～５Ｂ）ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞およびＴ細胞サブセットの分析。Ｔ細胞サブセットは、幹細胞メモリー細胞（Ｔｓｃｍ）、セントラルメモリー細胞（Ｔｃｍ）、エフェクターメモリー再発現ＣＤ４５ＲＡ細胞（Ｔｅｍｒａ）、およびエフェクターメモリー細胞（Ｔｅｍ）からなる。（図５Ａ）２週目では、Ｔ細胞は、ＣＤ４／ＣＤ８比が類似していた。ＴｅｍｒａおよびＴｅｍは、Ｔ細胞ランドスケープにおいて優位であった。（図５Ｂ）５週目では、ＣＤ８ Ｔ細胞が最も豊富であった。Ｔｅｍｒａ細胞が富化され、増殖機能、メモリー機能、およびエフェクター機能に関与していた。（図５Ｃ）マウス血液由来のＣＡＲ Ｔ細胞カウントの経時変化。（図５Ｄ）マウス血液由来のＴ細胞のＰＤ１発現の経時変化。（図５Ｅ）５週目の疲弊マーカーパネル。（図５Ｆ）ＣＡＲ発現Ｔ細胞によって誘導されたＨｅｐ３Ｂ腫瘍細胞の死滅。ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ構築物は、腫瘍細胞溶解の誘導が最も高かった。
【図5C-D】同上。
【図5E】同上。
【図5F】同上。
【図6A-B】図６Ａ～６Ｄ：（図６Ａ）ＮＳＧマウスモデルを使用した実験研究デザインの略図。Ｈｕｈ７ ＧＦＰ／ルシフェラーゼ発現細胞をマウスにＩＰ注射し（－１２日目）、１２日間生着させた。マウスに、０日目に１５００万個の非形質導入Ｔ細胞またはｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭもしくはＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭのＣＡＲ Ｔ細胞をＩＰ注射し、４週間にわたって定期的に画像化した。（図６Ｂ）腫瘍サイズを示す生物発光画像化の結果。（図６Ｃ）研究の全過程（処置後２８日間）にわたる生存曲線。（図６Ｄ）２８日間の研究終了時の腫瘍容積。
【図6C-D】同上。
【図7A】図７Ａ～７Ｂ：（図７Ａ）３０分間および３時間ＣＡＲ Ｔ細胞に曝露した腫瘍細胞中の活性および合計のβカテニン、ＧＰＣ３、およびＧＡＰＤＨのウェスタンブロット。（図７Ｂ）ＣＡＲ Ｔ細胞をＨｅｐ３Ｂ 腫瘍細胞と共に培養した場合のＣＡＲ Ｔ細胞におけるＮＦＡＴシグナル伝達。
【図7B】同上。
【発明を実施するための形態】
【0014】
配列表
添付の配列表に列挙した核酸配列およびアミノ酸配列を、連邦規則集第３７巻１．８２２に定義の通り、ヌクレオチド塩基については標準的な文字の略号、およびアミノ酸については一文字表記を使用して示す。各々の核酸配列の一方の鎖のみを示すが、表示の鎖を任意に参照することによって相補鎖が含まれると理解される。配列表を、ＸＭＬファイル（ファイル名４２３９－１０７１６４－０２．ｘｍｌ（９１，４３０バイト）、作成日２０２２年１０月２５日）として提出し、この配列表は、本明細書中で参考として援用される。添付の配列表において：
配列番号１は、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号２は、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ２８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号４は、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号６は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号７は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号８は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号９は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号１０は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ２ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号１２は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ２ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ｈＹＰ７－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号１４は、ｈＹＰ７－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号１６は、ｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号１７は、抗体ＨＮ３をコードする核酸配列である。
配列番号１８は、抗体ＨＮ３のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、抗体ｈＹＰ７のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号２０は、抗体ｈＹＰ７のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２１は、抗体ｈＹＰ７のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号２２は、抗体ｈＹＰ７のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２３は、抗体ＹＰ９．１のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号２４は、抗体ＹＰ９．１のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２５は、抗体ＹＰ９．１のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号２６は、抗体ＹＰ９．１のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２７は、抗体ＹＰ８のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号２８は、抗体ＹＰ８のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２９は、抗体ＹＰ８のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号３０は、抗体ＹＰ８のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３１は、抗体ＹＰ９のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号３２は、抗体ＹＰ９のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ＹＰ９クローン９のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号３４は、ＹＰ９クローン９のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３５は、ＹＰ９クローン１０のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号３６は、ＹＰ９クローン１０のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３７は、ＹＰ９クローン１のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号３８は、ＹＰ９クローン１のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３９は、抗体ＨＳ２０のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号４０は、抗体ＨＳ２０のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４１は、抗体ＨＳ２０のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号４２は、抗体ＨＳ２０のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４３は、改変されたＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号４４は、ＧＭＳＣＦＲｓｓのアミノ酸配列である。
配列番号４５は、ＣＤ８αヒンジのアミノ酸配列である。
配列番号４６は、ＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４７は、ＣＤ８α膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４８は、４－１ＢＢのアミノ酸配列である。
配列番号４９は、ＣＤ３ζのアミノ酸配列である。
配列番号５０は、自己切断Ｔ２Ａペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５１は、ｈｕＥＧＦＲｔのアミノ酸配列である。
配列番号５２は、野生型ＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号５３は、抗体ＹＰ７のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号５４は、抗体ＹＰ７のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号５５は、抗体ＹＰ７のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号５６は、抗体ＹＰ７のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号５７は、抗体ＹＰ６のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号５８は、抗体ＹＰ６のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号５９は、改変されたＣＨ２ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号６０は、野生型ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列である。
添付の配列表に列挙した核酸配列およびアミノ酸配列を、連邦規則集第３７巻１．８２２に定義の通り、ヌクレオチド塩基については標準的な文字の略号、およびアミノ酸については一文字表記を使用して示す。各々の核酸配列の一方の鎖のみを示すが、表示の鎖を任意に参照することによって相補鎖が含まれると理解される。配列表を、ＸＭＬファイル（ファイル名４２３９－１０７１６４－０２．ｘｍｌ（９１，４３０バイト）、作成日２０２２年１０月２５日）として提出し、この配列表は、本明細書中で参考として援用される。添付の配列表において：
配列番号１は、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号２は、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号３は、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ２８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号４は、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号６は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号７は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号８は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号９は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号１０は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ２ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号１２は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ２ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号１３は、ｈＹＰ７－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号１４は、ｈＹＰ７－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号１５は、ｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭをコードする核酸配列である。
配列番号１６は、ｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭのアミノ酸配列である。
配列番号１７は、抗体ＨＮ３をコードする核酸配列である。
配列番号１８は、抗体ＨＮ３のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、抗体ｈＹＰ７のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号２０は、抗体ｈＹＰ７のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２１は、抗体ｈＹＰ７のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号２２は、抗体ｈＹＰ７のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２３は、抗体ＹＰ９．１のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号２４は、抗体ＹＰ９．１のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２５は、抗体ＹＰ９．１のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号２６は、抗体ＹＰ９．１のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２７は、抗体ＹＰ８のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号２８は、抗体ＹＰ８のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号２９は、抗体ＹＰ８のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号３０は、抗体ＹＰ８のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３１は、抗体ＹＰ９のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号３２は、抗体ＹＰ９のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ＹＰ９クローン９のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号３４は、ＹＰ９クローン９のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３５は、ＹＰ９クローン１０のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号３６は、ＹＰ９クローン１０のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３７は、ＹＰ９クローン１のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号３８は、ＹＰ９クローン１のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号３９は、抗体ＨＳ２０のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号４０は、抗体ＨＳ２０のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４１は、抗体ＨＳ２０のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号４２は、抗体ＨＳ２０のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４３は、改変されたＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号４４は、ＧＭＳＣＦＲｓｓのアミノ酸配列である。
配列番号４５は、ＣＤ８αヒンジのアミノ酸配列である。
配列番号４６は、ＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４７は、ＣＤ８α膜貫通ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号４８は、４－１ＢＢのアミノ酸配列である。
配列番号４９は、ＣＤ３ζのアミノ酸配列である。
配列番号５０は、自己切断Ｔ２Ａペプチドのアミノ酸配列である。
配列番号５１は、ｈｕＥＧＦＲｔのアミノ酸配列である。
配列番号５２は、野生型ＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列である。
配列番号５３は、抗体ＹＰ７のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号５４は、抗体ＹＰ７のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号５５は、抗体ＹＰ７のＶＬドメインをコードする核酸配列である。
配列番号５６は、抗体ＹＰ７のＶＬドメインのアミノ酸配列である。
配列番号５７は、抗体ＹＰ６のＶＨドメインをコードする核酸配列である。
配列番号５８は、抗体ＹＰ６のＶＨドメインのアミノ酸配列である。
配列番号５９は、改変されたＣＨ２ドメインのアミノ酸配列である。
配列番号６０は、野生型ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列である。
【0015】
詳細な説明
Ｉ．略語
ＣＡＲ キメラ抗原受容体
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＥＦ１α 伸長因子１アルファ
ＥＧＦ 上皮増殖因子
ＥＧＦＲ 上皮増殖因子受容体
ＧＰＣ３ グリピカン－３
ＧＭＣＳＦＲｓｓ 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体シグナル配列
ＨＣＣ 肝細胞癌
ｈｕＥＧＦＲｔ ヒト短縮上皮増殖因子受容体
ＩＰ 腹腔内
ｉＰＳＣ 誘導多能性幹細胞
ＫＯ ノックアウト
ＮＫ ナチュラルキラー
ＮＳＧ ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ガンマ
ｓｃＦｖ 単鎖可変断片
ＴＭ 膜貫通
Ｔｃｍ セントラルメモリーＴ細胞
Ｔｅｍ エフェクターメモリーＴ細胞
Ｔｅｍｒａ エフェクターメモリーＴ細胞再発現ＣＤ４５ＲＡ
Ｔｓｃｍ 幹細胞メモリーＴ細胞
ＶＨ 重鎖可変
ＶＬ 軽鎖可変
Ｉ．略語
ＣＡＲ キメラ抗原受容体
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＥＦ１α 伸長因子１アルファ
ＥＧＦ 上皮増殖因子
ＥＧＦＲ 上皮増殖因子受容体
ＧＰＣ３ グリピカン－３
ＧＭＣＳＦＲｓｓ 顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体シグナル配列
ＨＣＣ 肝細胞癌
ｈｕＥＧＦＲｔ ヒト短縮上皮増殖因子受容体
ＩＰ 腹腔内
ｉＰＳＣ 誘導多能性幹細胞
ＫＯ ノックアウト
ＮＫ ナチュラルキラー
ＮＳＧ ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ガンマ
ｓｃＦｖ 単鎖可変断片
ＴＭ 膜貫通
Ｔｃｍ セントラルメモリーＴ細胞
Ｔｅｍ エフェクターメモリーＴ細胞
Ｔｅｍｒａ エフェクターメモリーＴ細胞再発現ＣＤ４５ＲＡ
Ｔｓｃｍ 幹細胞メモリーＴ細胞
ＶＨ 重鎖可変
ＶＬ 軽鎖可変
【0016】
ＩＩ．用語の概要
別段の記述がない限り、技術用語を、従来の使用法に従って使用する。分子生物学における多数の一般的な用語の定義は、Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｌｅｗｉｎ’ｓ ｇｅｎｅｓ ＸＩＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，２０１７に見出され得る。本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないと明確に示されない限り、単数および複数の両方を指す。例えば、用語「１つの抗原（ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ）」は、単数または複数の抗原を含み、句「少なくとも１つの抗原」と等価であると見なすことができる。本明細書中で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。別段の指示がない限り、核酸またはポリペプチドのために付与されたありとあらゆる塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量の値は近似値であり、説明のために提供されるとさらに理解すべきである。本明細書中に記載の方法および材料と類似するか等価な多数の方法および材料を使用することができるが、特に好適な方法および材料を本明細書中に記載する。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書を優先するであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみを目的とし、本発明の制限を意図しない。
別段の記述がない限り、技術用語を、従来の使用法に従って使用する。分子生物学における多数の一般的な用語の定義は、Ｋｒｅｂｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｌｅｗｉｎ’ｓ ｇｅｎｅｓ ＸＩＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，２０１７に見出され得る。本明細書中で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないと明確に示されない限り、単数および複数の両方を指す。例えば、用語「１つの抗原（ａｎ ａｎｔｉｇｅｎ）」は、単数または複数の抗原を含み、句「少なくとも１つの抗原」と等価であると見なすことができる。本明細書中で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。別段の指示がない限り、核酸またはポリペプチドのために付与されたありとあらゆる塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量の値は近似値であり、説明のために提供されるとさらに理解すべきである。本明細書中に記載の方法および材料と類似するか等価な多数の方法および材料を使用することができるが、特に好適な方法および材料を本明細書中に記載する。矛盾する場合、用語の説明を含む本明細書を優先するであろう。さらに、材料、方法、および実施例は、例示のみを目的とし、本発明の制限を意図しない。
【0017】
種々の実施形態の概説を容易にするために、以下の用語を説明する：
【0018】
４－１ＢＢ：Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化リンパ球、および他の細胞（ナチュラルキラー細胞が挙げられる）によって発現される共刺激分子。４－１ＢＢのライゲーションによってシグナル伝達カスケードが誘導され、その結果、サイトカインが産生され、抗アポトーシス分子が発現され、免疫応答が増強される。４－１ＢＢの例示的なアミノ酸配列を、配列番号４８として本明細書中に記載する。
