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特表2024-540392核酸抽出を伴わないＳＴＩ病原体検査のためのデバイスおよび方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】核酸抽出を伴わないＳＴＩ病原体検査のためのデバイスおよび方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20241024BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241024BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20241024BHJP
C12Q 1/689 20180101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6888 Z
C12Q1/689 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024526947
(86)(22)【出願日】2022-10-24
(85)【翻訳文提出日】2024-07-05
(86)【国際出願番号】 US2022047564
(87)【国際公開番号】W WO2023081029
(87)【国際公開日】2023-05-11
(31)【優先権主張番号】63/277,061
(32)【優先日】2021-11-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524016714
【氏名又は名称】サミット バイオラブズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ブロムクイスト， ロバート イー．
(72)【発明者】
【氏名】ルー， シ－ロン
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ01
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR62
4B063QS10
4B063QS25
(57)【要約】
本発明は、核酸抽出を伴わない直接的なＰＣＲ技術による疾患および病原体（性感染性疾患が挙げられる）の迅速な診断を可能にする、組成物、デバイス、方法およびキットを提供する。本発明は、生体サンプルにおける迅速で、抽出を伴わない核酸の検出および分析のための組成物および方法を提供する。より詳細には、本発明は、生体サンプルを処理し、後の増幅および／または検出（例えば次世代シーケンシング技術を使用する）のために利用可能な核酸を提供し、同時に初期核酸抽出工程の必要性を排除するための、組成物を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抽出を伴わずに核酸を分析するための方法であって、粘膜スワブサンプルおよび／または体液サンプルを含むサンプルを対象から取得する工程；
該サンプルを、ヌクレアーゼフリー水と抗真菌剤と抗生物質とリボヌクレアーゼインヒビターとを含む緩衝液組成物と接触させる工程；
１種または複数種の性感染病原体の１つまたは複数の標的核酸に特異的なプライマーで該緩衝液中の該サンプルから核酸を、該核酸の事前抽出を行うことなく直接増幅する工程；ならびに
該増幅する工程において生成されたアンプリコンを分析して、該対象における１種または複数種の性感染病原体を検出する工程
を含む、方法。
【請求項2】
前記粘膜スワブサンプルが膣スワブ、子宮頸部スワブ、尿道スワブ、生殖器スワブ、口腔スワブ、咽頭スワブ、鼻腔スワブ、眼スワブ、およびそれらのいずれかの組合せのうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記粘膜スワブサンプルが膣スワブ、子宮頸部スワブ、尿道スワブ、生殖器スワブ、口腔スワブ、咽頭スワブ、鼻腔スワブ、眼スワブ、およびそれらの組合せのうちの２つまたはそれより多くを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記サンプルが前記粘膜サンプルおよび体液サンプルを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項5】
前記体液サンプルが粘液、血液、血漿、血清、血清派生物、胆汁、母体血、痰、唾液、喀痰、汗、羊水、月経液、乳腺液、卵胞液、卵管液、腹水、尿、精液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、またはそれらの組合せのうちの１つまたは複数を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記体液サンプルが尿を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記体液サンプルが唾液を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記サンプルが、粘液、血液、血漿、血清、血清派生物、胆汁、母体血、痰、唾液、喀痰、汗、羊水、月経液、乳腺液、卵胞液、卵管液、腹水、尿、精液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、またはそれらの組合せのうちの１つまたは複数を含む体液サンプルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記１種または複数種の性感染病原体がウイルスおよび／または細菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記１種または複数種の性感染病原体が細菌性膣炎、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）、膀胱炎、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペス（単純ヘルペス１型および単純ヘルペス２型）、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＭＰＶ、性病性リンパ肉芽腫、伝染性軟属腫、非淋菌性尿道炎、骨盤腹膜炎、ケジラミ、梅毒、トリコモナス症、ならびに腟炎のうちの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記標的核酸が複数の性感染病原体に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記複数の性感染病原体がＣＴおよび／またはＮＧを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記核酸特異的プライマーが、配列番号１、２、４、および５のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一な配列を有するプライマーの１つまたは複数を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
混合する工程の前に、容器中に前記体液サンプルを取得し、粘膜スワブを該容器中の該体液サンプル中に配置する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記核酸がＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記分析する工程が、前記アンプリコンを配列決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記緩衝液組成物が還元剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
前記還元剤がトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩溶液である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記抗真菌剤がアムホテリシンＢを含み、前記抗生物質がペニシリン－ストレプトマイシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
前記緩衝液組成物が、前記サンプルに由来する前記核酸を安定化する、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
逐次的な時点で前記対象から取得された複数のサンプル中の標的核酸量を比較し、経時的な該核酸量の増加または減少に基づいて疾患の進行を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記アンプリコンが腫瘍ウイルスに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
前記標的核酸が癌遺伝子またはその部分である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（技術分野）
本発明は、一般的には診断方法に関連し、より詳細には、特に性感染症について、抽出を伴わない病原体の検査および検出を実施するための組成物および方法に関連する。
本発明は、一般的には診断方法に関連し、より詳細には、特に性感染症について、抽出を伴わない病原体の検査および検出を実施するための組成物および方法に関連する。
【背景技術】
【0002】
（背景）
アメリカ疾病予防管理センター（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、５人に１人が性感染症（ＳＴＩ）を有しており、毎年２５００万件を超える新規ＳＴＩ症例が存在すると、推定している。結果として、米国において、推定１６０億ドルが、ＳＴＩに起因する直接的な医療費に対して毎年支払われている。細菌性ＳＴＩの抗生物質耐性株がより多く蔓延し、他のＳＴＩが例えば２０２２年にサル痘とともに出現しているので、これらの費用は増加する可能性がある。
アメリカ疾病予防管理センター（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）は、５人に１人が性感染症（ＳＴＩ）を有しており、毎年２５００万件を超える新規ＳＴＩ症例が存在すると、推定している。結果として、米国において、推定１６０億ドルが、ＳＴＩに起因する直接的な医療費に対して毎年支払われている。細菌性ＳＴＩの抗生物質耐性株がより多く蔓延し、他のＳＴＩが例えば２０２２年にサル痘とともに出現しているので、これらの費用は増加する可能性がある。
【0003】
ＳＴＩは、無数のウイルス、細菌、および微生物に起因し得る。最も一般的なＳＴＩは、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）感染症であり、米国で毎年１５０万件を超える新規症例がある。約半数の蔓延であるが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ）感染症が、ＮＧ感染症についての第一選択処置であるセフトリアキソンに対して耐性の菌の出現に伴って、増大する懸念事項になりつつある。
【0004】
ＳＴＩが処置可能であるか否かに関わらず、早期検出およびサーベイランスが、ＳＴＩの社会的負荷および蔓延を減少させることにおける重要な構成要素のままである。
【0005】
多くの感染性疾患についての現在の検出技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用を含む。ＰＣＲは、目的のＤＮＡ（ＤＮＡ標的）の特定領域を選択的に増幅するために使用される技術である。例えば、多くのウイルス感染症および細菌感染症を検出するための種々のリアルタイムＰＣＲアッセイ（定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）とも呼ばれる）が、世界中で開発されてきた。
【0006】
しかし、現在のＰＣＲ方法は感染性疾患の検出および診断を可能にするが、それらの方法は欠点に悩まされている。１つの顕著な欠点は、現在のアプローチが、その検査プロトコルの一部として、核酸を臨床サンプルから単離および精製する初期工程に依存することである。従来の方法においてＰＣＲを受ける前に必要とされるこの初期の核酸の単離および精製工程（すなわち、抽出工程）は、この診断プロセスにおける主要な障害を構成する。その理由は、これが、手作業で面倒でありかつ高価なままであり、偶発的な混入および人為的誤りの機会をさらに増加するからである。
さらに、感染症（特に、性感染症）を診断するためのＰＣＲベースの検査の有効性は、分析されるサンプルの型（例えば、生殖器スワブ、尿、血液、または唾液）、感染症の経過に対するサンプル収集の時期、およびサンプル収集前の対象の行動にさえ基づいて、変動する。
さらに、感染症（特に、性感染症）を診断するためのＰＣＲベースの検査の有効性は、分析されるサンプルの型（例えば、生殖器スワブ、尿、血液、または唾液）、感染症の経過に対するサンプル収集の時期、およびサンプル収集前の対象の行動にさえ基づいて、変動する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
（概要）
本発明は、生体サンプルにおける迅速で、抽出を伴わない核酸の検出および分析のための組成物および方法を提供する。より詳細には、本発明は、生体サンプルを処理し、後の増幅および／または検出（例えば次世代シーケンシング技術を使用する）のために利用可能な核酸を提供し、同時に初期核酸抽出工程の必要性を排除するための、組成物を提供する。さらに、本発明の組成物は、後のＰＣＲアッセイを阻害することが公知であるあらゆる病原体輸送媒体の必要性を排除する。本発明の組成物は、例えば、目的のサンプルと混合された場合に、初期核酸抽出（すなわち、核酸の単離および精製）を必要とすることなく、直接的な核酸の増幅および分析のために核酸を安定化しその核酸をそのサンプルから調製することが可能である、サンプルの輸送および調製のための独特な緩衝液組成物を含む。
本発明は、生体サンプルにおける迅速で、抽出を伴わない核酸の検出および分析のための組成物および方法を提供する。より詳細には、本発明は、生体サンプルを処理し、後の増幅および／または検出（例えば次世代シーケンシング技術を使用する）のために利用可能な核酸を提供し、同時に初期核酸抽出工程の必要性を排除するための、組成物を提供する。さらに、本発明の組成物は、後のＰＣＲアッセイを阻害することが公知であるあらゆる病原体輸送媒体の必要性を排除する。本発明の組成物は、例えば、目的のサンプルと混合された場合に、初期核酸抽出（すなわち、核酸の単離および精製）を必要とすることなく、直接的な核酸の増幅および分析のために核酸を安定化しその核酸をそのサンプルから調製することが可能である、サンプルの輸送および調製のための独特な緩衝液組成物を含む。
【0008】
