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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 38/20 20060101AFI20241024BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241024BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241024BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20241024BHJP
A61K 47/12 20060101ALI20241024BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20241024BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20241024BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20241024BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20241024BHJP
A61K 47/14 20170101ALI20241024BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20241024BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20241024BHJP
C07K 14/54 20060101ALN20241024BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20241024BHJP
C07K 16/00 20060101ALN20241024BHJP
【ＦＩ】
A61K38/20
A61P35/00
A61P35/02
A61P29/00
A61K47/68
A61K47/12
A61K47/18
A61K47/02
A61K47/26
A61K47/34
A61K47/14
A61K9/08
A61K9/19
C07K14/54 ZNA
C07K19/00
C07K16/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024529692
(86)(22)【出願日】2022-11-17
(85)【翻訳文提出日】2024-07-12
(86)【国際出願番号】 CN2022132510
(87)【国際公開番号】W WO2023088354
(87)【国際公開日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】202111375146.0
(32)【優先日】2021-11-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(31)【優先権主張番号】202111384988.2
(32)【優先日】2021-11-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523079059
【氏名又は名称】山▲東▼先声生物制▲薬▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｓｉｍｃｅｒｅ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｒｏａｄ，Ｙａｎｔａｉ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ，Ｙａｎｔａｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２６４００６，Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】100115255
【弁理士】
【氏名又は名称】辻丸 光一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100201732
【弁理士】
【氏名又は名称】松縄 正登
(74)【代理人】
【識別番号】100154081
【弁理士】
【氏名又は名称】伊佐治 創
(74)【代理人】
【識別番号】100227019
【弁理士】
【氏名又は名称】安 修央
(72)【発明者】
【氏名】▲馬▼ ▲飛▼
(72)【発明者】
【氏名】李 シンシン
(72)【発明者】
【氏名】胡 建中
(72)【発明者】
【氏名】▲劉▼ ▲楊▼
(72)【発明者】
【氏名】▲趙▼ ▲暁▼峰
(72)【発明者】
【氏名】曹 卓▲暁▼
(72)【発明者】
【氏名】唐 任宏
(72)【発明者】
【氏名】任 晋生
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076AA29
4C076BB11
4C076CC04
4C076CC27
4C076DD09E
4C076DD23Q
4C076DD26Z
4C076DD38Q
4C076DD41Z
4C076DD43Z
4C076DD46E
4C076DD51Q
4C076DD51Z
4C076DD67Q
4C076EE23E
4C076EE59
4C076FF15
4C076FF36
4C076FF61
4C076FF63
4C076GG07
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA21
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA41
4C084CA53
4C084DA12
4C084MA65
4C084NA03
4C084ZB111
4C084ZB112
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA02
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質製剤である。具体的には、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、緩衝液、タンパク質安定剤及び界面活性剤を含む、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質医薬組成物を提供する。上記医薬組成物は、製品の長期貯蔵及び輸送中にＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質の安定性を維持し、ひいては医薬品の安定性、安全性及び有効性を保証することができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、緩衝液、タンパク質安定剤及び界面活性剤を含む、ことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項2】
前記ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質は、以下のドメイン：（１）ＩＬ－１５突然変異体、
（２）ＩＬ－１５突然変異体と融合される免疫グロブリン分子又はその一部、
（３）ＩＬ－１５Ｒα、を含む、
ことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記ＩＬ－１５突然変異体は、野生型ＩＬ－１５のＡｓｐ８、Ｉｌｅ６、Ｖａｌ３及びＨｉｓ１０５に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基における突然変異を含む、ことを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記突然変異は、Ａｓｐ８Ｓｅｒ（Ｄ８Ｓ）、Ａｓｐ８Ｇｌｙ（Ｄ８Ｇ）、Ａｓｐ８Ｇｌｕ（Ｄ８Ｅ）、Ｖａｌ３Ｌｅｕ（Ｖ３Ｌ）、Ｉｌｅ６Ａｓｐ（Ｉ６Ｄ）、及び／又はＨｉｓ１０５Ｌｙｓ（Ｈ１０５Ｋ）のアミノ酸置換からなる群から選択される、ことを特徴とする、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記ＩＬ－１５突然変異体は、（１）Ａｓｐ８Ｓｅｒ、（２）Ａｓｐ８Ｇｌｙ、（３）Ｈｉｓ１０５Ｌｙｓ、（４）Ａｓｐ８Ｇｌｕ及びＶａｌ３Ｌｅｕ、（５）Ｖａｌ３Ｌｅｕ及びＩｌｅ６Ａｓｐ、又は、（６）Ａｓｐ８Ｓｅｒ及びＨｉｓ１０５Ｌｙｓの突然変異又は突然変異の組み合わせを含み、好ましくはＡｓｐ８Ｓｅｒ及びＨｉｓ１０５Ｌｙｓである、ことを特徴とする、請求項１～４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記ＩＬ－１５突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７に示され、好ましくは、前記野生型ＩＬ－１５のアミノ酸配列は、配列番号１に示される、
ことを特徴とする、請求項１～５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質における各ドメインの連結順序は、Ｎ末端からＣ末端へ：（１）免疫グロブリン分子又はその一部、ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５突然変異体、
（２）免疫グロブリン分子又はその一部、ＩＬ－１５突然変異体、ＩＬ－１５Ｒα、
（３）ＩＬ－１５突然変異体、ＩＬ－１５Ｒα、免疫グロブリン分子又はその一部、
（４）ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５突然変異体、免疫グロブリン分子又はその一部であり、
好ましくは、ＩＬ－１５Ｒα又はＩＬ－１５突然変異体は、免疫グロブリン分子と融合される場合、免疫グロブリン分子の重鎖可変領域のＮ末端又は免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に融合され、ＩＬ－１５Ｒα又はＩＬ－１５突然変異体は、免疫グロブリンＦｃ領域と融合される場合、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端に融合される、
ことを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記ＩＬ－１５突然変異体は、リンカーペプチドを介して又は介さずに、免疫グロブリン分子又はその一部と融合され、或いは前記ＩＬ－１５突然変異体は、リンカーペプチドを介して又は介さずにＩＬ－１５Ｒαと融合され、好ましくは、リンカーペプチドを使用し、好ましくは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６に示されるリンカーペプチドを使用し、好ましくは、前記ＩＬ－１５突然変異体は、リンカーペプチドを介して又は介さずにＩＬ－１５Ｒαと融合され、さらに免疫グロブリン分子又はその一部と融合され、好ましくは、リンカーペプチドを使用し、好ましくは、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１６に示されるリンカーペプチドを使用する、
ことを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記免疫グロブリン分子は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片であり、好ましくは、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片は、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、ＫＮ－０３５又は７９４－ｈ１－７１から選択され、より好ましくは、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖は、配列番号１９又は配列番号２０に示される配列を有し、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖は、配列番号２１に示される配列を有する、
ことを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
前記免疫グロブリン分子の一部は、免疫グロブリンＦｃ領域であり、好ましくは、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤのいずれか１つのＦｃ領域から選択され、好ましくは、ヒト又はマウス抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常領域の配列を含み、
より好ましくは、前記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列は、配列番号１２に示される、
