特表 2024-540406 ＩＬ１０単量体融合タンパク質及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-31

(54)【発明の名称】ＩＬ１０単量体融合タンパク質及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20241024BHJP

   C07K 14/54 20060101ALI20241024BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20241024BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241024BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241024BHJP

   C07K 16/24 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241024BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00

C07K14/54 ZNA

C07K16/00

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/02 K

C12P21/08

C07K16/28

C07K16/24

A61P35/00

A61P29/00

A61K39/395 T

A61K39/395 U

A61K38/20

A61K31/7088

A61K48/00

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024527110

(86)(22)【出願日】2022-11-01

(85)【翻訳文提出日】2024-05-02

(86)【国際出願番号】 CN2022128998

(87)【国際公開番号】W WO2023078245

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】202111286063.4

(32)【優先日】2021-11-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524169412

【氏名又は名称】コアントン フェイポン バイオファーマ インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】ルー ティー

(72)【発明者】

【氏名】フオ ヨンティン

(72)【発明者】

【氏名】チャン イーポー

(72)【発明者】

【氏名】イェン チアチン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG03

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA08

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA44

4C084DA12

4C084MA02

4C084NA13

4C084ZB11

4C084ZB26

4C084ZC751

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC23

4C085DD61

4C085EE03

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA13

4C086ZB11

4C086ZB26

4C086ZC75

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

ＩＬ１０単量体融合タンパク質及びその使用を提供し、生物医学分野に関し、前記融合タンパク質は、抗体と、ＩＬ－１０単量体と、を含む。本発明に記載の融合タンパク質は、比較的強い標的性を有し、安全性が顕著に向上し、且つ種々の腫瘍又は炎症性疾患の治療又は予防に有効である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体と、ＩＬ－１０単量体と、を含み、ここで、前記抗体は、２本の同一の軽鎖と、２本の同一の重鎖と、を含み、１本のＩＬ－１０単量体は、前記抗体の重鎖又は軽鎖に接続されており、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記抗体の重鎖のＣ末端に接続されていない、ことを特徴とする融合タンパク質。

【請求項2】

前記抗体の各軽鎖は、ＶＬ領域と、ＣＬ領域と、を含み、前記抗体の各重鎖は、ＶＨ領域と、ＣＨ１領域と、ＣＨ２領域と、ＣＨ３領域と、を含み、前記抗体の各軽鎖又は各重鎖に１本の前記ＩＬ－１０単量体が接続されており、
任意に、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記抗体の軽鎖Ｃ末端に連結されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記抗体の軽鎖Ｎ末端に連結されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記抗体の軽鎖のＶＬ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記抗体の軽鎖のＣＬ領域のＮ末端に連結されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記抗体の重鎖のＮ末端に連結されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記抗体の重鎖ＶＨ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記抗体の重鎖ＣＨ１領域のＮ末端に連結されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記抗体の重鎖ＣＨ２領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記抗体の重鎖ＣＨ３領域のＮ末端に連結されている、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記ＩＬ－１０単量体は、天然ＩＬ－１０単量体を含む、ことを特徴とする請求項１～２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記ＩＬ－１０単量体は、修飾された天然ＩＬ－１０単量体を含み、前記修飾は、１１６位と１１７位のアミノ酸の間に第１接続ペプチドを挿入することを含み、前記第１接続ペプチドは、可撓性接続ペプチドであり、
任意に、前記第１接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列を有し、
任意に、前記ＩＬ－１０単量体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記ＩＬ－１０単量体と前記抗体の重鎖又は軽鎖とは、第２接続ペプチド及び／又は第３接続ペプチドによって接続されており、
任意に、前記第２接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有し、前記第３接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記ＩＬ－１０単量体と前記抗体の重鎖末端又は軽鎖末端とは、前記第２接続ペプチドによって接続されており、任意に、
前記第２接続ペプチドのＮ末端は、前記抗体の軽鎖のＣ末端に連結されており、前記第２接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は
前記第２接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第２接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体の軽鎖のＮ末端に連結されており、又は
前記第２接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第２接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体の重鎖のＮ末端に連結されている、ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

前記ＩＬ－１０単量体と前記抗体の重鎖末端又は軽鎖末端とは、前記第３接続ペプチドによって接続されており、
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記抗体の軽鎖のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体の軽鎖のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体の重鎖のＮ末端に連結されている、ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記軽鎖ＶＬ領域のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記軽鎖ＣＬ領域のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記重鎖ＶＨ領域のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記重鎖ＣＨ１領域のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記重鎖ＣＨ２領域のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記重鎖ＣＨ３領域のＮ末端に連結されている、ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の軽鎖のＶＬ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の軽鎖ＣＬ領域のＮ末端に接続されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＶＨ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＣＨ１領域のＮ末端に連結されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＣＨ２領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＣＨ３領域のＮ末端に連結されている、ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

前記抗体は、免疫細胞系抗体及び腫瘍細胞系抗体からなる群より選ばれ、
任意に、前記抗体は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＣＲ８抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＳＭＡ４Ｄ抗体、抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ４７抗体又は抗ＴＮＦα抗体であり、
任意に、前記抗体は、抗ＰＤ－１抗体である、ことを特徴とする請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載のアミノ酸配列を有し、又は
前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列を有し、又は
前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有し、又は
前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有し、又は
前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列を有し、又は
前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする、ことを特徴とする核酸。

【請求項13】

請求項１２に記載の核酸を含む、ことを特徴とする発現ベクター。

【請求項14】

請求項１２に記載の核酸、請求項１３に記載の発現ベクターを担持するか又は請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する、ことを特徴とする組換え細胞。

【請求項15】

腫瘍又は炎症性疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１２に記載の核酸、請求項１３に記載の発現ベクター又は請求項１４に記載の組換え細胞の使用。

【請求項16】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項１２に記載の核酸、請求項１３に記載の発現ベクター又は請求項１４に記載の組換え細胞を含む、ことを特徴とする医薬組成物。

【請求項17】

前記医薬組成物は、腫瘍又は炎症性疾患の治療又は予防に用いられる、ことを特徴とする請求項１６に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本出願は、出願番号が２０２１１１２８６０６３．４で、出願日が２０２１年１１月２日で、発明の名称がＩＬ１０単量体融合タンパク質及びその使用である中国発明特許出願の優先権を主張し、その内容の全てが参照によって本出願に組み込まれる。

【0002】

本発明は、生物医学分野に関し、具体的には、融合タンパク質及びその使用に関し、より具体的には、融合タンパク質、核酸、発現ベクター、組換え細胞、医薬の製造における前記融合タンパク質又は核酸又は発現ベクター又は組換え細胞の使用及び医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0003】

インターロイキン１０（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０、ＩＬ－１０、又はＩＬ１０）は、ヒトサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）とも呼ばれ、抗炎症性サイトカインであって、ホモ二量体分泌物に属し、現在の臨床上のＩＬ－１０タンパク質の安全性に問題があり、少量の天然の二量体化ＩＬ－１０分子がその受容体であるＩＬ－１０Ｒαに高親和性で結合した後、さらにＩＬ－１０Ｒβに結合し、ヘキサマー複合体を形成して下流シグナルを活性化し、生物学的機能的反応を引き起こす。

【0004】

現在の臨床上のＩＬ－１０薬物分子は標的性に乏しく、薬物分子が容易に脱標的化され、且つ副作用を生じ、しかしながら、開発中のＩＬ－１０抗体融合タンパク質のほとんどの設計思想は、抗体標的化作用を利用してＩＬ－１０を局所環境に導入して機能することである。これらの融合タンパク質分子は、通常のＩＬ－１０二量体構造を有する傾向があるが、ＩＬ－１０二量体がＩＬ－１０Ｒαに高親和性で結合するため、抗体側の標的化作用に影響を与え、それによって設計思想の失敗につながる可能性があり、抗体側の活性のために必要とされる用量が比較的大きい場合、ＩＬ－１０側の副作用は依然として厄介な問題である。

【0005】

したがって、標的性が強く、副作用が少ないＩＬ－１０薬物の積極的な探索が依然として必要であり、その研究方向は腫瘍又は炎症性疾患の予防又は治療に重要な意義を持つ。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本出願は、以下の課題に関する発明者らの発見及び認識に基づいてなされたものである。

【0007】

現在の臨床上のＩＬ－１０薬物は標的性に乏しく、薬物分子が容易に脱標的化され、薬効が発揮されにくいだけでなく、且つ副作用を生じやすく、発明者らはＩＬ－１０単量体分子と抗体分子との接続方式を探索することで、ＩＬ－１０単量体分子と抗体分子とを含む融合タンパク質を製造し、前記融合タンパク質中のＩＬ－１０分子は抗体が標的細胞に結合する前にＩＬ－１０が単量体形態を呈し、その受容体に結合できず、抗体分子と標的細胞上の抗原との結合を妨害せず、抗体が抗原に結合した後、大量のＩＬ－１０単量体分子が凝集することで、互いに近接した２つのＩＬ－１０単量体が二量体として機能し、ＩＬ－１０受容体に結合し、それによって正常な生物学的反応を引き起こし、ＩＬ－１０薬物の標的性及び安全性を顕著に向上させ、薬効を十分に発揮させる。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明の第１態様において、本発明は、融合タンパク質を提案する。本発明の実施例によれば、抗体と、ＩＬ－１０単量体と、を含み、ここで、前記抗体は、２本の同一の軽鎖と、２本の同一の重鎖と、を含み、１本のＩＬ－１０単量体は、抗体重鎖又は軽鎖に接続されており、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、抗体重鎖のＣ末端に接続されていない。天然ＩＬ－１０分子は、二量体形態であり、本発明の実施例による融合タンパク質は、抗体が標的細胞に結合する前にＩＬ－１０分子が単量体形態を呈し、その受容体に結合できず、抗体分子と標的細胞との結合を妨害しない。抗体が標的細胞に結合した後、大量のＩＬ－１０単量体分子が凝集することで、互いに近接した２つのＩＬ－１０単量体が二量体として機能し、ＩＬ－１０受容体に結合し、それによって正常な生物学的反応を引き起こし、且つＩＬ－１０単量体が生物学的機能を誘発することが非常に困難であるため、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質は天然二量体ＩＬ－１０分子又はその抗体融合タンパク質の投与量の制限を生じず、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質の投与量を顕著に向上させる。前記融合タンパク質は、より多くの抗体分子と組み合わせて用いることができ、融合タンパク質の標的性及び安全性を顕著に向上させ、薬効を十分に発揮させ、且つ種々の腫瘍又は炎症性疾患を治療又は予防することができる。