有利なことに、本発明の方法は、非侵襲的なサンプルの型（例えば、感染した可能性のある領域から採取されたスワブ）を使用し得る。抽出を伴わない本発明の方法において使用される緩衝液は、その非侵襲的サンプルに由来する（例えば、１種または複数種の性感染病原体に由来する）標的核酸を安定化し保存する。このことは、サンプルが家で採取され、分析のために実験室に送付され、または適切なポイントオブケア検査デバイスにて家で分析さえされることを可能にする。これは、特に性感染症（ＳＴＩ）について検査する場合に、使用者による検査様式の採用にとって重要であり得る。ＳＴＩについてのサンプルの自己収集は、特に男性において、容易に受け入れられることが示されている。Ｙａｒｅｄ Ｎら、Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｅｘｕａｌｌｙ Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｅｎ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｌｆ－Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ Ｓｗａｂｓ：Ａ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｒｅｖｉｅｗ、Ｓｅｘ Ｔｒａｎｓｍ Ｄｉｓ．、２０１８年５月；４５（５）：２９４～３００（これは参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【0009】
本発明の方法において、サンプル検査は、核酸抽出工程を行うことなく、サンプルから直接的である。代わりに、本明細書において記載されている独特な緩衝液組成物により臨床サンプルが提供された後、そのサンプルに由来する核酸が、下流アッセイ（ｑＰＣＲ、ｒｔＰＣＲ、および／またはＮＧＳをベースとする下流の診断検査が挙げられる）において直接使用され得る。本発明は、必要に応じて、１種または複数種の性感染病原体の検出のために、ＤＮＡまたはＲＮＡの検出のために有用である。したがって、好ましい態様において、検出のための標的核酸は、１種または複数種の性感染病原体に関連する核酸配列を含む。
【0010】
本発明の方法は、ＰＣＲ増幅を受けることができる任意の病原体の検出に適用可能であり、その病原体としては、ウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびサル痘ウイルス（ＭＰＶ））、細菌（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＮＧ））、ならびに他の病原体（例えば、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ酵母）が挙げられる。特定の態様において、本発明の方法は、単一のサンプルから複数の性感染病原体を検出し得、そのサンプルは、組み合わせたサンプルを含む。さらに、本発明の方法は腫瘍ウイルスを検出することに適しており、それらの腫瘍ウイルスの一部は性感染性（例えば、ＨＰＶ）である。その延長として、本発明の方法は、１種または複数種のがん（例えば、肺がん、頭頸部がん、子宮頸がん）を検出し得る。
【0011】
したがって、特定の態様において、本発明の方法は、がんのリスク上昇に相関する１つまたは複数の遺伝子マーカーを検出する工程を含み得る。そのような遺伝子マーカーは、特定の病原体または病原体変異株に相関する遺伝子マーカー、例えば、ＨＰＶの高リスク変異株（ＨＰＶ－６、ＨＰＶ－１１、ＨＰＶ－１６、ＨＰＶ－１８、ＨＰＶ－３１、ＨＰＶ－３３、ＨＰＶ－３５、ＨＰＶ－３９、ＨＰＶ－４５、ＨＰＶ－５１、ＨＰＶ－５２、またはＨＰＶ－６８が挙げられる）を識別するために使用される遺伝子マーカーであり得る（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ），Ｃａｎｃｅｒ，ＨＰＶ Ｔｅｓｔｉｎｇ，ａｎｄ ＨＰＶ Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ Ａｓｋｅｄ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ（２０１３年１０月２２日）を参照のこと）。同様に、がんのリスク上昇に相関する遺伝子マーカーとしては、癌遺伝子配列および／または遺伝子変異配列（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異型ＮＳＣＬＣ）が挙げられ得る。例示的な遺伝子マーカーとしては、例えば、子宮頸がんに関連する遺伝子マーカー、例えば、ＳＣ６；ＳＩＸ１；ヒト子宮頸がん２癌原遺伝子（ＨＣＣＲ－２）；ｐ２７；ウイルス癌遺伝子Ｅ６；ウイルス癌遺伝子Ｅ７；ｐｌ６ＩＮＫ４Ａ；Ｍｃｍタンパク質（例えば、Ｍｃｍ５）；Ｃｄｃタンパク質；トポイソメラーゼ２α；ＰＣＮＡ；Ｋｉ－６７；サイクリンＥ；ｐ－５３；ＰＡＩ１；ＤＡＰキナーゼ；ＥＳＲＩ；ＡＰＣ；ＴＩＭＰ－３；ＲＡＲ－β；ＣＡＬＣＡ；ＴＳＬＣ１；ＴＩＭＰ－２；ＤｃＲｌ；ＣＵＤＲ；ＤｃＲ２；ＢＲＣＡ１；ｐ１５；ＭＳＨ２；Ｒａｓｓｆ１Ａ；ＭＬＨ１；ＭＧＭＴ；ＳＯＸ１；ＰＡＸ１；ＬＭＸ１Ａ；ＮＫＸ６－１；ＷＴ１；ＯＮＥＣＵＴ１；ＳＰＡＧ９；およびＲｂ（網膜芽細胞腫）タンパク質が挙げられる。
【0012】
本発明の好ましい方法は、対象から取得された最小侵襲的サンプルから１種または複数種の性感染症（ＳＴＩ）を検出するために使用される。例えば、好ましい態様において、本発明の方法において使用されるサンプルは、粘膜スワブとして取得される。そのようなサンプルとしては、膣スワブ、子宮頸部スワブ、尿道スワブ、生殖器スワブ、口腔スワブ、咽頭スワブ、鼻腔スワブ、眼スワブ、およびそれらのいずれかの組合せのうちの１つまたは複数が挙げられ得る。特定の態様において、本発明の方法は、対象に由来する流体サンプルを使用し、その流体サンプルとしては、尿、腟粘膜、唾液、血液、鼻粘膜、喀痰、脳脊髄液、膿、乳頭吸引液、腹水、リンパ液、汗、涙液、およびそれらのいずれかの組合せのうちの１つまたは複数が挙げられ得る。特定の態様において、組み合わせたスワブおよび流体サンプルが、性感染症を検出するために本発明の方法において使用される。
【0013】
好ましくは、サンプルとしては、１つもしくは複数の非侵襲的粘膜スワブならびに／または流体サンプル（例えば、尿および／もしくは唾液）が挙げられる。非侵襲的サンプル採取は、精巧な実験室器具およびスタッフの現場に接近することなく、患者が自宅または遠隔地の診療所でサンプルを収集することを可能にする。有利なことに、抽出を伴わない本発明の方法は所有権のある緩衝液組成物を使用し、この所有権のある緩衝液組成物は、そのサンプルに由来する標的核酸が、分析のために実験室に輸送するために保存され確保されることを可能にする。幸運にも、抽出を伴わない本発明の方法およびその所有権のある緩衝液組成物の使用はまた、そのサンプルに由来する標的核酸が、適切なポイントオブケア検査デバイスにて家で分析されることも可能にする。
【0014】
本発明の方法はＳＴＩ検査のための家でのサンプル収集を可能にするので、その方法は、伝統的な診療所内検査を上回るいくつかの利点（プライバシーが挙げられる）を提供する。したがって、本発明の方法は、知覚されたスティグマが原因で、本人が直接出向く検査に行くことをためらう人々を助け得る。さらに、家で提供されない場合であってさえ、本発明の方法は、かなり簡素な場所で使用され得、そのサンプルは、最小限の訓練をされたスタッフによって収集され得る。このことは、十分なサービスを受けられていないコミュニティへとＳＴＩ検査を拡張することにおいて、集中した場所（例えば、専門スタッフがいる病院）を上回る明瞭な有用性を見出す。
【0015】
一態様において、本発明は、単一のアッセイにおける２種以上の異なるサンプル型の組合せを可能にし、それにより、特に（存在し得る）複数の性感染病原体を検査する場合に、より正確な結果を可能にする。特定の態様において、その２種以上の異なるサンプル型は、２種以上の異なる型の粘膜スワブを含む。特定の態様において、その２種以上の異なるサンプル型は、２種以上の異なる型の流体サンプルを含む。特定の態様において、その２種以上の異なるサンプル型は、１つまたは複数の粘膜スワブ（例えば、膣スワブ）と、１つまたは複数の流体サンプル（例えば、唾液または尿）とを含む。
【0016】
種々のＳＴＩ（集団において差次的に提示するようなものが挙げられる）は、サンプルの型に依存して、種々の質および／または量の標的核酸を提供し得る。例えば、患者は複数のＳＴＩを有し得、各々のＳＴＩはその対象の身体の特定の位置でのみ検出可能である（例えば、ＣＴ感染症は生殖器スワブから確実に検出され、潜伏ＨＰＶ感染症は口腔スワブから検出される）。本発明の方法を使用して、それらの種々のサンプルが、さらなる分析のために実験室に輸送するために、本明細書において開示されている緩衝液中で組み合わせられ得る。
【0017】
本発明の方法は、任意の性感染症を検出するために使用され得る。
【0018】
本発明の方法によって検出される例示的なＳＴＩとしては、細菌性膣炎、ＣＴ、膀胱炎、ＮＧ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペス（単純ヘルペス１型および単純ヘルペス２型）、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＭＰＶ、性病性リンパ肉芽腫、伝染性軟属腫、非淋菌性尿道炎、骨盤腹膜炎、ケジラミ（ｐｈｔｈｉｒｕｓ ｐｕｂｉｓ）、梅毒、トリコモナス症、および腟炎が挙げられる。特定の態様において、本発明の方法は、単一のサンプルから複数の性感染症を検出する。好ましい態様において、本発明の方法は、サンプルにおいてＣＴ感染症および／またはＮＧ感染症を検出する。本発明の方法は、腫瘍ウイルスを検出するために使用され得る。本発明の方法によって検出される例示的な腫瘍ウイルスとしては、ＨＰＶ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が挙げられる。
【0019】
別の態様において、本発明は、サンプル中の１種または複数種の性感染病原体の核酸を保存する安定化緩衝液を提供する。その（以下に記載される）緩衝液は、病原体核酸の検出前の輸送のために、ウイルス、細菌、および他の病原体の核酸を安定化する。好ましい実施形態において、本明細書において記載されている輸送緩衝液は、病原体を含むと疑われる液体サンプルに添加される。その後、そのサンプルは、抽出および検査のために実験室に輸送される。本明細書において開示されている緩衝液組成物は標的核酸を保存するので、複数の病原体検出アッセイが単一のサンプルにおいて実行され得、かつ／またはサンプル型が多重病原体分析のために組み合わせられ得る。
【0020】
第一の態様において、本発明は、サンプル（本明細書において記載されている組み合わせたサンプルが挙げられる）を処理し、後の増幅および／または検出（例えば次世代シーケンシング技術を使用する）のために利用可能な核酸を提供し、同時に初期核酸抽出工程の必要性を排除するための、組成物を提供する。本発明の組成物は、ＰＣＲを典型的には阻害する、病原体輸送媒体の必要性を排除する。
【0021】
本発明の組成物は、例えば、目的のサンプルと混合された場合に、初期核酸抽出（すなわち、核酸の単離および精製）を必要とすることなく、直接的な核酸の増幅および分析のために適切な核酸をそのサンプルから調製可能である、サンプルの輸送および調製のための独特な緩衝液を含む。
【0022】
特定の態様において、本発明は、組み合わせたサンプル（これは、好ましくは、１つまたは複数の粘膜スワブもしくは尿サンプルであり得る）を取得するために必要なすべての成分を備えるキットを含む。これは、患者にキットを提供することを含み得る。その対象は、そのキットの簡単に使える成分を自宅の快適な状況で使用して、サンプルを提供し得る。本明細書において開示されている所有権のある緩衝液組成物を使用して、そのサンプルは、分析のために実験室に郵送され得るように十分に保存および確保され得る。
【0023】
本発明の目的のために、標的核酸は、ヒトゲノム配列、ヒト転写物配列、癌遺伝子配列、遺伝子変異配列（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異型ＮＳＣＬＣ）、病原体配列または寄生生物配列であり得る。
【0024】
好ましい方法は、サンプルを、核酸増幅のために適切な核酸をその生体サンプルから、その核酸の初期抽出を行うことなく調製可能な発明の緩衝液組成物と混合する工程をさらに含む。換言すれば、その生体サンプルをその緩衝液と混合すると、その緩衝液内にある特定の成分は、そのサンプルに由来する核酸が、典型的な抽出（単離および精製）工程を必要とすることなく、後の核酸分析（すなわち、ＰＣＲによる増幅）のために十分に調製されることを可能にする。
【0025】
本発明の方法において使用される緩衝液組成物は、一般的には、ヌクレアーゼフリー水、抗真菌剤溶液、抗生物質溶液、リボヌクレアーゼインヒビター、還元剤溶液および／またはトリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ緩衝液溶液を含む。特定の態様において、その緩衝液組成物は輸送媒体としても機能し、その中では、サンプル（任意のサンプル収集スワブを含む）が、その緩衝液組成物を含む適切な収集容器内に直接配置されている。
【0026】
方法は、調製された核酸に対して１つまたは複数のＰＣＲアッセイを実施して、１つまたは複数の標的病原体核酸を検出する工程をさらに含む。標的核酸を検出した場合、患者は、ＳＴＩを有すると診断され得る。
【0027】
そのＰＣＲアッセイを実施する工程は、標的核酸特異的プライマー－プローブセットを使用することを含む。特定の方法において、その標的核酸特異的プライマー－プローブは、単一サンプル中の種々の病原体の標的核酸に特異的である。一部の実施形態において、そのＰＣＲアッセイを実施する工程は、リボヌクレアーゼＰ（ＲＮＰ）に特異的なプライマー－プローブセットを使用することを含む。本明細書において開示されている抽出方法はまた、核酸の供給源に依存しない（ａｇｎｏｓｔｉｃ）ので、ヒトゲノム配列またはヒトＲＮＡ配列を検出するために有用である。
【0028】
特定の態様において、本発明の方法は、病原体核酸を定量化する工程をさらに含む。例えば、その１つまたは複数のＰＣＲアッセイを実施する工程は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびデジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）（これには、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ）（ｄｄＰＣＲ）が挙げられ得る）の少なくとも１つを実施することを含む。その患者を、性感染病原体に感染しているかまたは性感染病原体に感染していないかのいずれかとして診断することに加えて、その方法は、その病原体核酸量に基づいてその感染症の重症度を決定する工程をさらに含み得る。一部の実施形態において、方法は、逐次的な時点でその患者から取得された複数の生体サンプル中の病原体核酸量を比較し、経時的なその核酸量の増加または減少に基づいて疾患の進行を決定する工程をさらに含み得る。本発明の方法は、サンプル中の標的核酸の正体または量に基づいて疾患の転帰を予測する工程をさらに含み得る。本発明の方法はまた、処置または診断の過程を知らせるために使用され得る。例えば、結果は、適切な治療手順または臨床手順を決定するために使用され得る。
