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特表2024-540500強力な適応免疫反応を誘導し且つ母体移行抗体の干渉を克服する組換え口蹄疫Ｏ型ウイルス、及びそれを含む口蹄疫ワクチン組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】強力な適応免疫反応を誘導し且つ母体移行抗体の干渉を克服する組換え口蹄疫Ｏ型ウイルス、及びそれを含む口蹄疫ワクチン組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 15/41 20060101AFI20241024BHJP
A61K 39/135 20060101ALI20241024BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241024BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241024BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20241024BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20241024BHJP
C12N 7/02 20060101ALI20241024BHJP
C07K 14/09 20060101ALI20241024BHJP
C07K 1/14 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241024BHJP
G01N 33/569 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C12N15/41 ZNA
A61K39/135
A61K39/395 S
A61K49/00
A61P31/14
A61P37/04
C12N7/01
C12N7/02
C07K14/09
C07K1/14
C12N15/63 Z
G01N33/569 L
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024529411
(86)(22)【出願日】2022-11-11
(85)【翻訳文提出日】2024-05-16
(86)【国際出願番号】 KR2022017801
(87)【国際公開番号】W WO2023090771
(87)【国際公開日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】10-2021-0158591
(32)【優先日】2021-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0158592
(32)【優先日】2021-11-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520130373
【氏名又は名称】リパブリック オブ コリア（アニマル アンド プラント クオレンティン エージェンシー）
【氏名又は名称原語表記】ＲＥＰＵＢＬＩＣ ＯＦ ＫＯＲＥＡ（ＡＮＩＭＡＬ ＡＮＤ ＰＬＡＮＴ ＱＵＡＲＡＮＴＩＮＥ ＡＧＥＮＣＹ）
(74)【代理人】
【識別番号】100090398
【弁理士】
【氏名又は名称】大渕 美千栄
(74)【代理人】
【識別番号】100090387
【弁理士】
【氏名又は名称】布施 行夫
(72)【発明者】
【氏名】イ ミンジャ
(72)【発明者】
【氏名】キム ヒョンミ
(72)【発明者】
【氏名】シン セヒ
(72)【発明者】
【氏名】キム スミ
(72)【発明者】
【氏名】パク ジョンヒョン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA95X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD14
4B065CA44
4B065CA46
4C085AA03
4C085AA19
4C085BA54
4C085CC08
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4C085KA01
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA00
(57)【要約】
本発明は、組換え口蹄疫ウイルス、前記ウイルスから分離・精製された抗原を含む口蹄疫ワクチン組成物に関するものであり、ワクチン接種初期、強力な細胞性免疫反応の誘導を介して体液性免疫反応を同時に誘導する一方、母体移行抗体（ＭＤＡ、ｍａｔｅｒｎａｌｌｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）の存在時にＢ細胞受容体の刺激を介して母体移行抗体の干渉克服及び能動免疫を可能にしたワクチン組成物と、該組成物を用いた口蹄疫予防又は治療方法を提供することができる。
【選択図】図１ａ
【選択図】図１ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号８の配列を有する組換えプラスミド。
【請求項2】
請求項１に記載の組換えプラスミドから製造された免疫増強組換え口蹄疫Ｏ型ウイルス。
【請求項3】
請求項２に記載の免疫増強組換え口蹄疫ウイルスを精製、分離して得た、免疫増強組換え口蹄疫Ｏ型ウイルス抗原。
【請求項4】
請求項２に記載の免疫増強組換え口蹄疫ウイルス又は請求項３に記載の免疫増強組換え口蹄疫ウイルス抗原を含む口蹄疫ワクチン組成物。
【請求項5】
請求項２に記載の免疫増強組換え口蹄疫ウイルス又は請求項３に記載の免疫増強組換え口蹄疫ウイルス抗原を含む口蹄疫診断キット。
【請求項6】
請求項５に記載の口蹄疫診断キットを用いた口蹄疫診断方法。
【請求項7】
請求項４に記載の口蹄疫ワクチン組成物を用いた口蹄疫予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、強力な適応（細胞性・体液性）免疫反応の誘導によって母体移行抗体の干渉を克服するために、口蹄疫Ｏ型ワクチン株Ｏ１ Ｍａｎｉｓａ－Ｏ ＰａｎＡｓｉａ２（Ｏ１ Ｍ－Ｏ ＰＡ２）に「Ｃ３ｄ遺伝子（Ｂ細胞エピトープ）」を挿入した免疫増強組換え口蹄疫ウイルス、免疫原性が増加した口蹄疫ウイルス不活化抗原の分離・精製方法、及び母体移行抗体（ｍａｔｅｒｎａｌｌｙ－ｄｅｒｉｖｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＭＤＡ）干渉克服用口蹄疫ワクチン組成物としての使用に関する。
【背景技術】
【0002】
口蹄疫（ｆｏｏｔ－ａｎｄ－ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ、ＦＭＤ）ワクチンは、ウシとブタの両方で定期的、反復的なワクチン接種が要求され、このようなワクチン接種によって、母体から誘導された抗体が胎盤又は初乳摂取を介して母体移行抗体の形で子ウシ又は子ブタに伝達されて受動免疫（ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を形成する。母体移行抗体は、子ウシ及び子ブタで初期口蹄疫ウイルス感染の際に、宿主（ｈｏｓｔ）防御効果を示す一方、持続力が短く、若い週齢の動物への口蹄疫ワクチンの早期接種時に、受動免疫による干渉（形質細胞（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）、記憶Ｂ細胞から抗原特異的抗体の生産を阻害することにより免疫学的寛容メカニズムを招き）を引き起こすことにより、ワクチンの効能阻害及び能動免疫（ａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）形成を阻害する悪影響を及ぼす。現在、口蹄疫ワクチン予防接種プログラムは、子ウシや子ブタの場合、母体移行抗体のレベルが低下する時点である２ヶ月齢以後に接種することを勧告している。
【0003】
個体によって母体移行抗体のレベル、力価及び半減期などが異なるため、現場で適切な口蹄疫ワクチン接種時期を決定することに困難が伴う。また、商業的に用いられている現在の口蹄疫ワクチンは、一般に、母体移行抗体による干渉の克服が難しいため、ワクチン接種による能動免疫形成が阻害されるという限界点がある。
【0004】
一方、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤ ｖｉｒｕｓ、ＦＭＤＶ）は、アフトウイルス（Ａｐｈｔｈｏｖｉｒｕｓ）属（ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、Ｏ、Ａ、Ｃ、Ａｓｉａ１、ＳＡＴ１、ＳＡＴ２及びＳＡＴ３の７つの血清型に分類される。ＶＰ１タンパク質に該当するＦＭＤＶゲノム領域で少なくとも８５％のヌクレオチド同一性を共有するウイルスは、単一の血清型を形成する。これらは、一般に地理的に制限されており、トポタイプに区分される。ＦＭＤＶは、高い遺伝的、抗原的変異を示すため、一つの血清型により誘導された抗体が他の血清型を中和することができず、ワクチン接種の際に交叉防御が発揮されない。それにも拘らず、ワクチン接種は、口蹄疫発生国で病気を予防及び統制するために広く用いられている。
【0005】
Ｂ細胞の活性化経路は、次のように大きく３つに分けられる：１）Ｔ細胞依存性経路、２）Ｔ細胞非依存性タイプI経路、３）Ｔ細胞非依存性タイプII経路。これらの中でも、Ｔ細胞依存性経路は、ＴＣＲ／ＭＨＣ、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０などを介してＢ細胞が活性化される典型的な経路であり、Ｔ細胞非依存性経路タイプＩは、ＰＡＭＰ（ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎ）がパターン認識受容体（Ｐａｔｔｅｒｎ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＰＲＲｓ）を刺激してＢ細胞を直接活性化させる場合であって、宿主内で稀に起こる経路として知られている。最後に、Ｔ細胞非依存性タイプII経路は、Ｂ細胞受容体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるＣＤ２１、ＣＤ１９、及びＣＤ８１などを抗原又はＣ３ｄなどのＢ細胞エピトープが刺
激することによりＢ細胞を活性化させる経路である。宿主内に母体移行抗体が存在する場合、免疫耐性及び寛容（ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）メカニズムによって、Ｔ細胞への抗原提示、細胞性免疫反応の誘導及びＴ細胞依存性経路によるＢ細胞の活性化が困難であるため、Ｔ細胞非依存性経路を介してＢ細胞を直接活性化させるか、或いは強力な細胞性免疫反応の誘導を介してＴ細胞を持続的に刺激しなければならない。
激することによりＢ細胞を活性化させる経路である。宿主内に母体移行抗体が存在する場合、免疫耐性及び寛容（ｉｍｍｕｎｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）メカニズムによって、Ｔ細胞への抗原提示、細胞性免疫反応の誘導及びＴ細胞依存性経路によるＢ細胞の活性化が困難であるため、Ｔ細胞非依存性経路を介してＢ細胞を直接活性化させるか、或いは強力な細胞性免疫反応の誘導を介してＴ細胞を持続的に刺激しなければならない。
【0006】
したがって、本発明では、現在市販されている口蹄疫ワクチンの主な限界点として指摘されている母体移行抗体の干渉現象を克服するために、Ｂ細胞エピトープであるＣ３ｄを介してＢ細胞表面の受容体を刺激することにより母体移行抗体の干渉を克服しようと候補物質としてＣ３ｄの活性部位を選定したとともに、Ｏ ＰＡ２ Ｐ１バックボーン（ＶＰ１部位）にこれを挿入してＦＭＤＶ Ｏ型の母体移行抗体干渉克服用口蹄疫ワクチン株、それから分離・精製した免疫増強抗原、及びそれを含む母体移行抗体干渉克服用口蹄疫ワクチン組成物を開発した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】韓国登録特許第１０－２２３４７５４号公報
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】Lee, S. Y. et al. Rapid engineering of foot-and-mouth disease vaccine and challenge viruses. J. Virol. 91, e00155-00117 (2017)
【非特許文献2】Lee, M. J. et al. Advanced foot-and-mouth disease vaccine platform for stimulation of simultaneous cellular and humoral immune responses. Vaccines (Basel) 8, 254 (2020)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
上述した背景の下で、本発明は、現在市販されている口蹄疫ワクチンの限界点である母体移行抗体の干渉現象を克服するために、Ｂ細胞エピトープであるＣ３ｄを介してＢ細胞表面の受容体を直接刺激することにより母体移行抗体の干渉を克服しようとした。
【0010】
そこで、本発明の目的は、現在商用されている口蹄疫ワクチンの限界点として指摘されている母体移行抗体の干渉現象による口蹄疫ワクチン媒介免疫反応誘導の困難を克服するために、口蹄疫Ｏ型ワクチン株Ｏ１ Ｍａｎｉｓａ－Ｏ ＰＡ２－Ｒ（Ｏ１ Ｍ－Ｏ ＰＡ２、以下「Ｏ ＰＡ２」という。）に「Ｃ３ｄ遺伝子（Ｂ細胞エピトープ）」を挿入した免疫増強組換え口蹄疫ウイルス、前記ウイルスから分離・精製された抗原を含む口蹄疫ワクチン組成物、及び前記組換え口蹄疫ウイルスの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0011】
上記の目的を達成するために、本発明は、組換え口蹄疫ウイルス、前記組換え口蹄疫ウイルスから分離・精製された抗原を含む口蹄疫ワクチン組成物を提供する。
【0012】
また、本発明は、前記組換え口蹄疫ウイルスの製造方法、及び前記組換え口蹄疫ウイルスから抗原を分離・精製する方法を提供する。
【0013】
本発明による組換え口蹄疫ウイルスは、口蹄疫ウイルスの遺伝子が挿入された組換えプラスミドを介して製造でき、前記組換え口蹄疫ウイルスは、限定されないが、口蹄疫ウイルスＯ型又はＡ型であり得る。
【0014】
口蹄疫Ｏ型組換えウイルスは、配列番号８の組換えプラスミドを介して製造でき、口蹄
疫Ａ型組換えウイルスは、配列番号１１の組換えプラスミドを介して製造できる。
疫Ａ型組換えウイルスは、配列番号１１の組換えプラスミドを介して製造できる。
【0015】
前記組換え口蹄疫ウイルスを製造するために、バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）に挿入する候補物質としてＣ３ｄの活性部位（ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ）（１３アミノ酸）を選定し、前記Ｃ３ｄの活性部位は、配列番号４（これをコードする塩基配列は、配列番号５）を有する。
【0016】
これをＯ ＰＡ２又はＡ２２ Ｐ１バックボーン（ＶＰ１部位）に挿入して、ＦＭＤＶ
Ｏ型であるＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ、ＦＭＤＶ Ａ型であるＡ２２－Ｃ３ｄなどの母体移行抗体干渉克服用口蹄疫ワクチン用組成物を提供する。
Ｏ型であるＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ、ＦＭＤＶ Ａ型であるＡ２２－Ｃ３ｄなどの母体移行抗体干渉克服用口蹄疫ワクチン用組成物を提供する。
【0017】
また、これから分離・精製した免疫増強抗原、及びそれを含む母体移行抗体干渉克服用口蹄疫ワクチン組成物を提供する。
【0018】
また、前記組換え口蹄疫ウイルス、又は前記組換え口蹄疫ウイルスから分離・精製された抗原を含むワクチン組成物を用いて口蹄疫を予防又は治療する方法を提供する。
【0019】
