特表 2024-540502 ＧＰＩアンカーを含む膜表在性タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-31

(54)【発明の名称】ＧＰＩアンカーを含む膜表在性タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20241024BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20241024BHJP

   C07K 14/715 20060101ALI20241024BHJP

   C07K 14/52 20060101ALI20241024BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20241024BHJP

   C12N 5/0781 20100101ALI20241024BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20241024BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20241024BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20241024BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20241024BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K14/705

C07K14/715

C07K14/52

C07K16/28

C12N15/62 Z

C12N15/13

C12N15/12

C12N15/63 Z

C12N5/10

C12N5/078

C12N5/0781

C12N5/0783

A61P35/00

A61P35/02

A61K38/02

A61K39/395 N

A61K39/395 T

A61K47/64

A61K48/00

A61K35/76

A61K35/17

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024529423

(86)(22)【出願日】2022-11-15

(85)【翻訳文提出日】2024-07-12

(86)【国際出願番号】 CN2022131974

(87)【国際公開番号】W WO2023088246

(87)【国際公開日】2023-05-25

(31)【優先権主張番号】202111361248.7

(32)【優先日】2021-11-17

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523136226

【氏名又は名称】上海君賽生物科技有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＪＵＮＣＥＬＬ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＣＯ．， ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】金 華 君

(72)【発明者】

【氏名】周 ▲イン▼

(72)【発明者】

【氏名】王 超

(72)【発明者】

【氏名】黄 晨

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA11

4C076BB01

4C076BB11

4C076BB13

4C076BB16

4C076CC27

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA01

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA03

4C084BA41

4C084BA44

4C084MA17

4C084MA44

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB272

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085BB41

4C085BB43

4C085EE01

4C085GG01

4C085GG02

4C085GG04

4C085GG08

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087CA12

4C087MA17

4C087MA44

4C087MA52

4C087MA55

4C087MA66

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA02

4H045DA50

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、ＧＰＩアンカーを含む膜表在性タンパク質を提供し、機能的ドメインとＧＰＩアンカーとを含む融合タンパク質およびその用途を具体的に提供する。前記融合タンパク質は、免疫細胞を効果的に活性化および増殖させ、免疫細胞の効果や機能を向上させることができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

機能的ドメインとＧＰＩアンカーとを含み、
好ましくは、前記機能的ドメインは二量化または多量化によりその機能が実行される、融合タンパク質。

【請求項2】

前記ＧＰＩアンカーは、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ５５、Ｔｈｙ１、ＡｃｈＥ、ＩＡＰ、ＡＬＰＰ、ＣＤ５９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ８７、ＣＤ１０８、ＣＤ１５７、ｕＰＡＲ、ＪＭＨタンパク質、ＧＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＴＡＧ－１、ＰｒＰ、ホスファチジルイノシトールタンパク質、アラーモン７、ＣＥＡ、ＧＦＲ、Ｌｙ６Ｇ、トランスフェリン受容体、コンタクチン（Ｆ３）およびＴ－カドヘリンから選ばれる１種または複数種或いはそのＧＰＩアンカードメインを含み、
好ましくは、前記ＧＰＩアンカーは、ＣＤ５２、ＣＤ４８、ＣＤ５５、ＡＬＰＰ、ＣＤ９０タンパク質から選ばれる１種または複数種或いはそのＧＰＩアンカードメインを含み、
より好ましくは、前記ＧＰＩアンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の２３２～２６８番目に示される配列を有し、或いはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有すると共にＧＰＩアンカー構造を形成する機能的バリアントを有することを特徴とする、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記機能的ドメインは、抗体またはその抗原結合断片、および／または、アミノ酸に基づくサイトカインまたはその機能断片を含み、好ましくは、前記抗体は遮断抗体および活性化抗体を含み、前記サイトカインはインターロイキンまたはその受容体、ケモカインまたはその受容体、インターフェロンおよびＴＮＦ－αを含み、
より好ましくは、前記融合タンパク質は、
前記抗体は腫瘍関連抗原をターゲティングする抗体であること、
前記インターロイキンまたはその受容体は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＣＤ２５、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２およびＩＬ－１５Ｒから選ばれる１種または複数種を含むこと、
前記ケモカインまたはその受容体は、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３Ａ、ＣＸＣＲ３Ｂ、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０およびＸＣＲ１から選ばれる１種または複数種を含むこと、
前記インターフェロンはＩＦＮ－γであること、から選ばれる１つまたは複数の特徴を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記融合タンパク質は、前記機能的ドメインと前記ＧＰＩアンカーとの間にあるスペーサー領域を、さらに任意に含み、
好ましくは、前記スペーサー領域は、リンカーおよび／またはタンパク質細胞外領域を含み、前記タンパク質細胞外領域は、例えば、ＣＤ８細胞外領域および／またはＢＣＭＡ細胞外領域であり、
より好ましくは、
前記リンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１７７～１８８番目に示される配列を有し、或いはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有し、および／または
前記タンパク質細胞外領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１７７～２３１番目および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１８９～２４２番目に示される配列を有し、或いはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

前記融合タンパク質はシグナルペプチドをさらに含み、
好ましくは、前記シグナルペプチドは、前記ＧＰＩアンカーの対応するタンパク質のシグナルペプチドであり、
より好ましくは、前記シグナルペプチドは、ＣＤ５２、ＣＤ４８、ＣＤ５５、ＡＬＰＰ、ＣＤ９０タンパク質シグナルペプチドの何れか１種または複数種であることを特徴とする、請求項１または２に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

（１）請求項１～５の何れか１項に記載の融合タンパク質のコーディング配列、或いはその増幅プライマーまたは検出プローブとする断片、
（２）（１）と少なくとも８０％の配列同一性を有するバリアント、
（３）（１）または（２）の相補配列、から選ばれる配列を含む、核酸分子。

【請求項7】

請求項６に記載の核酸分子を含み、
好ましくは、クローニングベクター、発現ベクターまたは統合ベクターである、核酸コンストラクト。

【請求項8】

（１）請求項１～５の何れか１項に記載の融合タンパク質を含有、発現および／または分泌し、および／または
（２）請求項６に記載の核酸分子と、請求項７に記載の核酸コンストラクトと、の何れか１種または複数種を含み、
好ましくは、リンパ球であり、
より好ましくは、前記リンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＴＩＬ細胞であり、
より好ましくは、前記Ｔ細胞またはＴＩＬ細胞は外来性ＴＣＲおよび／またはＣＡＲをさらに発現する、細胞。

【請求項9】

請求項１～５の何れか１項に記載の融合タンパク質、請求項６に記載の核酸分子、請求項７に記載の核酸コンストラクトおよび請求項８に記載の細胞の何れか１種または複数種、および薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物。

【請求項10】

請求項１～５の何れか１項に記載の融合タンパク質、請求項６に記載の核酸分子、請求項７に記載の核酸コンストラクト、請求項８に記載の細胞、および請求項９に記載の医薬組成物の何れか１種または複数種の、抗腫瘍薬物の製造における応用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はバイオテクノロジー分野に関し、具体的には、ＧＰＩアンカーを含む膜表在性タンパク質に関する。

【背景技術】

【0002】

膜貫通型タンパク質は、通常、膜貫通型ドメインである膜貫通型ポリペプチドを介して膜表面に定着している。なお、一般的なポリペプチドである膜貫通型ドメインのほかに、タンパク質も翻訳後に発生された脂質修飾によって膜表面に定着されても良い。脂質修飾の大半は細胞質内に発生して、タンパク質が膜に定着し、場合によって特定の膜マイクロドメインに定着するのを助ける。別の脂質修飾として、グリコシルホスファチジルイノシトール（Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ、ＧＰＩ）修飾は、小胞体膜の内腔側に発生する。ＧＰＩの主要構造が小胞体膜に合成された後、全体的に小胞体移行（ＥＲ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）直後の前駆体タンパク質に輸送されて、新生のＧＰＩアンカー型タンパク質が形成される。新生のＧＰＩアンカー型タンパク質が改めて小胞体とゴルジ体に修飾を数回も行った後、成熟のＧＰＩアンカー型タンパク質が形成されて、最終的に細胞膜の表面に輸送され、ＧＰＩ構造を介して細胞膜の脂質二重層に組み込まれる膜表在性タンパク質になる。

【0003】

ＧＰＩアンカー型タンパク質のＧＰＩ部分は、保守的な主要構造となる多糖と、ホスファチジルイノシトールと、多糖の分岐鎖とからなる。その主要構造となる多糖の構造は、ＥｔＮＰ－６Ｍａｎα２－Ｍａｎα６－（ＥｔＮＰ）２Ｍａｎα４－ＧｌＮα６－ｍｙｏｉｎｏｓｉｔｏｌ－ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄである。タンパク質部分が殆ど膜貫通領域欠失の疎水性ポリペプチドであり、Ｃ末端に共有結合するＧＰＩが細胞膜に定着される。例えば、サイトカイン、抗体などの、二量体または多量体を形成することで機能する分子にとっては、ＧＰＩアンカー型タンパク質の構造を介して膜表面に定着する場合、より効果的に機能できる。

【発明の概要】

【0004】

本発明は、機能的ドメインとＧＰＩアンカーとを含む融合タンパク質を提供する。

【0005】

１つまたは複数の実施形態において、前記機能的ドメインは、二量化または多量化によりその機能が実行される。

【0006】

１つまたは複数の実施形態において、前記機能的ドメインは、抗体またはその抗原結合断片、および／または、アミノ酸に基づくサイトカインまたはその機能断片を含む。

【0007】

１つまたは複数の実施形態において、前記サイトカインは、インターロイキンまたはその受容体、ケモカインまたはその受容体、インターフェロンおよびＴＮＦ－αを含む。

【0008】

１つまたは複数の実施形態において、前記インターロイキンまたはその受容体は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＣＤ２５、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２およびＩＬ－１５Ｒから選ばれる１種または複数種を含む。

【0009】

１つまたは複数の実施形態において、前記ケモカインまたはその受容体は、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３Ａ、ＣＸＣＲ３Ｂ、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０およびＸＣＲ１から選ばれる１種または複数種を含む。

【0010】

１つまたは複数の実施形態において、前記インターフェロンはＩＦＮ－γである。

【0011】

１つまたは複数の実施形態において、前記抗体は、遮断抗体および活性化抗体を含む。

【0012】

１つまたは複数の実施形態において、前記抗体は、腫瘍関連抗原をターゲティングする抗体であり、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＤ１３７またはＰＤ－１をターゲティングする抗体である。

【0013】

１つまたは複数の実施形態において、前記ＧＰＩアンカーは、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ５５、Ｔｈｙ１、ＡｃｈＥ、ＩＡＰ、ＡＬＰＰ、ＣＤ５９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ８７、ＣＤ１０８、ＣＤ１５７、ｕＰＡＲ、ＪＭＨタンパク質、ＧＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＴＡＧ－１、ＰｒＰ、ホスファチジルイノシトールタンパク質、アラーモン７、ＣＥＡ、ＧＦＲ、Ｌｙ６Ｇ、トランスフェリン受容体、コンタクチン（Ｆ３）およびＴ－カドヘリンから選ばれる１種または複数種或いはそのＧＰＩアンカードメインを含む。