【0029】
別の態様において、本発明は、検出用の細菌のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを保存するために抽出を伴わない緩衝液を使用する、細菌の検出を提供する。その同じ緩衝液はウイルスおよび細菌の両方の保存のために有用であり、これにより、同じサンプル中またはサンプルの組合せ中のウイルス病原体および細菌病原体の検出を可能にする。したがって、一態様において、本発明は、例えば、抽出を伴わないＰＣＲ検査のために、生体サンプル中の細菌および／またはウイルスを安定化する方法を提供する。したがって、本発明は、ウイルスサンプルと細菌サンプルとの同時検出を可能にする。これは、ウイルス性性感染症（ＳＴＩ）および細菌性性感染症（ＳＴＩ）（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ）についての「オールインワン」検査を可能にする。さらに、本明細書において開示されている緩衝液はウイルスも安定化するので、単一の検査およびサンプルが、ウイルス性ＳＴＩ（例えば、ＨＰＶ、ＨＩＶ、ＭＰＶ、およびヘルペス）を検出するためにも使用され得る。
【0030】
本発明はまた、抽出を伴わずに核酸を分析するための方法も提供する。例示的な方法は、対象に由来する粘膜スワブサンプルを含む。あるいは、またはさらに、その方法は、さらなる粘膜スワブ（例えば、別の身体位置に由来する）および／または１つもしくは複数の流体サンプル（例えば、尿）を取得する工程を含み得る。複数のサンプルが使用される場合、本発明の方法は、バイアル中でそのそれらのサンプルを組み合わせる工程を含み得る。
【0031】
サンプル（組み合わせたサンプルが挙げられる）は、そのバイアル中で、保存緩衝液組成物（これは、例えば、緩衝液ヌクレアーゼフリー水と抗真菌剤と抗生物質とリボヌクレアーゼインヒビターとを含む）と混合される。したがって、方法は、標的核酸に特異的なプライマーでその緩衝液中の核酸を直接増幅する工程を含む。直接増幅は、事前核酸抽出工程を行うことなく行われる。増幅後、その方法は、その増幅する工程において生成されたアンプリコンを分析して、１種または複数種の病原体の存在を検出する工程を含む。
【0032】
特定の態様において、そのサンプルは流体サンプルである。流体サンプルは、収集補助器具（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｉｄ）を使用して取得され得る。例えば、その流体サンプルが唾液である場合、そのサンプルは、サンプル収集補助器具または漏斗を使用して、対象から取得され得る。そのサンプル収集補助器具はその緩衝液組成物を含み得、その緩衝液組成物は、そのバイアル中に放出される。例えば、そのサンプル収集補助器具は、その緩衝液組成物を内部パウチもしくは内部区画中または蓋中に含み得、それらが、その緩衝液組成物をそのバイアル中に放出する。特定の態様において、そのサンプル収集補助器具または漏斗は蓋を備える。その蓋はその緩衝液組成物を含み得、その緩衝液組成物は、その蓋が閉じられた際にそのバイアル中に放出される。特定の態様において、そのサンプル収集補助器具または漏斗はそのバイアルと一体化されている。あるいは、そのサンプル収集補助器具または漏斗は、唾液収集中にそのバイアルに連結する構成であり得る。特定の態様において、そのサンプル収集補助器具または漏斗は、それがそのバイアルに可逆的に連結され得るような構成である。
【0033】
好ましい態様において、そのサンプルは、１つまたは複数の粘膜スワブを使用して取得される。特定の態様において、その粘膜スワブとしては、膣スワブ、子宮頸部スワブ、尿道スワブ、生殖器スワブ、口腔スワブ、咽頭スワブ、鼻腔スワブ、眼スワブ、およびそれらのいずれかの組合せのうちの１つまたは複数が挙げられる。特定の態様において、粘膜サンプルを取得するために使用されるスワブは、そのバイアルを密封するために使用されるキャップに取り付けられている。そのバイアルをそのキャップで密封することは、流体サンプル中にそのスワブを配置して、組み合わせたサンプルを形成し得る。あるいは、第一のスワブがバイアルに添加され得、第二のスワブが添加される。それらのスワブのうちの１つが、そのバイアルのキャップに取り付けられ得る。
【0034】
本発明はまた、核酸（本明細書において開示されているウイルス核酸および／または細菌核酸が挙げられる）を定量化する方法を実施するためのキットを提供する。特定の態様において、本発明のキットは、１つまたは複数のバイアル、サンプル収集補助器具および／または漏斗；緩衝液組成物（例えば、輸送（保存）緩衝液）、１種または複数種の標的核酸を増幅するためのプライマー、ならびに使用についての指示を備える。
【図面の簡単な説明】
【0035】
【0036】
【0037】
【0038】
【0039】
【0040】
【0041】
【0042】
【0043】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【発明を実施するための形態】
【0048】
（詳細な説明）
本発明は、最小侵襲的サンプルを使用して、抽出を伴わない直接的なＰＣＲ技術によって性感染症の迅速な診断を可能にする、組成物、方法、およびキットを提供する。本発明はまた、サンプル中の標的核酸を安定化し保存し、病原体核酸の抽出を伴わない検査（詳細には、１つまたは複数の供給源に同時に由来する複数の病原体（例えば、１つの個体に由来する複数のサンプル）の抽出を伴わない検査）を可能にする、緩衝液を提供する。したがって、本発明の方法は、ウイルス検査、細菌検査、または組合せのための方法を含む。さらに、本明細書において教示されている緩衝液はサンプル（例えば、ウイルス性ＳＴＩ（例えば、ＨＰＶおよびＨＩＶ）、細菌性ＳＴＩ（例えば、ＣＴおよびＮＧ）、他の病原体、ならびに癌遺伝子に由来する核酸）を保存するので、それらのサンプルは、その標的の病原体および／または核酸配列を実質的に損失することなく輸送され得る。
本発明は、最小侵襲的サンプルを使用して、抽出を伴わない直接的なＰＣＲ技術によって性感染症の迅速な診断を可能にする、組成物、方法、およびキットを提供する。本発明はまた、サンプル中の標的核酸を安定化し保存し、病原体核酸の抽出を伴わない検査（詳細には、１つまたは複数の供給源に同時に由来する複数の病原体（例えば、１つの個体に由来する複数のサンプル）の抽出を伴わない検査）を可能にする、緩衝液を提供する。したがって、本発明の方法は、ウイルス検査、細菌検査、または組合せのための方法を含む。さらに、本明細書において教示されている緩衝液はサンプル（例えば、ウイルス性ＳＴＩ（例えば、ＨＰＶおよびＨＩＶ）、細菌性ＳＴＩ（例えば、ＣＴおよびＮＧ）、他の病原体、ならびに癌遺伝子に由来する核酸）を保存するので、それらのサンプルは、その標的の病原体および／または核酸配列を実質的に損失することなく輸送され得る。
【0049】
本発明の組成物、方法、およびキットは、生体サンプルを処理し、後のＰＣＲアッセイのために利用可能なＤＮＡを提供し、同時に初期核酸抽出工程の必要性を排除するために、使用され得る。本発明は、目的のサンプルと混合された場合に、初期核酸抽出（すなわち、核酸の単離および精製）を必要とすることなく、核酸の増幅および分析のために直接使用され得る核酸をそのサンプルから調製可能である、サンプルの輸送および調製のための独特な緩衝液組成物を含む。したがって、以前の多くのアプローチ（これらは、核酸抽出工程を含む）とは異なり、本発明の直接的なサンプル検査は、その抽出工程を省略することによってこのプロセスを簡略化する。その代わりに、臨床サンプルがその独特な緩衝液組成物中で提供された後に、病原体は、加熱またはその緩衝液中での直接溶解のいずれかによって不活化され得る。その後、その不活化サンプルは、下流のｑＰＣＲ診断検査のために使用され得る。
【0050】
結果として、本発明の組成物、方法、およびキットは、サンプルの調製および検査のために必要とされる工程の数を減少することによって、従来の病原体の検査および検出のアプローチを改善する。次に、検査のために必要とされる時間が大いに減少され、より速い所要時間および結果の送達をもたらす。さらに、本発明は、人件費および消耗品を減少すると同時に、サンプルの相互混入ならびにそのサンプルから操作担当者への感染をさらに減少する。その効率およびコスト節約は、単一のサンプルを使用して複数のＳＴＩについて検査することによって拡大される。
【0051】
本明細書において記載されている方法は、種々の伝染病（微生物性、ウイルス性およびがんが挙げられる）を診断するために使用され得ることが、留意されるべきである。しかし、説明および例を簡単および容易にするために、以下は、抽出を伴わない直接的なＰＣＲアプローチによりＳＴＩを診断するための方法を記載する。ＳＴＩは、腫瘍ウイルス由来の核酸を標的とする本発明の方法を使用して診断され得、それらの腫瘍ウイルスの一部は性感染性（例えば、ＨＰＶ）であることが、留意されるべきである。その延長として、本発明の方法は、１種または複数種のがん（例えば、肺がん、頭頸部がん、子宮頸がん）を検出し得る。
【0052】
本発明の方法は、ＰＣＲアッセイに依存する従来のＳＴＩ検出方法では典型的には必要とされるサンプル調製中の工程の数を減少することによって、ＳＴＩ（すなわち、患者中の性感染病原体の存在）の迅速な検出を提供する。さらに、組み合わせたサンプルを使用する本発明の方法は、感染症の経過中の種々の時点を含む、高濃度の病原体を保有する位置から取得されたサンプルに対して検査が同時に実施されることを可能にする。
【0053】
好ましくは、本発明の方法において使用されるサンプルとしては、１つもしくは複数の非侵襲的粘膜スワブならびに／または流体サンプル（例えば、尿および／もしくは唾液）が挙げられる。非侵襲的サンプル採取は、精巧な実験室器具およびスタッフの現場に接近することなく、患者が自宅または遠隔地の診療所でサンプルを収集することを可能にする。有利なことに、抽出を伴わない本発明の方法は所有権のある緩衝液組成物を使用し、この所有権のある緩衝液組成物は、そのサンプルに由来する標的核酸が、分析のために実験室に輸送するために保存され確保されることを可能にする。
【0054】
幸運にも、抽出を伴わない本発明の方法およびその所有権のある緩衝液組成物の使用はまた、そのサンプルに由来する標的核酸が、適切なポイントオブケア検査デバイスにて家で分析されることも可能にする。
【0055】
本発明の方法はＳＴＩ検査のための家でのサンプル収集を可能にするので、その方法は、伝統的な診療所内検査を上回るいくつかの利点（プライバシーが挙げられる）を提供する。したがって、本発明の方法は、知覚されたスティグマが原因で、本人が直接出向く検査に行くことをためらう人々を助け得る。さらに、家で提供されない場合であってさえ、本発明の方法は、かなり簡素な場所で使用され得、そのサンプルは、最小限の訓練をされたスタッフによって収集され得る。このことは、十分なサービスを受けられていないコミュニティへとＳＴＩ検査を拡張することにおいて、集中した場所（例えば、専門スタッフがいる病院）を上回る明瞭な有用性を見出す。
【0056】
一般に、本発明の例示的な方法のためのワークフローは、生体サンプルを個体から取得する工程を含む。そのサンプル収集の方法、ならびに収集されるサンプルの型は、検査される特定の性感染症に依存し得る。例えば、本発明において使用されるサンプルとしては、臨床的に受容される任意の様式で収集された１つもしく複数の粘膜スワブまたは体液サンプルが挙げられ得る。
【0057】
粘膜サンプルとしては、膣スワブ、子宮頸部スワブ、尿道スワブ、生殖器スワブ、口腔スワブ、咽頭スワブ、鼻腔スワブ、眼スワブ、およびそれらのいずれかの組合せのうちの１つまたは複数に由来する生体物質が挙げられ得る。体液サンプルは、例えば、ヒトまたは他の哺乳動物に由来する、液体物質であり得る。そのような体液としては、粘液、血液、血漿、血清、血清派生物、胆汁、母体血、痰、唾液、喀痰、汗、羊水、月経液（ｍｅｎｓｔｒｕａｌ ｆｌｕｉｄ）、乳腺液（ｍａｍｍａｒｙ ｆｌｕｉｄ）、卵胞液、卵管液、腹水、尿、精液、および脳脊髄液（ＣＳＦ）（例えば、腰椎ＣＳまたは脳室ＣＳ）が挙げられるが、これらに限定はされない。サンプルはまた、細胞または生体物質を含む、媒体を含み得る。サンプルはまた、血餅（例えば、血清が除去された後に全血から取得された血餅）を含み得る。
【0058】
本明細書の方法において使用されるスワブは、サンプルを抽出し、特定の態様においては、組み合わせたサンプルの別の部分（例えば、唾液）とそれを混合するために、圧搾または撹拌され得る。特定の態様において、体液サンプルが収集され、スワブがサンプル調製のためにそのサンプル中に配置される。
【0059】
上記のとおり、現行の多くのＳＴＩ検査アプローチは、臨床サンプルから核酸を単離および精製する初期工程に依存する。例えば、以前の多くの方法において、目的の核酸の相対的定量化のためのｑＰＣＲの適用の前には、以下を含み得る工程が先行する：（１）そのサンプルからの全核酸の単離および精製；（２）その物質の溶出および可能な濃縮；ならびに／または（３）相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生じる逆転写（ＲＴ）反応における精製ＲＮＡの使用（その後、この相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）がこのｑＰＣＲ反応のために利用される）。これらの方法においてＰＣＲを受ける前に必要とされる初期の核酸の単離および精製の工程（すなわち、抽出工程）は、この診断プロセスにおける主要な障害を構成する。その理由は、これが、手作業で面倒でありかつ高価なままであり、偶発的な混入および人為的誤りの機会をさらに増加するからである。
【0060】
本発明は、サンプルを処理し、後のＰＣＲアッセイのために利用可能なＤＮＡを提供し、同時に初期核酸抽出工程の必要性を排除するための、組成物を提供する。例えば、独特な緩衝液組成物が、生体サンプルと混合された場合に、初期核酸抽出（すなわち、核酸の単離および精製）を必要とすることなく、核酸の増幅および分析のために直接使用され得る核酸をそのサンプルから調製可能であるように、その独特な緩衝液組成物はサンプル調製のために使用される。
【0061】
