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特表2024-540542耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片，及びその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片，及びその使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/50 20060101AFI20241024BHJP
C12N 15/19 20060101ALI20241024BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20241024BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 17/02 20060101ALI20241024BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241024BHJP
A61K 8/64 20060101ALI20241024BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C07K14/50 ZNA
C12N15/19
A61K38/18
A61P11/00
A61P17/02
A61P9/00
A61K8/64
A61Q19/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024529603
(86)(22)【出願日】2022-11-21
(85)【翻訳文提出日】2024-07-05
(86)【国際出願番号】 EP2022082545
(87)【国際公開番号】W WO2023089157
(87)【国際公開日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】21209408.0
(32)【優先日】2021-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518185691
【氏名又は名称】エナンティス スポレチノスト エス ルチェニム オメゼニム
(74)【代理人】
【識別番号】110002398
【氏名又は名称】弁理士法人小倉特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ハロウプコヴァー，ラトカ
(72)【発明者】
【氏名】シュチェパーンコヴァー，ヴェロニカ
(72)【発明者】
【氏名】ホラツコヴァー，アネタ
(72)【発明者】
【氏名】ベドナー，ダヴィト
(72)【発明者】
【氏名】クタルコヴァー，カテリーナ
(72)【発明者】
【氏名】ラスコヴァー，ヴェロニカ
【テーマコード（参考）】
4C083
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C083AD411
4C083CC02
4C083EE01
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084DB54
4C084MA63
4C084NA03
4C084ZA36
4C084ZA59
4C084ZA89
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA01
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は，ＦＧＦ１０活性を有し，配列番号：１のＳｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８のアミノ酸配列を有するか若しくはそれから成る配列番号：３，又は配列番号：１のＬｅｕ４０～Ｓｅｒ２０８のアミノ酸配列を有するか若しくはそれから成る配列番号：５と少なくとも８５％の配列同一性を有するか若しくはそれから成る耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド，あるいは少なくともアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを含むその断片に関する。アミノ酸置換Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ，及びＮ１８１Ｄのいずれかが更に含まれ得ることが好ましい。本発明は更に，再生医療若しくは他の関連医療用途又は化粧品における対象の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドの使用を開示する。更に，本発明は，ヒト胚性幹細胞の増殖及び分化又は，スフェロイド並びにオルガノイドの形成及び分化に適した対象の熱安定性ＦＧＦ１０ポリペプチドを含む培地を開示する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＦＧＦ１０活性を有し，配列番号：１のＳｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８のアミノ酸配列を有する配列番号：３と少なくとも８５％の配列同一性を有する若しくはそれから成る耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片であって，前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は少なくともアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを含む，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項2】
前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，配列番号：３若しくはその断片を有する又はそれから成り，前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は少なくともアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを含む，請求項１記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項3】
前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は更に，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ及び，Ｎ１８１Ｄから成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換から成る，請求項１又は２記載の熱安定性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項4】
前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は更に，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ及び，Ｎ１８１Ｄから成る群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む，請求項１又は２記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項5】
前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は更に，３つのアミノ酸置換Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ及び，Ｎ１８１Ｄを含む，請求項１又は２記載の熱安定性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項6】
更に以下：‐ 配列番号：４の少なくとも一部若しくは全アミノ酸又は，配列番号：３のＮ末端のメチオニン；
及び／又は
‐ Ｎ末端又はＣ末端部分における，最大長が２０のアミノ酸である少なくとも１つの短い融合アミノ酸配列（タグ）
を有する，請求項１～５いずれか１項記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項7】
前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，配列番号：１のＬｅｕ４０～Ｓｅｒ２０８のアミノ酸配列を有する配列番号：５若しくはその断片と少なくとも８５％の配列同一性を有する又はそれから成り，前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は，少なくともアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを含む，請求項１記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項8】
前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，配列番号：５若しくはその断片を有する又はそれから成り，前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は，少なくともアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを含む，請求項７記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項9】
前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は更に，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ及び，Ｎ１８１Ｄから成る群より選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む，請求項７又は８記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項10】
前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は更に，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ及び，Ｎ１８１Ｄから成る群より選択される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む，請求項７又は８記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項11】
前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は更に３つのアミノ酸置換，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ及び，Ｎ１８１Ｄを含む，請求項７又は８記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項12】
配列番号：５，配列番号：７，配列番号：８，配列番号：９，配列番号：１０，配列番号：１１，配列番号：１２又は配列番号：１３から成るＦＧＦ１０ポリペプチドの群より選択される請求項７～１１いずれか１項記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項13】
更に以下‐ 配列番号：６のアミノ酸の少なくとも一部若しくは全部又は，配列番号：５のＮ末端のメチオニン；
及び／又は
‐ Ｎ末端又はＣ末端部分における，最大長が２０のアミノ酸である少なくとも１つの短い融合アミノ酸配列（タグ）
を有する請求項７～１２いずれか１項記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項14】
更に，配列番号：５，配列番号：７，配列番号：８，配列番号：９，配列番号：１０，配列番号：１１，配列番号：１２，又は配列番号：１３のいずれかのＮ末端で，配列番号：６を有する請求項７～１２いずれか１項記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項15】
再生医療における使用，好ましくは様々なストレスを掛けた後の肺上皮再生又は，創傷及び潰瘍の治癒又は，他の関連する医療用途，例えば心臓治療のための請求項１～１４いずれか１項記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド。
【請求項16】
化粧品中での，好ましくはコラーゲン合成，皮膚強度，抗老化治療及び，毛髪成長の非治療的刺激を支援する際の，請求項１～１４いずれか１項記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドの使用。
【請求項17】
ヒト胚性幹細胞の増殖及び分化又は，スフェロイド及びオルガノイド，好ましくは肺オルガノイド，胃オルガノイド，肝オルガノイド，膵臓オルガノイド及び，前立腺オルガノイドの形成及び分化のための培地であって，前記培地中に１０ng/mL～５００ng/mLで有効量の請求項１～１４いずれか１項記載の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドを含む培地。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は，野生型ＦＧＦ１０と比較して熱安定性（thermal stability又はthermostability）が改善された耐熱性（thermostable）改変線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０）又はその断片（フラグメント），並びにスフェロイド及びオルガノイドの培養，再生医療，又は他の関連医療用途若しくは化粧品におけるその使用に関する。本発明は更に，ヒト胚性幹細胞の増殖及び分化，並びにスフェロイド及びオルガノイドの形成及び分化に好適なＦＧＦ１０から成る培地に関する。
【背景技術】
【0002】
線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ１０，ケラチノサイト成長因子２，ＫＧＦ‐２，ＫＧＦ２，又はｒｈＫＧＦ２とも称する）は，ヘパリンと相互作用する線維芽細胞成長因子の５つのパラクリン作用サブファミリー（paracrine-acting subfamilies）のうちの１サブファミリーに属する。近縁のＦＧＦ３，ＦＧＦ７，及びＦＧＦ２２と共に，ＦＧＦ１０はいわゆるＦＧＦ７サブファミリーを形成する。このサブファミリーは，そのメンバーが間葉でのみ分泌され，上に重なる上皮に存在するレセプターＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１ｂ）とＦＧＦＲ２（ＦＧＦＲ２ｂ）との「ｂ」アイソフォームを特異的に活性化するという点で，他のＦＧＦより独特である（Itoh, N. & Ornitz, D.M., 2004, Trends Genet. 20:563‐569）。ＦＧＦ１０は胚の器官形成及び組織パターン化に重要な役割を担い，細胞増殖及び細胞分化の制御を経て成体哺乳動物の創傷治癒及び組織恒常性を媒介する（Beenken, A. & Mohammadi, M., 2009, Nat. Rev. Drug Discov. 8:235‐253）。ＦＧＦ１０は上皮‐間葉相互作用を媒介することが分かっており，この相互作用は肺の発生及び様々なストレスを経た後の再生に不可欠である（Tong, L. et al., 2016, Sci. Rep. 6:21642）。ＦＧＦ１０は更に，四肢，甲状腺，下垂体，腎臓，歯，毛包，唾液腺，内耳，胸腺，腺胃，及び膵臓の発生にも必要である（Itoh, N., 2016, Cytokine Growth Factor Rev. 28:63-69）。
【0003】
ヒトＦＧＦ１０のｃＤＮＡは，３７アミノ酸の疎水性Ｎ末端シグナルペプチドを有する２０８アミノ酸残基タンパク質をコードする。ＦＧＦ１０は脊椎動物種で，遺伝子構造とアミノ酸配列との両方において高度に保存されている（Ornitz, D.M & Itoh, N., 2001, Genome Biol. 2: 3005）。脊椎動物種全体では，オルソロガスなＦＧＦ１０タンパク質同士は約８５％のアミノ酸配列同一性及び類似の生物学的機能を共有している（Ornitz, D.M & Itoh, N., 2015, Rev. Dev. Biol. 4:215-266）。ＦＧＦ１０は，保存された約１２０アミノ酸のコア領域（アミノ酸７５～１６６及び１７６～２０５）を含み，この領域は他のパラクリンＦＧＦメンバーと相同性（約３０～６０％）であり（Emoto, H. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 23191-23194），１２本のβ‐鎖から成るβ‐三葉結び目フォールドを有する（Yeh, B.K. et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100:2266-2271）。ＦＧＦ１０のコア領域では，アミノ酸のほとんどがＦＧＦＲ２レセプターとの相互作用に重要である。
【0004】
ＦＧＦ１０とＦＧＦＲ２ｂレセプターとの選択的相互作用は，レセプターを自己リン酸化し，その後，細胞内シグナル伝達経路（ＲＡＳ‐ＭＡＰＫ，ＰＩ３Ｋ‐ＡＫＴ，及びＰＬＣγ１）を活性化し，細胞生存を促進し，分裂促進性細胞応答を誘導し，細胞移動性を媒介する。上皮増殖や，胚発生中及び出生後の生活中における分化系列決定を制御する能力，並びにげっ歯類動物モデルで実証された損傷後の上皮再生を刺激する能力があることから，ＦＧＦ１０の主な治療可能性は，肺胞細胞の損傷を予防し，損傷した肺の正常な上皮機能を回復させることにある（Yuan, T. et al., 2018, Front. Genet. 9:418）。ＦＧＦ１０の可能性ある他の治療用途には，創傷治癒（米国特許第６，６５３，２８４号明細書），心臓疾患の治療（Rochairs, F. et al., 2014, Cardiovasc. Res. 104:432-442），又は肥満及び代謝性疾患の治療（Fisher, C. et al., 2017, Nat. Commun. 8:2079）が挙げられる。治療用途以外にも，ＦＧＦ１０は様々な胚性幹細胞，スフェロイド，及びオルガノイドの培地の成分として使用されることが多い（US 6,692,961 B1; Rabata, A. et al., 2020, Front. Cell Dev. Biol. 21:574）。
【0005】
しかし，ＦＧＦ１０の実用的な可能性は，その短い半減期（無細胞培地中では２４時間未満），低い熱安定性，及び生物学的活性の急速な喪失を伴うタンパク質分解に対する脆弱性から実証された固有の不安定性により制限されている（Buchtova, M. et al., 2015, Cell. Mol. Life Sci., 72: 2445-2459; Chen, G. et al., 2012, Stem Cells 30:623‐630）。ＦＧＦ１０の安定性が低いことは，このタンパク質の貯蔵，輸送，及び実用化にとって大きな障害となっている。安定性が低いため，ＦＧＦ１０は細胞培養で頻繁に入れ替えなければならず，濃度の変動が細胞の適応度に悪影響を及ぼす可能性がある。分解の結果生じた非折り畳み型又は凝集型タンパク質形態は毒性や免疫原性を有する可能性があるため，治療用途についても同様である（Chen, B.L. & Arakawa, T., 1996, J. Pharm. Sci. 85:419-426）。
【0006】
ＦＧＦ１０安定化の典型的なプロセスはヘパリンの添加に代表される。ヘパリン結合はＦＧＦ１０を熱や酸による変性から保護し，半減期を延長する（Buchtova, M. et al., 2015, Cell. Mol. Life Sci., 72: 2445-2459）。しかし，ヘパリンは主に肥満細胞により生成され，その抗凝固特性は細胞環境の脆弱なバランスに更に影響を及ぼす可能性があるため，ヘパリンの使用は生理的用途ではない。ＦＧＦ１０を医療や化粧品に使用するためには，より高い安定性を得るための様々な方法を開発しなければならない。
【0007】
ヘパリンを使用せずにＦＧＦ１０を安定化させるために，他の戦略も採用されている。ＷＯ２０１３／０８２１９６（又は米国特許１０，０３９，８０７号）に記載されている戦略は，ヘパリン模倣スルホン酸ポリマー及びコポリマーをＦＧＦ１０と併用して安定化を図るものである。他の戦略は，還元剤（米国特許第７，７５４，６８６号），ショ糖オクタ硫酸塩添加（米国特許第５，２０２，３１１号），ヒドロキシプロピルセルロース添加（米国特許第５，１８９，１４８号），硫酸グルカン添加（欧州特許第０３４５６６０号），ポリアニオン‐ＰＥＧ接合体（Khondee, S., et al., 2011, Biomacromolecules 12:3880-3894），又はキレート剤（米国特許第５，２１７，９５４号）を用いてＦＧＦポリペプチドを安定化している。特許文献，米国特許第８，３０４，３８７号には，凍結乾燥に有用なケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）の新規な安定的製剤が記載されており，ここではＫＧＦは糖，界面活性剤，又は増量剤と併用している。欧州特許７５０６２８号明細書には，組換え技術により生成されたＦＧＦ１０が記載されている。このようなポリペプチド，又はこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは，治療目的，例えば，創傷，火傷，及び潰瘍の治癒を促進する目的で，神経細胞障害による神経細胞損傷を予防し，皮膚老化及び脱毛を予防するために使用することが可能である。しかし，この形態のポリペプチドは，いかなる手段によっても安定化されていない。