【0014】

１つまたは複数の実施形態において、前記ＧＰＩアンカーは、ＣＤ５２、ＣＤ４８、ＣＤ５５、ＡＬＰＰ、ＣＤ９０タンパク質から選ばれる１種または複数種或いはそのＧＰＩアンカードメインを含む。

【0015】

１つまたは複数の実施形態において、前記ＧＰＩアンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の２３２～２６８番目に示される配列を有し、或いは、それと少なくとも９０％の配列同一性を有すると共に、ＧＰＩアンカー構造を形成する機能的バリアントを有する。

【0016】

１つまたは複数の実施形態において、前記機能的ドメインは前記ＧＰＩアンカーのＮ末端方向にある。

【0017】

１つまたは複数の実施形態において、前記融合タンパク質は、前記機能的ドメインと前記ＧＰＩアンカーとの間にあるスペーサー領域を、さらに任意に含む。

【0018】

１つまたは複数の実施形態において、前記スペーサー領域の長さが１２～６６ａａであり、例えば、１２ａａ、５４ａａ、５５ａａまたは６６ａａである。

【0019】

１つまたは複数の実施形態において、前記スペーサー領域は、リンカーおよび／またはタンパク質細胞外領域を含む。

【0020】

１つまたは複数の実施形態において、前記リンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１７７～１８８番目に示される配列を有し、或いはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する。

【0021】

１つまたは複数の実施形態において、前記タンパク質細胞外領域は、ＣＤ８細胞外領域および／またはＢＣＭＡ細胞外領域である。

【0022】

１つまたは複数の実施形態において、前記タンパク質細胞外領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１７７～２３１番目またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１８９～２４２番目に示される配列を有し、或いはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する。

【0023】

１つまたは複数の実施形態において、前記融合タンパク質は、シグナルペプチドをさらに含む。

【0024】

１つまたは複数の実施形態において、前記シグナルペプチドは、前記ＧＰＩアンカーの対応するタンパク質のシグナルペプチドである。

【0025】

１つまたは複数の実施形態において、前記シグナルペプチドは、ＣＤ５２、ＣＤ４８、ＣＤ５５、ＡＬＰＰ、ＣＤ９０タンパク質シグナルペプチドの任意１種または複数種である。

【0026】

本発明は、
（１）本明細書の第１様態に記載の融合タンパク質のコーディング配列、または、その増幅プライマー或いは検出プローブとする断片、
（２）（１）と少なくとも８０％の配列同一性を有するバリアント、
（３）（１）または（２）の相補配列、から選ばれる配列を含む、核酸分子をさらに提供する。

【0027】

本発明の別の様態は、本明細書の何れか１つの実施形態に記載の核酸分子を含む、核酸コンストラクトを提供する。

【0028】

１つまたは複数の実施形態において、前記核酸コンストラクトはクローニングベクター、発現ベクターまたは統合ベクターである。

【0029】

本発明の別の様態は、
（１）本明細書の第１様態の何れか１つの実施形態に記載の融合タンパク質を含有、発現および／または分泌し、および／または
（２）本明細書の何れか１つの実施形態に記載の核酸分子と、核酸コンストラクトと、の任意１種または複数種を含む、宿主細胞を提供する。

【0030】

１つまたは複数の実施形態において、前記宿主細胞は、リンパ球であり、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＴＩＬ細胞などである。

【0031】

１つまたは複数の実施形態において、前記リンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞または腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。

【0032】

１つまたは複数の実施形態において、前記Ｔ細胞またはＴＩＬ細胞は外来性ＴＣＲおよび／またはＣＡＲをさらに発現する。

【0033】

１つまたは複数の実施形態において、前記Ｔ細胞は、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＣＲ－Ｔ細胞を含む。

【0034】

本発明は、本明細書の何れか１つの実施形態に記載の宿主細胞をインキュベートすることを含む、本明細書の第１様態の何れか１つの実施形態に記載の融合タンパク質の製造方法をさらに提供する。

【0035】

本発明の別の様態は、本明細書の何れか１つの実施形態に記載の融合タンパク質、核酸分子、核酸コンストラクトおよび細胞の任意１種または複数種、並びに薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物を提供する。

【0036】

本発明は、本明細書の何れか１つの実施形態に記載の融合タンパク質、核酸分子、核酸コンストラクト、細胞および医薬組成物の任意１種または複数種の、抗腫瘍薬物の製造における応用をさらに提供する。

【0037】

本発明は、必要とする対象に、本明細書の何れか１つの実施形態に記載の融合タンパク質、核酸分子、核酸コンストラクトおよび細胞の任意１種または複数種を、治療および／または予防有効量で投与することを含む、腫瘍を治療および／または予防するための方法をさらに提供する。

【0038】

本発明の優位性：
１）ＧＰＩアンカー型タンパク質によりサイトカインまたは抗体を免疫細胞の表面に定着させることで、免疫細胞を効果的に活性化および増殖させ、免疫細胞の効果や機能を向上させることができる。

【0039】

２）ＧＰＩアンカー型タンパク質により細胞膜の表面に定着される外来性タンパク質、例えば、サイトカインや抗体などは、通常のアミノ酸膜貫通型ドメインによる定着と比較すれば、その発現強度が明らかに向上された。

【0040】

３）ＣＮ１１０７０９４１６Ａにより開示されたＧＰＩシグナル配列と比較すれば、本発明に使用されるＣＤ５２が完全なタンパク質であるため、本発明のＣＤ５２によって定着される膜表在性タンパク質は、潜在的な新しい抗原配列に組み込まれず、免疫原性が低く、その後のインビボ応用をさらに助長する。

【図面の簡単な説明】

【0041】

【図1】ＧＰＩアンカーにより膜表面にサイトカインを発現するＴ細胞およびＥＧＦＰを発現するＴ細胞の、顕微鏡明視野形態である。

【図2】ＧＰＩアンカーにより膜表面にサイトカインを発現するＴ細胞の数量である。

【図3】ＧＰＩアンカーにより膜表面にサイトカインを発現するＴ細胞の生存率である。

【図4】ＧＰＩアンカーにより膜表面にサイトカインを発現するＴ細胞のフローサイトメトリー結果である。

【図5】ＧＰＩアンカーにより膜表面にサイトカインを発現するＴ細胞のサイトカイン分泌レベルである。

【図6】ＧＰＩアンカーにより膜表面にサイトカインとＴＣＲを発現するＴ細胞の発現のフローサイトメトリー結果である。

【図7】ＥＴ比１：１の条件で、ＧＰＩアンカーにより膜表面にサイトカインとＴＣＲを発現するＴ細胞の発現の、標的細胞に対する殺傷効果である。

【図8】ＥＴ比０．５：１の条件で、ＧＰＩアンカーにより膜表面にサイトカインとＴＣＲを発現するＴ細胞の発現の、標的細胞に対する殺傷効果である。

【図9】ＧＰＩアンカーにより膜表面にＨＥＲ２抗体を発現するＴＩＬの発現の、相同的対合の腫瘍初代細胞に対する殺傷効果である。

【図10】ＧＰＩアンカーにより膜表面にＨＥＲ２抗体とＴＣＲを発現するＴ細胞の発現の、標的細胞に対する殺傷効果である。

【図11】異なるＧＰＩタンパク質により膜表面に定着されるサイトカインを発現するＴ細胞の数量である。

【図12】異なるＧＰＩタンパク質により膜表面に定着されるサイトカインを発現するＴ細胞の生存率である。

【図13】異なるＧＰＩタンパク質により膜表面に定着されるサイトカインとＴＣＲを発現するＴ細胞およびＴＣＲ－Ｔ細胞の、０．５：１ＥＴ比での、標的細胞に対する殺傷効果である。

【図14】ＴＣＲ－ＴおよびＧＰＩタンパク質により定着される膜表面サイトカインを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞をインビボで投与された担腫瘍マウスの腫瘍体積変化である。

【図15】ＴＣＲ－ＴおよびＧＰＩタンパク質により定着される膜表面サイトカインを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞をインビボで投与された担腫瘍マウスの腫瘍蛍光値変化である。

【図16】ＴＣＲ－ＴおよびＧＰＩタンパク質により定着される膜表面サイトカインを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞をインビボで投与された担腫瘍マウスの腫瘍蛍光生体イメージングである。

【図17】ＴＣＲ－ＴおよびＧＰＩタンパク質により定着される膜表面サイトカインを発現するＴＣＲ－Ｔ細胞をインビボで投与された担腫瘍マウスの末梢血におけるヒトリンパ球数量である。

【発明を実施するための形態】

【0042】

別段の定義がない限り、本発明の実施は、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の通常技術を使用し、これらはいずれも当分野の技術範囲内である。これらの技術は文献により十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）や、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）や、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８７）や、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）や、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９８７版およびその定期更新版）や、ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓら編集、１９９４）や、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．、１９８８）や、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｂａｒｂａｓら、２００１）が挙げられる。

【0043】

ＧＰＩアンカー型タンパク質は、脂質の相互作用または多糖の相互作用により細胞膜における脂質ラフト（ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ）と結合する。発明者は研究において、例えば、サイトカイン、抗体などの、二量体または多量体を形成することで機能する分子にとって、ＧＰＩアンカー型タンパク質の構造を介して膜表面に定着することで、これらの分子がそれぞれの機能をより効果的に発揮でき、例えば、免疫細胞の増殖や活性化および標的細胞の殺傷レベルを効果的に向上できること、を発見した。

【0044】

本発明は、まず、機能的ドメインとＧＰＩアンカーを含む融合タンパク質を提供する。ＧＰＩアンカーは機能的ドメインを細胞の表面（例えば、免疫細胞）に定着させることで、機能的ドメインの二量化または多量化を促進する。好ましくは、前記機能的ドメインは前記ＧＰＩアンカーのＮ末端方向にある。

【0045】

前記ＧＰＩアンカーは、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ５５、Ｔｈｙ１、ＡｃｈＥ、ＩＡＰ、ＡＬＰＰ、ＣＤ５９、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ４８、ＣＤ５２、ＣＤ５８、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６７、ＣＤ８７、ＣＤ１０８、ＣＤ１５７、ｕＰＡＲ、ＪＭＨタンパク質、ＧＤＮＦＲ、ＣＮＴＦＲ、ＴＡＧ－１、ＰｒＰ、ホスファチジルイノシトールタンパク質、アラーモン７、ＣＥＡ、ＧＦＲ、Ｌｙ６Ｇ、トランスフェリン受容体、コンタクチン（Ｆ３）およびＴ－カドヘリンから選ばれる１種または複数種、或いは、そのＧＰＩアンカードメイン（本明細書においてＧＰＩシグナル配列とも呼ばれる）を含む。好ましくは、前記ＧＰＩアンカーはＣＤ５２タンパク質またはそのＧＰＩアンカードメインである。本分野においてＧＰＩアンカー型タンパク質またはそのアンカードメイン配列が知られている。さらに、当業者は、ＧＰＩアンカー型タンパク質の配列からそのアンカードメイン配列を容易に取得できる。