分析のためには不十分な量の核酸しか存在しない場合、その量を増加するために使用される一般的な技術は、その核酸を増幅することを含む。増幅とは、核酸配列の追加コピーの生成を指し、ポリメラーゼ連鎖反応または当該分野において周知の他の技術を使用して一般的には実行される（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ、ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、１９９５、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ）。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とは、クローニングも精製も行うことなくゲノムＤＮＡ混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加するためのＫ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓによる方法（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号（参照により本明細書に援用される））を指す。プライマーは、種々の方法によって調製され得、それらの方法としては、当該分野において周知の方法を使用する適切な配列のクローニングおよび直接的な化学合成（Ｎａｒａｎｇら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０（１９７９）；Ｂｒｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：１０９（１９７９））が挙げられるが、それらに限定はされない。プライマーはまた、商業的供給源（例えば、Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｉｇｍａ、およびＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から入手され得る。増幅用もしくは配列決定用のアダプターもしくはバーコード、またはそれらの組合せが、フラグメント化された核酸に結合され得る。そのような分子は、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から商業的に入手され得る。特定の実施形態において、そのような配列は、酵素（例えば、リガーゼ）を用いてテンプレート核酸分子に結合される。適切なリガーゼとしては、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびＴ４ ＲＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）から商業的に入手可能）が挙げられる。その連結は、平滑末端であってもよく、または相補的な突出末端の使用によってもよい。
【0062】
例えば、ＤＮＡは、生体サンプル内の目的のウイルス（存在する場合）に関連するウイルスＲＮＡから逆転写によって合成されて、それにより相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成し得る。一般的に理解されるとおり、逆転写酵素（ＲＴ）は、ＲＮＡテンプレートと、そのＲＮＡの３’末端と相補的な短いプライマーとを使用して第一鎖ｃＤＮＡの合成を指令し、その第一鎖ｃＤＮＡが（ＰＣＲによる）増幅のためのテンプレートとして直接使用され得る。この逆転写とＰＣＲとの組合せ（ＲＴ－ＰＣＲ）は、サンプル中の低存在量のＲＮＡの検出、および対応するｃＤＮＡの生成を可能にし、それにより低コピー遺伝子のクローニングを容易にする。あるいは、その第一鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤＮＡリガーゼを使用して二本鎖にされ得る。多くのＲＴは、商業的供給業者から入手可能である。操作されたＲＴの使用は、全長生成物形成の効率を改善し、そのｍＲＮＡ転写物の５’末端のコピー形成が完全であること確実にし、ＲＮＡ配列の忠実なＤＮＡのコピーの増幅および特徴付けを可能にする。反応がより高温で実施される、より熱安定性が高いＲＴの使用は、大量の二次構造を含むＲＮＡを扱う場合に非常に有用であり得る。
【0063】
デジタルポリメラーゼ連鎖反応（ｄＰＣＲ）は、核酸鎖（ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡが挙げられる）を直接的に定量化およびクローン増幅するために使用され得る、従来のポリメラーゼ連鎖反応方法の改良法である。ｄＰＣＲにおいて、サンプルが多数の区画へと分離され、反応が各区画中で個々に実行され、それにより、標準的なＰＣＲ技術において見出されるようなサンプル全体についての単一の値とは対照的に、各区画における蛍光分析による標的ＤＮＡの感度の高い定量化を可能にする。
【0064】
液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）は、上記の区画がナノリットルサイズの水－油エマルション液滴からなるｄＰＣＲの方法であり、その区画において、ＰＣＲ反応および蛍光検出が、例えば、液滴フローサイトメトリーを使用して実施され得る。ｄｄＰＣＲのための液滴を生成し読み取るための方法は、他の場所において詳細に記載されている（Ｚｈｏｎｇら、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ：ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｏｎｅ ｔａｒｇｅｔ ｐｅｒ ｃｏｌｏｒ ｂａｒｒｉｅｒ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ」、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ、１１：２１６７～２１７４、２０１１を参照のこと）が、本質的に、各液滴は別個の反応ウェルのようであり、熱サイクリング後に、各個の液滴の蛍光強度が、ピーク蛍光強度を記録したフローサイトメトリーなどのフロースルー（ｆｌｏｗ－ｔｈｒｏｕｇｈ）機器において読み取られた。
【0065】
本発明の組成物および方法は、なんらかの病原体に特異的な核酸を検出するために使用され得るが、好ましい実施形態において、１種または複数種の性感染病原体がその検出標的である。本発明の方法は、なんらかの性感染症を検出するために使用され得る。本発明の方法によって検出される例示的なＳＴＩとしては、細菌性膣炎、ＣＴ、膀胱炎、ＮＧ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペス（単純ヘルペス１型および単純ヘルペス２型）、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＭＰＶ、性病性リンパ肉芽腫、伝染性軟属腫、非淋菌性尿道炎、骨盤腹膜炎、ケジラミ、梅毒、トリコモナス症、および腟炎が挙げられる。特定の態様において、本発明の方法は、単一のサンプルから複数の性感染症を検出する。好ましい態様において、本発明の方法は、サンプルにおいてＣＴ感染症および／またはＮＧ感染症を検出する。
【0066】
本発明の方法は、腫瘍ウイルスを検出するために使用され得る。本発明の方法によって検出される例示的な腫瘍ウイルスとしては、ＨＰＶ、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）が挙げられる。本発明の方法は腫瘍ウイルスを検出することに適しており、それらの腫瘍ウイルスの一部は性感染性（例えば、ＨＰＶ）である。その延長として、本発明の方法は、１種または複数種のがん（例えば、肺がん、頭頸部がん、子宮頸がん）を検出し得る。
【0067】
したがって、特定の態様において、本発明の方法は、がんのリスク上昇に相関する１つまたは複数の遺伝子マーカーを検出する工程を含み得る。そのような遺伝子マーカーは、特定の病原体または病原体変異株に相関する遺伝子マーカー、例えば、ＨＰＶの高リスク変異株（ＨＰＶ－６、ＨＰＶ－１１、ＨＰＶ－１６、ＨＰＶ－１８、ＨＰＶ－３１、ＨＰＶ－３３、ＨＰＶ－３５、ＨＰＶ－３９、ＨＰＶ－４５、ＨＰＶ－５１、ＨＰＶ－５２、またはＨＰＶ－６８が挙げられる）を識別するために使用される遺伝子マーカーであり得る（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａ Ｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ），Ｃａｎｃｅｒ，ＨＰＶ Ｔｅｓｔｉｎｇ，ａｎｄ ＨＰＶ Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ Ａｓｋｅｄ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ（２０１３年１０月２２日）を参照のこと）。同様に、がんのリスク上昇に相関する遺伝子マーカーとしては、癌遺伝子配列および／または遺伝子変異配列（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異型ＮＳＣＬＣ）が挙げられ得る。例示的な遺伝子マーカーとしては、例えば、子宮頸がんに関連する遺伝子マーカー、例えば、ＳＣ６；ＳＩＸ１；ヒト子宮頸がん２癌原遺伝子（ＨＣＣＲ－２）；ｐ２７；ウイルス癌遺伝子Ｅ６；ウイルス癌遺伝子Ｅ７；ｐｌ６ＩＮＫ４Ａ；Ｍｃｍタンパク質（例えば、Ｍｃｍ５）；Ｃｄｃタンパク質；トポイソメラーゼ２α；ＰＣＮＡ；Ｋｉ－６７；サイクリンＥ；ｐ－５３；ＰＡＩ１；ＤＡＰキナーゼ；ＥＳＲＩ；ＡＰＣ；ＴＩＭＰ－３；ＲＡＲ－β；ＣＡＬＣＡ；ＴＳＬＣ１；ＴＩＭＰ－２；ＤｃＲｌ；ＣＵＤＲ；ＤｃＲ２；ＢＲＣＡ１；ｐ１５；ＭＳＨ２；Ｒａｓｓｆ１Ａ；ＭＬＨ１；ＭＧＭＴ；ＳＯＸ１；ＰＡＸ１；ＬＭＸ１Ａ；ＮＫＸ６－１；ＷＴ１；ＯＮＥＣＵＴ１；ＳＰＡＧ９；およびＲｂ（網膜芽細胞腫）タンパク質が挙げられる。
【0068】
特定の態様において、本発明の方法は、本明細書において記載されている安定化緩衝液組成物を含む１つまたは複数のサンプルを使用して、対象の１つもしくは複数の内在性核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ／ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ転写物）または遺伝子標的を標的とする工程を含む。したがって、例えば、本発明の方法は、標的として、１つもしくは複数のヒトゲノム配列、ヒト転写物配列、癌遺伝子配列、および／または遺伝子変異配列（例えば、ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｃ変異型ＮＳＣＬＣ）を含み得る。本発明の方法は、疾患（例えば、がん）または他の状態（例えば、がんの発症もしくはがんの進行についての素因）を示す変異について、１つまたは複数の内在性核酸を評価する工程を含み得る。本発明の方法を使用して検出される変異としては、例えば、体細胞変異（これはがん／腫瘍または微小残存病変を示し得る）が挙げられ得る。特定の態様において、本発明の方法は、１つまたは複数の標的核酸のメチル化状態を評価する工程を含む。ＤＮＡメチル化は遺伝子発現の調節において役割を果たし、異常なＤＮＡメチル化は多くの疾患（がんが挙げられる）に関連する。ＤＮＡメチル化プロファイリング（縦断的プロファイリングが挙げられる）は、がんの検出、診断、および／またはモニタリングのための価値ある診断ツールである。例えば、差次的メチル化領域の特定のパターンおよび／またはアレル特異的メチル化パターンが、核酸抽出を伴わない本発明の方法を使用して取得された標的核酸を使用する非侵襲的診断のための分子マーカーとして、有用であり得る。
【0069】
特定の態様において、標的核酸は、対象における疾患または状態（例えば、がんもしくは感染症）の進行をモニターまたは評価するために使用される。本発明の方法にしたがって疾患を評価することは、疾患の重症度を予測すること、疾患の進行の診断もしくは段階を決定すること、がんの型を分類すること、および薬物応答を予測することのうちの１つもしくは複数を含み得る。本発明の特定の方法は、腫瘍が目に見える前にその腫瘍を診断するために使用される標的核酸をサンプルから取得する工程を含み得る。これは、既存の診断様式によって提供されるよりも早期の処置を可能にする。
【0070】
本発明の方法は、対象の疾患または状態の縦断的評価を提供するために使用され得る。例えば、縦断的評価は、時間的に複数の時点で対象からサンプルを取得すること、および核酸抽出を伴わない本発明の方法を使用して標的核酸を増幅することを含み得る。複数の時点に由来する評価されるアンプリコンは、例えば、がんの進行、特定のサブタイプのがんの発症、微小残存病変、転移の起こり得るリスク、さらなるモニタリングにおける何らかの利点、メチル化状態またはメチル化パターンにおける変化、遺伝子発現パターンなどを評価するために、使用され得る。
【0071】
性感染症の検出のための本発明の組成物および方法は、粘膜スワブサンプルおよび／または体液サンプルから取得された標的核酸の１つもしくは複数のＰＣＲアッセイ（例えば、ｄｄＰＣＲ）の使用を含む。さらに、一部の実施形態において、その１つまたは複数のＰＣＲアッセイを実施する工程は、リボヌクレアーゼＰ（ＲＮＰ）に特異的なプライマー－プローブセットを使用することを含む。
【0072】
ＳＴＩに感染していると個体を診断することに加えて、発明の方法は、そのサンプル中の標的核酸量に基づいてその感染症の重症度を決定する工程をさらに含み得る。例えば、本発明の方法はウイルス負荷または細菌負荷を評価するために有用であり、これらのウイルス負荷または細菌負荷は疾患の重症度および／または進行に直接相関し得る。一部の実施形態において、方法は、逐次的な時点でその患者から取得された複数の組み合わせた生体サンプル中の標的核酸量を比較し、経時的なその標的核酸量の増加または減少に基づいて疾患の進行を決定する工程をさらに含み得る。本発明の方法はまた、その標的核酸量に基づいて疾患の転帰および／または重症度を予測するために使用され得る。
【0073】
図１は、本発明の独特な緩衝液組成物によって収集および処理された生体検体（例えば、スワブサンプルおよび／または体液サンプル）中の１種もしくは複数種の性感染病原体に由来する核酸の定量的検出を目的とする抽出を伴わないリアルタイムｑＰＣＲ検査の概略図を示す。特定の態様において、体液サンプルが、許容可能な容器に収集される。スワブ、スパチュラ、ブラシ、または同様のデバイスが粘膜サンプルの収集のために使用され、その後、その体液サンプルを含むその容器内に配置される。そのスワブは、その粘膜サンプルを抽出しそれをその体液サンプルと混合するために、圧搾または撹拌され得る。その容器が本発明の独特な緩衝液組成物を含み得、または本発明の独特な緩衝液組成物がその組み合わせたサンプルの後に添加され得る。特定の態様において、その緩衝液組成物は、サンプル調製および／または輸送媒体のために使用され得る。
【0074】
それらのサンプルを収集し、それらのサンプルにその独特な緩衝液組成物を供給した後に、ウイルス粒子および／または細菌が、加熱またはその緩衝液中での直接溶解のいずれかによって不活化され得る。その後、その不活化サンプルは、従来のアプローチが依存する追加的核酸抽出工程（単離および精製）を必要とすることなく、下流のｑＰＣＲ診断検査のために使用され得る。
【0075】
特定の態様において、調製されたサンプルは、（必要とされる場合）ＲＴによるｃＤＮＡ合成および／またはｑＰＣＲによる検出が行われ得る、ＰＣＲプレート（９６ウェル／３８４ウェル）フォーマットに移され得る。
【0076】