【0008】
安定化添加物の添加に代わるアプローチとして，タンパク質工学が挙げられる。タンパク質工学は，タンパク質の安定性を高めるアミノ酸配列の置換を導入する。特許文献，欧州特許第０９５０１００号明細書は，Ｎ末端又はＣ末端部分を切断し，Ｃ末端置換Ｒ１９４Ｅ，Ｒ１９４Ｑ，Ｋ１９１Ｅ，Ｋ１９１Ｑ，Ｒ１８８Ｅ，Ｒ１８８Ｑを有する人工形態のＦＧＦ１０ポリペプチドに言及しており，これら置換は大腸菌（E.coli）でのタンパク質発現レベル及び溶解性を高める目的で構築され，治療用途に使用可能である。しかし，これらの文献は，突然変異や切断が，提供されたＦＧＦ１０変異体の熱安定性や半減期に影響を与えるとは述べておらず，支持もしていない。特許文献，米国特許第６，６５３，２８４号明細書は，軟部組織の成長及び再生を必要とする治療用途のための，Ｎ末端又はＣ末端部分のいずれかを切断したＦＧＦ１０ポリペプチドの液体製剤及び凍結乾燥製剤に言及している。ＦＧＦ１０のいずれの切断形態についても，熱安定性又は半減期の向上は実証されていない。特許文献，ＷＯ２００１／００２４３３号は，Ｎ末端部分で切断され，置換Ｒ６８Ｇ，Ｒ６８Ｓ，Ｒ６８Ａ，Ｒ７８Ａ，Ｒ８０Ａ，Ｋ８１Ａ，Ｋ８７Ａ，Ｋ９１Ａ，Ｋ１３６Ａ，Ｋ１３７Ａ，Ｋ１３９Ａ，Ｋ１４４Ａ，Ｋ１４８Ｅ，Ｋ１４９Ｅ，Ｋ１５１Ａ，Ｋ１５３Ａ，Ｋ１５５Ａ，Ｒ１７４Ａ，Ｋ１８３Ａ，Ｋ１８３Ｑ，Ｋ１８３Ｅ，Ｒ１８７Ａ，Ｒ１８８Ａ，Ｒ１８８Ｅ，又はＫ１９１Ｅを有するＦＧＦ１０ポリペプチドの複数の突然変異形態に言及しており，これらは，活性の促進，安定性の増加，収率の向上，又は溶解性の改善を示し，創傷治癒を促進する治療用途に使用可能である。ＦＧＦ１０ポリペプチドの他の安定化する可能性がある置換，Ｎ１０５Ｄ，Ｃ１０６Ｆ，Ｋ１４４Ｒ，Ｋ１５３Ｍ，及びＩ１５６Ｒは，最近イン・シリコ（In silico）デザインにより同定されているが，これらは実験的に実証されていない（Alizadeh, A.K., et al., 2021, Growth Factors 38:197-209）。
【発明の概要】
【0009】
本発明は，ヒトＦＧＦ１０ポリペプチド（配列番号：１）に由来し，スフェロイド及びオルガノイドの培養，再生医療若しくは他の関連医療用途，又は化粧品に使用できる，単離された熱安定性人工ポリペプチドを提供する。
MWKWILTHCA SAFPHLPGCC CCCFLLLFLV SSVPVTCQAL GQDMVSPEAT
NSSSSSFSSP SSAGRHVRSY NHLQGDVRWR KLFSFTKYFL KIEKNGKVSG
TKKENCPYSI LEITSVEIGV VAVKAINSNY YLAMNKKGKL YGSKEFNNDC
KLKERIEENG YNTYASFNWQ HNGRQMYVAL NGKGAPRRGQ KTRRKNTSAH
FLPMVVHS（配列番号：１）
MWKWILTHCA SAFPHLPGCC CCCFLLLFLV SSVPVTCQAL GQDMVSPEAT
NSSSSSFSSP SSAGRHVRSY NHLQGDVRWR KLFSFTKYFL KIEKNGKVSG
TKKENCPYSI LEITSVEIGV VAVKAINSNY YLAMNKKGKL YGSKEFNNDC
KLKERIEENG YNTYASFNWQ HNGRQMYVAL NGKGAPRRGQ KTRRKNTSAH
FLPMVVHS（配列番号：１）
【0010】
ＦＧＦ１０ポリペプチドの天然の不安定性に起因する欠点は，ＦＧＦ１０活性を有し，配列番号：１又はその機能的断片と８５％の配列同一性を有する単離された耐熱性改変ポリペプチドを提供する本発明により解消される。
【0011】
本発明の主題は，ＦＧＦ１０活性を有し，配列番号：１のＳｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８のアミノ酸配列を有する配列番号：３と少なくとも８５％の配列同一性を有する若しくはそれから成る耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又は，その断片であり，前記耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は少なくともアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを含む。
【0012】
本発明の好ましい実施態様によれば，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，配列番号：３若しくはその断片を有する又はそれから成り，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は少なくともアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを含む。
【0013】
本発明の好ましい実施態様は，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ及びＮ１８１Ｄから成る群より選択される少なくとも１つ又は，少なくとも２つ又は，少なくとも３つのアミノ酸置換を更に含む耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片を開示する。即ち，本発明に従ったポリペプチドは常に，少なくともＬ１５２Ｆ置換；又は，Ｌ１５２Ｆと，Ｖ１２３Ｉ及び／若しくはＱ１７５Ｅ及び／若しくはＮ１８１Ｄとを組み合わせた２つ，３つ又は，４つの置換の組み合わせを示す。
【0014】
ヒトＦＧＦ１０ポリペプチド（配列番号：１）のアミノ酸配列は２０８のアミノ酸から成り，アミノ酸配列の配列番号：１のＮ末端アミノ酸領域ＭＷＫＷＩＬＴＨＣＡ ＳＡＦＰＨＬＰＧＣＣ ＣＣＣＦＬＬＬＦＬＶ ＳＳＶＰＶＴＣ（配列番号：２）はＮ末端シグナルペプチドに相当し，このシグナルペプチドはタンパク質の転位を目的とし，通常，成熟ポリペプチドで除去される。従って，シグナルペプチドは，本発明に従ったＦＧＦ１０ポリペプチドのアミノ酸配列中に存在してもしなくてもよい。大腸菌においてＦＧＦ１０ポリペプチドの組換え生成を行うようないくつかの実施態様では，前記シグナルペプチドは単独のアミノ酸メチオニン（Ｍ）のみで置換してもよい。
【0015】
成熟ヒトＦＧＦ１０ポリペプチドは，その生物学的活性を失うことなく，そのＮ末端において最大３１アミノ酸で更に切断してもよく，従って，Ｎ末端Ｍｅｔの有無にかかわらず，Ｓｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８のアミノ酸配列から成る（アミノ酸番号は，配列番号：１に対応する）。
【0016】
様々な脊椎動物種のＦＧＦ１０ポリペプチド同士が約８５％の配列同一性を有し，類似の機能を示し，類似の生物学的活性を有することは，当該技術分野において更に公知である。
【0017】
本発明の対象は単離された改変耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドに関し，前記ＦＧＦ１０ポリペプチドはＦＧＦ１０活性を示し，以下から成る：
（ａ）配列番号：１のＳｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する又はそれから成る，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド（配列番号：３参照）；
（ｂ）配列番号：３又はその断片を有する若しくはそれから成る耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド；並びに
（ｃ）少なくとも安定化アミノ酸置換Ｌ１５２Ｆ（配列番号：３）又は，安定化置換Ｌ１５２Ｆと，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ若しくはＮ１８１Ｄから成る群より選択される少なくとも１つの追加の安定化アミノ酸置換との組み合わせを有する（ａ又はｂ）耐熱性ポリペプチド。
（ａ）配列番号：１のＳｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８のアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有する又はそれから成る，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド（配列番号：３参照）；
（ｂ）配列番号：３又はその断片を有する若しくはそれから成る耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド；並びに
（ｃ）少なくとも安定化アミノ酸置換Ｌ１５２Ｆ（配列番号：３）又は，安定化置換Ｌ１５２Ｆと，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ若しくはＮ１８１Ｄから成る群より選択される少なくとも１つの追加の安定化アミノ酸置換との組み合わせを有する（ａ又はｂ）耐熱性ポリペプチド。
【0018】
好ましくは，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド配列の最大長は２２８のアミノ酸，より好ましくは１９０のアミノ酸である。
【0019】
配列番号：３において太字及び下線で記したアミノ酸は，このアミノ酸配列の８４位で突然変異している；この部分は，配列番号：１に従ったアミノ酸番号におけるアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆに対応する。
【0020】
いくつかの実施態様では，耐熱性ポリペプチドは更に，以下のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つ又は，少なくとも２つ又は，少なくとも３つを含む：
‐ 前記アミノ酸配列の配列番号：３における５５位のアミノ酸置換Ｉ（配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｖ１２３Ｉに対応する）；
‐ 前記アミノ酸配列の配列番号：３における１０７位のアミノ酸置換Ｅ（配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｑ１７５Ｅに対応する）；
‐ 前記アミノ酸配列の配列番号：３における１１３位のアミノ酸置換Ｄ（配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｎ１８１Ｄに対応する）。
‐ 前記アミノ酸配列の配列番号：３における５５位のアミノ酸置換Ｉ（配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｖ１２３Ｉに対応する）；
‐ 前記アミノ酸配列の配列番号：３における１０７位のアミノ酸置換Ｅ（配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｑ１７５Ｅに対応する）；
‐ 前記アミノ酸配列の配列番号：３における１１３位のアミノ酸置換Ｄ（配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｎ１８１Ｄに対応する）。
【0021】
いくつかの実施態様では，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，配列番号：３のＮ末端部分で，アミノ酸配列ＭＷＫＷＩＬＴＨＣＡ ＳＡＦＰＨＬＰＧＣＣ ＣＣＣＦＬＬＬＦＬＶ ＳＳＶＰＶＴＣＱＡＬ ＧＱＤＭＶＳＰＥＡＴ ＮＳＳＳＳＳＦＳＳＰ ＳＳＡＧＲＨＶＲ（配列番号：４）の少なくとも一部又は全部を有してもよい。他の実施態様では，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，配列番号：３のＮ末端部分でメチオニン（Ｍ）を有してもよい。いくつかの実施態様では，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，そのＮ末端又はＣ末端部分で最大長が２０のアミノ酸である短い融合アミノ酸配列（タグとして知られている）を有してもよい。耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド配列のＮ末端及びＣ末端での延長に関する前記実施態様同士は組み合わせることが可能である。
【0022】
本発明の他の好ましい実施態様によれば，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは更に，以下を有する：
‐ 配列番号：４の少なくとも一部若しくは全アミノ酸又は，配列番号：３のＮ末端のメチオニン；
及び／又は
‐ Ｎ末端又はＣ末端部分における，最大長が２０のアミノ酸である少なくとも１つの短い融合アミノ酸配列（タグ）。
‐ 配列番号：４の少なくとも一部若しくは全アミノ酸又は，配列番号：３のＮ末端のメチオニン；
及び／又は
‐ Ｎ末端又はＣ末端部分における，最大長が２０のアミノ酸である少なくとも１つの短い融合アミノ酸配列（タグ）。
【0023】
好ましい実施態様では，本発明は，配列番号：５と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列を有する又はそれから成る耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドを開示する：
配列中，太字及び下線で記したアミノ酸は保持する必要がある。
【0024】
好ましくは，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド配列の最大長は２２８のアミノ酸，より好ましくは１９０のアミノ酸である。
【0025】
アミノ酸配列の配列番号：５は配列番号：１のＬｅｕ４０～Ｓｅｒ２０８の断片に対応する。配列番号：５において太字及び下線で記したアミノ酸は，このアミノ酸配列の１１３位で突然変異している；この部分は，配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆに対応する。
【0026】
本発明の他の好ましい実施態様によれば，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，配列番号：１のＬｅｕ４０～Ｓｅｒ２０８のアミノ酸配列を有する配列番号：５又はその断片と少なくとも８５％の配列同一性を有する又はそれから成り，当該耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は，少なくともアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを含む。
【0027】
本発明の他の好ましい実施態様によれば，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，配列番号：５又はその断片を有する又はそれから成り，当該耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は，少なくともアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを含む。
【0028】
いくつかの実施態様では，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは更に，以下のアミノ酸置換のうちの少なくとも１つ又は，少なくとも２つ又は，少なくとも３つを含む：
‐ 前記アミノ酸配列の配列番号：５における８４位のアミノ酸置換Ｉ（配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｖ１２３Ｉに対応する）；
‐ 前記アミノ酸配列の配列番号：５における１３６位のアミノ酸置換Ｅ（配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｑ１７５Ｅに対応する）；
‐ 前記アミノ酸配列の配列番号：５における１４２位のアミノ酸置換Ｄ（配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｎ１８１Ｄに対応する）。
‐ 前記アミノ酸配列の配列番号：５における８４位のアミノ酸置換Ｉ（配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｖ１２３Ｉに対応する）；
‐ 前記アミノ酸配列の配列番号：５における１３６位のアミノ酸置換Ｅ（配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｑ１７５Ｅに対応する）；
‐ 前記アミノ酸配列の配列番号：５における１４２位のアミノ酸置換Ｄ（配列番号：１に従った番号におけるアミノ酸置換Ｎ１８１Ｄに対応する）。
【0029】
本発明の他の好ましい実施態様によれば，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は更に，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ及びＮ１８１Ｄから成る群より選択される少なくとも１つ又は，少なくとも２つ又は，少なくとも３つのアミノ酸置換を含む。
【0030】
いくつかの実施態様では，耐熱性ポリペプチドは，配列番号：５のＮ末端部分でアミノ酸配列ＭＷＫＷＩＬＴＨＣＡ ＳＡＦＰＨＬＰＧＣＣ ＣＣＣＦＬＬＬＦＬＶ ＳＳＶＰＶＴＣＱＡ（配列番号：６）の少なくとも一部又は全部を有してもよい。他の実施態様では，耐熱性ポリペプチドは，配列番号：５のＮ末端部分でメチオニン（Ｍ）を有してもよい。いくつかの実施態様では，耐熱性ポリペプチドは，そのＮ末端部分又はＣ末端部分で，最大長が２０のアミノ酸である短い融合アミノ酸配列（タグとして知られている）を有してもよい。耐熱性ポリペプチド配列のＮ末端及びＣ末端での延長に関する前記実施態様同士は組み合わせることが可能である。
【0031】
本発明の詳細な説明及び本発明の実施例では，配列番号：１に従ったアミノ酸置換の番号を使用する。即ち，切断されたアミノ酸配列を使用する場合でも，ヒトＦＧＦ１０ポリペプチドの全アミノ酸配列に対する番号を使用する。
【0032】
本発明に従った耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は，４ＭＢｒ‐５細胞増殖アッセイでは未変化のＦＧＦ１０活性を有する。このアッセイでは，肺上皮４ＭＢｒ‐５細胞はＦＧＦ１０ポリペプチドの天然配位子であるＦＧＦレセプター２ｂ（ＦＧＦＲ２ｂ）を発現している（図２，６，１４，及び１７参照）。有利にも，本発明に従った耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は，３７℃で長期間，安定で変化していない生物学的活性を示す（図７，９，及び１０参照）。
【0033】
本発明の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，ＦＧＦ１０野生型又はその断片と比較して大幅に安定しているため，特に有利である。この安定性は，ポリペプチド分子が本来有する安定性に起因している。添加物（即ちヘパリン）又は担体分子（即ちウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））などの，タンパク質安定性を促進する他の化合物を添加する必要はない。同時に，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドの生物学的活性は保たれる。開示した耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，研究及び臨床用途に使用できる。
【0034】
本発明に従った耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片は非修飾のＦＧＦ１０活性を有し，その融解温度は，野生型ＦＧＦ１０ポリペプチドと比較して７～１９℃，好ましくは１０～１９℃高い。本発明に従った全ての耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，指定変異導入法（site-directed mutagenesis）により又は，人工遺伝子合成により構築し，発現ベクターｐＥＴ２８ｂにサブクローン化し，均質に精製し（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動により測定したタンパク質純度≧９５％），続いて安定性（融解温度測定）及び生物学的活性について特性解析を行った。
【0035】
配列番号：５及び配列番号：７～配列番号：１３から選択されるアミノ酸配列又はその断片と少なくとも８５％の配列同一性を有する若しくはそれから成る，全長最大２２８のアミノ酸（より好ましくは全長最大１９０のアミノ酸）の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドがより好ましい。