【0019】
投与：任意の有効な経路によって被験体に薬剤（本明細書中に提供したＣＡＲまたはＣＡＲ発現細胞など）を提供するか与えること。例示的な投与経路としては、経口、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、動脈内（肝動脈内が挙げられる）、前立腺内、および腫瘍内など）、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣、および吸入経路が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、投与は局所投与である。いくつかの例では、投与は全身投与である。
【0020】
抗体：ＧＰＣ３などの抗原のエピトープを認識して結合する（例えば、特異的に認識して特異的に結合する）少なくとも１つの可変領域を含むポリペプチドリガンド。哺乳動物イムノグロブリン分子は、重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖から構成され、これらの各々がそれぞれ重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域と称される可変領域を有する。合わせて、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原の結合を担う。哺乳動物イムノグロブリンには抗体分子の機能活性を決定づける以下の５つの主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）が存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ。哺乳動物において見出されない抗体アイソタイプとしては、ＩｇＸ、ＩｇＹ、ＩｇＷ、およびＩｇＮＡＲが挙げられる。ＩｇＹは、鳥類および爬虫類によって産生される一次抗体であり、哺乳動物のＩｇＧおよびＩｇＥといくらか機能が類似している。ＩｇＷ抗体およびＩｇＮＡＲ抗体は軟骨魚類によって産生され、一方で、ＩｇＸ抗体は両生類で見出される。
【0021】
抗体可変領域は、「フレームワーク」領域および「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」として公知の超可変領域を含む。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合を担う。抗体のフレームワーク領域は、三次元空間中にＣＤＲを配置および整列させるのに役立つ。所与のＣＤＲのアミノ酸配列の境界を、いくつかのナンバリングスキーム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって記載されたもの（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１；「Ｋａｂａｔ」ナンバリングスキーム）、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．によって記載されたもの（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７，１９８９；およびＡｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（ＪＭＢ ２７３，９２７－９４８，１９９７を参照のこと；「Ｃｈｏｔｈｉａ」ナンバリングスキーム）、およびＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９：２０７－９，２００１を参照のこと；「ＩＭＧＴ」ナンバリングスキーム）が挙げられる）のうちのいずれかを使用して容易に決定することができる。ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴデータベースは、オンラインで保持されている。
【0022】
「単一ドメイン抗体」は、さらなる抗体ドメインが不在で、抗原または抗原のエピトープに特異的に結合することができる単一のドメイン（可変ドメイン）を含む抗体を指す。単一ドメイン抗体としては、例えば、ＶＨドメイン抗体、ＶＮＡＲ抗体、ラクダ科動物ＶＨＨ抗体、およびＶＬドメイン抗体が挙げられる。ＶＮＡＲ抗体は、軟骨魚類（テンジクザメ科のサメ、オオセ科のサメ、ツノザメ科のサメ、およびイヌザメなど）によって産生される。ラクダ科動物ＶＨＨ抗体は、自然界では軽鎖を欠く、重鎖抗体を産生するいくつかの種（ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグアナコが挙げられる）によって産生される。
【0023】
「モノクローナル抗体」は、リンパ球の単一のクローンまたは単一抗体のコード配列がトランスフェクトされている細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、公知の方法によって産生される。モノクローナル抗体としては、ヒト化モノクローナル抗体が挙げられる。
【0024】
「キメラ抗体」は、ある種（ヒトなど）由来のフレームワーク残基および別の種由来のＣＤＲ（一般に抗原結合を付与する）を有する。
【0025】
「ヒト化」抗体は、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（例えば、マウス、ウサギ、ラット、サメ、または合成）イムノグロブリン由来の１またはそれを超えるＣＤＲを含むイムノグロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒトイムノグロブリンは、「ドナー」と称され、フレームワークを提供するヒトイムノグロブリンは、「アクセプター」と称される。１つの態様では、全てのＣＤＲは、ヒト化免疫グロブリン中のドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一でなければならない（すなわち、少なくとも約８５～９０％同一、例えば、約９５％またはそれを超えて同一）。それ故に、場合によってＣＤＲを例外としたヒト化免疫グロブリンの全ての部分は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同一の抗原に結合する。ヒト化または他のモノクローナル抗体は、抗原結合や他のイムノグロブリン機能に実質的に影響を及ぼさないさらなる保存的アミノ酸置換を有することができる。
【0026】
結合親和性：抗原に対する抗体または他の抗原結合分子の親和性。１つの態様では、親和性は、Ｆｒａｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１０１－１０６，１９７９によって記載されたＳｃａｔｃｈａｒｄ法の修正形態によって計算される。別の態様では、結合親和性は、抗原／抗体解離速度によって測定される。別の態様では、高結合親和性は、競合放射免疫アッセイによって測定される。別の態様では、結合親和性は、ＥＬＩＳＡによって測定される。いくつかの態様では、結合親和性は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）テクノロジーに基づいたＯｃｔｅｔシステム（Ｃｒｅａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して測定される。他の態様では、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥＳ－２０００またはＢＩＡＣＯＲＥＳ－３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を使用した表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。他の態様では、抗体親和性を、フローサイトメトリーによって測定する。抗原（ＧＰＣ３など）に「特異的に結合する」抗体またはＣＡＲは、前述の抗原に高い親和性で結合し、かつ他の無関係の抗原には有意に結合しない抗体またはＣＡＲである。
【0027】
化学療法剤：異常細胞成長を特徴とする疾患の処置において治療有用性を有する任意の化学剤。かかる疾患としては、腫瘍、新生物、および癌が挙げられる。１つの態様では、化学療法剤は、ＧＰＣ３陽性腫瘍の処置で有用な薬剤である。１つの態様では、化学療法剤は放射性化合物である。本明細書中に提供した方法と共に使用することができる例示的な化学療法剤は、Ｓｌａｐａｋ ａｎｄ Ｋｕｆｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８６ ｉｎ Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｐｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈ．１７ ｉｎ Ａｂｅｌｏｆｆ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，（Ｃ）２０００ Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，Ｉｎｃ；Ｂａｌｔｚｅｒ，Ｌ．，Ｂｅｒｋｅｒｙ，Ｒ．（ｅｄｓ．）：Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｐｏｃｋｅｔ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，２ｎｄ ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ－Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９５；Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｋｎｏｂｆ，Ｍ．Ｆ．，Ｄｕｒｉｖａｇｅ，Ｈ．Ｊ．（ｅｄｓ）：Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４ｔｈ ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ－Ｙｅａｒ Ｂｏｏｋ，１９９３）に開示されている。併用化学療法は、癌を処置するための１つを超える薬剤の投与である。１つの例は、放射性または化学的な化合物と併用されるＧＰＣ３標的化ＣＡＲ Ｔ細胞の投与である。１つの例では、化学療法剤は、生物学的製剤、例えば、治療抗体（例えば、治療モノクローナル抗体）、例えば、抗ＧＰＣ３抗体、ならびに他の抗癌抗体、例えば、抗ＰＤ１または抗ＰＤＬ１（例えば、ペムブロリズマブおよびニボルマブ）、抗ＣＴＬＡ４（例えば、イピリムマブ）、抗ＥＧＦＲ（例えば、セツキシマブ）、抗ＶＥＧＦ（例えば、ベバシズマブ）、またはこれらの組み合わせ（例えば、抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４）である。併用化学療法は、癌を処置するための１つを超える薬剤の投与である。
【0028】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）：抗原結合部分（単一ドメイン抗体またはｓｃＦｖなど）およびシグナル伝達ドメイン（Ｔ細胞受容体（例えば、ＣＤ３ζ）由来のシグナル伝達ドメインなど）を含むキメラ分子。多くの例では、ＣＡＲは、抗原結合部分、ヒンジ領域、膜貫通ドメイン、およびエンドドメインから構成される。エンドドメインは、典型的には、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有するシグナル伝達鎖（ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγなど）を含む。いくつかの場合、エンドドメインは、少なくとも１つのさらなる共刺激ドメイン（ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ２７、ＭＹＤ８８－ＣＤ４０、ＫＩＲ２ＤＳ２、および／またはＤＡＰ１０など）の細胞内部分をさらに含む。いくつかの例では、ＣＡＲは、多特異性（二重特異性など）またはバイシストロン性である。多重特異性ＣＡＲは、少なくとも２つの抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖおよび／または単一ドメイン抗体など）（各々が異なる抗原または同一抗原上の異なるエピトープに結合する）から構成される単一のＣＡＲ分子である（例えば、米国特許出願公開第２０１８／０２３０２２５号を参照のこと）。例えば、二重特異性ＣＡＲは、２つの抗原結合ドメイン（各々が異なる抗原に結合する）を有する単一のＣＡＲ分子を指す。バイシストロン性ＣＡＲは、２つの完全なＣＡＲ分子（各々が異なる抗原に結合する抗原結合部分を含む）を指す。いくつかの場合、バイシストロン性ＣＡＲ構築物は、切断リンカーによって連結された２つの完全なＣＡＲ分子を発現する。二重特異性またはバイシストロン性のＣＡＲを発現する免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）またはｉＰＳＣは、結合部分が指向する抗原の両方を発現する細胞に結合することができる（例えば、Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １３０：８１０，２０１７；および国際公開第２０１８／２１３３３７号を参照のこと）。いくつかの態様では、ＣＡＲは、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ４：６２，２０１８）に記載の二本鎖抗体－Ｔ細胞受容体（ＡｂＴＣＲ）またはＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ １３（５８６）：ｅａｂｂ５１９１，２０２１）に記載の合成Ｔ細胞受容体および抗原受容体（ＳＴＡＲ）である。
【0029】
相補性決定領域（ＣＤＲ）：抗体の結合親和性および特異性を定義する超可変アミノ酸配列領域。哺乳動物イムノグロブリンの軽鎖および重鎖の各々は、それぞれＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３、およびＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と命名された３つのＣＤＲを有する。単一ドメイン抗体は、本明細書中でＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称される３つのＣＤＲを含む。
【0030】
保存的バリアント：本開示の文脈では、「保存的」アミノ酸置換は、ＧＰＣ３に対する抗体などのタンパク質の親和性に実質的に影響を及ぼすことも低下させることもない置換である。一例として、ＧＰＣ３に特異的に結合するモノクローナル抗体は、最大で約１、最大で約２、最大で約５、および最大で（ｍｏｓｔ）約１０、または最大で約１５の保存的置換を含み、ＧＰＣ３ポリペプチドに特異的に結合することができる。また、用語「保存的バリアント」は、バリアントが活性を維持することを条件として、非置換の親アミノ酸の代わりの置換されたアミノ酸の使用を含む。非保存的置換は、タンパク質の活性（親和性など）を低下させる置換である。
【0031】
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的アミノ酸置換の表が公知である。以下の６つの群は、相互に保存的置換であると見なされるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【0032】
本明細書中のいくつかの態様では、本明細書中に開示の任意のアミノ酸配列と比較して１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を提供する。
【0033】
接触：直接的な物理的関連下に置かれること；固体および液体の両方が含まれる。
【0034】
縮重バリアント：遺伝暗号の結果として縮重する配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。２０種の天然アミノ酸が存在し、そのほとんどが１つを超えるコドンによって特定される。したがって、ポリペプチドのアミノ酸配列が不変である限り、全ての縮重ヌクレオチド配列が含まれる。
【0035】
エピトープ：抗原決定基。これらは、抗原性を示す（特異的な免疫応答を誘発する）分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は、ポリペプチド上の特定の抗原エピトープに特異的に結合する。
【0036】
フレームワーク領域：ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列。フレームワーク領域としては、軽鎖可変フレームワーク領域および重鎖可変フレームワーク領域が挙げられる。フレームワーク領域は、抗原結合に適切な方向にＣＤＲを保持する働きをする。
【0037】
融合タンパク質：２つの異なる（異種）タンパク質の少なくとも一部を含むタンパク質。
【0038】
グリピカン－３（ＧＰＣ３）：グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーによって細胞表面に付着されたヘパラン硫酸（ＨＳ）プロテオグリカンのグリピカンファミリーのメンバー（Ｆｉｌｍｕｓ ａｎｄ Ｓｅｌｌｅｃｋ，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０８：４９７－５０１，２００１）。ＧＰＣ３遺伝子は、およそ７０ｋＤのコアタンパク質をコードし、このタンパク質は、フューリンによって切断されてＮ末端４０ｋＤ断片およびＣ末端３０ｋＤ断片を産生することができる。２つのＨＳ鎖は、ＧＰＣ３のＣ末端部分に付着している。ＧＰＣ３および他のグリピカンファミリータンパク質は、細胞分裂および細胞成長の制御で役割を果たす。ＧＰＣ３は、ＨＣＣおよびいくつかの他のヒトの癌（黒色腫、肺の扁平上皮癌、および卵巣の明細胞癌が挙げられる）で高度に発現されるが（Ｈｏ ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４７（３）：３３３－３３８，２０１１）、正常組織では発現されない。ＧＰＣ３は、ＳＧＢ、ＤＧＳＸ、ＭＸＲ７、ＳＤＹＳ、ＳＧＢＳ、ＯＣＩ－５、ＳＧＢＳ１、およびＧＴＲ２－２としても公知である。
【0039】
ヒトＧＰＣ３の４つのイソ型が公知である（イソ型１～４）（Ｈｏ ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４７（３）：３３３－３３８，２０１１）。ＧＰＣ３の４つのイソ型の核酸配列およびアミノ酸の配列が公知である（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１１６４６１７およびＮＰ＿００１１５８０８９（イソ型１）；ＮＭ＿００４４８４およびＮＰ＿００４４７５（イソ型２）；ＮＭ＿００１１６４６１８およびＮＰ＿００１１５８０９０（イソ型３）；ならびにＮＭ＿００１１６４６１９およびＮＰ＿００１１５８０９１（イソ型４）が挙げられる）。
【0040】
ＧＰＣ３陽性癌：ＧＰＣ３を発現または過剰発現する癌。ＧＰＣ３陽性癌の例としては、ＨＣＣ、黒色腫、卵巣明細胞癌、卵黄嚢腫瘍（ＹＳＴ）、神経芽細胞腫、肝芽腫、ウィルムス腫瘍、肺の扁平上皮癌、精巣非セミノーマ性胚細胞腫瘍、脂肪肉腫、子宮頸部上皮内新形成、副腎の腺腫、シュワン細胞腫、および胎児性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｏ ａｎｄ Ｋｉｍ，Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４７（３）：３３３－３３８，２０１１；Ｂａｕｍｈｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １２９（６）：８９９－９０６，２００８；Ｓａｉｋａｌｉ ａｎｄ Ｓｉｎｎｅｔｔ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８９（５）：４１８－４２２，２０００）。
【0041】
肝細胞癌（ＨＣＣ）：ウイルス性肝炎に起因する肝炎、肝臓毒素、または肝硬変（アルコール中毒症に原因することが多い）を有する患者で典型的に生じる肝臓の原発性悪性疾患。ＨＣＣは、悪性ヘパトームとも呼ばれる。
【0042】
異種の：別個の遺伝源または種に由来すること。
【0043】
宿主細胞：ベクターを増殖させ、そのＤＮＡを発現させることができる細胞。細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。いくつかの例では、原核細胞は、大腸菌細胞である。いくつかの例では、真核細胞は、ヒト細胞（ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞など）である。本用語には、本件の宿主細胞の任意の子孫も含まれる。複製中に起こる変異が存在し得るので、全ての子孫が親細胞と同一ではないかもしれないと理解される。しかしながら、用語「宿主細胞」を使用する場合、かかる子孫が含まれる。
【0044】
免疫応答：免疫系の細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、または単球など）の刺激に対する応答。１つの態様では、応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。１つの態様では、免疫応答は、Ｔ細胞応答（ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答など）である。別の態様では、応答はＢ細胞応答であり、結果として特異的抗体が産生される。
【0045】
単離された：「単離された」生物学的成分（核酸、タンパク質（抗体が挙げられる）、またはオルガネラなど）は、前述の成分が存在する環境（細胞など）中の他の生物学的成分（例えば、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質およびオルガネラ）から実質的に分離または精製されている。「単離」されている核酸およびタンパク質として、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が挙げられる。また、この用語は、宿主細胞中での組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学合成された核酸を包含する。
【0046】
標識：分子の検出を容易にするために抗体またはタンパク質などの別の分子に直接または間接的に抱合された検出可能な化合物または組成物。標識の非限定的な具体例としては、蛍光タグ、酵素結合、および放射性同位体が挙げられる。１つの例では、「標識された抗体」は、抗体中への別の分子の組み込みを指す。例えば、標識は、放射性標識したアミノ酸の組み込み、またはマーカーを付けたアビジン（例えば、光学的方法または比色法によって検出することができる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出することができるビオチニル部分のポリペプチドへの付着などの検出可能なマーカーである。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識するための種々の方法が公知であり、使用され得る。ポリペプチドのための標識の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性ヌクレオチド（３５Ｓ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、１９Ｆ、９９ｍＴｃ、１３１Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、および１２５Ｉなど）、蛍光標識（フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニドリン光体など）、酵素標識（セイヨウワサビペルオキシダーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなど）、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）、または磁性剤（ガドリニウムキレートなど）。いくつかの態様では、標識は、潜在的な立体障害を軽減するための様々な長さのスペーサーアームが付着している。
【0047】