図４は、本発明の方法において使用される特定の成分を示す。特定の態様において、それらの成分のうちの１つまたは複数が、診断キットの一部として、使用についての指示とともに提供され得る。示されているとおり、本発明の方法およびキットは、バイアル４０３を含み得る。特定の態様において、そのバイアルには、緩衝液組成物４０５が供給される。その緩衝液組成物は、例えば、本明細書において開示されている病原体核酸輸送緩衝液である。本発明の特定のキットおよび方法において、バイアル４０３は、緩衝液組成物４０５を予め充填されている。あるいは、その緩衝液組成物は、サンプル収集の前または後にそのバイアルに添加される。
【0077】
好ましくは、そのバイアルは、それが少なくとも１つのスワブサンプルおよび／または体液サンプルと、本発明の緩衝液組成物とを収容し得るように、少なくとも１．５ｍＬである。例えば、サンプルは、遠心チューブ（例えば、スクリューキャップクライオバイアル）中に収集され得る。例示的なバイアルはバーコード４０７を備え、そのバーコードは、個々のバイアルおよび／または収集されたサンプルを追跡するために使用され得る。本明細書に開示されている発明と組み合わせて有用であるバイアルとしては、ポリプロピレンクライオバイアル（例えば、ＮＥＳＴ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＵＳＡ（ＮＪ、ＵＳＡ）の１．９ｍＬ ２Ｄ Ｂａｒｃｏｄｅｄクライオバイアル）が挙げられる。
【0078】
特定の態様において、そのバイアルは、キャップ、蓋、漏斗、および／もしくは体液サンプル収集補助器具（図４において唾液収集補助器具として示されている）を固定するための、ネジ山４０７または他の手段を備える。特定の態様において、ネジ山４０７または他の固定手段が、輸送および／または保管のためにサンプルを密封するために、キャップ４０９をそのバイアルに固定するために使用される。特定の態様において、そのキャップ４０９は、区画またはパウチ４１１を備える。そのキャップ４０９をそのバイアルに固定すると、その区画が穿孔され、または別の方法で緩衝液組成物をその区画またはパウチ４１１の内側からそのバイアル４０３の中へと放出させられる。
【0079】
特定の態様において、本発明の方法およびキットは、体液サンプルを対象から収集するための手段を備える。一部の方法およびキットにおいて、その対象は、滅菌バイアル４０３中に体液サンプルをただ提供するだけである。あるいは、サンプル収集補助器具４１３（例えば、唾液収集補助器具）または漏斗４１５が、収集を容易にするために提供される。そのサンプル収集補助器具４１３または漏斗４１５は、流体収集中にその収集補助器具／漏斗をそのバイアルに連結するための手段（例えば、ネジ山４１７）を備え得る。あるいは、その漏斗または収集補助器具は、そのバイアルと一体化されて単一ユニットを形成する。
【0080】
好ましくは、診断キットとして提供された場合、その収集補助器具／漏斗はそのバイアルに予め取り付けられている。その収集補助器具／漏斗は、そのサンプルを密封するための手段（例えば、蓋またはキャップ）を備え得る。あるいは、その収集補助器具／漏斗は、例えば、ネジ山およびネジ取付け手段によって、取り外され得る。いったん取り外されると、その収集補助器具／漏斗は、そのサンプルをそのバイアル中に密封するためにキャップまたは蓋によって置き換えられ得る。
【0081】
収集補助器具４１３または漏斗４１５は、緩衝液組成物（例えば、本明細書において開示されている輸送緩衝液）を含む、パウチまたは区画を備え得る。そのパウチまたは区画は、サンプル収集中にその緩衝液を放出し得る。例えば、そのパウチまたは区画は、ＯＭＥ－５０５収集キット（ＤＮＡ Ｇｅｎｅｔｅｋ，Ｉｎｃ．、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）において用いられるものなどの、漏斗／収集補助器具用の蓋またはキャップ内に一体化され得る。その蓋またはキャップを閉じると、区画は穿孔され、それによりその緩衝液を、そのサンプルを含むそのバイアル中に放出する。
【0082】
本発明の方法およびキットはまた、１つまたは複数の粘膜サンプルを収集するためのスワブを含むかまたはそのスワブを使用する。特定の態様において、そのスワブ４１９はハンドル４２１を備え、そのハンドルは、サンプルが対象から取得されている間、保持される。そのハンドル４２１は、ブレイクポイントを備え得る。そのサンプルが取得された後、そのハンドルはそのブレイクポイントで折られ、これにより、そのハンドルの長さを短くする。したがって、短くなったハンドルを備えるスワブ４２３は、そのバイアル４０３内に適合するのに十分に短い。示されているとおり、そのバイアル中の緩衝液（およびいくらかの流体サンプル）のレベル４２５は、そのスワブを覆うのに十分である。しかし、その流体サンプル／緩衝液のレベル４２５は、そのスワブを覆う必要はない。むしろ、その流体サンプル／緩衝液が、それらとスワブとがそのバイアル中で混合され得る程度に十分な量であることだけが、必要である。
【0083】
あるいは、またはさらに、そのスワブ４２１はキャップ４２７に連結される。そのキャップ４２７は、輸送、保管、および／または処理のためにそのサンプルを密封するために、サンプル収集後にそのバイアル４０３に連結され得る。示されているとおり、そのキャップ４２７がそのバイアル４０３に固定された場合、そのスワブはそのバイアル中の緩衝液内に位置する。
【0084】
好ましい態様において、その緩衝液組成物は、予め充填されたバイアル中にか、またはそのキットの別の成分（例えば、本明細書において記載されているキャップ）の一部として、提供される。予め測定した体積のその緩衝液を、対象によってそのサンプルに容易に添加され得る様式で提供することによって、本発明の例示的なキットは、対象が家でサンプルを提供することを可能にする。予め測定した本発明の新規な輸送緩衝液組成物をそのサンプルに添加することによって、その対象は、そのサンプルを家または他の任意の好都合な場所で提供し得、そのサンプルを分析のために実験室に郵便により送付し得る。
【0085】
図５は、サンプル中の標的核酸（例えば、性感染病原体を示す標的核酸）を検出するために使用される本発明のキットの選択した成分の詳細を示す。そのキットは指示を備え、その指示は、サンプル（例えば、スワブおよび／または体液サンプル）を取得するために必要な工程を含む。その指示は、バイアル５０３がサンプル収集ツール（例えば、スワブ、ブラシ、スパチュラ、パドル、または粘膜スワブを取得するための同様のツール、および／または流体サンプル収集補助器具５０５などのツールと一緒に対象に提供されることを、概説する。示されているとおり、本発明の特定のキットにおいて、そのバイアル５０３には、本明細書において記載されている輸送緩衝液５０９が予め充填される。
【0086】
示されているキットにおいて、その対象は、提供された体液サンプル収集補助器具５０５を使用して、サンプル（例えば、尿または唾液）をそのバイアルに提供する。示されているとおり、その流体サンプル収集補助器具５０５は、サンプル収集を容易にするためにバイアル５０３の開口部中にしっかりと適合する形状である。
【0087】
そのキットはまたスワブ５１１も備え、そのスワブは、粘膜スワブ（例えば、膣スワブ）を取得するために使用される。そのスワブのハンドルはブレイクポイント５１３を備える。サンプルを取得するためにそのスワブが使用された後、そのハンドルはそのブレイクポイントで折られる。その短くなったスワブは、体液サンプルと緩衝液とを含むそのバイアル中に配置される。その後、そのバイアルは、保管または輸送のためにキャップで密封される。特定の態様において、そのキットは、その組み合わせたサンプルを対象が分析のために実験室に郵送するための物質を備える。
【0088】
図５において示されているキットは、本明細書において記載されているとおり、体液サンプルを取得するための供給品（ｐｒｏｖｉｓｉｏｎ）を備えるが、本発明は、体液サンプルを必要としないキット、複数の体液サンプルを必要とするキット、および本発明の特定の方法において組み合わせられ得る複数の粘膜スワブを必要とするキットを企図する。
【0089】
特定の態様において、そのキットは１つまたは複数のプライマーを備え、それらのプライマーのうちの少なくとも１つは、サンプル中の標的核酸の増幅および／または検出のために使用される。
【0090】
図２は、患者から収集されたＳＴＩ検査用の粘膜サンプル１０２、および少なくとも１種の性感染病原体に関連する１つまたは複数の標的核酸がそのサンプル中に存在するか否かを決定するためにそのサンプルに対して１つまたは複数のアッセイを実施可能な機器２００へのそのサンプルのローディングを示す。本明細書においてより詳細に記載されるとおり、患者から取得（１２）されたサンプル１０２は、適切な容器１０４内に含まれ得る。特定の態様において、その患者は、例えば、症状を呈することによって、またはＳＴＩを有すると疑われている人物との性的接触の報告が原因で、１種または複数種のＳＴＩを有すると疑われている。あるいは、本発明の方法は、継続中の患者のモニタリングのため、および／または定期的なＳＴＩ検査のために、使用され得る。
【0091】
サンプルは、そのサンプル特有の容器（例えば、遠心チューブ、例えば、スクリューキャップクライオバイアル）中に収集され保管され得る。好ましくは、１．９ｍｌのスクリューキャップ付きクライオバイアルが、使用される。近位ブレイクポイントを備えるスワブまたは類似のツールが使用され、これは、このスワブがサンプル収集後にこのチューブ中に挿入されることを可能にする。そのスクリューキャップは、混入を防止するために重要である。標準サイズのクライオバイアルは、追加的なサンプル移動を行うことなく直接サンプル保管を可能にする。望まれる場合には、漏斗またはサンプル収集補助器具が、体液サンプルの収集を容易にするために使用され得る。
【0092】
図２は、ＰＣＲプレート１０６へのサンプル１０２のローディングをさらに示し、このＰＣＲプレートにおいてサンプル調製（独特な緩衝液および／またはＰＣＲミックスへのこのサンプルの導入）が行われ得、その時点で、その後、このプレート１０６は、サンプル１０２に対して１つまたは複数のＰＣＲアッセイを実施可能な機器２００に導入されて、少なくとも１種の性感染病原体に関連する１つまたは複数の標的核酸がそのサンプル中に存在するか否かを決定し得る。詳細には、この機器２００は、方法の事前工程（標的ＤＮＡおよび／または標的ＲＮＡの検出、ｃＤＮＡを生成するための任意の標的ＲＮＡの逆転写、標的ＤＮＡ／標的ｃＤＮＡの増幅（操作１６）、増幅工程からのデータの分析（操作１８）、ならびにそのＳＴＩ評価に関連する情報を提供するレポート３００の作成（操作２０）が挙げられるが、それらには限定されない）のうちのいずれか１つを提供する構成であり得る。
【0093】
したがって、その機器２００は、概して、その標的核酸もしくは生じるフラグメントを検出、配列決定、および／または計数するための構成である。この場合、複数のフラグメントが存在するかまたは予期される場合、そのフラグメントは、例えば、ｑＰＣＲによって定量化され得る。得られるレポート３００は、そのアッセイに関連する特定のデータ（例えば、患者データ（すなわち、背景情報、属性および特徴、病歴、追跡情報など）、検査データ（そのサンプルが検査で１種または複数種の標的病原体について陽性であったかまたは陰性であったかが挙げられる）、陽性であった場合は、さらなる測定基準（疾患の進行および予測される疾患の転帰が挙げられる）が挙げられる）を含み得る。
【実施例】
【0094】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の方法にしたがう標的病原体核酸の検出のための例示的なプロトコルを提供する。以下の実施例は、本発明の数ある局面のうちでも特に、それらの方法が、核酸抽出工程を行うことなく病原体検査のために利用可能なＤＮＡを首尾良く提供可能であることを示す。さらに、示されているとおり、本発明の方法は、粘膜スワブ、体液サンプル、ならびに組み合わせたスワブおよび体液サンプルによって取得されたサンプルに適用可能である。さらに、本発明の方法はサンプルからウイルスおよび細菌の両方を検出可能であり、本発明の方法はまた、単一の検査を使用して複数の性感染病原体を検出および識別可能である。
以下の実施例は、本発明の方法にしたがう標的病原体核酸の検出のための例示的なプロトコルを提供する。以下の実施例は、本発明の数ある局面のうちでも特に、それらの方法が、核酸抽出工程を行うことなく病原体検査のために利用可能なＤＮＡを首尾良く提供可能であることを示す。さらに、示されているとおり、本発明の方法は、粘膜スワブ、体液サンプル、ならびに組み合わせたスワブおよび体液サンプルによって取得されたサンプルに適用可能である。さらに、本発明の方法はサンプルからウイルスおよび細菌の両方を検出可能であり、本発明の方法はまた、単一の検査を使用して複数の性感染病原体を検出および識別可能である。
【0095】
（実施例１－スワブ、体液、および組み合わせたサンプルにおける抽出を伴わない方法）
抽出を伴わないＰＣＲは、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）消化（これは、さもなければ望ましいＤＮＡサンプルまたはＲＮＡサンプルを分解する）の有効性に部分的には依存する。スワブまたは唾液マトリックスのいずれかにおけるＰＫ活性について最適化するために、種々の緩衝液成分を試験した。これは、スワブサンプルのためには特に重要である。体液サンプル（例えば、尿および唾液）（これは、生サンプルとして収集および輸送が可能である）とは異なり、スワブサンプルは輸送媒体（例えば、ウイルスおよび／または細菌輸送媒体）中で保管されるべきである。しかし、多くの性感染病原体について、輸送中の従来のスワブサンプルは、検査のために核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）抽出工程を通常は必要とする。
抽出を伴わないＰＣＲは、プロテイナーゼＫ（ＰＫ）消化（これは、さもなければ望ましいＤＮＡサンプルまたはＲＮＡサンプルを分解する）の有効性に部分的には依存する。スワブまたは唾液マトリックスのいずれかにおけるＰＫ活性について最適化するために、種々の緩衝液成分を試験した。これは、スワブサンプルのためには特に重要である。体液サンプル（例えば、尿および唾液）（これは、生サンプルとして収集および輸送が可能である）とは異なり、スワブサンプルは輸送媒体（例えば、ウイルスおよび／または細菌輸送媒体）中で保管されるべきである。しかし、多くの性感染病原体について、輸送中の従来のスワブサンプルは、検査のために核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）抽出工程を通常は必要とする。
【0096】
本発明者らは、種々の緩衝液成分、ウイルス輸送媒体、および市販のスワブ収集デバイスであるＯＲ１００（ＤＮＡ Ｇｅｎｏｔｅｋ）を、抽出を伴わないＰＣＲについて試験した。陰性スワブサンプルを健常な志願者から収集し、各溶液中に配置した。
【0097】