また、前記組換え口蹄疫ウイルス、又は前記組換え口蹄疫ウイルス抗原を含む口蹄疫診断キット又は口蹄疫診断キット組成物を提供する。
【0020】
また、前記口蹄疫診断キット又は口蹄疫診断キット組成物を用いた口蹄疫診断方法を提供する。
【0021】
本発明の組換え口蹄疫ウイルスは、Ｏ型又はＡ型を基礎とする。
【0022】
Ｏ型は、限定されないが、本発明の一実施形態ではＯ１－Ｍａｎｉｓａであり得る。
【0023】
Ａ型は、限定されないが、本発明の一実施形態では亜型のＡ２２、好ましくはＡ２２／Ｉｒａｑ／２４／６４であり得る。
【0024】
本発明において、用語「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」は、適切な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適切な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ調製物を意味する。適切な宿主に形質転換されると、プラスミドは、宿主ゲノムとは無関係に複製及び機能することができるか、或いは一部の場合にゲノム自体に統合されることができる。プラスミドが現在ベクターの最も一般的に使用される形態であるので、本発明の明細書において、「プラスミド」及び「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、ときによっては相互交換的に使用される。
【0025】
本発明の目的上、プラスミドベクターを利用することが好ましい。このような目的に使用できる典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターで形質転換された宿主細胞が選抜され得るようにする選別標識、及び（ｃ）外来ＤＮＡ断片が挿入できる制限酵素切断部位を含む構造を持っている。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプター（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｄａｐｔｏｒ）又はリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）などを使用すると、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）することができる。
【0026】
本発明の組換えベクター及び組換え口蹄疫ウイルスは、通常の遺伝子操作法、形質転換法によって製造でき、少ない量で形成されたウイルスを細胞培養を介した連続継代で適切な
量のウイルスを得ることができる。
量のウイルスを得ることができる。
【0027】
前記細胞は、イヌ科動物、ネコ科動物、イノシシ科動物、ウシ科動物、シカ科動物、キリン科動物、ペッカリー科動物、ラクダ科動物、カバ科動物、ウマ科動物、バク科動物、サイ科動物、イタチ科、ウサギ科、げっ歯類及び霊長類の細胞よりなる群から選択された１種以上の細胞に由来するものであってよく、好ましくは、ヤギ舌細胞（ＺＺ－Ｒ）及びハムスター腎細胞（ＢＨＫ－２１）、黒ヤギ腎細胞（ＢＧＫ）、ブタ腎細胞（ＩＢＲＳ－２）及びウシ腎細胞（ＬＦＢＫ）よりなる群から選択された１種以上を使用することができる。
【0028】
本発明の口蹄疫ワクチン組成物は、本発明の組換え口蹄疫ウイルス又は前記組換えウイルスから分離・精製された抗原を有効成分として含む。
【0029】
本発明における口蹄疫ワクチン組成物、口蹄疫診断キット、口蹄疫診断キット組成物に含まれる組換え口蹄疫ウイルスは、組換え口蹄疫ウイルスＯ型、Ａ型それぞれ、又はこれらの組み合わせであり得る。
【0030】
また、本発明における口蹄疫ワクチン組成物、口蹄疫診断キット、口蹄疫診断キット組成物に含まれる組換え口蹄疫ウイルスから分離・精製された抗原は、組換え口蹄疫ウイルスＯ型、Ａ型にそれぞれ由来したもの、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【0031】
前記ワクチン組成物を含むワクチンは、生ワクチン、弱毒化ワクチン、又は不活性化ワクチンであり得る。
【0032】
前記組換え口蹄疫ウイルス又は前記組換えウイルスから分離・精製された抗原を含むワクチン組成物は、１／６４０～１／１０ｄｏｓｅの用量で投与でき、好ましくは、１／４０～１／１０ｄｏｓｅの用量で投与できる。
【0033】
前記ワクチン組成物は、ヒトを除いたブタ、ヒツジ、ヤギ、シカ及び野生の反芻類などの偶蹄類に投与できる。
【0034】
また、前記ワクチン組成物は、当技術分野で通常許容される担体、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤などをさらに含むことができる。
【0035】
また、前記ワクチン組成物は、様々な形態で個体に投与（又は注入）できる。投与は、皮下注射、筋肉内注射、皮下内注射、腹膜内注射、鼻腔投与、口腔投与、経皮投与又は経口投与よりなる群から選択されたいずれかの方法で行われることができる。
【発明の効果】
【0036】
本発明は、組換え口蹄疫ウイルス、前記ウイルスから分離・精製された抗原を含む口蹄疫ワクチン組成物に関するものであり、ワクチン接種初期、強力な細胞性免疫反応の誘導によって体液性免疫反応を同時に誘導する一方、ＭＤＡ存在の際にＢ細胞受容体の刺激によってＭＤＡの干渉の克服及び能動免疫を可能にしたワクチン組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1a】本発明による組換え免疫増強口蹄疫Ｏ型ウイルスの遺伝子模式図。
【図1b】本発明による組換え免疫増強口蹄疫Ａ型ウイルスの遺伝子模式図。
【図2a】Ｏ ＰＡ２、Ａ２２から分離及び精製された抗原の免疫原性評価戦略及び結果を示す図。
【図2b】Ｏ ＰＡ２、Ａ２２から分離及び精製された抗原の免疫原性評価戦略及び結果を示す図。
【図3】Ｏ ＰＡ２及びＡ２２から分離及び精製された抗原の併用投与時の免疫原性評価戦略及び結果を示す図。
【図4a】本発明による組換え口蹄疫Ｏ型ウイルスの実験戦略（Ａ）、生存率（Ｂ）及び体重変化（Ｃ）を示す図。
【図4b】本発明による組換え口蹄疫Ａ型ウイルスの実験戦略（Ｄ）、生存率（Ｅ）及び体重変化（Ｆ）を示す図。
【図5】マウスに対する、本発明による組換え免疫増強口蹄疫Ｏ型及びＡ型ウイルスから分離・精製した抗原を含むワクチンの接種及び免疫反応誘導評価結果を示す図。
【図6a】ブタに対する、本発明による組換え免疫増強口蹄疫Ｏ型及びＡ型ウイルスから分離・精製した抗原を含むワクチン接種戦略を示す図。
【図6b】ブタに対する、本発明による組換え免疫増強口蹄疫Ｏ型及びＡ型ウイルスから分離・精製した抗原を含むワクチンの接種による初期、中期、長期免疫（ＳＰ Ｏ、Ａ ＥＬＩＳＡによる抗体が誘導）評価結果を示す図。
【図7】ブタに対する、本発明による組換え免疫増強口蹄疫Ｏ型及びＡ型ウイルスから分離・精製した抗原を含むワクチンの接種による初期、中期、長期免疫（中和抗体が誘導）評価結果を示す図。
【図8a】ブタに対する、本発明による組換え免疫増強口蹄疫Ｏ型及びＡ型ウイルスから分離・精製した抗原を含むワクチンの接種による細胞性免疫反応遺伝子（サイトカイン、共刺激分子など）発現評価結果を示す図。
【図8b】ブタに対する、本発明による組換え免疫増強口蹄疫Ｏ型及びＡ型ウイルスから分離・精製した抗原を含むワクチンの接種による細胞性免疫反応遺伝子（サイトカイン、共刺激分子など）発現評価結果を示す図。
【図8c】ブタに対する、本発明による組換え免疫増強口蹄疫Ｏ型及びＡ型ウイルスから分離・精製した抗原を含むワクチンの接種による細胞性免疫反応遺伝子（サイトカイン、共刺激分子など）発現評価結果を示す図。
【図8d】ブタにおける、本発明による組換え免疫増強組換え口蹄疫Ｏ型及びＡ型ウイルスから分離・精製した抗原を含むワクチンの接種によって媒介される体液性免疫反応（ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡなどの免疫グロブリン亜型）誘導評価結果を示す図。
【図8e】本発明による免疫増強組換え口蹄疫Ｏ型及びＡ型ウイルスから分離・精製した抗原処理によって誘導されたマウス（ｍｕｒｉｎｅ）腹腔滲出液細胞（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｅｘｕｄａｔｅ ｃｅｌｌｓ、ＰＥＣｓ）及びブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ、ＰＢＭＣｓ）に対する細胞免疫反応結果を示す図。
【図9】本発明による組換え口蹄疫ウイルスから分離・精製された抗原を含む簡易キットにおける抗原量の測定及び野外株との鑑別結果を示す図。
【図10】本発明による組換え口蹄疫ウイルスを用いて精製された抗原（１４６ｓ粒子）の電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察結果を示す図。
【図11】本発明のＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄのＶＰ１配列を示す図であり、１番目（Ｓｕｓ．１）及び４番目（Ｓｕｓ．４）の懸濁細胞（ＢＨＫ）継代の際に、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄのＶＰ１配列をＳｎａｐＧｅｎｅを用いて整列した；（ａ）Ｏ ＰＡ－Ｃ３ｄヌクレオチド配列、（ｂ）Ａ２２－Ｃ３ｄヌクレオチド配列、（ｃ）Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄアミノ酸配列、（ｄ）Ａ２２－Ｃ３ｄアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【0038】
以下、本発明を実施例及び実験例によって詳細に説明する。
【0039】
但し、下記実施例及び実験例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明の内容は下記実
施例及び実験例に限定されるものではない。
施例及び実験例に限定されるものではない。
【0040】
＜材料及び方法＞
１．組換えプラスミドの製造
組換えプラスミドは、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（Lee, S. Y. et al. Rapid engineering of foot-and-mouth disease vaccine and challenge viruses. J. Virol. 91, e00155-00117 (2017).）によって記述されているように製造された。全ＦＭＤ－Ｏ１－Ｍａｎｉｓａウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ５９３８２３．１）をＰＣＲで増幅した。
１．組換えプラスミドの製造
組換えプラスミドは、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（Lee, S. Y. et al. Rapid engineering of foot-and-mouth disease vaccine and challenge viruses. J. Virol. 91, e00155-00117 (2017).）によって記述されているように製造された。全ＦＭＤ－Ｏ１－Ｍａｎｉｓａウイルスゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ５９３８２３．１）をＰＣＲで増幅した。
【0041】
（１）組換え口蹄疫Ｏ型ウイルスを製造するための組換えプラスミドの作製
増幅されたＯ１－Ｍａｎｉｓａゲノム（配列番号１）をプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ II）に挿入してｐＯ１－Ｍａｎｉｓａ（ｐＯ１ Ｍ）プラスミドを製造した。製造されたｐＯ１ ＭにおけるＰ１構造タンパク質をコードする遺伝子は、Ｏ－血清型ＦＭＤＶ Ｏ ＰＡ２（配列番号２）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＧＵ３８４６８２．１）の構造タンパク質をコードする遺伝子に置換してｐＯ１ Ｍ－Ｏ
ＰＡ２ Ｐ１（配列番号３）プラスミドを製造した。
増幅されたＯ１－Ｍａｎｉｓａゲノム（配列番号１）をプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ II）に挿入してｐＯ１－Ｍａｎｉｓａ（ｐＯ１ Ｍ）プラスミドを製造した。製造されたｐＯ１ ＭにおけるＰ１構造タンパク質をコードする遺伝子は、Ｏ－血清型ＦＭＤＶ Ｏ ＰＡ２（配列番号２）（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＧＵ３８４６８２．１）の構造タンパク質をコードする遺伝子に置換してｐＯ１ Ｍ－Ｏ
ＰＡ２ Ｐ１（配列番号３）プラスミドを製造した。
【0042】
上記のように製造されたプラスミド（ｐＯ１ Ｍ－Ｏ ＰＡ２ Ｐ１）を用いてアミノ酸残基配列（ＧＫＱＬＹＮＶＥＡＴＳＹＡ、配列番号５）に該当するＢ細胞エピトープ配列（Ｃ３ｄ配列（ＧＧＴＡＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＣＣ、配列番号４）をＶＰ１配列の［ＰＡ２－Ｃ３ｄ：４５６及び４５７塩基対位置（１５２及び１５３アミノ酸位置、すなわちｐＯ１ Ｍ－Ｏ ＰＡ２ Ｐ１配列の２０２５及び２０２６番目の塩基）の間に挿入した。その後、ＰＣＲテンプレートとして、ｐＯ１ Ｍ－Ａ２２ Ｐ１ ３００ｎｇ／μＬ、１０ｐｍｏｌｅ／μＬのプライマーＣ３ｄ Ｆ（５’－ＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＣＣＣＧＣＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＡＧＧＴＣＧＣ－３’、配列番号６）１μＬ、１０ｐｍｏｌｅ／μＬのプライマーＣ３ｄ
Ｒ（５’）１μＬ－ＡＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＡＧＧＧＴＣＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴ－３’、配列番号７）は、以前の研究で使用したのと同一のセルフライゲーション（ｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｎｇ）方法で標的プラスミドを製造するのに使用された。最終的に製造された組換えプラスミドは、配列番号８の通りである。
Ｒ（５’）１μＬ－ＡＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＡＧＧＧＴＣＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＴ－３’、配列番号７）は、以前の研究で使用したのと同一のセルフライゲーション（ｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｎｇ）方法で標的プラスミドを製造するのに使用された。最終的に製造された組換えプラスミドは、配列番号８の通りである。
【0043】
（２）組換え口蹄疫Ａ型ウイルスを製造するための組換えプラスミドの作製
増幅されたＯ１－Ｍａｎｉｓａゲノム（配列番号１）をプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ II）に挿入してｐＯ－Ｍａｎｉｓａ（ｐＯ１ Ｍ）プラスミドを製造した。製造されたｐＯ１ Ｍにおける構造タンパク質をコードする遺伝子は、Ａ血清型ＦＭＤＶ Ａ２２／Ｉｒａｑ／２４／６４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ５９３７６４．１）（配列番号９）の構造タンパク質をコードする遺伝子に置換してＯ１
Ｍ－Ａ２２ Ｐ１プラスミド（配列番号１０）を製造した。
増幅されたＯ１－Ｍａｎｉｓａゲノム（配列番号１）をプラスミド（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ II）に挿入してｐＯ－Ｍａｎｉｓａ（ｐＯ１ Ｍ）プラスミドを製造した。製造されたｐＯ１ Ｍにおける構造タンパク質をコードする遺伝子は、Ａ血清型ＦＭＤＶ Ａ２２／Ｉｒａｑ／２４／６４（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ５９３７６４．１）（配列番号９）の構造タンパク質をコードする遺伝子に置換してＯ１