【0036】
本発明の他の好ましい実施態様によれば，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，配列番号：５，配列番号：７，配列番号：８，配列番号：９，配列番号：１０，配列番号：１１，配列番号：１２又は，配列番号：１３から成る耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドの群より選択される。
【0037】
いくつかの実施態様では，配列番号：５及び，配列番号：７～配列番号：１３のいずれかの耐熱性ポリペプチドは，そのＮ末端部分で，アミノ酸配列ＭＷＫＷＩＬＴＨＣＡ ＳＡＦＰＨＬＰＧＣＣ ＣＣＣＦＬＬＬＦＬＶ ＳＳＶＰＶＴＣＱＡ（配列番号：６）の少なくとも一部又は全部を有してもよい。他の実施態様では，配列番号：５及び，配列番号：７～配列番号：１３のいずれかの耐熱性ポリペプチドは，そのＮ末端部分でメチオニン（Ｍ）を有してもよい。いくつかの実施態様では，配列番号：５及び，配列番号：７～配列番号：１３のいずれかの耐熱性ポリペプチドは，そのＮ末端部分又はＣ末端部分で，最大長が２０のアミノ酸である短い融合アミノ酸配列（タグとして知られている）を有してもよい。耐熱性ポリペプチド配列のＮ末端及びＣ末端での延長に関する前記実施態様同士は組み合わせることが可能である。
【0038】
本発明の他の好ましい実施態様によれば，耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは更に以下を有する：
‐ 配列番号：６のアミノ酸の少なくとも一部若しくは全部又は，配列番号：５のＮ末端のメチオニン；
及び／又は
‐ Ｎ末端又はＣ末端部分における，最大長が２０のアミノ酸である少なくとも１つの短い融合アミノ酸配列（タグ）。
‐ 配列番号：６のアミノ酸の少なくとも一部若しくは全部又は，配列番号：５のＮ末端のメチオニン；
及び／又は
‐ Ｎ末端又はＣ末端部分における，最大長が２０のアミノ酸である少なくとも１つの短い融合アミノ酸配列（タグ）。
【0039】
本発明の別の実施態様は，ＦＧＦ１０活性を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドを開示する。本発明に従った耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは更に，配列番号：５，配列番号：７，配列番号：８，配列番号：９，配列番号：１０，配列番号：１１，配列番号：１２又は，配列番号：１３のいずれかのＮ末端で，配列番号：６を有する。
【0040】
本発明に従ったＦＧＦ１０ポリペプチド又はその断片又はそのムテイン（mutein）の生物学的活性は，４ＭＢｒ‐５細胞を増殖させるための有効用量中央値であるＥＤ50（最大生物学的効果の半分を達成するのに必要なポリペプチドの濃度）により定量的に表すことが可能であり，この効果のためのＥＤ50は＜１５ng/mL，好ましくは＜１２ng/mLである。ＦＧＦ１０の生物学的活性は，過去に報告されたような，培養肺上皮増殖アッセイにより評価できる（Rubin, J.S. et al., 1989, Proc Natl Acad Sci U S A, 86:802-806）。
【0041】
本発明のより好ましい実施態様は，再生医療における使用，好ましくは様々なストレスを掛けた後の肺上皮再生又は，創傷及び潰瘍の治癒又は，他の関連する医療用途，例えば心臓治療のための，本発明に従った耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドを開示する。
【0042】
本発明のより好ましい実施形態は，化粧品中での，好ましくはコラーゲン合成，皮膚強度，抗老化治療及び，毛髪成長の非治療的刺激を支援する際の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドの使用を開示する。
【0043】
本発明のより好ましい実施形態は，ヒト胚性幹細胞の増殖及び分化又は，スフェロイド及びオルガノイド，好ましくは肺オルガノイド，胃オルガノイド，肝オルガノイド，膵臓オルガノイド及び，前立腺オルガノイドの形成及び分化のための培地であって，前記培地中に１０ng/mL～５００ng/mLで有効量の耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドを含む培地を開示する。
【0044】
本発明のこれらの特徴及び他の特徴，目的及び，利点は，以下の説明からより深く理解されるであろう。本明細書では，添付の図面を参照する。図面は本明細書の一部を構成し，ここでは本発明の実施態様は限定するものではなく，例として示している。
【0045】
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用されるいくつかの用語の定義を下記に示す。特記しない限り，ここに使用される技術及び科学用語は全て本発明の属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
定義
本明細書で使用されるいくつかの用語の定義を下記に示す。特記しない限り，ここに使用される技術及び科学用語は全て本発明の属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0046】
ＦＧＦ１０ポリペプチドのアミノ酸配列を説明するために，本発明では，アミノ酸の標準的な１文字略号を使用する：
アラニン：Ａ，システイン：Ｃ，アスパラギン酸：Ｄ，グルタミン酸：Ｅ，フェニルアラニン：Ｆ，グリシン：Ｇ，ヒスチジン：Ｈ，イソロイシン：Ｉ，リジン：Ｋ，ロイシン：Ｌ，メチオニン：Ｍ，アスパラギン：Ｎ，プロリン：Ｐ，グルタミン：Ｑ，アルギニン：Ｒ，セリン：Ｓ，トレオニン：Ｔ，バリン：Ｖ，トリプトファン：Ｗ，及びチロシン：Ｙ。
アラニン：Ａ，システイン：Ｃ，アスパラギン酸：Ｄ，グルタミン酸：Ｅ，フェニルアラニン：Ｆ，グリシン：Ｇ，ヒスチジン：Ｈ，イソロイシン：Ｉ，リジン：Ｋ，ロイシン：Ｌ，メチオニン：Ｍ，アスパラギン：Ｎ，プロリン：Ｐ，グルタミン：Ｑ，アルギニン：Ｒ，セリン：Ｓ，トレオニン：Ｔ，バリン：Ｖ，トリプトファン：Ｗ，及びチロシン：Ｙ。
【0047】
ここで使用される限り，「耐熱性」という用語は，タンパク質の「熱安定性」という用語と同義であり，熱力学的安定性及び動力学的安定性を包含する。熱力学的安定性は，タンパク質の折り畳まれた状態（未変性機能的タンパク質）及び，広げられた状態又は部分的に広げられた状態との間の平衡に関連し，これら２つのタンパク質状態間のギブス自由エネルギーの差として定義される。動力学的安定性は，タンパク質の折り畳み及び非折り畳みの速度（即ち，動力学）を反映し，タンパク質の未変性状態を，非機能形態（広げられた状態又は部分的に広げられた状態，不可逆的に変性したタンパク質，凝集したタンパク質）から「分離する」自由エネルギー障壁に関連する。
【0048】
ここで使用される限り，ＦＧＦ１０タンパク質の「融解温度」（Ｔm）という用語は，タンパク質の５０％が折り畳まれ，５０％が広げられた温度を指す。融解温度は熱力学的安定性の直接的な指標である。Ｔmは，以下の実施例で更に述べる円偏光二色性（ＣＤ）分光法，示差走査熱量測定法（ＤＳＣ），示差走査蛍光分析法（ＤＳＦ）など，当技術分野で公知の任意の好適な方法により測定できる。ＣＤ分光法は，温度又は他の可変な物理化学的パラメータ（例えば，塩，変性剤又は，有機共溶媒の濃度）の関数として，タンパク質の二次構造及び立体構造変化をモニターすることに適した方法である。ＤＳＣは，構造変化が起こる際に上昇又は下降を調節した温度範囲内でタンパク質サンプルに生じる熱エネルギーの取り込みを直接評価できるようにする熱力学的な方法である。ＤＳＦは，固有の蛍光の変化を追跡することにより，タンパク質の全体的な三次構造の変化を温度の関数としてモニターする方法である。
【0049】
ここで使用される限り，ＦＧＦ１０ポリペプチドの「構造的半減期」又は「二次構造の半減期」という用語は，定義されたプロセス条件下で，タンパク質二次構造の指標である楕円率が半分に減少するのに掛かる時間の量を指す。半減期は動力学的安定性の直接的な指標である。
【0050】
ここで使用される限り，「野生型」という用語は，種の中で最も一般的なアミノ酸配列を有する未変性ＦＧＦ１０を指す。本明細書では，野生型ＦＧＦ１０とは，１６９のアミノ酸から成る１９．１kDaのタンパク質である配列番号：１のＬｅｕ４０～Ｓｅｒ２０８の断片に対応するヒトＦＧＦ１０の組換え成熟型（the recombinant mature form）である（配列番号：１４）：
L GQDMVSPEAT NSSSSSFSSP SSAGRHVRSY NHLQGDVRWR
KLFSFTKYFL KIEKNGKVSG TKKENCPYSI LEITSVEIGV VAVKAINSNY
YLAMNKKGKL YGSKEFNNDC KLKERIEENG YNTYASFNWQ HNGRQMYVAL
NGKGAPRRGQ KTRRKNTSAH FLPMVVHS （配列番号：１４）
L GQDMVSPEAT NSSSSSFSSP SSAGRHVRSY NHLQGDVRWR
KLFSFTKYFL KIEKNGKVSG TKKENCPYSI LEITSVEIGV VAVKAINSNY
YLAMNKKGKL YGSKEFNNDC KLKERIEENG YNTYASFNWQ HNGRQMYVAL
NGKGAPRRGQ KTRRKNTSAH FLPMVVHS （配列番号：１４）
【0051】
好ましくは，「野生型」ＦＧＦ１０は，分子量２１．４kDa，１９０のアミノ酸長のＨｉｓタグ及びトロンビン切断部位をＮ末端部分で含むヒトＦＧＦ１０の組換え成熟型を指す（配列番号：１５）：
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MLGQDMVSPE ATNSSSSSFS SPSSAGRHVR
SYNHLQGDVR WRKLFSFTKY FLKIEKNGKV SGTKKENCPY SILEITSVEI
GVVAVKAINS NYYLAMNKKG KLYGSKEFNN DCKLKERIEE NGYNTYASFN
WQHNGRQMYV ALNGKGAPRR GQKTRRKNTS AHFLPMVVHS （配列番号：１５）
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MLGQDMVSPE ATNSSSSSFS SPSSAGRHVR
SYNHLQGDVR WRKLFSFTKY FLKIEKNGKV SGTKKENCPY SILEITSVEI
GVVAVKAINS NYYLAMNKKG KLYGSKEFNN DCKLKERIEE NGYNTYASFN
WQHNGRQMYV ALNGKGAPRR GQKTRRKNTS AHFLPMVVHS （配列番号：１５）
【0052】
最大２０のアミノ酸の短い融合アミノ酸配列，いわゆるタグ又はペプチドタグは，組換えポリペプチドの発現，溶解性，精製及び，検出を容易にする。当業者であれば，一般に，タグをポリペプチドのＮ末端又はＣ末端部分に付加しても，その生物学的機能（例えば，生物学的活性又は安定性）は有意な影響を受けないことは分かっている。タグ，そのアミノ酸配列及び，それらの使用法は当業者に公知である。一般的に使用されるタグとしては，例えば，ＡＬＦＡタグ，Ａｖｉタグ，Ｃタグ，ポリグルタミン酸タグ，ポリアルギニンタグ，Ｅタグ，ＦＬＡＧタグ，ＨＡタグ，Ｈｉｓタグ，Ｍｙｃタグ，ＮＥタグ，Ｒｈｏ１Ｄ４タグ，Ｓタグ，Ｓｏｆタグ１，Ｓｏｆタグ３，Ｓｐｏｔタグ，Ｓｔｒｅｐタグ，Ｔ７タグ，ＴＣタグ，Ｔｙタグ，Ｖ５タグ，ＶＳＶタグ，Ｘｐｒｅｓｓタグ，Ｉｓｏｐｅｐタグ，Ｓｐｙタグ，Ｓｎｏｏｐタグ，Ｄｏｇタグ又は，Ｓｄｙタグが挙げられる。
【0053】
ここで使用される限り，「ヒトＦＧＦ１０由来のポリペプチド」又は「耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド」という用語は，ＦＧＦ１０活性を有し，配列番号：３若しくは配列番号：５と少なくとも８５％の配列同一性を有する又はそれから成るポリペプチドを指す。
【0054】
ここで使用される限り，「ＦＧＦ１０の２点（two-point）突然変異体」という用語は，配列番号：５又はその断片を有し，アミノ酸置換Ｌ１５２Ｆと，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ及びＮ１８１Ｄから成る群より選択される１つの付加的なアミノ酸置換との組み合わせから成る耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドを指す。その耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，配列番号：７（置換Ｌ１５２Ｆ及びＶ１２３Ｉを含む）を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド，配列番号：８（置換Ｌ１５２Ｆ及びＱ１７５Ｅを含む）を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド，又は配列番号：９（置換Ｌ１５２Ｆ及びＮ１８１Ｄを含む）を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドであることが好ましい。
【0055】
ここで使用される限り，「ＦＧＦ１０の多点（multiple-point）突然変異体」という用語は，配列番号：５又はその断片を有し，アミノ酸置換Ｌ１５２Ｆと，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ及びＮ１８１Ｄから成る群より選択される少なくとも２つ又は３つの付加的なアミノ酸置換との組み合わせから成る耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドを指す。その耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，配列番号：１０（置換Ｌ１５２Ｆ，Ｖ１２３Ｉ及びＱ１７５Ｅを含む）を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド，配列番号：１１（置換Ｌ１５２Ｆ，Ｖ１２３Ｉ及びＮ１８１Ｄを含む）を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド，配列番号：１２（置換Ｌ１５２Ｆ，Ｑ１７５Ｅ及びＮ１８１Ｄを含む）を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド，又は配列番号：１３（置換Ｌ１５２Ｆ，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ及びＮ１８１Ｄを含む）を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドであることが好ましい。
【0056】
ここで使用される限り，「ＦＧＦ１０の４点（4-point）突然変異体」という用語は，「ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ」と同義であり，アミノ酸置換Ｌ１５２Ｆ，Ｖ１２３Ｉ，Ｑ１７５Ｅ及びＮ１８１Ｄから成る配列番号：５又はその断片を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドを指す。その耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドは，配列番号：１３を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドであることが好ましい。
【0057】
ここで使用される限り，「ハヤブサ（Falco peregrinus）由来のＦＧＦ１０」という用語は「ＦＧＦ１０‐Ｆｐ」と同義であり，配列番号：１のアミノ酸配列Ｓｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８又はＬｅｕ４０～Ｓｅｒ２０８をそれぞれ有するＦＧＦ１０ポリペプチドの機能的断片に対応する配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有するＦＧＦ１０ポリペプチドを指す。１３６個のアミノ酸のうち１６個において修飾を有するＦＧＦ１０‐Ｆｐポリペプチドは，配列番号：３又は配列番号：５の両方と比較すると，非修飾のＦＧＦ１０活性を有し（実施例１４に記載），アミノ酸配列の配列番号：１６を有する。
LQGDVRKRK LYSYNKYFLK IEKNGKVSGT KKENCPFSIL EITSVEIGVV
AVKSIKSNYY LAMNKKGKVY GSKEFNSDCK LKERIEENGY NTYASLNWKH
NGRQMFVALN GRGATKRGQK TRRKNTSAHF LPMVVMS（配列番号：１６）
LQGDVRKRK LYSYNKYFLK IEKNGKVSGT KKENCPFSIL EITSVEIGVV
AVKSIKSNYY LAMNKKGKVY GSKEFNSDCK LKERIEENGY NTYASLNWKH
NGRQMFVALN GRGATKRGQK TRRKNTSAHF LPMVVMS（配列番号：１６）
【0058】
ここで使用される限り，「ＦＧＦ１０‐Ｆｐの単一点（single point）突然変異体」という用語は，「ＦＧＦ１０‐Ｆｐ＋Ｌ１５２Ｆ」と同義であり，配列番号：１に従った番号において置換Ｌ１５２Ｆに対応するアミノ酸配列番号：１６の８０位に安定化アミノ酸置換Ｆを含み，配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有する耐熱性ＧＦ１０ポリペプチドを指す。ＦＧＦ１０‐Ｆｐ＋Ｌ１５２Ｆは，配列番号：１６や非修飾のＦＧＦ１０活性（実施例１４に記載）と比較して安定性が向上し，かつ，アミノ酸配列番号：１７を有する。
【0059】
ここで使用される限り，「ヒトＦＧＦ１０由来ポリペプチド」という用語は，「ＦＧＦ１０突然変異体」及び「ＦＧＦ１０ムテイン」と同義であり，ヒトＦＧＦ１０ポリペプチド（配列番号：１）又はその断片と比較して，本発明に従った置換のいずれかを示す少なくとも１つの異なるアミノ酸配列を有する修飾ＦＧＦ１０ポリペプチド配列を指す。
【0060】
ここで使用される限り，「ポリペプチド」という用語は「タンパク質」と同義である。本発明のポリペプチドは，組換えポリペプチド，天然ポリペプチド又は，合成ポリペプチドであってもよく，好ましくは組換えポリペプチドである。
【0061】
ここで使用される限り，「ＦＧＦ１０の活性」という用語は，「ＦＧＦ１０の生物学的活性」と同義である。そのＦＧＦ１０の活性は，本発明に従ったＦＧＦ１０ポリペプチド若しくはヒトＦＧＦ１０ポリペプチド由来のポリペプチド又は，その断片又は，そのムテインの生物学的活性を意図する。活性（機能的）ポリペプチドは，本発明に従った被験ＦＧＦ１０ポリペプチドのアミノ酸配列及び構造の完全部分であり，ＦＧＦ１０ポリペプチドは，細胞表面レセプター，ヘパラン硫酸又は，その構造類似体ヘパリンとの結合相互作用（iterations）を担う全ての機能的に重要なアミノ酸から成る。ポリペプチドの機能に必須なＦＧＦ１０のアミノ酸（例えば，ポリペプチド‐レセプター相互作用に重要なアミノ酸）は，当技術分野で周知の方法，例えばＸ線結晶構造解析や核磁気共鳴を含む構造解析，指定変異導入法（site-directed mutagenesis），又はアラニンスキャンニング変異解析（alanine-scanning mutagenesis）などの構造分析により同定できる。ＦＧＦ１０ポリペプチドの機能的に重要なアミノ酸は，Yeh, K.B. et al., 2003, Proc Natl Acad Sci U S A, 100:2266‐2271; and Zinkle, A. & Mohammadi, M., 2019, Front. Genet. 10:102に見られる。
【0062】
組織の発生及び修復におけるＦＧＦ１０ポリペプチドの生物学的機能は，線維芽細胞増殖因子レセプター２（ＦＧＦＲ２）への結合を介して作動する。細胞外免疫グロブリンドメインIIIの選択的スプライシングにより生じるＦＧＦＲアイソフォーム「ｂ」（IIIｂ）及び「ｃ」（IIIｃ）のうち，ＦＧＦ１０は主にＦＧＦＲ２ｂレセプターとの選択的相互作用を介して作用する。ＦＧＦ１０とＦＧＦＲ２ｂとの結合相互作用は，レセプターを二量化及び自己リン酸化し，その後，細胞内シグナル伝達経路（ＲＡＳ‐ＭＡＰＫ，ＰＩ３Ｋ‐ＡＫＴ及びＰＬＣγ１）を活性化し，細胞生存を促進し，分裂促進性細胞応答を誘導し，細胞移動性を媒介する。ＦＧＦ１０ポリペプチドは主に肺の間葉系で発現する。肺の間葉系では，ＦＧＦ１０ポリペプチドは，胚性肺発生中及び出生後の生活中における上皮増殖及び分化系列決定の調節に重要な役割を担っている。他の標的細胞としては，一般に，上皮由来の細胞，例えば，ＦＧＦＲ２ｂレセプターを発現すること又は，ＦＧＦ１０に応答することが当技術分野で知られている，四肢，小腸及び大腸の両方並びに，腎臓，胸腺，肝臓及び，心臓などの様々な他の器官の発生に関与する細胞が挙げられる。
【0063】
生物学的活性は，例えば細胞増殖及び／又は基質リン酸化などの当技術分野で公知の方法で測定できる。従って，「ＦＧＦ１０活性を有するポリペプチド」としては，細胞増殖アッセイ（例えば，実施例４，８，１３，及び１４に記載の肺上皮４ＭＢｒ‐５細胞増殖アッセイ）及び，基質リン酸化（例えば，実施例９及び１０に記載のＥＲＫ１／２リン酸化）においてＦＧＦ１０活性を示し，ＦＧＦＲ２ｂレセプターに結合するポリペプチドが挙げられる。