【0046】

１つまたは複数の実施形態において、前記ＧＰＩアンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の２３２～２６８番目に示される配列を有し、或いは、それと少なくとも９０％の配列同一性を有すると共に、ＧＰＩに共有結合する機能的バリアントを有する。或いは、ＧＰＩアンカーは、ＣＤ４８ ＧＰＩドメイン、ＣＤ５５ ＧＰＩドメイン、ＡＬＰＰ ＧＰＩドメイン、ＣＤ９０ ＧＰＩドメインであってもよく、そのアミノ酸配列はそれぞれＣＮ１１０７０９４１６Ａ明細書の１４ページに記載されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１８に示される。

【0047】

本明細書において、機能的ドメインは、二量化または多量化によりその機能を実行できる任意のポリペプチドまたはタンパク質を含む。幾つかの実施形態において、前記機能的ドメインはサイトカインまたはその機能断片を含む。

【0048】

本明細書に係る機能的ドメインとするサイトカインは、主にアミノ酸に基づくポリペプチド類サイトカインであり、インターロイキンまたはその受容体、ケモカインまたはその受容体、インターフェロン、ＴＮＦ－αを含むが、これらに限定されるものではない。前記インターロイキンまたはその受容体は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＣＤ２５、ＩＬ－７Ｒ、ＩＬ－１２Ｒβ１、ＩＬ－１２Ｒβ２およびＩＬ－１５Ｒから選ばれる１種または複数種を含む。前記ケモカインまたはその受容体は、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３Ａ、ＣＸＣＲ３Ｂ、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０およびＸＣＲ１から選ばれる１種または複数種を含む。前記インターフェロンは、例えば、ＩＦＮ－γである。上記サイトカインは、その既知の任意形態、例えば、サブタイプ、誘導体を含む。これらのサイトカインのアミノ酸配列は、当業者の通常の知識範囲内にある。

【0049】

前記機能的ドメインは抗体またはその抗原結合断片であってもよい。本明細書において、広義的な「抗体」は、抗原に特異的に結合する任意のタイプの分子、例えば、全長抗体（免疫グロブリンＦｃ領域を有する）、重鎖抗体、ナノボディ、ミニボディ、アフィボディ、受容体の標的結合ドメイン、細胞接着分子、リガンドなどであってもよい。幾つかの具体的な実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、マルチエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、ダイアボディ、一本鎖分子、および抗体断片、特に抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖを含む。前記抗体は遮断抗体、活性化抗体を含む。腫瘍に向ける実施形態において、好ましくは、前記抗体は腫瘍関連抗原をターゲティングする抗体であり、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＣＤ１３７またはＰＤ－１をターゲティングする抗体である。例示的に、前記ＨＥＲ２をターゲティングする抗体は一本鎖抗体であり、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の２５～２６８番目に示される配列を有する。或いは、例示的に、前記ＣＤ１３７をターゲティングする抗体は一本鎖抗体であり、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の２５～２６９番目に示される配列を有する。

【0050】

前記融合タンパク質は、前記機能的ドメインと前記ＧＰＩアンカーとの間にあるスペーサー領域を、さらに任意に含む。スペーサー領域を利用するか否かは、当業者の通常の選択によるため、スペーサー領域が必ずしも存在するとは限らない。通常、スペーサー領域の長さは１０～７０ａａであり、好ましくは、１２～６６ａａであり、例えば、１２ａａ、５４ａａ、５５ａａまたは６６ａａ、或いは上記任意の２つの数字の間の範囲である。スペーサー領域は、リンカーを含んでもよく、例えば、Ｇおよび／またはＳからなるポリペプチド配列であり、例えば、ＧＳ、ＧＳＧ、ＧＳＳＧ、ＳＧＳ、ＧＧＧＧＳのｎ回（例えば３回）反復のポリペプチドである。例示的なリンカーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１７７～１８８番目に示される配列を有し、或いはそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する。スペーサー領域は特定のタンパク質の細胞外領域を含んでもよい。例えば、ＣＤ８細胞外領域、ＢＣＭＡ細胞外領域である。例示的なリンカーのタンパク質細胞外領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１７７～２３１番目またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の１８９～２４２番目に示される配列を有し、或いは、それと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を有する。

【0051】

本発明の融合タンパク質は、機能に影響を与えられるように、修飾されてもよい。本発明は修飾を有するグリコシル化様態の融合タンパク質を含む。或いは、望まないグリコシル化部位を除去するように修飾してもよい。前記融合タンパク質は、発現、分泌、精製を容易に実施するための修飾、例えば、シグナルペプチドをさらに有してもよい。１つまたは複数の実施形態において、シグナルペプチドは、前記ＧＰＩアンカーの対応するタンパク質のシグナルペプチドである。例示的に、本明細書の融合タンパク質のシグナルペプチドは、ＣＤ５２、ＣＤ４８、ＣＤ５５、ＡＬＰＰ、ＣＤ９０タンパク質シグナルペプチドの任意１種または複数種である。

【0052】

具体的な実施例において、本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端まで、（１）ＩＬ－７、ＣＤ８細胞外領域、ＣＤ５２を有すると共に、Ｎ末端にＣＤ５２シグナルペプチドを任意に有する構造、（２）ＩＬ－７、リンカー、ＢＣＭＡ細胞外領域、ＣＤ５２を有すると共に、Ｎ末端にＣＤ５２シグナルペプチドを任意に有する構造、（３）Ｈｅｒ２抗体、リンカー、ＣＤ５２を有すると共に、Ｎ末端にＣＤ５２シグナルペプチドを任意に有する構造、（４）ＣＤ１３７抗体、リンカー、ＣＤ５２を有すると共に、Ｎ末端にＣＤ５２シグナルペプチドを任意に有する構造、（５）ＩＬ－７、ＣＤ８細胞外領域、ＣＤ４８ ＧＰＩアンカードメインを有すると共に、Ｎ末端にＣＤ４８シグナルペプチドを任意に有する構造、（６）ＩＬ－７、ＣＤ８細胞外領域、ＣＤ５５ ＧＰＩアンカードメインを有すると共に、Ｎ末端にＣＤ５５シグナルペプチドを任意に有する構造、（７）ＩＬ－７、ＣＤ８細胞外領域、ＡＬＰＰ ＧＰＩアンカードメインを有すると共に、Ｎ末端にＡＬＰＰシグナルペプチドを任意に有する構造、（８）ＩＬ－７、ＣＤ８細胞外領域、ＣＤ９０ ＧＰＩアンカードメインを有すると共に、Ｎ末端にＣＤ９０シグナルペプチドを任意に有する構造、から選ばれる何れか１つの構造を有する。

【0053】

本発明の融合タンパク質は、それと相同な機能を有すると共にその示される配列を有する変異形態、をさらに含む。これらの変異形態は、幾つかの（通常、１～５０個、好ましくは１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～８個、１～５個の）アミノ酸の欠失、挿入および／または置換、並びにＣ末端および／またはＮ末端における１つまたは複数の（通常、２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内の）アミノ酸の付加または欠失を含む（これらに限定されるものではない）。例えば、本分野において、近いか又は類似的な特性を持つアミノ酸で置換する場合、通常、タンパク質の機能が変化することはない。本分野において、通常、類似的な特性を持つアミノ酸は、類似的な側鎖を有するアミノ酸ファミリーであり、本分野では明確に定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、乳酸、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β‐分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。また、例えば、アミノ基末端および／またはカルボキシ基末端に１つまたは複数のアミノ酸が付加された場合でも、通常、ポリペプチドまたはタンパク質の機能が変化することはない。一般的に知られている様々な非遺伝性コードアミノ酸の保存的なアミノ酸置換については、本分野で既に知られている。その他の非コードアミノ酸の保存的な置換はその物理特性と遺伝性コードアミノ酸の特性との比較によって決定される。

【0054】

前記融合タンパク質と高い相同性（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２または４に示される配列との相同性が７０％以上であり、好ましくは、相同性が８０％以上であり、より好ましくは、相同性が９０％以上であり、例えば、相同性が９５％、９８％または９９％である）を有すると共に、融合タンパク質と類似的または相同な機能を有する任意のポリペプチドも、本発明に含まれる。前記「相同または類似的な機能」は、主に、融合タンパク質の機能的ドメインの機能（例えば、抗腫瘍）およびＧＰＩアンカーの機能（即ち、ＧＰＩに共有結合することで膜に定着されること）である。

【0055】

本発明は、保護が要請される融合タンパク質の類似体をさらに含む。これらの類似体と元の融合タンパク質との相違点は、アミノ酸配列の差異であってもよく、配列に影響を与えない修飾形態の差異であってもよく、或いは両方を兼ね備える。これらのタンパク質の類似体は、自然発生または誘発の遺伝子変異体を含む。誘発変異体は様々な技術により得られるが、例えば、放射により、または突然変異誘起剤に暴露させることで、ランダムな突然変異を誘発し、或いは、部位特異的突然変異誘発法またはその他の既知の分子生物学技術により得られる。類似体は、天然Ｌ－アミノ酸と異なる残基（例えば、Ｄ－アミノ酸）を有する類似体、および非天然または合成のアミノ酸（例えば、β、γ－アミノ酸）を有する類似体、をさらに含む。本発明のタンパク質は、上記に挙げられる代表的なタンパク質に限定されるものではないと理解すべきである。

【0056】

本発明のポリペプチド断片、誘導体または類似体は、さらに、（ｉ）成熟したポリペプチドがその他の化合物（例えば、ポリエチレングリコールなどの、ポリペプチドの半減期を延長する化合物）に融合して形成されたポリペプチド、或いは（ｉｉ）付加されたアミノ酸配列が当該ポリペプチド配列に融合して形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列、分泌配列、或いは当該ポリペプチドを精製するための配列またはタンパク質構成配列）であってもよい。本明細書の定義によれば、これらの断片、誘導体および類似体は、当業者が周知する範囲に属する。

【0057】

本発明は、さらに、本発明の融合タンパク質またはそのバリアント、類似体、誘導体をコードするポリヌクレオチド配列、および当該配列を含む核酸分子に関する。前記ポリヌクレオチドはＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であってもよい。ＤＮＡ形態はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは人工合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であってもよい。ＤＮＡはコード鎖または非コード鎖であってもよい。