Ｍ－Ａ２２ Ｐ１プラスミド（配列番号１０）を製造した。
【0044】
上記のように製造されたプラスミド（Ｏ１ Ｍ－Ａ２２ Ｐ１）を用いてアミノ酸残基配列（ＧＫＱＬＹＮＶＥＡＴＳＹＡ、配列番号５）に該当するＢ細胞エピトープ配列（Ｃ３ｄ配列（ＧＧＴＡＡＧＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＣＣ、配列番号４）をＶＰ１配列の［ＰＡ２－Ｃ３ｄ：４５３及び４５４塩基対位置（１５１及び１５２アミノ酸位置、すなわちｐＯ１ Ｍ－Ｏ ＰＡ２ Ｐ１配列の２０２５及び２０２６番目の塩基）の間に挿入した。その後、ＰＣＲテンプレートとして、Ｏ１
Ｍ－Ａ２２ Ｐ１ ３００ｎｇ／μＬ、１０ｐｍｏｌｅ／μＬのプライマーＣｄ３ Ｆ（５’－ＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＣＣＣＧＣＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＡＧＧＴＣＧＣ－３’、配列番号６）１μＬ、１０ｐｍｏｌｅ／μＬのプライマーＣ３ｄ Ｒ（５’）１μＬ－ＡＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＡＧＧＧＴＣＧＣＣＧＣ
ＴＣＡＧＣＴ－３’、配列番号７）は、以前の研究で使用したのと同一のセルフライゲーション（ｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｎｇ）方法で標的プラスミドを製造するのに使用された。最終的に製造された組換えプラスミドは、配列番号１１の通りである。
Ｍ－Ａ２２ Ｐ１ ３００ｎｇ／μＬ、１０ｐｍｏｌｅ／μＬのプライマーＣｄ３ Ｆ（５’－ＧＧＡＧＧＣＣＡＣＡＴＣＣＴＡＴＧＣＣＣＧＣＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＡＧＧＴＣＧＣ－３’、配列番号６）１μＬ、１０ｐｍｏｌｅ／μＬのプライマーＣ３ｄ Ｒ（５’）１μＬ－ＡＣＧＴＴＧＴＡＧＡＧＣＴＧＣＴＴＡＣＣＧＣＧＡＧＧＧＴＣＧＣＣＧＣ
ＴＣＡＧＣＴ－３’、配列番号７）は、以前の研究で使用したのと同一のセルフライゲーション（ｓｅｌｆ－ｌｉｇａｔｉｎｇ）方法で標的プラスミドを製造するのに使用された。最終的に製造された組換えプラスミドは、配列番号１１の通りである。
【0045】
【0046】
ＰＣＲ条件は、次の通りである：１０μＬの５×Ｐｈｕｓｉｏｎ ＨＦ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）、１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、１μＬの２Ｕ／μＬ Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び３５μＬの滅菌蒸留水を９８℃で３０秒、９８℃で１０秒、６５℃で２０秒、７２℃で２分及び３０秒間２５サイクル増幅し、最終サイクルは７２℃で１０分間行った。次に、１μＬのＤｐｎI（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｄａｅｊｅｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を２５μＬのＰＣＲ産物に添加し、３７℃のインキュベーターで１時間反応させた。その後、３５μＬの滅菌蒸留水、５μＬのＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡、大阪、日本）及び１μＬの５Ｕ／μＬ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡、大阪、日本）を４μＬのＤｐｎI処理製品に添加した。混合物を１６℃の水浴で１時間ライゲーションさせた。
【0047】
ライゲーションの後、プラスミドは、製造業者のプロトコルに従って１００μＬのＤＨ５α細胞（Ｙｅａｓｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｔａｉｐｅｉ、Ｔａｉｗａｎ）に形質転換された。形質転換された細胞をアンピシリン含有寒天プレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した。
【0048】
ピペットチップ付きプレートからコロニーを選択し、１８μＬの滅菌蒸留水、１μＬの１０ｐｍｏｌフォワードユニバーサルプライマーＶＰ１（５’－ＡＧＮＧＣＮＧＧＮＡＡＲＴＴＴＧＡ－３’）（配列番号１２）及び１μＬの１０ｐｍｏｌ／μＬリバースユニバ―サルプライマーと混合した。プライマーＶＰ１（５’－ＣＡＴＧＴＣＮＴＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴ－３’）（配列番号１３）をコロニーＰＣＲチューブに入れ、９４℃で５分、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分、最後のサイクルは７２℃で５分間行って合計２５サイクルのＰＣＲ増幅を行った。前記ユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）プライマーにおいて、Ｎは任意のヌクレオチドを示すことができる。５μＬのＰＣＲサンプルを１μＬの６×ローディングバッファー（ＤＹＮＥ ＢＩＯ、京畿道、韓国）と混合した後、アガロースゲルにロードした。その後、５μＬの１００ｂｐマーカー（ＤＹＮＥ ＢＩＯ）もゲルにロードした。１００Ｖで３０分間電気泳動した後、バンドをＧｅｌ Ｄｏｃで評価した。バンド評価の後、５μＬのＰＣＲ産物を２μＬのＥｘｏＳＡＰ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と混合し、３７℃で１５分間及び８５℃で１５分間ＰＣＲによって増幅した。ＶＰ１へのエピトープの挿入は、全ＤＮＡ配列決定によって確認された。塩基配列を確認した後、コロニーをアンピシリン含有ＬＢ培地２００ｍＬに入れ、３７℃で一晩振盪しがら培養した。Ｍｉｄｉ ｐｒｅｐ（ＭＡＣＨＥＲＥＹＮＡＧＥＬ、Ｄｕｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてプラスミドを製造した。
【0049】
２．免疫増強組換え口蹄疫ウイルスの準備
組換え口蹄疫ウイルスは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて上記で製造した組換えプラスミドでＢＨＫＴ７－９（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞株）をトランスフェクトさせた後、２～３日間培養して回収した。その後、準備されたウイルスは、ウイルス増殖のために胎児ヤギ舌（ＺＺ－Ｒ）細胞又はベビーハムスター腎臓－２１（ＢＨＫ－２１）細胞に継代された。
組換え口蹄疫ウイルスは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて上記で製造した組換えプラスミドでＢＨＫＴ７－９（Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞株）をトランスフェクトさせた後、２～３日間培養して回収した。その後、準備されたウイルスは、ウイルス増殖のために胎児ヤギ舌（ＺＺ－Ｒ）細胞又はベビーハムスター腎臓－２１（ＢＨＫ－２１）細胞に継代された。
【0050】
３．表面にＣ３ｄ－エピトープを提示する組換え口蹄疫Ｏ型及びＡ型ウイルスからの抗原（不活化ウイルス）の精製
精製された抗原は、改変されたＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（非特許文献２）によって記述された方法に従って、逆遺伝学によってＰ１の迅速な表現型（参照された配列）に対して構成された組換え免疫刺激ＦＭＤＶ Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄで感染したＢＨＫ－２１細胞から製造された。
精製された抗原は、改変されたＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（非特許文献２）によって記述された方法に従って、逆遺伝学によってＰ１の迅速な表現型（参照された配列）に対して構成された組換え免疫刺激ＦＭＤＶ Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄで感染したＢＨＫ－２１細胞から製造された。
【0051】
ウイルス感染のために、培養培地を無血清Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）で取り替え、細胞を５％ＣＯ２、３７℃で１時間培養してウイルスを接種した。その後、細胞外ウイルスを除去した。感染２４時間後、振盪インキュベーターで２４時間０．００３Ｎバイナリー（ｂｉｎａｒｙ）エチレンイミンを２回処理してウイルスを不活性化させた後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で濃縮させた。ウイルス濃縮液は、１５％～４５％スクロース密度勾配に積層され、遠心分離された。超遠心分離の後、遠心分離管の底部に穴を開けて１ｍＬの画分を収集した。各画分のサンプルにおけるＦＭＤＶ粒子の存在は、側方流動装置（ＢｉｏＳｉｇｎ ＦＭＤＶ Ａｇ；Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ ＢｉｏＭｅｄｉｔｅｃｈ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）を用いて光学密度によって確認した。現場実験に使用する前に、予めＰＥＧ処理された上澄み液をＺＺ－Ｒ及びＢＨＫ－２１細胞に２回以上通過させ、細胞変性効果（ＣＰＥ）が発生していないかを確認することにより、上澄み液に生きているウイルスがないことを確認した。
【0052】
４．精製された抗原を用いた構造及び非構造タンパク質の確認及びＴＥＭを用いた１４６Ｓ粒子の検査
免疫増強組換えＦＭＤＶ Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄに感染した細胞の精製された抗原発現の構造タンパク質（ＳＰ）は、ＳＰに対するバンド形成を示すＲａｐｉｄ抗原キット（ＰＢＭキット、ＰＢＭ Ｃｏ Ｌｔｄ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）で確認された。ＦＭＤＶの非構造タンパク質（ＮＳＰ）に対するバンド形成がなかった。ウイルス粒子（１４６Ｓ）は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージングによって特徴を確認した。また、組換えウイルスを継代する際に、配列が変化する現象が頻繁であるため、１番目、４番目の継代の際に、配列が変化しなかったことを証明するために、「Ｃ３ｄ」の特定エピトープが挿入されたＦＭＤＶが細胞に継代された後にもウイルスの遺伝的安定性を維持するかを確認し、最終的に４番目の継代まで配列変化がないことを確認した（図１１）。
免疫増強組換えＦＭＤＶ Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄに感染した細胞の精製された抗原発現の構造タンパク質（ＳＰ）は、ＳＰに対するバンド形成を示すＲａｐｉｄ抗原キット（ＰＢＭキット、ＰＢＭ Ｃｏ Ｌｔｄ．、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ、ＵＳＡ）で確認された。ＦＭＤＶの非構造タンパク質（ＮＳＰ）に対するバンド形成がなかった。ウイルス粒子（１４６Ｓ）は、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）イメージングによって特徴を確認した。また、組換えウイルスを継代する際に、配列が変化する現象が頻繁であるため、１番目、４番目の継代の際に、配列が変化しなかったことを証明するために、「Ｃ３ｄ」の特定エピトープが挿入されたＦＭＤＶが細胞に継代された後にもウイルスの遺伝的安定性を維持するかを確認し、最終的に４番目の継代まで配列変化がないことを確認した（図１１）。
【0053】
５．母体移行抗体干渉克服用免疫増強口蹄疫ワクチン株、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄの実験動物（マウス）における免疫原性の評価
（１）マウス（Ｍｉｃｅ）
マウス実験は、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（非特許文献２）に記述された方法に従って行われた。年齢及び性別が一致する野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～７週齢の雌）は、ＫＯＳＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．（京畿、韓国）から購入した。全てのマウスは、農林畜産検疫本部の特定の無病原体（ＳＰＦ）生物安全性レベル３（ＡＢＳＬ３）動物施設で飲食と水に自由に接近することができるマイクロアイソレータケージに収容された。全ての動物は、実験に使用する前に少なくとも１週間適応するようにした。飼育室は、１２時間の明暗周期、約２２℃の温度、約５０％の相対湿度に設定された。試験は、機関のガイドラインと農林畜産検疫本部動物実験倫理委員会の承認（認証番号ＩＡＣＵＣ－２０２１－５８４）に従って行われた。
（１）マウス（Ｍｉｃｅ）
マウス実験は、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（非特許文献２）に記述された方法に従って行われた。年齢及び性別が一致する野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～７週齢の雌）は、ＫＯＳＡ ＢＩＯ Ｉｎｃ．（京畿、韓国）から購入した。全てのマウスは、農林畜産検疫本部の特定の無病原体（ＳＰＦ）生物安全性レベル３（ＡＢＳＬ３）動物施設で飲食と水に自由に接近することができるマイクロアイソレータケージに収容された。全ての動物は、実験に使用する前に少なくとも１週間適応するようにした。飼育室は、１２時間の明暗周期、約２２℃の温度、約５０％の相対湿度に設定された。試験は、機関のガイドラインと農林畜産検疫本部動物実験倫理委員会の承認（認証番号ＩＡＣＵＣ－２０２１－５８４）に従って行われた。
【0054】
（２）マウスへのワクチン接種及びＦＭＤＶ投与
免疫原性の強いＦＭＤＶ Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄとＡ２２－Ｃ３ｄから分離・精製した抗
原の免疫原性と短期免疫誘導効果を検証し、口蹄疫ワクチン開発のためのマスターシードウイルス（ｍａｓｔｅｒ ｓｅｅｄ ｖｉｒｕｓ、ＭＳＶ）としての可能性を確認するために、次のように動物実験を行った。
免疫原性の強いＦＭＤＶ Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄとＡ２２－Ｃ３ｄから分離・精製した抗
原の免疫原性と短期免疫誘導効果を検証し、口蹄疫ワクチン開発のためのマスターシードウイルス（ｍａｓｔｅｒ ｓｅｅｄ ｖｉｒｕｓ、ＭＳＶ）としての可能性を確認するために、次のように動物実験を行った。
【0055】
実験に使用されたワクチンの組成は、次の通りである：Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ（１５μｇ／ｄｏｓｅ／ｍＬ、ブタの場合は１／１０～１／６４０用量）、ＩＳＡ ２０６（Ｓｅｐｐｉｃ、Ｐａｒｉｓ、フランス、５０％、ｗ／ｗ）、１０％Ａｌ（ＯＨ）３及び１５μｇ／マウスＱｕｉｌ－Ａ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）。マウスを太ももの筋肉に筋肉内（ＩＭ）注射し（ワクチン接種後０日（ｄｐｖ））、ＦＭＤＶ（Ｏ／ＶＥＴ／２０１３の１００ ＬＤ５０ ＭＥ－ＳＡトポタイプ又は１００ ＬＤ５０ Ａ／Ｍａｌａｙ／９７、ＳＥＡトポタイプ）を７ｄｐｖに腹腔内（ＩＰ）注射して投与した。陰性対照群のマウスには、同じ経路を介して同体積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）が投与された。短期免疫原性を評価するために、投与後（ｄｐｃ）最大７日間の生存率及び体重変化をモニタリングした。