【0064】
本発明に従った耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又は，その断片又は，そのムテインは，４ＭＢｒ‐５細胞増殖アッセイにより測定するＥＤ50値（有効量の中央値）が≦１５ng/mL，好ましくは＜１２ng/mLであれば，ＦＧＦ１０活性を有すると考える。活性の程度はＦＧＦ１０タンパク質の活性と同一である必要はないが，「ＦＧＦ１０活性を有するポリペプチド」は，ＦＧＦ１０‐ｗｔと比較してほぼ類似の活性を示すことが好ましい（即ち，候補ポリペプチドは，参照ＦＧＦ１０タンパク質より高い活性を示すか，又は約２倍以上低い活性を示さない）。
【0065】
ここで使用される限り，「有効用量の中央値」という用語は，「ＥＤ50値」と同義であり，最大増殖の半量を達成するのに必要な（即ち，最大生物学的活性の５０％を達成するのに必要な），本発明に従った耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド又は，その断片又は，そのムテインの濃度を指す。
【0066】
ＦＧＦ１０ポリペプチドの生物学的活性は，ＦＧＦ１０の生物学的活性を保持する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドの機能的断片の存在を必要とする。ここで使用される限り，「断片」という用語は「機能的断片」と同義であり，全ての機能的に重要なアミノ酸，即ちポリペプチドとＦＧＦレセプターとの相互作用やヘパラン硫酸との相互作用を担うアミノ酸を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドの配列及び構造の無傷（intact）部分を指す。ＦＧＦ１０配列（配列番号：１）のＮ末端部分で３７（シグナル配列を欠損した成熟ＦＧＦ１０ポリペプチドに相当する）～６８アミノ酸を切断しても，ＦＧＦ１０活性が維持されたままであることは当業者に公知である。また，ＦＧＦＲ２ｂレセプターに結合し，活性化し又は，阻害することによりＦＧＦ１０活性を模倣するＦＧＦ１０の模倣ペプチドである短いＦＧＦ１０ペプチドは，以前に報告されている（特許文献，米国特許第６，６５３，２８４号，及び欧州特許出願公開第０９５０１００号を参照）。
【0067】
ＦＧＦ１０ポリペプチドは，様々な脊椎動物種同士で約８５％の配列同一性を示す。従って，当業者であれば，８５％の配列同一性はＦＧＦ１０ポリペプチドの生物学的活性に悪影響を及ぼさないことは理解している。配列同一性は少なくとも９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％及び，１００％であることが好ましい。熱安定性ＦＧＦ１０ポリペプチドはまた，本発明に従った少なくとも１つ以上の安定化アミノ酸置換も示す。従って，本発明に従った被験耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドのＴmは，少なくとも７℃，好ましくは少なくとも１０℃，より好ましくは少なくとも１４℃上昇し，同時に，所望の生物学的活性を保持しており，即ち，細胞表面の標的ＦＧＦレセプターと結合し，未処理のコントロール細胞と比較して培養細胞の成長，増殖又は，生存を誘発することが可能である。
【0068】
ここで使用される限り，「ムテイン」という用語は，「突然変異体（mutant）」及び「変異体（variant）」と同義であり，本発明に従った安定化アミノ酸置換を有して所望の生物学的活性を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドの機能的ムテインを指す。更に，ムテインは，配列番号：３又は配列番号：５と少なくとも８５％の配列同一性を有する場合には，付加的な置換（点置換，点挿入及び点欠失）を有する耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドの機能的ムテインを指す。従って，機能的ＦＧＦ１０ポリペプチドは，本発明の安定化アミノ酸置換を有し，配列番号：３又は配列番号：５のアミノ酸を少なくとも８５％以上を有する。当業者は，アミノ酸置換がポリペプチドの機能に著しく影響する（例えば，１つの脂肪族アミノ酸を第２の脂肪族アミノ酸で置換する）可能性が低いか又は可能性がないことは完全に認識している。一般に，同様の機能を示す残基を使用する場合，三次構造を形成する残基を置換することが可能である。例えば，配列変異の１５％はＬ‐アミノ酸の保存的置換であることが好ましい。ここでは，新たに挿入されたアミノ酸は，元の置換アミノ酸と同様の物理化学的特性を有し，技術常識によれば，タンパク質の構造，活性及び，安定性に対する影響は無いか又は，最小であると予想される。当業者に公知の保存的置換の例としては，１つの疎水性残基を別の残基と置換すること，又は荷電残基若しくは極性残基を別の残基と置換することが挙げられる。このような保存的置換には，以下：（i）グリシン，アラニン，バリン，ロイシン及び，イソロイシン；（ii）フェニルアラニン，チロシン及び，トリプトファン；（iii）セリン及びトレオニン；（iv）アスパラギン酸及びグルタミン酸；（v）グルタミン及びアスパラギン；並びに（vi）リジン，アルギニン及び，ヒスチジンの各群内のアミノ酸置換が挙げられる。どのアミノ酸変化が表現型的にサイレントである可能性が高いか（即ち，タンパク質の機能に重大な悪影響を及ぼす可能性が無いか）についての更なる指針は，Bowie, J.U. et al., 1990, 'Deciphering the Message in Protein Sequences: Tolerance to Amino Acid Substitutions', Science 247:1306-1310に見られる。他の例では，改変がタンパク質の非重要領域（即ち，タンパク質の機能にとって重要でないタンパク質領域）で起こる場合，残基のタイプは全く重要でない場合もある。
【0069】
ここで使用される限り，「配列同一性」という用語は，２つのポリペプチド配列間の関係を指し，参照アミノ酸配列の全長に渡る位置配列同一性のパーセンテージで定義する。位置配列同一性のパーセンテージは，所与のアラインメントにおいて，定義した長さ全体に渡って同一位置にある全く同じ残基の数に１００を掛けて決定する。最大限対応させてアラインメントさせたときに２つのポリペプチドのアミノ酸残基が同一であれば，２つのポリペプチドは「１００％配列同一性」である。配列アラインメントのバイオインフォマティクス法は当技術分野で周知である。位置配列同一性のパーセンテージは，標準的なソフトウェアプログラムを用いて計算できる。好ましいコンピュータプログラムとしては，BLASTP，MatGAT，Water（EMBOSS），Matcher（EMBOSS），LALIGNが挙げられるが，これらに限定されるものではない。周知のSmith-Watermanアルゴリズムもまた，配列同一性を決定するために使用できる。
【0070】
本発明に従った耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドのアミノ酸配列は，ＦＧＦ１０ポリペプチドの参照配列（配列番号：３又は配列番号：５）と同一であってもよく，即ち配列同一性は１００％であってもよい。あるいは，その参照配列と異なる，特定の整数を最大数とするアミノ酸置換（最大１５％の配列変異に相当する）を含んでもよく，この場合ＦＧＦ１０ポリペプチドの配列同一性は１００％未満である。配列変異に寄与するこれらのアミノ酸変化は，点置換，点挿入，点欠失又はこれらの組み合わせにより形成される場合もある。この変化は，参照ポリペプチドのＮ末端部，Ｃ末端部又は参照ポリペプチドのこれらの末端部間のいずれかで起こり，参照ポリペプチドの個々のアミノ酸間で個別に又は参照配列の１つ以上の連続した領域で広がる。
【0071】
霊長類，マウス，ラット，ウサギ，ブタ，イヌ，ウシ，ウマ，タカ，トカゲ，ヒトなどの脊椎動物種では，ＦＧＦ１０は高度に保存されており，広範な種の間で少なくとも８５％の配列同一性を示す。当業者であれば，例えば非ヒト起源のＦＧＦ１０配列を用いれば耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドが１５％配列変異する（本明細書に記載の８５％の配列同一性に相当）ことは理解している。耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドと少なくとも８５％の同一性を有する本発明の実施態様に従ったＦＧＦ１０タンパク質は，一般にＦＧＦファミリーの他のメンバーは配列同一性がかなり低いことから，ＦＧＦ１０に類似するタンパク質以外のタンパク質を含む可能性は低い。
【0072】
本発明に従ったヒトＦＧＦ１０に由来するＦＧＦ１０ポリペプチドは，遺伝子合成又は変異導入（mutagenesis）により調製できる。一般に，ＦＧＦ１０ポリペプチドをコードする遺伝子は発現ベクターにクローン化され，次いで形質転換された宿主生物，好ましくは微生物中で発現する。宿主生物は外来遺伝子を発現し，所与の発現条件下でＦＧＦ１０ポリペプチドを生成する。ＦＧＦ１０ポリペプチドをコードする遺伝子はまた，酵母や哺乳動物細胞などの真核生物中で調製することも可能である。
【0073】
組換えＦＧＦ１０‐ｗｔ（５’‐３’）のヌクレオチド配列とｐＥＴ２８ｂベクター中の上流配列との例を以下に示す（配列番号：１８）。開始コドンａｔｇ及び停止コドンＴＡＡは灰色で記し，Ｎ末端Ｈｉｓタグ（６×Ｈｉｓ）は太字及び下線で記し，トロンビン切断認識部位は黒色で記し，発現ベクターｐＥＴ２８ｂへのクローン化を可能にするＮｃｏＩ，ＮｄｅＩ，ＸｈｏＩの制限部位は下線で記している（ｃｃａｔｇｇ‐５’ＮｃｏＩ，ＣＡＴＡＴＧ‐５’ＮｄｅＩ，及びＣＴＣＧＡＧ‐３’ＸｈｏＩ）。ＦＧＦ１０ポリペプチドのコード配列は開始コドンａｔｇで始まり，終止コドンＴＡＡで終わる。
【0074】
本発明に従ったアミノ酸置換の挿入に使用するＦＧＦ１０ポリペプチドは，霊長類，マウス，ラット，ウサギ，ブタ，イヌ，ウシ，ウマ，タカ，ヘビ，トカゲ及びヒトなどの任意の脊椎動物種から単離できる。ＦＧＦ１０ポリペプチドはヒト由来であることが好ましい。しかし，ヒトＦＧＦ１０のアミノ酸配列（配列番号：１）又は耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチド（配列番号：３，配列番号：５）と少なくとも８５％，若しくは８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，１００％配列同一性を有する哺乳動物，鳥類，若しくは爬虫類のＦＧＦ１０ポリペプチドの生物学的に活性な形態を使用してもよい。
【図面の簡単な説明】
【0075】
【図1】精製したＦＧＦ１０‐ｗｔ及びその単一点突然変異体（以下の置換Ｎ７１Ｅ，Ｔ８６Ｆ，Ｉ１１８Ｖ，Ｖ１２３Ｉ，Ｉ１２６Ｙ，Ｎ１２７Ｙ，Ｌ１５２Ｆ，Ｈ１７１Ｙ，Ｒ１７４Ｙ，Ｑ１７５Ｅ，Ｙ１７７Ｆ，Ｎ１８１Ｄ，Ｖ２０５Ｐのうち１種を有する）のＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルを示す。タンパク質マーカー：１１６，６６．２，４５，３５，２５，１８．４，１４．４kDa。組み換えＦＧＦ１０‐ｗｔ，並びにＮ末端Ｈｉｓタグ及びトロンビン切断部位を有するその突然変異体のＭｗは約２１．４kDaである。
【図2】ＦＧＦ１０‐ｗｔ及び安定性が向上したその単一点突然変異体により誘導された肺上皮４ＭＢｒ‐５細胞の増殖を示す。ＦＧＦ１０‐ｗｔ，並びにアミノ酸置換Ｖ１２３Ｉ，Ｌ１５２Ｆ，Ｑ１７５Ｅ及び，Ｎ１８１Ｄを有するその単一点突然変異体の効果について測定したＥＤ50値はそれぞれ０．８，０．４，１．４，０．２，１．６ng/mLであった。各データポイントは３連サンプルの平均値を表す。エラーバーは記号の大きさより小さく，一般に４％未満であった。
【図3】精製したＦＧＦ１０‐ｗｔ及び，安定性を高めたその４点突然変異体ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢのＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルを示す。タンパク質マーカー：１１６，６６．２，４５，３５，２５，１８．４，１４．４kDa。組み換えＦＧＦ１０‐ｗｔ，及びＮ末端にＨｉｓタグ及びトロンビン切断部位を有するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢのＭｗは約２１．４ kDaである。
【図4】ＦＧＦ１０‐ｗｔとその４点突然変異体ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢとの熱安定性の比較を示す。融解温度（Ｔm）はＤＳＦにより測定した。
【図5】４つの安定化アミノ酸置換（Ｖ１２３Ｉ＋Ｌ１５２Ｆ＋Ｑ１７５Ｅ＋Ｎ１８１Ｄ）の導入を行うタンパク質工学により媒介したＦＧＦ１０ポリペプチド安定化と，ヘパリン添加により媒介したポリペプチド安定化との程度の比較を示す。タンパク質の安定化は，安定化したＦＧＦ１０ポリペプチドと安定化していない（野生型ポリペプチド）ＦＧＦ１０ポリペプチドとの間の融解温度の差（ΔＴm）として表している。ＴmはＤＳＦにより測定した。
【図6】ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢに誘導された肺上皮４ＭＢｒ‐５細胞の増殖を示す。この効果について測定したＥＤ50値は０．２ng/mLであり，これは組み換えＦＧＦ１０‐ｗｔについて予測したＥＤ50値＜１５ng/mLと一致している。各データポイントは３連サンプルの平均値を表す。エラーバーは記号の大きさより小さく，一般に４％未満であった。
【図7】長時間のインキュベート中，３７℃で生物学的活性を保持するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの能力を示す。（Ａ）ＦＧＦ１０‐ｗｔ及びＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢを，細胞処理の前に完全培地中で１０分，３０分，１時間，２時間，４時間，６時間，８時間，１２時間，１４時間，及び２４時間プレインキュベートした。ＦＧＦＲ２レセプターを内因性発現している哺乳動物腺癌ＭＣＦ７細胞を完全培地中で２４時間培養した。その後，細胞をＦＧＦ１０‐ｗｔ又はＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢで３０分間刺激し，リン酸化ＥＲＫｌ／２について免疫ブロットした。培地アリコート中のＦＧＦ１０レベルをローディングコントロールとして用いた。野生型ＦＧＦ１０の生物学的活性は熱プレインキュベートの時間経過と共に低下したが，耐熱化したＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢは３７℃で２４時間経過後でも完全な生物学的活性を保持していた。（Ｂ）ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて行ったウエスタンブロットのデンシトメトリー分析。（Ｃ）ローディングコントロールのデンシトメトリー分析。エラーバーは３つの独立した実験から得られた平均値の標準誤差を表す。スチューデントのｔ検定：***ｐ＜０．００１，**ｐ＜０．０１，*ｐ＜０．０５。
【図8】３７℃，長時間のインキュベート中での，二次構造を保持するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの能力を示す。両タンパク質の二次構造の変化はＣＤ分光法によりモニターした。（Ａ）７５０mMのＮａＣｌを含む２５mMリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中の濃度０．２mg/mLのＦＧＦ１０‐ｗｔ及びＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの構造的完全性を，２００～２６０nmの波長範囲に渡って，３７℃で２４時間楕円率をモニターすることにより追跡した（測定の最大時間は，ＣＤ分光法プロトコルで使用した圧縮窒素を用いたボンベの容量により制限した）。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢは３７℃で２４時間，二次構造を保持したが，２２７nmで評価したＦＧＦ１０‐ｗｔの二次構造の測定した半減期は１１．６時間であった。（Ｂ）３７℃，２４時間のタンパク質インキュベート前後で記録したＦＧＦ１０‐ｗｔ及びＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢのＣＤスペクトル。適切に折り畳まれたＦＧＦ１０タンパク質サンプルは，２２７nm付近を中心とするブロードな正のピークを有し，２０４nm付近が最小値であるＣＤスペクトルを示した。これはβ‐IIタイプのβリッチタンパク質に特徴的である。３７℃，２４時間のインキュベート後のＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢは，加熱インキュベート前と同一のＣＤスペクトル形状及び強度を示したが，３７℃でインキュベート中のＦＧＦ１０‐ｗｔは立体構造変化を起こしており，これは，インキュベート前に記録したＦＧＦ１０‐ｗｔのスペクトルとはＣＤスペクトル形状及び強度が異なっていることにより分かる。
【図9】ｐＫｒｏｘ２４（ＭａｐＥＲＫ）‐ＤｓＲｅｄレポーターを有するＴＲ０１ＧベクターでトランスフェクションしたＭＣＦ７細胞において，ＦＧＦＲシグナル伝達の持続的活性化を誘導するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの能力を示す。（Ａ）新鮮なＦＧＦ１０‐ｗｔ及びＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの刺激により誘導したＭＣＦ７細胞中のｐＫｒｏｘ２４レポーターのトランス活性化。（Ｂ）３７℃で２時間サンプルをプレインキュベートした後にＦＧＦ１０‐ｗｔ及びＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢを刺激することにより誘導したＭＣＦ７細胞中のｐＫｒｏｘ２４レポーターのトランス活性化。ＦＧＦを介したｐＫｒｏｘ２４誘導を，ＤｓＲｅｄ蛍光のライブセルイメージングにより２４時間モニターした。
【図10】３７℃で７日間インキュベートした後の肺上皮４ＭＢｒ‐５細胞の増殖を誘導するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの能力を示す。ＦＧＦ１０‐ｗｔ及びＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢを３７℃の温度に１，３，及び７日間曝露し，次いで４ＭＢｒ‐５細胞の処理に使用した。プロットは，ＦＧＦ１０サンプルで３日間培養した後に測定したレゾルフィン蛍光を示す。各データポイントは３連サンプルの平均値を表す。エラーバーは記号の大きさより小さく，一般に４％未満であった。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢは全プレインキュベート期間後も細胞増殖を誘導する能力を保持しているが，ＦＧＦ１０‐ｗｔの細胞増殖を誘導する能力は，３７℃で１日インキュベートした後には既に減少している。
【図11】タンパク質トリプシン分解に対するＦＧＦ１０‐ｗｔとＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢとの耐性の比較を示す。（Ａ）ＦＧＦ１０‐ｗｔ及び（Ｂ）ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢをトリプシン（最終濃度２μgプロテアーゼ／１００μgＦＧＦ１０）により３７℃で１８０分間消化した。反応生成物をＳＤＳ‐ＰＡＧＥで可視化した。時間０分と５分との間の差は，組み換えＦＧＦ１０ポリペプチドのＮ末端部分（Ｎ末端Ｈｉｓタグ，トロンビン切断部位，及びそれに続く２９アミノ酸により形成された）の切断による可能性が最も高いが，これはＦＧＦ１０の生物学的機能には悪影響を及ぼさない。
【図12】配列番号：１のアミノ酸配列Ｓｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８から成る精製ＦＧＦ１０ポリペプチド（ＦＧＦ１０69‐208）及び置換Ｌ１５２Ｆを有するその安定な変異体（ＦＧＦ１０69‐208＋Ｌ１５２Ｆ）のＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルを示す。タンパク質マーカー：１１６，６６．２，４５，３５，２５，１８．４，１４．４kDa。組み換えＦＧＦ１０69‐208並びに，Ｎ末端Ｈｉｓタグ及びトロンビン切断部位を有するＦＧＦ１０69‐208＋Ｌ１５２ＦのＭｗは，約１８．５kDaである。
【図13】アミノ酸配列Ｓｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８（ＦＧＦ１０69‐208）及び，置換Ｌ１５２Ｆを有するその安定な変異体（ＦＧＦ１０69‐208＋Ｌ１５２Ｆ）から成るＦＧＦ１０ポリペプチドが適切に折り畳まれていることを実証するＦＧＦ１０ポリペプチドのＣＤスペクトルを示す。