【0009】

本発明の実施例によれば、上記融合タンパク質は、以下の付加的な技術的特徴の少なくとも１つをさらに含んでもよい。

【0010】

本発明の実施例によれば、各抗体軽鎖は、ＶＬ領域と、ＣＬ領域と、を含み、各抗体重鎖は、ＶＨ領域と、ＣＨ１領域と、ＣＨ２領域と、ＣＨ３領域と、を含み、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、抗体軽鎖Ｃ末端に連結されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、抗体軽鎖Ｎ末端に連結されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、軽鎖ＶＬ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、軽鎖ＣＬ領域のＮ末端に連結されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、抗体重鎖のＮ末端に連結されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、重鎖ＶＨ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、重鎖ＣＨ１領域のＮ末端に連結されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、重鎖ＣＨ２領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、重鎖ＣＨ３領域のＮ末端に連結されている。

【0011】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体は、天然ＩＬ－１０単量体を含む。

【0012】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体は、修飾された天然ＩＬ－１０単量体であり、前記修飾は、（ｉ）天然ＩＬ－１０単量体のＮ末端の最初の２つのアミノ酸を除去すること、及び（ｉｉ）１１６位と１１７位のアミノ酸の間に第１接続ペプチドを挿入し、前記第１接続ペプチドが可撓性接続ペプチドであること、のうちの少なくとも１つを含む。

【0013】

天然ＩＬ－１０単量体のＮ末端の最初の２つのアミノ酸を除去した後、ＩＬ－１０単量体の安定性が向上すると同時に、ＩＬ－１０単量体の１１６位と１１７位のアミノ酸の間に第１接続ペプチドを挿入した後、前記融合タンパク質中のＩＬ－１０単量体分子がブロックされ、閉ループＩＬ－１０単量体分子となり（天然ＩＬ１０二量体の２本のＩＬ１０鎖が互いに絡み合って形成され、ｌｉｎｋｅｒを挿入することにより改造すると、ＩＬ１０単量体は独立してドメイン、即ち閉ループ単量体分子を形成することができる）、同一の融合タンパク質中の２つのＩＬ－１０単量体は相互接続などの妨害を起こすことがない。

【0014】

本発明の実施例によれば、前記第１接続ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示される。

【0015】

【化1】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有する。

【0016】

【化2】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体と抗体重鎖又は軽鎖とは、第２接続ペプチド又は／及び第３接続ペプチドによって接続されている。第２接続ペプチド又は／及び第３接続ペプチドを利用して前記ＩＬ１０単量体と前記抗体重鎖又は軽鎖とを連結した後、前記融合タンパク質中の抗体部分が対応する標的細胞に結合した後、互いに近接した２つの融合タンパク質のＩＬ－１０単量体が二量体をより形成しやすく機能し、ＩＬ－１０受容体に結合する。

【0017】

本発明の実施例によれば、前記第２接続ペプチド又は／及び第３接続ペプチドは、可撓性接続ペプチド又は剛性接続ペプチドであってもよい。

【0018】

本発明の実施例によれば、前記第２接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有し、前記第３接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を有する。

【0019】

【化3】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体と前記抗体の重鎖末端又は軽鎖末端とは、前記第２接続ペプチドによって接続されている。

【0020】

本発明の実施例によれば、前記第２接続ペプチドのＮ末端は、前記抗体軽鎖のＣ末端に連結されており、前記第２接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は前記第２接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第２接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体軽鎖のＮ末端に連結されており、又は前記第２接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第２接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体重鎖のＮ末端に連結されている。

【0021】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体と前記抗体の重鎖末端又は軽鎖末端とは、前記第３接続ペプチドによって接続されており、
本発明の実施例によれば、前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記抗体軽鎖のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体軽鎖のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体重鎖のＮ末端に連結されている。

【0022】

本発明の実施例によれば、前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記軽鎖ＶＬ領域のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記軽鎖ＣＬ領域のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記重鎖ＶＨ領域のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記重鎖ＣＨ１領域のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記重鎖ＣＨ２領域のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記重鎖ＣＨ３領域のＮ末端に連結されている。

【0023】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の軽鎖のＶＬ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の軽鎖ＣＬ領域のＮ末端に接続されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＶＨ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＣＨ１領域のＮ末端に連結されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＣＨ２領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＣＨ３領域のＮ末端に連結されている。

【0024】

本発明の実施例によれば、前記抗体は、免疫細胞系抗体及び腫瘍細胞系抗体からなる群より選ばれる。

【0025】

本発明の実施例によれば、前記抗体は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＣＲ８抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＳＭＡ４Ｄ抗体、抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ４７抗体又は抗ＴＮＦα抗体である。

【0026】

本発明の実施例によれば、前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載のアミノ酸配列を有し、又は前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列を有し、又は前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有し、又は前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有し、又は前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列を有し、又は前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有する。

【0027】

【化4】

【化5】

【化6】

本発明の第２態様において、本発明は、核酸を提案する。本発明の実施例によれば、前記核酸は、第１態様に記載の融合タンパク質をコードする。本発明の実施例による核酸によってコードされる融合タンパク質中のＩＬ－１０分子は、抗体部分が標的細胞に結合する前に単量体形態を呈し、その受容体に結合できず、抗体分子と標的細胞との結合を妨害せず、抗体が標的細胞に結合した後、大量のＩＬ－１０単量体分子が凝集することで、互いに近接した２つのＩＬ－１０単量体が二量体として機能し、ＩＬ－１０受容体に結合し、それによって正常な生物学的反応を引き起こし、且つＩＬ－１０単量体が生物学的機能を誘発することが非常に困難であるため、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質は天然二量体ＩＬ－１０分子又はその抗体融合タンパク質の投与量の制限を生じず、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質の投与量を顕著に向上させる。前記融合タンパク質は、より多くの抗体分子と組み合わせて用いることができ、融合タンパク質の標的性及び安全性を顕著に向上させ、薬効を十分に発揮させ、且つ種々の腫瘍又は炎症性疾患を治療又は予防することができる。

【0028】

本発明の実施例によれば、前記核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。

【0029】

本発明の第３態様において、本発明は、発現ベクターを提案する。本発明の実施例によれば、前記発現ベクターは、第２態様に記載の核酸を含む。本発明の実施例による発現ベクターは、適切な受容体細胞に導入された後、調節系の介在下で、前述の融合タンパク質の発現を効果的に達成することができ、得られた融合タンパク質中のＩＬ－１０分子は、抗体部分が標的細胞に結合する前に単量体形態を呈し、その受容体に結合できず、抗体分子と標的細胞との結合を妨害せず、抗体が標的細胞に結合した後、大量のＩＬ－１０単量体分子が凝集することで、互いに近接した２つのＩＬ－１０単量体が二量体として機能し、ＩＬ－１０受容体に結合し、それによって正常な生物学的反応を引き起こし、且つＩＬ－１０単量体が生物学的機能を誘発することが非常に困難であるため、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質は天然二量体ＩＬ－１０分子又はその抗体融合タンパク質の投与量の制限を生じず、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質の投与量を顕著に向上させる。前記融合タンパク質は、より多くの抗体分子と組み合わせて用いることができ、融合タンパク質の標的性及び安全性を顕著に向上させ、薬効を十分に発揮させ、且つ種々の腫瘍又は炎症性疾患を治療又は予防することができる。

【0030】

本発明の第４態様において、本発明は、組換え細胞を提案する。本発明の実施例によれば、前記組換え細胞は、第２態様に記載の核酸、第３態様に記載の発現ベクターを担持するか又は第１態様に記載の融合タンパク質を発現する。本発明の実施例による組換え細胞は、前述の融合タンパク質の発現及び大量取得に用いることができ、得られた融合タンパク質は、抗体部分が標的細胞に結合する前にＩＬ－１０分子が単量体形態を呈し、その受容体に結合できず、抗体分子と標的細胞との結合を妨害せず、抗体が標的細胞に結合した後、大量のＩＬ－１０単量体分子が凝集することで、互いに近接した２つのＩＬ－１０単量体が二量体として機能し、ＩＬ－１０受容体に結合し、それによって正常な生物学的反応を引き起こし、且つＩＬ－１０単量体が生物学的機能を誘発することが非常に困難であるため、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質は天然二量体ＩＬ－１０分子又はその抗体融合タンパク質の投与量の制限を生じず、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質の投与量を顕著に向上させる。前記融合タンパク質は、より多くの抗体分子と組み合わせて用いることができ、融合タンパク質の標的性及び安全性を顕著に向上させ、薬効を十分に発揮させ、且つ種々の腫瘍又は炎症性疾患を治療又は予防することができる。

【0031】

本発明の第５態様において、本発明は、医薬の製造における、第１態様に記載の融合タンパク質、第２態様に記載の核酸、第３態様に記載の発現ベクター又は第４態様に記載の組換え細胞の使用を提案する。本発明の実施例によれば、前記医薬は、腫瘍又は炎症性疾患の治療又は予防に用いられる。本発明の具体的な実施例によれば、前記医薬は、腫瘍及び炎症性疾患の治療又は緩和に有効であり、且つ安全性が比較的高い。

【0032】

本発明の第６態様において、本発明は、医薬組成物を提案する。本発明の実施例によれば、第１態様に記載の融合タンパク質、第２態様に記載の核酸、第３態様に記載の発現ベクター又は第４態様に記載の組換え細胞を含む。本発明の具体的な実施例による医薬は、腫瘍及び炎症性疾患の治療又は緩和に有効であり、且つ比較的高い安全性を有する。