【0058】

本発明は、さらに、上記核酸分子の変異体に関し、当該変異体が本発明と相同なアミノ酸配列を有する融合タンパク質またはその断片、類似体および誘導体をコードする。前記変異体は、自然発生の対立遺伝子変異体または非自然発生の変異体であってもよい。これらのヌクレオチド変異体は、置換変異体、欠失変異体および挿入変異体を含む。本分野で知られている通り、対立遺伝子変異体は、ポリヌクレオチドの置換形態の１つであり、１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失または挿入であってもよいが、それによりコードされるポリペプチドの機能を実質的に変更することはない。本明細書に使用されるように、縮重変異体は、本発明において、前記融合タンパク質をコードするがコード領域配列に相違点がある核酸配列である。「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでもよく、コーディングおよび／または非コーディング配列を付加するポリヌクレオチドをさらに含んでもよい。

【0059】

本発明は、さらに、上記配列とハイブリダイズ（相補）すると共に、２つの配列間が少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は、特に、ストリンジェントな条件で、本発明に係るポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「ストリンジェントな条件」とは、（１）例えば０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃など低いイオン強度および高い温度でのハイブリダイゼーションおよび溶出、または、（２）例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０．１％子ウシ血清／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、４２℃など変性剤によるハイブリダイゼーション、または、（３）２つの配列間の同一性が少なくとも９０％以上であり、より好ましくは９５％以上である場合のみハイブリダイゼーションが発生する。幾つかの実施形態において、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または２に示される成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。

【0060】

本発明に記載の変異体の配列はその由来配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有してもよい。本発明に記載の配列同一性は配列分析ソフトウエアを利用して測定できる。例えば、デフォルト引数を使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＢＬＡＳＴＮが挙げられる。

【0061】

本発明の融合タンパク質コーディング配列の全長配列或いはその断片（例えばプライマーまたはプローブ）は、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法または人工合成法により得られる。ＰＣＲ増幅法について、本発明に開示される関連アミノ酸またはヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列によりプライマーを設計すると共に、市販されるＤＮＡライブラリーまたは当業者によく知られている通常の方法で製造されたｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして増幅して関連配列を取得した。また、特に、例えば、プライマーまたはプローブなど、断片の長さが短い場合に、人工合成法により関連配列を合成してもよい。例えば、ソフトＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓなど、本分野で知られているプライマーおよびプローブ配列の設計方法はいずれも本明細書に使用できる。

【0062】

本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列、およびこれらの配列に操作可能に連結される１つまたは複数の調節配列を含む核酸コンストラクトにも関する。本発明に記載のポリヌクレオチドは、前記融合タンパク質の発現を確実にするように、様々な方法で操作されてもよい。核酸コンストラクトをベクターに挿入する前に、発現ベクターの相違点または要求に応じて核酸コンストラクトを操作してもよい。組換えＤＮＡ方法でポリヌクレオチド配列を変更する技術は本分野で既知である。

【0063】

調節配列は、適切なプロモーター配列であってもよい。プロモーター配列は通常、タンパク質を発現しようとするコード配列と操作可能に連結する。プロモーターは、変異、トランケート、およびハイブリッドプロモーターを含む、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のヌクレオチド配列であってもよく、宿主細胞と相同または異種である細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。調節配列は、適切な転写ターミネーター配列、すなわち転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列であり得る。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の３’末端に操作可能に連結される。選択された宿主細胞において機能する任意のターミネーターが本発明で使用することができる。調節配列は、適切なリーダー配列であってもよく、宿主細胞翻訳にとって非常に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であり得る。リーダー配列は、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’末端に操作可能に連結される。選択された宿主細胞において機能する任意のターミネーターが本発明で使用することができる。

【0064】

特定の実施形態において、前記核酸コンストラクトはベクターである。ベクターは、クローニングベクターであってもよく、発現ベクター、または統合ベクターであってもよい。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルスおよびコスミドなどの、様々なタイプのベクターにクローニングされてもよい。クローニングベクターは本発明の融合タンパク質のコーディング配列を提供するために利用されてもよい。発現ベクターはウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。通常、本発明のポリヌクレオチドをプロモーターに操作可能に連結すると共に、コンストラクトを発現ベクターに導入することで、本発明のポリヌクレオチドの発現が実現される。統合ベクターは本明細書に記載の発現カセットを宿主ゲノムに統合するために利用され、例えば、ｐＮＢ、ｐＮＣなどの、ＰＢトランスポゾンシステムにより遺伝子を統合する統合ベクターである。通常、適切なベクターは、少なくとも１種の有機体において機能を果たす複製起点と、プロモーター配列と、転写および翻訳ターミネーターと、便利な制限酵素部位、および／または１つまたは複数の選択可能な標識と、を含む。これらの配列は当業者が必要に応じて選定できる。

【0065】

タンパク質の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターによってトランスフェクトまたは感染を求められる細胞集団から発現細胞を同定および選択することを容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子および／またはレポーター遺伝子を含んでもよい。選択可能な標識は、単独のＤＮＡに持ち込まれると共に、コトランスフェクション工程に利用できる。選択可能な標識とレポーター遺伝子の両者の側鎖は、宿主細胞において発現できるように、適切な調節配列を有しても良い。有用で選択可能な標識は例えばｎｅｏなどの抗生物質耐性遺伝子を含む。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリフォスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子を含んでも良い。適切な発現システムは、よく知られていると共に、既知の技術により製造でき、または市販により取得できる。

【0066】

本明細書に記載のポリヌクレオチドは、通常ＰＣＲ増幅法によって得ることができる。具体的には、本明細書に開示されるヌクレオチド配列、特にオープンリーディングフレーム配列によりプライマーを設計すると共に、市販されるｃＤＮＡライブラリーまたは当業者によく知られている通常の方法で製作されたｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして増幅して関連配列を取得することができる。長い配列の場合、通常、ＰＣＲ増幅を２回または複数回実施してから、それぞれ増幅された断片を正確な順番で繋げる必要がある。或いは、本明細書に記載の核酸分子を直接的に合成しても良い。

【0067】

遺伝子を細胞に導入するおよび遺伝子を細胞内に発現させる方法は、当該技術分野において公知である。ベクターは、本分野で知られている任意の方法によって、例えば哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞などの宿主細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的または生物学的手段によって宿主細胞に導入することができる。

【0068】

ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、粒子衝撃法、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などが含まれる。関心を持っているポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、ＤＮＡとＲＮＡベクターの使用が含まれる。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、マクロ複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質系システムが挙げられる。

【0069】

本明細書において、宿主細胞は、本明細書に記載の融合タンパク質を含有、発現および／または分泌する。本明細書において、細胞がポリペプチドなどの特定の分子を含有または含み、発現、分泌すると記述した場合、「含有」とは前記分子が前記細胞内またはその表面に含まれることであり、「発現」とは当該細胞が前記分子を生産することであり、「分泌」とは当該細胞が発現された分子を細胞外へ分泌することである。宿主細胞は、本発明のタンパク質のコーディング配列または本明細書に記載のベクターを提供するために、最終的に疾患を治療するための免疫細胞（例えばＴ細胞）を含むほかに、例えば、大腸菌細胞などの、免疫細胞の生産プロセスで使用される様々な細胞も含む。細胞が発現および／または分泌するタンパク質は本分野で周知の精製方法により精製できる。

【0070】

本発明に適用されるＴ細胞は、様々な由来の、様々なタイプのＴ細胞であってもよい。例えば、Ｔ細胞は健康個体のＰＢＭＣに由来してもよい。特定の実施形態において、本明細書は、本明細書に記載の融合タンパク質を安定的に発現するＴＣＲ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、ＴＩＬ細胞を提供する。当業者はこれらの細胞の取得方法をよく知っている。特定の実施形態において、Ｔ細胞を取得した後、まず、適量（例えば３０～８０ｎｇ／ｍｌ、例えば５０ｎｇ／ｍｌ）のＣＤ３抗体で刺激し活性化させてから、適量（例えば３０～８０ＩＵ／ｍｌ、例えば５０ＩＵ／ｍｌ）のＩＬ２を含む培地で培養して、使用に備える。

【0071】

そのため、特定の実施形態において、本発明は遺伝子修飾の細胞（例えば免疫細胞）を提供し、当該遺伝子修飾の免疫細胞は、本明細書に記載の核酸分子を含み、または本明細書に記載のベクターを含み、または本明細書に記載の方法で製造して取得し、または本明細書に記載の融合タンパク質を安定的に発現する。

【0072】

本明細書は、融合タンパク質、核酸分子、核酸コンストラクトおよび細胞の任意１種または複数種、および薬学的に許容される添加物を含む、医薬組成物を提供する。本明細書において、薬学的に許容される添加物は、薬理学的および／または生理学的に被験者や活性成分と相溶性があるベクターおよび／または賦形剤である。特定の実施形態において、医薬組成物における許容される添加物などは、好ましくは、採用される用量と濃度で受験者に対して無毒である。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ値、浸透性、粘度、清澄度、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解または放出速度、吸収または浸透を改善、維持または保留するための物質を含んでもよい。これらの物質は既存技術でよく知られており、ｐＨ調整剤、界面活性剤、イオン強度増強剤、希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントを含むが、これらに限定されるものではない。具体的には、薬学的に許容される適切な添加物は、本分野で免疫細胞、特にＴ細胞の投与によく利用される添加物であってもよい。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ編集、１９９０、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照する。所望の投与経路、送達方式および必要とされる用量によって最適な医薬組成物を決定する。

【0073】

本発明の医薬組成物は非経口送達で使用してもよい。或いは、組成物は吸入または消化器（例えば、経口）送達で使用してもよい。前記薬学的に許容される組成物は本分野の技術により製造する。その他の医薬組成物は当業者にとって明らかであり、持続的にまたは制御的に放出される送達調製物に免疫細胞、特に免疫細胞（例えばＴ細胞）が含まれる調製物を含む。幾つかのその他の持続的または制御可能な送達方式を提供するための技術（例えば、リポソームベクター、生分解性微粒子または多孔質ビーズおよびデポ注射）も当業者によく知られている。細胞を含む薬物組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部に直接的に注入してもよい。

【0074】

インビボで投与する医薬組成物は、通常、無菌製剤の形態で提供する。無菌ろ過膜によりろ過することで殺菌を実現する。非経口投与に利用される組成物は凍結乾燥の形態または溶液で（例えば凍結保存製剤）保存できる。非経口組成物は、通常、無菌アクセスポートを有する容器、例えば皮下注射針によって穿通可能な栓を有する静脈内溶液バッグ、またはバイアルに入れられる。