【図14】（Ａ）アミノ酸配列Ｓｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８から成るＦＧＦ１０ポリペプチド（ＦＧＦ１０69‐208）及び（Ｂ）置換Ｌ１５２Ｆを有するその安定な変異体（ＦＧＦ１０69‐208＋Ｌ１５２Ｆ）により誘導した肺上皮４ＭＢｒ‐５細胞の増殖を示す。ＦＧＦ１０69‐208及びＦＧＦ１０69‐208＋Ｌ１５２Ｆのこの効果について測定したＥＤ50値はそれぞれ０．５及び１．９ng/mLであった。各データポイントは，３連サンプルの平均値を表す。エラーバーは記号の大きさより小さく，一般に４％未満であった。
【図15】ハヤブサ由来のＦＧＦ１０（ＦＧＦ１０‐Ｆｐ）及び置換Ｌ１５２Ｆを有するその安定な変異体（ＦＧＦ１０‐Ｆｐ＋Ｌ１５２Ｆ）に相当する，配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有する，精製ＦＧＦ１０ポリペプチドのＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルを示す。タンパク質マーカー：１１６，６６．２，４５，３５，２５，１８．４，１４．４kDa。組み換えＦＧＦ１０‐Ｆｐ並びに，Ｎ末端Ｈｉｓタグ及びトロンビン切断部位を有するＦＧＦ１０‐Ｆｐ＋Ｌ１５２ＦのＭｗは，約１７．９kDaである。
【図16】ＦＧＦ１０ポリペプチドのＣＤスペクトルを示し，ＦＧＦ１０アミノ酸配列に１２％の変異（即ち，配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有するＦＧＦ１０‐Ｆｐ）を導入しても，タンパク質の二次構造は変化しないことを実証している。同時に，配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有するＦＧＦ１０ポリペプチド（ＦＧＦ１０‐Ｆｐ＋Ｌ１５２Ｆ）に単一点安定化置換Ｌ１５２Ｆを導入しても，タンパク質の二次構造は変化しない。
【図17】（Ａ）ハヤブサ由来のＦＧＦ１０に対応する配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有するＦＧＦ１０ポリペプチド（ＦＧＦ１０‐Ｆｐ）及び（Ｂ）置換Ｌ１５２Ｆを有するその安定な変異体（ＦＧＦ１０‐Ｆｐ＋Ｌ１５２Ｆ）により誘導した肺上皮４ＭＢｒ‐５細胞の増殖を示す。ＦＧＦ１０‐Ｆｐ及びＦＧＦ１０‐Ｆｐ＋Ｌ１５２Ｆのこの効果について測定したＥＤ50値はそれぞれ１２．７及び６．１ng/mLであった。各データポイントは，３連サンプルの平均値を表す。エラーバーは記号の大きさより小さく，一般に４％未満であった。
【図18】ＦＧＦ１０‐ｗｔのものより高い，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの肺細胞塊（lungospheres）及び肺オルガノイド形成効率を示す。プロットは平均±ＳＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【0076】
下記の実施例は本発明の実施態様を説明するために示される。示された実施例は，説明的な性質のものであり，限定することを意図してはいない。本発明の試験の中でここに記載されたものに似ているか等価である方法及び材料を使用することができるが，適切な方法及び材料を下記に述べる。
【0077】
実施例１．エネルギーベース及び進化ベースアプローチによる，ＦＧＦ１０において安定化できる可能性のある単一点突然変異のイン・シリコデザイン
解像度が２．９ÅのＦＧＦ１０‐ＦＧＦＲ２ｂ複合体の利用可能な結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ １ＮＵＮ）をRCSB PDBデータベースからダウンロードし，エネルギーベースアプローチ（energy-based approach）により，ＦＧＦ１０での置換を安定化できる可能性を予測するために使用した。全ての配位子及び水分子を除去し，ＦＧＦ１０分子に対応する分離鎖Ａを含んでアミノ酸残基Ｓｅｒ６９～Ｈｉｓ２０７を含むｐｄｂファイルを作成することにより，複合体構造を解析用に準備した。タンパク質側鎖を最小化し，最小化が適正に行われたか否かを判定するためにスコア化した。可能性のある全ての単一点突然変異の安定効果をフォースフィールド計算（force-field calculations）により推定した。特定の位置における２０変異全てについてΔΔＧ自由エネルギーを収集した。進化の保存は，相同配列の系統発生分析により推定した。更なる分析のために，ΔΔＧ＜－１．０kcal/mol及び保存≦７である突然変異を選択した。レセプター結合部位及びヘパリン結合部位に位置する残基のような機能的に適切な位置は，タンパク質機能を損なう突然変異の発生を最小限にするために，選択から除外した。
解像度が２．９ÅのＦＧＦ１０‐ＦＧＦＲ２ｂ複合体の利用可能な結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ １ＮＵＮ）をRCSB PDBデータベースからダウンロードし，エネルギーベースアプローチ（energy-based approach）により，ＦＧＦ１０での置換を安定化できる可能性を予測するために使用した。全ての配位子及び水分子を除去し，ＦＧＦ１０分子に対応する分離鎖Ａを含んでアミノ酸残基Ｓｅｒ６９～Ｈｉｓ２０７を含むｐｄｂファイルを作成することにより，複合体構造を解析用に準備した。タンパク質側鎖を最小化し，最小化が適正に行われたか否かを判定するためにスコア化した。可能性のある全ての単一点突然変異の安定効果をフォースフィールド計算（force-field calculations）により推定した。特定の位置における２０変異全てについてΔΔＧ自由エネルギーを収集した。進化の保存は，相同配列の系統発生分析により推定した。更なる分析のために，ΔΔＧ＜－１．０kcal/mol及び保存≦７である突然変異を選択した。レセプター結合部位及びヘパリン結合部位に位置する残基のような機能的に適切な位置は，タンパク質機能を損なう突然変異の発生を最小限にするために，選択から除外した。
【0078】
進化ベースアプローチ（evolution-based approach）によりＦＧＦ１０において安定化できる可能性のある置換を予測するために，ＦＧＦ１０及び関連タンパク質の多重配列アライメントを構築した。ＦＧＦ１０タンパク質配列（配列番号：１）を，ＮＣＢＩのnrデータベースに対するPSI‐BLAST(Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389‐3402)サーチのクエリとして使用した。PSI‐BLASTを３回行った後に収集した，ｅ値が１０-15である配列を，CD‐HIT（Li, W. & Godzik, A., 2006, Bioinformatics 22:1658-1659）により同一性閾値９０％でクラスター化した。得られた２００を超える配列のデータセットを，デフォルトパラメーターを使用し，Ｐ値閾値を変えて，CLANS（Frickey & Lupas, (2004). Bioinformatics. 20, 3702‐3704)でクラスター化した。１０-29のＰ値でＦＧＦ１０と共にクラスター化した配列を抽出し，MUSCLEプログラム(Edgar, R.C., 2004, BMC Bioinformatics 5:113)でアラインメントさせた。１２９配列から成る最終アラインメントを，単純なコンセンサスアプローチを使用するバックトゥーコンセンサス分析（back-to-consensus analysis）のインプットとして使用した。この分析はコンセンサスのカットオフ値０．５を使用して行った。このことは与えられた残基が，コンセンサス残基として割り当てられるべき全ての分析された配列の少なくとも５０％で，与えられた位置で存在する必要があることを意味する。コンセンサスにより同定した突然変異は，フォースフィールド計算で評価したΔΔＧ＜０．５kcal/molのカットオフ値をパスしなければならない。
【0079】
エネルギーベースアプローチ及び進化ベースアプローチの両方により同定した最良の１４個の突然変異のリストを表１に収載する。同定した１４個の突然変異は全て実験的検証のために選択した。アミノ酸番号はヒトＦＧＦ１０ポリペプチドの配列（配列番号：１）に対応している。
【0080】
【表1】
【0081】
実施例２．ＦＧＦ１０の１４個の単一点突然変異体の構築及びその発現並びに，アフィニティークロマトグラフィーによる均一になるまでの精製
OneClick法及びPhusionポリメラーゼ（New England Biolabs）により，ウェブプログラムOneClickの説明書及びポリメラーゼメーカーの推奨に従って，突然変異体組み換え遺伝子を構築した。ＦＧＦ１０の突然変異誘発は，テンプレートとしてのベクターｐＥＴ２８ｂ‐Ｈｉｓ‐トロンビン：：ｆｇｆ１０及び，所望の突然変異を有する２つの逆相補的オリゴヌクレオチドを用い，全プラスミドＰＣＲにより行った。得られた構築物を大腸菌ＮＥＢ５‐アルファコンピテント細胞に形質転換した。細胞をカナマイシン（５０μg/mL）を含む寒天プレート上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。プラスミドを単離し，ヌクレオチド配列を市販シーケンシングにより確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を発現ベクターで形質転換し，カナマイシンを含む寒天プレート上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。単一のコロニーを，カナマイシン（５０μg.mL）を含むＬＢ培地１０mLに接種し，細胞を３７℃で一晩培養した。一夜培養液（Overnight culture）を，カナマイシンを含むＬＢ培地１Lに接種した。細胞を３７℃で培養した。その発現を，終濃度０．５mMになるまでイソプロピルｂ‐Ｄ‐１‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。その後，細胞を２０℃で一晩培養した。培養の終わりに，バイオマスを遠心分離により採取し，バッファー（２０mMのリン酸水素二カリウム塩及びリン酸二水素カリウム，ｐＨ７．５，０．５MのＮａＣｌ，１０mMのイミダゾール）により洗浄した。懸濁液中の細胞を音波処理により破壊し，細胞ライセートを遠心分離した。シングルステップニッケルアフィニティークロマトグラフィー（single-step nickel affinity chromatography）を使用して，粗抽出液からタンパク質を精製した。ピークフラクション中のタンパク質の存在を１５％のポリアクリルアミドゲル中のＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより証明した。精製したタンパク質を，７５０mMのＮａＣｌを含むリン酸バッファーに対して透析した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動（図１）で検証されたように，アフィニティークロマトグラフィーによるＦＧＦ１０突然変異体の精製により，９５％を超える純度の均質なタンパク質が得られた。ほとんどのＦＧＦ１０単一点突然変異体の収量は，細胞培養液１リットル当たり１０～２１mgの範囲であった。唯一の例外は，ＦＧＦ１０突然変異Ｓ１４３Ｐによりタンパク質収量が約９０％減少したことである。従って，この突然変異は後の分析から除外した。
OneClick法及びPhusionポリメラーゼ（New England Biolabs）により，ウェブプログラムOneClickの説明書及びポリメラーゼメーカーの推奨に従って，突然変異体組み換え遺伝子を構築した。ＦＧＦ１０の突然変異誘発は，テンプレートとしてのベクターｐＥＴ２８ｂ‐Ｈｉｓ‐トロンビン：：ｆｇｆ１０及び，所望の突然変異を有する２つの逆相補的オリゴヌクレオチドを用い，全プラスミドＰＣＲにより行った。得られた構築物を大腸菌ＮＥＢ５‐アルファコンピテント細胞に形質転換した。細胞をカナマイシン（５０μg/mL）を含む寒天プレート上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。プラスミドを単離し，ヌクレオチド配列を市販シーケンシングにより確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を発現ベクターで形質転換し，カナマイシンを含む寒天プレート上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。単一のコロニーを，カナマイシン（５０μg.mL）を含むＬＢ培地１０mLに接種し，細胞を３７℃で一晩培養した。一夜培養液（Overnight culture）を，カナマイシンを含むＬＢ培地１Lに接種した。細胞を３７℃で培養した。その発現を，終濃度０．５mMになるまでイソプロピルｂ‐Ｄ‐１‐チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。その後，細胞を２０℃で一晩培養した。培養の終わりに，バイオマスを遠心分離により採取し，バッファー（２０mMのリン酸水素二カリウム塩及びリン酸二水素カリウム，ｐＨ７．５，０．５MのＮａＣｌ，１０mMのイミダゾール）により洗浄した。懸濁液中の細胞を音波処理により破壊し，細胞ライセートを遠心分離した。シングルステップニッケルアフィニティークロマトグラフィー（single-step nickel affinity chromatography）を使用して，粗抽出液からタンパク質を精製した。ピークフラクション中のタンパク質の存在を１５％のポリアクリルアミドゲル中のＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより証明した。精製したタンパク質を，７５０mMのＮａＣｌを含むリン酸バッファーに対して透析した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動（図１）で検証されたように，アフィニティークロマトグラフィーによるＦＧＦ１０突然変異体の精製により，９５％を超える純度の均質なタンパク質が得られた。ほとんどのＦＧＦ１０単一点突然変異体の収量は，細胞培養液１リットル当たり１０～２１mgの範囲であった。唯一の例外は，ＦＧＦ１０突然変異Ｓ１４３Ｐによりタンパク質収量が約９０％減少したことである。従って，この突然変異は後の分析から除外した。
【0082】
実施例３．単一点ＦＧＦ１０変異体の熱安定性の測定
エネルギーベース及び進化ベースアプローチにより予測した単一点ＦＧＦ１０突然変異体の熱安定性を，示差走査蛍光分析法（ＤＳＦ）及び示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）により測定した。７５０mMの塩化ナトリウムを含む２０mMのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中の０．２mg/mL及び１．０mg/mLのタンパク質溶液は熱で折り畳まれず，その後，NanoTemper Prometheus DSFシステム及びVP-capillary DSCシステムをそれぞれ使用して固有の蛍光及び熱容量の変化をモニターした。その測定は１℃／分の加熱速度で２５～９０℃の温度で行った。融解温度（Ｔm）は，ＤＳＦ実験の場合は規格化した蛍光熱転移の中点として又は，ＤＳＣ実験の場合は見かけの熱容量ピークの最大値としてそれぞれ評価した。結果を表２に収載する。ΔＴm≧２℃の安定性増加突然変異を有する単一点突然変異体を生物学的活性試験のために選択し（実施例４参照），非修飾の活性が確認された時点で，自由エネルギー計算を用い，安定化変異を多点突然変異体に組み合わせた（combine）（実施例５参照）。
エネルギーベース及び進化ベースアプローチにより予測した単一点ＦＧＦ１０突然変異体の熱安定性を，示差走査蛍光分析法（ＤＳＦ）及び示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）により測定した。７５０mMの塩化ナトリウムを含む２０mMのリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中の０．２mg/mL及び１．０mg/mLのタンパク質溶液は熱で折り畳まれず，その後，NanoTemper Prometheus DSFシステム及びVP-capillary DSCシステムをそれぞれ使用して固有の蛍光及び熱容量の変化をモニターした。その測定は１℃／分の加熱速度で２５～９０℃の温度で行った。融解温度（Ｔm）は，ＤＳＦ実験の場合は規格化した蛍光熱転移の中点として又は，ＤＳＣ実験の場合は見かけの熱容量ピークの最大値としてそれぞれ評価した。結果を表２に収載する。ΔＴm≧２℃の安定性増加突然変異を有する単一点突然変異体を生物学的活性試験のために選択し（実施例４参照），非修飾の活性が確認された時点で，自由エネルギー計算を用い，安定化変異を多点突然変異体に組み合わせた（combine）（実施例５参照）。
【0083】
【表2】
【0084】
実施例４．肺上皮４ＭＢｒ‐５細胞増殖アッセイを用いた，安定性が向上した単一点ＦＧＦ１０突然変異体の生物学的活性試験
ＦＧＦ１０は間葉系細胞中で発現し，上皮で発現したＦＧＦレセプター２ｂ（ＦＧＦＲ２ｂ）と結合することにより，上皮‐間葉系シグナル伝達を促進する。４ＭＢｒ‐５アカゲザルの気管支上皮細胞は増殖するために上皮成長因子（ＥＧＦ）を必要とするが，その細胞はＦＧＦＲ２ｂを天然に発現することから，代わりにＦＧＦ１０を用いて細胞増殖を誘導してもよい。ＦＧＦＲ２ｂシグナル伝達が活性化すると，分裂促進反応が起こり，この分裂促進反応はレサズリンベースアッセイなどの様々な細胞増殖／生存率アッセイを用いて定量することが可能である。レサズリンは細胞透過性の酸化還元指標であり，細胞増殖に起因する成長培地の化学的還元に応答して，非蛍光青色色素レサズリンから高蛍光赤色色素レゾルフィンに変換されることにより，細胞生存率を反映する。蛍光シグナルはサンプル中の生細胞数に比例する。
ＦＧＦ１０は間葉系細胞中で発現し，上皮で発現したＦＧＦレセプター２ｂ（ＦＧＦＲ２ｂ）と結合することにより，上皮‐間葉系シグナル伝達を促進する。４ＭＢｒ‐５アカゲザルの気管支上皮細胞は増殖するために上皮成長因子（ＥＧＦ）を必要とするが，その細胞はＦＧＦＲ２ｂを天然に発現することから，代わりにＦＧＦ１０を用いて細胞増殖を誘導してもよい。ＦＧＦＲ２ｂシグナル伝達が活性化すると，分裂促進反応が起こり，この分裂促進反応はレサズリンベースアッセイなどの様々な細胞増殖／生存率アッセイを用いて定量することが可能である。レサズリンは細胞透過性の酸化還元指標であり，細胞増殖に起因する成長培地の化学的還元に応答して，非蛍光青色色素レサズリンから高蛍光赤色色素レゾルフィンに変換されることにより，細胞生存率を反映する。蛍光シグナルはサンプル中の生細胞数に比例する。
【0085】
熱力学的安定性を高めたＦＧＦ１０変異体の生物学的活性を試験するため，４ＭＢｒ‐５細胞を，１５０μLの４ＭＢｒ‐５飢餓培地（Ham's F-12K-Gibco，１０％ウシ新生仔血清，１％ペニシリンＧ／硫酸ストレプトマイシン，２μg/mLヘパリン）が入った９６ウェルプレートに，７．５×１０3個／ウェルで播種した。播種から３時間後，細胞を適切に接着するために，細胞をタンパク質処理した。ＦＧＦ１０変異体を飢餓培地で連続希釈し，５０μLのタンパク質溶液をウェルに添加した。ＦＧＦ１０変異体の最終濃度は０．００１ng/mL～２０００ng/mLの範囲であり，各濃度を３重に試験した。マウスＥＧＦをポジティブコントロールとして用いた。培養３日後，各ウェルに２０μLのレサズリン溶液を添加し，プレートを一晩インキュベートした。Synergy 4Hリーダー（BioTek，米国）で蛍光測定（励起５６０nm，発光５９０nm）により代謝活性を測定した。ＦＧＦ１０による細胞増殖は，オンラインソフトウェアED50 Calculator（AAT Bioquest，米国）により計算した有効量ＥＤ50（最大増殖の半分を達成するのに必要なタンパク質の濃度）の中央値で表す。
【0086】
ＦＧＦ１０‐ｗｔ及びその熱安定性単一点変異体は，４ＭＢｒ‐５細胞の増殖を効果的に誘導した（図２）。有効量の中央値（ＥＤ50）の比較から，全ての熱安定性単一点変異体は，ＦＧＦ１０‐ｗｔ（ＥＤ50＝０．８ng/mL）と同様に４ＭＢｒ‐５細胞（ＥＤ50値は０．２～１．６ng/mLの範囲）の増殖の誘導に有効であることが明らかになった。４ＭＢｒ‐５細胞を用いた細胞増殖アッセイで測定した市販の組換えヒトＦＧＦ１０分子の予測ＥＤ50値は＜１５ng/mLである。この実施例は，ＦＧＦ１０の熱安定性単一点変異体の変化していない生物学的活性を実証している。
【0087】
実施例５．ＦＧＦ１０ポリペプチドの多点突然変異体のイン・シリコ検証