【0033】

本発明の実施例によれば、上記医薬組成物は、以下の付加的な技術的特徴（ｉ）及び（ｉｉ）の少なくとも１つをさらに含んでもよい。

【0034】

（ｉ）本発明の実施例によれば、前記医薬組成物は、腫瘍又は炎症性疾患の治療又は予防に用いられる。

【0035】

（ｉｉ）本発明の実施例によれば、前記医薬組成物は、安定剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤のうちの少なくとも１つを含む薬学的に許容される補助剤を含むことができ、前記医薬組成物は、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、溶液剤、懸濁剤、凍結乾燥製剤のうちの少なくとも１つである。

【0036】

本発明の第７態様において、本発明は、対象における腫瘍又は炎症性疾患に関連する疾患、病症又は状況を診断、治療、予防又は軽減する方法であって、上記対象に、治療有効量の前記融合タンパク質及び／又は前記医薬組成物を投与することを含む方法を提案する。

【0037】

本発明の追加の態様及び利点は、部分的には以下の説明で与えられ、部分的には以下の説明から明らかになるか、又は本発明の実施によって知ることができる。

【図面の簡単な説明】

【0038】

本発明の上記及び／又は追加の態様及び利点は、以下の図面と併せて、実施例の説明から明らかになり、容易に理解されるであろう。

【図1】本発明の実施例による天然ＩＬ－１０分子及びＩＬ－１０単量体とＩＬ－１０受容体との結合方式の概略図であり、ここで、Ａは、天然ＩＬ－１０分子とＩＬ－１０受容体との結合方式の概略図を示し、Ｒ１は、ＩＬ－１０受容体（ＩＬ－１０Ｒα）を示し、Ｒ２は、ＩＬ－１０受容体（ＩＬ－１０Ｒβ）を示し、Ｂは、ＩＬ－１０単量体とＩＬ－１０受容体との結合方式の概略図を示し、Ｒ１は、ＩＬ－１０受容体（ＩＬ－１０Ｒα）を示し、ＩＬ－１０Ｍ１は、ＩＬ－１０単量体を示す。

【図2】本発明の実施例による融合タンパク質における前記抗体が標的細胞上の抗原に結合し、ＩＬ－１０単量体がＩＬ－１０受容体に結合する概略図であり、ＩＬ－１０単量体は親和性が比較的弱く、標的化作用が悪いため、抗体側は正常に標的化作用を発揮でき、腫瘍表面を標的化した後、抗体が局所的に濃縮され、ＩＬ－１０単量体を凝集し、二量体ＩＬ－１０（Ｍ）＊２になって機能することが可能である。ここで、ＩＬ－１０Ｒは、ＩＬ１０ＲαＲβ複合体を示し、Ｈｅｒ２は、ヒト上皮成長因子受容体を示し、抗体が抗原を標的にする例であり、Ｔ－ｃｅｌｌは、Ｔ細胞を示し、Ｔｕｍｏｒは、腫瘍を示す。

【図3】本発明の実施例によるＩＬ－１０単量体が抗体分子に挿入される位置構造概略図であり、ここで、Ａは、ＩＬ－１０単量体の抗体における挿入可能位置（位置１～位置７）を示し、Ｂは、抗体の各軽鎖のＶＬ、ＣＬの間（即ち位置１）に１本のＩＬ－１０単量体を挿入する構造概略図を示し、且つｌｉｎｋｅｒ２を用いて接続し、得られた融合タンパク質分子をＲ０９８７と命名し、Ｃは、抗体重鎖のＶＨ、ＣＨ１の間（即ち位置２）に１本のＩＬ－１０単量体を挿入する構造概略図を示し、且つｌｉｎｋｅｒ２を用いて接続し、得られた融合タンパク質分子をＲ０９８８と命名し、Ｄは、抗体重鎖のＣＨ２、ＣＨ３の間（即ち位置３）に１本のＩＬ－１０単量体を挿入する構造概略図を示し、且つｌｉｎｋｅｒ２を用いて接続し、得られた融合タンパク質分子をＲ０９８９と命名し、Ｅは、抗体軽鎖のＮ末端（即ち位置４）に１本のＩＬ－１０単量体を挿入する構造概略図を示し、且つｌｉｎｋｅｒ２を用いて接続し、得られた融合タンパク質分子をＲ０９９０と命名し、Ｆは、抗体軽鎖のＣ末端（即ち位置５）に１本のＩＬ－１０単量体を挿入する構造概略図を示し、且つｌｉｎｋｅｒ３を用いて接続し、得られた融合タンパク質分子をＲ０９９１と命名し、Ｇは、抗体重鎖のＮ末端（即ち位置６）に１本のＩＬ－１０単量体を挿入する構造概略図を示し、且つｌｉｎｋｅｒ３を用いて接続し、得られた融合タンパク質分子をＲ０９９２と命名し、Ｈは、抗体重鎖のＣ末端（即ち位置７）に１本のＩＬ－１０単量体を挿入する構造概略図を示し、且つｌｉｎｋｅｒ３を用いて接続し、得られた融合タンパク質分子をＲ０９９３と命名し、Ｉは、本発明の実施例３～５における対照分子（Ｒ０４２８、Ｒ０５９４、Ｒ０８６２、Ｒ０６７６、Ｒ０５７９、Ｒ１０４９）の構造図である。

【図4】本発明の実施例による融合タンパク質Ｒ０９８７、Ｒ０９８８、Ｒ０９８９、Ｒ０９９０、Ｒ０９９１、Ｒ０９９２、Ｒ０９９３のＳＤＳ－ＰＡＧＥ検出結果図である。

【図5】本発明の実施例による融合タンパク質がフローサイトメトリーにより抗体側結合活性を検出する結果図であり、ここで、横軸（Ａｂ ｃｏｎｃ．Ｌｏｇ（ｎＭ））は、抗体濃度（ｎＭ）を示し、縦軸ＭＦＩ ＰＥは、平均蛍光強度を示す。

【図6】本発明の実施例による融合タンパク質がフローサイトメトリーによりＩＬ－１０単量体側結合活性を検出する結果図であり、ここで、横軸（Ａｂ ｃｏｎｃ．Ｌｏｇ（ｎＭ））は、抗体濃度（ｎＭ）を示し、縦軸ＭＦＩ ＰＥは、平均蛍光強度を示す。

【図7】本発明の実施例による融合タンパク質がレポーター遺伝子法によりＩＬ－１０単量体側結合活性を検出する結果図であり、ここで、横軸（Ａｂ ｃｏｎｃ．Ｌｏｇ（μｇ／ｍＬ））は、抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を示し、縦軸（Ｌｕｍ）は、Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ蛍光強度を示す。

【図8】本発明の実施例によるＭＣ３８腫瘍モデルマウスの融合タンパク質治療後のマウス体内の腫瘍体積の統計分析結果図であり、ここで、横軸（Ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）は、マウス移植後の日数を示し、縦軸（Ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）は、腫瘍体積を示す。

【図9】本発明の実施例によるＣＴ２６腫瘍モデルマウスの融合タンパク質治療後のマウス体内の腫瘍体積の統計分析結果図であり、ここで、横軸（Ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ）は、マウス移植後の日数を示し、縦軸（Ｔｕｍｏｒ ｖｏｌｕｍｅ）は、腫瘍体積を示す。

【発明を実施するための形態】

【0039】

以下、本発明の実施例を詳細に説明し、前記実施例の例を図面に示す。以下は図面を参照して説明する実施例は例示的なものであり、本発明を解釈するためのものであり、本発明を限定するものと理解されるべきではない。

【0040】

さらに、「第１」、「第２」という用語は、単に説明の目的のためのものであり、相対的な重要性を示すか、暗示するか、又は示される技術的特徴の数を暗示することを意味するものと理解されるべきではない。したがって、「第１」、「第２」と定義された特徴は、少なくとも１つのその特徴を明示的又は暗示的に含んでもよい。本発明の説明において、「複数」は、特に断りのない限り、少なくとも２つ、例えば２つ、３つなどを意味する。

【0041】

本明細書において、用語「抗体」は、抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。２本の軽い分子量の軽鎖及び２本の重い分子量の重鎖を含み、重鎖（Ｈ鎖）及び軽鎖（Ｌ鎖）は、ジスルフィド結合で接続されて１つのテトラペプチド鎖分子を形成している。ここで、ペプチド鎖のアミノ末端（Ｎ末端）のアミノ酸配列は変化が非常に大きく、可変領域（Ｖ領域）と呼ばれ、カルボキシ末端（Ｃ末端）が比較的安定的であり、変化が非常に小さく、定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。Ｌ鎖及びＨ鎖のＶ領域は、それぞれＶＬ及びＶＨと呼ばれ、Ｌ鎖のＣ領域は、ＣＬであり、Ｈ鎖のＣ領域は、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含む。

【0042】

天然ＩＬ－１０分子は、二量体構造（２本の天然ＩＬ－１０単量体を含む）であり、天然ＩＬ－１０分子とＩＬ－１０受容体（ＩＬ－１０Ｒ）との結合方式を図１－Ａに示し、ＩＬ－１０単量体のＩＬ－１０Ｒαに対する活性は、天然ＩＬ－１０二量体よりも１０倍弱く（具体的な実験データ参照文献：Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０００ Ｍａｙ ５；２７５（１８）：１３５５２－７．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．２７５．１８．１３５５２．）、且つＩＬ－１０Ｒβとのさらなる結合をほとんど媒介できず、したがって下流シグナルを活性化して生物学的機能的反応を引き起こすことが非常に困難であり、ＩＬ－１０単量体とＩＬ－１０受容体との結合方式を図１－Ｂに示す。