リンカー：いくつかの場合、リンカーは、可変重鎖を可変軽鎖に間接的に結合させる働きをする抗体結合断片（Ｆｖ断片など）内のペプチドである。また、「リンカー」は、標的部分（抗体など）をエフェクター分子（細胞毒素または検出可能な標識など）に連結させる働きをするペプチドを指すことができる。用語「抱合」、「接合」、「結合」、または「連結」は、２つのポリペプチドから１つの連続したポリペプチド分子を作製すること、または放射性核種もしくは他の分子のポリペプチド（ｓｃＦｖなど）への共有結合性の付着を指す。具体的な文脈では、この用語は、リガンド（抗体部分など）のエフェクター分子への接合について言及することを含む。化学的手段または組換え手段のいずれかによって連結することができる。「化学的手段」は、抗体部分とエフェクター分子との間の、２つの分子間で共有結合が形成されて１つの分子が形成されるような反応を指す。
【0048】
哺乳動物：この用語には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。同様に、用語「被験体」には、ヒトおよび獣医学的被験体（マウス、ラット、ウシ、ネコ、イヌ、ブタ、および非ヒト霊長類など）の両方が含まれる。
【0049】
黒色腫：メラノサイト（色素メラニンを生成する細胞）由来の癌の形態。メラノサイトは、主に皮膚で見出されるが、腸内および眼内にも存在する。皮膚の黒色腫としては、表在性拡大型黒色腫、結節性黒色腫、末端部黒子黒色腫、および悪性黒子（黒色腫）が挙げられる。上記のタイプのうちのいずれかは、メラニンを生成し得るか、無色素性であり得る。同様に、任意のサブタイプは、侵襲的な挙動および局所再発の傾向のマーカーである線維形成（神経親和性の緻密線維性反応）を示し得る。他の黒色腫としては、明細胞肉腫、粘膜黒色腫、およびブドウ膜黒色腫が挙げられる。
【0050】
新形成、悪性疾患、癌、または腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂に起因する組織または細胞の異常な成長である。新生物が成長すると腫瘍を産生することができる。個体中の腫瘍量は「全身腫瘍組織量」であり、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる。転移しない腫瘍は、「良性」と称される。周囲の組織に侵入し、そして／あるいは転移することができる腫瘍は、「悪性」と称される。
【0051】
神経芽細胞腫：胚性神経堤細胞から生じる固形腫瘍。神経芽細胞腫は、一般に、副腎内または副腎周囲に生じるが、交感神経組織が見出されるいかなる場所（腹部、胸部、頸部、または脊椎付近の神経組織中など）にも生じることができる。神経芽細胞腫は、典型的には、５歳未満の小児に生じる。
【0052】
作動可能に連結された：第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的関係にある場合、第１の核酸配列は第２の核酸配列と作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合、同一の読み枠中に存在する。
【0053】
卵巣癌：卵巣（卵子（すなわち、卵）が形成される女性生殖腺対のうちの１つ）の組織中に形成される癌。ほとんどの卵巣癌は、卵巣上皮癌（卵巣表面上の細胞中から始まる癌）または悪性胚細胞腫瘍（卵細胞中から始まる癌）のいずれかである。
【0054】
卵巣明細胞癌：発症率が全卵巣悪性疾患の５％未満の上皮卵巣癌の特徴のある組織病理学的亜型。顕微鏡下で観察すると、この腫瘍型の細胞の内側は透明である。
【0055】
薬学的に許容され得る担体：有用な薬学的に許容され得る担体は従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ ｅｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，２０１３）は、本明細書中に開示のＣＡＲ発現免疫細胞および他の組成物の薬学的送達に好適な組成物および製剤を記載している。一般に、担体の性質は、使用される特定の投与様式に依存するであろう。例えば、非経口製剤は、通常、薬学的および生理学的に許容され得る流体（水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、またはグリセロールなど）をビヒクルとして含む注射液を含む。固体組成物（粉末、丸薬、錠剤、またはカプセルの形態など）のために、従来の無毒の固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に天然の担体に加えて、投与すべき医薬組成物は、少量の無毒の補助剤（湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウラートなど）を含むことができる。
【0056】
疾患の予防、処置、または改善：疾患の「予防」は、疾患の発症の完全な阻害を指す。「処置」は、発症が開始された後の疾患もしくは病的症状の兆候もしくは徴候を改善する（全身腫瘍組織量の低下または転移の数もしくはサイズの減少など）治療的介入を指す。「改善」は、疾患（癌など）の兆候または徴候の数または重症度の低下を指す。
【0057】
精製された：精製されたという用語は、絶対純度である必要はなく；むしろ、相対的用語であることが意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質が細胞内でのその天然の環境にある場合よりもペプチドまたはタンパク質が富化されている調製物である。１つの態様では、調製物は、タンパク質またはペプチドが調製物の総ペプチドまたはタンパク質含有量の少なくとも５０％存在するように精製されている。実質的な精製は、他のタンパク質または細胞成分からの精製を意味する。実質的に精製されたタンパク質は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％の純度である。したがって、非限定的な１つの具体例では、実質的に精製されたタンパク質は、他のタンパク質または細胞成分を９０％含まない。
【0058】
組換え：組換え核酸は、天然に存在しない配列を有するか、あるいは本来は分離されている２つの配列セグメントの人為的組み合わせによって作製された配列を有するものである。この人為的な組み合わせは、しばしば、化学合成または核酸の単離されたセグメントの人為的操作（例えば、遺伝子工学技術）によって行われる。
【0059】
試料（または生物試料）：被験体から得たゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ（ｍＲＮＡが挙げられる）、タンパク質、またはこれらの組み合わせを含む生物標本。例としては、末梢血、組織、細胞、尿、唾液、組織生検、細針吸引液、外科標本、および剖検材料が挙げられるが、これらに限定されない。１つの例では、試料としては、腫瘍生検（腫瘍組織生検など）が挙げられる。
【0060】
配列同一性：アミノ酸配列または核酸配列の間の類似性は、配列間の類似性について表されるか、そうでなければ、配列同一性と称される。配列同一性は、同一率（または類似性もしくは相同性）について測定されることが多い；百分率が高いほど２つの配列は類似性が高い。ポリペプチドまたは核酸分子のホモログまたはバリアントは、標準的な方法を使用してアラインメントしたときに配列同一度が比較的高いであろう。
【0061】
比較のための配列のアラインメント法は、公知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ ７３：２３７，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １６：１０８８１，１９８８；およびＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４，１９８８に記載されている。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．６：１１９，１９９４は、配列アラインメント法および相同性計算を詳細に検討している。
【0062】
配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと関連付けて用いるためのＮＣＢＩの基本的な局所アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０）は、いくつかの情報源（国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）が挙げられる）およびインターネットから入手可能である。このプログラムを用いた配列同一性の決定方法の説明は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。
【0063】
ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体またはＣＡＲのホモログおよびバリアントは、典型的には、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ２．０においてデフォルトパラメーターに設定したギャップ挿入ｂｌａｓｔｐを使用して、抗体またはＣＡＲのアミノ酸配列との全長にわたるアラインメントによってカウントした場合に、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有することを特徴とする。約３０アミノ酸を超えるアミノ酸配列を比較する場合、デフォルトパラメーター（ギャップ伸長コスト１１および残基あたりのギャップコスト１）に設定されたデフォルトＢＬＯＳＵＭ６２行列を使用したＢｌａｓｔ２配列機能を使用する。短いペプチド（およそ３０アミノ酸未満）をアラインメントする場合、デフォルトパラメーター（オープンギャップ９、伸長ギャップペナルティー１）に設定されたＰＡＭ３０行列を用いたＢｌａｓｔ２配列機能を使用してアラインメントを行うべきである。参照配列に対する類似性がさらにより高いタンパク質は、この方法によって査定する場合に同一率が増加するであろう（少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性など）。全配列未満を配列同一性について比較しようとする場合、ホモログおよびバリアントは、典型的には、１０～２０アミノ酸の短いウィンドウにわたって少なくとも８０％の配列同一性を保有するであろうし、参照配列に対するその類似性に応じて少なくとも８５％または少なくとも９０％または９５％の配列同一性を保有し得る。かかる短いウィンドウにわたる配列同一性の決定方法は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで利用可能である。これらの配列同一性の範囲は、ガイダンスのみを提供する；提供された範囲外に非常に有意なホモログが得られる可能性が十分に起こり得る。
【0064】
扁平上皮癌：扁平細胞（皮膚、眼、様々な内部器官の表面、ならびに中空器官およびいくつかの腺管の内膜を形成する薄く平坦な細胞）由来の癌のタイプ。扁平上皮癌は、類上皮癌とも称される。扁平上皮癌の１つのタイプは、肺の扁平上皮癌である。扁平上皮癌は、最もよく見られるタイプの皮膚癌である。
【0065】
被験体：生きている多細胞の脊椎生物（ヒトおよび獣医学的被験体の両方（ヒトおよび非ヒト哺乳動物、例えば、ブタ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、および非ヒト霊長類が挙げられる）が挙げられるカテゴリー）。
【0066】
合成の：研究室において人為的手段によって産生されることであって、例えば、合成の核酸またはタンパク質（例えば、抗体）を、実験室で化学合成することができる。
【0067】
治療有効量：処置される被験体において所望の効果を達成するのに十分な特定の物質の量。例えば、これは、腫瘍の成長を阻害または抑制するのに必要な量であり得る。１つの態様では、治療有効量は、腫瘍を消失させるか、サイズを減少させるか、転移を予防する（例えば、処置前のサイズ／体積／数と比較して、例えば、腫瘍のサイズおよび／または体積を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはさらには１００％低下させ、そして／あるいは転移の数および／またはサイズ／体積を少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはさらには１００％低下させる）のに必要な量である。被験体に投与するとき、所望のｉｎ ｖｉｔｒｏでの効果が得られることが示されている（例えば、腫瘍中の）標的組織濃度が得られる投薬量を一般に使用するであろう。
【0068】
ベクター：宿主細胞に導入され、それにより、形質転換された宿主細胞が産生される核酸分子。ベクターは、複製起点などの宿主細胞中での複製を可能にする核酸配列を含み得る。また、ベクターは、１またはそれを超える選択可能なマーカー遺伝子および他の公知の遺伝要素を含み得る。いくつかの例では、ベクターは、ウイルスベクター（レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなど）である。
【0069】
ＩＩＩ．いくつかの態様の概要
ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の悪性疾患の処置を一変させた；しかしながら、固形腫瘍においてはいくつかの障壁（腫瘍特異的抗原の不足、ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍部位で効率的に拡大できないこと、および不均一な抗原発現が挙げられる）によって限られた成功しか収められていない（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（１２）：２７０９－２７２０；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ２０１１；３６５（８）：７２５－７３３；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７；７：６９０；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１４；２０（２４）：６４１８－６４２８；Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１７；９（４１０）ａａｌ４２９１；Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８；６８（２３）：９８３２－９８３８；Ｌｏｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０２０；１１（１）：２９１）。本開示は、ＣＡＲの構造成分を正確に変化させる合理的な操作ストラテジーを使用してこれらの課題に対処する。具体的には、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲを発現する免疫細胞が、ＩｇＧ４由来の短いヒンジ配列を構築物中に使用した場合に最も有効であったことを本明細書中に開示する。さらに、ＩｇＧ４ヒンジ（ＩｇＧ４Ｈ）をＣＤ２８膜貫通（ＣＤ２８ＴＭ）ドメインと組み合わせると最も強力な抗腫瘍効果が得られた（図３Ａ～３Ｄおよび４Ａ～４Ｄ）。また、本明細書中に開示のデータは、ＧＰＣ３標的化ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ免疫細胞が強力なＣＤ８ Ｔ細胞およびＴｅｍｒａの応答を誘導し（図５Ｂ）、驚異的に迅速で持続的な腫瘍根絶に至ることを実証している。
ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の悪性疾患の処置を一変させた；しかしながら、固形腫瘍においてはいくつかの障壁（腫瘍特異的抗原の不足、ＣＡＲ Ｔ細胞が腫瘍部位で効率的に拡大できないこと、および不均一な抗原発現が挙げられる）によって限られた成功しか収められていない（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１１９（１２）：２７０９－２７２０；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇ Ｊ Ｍｅｄ ２０１１；３６５（８）：７２５－７３３；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１７；７：６９０；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１４；２０（２４）：６４１８－６４２８；Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２０１７；９（４１０）ａａｌ４２９１；Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００８；６８（２３）：９８３２－９８３８；Ｌｏｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０２０；１１（１）：２９１）。本開示は、ＣＡＲの構造成分を正確に変化させる合理的な操作ストラテジーを使用してこれらの課題に対処する。具体的には、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲを発現する免疫細胞が、ＩｇＧ４由来の短いヒンジ配列を構築物中に使用した場合に最も有効であったことを本明細書中に開示する。さらに、ＩｇＧ４ヒンジ（ＩｇＧ４Ｈ）をＣＤ２８膜貫通（ＣＤ２８ＴＭ）ドメインと組み合わせると最も強力な抗腫瘍効果が得られた（図３Ａ～３Ｄおよび４Ａ～４Ｄ）。また、本明細書中に開示のデータは、ＧＰＣ３標的化ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ免疫細胞が強力なＣＤ８ Ｔ細胞およびＴｅｍｒａの応答を誘導し（図５Ｂ）、驚異的に迅速で持続的な腫瘍根絶に至ることを実証している。
【0070】
ＧＰＣ３に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメイン；野生型または改変されたＩｇＧ４ヒンジ領域；膜貫通ドメイン；細胞内共刺激ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを本明細書中に提供する。いくつかの態様では、ヒンジ領域は、改変されたＩｇＧ４ヒンジ配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号４３）を含むか、この配列からなる。他の態様では、ヒンジ領域は、野生型ＩｇＧ４配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号５２）を含むか、この配列からなる。いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはＣＤ８膜貫通ドメインを含む。
【0071】
いくつかの態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、高親和性でＧＰＣ３に特異的に結合する。いくつかの例では、抗原結合ドメインは、ＧＰＣ３特異的単一ドメイン抗体またはＧＰＣ３特異的ｓｃＦｖを含む。いくつかの例では、抗原結合ドメインは、ＧＰＣ３特異的単一ドメイン抗体ＨＮ３由来の１またはそれを超えるＣＤＲ配列（１つ、２つ、または３つ全てのＣＤＲ配列など）を含む。他の例では、抗原結合ドメインは、ＧＰＣ３特異的モノクローナル抗体ｈＹＰ７、ＹＰ９．１、ＹＰ８、ＹＰ９、ＹＰ６、ＹＰ７、またはＨＳ２０由来の１またはそれを超えるＣＤＲ配列（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ全てのＣＤＲ配列など）を含む。
【0072】
いくつかの態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、配列番号１８（ＨＮ３）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む単一ドメイン抗体である。いくつかの例では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号１８の残基３１～３５、５０～６５、および９６～１０５；または配列番号１８の残基２６～３３、５１～５７、および９６～１０５を含む。具体例において、単一ドメイン抗体のアミノ酸配列は、配列番号１８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号１８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）。特定の非限定的な例において、単一ドメイン抗体のアミノ酸配列は、配列番号１８を含むか、配列番号１８からなる。
【0073】
他の態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、ＶＨドメインは、配列番号２０（ｈＹＰ７のＶＨドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号２２（ｈＹＰ７のＶＬドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む。いくつかの例では、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２０の残基３１～３５、５０～６８、および１０１～１０６；または配列番号２０の残基２６～３３、５１～６０、および９９～１０６を含む。いくつかの例では、ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２２の残基２４～４０、５６～６２、および９５～１０３；または配列番号２２の残基２７～３８、５６～５８、および９５～１０３を含む。具体例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号２０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号２０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号２２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号２２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）。特定の非限定的な例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号２０を含むか、配列番号２０からなる；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号２２を含むか、配列番号２２からなる。他の特定の例では、抗原結合ドメインは、配列番号１４の残基１～２４５のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。
【0074】
他の態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ＶＨドメインは、配列番号２４（ＹＰ９．１のＶＨドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号２６（ＹＰ９．１のＶＬドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む。いくつかの例では、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２４の残基３１～３５、５０～６８、および１０１～１０６；または配列番号２４の残基２６～３３、５１～６０、および９９～１０６を含む。いくつかの例では、ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２６の残基２４～４０、５６～６２、および９５～１０３；または配列番号２６の残基２７～３８、５６～５８、および９５～１０３を含む。具体例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号２４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号２４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号２６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号２６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）。特定の非限定的な例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号２４を含むか、配列番号２４からなる；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号２６を含むか、配列番号２６からなる。