非修飾の生物学的活性を保持しながら安定化することが実験的に確認された，上記で選択した単一点置換全てを，可能性のある全ての二点及び多点突然変異体にイン・シリコで組み合わせ，それらのエネルギーをフォースフィールド計算により推定した。Kelloggら（Kellogg, E. et al., 2011, Proteins, 79:830-838）に従い，Rosettaソフトウェアのｄｄｇモノマーモジュールにバックボーンの柔軟性（backbone flexibility）を組み込んだプロトコル１６を用い，２点突然変異体及び多点突然変異体の両方をイン・シリコで設計した。側鎖リパッキング（side chain repacking）にはソフト反発設計エネルギー関数（soft-repulsive design energy function）を使用した。距離制限なく，全タンパク質に対して最適化を行った。反発項への加重を増加させながら最適化を３回行った。５０回繰り返して得られた最小エネルギーを，安定性効果を表す最終パラメータとして採用した。多点突然変異体の計算した自由エネルギーと，個々の安定化突然変異からの寄与エネルギーの合計として推定した予測ΔΔＧ値との比較を表３にまとめている。多点突然変異体のΔΔＧの計算値と，個々の安定化突然変異の合計ΔΔＧとの間で観察された差から，個々の突然変異は互いに大幅な拮抗作用を示さず，それらの組み合わせが安定なＦＧＦ１０ポリペプチドをもたらすことが示唆された。
非修飾の生物学的活性を保持しながら安定化することが実験的に確認された，上記で選択した単一点置換全てを，可能性のある全ての二点及び多点突然変異体にイン・シリコで組み合わせ，それらのエネルギーをフォースフィールド計算により推定した。Kelloggら（Kellogg, E. et al., 2011, Proteins, 79:830-838）に従い，Rosettaソフトウェアのｄｄｇモノマーモジュールにバックボーンの柔軟性（backbone flexibility）を組み込んだプロトコル１６を用い，２点突然変異体及び多点突然変異体の両方をイン・シリコで設計した。側鎖リパッキング（side chain repacking）にはソフト反発設計エネルギー関数（soft-repulsive design energy function）を使用した。距離制限なく，全タンパク質に対して最適化を行った。反発項への加重を増加させながら最適化を３回行った。５０回繰り返して得られた最小エネルギーを，安定性効果を表す最終パラメータとして採用した。多点突然変異体の計算した自由エネルギーと，個々の安定化突然変異からの寄与エネルギーの合計として推定した予測ΔΔＧ値との比較を表３にまとめている。多点突然変異体のΔΔＧの計算値と，個々の安定化突然変異の合計ΔΔＧとの間で観察された差から，個々の突然変異は互いに大幅な拮抗作用を示さず，それらの組み合わせが安定なＦＧＦ１０ポリペプチドをもたらすことが示唆された。
【0088】
【表3】
【0089】
実施例６．４点ＦＧＦ１０突然変異体の構築，精製及び，熱安定性試験
ＦＧＦ１０，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの４点突然変異体をコードする遺伝子を商業的に合成し，Ｔ７ｌａｃプロモーターの制御下，発現ベクターｐＥＴ２８ｂ‐Ｈｉｓ‐トロンビンのＮｄｅｌ部位及びＸｈｏｌ部位でサブクローン化した。得られた構築物を大腸菌ＮＥＢ５‐アルファコンピテント細胞に形質転換した。この細胞をカナマイシン（５０μg/mL）を含む寒天プレート上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。プラスミドを単離し，ヌクレオチド配列を市販のシーケンシングにより確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を発現ベクターで形質転換し，カナマイシンを含む寒天プレート上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。単一のコロニーを，カナマイシン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地１０mLに接種し，細胞を３７℃で一晩培養した。一夜培養液を，カナマイシン含むＬＢ培地１Lに接種した。細胞を３７℃で培養した。その発現を，終濃度０．５mMになるまでＩＰＴＧで誘導した。その後，細胞を２０℃で一晩培養した。培養の終わりに，バイオマスを遠心分離により採取し，精製バッファー（２０mMのリン酸水素二カリウム塩及びリン酸二水素カリウム，ｐＨ７.５，０．５MのＮａＣｌ，１０mMのイミダゾール）により洗浄し，湿潤バイオマスを－８０℃で凍結させた。解凍した培養液を音波処理により破壊し，ライセートを遠心分離した。シングルステップニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して，粗抽出液からＦＧＦｑ１０‐ＳＴＡＢを精製した。精製したタンパク質を，７５０mMのＮａＣｌを含むバッファーに対して透析した。１５％ポリアクリルアミドゲル中のＳＤＳ‐ＰＡＧＥによりタンパク質の純度を明らかにした（図３）。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの平均収量は細胞培養液１リットル当たり１２mgであった。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの熱安定性は，タンパク質溶液を１．０mg/mLに希釈し，ＤＳＦ及びＤＳＣにより測定した。測定は２５～９０℃の温度で１℃／分の昇温速度で行った。融解温度（Ｔm）は，規格化した蛍光熱転移の中点として又は，ＤＳＦ及びＤＳＣ実験の場合は見かけの熱容量ピークの最大値としてそれぞれ評価した。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢのＴmは６４℃であり，これはＦＧＦ１０‐ｗｔと比較して融解温度が１９℃上昇したことを意味する（図４）。
ＦＧＦ１０，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの４点突然変異体をコードする遺伝子を商業的に合成し，Ｔ７ｌａｃプロモーターの制御下，発現ベクターｐＥＴ２８ｂ‐Ｈｉｓ‐トロンビンのＮｄｅｌ部位及びＸｈｏｌ部位でサブクローン化した。得られた構築物を大腸菌ＮＥＢ５‐アルファコンピテント細胞に形質転換した。この細胞をカナマイシン（５０μg/mL）を含む寒天プレート上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。プラスミドを単離し，ヌクレオチド配列を市販のシーケンシングにより確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を発現ベクターで形質転換し，カナマイシンを含む寒天プレート上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。単一のコロニーを，カナマイシン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地１０mLに接種し，細胞を３７℃で一晩培養した。一夜培養液を，カナマイシン含むＬＢ培地１Lに接種した。細胞を３７℃で培養した。その発現を，終濃度０．５mMになるまでＩＰＴＧで誘導した。その後，細胞を２０℃で一晩培養した。培養の終わりに，バイオマスを遠心分離により採取し，精製バッファー（２０mMのリン酸水素二カリウム塩及びリン酸二水素カリウム，ｐＨ７.５，０．５MのＮａＣｌ，１０mMのイミダゾール）により洗浄し，湿潤バイオマスを－８０℃で凍結させた。解凍した培養液を音波処理により破壊し，ライセートを遠心分離した。シングルステップニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して，粗抽出液からＦＧＦｑ１０‐ＳＴＡＢを精製した。精製したタンパク質を，７５０mMのＮａＣｌを含むバッファーに対して透析した。１５％ポリアクリルアミドゲル中のＳＤＳ‐ＰＡＧＥによりタンパク質の純度を明らかにした（図３）。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの平均収量は細胞培養液１リットル当たり１２mgであった。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの熱安定性は，タンパク質溶液を１．０mg/mLに希釈し，ＤＳＦ及びＤＳＣにより測定した。測定は２５～９０℃の温度で１℃／分の昇温速度で行った。融解温度（Ｔm）は，規格化した蛍光熱転移の中点として又は，ＤＳＦ及びＤＳＣ実験の場合は見かけの熱容量ピークの最大値としてそれぞれ評価した。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢのＴmは６４℃であり，これはＦＧＦ１０‐ｗｔと比較して融解温度が１９℃上昇したことを意味する（図４）。
【0090】
実施例７．ヘパリンの安定化効果を上回るタンパク質工学によるＦＧＦ１０ポリペプチドの安定化
ヘパリン添加の安定化効果は，ＦＧＦ１０ポリペプチドを含むＦＧＦタンパク質ファミリーの様々なメンバーについて以前から報告されている。そこで，ＦＧＦ１０ポリペプチドの安定化形態であるＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの熱安定性に対するヘパリンの効果を試験し，ＦＧＦ１０‐ｗｔに対するヘパリンの安定化効果と比較した。ヘパリン濃度の範囲でのＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ及びＦＧＦ１０‐ｗｔの融解温度を，タンパク質溶液を１．０mg/mLに希釈し，ＤＳＦにより測定した。測定は２５～９０℃の温度で１℃／分の昇温速度で行った。Ｔmは，規格化した蛍光熱転移の中点として評価した。ＦＧＦ１０‐ｗｔの融解温度（Ｔm４６℃；ヘパリン非存在下で測定）は，５～１５μMのヘパリン存在下で大幅に上昇したが（Ｔm５７℃），タンパク質工学により安定化したＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの熱安定性は，試験した最高ヘパリン濃度（１５μM）存在下でも影響を受けなかった。ヘパリンを介したＦＧＦ１０ポリペプチドの安定化では融解温度が１０℃上昇したが，タンパク質工学を介した（即ち，４つの安定化アミノ酸置換の導入）ＦＧＦ１０安定化では融解温度は１９℃上昇した（図５）。この実施例は，タンパク質工学によるＦＧＦ１０の安定化がヘパリンの安定化効果を補い，更にヘパリンの安定化効果を凌駕することを実証している。
ヘパリン添加の安定化効果は，ＦＧＦ１０ポリペプチドを含むＦＧＦタンパク質ファミリーの様々なメンバーについて以前から報告されている。そこで，ＦＧＦ１０ポリペプチドの安定化形態であるＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの熱安定性に対するヘパリンの効果を試験し，ＦＧＦ１０‐ｗｔに対するヘパリンの安定化効果と比較した。ヘパリン濃度の範囲でのＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ及びＦＧＦ１０‐ｗｔの融解温度を，タンパク質溶液を１．０mg/mLに希釈し，ＤＳＦにより測定した。測定は２５～９０℃の温度で１℃／分の昇温速度で行った。Ｔmは，規格化した蛍光熱転移の中点として評価した。ＦＧＦ１０‐ｗｔの融解温度（Ｔm４６℃；ヘパリン非存在下で測定）は，５～１５μMのヘパリン存在下で大幅に上昇したが（Ｔm５７℃），タンパク質工学により安定化したＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの熱安定性は，試験した最高ヘパリン濃度（１５μM）存在下でも影響を受けなかった。ヘパリンを介したＦＧＦ１０ポリペプチドの安定化では融解温度が１０℃上昇したが，タンパク質工学を介した（即ち，４つの安定化アミノ酸置換の導入）ＦＧＦ１０安定化では融解温度は１９℃上昇した（図５）。この実施例は，タンパク質工学によるＦＧＦ１０の安定化がヘパリンの安定化効果を補い，更にヘパリンの安定化効果を凌駕することを実証している。
【0091】
実施例８．肺上皮４ＭＢｒ‐５細胞増殖アッセイによる，安定性を高めた４点ＦＧＦ１０突然変異体の生物学的活性試験
４点ＦＧＦ１０突然変異体，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの生物学的活性を，４ＭＢｒ‐５細胞系を用いた細胞増殖アッセイにより測定した（Rubin, J.S. et al., 1989, Proc Natl Acad Sci U S A, 86:802-806）。分析に先立ち，凍結乾燥形態のＦＧＦ１０を水中で再構築し，最終濃度１００μg/mLになるように０．１％ＢＳＡで希釈し，その直後に使用するか又は，－２０℃で保存した。４ＭＢｒ‐５細胞を１５０μLの４ＭＢｒ‐５飢餓培地（Ham's-12K-Gibco（登録商標）＋１０％ウシ新生仔血清＋１％ペニシリンＧ／硫酸ストレプトマイシン＋２μg/mLヘパリン）が入った９６ウェルプレートに，７．５×１０3個／ウェルで播種した。播種から３時間後，細胞を適切に接着するために，細胞をタンパク質処理した。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢを飢餓培地で連続希釈し，５０μLのタンパク質溶液をウェルに添加した。ＦＧＦ１０の最終濃度は０．００１ng/mL～２０００ng/mLの範囲であり，各濃度を３重に試験した。マウスＥＧＦをポジティブコントロールとして用いた。培養３日後，各ウェルに２０μLのレサズリン溶液を添加し，プレートを一晩インキュベートした。Synergy 4Hリーダーで蛍光測定（励起５６０nm，発光５９０nm）により代謝活性を測定した。ＦＧＦ１０による細胞増殖は，オンラインソフトウェアED50 Calculatorにより計算した有効量ＥＤ50（最大増殖の半分を達成するのに必要なタンパク質の濃度）の中央値で表す。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの測定したＥＤ50値，即ち４ＭＢｒ‐５細胞の増殖において最大反応の２分の１を誘導するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの濃度は０．２１ng/mLであり，これはこの効果について予測される組換えＦＧＦ１０‐ｗｔのＥＤ50値（＜１５ng/mL）と完全に一致する（図６）。従ってこの実施例は，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの生物学的活性が変化していないことを実証している。
４点ＦＧＦ１０突然変異体，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの生物学的活性を，４ＭＢｒ‐５細胞系を用いた細胞増殖アッセイにより測定した（Rubin, J.S. et al., 1989, Proc Natl Acad Sci U S A, 86:802-806）。分析に先立ち，凍結乾燥形態のＦＧＦ１０を水中で再構築し，最終濃度１００μg/mLになるように０．１％ＢＳＡで希釈し，その直後に使用するか又は，－２０℃で保存した。４ＭＢｒ‐５細胞を１５０μLの４ＭＢｒ‐５飢餓培地（Ham's-12K-Gibco（登録商標）＋１０％ウシ新生仔血清＋１％ペニシリンＧ／硫酸ストレプトマイシン＋２μg/mLヘパリン）が入った９６ウェルプレートに，７．５×１０3個／ウェルで播種した。播種から３時間後，細胞を適切に接着するために，細胞をタンパク質処理した。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢを飢餓培地で連続希釈し，５０μLのタンパク質溶液をウェルに添加した。ＦＧＦ１０の最終濃度は０．００１ng/mL～２０００ng/mLの範囲であり，各濃度を３重に試験した。マウスＥＧＦをポジティブコントロールとして用いた。培養３日後，各ウェルに２０μLのレサズリン溶液を添加し，プレートを一晩インキュベートした。Synergy 4Hリーダーで蛍光測定（励起５６０nm，発光５９０nm）により代謝活性を測定した。ＦＧＦ１０による細胞増殖は，オンラインソフトウェアED50 Calculatorにより計算した有効量ＥＤ50（最大増殖の半分を達成するのに必要なタンパク質の濃度）の中央値で表す。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの測定したＥＤ50値，即ち４ＭＢｒ‐５細胞の増殖において最大反応の２分の１を誘導するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの濃度は０．２１ng/mLであり，これはこの効果について予測される組換えＦＧＦ１０‐ｗｔのＥＤ50値（＜１５ng/mL）と完全に一致する（図６）。従ってこの実施例は，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの生物学的活性が変化していないことを実証している。
【0092】
実施例９．構造的半減期の向上により，３７℃で長時間インキュベートしても生物学的活性を維持する熱安定化４点ＦＧＦ１０変異体，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ
ＦＧＦタンパク質の固有な不安定性はその生物学的機能を制限し，長期間に渡ってＦＧＦレセプターシグナル伝達を活性化できないことは明らかである（Buchtova, M. et al., 2015, Cell. Mol. Life Sci., 72: 2445-2459）。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの熱力学的安定性の向上がどのように，３７℃での長時間インキュベート後に細胞シグナル伝達を維持する能力と相関するかを評価するため，乳腺癌ＭＣＦ７細胞シグナル伝達アッセイにより，ＥＲＫ経路の活性化を介してＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの生物学的活性をモニターした。ＭＣＦ７細胞はＦＧＦＲ２レセプターを内在的に発現する。このＦＧＦＲ２レセプターは，ＥＲＫ１／２を含むその下流のエフェクターと共にＦＧＦ１０との相互作用で活性化される。ＦＧＦ１０の生物学的活性が３７℃で低下すると，ＥＲＫ１／２リン酸化（ｐＥＲＫ１／２）は低下する。ＭＣＦ７細胞は完全培地（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）；Thermo Fisher Scientific）で増殖させた。ウェスタンブロット実験のために，ＭＣＦ７細胞２００，０００個／ウェルを０．５mLの完全培地が入った２４ウェルプレートにプレーティングし，翌日，最終濃度１０ng/mLのＦＧＦ１０で３０分間刺激し，２倍Laemmliサンプルバッファー中に溶解した。この処理のために，ＦＧＦ１０を完全培地で０．５μg/mLの濃度に希釈し，３７℃で最大２４時間プレインキュベートした。細胞ライセートを煮沸し（９５℃，７分間），ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで分解し，ＰＤＶＦ膜に転写し，ｐＥＲＫ１／２及びＥＲＫ１／２レベルを抗体及び化学発光により可視化した。ＦＧＦ１０を含む培地のアリコートをプレインキュベートの各時点で収集し，等量の２倍Laemmliサンプルバッファーと混合し，煮沸してＦＧＦ１０についてウェスタンブロットした。以下の抗体を用いた：ウサギモノクローナル抗ｐＥＲＫ（4376；Cell Signaling），ウサギポリクローナル抗ＥＲＫ（9102；Cell Signaling），ウサギポリクローナル抗ＦＧＦ１０（sc‐7917；SCBT）及び，ヤギ抗ウサギＩｇＧ‐ＨＲＰ（A6667；Sigma‐Aldrich）。ＦＧＦ１０‐ｗｔの生物学的活性は熱プレインキュベートの時間経過と共に低下したが，熱安定化ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ変異体は３７℃で２４時間後でも完全な生物学的活性を保持していた（図７）。
ＦＧＦタンパク質の固有な不安定性はその生物学的機能を制限し，長期間に渡ってＦＧＦレセプターシグナル伝達を活性化できないことは明らかである（Buchtova, M. et al., 2015, Cell. Mol. Life Sci., 72: 2445-2459）。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの熱力学的安定性の向上がどのように，３７℃での長時間インキュベート後に細胞シグナル伝達を維持する能力と相関するかを評価するため，乳腺癌ＭＣＦ７細胞シグナル伝達アッセイにより，ＥＲＫ経路の活性化を介してＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの生物学的活性をモニターした。ＭＣＦ７細胞はＦＧＦＲ２レセプターを内在的に発現する。このＦＧＦＲ２レセプターは，ＥＲＫ１／２を含むその下流のエフェクターと共にＦＧＦ１０との相互作用で活性化される。ＦＧＦ１０の生物学的活性が３７℃で低下すると，ＥＲＫ１／２リン酸化（ｐＥＲＫ１／２）は低下する。ＭＣＦ７細胞は完全培地（１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）；Thermo Fisher Scientific）で増殖させた。ウェスタンブロット実験のために，ＭＣＦ７細胞２００，０００個／ウェルを０．５mLの完全培地が入った２４ウェルプレートにプレーティングし，翌日，最終濃度１０ng/mLのＦＧＦ１０で３０分間刺激し，２倍Laemmliサンプルバッファー中に溶解した。この処理のために，ＦＧＦ１０を完全培地で０．５μg/mLの濃度に希釈し，３７℃で最大２４時間プレインキュベートした。細胞ライセートを煮沸し（９５℃，７分間），ＳＤＳ‐ＰＡＧＥで分解し，ＰＤＶＦ膜に転写し，ｐＥＲＫ１／２及びＥＲＫ１／２レベルを抗体及び化学発光により可視化した。ＦＧＦ１０を含む培地のアリコートをプレインキュベートの各時点で収集し，等量の２倍Laemmliサンプルバッファーと混合し，煮沸してＦＧＦ１０についてウェスタンブロットした。以下の抗体を用いた：ウサギモノクローナル抗ｐＥＲＫ（4376；Cell Signaling），ウサギポリクローナル抗ＥＲＫ（9102；Cell Signaling），ウサギポリクローナル抗ＦＧＦ１０（sc‐7917；SCBT）及び，ヤギ抗ウサギＩｇＧ‐ＨＲＰ（A6667；Sigma‐Aldrich）。ＦＧＦ１０‐ｗｔの生物学的活性は熱プレインキュベートの時間経過と共に低下したが，熱安定化ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ変異体は３７℃で２４時間後でも完全な生物学的活性を保持していた（図７）。