【0043】

したがって、本発明は、ＩＬ－１０単量体を前記抗体分子の異なる部位（対称又は非対称構造であってもよい）に接続して前記融合タンパク質（ＩＬ－１０単量体融合タンパク質）を構築し、前記抗体自体の構造の立体障害によってＩＬ－１０単量体が隔離され、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質が遊離状態にある場合、ＩＬ－１０単量体がＩＬ－１０Ｒαに結合しても機能的反応を引き起こすことができず、抗体側が標的細胞に結合して初めて、凝集効果によって、隣接するＩＬ－１０単量体－ＩＬ－１０Ｒα複合体を集め、さらにＩＬ－１０Ｒβに結合して複合体を形成して下流シグナルを生成し、生物学的機能を誘発し、具体的な結合方式を図２に示し、このように薬物分子が標的部位に到達しない前にＩＬ－１０分子が前記抗体の標的性を妨害することを回避することができ、臨床的副作用を生じず、且つＩＬ－１０単量体が生物学的機能を誘発することが非常に困難であるため、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質は天然二量体ＩＬ－１０分子又はその抗体融合タンパク質の投与量の制限を生じず、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質の投与量を顕著に向上させる。同時に、異なる抗体の臨床使用量には差があるため、ＩＬ－１０分子の使用量が低い場合、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質中の抗体標的の選択を深刻に制限するため、本発明で得られた前記融合タンパク質は、融合した抗体側の機能発揮にさらに広い空間を提供し、それによって前記ＩＬ－１０単量体融合タンパク質はより多くの抗体分子と組み合わせて用いることができる。

【0044】

いくつかの実施形態において、本発明は、融合タンパク質を提案し、抗体と、ＩＬ－１０単量体と、を含み、ここで、前記抗体は、２本の同一の軽鎖と、２本の同一の重鎖と、を含み、１本のＩＬ－１０単量体は、抗体重鎖又は軽鎖に接続されており、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、抗体重鎖のＣ末端に接続されていない。天然ＩＬ－１０分子は、二量体形態であり、本発明のいくつかの具体的な実施例による融合タンパク質は、抗体が標的細胞に結合する前にＩＬ－１０分子が単量体形態を呈し、その受容体に結合できず、抗体分子と標的細胞との結合を妨害せず、抗体が標的細胞に結合した後、大量のＩＬ－１０単量体分子が凝集することで、互いに近接した２つのＩＬ－１０単量体が二量体として機能し、ＩＬ－１０受容体に結合し、それによって正常な生物学的反応を引き起こし、融合タンパク質の標的性及び安全性を顕著に向上させ、薬効を十分に発揮させる。

【0045】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、各抗体軽鎖は、ＶＬ領域と、ＣＬ領域と、を含み、各抗体重鎖は、ＶＨ領域と、ＣＨ１領域と、ＣＨ２領域と、ＣＨ３領域と、を含み、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、抗体軽鎖Ｃ末端に連結されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、抗体軽鎖Ｎ末端に連結されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、軽鎖ＶＬ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、軽鎖ＣＬ領域のＮ末端に連結されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、抗体重鎖のＮ末端に連結されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、重鎖ＶＨ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、重鎖ＣＨ１領域のＮ末端に連結されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、重鎖ＣＨ２領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、重鎖ＣＨ３領域のＮ末端に連結されている。

【0046】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記ＩＬ－１０単量体は、天然ＩＬ－１０単量体を含み、前記天然ＩＬ－１０単量体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるアミノ酸配列を有する。

【0047】

【化7】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記ＩＬ－１０単量体は、修飾された天然ＩＬ－１０単量体を含み、前記修飾は、（ｉ）天然ＩＬ－１０単量体のＮ末端の最初の２つのアミノ酸を除去すること、及び（ｉｉ）１１６位と１１７位のアミノ酸の間に第１接続ペプチドを挿入し、前記第１接続ペプチドが可撓性接続ペプチドであること、のうちの少なくとも１つを含む。

【0048】

天然ＩＬ－１０単量体のＮ末端の最初の２つのアミノ酸を除去した後、ＩＬ－１０単量体の安定性が向上すると同時に、ＩＬ－１０単量体の１１６位と１１７位のアミノ酸の間に第１接続ペプチドを挿入した後、前記融合タンパク質中のＩＬ－１０単量体分子が閉ループ単量体分子となり（天然ＩＬ１０二量体の２本のＩＬ１０鎖が互いに絡み合って形成され、ｌｉｎｋｅｒを挿入することにより改造すると、ＩＬ１０単量体は独立してドメイン、即ち閉ループ単量体分子を形成することができる）、同一の融合タンパク質中の２つのＩＬ－１０単量体は相互接続などの妨害を起こすことがない。

【0049】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記第１接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列を有する。
ＧＧＧＳＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）
本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記ＩＬ－１０単量体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有する。

【化8】

【0050】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体と抗体重鎖又は軽鎖とは、第２接続ペプチド又は／及び第３接続ペプチドによって接続されている。第２接続ペプチド又は／及び第３接続ペプチドを利用して前記ＩＬ１０単量体と前記抗体重鎖又は軽鎖とを連結した後、前記融合タンパク質中の抗体部分が対応する標的細胞に結合した後、互いに近接した２つの融合タンパク質のＩＬ－１０単量体が二量体をより形成しやすく機能し、ＩＬ－１０受容体に結合する。

【0051】

本発明の実施例によれば、前記第２接続ペプチド又は／及び第３接続ペプチドは、特に限定されず、可撓性接続ペプチド又は剛性接続ペプチドのいずれであってもよい。

【0052】

本発明の実施例によれば、前記第２接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有し、前記第３接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を有する。

【0053】

【化9】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体と前記抗体の重鎖末端又は軽鎖末端とは、前記第２接続ペプチドによって接続されている。

【0054】

本発明の実施例によれば、前記第２接続ペプチドのＮ末端は、前記抗体軽鎖のＣ末端に連結されており、前記第２接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は前記第２接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第２接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体軽鎖のＮ末端に連結されており、又は前記第２接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第２接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体重鎖のＮ末端に連結されている。

【0055】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体と前記抗体の重鎖末端又は軽鎖末端とは、前記第３接続ペプチドによって接続されており、
本発明の実施例によれば、前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記抗体軽鎖のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体軽鎖のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体重鎖のＮ末端に連結されている。

【0056】

本発明の実施例によれば、前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記軽鎖ＶＬ領域のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記軽鎖ＣＬ領域のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記重鎖ＶＨ領域のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記重鎖ＣＨ１領域のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記重鎖ＣＨ２領域のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記重鎖ＣＨ３領域のＮ末端に連結されている。

【0057】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の軽鎖のＶＬ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の軽鎖ＣＬ領域のＮ末端に接続されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＶＨ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＣＨ１領域のＮ末端に連結されており、又は前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＣＨ２領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＣＨ３領域のＮ末端に連結されている。

【0058】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記抗体は、免疫細胞系抗体及び腫瘍細胞系抗体からなる群より選ばれる。

【0059】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記抗体は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗－Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＣＲ８抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＳＭＡ４Ｄ抗体、抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ４７抗体又は抗ＴＮＦα抗体である。

【0060】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載のアミノ酸配列を有し、又は前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列を有し、又は前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有し、又は前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有し、又は前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列を有し、又は前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有する。

【0061】

【化10】

【化11】

【化12】

いくつかの実施形態において、本発明は、分離された核酸を提案し、前記核酸は、第１態様に記載の融合タンパク質をコードする。本発明のいくつかの具体的な実施形態による核酸によってコードされる融合タンパク質は、抗体部分が標的細胞に結合する前にＩＬ－１０分子が単量体形態を呈し、その受容体に結合できず、抗体分子と標的細胞との結合を妨害せず、抗体が標的細胞に結合した後、大量のＩＬ－１０単量体分子が凝集することで、互いに近接した２つのＩＬ－１０単量体が二量体として機能し、ＩＬ－１０受容体に結合し、それによって正常な生物学的反応を引き起こし、且つＩＬ－１０単量体が生物学的機能を誘発することが非常に困難であるため、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質は天然二量体ＩＬ－１０分子又はその抗体融合タンパク質の投与量の制限を生じず、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質の投与量を顕著に向上させる。前記融合タンパク質は、より多くの抗体分子と組み合わせて用いることができ、融合タンパク質の標的性及び安全性を顕著に向上させ、薬効を十分に発揮させ、且つ種々の腫瘍又は炎症性疾患を治療又は予防することができる。

【0062】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記核酸分子は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。

【0063】

いくつかの実施形態において、本発明は、第２態様に記載の核酸を含む発現ベクターを提案する。上記核酸分子をベクターに接続する場合、核酸分子の翻訳や発現などを制御することができる限り、核酸分子をベクター上の制御要素に直接的又は間接的に連結してもよい。もちろん、これらの制御要素は、ベクター自体に直接由来してもよく、外因性であってもよく、即ちベクター自体に直接由来するものではない。もちろん、核酸分子は、制御要素と作動可能に接続されていればよい。本明細書において「作動可能に接続される」とは、外来遺伝子の転写及び翻訳を調節することが期待される機能をベクター内の制御要素、例えば転写制御配列及び翻訳制御配列などが発揮できるように、外来遺伝子をベクターに接続することを意味する。本発明のいくつかの具体的な実施形態による発現ベクターは、適切な受容体細胞に導入された後、調節系の介在下で、前述の融合タンパク質の発現を効果的に達成することができ、得られた融合タンパク質は、抗体部分が標的細胞に結合する前にＩＬ－１０分子が単量体形態を呈し、その受容体に結合できず、抗体分子と標的細胞との結合を妨害せず、抗体が標的細胞に結合した後、大量のＩＬ－１０単量体分子が凝集することで、互いに近接した２つのＩＬ－１０単量体が二量体として機能し、ＩＬ－１０受容体に結合し、それによって正常な生物学的反応を引き起こし、且つＩＬ－１０単量体が生物学的機能を誘発することが非常に困難であるため、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質は天然二量体ＩＬ－１０分子又はその抗体融合タンパク質の投与量の制限を生じず、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質の投与量を顕著に向上させる。前記融合タンパク質は、より多くの抗体分子と組み合わせて用いることができ、融合タンパク質の標的性及び安全性を顕著に向上させ、薬効を十分に発揮させ、且つ種々の腫瘍又は炎症性疾患を治療又は予防することができる。