【0056】
目的動物（ブタ）における実験のための予備実験として、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ抗原＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原を含む２価試験ワクチンの免疫原性確認のためにＰＤ５０テストを行ったとともに、免疫増強ワクチン株のバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として使用したＯ
ＰＡ２抗原＋Ａ２２抗原を含む試験ワクチン投与群を一緒に比較した。実験に使用されたワクチンの組成は、次の通りである；Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ抗原＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原（１５μｇ＋１５μｇ／ｄｏｓｅ／ｍｌ、１／１０～１／６４０ｄｏｓｅ）又はＯ ＰＡ２抗原＋Ａ２２抗原（１５μｇ＋１５μｇ／ｄｏｓｅ／ｍｌ、１／１０～１／６４０ｄｏｓｅ）、ＩＳＡ ２０６（５０％、ｗ／ｗ）、１０％Ａｌ（ＯＨ）３、１５μｇ Ｑｕｉｌ－Ａ／ｍｏｕｓｅ。陰性対照群の場合、同体積のＰＢＳを同じ経路で投与された。
ＰＡ２抗原＋Ａ２２抗原を含む試験ワクチン投与群を一緒に比較した。実験に使用されたワクチンの組成は、次の通りである；Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ抗原＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原（１５μｇ＋１５μｇ／ｄｏｓｅ／ｍｌ、１／１０～１／６４０ｄｏｓｅ）又はＯ ＰＡ２抗原＋Ａ２２抗原（１５μｇ＋１５μｇ／ｄｏｓｅ／ｍｌ、１／１０～１／６４０ｄｏｓｅ）、ＩＳＡ ２０６（５０％、ｗ／ｗ）、１０％Ａｌ（ＯＨ）３、１５μｇ Ｑｕｉｌ－Ａ／ｍｏｕｓｅ。陰性対照群の場合、同体積のＰＢＳを同じ経路で投与された。
【0057】
マウスは、０ｄｐｖにＩ．Ｍ．でワクチン接種した後、７日目（ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ、ｄｐｖ）、ＦＭＤＶ（１００ ＬＤ５０、Ｏ／ＶＥＴ／２０１３、ＭＥ－ＳＡトポタイプ又は１００ ＬＤ５０ Ａ／Ｍａｌａｙ／９７、ＳＥＡトポタイプ）をマウス腹腔内に投与し、７日後（ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ、ｄｐｃ）まで生存率及び体重変化をモニタリングした。
【0058】
６．母体移行抗体干渉克服用免疫増強口蹄疫ワクチン株、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄの目的動物（ブタ）における免疫原性の評価
（１）ブタ
ブタ（８～９週齢、合計ｎ＝３２）は、ＳＰ Ｏ ＥＬＩＳＡ、ＳＰ Ａ ＥＬＩＳＡを介して抗体価（ＰＩ値：５０％基準）及びＶＮ ｔｉｔｅｒｓ（１．６ Ｌｏｇ１０基準）を介してスクリーニングし、ＭＤＡ（＋）群、ＭＤＡ（－）群（各群当たりｎ＝１６）に区分した。
（１）ブタ
ブタ（８～９週齢、合計ｎ＝３２）は、ＳＰ Ｏ ＥＬＩＳＡ、ＳＰ Ａ ＥＬＩＳＡを介して抗体価（ＰＩ値：５０％基準）及びＶＮ ｔｉｔｅｒｓ（１．６ Ｌｏｇ１０基準）を介してスクリーニングし、ＭＤＡ（＋）群、ＭＤＡ（－）群（各群当たりｎ＝１６）に区分した。
【0059】
ＭＤＡ（＋）群、ＭＤＡ（－）群に該当する各群別ブタは、３群（ｎ＝４又は６／群）：ＮＣ（陰性対照群）、Ｏ ＰＡ２＋Ａ２２（陽性対照群、ＰＣ）処理、及びＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ処理群にランダムに分けた。
【0060】
動物は、実験期間中に閉鎖された隔離室（ＡＢＳＬ３）で隔離された。ＡＢＳＬに到着した後、全ての動物は、飲食と水に自由に接近（ａｄ ｌｉｂｉｔｕｍ）することができるケージに保管され、少なくとも１週間の適応後に実験に使用された。飼育室は、１２時間の明暗周期、約２２℃の温度、約５０％の相対湿度に設定された。本発明は、農林畜産検疫本部動物実験倫理委員会（認証番号ＩＡＣＵＣ－２０２１－５８４）の承認を受けた機関のガイドラインに従って行われた。
【0061】
（２）ワクチン接種による免疫反応の誘導及びサンプリング
目的動物であるブタにおいて、母体移行抗体干渉克服のために作製した免疫増強口蹄疫ワクチン株であるＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄとＡ２２－Ｃ３ｄから分離・精製した抗原の免疫原性を評価し、適応性免疫反応誘導効果及び母体移行抗体干渉回避克服効果を観察するために、母体移行抗体陽性（ＭＤＡ（＋）、ＦＭＤ－ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）、陰性（ＭＤＡ（－）、ＦＭＤ－ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ）－野外ブタを用いて実験を行った。ワクチンの組成は、次の通りである。総１ｍｌ体積のワクチンを１ｄｏｓｅとして、１５μｇのＯ ＰＡ２抗原＋１５μｇのＡ２２抗原（陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ）、ＰＣ群）又は１５μｇのＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ抗原＋１５μｇのＡ２２－Ｃ３ｄ抗原（実験群（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ）、実験群）、ＩＳＡ ２０６（５０％、ｗ／ｗ）、１０％Ａｌ（ＯＨ）３、１５０μｇのＱｕｉｌ－Ａが含まれるように製造した。陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ、ＮＣ群）の場合、同体積のＰＢＳを同じ経路で投与された。
目的動物であるブタにおいて、母体移行抗体干渉克服のために作製した免疫増強口蹄疫ワクチン株であるＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄとＡ２２－Ｃ３ｄから分離・精製した抗原の免疫原性を評価し、適応性免疫反応誘導効果及び母体移行抗体干渉回避克服効果を観察するために、母体移行抗体陽性（ＭＤＡ（＋）、ＦＭＤ－ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）、陰性（ＭＤＡ（－）、ＦＭＤ－ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ）－野外ブタを用いて実験を行った。ワクチンの組成は、次の通りである。総１ｍｌ体積のワクチンを１ｄｏｓｅとして、１５μｇのＯ ＰＡ２抗原＋１５μｇのＡ２２抗原（陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ）、ＰＣ群）又は１５μｇのＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ抗原＋１５μｇのＡ２２－Ｃ３ｄ抗原（実験群（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｇｒｏｕｐ）、実験群）、ＩＳＡ ２０６（５０％、ｗ／ｗ）、１０％Ａｌ（ＯＨ）３、１５０μｇのＱｕｉｌ－Ａが含まれるように製造した。陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ、ＮＣ群）の場合、同体積のＰＢＳを同じ経路で投与された。
【0062】
８～９週齢のブタ、母体移行抗体陽性、陰性動物をスクリーニングしてＭＤＡ（＋）群（ｎ＝１６）とＭＤＡ（－）群（ｎ＝１６）の２つの分類に区分した。ＭＤＡ（＋）群、ＭＤＡ（－）群の個体をそれぞれ３つの群に分け、ＮＣ群（ＰＢＳ投与群、ｎ＝４／ｇｒｏｕｐ）、ＰＣ群（Ｏ ＰＡ２＋Ａ２２投与群、ｎ＝６／ｇｒｏｕｐ）、実験群（Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ投与群、ｎ＝６／ｇｒｏｕｐ）に区分し、２８日間隔で２回（０ｄｐｖ、２８ｄｐｖ）、１ｍＬのワクチンをＩ．Ｍ．経路で投与した。ワクチン接種ブタ血液サンプルを０、７、１４、２８、４２、５６、７０、８４ｄｐｖに収集してＳＰ Ｏ、Ａ ＥＬＩＳＡ、及びＶＮ ｔｉｔｅｒの確認などの血清学的分析に使用した。ＳＰ Ｏ、Ａ ＥＬＩＳＡの場合、抗原の特性による抗体陽性率を考慮して、ＦＭＤＶ Ｏ型、Ａ型それぞれＰｒｉｏＣＨＥＣＫＴＭキット、ＶＤＰｒｏ（登録商標）キットを用いて比較した。また、全てのサンプリングスケジュールに採取した血液サンプルからＰＢＭＣｓ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）を分離して、試験ワクチン媒介－細胞性・体液性免疫反応関連遺伝子発現の変化を分析した。
【0063】
（３）血清学的分析
血清内のＳＰ抗体を検出するために、ＰｒｉｏＣＨＥＣＫＴＭＦＭＤＶタイプＯ又はＦＭＤＶタイプＡ（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とＶＤＰｒｏ（登録商標）ＦＭＤＶタイプＯ又はＦＭＤＶタイプＡ（Ｍｅｄｉａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、韓国江原道）を使用した。ＥＬＩＳＡプレートの吸光度を抑制率（ＰＩ）値に変換した。ＰＩ値がＰｒｉｏＣＨＥＣＫＴＭＦＭＤＶキットの場合に５０％、又はＶＤＰｒｏ（登録商標）ＦＭＤＶキットの場合に４０％以上であれば、動物は抗体陽性と見なされた。
血清内のＳＰ抗体を検出するために、ＰｒｉｏＣＨＥＣＫＴＭＦＭＤＶタイプＯ又はＦＭＤＶタイプＡ（Ｐｒｉｏｎｉｃｓ ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）とＶＤＰｒｏ（登録商標）ＦＭＤＶタイプＯ又はＦＭＤＶタイプＡ（Ｍｅｄｉａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、韓国江原道）を使用した。ＥＬＩＳＡプレートの吸光度を抑制率（ＰＩ）値に変換した。ＰＩ値がＰｒｉｏＣＨＥＣＫＴＭＦＭＤＶキットの場合に５０％、又はＶＤＰｒｏ（登録商標）ＦＭＤＶキットの場合に４０％以上であれば、動物は抗体陽性と見なされた。
【0064】
ウイルス中和試験（ＶＮＴ）は、世界動物保健機関（ＯＩＥ）のマニュアルに従って行われた。血清を水浴中で３０分間５６℃で熱不活性化させた。細胞密度を調整して７０％単層を形成し、血清サンプルの２倍連続希釈液（１：８～１：１０２４）を準備した。その後、希釈された血清サンプルを、１００－組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）５０／０．５ｍＬの相同ウイルスと共に３７℃で１時間培養した。１時間後、ＬＦ－ＢＫ（ウシ腎臓）細胞懸濁液をすべてのウェルに添加した。２～３日の後、ＣＰＥは、力価を決定するために評価された。これは、ウイルスの１００ ＴＣＩＤ５０を中和するのに必要な逆抗体希釈のＬｏｇ１０値として計算された。ＦＭＤＶ Ｏ／ＰＡ２及びＦＭＤＶ Ａ２２／ＩＲＡＱは、ＶＮＴに使用された。
【0065】
（４）ＰＥＣｓ分離及び細胞培養
Ｎａｉｖｅマウスは、ＣＯ２を用いて麻酔され、犠牲にされた。Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋／ｐｈｅｎｏｌ－ｒｅｄのない冷却されたＨａｎｋの均衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ、
Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）緩衝液５ｍＬで腹腔を洗浄した。腹膜洗浄液を４℃で１０分間３００×ｇで遠心分離した。ペレット化されたＰＥＣｓを再懸濁し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＴＣ２０自動細胞カウンター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて計数した。全ての細胞は、使用前に新たに分離された。如何なる実験においても、凍結保存された細胞を使用しなかった。その後、精製されたＰＥＣｓを、１０％子ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び０．０５ｍＭの２－β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から構成された完全培地で培養した。培養は、３７℃及び５％ＣＯ２で行われた。
Ｎａｉｖｅマウスは、ＣＯ２を用いて麻酔され、犠牲にされた。Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋／ｐｈｅｎｏｌ－ｒｅｄのない冷却されたＨａｎｋの均衡塩溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ、
Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）緩衝液５ｍＬで腹腔を洗浄した。腹膜洗浄液を４℃で１０分間３００×ｇで遠心分離した。ペレット化されたＰＥＣｓを再懸濁し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＴＣ２０自動細胞カウンター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて計数した。全ての細胞は、使用前に新たに分離された。如何なる実験においても、凍結保存された細胞を使用しなかった。その後、精製されたＰＥＣｓを、１０％子ウシ胎児血清（ＨｙＣｌｏｎｅ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び０．０５ｍＭの２－β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）１６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）から構成された完全培地で培養した。培養は、３７℃及び５％ＣＯ２で行われた。
【0066】
（５）ＰＢＭＣｓ分離及び細胞培養
ブタＰＢＭＣｓは、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（非特許文献２）によって誘導された方法に従って、上述した特定の時点（ｎ＝４又は６／群）にワクチン接種されたブタの全血から分離された。全血（２０ｍＬ／個体）は、ＢＤ Ｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒヘパリンチューブ（ＢＤ、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）から独立して収集された。ＰＢＭＣｓは、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）勾配遠心分離を用いてＰＢＭＣｓを分離した。残留赤血球は、塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で処理して溶解した。ＰＢＭＣをＣａ２＋及びＭｇ２＋のないＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁させ、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を補充し、体積フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計数した。全ての細胞は、使用前に新たに分離された。如何なる実験においても、凍結保存された細胞を使用しなかった。その後、精製されたＰＢＭＣを１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地に再懸濁した。