その後、サンプルを熱不活化ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに添加し、唾液サンプル用の唾液調製緩衝液（下記を参照のこと）とＰＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）との混合物、またはスワブサンプル用のＰＫ単独のいずれかを予め充填した９６ウェルプレートにサンプルを分注することによってＰＫと混合した。唾液サンプル（ＳａｌｉｖａＦＡＳＴ）について、単一の唾液サンプルからの３０μＬを５μＬの唾液調製緩衝液および５μＬのＰＫとそのプレートの各ウェル中で混合した。スワブサンプル（ＳｗａｂＦＡＳＴ）について、単一のスワブサンプルからの３５μＬを、各ウェル当たり５μＬのＰＫと混合した。その後、その調製したサンプルプレートをデジタルマイクロプレートシェーカーに５００ＲＰＭにて１分間配置し、その後、熱不活化のためにサーマルサイクラーに９５℃にて５分間配置した。
【0098】
ＰＢＳ中のスワブサンプル、ウイルス輸送媒体、およびＯＲ１００は、Ｎ１領域にて陽性シグナルを生じなかった。陽性シグナルのうちでは、トリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中の疑似（ｃｏｎｔｒｉｖｅｄ）スワブサンプルが最も強い定量サイクル（Ｃｑ）値を生じ、これは、本発明のウイルス輸送緩衝液のための緩衝液成分を含む。同様に、種々の緩衝液成分、生の唾液、および市販の唾液収集デバイスであるＯＭ５０５（ＤＮＡ Ｇｅｎｏｔｅｋ）を、抽出を伴わないＰＣＲについて試験した。ＯＭ５０５中の疑似唾液サンプルはＮ１領域にて陽性シグナルを生じなかった。陽性シグナルのうち、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）緩衝液条件中の疑似唾液サンプルが最も強いＣｑ値を生じた。これを使用してＳａｌｉｖａＦＡＳＴプロトコルにおけるＰＫの有効性を改善する。
【0099】
したがって、本明細書において記載されている輸送緩衝液を使用する核酸抽出を伴わない本発明の方法は、スワブサンプルおよび流体サンプルの両方に由来する標的核酸の安定な保管および検出を可能にする。
【0100】
その後、本発明者らは、粘膜スワブサンプルおよび体液サンプルの相対的有効性を試験した。外鼻孔（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｎａｓａｌ）スワブ（ＡＮＳ）サンプルと唾液サンプルとを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの検出について比較した。簡単に述べると、ＡＮＳサンプルをＤＮＡ ＧｅｎｏｔｅｋのＯＲ－１００デバイス（ＳｗａｂＣｌｅａｒ（商標））で収集し、唾液サンプルはＤＮＡ ＧｅｎｏｔｅｋのＯＭ－５０５デバイス（ＳａｌｉｖａＣｌｅａｒ（商標））を使用して同じ患者から収集した。サンプルを、製造業者の指示にしたがってＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを検出するために試行した。
【0101】
ほとんどの対にしたサンプルはＡＮＳサンプルと唾液サンプルとの間で一致する結果（両方で検出、または両方で非検出）を示したが、それらの２種類の検体間で一致しない結果が、一部の対にしたサンプルで観察された（すなわち、一方の検体ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ２を検出したが、もう一方の検体では非検出）。これらの臨床的知見に基づいて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２もしくは他の呼吸器ウイルスの存在量もしくはクリアランスは、個体間で、またはその感染症もしくは疾患の経過中の種々の時点で、鼻腔中と唾液中とを比較して変化し得ると仮定した。したがって、１箇所の検体部位のみに依存する検査は、一部の陽性症例を見逃すことを意味し得る。これは本発明のＳＴＩ検出法に当てはまる。その理由は、多くの性感染病原体は種々のサンプル型の間で（感染症の経過全体を含む）異なって検出され得るからである。
【0102】
本発明者らは、本発明の方法が、組み合わせたスワブおよび体液サンプルを使用可能であることを示す実験結果をさらに得た。１６人のヒト参加者が、唾液サンプルを５０ｍｌファルコンチューブ中に吐いた。フロック（ｆｌｏｃｋｅｄ）鼻咽頭スワブを使用して、同じ参加者から外鼻孔スワブ（ＡＮＳ）サンプルを収集した。各患者に由来する１つの唾液サンプルを、ＲＮＡ抽出を伴わないｑＰＣＲプロトコルにおいて使用して、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症を検出した。その鼻腔スワブを、各参加者に由来する第２の唾液サンプルを保持するファルコンチューブ中にスワブを下にして配置した。そのスワブを圧搾してそのＡＮＳサンプルを抽出し、それをその唾液と混合した。その組み合わせた唾液およびＡＮＳサンプルに、上記の唾液サンプルと同じＲＮＡ抽出を伴わないｑＰＣＲプロトコルを行った。
【0103】
図３はそれらのｑＰＣＲ結果をサイクル閾値（Ｃｔ）値として提示し、これは、どのくらい多くのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスがそのサンプルにおいて検出されたかを示す。その対となった結果は、唾液のみのサンプルについて「ＳａｌｉｖａＦａｓｔ」として提示され、組み合わせたサンプルについて「Ｓｐｉｔ－Ｎ－Ｄｉｐ」として提示されている。このデータは、同じ検査プロトコルを使用して唾液のみを使用した検査と比較した場合に、その混合型のＡＮＳ－唾液検体における濃縮されたウイルス存在量の顕著な改善（より低いＣｔ値として示される）を示す。
【0104】
したがって、特定の病原体および／またはサンプルの型について、組み合わせた粘膜スワブおよび体液サンプルは、単一の供給源から取得されたサンプルと比較した場合に、より感度の高い結果を提供する。したがって、１つまたは複数の粘膜スワブと１つまたは複数の体液サンプルとを組み合わせて、多様な集団間および感染症または疾患の経過中の種々の時点にて目的の性感染病原体の検出機会を最大化するＳＴＩ検出検査のために、本明細書において開示されている方法を使用し得る。
【0105】
（実施例２－核酸抽出工程を行わない方法を使用するＳＴＩ検出のための例示的なプロトコル）
本開示は、ＣＴ感染症および／またはＮＧ感染症についてＳＴＩ検出を実施する核酸抽出を伴わない方法についてのこの例示的なプロトコルを提供する。しかし、本発明の方法は、他の任意の性感染病原体由来の核酸を検出するために使用し得る。
本開示は、ＣＴ感染症および／またはＮＧ感染症についてＳＴＩ検出を実施する核酸抽出を伴わない方法についてのこの例示的なプロトコルを提供する。しかし、本発明の方法は、他の任意の性感染病原体由来の核酸を検出するために使用し得る。
【0106】
（スワブサンプルの収集）
スワブ収集デバイスは、以下を含む：スワブサンプルに特異的な独特な緩衝液組成物（本明細書中で以後はスワブ輸送緩衝液と呼ぶ）を１ｍｌ充填した１．９ｍｌ Ｎｅｓｔチューブ（これは、そのスワブサンプルのための容器として使用する）；少なくとも１つのスワブ（これを使用して患者の粘膜をスワブ採取し、その後、そのスワブ輸送緩衝液を充填したそのチューブの内側に配置する）。
スワブ収集デバイスは、以下を含む：スワブサンプルに特異的な独特な緩衝液組成物（本明細書中で以後はスワブ輸送緩衝液と呼ぶ）を１ｍｌ充填した１．９ｍｌ Ｎｅｓｔチューブ（これは、そのスワブサンプルのための容器として使用する）；少なくとも１つのスワブ（これを使用して患者の粘膜をスワブ採取し、その後、そのスワブ輸送緩衝液を充填したそのチューブの内側に配置する）。
【0107】
そのスワブは、その収集場所を監督する機関によって指定された訓練を受けた医療従事者の監督下で収集し得る。あるいは、自宅または他の遠隔地の施設にいる患者にキットを送付し得る。その収集を監督する医療従事者またはそのサンプルを取得する患者は、アルコールベースの消毒剤または無香料石鹸と水とで手を清浄にすべきである。収集の前に、患者に指示書を提示する。患者は、患者情報（名前、生年月日、および必要とされる追加情報を含む）を提供し得る。医療従事者は、患者に、研究同意書を吟味して（Ｏｖａｔｉｏｎによって提供される）研究への参加または不参加を決定するように依頼し得る。最後に、医療従事者は、予め印刷されたバーコード表示をスキャンして、それを、すでに収集された患者情報に紐付け、その後、サンプル収集のためにその患者により使用されるチューブにその表示を配置する。
【0108】
収集のために、そのＮｅｓｔチューブのキャップを外し、特定の検査のための目的の粘膜から１０回スワブ採取する。そのチューブの内部にてそのスワブのハンドルを近位ブレイクポイントで折る。そのＮｅｓｔチューブのキャップをスワブを内側にして元に戻し、そのキャップを確実に締める。この収集プロセス中にいくらかサンプルがこぼれた場合は、アルコールワイプまたはそのチューブの外側を拭くための同等物を使用して、混入を防ぐ。その後、そのサンプルを、実験室へ輸送する前に室温下で個々のバッグに配置する。
（実験室におけるサンプルの受領（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ）および受入れ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｉｎｇ））
（実験室におけるサンプルの受領（ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ）および受入れ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｉｎｇ））
【0109】
スワブサンプルを実験室に輸送する。サンプルをバッグから取り出し、なんらかの漏出または損傷が無いかについての受領受付にいる受入れ監督者が視覚的に調べる。その監督者による事前スクリーニング段階を合格したサンプルを、受入れチームが使用する机上に移動させる。その事前スクリーニング段階を合格しなかったサンプルは、さらなる調査のために取って置く。受入れ担当者（ａｃｃｅｓｓｉｏｎｅｒ）は、そのＮｅｓｔチューブのバーコードをスキャンし、実験室情報管理システム（ＬＩＭＳ）によってコンピュータスクリーンに示される患者情報および同意ステータスを調べる。ＬＩＭＳにおいて完全な患者情報を備え漏出が全くないチューブ（すなわち、適格なサンプル）を、ラックに配置する。そのラック中のサンプルの位置は、ＬＩＭＳにおいて割り当てられた位置と一致すべきである。不適格なサンプルは別のラックに配置し、受入れ監督者によるさらなる調査のために取って置く。その後、サンプル調製チームの臨床検査技師（ＭＬＳ）がそのサンプルを取り出すまで、サンプルのラックを６００ｒｐｍにて保持位置でプラットフォームロッカーに配置し得る。
【0110】
（スワブ調製緩衝液）
サンプル調製の一部として、そのスワブサンプルを、スワブサンプルのために特別に調製した独特な緩衝液組成物（本明細書において、スワブ調製緩衝液と呼ぶ）と混合する。そのスワブ調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の装置の使用を含む：安全キャビネットまたは層流フード（無菌環境を維持可能な作業領域）；滅菌済みの個別包装ピペット、ピペットチップ（例えば、１０ｍＬおよび２５ｍＬ）；ピペット・エイド；ピペッター（１ｍＬまたは２００μＬ）および対応するチップ；ならびに５０ｍｌの滅菌済みでヌクレアーゼフリーのＦａｌｃｏｎチューブ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆリピーター（５０ｍＬ容量）；１．９ｍｌ Ｃｒｙｏｖｉａｌチューブ（Ｎｅｓｔ）；Ｎｅｓｔチューブラック；ならびにスクリューキャップチューブデキャッパー装置（Ｂｒｏｏｋｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
サンプル調製の一部として、そのスワブサンプルを、スワブサンプルのために特別に調製した独特な緩衝液組成物（本明細書において、スワブ調製緩衝液と呼ぶ）と混合する。そのスワブ調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の装置の使用を含む：安全キャビネットまたは層流フード（無菌環境を維持可能な作業領域）；滅菌済みの個別包装ピペット、ピペットチップ（例えば、１０ｍＬおよび２５ｍＬ）；ピペット・エイド；ピペッター（１ｍＬまたは２００μＬ）および対応するチップ；ならびに５０ｍｌの滅菌済みでヌクレアーゼフリーのＦａｌｃｏｎチューブ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆリピーター（５０ｍＬ容量）；１．９ｍｌ Ｃｒｙｏｖｉａｌチューブ（Ｎｅｓｔ）；Ｎｅｓｔチューブラック；ならびにスクリューキャップチューブデキャッパー装置（Ｂｒｏｏｋｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【0111】
そのスワブ輸送緩衝液の調製は、少なくとも以下の試薬／成分の使用をさらに含む：
・１０×ＴＢＥ緩衝液（トリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２～８．４）、滅菌済み、ＤＮａｓｅフリー・ＲＮａｓｅフリー・プロテアーゼフリーグレード、Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＢＰ１３３３２０、２０Ｌ；
・ＲＮａｓｅインヒビター、ヒト胎盤、４０，０００単位／ｍｌ、滅菌済み、ＤＮａｓｅフリー・ＲＮａｓｅフリーグレード、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０３０７Ｌ、１０，０００単位、２５０μｌ／チューブ；
・アムホテリシンＢ溶液、脱イオン水中２５０μｇ／ｍｌ、滅菌済み、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２９４２、１００ｍｌ（または真菌の混入および増殖を防止するために適切な濃度の類似の抗真菌剤）；
・ペニシリン－ストレプトマイシン溶液、１００×、ペニシリン（１０，０００ＩＵ）とストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）との１００倍作業濃度の混合物、滅菌済み、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０－００２－ＣＩ（または細菌の混入および増殖を防止するために適切な濃度の類似の抗生物質）；
・ヌクレアーゼフリー水、滅菌済み、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａ、Ｗ４５０２、ＤＮａｓｅフリー・ＲＮａｓｅフリー・プロテアーゼフリーグレード；ならびに
・消毒薬（例えば、７０％エタノール）。
・１０×ＴＢＥ緩衝液（トリス－ホウ酸－ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２～８．４）、滅菌済み、ＤＮａｓｅフリー・ＲＮａｓｅフリー・プロテアーゼフリーグレード、Ｆｉｓｈｅｒ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ、カタログ番号ＢＰ１３３３２０、２０Ｌ；