【0064】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記発現ベクターは、真核発現ベクターである。

【0065】

いくつかの実施形態において、本発明は、第２態様に記載の核酸、第３態様に記載の発現ベクターを担持するか又は第１態様に記載の融合タンパク質を発現する組換え細胞を提案する。本発明の具体的な実施例による組換え細胞は、前述の融合タンパク質の発現及び大量取得に用いることができ、得られた融合タンパク質は、抗体部分が標的細胞に結合する前にＩＬ－１０分子が単量体形態を呈し、その受容体に結合できず、抗体分子と標的細胞との結合を妨害せず、抗体が標的細胞に結合した後、大量のＩＬ－１０単量体分子が凝集することで、互いに近接した２つのＩＬ－１０単量体が二量体として機能し、ＩＬ－１０受容体に結合し、それによって正常な生物学的反応を引き起こし、且つＩＬ－１０単量体が生物学的機能を誘発することが非常に困難であるため、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質は天然二量体ＩＬ－１０分子又はその抗体融合タンパク質の投与量の制限を生じず、ＩＬ－１０単量体融合タンパク質の投与量を顕著に向上させる。前記融合タンパク質は、より多くの抗体分子と組み合わせて用いることができ、融合タンパク質の標的性及び安全性を顕著に向上させ、薬効を十分に発揮させ、且つ種々の腫瘍又は炎症性疾患を治療又は予防することができる。

【0066】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記組換え細胞は、哺乳動物細胞であり、哺乳動物は、例えば、ヒト、サル、ウサギ、イヌ、ウシなどであり、哺乳動物細胞は、例えば、ヒトＨＥＫ－２９３Ｆ細胞又はＣＨＯ－Ｋ１細胞である。

【0067】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記組換え細胞は、動物生殖細胞、受精卵又は胚幹細胞を含まない。

【0068】

いくつかの実施形態において、本発明は、腫瘍又は炎症性疾患の治療又は予防に用いられる医薬の製造における前述の融合タンパク質、核酸、発現ベクター又は組換え細胞の使用を提案する。本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記医薬は、腫瘍及び炎症性疾患の治療又は緩和に有効であり、且つ安全性が比較的高い。

【0069】

いくつかの実施形態において、本発明は、前述の融合タンパク質、核酸、発現ベクター又は組換え細胞を含む医薬組成物を提案する。本発明のいくつかの具体的な実施形態による医薬組成物は、前記医薬組成物に含まれる前記抗体が結合できる標的細胞に正確に結合でき、前記抗体が標的細胞に結合する前に前記医薬組成物におけるＩＬ－１０単量体分子とＩＬ－１０受容体との結合活性が比較的低く、したがって、前記ＩＬ－１０単量体は前記医薬組成物に含まれる前記抗体の標的性を妨害せず、且つ前記医薬組成物に含まれる前記抗体が標的細胞に結合した後に薬効を十分に発揮し、腫瘍及び炎症性疾患の治療又は緩和に有効であり、且つ比較的高い安全性を有する。

【0070】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記医薬組成物は、腫瘍又は炎症性疾患の治療又は予防に用いられる。

【0071】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、本発明にて提供される融合タンパク質は、対象への投与に適した医薬組成物に組み込むことができる。通常、これらの医薬組成物は、本発明にて提供される融合タンパク質を含む。

【0072】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、前記医薬組成物は、特定の目的剤形に適した任意の溶媒、固体賦形剤、希釈剤、結合剤、崩壊剤又は他の液体賦形剤、分散剤、矯味剤又は懸濁剤、界面活性剤、等張化剤、増粘剤、乳化剤、保存剤、固体結合剤、流動促進剤又は滑沢剤などを含む薬学的に許容されるベクターをさらに含む。本発明の融合タンパク質と不適合な任意の従来のアジュバントの範囲、例えば、あらゆる有害な生物学的効果を生じるか、又は薬学的に許容される組成物の任意の他の成分と有害な方式で相互作用を生じる範囲を除き、それらの使用も本発明の対象とする範囲である。

【0073】

例えば、本発明の融合タンパク質は、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）に適した医薬組成物に組み込むことができる。これらの医薬組成物は、様々な形態に製造されてもよい。例えば、液体、半固体、及び固体の剤形などが挙げられ、液体溶液（例えば、注射溶液及び注入溶液）、分散剤又は懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末、リポソーム、及び坐剤を含むが、これらに限定されない。前記融合タンパク質は、静脈内注射又は筋肉内又は皮下注射によって投与されてもよい。

【0074】

本明細書で用いられる「治療」及び「予防」という用語、ならびに本明細書に由来する用語は、必ずしも１００％又は完全な治療又は予防を暗示しない。むしろ、当業者が潜在的利益又は治療効果を有すると考える様々な程度の治療又は予防が存在する。さらに、本発明にて提供される治療又は予防は、がんの１つ又は複数の病気又は症状の治療又は予防などの治療又は予防中の疾患を含むことができる。さらに、本明細書の目的のために、「予防」は、疾患又はその症状又は病気の発症の遅延を包含することができる。

【0075】

本発明のいくつかの具体的な実施形態によれば、本発明は、対象における腫瘍又は炎症性疾患に関連する疾患、病症又は状況を診断、治療、予防又は軽減する方法であって、上記対象に、治療有効量の前記融合タンパク質及び／又は前記医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0076】

以下、具体的な実施例を参照して本発明を説明し、なお、これらの実施例は単に説明的なものであり、本発明を何ら制限するものではない。

【0077】

実施例における具体的な技術や条件が明記されていない場合、当該技術分野における文献に記載の技術や条件にしたがって、あるいは、製品仕様にしたがって、行われる。使用する試薬や機器は、メーカーが明記されていない場合、いずれも市販で入手可能な通常のものである。
（実施例１）融合タンパク質の構築
本実施例は、ＩＬ－１０単量体を抗体分子（本実施例は抗ＰＤ－１抗体を例に）の異なる位置に挿入して融合タンパク質を得、ここで、ＩＬ－１０単量体分子の構築の具体的な実験操作は、主に「分子クローン実験ガイドライン」を参照する。天然ＩＬ－１０単量体分子配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示し、天然ＩＬ－１０単量体分子配列の１１６Ｎ、１１７Ｋの２つの部位の間にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列のペプチド断片（即ち、第１接続ペプチド、ｌｉｎｋｅｒ１）を挿入し、同時に天然ＩＬ－１０単量体のＮ末端の最初の２つのアミノ酸を除去し、それによって本発明の実施例のＩＬ－１０単量体を形成し、その配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示し、前記抗体重鎖をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示し、抗体軽鎖をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示す。

【0078】

【化13】

本実施例は、合計７種類の融合タンパク質を構築し、融合タンパク質の具体的な構造を図３に示し（図にＩＬ－１０単量体の挿入位置を示す）、前記融合タンパク質におけるＩＬ－１０単量体と抗体分子との接続方式を以下のように説明した。

【0079】

Ｒ０９８７：ＩＬ－１０単量体を抗体軽鎖のＶＬ、ＣＬの間（位置１）に挿入し、且つｌｉｎｋｅｒ２（ＧＳＧＳＧＳＧＳ）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｂに示し、
Ｒ０９８８：ＩＬ－１０単量体を抗体重鎖のＶＨ、ＣＨ１の間（位置２）に挿入し、且つｌｉｎｋｅｒ２（ＧＳＧＳＧＳＧＳ）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｃに示し、
Ｒ０９８９：ＩＬ－１０単量体を抗体重鎖のＣＨ２、ＣＨ３の間（位置３）に挿入し、且つｌｉｎｋｅｒ２（ＧＳＧＳＧＳＧＳ）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｄに示し、
Ｒ０９９０：ＩＬ－１０単量体をｌｉｎｋｅｒによって抗体軽鎖のＮ末端（位置４）に接続し、且つｌｉｎｋｅｒ３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｅに示し、
Ｒ０９９１：ＩＬ－１０単量体をｌｉｎｋｅｒによって抗体軽鎖のＣ末端（位置５）に接続し、且つｌｉｎｋｅｒ３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｆに示し、
Ｒ０９９２：ＩＬ－１０単量体をｌｉｎｋｅｒによって抗体重鎖のＮ末端（位置６）に接続し、且つｌｉｎｋｅｒ３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｇに示し、
Ｒ０９９３：ＩＬ－１０単量体をｌｉｎｋｅｒによって抗体重鎖のＣ末端（位置７）に接続してｌｉｎｋｅｒ３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｈに示し、
本発明の実施例３～５における対照分子（Ｒ０４２８、Ｒ０５９４、Ｒ０８６２、Ｒ０６７６、Ｒ０５７９、Ｒ１０４９）の構造図を図３Ｉに示す。

【0080】

前記第２接続ペプチド（ｌｉｎｋｅｒ２）及び第３接続ペプチド（ｌｉｎｋｅｒ３）は、可撓性又は剛性接続ペプチドであり、ここで、前記第２接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有し、前記第３接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を有し、
上記融合タンパク質の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を以下の表１に示し、ここで、太字斜体でタグ付けされた配列ＧＳＧＳＧＳＧＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）は、第２接続ペプチド（ｌｉｎｋｅｒ２）のアミノ酸配列であり、太字のみでタグ付けされた配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）は、第３接続ペプチド（ｌｉｎｋｅｒ３）のアミノ酸配列であり、下線のみでタグ付けされた配列ＧＱＧＴＱＳＥＮＳＣＴＨＦＰＧＮＬＰＮＭＬＲＤＬＲＤＡＦＳＲＶＫＴＦＦＱＭＫＤＱＬＤＮＬＬＬＫＥＳＬＬＥＤＦＫＧＹＬＧＣＱＡＬＳＥＭＩＱＦＹＬＥＥＶＭＰＱＡＥＮＱＤＰＤＩＫＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫＴＬＲＬＲＬＲＲＣＨＲＦＬＰＣＥＮＧＧＧＳＧＧＫＳＫＡＶＥＱＶＫＮＡＦＮＫＬＱＥＫＧＩＹＫＡＭＳＥＦＤＩＦＩＮＹＩＥＡＹＭＴＭＫＩＲＮ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）は、改造後のＩＬ－１０単量体のアミノ酸配列である。