ブタＰＢＭＣｓは、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（非特許文献２）によって誘導された方法に従って、上述した特定の時点（ｎ＝４又は６／群）にワクチン接種されたブタの全血から分離された。全血（２０ｍＬ／個体）は、ＢＤ Ｖａｃｃｕｔａｉｎｅｒヘパリンチューブ（ＢＤ、Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）から独立して収集された。ＰＢＭＣｓは、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭ ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、ＵＳＡ）勾配遠心分離を用いてＰＢＭＣｓを分離した。残留赤血球は、塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で処理して溶解した。ＰＢＭＣをＣａ２＋及びＭｇ２＋のないＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁させ、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）を補充し、体積フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計数した。全ての細胞は、使用前に新たに分離された。如何なる実験においても、凍結保存された細胞を使用しなかった。その後、精製されたＰＢＭＣを１０％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ、ＵＳＡ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地に再懸濁した。
【0067】
ＰＢＭＣｓをＣａ２＋／Ｍｇ２＋のないＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）に懸濁し、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＴＣ２０自動細胞カウンター（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて計数した。すべての細胞は、使用前に新たに分離され、如何なる実験においても、凍結保存された細胞を使用しなかった。その後、精製されたＰＢＭＣｓを、１０％ ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、３ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１００Ｕ／ｍＬのペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）培地に再懸濁した。培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）は、３７℃及び５％ＣＯ２で行われた。
【0068】
（６）ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＥＣ及びＰＢＭＣに対する抗原誘導ＩＦＮγ ＥＬＩＳｐｏｔの分析
Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ抗原媒介ＩＦＮγ分泌は、製造業者のガイドラインに従って商業用ＥＬＩＳｐｏｔ分析キット（マウス及びブタ用カタログ番号ＥＬ４８５及びＥＬ９８５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を用いて分析された。分離されたマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＰＥＣｓ又はブタＰＢＭＣｓ（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を、マウス又はブタＩＦＮγに対して特異的なモノクローナル捕捉抗体を含有する９６ウェルＰＶＤＦ支持マイクロプレートで培養し、不活性化ＦＭＤＶ（Ｏ ＰＡ２、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ、Ａ２２、Ａ２２－Ｃ３ｄ）抗原を４μｇ
／ｍＬ（最終濃度）の各濃度で３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で１８時間刺激した。陰性対照群と陽性対照群として、それぞれＰＢＳと５μｇ／ｍＬのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗マウスＩＦＮγ抗体（１：１１９）又は抗ブタ抗体（１：１１９）と共に４℃で一晩培養した後、ＲＴでＡＰ接合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ストレプトアビジン（１：１１９）で２時間培養した。プレートを洗浄し、５－ブロモ－４－クロロ－３’インドリホスフェートｐ－トルイジン塩（ＢＣＩＰ）／塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）で現像し、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ＥＬＩＳｐｏｔリーダー（ＡＩＤ ｉＳｐｏｔリーダーシステム；Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ、Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計数した。結果は、スポット形成単位（ＳＦＵ）で表示された。
Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ抗原媒介ＩＦＮγ分泌は、製造業者のガイドラインに従って商業用ＥＬＩＳｐｏｔ分析キット（マウス及びブタ用カタログ番号ＥＬ４８５及びＥＬ９８５、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、ＵＳＡ）を用いて分析された。分離されたマウス（ｍｕｒｉｎｅ）ＰＥＣｓ又はブタＰＢＭＣｓ（５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）を、マウス又はブタＩＦＮγに対して特異的なモノクローナル捕捉抗体を含有する９６ウェルＰＶＤＦ支持マイクロプレートで培養し、不活性化ＦＭＤＶ（Ｏ ＰＡ２、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ、Ａ２２、Ａ２２－Ｃ３ｄ）抗原を４μｇ
／ｍＬ（最終濃度）の各濃度で３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター中で１８時間刺激した。陰性対照群と陽性対照群として、それぞれＰＢＳと５μｇ／ｍＬのホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用した。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗マウスＩＦＮγ抗体（１：１１９）又は抗ブタ抗体（１：１１９）と共に４℃で一晩培養した後、ＲＴでＡＰ接合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ストレプトアビジン（１：１１９）で２時間培養した。プレートを洗浄し、５－ブロモ－４－クロロ－３’インドリホスフェートｐ－トルイジン塩（ＢＣＩＰ）／塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）で現像し、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ ＥＬＩＳｐｏｔリーダー（ＡＩＤ ｉＳｐｏｔリーダーシステム；Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ ＧｍｂＨ、Ｓｔｒａｓｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計数した。結果は、スポット形成単位（ＳＦＵ）で表示された。
【0069】
（７）ＲＮＡ分離、ｃＤＮＡ合成、及び定量的リアルタイムＰＣＲ
精製されたブタＰＢＭＣで全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて抽出した。ｃＤＮＡは、製造業者のガイドラインに従ってＧｏＳｃｒｉｐｔ逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて逆転写することにより準備した。合成されたｃＤＮＡは、ｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＢｉｏ－Ｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒで定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって増幅された。
精製されたブタＰＢＭＣで全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔｓ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて抽出した。ｃＤＮＡは、製造業者のガイドラインに従ってＧｏＳｃｒｉｐｔ逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて逆転写することにより準備した。合成されたｃＤＮＡは、ｉＱ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてＢｉｏ－Ｒａｄ ｉＣｙｃｌｅｒで定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）によって増幅された。
【0070】
遺伝子発現レベルをｈｐｒｔレベルに正規化し、対照群と比較した相対的比率で提示した。本発明に使用されたプライマーのリストは、表１に記載した。
【0071】
ｑＲＴ－ＰＣＲ用プライマー配列表
【表1】
【0072】
７．統計
すべての定量的データは、特に明示されない限り、平均±標準誤差（ＳＥＭ）で表現された。群間の統計的有意性は、双方向ＡＮＯＶＡに続いてＴｕｋｅｙ事後検定、又は一元ＡＮＯＶＡに続いてＴｕｋｅｙ事後検定を用いて評価された。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。異なる群を比較するために、パラメータテストが使用された。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法を用いて生存曲線を作成し、ログランク和検定を用いて差異を分析した。全ての統計分析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９．１．２（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）ソフトウェア及びＩＢＭ ＳＰＳＳソフトウェア（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．、Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）が使用された。
すべての定量的データは、特に明示されない限り、平均±標準誤差（ＳＥＭ）で表現された。群間の統計的有意性は、双方向ＡＮＯＶＡに続いてＴｕｋｅｙ事後検定、又は一元ＡＮＯＶＡに続いてＴｕｋｅｙ事後検定を用いて評価された。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。異なる群を比較するために、パラメータテストが使用された。Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法を用いて生存曲線を作成し、ログランク和検定を用いて差異を分析した。全ての統計分析には、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ９．１．２（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）ソフトウェア及びＩＢＭ ＳＰＳＳソフトウェア（ＩＢＭ Ｃｏｒｐ．、Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ、ＵＳＡ）が使用された。
【0073】
＜実施例＞母体移行抗体干渉克服のための免疫増強口蹄疫ワクチン株の作製、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄを用いた不活化抗原の生産及び精製
母体移行抗体干渉克服用口蹄疫ワクチン株の開発のために、逆遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて既に開発されたＯ１ Ｍａｎｉｓａ－Ｏ ＰＡ２（Ｏ１ Ｍ－Ｏ ＰＡ２）及びＯ１ Ｍａｎｉｓａ－Ａ２２／Ｉｒａｑ／２４／６４（Ｏ１ Ｍ－Ａ２２）株のＰ１バックボーンを用いた。Ｏ型の場合、周辺の発生状況に対するワクチンマッチング率及びウイルスの浮遊細胞における増殖性、特に、実験動物（マウス）及び目的動物（ブタ）における抗原媒介－免疫原性を確認した先行研究結果に基づいて、Ｏ ＰＡ２が最も強力な候補ワクチン株として判断された一方、Ａ型の場合にも、世界的発生状況を見ると、マッチング率は概ね低い傾向を示してはいるが、その中でもＡ２２が適切なワクチン株として分類された。
母体移行抗体干渉克服用口蹄疫ワクチン株の開発のために、逆遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅ
ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて既に開発されたＯ１ Ｍａｎｉｓａ－Ｏ ＰＡ２（Ｏ１ Ｍ－Ｏ ＰＡ２）及びＯ１ Ｍａｎｉｓａ－Ａ２２／Ｉｒａｑ／２４／６４（Ｏ１ Ｍ－Ａ２２）株のＰ１バックボーンを用いた。Ｏ型の場合、周辺の発生状況に対するワクチンマッチング率及びウイルスの浮遊細胞における増殖性、特に、実験動物（マウス）及び目的動物（ブタ）における抗原媒介－免疫原性を確認した先行研究結果に基づいて、Ｏ ＰＡ２が最も強力な候補ワクチン株として判断された一方、Ａ型の場合にも、世界的発生状況を見ると、マッチング率は概ね低い傾向を示してはいるが、その中でもＡ２２が適切なワクチン株として分類された。
【0074】
本発明においてＢ細胞エピトープであるＣ３ｄの活性部位をＯ ＰＡ２及びＡ２２ Ｐ１バックボーンに挿入して、ＦＭＤＶ Ｏ型及びＦＭＤＶ Ａ型の母体移行抗体干渉克服用口蹄疫ワクチン株の作製戦略は、図１ａ、図１ｂに示す通りであり、詳細な方法は、材料及び方法に記述した。
【0075】
＜実験例１＞母体移行抗体干渉克服用免疫増強口蹄疫ワクチン株、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ抗原を含むＦＭＤワクチンのマウスにおける免疫原性の評価
Ｂ細胞の活性化のために、Ｂ細胞エピトープであるＣ３ｄが挿入されたＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ、Ｏ ＰＡ２及びＡ２２から分離・精製した抗原のマウスにおける免疫原性の確認、口蹄疫ワクチンマスターシードウイルス（ｍａｓｅｒ ｓｅｅｄ ｖｉｒｕｓ、ＭＳＶ）としての可能性、及びＦＭＤＶ感染に対する防御効果を評価するために、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄは、それぞれ図４ａの（Ａ）及び図４ｂの（Ｄ）のような戦略で実験を行った。Ｏ ＰＡ２及びＡ２２は、図２ａの（Ａ）、図２ｂの（Ｄ）のような戦略で実験を行った。実験に使用されたワクチンの組成は、次の通りである；Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ又はＡ２２－Ｃ３ｄ抗原、Ｏ ＰＡ２又はＡ２２抗原（１５μｇ／ｄｏｓｅ／ｍＬ、１／１０～１／６４０ｄｏｓｅ）、ＩＳＡ２０６（５０％、ｗ／ｗ）、１０％ Ａｌ（ＯＨ）３、１５μｇ Ｑｕｉｌ－Ａ／ｍｏｕｓｅ。