ことを特徴とする、請求項１～８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質は、（１）前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖を含み、それぞれ配列番号２２、２３、２４、２５又は２６に示される配列を有する単量体１、配列番号２１に示される配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖、
（２）前記（１）に示される配列と少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む、
ことを特徴とする、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは２５ｍｇ／ｍＬ～９５ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ又は２５ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする、請求項１～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記緩衝液は、酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液、クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液から選択され、好ましくはヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液である、ことを特徴とする、請求項１～１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記緩衝液の濃度は、１０ｍＭ～１００ｍＭであり、好ましくは１５ｍＭ～３０ｍＭであり、より好ましくは２０ｍＭである、ことを特徴とする、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項15】
前記タンパク質安定剤は、塩化ナトリウム、グリシン、塩酸アルギニン、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトールから選択され、好ましくはスクロース、トレハロースである、ことを特徴とする、請求項１～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項16】
前記タンパク質安定剤の濃度は、１％～１０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは２％（ｗ／ｖ）、４．５％（ｗ／ｖ）又は８％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは８％（ｗ／ｖ）である、ことを特徴とする、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項17】
前記界面活性剤は、ポリソルベート、ポロキサマー、グリセリン脂肪酸エステルから選択され、好ましくはポロキサマー１８８である、ことを特徴とする、請求項１～１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項18】
前記界面活性剤の濃度は、０．０１％～０．１％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）又は０．０８％（ｗ／ｖ）である、ことを特徴とする、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項19】
前記医薬組成物のｐＨは、約４．５～７．５であり、好ましくは４．５～６．５であり、より好ましくは６である、ことを特徴とする、請求項１～１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項20】
ａ）濃度が１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬであるＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、ｂ）濃度が１０ｍＭ～１００ｍＭで、ｐＨが４．５～７．５であるヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液、
ｃ）濃度が１％～１０％（ｗ／ｖ）であるトレハロース、及び
ｄ）濃度が０．０１％～０．１％（ｗ／ｖ）であるポロキサマー、を含み、
好ましくは、前記医薬組成物は、
ａ）濃度が２５ｍｇ／ｍＬ～９５ｍｇ／ｍＬであるＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、
ｂ）濃度が１５ｍＭ～３０ｍＭで、ｐＨが５．５～６．５であるヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液、
ｃ）濃度が２％～８％（ｗ／ｖ）であるトレハロース、及び
ｄ）濃度が０．０４％（ｗ／ｖ）であるポロキサマー１８８、を含み
好ましくは、前記医薬組成物は、液体形態又は凍結乾燥粉末製剤である、
請求項１～１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項21】
請求項１～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物を製造する方法であって、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質溶液を緩衝液により置換するステップを含み、前記緩衝液は、好ましくはヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液であり、前記緩衝液の濃度は、好ましくは２０ｍＭであり、前記緩衝液のｐＨは、好ましくは６であり、
好ましくは、製造方法は、凍結乾燥のステップをさらに含み、
より好ましくは、凍結乾燥ステップは、以下を含む：（１）真空凍結乾燥機の乾燥箱を－４５℃に降温して３時間～５時間保持し、（２）乾燥箱の温度を－５℃に昇温して３時間～５時間保持し、（３）乾燥箱の温度を－４５℃に降温して３時間～５時間保持し、ステップ（１）～（３）の予備凍結の過程において、昇温降温速度を０．５℃～１℃／ｍｉｎに保持し、（４）一次乾燥真空度を０．１ｍＢａｒとし、温度を－３０℃～－２０℃に保持し、このステップの合計時間が３０時間を超える必要があり、（５）一次乾燥後、０．１℃～０．３℃／ｍｉｎの昇温速度で２５℃に昇温して解析乾燥を開始し、真空度を０．１ｍＢａｒに１時間～２時間保持し、その後、到達真空になり、温度を不変に保持し、保持時間が１５時間を超える、
方法。
【請求項22】
請求項２１に記載の方法によって製造される、ことを特徴とする、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項23】
請求項１～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物を凍結乾燥することによって得られる、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質を含む凍結乾燥製剤。
【請求項24】
請求項２３に記載の凍結乾燥製剤を再溶解することによって製造される、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質を含む再溶解溶液。
【請求項25】
個体における疾患を予防及び／又は治療する薬物の製造における、請求項１～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２１に記載の方法によって製造される製品、請求項２２に記載の医薬組成物、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤、又は請求項２４に記載の再溶解溶液の用途であって、前記疾患は、好ましくは腫瘍又は炎症性疾患であり、好ましくは、前記腫瘍は、膠芽腫、前立腺癌、血液癌、Ｂ細胞腫瘍、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃癌と食道癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌及び扁平上皮頭頸部癌から選択される、
用途。
【請求項26】
個体における疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする患者に、請求項１～２０のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項２１に記載の方法によって製造される製品、請求項２２に記載の医薬組成物、請求項２３に記載の凍結乾燥製剤、又は請求項２４に記載の再溶解溶液を投与することを含み、前記疾患は、好ましくは腫瘍又は炎症性疾患であり、好ましくは、前記腫瘍は、膠芽腫、前立腺癌、血液癌、Ｂ細胞腫瘍、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃癌と食道癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌及び扁平上皮頭頸部癌から選択される、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、以下の２件の中国発明特許出願の利益及び優先権を主張し、それらの全ての内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる：２０２１年１１月１８日に中国国家知識産権局に提出された第２０２１１１３７５１４６．０号特許出願、及び２０２１年１１月２２日に中国国家知識産権局に提出された第２０２１１１３８４９８８．２号特許出願。
本願は、以下の２件の中国発明特許出願の利益及び優先権を主張し、それらの全ての内容が参照により全体として本明細書に組み込まれる：２０２１年１１月１８日に中国国家知識産権局に提出された第２０２１１１３７５１４６．０号特許出願、及び２０２１年１１月２２日に中国国家知識産権局に提出された第２０２１１１３８４９８８．２号特許出願。
【0002】
本発明は、薬物製剤の分野に関し、具体的には、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0003】
高分子タンパク質薬物（例えば、抗体など）の製剤は、通常、非経口投与に適した注射剤であり、その投与方法は、通常、皮下、静脈、筋肉内などを含む。タンパク質は溶液中で比較的不安定であり、粒子の形成や凝集などが非常に起こりやすいため、安定性が高分子タンパク質薬物の開発の一難題になっている。したがって、高分子タンパク質薬物（例えば、抗体など）の製剤の開発には、まずタンパク質の安定性の問題を解決する必要がある。
【発明の概要】
【0004】
本発明は、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質の液体製剤及び凍結乾燥製剤を提供し、本発明に記載の製剤は、製品の長期貯蔵及び輸送中にＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質の安定性を維持し、ひいては医薬品の安定性、安全性及び有効性を保証することができる。
【0005】
第１の態様において、本開示は、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、緩衝液、タンパク質安定剤及び界面活性剤を含む、医薬組成物を提供する。
【0006】
一実施形態において、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質は、ＩＬ－１５突然変異体、ＩＬ－１５突然変異体と融合される免疫グロブリン分子若しくはその一部、及び／又はＩＬ－１５Ｒαを含む。
【0007】
一実施形態において、ＩＬ－１５突然変異体は、野生型ＩＬ－１５のＡｓｐ８、Ｉｌｅ６、Ｖａｌ３及びＨｉｓ１０５に対応する１つ又は複数のアミノ酸残基における突然変異を含む。
【0008】
一実施形態において、上記突然変異は、置換、挿入又は欠失である。
【0009】
１つの具体的な実施形態において、上記突然変異は、Ａｓｐ８Ｓｅｒ（Ｄ８Ｓ）、Ａｓｐ８Ｇｌｙ（Ｄ８Ｇ）、Ａｓｐ８Ｇｌｕ（Ｄ８Ｅ）、Ｖａｌ３Ｌｅｕ（Ｖ３Ｌ）、Ｉｌｅ６Ａｓｐ（Ｉ６Ｄ）、及び／又はＨｉｓ１０５Ｌｙｓ（Ｈ１０５Ｋ）のアミノ酸置換からなる群から選択される。
【0010】
１つの具体的な実施形態において、上記ＩＬ－１５突然変異体は、（１）Ａｓｐ８Ｓｅｒ、（２）Ａｓｐ８Ｇｌｙ、（３）Ｈｉｓ１０５Ｌｙｓ、（４）Ａｓｐ８Ｇｌｕ及びＶａｌ３Ｌｅｕ、（５）Ｖａｌ３Ｌｅｕ及びＩｌｅ６Ａｓｐ、又は、（６）Ａｓｐ８Ｓｅｒ及びＨｉｓ１０５Ｌｙｓの突然変異又は突然変異の組み合わせを含む。
【0011】
１つの具体的な実施形態において、上記ＩＬ－１５突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７に示され、上記野生型ＩＬ－１５のアミノ酸配列は、配列番号１に示される。