【0081】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【表1-6】

【表1-7】

【表1-8】

【0082】

（実施例２）融合タンパク質の製造
目的遺伝子（実施例１における融合タンパク質をコードする）を含むプラスミドを、常法により構築、製造した。目的遺伝子を含むプラスミドをトランスフェクション試薬ＰＥＩとカチオン複合体を形成した後、宿主細胞Ｅｘｐｉ２９３に導入し、プラスミドが細胞内にある間に、プラスミド上の外来遺伝子が細胞内で転写翻訳を起こし、それによって前記融合タンパク質を得、具体的な実験操作は以下のとおりである。

【0083】

Ｅｘｐｉ２９３を３７℃、８％二酸化炭素、１３０ｒｐｍ条件下で培養し、且つトランスフェクション前に細胞計数により、２Ｅ６の細胞を１ＬＬ振盪フラスコに接種し、培養系は約３００ｍＬであった。トランスフェクション複合体を調製してトランスフェクションを準備する：まず７５０μｇの目的プラスミドを１５ｍＬＯｐｔｉ－ＭＥＭ試薬を含む５０ｍＬ遠心分離管に加え、軽く均一に混合し、Ａ管と標識し、１．５ｍｇのトランスフェクション試薬ＰＥＩを１５ｍＬＯｐｔｉ－ＭＥＭ試薬を含む５０ｍＬ遠心分離管に加え、軽く均一に混合した後、室温で５ｍｉｎインキュベートし、Ｂ管と標識し、Ｂ管ＰＥＩ希釈液をＡ管ＤＮＡ希釈液に滴下し、軽く均一に混合した後、室温で１５ｍｉｎインキュベートし、インキュベートが終了した後、ＰＥＩ－目的プラスミド複合体をＥｘｐｉ２９３細胞に加え、３７℃の振盪床に置いて培養を継続し、Ｄ５－Ｄ１０まで培養して、試料を回収した。

【0084】

トランジェント細胞発現液を９０００ｒｐｍ／２０ｍｉｎで遠心分離し、上清を収集し、さらに０．２２μｍフィルター膜で除菌濾過した。精製はＰｒｏＡアフィニティークロマトグラフィーを用いた。過程は、ＡＫＴＡ ａｖａｎｔ １５０クロマトグラフィーデバイスを用いて、少なくとも５ＣＶ平衡化緩衝液（１０ｍＭ ＰＢＳ）でクロマトグラフィーカラムを平衡化し（例えばＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ ＬＸ，ＧＥ）、試料をクロマトグラフィーカラムにロードし、目的タンパク質をクロマトグラフィーカラムに吸着させ、他の不純物を破過分離させた。ロード完了後に少なくとも５ＣＶ平衡化緩衝液（１０ｍＭ ＰＢＳ）でクロマトグラフィーカラムを再度洗浄し、その後、溶出緩衝液（２０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ＝３．４）を用いて目的タンパク質を溶出し、収集管に予め中和緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ＝８．０）を加え、中和緩衝液の加え体積は溶出試料の予測含有量に基づいて決定され、一般的に溶出体積の１０％分を加える。

【0085】

ＩＬ－１０単量体融合タンパク質発現データを表２に示し、Ｒ０９８７の発現量が９７．７３１ｍｇ／ｍＬであったことを除いて、残りの融合タンパク質のトランジェント発現量はいずれも１００ｍｇ／Ｌよりも大きく、Ｒ０９９０の発現量は１９４．４０９ｍｇ／Ｌまで達した。一段階アフィニティー精製後の試料をＳＥＣ－ＨＰＬＣで検出したところ、目標純度はいずれも８５％以上であり、Ｒ０９８９の純度は９５％超であった。試料をＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出したところ、正確な軽重鎖分布を示し、電気泳動の結果を図４に示した。異なる挿入位置のＩＬ－１０単量体融合タンパク質は、いずれも良好な生産特性を示すと結論付けられる。

【0086】

【表2】

【0087】

（実施例３）融合タンパク質のインビトロ活性
３．１フローサイトメトリー蛍光選別技術（ＦＡＣＳ）による融合タンパク質抗体側、ＩＬ－１０単量体側の結合活性の検出
３％ＢＳＡを含むＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒを用いて全ての融合タンパク質分子、Ｒ０４２８（ＩＬ－１０を含まない陽性対照抗体、その重鎖アミノ酸配列、軽鎖アミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、１４に示す）又はＲ０５９４（ＩＬ－１０－Ｆｃ融合タンパク質対照、そのアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示し、ここでＩＬ－１０が天然ＩＬ－１０の最初の２つのアミノ酸を除去し、第１接続ペプチドを挿入しなかった）タンパク質分子を初期濃度４００ｎＭに希釈し、体積１８０μｌ、３倍勾配希釈（６０μｌ試料＋１２０μｌ希釈Ｂｕｆｆｅｒ）であり、合計１１の濃度勾配点を得た。ＣＨＯ－ｍＰＤ１又はＣＨＯ－ｈＩＬ－１０Ｒ細胞を２５０ｇ条件下で５ｍｉｎ遠心分離した後に上清を廃棄し、３％ＢＳＡのＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒを用いて細胞密度を２Ｅ＋０６に調整し、１００μＬ／管で９６ウェルＶ型プレートに均等に分配し、上記希釈した融合タンパク質分子を細胞に加え、１００μＬ／ウェルで、２～８℃で０．５ｈインキュベートし、９６ウェルプレートを取り出し、２５０ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を注意深く除去した後、３％ＢＳＡのＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ２００μｌ／ウェルを加え、再度２５０ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を注意深く除去し、３％ＢＳＡのＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒを用いてＰＥ蛍光二次抗体（１：５００希釈）を調製し、１００μｌ／ウェルの体積で対応する９６ウェルプレートに添加し、細胞を再懸濁し、２～８℃で３０ｍｉｎインキュベートし、９６ウェルプレートを取り出し、２５０ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を注意深く除去した後、３％ＢＳＡのＰＢＳ ｂｕｆｆｅｒ２００μｌ／ウェルを加え、再度２５０ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を注意深く除去し、１ｘＰＢＳを用いて１００μＬ／ウェルの体積で再懸濁し、再懸濁後にＦＡＣＳ検出を行った。

【0088】

Ｒ０４２８の重鎖配列：

【化14】

Ｒ０４２８の軽鎖配列：

【化15】

Ｒ０５９４が２つの同一のペプチド鎖を含み、ここで１本の鎖のアミノ酸配列：

【化16】

抗体側の結合活性の検出結果を図５に示し、融合タンパク質Ｒ０９８７、Ｒ０９８８、Ｒ０９８９、Ｒ０９９１抗体側の活性が比較的強く、Ｒ０９９０が最も弱い。ＩＬ－１０単量体が軽鎖ＶＬ、ＣＬの間、又は重鎖ＶＨ、ＣＨ１の間、重鎖ＣＨ２、ＣＨ３の間、軽鎖のＣ末端に挿入された場合、抗体の結合活性に影響を与えないことが示された。

【0089】

ＩＬ－１０単量体側のＩＬ－１０Ｒαに対する結合活性の検出結果を図６に示し、ここで、融合タンパク質Ｒ０９８９、Ｒ０９９３のＩＬ－１０単量体側のＩＬ－１０Ｒαに対する結合活性は明らかに弱く、ＩＬ－１０単量体の挿入位置がいずれも抗体のＣ末端部位に近いことに関連する可能性があり、残りの融合タンパク質のＩＬ－１０Ｒαに対する結合活性は比較的近く、陽性対照分子Ｒ０５９４と一致する。抗体ドメインに挿入されたＩＬ－１０単量体は、組換え発現を経た後に依然として所望の空間構造を形成することができ、且つＩＬ－１０Ｒαに正常に結合することが示された。

【0090】

３．２レポーター遺伝子法によるＩＬ－１０単量体融合タンパク質のＩＬ－１０単量体側の活性の検出。

【0091】

１６４０＋１０％ＦＢＳを用いて全ての融合タンパク質分子及び対照タンパク質分子Ｒ０５７９（ＩＬ－１０－陽性抗体融合タンパク質対照、その重鎖アミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示し、その軽鎖アミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４に示し、ここで前記ＩＬ－１０が天然ＩＬ－１０の最初の２つのアミノ酸を除去し、第１接続ペプチドを挿入しなかった）を初期濃度２０μｇ／ｍＬに希釈し、体積４５０μｌ、３倍勾配希釈（１５０μｌ＋３００μｌ）であり、合計９つの濃度を得た。細胞準備：培養中のＨＥＫ２９３－ｈＩＬ－１０－Ｒｅｐｏｒｔ ｇｅｎｅ ｃｅｌｌ（Ｃａｔ＃ＧＭ－Ｃ０７９２７，Ｇｅｎｏｍｅｄｉｔｅｃｈ）を取り出して顕微鏡で観察し、細胞が正常に壁に接着し、粒子が透明であり、且つ密度が適切な細胞は実験に用いられるエフェクター細胞とすることができ、上記細胞をＴＥで消化し、消化を終了した後に３００ｇ条件下で４ｍｉｎ遠心分離した後に上清を除去し、１％ＦＢＳ－ＰＢＳで再懸濁した後にさらに１回洗浄し、上清を廃棄し、最終的に培地を用いて細胞を再懸濁し、細胞を計数した後に細胞密度を５×１０^５個／ｍＬに調整した。上記実験設計にしたがってまず希釈した薬物を５０μＬ／ウェルの体積で対応するウェルプレートに添加し、さらに上記再懸濁後の細胞も５０μＬ／ウェルの体積で加え、Ｍｅｄｉｕｍ ｏｎｌｙのウェルに１００μＬの培地を追加し、Ｃｅｌｌ ｏｎｌｙのウェルにも５０μＬの培地を追加し、最終的に全てのウェルの最終体積を１００μＬとした。９６ウェルプレートをインキュベータで１６ｈ培養し続けた。Ｂｒｉｇｈｔ－ＬｕｍｉＴＭホタルルシフェラーゼ検出試薬を予め解凍し、室温に平衡化した。細胞を１６ｈ培養した後に細胞培養プレートを取り出して室温に１０ｍｉｎ（３０ｍｉｎを超えないことが好ましい）平衡化した。各ウェルに１００μＬＢｒｉｇｈｔ－ＬｕｍｉＴＭホタルルシフェラーゼ検出試薬を加え、室温で５～１０ｍｉｎインキュベートした。多機能性マイクロプレートリーダーにおける化学発光パターンを用いて信号を検出した。