【0075】

医薬組成物は、調製されると、溶液、懸濁液、ゲル、乳液、固体、結晶、凍結保存物、或いは、脱水または凍結乾燥粉末の形態で無菌バイアルに保存される。前記医薬調製物（例えば、凍結保存製剤）はレディー・ツー・ユースの形態または投与直前再調製の形態で保存できる。例えば、本明細書に記載の医薬組成物の送達に適用されるのは凍結保存製剤であってもよく、これにより、細胞を損傷せずに遠距離輸送に耐えられる。細胞そのもの以外に、凍結保存製剤は、通常、細胞凍結保存液、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの成分をさらに含む。投与前（例えば静脈輸注）に、凍結保存される医薬組成物は、低温で保存する必要がる（例えば液体窒素に置く）。凍結保存製剤は、解凍後に、直接的にまたは輸注組成物に調製されてから、患者に輸注される。当業者は通常の凍結保存液の成分および濃度をよく知っている。例えば、凍結保存液または輸注組成物は、塩化ナトリウム、グルコース、酢酸ナトリウム、塩化カリウムまたは塩化マグネシウムなどをさらに含んでもよく、その濃度は当業者（例えば、経験のある医者）が細胞、疾患、患者などの状況に基づいて決定される。本発明は単回用量投与単位を生成するための試薬キットを更に提供する。本発明の試薬キットは、細胞凍結保存液または凍結保存製剤を有する第１容器と、輸注調製物を有する任意の第２容器をそれぞれ含む。本発明の特定の実施形態において、シングルチャンバーおよびマルチチャンバープレフィルドシリンジ（例えば、液体用シリンジ）を含む試薬キットを提供する。

【0076】

本明細書は、本明細書に記載の核酸コンストラクトを含む、試薬キットをさらに提供する。試薬キットは、前記核酸コンストラクトの細胞へのトランスフェクションに適用される様々な試薬と、前記組換え発現ベクターの細胞へのトランスフェクションを当業者に指導するための任意の取扱説明書と、をさらに含んでもよい。

【0077】

本発明は、本発明の何れか１つの実施形態に記載の融合タンパク質、細胞または医薬組成物を投与することで、患者の疾患を治療する方法を提供する。本明細書に記載の疾患は、様々ながん（腫瘍）を含み、腺がん、肺がん、結腸がん、大腸がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、胃がん、胆管がん、胆嚢がん、食道がん、膵臓がん、前立腺がんなどの固形腫瘍と血液腫瘍、およびＢ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ヘアリ細胞白血病、急性骨髄性白血病などの白血病とリンパ腫を含む。好ましくは、前記疾患は、本明細書に記載の機能的ドメイン（本明細書に記載の抗体またはサイトカイン）の二量化または多量化からメリットを得る腫瘍である。

【0078】

本明細書において、用語「患者」、「個体」、「対象」は交換して使用できるが、任意の生体を含み、好ましくは動物であり、より好ましくは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギなど）であり、最も好ましくはヒトである。「治療」は、対象に対して本明細書に記載される治療方案を採用して、少なくとも１つの陽性治療効果（例えば、がん細胞数減少、腫瘍体積減少、がん細胞の周辺器官への浸潤速度低下または腫瘍転移または腫瘍成長の速度低下）を得ることである。通常、医薬組成物に細胞が治療有効量で含まれる。治療有効量とは、対象における疾患または病状の治療、予防、軽減および／または緩和が実現できる用量である。患者の年齢、性別、罹患病状およびその重症度、患者のその他の体調などの要素によって治療有効量が決定される。本明細書において、通常、被験者または患者が哺乳動物であり、特に、ヒトである。

【0079】

採用しようとする本発明の融合タンパク質または免疫細胞を含む医薬組成物の治療有効量は、例えば、治療程度および目標によって決定される。当業者に理解されるように、患者を効果的に治療するための治療案は、部分的に、送達される分子、適応症、投与経路および患者の大きさ（体重、体表または器官の大きさ）および／または状況（年齢、一般健康状況、療法の被験者の抗がん反応を活性化させる能力）によって変化する。幾つかの実施形態において、最適の治療効果を得るために、臨床医が投薬量を設定して、投与経路を改変してもよい。

【0080】

投与頻度は使用される調製物における免疫細胞の薬物動態パラメータによって決定される。代表的には、臨床医は組成物を所望の効果を実現する投薬量まで投与する。従って、組成物は１回用量として投与してもよく、或いは２回以上の用量（必要とされる分子を同じ量で含んでもよくまたは含まなくてもよい）として経時的に、または移植デバイスまたはカテーテルを介して連続注入として投与してもよい。

【0081】

医薬組成物の投与経路は、通常、持続放出システムによるかまたは移植デバイスによる、例えば、経口、静脈内、腹膜内、脳内（脳実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈または病巣内の経路による注射を通じた公知の方法に従う。

【0082】

本発明の幾つかの実施形態において、本発明の融合タンパク質、細胞または医薬組成物は、本分野の既知のその他の療法と併用してもよい。前記療法は、化学療法、放射線治療、免疫抑制剤を含むが、これらに限定されない。例えば、本分野における周知の腫瘍抗原により仲介される疾患を治療するための放射線治療または化学療法製剤と併用して治療してもよい。

【0083】

本発明は、本明細書の何れか１つの実施形態に記載の融合タンパク質、核酸分子、核酸コンストラクト、細胞および医薬組成物の任意１種または複数種の、抗腫瘍薬物の製造における応用をさらに提供する。本明細書において、「抗腫瘍」とは、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、期待寿命の増加またはがんに関する様々な生理症状の改善と示す生物学的効果である。

【0084】

本発明について、下記実験実施例を参考にして、更に詳しく記述した。これらの実施例は、説明するために提示されるものであり、特に断りのない限り、限定的なものではない。そのため、本発明は、下記実施例に限定されるものではなく、本明細書により提供される示唆によって明らかになる任意および全ての変化を含むものである。実施例に使用される方法と試薬は、特に断りのない限り、本分野における通常の方法と試薬である。

【実施例】

【0085】

実施例
抗体および機器
ＯＫＴ３はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒより購入、製品番号：１４－００３７－８２
ＣＤ２８抗体はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒより購入、製品番号：１４－０２８１－８２
エレクトロポレーターＬｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ２ｂはＬｏｎｚａより購入、製品番号：ＡＡＢ－１００１

【0086】

実施例１、ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表在性タンパク質の発現ベクターの構築
ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表在性タンパク質を含む下記コーディング配列の合成：

【0087】

１、ＩＬ－７およびＣＤ５２リーディングフレームの融合タンパク質アミノ酸配列とコーディング配列：
ＩＬ－７－ＣＤ５２－１：ＣＤ５２シグナルペプチド－ＩＬ－７－ＣＤ８細胞外領域－ＣＤ５２、コーディング核酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、タンパク質配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、
ＩＬ－７－ＣＤ５２－２：ＣＤ５２シグナルペプチド－ＩＬ－７－ｌｉｎｋｅｒ－ＢＣＭＡ細胞外領域－ＣＤ５２、コーディング核酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、タンパク質配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、
ＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭ：ＣＤ８シグナルペプチド－ＩＬ－７－ＣＤ８細胞外領域－ＣＤ８膜貫通領域、コーディング核酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、タンパク質配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６

【0088】

２、ＨＥＲ２抗体およびＣＤ５２リーディングフレームの融合タンパク質アミノ酸配列とコーディング配列：
αＨｅｒ２－ＣＤ５２：ＣＤ５２シグナルペプチド－αＨｅｒ２－ｌｉｎｋｅｒ－ＣＤ５２、コーディング核酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７、タンパク質配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、

【0089】

３、ＣＤ１３７活性化抗体およびＣＤ５２リーディングフレームの融合タンパク質アミノ酸配列とコーディング配列：
αＣＤ１３７－ＣＤ５２：ＣＤ５２シグナルペプチド－αＣＤ１３７－ｌｉｎｋｅｒ－ＣＤ５２配列：コーディング核酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９、タンパク質配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０

【0090】

ＰＣＴ特許出願ＷＯ２０２２０７８３１０Ａ１明細書の２１ページの実施例１に記載される方法で、ｐＫＢ２０ベクターを構築した。当該実施例に記載される方法で、ＩＬ－７－ＣＤ５２－１、ＩＬ－７－ＣＤ５２－２、ＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭ、αＨｅｒ２－ＧＰＩおよびαＣＤ１３７－ＧＰＩの発現カセットを含むｐＫＢ２０ベクターを構築して、それぞれｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－１、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭ、ｐＫＢ２０－αＨｅｒ２－ＣＤ５２およびｐＫＢ２０－αＣＤ１３７－ＣＤ５２と名付けた。同実施例に記載される方法で、ＥＧＦＰを発現するベクターｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを構築した。得られた組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５ｃ）に形質転換し、シークエンシングを行った結果、正確である場合、Ｑｉａｇｅｎ社のプラスミド精製試薬キットでプラスミドを抽出し精製して、各組換え発現ベクターの高品質プラスミドを得た。

【0091】

実施例２、腫瘍抗原ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ発現ベクターの製造
ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原ペプチドＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（ＨＬＡ－^＊Ａ０２：０１）を識別するＴＣＲのα鎖とβ鎖をコードする遺伝子ＤＮＡ配列を合成し、両者はＰ２Ａペプチド断片をコードするＤＮＡ配列により連結し、連結された配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示される。さらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の３’末端に、Ｐ２Ａペプチド断片をコードするＤＮＡによりＥＧＦＰをコードするＤＮＡ配列を連結して、得られた配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示される。合成を会社に依頼してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を取得し、ＰＣＴ特許出願ＷＯ２０２２０７８３１０Ａ１明細書の２１ページの実施例１に記載される方法で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を製造されたｐＫＢ２０ベクターにクローニングし、ｐＫＢ２０－ＴＣＲと名付けた。ＰＣＴ特許出願ＷＯ２０２２０７８３１０Ａ１明細書の２１ページの実施例１に記載される方法で、ＰＢトランスポザーゼ発現カセットを含まないベクターｐＫＣ２０を製造して取得した。同実施例に記載される方法で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２を製造されたｐＫＣ２０ベクターにクローニングし、ｐＫＣ２０－ＴＣＲと名付けた。得られた組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５ｃ）に形質転換し、シークエンシングを行った結果、正確である場合、Ｑｉａｇｅｎ社のプラスミド精製試薬キットでプラスミドを抽出し精製して、各組換え発現ベクターの高品質プラスミドを得た。

【0092】

実施例３、ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴ細胞の製造および培養
下記工程で実施例１における発現ベクターによりＰＢＭＣを電気変換し、ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴ細胞を製造した。使用されるＰＢＭＣはＡｌｌＣｅｌｌｓ社より購入し、健康成人の末梢血に由来する。

【0093】

１）懸濁細胞を５０ｍｌ遠心分離チューブに収集して、１２００ｒｍｐで３ｍｉｎ遠心分離する。

【0094】

２）上澄みを捨て、生理食塩水を入れて再懸濁させ、１２００ｒｍｐで３ｍｉｎ遠心分離し、生理食塩水を捨てる。この工程を繰り返して細胞を計数する。

【0095】

３）１．５Ｍｌ遠心分離チューブを５つ取り、それぞれ５×１０^６個細胞を入れて、１２００ｒｍｐで３ｍｉｎ遠心分離する。

【0096】

４）上澄みを捨て、電気変換試薬キット（Ｌｏｎｚａ社より購入）を取り、１８μＬのｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ試薬と８２μＬのｓｏｌｕｔｉｏｎ ＩＩ試薬を入れ、第１チューブに５μｇのｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－１プラスミドを入れ、第２チューブに５μｇのｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２プラスミドを入れ、第３チューブに５μｇのｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭプラスミドを入れ、第４チューブおよび第５チューブにそれぞれ５μｇのｐＫＢ２０－ＥＧＦＰプラスミドを入れる。