別の実施形態において、上記ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質における各ドメインの連結順序は、Ｎ末端からＣ末端へ：
（１）免疫グロブリン分子又はその一部、ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５突然変異体、（２）免疫グロブリン分子又はその一部、ＩＬ－１５突然変異体、ＩＬ－１５Ｒα、（３）ＩＬ－１５突然変異体、ＩＬ－１５Ｒα、免疫グロブリン分子又はその一部、（４）ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５突然変異体、免疫グロブリン分子又はその一部、（５）ＩＬ－１５突然変異体、免疫グロブリン分子又はその一部、（６）免疫グロブリン分子又はその一部、ＩＬ－１５Ｒα、（７）ＩＬ－１５Ｒα、免疫グロブリン分子又はその一部、（８）ＩＬ－１５突然変異体、ＩＬ－１５Ｒα、又は、（９）ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５突然変異体であり、
好ましくは、ＩＬ－１５Ｒα又はＩＬ－１５突然変異体は、免疫グロブリン分子と融合される場合、免疫グロブリン分子の重鎖可変領域のＮ末端又は免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に融合され、ＩＬ－１５Ｒα又はＩＬ－１５突然変異体は、免疫グロブリンＦｃ領域と融合される場合、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端に融合される。
別の実施形態において、上記ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質における各ドメインの連結順序は、Ｎ末端からＣ末端へ：
（１）免疫グロブリン分子又はその一部、ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５突然変異体、（２）免疫グロブリン分子又はその一部、ＩＬ－１５突然変異体、ＩＬ－１５Ｒα、（３）ＩＬ－１５突然変異体、ＩＬ－１５Ｒα、免疫グロブリン分子又はその一部、（４）ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５突然変異体、免疫グロブリン分子又はその一部、（５）ＩＬ－１５突然変異体、免疫グロブリン分子又はその一部、（６）免疫グロブリン分子又はその一部、ＩＬ－１５Ｒα、（７）ＩＬ－１５Ｒα、免疫グロブリン分子又はその一部、（８）ＩＬ－１５突然変異体、ＩＬ－１５Ｒα、又は、（９）ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５突然変異体であり、
好ましくは、ＩＬ－１５Ｒα又はＩＬ－１５突然変異体は、免疫グロブリン分子と融合される場合、免疫グロブリン分子の重鎖可変領域のＮ末端又は免疫グロブリンＦｃ領域のＣ末端に融合され、ＩＬ－１５Ｒα又はＩＬ－１５突然変異体は、免疫グロブリンＦｃ領域と融合される場合、免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端に融合される。
【0012】
別の実施形態において、上記ＩＬ－１５突然変異体は、リンカーペプチドを介して又は介さずに、免疫グロブリン分子又はその一部と融合され、或いはＩＬ－１５突然変異体は、リンカーペプチドを介して又は介さずにＩＬ－１５Ｒαと融合され、好ましくは、リンカーペプチドを使用し、好ましくは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５又は配列番号１６に示されるリンカーペプチドを使用し、
好ましくは、ＩＬ－１５突然変異体は、リンカーペプチドを介して又は介さずにＩＬ－１５Ｒαと融合され、さらに免疫グロブリン分子又はその一部と融合され、好ましくは、リンカーペプチドを使用し、好ましくは、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１６に示されるリンカーペプチドを使用する。
好ましくは、ＩＬ－１５突然変異体は、リンカーペプチドを介して又は介さずにＩＬ－１５Ｒαと融合され、さらに免疫グロブリン分子又はその一部と融合され、好ましくは、リンカーペプチドを使用し、好ましくは、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１６に示されるリンカーペプチドを使用する。
【0013】
１つの具体的な実施形態において、上記免疫グロブリン分子は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片であり、上記免疫グロブリン分子の一部は、免疫グロブリンＦｃ領域であり、
好ましくは、上記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片は、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、ＫＮ－０３５又は７９４－ｈ１－７１から選択され、
好ましくは、上記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖は、配列番号１９又は配列番号２０に示される配列を有し、上記軽鎖は、配列番号２１に示される配列を有し、
好ましくは、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤのいずれか１つのＦｃ領域から選択され、好ましくは、ヒト又はマウス抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常領域の配列を含み、好ましくは、上記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列は、配列番号１２に示される。
好ましくは、上記抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片は、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ、ＫＮ－０３５又は７９４－ｈ１－７１から選択され、
好ましくは、上記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖は、配列番号１９又は配列番号２０に示される配列を有し、上記軽鎖は、配列番号２１に示される配列を有し、
好ましくは、上記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ又はＩｇＤのいずれか１つのＦｃ領域から選択され、好ましくは、ヒト又はマウス抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４の定常領域の配列を含み、好ましくは、上記免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ酸配列は、配列番号１２に示される。
【0014】
１つの具体的な実施形態において、上記ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質は、
（１）上記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖を含み、それぞれ配列番号２２、２３、２４、２５又は２６に示される配列を有する単量体１、配列番号２１に示される配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖、
（２）上記（１）に示される配列と少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。
（１）上記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖を含み、それぞれ配列番号２２、２３、２４、２５又は２６に示される配列を有する単量体１、配列番号２１に示される配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖、
（２）上記（１）に示される配列と少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するアミノ酸配列、を含む。
【0015】
別の実施形態において、上記ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは２５ｍｇ／ｍＬ～９５ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ又は２５ｍｇ／ｍＬである。
【0016】
別の実施形態において、上記緩衝液は、酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液、クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液から選択され、好ましくは、酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液又はヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液である。
【0017】
１つの具体的な実施形態において、上記緩衝液の濃度は、１０ｍＭ～１００ｍＭであり、好ましくは１５ｍＭ～３０ｍＭであり、より好ましくは２０ｍＭである。
【0018】
別の実施形態において、上記タンパク質安定剤は、塩化ナトリウム、グリシン、塩酸アルギニン、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトールから選択され、好ましくはスクロース及びトレハロースである。
【0019】
１つの具体的な実施形態において、上記タンパク質安定剤の濃度は、１％～１０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは２％（ｗ／ｖ）、４．５％（ｗ／ｖ）又は８％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは８％（ｗ／ｖ）である。
【0020】
別の実施形態において、上記界面活性剤は、ポリソルベート、ポロキサマー、グリセリン脂肪酸エステルから選択され、好ましくはポリソルベート８０又はポロキサマー１８８である。
【0021】
１つの具体的な実施形態において、上記界面活性剤の濃度は、０．０１％～０．１％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）又は０．０８％（ｗ／ｖ）である。
【0022】
別の実施形態において、上記医薬組成物のｐＨは、約４．５～７．５であり、好ましくは４．５～６．５であり、より好ましくは４．５、５、６である。
【0023】
第２の態様において、本開示は、
ａ）濃度が１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬであるＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、ｂ）濃度が１０ｍＭ～１００ｍＭで、ｐＨが４．５～７．５であるヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液、ｃ）濃度が１％～１０％（ｗ／ｖ）であるトレハロース、及びｄ）濃度が０．０１％～０．１％（ｗ／ｖ）であるポロキサマー、を含む医薬組成物であって、
好ましくは、上記医薬組成物は、ａ）濃度が２５ｍｇ／ｍＬ～９５ｍｇ／ｍＬであるＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、ｂ）濃度が１５ｍＭ～３０ｍＭで、ｐＨが５．５～６．５であるヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液、ｃ）濃度が２％～８％（ｗ／ｖ）であるトレハロース、及びｄ）濃度が０．０４％（ｗ／ｖ）であるポロキサマー１８８、を含み、
好ましくは、上記医薬組成物は、液体形態又は凍結乾燥粉末製剤である、医薬組成物を提供する。
ａ）濃度が１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬであるＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、ｂ）濃度が１０ｍＭ～１００ｍＭで、ｐＨが４．５～７．５であるヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液、ｃ）濃度が１％～１０％（ｗ／ｖ）であるトレハロース、及びｄ）濃度が０．０１％～０．１％（ｗ／ｖ）であるポロキサマー、を含む医薬組成物であって、
好ましくは、上記医薬組成物は、ａ）濃度が２５ｍｇ／ｍＬ～９５ｍｇ／ｍＬであるＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、ｂ）濃度が１５ｍＭ～３０ｍＭで、ｐＨが５．５～６．５であるヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液、ｃ）濃度が２％～８％（ｗ／ｖ）であるトレハロース、及びｄ）濃度が０．０４％（ｗ／ｖ）であるポロキサマー１８８、を含み、