Ｂ細胞の活性化のために、Ｂ細胞エピトープであるＣ３ｄが挿入されたＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ、Ｏ ＰＡ２及びＡ２２から分離・精製した抗原のマウスにおける免疫原性の確認、口蹄疫ワクチンマスターシードウイルス（ｍａｓｅｒ ｓｅｅｄ ｖｉｒｕｓ、ＭＳＶ）としての可能性、及びＦＭＤＶ感染に対する防御効果を評価するために、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄは、それぞれ図４ａの（Ａ）及び図４ｂの（Ｄ）のような戦略で実験を行った。Ｏ ＰＡ２及びＡ２２は、図２ａの（Ａ）、図２ｂの（Ｄ）のような戦略で実験を行った。実験に使用されたワクチンの組成は、次の通りである；Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ又はＡ２２－Ｃ３ｄ抗原、Ｏ ＰＡ２又はＡ２２抗原（１５μｇ／ｄｏｓｅ／ｍＬ、１／１０～１／６４０ｄｏｓｅ）、ＩＳＡ２０６（５０％、ｗ／ｗ）、１０％ Ａｌ（ＯＨ）３、１５μｇ Ｑｕｉｌ－Ａ／ｍｏｕｓｅ。
【0076】
マウスは、０ｄｐｖ（ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）にＩ．Ｍ．（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ、筋肉内接種）でワクチン接種した後、７日目（ｄｐｖ）、ＦＭＤＶ Ｏ型（１００ ＬＤ５０、Ｏ／ＶＥＴ／２０１３、ＭＥ－ＳＡｔｏｐｏｔｙｐｅ）又はＦＭＤＶ Ａ型（１００ＬＤ５０、Ａ／Ｍａｌａｙ／９７、ＳＥＡトポタイプ）をマウス腹腔内に投与して７日後（ｄｐｃ）まで生存率（図４ａの（Ｂ）、（Ｃ））と体重変化（図４ｂの（Ｅ）、（Ｆ））をモニタリングした。
【0077】
実験の結果、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ抗原を含む試験ワクチンは、マウスに接種すると、９７．０１ ＰＤ５０（Ｌｏｇ４）であって、１／１０、１／４０、１／１６０ｄｏｓｅでは１００％、１／６４０ｄｏｓｅでは８０％の生存率を示し、体重減少も１／１０、１／
４０、１／１６０ｄｏｓｅで殆ど観察されなかった（図４ａの（Ｂ）、（Ｃ））。また、Ａ２２－Ｃ３ｄから分離・精製した抗原を用いた試験ワクチンは、マウスに接種すると、７３．５２ ＰＤ５０（Ｌｏｇ４）であって、１／１０、１／４０、１／１６０ｄｏｓｅで１００％の生存率を示し、１／６４０ｄｏｓｅでは６０％の生存率を示した。体重減少においても、１／１０、１／４０、１／１６０ｄｏｓｅでは、体重変化が殆ど観察されなかった（図４ｂの（Ｅ）、（Ｆ））。
４０、１／１６０ｄｏｓｅで殆ど観察されなかった（図４ａの（Ｂ）、（Ｃ））。また、Ａ２２－Ｃ３ｄから分離・精製した抗原を用いた試験ワクチンは、マウスに接種すると、７３．５２ ＰＤ５０（Ｌｏｇ４）であって、１／１０、１／４０、１／１６０ｄｏｓｅで１００％の生存率を示し、１／６４０ｄｏｓｅでは６０％の生存率を示した。体重減少においても、１／１０、１／４０、１／１６０ｄｏｓｅでは、体重変化が殆ど観察されなかった（図４ｂの（Ｅ）、（Ｆ））。
【0078】
【0079】
Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原を含有するワクチンは、１／１０、１／４０及び１／１６０用量に対して１００％の生存率を示し、７３．５２ ＰＤ５０（Ｌｏｇ４）であって、１／６４０用量に対して６０％の生存率を示した。１／１０、１／４０及び１／１６０用量に対する体重変化はなかった。
【0080】
【0081】
ＰＤ５０試験は、ブタで２価研究ワクチン（Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原含有、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄとＡ２２－Ｃ３ｄの併用投与）の免疫原性を確認するために行われた。結果は、免疫増強ワクチン菌株のバックボーンとして使用された研究ワクチン（Ｏ ＰＡ２＋Ａ２２抗原を含む、Ｏ ＰＡ２とＡ２２の併用投与）を投与された群の結果と比較した（図５及び図３）。
【0082】
図５の（Ａ）及び図３の（Ａ）に示す実験戦略で、マウスにおけるワクチン接種は０ｄｐｖにＩ．Ｍ．で投与され、ＦＭＤＶ（Ｏ／ＶＥＴ／２０１３の１００ ＬＤ５０、ＭＥ－ＳＡトポタイプ又はＡ／Ｍａｌａｙ／９７の１００ ＬＤ５０、ＳＥＡトポタイプ）は、７ｄｐｖにＩ．Ｐ．でチャレンジされた。生存率と体重変化は、０ｄｐｃ（０ ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）から７ｄｐｃまでモニタリングした。
【0083】
Ｏ ＰＡ２＋Ａ２２抗原を含む２価ワクチンは、マウスでＯ／ＶＥＴ／２０１３及びＡ／Ｍａｌａｙ／９７にてそれぞれ攻撃したとき、ＰＤ５０（Ｌｏｇ４）値が５．６６及び４であった（図３の（Ｂ）、図３の（Ｄ））。
【0084】
Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原を含む２価ワクチンは、それぞれＯ／ＶＥＴ／２０１３及びＡ／Ｍａｌａｙ／９７でそれぞれ接種したとき、ＰＤ５０（Ｌｏｇ４）値が９０．５及び＞１２８ ＰＤ５０（Ｌｏｇ４）であって、高い免疫原性を示した（図５の（Ｂ）、図５の（Ｄ））。
【0085】
＜実験例２＞母体移行抗体干渉克服用免疫増強口蹄疫ワクチン株、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ抗原を含むＦＭＤワクチンの目的動物（ブタ）における免疫効果（初期、中期、長期）の評価
目的動物であるブタで母体移行抗体干渉克服のために作製した免疫増強口蹄疫ワクチン株であるＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄとＡ２２－Ｃ３ｄから分離・精製した抗原の免疫原性を評価し、適応性免疫反応誘導効果及び母体移行抗体干渉回避克服効果を観察するために、母体移行抗体陽性（ＭＤＡ（＋）、ＦＭＤ－ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）、陰性（ＭＤＡ（－）、ＦＭＤ－ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ）－野外ブタを用いて実験を行った（図６ａ）。
目的動物であるブタで母体移行抗体干渉克服のために作製した免疫増強口蹄疫ワクチン株であるＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄとＡ２２－Ｃ３ｄから分離・精製した抗原の免疫原性を評価し、適応性免疫反応誘導効果及び母体移行抗体干渉回避克服効果を観察するために、母体移行抗体陽性（ＭＤＡ（＋）、ＦＭＤ－ｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅ）、陰性（ＭＤＡ（－）、ＦＭＤ－ｓｅｒｏｎｅｇａｔｉｖｅ）－野外ブタを用いて実験を行った（図６ａ）。
【0086】
その結果、母体移行抗体干渉克服効果を確認するために、ＭＤＡ（＋）群のブタにＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原を用いた試験ワクチンを投与するとき、１４ｄｐｖからＳＰ Ｏ ＥＬＩＳＡによる抗体価がＯ ＰＡ２＋Ａ２２抗原を含む試験ワクチンを接種したＰＣ群に比べて有意に増加し（ｐ＜０．００１、ＰｒｉｏＣｈｅｃｋＴＭキット、ＶＤＰｒｏ（登録商標）キット）、２８ｄｐｖにもｐ＜０．０５（ＰｒｉｏＣｈｅｃｋＴＭｋｉｔ）、ｐ＜０．０１（ＶＤＰｒｏ（登録商標）キット）の有意性を示した（図６ｂの（Ａ）、（Ｂ））。特に、２８ｄｐｖに２次試験ワクチンを接種（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）した後、実験群で抗体価が非常に高かったが、これに対し、ＮＣ群の場合は、母体移行抗体が持続的に減少する傾向を示した。５６、７０、８４ｄｐｖにおける２群間の抗体価は、ｐ＜０．０００１又はｐ＜０．００１レベルの差を示した。また、ＭＤＡ（＋）群でＳＰ Ａ ＥＬＩＳＡの場合、４２ｄｐｖにおける実験群の抗体価がＰＣ群に比べて高いことが分かり（ｐ＜０．００１、ＰｒｉｏＣｈｅｃｋＴＭキット）、５６、７０、８４ｄｐｖにおける実験群とＮＣ群間の有意性差は、それぞれｐ＜０．５、ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１（ＰｒｉｏＣｈｅｃｋ（登録商標）キット）、ｐ＜０．０００１（ＶＤＰｒｏ（登録商標）キット）のレベルで観察された（図６ｂの（Ｃ）、（Ｄ））。
【0087】
一方、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原を含む試験ワクチンの目的動物（ブタ）における免疫原性、及び初期、中期、長期免疫誘導を確認するために、ＭＤＡ（－）群へのワクチン投与の際に、ＳＰ Ｏ ＥＬＩＳＡによる抗体価が７ｄｐｖ（ＰｒｉｏＣｈｅｃｋＴＭキット）、１４ｄｐｖ（ＶＤＰｒｏ（登録商標）キット）にｐ＜０．０５のレベルでＮＣ群に比べて有意に増加し、２８ｄｐｖから８４ｄｐｖまでＮＣ群と比較して有意性を示した（ｐ＜０．０００１）（図６ｂの（Ｅ）、（Ｆ））。ＭＤＡ（－）群における各群別ＳＰ Ａ ＥＬＩＳＡによる抗体価も、ＳＰ Ｏ ＥＬＩＳＡにおける結果と同様に、実験群とＮＣ群の間で７ｄｐｖ（ＰｒｉｏＣｈｅｃｋＴＭキット）、１４ｄｐｖ（ＶＤＰｒｏ（登録商標）キット）で有意な差を示し（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５）、２８～８４ｄｐｖにそれぞれ実験群がＮＣ群に比べて抗体価がさらに高いことが分かった（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５）。また、実験群における抗体価は、ＰＣ群における抗体価に比べて持続的にさらに高かった。２群間の有意性は、１４、８４ｄｐｖにｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５（ＶＤＰｒｏ（登録商標）キット）のレベルで観察された（図６ｂの（Ｇ）、（Ｈ））。
【0088】
ワクチンの接種前（０ｄｐｖ）、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）群におけるＯ１ Ｃａｍｐｏｓ、Ａ２００１ Ａｒｇｅｎｔｉｎａ、Ａ２４ Ｃｒｕｚｅｉｒｏに対する中和抗体価は、図７のＡの通りである。ＭＤＡ（＋）群では全て＞１．６ Ｌｏｇ１０のレベルを示し、ＭＤＡ（－）群では＜１．２ Ｌｏｇ１０のレベルを示した。ＰＣ群で抗原として使用したバックボーンウイルスであるＯ ＰＡ２、Ａ２２に対する相同性ウイルス（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｖｉｒｕｓ）を用いて中和抗体価を確認した（図７の（Ｂ）、（Ｃ））。ＭＤＡ（＋）群の場合、０ｄｐｖに、ＳＰ Ｏ、Ａ ＥＬＩＳＡによる抗体価は高い数値を示したが、Ｏ ＰＡ２、Ａ２２に対する中和抗体価は防御レベル以下に低く示された（図７の（Ｂ））。これは、母体移行抗体が高い（ＭＤＡ（＋））子ブタの母ブタがＢ社のワクチンを接種したため、Ｏ ＰＡ２及びＡ２２などの異種ウイルス（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｖｉｒｕｓ）に対して低い抗体価を示したと判断される。
【0089】
ＭＤＡ（－）群の場合、Ｏ ＰＡ２に対する中和抗体価（図７の（Ｃ））は、７ｄｐｖからＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原を含む試験ワクチンを投与した実験群でＮＣ群とＰＣ群に比べて有意に高く示されており（ｐ＜０．０５）、１４、２８ｄｐｖまで持続的に増加し（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５）、２８ｄｐｖにブースト（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）の後、４２～８４ｄｐｖにＮＣ群に比べて高く増加した（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５）。また、ブーストの後にも、実験群でＰＣ群に比べて中和抗体価が高く示されたが、２群間の有意性は、４２、８４ｄｐｖに観察され
た（ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１）。
た（ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１）。
【0090】
ＭＤＡ（＋）群とＭＤＡ（－）群におけるＡ２２に対する中和抗体価（図７の（Ｄ）、（Ｅ））は、２８ｄｐｖに実験群でＮＣ群とＰＣ群に比べて高く示されており（ｐ＜０．０１）、ブースト後、４２～８４ｄｐｖにＮＣ群に比べて高いレベルに増加した（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１）。実験群とＰＣ群との差は、４２～８４ｄｐｖに有意性が観察された（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１）。
【0091】
＜実験例３＞母体移行抗体干渉克服用免疫増強口蹄疫ワクチン株、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ抗原を含むＦＭＤワクチンのブタにおける細胞性免疫反応誘導の評価
３－１．図６ａに示すように、目的動物であるブタにＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ抗原を含む試験ワクチンを接種した後、各サンプリング時間別、全血からＰＢＭＣｓを分離して、ｑＲＴ－ＰＣＲを介して細胞性免疫反応の誘導に関連したサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２３ｐ１９、ＩＬ－２３Ｒ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ、ＩＬ－４、ＩＬ－６）及び共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ２１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＡＨＮＡＫ）などの遺伝子の発現変化を観察した（図８ａ～図８ｃ）。
３－１．図６ａに示すように、目的動物であるブタにＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ抗原を含む試験ワクチンを接種した後、各サンプリング時間別、全血からＰＢＭＣｓを分離して、ｑＲＴ－ＰＣＲを介して細胞性免疫反応の誘導に関連したサイトカイン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２３ｐ１９、ＩＬ－２３Ｒ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＴＧＦβ、ＩＬ－４、ＩＬ－６）及び共刺激分子（ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスII、ＣＤ２１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳ、ＡＨＮＡＫ）などの遺伝子の発現変化を観察した（図８ａ～図８ｃ）。
【0092】