・ＲＮａｓｅインヒビター、ヒト胎盤、４０，０００単位／ｍｌ、滅菌済み、ＤＮａｓｅフリー・ＲＮａｓｅフリーグレード、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０３０７Ｌ、１０，０００単位、２５０μｌ／チューブ；
・アムホテリシンＢ溶液、脱イオン水中２５０μｇ／ｍｌ、滅菌済み、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ａ２９４２、１００ｍｌ（または真菌の混入および増殖を防止するために適切な濃度の類似の抗真菌剤）；
・ペニシリン－ストレプトマイシン溶液、１００×、ペニシリン（１０，０００ＩＵ）とストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）との１００倍作業濃度の混合物、滅菌済み、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３０－００２－ＣＩ（または細菌の混入および増殖を防止するために適切な濃度の類似の抗生物質）；
・ヌクレアーゼフリー水、滅菌済み、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａ、Ｗ４５０２、ＤＮａｓｅフリー・ＲＮａｓｅフリー・プロテアーゼフリーグレード；ならびに
・消毒薬（例えば、７０％エタノール）。
【0112】
それらの成分の調製は少なくとも以下の工程を含む：適切な消毒薬で作業面を清浄にする；作業面に配置する前に試薬瓶を消毒する；５００ｍｌ／瓶の１０×ＴＢＥ緩衝液を滅菌済みの５００ｍｌ Ｃｏｒｎｉｎｇ瓶に分注し、室温にて保管する；８９４．９５ｍｌ／瓶のヌクレアーゼフリー水を滅菌済みの１Ｌ Ｃｏｒｎｉｎｇ瓶に分注し、室温にて保管する；（滅菌済みの５ｍｌ Ｃｏｒｎｉｎｇチューブに）４ｍｌ／チューブのアムホテリシンＢ溶液を分注し、－２０℃にて保管する；（滅菌済みＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに）１ｍｌ／チューブのペニシリン／ストレプトマイシンを分注し、－２０℃にて保管する；実験室が管理するノートにロットの情報および調製を記録する。
【0113】
そのスワブ調製緩衝液の調製は、少なくとも以下の工程を含む：
１．適切な消毒薬で作業面を清浄にする；
２．作業面に置く前に試薬瓶を消毒する（ＲＮａｓｅインヒビター以外を分注する）
３．例えば、１Ｌの輸送緩衝液を調製するために、
３．１．瓶１本分のヌクレアーゼフリー水（８９４．９５ｍｌ／瓶）を持ってくる；
３．２．滅菌済みの５０ｍｌファルコンチューブを使用して、１００ｍｌの１０×ＴＢＥ緩衝液を添加する；
３．３．滅菌済みのピペットを使用して、５０μｌのＲＮａｓｅインヒビターを添加する；
３．４．チューブ１本分のアムホテリシンＢ溶液およびチューブ１本分のペニシリン／ストレプトマイシンを解凍し、滅菌済みのピペットを使用して、４ｍｌのアムホテリシンおよび１ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンをその瓶に無菌的に添加する；
４．実験室が管理するノートにロットの情報および調製を記録する；
５．実験室の適切なＩＤ（例えば、ロット番号）を割り当てる；
６．そのチューブのキャップをしっかり閉め、そのチューブを反転することによって完全に混合する；
７．ＱＣサンプル用に１００μｌの媒体を抜き出す；
８．その瓶に
スワブ輸送緩衝液
実験室ＩＤ：（実験室の適切なＩＤ（例えば、Ｓｕｍｍｉｔ緩衝液（Ｓｕｍｍｉｔ Ｂｕｆｆｅｒ）２としてＳＴＢ２）を挿入する）
ＤＯＭ：（現在の製造日を挿入する）
有効期限：（製造日から１か月後の日付を挿入する）
２℃～８℃にて保管する
と表示を付ける；
９．アリコートに分配するまで２℃～８℃にて保管する；
１０．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆリピーター（５０ｍＬ容量）およびＢｒｏｏｋｓデキャッパーを使用して、１ｍＬの調製済みのスワブ調製緩衝液を個々の滅菌済みの１．９ｍｌスクリューキャップ付きチューブ（Ｎｅｓｔ）に分注する；
１１．無菌性確認を実施する；
１２．チューブと、その瓶に残っているあらゆる緩衝液とを２℃～８℃にて保管する。
１．適切な消毒薬で作業面を清浄にする；
２．作業面に置く前に試薬瓶を消毒する（ＲＮａｓｅインヒビター以外を分注する）
３．例えば、１Ｌの輸送緩衝液を調製するために、
３．１．瓶１本分のヌクレアーゼフリー水（８９４．９５ｍｌ／瓶）を持ってくる；
３．２．滅菌済みの５０ｍｌファルコンチューブを使用して、１００ｍｌの１０×ＴＢＥ緩衝液を添加する；
３．３．滅菌済みのピペットを使用して、５０μｌのＲＮａｓｅインヒビターを添加する；
３．４．チューブ１本分のアムホテリシンＢ溶液およびチューブ１本分のペニシリン／ストレプトマイシンを解凍し、滅菌済みのピペットを使用して、４ｍｌのアムホテリシンおよび１ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンをその瓶に無菌的に添加する；
４．実験室が管理するノートにロットの情報および調製を記録する；
５．実験室の適切なＩＤ（例えば、ロット番号）を割り当てる；
６．そのチューブのキャップをしっかり閉め、そのチューブを反転することによって完全に混合する；
７．ＱＣサンプル用に１００μｌの媒体を抜き出す；
８．その瓶に
スワブ輸送緩衝液
実験室ＩＤ：（実験室の適切なＩＤ（例えば、Ｓｕｍｍｉｔ緩衝液（Ｓｕｍｍｉｔ Ｂｕｆｆｅｒ）２としてＳＴＢ２）を挿入する）
ＤＯＭ：（現在の製造日を挿入する）
有効期限：（製造日から１か月後の日付を挿入する）
２℃～８℃にて保管する
と表示を付ける；
９．アリコートに分配するまで２℃～８℃にて保管する；
１０．Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆリピーター（５０ｍＬ容量）およびＢｒｏｏｋｓデキャッパーを使用して、１ｍＬの調製済みのスワブ調製緩衝液を個々の滅菌済みの１．９ｍｌスクリューキャップ付きチューブ（Ｎｅｓｔ）に分注する；
１１．無菌性確認を実施する；
１２．チューブと、その瓶に残っているあらゆる緩衝液とを２℃～８℃にて保管する。
【0114】
（サンプルの調製）
サンプル調製チームのＭＬＳは、ロッカーにある受入れたサンプルのラックを取り出し、検査のためにそれらを調製するためにそのラックをサンプル調製室に持って来る。ＭＬＳは、１０μＬ／ウェルのサンプル調製ミックス（Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｍｉｘ）（ＳＰＭ）を含む、調製済みの９６ウェルサンプル調製プレート（Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｐｌａｔｅ）（ＳＰＰ）を持って来る。このＳＰＭは、サンプル調製緩衝液およびプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）を含む。詳細には、この９６ウェルＳＰＰは、マルチチャンネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して各ウェルに分配された、１ウェル当たり１０μＬのＳＰＭ（５μＬサンプル調製緩衝液および５μＬプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を含む。そのサンプルのキャップを、安全キャビネットの内部で半自動化６チャンネルデキャッパー（Ｂｒｏｏｋｓ）または自動化４８フォーマットデキャッパー（Ｂｒｏｏｋｓ）を用いて開ける。この６チャンネルデキャッパーを使用する場合には、そのキャップキャリアラックにキャップを一時的に置く。Ｅ１－ＣｌｉｐＴｉｐ電子マルチチャンネル（８チャンネル）イコライザーを使用し十分にピペッティングして、およそ３０μＬのサンプルを、その４８ウェルラックのチューブから、１０μＬのＳＰＭを含む９６ウェルＳＰＰに移す。４８ウェルラック２個分のサンプルが、１個分の９６ウェルＳＰＰを満たす。サンプルに再びキャップを閉める（６チャンネルデキャッパーを使用する場合は一度に６個、または自動化４８フォーマットデキャッパーを使用する場合は一度に４８個）。デジタルマイクロプレートシェーカーに５００ＲＰＭにて１分間そのプレートを配置することによって、そのサンプルとＳＰＭとを十分に混合する。そのプレートをｍｉｎｉＡｍｐ ９６ウェルＰＣＲ機器に９５℃にて５分間置き、４℃にて保持する。その後、サンプルのラック全体を一時的サンプル保管領域に運ぶ。反復検査を必要とするサンプルはどれでも、この一時的サンプル保管領域から特定する。反復検査は１回だけ可能である。失敗した場合は、新たなサンプルを要求する。余ったサンプルは、将来の使用のために－８０℃にて保管する。
サンプル調製チームのＭＬＳは、ロッカーにある受入れたサンプルのラックを取り出し、検査のためにそれらを調製するためにそのラックをサンプル調製室に持って来る。ＭＬＳは、１０μＬ／ウェルのサンプル調製ミックス（Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｍｉｘ）（ＳＰＭ）を含む、調製済みの９６ウェルサンプル調製プレート（Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐ Ｐｌａｔｅ）（ＳＰＰ）を持って来る。このＳＰＭは、サンプル調製緩衝液およびプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）を含む。詳細には、この９６ウェルＳＰＰは、マルチチャンネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して各ウェルに分配された、１ウェル当たり１０μＬのＳＰＭ（５μＬサンプル調製緩衝液および５μＬプロテイナーゼＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を含む。そのサンプルのキャップを、安全キャビネットの内部で半自動化６チャンネルデキャッパー（Ｂｒｏｏｋｓ）または自動化４８フォーマットデキャッパー（Ｂｒｏｏｋｓ）を用いて開ける。この６チャンネルデキャッパーを使用する場合には、そのキャップキャリアラックにキャップを一時的に置く。Ｅ１－ＣｌｉｐＴｉｐ電子マルチチャンネル（８チャンネル）イコライザーを使用し十分にピペッティングして、およそ３０μＬのサンプルを、その４８ウェルラックのチューブから、１０μＬのＳＰＭを含む９６ウェルＳＰＰに移す。４８ウェルラック２個分のサンプルが、１個分の９６ウェルＳＰＰを満たす。サンプルに再びキャップを閉める（６チャンネルデキャッパーを使用する場合は一度に６個、または自動化４８フォーマットデキャッパーを使用する場合は一度に４８個）。デジタルマイクロプレートシェーカーに５００ＲＰＭにて１分間そのプレートを配置することによって、そのサンプルとＳＰＭとを十分に混合する。そのプレートをｍｉｎｉＡｍｐ ９６ウェルＰＣＲ機器に９５℃にて５分間置き、４℃にて保持する。その後、サンプルのラック全体を一時的サンプル保管領域に運ぶ。反復検査を必要とするサンプルはどれでも、この一時的サンプル保管領域から特定する。反復検査は１回だけ可能である。失敗した場合は、新たなサンプルを要求する。余ったサンプルは、将来の使用のために－８０℃にて保管する。
【0115】
（ＰＣＲ試薬の調製およびプレートの構成）
ＰＣＲマスターミックスを含むプレート（本明細書においてＰＣＲマスターミックスプレート（ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｐｌａｔｅ）（ＰＭＭＰ）と呼ぶ）は、マルチチャンネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートのプレートの各ウェルに分配された、１２．５μＬのＰＣＲマスターミックスを含む。このＰＣＲマスターミックスは、１０μＬのＬｕｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、１μＬのＬｕｎａ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ ＲＴ酵素ミックス、および１．５μＬの病原体特異的／ＲＮＰプライマー／プローブから構成される。この１．５μＬの病原体特異的／ＲＮＰプライマー／プローブは、５０．２５μＬの各１００μＭのプライマーおよびプローブストックを５２４μＬのＩＤＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加することによって、６６．７μＭ作業ストックの病原体特異的およびＲＮＰプライマー、ならびに１．７μＭのＦＡＭ標識病原体特異的およびＡＴＴＯ－６４７標識ＲＮＰプローブとして作製する。あるいは、単一のサンプルにおいて複数の病原体が検出される場合は、その１．５μＬの病原体特異的／ＲＮＰプライマー／プローブは、５０．２５μＬの各１００μＭのプライマーおよびプローブストックを５２４μＬのＩＤＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加することによって、６６．７μＭ作業ストックの病原体特異的およびＲＮＰプライマー、ならびに１．７μＭの異なって標識した病原体特異的プローブ（例えば、ＮＧ検出用のＲｏｘ標識プローブおよびＣＴ検出用のＦａｍ標識プローブ）ならびにＡＴＴＯ－６４７標識ＲＮＰプローブとして作製する。
ＰＣＲマスターミックスを含むプレート（本明細書においてＰＣＲマスターミックスプレート（ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｐｌａｔｅ）（ＰＭＭＰ）と呼ぶ）は、マルチチャンネルイコライザーまたはＶｉａｆｌｏｗ（Ｉｎｔｅｇｒａ）を使用して９６ウェルプレートまたは３８４ウェルプレートのプレートの各ウェルに分配された、１２．５μＬのＰＣＲマスターミックスを含む。このＰＣＲマスターミックスは、１０μＬのＬｕｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、１μＬのＬｕｎａ Ｗａｒｍｓｔａｒｔ ＲＴ酵素ミックス、および１．５μＬの病原体特異的／ＲＮＰプライマー／プローブから構成される。この１．５μＬの病原体特異的／ＲＮＰプライマー／プローブは、５０．２５μＬの各１００μＭのプライマーおよびプローブストックを５２４μＬのＩＤＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加することによって、６６．７μＭ作業ストックの病原体特異的およびＲＮＰプライマー、ならびに１．７μＭのＦＡＭ標識病原体特異的およびＡＴＴＯ－６４７標識ＲＮＰプローブとして作製する。あるいは、単一のサンプルにおいて複数の病原体が検出される場合は、その１．５μＬの病原体特異的／ＲＮＰプライマー／プローブは、５０．２５μＬの各１００μＭのプライマーおよびプローブストックを５２４μＬのＩＤＴＥ緩衝液（ｐＨ７．５）に添加することによって、６６．７μＭ作業ストックの病原体特異的およびＲＮＰプライマー、ならびに１．７μＭの異なって標識した病原体特異的プローブ（例えば、ＮＧ検出用のＲｏｘ標識プローブおよびＣＴ検出用のＦａｍ標識プローブ）ならびにＡＴＴＯ－６４７標識ＲＮＰプローブとして作製する。