好ましくは、上記医薬組成物は、液体形態又は凍結乾燥粉末製剤である、医薬組成物を提供する。
【0024】
第３の態様において、本開示は、医薬組成物を製造する方法であって、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質溶液を緩衝液により置換するステップを含む、方法を提供し、上記緩衝液は、好ましくはヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液であり、上記緩衝液の濃度は、好ましくは２０ｍＭであり、上記緩衝液のｐＨは、好ましくは６であり、
好ましくは、製造方法は、凍結乾燥のステップをさらに含み、
より好ましくは、凍結乾燥ステップは、以下を含む：（１）真空凍結乾燥機の乾燥箱を－４５℃に降温して３時間～５時間保持し、（２）乾燥箱の温度を－５℃に昇温して３時間～５時間保持し、（３）乾燥箱の温度を－４５℃に降温して３時間～５時間保持し、ステップ（１）～（３）の予備凍結の過程において、昇温降温速度を０．５℃～１℃／ｍｉｎに保持し、（４）一次乾燥真空度を０．１ｍＢａｒとし、温度を－３０℃～－２０℃に保持し、このステップの合計時間が３０時間を超える必要があり、（５）一次乾燥後、０．１℃～０．３℃／ｍｉｎの昇温速度で２５℃に昇温して解析乾燥を開始し、真空度を０．１ｍＢａｒに１時間～２時間保持し、その後、到達真空になり、温度を不変に保持し、保持時間が１５時間を超える。
好ましくは、製造方法は、凍結乾燥のステップをさらに含み、
より好ましくは、凍結乾燥ステップは、以下を含む：（１）真空凍結乾燥機の乾燥箱を－４５℃に降温して３時間～５時間保持し、（２）乾燥箱の温度を－５℃に昇温して３時間～５時間保持し、（３）乾燥箱の温度を－４５℃に降温して３時間～５時間保持し、ステップ（１）～（３）の予備凍結の過程において、昇温降温速度を０．５℃～１℃／ｍｉｎに保持し、（４）一次乾燥真空度を０．１ｍＢａｒとし、温度を－３０℃～－２０℃に保持し、このステップの合計時間が３０時間を超える必要があり、（５）一次乾燥後、０．１℃～０．３℃／ｍｉｎの昇温速度で２５℃に昇温して解析乾燥を開始し、真空度を０．１ｍＢａｒに１時間～２時間保持し、その後、到達真空になり、温度を不変に保持し、保持時間が１５時間を超える。
【0025】
第４の態様において、本開示は、第３の態様に記載の方法によって製造される、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【0026】
第５の態様において、本開示は、第１～第２の態様に記載の医薬組成物を凍結乾燥することによって得られる、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質を含む凍結乾燥製剤を提供する。
【0027】
第６の態様において、本開示は、第５の態様に記載の凍結乾燥製剤を再溶解することによって製造される、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質を含む再溶解溶液を提供する。
【0028】
第７の態様において、本開示は、個体における疾患を予防及び／又は治療する薬物の製造における、上記第１～第２の態様に記載の医薬組成物、第３の態様に記載の方法によって製造される製品、第４の態様に記載の医薬組成物、第５の態様に記載の凍結乾燥製剤、又は第６の態様に記載の再溶解溶液の用途を提供し、上記疾患は、好ましくは腫瘍又は炎症性疾患であり、好ましくは、上記腫瘍は、膠芽腫、前立腺癌、血液癌、Ｂ細胞腫瘍、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃癌と食道癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌及び扁平上皮頭頸部癌から選択される。
【0029】
第８の態様において、本開示は、個体における疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それを必要とする患者に、上記第１～第２の態様に記載の医薬組成物、第３の態様に記載の方法によって製造される製品、第４の態様に記載の医薬組成物、第５の態様に記載の凍結乾燥製剤、又は第６の態様に記載の再溶解溶液を投与することを含む方法を提供し、上記疾患は、好ましくは腫瘍又は炎症性疾患であり、好ましくは、上記腫瘍は、膠芽腫、前立腺癌、血液癌、Ｂ細胞腫瘍、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃癌と食道癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌及び扁平上皮頭頸部癌から選択される。
【0030】
用語の定義及び説明
特に明記しない限り、本明細書に使用される用語は、当業者に通常理解されている意味を有する。本明細書で明確に定義された用語について、その用語の意味は、記載されている定義に準拠するものとする。
特に明記しない限り、本明細書に使用される用語は、当業者に通常理解されている意味を有する。本明細書で明確に定義された用語について、その用語の意味は、記載されている定義に準拠するものとする。
【0031】
本明細書に使用されるように、「抗体」（Ａｂ）という用語は、抗体のポリクローナル、モノクローナル、遺伝子操作及び他の修飾形態（キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異性抗体及び四重特異性抗体、二重抗体、三重抗体及び四重抗体）、抗体複合体を含むが、これらに限定されない）、並びに抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びｓｃＦｖ断片を含む）を含む、標的抗原に特異的に結合するか又は免疫反応性を有する免疫グロブリン分子を指す。また、特に明記しない限り、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、標的タンパク質に特異的に結合することができる完全な抗体分子、及び不完全な抗体断片（例えば、ＦａｂやＦ（ａｂ’）２断片で、完全抗体のＦｃ断片を欠き（動物サイクルからより迅速に除去される）、従って、Ｆｃ媒介性エフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を欠く（Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２４：３１６、１９８３を参照、その内容は参照により本明細書に組み込まれる））を含むことを意味する。
【0032】
本明細書に使用されるように、「ＩＬ－１５」又は「ＩＬ１５」、インターロイキン１５（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５、ＩＬ－１５）という用語は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞を活性化すると共に、これらの細胞の増殖及び生存を媒介できる機能を有する、多機能性サイトカインである。さらに、ＩＬ－１５は、ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞を活性化、維持、及び増幅させることができる。本発明に記載の「ＩＬ－１５」又は「ＩＬ－１５ペプチドセグメント」又は「ＩＬ－１５ポリペプチド」は、任意のＩＬ－１５（インターロイキン１５）又はその突然変異体、例えばヒトＩＬ－１５又は非ヒト哺乳動物ＩＬ－１５又は非哺乳動物ＩＬ－１５であってもよい。例示的な非ヒト哺乳動物は、例えばブタ、ウサギ、サル、オランウータン、マウスなどであり、非哺乳動物は、例えばニワトリなどである。ヒトのインターロイキン１５成熟分子が好ましく、データベースＵｎｉＰｒｏｔＫＢ、アクセッション番号Ｐ４０９３３、４９－１６２ａａを参照されたい。
【0033】
本明細書に使用されるように、「ＩＬ－１５野生型」又は「野生型ＩＬ－１５」という用語は、天然由来のヒトＩＬ－１５又は非ヒト哺乳動物ＩＬ－１５又は非哺乳動物ＩＬ－１５を指し、当該技術分野において既に一般に使用されているＩＬ－１５ポリペプチドを指すこともでき、野生型は、ＷＴ又はｗｔと表すこともでき、好ましくは、「ＩＬ－１５野生型」又は「野生型ＩＬ－１５」のアミノ酸配列は（配列番号１）ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳである。
【0034】
本明細書に使用されるように、「ＩＬ－１５突然変異体」という用語は、１つ又は複数のアミノ酸の置換、増加又は欠失突然変異によって得られる、ＩＬ－１５とその受容体との間の親和性を向上又は減少させるか、或いは特定の細胞株、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の増殖活性、サイトカイン放出の活性の増加又は減少を刺激する突然変異体分子を指し、
【0035】
本開示において、好ましい実施例の１つにおいて、「ＩＬ－１５突然変異体」は、それぞれ以下に示されるアミノ酸配列を有する：
ＩＬ－１５突然変異体＃１（Ｄ８Ｓ）アミノ酸配列（配列番号２）：
ＮＷＶＮＶＩＳＳＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
ＩＬ－１５突然変異体＃２（Ｈ１０５Ｋ）アミノ酸配列（配列番号３）：
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＫＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
ＩＬ－１５突然変異体＃３（Ｄ８Ｇ）アミノ酸配列（配列番号４）：
ＮＷＶＮＶＩＳＧＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
ＩＬ－１５突然変異体＃６（Ｄ８Ｓ／Ｈ１０５Ｋ）アミノ酸配列（配列番号５）：
ＮＷＶＮＶＩＳＳＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＫＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
ＩＬ－１５突然変異体＃７（Ｄ８Ｅ／Ｖ３Ｌ）アミノ酸配列（配列番号６）：
ＮＷＬＮＶＩＳＥＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
ＩＬ－１５突然変異体＃８（Ｖ３Ｌ／Ｉ６Ｄ）アミノ酸配列（配列番号７）：
ＮＷＬＮＶＤＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ。
ＩＬ－１５突然変異体＃１（Ｄ８Ｓ）アミノ酸配列（配列番号２）：
ＮＷＶＮＶＩＳＳＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
ＩＬ－１５突然変異体＃２（Ｈ１０５Ｋ）アミノ酸配列（配列番号３）：
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＫＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
ＩＬ－１５突然変異体＃３（Ｄ８Ｇ）アミノ酸配列（配列番号４）：
ＮＷＶＮＶＩＳＧＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
ＩＬ－１５突然変異体＃６（Ｄ８Ｓ／Ｈ１０５Ｋ）アミノ酸配列（配列番号５）：
ＮＷＶＮＶＩＳＳＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＫＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
ＩＬ－１５突然変異体＃７（Ｄ８Ｅ／Ｖ３Ｌ）アミノ酸配列（配列番号６）：
ＮＷＬＮＶＩＳＥＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
ＩＬ－１５突然変異体＃８（Ｖ３Ｌ／Ｉ６Ｄ）アミノ酸配列（配列番号７）：
ＮＷＬＮＶＤＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ。
【0036】
本明細書に使用されるように、「ＩＬ－１５Ｒα」という用語は、任意の種のＩＬ－１５Ｒα又はその機能的断片、例えばヒトＩＬ－１５Ｒα又は非ヒト哺乳動物ＩＬ－１５Ｒα又は非哺乳動物ＩＬ－１５Ｒαであってもよい。例示的な非ヒト哺乳動物は、例えばブタ、ウサギ、サル、オランウータン、マウスなどであり、非哺乳動物は、例えばニワトリなどである。ヒトのＩＬ－１５Ｒαが好ましく、ＩＬ－１５Ｒα ＥＣＤと略称されるヒトのインターロイキン１５受容体α細胞外ドメイン断片が好ましい。
【0037】