【0093】
同時に，３７℃でのインキュベート中の，ＦＧＦ１０‐ｗｔ及びその熱安定化４点突然変異体ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの構造的完全性を円偏光二色性（ＣＤ）分光法によりモニターした。７５０mMのＮａＣｌを含む２５mMリン酸バッファー（ｐＨ７．５）中における濃度０．２mg/mLのＦＧＦ１０‐ｗｔ及びＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの二次構造の変化を，２００～２６０nmの波長範囲に渡って３７℃で楕円率をモニターすることにより追跡した。データは，タンパク質が入った０．１cmの石英キュベットを用い，１nmのバンド幅で５分間隔で記録した。試験したＦＧＦ１０変異体の記録した変性曲線（単一指数関数）は，Origin2019bソフトウェア（OriginLab，ノーサンプトン，マサチューセッツ州）を用いて指数関数的減衰曲線に全体的に当てはめた。ＦＧＦ１０二次構造の半減期ｔ１／２は，タンパク質の二次構造の指標である楕円率の初期値が元の値の１／２に減少するために必要な時間として定義し，収集したデータから減衰定数（τ）として次式に従って評価した：ｔ１／２＝ｌｎ（２）／λ＝τｌｎ（２）。式中，λは指数関数的減衰定数である。ｔ１／２は２２７nmで収集したデータから評価し（図８Ａ），２２７nmでは，両ＦＧＦ１０タンパク質変異体のＣＤスペクトルは最大の楕円率を示した（図８Ｂ）。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢは明らかにＦＧＦ１０‐ｗｔを上回っており，ＦＧＦ１０‐ｗｔのｔ１／２は１１．６時間であるのに対し，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの二次構造のｔ１／２は３７℃で＞２４時間である（図８Ａ）。この実施例は，野生型ＦＧＦ１０の生物学的活性の低下は３７℃で熱プレインキュベートした後の二次構造の消失で表わされているのに対し，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢはその二次構造が保持されているため，３７℃で１日インキュベートした後も完全な生物学的活性を保持していることを実証している。
【0094】
実施例１０．ＭＣＦ７細胞レポーターアッセイによる４点ＦＧＦ１０変異体ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの長期的生物学的活性試験
ｐＫｒｏｘ２４（ＭａｐＥＲＫ）‐ＤｓＲｅｄレポーターを有するＴＲ０１ＧベクターでトランスフェクションしたＭＣＦ７細胞を用い，延長ＦＧＦＲシグナル伝達を活性化するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの能力を蛍光レポーターアッセイで試験した。ｐＫｒｏｘ２４（ＭａｐＥＲＫ）‐ＤｓＲｅｄは，細胞培養液へのＦＧＦ１０添加時のＦＧＦＲシグナル伝達活性化に反応し，ＦＧＦＲ／ＥＲＫ ＭＡＰシグナル伝達経路を刺激するＦＧＦ１０の能力の高感度モニタリングを可能にした。レポーターアッセイでは，ｐＫｒｏｘ２４（ＭａｐＥＲＫ）プロモーターの制御下でＤｓＲｅｄ（イソギンチャクモドキ（Discosoma）赤色蛍光タンパク質）を発現する５０，０００個のＭＣＦ７細胞を，０．５mLの完全培地が入った２４ウェルプレートにプレーティングした。翌日，最終濃度１００ng/mLのＦＧＦ１０で２４時間細胞を刺激した。自動インキュベート顕微鏡BioStation CT（Nikon）によりＤｓＲｅｄの発現を２４時間の全期間に渡ってモニターし，ｐＫｒｏｘ２４（ＭａｐＥＲＫ）‐ＤｓＲｅｄでトランスフェクションした無ＦＧＦ１０細胞（FGF10-free cells）であるコントロールについて記録したシグナルに対してプロットした。細胞処理では，ＦＧＦ１０を完全培地中１００ng/mLの濃度に希釈し，３７℃で２時間プレインキュベートした。
ｐＫｒｏｘ２４（ＭａｐＥＲＫ）‐ＤｓＲｅｄレポーターを有するＴＲ０１ＧベクターでトランスフェクションしたＭＣＦ７細胞を用い，延長ＦＧＦＲシグナル伝達を活性化するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの能力を蛍光レポーターアッセイで試験した。ｐＫｒｏｘ２４（ＭａｐＥＲＫ）‐ＤｓＲｅｄは，細胞培養液へのＦＧＦ１０添加時のＦＧＦＲシグナル伝達活性化に反応し，ＦＧＦＲ／ＥＲＫ ＭＡＰシグナル伝達経路を刺激するＦＧＦ１０の能力の高感度モニタリングを可能にした。レポーターアッセイでは，ｐＫｒｏｘ２４（ＭａｐＥＲＫ）プロモーターの制御下でＤｓＲｅｄ（イソギンチャクモドキ（Discosoma）赤色蛍光タンパク質）を発現する５０，０００個のＭＣＦ７細胞を，０．５mLの完全培地が入った２４ウェルプレートにプレーティングした。翌日，最終濃度１００ng/mLのＦＧＦ１０で２４時間細胞を刺激した。自動インキュベート顕微鏡BioStation CT（Nikon）によりＤｓＲｅｄの発現を２４時間の全期間に渡ってモニターし，ｐＫｒｏｘ２４（ＭａｐＥＲＫ）‐ＤｓＲｅｄでトランスフェクションした無ＦＧＦ１０細胞（FGF10-free cells）であるコントロールについて記録したシグナルに対してプロットした。細胞処理では，ＦＧＦ１０を完全培地中１００ng/mLの濃度に希釈し，３７℃で２時間プレインキュベートした。
【0095】
組換えＦＧＦ１０‐ｗｔで細胞を処理すると，ＦＧＦＲ／ＥＲＫ ＭＡＰキナーゼ経路の活性化に反応するｐＫｒｏｘ２４レポーターの転写が誘導された。ＦＧＦを介したｐＫｒｏｘ２４誘導を２４時間モニターし，その誘導はＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢで処理した細胞ではＦＧＦ１０‐ｗｔと比較して約２．５倍強かった（図９Ａ）。ＦＧＦ１０を細胞に添加する前に完全培地中で２時間プレインキュベートすると，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢによる通常の活性化と比較して，ＦＧＦ１０‐ｗｔではｐＫｒｏｘ２４誘導はほとんど見られなかった（図９Ｂ）。この実施例は，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢが，血清存在下でのアンフォールディング及びタンパク質分解に抵抗性のあるＦＧＦＲシグナル伝達の活性化を持続できることを実証している。
【0096】
実施例１１．４ＭＢｒ‐５細胞を用いた４点ＦＧＦ１０突然変異体の熱安定性測定
３７℃に７日間曝露した後の４ＭＢｒ‐５細胞の増殖を促進するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの能力を更に試験し，タンパク質安定性を更に探求した。４ＭＢｒ‐５細胞を，１５０μLの４ＭＢｒ‐５飢餓培地（Ham's F-12K-Gibco，１０％新生仔ウシ血清，１％ペニシリンＧ／硫酸ストレプトマイシン，２μg/mLヘパリン）が入った９６ウェルプレートに，７．５×１０3個／ウェルで播種した。播種から３時間後，細胞を適切に接着するために，細胞をタンパク質処理した。試験に先立ち，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ及びＦＧＦ１０‐ｗｔの両方を８μg/mLの濃度で３７℃で１日，３日及び，７日間インキュベートした。プレインキュベート後，タンパク質溶液を飢餓培地で連続希釈し，０．００１ng/mL～２０００ng/mLの最終濃度のタンパク質溶液５０μLをウェルに添加した。各タンパク質濃度を３重に試験した。マウスＥＧＦをポジティブコントロールとして用いた。培養３日後，各ウェルに２０μLのレサズリン溶液を添加し，プレートを一晩インキュベートした。Synergy 4Hリーダーで蛍光測定（励起５６０nm，発光５９０nm）により代謝活性を測定した。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢを３７℃で２４時間，３日間及び，７日間プレインキュベートしても，４ＭＢｒ‐５細胞の増殖を効果的に誘導するタンパク質の能力に影響はなかった（図１０）。３回の試験期間，３７℃でプレインキュベートした後に測定したＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢのＥＤ50値は＜１５ng/mLであり，これはプレインキュベートしていないタンパク質のＥＤ50値に相当する（ＥＤ50＝０．３７ng/mL）。一方，ＦＧＦ１０‐ｗｔを３７℃で２４時間，３日及び，７日間処理すると，タンパク質活性は徐々に低下し，これはＥＤ50値の上昇により実証された（図１０及び表４）。この実施例は，３７℃で７日間プレインキュベートした後でも，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの生物学的活性は変化しないことを示している。
３７℃に７日間曝露した後の４ＭＢｒ‐５細胞の増殖を促進するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの能力を更に試験し，タンパク質安定性を更に探求した。４ＭＢｒ‐５細胞を，１５０μLの４ＭＢｒ‐５飢餓培地（Ham's F-12K-Gibco，１０％新生仔ウシ血清，１％ペニシリンＧ／硫酸ストレプトマイシン，２μg/mLヘパリン）が入った９６ウェルプレートに，７．５×１０3個／ウェルで播種した。播種から３時間後，細胞を適切に接着するために，細胞をタンパク質処理した。試験に先立ち，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ及びＦＧＦ１０‐ｗｔの両方を８μg/mLの濃度で３７℃で１日，３日及び，７日間インキュベートした。プレインキュベート後，タンパク質溶液を飢餓培地で連続希釈し，０．００１ng/mL～２０００ng/mLの最終濃度のタンパク質溶液５０μLをウェルに添加した。各タンパク質濃度を３重に試験した。マウスＥＧＦをポジティブコントロールとして用いた。培養３日後，各ウェルに２０μLのレサズリン溶液を添加し，プレートを一晩インキュベートした。Synergy 4Hリーダーで蛍光測定（励起５６０nm，発光５９０nm）により代謝活性を測定した。ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢを３７℃で２４時間，３日間及び，７日間プレインキュベートしても，４ＭＢｒ‐５細胞の増殖を効果的に誘導するタンパク質の能力に影響はなかった（図１０）。３回の試験期間，３７℃でプレインキュベートした後に測定したＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢのＥＤ50値は＜１５ng/mLであり，これはプレインキュベートしていないタンパク質のＥＤ50値に相当する（ＥＤ50＝０．３７ng/mL）。一方，ＦＧＦ１０‐ｗｔを３７℃で２４時間，３日及び，７日間処理すると，タンパク質活性は徐々に低下し，これはＥＤ50値の上昇により実証された（図１０及び表４）。この実施例は，３７℃で７日間プレインキュベートした後でも，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの生物学的活性は変化しないことを示している。
【0097】
【表4】
【0098】
実施例１２．タンパク質分解に対する耐性が改善された熱安定化４点ＦＧＦ１０突然変異体
タンパク質分解に対するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの耐性を特性解析するために，１mg/mLのＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ及びＦＧＦ１０‐ｗｔを，７５０mM塩化ナトリウムを含む２０mMリン酸バッファー中，３７℃で１５分間インキュベートした。次にトリプシン（最終濃度２μgプロテアーゼ／１００μgＦＧＦ１０）をタンパク質溶液に添加し，消化混合物を３７℃でインキュベートした。選択した時間ごとにアリコートを取り出し，等容量の電気泳動希釈液に添加し，９５℃で５分間加熱し，ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。タンパク質バンドをデンシトメトリー分析により分析した。ＦＧＦ１０‐ｗｔ分解の進行が観察され，トリプシンとのインキュベート１０分後には既にタンパク質は残っていなかった。対照的に，１０分では顕著なタンパク質分解は認められず，トリプシンとのインキュベート１８０分後でさえ，経時的に強度が減少しているＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢのバンドが検出できた（図１１）。この実施例は，ＦＧＦ１０‐ｗｔと比較して，タンパク質分解に対するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの抵抗性が促進されていることを実証している。
タンパク質分解に対するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの耐性を特性解析するために，１mg/mLのＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ及びＦＧＦ１０‐ｗｔを，７５０mM塩化ナトリウムを含む２０mMリン酸バッファー中，３７℃で１５分間インキュベートした。次にトリプシン（最終濃度２μgプロテアーゼ／１００μgＦＧＦ１０）をタンパク質溶液に添加し，消化混合物を３７℃でインキュベートした。選択した時間ごとにアリコートを取り出し，等容量の電気泳動希釈液に添加し，９５℃で５分間加熱し，ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。タンパク質バンドをデンシトメトリー分析により分析した。ＦＧＦ１０‐ｗｔ分解の進行が観察され，トリプシンとのインキュベート１０分後には既にタンパク質は残っていなかった。対照的に，１０分では顕著なタンパク質分解は認められず，トリプシンとのインキュベート１８０分後でさえ，経時的に強度が減少しているＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢのバンドが検出できた（図１１）。この実施例は，ＦＧＦ１０‐ｗｔと比較して，タンパク質分解に対するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの抵抗性が促進されていることを実証している。
【0099】
実施例１３．配列番号：１のアミノ酸配列Ｓｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８を形成し，ＦＧＦ１０安定性及び活性に悪影響を及ぼさない，成熟型ヒトＦＧＦ１０ポリペプチドからの３１アミノ酸のＮ末端切断
成熟型ヒトＦＧＦ１０ポリペプチドから３１アミノ酸のＮ末端切断がタンパク質安定性及び活性に影響を及ぼさないことを実証するために，配列番号：１のＳｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８のアミノ酸配列及び，置換Ｌ１５２Ｆを有するその安定的変異体から成るＦＧＦ１０ポリペプチドを構築し，特性解析を行った。Ｎ末端Ｍｅｔを有するアミノ酸配列Ｓｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８（ＦＧＦ１０69‐208）から成るＦＧＦ１０ポリペプチドを，Q5（登録商標）Site-Directed Mutagenesis Kit（New England Biolabs）を用い，メーカーの説明書に従って指定変異導入法（side-directed mutagenesis）により構築した。変異導入は，テンプレートとしてのプラスミドｐＥＴ２８ｂ‐Ｈｉｓ‐トロンビン：：ｆｇｆ１０及び、NEBaseChanger（商標）ツールを用いて設計した２つのオリゴヌクレオチド（Ｆｗ：ＡＧＣＴＡＴＡＡＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＧ，Ｒｖ：ＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧ）を用い，全プラスミドＰＣＲにより行った。次いで，テンプレートとしてのベクターｐＥＴ２８ｂ‐Ｈｉｓ‐トロンビン：：ｆｇｆ１０69‐208及び，所望の突然変異を有する２つの重複していないオリゴヌクレオチドを用い，全プラスミドＰＣＲにより，単一点置換Ｌ１５２Ｆ（突然変異の番号は配列番号：１に対応する）をＦＧＦ１０69‐208ポリペプチドに導入した。得られた構築物を大腸菌ＮＥＢ５‐アルファコンピテント細胞に形質転換した。細胞をカナマイシン（５０μg/mL）を含む寒天プレート上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。プラスミドを単離し，ヌクレオチド配列を市販のシークエンシングで確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を発現ベクターで形質転換し，カナマイシンを添加した寒天プレートにプレーティングし，３７℃で一晩培養した。単一のコロニーを，カナマイシン（５０μg.mL）を含むＬＢ培地１０mLに接種し，細胞を３７℃で一晩培養した。一夜培養液を，カナマイシンを含むＬＢ培地１Lに接種した。細胞を３７℃で培養した。その発現を，終濃度０．５mMになるまでＩＰＴＧで誘導した。その後，細胞を２０℃で一晩培養した。培養の終わりに，バイオマスを遠心分離により採取し，精製バッファー（２０mMのリン酸水素二カリウム塩及びリン酸二水素カリウム，ｐＨ７.５，０．５MのＮａＣｌ，１０mMのイミダゾール）により洗浄し，湿潤バイオマスを－８０℃で凍結させた。解凍した培養液を音波処理により破壊し，ライセートを遠心分離した。シングルステップニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して，粗抽出液からタンパク質を精製した。精製したタンパク質を，７５０mMのＮａＣｌを含むバッファーに対して透析した。１５％ポリアクリルアミドゲル中のＳＤＳ‐ＰＡＧＥによりタンパク質の純度を明らかにした（図１２）。ＦＧＦポリペプチドが適切に折り畳まれ，熱安定性であることをＣＤ分光法により測定した。ＣＤスペクトルは，ChirascanＣＤ分光分析装置を用い，毎分１００nm，応答時間１秒，バンド幅２nmで，２００～２６０nmから収集した。ＦＧＦ１０69‐208ポリペプチド及びその変異体ＦＧＦ１０69‐208＋Ｌ１５２ＦのＣＤスペクトルは，組み換えヒトＦＧＦ１０（ＦＧＦ１０‐ｗｔ）及び，同じ安定化アミノ酸置換Ｌ１５２Ｆから成るその変異体のＣＤスペクトルと同等であったことから，Ｎ末端切断はＦＧＦ１０ポリペプチドの折り畳みに悪影響を及ぼさないことが示唆された（図１３）。７５０mM塩化ナトリウムを含む２０mMリン酸バッファーｐＨ７．５中の０．２mg/mLタンパク質溶液の熱アンフォールディングを，ChirascanＣＤ分光分析装置を用い，１℃／分の昇温速度で，２５℃～９０℃の温度範囲に渡り，２２７nmでの楕円率をモニターすることにより追跡した。融解温度（Ｔm）を，正規化した楕円率熱転移の中点として評価した。ＦＧＦ１０69‐208はＦＧＦ１０‐ｗｔ（Ｔm５３．０℃）と同程度のＴm（５２．７℃）を示すことから，Ｎ末端切断はＦＧＦ１０ポリペプチドの熱安定性に負の影響も正の影響も及ぼさない。両ＦＧＦ１０ポリペプチド，ＦＧＦ１０‐ｗｔ及びＦＧＦ１０69‐208に安定化アミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを導入すると，一貫して安定性が７℃増加する。ＦＧＦ１０６９‐２０８ポリペプチド及びその変異体ＦＧＦ１０69‐208＋Ｌ１５２Ｆの生物学的活性を，４ＭＢｒ‐５細胞系を用いた細胞増殖アッセイにより測定した（Rubin, J.S. et al., 1989, Proc Natl Acad Sci U S A, 86:802-806）。４ＭＢｒ‐５細胞を１５０μLの４ＭＢｒ‐５飢餓培地（Ham's F-12K-Gibco，１０％新生仔ウシ血清，１％ペニシリンＧ／硫酸ストレプトマイシン，２μg/mLヘパリン）が入った９６ウェルプレートに，７．５×１０3個／ウェルで播種した。播種から３時間後，細胞をタンパク質処理した。最終タンパク質濃度は０．００１ng/mL～２０００ng/mLの範囲であった。処理後，細胞を更に３日間培養した。レサズリン蛍光アッセイにより細胞増殖を測定した。実験は３重に行った。ＦＧＦ１０69‐208及びＦＧＦ１０69‐208＋Ｌ１５２Ｆは共に，ＦＧＦ１０‐ｗｔと同程度の４ＭＢｒ‐５細胞増殖促進能を示し（図１４），測定したＥＤ50値はそれぞれ０．５及び１．９ng/mLであり，この効果の予測ＥＤ50値＜１５ng/mLに相当する。