【0097】

５）遠心分離チューブにプラスミドが混合された細胞懸濁液を電気変換カップに移動し、エレクトロポレーターに入れ、プログラムＴ０２０を選択して、エレクトロポレーションを行う。

【0098】

６）試薬キットのマイクロピペットで電気変換された細胞懸濁液を、ＡＩＭ－Ｖ培養液を入れた６ウェルプレートのウェル（２％ＦＢＳを含むＡＩＭ－Ｖ培養液）に移動し、均一に混合して、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータに置き、４～６時間静置して培養する。さらに、５μｇ／ｍＬのＯＫＴ－３と５μｇ／ｍＬのＣＤ２８抗体を含む混合液で６ウェルプレートの５つのウェルをコーティングし、各ウェルに１ｍＬの混合液を入れ、６ウェルプレートを３７℃でインキュベートする。

【0099】

７）６時間後、抗体コーティング混合液を取り除き、ＰＢＳで２回洗浄する。電気変換後に３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータで静置して培養した細胞を、ＯＫＴ－３とＣＤ２８抗体でコーティングされた６ウェルプレートに移動して、各ウェルに培養液を３ｍＬまで補充し、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－１、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２とｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭを電気変換する細胞培養液にＩＬ－２を入れず、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを電気変換する２ウェル細胞のうちの１ウェル細胞の培養液にＩＬ－２（ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ－ＩＬ－２－）を入れず、もう１つのウェルの細胞の培養液にＩＬ－２を最終濃度が５００Ｕ／ｍＬとなるように入れて培養し（ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ－ＩＬ－２＋）、各群細胞の成長状況をそれぞれ観察した。

【0100】

結果は図１、図２および図３に示される。図１は、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２を電気変換するＴ細胞（ＩＬ－７－ＣＤ５２－２）とｐＫＢ２０－ＥＧＦＰを電気変換した後にＩＬ－２を通常通りに入れて培養する（ＥＧＦＰ－ＩＬ－２＋）Ｔ細胞の、顕微鏡における形態である。ＥＧＦＰ－ＩＬ－２＋群Ｔ細胞と比較すれば、ＩＬ－７－ＣＤ５２－２群Ｔ細胞の凝集程度がより顕著であり、Ｔ細胞成長中の凝集は通常、自身活性化レベルの向上に関連する。図２は、電気変換後に１３日間まで培養し、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－１群とｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２群の細胞数量がｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭ群より明らかに高く、上記３群の細胞数量がｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ－ＩＬ－２＋群より明らかに高いことを示している。ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ－ＩＬ－２－群は顕著な細胞増殖を示していない。図３は、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－１群、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２群とｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭ群の細胞生存率がほぼ同じく、９０％以上であり、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ－ＩＬ－２＋群よりやや高いことを示している。ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ－ＩＬ－２－群の細胞生存率は、電気変換後に７日間培養してから低下し始め、電気変換後１３日間で２０％前後まで低下した。図１～図３の結果によれば、膜表面に定着されるＩＬ－７が細胞培養液におけるＩＬ－２の代わりにＰＢＭＣ細胞に対して顕著な活性化と増殖作用を果たすと共に、ＣＤ５２のＧＰＩによって細胞膜表面に定着されるＩＬ－７がＰＢＭＣに対する刺激と増殖効果の向上は通常のポリペプチドである膜貫通型ドメインの膜表面定着効果より優れることが分かる。

【0101】

実施例４、ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表面ＩＬ－７を発現する陽性Ｔ細胞比率の検出
Ａ、間接法で細胞膜表面に定着されるＩＬ－７発現陽性の細胞比率を検出し、方法は下記の通りである。

【0102】

１）ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－１、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２とｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭ群細胞をそれぞれ収集して、細胞ごとに１×１０^６個細胞を収集し、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離する。

【0103】

２）上澄みを捨て、生理食塩水をそれぞれ入れ、細胞を再懸濁させて、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離する。

【0104】

３）上澄みを捨て、１００μＬ生理食塩水をそれぞれ入れ、細胞を再懸濁させ、各チューブに１μＬのビオチン標識を実施した抗ＩＬ－７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄより購入、製品番号：５０６６０２）をそれぞれ入れて、４℃で３０分間インキュベートする。

【0105】

４）適量の生理食塩水をそれぞれ入れ、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、２回洗浄して、上澄みを捨てる。

【0106】

５）１００μＬ生理食塩水をそれぞれ入れ、細胞を再懸濁させ、１μＬのＰＥ標識を実施したストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒより購入、製品番号：Ｓ２０９８２）を各チューブにそれぞれ入れ、均一に混合して、４℃で３０ｍｉｎインキュベートする。

【0107】

６）適量の生理食塩水をそれぞれ入れ、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、２回洗浄して、上澄みを捨てる。

【0108】

７）４００μＬ生理食塩水で再懸濁させて、フローサイトメータにより検出する。

【0109】

フローサイトメトリーの結果によれば、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－１、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２とｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭ群細胞の外来遺伝子の発現陽性の細胞比率が３０％以上である。

【0110】

Ｂ、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２群細胞の細胞外領域に含まれるＢＣＭＡ細胞外ドメインをラベルとして、直接法で実施例３により得られたｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２群細胞に対して、フローサイトメータにより外来遺伝子の発現陽性の細胞比率を検出し、方法は下記の通りである。

【0111】

１）ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２群細胞を１×１０^６個収集して、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離する。

【0112】

２）上澄みを捨て、生理食塩水をそれぞれ入れ、細胞を再懸濁させて、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離する。

【0113】

３）上澄みを捨て、１００μＬ生理食塩水をそれぞれ入れ、細胞を再懸濁させ、各チューブに２μＬのＢＣＭＡフローサイトメトリー用抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄより購入、製品番号：３５７５０４）をそれぞれ入れて、室温で３０分間インキュベートする。

【0114】

４）適量の生理食塩水をそれぞれ入れ、１０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、２回洗浄して、上澄みを捨てる。

【0115】

５）４００μＬ生理食塩水で再懸濁させて、フローサイトメータにより検出する。

【0116】

結果は図４に示される。ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２群細胞のＢＣＭＡ＋細胞比率が３３．６２％であり、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２群細胞の陽性細胞比率が３０％以上であった。間接法で検出された結果とほぼ一致している。

【0117】

実施例５、ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴ細胞のＩＦＮ－γ分泌検出
実施例３により製造して取得された各群細胞を収穫し、ＨＴＲＦ ＩＦＮ－γ検出試薬キット（Ｃｉｓｂｉｏ Ｈｕｍａｎ ＩＦＮ ｇａｍｍａ ｋｉｔ製品番号：６２ＨＩＦＮＧＰＥＴ）により取扱説明書に記載される方法でＩＦＮ－γ分泌レベルを検出する。結果は図５に示される。図５は、各群細胞から上澄みに分泌するＩＦＮ－γ濃度が２５０００ｐｇ／ｍＬを超えたことを示している。ここで、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２群細胞のＩＦＮ－γ分泌レベルはｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－１群とｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭ群より高く、ｐＫＢ２０－ＥＧＦＰ－ＩＬ－２＋群の分泌レベルに相当する。Ｔ細胞の表面でのＣＤ５２アンカーによる発現がＩＬ－２によるインキュベートと類似するサイトカイン分泌効果を持つことを示している。

【0118】

実施例６、ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴＣＲ－Ｔの製造
ヒト活性化Ｔ細胞の製造：
５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体と５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８抗体を含むコーティング液により６ウェルプレートを室温で２～４時間コーティングし、コーティング液を吸い取ってから、生理食塩水でウェルプレートを１～３回洗浄し、２％ＦＢＳを含むＡＩＭ－Ｖ培地を入れて使用に備える。ヒト末梢血ＰＢＭＣ（ＨＬＡ－^＊０２：０１、ＡＬＬＣＥＬＬＳより購入）を３７℃水浴で蘇生させ、ＰＢＭＣを２～４ｈ接着培養した。そのうち、接着していない懸濁細胞はナイーブＴ細胞である。懸濁細胞を１５ｍｌ遠心分離チューブに収集して、１２００ｒｍｐで３ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨て、生理食塩水を入れて、１２００ｒｍｐで３ｍｉｎ遠心分離し、生理食塩水を捨て、この工程を繰り返す。さらに、洗浄されたナイーブＴ細胞を、用意された培地を入れた抗体コーティングウエルに移動し、３７℃、５％ＣＯ_２で３～４日培養してから、その後の実験に利用される。

【0119】

ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＥＧＦＰを発現、およびＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ－ＥＧＦＰ＋ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴＣＲ－Ｔ細胞の、電気変換により製造する：

【0120】

１）ＡＩＭ－Ｖ培地を１ウェルあたり２ｍＬで１２ウェルプレートの２つのウェルに事前に入れてから、インキュベータに入れて、３７℃、５％ＣＯ_２で１時間予熱する。

【0121】

２）下記表の１ウェルあたり単回使用量の電気変換液の配合比で２ウェル調製する。

【表1】

【0122】

３）得られた活性化Ｔ細胞を取り、２つのＥＰチューブに入れ、各ＥＰチューブに細胞をそれぞれ５×１０^６個入れて、１２００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離し、上澄みを捨ててから、５００μＬ生理食塩水で細胞を再懸濁させ、遠心分離工程を繰り返し、細胞を洗浄して沈殿させる。

【0123】

４）２）で配置された電気変換液系２ウェルのうちの１ウェルに６μｇのプラスミドｐＫＢ２０－ＴＣＲを入れて、もう１つのウェルに３μｇのｐＫＣ２０－ＴＣＲ＋３μｇのｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５２－２を入れてから、室温で３０ｍｉｎ以内静置する。

【0124】

５）４）で配置された、プラスミドを含む電気変換液で再懸濁させた２チューブの活性化Ｔ細胞から、細胞再懸濁液を１チューブあたり１００μＬでゆっくりと吸い取り、１００μＬのＬＯＮＺＡ電気変換カップに移動し、電気変換カップをＬＯＮＺＡ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ^ＴＭ２ｂ電気変換槽に入れて、電気変換プログラムを立ち上げた。電気変換プログラムはＴ－０２０を選択する。

【0125】

６）電気変換を完了してから、電気変換カップをゆっくりと取り出し、細胞懸濁液を吸い取り、ＥＰチューブに移動した。予熱されたＡＩＭ－Ｖ培地を１チューブあたり２００μＬ入れてから、１）における１２ウェルプレートの予熱されたＡＩＭ－Ｖ培地を含むウェルに移動し、３７℃、５％ＣＯ２で培養した。１ｈ培養してから、最終濃度が５μＭとなるように化合物Ｇ１５０（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓより購入）を入れた。その後、１３日間培養し続け、その間に細胞増殖状況に応じて継代し、１３日間後、各電気変換サンプルの細胞数と細胞生存率について検出した。