本発明において、「ＩＬ－１５Ｒα変異体」という用語は、ＩＬ－１５Ｒα上に１つ又は複数のアミノ酸の欠失、挿入又は置換突然変異によって形成される、そのリガンド分子、例えばＩＬ１５に結合する能力を有する機能的突然変異体を指し、好ましくはヒトのＩＬ１５Ｒα分子、より好ましくはヒトのＩＬ－１５Ｒα細胞外ドメイン断片の短縮形態、即ち、細胞外ドメイン断片のＣ末端から１つ又は複数のアミノ酸の欠失突然変異によって得られるヒトインターロイキン１５受容体α活性を有する分子、好ましくは６５～１２０個のアミノ酸を保持する欠失突然変異形態、より好ましくは６５～１０２個のアミノ酸を保持する欠失突然変異短縮形態、例えばＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉ、好ましくはＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉであり、そのアミノ酸配列はそれぞれ以下の通りである。
ＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉ－１（配列番号８）：
ＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ。
ＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉ－２（配列番号９）：
ＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ。
ＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉ－３（配列番号１０）：
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ。
ＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉ－４（配列番号１１）：
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ。
ＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉ－１（配列番号８）：
ＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ。
ＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉ－２（配列番号９）：
ＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ。
ＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉ－３（配列番号１０）：
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰ。
ＩＬ－１５Ｒα－ｓｕｓｈｉ－４（配列番号１１）：
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ。
【0038】
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」という用語は、免疫グロブリンの鎖の定常領域、特に抗原結合活性を有さず、抗体分子がエフェクター分子及び細胞と相互作用する部位である免疫グロブリンの重鎖定常領域のカルボキシ末端又はその一部を指す。本発明に記載の「免疫グロブリンＦｃ領域」は、ヒト又は非ヒト哺乳動物由来の任意のＦｃ又はその変異体であってもよい。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４の２つ又はそれ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組み合わせを含んでもよい。Ｆｃは、異なる種、好ましくはヒトの免疫グロブリンに由来することができる。重鎖定常領域のアミノ酸配列によって、免疫グロブリンは異なる種類に分けることができ、主にＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭという５種類の免疫グロブリンがある。そのうちのいくつかは、さらに、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ－１、ＩｇＧ－２、ＩｇＧ－３、ＩｇＧ－４、ＩｇＡ－１及びＩｇＡ－２に分けることができる。「Ｆｃ領域」は、好ましくは、少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域、並びにＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。より好ましくは、ＩｇＧ１の１つのＣＨ２ドメイン、１つのＣＨ３ドメイン及び１つの免疫グロブリンヒンジ領域を含み、ヒンジ領域の開始アミノ酸位置が変動できる。
【0039】
本開示において、好ましい実施例の１つにおいて、「免疫グロブリンＦｃ領域」は、以下に示されるアミノ酸配列を有する：
配列番号１２：
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
配列番号１２：
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ。
【0040】
本明細書に使用されるように、「ペプチドリンカー／リンカーペプチド（Ｌｉｎｋｅｒ）」という用語は、本発明において、ＩＬ－１５を別のタンパク質分子又はタンパク質断片と連結して、タンパク質の正確なフォールディング及び安定性を保証するために使用されるペプチドを指す。上記別の分子は、ＩＬ－１５Ｒα、Ｆｃ、Ｆｃ変異体、抗体などを含むが、これらに限定されない。本発明の「リンカーペプチド」は、好ましくは（ＧＧＧＧＳ）ｎであり、ここで、ｎは０、１、２、３、４、５又はそれ以上であってもよく、好ましくはｎは２～４であり、又は好ましくはＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱである。リンカーペプチド配列が短すぎる場合、両タンパク質の高次構造のフォールディングに影響を与え、それによって相互に干渉する可能性があり、リンカーペプチド配列が長すぎる場合、リンカーペプチド配列自体が新しい抗原であるため、免疫原性の問題も伴い、
【0041】
本開示において、好ましい実施例の１つにおいて、「ペプチドリンカー／リンカーペプチド（Ｌｉｎｋｅｒ）」は、それぞれ以下に示されるアミノ酸配列を有する：
配列番号１３：ＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱ、
配列番号１４：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、
配列番号１５：ＥＦ、
配列番号１６：ＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱ。
配列番号１３：ＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱ、
配列番号１４：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、
配列番号１５：ＥＦ、
配列番号１６：ＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＬＱ。
【0042】
本開示において、好ましい実施例において、好ましい抗体重鎖及び抗体軽鎖は、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体に由来し、より好ましくは、ヒト化の抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体に由来し、本明細書に使用されるように、「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、プログラム死リガンド－１を指し、ＣＤ２７９（分化クラスター２７９）とも呼ばれ、重要な免疫抑制分子であり、上記ＰＤ－Ｌ１は、好ましくはヒトＰＤ－Ｌ１であり、
本開示において、好ましい実施例の１つにおいて、「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」は、それぞれ以下に示されるアミノ酸配列を有する：
ＰＤ－Ｌ１－１重鎖 配列番号１７：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ、
ＰＤ－Ｌ１－１軽鎖 配列番号１８：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ、
ＰＤ－Ｌ１－２－１重鎖 配列番号１９：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ、
ＰＤ－Ｌ１－２－２重鎖 配列番号２０：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ、
ＰＤ－Ｌ１－２－１又はＰＤ－Ｌ１－２－２の軽鎖 配列番号２１：
ＥＩＶＭＴＱＳＰＰＴＬＳＬＳＰＧＥＲＶＴＬＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＹＧＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
本開示において、好ましい実施例の１つにおいて、「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」は、それぞれ以下に示されるアミノ酸配列を有する：
ＰＤ－Ｌ１－１重鎖 配列番号１７：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＤＳＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＷＩＳＰＹＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＨＷＰＧＧＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ、
ＰＤ－Ｌ１－１軽鎖 配列番号１８：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＬＹＨＰＡＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ、
ＰＤ－Ｌ１－２－１重鎖 配列番号１９：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ、
ＰＤ－Ｌ１－２－２重鎖 配列番号２０：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ、
ＰＤ－Ｌ１－２－１又はＰＤ－Ｌ１－２－２の軽鎖 配列番号２１：
ＥＩＶＭＴＱＳＰＰＴＬＳＬＳＰＧＥＲＶＴＬＳＣＫＳＳＱＳＬＬＹＳＳＮＱＫＮＳＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＹＧＹＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ。
【0043】
本明細書に使用されるように、「融合タンパク質」（ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）という用語は、遺伝子組換え方法、化学的方法又は他の適切な方法によって２つ又は複数の遺伝子のコード領域を連結し、同じ調節配列の制御下で遺伝子組換えを発現させることによって得られるタンパク質産物を指す。本発明の融合タンパク質において、２つ又は複数の遺伝子のコード領域同士は、ペプチドリンカー又はリンカーペプチドをコードする配列によって、１つ又は複数の位置で融合され得る。ペプチドリンカー又はリンカーペプチドも、本発明の融合タンパク質を構築するために使用することができる。本発明の「融合タンパク質」という用語は、抗体／Ｆｃ融合タンパク質構築物／複合体、又は非共有結合的手段によって形成された抗体／Ｆｃ融合タンパク質構築物／複合体の組成物をさらに含み、例えば、本発明に記載の融合タンパク質は、以下の構造と示すことができる：
（１）２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、例えば、抗体重鎖ＦｃをＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉに融合し、且つＩＬ－１５がＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉと非共有結合を形成するように、抗体軽鎖及びＩＬ－１５－ＷＴ（野生型）又はＩＬ－１５突然変異体と共発現させる、ＩＬ－１５融合タンパク質、
（２）２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、例えば、ｌｉｎｋｅｒを介して抗体重鎖ＦｃをＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ及びＩＬ－１５－ＷＴ又はＩＬ－１５突然変異体の３つの部分と直列に融合して発現させ、且つ抗体軽鎖と共発現させる、ＩＬ－１５融合タンパク質、