その結果、炎症性サイトカイン（Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）遺伝子の発現が全体的に非常に高く観察された。特に、タイプＩ ＩＦＮであるＩＦＮα及びＩＦＮβの発現は、７ｄｐｖにＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）条件の個体で実験群がＮＣ群に比べてｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１レベルの非常に高い増加を示した。一方、ＰＣ群ｖｓＮＣ群間の差異は、ＩＦＮαの場合にはＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）条件の両方でＰＣ群がＮＣ群に比べて高く示されたが（ｐ＜０．０１）、ＩＦＮβの場合にはＭＤＡ（＋）条件でのみＮＣ群に比べて有意な増加を示した（ｐ＜０．０１）。ＩＦＮγの発現レベルは、ＩＦＮαとＩＦＮβの発現に比べて多少低かったが、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）条件の両方において実験群がＮＣ群に比べて有意に高かった（ｐ＜０．０５）。
【0093】
ＩＬ－１βは、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）条件で実験群がＮＣ群に比べて著しく高い発現を示し（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１）、特に、ＰＣ群と比較して実験群でｐ＜０．０００１レベルの有意な差を示した。ＩＬ－１７Ａは、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）条件で実験群がＮＣ群に比べて非常に高い発現量を示し（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．０１）、ＭＤＡ（＋）状態でＰＣ群とＮＣ群間の有意性が観察された（ｐ＜０．０１）。ＩＬ－２３ｐ１９の発現も、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）条件で実験群がＮＣ群に比べて著しく高く示され（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１）、特に、ＭＤＡ（－）条件で実験群とＰＣ群間の有意な差を示した（ｐ＜０．０５）。ＩＬ－２３Ｒの発現も、他のサイトカイン発現と同様に非常に高く示され、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）条件の両方で実験群ｖｓＮＣ群間の有意な差を示した（ｐ＜０．０５）。ＩＬ－４、ＩＬ－６の場合、ＭＤＡ（＋）条件ではＭＤＡ（－）条件に比べて発現量が高く、ＭＤＡ（＋）条件で実験群ｖｓＮＣ群間の有意性はｐ＜０．０１、ＩＬ－４、ＩＬ－６に対するＰＣ群ｖｓＮＣ群間の有意性はそれぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．０１であった。ＭＤＡ（－）条件では、ＩＬ－４における実験群ｖｓＮＣ群の有意差がｐ＜０．０５と観察された。一方、抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０の場合、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）条件で実験群がＮＣ群に比べて高い発現を示した（ｐ＜０．０５）。ＩＬ－２、ＴＧＦβの場合、実験群＞ＰＣ群＞ＮＣ群の順に発現量が高く示されたが、各群間の有意性は観察されなかった。
【0094】
共刺激分子の発現量は、全般的にサイトカインの発現量に比べては多少低かったが、実験群でＰＣ群又はＮＣ群に比べて有意に発現量が増加することを確認した。ＣＤ８０、Ｃ
Ｄ２１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳの発現は、ＭＤＡ（＋）条件に比べてＭＤＡ（－）条件でワクチン投与時に増加する傾向を示し、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）条件で実験群ｖｓＮＣ群間の比較において有意性を示し（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５）、ＰＣ群ｖｓＮＣ群間の有意性は、ＩＣＯＳを除いた残りの遺伝子の発現に対してｐ＜０．０１、ｐ＜０．０１のレベルと観察された。これらのうち、ＣＤ８０、ＣＤ２１及びＣＤ２８は、試験ワクチン投与によって非常に高い遺伝子発現変化を示した。ＩＣＯＳの場合、実験群ｖｓＰＣ群間の有意性がＭＤＡ（＋）条件でｐ＜０．０１、ＭＤＡ（－）条件でｐ＜０．０００１であって、Ｃ３ｄが挿入された菌株でバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）株に比べて高い遺伝子発現を示した。
Ｄ２１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、ＩＣＯＳの発現は、ＭＤＡ（＋）条件に比べてＭＤＡ（－）条件でワクチン投与時に増加する傾向を示し、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）条件で実験群ｖｓＮＣ群間の比較において有意性を示し（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５）、ＰＣ群ｖｓＮＣ群間の有意性は、ＩＣＯＳを除いた残りの遺伝子の発現に対してｐ＜０．０１、ｐ＜０．０１のレベルと観察された。これらのうち、ＣＤ８０、ＣＤ２１及びＣＤ２８は、試験ワクチン投与によって非常に高い遺伝子発現変化を示した。ＩＣＯＳの場合、実験群ｖｓＰＣ群間の有意性がＭＤＡ（＋）条件でｐ＜０．０１、ＭＤＡ（－）条件でｐ＜０．０００１であって、Ｃ３ｄが挿入された菌株でバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）株に比べて高い遺伝子発現を示した。
【0095】
ＣＤ８６、ＡＨＮＡＫの場合、ＭＤＡ（－）条件で実験群とＮＣ群間の有意性が観察され（ｐ＜０．０００１、ｐ＜０．００１）、特に、ＣＤ８６は、実験群ｖｓＰＣ群（ｐ＜０．０００１）間の顕著な有意性が観察された。一方、ＭＨＣクラスＩは、ＭＤＡ（＋）条件に比べてＭＤＡ（－）条件で遺伝子の発現が減少し、ＣＤ４０、ＭＨＣクラスIIは、各群間の有意性は観察されなかった。
【0096】
３－２．ブタでＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡなどの免疫グロブリン亜型で測定した本発明による免疫増強口蹄疫ウイルスＯ型及びＡ型（Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ）によって媒介される体液性免疫反応は、以下のとおりである。
【0097】
ＦＭＤ抗体－陽性（ＭＤＡ（＋）、ｎ＝１６）又はＦＭＤ抗体－陰性（ＭＤＡ（－）、ｎ＝１６）であるブタ（８～９週齢）動物をそれぞれ３つの群に分けた。陰性対照群（ＮＣ、ｎ＝４／群）、陽性対照群（ＰＣ、ｎ＝６／群）及び実験群（Ｅｘｐ．、ｎ＝６／群）。
【0098】
実験群には、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原とＩＳＡ ２０６（オイルベースのエマルジョン、５０％、ｗ／ｗ）、１０％Ａｌ（ＯＨ）３及び１５０μｇ Ｑｕｉｌ－Ａが含まれた１５μｇ（ウシ及びブタ用１回用量）含有テストワクチンが投与された。陽性対照群（ＰＣ）は、Ｏ ＰＡ２＋Ａ２２抗原とＩＳＡ ２０６（オイルベースのエマルジョン、５０％、ｗ／ｗ）、１０％Ａｌ（ＯＨ）３、及び１５０μｇ Ｑｕｉｌ－Ａが含まれた１５μｇ（ウシ及びブタ用の１回用量）を投与された。陰性対照群（ＮＣ）には、同体積のＰＢＳを注入した。ワクチン接種は、２８日間隔で２回行われた。動物の首に深い筋肉内経路を介して１ｍＬのワクチン（１回用量）を注入した。血清学的検定のために、ブタへのワクチン接種後０、７、１４、２８、４２、５６、７０及び８４日に血液サンプルを収集した。実験結果は、図８ｄに示した。
【0099】
図８ｄにおいて、（ａ）ＩｇＧ濃度、（ｂ）ＩｇＭ濃度、（ｃ）ＩｇＡ濃度を示す。データは、三重測定の平均±ＳＥＭを示す（ｎ＝４又は６／群）。統計的分析は、双方向ＡＮＯＶＡに続いてＴｕｋｅｙのテストを用いて行われた。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【0100】
実験の結果、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄとＡ２２－Ｃ３ｄは、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）動物でＳＰ特異的抗体価（ＳＰ ＥＬＩＳＡを介して）だけでなく、ＩｇＧ（中和抗体の指標）、ＩｇＭ（病原体感染又はワクチン接種中に誘導された最初の天然抗体）及びＩｇＡ（粘膜免疫を誘導する核心要素）レベルを含むＳＰ非特異的抗体においても効果的に誘導された。母体ＩｇＧ及びＩｇＡは、初期幼児期（ｉｎｆａｎｃｙ）に粘膜補助細胞反応を弱化させることができ、母体ＩｇＧ調節Ｔ細胞エピトープは、免疫原性よりは免疫寛容を誘導する。上記の結果に基づいて、免疫増強組換え口蹄疫ワクチン菌株であるＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄは、ＭＤＡ（＋）動物においてＭＤＡ干渉媒介免疫耐性を克服することにより、宿主における活性免疫を効果的に誘導することができるとともに、Ｍ
ＤＡ（－）動物又は２～３ヶ月齢（現在のワクチンプログラムに従ってＭＤＡ力価がさらに低い期間）の動物においてワクチンを接種するとき、強力な細胞及び体液性免疫反応を誘導することができる。このような結果は、抗原に対するＣ３ｄスパイク（抗原の表面へのＣ３ｄの挿入）がＢ細胞表面受容体を持続的に刺激してＢ細胞を直接活性化させ、免疫原性の高いＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ抗原が強力なＴ細胞媒介免疫反応を提供して、より効率的な高力価抗体及び中和抗体を生成することを示唆する（図８ｄ）。
ＤＡ（－）動物又は２～３ヶ月齢（現在のワクチンプログラムに従ってＭＤＡ力価がさらに低い期間）の動物においてワクチンを接種するとき、強力な細胞及び体液性免疫反応を誘導することができる。このような結果は、抗原に対するＣ３ｄスパイク（抗原の表面へのＣ３ｄの挿入）がＢ細胞表面受容体を持続的に刺激してＢ細胞を直接活性化させ、免疫原性の高いＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄ抗原が強力なＴ細胞媒介免疫反応を提供して、より効率的な高力価抗体及び中和抗体を生成することを示唆する（図８ｄ）。
【0101】
以上の結果から、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄとＡ２２－Ｃ３ｄは、免疫増強口蹄疫ワクチン株であって抗原自体の免疫原性に優れ、短期免疫誘導と宿主初期防御において重要な役割を果たすと判断された。また、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ抗原＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原を含む２価試験ワクチンは、目的動物へのワクチン接種の際に、初期に強力な細胞性免疫反応及び体液性免疫反応の同時誘導によって母体移行抗体干渉の克服にさらに効果的であると期待される。
【0102】
＜実験例４＞ブタにおける母体移行抗体干渉の克服及び細胞性免疫反応と体液性免疫反応の同時誘導効果の評価
ブタにおける母体移動抗体干渉の克服、及び細胞性免疫反応と体液性免疫反応の同時誘導効果を評価するために、ＭＤＡ（＋）－又はＭＤＡ（－）－ブタを用いて実験を行った（図６ａ）。ＭＤＡ（＋）－個体において、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄは、特にＳＰ Ｏ ＥＬＩＳＡによる抗体価において、強力な母体移動抗体克服効果を示し、ＳＰ Ａ ＥＬＩＳＡによる抗体価の場合、抗体価自体はワクチン接種の初期にやや減少し、ブースト後には増加する傾向を示した。これは、ＦＭＤＶ Ａ型抗原の特性上、ＳＰ部位がＳＰ Ａ ＥＬＩＳＡプレートにコートされた抗原とは異なるため、検出自体が低く示されてＰＩ（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）値に影響を及ぼすと判断され、より正確な評価のためにＶＮ力価を介して母体移行抗体干渉の克服が可能であるかに対する検討が必要であると考えられた。
ブタにおける母体移動抗体干渉の克服、及び細胞性免疫反応と体液性免疫反応の同時誘導効果を評価するために、ＭＤＡ（＋）－又はＭＤＡ（－）－ブタを用いて実験を行った（図６ａ）。ＭＤＡ（＋）－個体において、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄは、特にＳＰ Ｏ ＥＬＩＳＡによる抗体価において、強力な母体移動抗体克服効果を示し、ＳＰ Ａ ＥＬＩＳＡによる抗体価の場合、抗体価自体はワクチン接種の初期にやや減少し、ブースト後には増加する傾向を示した。これは、ＦＭＤＶ Ａ型抗原の特性上、ＳＰ部位がＳＰ Ａ ＥＬＩＳＡプレートにコートされた抗原とは異なるため、検出自体が低く示されてＰＩ（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）値に影響を及ぼすと判断され、より正確な評価のためにＶＮ力価を介して母体移行抗体干渉の克服が可能であるかに対する検討が必要であると考えられた。
【0103】
これに対し、ＭＤＡ（－）－個体において、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄは、ＳＰ Ｏ ＥＬＩＳＡ、ＳＰ Ａ ＥＬＩＳＡによる強力な抗体価の増加を誘導したとともに、バックボーンとして用いたＯ ＰＡ２＋Ａ２２に比べて抗体価誘導能が有意に高かった（図８ｂ）。
【0104】
また、実際のウイルス中和効果を確認するために、Ｏ ＰＡ２、Ａ２２に対するＶＮ力価を確認した。該当個体は、Ｂ社（会社の権益保護及び紛争抑制のために使用したワクチンの出所は記載しない）ワクチンを接種したので、母体移行抗体の有無を確認するために、ワクチン接種前、０ｄｐｖに血清を用いてＯ１ Ｃａｍｐｏｓ、Ａ２００１ Ａｒｇｅｎｔｉｎａ、Ａ２４ Ｃｒｕｚｅｉｒｏに対するＶＮ ｔｉｔｅｒを確認した。その結果、ＭＤＡ（＋）群及びＭＤＡ（－）群に対するＶＮ力価は、それぞれ陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）及び陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）に正確に区分されており、これらの動物を用いてそれぞれの群に対するワクチン接種を行った。
【0105】
０～８４ｄｐｖのそれぞれの採血時間別血清を用いてＯ ＰＡ２、Ａ２２に対するＶＮ
ｔｉｔｅｒｓを確認した結果、母ブタが接種したワクチン内のワクチン株抗原と、本発明で接種したワクチン内の抗原とが互いに異なるため、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）群を問わず、Ｏ ＰＡ２、Ａ２２に対するＶＮ ｔｉｔｅｒｓは、初期（０ｄｐｖ）に防御レベル以下である＜１．２ Ｌｏｇ１０を示し、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄの２価試験ワクチンの投与によって母体移動抗体陽性／陰性群においていずれもＯ ＰＡ２＋Ａ２２ ２価試験ワクチンの投与時にさらに有意に高いＶＮ力価を示した（図７）。
ｔｉｔｅｒｓを確認した結果、母ブタが接種したワクチン内のワクチン株抗原と、本発明で接種したワクチン内の抗原とが互いに異なるため、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）群を問わず、Ｏ ＰＡ２、Ａ２２に対するＶＮ ｔｉｔｅｒｓは、初期（０ｄｐｖ）に防御レベル以下である＜１．２ Ｌｏｇ１０を示し、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄの２価試験ワクチンの投与によって母体移動抗体陽性／陰性群においていずれもＯ ＰＡ２＋Ａ２２ ２価試験ワクチンの投与時にさらに有意に高いＶＮ力価を示した（図７）。
【0106】
以上の結果から、母体移行抗体干渉克服のために開発された免疫増強口蹄疫ワクチン株
であるＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄとＡ２２－Ｃ３ｄは、母体移行抗体の存在時にも免疫寛容などの干渉現象を克服して宿主内で効果的に能動免疫を誘導することができると判断される。また、現在用いられているワクチンプログラムに従って母体移行抗体が減少する時期である８～１２週齢の目的動物（ブタ）への接種時にも、強力な体液性免疫反応の誘導が可能であると判断される。これは、抗原にスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）されているＣ３ｄがＢ細胞表面受容体を持続的に刺激してＢ細胞を直接活性化させる一方、免疫原性の高いＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ抗原とＡ２２－Ｃ３ｄ抗原が強力なＴ細胞媒介細胞性免疫反応を誘導することにより、より効率的な高力価抗体及び中和抗体価の生産が可能であるためと判断される。
であるＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄとＡ２２－Ｃ３ｄは、母体移行抗体の存在時にも免疫寛容などの干渉現象を克服して宿主内で効果的に能動免疫を誘導することができると判断される。また、現在用いられているワクチンプログラムに従って母体移行抗体が減少する時期である８～１２週齢の目的動物（ブタ）への接種時にも、強力な体液性免疫反応の誘導が可能であると判断される。これは、抗原にスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）されているＣ３ｄがＢ細胞表面受容体を持続的に刺激してＢ細胞を直接活性化させる一方、免疫原性の高いＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ抗原とＡ２２－Ｃ３ｄ抗原が強力なＴ細胞媒介細胞性免疫反応を誘導することにより、より効率的な高力価抗体及び中和抗体価の生産が可能であるためと判断される。
【0107】
これを証明するために、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）ブタにおけるＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原を含有する２価試験ワクチン媒介細胞性免疫反応を確認した。陽性対照群（ＰＣ）の場合には、バックボーン株（ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓｔｒａｉｎ）であるＯ ＰＡ２＋Ａ２２抗原を含有する２価試験ワクチンを投与され、陰性対照群（ＮＣ）の場合には、ＰＢＳを投与された。Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原を含む試験ワクチンは、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）条件の両方でワクチン接種初期（７ｄｐｖ）に抗ウイルス効果を有するタイプＩ ＩＦＮの発現を非常に高いレベルに増加させることが確認され、ＦＭＤＶ感染に対してワクチン接種の初期に宿主を効果的に防御することができると期待された。Ｔヘルパー（Ｔｈ）１細胞関連サイトカインであるＩＦＮγの場合、ＩＦＮα、ＩＦＮβに比べては発現量が低いが、＞２ ｆｏｌｄ－ｃｈａｎｇｅ以上の有意な発現を示すため（ｐ＜０．０５）、Ｔ細胞媒介細胞性免疫反応を効果的に誘導すると判断された。インフラマソーム（Ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）の活性に関与するＩＬ－１βとＴｈ１７細胞、非伝統的な（ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）Ｔ細胞（γδＴ細胞）由来ＩＬ－１７Ａの発現も、Ｃ３ｄが挿入されたワクチン株から分離、精製した抗原を投与した実験群で非常に高かった。先行研究を通じて、ＩＬ－２３ｐ１９とＩＬ－２３Ｒの発現が宿主の初期防御において非常に重要であることが明らかになったが、本発明においても、これらの発現は、初期に「サイトカインストーム」レベルを示し、その後に正常化されることが分かった。
【0108】
樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ、ＤＣｓ）、マクロファージ（ＭΦｓ）などの先天性免疫細胞において病原体認識受容体（ＰＲＲｓ）の刺激を介して、ＩＬ－２３Ａが分泌されると先天性様（ｉｎｎａｔｅ－ｌｉｋｅ）免疫細胞である非伝統的なＴ細胞表面のＩＬ－２３Ｒに結合して細胞を刺激し、ＩＬ－１７Ａを生産する。生産されたＩＬ－１７Ａは、病原体の感染部位に好中球を募集してＮＥＴ（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｐ）を形成して病原体をＮＥＴｏｓｉｓさせることにより、宿主の初期防御に決定的な役割を果たす。
【0109】
また、ＩＬ－２３／ＩＬ－１７Ａ ａｘｉｓは、先天性免疫と適応性免疫とを連結（ｌｉｎｋ）することが知られており、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原を含む試験ワクチンがこのような炎症性サイトカインの分泌を介して先天性免疫反応と適応性免疫反応を同時に誘導すると考えられる。
【0110】
ＣＤ４＋ＴｈサブセットとＣＤ４＋Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇｓ）の分化及び生存において中心的な役割を果たし、記憶細胞の生成に必須的なＴ細胞成長因子であるＩＬ－２とＴｒｅｇｓの発達とＤＣｓにおいて免疫学的耐性（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）の誘導に関与することが知られているＴＧＦβの場合、実験群でやや高かったが、各群間の有意性は観察されなかった。抗炎症性サイトカインであるＩＬ－１０の発現も、実験群で有意に増加したが（ｐ＜０．０５）、これは、炎症性サイトカインの「サイトカインストーム」を調節するための宿主の恒常性によるものと推測される。Ｔｈ２細胞由来のサイトカインであるＩＬ－４、ＩＬ－６の発現は、ＭＤＡ（＋）群がＭＤＡ（－
）群に比べて高いため、母体移行抗体による受動免疫の存在の際にこれらのサイトカイン発現レベルが増加すると判断された。
）群に比べて高いため、母体移行抗体による受動免疫の存在の際にこれらのサイトカイン発現レベルが増加すると判断された。
【0111】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナルと協力してＴ細胞の活性化を促進するＣＤ８０及びＣＤ８６共刺激シグナル伝達は、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ投与群で増加し、これらの免疫増強口蹄疫ワクチン株が抗原を効果的にＴ細胞に提示してＴ細胞を効果的に刺激することができると判断される。
【0112】
ＭＨＣクラスＩの場合、ＭＤＡ（＋）群ではＭＤＡ（－）群に比べて遺伝子発現が高く、ワクチン接種群ではむしろＮＣ群に比べてさらに低かったが、受動免疫の存在時に遺伝子の発現が低いため、ワクチン接種初期にｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原の認識が阻害される。これに対し、ＭＨＣクラスIIは、ＭＤＡ（＋）群に比べてＭＤＡ（－）群で高い発現を示し、群間の有意性はなかったが、実験群で増加する傾向を示した。これから、Ｃ３ｄ挿入免疫増強ワクチン株の抗原がＡＰＣ（ＤＣｓ、ＭΦｓ、Ｂ細胞など）によるＭＨＣクラスIIの提示を介してエフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）細胞の協同と調節を誘導するＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化させることが確認され、ＭＨＣ複合体との相互作用によって持続的な細胞－細胞接触形成及びＴ細胞の活性化を誘導することができると判断される。
【0113】
一方、直接的なＣ３ｄの受容体であるＣＤ２１の発現は、Ｃ３ｄが融合した口蹄疫ワクチン株抗原を含む試験ワクチンの接種によって、ＭＤＡ（＋）／（ＭＤＡ（－）条件ですべて有意に増加して（ｐ＜０．０１、ｐ＜０．０００１）、ＦＭＤＶ表面のＣ３ｄの刺激及びＣＤ２１の結合によってＢ細胞の活性化が可能であると見られる。
【0114】
Ｔ細胞活性の際に共刺激され、記憶Ｔ細胞の誘導に重要な役割を果たす共刺激シグナルであるＣＤ２８及びＩＣＯＳの発現は、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原を含む試験ワクチンの投与時に、ＭＤＡ（＋）／ＭＤＡ（－）条件で著しく高く増加した（ＣＤ２８：ｐ＜０．０００１；ｐ＜０．０５；ＩＣＯＳ：ｐ＜０．０１；ｐ＜０．００００１）。特に、ＩＣＯＳの発現は、実験群とＰＣ群との有意的な差を誘導したが（ＭＤＡ（＋）：ｐ＜０．０５；ＭＤＡ（－）：ｐ＜０．０００１）、Ｃ３ｄ融合口蹄疫ワクチン株抗原がＴ細胞、リンパ球の共刺激を増加させてＩＦＮγの有意な発現を誘導した。また、ＩＣＯＳは、免疫グロブリンドメインであって、ＩｇＡ生成のための腸間免疫（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｍｍｕｎｅ）関係にも影響を及ぼすことが知られており、今後、全身免疫・粘膜免疫同時誘導のための口蹄疫ワクチン株への使用が可能であると期待される。ＣＴＬＡ４の発現も、ＩＣＯＳの発現と類似した傾向を示すため、ＩＣＯＳの発現によってＣＴＬＡ ｐａｔｈｗａｙが誘導されたと考えられ、誘導されたＣＴＬＡ４は、細胞質ドメインにおける母体移行抗体干渉克服用口蹄疫ワクチンの接種時に、「サイトカインストーム」レベルの炎症性サイトカインの発現による自己免疫を抑制するための調節（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）Ｔ細胞の転換を引き起こすと推測される。
【0115】
一方、本発明において、ＡＨＮＡＫの発現は、ＭＤＡ（－）条件でＯ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ投与群で有意に増加し（ｐ＜０．００１）、ＭＤＡ（＋）条件においても実験群が多少高かったが、各群間の有意性は観察されなかった。ＡＨＮＡＫは、以前に構造的スキャフォルド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）タンパク質として確認された７００ｋＤａの大きなタンパク質であって、細胞構造、細胞内輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、細胞膜再生、調節された細胞外排出作用、Ｔ細胞分化及びＴ細胞活性化過程中のカルシウムシグナル経路などの様々な細胞過程に関与してきた。
【0116】
Ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、カルシウム依存的方式でウイルスに感染した細胞を死滅させる。ＡＨＮＡＫは、成熟したＣＴＬでは発現されるが、ｎａｉ
ｖｅ ＣＤ８＋Ｔ細胞では発現されず、免疫反応誘導のための適切な機能に必要なカルシウムの導入は非常に重要であると報告された。実際のＡＮＨＡＫ欠損（Ａｈｎａｋ１－／－）ＣＴＬは、ＴＣＲ刺激後のＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂ生産、細胞質活性（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）、ＩＦＮγ分泌の著しい減少を示したことがある。
ｖｅ ＣＤ８＋Ｔ細胞では発現されず、免疫反応誘導のための適切な機能に必要なカルシウムの導入は非常に重要であると報告された。実際のＡＮＨＡＫ欠損（Ａｈｎａｋ１－／－）ＣＴＬは、ＴＣＲ刺激後のＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂ生産、細胞質活性（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）、ＩＦＮγ分泌の著しい減少を示したことがある。
【0117】
したがって、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ＋Ａ２２－Ｃ３ｄ抗原を含む試験ワクチンは、ＡＨＮＡＫの発現を介してＴ細胞の活性及びＣＴＬ反応を誘導することができると考えられる。
【0118】
また、本発明による免疫増強口蹄疫ウイルス抗原は、細胞性免疫反応の指標であるＩＦＮγ分泌を誘導し、Ｃ３ｄが挿入されたＦＭＤＶ抗原によって誘導された特定の細胞免疫反応を立証するために、「Ｃ３ｄ」挿入ＦＭＤＶ（Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ、Ａ２２－Ｃ３ｄ）Ａｇ媒介ＩＦＮγ分泌を、マウス腹膜洗浄液から分離した腹膜滲出細胞（ＰＥＣ）とブタの全血から分離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＥＬＩＳｐｏｔ分析によって確認した。
【0119】
その結果、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄから派生した不活性化ＦＭＤＶ抗原は、マウスＰＥＣｓ及びブタＰＢＭＣｓに対する対照群よりも遥かに高いレベルのＩＦＮγ分泌を誘導した（図８ｅ）。まとめると、このような結果は、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄがＴｈ１型免疫反応を誘導することができることを立証した。
【0120】
＜実験例５＞簡易キットにおける抗原量の測定及び野外株との鑑別可否の評価
本発明によって製造された組換え口蹄疫ウイルス２種、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄと陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＰＣ）であるバックボーンウイルス２種、Ｏ ＰＡ２及びＡ２２を用いて、不活化抗原を生産及び精製した。これらを用いて、簡易キットにおける抗原量の測定及び野外株との鑑別試験を行った結果、２．３４ｎｇ（１／６４０ｄｏｓｅ）の少量でもＳＰ陽性バンドを確認したとともに、ＮＳＰバンドが形成されていないことから野外株との鑑別が可能であることが分かった（図９）。スクロース密度勾配（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を介して精製された抗原（１４６ｓ粒子）の電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察結果、１４６ｓ粒子の形成に問題がないことを確認して、これを口蹄疫試験ワクチン抗原として利用しようとした（図１０）。
本発明によって製造された組換え口蹄疫ウイルス２種、Ｏ ＰＡ２－Ｃ３ｄ及びＡ２２－Ｃ３ｄと陽性対照群（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＰＣ）であるバックボーンウイルス２種、Ｏ ＰＡ２及びＡ２２を用いて、不活化抗原を生産及び精製した。これらを用いて、簡易キットにおける抗原量の測定及び野外株との鑑別試験を行った結果、２．３４ｎｇ（１／６４０ｄｏｓｅ）の少量でもＳＰ陽性バンドを確認したとともに、ＮＳＰバンドが形成されていないことから野外株との鑑別が可能であることが分かった（図９）。スクロース密度勾配（Ｓｕｃｒｏｓｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を介して精製された抗原（１４６ｓ粒子）の電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察結果、１４６ｓ粒子の形成に問題がないことを確認して、これを口蹄疫試験ワクチン抗原として利用しようとした（図１０）。
【図1a】
【図1b】
【図2a】
【図2b】
【図3】
【図4a】
【図4b】
【図5】
【図6a】
【図6b】
【図7】
【図8a】
【図8b】
【図8c】
【図8d】
【図8e】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】