【0075】
他の態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ＶＨドメインは、配列番号２８（ＹＰ８のＶＨドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３０（ＹＰ８のＶＬドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む。いくつかの例では、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号２８の残基３１～３５、５０～６８、および１０１～１０６；または配列番号２８の残基２６～３３、５１～６０、および９９～１０６を含む。いくつかの例では、ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号３０の残基２４～４０、５６～６２、および９５～１０３；または配列番号３０の残基２７～３８、５６～５８、および９５～１０３を含む。具体例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号２８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号２８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号３０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）。特定の非限定的な例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号２８を含むか、配列番号２８からなる；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号３０を含むか、配列番号３０からなる。
【0076】
他の態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ＶＨドメインは、配列番号５８（ＹＰ６のＶＨドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３０（ＹＰ６のＶＬドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む。いくつかの例では、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号５８の残基３１～３５、５０～６８、および１０１～１０６；または配列番号２８の残基２６～３３、５１～６０、および９９～１０６を含む。いくつかの例では、ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号３０の残基２４～４０、５６～６２、および９５～１０３；または配列番号３０の残基２７～３８、５６～５８、および９５～１０３を含む。具体例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号５８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号５８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号３０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）。特定の非限定的な例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号５８を含むか、配列番号５８からなる；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号３０を含むか、配列番号３０からなる。
【0077】
他の態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ＶＨドメインは、配列番号３２（ＹＰ９のＶＨドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３４、３６、または３８（ＹＰ９クローン９、ＹＰ９クローン１０、およびＹＰ９クローン１のＶＬドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む。いくつかの例では、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号３２の残基３１～３５、５０～６８、および１０１～１０６；または配列番号３２の残基２６～３３、５１～６０、および９９～１０６を含む。いくつかの例では、ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号３４、３６、または３８の残基２４～４０、５６～６２、および９５～１０３；または配列番号３４、３６、または３８の残基２７～３８、５６～５８、および９５～１０３を含む。具体例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号３２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号３２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号３４、３６、または３８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号３４、３６、または３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列をそれぞれ含む）。特定の非限定的な例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号３２を含むか、配列番号３２からなる；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号３４、３６、または３８を含むか、配列番号３４、３６、または３８からなる。
【0078】
他の態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、重鎖可変（ＶＨ）ドメインおよび軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含み、ＶＨドメインは、配列番号５４（ＹＰ７のＶＨドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号５６（ＹＰ７のＶＬドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む。いくつかの例では、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号５４の残基３１～３５、５０～６８、および１０１～１０６；または配列番号５４の残基２６～３３、５１～６０、および９９～１０６を含む。いくつかの例では、ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号５６の残基２４～４０、５６～６２、および９５～１０３；または配列番号５６の残基２７～３８、５６～５８、および９５～１０３を含む。具体例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号５４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号５４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号５６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号５６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）。特定の非限定的な例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号５４を含むか、配列番号５４からなる；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号５６を含むか、配列番号５６からなる。
【0079】
他の態様では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ＶＨドメインは、配列番号４０（ＨＳ２０のＶＨドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４２（ＨＳ２０のＶＬドメイン）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む。いくつかの例では、ＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号４０の残基３１～３５、５０～６６、および９７～１０５；または配列番号４０の残基２６～３３、５１～５８、および９７～１０５を含む。いくつかの例では、ＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列は、それぞれ、配列番号４２の残基２４～３４、５０～５６、および８９～９７；または配列番号４２の残基２７～３２、５０～５２、および８９～９７を含む。具体例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号４０に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号４０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号４２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である（かつ配列番号４２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３配列を含む）。特定の非限定的な例において、ＶＨドメインのアミノ酸配列は、配列番号４０を含むか、配列番号４０からなる；そして／あるいはＶＬドメインのアミノ酸配列は、配列番号４２を含むか、配列番号４２からなる。
【0080】
いくつかの態様では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインを含む。いくつかの例では、ＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の非限定的な例において、ＣＤ２８膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４６を含むか、配列番号４６からなる。他の態様では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインを含む。いくつかの例では、ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の非限定的な例において、ＣＤ８膜貫通ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４７を含むか、配列番号４７からなる。
【0081】
いくつかの態様では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、４－１ＢＢシグナル伝達部分を含む。いくつかの例では、４－１ＢＢシグナル伝達部分のアミノ酸配列は、配列番号４８に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の非限定的な例において、４－１ＢＢシグナル伝達部分のアミノ酸配列は、配列番号４８を含むか、配列番号４８からなる。
【0082】
いくつかの態様では、ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの例では、シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４９に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の非限定的な例において、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのアミノ酸配列は、配列番号４９を含むか、配列番号４９からなる。
【0083】
いくつかの態様では、ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、および１４のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの例では、ＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、および１４のうちのいずれか１つを含む。具体例において、アミノ酸配列は、配列番号６（ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ）または配列番号１４（ｈＹＰ７－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ）を含む。
【0084】
本明細書中に開示のＣＡＲをコードする核酸分子をさらに提供する。いくつかの態様では、核酸分子は、プロモーター（誘導性または構成性のプロモーターなど）に作動可能に連結されている。いくつかの例では、核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、および１３のうちのいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。特定の例では、核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９、１１、および１３のうちのいずれか１つを含む。非限定的な具体例では、核酸分子は、配列番号５（ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ）または配列番号１３（ｈＹＰ７－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ）を含む。
【0085】
いくつかの態様では、核酸分子は、５’から３’への方向に、第１の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体シグナル配列（ＧＭＣＳＦＲｓｓ）をコードする核酸；抗原結合ドメインをコードする核酸；ＩｇＧ４ヒンジ領域をコードする核酸；膜貫通ドメインをコードする核酸；共刺激ドメインをコードする核酸；シグナル伝達ドメインをコードする核酸；自己切断２Ａペプチドをコードする核酸；第２のＧＭＣＳＦＲｓｓをコードする核酸；および短縮ヒト上皮増殖因子受容体（ｈｕＥＧＦＲｔ）をコードする核酸を含む。いくつかの例では、核酸分子は、第１のＧＭＣＳＦＲｓｓをコードする核酸の５’側にヒト伸長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター配列をさらに含む（国際公開第２０１９／０９４４８２号を参照のこと）。
【0086】
本明細書中に開示の核酸分子を含むベクターをさらに提供する。いくつかの例では、ベクターは、ウイルスベクター（レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターなど）である。
【0087】
本明細書中に開示のＣＡＲをコードする核酸分子を含み、そして／あるいは本明細書中に開示のＣＡＲを発現する単離された細胞も提供する。いくつかの態様では、細胞は、免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）である。他の態様では、細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【0088】
薬学的に許容され得る担体（水または生理食塩水など）および本明細書中に開示のＣＡＲ、核酸分子、ベクター、または細胞を含む組成物をさらに提供する。いくつかの例では、組成物は凍結されている。いくつかの例では、組成物は、凍結されており、かつ細胞およびＤＭＳＯまたは他の冷凍保存剤を含む。いくつかの例では、組成物は凍結乾燥されている。
【0089】
被験体におけるＧＰＣ３陽性癌を処置するか、あるいは、ＧＰＣ３陽性癌の腫瘍成長または転移を阻害する方法も提供する。いくつかの態様では、この方法は、治療有効量の本明細書中に開示のＣＡＲ、核酸分子、ベクター、細胞、または組成物を被験体に投与する工程を含む。いくつかの例では、ＧＰＣ３陽性癌は固形腫瘍である。特定の非限定的な例において、ＧＰＣ３陽性癌は、肝細胞癌（ＨＣＣ）、黒色腫、卵巣明細胞癌、卵黄嚢腫瘍（ＹＳＴ）、神経芽細胞腫、肝芽腫、ウィルムス腫瘍、肺の扁平上皮癌、精巣非セミノーマ性胚細胞腫瘍、脂肪肉腫、子宮頸部上皮内新形成、副腎の腺腫、シュワン細胞腫、または胎児性腫瘍である。具体例において、ＧＰＣ３陽性癌はＨＣＣである。
【0090】
ＩＶ．ＧＰＣ３特異的抗体配列
本明細書中に開示のＣＡＲは、ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体（またはその抗原結合断片）を含む。いくつかの態様では、抗体は、ＨＮ３（ヒト単一ドメイン（ＶＨ）モノクローナル抗体）またはｈＹＰ７（ヒト化マウス抗体）（ｓｃＦｖ形式）である。他の態様では、抗体は、ＹＰ９、ＹＰ８、ＹＰ６、ＹＰ７、もしくはＹＰ９．１（ｓｃＦｖ形式など）、またはそのヒト化バージョンである。さらに他の態様では、抗体は、ヒト抗体であるＨＳ２０（ｓｃＦｖ形式など）である。ＨＮ３、ｈＹＰ７、ＹＰ９、ＹＰ８、ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ９．１、およびＨＳ２０抗体は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１２／１４５４６９号、国際公開第２０１２／１４５４６９号、および国際公開第２０１９／０９４４８２号に記載されている。ＨＮ３、ｈＹＰ７、ＹＰ９、ＹＰ８、ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ９．１、およびＨＳ２０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を以下に提供する。表１～１３は、ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴを使用して決定した場合のＨＮ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにｈＹＰ７、ＹＰ９、ＹＰ８、ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ９．１、およびＨＳ２０のＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸の位置を列挙している。代替のナンバリングスキーム（ＰａｒａｔｏｍｅまたはＣｈｏｔｈｉａのナンバリングスキームなど）を使用して、ＣＤＲの境界を容易に決定することができる。
本明細書中に開示のＣＡＲは、ＧＰＣ３に特異的に結合する抗体（またはその抗原結合断片）を含む。いくつかの態様では、抗体は、ＨＮ３（ヒト単一ドメイン（ＶＨ）モノクローナル抗体）またはｈＹＰ７（ヒト化マウス抗体）（ｓｃＦｖ形式）である。他の態様では、抗体は、ＹＰ９、ＹＰ８、ＹＰ６、ＹＰ７、もしくはＹＰ９．１（ｓｃＦｖ形式など）、またはそのヒト化バージョンである。さらに他の態様では、抗体は、ヒト抗体であるＨＳ２０（ｓｃＦｖ形式など）である。ＨＮ３、ｈＹＰ７、ＹＰ９、ＹＰ８、ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ９．１、およびＨＳ２０抗体は、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１２／１４５４６９号、国際公開第２０１２／１４５４６９号、および国際公開第２０１９／０９４４８２号に記載されている。ＨＮ３、ｈＹＰ７、ＹＰ９、ＹＰ８、ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ９．１、およびＨＳ２０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を以下に提供する。表１～１３は、ＫａｂａｔおよびＩＭＧＴを使用して決定した場合のＨＮ３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３、ならびにｈＹＰ７、ＹＰ９、ＹＰ８、ＹＰ６、ＹＰ７、ＹＰ９．１、およびＨＳ２０のＶＨおよびＶＬドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３のアミノ酸の位置を列挙している。代替のナンバリングスキーム（ＰａｒａｔｏｍｅまたはＣｈｏｔｈｉａのナンバリングスキームなど）を使用して、ＣＤＲの境界を容易に決定することができる。
【化1】
【表1】
【化2-1】
【化2-2】
【表2】
【表3】
【化3-1】
【化3-2】
【表4】
【表5】
【化4-1】
【化4-2】
【表6】
【表7】
【化5-1】
【化5-2】
【化5-3】
【表8】
【表9】
【化6-1】
【化6-2】
【表10】
【表11】
【化7-1】
【化7-2】
【表12】
【表13】
【0091】
Ｖ．ＧＰＣ３標的化ＣＡＲ配列
ＨＮ３単一ドメイン抗体およびｈＹＰ７ ｓｃＦｖを使用し、ＣＤ８ヒンジ（配列番号４５）、ＩｇＧ４ヒンジ（配列番号４３）、ＩｇＧ４－ＣＨ３ヒンジ、またはＩｇＧ４－ＣＨ２－ＣＨ３ヒンジのいずれか、およびＣＤ８膜貫通（ＴＭ）ドメイン（配列番号４７）またはＣＤ２８膜貫通ドメイン（配列番号４６）のいずれかを利用して、いくつかの異なるＣＡＲ構築物を生成した。以下に提供したＣＡＲアミノ酸配列では、抗原結合配列（ＨＮ３単一ドメインまたはｈＹＰ７ ＶＨ－リンカー－ＶＬ）に下線を引き、ヒンジ領域（ＣＤ８α、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４－ＣＨ３、またはＩｇＧ４－ＣＨ２－ＣＨ３）を太字で示し、ＴＭドメイン（ＣＤ８αまたはＣＤ２８）を斜体で示す。
ＨＮ３単一ドメイン抗体およびｈＹＰ７ ｓｃＦｖを使用し、ＣＤ８ヒンジ（配列番号４５）、ＩｇＧ４ヒンジ（配列番号４３）、ＩｇＧ４－ＣＨ３ヒンジ、またはＩｇＧ４－ＣＨ２－ＣＨ３ヒンジのいずれか、およびＣＤ８膜貫通（ＴＭ）ドメイン（配列番号４７）またはＣＤ２８膜貫通ドメイン（配列番号４６）のいずれかを利用して、いくつかの異なるＣＡＲ構築物を生成した。以下に提供したＣＡＲアミノ酸配列では、抗原結合配列（ＨＮ３単一ドメインまたはｈＹＰ７ ＶＨ－リンカー－ＶＬ）に下線を引き、ヒンジ領域（ＣＤ８α、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４－ＣＨ３、またはＩｇＧ４－ＣＨ２－ＣＨ３）を太字で示し、ＴＭドメイン（ＣＤ８αまたはＣＤ２８）を斜体で示す。
【化8-1】
【化8-2】
【表14】
【化9】
【表15】
【化10-1】
【化10-2】
【表16】
【化11】
【表17】
【化12-1】
【化12-2】
【表18】
【化13-1】
【化13-2】
【表19】
【0092】
ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ２ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ中に含まれるＣＨ２ドメインは、以下の配列を有する改変されたＣＨ２ドメインである（配列番号５９；置換されたアミノ酸残基に下線を引いている）：
【化14】
【0093】
いくつかの態様では、野生型ＣＨ２ドメインを、改変されたＣＨ２ドメインの代わりに使用する（例えば、以下の配列を有する野生型ＣＨ２ドメイン（配列番号６０））：
【化15-1】
【化15-2】
【表20】
【化16-1】
【化16-2】
【表21】
【0094】
ＶＩ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