（３）２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、Ｆｃ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、例えば、ＩＬ－１５－ＷＴ又はＩＬ－１５突然変異体は、ｌｉｎｋｅｒを介してＩＬ１５－Ｒα ｓｕｓｈｉに連結され、ＩＬ１５－Ｒα ｓｕｓｈｉは、さらにｌｉｎｋｅｒを介してＦｃに連結される、ＩＬ－１５融合タンパク質、又は、
（４）２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、Ｆｃ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、例えば、ＩＬ１５－Ｒα ｓｕｓｈｉは、ｌｉｎｋｅｒを介してＩＬ－１５－ＷＴ又はＩＬ－１５突然変異体に連結され、ＩＬ－１５は、さらにｌｉｎｋｅｒを介してＦｃに連結される、ＩＬ－１５融合タンパク質。
（１）２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、例えば、抗体重鎖ＦｃをＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉに融合し、且つＩＬ－１５がＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉと非共有結合を形成するように、抗体軽鎖及びＩＬ－１５－ＷＴ（野生型）又はＩＬ－１５突然変異体と共発現させる、ＩＬ－１５融合タンパク質、
（２）２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、例えば、ｌｉｎｋｅｒを介して抗体重鎖ＦｃをＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ及びＩＬ－１５－ＷＴ又はＩＬ－１５突然変異体の３つの部分と直列に融合して発現させ、且つ抗体軽鎖と共発現させる、ＩＬ－１５融合タンパク質、
（３）２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、Ｆｃ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、例えば、ＩＬ－１５－ＷＴ又はＩＬ－１５突然変異体は、ｌｉｎｋｅｒを介してＩＬ１５－Ｒα ｓｕｓｈｉに連結され、ＩＬ１５－Ｒα ｓｕｓｈｉは、さらにｌｉｎｋｅｒを介してＦｃに連結される、ＩＬ－１５融合タンパク質、又は、
（４）２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、Ｆｃ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、例えば、ＩＬ１５－Ｒα ｓｕｓｈｉは、ｌｉｎｋｅｒを介してＩＬ－１５－ＷＴ又はＩＬ－１５突然変異体に連結され、ＩＬ－１５は、さらにｌｉｎｋｅｒを介してＦｃに連結される、ＩＬ－１５融合タンパク質。
【0044】
本開示において、「単量体１」という用語は、遺伝子組換え方法、化学的方法又は他の適切な方法によって、以下に示される複数の遺伝子のコード領域を連結し、同じ調節配列の制御下で遺伝子組換えを発現させることによって得られるタンパク質産物を指す：（１）ＰＤ－Ｌ１抗体重鎖、（２）重鎖ＦｃとＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉとを連結するＬｉｎｋｅｒ、（３）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ、（４）ＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉとＩＬ－１５（ＷＴ又は突然変異体）とを連結するＬｉｎｋｅｒ、（４）ＩＬ－１５（ＷＴ又は突然変異体）。
【0045】
本開示において、好ましい実施例の１つにおいて、「ＩＬ－１５融合タンパク質」は、それぞれ以下に示されるアミノ酸配列を有する：
＃６－１－１、単量体１：配列番号２２：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＳＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＶＮＶＩＳＳＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＫＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
＃６－１－１、軽鎖：配列番号２１、
＃６－１－２、単量体１、配列番号２３：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＳＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＶＮＶＩＳＳＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＫＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
＃６－１－２、軽鎖：配列番号２１、
＃７－１、単量体１、配列番号２４：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＳＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＬＮＶＩＳＥＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
＃７－１、軽鎖：配列番号２１、
＃８－１、単量体１、配列番号２５：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＳＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＬＮＶＤＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
＃８－１、軽鎖：配列番号２１、
＃９－１、単量体１、配列番号２６：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＳＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
＃９－１、軽鎖：配列番号２１。
＃６－１－１、単量体１：配列番号２２：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＳＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＶＮＶＩＳＳＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＫＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
＃６－１－１、軽鎖：配列番号２１、
＃６－１－２、単量体１、配列番号２３：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＳＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＶＮＶＩＳＳＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＫＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
＃６－１－２、軽鎖：配列番号２１、
＃７－１、単量体１、配列番号２４：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＳＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＬＮＶＩＳＥＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
＃７－１、軽鎖：配列番号２１、
＃８－１、単量体１、配列番号２５：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＳＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＬＮＶＤＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
＃８－１、軽鎖：配列番号２１、
＃９－１、単量体１、配列番号２６：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＡＶＳＧＤＳＩＴＳＧＹＷＮＷＩＲＫＦＰＳＲＧＬＥＹＭＧＹＩＳＹＳＧＳＴＹＹＮＰＦＬＫＳＲＩＳＩＮＲＤＴＳＫＮＱＹＹＬＱＬＮＳＶＴＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＭＧＤＷＬＡＷＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＳＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲＤＰＡＬＶＨＱＲＰＡＰＰＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＱＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ、
＃９－１、軽鎖：配列番号２１。
【0046】
本明細書に使用されるように、「パーセント（％）配列同一性」という用語は、最大パーセント配列同一性を達成するために配列をアラインメントし、（必要に応じて）ギャップを導入した（例えば、最適なアラインメントのために、候補配列と参照配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、且つ比較の目的のために、非相同配列を無視することができる）後、候補配列のアミノ酸（又はヌクレオチド）残基が、参照配列のアミノ酸（又はヌクレオチド）残基と同一であるパーセントを指す。パーセント配列同一性を決定するという目的のために、当業者に周知の種々の方法でアラインメントを実現させることができ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＩｉ）ソフトウェアなどの公衆に取得可能なコンピュータソフトウェアを使用する。当業者は、比較される配列の全長範囲内に最大アラインメントを実現する必要がある任意のアルゴリズムを含み、測定アラインメントに用いられる適当なパラメータを決定することができる。例えば、候補配列との比較のためにアラインメントされた参照配列は、候補配列が候補配列の全長又は候補配列の連続的なアミノ酸（又はヌクレオチド）残基の選択された部分で５０％～１００％の配列同一性を呈することを示すことができる。比較の目的でアラインメントされた候補配列の長さは、例えば、参照配列の長さの少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は１００％）であってもよい。候補配列中の位置が、参照配列中の対応する位置と同じアミノ酸（又はヌクレオチド）残基によって占められている場合、これらの分子は、その位置において同一である。
【0047】
本明細書に使用されるように、「医薬組成物」は、１種又は複数種の本明細書に記載の化合物又はその生理学的／薬学的に許容される塩若しくはプロドラッグ及び他の化学成分を含む混合物を意味し、上記他の成分は例えば、生理学的／薬学的に許容される担体及び賦形剤である。医薬組成物は、抗体の活性成分の安定性を保持し、生体への投与を促進し、活性成分の吸収に寄与してさらに生物活性を発揮することを目的とする。本明細書において、「医薬組成物」と「製剤」は、相互に排他的ではない。
【0048】
本明細書に使用されるように、「凍結乾燥製剤」は、液体若しくは溶液の形態の医薬組成物、又は液体若しくは溶液製剤に対して真空凍結乾燥ステップを行った後に得られる製剤又は医薬組成物を意味する。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1】ＩＬ－１５融合タンパク質の構造の模式図である。
【図2】安定性試験においてサンプルを４０℃に置いて考察されるＳＥ－ＨＰＬＣ結果のまとめの傾向図である。
【図3】安定性試験においてサンプルを４０℃に置いて考察されるＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）結果のまとめの傾向図である。
【図4】安定性試験においてサンプルを４０℃に置いて考察されるＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）結果のまとめの傾向図である。
【図5】安定性試験においてサンプルを４０℃に置いて考察されるｉＣＩＥＦ結果のまとめの傾向図である。
【図6】混合リンパ球反応（ＭＬＲ）による、Ｔ細胞増殖及びＩＦＮ－γ分泌に対する試験薬物の影響の検出である。
【図7】Ａはヒト骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）増殖のＦＡＣＳ図であり、ＢはＦＡＣＳによるヒト骨髄系由来抑制細胞増殖に対する試験薬物の影響の検出であり、ＣはＭＤＳＣ細胞の絶対細胞計数結果を示す図である。