【0116】
分子チームのＭＬＳは、９６ウェルまたは３８４ウェルのＰＭＭＰをそれらの個々のＰＣＲワークステーションに配置し、上記のサンプルの調製工程から得た７．５μＬの処理済みサンプルを、そのＰＭＭＰの指定された各ウェルに添加する。その後、その処理済みサンプルをピペッティングにより上記のＰＣＲマスターミックスと混合し、泡を生じさせるのを回避するように注意を払う。そのＭＬＳは、陽性コントロール（例えば、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅｓおよびＳｅｒａｃａｒｅから得たものなど、不活化ＣＴ／ＮＧスワブに由来する）ならびに陰性コントロール、ならびにテンプレートなしのコントロール（ＮＴＣ－水）を、それらのコントロールについて指定したＰＣＲウェル（プレート１つ当たり１個の陽性コントロール、１個の陰性コントロール、およびＮＴＣ）に７．５μＬ添加し得、ピペッティングにより混合して、泡を生じさせるのを回避する。その後、そのＭＬＳは、そのＰＭＭＰの上に透明なプラスチックｑＰＣＲフィルムを置き、そのフィルムをプレートシーラーで密封し、プレート遠心機で短時間遠心分離して泡を除去する。
【0117】
（ＰＣＲ温度プロファイル（増幅領域））
プレートをＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸまたはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ＰＣＲ装置にローディングし、マスターファイルを開き、以下のサーマルサイクラー条件を実行する：
１．工程１：５５℃で１０分間、１サイクル；
２．工程２：９５℃で１分間、１サイクル；および
工程３：９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間（これに加えて、ＣＴ標的についてのＦＡＭチャンネルおよび／またはＮＧ標的についてのＲｏｘチャンネルならびにＲＮＰ標的についてのＣｙ５チャンネルの両方でのプレート読取り）を４０サイクル。
プレートをＢｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸまたはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ＰＣＲ装置にローディングし、マスターファイルを開き、以下のサーマルサイクラー条件を実行する：
１．工程１：５５℃で１０分間、１サイクル；
２．工程２：９５℃で１分間、１サイクル；および
工程３：９５℃で１０秒間、６０℃で３０秒間（これに加えて、ＣＴ標的についてのＦＡＭチャンネルおよび／またはＮＧ標的についてのＲｏｘチャンネルならびにＲＮＰ標的についてのＣｙ５チャンネルの両方でのプレート読取り）を４０サイクル。
【0118】
（データの解釈（ＢｉｏＲａｄ ＣＦＸ ｏｐｕｓ ９６ウェルフォーマット）（唾液／粘膜の検査））
Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸはＣｑ値を報告する。その際、このＣｑ値ファイル（ｃｓｖファイル）をＰＣＲ装置からＯｖＤｘ ＬＩＭＳへとエクスポートする。このＣｑ値の解釈（検出（ＤＥＴＥＣＴＥＤ）、非検出（ＮＯＴ ＤＥＴＥＣＴＥＤ）および無効（ＩＮＶＡＬＩＤ））を、以下の基準にしたがってＯｖＤｘ ＬＩＭＳへとエクスポートする：
ＣＴ／ＮＧが検出された場合、その結果は有効であり、ＲＮＰについての値に関わらず「検出（ＤＥＴＥＣＴＥＤ）」を返す。ＣＴ／ＮＧが検出されずＲＮＰが≦２５である場合、「非検出（ＮＯＴ ＤＥＴＥＣＴＥＤ）」という結果を返す。ＲＮＰ Ｃｑ値＞２５かつＣＴ／ＮＧ＞２５である場合、そのサンプルを再検査のためにレスキューする。再検査後に、そのＲＮＰが依然として＞２５である場合、その提供者に接触して別のサンプルを収集しなければならない。ＮａＮ＝非数。
Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸはＣｑ値を報告する。その際、このＣｑ値ファイル（ｃｓｖファイル）をＰＣＲ装置からＯｖＤｘ ＬＩＭＳへとエクスポートする。このＣｑ値の解釈（検出（ＤＥＴＥＣＴＥＤ）、非検出（ＮＯＴ ＤＥＴＥＣＴＥＤ）および無効（ＩＮＶＡＬＩＤ））を、以下の基準にしたがってＯｖＤｘ ＬＩＭＳへとエクスポートする：
【表2】
【0119】
（品質保証およびバッチリリース）
実験室監督者は、以下を含むコントロールを試験する：陽性コントロール（これは、ＮＧ／ＣＴ標的について陽性であるがＲＮＰ標的については陰性であるべきである）；陰性コントロール（これは、ＮＧ／ＣＴ標的について陰性であるがＲＮＰ標的については陽性であるべきである）；およびＮＴＣコントロール（これは、ＮＧ／ＣＴ標的およびＲＮＰ標的の両方について陰性であるべきである）。この実験室監督者はさらに、抜き打ち検査を実行し、陽性結果対陰性結果の比を推定する。メディカルディレクター（ｍｅｄｉｃａｌ ｄｉｒｅｃｔｏｒ）が、さらなる試験後にそのバッチをリリースし、そのレポートを承認する。
実験室監督者は、以下を含むコントロールを試験する：陽性コントロール（これは、ＮＧ／ＣＴ標的について陽性であるがＲＮＰ標的については陰性であるべきである）；陰性コントロール（これは、ＮＧ／ＣＴ標的について陰性であるがＲＮＰ標的については陽性であるべきである）；およびＮＴＣコントロール（これは、ＮＧ／ＣＴ標的およびＲＮＰ標的の両方について陰性であるべきである）。この実験室監督者はさらに、抜き打ち検査を実行し、陽性結果対陰性結果の比を推定する。メディカルディレクター（ｍｅｄｉｃａｌ ｄｉｒｅｃｔｏｒ）が、さらなる試験後にそのバッチをリリースし、そのレポートを承認する。
【0120】
（ＰＣＲ検査後のサンプル配置）
無効（ＩＮＶＡＬＩＤ）の結果となったサンプルを上記の一時的サンプル保管領域（換気フード１）において特定する。反復検査をこれらのサンプルに対して実施し、工程ＩＩＩ（サンプルの調製）から開始する。検証された結果を有するサンプルを－８０℃にて保管する。ＰＣＲプレートをバイオハザードとして廃棄領域（換気フード２）へと移動させる。
無効（ＩＮＶＡＬＩＤ）の結果となったサンプルを上記の一時的サンプル保管領域（換気フード１）において特定する。反復検査をこれらのサンプルに対して実施し、工程ＩＩＩ（サンプルの調製）から開始する。検証された結果を有するサンプルを－８０℃にて保管する。ＰＣＲプレートをバイオハザードとして廃棄領域（換気フード２）へと移動させる。
【0121】
（実施例３－ＳＴＩＦａｓｔ添加実験）
上記で提示したプロトコルと同様のプロトコルを使用して、本発明者らはＳＴＩＦａｓｔを開発した。これは、サンプルから性感染病原体を検出する、核酸抽出を伴わない方法である。ＳＴＩＦａｓｔが性感染症を検出する能力を試験するために、本発明者らは、その方法がサンプルにおけるＣＴまたはＮＧのいずれかの存在を検出する能力を示す、一連の添加実験を行った。
上記で提示したプロトコルと同様のプロトコルを使用して、本発明者らはＳＴＩＦａｓｔを開発した。これは、サンプルから性感染病原体を検出する、核酸抽出を伴わない方法である。ＳＴＩＦａｓｔが性感染症を検出する能力を試験するために、本発明者らは、その方法がサンプルにおけるＣＴまたはＮＧのいずれかの存在を検出する能力を示す、一連の添加実験を行った。
【0122】
以下の概念実証実験において、ＣＴ／ＮＧサンプルを不活化スワブにて提供した。それらのＣＴ／ＮＧスワブは、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって作製されたＨｅｌｉｘ Ｅｌｉｔｅ（商標）ＣＴ／ＮＧコントロールスワブを含んだ。これらのスワブは、ＣＴ細菌およびＮＧ細菌を１×１０３ ～５×ｌ０３の濃度で含む。他の試験において、それらのＣＴ／ＮＧスワブは、ＳｅｒａｃａｒｅによるＡＣＣＵＲＵＮ分子コントロールを含んだ。これは、所有権のある濃度でＣＴ／ＮＧ核酸を提供する。検査用のサンプルは、望ましいコントロール物質を含む病原体輸送緩衝液を添加することによって作製した。
【0123】
以下の表１は、添加アッセイで使用したＣＴ用およびＮＧ用のプローブおよびプライマーを詳述する。
【表1-1】
【表1-2】
【0124】
第１のセットのシングルプレックスアッセイにおいて、サンプルを、ＴＥ緩衝液中で種々の濃度の組み合わせたＮＧ／ＣＴコントロール（すなわち、Ｈｅｌｉｘ Ｅｌｉｔｅ（商標）ＣＴ／ＮＧコントロールスワブまたはＣＴ／ＮＧコントロール核酸）を使用して添加した。Ｈｅｌｉｘ Ｅｌｉｔｅ（商標）ＣＴ／ＮＧコントロールスワブまたはＣＴ／ＮＧコントロール核酸の両方を使用する組み合わせたサンプルもまた、調製した。ＲＮＰを陰性コントロールとして使用した。「ランダム患者検体」サンプルもまた、ＣＴ感染症もＮＧ感染症も有しない対象に由来するスワブを使用して、調製した。
【0125】
第１のセットのシングルプレックスアッセイはＮＧ用およびＲＮＰ用のプライマーおよびプローブを使用して実施し、第２のセットのシングルプレックスアッセイはＣＴ用およびＲＮＰ用のプライマーおよびプローブを使用して実施した。
【0126】
図６は、これらのアッセイからのｑＰＣＲ読取りを提示する。
【0127】
図７は、ＮＧシングルプレックスアッセイにおけるｑＰＣＲ Ｃｑデータおよび使用した成分を提示する。それらのＣｑ値によって示されるとおり、ＣＴ／ＮＧ核酸コントロールを使用して作製したサンプルは、検出可能な標的ＮＧ ＤＮＡを提供した。対応するＲＮＰ陰性コントロールシグナルの欠如は、ＮＧ標的ＤＮＡのみが検出されていたことを示す。同様に、Ｈｅｌｉｘ Ｅｌｉｔｅ（商標）ＣＴ／ＮＧコントロールスワブを使用して作製したサンプルは、検出可能な標的ＮＧ ＤＮＡを提供し、これは、本発明の方法を使用して、粘膜スワブサンプルを使用してＳＴＩを検出し得ることを示した。非感染患者サンプル（および対応するＲＮＰシグナル）の添加の際の検出可能なＮＧシグナルの欠如は、標的ＮＧ ＤＮＡのみが検出されたことを示す。同様に正確な結果が、Ｈｅｌｉｘ Ｅｌｉｔｅ（商標）ＣＴ／ＮＧコントロールスワブおよびＣＴ／ＮＧコントロール核酸の両方を使用して、組み合わせたサンプルを作製した場合に得られた。さらに、その組み合わせたサンプルについてのＣｑ値は、Ｈｅｌｉｘ Ｅｌｉｔｅ（商標）ＣＴ／ＮＧコントロールスワブおよびＣＴ／ＮＧコントロール核酸サンプル単独のいずれかについてよりも高かった。
【0128】
図８は、ＣＴシングルプレックスアッセイにおけるｑＰＣＲ Ｃｑデータおよび使用した成分を提示する。それらのＣｑ値によって示されるとおり、ＣＴ／ＮＧ 核酸コントロールを使用して作製したサンプルは、検出可能な標的ＣＴ ＤＮＡを提供した。対応するＲＮＰ陰性コントロールシグナルの欠如は、ＣＴ標的ＤＮＡのみが検出されていたことを示す。同様に、Ｈｅｌｉｘ Ｅｌｉｔｅ（商標）ＣＴ／ＮＧコントロールスワブを使用して作製したサンプルは、検出可能な標的ＣＴ ＤＮＡを提供し、これは、本発明の方法を使用して、粘膜スワブサンプルを使用してＳＴＩを検出し得ることを示した。非感染患者サンプル（および対応するＲＮＰシグナル）の添加の際の検出可能なＣＴシグナルの欠如は、標的ＣＴ ＤＮＡのみが検出されたことを示す。同様に正確な結果が、Ｈｅｌｉｘ Ｅｌｉｔｅ（商標）ＣＴ／ＮＧコントロールスワブおよびＣＴ／ＮＧコントロール核酸の両方を使用して、組み合わせたサンプルを作製した場合に得られた。
【0129】
そのアッセイがシングルプレックスフォーマット（すなわち、１回で１つの病原体をサンプルから検出する）で機能したことを確認した後で、マルチプレックスフォーマットを使用して、本明細書において開示されている方法が単一のサンプルにおいて複数の性感染病原体を検出する能力を評価する実験を実施した。
【0130】
シングルプレックスアッセイと同様のサンプルを、ＣＴ／ＮＧコントロールを使用して調製した。ＣＴについてのシングルプレックスアッセイおよびＮＧについてのシングルプレックスアッセイを、これらの新しいサンプルについて実施した。これらの新しいサンプルを、同じサンプルにおいてＣＴ用およびＮＧ用の両方のプライマーおよびプローブを使用するアッセイでも使用して、単一のサンプルを使用する複数の病原体の多重検出を評価した。
【0131】
図９は、これらのアッセイからのｑＰＣＲ読取りを提示する。
【0132】
図１０～図１１は、ＣＴシングルプレックスアッセイおよびＮＧシングルプレックスアッセイにおけるｑＰＣＲ Ｃｑデータおよび使用した成分を提示する。示されているとおり、そのデータは、上記のシングルプレックスアッセイにおいて得られたデータと一致する。
【0133】
図１２は、ＣＴおよびＮＧマルチプレックスアッセイにおけるｑＰＣＲ Ｃｑデータおよび使用した成分を提示する。示されているとおり、ＣＴおよびＮＧの両方が、ＣＴ用およびＮＧ用の両方のプライマーおよびプローブを使用することによって、同じサンプルから容易に検出された。
【0134】
図１３は、それらのシングルプレックスアッセイおよびマルチプレックスアッセイの両方において得られた結果を要約する図表を提示する。示されているとおり、ＮＧ検出およびＣＴ検出の両方について、各サンプル型についての結果はアッセイ間で一致し、それらのアッセイは、各アッセイについて新しいサンプルを使用して別々の日に行った。
【0135】
したがって、示されたとおり、本発明の方法は、スワブサンプルおよび体液サンプルの両方から性感染病原体を検出可能である。さらに、本発明の方法は、単一のサンプルを使用して、複数の別々の性感染病原体を検出可能である。さらに、本発明の方法。
【0136】
（参照による援用）
他の文献（例えば、特許、特許出願、特許公開物、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ）の参照および引用が、本開示の全体にわたって行われた。すべてのそのような文献は、すべての目的のためにその全体が参照によって本明細書により本明細書中に援用される。
他の文献（例えば、特許、特許出願、特許公開物、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ）の参照および引用が、本開示の全体にわたって行われた。すべてのそのような文献は、すべての目的のためにその全体が参照によって本明細書により本明細書中に援用される。
【0137】
（均等物）
本発明およびその多くのさらなる実施形態の種々の改変が、本明細書において示され記載されたものの他にも、本明細書の全内容（本明細書中に引用される科学文献および特許文献の参照を含む）から当業者に明らかになる。本明細書中の主題は、本発明の種々の実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合され得る重要な情報、例証および指針を含む。
本発明およびその多くのさらなる実施形態の種々の改変が、本明細書において示され記載されたものの他にも、本明細書の全内容（本明細書中に引用される科学文献および特許文献の参照を含む）から当業者に明らかになる。本明細書中の主題は、本発明の種々の実施形態およびその均等物において本発明の実施に適合され得る重要な情報、例証および指針を含む。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【国際調査報告】