ＧＰＣ３特異的ＣＡＲおよびＣＡＲを発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、およびｉＰＳＣ）を本明細書中に開示する。一般に、ＣＡＲは、結合部分、細胞外ヒンジ／スペーサーエレメント、膜貫通領域、およびシグナル伝達機能を果たす細胞内ドメインを含む（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０：９５６３０４，２０１０；Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０８（７）：ｄｊｖ４３９，２０１６）。多くの例では、結合部分は、モノクローナル抗体の抗原結合断片（ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体など）である。スペーサー／ヒンジ領域は、典型的には、ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ４など）、ＩｇＤ、およびＣＤ８ドメイン由来の配列を含む。本明細書中のいくつかの態様では、ヒンジ領域は、配列番号４３に記載の改変されたＩｇＧ４ヒンジ配列を含む（または、からなる）。本明細書中の他の態様では、ヒンジ領域は、配列番号５２に記載の野生型ＩｇＧ４ヒンジ配列を含む（または、からなる）。膜貫通ドメインは、種々の異なるＴ細胞タンパク質（ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、または誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）など）に由来することができる。いくつかの異なるエンドドメインが、ＣＡＲを生成するために使用されている。例えば、エンドドメインは、ＩＴＡＭを有するシグナル伝達鎖（ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγなど）からなることができる。いくつかの例では、エンドドメインは、少なくとも１つのさらなる共刺激ドメインの細胞内部分（ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＭＹＤ８８－ＣＤ４０、キラー細胞免疫グロブリン様受容体 ２ＤＳ２（ＫＩＲ２ＤＳ２）、および／またはＤＡＰ１０など）をさらに含む。
ＧＰＣ３特異的ＣＡＲおよびＣＡＲを発現するように操作された細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、およびｉＰＳＣ）を本明細書中に開示する。一般に、ＣＡＲは、結合部分、細胞外ヒンジ／スペーサーエレメント、膜貫通領域、およびシグナル伝達機能を果たす細胞内ドメインを含む（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０１０：９５６３０４，２０１０；Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ １０８（７）：ｄｊｖ４３９，２０１６）。多くの例では、結合部分は、モノクローナル抗体の抗原結合断片（ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体など）である。スペーサー／ヒンジ領域は、典型的には、ＩｇＧサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ４など）、ＩｇＤ、およびＣＤ８ドメイン由来の配列を含む。本明細書中のいくつかの態様では、ヒンジ領域は、配列番号４３に記載の改変されたＩｇＧ４ヒンジ配列を含む（または、からなる）。本明細書中の他の態様では、ヒンジ領域は、配列番号５２に記載の野生型ＩｇＧ４ヒンジ配列を含む（または、からなる）。膜貫通ドメインは、種々の異なるＴ細胞タンパク質（ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、または誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）など）に由来することができる。いくつかの異なるエンドドメインが、ＣＡＲを生成するために使用されている。例えば、エンドドメインは、ＩＴＡＭを有するシグナル伝達鎖（ＣＤ３ζまたはＦｃεＲＩγなど）からなることができる。いくつかの例では、エンドドメインは、少なくとも１つのさらなる共刺激ドメインの細胞内部分（ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７、ＴＮＦＲＳＦ９）、ＯＸ－４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＭＹＤ８８－ＣＤ４０、キラー細胞免疫グロブリン様受容体 ２ＤＳ２（ＫＩＲ２ＤＳ２）、および／またはＤＡＰ１０など）をさらに含む。
【0095】
また、ＣＡＲは、例えば、抗原結合ドメインのＮ末端にシグナルペプチド配列を含むことができる。シグナルペプチド配列は、任意の好適なシグナルペプチド配列（顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭＣＳＦＲ）、イムノグロブリン軽鎖カッパ、またはＩＬ－２由来のシグナル配列など）であり得る。シグナルペプチド配列は細胞表面上でＣＡＲの発現を容易にし得るが、発現したＣＡＲ中のシグナルペプチド配列の存在は、ＣＡＲが機能するのに必要ではない。細胞表面上のＣＡＲの発現の際に、シグナルペプチド配列を、ＣＡＲから切り出し得る。したがって、いくつかの態様では、ＣＡＲはシグナルペプチド配列を欠く。
【0096】
いくつかの態様では、本明細書中に開示のＣＡＲは、ヒトＥＧＦＲの短縮バージョン（ｈｕＥＧＦＲｔ；以下のＶＩＩ項でより詳細に考察されている）も発現する構築物（レンチウイルスベクターなど）から発現される。ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔは、形質導入された細胞中での発現の際に、ＣＡＲがｈｕＥＧＦＲｔから切断されるように自己切断ペプチド配列（Ｔ２Ａなど）によって分離されている（国際公開第２０１９／０９４４８２号を参照のこと）。
【0097】
本明細書中で考察されたいくつかの態様では、ＣＡＲ構築物は、Ｎ末端からＣ末端の方向に以下のアミノ酸配列をコードする：
ＧＭＣＳＦＲｓｓ：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP（配列番号４４）
ＮｄｅＩ：HM
抗原結合：ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体配列
ＳｐｅＩ：TS
ヒンジ：改変されたＩｇＧ４（ESKYGPPCPPCP；配列番号４３）、野生型ＩｇＧ４（ESKYGPPCPSCP；配列番号５２）、またはＣＤ８α（TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；配列番号４５）
ＴＭ：ＣＤ２８（FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV；配列番号４６）またはＣＤ８α（IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT；配列番号４７）
ＧＭＣＳＦＲｓｓ：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP（配列番号４４）
ＮｄｅＩ：HM
抗原結合：ｓｃＦｖまたは単一ドメイン抗体配列
ＳｐｅＩ：TS
ヒンジ：改変されたＩｇＧ４（ESKYGPPCPPCP；配列番号４３）、野生型ＩｇＧ４（ESKYGPPCPSCP；配列番号５２）、またはＣＤ８α（TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；配列番号４５）
ＴＭ：ＣＤ２８（FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV；配列番号４６）またはＣＤ８α（IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT；配列番号４７）
【化17】
【0098】
本明細書中に開示のＣＡＲを発現する免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）またはｉＰＳＣを使用して、腫瘍細胞（例えば、ＧＰＣ３陽性腫瘍細胞）などの特異的細胞型を標的にすることができる。ＣＡＲを発現する免疫細胞（Ｔ細胞など）を使用することは、ＣＡＲを発現する免疫細胞がＨＬＡに拘束されず、したがって、標的抗原を発現する腫瘍を有する任意の患者に使用することができるので、標準的なＣＴＬベースの免疫療法より普遍的である。
【0099】
したがって、ＧＰＣ３特異的抗体（またはその結合断片）を含むＣＡＲを本明細書中に提供する。ＣＡＲをコードする単離された核酸分子およびベクター、ならびにＣＡＲを発現する宿主細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、またはｉＰＳＣなど）も提供する。ＧＰＣ３特異的モノクローナル抗体から構成されるＣＡＲを発現する細胞を、ＧＰＣ３を発現する癌（ＨＣＣ、黒色腫、卵巣明細胞癌、卵黄嚢腫瘍（ＹＳＴ）、神経芽細胞腫、肝芽腫、ウィルムス腫瘍、肺の扁平上皮癌、精巣非セミノーマ性胚細胞腫瘍、脂肪肉腫、子宮頸部上皮内新形成、副腎の腺腫、シュワン細胞腫、または胎児性腫瘍など）の処置のために使用することができる。
【0100】
ＶＩＩ．短縮ヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ）
ヒト上皮増殖因子受容体は、４つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および３つの細胞内ドメインから構成される。ＥＧＦＲドメインは、以下のＮ末端からＣ末端への順序で見出される：ドメインＩ－ドメインＩＩ－ドメインＩＩＩ－ドメインＩＶ－膜貫通（ＴＭ）ドメイン－膜近傍ドメイン－チロシンキナーゼドメイン－Ｃ末端テール。ドメインＩおよびドメインＩＩＩは、リガンド結合に関与するロイシンリッチドメインである。ドメインＩＩおよびドメインＩＶは、システインリッチドメインであり、ＥＧＦＲリガンドと接触していない。ドメインＩＩは、他のＥＧＦＲファミリーメンバー由来の類似ドメインとのホモ二量体またはヘテロ二量体の形成を媒介し、ドメインＩＶは、ドメインＩＩとジスルフィド結合を形成することができる。ＥＧＦＲ ＴＭドメインは、細胞膜を１回貫通し、タンパク質二量体化で役割を果たし得る。細胞内ドメインは、膜近傍ドメイン、チロシンキナーゼドメイン、およびＣ末端テールを含み、ＥＧＦＲシグナル伝達を媒介する（Ｗｅｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｃａｎｃｅｒｓ ９（５２），ｄｏｉ：１０．３３９０／ｃａｎｃｅｒｓ９０５００５２；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３７：３５３－３７３，２００８；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１８（５）：１２５５－１２６３，２０１１）。
ヒト上皮増殖因子受容体は、４つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および３つの細胞内ドメインから構成される。ＥＧＦＲドメインは、以下のＮ末端からＣ末端への順序で見出される：ドメインＩ－ドメインＩＩ－ドメインＩＩＩ－ドメインＩＶ－膜貫通（ＴＭ）ドメイン－膜近傍ドメイン－チロシンキナーゼドメイン－Ｃ末端テール。ドメインＩおよびドメインＩＩＩは、リガンド結合に関与するロイシンリッチドメインである。ドメインＩＩおよびドメインＩＶは、システインリッチドメインであり、ＥＧＦＲリガンドと接触していない。ドメインＩＩは、他のＥＧＦＲファミリーメンバー由来の類似ドメインとのホモ二量体またはヘテロ二量体の形成を媒介し、ドメインＩＶは、ドメインＩＩとジスルフィド結合を形成することができる。ＥＧＦＲ ＴＭドメインは、細胞膜を１回貫通し、タンパク質二量体化で役割を果たし得る。細胞内ドメインは、膜近傍ドメイン、チロシンキナーゼドメイン、およびＣ末端テールを含み、ＥＧＦＲシグナル伝達を媒介する（Ｗｅｅ ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｃａｎｃｅｒｓ ９（５２），ｄｏｉ：１０．３３９０／ｃａｎｃｅｒｓ９０５００５２；Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３７：３５３－３７３，２００８；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１８（５）：１２５５－１２６３，２０１１）。
【0101】
本明細書中で「ｈｕＥＧＦＲｔ」称されるヒトＥＧＦＲの短縮バージョンは、ドメインＩＩＩ、ドメインＩＶ、およびＴＭドメインのみを含む。したがって、ｈｕＥＧＦＲｔは、ドメインＩ、ドメインＩＩ、および３つ全ての細胞内ドメインを欠く。ｈｕＥＧＦＲｔは、ＥＧＦに結合することができず、シグナル伝達活性を欠く。しかしながら、この分子は、特定のＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体（ＦＤＡ承認されたセツキシマブ（ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１１／０５６８９４号）など）に結合する能力を保持している。
【0102】
本明細書中に開示のｈｕＥＧＦＲｔおよびＧＰＣ３特異的ＣＡＲの両方をコードする構築物（レンチウイルスベクターなど）での免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）またはｉＰＳＣの形質導入により、形質導入された細胞を、標識されたＥＧＦＲモノクローナル抗体セツキシマブ（エルビタックス（商標））を使用して選択可能である。例えば、セツキシマブをビオチンで標識することができ、形質導入された細胞を、（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃなどから）市販されている抗ビオチン磁性ビーズを使用して選択することができる。また、ｈｕＥＧＦＲｔの同時発現により、養子移入されたＣＡＲ発現細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの追跡が可能である。さらに、ｈｕＥＧＦＲｔを発現する細胞へのセツキシマブの結合により、ＡＤＣＣエフェクター細胞の細胞傷害性が誘導され、それにより、治療終了時などに形質導入された免疫細胞またはｉＰＳＣをｉｎ ｖｉｖｏで消失させる機序が得られる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１８（５）：１２５５－１２６３，２０１１）。
【0103】
本明細書中のいくつかの態様では、ｈｕＥＧＦＲｔのアミノ酸配列は、配列番号５１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。いくつかの例では、ｈｕＥＧＦＲｔのアミノ酸配列は、配列番号５１を含むか、配列番号５１からなる。他の態様では、ｈｕＥＧＦＲｔのアミノ酸配列は、配列番号５１と比較して１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、２以下、または１以下のアミノ酸置換を含む。いくつかの例では、アミノ酸置換は、保存的置換である。
【0104】
ＶＩＩＩ．ＣＡＲ発現細胞組成物
１またはそれを超える薬学的または生理学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせてＣＡＲ発現細胞を含む組成物を提供する。ＣＡＲ発現細胞は、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、または任意の他の好適な免疫細胞であり得る。そのような組成物は、緩衝液（中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝食塩水など）；炭水化物（グルコース、マンノース、スクロースデキストラン、またはマンニトールなど）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（グリシンなど）；酸化防止剤；キレート剤（ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。いくつかの例では、細胞含有組成物は、冷凍保存剤（ＤＭＳＯまたはグリセロールなど）を含む。いくつかの例では、細胞含有組成物は、培養培地（ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩなど）を含み、血清（ＦＢＳなど）をさらに含み得る。いくつかの例では、細胞含有組成物は、凍結されているか液体の形態である。細胞は、レシピエントに対して自家性であり得る。しかしながら、細胞は、異種（同種）であってもよい。
１またはそれを超える薬学的または生理学的に許容され得る担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせてＣＡＲ発現細胞を含む組成物を提供する。ＣＡＲ発現細胞は、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３＋Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、または任意の他の好適な免疫細胞であり得る。そのような組成物は、緩衝液（中性緩衝化食塩水、リン酸緩衝食塩水など）；炭水化物（グルコース、マンノース、スクロースデキストラン、またはマンニトールなど）；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（グリシンなど）；酸化防止剤；キレート剤（ＥＤＴＡまたはグルタチオンなど）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含み得る。いくつかの例では、細胞含有組成物は、冷凍保存剤（ＤＭＳＯまたはグリセロールなど）を含む。いくつかの例では、細胞含有組成物は、培養培地（ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩなど）を含み、血清（ＦＢＳなど）をさらに含み得る。いくつかの例では、細胞含有組成物は、凍結されているか液体の形態である。細胞は、レシピエントに対して自家性であり得る。しかしながら、細胞は、異種（同種）であってもよい。
【0105】
細胞に関して、細胞を導入するために種々の水性担体（例えば、緩衝化生理食塩水など）を使用することができる。これらの溶液は無菌であり、一般に、望ましくない物質を含まない。これらの組成物を、従来の滅菌技術によって滅菌し得る。組成物は、ｐＨ調整剤および緩衝剤、ならびに毒性調整剤などの生理学的条件に近づけることが必要な場合の薬学的に許容され得る補助剤（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および乳酸ナトリウムなど）を含み得る。これらの製剤中の濃度は大きく変動する可能性があり、選択される特定の投与様式および被験体のニーズに従って、主に流体の体積、粘度、および体重などに基づいて選択されるであろう。
【0106】
組成物の正確な投与量を、年齢、体重、腫瘍サイズ／全身腫瘍組織量、転移の範囲、および患者（被験体）の症状の個人差を考慮して、医師が決定することができる。本明細書中に記載のＣＡＲ発現免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および／またはＮＫ細胞）またはｉＰＳＣを含む医薬組成物を、１０４～１０９細胞／ｋｇ体重、例えば、１０５～１０６細胞／ｋｇ体重（前述の範囲内の全ての整数値を含む）の投薬量で投与し得ると一般に述べることができる。例示的な用量は、１０６細胞／ｋｇ～約１０８細胞／ｋｇ、例えば、約５×１０６細胞／ｋｇから約７．５×１０７細胞／ｋｇまで、例えば、約２．５×１０７細胞／ｋｇ、または約５．０×１０７細胞／ｋｇである。
【0107】
組成物を、これらの投薬量で１回または複数回（２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回など）投与することができる。組成物を、公知の免疫療法による注入技術を使用して投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照のこと）。組成物を、１日１回、１週間に１回、１ヶ月に２回、または１ヶ月に１回投与することができる。いくつかの非限定的な例では、組成物を、静脈内投与用に製剤化し、複数回投与する。適切な投薬量を臨床試験によって決定し得るが、投与の量および頻度を、被験体の症状、ならびに被験体の疾患のタイプおよび重症度などの要因によって決定するであろう。
【0108】
いくつかの態様では、ＣＡＲをコードする核酸分子を、細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、またはｉＰＳＣなど）に導入し、被験体に細胞を最初に投与し、その後に細胞を１またはそれを超える回数で投与し、ここで、１またはそれを超える回数のその後の投与は、前の投与から１５日後未満（例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日後）の投与である。１つの態様では、被験体に１週間あたり１回を超えてＣＡＲ発現細胞を投与する（例えば、開示のＣＡＲ発現細胞を１週間あたり２、３、または４回投与する）。１つの態様では、被験体にＣＡＲ発現細胞を１週間あたり１回を超える回数で投与し（例えば、１週間あたり２、３、または４回の投与）（サイクルとも称される）、その後の１週間はＣＡＲ発現細胞を投与せず、次いで、ＣＡＲ発現細胞の１またはそれを超える回数のさらなる投与（例えば、１週間あたり１回を超えるＣＡＲ発現細胞の投与）を被験体に行う。別の態様では、被験体（例えば、ヒト被験体）に、１サイクルを超えるＣＡＲ発現細胞を投与し、各々のサイクル間の期間は、１０、９、８、７、６、５、４、または３日未満である。１つの態様では、ＣＡＲ発現細胞を、１週間あたり１日おきに３回投与する。別の態様では、ＣＡＲ発現細胞を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間、またはそれを超えて投与する。患者に投与すべき上記処置の投薬量は、処置を受ける症状および処置のレシピエントの正確な性質に応じて変動するであろう。ヒトへの投与のための投薬量を、慣例にしたがって調整することができる。
【0109】
いくつかの態様では、ＣＡＲ発現細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで複製することができ、その結果長期で持続され、腫瘍の制御を維持することができる。様々な態様では、被験体に投与されるｉＰＳＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、もしくはＮＫ細胞、またはこれらの細胞の子孫は、被験体への細胞の投与後、少なくとも４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１４ヶ月間、１５ヶ月間、１６ヶ月間、１７ヶ月間、１８ヶ月間、１９ヶ月間、２０ヶ月間、２１ヶ月間、２２ヶ月間、２３、または１年間被験体中に存続する。他の態様では、細胞およびその子孫は、被験体へのＣＡＲ発現細胞の投与後、６ヶ月未満、５ヶ月未満、４ヶ月未満、３ヶ月未満、２ヶ月未満、１ヶ月未満（例えば、３週間、２週間、１週間）存在する。
【0110】
組成物を、任意の従来の様式で（注射、摂取、輸液、体内移植、移植が挙げられる）投与し得る。開示の組成物を、患者の経動脈、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、髄内、筋肉内、動脈内（肝動脈（ＨＡＩなど）または大腿動脈が挙げられる）、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、前立腺内（例えば、前立腺癌のため）、または腹腔内に投与することができる。いくつかの態様では、組成物を、皮内注射または皮下注射によって患者に投与する。他の態様では、開示の組成物を、ｉ．ｖ．注射によって投与する。他の態様では、開示の組成物を、動脈内注射によって投与する。また、組成物を、腫瘍またはリンパ節中に直接注射することができる。
【0111】