【0092】

検出結果を図７に示し、レポーター遺伝子の結果はＢｉｎｄｉｎｇ結果と類似しており、融合タンパク質Ｒ０９８９、Ｒ０９９３のＩＬ－１０単量体側の結合活性は比較的低いが、陽性対照Ｒ０５７９の活性は今回検出された融合タンパク質よりも遥かに強い。レポーター遺伝子法の検出結果により、改造後のＩＬ－１０単量体結合活性が二量体形態のＩＬ－１０分子よりも低いことを示している。
（実施例４）融合タンパク質のＭＣ３８腫瘍モデルマウスに対する影響
発明者らは実施例３の検出に基づいてマウス体内実験を行い、具体的な実験操作は以下のとおりである。

【0093】

細胞培養：ＭＣ３８腫瘍細胞（由来：国家実験細胞資源共有プラットフォーム、資源番号：３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ０００５２３）を、１０％ＦＢＳ（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、供給元：Ｇｉｂｃｏ、商品番号：１００９１１４８）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（供給元：Ｇｉｂｃｏ、商品番号：１１９６５０８４）培地で培養した。インキュベータの温度を３７℃に制御し、５％二酸化炭素を補充した。腫瘍細胞を週２回継代し、パンクレアチン－ＥＤＴＡで消化した。

【0094】

接種：対数増殖期のＭＣ３８腫瘍細胞を収集し、消化後に２５０ｇ条件下で１０分間遠心分離した。氷冷したＰＢＳで２回洗浄した後に細胞計数を行い、細胞濃度が３×１０^６個／ｍＬになるようにＰＢＳを調節した。マウスの右側腹部に予め毛を剃って皮を準備し、各マウスに０．１ｍＬの細胞懸濁液を接種し、接種量は即ちマウス当たり３×１０^５個の腫瘍細胞であった。

【0095】

群分け：接種後６～８日目に、全ての動物の腫瘍を測定し且つ秤量した。治療有効性に対する初期腫瘍体積の影響を回避するために、マウスを腫瘍体積に基づいてランダムに群に割り当て、全ての群の平均腫瘍体積が同程度であることを確保し、治療効果がベースラインで比較可能性を有する。

【0096】

観察：接種後、毎日動物の発病率と死亡率を調べた。治療開始後、融合タンパク質Ｒ０９８７、Ｒ０９８８、Ｒ０９８９、Ｒ０９９１、Ｒ０９９２、Ｒ０９９３及びＲ０８６２（即ちＩｓｏｔｙｐｅ、陰性対照抗体、その重鎖アミノ酸配列、軽鎖アミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７に示す）、Ｒ０４２８、Ｒ０６７６（ＩＬ－１０－Ｆｃ融合タンパク質対照、そのアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示し、ここで前記ＩＬ－１０が天然ＩＬ－１０の最初の２つのアミノ酸を除去し、第１接続ペプチドを挿入しなかった））、Ｒ０５７９タンパク質分子をそれぞれ０．６１、０．６１、０．６１、０．６１、０．６１、０．６１、０．５、０．５、０．３、０．６ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに腹腔内注射を行い、Ｑ３Ｄ×３（３日に１回投与し、合計３回投与する）であり、腫瘍体積を週３回測定し、動物腫瘍の増殖及び治療の正常行動への影響、例えば行動能力、食物と水の消費、体重の増加／損失、目／毛髪／皮膚などへの影響を検査し且つ記録した。

【0097】

Ｒ０８６２の重鎖配列：

【化17】

Ｒ０８６２の軽鎖配列：

【化18】

Ｒ０６７６が２つの同一のペプチド鎖を含み、ここで１本の鎖のアミノ酸配列：

【化19】

Ｒ０５７９の重鎖配列：
QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSLTSYNVHWVRQPPGKGLEWMGGMRYNEDTSYNSALKSRLSISRDTSKNQVFLKMNSLQTDDTGTYYCTRDAVYGGYGGWFAYWGQGTLVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSQTVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVAISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTKPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGAGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGSPGQGTQSENSCTHFPGNLPNMLRDLRDAFSRVKTFFQMKDQLDNLLLKESLLEDFKGYLGCQALSEMIQFYLEEVMPQAENQDPDIKAHVNSLGENLKTLRLRLRRCHRFLPCENKSKAVEQVKNAFNKLQEKGIYKAMSEFDIFINYIEAYMTMKIRN (SEQ ID NO:23).
Ｒ０５７９の軽鎖配列：

【化20】

【0098】

実験終点（Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ）：実験の主な終点は腫瘍増殖が遅延されるか否か又はマウスが治癒されるか否かである。各群の腫瘍体積に基づいてＴＧＩ（Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を計算した。計算方法：２群の間の比較は独立したサンプルＴで検査することができる。３群以上の比較はＯｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡを適用した。Ｆ値に有意差があることを示していれば、複数群間での事後解析が可能となる。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで処理し、ｐ＜０．０５が統計的有意差を有することを示す。腫瘍体積Ｖ＝０．５ａ×ｂ２であり、ａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長さ、短径である。腫瘍増殖抑制ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００であり、Ｔｉはｉ日目の治療群の平均腫瘍体積、Ｔ０は治療開始時の治療群の平均腫瘍体積、Ｖｉはｉ日目の溶媒対照群の平均腫瘍体積、Ｖ０は治療開始時の溶媒対照群Ｓの平均腫瘍体積である。ＴＧＩで腫瘍増殖抑制に対する薬物の効果を示す。

【0099】

実験結果を図８に示し、融合タンパク質Ｒ０９８７、Ｒ０９９１、Ｒ０９９３で治療した後のマウス体内腫瘍の増殖速度が低下し、腫瘍体積が小さく、モノクローナル抗体又はＩＬ－１０融合タンパク質に比べ、融合タンパク質Ｒ０９８７、Ｒ０９９１、Ｒ０９９３はより良好な腫瘍抑制効果を有する。
（実施例５）ＣＴ２６腫瘍モデルマウスに対する融合タンパク質の影響
発明者らは実施例４で得られた実験結果に基づいて前記融合タンパク質をさらに検証し、具体的な実験操作は以下のとおりである。

【0100】

細胞培養：ＣＴ２６腫瘍細胞（供給元：中国科学院細胞ライブラリ、商品番号：ＮＡ）を、１０％ＦＢＳ（ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、供給元：Ｇｉｂｃｏ、商品番号：１００９１１４８）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ－１６４０（供給元：Ｇｉｂｃｏ、商品番号：１１８７５０８５）培地で培養した。インキュベータの温度を３７℃に制御し、５％二酸化炭素を補充した。腫瘍細胞を週２回継代し、パンクレアチン－ＥＤＴＡで消化した。

【0101】

接種：対数増殖期の細胞を収集し、消化後に２５０ｇで１０分間遠心分離した。氷冷したＰＢＳで２回洗浄した後に計数を行い、細胞濃度が１×１０^６／ｍＬになるようにＰＢＳを調節した。マウスの右側腹部に予め毛を剃って皮を準備し、各マウスに０．１ｍＬの細胞懸濁液を接種し、接種量は即ちマウス当たり１×１０^５個の腫瘍細胞であった。

【0102】

群分け：接種後６～８日目に、全ての動物の腫瘍を測定し且つ秤量した。治療有効性に対する初期腫瘍体積の影響を回避するために、マウスを腫瘍体積に基づいてランダムに群に割り当て、全ての群の平均腫瘍体積が同程度であることを確保し、治療効果がベースラインで比較可能性を有する。

【0103】

観察：本研究案に係る動物の使用及び介護は、行う前に広東Ｆａｐｏｎ Ｂｉｏｐｈａｒｍａ製薬株式会社動物倫理委員会により審査及び承認された。研究中に、ＳＰＦ動物ルームの標準的な操作手順に基づいて動物を介護及び使用した。接種後、毎日動物の発病率と死亡率を調べた。治療開始後、融合タンパク質Ｒ０９８７、Ｒ０９９１、Ｒ０９９３及びＲ０８６２、Ｒ０５７９、Ｒ０６７６、Ｒ１０４９（抗ＰＤ－１のモノクローナル抗体対照、その重鎖アミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示し、軽鎖アミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示す）タンパク質分子をそれぞれ１０、１０、１０、１０、１０、５、７．９ｍｇ／ｋｇの用量でマウスに腹腔内注射を行い、Ｑ３Ｄ×３（３日に１回投与し、合計３回投与する）であり、腫瘍体積を週２回測定し、動物腫瘍の増殖及び治療の正常行動への影響、例えば行動能力、食物と水の消費、体重の増加／損失、目／毛髪／皮膚などへの影響を検査し且つ記録した。

【0104】

Ｒ１０４９重鎖配列：

【化21】

Ｒ１０４９軽鎖配列：

【化22】

実験終点（Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ）：実験の主な終点は腫瘍増殖が遅延されるか否か又はマウスが治癒されるか否かである。各群の腫瘍体積に基づいてＴＧＩ（Ｔｕｍｏｒ Ｇｒｏｗｔｈ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を計算し、計算方法：２群の間の比較は独立したサンプルＴで検査することができる。３群以上の比較はＯｎｅ－ＷａｙＡＮＯＶＡを適用した。Ｆ値に有意差があることを示していれば、複数群間での事後解析が可能となる。データをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで処理し、ｐ＜０．０５が統計的有意差を有することを示す。腫瘍体積Ｖ＝０．５ａ×ｂ２であり、ａ及びｂはそれぞれ腫瘍の長さ、短径である。腫瘍増殖抑制ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｔｉ－Ｔ０）／（Ｖｉ－Ｖ０）］×１００であり、Ｔｉはｉ日目の治療群の平均腫瘍体積、Ｔ０は治療開始時の治療群の平均腫瘍体積、Ｖｉはｉ日目の溶媒対照群の平均腫瘍体積、Ｖ０は治療開始時の溶媒対照群Ｓの平均腫瘍体積である。ＴＧＩで腫瘍増殖抑制に対する薬物の効果を示す。具体的な実験に基づき、生存曲線も薬効を評価する標準の１つとする。