【0126】

上記方法により製造された外来遺伝子を発現する細胞を、それぞれＴＣＲ－Ｔ、ＩＬ－７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－Ｔと名付けた。

【0127】

得られた上記細胞に対して、フローサイトメータ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｙｔｏｆｌｅｘ）によりＥＧＦＰ陽性の細胞比率を検出した。ＴＣＲ－Ｔに対して、ＥＧＦＰ陽性細胞がＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲ遺伝子の発現陽性の細胞だと考えられる。ＩＬ－７－ＣＤ５２－２とＴＣＲをコトランスフェクションした細胞に対して、ｐＫＣ２０ベクターにＰＢトランスポザーゼの発現カセットを含まないため、ＥＧＦＰ陽性は、ＴＣＲ－ＥＧＦＰの成功した統合発現の依存するＰＢトランスポザーゼが、ＩＬ－７－ＣＤ５２－２遺伝子をコードするｐＫＢ２０ベクターの発現に由来することを示している。そのため、ＩＬ－７－ＣＤ５２－２とＴＣＲをコトランスフェクションした細胞において、ＥＧＦＰ陽性細胞がＩＬ－７－ＣＤ５２－２とＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの二重統合発現だと考えられる。

【0128】

得られたフローサイトメトリー結果は図６に示される。図６の１行目はＴＣＲ－Ｔフローサイトメトリー結果であり、２行目はＩＬ－７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－Ｔフローサイトメトリー結果である。図５は、ＴＣＲ－ＴにおけるＴＣＲ統合発現陽性の細胞の、ＧＦＰ陽性細胞による反応の比率が２７．９２％であり、ＩＬ－７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－ＴにおけるＩＬ－７－ＣＤ５２－２とＴＣＲ二重統合発現陽性の細胞の、ＧＦＰ陽性細胞による比率が１３．４８％であることを示している。

【0129】

実施例７、ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴＣＲ－Ｔの、標的細胞に対する殺傷
ＮＹ－ＥＳＯ－１発現陽性のＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１型黒色腫細胞系Ａ３７５（アメリカンタイプカルチャーコレクションＡＴＣＣより購入、Ｃａｔ．ＣＲＬ－１６１９）を選定して標的細胞とし、ＡＣＥＡ社のリアルタイム非標識細胞機能アナライザー（ＲＴＣＡ）で実施例６により製造して取得したＴＣＲ－ＴとＩＬ－７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－Ｔ細胞のインビトロ殺傷活性を検出した。具体的な工程は下記の通りである。

【0130】

（１）ゼロ設定：各ウェルに５０μＬのＤＭＥＭまたは１６４０培養液を入れ、装置に入れ、ｓｔｅｐ１を選択して、ゼロ設定する。

【0131】

（２）標的細胞プレーティング：黒色腫細胞Ａ３７５を、１ウェルあたり１０^４個細胞／５０μＬで検出電極を含むプレートにプレーティングし、細胞が安定的になるまで数分間静置してから、装置に入れ、ｓｔｅｐ２を開始して、細胞を培養する。

【0132】

（３）エフェクター細胞の添加：標的細胞を細胞指数（Ｃｅｌｌ Ｉｎｄｅｘ）が１．０に達するように２４ｈ培養した後、ｓｔｅｐ２を一時的に停止し、エフェクター細胞を１ウェルあたり５０μＬで添加する。実施例６における陽性細胞比率に従って、それぞれ１：１、０．５：１といったＥＴ比でエフェクター細胞数量を添加し、ｓｔｅｐ３を開始し、８０ｈ以上共培養し続けて、細胞の増殖曲線を観察する。

【0133】

結果を図７と図８に示す。図７および図８は、ＥＴ比１：１および０．５：１の条件で、ＩＬ－７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－Ｔの標的細胞Ａ３７５に対する殺傷レベルがＴＣＲ－Ｔより明らかに高く、ＣＤ５２リンカーによって定着されるＩＬ－７の発現がＴＣＲ－Ｔ細胞の抗原に対する認識および標的細胞に対する殺傷力を明らかに向上させることを示している。

【0134】

実施例８、ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表面抗ＨＥＲ２抗体を発現する腫瘍浸潤リンパ球の製造およびインビトロ殺傷の検出
乳腺腫瘍組織の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の製造：
切除されたばかりのＨＥＲ２＋乳がん標本を収集し、直ちに無菌条件で処理する。具体的な方法は下記の通りである。乳腺腫瘍標本の周りの正常な組織と壊死部分を除去し、標本の異なる部分から１～２ｍｍ^３サイズの組織ブロックを切り取り、２４ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ１つ入れる。各ウェルにそれぞれ２ｍＬ完全培地（１０％ＦＢＳを含むＡＩＭ－Ｖ培地）と３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を入れる。２４ウェルプレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養する。培養開始後の５～６日間に全てのウェルに半分の液を交換する。その後、ＴＩＬ成長状況に応じて、１～２日間おきに半分の液を交換する。ウェル内にＴＩＬが一杯になるまで成長し、しかも全ての接着細胞が除かれると、各ウェル内に一杯になるまで成長したＴＩＬを収集する。

【0135】

ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表面抗ＨＥＲ２抗体を発現するＴＩＬの製造、および腫瘍初代細胞のインビトロ殺傷：
実施例３に記載される方法で、上記製造された乳腺腫瘍ＴＩＬ細胞に対して、実施例１により製造されたｐＫＢ２０－αＨｅｒ２－ＣＤ５２ベクターを電気変換して、αＨｅｒ２－ＣＤ５２－ＴＩＬを製造して取得した。部分的に同じ乳腺腫瘍組織を取り、単細胞懸濁液に酵素消化してから、実施例７に記載される方法でＲＴＣＡアナライザーのウェルをプレーティングし、腫瘍細胞の成長速度に応じて、エフェクター細胞の添加時間を標的細胞プレーティング後の１６時間に調整して、ＴＩＬ群とαＨｅｒ２－ＣＤ５２－ＴＩＬ群に分けて、ＴＩＬ群のＥＴ比を０．５：１に設定し、αＨｅｒ２－ＣＤ５２－ＴＩＬ群をそれぞれ０．５：１、１：１、２：１の３つのＥＴ比群に設定して、異なる群別の殺傷効果差異を観察した。

【0136】

結果は図９に示されるように、同じＥＴ比（０．５：１）の前提で、αＨｅｒ２－ＣＤ５２－ＴＩＬの初代乳がん細胞に対する殺傷効果が修飾されていないＴＩＬより明らかに高い。ＥＴ比の向上に伴って、αＨｅｒ２－ＣＤ５２－ＴＩＬの初代乳がん細胞に対する殺傷効果も明らかに向上するため、αＨｅｒ２－ＣＤ５２のＴＩＬ表面における発現がＴＩＬの相応する相同的対合の標的細胞に対する殺傷力を明らかに向上させることを示している。

【0137】

実施例９、ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表面ＣＤ１３７抗体を発現するＴＣＲ－Ｔの製造および標的細胞のインビトロ殺傷
実施例６に記載される方法で、実施例１により製造されたｐＫＢ２０－αＣＤ１３７－ＣＤ５２ベクターとｐＫＣ２０－ＴＣＲベクターをＴ細胞にコトランスフェクションして、αＣＤ１３７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－Ｔを取得した。使用されるＴ細胞は実施例６で使用されるＴ細胞と同じロットである。実施例７に記載される方法で、αＣＤ１３７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－Ｔと実施例６により製造されたＴＣＲ－Ｔを利用して、標的細胞Ａ３７５に対してＲＴＣＡ殺傷を検出した。プレーティングしたＡ３７５の成長速度に応じて、エフェクター細胞の添加時間を標的細胞プレーティング後の１６時間に調整して、ＴＣＲ－Ｔ群とαＣＤ１３７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－Ｔ群に分けて、ＴＣＲ－Ｔ群のＥＴ比を０．５：１に設定し、αＣＤ１３７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－Ｔ群をそれぞれ０．５：１、１：１、２：１の３つのＥＴ比群に設定して、異なる群別の殺傷効果差異を観察した。

【0138】

結果は図１０に示されるように、同じＥＴ比（０．５：１）の前提で、αＣＤ１３７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－Ｔの標的細胞Ａ３７５に対する殺傷効果が修飾していないＴＣＲ－Ｔより明らかに高い。ＥＴ比の向上に伴って、αＣＤ１３７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－ＴのＡ３７５細胞に対する殺傷効果も明らかに向上するため、αＣＤ１３７－ＣＤ５２のＴＣＲ－Ｔ表面における発現がＴＣＲ－Ｔの標的細胞に対する殺傷力を明らかに向上させることを示している。

【0139】

実施例１０、その他のＧＰＩタンパク質によって定着される膜表面ＩＬ－７の発現ベクターの構築
下記ＩＬ－７－ＧＰＩアンカー型タンパク質の融合タンパク質をそれぞれ構築する

【0140】

ＩＬ－７－ＣＤ４８：ＣＤ４８シグナルペプチド－ＩＬ－７－ＣＤ８細胞外領域－ＣＤ４８ ＧＰＩシグナル配列、そのコーディング核酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、タンパク質配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４

【0141】

ＩＬ－７－ＣＤ５５：ＣＤ５５シグナルペプチド－ＩＬ－７－ＣＤ８細胞外領域－ＣＤ５５ ＧＰＩシグナル配列、そのコーディング核酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、タンパク質配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６

【0142】

ＩＬ－７－ＡＬＰＰ：ＡＬＰＰシグナルペプチド－ＩＬ－７－ＣＤ８細胞外領域－ ＡＬＰＰ ＧＰＩシグナル配列、そのコーディング核酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、タンパク質配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８

【0143】

ＩＬ－７－ＣＤ９０：ＣＤ９０シグナルペプチド－ＩＬ－７－ＣＤ８細胞外領域－ ＣＤ９０ ＧＰＩシグナル配列、そのコーディング核酸配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、タンパク質配列：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０

【0144】

そのうち、ＣＤ４８ ＧＰＩシグナル配列、ＣＤ５５ ＧＰＩシグナル配列、ＡＬＰＰ ＧＰＩシグナル配列とＣＤ９０ ＧＰＩシグナル配列のアミノ酸配列はそれぞれＣＮ１１０７０９４１６Ａ明細書の１４ページに記載されるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５～１８に示される。