いくつかの態様では、白血球を採取し、ｅｘ ｖｉｖｏで富化するか枯渇させて目的の細胞（例えば、ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、および／またはＮＫ細胞）を選択および／または単離する白血球搬出を被験体に実施することができる。これらの細胞単離物を、公知の方法によって拡大し、１またはそれを超えるＣＡＲ構築物を導入できるように処置し、それにより、ＣＡＲを発現する自家細胞を作製し得る。本明細書中のいくつかの態様では、ＣＡＲ発現細胞を、ＣＡＲおよび短縮形態のヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ）を発現するレンチウイルスベクターを使用して生成する。ｈｕＥＧＦＲｔの同時発現により、上記ＶＩＩＩ項に記載のｈｕＥＧＦＲｔを認識する抗体（例えば、セツキシマブ、ＰＣＴ公開番号国際公開第２０１１／０５６８９４号を参照のこと）を使用して、ＣＡＲ発現免疫細胞を選択および精製可能である。
【0112】
いくつかの態様では、免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および／またはマクロファージなど）を、赤血球を溶解し、いくつかの場合、例えば、パーコール（商標）勾配による遠心分離または逆流遠心溶出法によって単球を枯渇させることによって末梢血から単離する。Ｔ細胞の特異的な亜集団（ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞など）を、ポジティブ選択技術またはネガティブ選択技術によってさらに単離することができる。例えば、Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）抱合ビーズ（ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔなど）との所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間のインキュベーションによって単離することができる（米国特許出願公開第２０１４０２７１６３５号を参照のこと）。非限定的な例では、時間は約３０分間である。他の非限定的な例では、時間は、３０分間から３６時間までまたはそれを超える時間の範囲およびその間の全ての整数値である。さらなる非限定的な例では、時間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間、１０～２４時間、２４時間またはそれを超える時間である。より長いインキュベーション時間を使用して、他の細胞型と比較してＴ細胞が少ない任意の状況（免疫無防備状態の個体からの単離など）においてＴ細胞を単離することができる。さらに、より長いインキュベーション時間を使用すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率を上昇させることができる。したがって、時間を単純に短縮または延長させることにより、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させることが可能であり、そして／あるいはＴ細胞に対するビーズの比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時または過程中の他の時点で自在に優先的に選択することができる。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８抗体の比を増加または減少させることにより、Ｔ細胞の亜集団を、培養開始時または他の所望の時点で自在に優先的に選択することができる。複数ラウンドの選択も使用することができる。
【0113】
ネガティブ選択による細胞集団の富化を、ネガティブ選択された細胞に固有の表面マーカーに指向する抗体と組み合わせて行うことができる。１つの方法は、ネガティブ選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向するモノクローナル抗体のカクテルを使用する負の磁性免疫接着またはフローサイトメトリーによる細胞の分取および／または選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋Ｔ細胞を富化するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。１またはそれを超えるサイトカインを発現するＴ細胞集団を選択することができる。細胞発現のスクリーニング方法は、ＰＣＴ公開国際公開第２０１３／１２６７１２号に開示されている。
【0114】
ポジティブ選択またはネガティブ選択による所望の細胞集団の単離のために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を、細胞およびビーズの接触が確実に最大になるように変動させることができる。いくつかの態様では、１０億個の細胞／ｍｌの濃度を使用する。さらなる態様では、１億個超の細胞／ｍｌを使用する。他の態様では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、５０００万、５５００万、６０００万、６５００万、７０００万、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、１億個の細胞／ｍｌの細胞濃度を使用する。理論に拘束されないが、高濃度で使用すると、細胞収量、細胞活性化、および細胞発現を増加させることができる。より低い細胞濃度も使用することができる。理論に拘束されないが、Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を著しく希釈すると、粒子と細胞との間の相互作用が最小になる。これにより、粒子に結合すべき所望の抗原を大量に発現する細胞が選択される。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、希釈された濃度でＣＤ２８をＣＤ８＋Ｔ細胞より高いレベルで発現し、より高い効率で捕捉される。いくつかの態様では、使用される細胞濃度は５×１０６／ｍｌである。他の態様では、使用濃度は、約１×１０５／ｍｌから１×１０６／ｍｌまで、およびその間の任意の整数値であり得る。
【0115】
ＩＸ．処置方法
治療有効量の本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ発現免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）またはＣＡＲ発現ｉＰＳＣを被験体に投与することによる被験体における癌の処置方法を本明細書中に提供する。治療有効量の本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ発現細胞を被験体に投与することによる被験体における腫瘍成長または転移の阻害方法も本明細書中に提供する。したがって、いくつかの例では、方法は、腫瘍のサイズ、体積、および／または重量を、例えば、処置前の腫瘍のサイズ、体積、および／または重量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％減少させる。いくつかの例では、方法は、転移のサイズ、体積、および／または重量を、例えば、処置前の転移のサイズ、体積、および／または重量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％減少させる。いくつかの例では、方法は、ＧＰＣ３陽性癌を有する被験体の生存期間を、例えば、本明細書中に提供した処置を行わなかった生存期間と比較して、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）３６ヶ月間、少なくとも４８ヶ月間、または少なくとも６０ヶ月間延長する。いくつかの例では、これらの効果の組み合わせが達成される。
治療有効量の本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ発現免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）またはＣＡＲ発現ｉＰＳＣを被験体に投与することによる被験体における癌の処置方法を本明細書中に提供する。治療有効量の本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ発現細胞を被験体に投与することによる被験体における腫瘍成長または転移の阻害方法も本明細書中に提供する。したがって、いくつかの例では、方法は、腫瘍のサイズ、体積、および／または重量を、例えば、処置前の腫瘍のサイズ、体積、および／または重量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％減少させる。いくつかの例では、方法は、転移のサイズ、体積、および／または重量を、例えば、処置前の転移のサイズ、体積、および／または重量と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％減少させる。いくつかの例では、方法は、ＧＰＣ３陽性癌を有する被験体の生存期間を、例えば、本明細書中に提供した処置を行わなかった生存期間と比較して、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１８ヶ月間、少なくとも２４ヶ月間、少なくとも（ａｔ ｌａｓｔ）３６ヶ月間、少なくとも４８ヶ月間、または少なくとも６０ヶ月間延長する。いくつかの例では、これらの効果の組み合わせが達成される。
【0116】
被験体におけるＧＰＣ３陽性癌の処置方法を具体的に提供する。いくつかの態様では、方法は、被験体に、治療有効量の、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔをコードする核酸分子を含む単離された免疫細胞またはｉＰＳＣを投与する工程、または治療有効量の、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔを同時発現する単離された免疫細胞またはｉＰＳＣを投与する工程を含む。いくつかの態様では、ＧＰＣ３陽性癌は、肝細胞癌（ＨＣＣ）、黒色腫、卵巣明細胞癌、卵黄嚢腫瘍（ＹＳＴ）、神経芽細胞腫、肝芽腫、ウィルムス腫瘍、肺の扁平上皮癌、精巣非セミノーマ性胚細胞腫瘍、脂肪肉腫、子宮頸部上皮内新形成、副腎の腺腫、シュワン細胞腫、または胎児性腫瘍である。具体的な態様では、処置される癌はＨＣＣである。
【0117】
本明細書中に開示の方法のいくつかの態様では、単離された免疫細胞はＴリンパ球である。いくつかの例では、Ｔリンパ球は自家Ｔリンパ球である。他の態様では、単離された宿主細胞は、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージである。
【0118】
治療有効量のＣＡＲ発現免疫細胞またはｉＰＳＣは、疾患の重症度、疾患のタイプ、および患者の一般的な健康状態に依存するであろう。治療有効量のＣＡＲ発現細胞およびその組成物は、徴候（複数可）の主観的な軽減または臨床医もしくは他の適格な観察者によって指摘された客観的に同定可能な改善（腫瘍の容積または転移の減少など）のいずれかを提供するものである。
【0119】
本明細書中に開示のＣＡＲ発現細胞および組成物を、他の抗癌剤の投与または治療上の処置（腫瘍の外科的切除など）によって投与することもできる。任意の好適な抗癌剤を、本明細書中に開示の組成物と組み合わせて投与することができる。例示的な抗癌剤としては、化学療法剤（例えば、分裂阻止因子、アルキル化剤、代謝拮抗物質、挿入抗生物質、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物学的応答調節物質、抗ホルモン（例えば、抗アンドロゲン）、および抗血管形成剤など）が挙げられるが、これらに限定されない。他の抗癌処置としては、放射線療法および癌細胞または他の細胞を特異的に標的にする抗体（例えば、ｍＡｂ）（例えば、抗ＰＤ－１、抗ＣＬＴＡ４、抗ＥＧＦＲ、または抗ＶＥＧＦ）が挙げられる。１つの例では、癌を、本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ免疫細胞（ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）および１またはそれを超える治療ｍＡｂ（ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、デュルバルマブ、ＫＮ０３５、コシベリマブ、ＢＭＳ－９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ－４７３６、ＭＰＤＬ－３２８０Ａ、またはＭＥＤＩ－４７３７）、またはＣＬＴＡ－４抗体（例えば、イピリムマブまたはトレメリムマブ）のうちの１つまたは複数など）の投与によって処置する。１つの例では、癌を、本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ免疫細胞（ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）および、例えば、以下の１またはそれを超えるｍＡｂの投与によって処置する：３Ｆ８、アバゴボマブ、アデカツムマブ、アフツズマブ、アラシズマブ、アレムツズマブ、アルツモマブペンテタート、アナツモマブ・マフェントクス、アポリズマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ、ベクツモマブ、ベリムマブ、ベシレソマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブ・メルタンシン、ブリナツモマブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、カンツズマブ・メルタンシン、カプロマブ・ペンデチド、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セツキシマブ、シタツズマブ・ボガトクス、シクスツムマブ、クリバツズマブ・テトラキセタン、コナツムマブ、ダセツズマブ、デツモマブ、エクロメキシマブ、エクリズマブ、エドレコロマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ、エタラシズマブ、ファーレツズマブ、フィギツムマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、ギレンツキシマブ、グレムバツムマブ・ベドチン、イブリツモマブ・チウキセタン、イゴボマブ、イムシロマブ、インテツムマブ、イノツズマブ・オゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ、ラベツズマブ、レキサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブ・メルタンシン、ルカツムマブ、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ、ミラツズマブ、ミツモマブ、モロリムマブ、ナコロマブ・タフェナトクス、ナプツモマブ・エスタフェナトクス、ネシツムマブ、ニモツズマブ、ノフェツモマブ・メルペンタン、オファツムマブ、オララツマブ、オポルツズマブ・モナトクス、オレゴボマブ、パニツムマブ、ペムツモマブ、ペルツズマブ、ピンツモマブ、プリツムマブ、ラムシルマブ、リロツムマブ、リツキシマブ、ロバツムマブ、サツモマブ・ペンデチド、シブロツズマブ、ソネプシズマブ、タカツズマブ・テトラキセタン、タプリツモマブ・パプトクス、テナツモマブ、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（トレメリムマブ）、チガツズマブ、ＴＮＸ－６５０、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブ・セルモロイキン、ベルツズマブ、ボロシキシマブ、ボツムマブ、ザルツムマブ、またはこれらの組み合わせ。
【0120】
１つの例では、癌を、本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ免疫細胞（ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）および／または１またはそれを超えるアルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード、またはクロラムブシルなど）、スルホン酸アルキル（ブスルファンなど）、ニトロソ尿素（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジンなど）を投与することによって処置する。
【0121】
１つの例では、癌を、本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ免疫細胞（ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）、ならびに１またはそれを超える代謝拮抗物質、例えば、葉酸アナログ（メトトレキサートなど）、ピリミジンアナログ（５－ＦＵまたはシタラビンなど）、およびプリンアナログ、例えば、メルカプトプリンまたはチオグアニンを投与することによって処置する。
【0122】
１つの例では、癌を、本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ免疫細胞（ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）、ならびに１またはそれを超える天然物（ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシンなど）、エピポドフィロトキシン（エトポシドまたはテニポシドなど）、抗生物質（ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣなど）、および酵素（Ｌ－アスパラギナーゼなど）などが挙げられる）を投与することによって処置する。
【0123】
１つの例では、癌を、本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ免疫細胞（ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）、ならびに１またはそれを超える白金配位錯体（シスプラチンとしても公知のシス－ジアミン－ジクロロ白金ＩＩなど）、置換尿素（ヒドロキシ尿素など）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジンなど）、および副腎皮質（ａｄｒｅｎｏｃｒｏｔｉｃａｌ）抑制薬（ミトタンおよびアミノグルテチミドなど）を投与することによって処置する。
【0124】
１つの例では、癌を、本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ免疫細胞（ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）、ならびに１またはそれを超えるホルモンまたはアンタゴニスト、例えば、副腎皮質ステロイド（プレドニゾンなど）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール（ｍａｇｅｓｔｒｏｌ ａｃｅｔａｔｅ）など）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールなど）、抗エストロゲン（タモキシフェンなど）、およびアンドロゲン（テステロンプロピオナートおよびフルオキシメステロンなど）を投与することによって処置する。
【0125】
１つの例では、癌を、本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ免疫細胞（ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）、ならびに１またはそれを超える化学療法薬、例えば、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ－Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチナム、シスプラチナム、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５－ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イフォスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（または他のタキサン、例えば、ドセタキセル）、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ－１６、ゲムシタビン（ジェムザール）、ハーセプチン、イリノテカン（カムプトザール、ＣＰＴ－１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ－５７１、タキソテール、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼベリン、およびカルシトリオールを投与することによって処置する。
【0126】
１つの例では、癌を、本明細書中に開示のＧＰＣ３標的化ＣＡＲ免疫細胞（ｉＰＳＣ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージなど）、ならびに１またはそれを超える免疫調節薬、例えば、ＡＳ－１０１（Ｗｙｅｔｈ－Ａｙｅｒｓｔ Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ－ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ－２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ－ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、イムレグ（Ｉｍｒｅｇ ｏｆ Ｎｅｗ Ｏｒｌｅａｎｓ，Ｌａ．）、ＳＫ＆Ｆ １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を投与することによって処置する。
【0127】
本明細書中に提供した処置と組み合わせて使用することができる別の処置は、外科的処置、例えば、癌またはその一部の外科的切除である。処置の別の例は、照射療法、例えば、腫瘍の根治または外科的切除前の腫瘍の縮小を支援するための腫瘍部位への放射性物質またはエネルギー（体外放射線療法など）の投与である。
具体例において、方法は、被験体に、治療有効量の（１）ＧＰＣ３標的化ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔをコードする核酸分子を含む単離された免疫細胞またはｉＰＳＣを投与すること、または治療有効量の、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔを同時発現する単離された免疫細胞またはｉＰＳＣを投与することによってＨＣＣを処置する工程を含む。いくつかの例では、方法は、被験体に、治療有効量の１またはそれを超える他の化学療法剤または生物学的作用因子を投与する工程をさらに含む。いくつかの態様では、１またはそれを超える他の化学療法剤または生物学的作用因子は、５－ＦＵ、シスプラチン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、カペシタビン、フロクスウリジン、またはミトキサントロン、例えば、ゲムシタビン＋オキサリプラチン（ＧＥＭＯＳ）、フロクスウリジン、シスプラチン、およびオキサリプラチン、または５－ＦＵ、オキサリプラチン、およびロイコボリン（ＦＯＬＦＯＸ）のうちの１つまたは複数である。いくつかの態様では、１またはそれを超える他の化学療法剤または生物学的作用因子は、ソラフェニブ、レンバチニブ、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、およびラムシルマブのうちの１つまたは複数である。いくつかの態様では、１またはそれを超える他の化学療法剤または生物学的作用因子は、免疫療法薬、例えば、ペムブロリズマブおよび／またはニボルマブである。