【0105】

実験結果を図９に示し、融合タンパク質Ｒ０９８７、Ｒ０９９３に対して、融合タンパク質Ｒ０９９１で治療した後のマウス体内腫瘍の増殖速度が顕著に低下し、腫瘍体積が小さく、より良好な腫瘍抑制効果を有する。

【0106】

本明細書の説明において、参照用語「１つの実施例」、「いくつかの実施例」、「例」、「具体例」、又は「いくつかの例」などの説明は当該実施例又は例と結び付けて説明した具体的な特徴、構造、材料又は特性が本発明の少なくとも１つの実施例又は例に含まれることを意味する。本明細書において、上記用語の概略的な記述は必ずしも同一の実施例又は例を対象としない。且つ、説明された具体的な特徴、構造、材料又は特性はいずれか１つ又は複数の実施例又は例において適切な方式で組み合わせることができる。また、互いに矛盾しない場合、当業者は本明細書に記載された異なる実施例又は例、及び異なる実施例又は例の特徴を結び付け、組み合わせてもよい。

【0107】

以上は本発明の実施例を示して説明したが、理解されるように、上記実施例は例示的なものであり、本発明を限定するものと理解できず、当業者は本発明の範囲内で上記実施例に対して変更、修正、置換及び変形を行うことができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図】

【図7】

【図】

【図8】

【図9】

【配列表】

2024540406000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-05-22

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0019】

【化3】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体と前記抗体の重鎖末端又は軽鎖末端とは、前記第２接続ペプチドによって接続されている。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００５３

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0053】

【化9】

本発明の実施例によれば、前記ＩＬ－１０単量体と前記抗体の重鎖末端又は軽鎖末端とは、前記第２接続ペプチドによって接続されている。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００７９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0079】

Ｒ０９８７：ＩＬ－１０単量体を抗体軽鎖のＶＬ、ＣＬの間（位置１）に挿入し、且つｌｉｎｋｅｒ２（ＧＳＧＳＧＳＧＳ）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｂに示し、
Ｒ０９８８：ＩＬ－１０単量体を抗体重鎖のＶＨ、ＣＨ１の間（位置２）に挿入し、且つｌｉｎｋｅｒ２（ＧＳＧＳＧＳＧＳ）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｃに示し、
Ｒ０９８９：ＩＬ－１０単量体を抗体重鎖のＣＨ２、ＣＨ３の間（位置３）に挿入し、且つｌｉｎｋｅｒ２（ＧＳＧＳＧＳＧＳ）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｄに示し、
Ｒ０９９０：ＩＬ－１０単量体をｌｉｎｋｅｒによって抗体軽鎖のＮ末端（位置４）に接続し、且つｌｉｎｋｅｒ３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｅに示し、
Ｒ０９９１：ＩＬ－１０単量体をｌｉｎｋｅｒによって抗体軽鎖のＣ末端（位置５）に接続し、且つｌｉｎｋｅｒ３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｆに示し、
Ｒ０９９２：ＩＬ－１０単量体をｌｉｎｋｅｒによって抗体重鎖のＮ末端（位置６）に接続し、且つｌｉｎｋｅｒ３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｇに示し、
Ｒ０９９３：ＩＬ－１０単量体をｌｉｎｋｅｒによって抗体重鎖のＣ末端（位置７）に接続してｌｉｎｋｅｒ３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）を用いて接続し、得られた融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（重鎖）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（軽鎖）に示されるアミノ酸配列を有し、図３Ｈに示し、
本発明の実施例３～５における対照分子（Ｒ０４２８、Ｒ０５９４、Ｒ０８６２、Ｒ０６７６、Ｒ０５７９、Ｒ１０４９）の構造図を図３Ｉに示す。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９７

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0097】

Ｒ０８６２の重鎖配列：

【化17】

Ｒ０８６２の軽鎖配列：

【化18】

Ｒ０６７６が２つの同一のペプチド鎖を含み、ここで１本の鎖のアミノ酸配列：

【化19】

Ｒ０５７９の重鎖配列：

【化19-2】

Ｒ０５７９の軽鎖配列：

【化20】

【手続補正5】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体と、ＩＬ－１０単量体と、を含み、ここで、前記抗体は、２本の同一の軽鎖と、２本の同一の重鎖と、を含み、１本のＩＬ－１０単量体は、前記抗体の重鎖又は軽鎖に接続されており、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記抗体の重鎖のＣ末端に接続されていない、ことを特徴とする融合タンパク質。

【請求項2】

前記抗体の各軽鎖は、ＶＬ領域と、ＣＬ領域と、を含み、前記抗体の各重鎖は、ＶＨ領域と、ＣＨ１領域と、ＣＨ２領域と、ＣＨ３領域と、を含み、前記抗体の各軽鎖又は各重鎖に１本の前記ＩＬ－１０単量体が接続されており、
任意に、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記抗体の軽鎖Ｃ末端に連結されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記抗体の軽鎖Ｎ末端に連結されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記抗体の軽鎖のＶＬ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記抗体の軽鎖のＣＬ領域のＮ末端に連結されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記抗体の重鎖のＮ末端に連結されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記抗体の重鎖ＶＨ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記抗体の重鎖ＣＨ１領域のＮ末端に連結されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記抗体の重鎖ＣＨ２領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記抗体の重鎖ＣＨ３領域のＮ末端に連結されている、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記ＩＬ－１０単量体は、天然ＩＬ－１０単量体を含む、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記ＩＬ－１０単量体は、修飾された天然ＩＬ－１０単量体を含み、前記修飾は、１１６位と１１７位のアミノ酸の間に第１接続ペプチドを挿入することを含み、前記第１接続ペプチドは、可撓性接続ペプチドであり、
任意に、前記第１接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示されるアミノ酸配列を有し、
任意に、前記ＩＬ－１０単量体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示されるアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記ＩＬ－１０単量体と前記抗体の重鎖又は軽鎖とは、第２接続ペプチド及び／又は第３接続ペプチドによって接続されており、
任意に、前記第２接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示されるアミノ酸配列を有し、前記第３接続ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示されるアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記ＩＬ－１０単量体と前記抗体の重鎖末端又は軽鎖末端とは、前記第２接続ペプチドによって接続されており、任意に、
前記第２接続ペプチドのＮ末端は、前記抗体の軽鎖のＣ末端に連結されており、前記第２接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は
前記第２接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第２接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体の軽鎖のＮ末端に連結されており、又は
前記第２接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第２接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体の重鎖のＮ末端に連結されている、ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

前記ＩＬ－１０単量体と前記抗体の重鎖末端又は軽鎖末端とは、前記第３接続ペプチドによって接続されており、
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記抗体の軽鎖のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体の軽鎖のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記抗体の重鎖のＮ末端に連結されている、ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項8】

前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記軽鎖ＶＬ領域のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記軽鎖ＣＬ領域のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記重鎖ＶＨ領域のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記重鎖ＣＨ１領域のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記重鎖ＣＨ２領域のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端に連結されており、又は
前記第３接続ペプチドのＮ末端は、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端に連結されており、前記第３接続ペプチドのＣ末端は、前記重鎖ＣＨ３領域のＮ末端に連結されている、ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項9】

前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の軽鎖のＶＬ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の軽鎖ＣＬ領域のＮ末端に接続されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＶＨ領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＣＨ１領域のＮ末端に連結されており、又は
前記ＩＬ－１０単量体のＮ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＣＨ２領域のＣ末端に連結されており、前記ＩＬ－１０単量体のＣ末端は、前記第２接続ペプチドによって前記抗体の重鎖ＣＨ３領域のＮ末端に連結されている、ことを特徴とする請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項10】

前記抗体は、免疫細胞系抗体及び腫瘍細胞系抗体からなる群より選ばれ、
任意に、前記抗体は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＣＣＲ８抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ｃｌａｕｄｉｎ１８．２抗体、抗ＣＤ３９抗体、抗ＳＭＡ４Ｄ抗体、抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ４７抗体又は抗ＴＮＦα抗体であり、
任意に、前記抗体は、抗ＰＤ－１抗体である、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項11】

前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に記載のアミノ酸配列を有し、又は
前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に記載のアミノ酸配列を有し、又は
前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有し、又は
前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有し、又は
前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に記載のアミノ酸配列を有し、又は
前記融合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に記載のアミノ酸配列を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項12】

請求項１に記載の融合タンパク質をコードする、ことを特徴とする核酸。

【請求項13】

請求項１２に記載の核酸を含む、ことを特徴とする発現ベクター。

【請求項14】

請求項１２に記載の核酸、請求項１３に記載の発現ベクターを担持するか又は請求項１に記載の融合タンパク質を発現する、ことを特徴とする組換え細胞。

【請求項15】

腫瘍又は炎症性疾患の治療又は予防のための医薬の製造における、請求項１に記載の融合タンパク質、請求項１２に記載の核酸、請求項１３に記載の発現ベクター又は請求項１４に記載の組換え細胞の使用。

【請求項16】

請求項１に記載の融合タンパク質、請求項１２に記載の核酸、請求項１３に記載の発現ベクター又は請求項１４に記載の組換え細胞を含む、ことを特徴とする医薬組成物。

【請求項17】

前記医薬組成物は、腫瘍又は炎症性疾患の治療又は予防に用いられる、ことを特徴とする請求項１６に記載の医薬組成物。

【国際調査報告】