【図8】ＡはＮＰＧマウスの腫瘍増殖曲線であり、ＢはＴｅｃｅｎｔｒｉｑ群と＃６－１群との１匹のマウスの増殖曲線の比較であり、ＣはａＨｅｌ－ＩＬ１５群と＃６－１群との１匹のマウスの増殖曲線の比較である。
【図9】ＮＰＧマウスの体重成長曲線である。
【図10】ＥｌｉｓａによりＮＰＧマウス腫瘍の内部血中薬物濃度を検出する結果である。
【図11】ＦＡＣＳにより腫瘍組織の細胞に対する試験薬物の結合を検出する結果である。
【発明を実施するための形態】
【0050】
以下、具体的な実施例を参照しながら本発明をさらに説明するが、本発明の利点及び特徴は説明と共により明らかになるであろう。実施例において具体的な条件が明記されていないものは、一般的な条件又はメーカーが推奨する条件に従う。使用される試薬又は機器において生産メーカーが明記されていないものは、何れも市場で入手できる一般的な製品である。
【0051】
本発明の実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、本発明の技術案の詳細と形態を修正又は置換することができるが、これらの修正及び置換はすべて本発明の保護範囲内にあることを当業者は理解すべきである。
【0052】
以下の実施例を通じて本発明をより詳細に説明するが、本発明の請求範囲はこれらに限定されない。
【実施例】
【0053】
実施例１ ＩＬ－１５融合タンパク質の設計及び発現・精製
１．１ ＩＬ－１５融合タンパク質（抗体融合構築物）の構造設計（ｆｏｒｍａｔ）には、４つのフォーマットがある：
ｆｏｒｍａｔ１：図１のＡに示される構造のように、２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、抗体重鎖Ｆｃ末端をＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉに融合し、且つＩＬ－１５がＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉと非共有結合を形成するように、モノクローナル抗体軽鎖及びＩＬ－１５－ＷＴ（野生型）又はＩＬ－１５突然変異体と共発現させる、ＩＬ－１５融合タンパク質、
ｆｏｒｍａｔ２：図１のＢに示される構造のように、２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、ｌｉｎｋｅｒを介して抗体重鎖Ｆｃ末端をＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ及びＩＬ－１５－ＷＴ又はＩＬ－１５突然変異体の３つの部分と順次に直列に融合して発現させ、且つ抗体軽鎖と共発現させる、ＩＬ－１５融合タンパク質、
ｆｏｒｍａｔ３：図１のＣに示される構造のように、２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、Ｆｃ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、ＩＬ－１５－ＷＴ又はＩＬ－１５突然変異体は、ｌｉｎｋｅｒを介してＩＬ１５－Ｒα ｓｕｓｈｉに連結され、ＩＬ１５－Ｒα ｓｕｓｈｉは、さらにｌｉｎｋｅｒを介してＦｃに連結される、ＩＬ－１５融合タンパク質、又は、
ｆｏｒｍａｔ４：図１のＤに示される構造のように、２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、Ｆｃ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、ＩＬ１５－Ｒα ｓｕｓｈｉは、ｌｉｎｋｅｒを介してＩＬ－１５－ＷＴ又はＩＬ－１５突然変異体に連結され、ＩＬ－１５は、さらにｌｉｎｋｅｒを介してＦｃに連結される、ＩＬ－１５融合タンパク質。
１．１ ＩＬ－１５融合タンパク質（抗体融合構築物）の構造設計（ｆｏｒｍａｔ）には、４つのフォーマットがある：
ｆｏｒｍａｔ１：図１のＡに示される構造のように、２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、抗体重鎖Ｆｃ末端をＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉに融合し、且つＩＬ－１５がＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉと非共有結合を形成するように、モノクローナル抗体軽鎖及びＩＬ－１５－ＷＴ（野生型）又はＩＬ－１５突然変異体と共発現させる、ＩＬ－１５融合タンパク質、
ｆｏｒｍａｔ２：図１のＢに示される構造のように、２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、抗体重鎖、抗体軽鎖、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、ｌｉｎｋｅｒを介して抗体重鎖Ｆｃ末端をＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉ及びＩＬ－１５－ＷＴ又はＩＬ－１５突然変異体の３つの部分と順次に直列に融合して発現させ、且つ抗体軽鎖と共発現させる、ＩＬ－１５融合タンパク質、
ｆｏｒｍａｔ３：図１のＣに示される構造のように、２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、Ｆｃ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、ＩＬ－１５－ＷＴ又はＩＬ－１５突然変異体は、ｌｉｎｋｅｒを介してＩＬ１５－Ｒα ｓｕｓｈｉに連結され、ＩＬ１５－Ｒα ｓｕｓｈｉは、さらにｌｉｎｋｅｒを介してＦｃに連結される、ＩＬ－１５融合タンパク質、又は、
ｆｏｒｍａｔ４：図１のＤに示される構造のように、２個の単量体を含むホモ二量体であるＩＬ－１５融合タンパク質であって、上記単量体が、Ｆｃ、ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉを含み、ＩＬ１５－Ｒα ｓｕｓｈｉは、ｌｉｎｋｅｒを介してＩＬ－１５－ＷＴ又はＩＬ－１５突然変異体に連結され、ＩＬ－１５は、さらにｌｉｎｋｅｒを介してＦｃに連結される、ＩＬ－１５融合タンパク質。
【0054】
様々なＩＬ－１５融合タンパク質設計は表１及び表２に詳しく示される。
【0055】
【表1】
【0056】
【表2】
【0057】
１．２ 融合タンパク質の発現
上記４つの構築フォーマットに従って、融合タンパク質をコードする核酸配列を、それぞれｐＴＴ５プラスミドに構築した。ＥｘｐｉＣＨＯ発現系を使用してタンパク質の一過性発現を行った。ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｔ ｎｏ．Ａ２９１０００１）で継代された宿主細胞ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（Ｃａｔ ｎｏ．Ａ２９１２７）を適切な密度に希釈し、シェーカー（１００ｒｐｍ、３７℃、８％のＣＯ２）に置いてトランスフェクションを待つことになった。融合タンパク質をコードする核酸配列を有するベクターを、ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ ＳＦＭ（Ｃａｔ ｎｏ．１２３０９０１９）培地に、ベクターの最終濃度が０．５μｇ／ｍＬ～１．０μｇ／ｍＬとなるように加えた。ＤＮＡを含むＯｐｔｉＰＲＯＴＭ ＳＦＭ培地に、適量のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ ｎｏ．Ａ２９１２９）を加えてＤＮＡ－ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔ複合体を形成し、室温で１ｍｉｎ～５ｍｉｎ静置した後、複合体をトランスフェクション対象の細胞懸濁液にゆっくりと滴下した。トランスフェクション後の１日目に、一定量のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｃａｔ ｎｏ．Ａ２９１２９）及びＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｆｅｅｄ（Ｃａｔ ｎｏ．Ａ２９１２９）を追加した後、３２℃に降温して培養した。トランスフェクション後の４日目～６日目に、一定量のＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｆｅｅｄ（Ｃａｔ ｎｏ．Ａ２９１２９）を追加した。トランスフェクション後の１０日目～１２日目に、５０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離して上清を得た。
上記４つの構築フォーマットに従って、融合タンパク質をコードする核酸配列を、それぞれｐＴＴ５プラスミドに構築した。ＥｘｐｉＣＨＯ発現系を使用してタンパク質の一過性発現を行った。ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｃａｔ ｎｏ．Ａ２９１０００１）で継代された宿主細胞ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（Ｃａｔ ｎｏ．Ａ２９１２７）を適切な密度に希釈し、シェーカー（１００ｒｐｍ、３７℃、８％のＣＯ２）に置いてトランスフェクションを待つことになった。融合タンパク質をコードする核酸配列を有するベクターを、ＯｐｔｉＰＲＯＴＭ ＳＦＭ（Ｃａｔ ｎｏ．１２３０９０１９）培地に、ベクターの最終濃度が０．５μｇ／ｍＬ～１．０μｇ／ｍＬとなるように加えた。ＤＮＡを含むＯｐｔｉＰＲＯＴＭ ＳＦＭ培地に、適量のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｃａｔ ｎｏ．Ａ２９１２９）を加えてＤＮＡ－ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔ複合体を形成し、室温で１ｍｉｎ～５ｍｉｎ静置した後、複合体をトランスフェクション対象の細胞懸濁液にゆっくりと滴下した。トランスフェクション後の１日目に、一定量のＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＣＨＯ Ｅｎｈａｎｃｅｒ（Ｃａｔ ｎｏ．Ａ２９１２９）及びＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｆｅｅｄ（Ｃａｔ ｎｏ．Ａ２９１２９）を追加した後、３２℃に降温して培養した。トランスフェクション後の４日目～６日目に、一定量のＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｆｅｅｄ（Ｃａｔ ｎｏ．Ａ２９１２９）を追加した。トランスフェクション後の１０日目～１２日目に、５０００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離して上清を得た。
【0058】
１．３ タンパク質の精製
磁気ビーズ法により突然変異体融合タンパク質を精製し、発酵上清に適量の磁気ビーズ懸濁液（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｃａｔ．ＮＯ．Ｌ００６９５）を加え、ＩＬ－１５融合タンパク質の磁気ビーズへの結合を保証するように回転ミキサー中で２ｈインキュベートし、上清を捨てた後に磁気ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、最後にｐＨ３．０のクエン酸塩を加えて溶出してＩＬ－１５融合タンパク質を得、サンプルを１ＭのＴｒｉｓ－Ｈｃｌで中和した後、タンパク質濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅにより測定した。タンパク質純度５０ｍｇ／ｍＬのＩＬ－１５融合タンパク質を、その後の製剤スクリーニング試験のために選択した。
磁気ビーズ法により突然変異体融合タンパク質を精製し、発酵上清に適量の磁気ビーズ懸濁液（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｃａｔ．ＮＯ．Ｌ００６９５）を加え、ＩＬ－１５融合タンパク質の磁気ビーズへの結合を保証するように回転ミキサー中で２ｈインキュベートし、上清を捨てた後に磁気ビーズをＰＢＳで３回洗浄し、最後にｐＨ３．０のクエン酸塩を加えて溶出してＩＬ－１５融合タンパク質を得、サンプルを１ＭのＴｒｉｓ－Ｈｃｌで中和した後、タンパク質濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅにより測定した。タンパク質純度５０ｍｇ／ｍＬのＩＬ－１５融合タンパク質を、その後の製剤スクリーニング試験のために選択した。
【0059】
実施例２ 緩衝系のスクリーニング
２．１ 緩衝系のスクリーニング計画