具体例において、方法は、被験体に、治療有効量の（１）ＧＰＣ３標的化ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔをコードする核酸分子を含む単離された免疫細胞またはｉＰＳＣを投与すること、または治療有効量の、ＧＰＣ３標的化ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔを同時発現する単離された免疫細胞またはｉＰＳＣを投与することによってＨＣＣを処置する工程を含む。いくつかの例では、方法は、被験体に、治療有効量の１またはそれを超える他の化学療法剤または生物学的作用因子を投与する工程をさらに含む。いくつかの態様では、１またはそれを超える他の化学療法剤または生物学的作用因子は、５－ＦＵ、シスプラチン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、カペシタビン、フロクスウリジン、またはミトキサントロン、例えば、ゲムシタビン＋オキサリプラチン（ＧＥＭＯＳ）、フロクスウリジン、シスプラチン、およびオキサリプラチン、または５－ＦＵ、オキサリプラチン、およびロイコボリン（ＦＯＬＦＯＸ）のうちの１つまたは複数である。いくつかの態様では、１またはそれを超える他の化学療法剤または生物学的作用因子は、ソラフェニブ、レンバチニブ、レゴラフェニブ、カボザンチニブ、およびラムシルマブのうちの１つまたは複数である。いくつかの態様では、１またはそれを超える他の化学療法剤または生物学的作用因子は、免疫療法薬、例えば、ペムブロリズマブおよび／またはニボルマブである。
【0128】
以下の実施例を、ある特定の特徴および／または態様を説明するために提供する。これらの実施例は、本開示を特定の記載の特徴または態様に制限すると解釈されないものとする。
【実施例】
【0129】
実施例
完全なヒトＨＮ３ナノボディは、いくつかの魅力的な特徴（ヒトにおける免疫原性の懸念を和らげる能力；マウスおよびヒトＧＰＣ３への異種間結合；およびＷｎｔ遮断能が挙げられる）を有する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７０（４）：１２３１－１２４５，２０１９；Ｆｌｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７１（５）：１６９６－１７１１，２０２０；Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０（１２）：Ｅ１０８３－Ｅ１０９１，２０１３；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６６（４）：４７５－４８９，２０１７；Ｐｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ４（５）：５９２－５９９，２０１２；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６０（１５２７－３３５０）：５７６－５８７，２０１４；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｈｏ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：６３３８７８，２０１６）。完全なヒトＨＮ３の特徴は、マウス由来ｓｃＦｖと比較して免疫原性による制約が小さいことである。異種間の特徴は、マウスモデルにおける前臨床試験を迅速に行い、ナノボディの内容を変更することなくヒトで研究することが可能である。最後に、ＨＮ３ナノボディは、ＧＰＣ３のネイティブなＷｎｔ結合ドメインを特異的に標的にし、そして不活化する。Ｗｎｔシグナル伝達の上方制御がＨＣＣ病理発生における重要因子であるので、天然結合領域の活用は有利である（ｄｅ Ｌａ Ｃｏｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５（１５）：８８４７－８８５１，１９９８；Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｃｅｌｌ １６９（７）：１３２７－１３４１，２０１７；Ｌａｕｒｅｎｔ－Ｐｕｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２０（７）：１７６３－１７７３，２００１；Ｚｕｃｍａｎ－Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４３（３）：５１５－５２４，２００６；Ｃａｐｕｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５（１４）：６２４５－６２５４，２００５）。
完全なヒトＨＮ３ナノボディは、いくつかの魅力的な特徴（ヒトにおける免疫原性の懸念を和らげる能力；マウスおよびヒトＧＰＣ３への異種間結合；およびＷｎｔ遮断能が挙げられる）を有する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７０（４）：１２３１－１２４５，２０１９；Ｆｌｅｍｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７１（５）：１６９６－１７１１，２０２０；Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０（１２）：Ｅ１０８３－Ｅ１０９１，２０１３；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ６６（４）：４７５－４８９，２０１７；Ｐｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ４（５）：５９２－５９９，２０１２；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ６０（１５２７－３３５０）：５７６－５８７，２０１４；Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｈｏ，Ｓｃｉ Ｒｅｐ ６：６３３８７８，２０１６）。完全なヒトＨＮ３の特徴は、マウス由来ｓｃＦｖと比較して免疫原性による制約が小さいことである。異種間の特徴は、マウスモデルにおける前臨床試験を迅速に行い、ナノボディの内容を変更することなくヒトで研究することが可能である。最後に、ＨＮ３ナノボディは、ＧＰＣ３のネイティブなＷｎｔ結合ドメインを特異的に標的にし、そして不活化する。Ｗｎｔシグナル伝達の上方制御がＨＣＣ病理発生における重要因子であるので、天然結合領域の活用は有利である（ｄｅ Ｌａ Ｃｏｓｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５（１５）：８８４７－８８５１，１９９８；Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｎｅｔｗｏｒｋ，Ｃｅｌｌ １６９（７）：１３２７－１３４１，２０１７；Ｌａｕｒｅｎｔ－Ｐｕｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２０（７）：１７６３－１７７３，２００１；Ｚｕｃｍａｎ－Ｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ４３（３）：５１５－５２４，２００６；Ｃａｐｕｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５（１４）：６２４５－６２５４，２００５）。
【0130】
以下の実施例は、ＧＰＣ３陽性腫瘍細胞に輸送するためのターゲティングエレメントとしてＨＮ３ナノボディまたはｈＹＰ７ ｓｃＦｖを使用したＧＰＣ３標的化ＣＡＲの合理的なデザインを記載する。ヒンジおよび膜貫通ドメインの正確な操作によって抗腫瘍有効性が最大になることを本明細書中で実証している。各々のヒンジおよび膜貫通成分の寄与を分析することにより、ヒンジおよび膜貫通が相乗的に作用すると判定した。
【0131】
下記のデータは、ＩｇＧ４ヒンジおよびＣＤ２８膜貫通を含むＨＮ３操作Ｔ細胞が迅速で強力な持続的抗腫瘍応答を誘導したことを実証している。さらに、これらの抗腫瘍応答は、他のＣＡＲ Ｔ細胞で認められない特異的ＣＤ８＋Ｔｅｍｒａシグネチャーと相関していた。
【0132】
実施例１：材料と方法
この実施例は、実施例２～６に記載の研究で使用した材料および実験手順を記載する。
この実施例は、実施例２～６に記載の研究で使用した材料および実験手順を記載する。
【0133】
細胞モデル
Ｈｅｐ３Ｂ（ＨＣＣ）、ＨｅｐＧ２（肝芽腫）、ＨＥＫ－２９３Ｔ、およびＪｕｒｋａｔ細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２を、ルシフェラーゼを発現するレンチウイルスで形質導入した。Ｈｅｐ３ＢＫＯ ＧＦＰ－ルシフェラーゼ細胞株を、以前に記載のようにＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ノックアウトを使用して樹立した。細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ－グルタミン、および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地中で５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下にて３７℃で培養した。健康なドナーの末梢血由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、製造者の説明書に従ってＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して単離した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ－グルタミン、および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ－１６４０培地中で５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下にて３７℃で成長させた。
Ｈｅｐ３Ｂ（ＨＣＣ）、ＨｅｐＧ２（肝芽腫）、ＨＥＫ－２９３Ｔ、およびＪｕｒｋａｔ細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。Ｈｅｐ３ＢおよびＨｅｐＧ２を、ルシフェラーゼを発現するレンチウイルスで形質導入した。Ｈｅｐ３ＢＫＯ ＧＦＰ－ルシフェラーゼ細胞株を、以前に記載のようにＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９ノックアウトを使用して樹立した。細胞株を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％Ｌ－グルタミン、および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地中で５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下にて３７℃で培養した。健康なドナーの末梢血由来の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、製造者の説明書に従ってＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して単離した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ－グルタミン、および１％ペニシリン－ストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ－１６４０培地中で５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気下にて３７℃で成長させた。
【0134】
Ｊｕｒｋａｔ結合およびＪｕｒｋａｔ ＮＦκＢレポーター
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＣＡＲ含有レンチウイルスを用いて感染多重度（ＭＯＩ）５で形質導入した。７日後、細胞表面ＥＧＦＲｔを、抗ヒトＩｇＧ－フィコエリトリン（ＡＰＣ）抱合抗体を使用して査定した。ｈＦｃでタグ化したＧＰＣ３タンパク質（ＡＣＲＯ）のＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞への細胞表面結合を、抗ヒトＩｇＧ－フィコエリトリン（ＡＰＣ）抱合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用して査定した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＣＡＲ含有レンチウイルスを用いて感染多重度（ＭＯＩ）５で形質導入した。７日後、細胞表面ＥＧＦＲｔを、抗ヒトＩｇＧ－フィコエリトリン（ＡＰＣ）抱合抗体を使用して査定した。ｈＦｃでタグ化したＧＰＣ３タンパク質（ＡＣＲＯ）のＣＡＲ発現Ｊｕｒｋａｔ細胞への細胞表面結合を、抗ヒトＩｇＧ－フィコエリトリン（ＡＰＣ）抱合抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）を使用して査定した。
【0135】
ＣＡＲ Ｔ細胞の産生
ＣＡＲ Ｔ細胞を、以前に記載のように産生した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １５８（８）：２２５０－２２６５，２０２０）。簡潔に述べれば、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、カルフェクチン（ＳｉｇｎａＧｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用してパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ番号１２２６０）およびエンベロープ型プラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ番号１２２５９）で同時トランスフェクトした。レンチウイルス粒子を回収し、濃縮し、機能力価を、ＥＧＦＲｔマーカーを使用して査定した。健康なドナー由来のＰＢＭＣを、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズを使用して、インターロイキン２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在下で２４時間刺激した。細胞カウントおよび生存能を追跡するために、生存細胞を、トリパンブルーを使用してカウントした。
ＣＡＲ Ｔ細胞を、以前に記載のように産生した（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １５８（８）：２２５０－２２６５，２０２０）。簡潔に述べれば、ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞を、カルフェクチン（ＳｉｇｎａＧｅｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用してパッケージングプラスミドｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ番号１２２６０）およびエンベロープ型プラスミドｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ番号１２２５９）で同時トランスフェクトした。レンチウイルス粒子を回収し、濃縮し、機能力価を、ＥＧＦＲｔマーカーを使用して査定した。健康なドナー由来のＰＢＭＣを、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体をコーティングしたビーズを使用して、インターロイキン２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在下で２４時間刺激した。細胞カウントおよび生存能を追跡するために、生存細胞を、トリパンブルーを使用してカウントした。
【0136】
細胞死滅研究
細胞溶解アッセイを、以前に記載のようにＧＰＣ３ ＣＡＲで形質導入したルシフェラーゼ発現細胞株およびＴ細胞を使用して行った（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１８（５）：１２５５－１２６３，２０１１）。簡潔に述べれば、腫瘍細胞をＴ細胞と表示のエフェクター－標的比で２４時間インキュベートした。ライセートの発光を、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してプレート分光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にて分析した。各々の試料の特異的溶解を、標的細胞のみの発光（それぞれ０％溶解および１００％溶解に対応する）を使用して計算した。
細胞溶解アッセイを、以前に記載のようにＧＰＣ３ ＣＡＲで形質導入したルシフェラーゼ発現細胞株およびＴ細胞を使用して行った（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１８（５）：１２５５－１２６３，２０１１）。簡潔に述べれば、腫瘍細胞をＴ細胞と表示のエフェクター－標的比で２４時間インキュベートした。ライセートの発光を、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してプレート分光光度計（Ｖｉｃｔｏｒ，Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）にて分析した。各々の試料の特異的溶解を、標的細胞のみの発光（それぞれ０％溶解および１００％溶解に対応する）を使用して計算した。
【0137】
動物研究
異種移植片マウスモデルを、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ガンマ（ＮＳＧ）マウスに３×１０６個のＨｅｐ３Ｂ細胞または１×１０６個のＨｕｈ７ ＧＦＰ－ルシフェラーゼ細胞を腹腔内注射することによって樹立した。平均腫瘍生物発光が１×１０８に到達したとき、マウスに、５×１０６個の非形質導入の正常ヒトドナーＴ細胞または操作されたＨＮ３ ＣＡＲ Ｔ細胞を腹腔内または静脈内に注射した。処置したマウスを、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－２００Ｓｐｅｃｔｒｕｍカメラにて１～４週目の間は週に２回、４週目以後は週１回画像化した。ＩＡＣＵＣ承認された罹病率エンドポイント（苦痛の任意の兆候が挙げられる）に到達したときにマウスを安楽死させた。
異種移植片マウスモデルを、ＮＯＤ－ＳＣＩＤ－ガンマ（ＮＳＧ）マウスに３×１０６個のＨｅｐ３Ｂ細胞または１×１０６個のＨｕｈ７ ＧＦＰ－ルシフェラーゼ細胞を腹腔内注射することによって樹立した。平均腫瘍生物発光が１×１０８に到達したとき、マウスに、５×１０６個の非形質導入の正常ヒトドナーＴ細胞または操作されたＨＮ３ ＣＡＲ Ｔ細胞を腹腔内または静脈内に注射した。処置したマウスを、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ－２００Ｓｐｅｃｔｒｕｍカメラにて１～４週目の間は週に２回、４週目以後は週１回画像化した。ＩＡＣＵＣ承認された罹病率エンドポイント（苦痛の任意の兆候が挙げられる）に到達したときにマウスを安楽死させた。
【0138】
実施例２：ＨＮ３ナノボディＣＡＲ Ｊｕｒｋａｔ細胞は、抗原特異性を保持する
いくつかのＣＡＲ構築物を、（１）抗原結合ドメインとしてのＨＮ３またはｈＹＰ７ ｓｃＦｖ、（２）改変されたＩｇＧ４由来のヒンジ領域（ＩｇＧ４Ｈ）またはＣＤ８由来のヒンジ領域（ＣＤ８Ｈ）、および（３）ＣＤ８（ＣＤ８ＴＭ）またはＣＤ２８（ＣＤ２８ＴＭ）由来の膜貫通ドメインを使用して生成した：ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ、ｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、およびｈＹＰ７－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８８ＴＭ。これらのＣＡＲ構築物を、図２Ａおよび図２Ｂに示す。Ｔ細胞を、ＣＡＲ含有レンチウイルスで形質導入し、細胞カウントを、トランスフェクション後１１日目まで測定した（図２Ｃ）。形質導入したＴ細胞の細胞カウントは、非形質導入Ｔ細胞と有意に異ならなかった。また、ＣＡＲ構築物の形質導入効率を、８日目のＣＡＲ陽性細胞の検出によって測定した（図２Ｄ）。
いくつかのＣＡＲ構築物を、（１）抗原結合ドメインとしてのＨＮ３またはｈＹＰ７ ｓｃＦｖ、（２）改変されたＩｇＧ４由来のヒンジ領域（ＩｇＧ４Ｈ）またはＣＤ８由来のヒンジ領域（ＣＤ８Ｈ）、および（３）ＣＤ８（ＣＤ８ＴＭ）またはＣＤ２８（ＣＤ２８ＴＭ）由来の膜貫通ドメインを使用して生成した：ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ、ｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、およびｈＹＰ７－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８８ＴＭ。これらのＣＡＲ構築物を、図２Ａおよび図２Ｂに示す。Ｔ細胞を、ＣＡＲ含有レンチウイルスで形質導入し、細胞カウントを、トランスフェクション後１１日目まで測定した（図２Ｃ）。形質導入したＴ細胞の細胞カウントは、非形質導入Ｔ細胞と有意に異ならなかった。また、ＣＡＲ構築物の形質導入効率を、８日目のＣＡＲ陽性細胞の検出によって測定した（図２Ｄ）。
【0139】
操作されたＧＰＣ３標的化ＣＡＲの抗原特異性および細胞結合能を試験するために、ＣＡＲ構築物でトランスフェクトしたＴ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ）を作出し、ヒトＦｃでタグ化したＧＰＣ３（ＧＰＣ３－ｈＦｃ）への結合を査定した。最初に、ＣＡＲレンチウイルスによって発現された短縮ＥＧＦＲマーカーを使用して、全てのＣＡＲ構築物で首尾の良い形質導入（９５～９８％）が確認された。次に、全てのＪｕｒｋａｔ－ＣＡＲ構築物が１、２、および５μｇ／ｍＬでＧＰＣ３－ｈＦｃに効率よく（７５．８～９８．６％）結合することが実証された（図１Ａ）。全てのＣＡＲ Ｔ細胞は、同一濃度でＧＰＣ３－ｈＦｃに特異的に結合し（図１Ａ）、ＧＰＣ１－ｈＦｃ（図１Ｂ）に結合しなかった。概して、このデータは、ＨＮ３および操作されたＨＮ３ ＣＡＲがＧＰＣ３に特異的に結合し、他のグリピカンへの非特異的結合は最小であることを示す。
【0140】
実施例３：ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの高いおよび低い抗原密度の設定で活性を増強する
高い抗原密度の状況と低い抗原密度の状況を対比してＣＡＲ Ｔ細胞の効力を試験するために、種々の抗原密度を有する複数のＨＣＣ細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、およびＨｕｈ７）を使用した（Ｆｕ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７０（２）：５６３－５７６，２０１９）。これらの細胞株を、腫瘍進行度が異なるレベルの多様な患者から単離した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞はＧＰＣ３を高発現し、一方で、Ｈｕｈ７細胞はＧＰＣ３をより低い程度に発現する。ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞が全てのＨＣＣ株において最も高い細胞死滅を示した一方で、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞は低抗原密度のＨｕｈ７細胞において高い活性を示したことが見出された（図２Ｅ～２Ｈ）。ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞はＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して４０％の死滅改善が実証され、ＣＤ２８ＴＭが低いおよび高い抗原密度条件下の両方においてＣＡＲ Ｔの効力を増大させることを示していた。しかしながら、ＣＤ２８ＴＭのみではより低い比で１００％死滅を誘導するには不十分である。ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ２８ＴＭをＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭと比較して、ＩｇＧ４Ｈは効力を１０～２０％増加させた。全てのＣＡＲ Ｔ細胞は、ＧＰＣ３ノックアウト細胞株との反応が最小であり（図２Ｆ）、これらの条件下では同種抗原反応性および抗原特異的細胞死滅のレベルが低かった。まとめると、これらの結果は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭが試験した中で最も強力なＣＡＲ構築物であることを示す。ＩｇＧ４ヒンジおよびＣＤ２８ ＴＭの両方は、ＧＰＣ３ ＣＡＲ Ｔ細胞治療の抗腫瘍効果を非依存的に増強する。