成熟型ヒトＦＧＦ１０ポリペプチドから３１アミノ酸のＮ末端切断がタンパク質安定性及び活性に影響を及ぼさないことを実証するために，配列番号：１のＳｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８のアミノ酸配列及び，置換Ｌ１５２Ｆを有するその安定的変異体から成るＦＧＦ１０ポリペプチドを構築し，特性解析を行った。Ｎ末端Ｍｅｔを有するアミノ酸配列Ｓｅｒ６９～Ｓｅｒ２０８（ＦＧＦ１０69‐208）から成るＦＧＦ１０ポリペプチドを，Q5（登録商標）Site-Directed Mutagenesis Kit（New England Biolabs）を用い，メーカーの説明書に従って指定変異導入法（side-directed mutagenesis）により構築した。変異導入は，テンプレートとしてのプラスミドｐＥＴ２８ｂ‐Ｈｉｓ‐トロンビン：：ｆｇｆ１０及び、NEBaseChanger（商標）ツールを用いて設計した２つのオリゴヌクレオチド（Ｆｗ：ＡＧＣＴＡＴＡＡＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＡＴＧＴＴＣＧ，Ｒｖ：ＣＡＴＡＴＧＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＧＧ）を用い，全プラスミドＰＣＲにより行った。次いで，テンプレートとしてのベクターｐＥＴ２８ｂ‐Ｈｉｓ‐トロンビン：：ｆｇｆ１０69‐208及び，所望の突然変異を有する２つの重複していないオリゴヌクレオチドを用い，全プラスミドＰＣＲにより，単一点置換Ｌ１５２Ｆ（突然変異の番号は配列番号：１に対応する）をＦＧＦ１０69‐208ポリペプチドに導入した。得られた構築物を大腸菌ＮＥＢ５‐アルファコンピテント細胞に形質転換した。細胞をカナマイシン（５０μg/mL）を含む寒天プレート上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。プラスミドを単離し，ヌクレオチド配列を市販のシークエンシングで確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を発現ベクターで形質転換し，カナマイシンを添加した寒天プレートにプレーティングし，３７℃で一晩培養した。単一のコロニーを，カナマイシン（５０μg.mL）を含むＬＢ培地１０mLに接種し，細胞を３７℃で一晩培養した。一夜培養液を，カナマイシンを含むＬＢ培地１Lに接種した。細胞を３７℃で培養した。その発現を，終濃度０．５mMになるまでＩＰＴＧで誘導した。その後，細胞を２０℃で一晩培養した。培養の終わりに，バイオマスを遠心分離により採取し，精製バッファー（２０mMのリン酸水素二カリウム塩及びリン酸二水素カリウム，ｐＨ７.５，０．５MのＮａＣｌ，１０mMのイミダゾール）により洗浄し，湿潤バイオマスを－８０℃で凍結させた。解凍した培養液を音波処理により破壊し，ライセートを遠心分離した。シングルステップニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して，粗抽出液からタンパク質を精製した。精製したタンパク質を，７５０mMのＮａＣｌを含むバッファーに対して透析した。１５％ポリアクリルアミドゲル中のＳＤＳ‐ＰＡＧＥによりタンパク質の純度を明らかにした（図１２）。ＦＧＦポリペプチドが適切に折り畳まれ，熱安定性であることをＣＤ分光法により測定した。ＣＤスペクトルは，ChirascanＣＤ分光分析装置を用い，毎分１００nm，応答時間１秒，バンド幅２nmで，２００～２６０nmから収集した。ＦＧＦ１０69‐208ポリペプチド及びその変異体ＦＧＦ１０69‐208＋Ｌ１５２ＦのＣＤスペクトルは，組み換えヒトＦＧＦ１０（ＦＧＦ１０‐ｗｔ）及び，同じ安定化アミノ酸置換Ｌ１５２Ｆから成るその変異体のＣＤスペクトルと同等であったことから，Ｎ末端切断はＦＧＦ１０ポリペプチドの折り畳みに悪影響を及ぼさないことが示唆された（図１３）。７５０mM塩化ナトリウムを含む２０mMリン酸バッファーｐＨ７．５中の０．２mg/mLタンパク質溶液の熱アンフォールディングを，ChirascanＣＤ分光分析装置を用い，１℃／分の昇温速度で，２５℃～９０℃の温度範囲に渡り，２２７nmでの楕円率をモニターすることにより追跡した。融解温度（Ｔm）を，正規化した楕円率熱転移の中点として評価した。ＦＧＦ１０69‐208はＦＧＦ１０‐ｗｔ（Ｔm５３．０℃）と同程度のＴm（５２．７℃）を示すことから，Ｎ末端切断はＦＧＦ１０ポリペプチドの熱安定性に負の影響も正の影響も及ぼさない。両ＦＧＦ１０ポリペプチド，ＦＧＦ１０‐ｗｔ及びＦＧＦ１０69‐208に安定化アミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを導入すると，一貫して安定性が７℃増加する。ＦＧＦ１０６９‐２０８ポリペプチド及びその変異体ＦＧＦ１０69‐208＋Ｌ１５２Ｆの生物学的活性を，４ＭＢｒ‐５細胞系を用いた細胞増殖アッセイにより測定した（Rubin, J.S. et al., 1989, Proc Natl Acad Sci U S A, 86:802-806）。４ＭＢｒ‐５細胞を１５０μLの４ＭＢｒ‐５飢餓培地（Ham's F-12K-Gibco，１０％新生仔ウシ血清，１％ペニシリンＧ／硫酸ストレプトマイシン，２μg/mLヘパリン）が入った９６ウェルプレートに，７．５×１０3個／ウェルで播種した。播種から３時間後，細胞をタンパク質処理した。最終タンパク質濃度は０．００１ng/mL～２０００ng/mLの範囲であった。処理後，細胞を更に３日間培養した。レサズリン蛍光アッセイにより細胞増殖を測定した。実験は３重に行った。ＦＧＦ１０69‐208及びＦＧＦ１０69‐208＋Ｌ１５２Ｆは共に，ＦＧＦ１０‐ｗｔと同程度の４ＭＢｒ‐５細胞増殖促進能を示し（図１４），測定したＥＤ50値はそれぞれ０．５及び１．９ng/mLであり，この効果の予測ＥＤ50値＜１５ng/mLに相当する。
【0100】
実施例１４．タンパク質の熱安定性及び活性を失うことなく達成できる熱安定性ＦＧＦ１０アミノ酸配列の１２％の変化
ハヤブサ由来のＦＧＦ１０（ＦＧＦ１０‐Ｆｐ）に相当する配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有するＦＧＦ１０ポリペプチドをコードする遺伝子を人工的に合成し，Ｔ７ｌａｃプロモーターの制御下で発現ベクターｐＥＴ２８ｂ‐Ｈｉｓ‐トロンビンのＮｄｅｌ部位及びＸｈｏｌ部位でサブクローン化した。次いで，テンプレートとしてのベクターｐＥＴ２８ｂ‐Ｈｉｓ‐トロンビン：：ｆｇｆ１０‐ｆｐ及び，所望の突然変異を有する２つの重複していないオリゴヌクレオチドを用い，全プラスミドＰＣＲにより，単一点置換Ｌ１５２Ｆ（突然変異の番号は配列番号：１に対応する）を，配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有するＦＧＦ１０‐ＦＰポリペプチドに導入した。得られた構築物を大腸菌ＮＥＢ５‐アルファコンピテント細胞に形質転換した。細胞をカナマイシン（５０μg/mL）を含む寒天プレート上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。プラスミドを単離し，ヌクレオチド配列を市販のシークエンシングで確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を発現ベクターで形質転換し，カナマイシンを添加した寒天プレートにプレーティングし，３７℃で一晩培養した。単一のコロニーを，カナマイシン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地１０mLに接種し，細胞を３７℃で一晩培養した。一夜培養液を，カナマイシンを含むＬＢ培地１Lに接種した。細胞を３７℃で培養した。その発現を０．５mMの終濃度までＩＰＴＧで誘導した。その後，細胞を２０℃で一晩培養した。培養の終わりに，バイオマスを遠心分離により採取し，精製バッファー（２０mMのリン酸水素二カリウム塩及びリン酸二水素カリウム，ｐＨ７.５，０．５MのＮａＣｌ，１０mMのイミダゾール）により洗浄し，湿潤バイオマスを－８０℃で凍結させた。解凍した培養液を音波処理により破壊し，ライセートを遠心分離した。シングルステップニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して，粗抽出液からタンパク質を精製した。精製したタンパク質を，７５０mMのＮａＣｌを含むバッファーに対して透析した。１５％ポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ‐ＰＡＧＥによりタンパク質の純度を明らかにした（図１５）。ＦＧＦポリペプチドが適切に折り畳まれ，熱安定性であることをＣＤ分光法により測定した。ＣＤスペクトルは，ChirascanＣＤ分光分析装置を用い，毎分１００nm，応答時間１秒，バンド幅２nmで，２００～２６０nmから収集した。アミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを含む，配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有するＦＧＦ１０ポリペプチド及びその単一点変異体のＣＤスペクトルは，組み換えヒトＦＧＦ１０‐ｗｔ及び同じアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆから成るその変異体のＣＤスペクトルと同等であったことから（図１６），アミノ酸配列を１２％変えた新たに構築したＦＧＦ１０ポリペプチドの折り畳みは適切であることが示唆された。７５０mM塩化ナトリウムを含む２０mMリン酸バッファーｐＨ７．５中の０．２mg/mLタンパク質溶液の熱アンフォールディングを，ChirascanＣＤ分光分析装置を用い，１℃／分の昇温速度で，２５℃～９０℃の温度範囲に渡り，２２７nmでの楕円率をモニターすることにより追跡した。融解温度（Ｔm）を，正規化した楕円率熱転移の中点として評価した。配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有する組換えタカＦＧＦ１０ポリペプチド（ＦＧＦ１０‐Ｆｐ）の融解温度は，組換えヒトＦＧＦ１０（ＦＧＦ１０‐ｗｔ）より５℃高かった。観察されたＦＧＦ１０ポリペプチドの融解温度の差は，鳥類の深部体温がヒトの体温より一般的に３～６℃高いことに起因すると考えられる（McCafferty, D.J., et al., 2015, Anim. Biotelemetry 3:33）。しかし，ＦＧＦ１０‐ｗｔとＦＧＦ１０‐Ｆｐの両ポリペプチドに同じ安定化突然変異Ｌ１５２Ｆを導入すると，融解温度がそれぞれ７℃及び５℃上昇した。
ハヤブサ由来のＦＧＦ１０（ＦＧＦ１０‐Ｆｐ）に相当する配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有するＦＧＦ１０ポリペプチドをコードする遺伝子を人工的に合成し，Ｔ７ｌａｃプロモーターの制御下で発現ベクターｐＥＴ２８ｂ‐Ｈｉｓ‐トロンビンのＮｄｅｌ部位及びＸｈｏｌ部位でサブクローン化した。次いで，テンプレートとしてのベクターｐＥＴ２８ｂ‐Ｈｉｓ‐トロンビン：：ｆｇｆ１０‐ｆｐ及び，所望の突然変異を有する２つの重複していないオリゴヌクレオチドを用い，全プラスミドＰＣＲにより，単一点置換Ｌ１５２Ｆ（突然変異の番号は配列番号：１に対応する）を，配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有するＦＧＦ１０‐ＦＰポリペプチドに導入した。得られた構築物を大腸菌ＮＥＢ５‐アルファコンピテント細胞に形質転換した。細胞をカナマイシン（５０μg/mL）を含む寒天プレート上にプレーティングし，３７℃で一晩培養した。プラスミドを単離し，ヌクレオチド配列を市販のシークエンシングで確認した。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を発現ベクターで形質転換し，カナマイシンを添加した寒天プレートにプレーティングし，３７℃で一晩培養した。単一のコロニーを，カナマイシン（５０μg/mL）を含むＬＢ培地１０mLに接種し，細胞を３７℃で一晩培養した。一夜培養液を，カナマイシンを含むＬＢ培地１Lに接種した。細胞を３７℃で培養した。その発現を０．５mMの終濃度までＩＰＴＧで誘導した。その後，細胞を２０℃で一晩培養した。培養の終わりに，バイオマスを遠心分離により採取し，精製バッファー（２０mMのリン酸水素二カリウム塩及びリン酸二水素カリウム，ｐＨ７.５，０．５MのＮａＣｌ，１０mMのイミダゾール）により洗浄し，湿潤バイオマスを－８０℃で凍結させた。解凍した培養液を音波処理により破壊し，ライセートを遠心分離した。シングルステップニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して，粗抽出液からタンパク質を精製した。精製したタンパク質を，７５０mMのＮａＣｌを含むバッファーに対して透析した。１５％ポリアクリルアミドゲルのＳＤＳ‐ＰＡＧＥによりタンパク質の純度を明らかにした（図１５）。ＦＧＦポリペプチドが適切に折り畳まれ，熱安定性であることをＣＤ分光法により測定した。ＣＤスペクトルは，ChirascanＣＤ分光分析装置を用い，毎分１００nm，応答時間１秒，バンド幅２nmで，２００～２６０nmから収集した。アミノ酸置換Ｌ１５２Ｆを含む，配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有するＦＧＦ１０ポリペプチド及びその単一点変異体のＣＤスペクトルは，組み換えヒトＦＧＦ１０‐ｗｔ及び同じアミノ酸置換Ｌ１５２Ｆから成るその変異体のＣＤスペクトルと同等であったことから（図１６），アミノ酸配列を１２％変えた新たに構築したＦＧＦ１０ポリペプチドの折り畳みは適切であることが示唆された。７５０mM塩化ナトリウムを含む２０mMリン酸バッファーｐＨ７．５中の０．２mg/mLタンパク質溶液の熱アンフォールディングを，ChirascanＣＤ分光分析装置を用い，１℃／分の昇温速度で，２５℃～９０℃の温度範囲に渡り，２２７nmでの楕円率をモニターすることにより追跡した。融解温度（Ｔm）を，正規化した楕円率熱転移の中点として評価した。配列番号：３又は配列番号：５と８８％の配列同一性を有する組換えタカＦＧＦ１０ポリペプチド（ＦＧＦ１０‐Ｆｐ）の融解温度は，組換えヒトＦＧＦ１０（ＦＧＦ１０‐ｗｔ）より５℃高かった。観察されたＦＧＦ１０ポリペプチドの融解温度の差は，鳥類の深部体温がヒトの体温より一般的に３～６℃高いことに起因すると考えられる（McCafferty, D.J., et al., 2015, Anim. Biotelemetry 3:33）。しかし，ＦＧＦ１０‐ｗｔとＦＧＦ１０‐Ｆｐの両ポリペプチドに同じ安定化突然変異Ｌ１５２Ｆを導入すると，融解温度がそれぞれ７℃及び５℃上昇した。
【0101】
ＦＧＦ１０‐Ｆｐ及び，単一点置換Ｌ１５２Ｆを有するその変異体（ＦＧＦ１０‐Ｆｐ＋Ｌ１５２Ｆ）の生物学的活性を，４ＭＢｒ‐５細胞系を用いた細胞増殖アッセイにより測定した（Rubin, J.S. et al., 1989, Proc Natl Acad Sci U S A, 86:802-806）。４ＭＢｒ‐５細胞を１５０μLの４ＭＢｒ‐５飢餓培地（Ham's F-12K-Gibco，１０％新生仔ウシ血清，１％ペニシリンＧ／硫酸ストレプトマイシン，２μg/mLヘパリン）が入った９６ウェルプレートに，７．５×１０3個／ウェルで播種した。播種から３時間後，細胞をタンパク質処理した。最終タンパク質濃度は０．００１ng/mL～２０００ng/mLの範囲であった。処理後，細胞を更に３日間培養した。レサズリン蛍光アッセイにより細胞増殖を測定した。実験は３重に行った。４ＭＢｒ‐５の増殖アッセイで測定したＦＧＦ１０‐Ｆｐ及びＦＧＦ１０‐Ｆｐ＋Ｌ１５２ＦのＥＤ50値はそれぞれ１２．７及び６．１ng/mLであった（図１７）。この実施例は，生物学的活性を保持しつつ耐熱性ＦＧＦ１０ポリペプチドの安定性をあまり損なわずに，１２％のアミノ酸配列変化を導入できることを実証している。
【0102】
実施例１５．肺細胞塊及び肺オルガノイドの形成を促進する培地中のＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの存在。
ＦＧＦ１０は肺の発生，分化及び，再生において重要な役割を担っている。そこで，肺細胞塊及び肺オルガノイドの形成，分岐及び，分化に対するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの効果を調べた。肺上皮細胞を前述のように単離し（Rabata, A. et al., 2017, Methods Mol Biol, 1612:149-165），非接着条件下で培養した。肺細胞塊培地（フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２中，ビタミンＡを含まない1 x Ｂ‐２７，１００U/mLのペニシリン，１００μg/mLのストレプトマイシン，４μg/mLのヘパリン，２０ng/mLのマウスＥＧＦ，１０ng/mLのＦＧＦ１０‐ｗｔ又はＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ，１０μMのＹ－２７６３２）２mL／ウェルを含む，ポリＨＥＭＡで処理した６ウェルプレートに，２．５×１０4～５×１０4細胞でソーティングしない（Unsorted）肺上皮細胞を播種した。プレートを３７℃，５％ＣＯ２の加湿雰囲気中でインキュベートした。新鮮な肺細胞塊培地（Ｙ‐２７６３２を含まない）を３日毎に添加した。１０～１５日間培養した後，肺細胞塊を計数した。肺細胞塊形成効率は，形成された肺細胞塊の数と播種した細胞の数との比として計算した。
ＦＧＦ１０は肺の発生，分化及び，再生において重要な役割を担っている。そこで，肺細胞塊及び肺オルガノイドの形成，分岐及び，分化に対するＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢの効果を調べた。肺上皮細胞を前述のように単離し（Rabata, A. et al., 2017, Methods Mol Biol, 1612:149-165），非接着条件下で培養した。肺細胞塊培地（フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２中，ビタミンＡを含まない1 x Ｂ‐２７，１００U/mLのペニシリン，１００μg/mLのストレプトマイシン，４μg/mLのヘパリン，２０ng/mLのマウスＥＧＦ，１０ng/mLのＦＧＦ１０‐ｗｔ又はＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ，１０μMのＹ－２７６３２）２mL／ウェルを含む，ポリＨＥＭＡで処理した６ウェルプレートに，２．５×１０4～５×１０4細胞でソーティングしない（Unsorted）肺上皮細胞を播種した。プレートを３７℃，５％ＣＯ２の加湿雰囲気中でインキュベートした。新鮮な肺細胞塊培地（Ｙ‐２７６３２を含まない）を３日毎に添加した。１０～１５日間培養した後，肺細胞塊を計数した。肺細胞塊形成効率は，形成された肺細胞塊の数と播種した細胞の数との比として計算した。
【0103】
３Ｄマトリゲル（Matrigel）中の肺オルガノイド培養では，肺上皮細胞をマトリゲルに再懸濁し，マトリゲルでコーティングしたドーム状２４ウェルプレートにプレーティングした（５０μLマトリゲル／ウェル中１．０～１．５×１０4細胞）。プレートを３７℃で４５分間インキュベートした後，１mLの培地（フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２中，ビタミンＡを含まない1 x Ｂ‐２７，１００U/mLのペニシリン，１００μg/mLのストレプトマイシン，２０ng/mLのマウスＥＧＦ，２nMのＦＧＦ１０‐ｗｔ又はＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢ，１０μMのＹ－２７６３２）を各ウェルに添加した。細胞を３７℃，５％ＣＯ２の加湿雰囲気下でインキュベートした。培地を３日毎に交換した。２１日間培養した後，肺オルガノイドを計数した。オルガノイド形成効率は，形成された肺オルガノイドの数と播種した細胞の数との比として計算した。
【0104】
得られた結果から，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢではＦＧＦ１０‐ｗｔより高い肺細胞塊形成効率及びオルガノイド形成効率が観察された（図１８）。更に，ＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢで形成されたオルガノイドは基底細胞マーカーより，分岐が多く，気道及び肺胞細胞マーカーの染色率が高かった。この実施例は，肺細胞塊／肺オルガノイド培地中にＦＧＦ１０‐ＳＴＡＢが存在すると，肺細胞塊／オルガノイドの形成及び分化が促進されることを実証している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【配列表】
【国際調査報告】