【0145】

実施例１に記載される方法で、ＩＬ－７－ＣＤ４８、ＩＬ－７－ＣＤ５５、ＩＬ－７－ＡＬＰＰおよびＩＬ－７－ＣＤ９０の発現カセットを含むｐＫＢ２０ベクターを構築して、それぞれｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ４８、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５５、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＡＬＰＰおよびｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ９０と名付けた。得られた組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ（ＤＨ５ｃ）に形質転換し、シークエンシングを行った結果、正確である場合、Ｑｉａｇｅｎ社のプラスミド精製試薬キットでプラスミドを抽出し精製して、各組換え発現ベクターの高品質プラスミドを得た。

【0146】

実施例１１、その他のＧＰＩタンパク質によって定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴ細胞の製造および培養
実施例３に記載される方法で、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ４８、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５５、ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＡＬＰＰおよびｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ９０を利用して、健康ヒトのドナーに由来するＰＢＭＣを電気変換し、電気変換後の細胞培養液にＩＬ－２を入れず、ＩＬ－７－ＣＤ４８、ＩＬ－７－ＣＤ５５、ＩＬ－７－ＡＬＰＰおよびＩＬ－７－ＣＤ９０を発現するＴ細胞を製造した。各群細胞の成長状況をそれぞれ観察して、実施例３により製造されたＩＬ－７－ＣＤ５２を発現するＴ細胞と比較し、ＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭを発現するＴ細胞を対照群とする。

【0147】

結果を図１１と図１２に示す。図１１は、ＩＬ－７－ＣＤ９０を発現するＴ細胞の増殖レベルがＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭを発現する対照群とほぼ相当する。ＩＬ－７－ＣＤ４８、ＩＬ－７－ＣＤ５５、ＩＬ－７－ＡＬＰＰを発現するＴ細胞の増殖レベルはＩＬ－７－ＣＤ８ＴＭの対照群より明らかに高い。ＩＬ－７－ＣＤ５２－２を発現するＴ細胞の増殖レベルはその他の各群より高い。図１２は、各群の異なる膜表面ＩＬ－７ベクターを電気変換したＴ細胞の生存率は異なる時点でもほぼ同じであることを示している。

【0148】

上記結果によれば、ＧＰＩタンパク質により定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴ細胞は、Ｔ細胞の活性化および増殖レベルをそれぞれ違う程度で向上させ、ＣＤ５２により定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴ細胞の活性化および増殖の向上程度は、ＣＤ４８、ＣＤ５５、ＡＬＰＰおよびＣＤ９０により定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴ細胞より、明らかに高い。

【0149】

実施例１２、その他のＧＰＩタンパク質により定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴＣＲ－Ｔの製造およびインビトロ殺傷の検出
実施例６に記載される方法で、ｐＫＣ２０－ＴＣＲ＋ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ４８、ｐＫＣ２０－ＴＣＲ＋ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ５５、ｐＫＣ２０－ＴＣＲ＋ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＡＬＰＰおよびｐＫＣ２０－ＴＣＲ＋ｐＫＢ２０－ＩＬ－７－ＣＤ９０をそれぞれコトランスフェクションし、ＩＬ－７－ＣＤ４８－ＴＣＲ－Ｔ、ＩＬ－７－ＣＤ５５－ＴＣＲ－Ｔ、ＩＬ－７－ＡＬＰＰ－ＴＣＲ－ＴおよびＩＬ－７－ＣＤ９０－ＴＣＲ－Ｔを製造して取得し、フローサイトメトリーによりＩＬ－７－ＣＤ４８－ＴＣＲ－Ｔ、ＩＬ－７－ＣＤ５５－ＴＣＲ－Ｔ、ＩＬ－７－ＡＬＰＰ－ＴＣＲ－ＴおよびＩＬ－７－ＣＤ９０－ＴＣＲ－Ｔを検出した陽性細胞比率はそれぞれ１５．０９％、１６．７４％、１２．５３％および１７．６６％である。

【0150】

実施例７に記載される方法で、Ａ３７５細胞系を選定して標的細胞とし、ＩＬ－７－ＣＤ４８－ＴＣＲ－Ｔ、ＩＬ－７－ＣＤ５５－ＴＣＲ－Ｔ、ＩＬ－７－ＡＬＰＰ－ＴＣＲ－Ｔ、ＩＬ－７－ＣＤ９０－ＴＣＲ－Ｔおよび実施例６により製造されたＴＣＲ－Ｔ、ＩＬ－７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－Ｔをエフェクター細胞とし、生細胞でＥＴ比０．５：１を計算して、殺傷を検出した。エフェクター細胞を標的細胞と９０時間以上共培養して、細胞増殖の曲線を観察した。

【0151】

結果は図１３に示される。ＥＴ比０．５：１の条件で、各群の異なるＧＰＩタンパク質により定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴＣＲ－Ｔの、標的細胞Ａ３７５に対する殺傷効果は、膜表面ＩＬ－７を発現しないＴＣＲ－Ｔより明らかに優れる。各群のＧＰＩにより定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴＣＲ－Ｔにおいて、ＩＬ－７－ＣＤ５２－２を発現するＩＬ－７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－Ｔの、標的細胞に対する殺傷効果は、ＩＬ－７－ＣＤ４８－ＴＣＲ－Ｔ、ＩＬ－７－ＣＤ５５－ＴＣＲ－Ｔ、ＩＬ－７－ＡＬＰＰ－ＴＣＲ－ＴおよびＩＬ－７－ＣＤ９０－ＴＣＲ－Ｔより明らかに優れる。これにより、ＧＰＩにより定着される膜表面ＩＬ－７を発現することで、ＴＣＲ－Ｔの標的細胞に対する殺傷効果をより効果的に向上できるが、ＣＤ５２により定着される膜表面ＩＬ－７の発現による、ＴＣＲ－Ｔの標的細胞に対する殺傷効果の向上は、その他のＧＰＩタンパク質より顕著である。

【0152】

実施例１３、ＣＤ５２リンカーによって定着される膜表面ＩＬ－７を発現するＴＣＲ－Ｔの、体内腫瘍組織に対する殺傷効果
実験動物
免疫不全Ｂ－ＮＤＧマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎより購入）を選定して、ＣＤＸモデル構築用実験動物とする。

【0153】

実験設計と群分け：下記表２に示される

【表2】

【0154】

実験動物に投与する細胞は、実施例６により製造されたＴＣＲ－ＴおよびＩＬ－７－ＣＤ５２－ＴＣＲ－Ｔである。尾静脈注射投与前に細胞を遠心分離してＰＢＳに再懸濁させ、細胞密度が１×１０^８／ｍＬであるＰＢＳ細胞懸濁液を調製する。

【0155】

動物飼養
Ｂ－ＮＤＧマウスを必要な用量で購入した後、ＳＰＦ級実験動物飼育室に飼養する。適応期間が７～１０日間である。

【0156】

環境：マウスを動物飼育室の透明な樹脂製檻に入れる。檻の床材は高圧滅菌が行われた木屑やとうもろこしの芯であり、定期的に交換する。動物飼育室に高効率エアフィルターを配置して、温度を２０～２６℃（６８～７９°Ｆ）に保持し、相対湿度が４０～７０％である。観測し続けると共に、温度と湿度を記録する。照明条件は１日で１２時間蛍光灯照射と１２時間照明無しである。

【0157】

餌と水：実験用マウスは専門のマウス餌（放射線により消毒済み、Ｓｈａｎｇｈａｉ ＳＬＡＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ、中国）を無限量で摂取し、任意の時間で滅菌に近い清潔な水を支障なく飲用してもよい。

【0158】

腫瘍細胞の接種
各マウスの右側皮下にＡ３７５－Ｌｕｃ２腫瘍細胞（アメリカＡＴＣＣより購入、Ｃａｔ．ＣＲＬ－１６１９－ＬＵＣ２）をマウス１匹あたり２×１０^６細胞で接種する。腫瘍の成長を促進するために、接種は０．１ｍＬの５０％マトリックスを含む培地で行う。

【0159】

動物の群分けと投与
腫瘍体積が～５０ｍｍ^３程度に達した場合、１８匹の動物を腫瘍体積でランダムに群分けして（ｎ＝６）、全ての群がベースラインにおいて比較可能性を有するようにする。群分け当日をＰ０とする。実験期間において動物体重と腫瘍体積を週２回測定し、毎日、動物の臨床症状を観察する。腫瘍体積がｍｍ^３で示す。計算式はＶ＝０．５×ａ×ｂ^２である。但し、ａとｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径である。実験終了の当日に各群のマウスから末梢血を採血し、ヒトＣＤ４５フローサイトメトリー用抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄより購入、Ｃａｔ．３０４０３６）で染色した後、フローサイトメータによる検出を行う。同日に各群のマウスにルシフェラーゼの基質フルオレセインを注射することで反応させてから、小動物生体イメージング観測装置により生体蛍光イメージングを行い、各群のマウスの腫瘍負荷の大きさを観察して、蛍光値を記録した。

【0160】

結果
実験結果は図１４～１７に示される。群同士の腫瘍体積の差、腫瘍蛍光値の差異およびリンパ球の血液密度の差異は、対応のない両側ｔ検定により統計的分析を行う。^＊：ｐ＜０．０５、^＊＊：ｐ＜０．０１、^＊＊＊：ｐ＜０．００１。図１４は、投与後２１日目まで、ＰＢＳ対照群を注射する担腫瘍マウスに比べて、ＴＣＲ－Ｔ細胞投与群のマウス腫瘍体積の増大が顕著に抑制されるが、ＴＣＲ－Ｔ投与群に比べて、ＩＬ－７－ＣＤ５２－２ ＴＣＲ－Ｔ投与群の腫瘍体積がさらに顕著に小さくなる。図１５は腫瘍蛍光値および腫瘍体積のトレンドが一致することを示している。投与２１日間後にＴＣＲ－Ｔ投与群の腫瘍蛍光値はＰＢＳ群より明らかに低い。ＩＬ－７－ＣＤ５２－２ ＴＣＲ－Ｔ投与群の蛍光値が０に近い。図１６はＩＬ－７－ＣＤ５２－２ ＴＣＲ－Ｔ投与群のマウス体内にＡ３７５－Ｌｕｃ２腫瘍細胞の蛍光が殆ど見えなくなることを示している。図１７は、投与後２１日目に、ＴＣＲ－Ｔ投与群のマウス体内のヒトリンパ球密度がＰＢＳ投与群よりある程度で増加するが、ＩＬ－７－ＣＤ５２－２ ＴＣＲ－Ｔ投与群のマウス体内の末梢血におけるヒトリンパ球密度がＴＣＲ－Ｔ群より急に増加することを示している。

【0161】

上記結果によれば、ＩＬ－７－ＣＤ５２－２の発現は、ＴＣＲ－Ｔ細胞体内において腫瘍に対する殺傷効果が明らかに向上した。

【0162】

本発明の具体的な実施形態について詳しく記述したにも関わらず、当業者は、開示された全ての教示に基づき、その詳細内容について様々な修正と置換を実施してもよく、これらの変更がすべて本発明の保護範囲にあると理解すべきである。本発明の全範囲は、添付される請求項およびその任意の同等物より提示される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

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【国際調査報告】