高い抗原密度の状況と低い抗原密度の状況を対比してＣＡＲ Ｔ細胞の効力を試験するために、種々の抗原密度を有する複数のＨＣＣ細胞株（Ｈｅｐ３Ｂ、ＨｅｐＧ２、およびＨｕｈ７）を使用した（Ｆｕ ｅｔ ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７０（２）：５６３－５７６，２０１９）。これらの細胞株を、腫瘍進行度が異なるレベルの多様な患者から単離した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞はＧＰＣ３を高発現し、一方で、Ｈｕｈ７細胞はＧＰＣ３をより低い程度に発現する。ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞が全てのＨＣＣ株において最も高い細胞死滅を示した一方で、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞は低抗原密度のＨｕｈ７細胞において高い活性を示したことが見出された（図２Ｅ～２Ｈ）。ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞はＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞と比較して４０％の死滅改善が実証され、ＣＤ２８ＴＭが低いおよび高い抗原密度条件下の両方においてＣＡＲ Ｔの効力を増大させることを示していた。しかしながら、ＣＤ２８ＴＭのみではより低い比で１００％死滅を誘導するには不十分である。ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ２８ＴＭをＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭと比較して、ＩｇＧ４Ｈは効力を１０～２０％増加させた。全てのＣＡＲ Ｔ細胞は、ＧＰＣ３ノックアウト細胞株との反応が最小であり（図２Ｆ）、これらの条件下では同種抗原反応性および抗原特異的細胞死滅のレベルが低かった。まとめると、これらの結果は、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭが試験した中で最も強力なＣＡＲ構築物であることを示す。ＩｇＧ４ヒンジおよびＣＤ２８ ＴＭの両方は、ＧＰＣ３ ＣＡＲ Ｔ細胞治療の抗腫瘍効果を非依存的に増強する。
【0141】
実施例４：Ｆｃを持たないＩｇＧ４ＨおよびＣＤ２８ＴＭドメインはｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＮ３効力を増強する
ヒンジの長さが抗原結合に影響を及ぼすかどうかを試験するために、Ｆｃ成分を組み込み、短いヒンジ（ＩｇＧ４Ｈ）、中程度のヒンジ（ＩｇＧ４－ＣＨ３）、および長いヒンジ（ＩｇＧ４－ＣＨ２ＣＨ３）を有するＨＮ３ ＣＡＲ Ｔ細胞を試験した（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．１１（４８５）：ｅａａｕ７７４６，２０１９；Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３（４）：７５７－７６８，２０１５）。細胞カウントおよび形質導入アッセイは、長いヒンジの構築物は同一ＭＯＩで拡大するのがより遅く、あまり有効に発現しないことを示した。全ての構築物は、ＧＰＣ３ノックアウトＨｅｐ３Ｂ細胞（ｅｌｌ）との反応が最小であり、抗原特異的相互作用を示していた。ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞は、中程度および長いヒンジのＣＡＲ Ｔ細胞より優れていた。これらのデータは、Ｆｃを使用したヒンジの伸長は必要なく、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＮ３－ＧＰＣ３相互作用を妨害する可能性があることを実証している。要するに、このデータから、ＩｇＧ４ＨおよびＣＤ２８ＴＭを共に使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでの強力な死滅を誘導するようにＨＮ３ナノボディを操作することができることが確認された。
ヒンジの長さが抗原結合に影響を及ぼすかどうかを試験するために、Ｆｃ成分を組み込み、短いヒンジ（ＩｇＧ４Ｈ）、中程度のヒンジ（ＩｇＧ４－ＣＨ３）、および長いヒンジ（ＩｇＧ４－ＣＨ２ＣＨ３）を有するＨＮ３ ＣＡＲ Ｔ細胞を試験した（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．１１（４８５）：ｅａａｕ７７４６，２０１９；Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２３（４）：７５７－７６８，２０１５）。細胞カウントおよび形質導入アッセイは、長いヒンジの構築物は同一ＭＯＩで拡大するのがより遅く、あまり有効に発現しないことを示した。全ての構築物は、ＧＰＣ３ノックアウトＨｅｐ３Ｂ細胞（ｅｌｌ）との反応が最小であり、抗原特異的相互作用を示していた。ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞は、中程度および長いヒンジのＣＡＲ Ｔ細胞より優れていた。これらのデータは、Ｆｃを使用したヒンジの伸長は必要なく、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＮ３－ＧＰＣ３相互作用を妨害する可能性があることを実証している。要するに、このデータから、ＩｇＧ４ＨおよびＣＤ２８ＴＭを共に使用してｉｎ ｖｉｔｒｏでの強力な死滅を誘導するようにＨＮ３ナノボディを操作することができることが確認された。
【0142】
実施例５：ＨＮ３－ＩｇＧＨ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞は、マウスにおいて高ＧＰＣ３ ＨＣＣ異種移植片を根絶する
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの操作されたＣＡＲ Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性の両方が実証されたので、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を試験するためにさらなる研究を行った。第１の研究では（図３Ａ）、Ｈｅｐ３Ｂ ＧＦＰ／ルシフェラーゼ発現細胞（３００万個）をＮＳＧマウスにＩＰ注射し、１２日間生着させた。マウスを、０日目に５００万個のｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、ｈＹＰ７－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、またはＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置し、定期的に画像化した。結果を、図３Ｂ～３Ｄに示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの所見と一致して、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞は高い抗腫瘍活性を実証し、腫瘍は１０日以内に根絶された。対照的に、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭ群の腫瘍は、一部が応答し、研究中に成長し続けた。非形質導入Ｔ細胞、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、およびｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスの生存期間中央値は、それぞれ２７、２９、および３０日であった。対照的に、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ、およびＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭで処置した３匹のマウスは、研究終了時まで（３５日目）生存した。ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ群は、腫瘍サイズの迅速な減少が３日目から開始され、最終的に全研究期間にわたって腫瘍を担持しない状態を維持した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの操作されたＣＡＲ Ｔ細胞の特異性および細胞傷害性の両方が実証されたので、ｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を試験するためにさらなる研究を行った。第１の研究では（図３Ａ）、Ｈｅｐ３Ｂ ＧＦＰ／ルシフェラーゼ発現細胞（３００万個）をＮＳＧマウスにＩＰ注射し、１２日間生着させた。マウスを、０日目に５００万個のｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、ｈＹＰ７－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、またはＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置し、定期的に画像化した。結果を、図３Ｂ～３Ｄに示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの所見と一致して、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞は高い抗腫瘍活性を実証し、腫瘍は１０日以内に根絶された。対照的に、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭ群の腫瘍は、一部が応答し、研究中に成長し続けた。非形質導入Ｔ細胞、ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ、およびｈＹＰ７－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスの生存期間中央値は、それぞれ２７、２９、および３０日であった。対照的に、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ、およびＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ８ＴＭで処置した３匹のマウスは、研究終了時まで（３５日目）生存した。ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ群は、腫瘍サイズの迅速な減少が３日目から開始され、最終的に全研究期間にわたって腫瘍を担持しない状態を維持した。
【0143】
ｓｃＦｖとナノボディの性能の問題に取り組むために、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭと比較するためにｈＹＰ７－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞を含めた。ｈＹＰ７－ＩｇＧＨ－ＣＤ２８ＴＭ構築物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで形質導入することが困難であり、形質導入率は２５～３０％であった。これらの課題にもかかわらず、構築物は、特にＨｅｐ３Ｂ株およびＨｅｐＧ２株において試験した細胞でうまく機能した。驚いたことに、ｉｎ ｖｉｖｏでは、ｈＹＰ７構築物は腫瘍退縮の誘導が３０日目まで遅延された一方で、操作されたＨＮ３構築物は３日以内に腫瘍退縮を誘導した。これらのデータは、同一の用量レベルでＨＮ３－ＩｇＧ４－ＣＤ２８ＴＭがｈＹＰ７－ＩｇＧ４－ＣＤ２８ＴＭより強力であることを示唆している。
【0144】
上記と同一の研究条件を使用した第２の研究では（図４Ａ）、Ｆｃ含有ＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性を試験した。結果を図４Ｂ～４Ｄに示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの所見と一致して、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ群では、腫瘍は７日以内に退縮した。ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ群の全ての腫瘍は完全に根絶され、６７日後に再成長しなかった。Ｆｃ成分を含むＣＡＲ Ｔ細胞で処置したマウスは、部分応答を示した。特に、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭ群（「ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ－Ｍ」）の５匹のマウスのうちの４匹は２４日目に腫瘍が存在せず、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ２ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭ（「ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ－Ｌ」）群の５匹のマウスのうちの２匹は１５日目に腫瘍が存在しなかった。ＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ群は、ＣＡＲ Ｔ細胞処置に応答しなかった。
【0145】
ｉｎ ｖｉｖｏでの低抗原密度モデルでは（Ｈｕｈ７）、６匹のマウスのうち５匹で顕著な腫瘍退縮が認められた（図６Ａ～６Ｄ）。まとめると、これらのデータは、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ構築物が迅速かつ持続的な抗腫瘍応答を達成するのに最も強力であることを示した。
【0146】
実施例６：ＧＰＣ３を標的にするキメラ抗原受容体Ｔ細胞はＣＤ８＋およびＴｅｍｒａサブセットを富化する
ＣＡＲ Ｔ細胞、疲弊マーカー、およびＴ細胞サブセットの数をモニタリングするために、研究マウス由来の血液を分析した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ １１（９）：２１８６－２１９９，２０２１；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ３（４）：４１８－４２９，２０１３；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２３（２４）：３７５０－３７５９，２０１４）。結果を図５Ａ～５Ｆに示す。２８日目に、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ群由来のマウスがＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ処置群よりもＣＡＲ Ｔ細胞数が数対数倍多く、大きな増殖応答を示していた。さらに、ＰＤ１発現はＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭ群で最低であった（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ９：１１１８，２０１８）。Ｔ細胞応答を理解するために、ＣＤ８発現とＣＤ４発現を対比して試験し、Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａを含むＴ細胞サブセットも試験した。操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、多数のＣＡＲ陽性ＣＤ８ Ｔ細胞を保有していた。Ｔ細胞は、早期には類似の表現型を示していたが、４週目および５週目までにｉｎ ｖｉｖｏでメモリー機能およびエフェクター機能の両方を示した。４週目および５週目までに、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ群のほとんどのＣＡＲ Ｔ細胞はＣＤ８＋表現型を有し、エフェクター機能に携わっていた。これらのデータは、２～５週間にわたってＣＡＲ Ｔ細胞が拡大してＣＤ８＋Ｔｅｍｒａに明確に移行し、これが抗腫瘍応答に非常に重要なようであることを示す。セントラルメモリーＴ細胞も集団のサブセット内に維持されており、両方のＴ細胞型が疲弊の回避および腫瘍部位への輸送の継続に必要であることを示した。ＣＤ８＋Ｔｅｍｒａのこの優勢は、Ｈｕｈ７腫瘍群における不応答者で認められなかった。まとめると、これは、ＣＤ８＋Ｔｅｍｒａ細胞の初期の移行が退縮および持続的な応答の誘導に重要であるという仮説を支持している。
ＣＡＲ Ｔ細胞、疲弊マーカー、およびＴ細胞サブセットの数をモニタリングするために、研究マウス由来の血液を分析した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ １１（９）：２１８６－２１９９，２０２１；Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ ３（４）：４１８－４２９，２０１３；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １２３（２４）：３７５０－３７５９，２０１４）。結果を図５Ａ～５Ｆに示す。２８日目に、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ群由来のマウスがＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭ処置群よりもＣＡＲ Ｔ細胞数が数対数倍多く、大きな増殖応答を示していた。さらに、ＰＤ１発現はＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＨ３－ＣＤ２８ＴＭ群で最低であった（Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ９：１１１８，２０１８）。Ｔ細胞応答を理解するために、ＣＤ８発現とＣＤ４発現を対比して試験し、Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｍｒａを含むＴ細胞サブセットも試験した。操作されたＣＡＲ Ｔ細胞は、多数のＣＡＲ陽性ＣＤ８ Ｔ細胞を保有していた。Ｔ細胞は、早期には類似の表現型を示していたが、４週目および５週目までにｉｎ ｖｉｖｏでメモリー機能およびエフェクター機能の両方を示した。４週目および５週目までに、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ群のほとんどのＣＡＲ Ｔ細胞はＣＤ８＋表現型を有し、エフェクター機能に携わっていた。これらのデータは、２～５週間にわたってＣＡＲ Ｔ細胞が拡大してＣＤ８＋Ｔｅｍｒａに明確に移行し、これが抗腫瘍応答に非常に重要なようであることを示す。セントラルメモリーＴ細胞も集団のサブセット内に維持されており、両方のＴ細胞型が疲弊の回避および腫瘍部位への輸送の継続に必要であることを示した。ＣＤ８＋Ｔｅｍｒａのこの優勢は、Ｈｕｈ７腫瘍群における不応答者で認められなかった。まとめると、これは、ＣＤ８＋Ｔｅｍｒａ細胞の初期の移行が退縮および持続的な応答の誘導に重要であるという仮説を支持している。
【0147】
実施例７：ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭは、ＨＣＣにおいてＷｎｔシグナル伝達を遮断し、ＮＦＡＴを活性化する
ｉｎ ｖｉｖｏでの効力が認められたので、ＧＰＣ３発現Ｈｅｐ３Ｂ細胞に曝露されときにＨＮ３構築物が腫瘍Ｗｎｔシグナル伝達を遮断する能力を試験した（図７Ａ）。Ｈｅｐ３Ｂ細胞と３０分間および３時間共培養したときのＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞で、活性βカテニンおよび総βカテニンのレベルの両方の減少が認められた。操作されたＨＮ３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、総βカテニンを迅速に阻害し、３時間で活性βカテニンを完全に無効にした（図７Ａ）。３０分間でさえ、操作されたＨＮ３構築物の総βカテニンレベルはより低かった。これらのデータから、Ｗｎｔシグナル伝達がＨＮ３ベースのＣＡＲ Ｔ細胞の直接の標的であること、および３時間以内にＨＮ３に指示されたＣＡＲ Ｔ細胞がβカテニン活性化を直接阻害することが確認された。
ｉｎ ｖｉｖｏでの効力が認められたので、ＧＰＣ３発現Ｈｅｐ３Ｂ細胞に曝露されときにＨＮ３構築物が腫瘍Ｗｎｔシグナル伝達を遮断する能力を試験した（図７Ａ）。Ｈｅｐ３Ｂ細胞と３０分間および３時間共培養したときのＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞で、活性βカテニンおよび総βカテニンのレベルの両方の減少が認められた。操作されたＨＮ３ ＣＡＲ Ｔ細胞は、総βカテニンを迅速に阻害し、３時間で活性βカテニンを完全に無効にした（図７Ａ）。３０分間でさえ、操作されたＨＮ３構築物の総βカテニンレベルはより低かった。これらのデータから、Ｗｎｔシグナル伝達がＨＮ３ベースのＣＡＲ Ｔ細胞の直接の標的であること、および３時間以内にＨＮ３に指示されたＣＡＲ Ｔ細胞がβカテニン活性化を直接阻害することが確認された。
【0148】
ＣＡＲ Ｔ細胞がｉｎ ｖｉｖｏでどのように作用するのかを理解するために、ＮＦＡＴがＴ細胞シグナル伝達で役割を果たすのかどうかを判定するための試験を行った（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ６：６８１８，２０１５；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ３１：３８３－３９５，２０１７；Ｃａｐｕｒｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １２７：１５６５－１５７５，２０１４）。各々の時点にわたって、ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭを含む元の構築物と比較してＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞においてＮＦＡＴシグナル伝達が段階的に高くなった。代表的な画像化ウィンドウにおいてＣＡＲ細胞がＨｅｐ３Ｂ細胞よりも多数存在するときに、ＮＦＡＴシグナル伝達の飽和が４時間で最大に到達した（図７Ｂ）。細胞のカウントおよびサイズによってｔｄＴｏｍａｔｏシグナルを定量した場合、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭとＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭとの対比におけるＮＦＡＴシグナル伝達の間の相違は顕著であった。ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ処置Ｈｅｐ３Ｂ細胞におけるＮＦＡＴシグナル伝達は、２００の範囲全体においてより多数の細胞で開始され、細胞数およびシグナル強度に関して４時間以内に倍増する。これらの所見は、ＮＦＡＴを介したシグナル伝達がＨＮ３－ＣＤ８Ｈ－ＣＤ８ＴＭよりもＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭにおけるＴ細胞活性化で多く見られることを示していた。概して、ＨＮ３－ＩｇＧ４Ｈ－ＣＤ２８ＴＭ ＣＡＲ Ｔ細胞においてＮＦＡＴが確実に上方制御されることが認められた。データ全体に基づいて、抗原－ＣＡＲ相互作用を微調整することによって前述の細胞におけるこれらの機序が変化し、それにより、腫瘍を強力かつ持続的に根絶することが提案される。
【0149】
記載の本開示の態様の意図を逸脱することなく、記載の方法または組成物の正確な詳細を変更または修正し得ることが明らかであろう。本発明者らは、全てのかかる修正および変更が以下の特許請求の範囲の範囲および意図の範囲内にあると主張する。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B-C】
【図2D】
【図2E-F】
【図2G-H】
【図3A-B】
【図3C-D】
【図4A-B】
【図4C-D】
【図5A-B】
【図5C-D】
【図5E】
【図5F】
【図6A-B】
【図6C-D】
【図7A】
【図7B】
【配列表】
【国際調査報告】