スクリーニング実験は、４つの緩衝塩（酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン塩及びリン酸塩）、１２つの製剤緩衝系（ｐＨ値４．５～７．５）をカバーし、各処方において、タンパク質濃度が５０ｍｇ／ｍＬであるＩＬ－１５融合タンパク質＃６－１－２（以下の実施例３～７は同じ）を使用し、タンパク質原液に対して限外濾過、濃縮、液交換処理を行い、原液を対応する１２つの緩衝系内に置換した。最適な緩衝系をスクリーニングするように、４０℃高温加速試験により、外観、ｐＨ値、濃度、純度（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、非還元ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、還元ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ））、電荷異性（全カラムイメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ））、動的光散乱（ＤＬＳ）を指標として、１２つの緩衝系におけるこのタンパク質の安定性を総合的に考察して比較した。具体的な処方組成及び考察計画は下記の表３に示される。
２．１ 緩衝系のスクリーニング計画
スクリーニング実験は、４つの緩衝塩（酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン塩及びリン酸塩）、１２つの製剤緩衝系（ｐＨ値４．５～７．５）をカバーし、各処方において、タンパク質濃度が５０ｍｇ／ｍＬであるＩＬ－１５融合タンパク質＃６－１－２（以下の実施例３～７は同じ）を使用し、タンパク質原液に対して限外濾過、濃縮、液交換処理を行い、原液を対応する１２つの緩衝系内に置換した。最適な緩衝系をスクリーニングするように、４０℃高温加速試験により、外観、ｐＨ値、濃度、純度（サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、非還元ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、還元ドデシル硫酸ナトリウムキャピラリー電気泳動ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ））、電荷異性（全カラムイメージングキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ））、動的光散乱（ＤＬＳ）を指標として、１２つの緩衝系におけるこのタンパク質の安定性を総合的に考察して比較した。具体的な処方組成及び考察計画は下記の表３に示される。
【0060】
【表3】
【0061】
２．２ 緩衝系のスクリーニングの結果
緩衝系のスクリーニングの主な結果を、下記の表４～表５にまとめる。
緩衝系のスクリーニングの主な結果を、下記の表４～表５にまとめる。
【0062】
【表4-1】
【0063】
【表4-2】
【0064】
【表5-1】
【0065】
【表5-2】
【0066】
２．３ 緩衝系のスクリーニングの結論
この緩衝系のスクリーニング実験は、４つの緩衝塩（酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン塩及びリン酸塩）、１２つの製剤緩衝系（ｐＨ値４．５～７．５）をカバーした。４０℃高温加速試験を行い、１２つの緩衝系におけるこのタンパク質の安定性を総合的に考察して比較した。
この緩衝系のスクリーニング実験は、４つの緩衝塩（酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン塩及びリン酸塩）、１２つの製剤緩衝系（ｐＨ値４．５～７．５）をカバーした。４０℃高温加速試験を行い、１２つの緩衝系におけるこのタンパク質の安定性を総合的に考察して比較した。
【0067】
本研究は、純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、電荷異性（ｉＣＩＥＦ）、ＤＬＳを指標として、ＳＥ－ＨＰＬＣ：４０℃で４週間考察し、ＳＥ－ＨＰＬＣのメインピーク純度及び高重合体の優劣順位：Ｆ２、Ｆ３、Ｆ７、Ｆ８＞Ｆ１、Ｆ９＞Ｆ５、Ｆ６＞Ｆ１０＞Ｆ４、Ｆ１１、Ｆ１２、
ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）：４０℃で４週間考察し、ＣＥ（ＮＲ）のメインピーク純度Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３＞Ｆ４、Ｆ５、Ｆ７＞Ｆ６、Ｆ８＞Ｆ９＞Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、分解ピークの優劣：Ｆ２、Ｆ３＞Ｆ１、Ｆ４＞Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９＞Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、
ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）：４０℃で４週間考察し、軽鎖及び重鎖含有量の優劣順位：Ｆ３、Ｆ８＞Ｆ２、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ９＞Ｆ１、Ｆ４＞Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、
ＤＬＳ：４０℃で４週間考察し、粒径の優劣順位：Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３＞Ｆ７、Ｆ８＞Ｆ９＞Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６＞Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、
ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）：４０℃で４週間考察し、ＣＥ（ＮＲ）のメインピーク純度Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３＞Ｆ４、Ｆ５、Ｆ７＞Ｆ６、Ｆ８＞Ｆ９＞Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、分解ピークの優劣：Ｆ２、Ｆ３＞Ｆ１、Ｆ４＞Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９＞Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、
ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）：４０℃で４週間考察し、軽鎖及び重鎖含有量の優劣順位：Ｆ３、Ｆ８＞Ｆ２、Ｆ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ９＞Ｆ１、Ｆ４＞Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、
ＤＬＳ：４０℃で４週間考察し、粒径の優劣順位：Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３＞Ｆ７、Ｆ８＞Ｆ９＞Ｆ４、Ｆ５、Ｆ６＞Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２、
【0068】
以上をまとめると、緩衝系のスクリーニングを経て、各処方の優劣順位は以下の通りである：Ｆ２、Ｆ３＞Ｆ１、Ｆ８＞Ｆ７＞Ｆ５、Ｆ６、Ｆ９＞Ｆ４、Ｆ１０、Ｆ１１、Ｆ１２。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ８処方は、今回の４０℃加速試験考察における純度、分解、凝集、電荷異性体などにおいて、総合的に他の処方よりも優れており、良好な安定性を示している（そのうち、Ｆ２、Ｆ３はＦ１、Ｆ８よりもやや優れている）。しかし、４０℃で４週間考察する時、各処方のＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）純度は何れも激しく低下し（＞１０％）、他の検出項目も異なる程度の変化があるので、その後、凍結乾燥製剤の開発を行う。酢酸緩衝系（Ｆ１～Ｆ３）では酢酸が揮発しやすく、凍結乾燥を行うことができないため、Ｆ８（２０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン、ｐＨ６．０）を選択して次の開発を行った。
【0069】
実施例３ 添加物のスクリーニング
３．１ 添加物のスクリーニング計画
緩衝系のスクリーニングの結果と凍結乾燥製剤の開発目標とを合わせて、最適な緩衝系に対応する添加物を加え、グリシン、スクロース、トレハロース、マンニトールを含めて合計４つの処方があり、タンパク質濃度が５０ｍｇ／ｍＬであった。真空凍結乾燥機を用いてサンプルを凍結乾燥し、凍結乾燥ステップは以下の通りである：（１）予備凍結：真空凍結乾燥機の乾燥箱を極限冷却の方式で－４５℃に降温し、３時間～５時間保持し、（２）一次乾燥：一次乾燥真空度を０．１ｍＢａｒとし、温度を－３０℃～０℃に保持し、このステップの合計時間が３０時間を超える必要があり、（３）解析乾燥：一次乾燥後、０．１℃／ｍｉｎ～０．３℃／ｍｉｎの昇温速度で２５℃に昇温して解析乾燥を開始し、真空度を０．１ｍＢａｒに１２時間～１４時間保持し、その後、到達真空になり、温度を不変に保持し、保持時間が１時間を超える。
３．１ 添加物のスクリーニング計画
緩衝系のスクリーニングの結果と凍結乾燥製剤の開発目標とを合わせて、最適な緩衝系に対応する添加物を加え、グリシン、スクロース、トレハロース、マンニトールを含めて合計４つの処方があり、タンパク質濃度が５０ｍｇ／ｍＬであった。真空凍結乾燥機を用いてサンプルを凍結乾燥し、凍結乾燥ステップは以下の通りである：（１）予備凍結：真空凍結乾燥機の乾燥箱を極限冷却の方式で－４５℃に降温し、３時間～５時間保持し、（２）一次乾燥：一次乾燥真空度を０．１ｍＢａｒとし、温度を－３０℃～０℃に保持し、このステップの合計時間が３０時間を超える必要があり、（３）解析乾燥：一次乾燥後、０．１℃／ｍｉｎ～０．３℃／ｍｉｎの昇温速度で２５℃に昇温して解析乾燥を開始し、真空度を０．１ｍＢａｒに１２時間～１４時間保持し、その後、到達真空になり、温度を不変に保持し、保持時間が１時間を超える。
【0070】
凍結乾燥サンプルに対して４０℃高温加速試験を行い、純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ））、電荷異性（ｉＣＩＥＦ）、ＤＬＳを指標として各処方の安定性を考察し、１つの最適な製剤処方をスクリーニングして次のラウンドの界面活性剤のスクリーニングを行った。具体的な処方組成及び考察計画は下記の表６に示される。
【0071】
【表6】
【0072】
３．２ 添加物のスクリーニングの結果
添加物のスクリーニングの主な結果を、下記の表７～表８にまとめる。
添加物のスクリーニングの主な結果を、下記の表７～表８にまとめる。
【0073】
【表7】
【0074】
【表8】
【0075】
３．３ 添加物のスクリーニングの結論
サンプル濃度が５０ｍｇ／ｍＬであり、凍結乾燥粉末の形態として４０℃で４週間の添加物のスクリーニングを行った。４０℃で４週間考察すると、純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、電荷異性（ｉＣＩＥＦ）、ＤＬＳを指標として、不溶性微粒子においてＦ８－２処方が他の処方よりも明らかに高く、ＳＥ－ＨＰＬＣ純度において、Ｆ８－１、Ｆ８－２のメインピークの低下が明らかで、低分子量ピークの増加が明らかであり、ＤＬＳ検出においてＦ８－１、Ｆ８－２直径の増加が明らかであり、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）検出においてメインピークＦ８－３、Ｆ８－４＞Ｆ８－１、Ｆ８－２であり、総合的に比較すると、Ｆ８－３、Ｆ８－４処方は今回の４０℃加速試験考察における純度、分解、凝集、電荷異性体などにおいて、総合的に他の処方よりも優れており、良好な安定性を示している。したがって、Ｆ８－３、Ｆ８－４処方（それぞれ８％のスクロース（Ｗ／Ｖ）及び８％のトレハロース（Ｗ／Ｖ）を含む）を予備的に選定し、次の界面活性剤のスクリーニング研究を行った。
サンプル濃度が５０ｍｇ／ｍＬであり、凍結乾燥粉末の形態として４０℃で４週間の添加物のスクリーニングを行った。４０℃で４週間考察すると、純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、電荷異性（ｉＣＩＥＦ）、ＤＬＳを指標として、不溶性微粒子においてＦ８－２処方が他の処方よりも明らかに高く、ＳＥ－ＨＰＬＣ純度において、Ｆ８－１、Ｆ８－２のメインピークの低下が明らかで、低分子量ピークの増加が明らかであり、ＤＬＳ検出においてＦ８－１、Ｆ８－２直径の増加が明らかであり、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）検出においてメインピークＦ８－３、Ｆ８－４＞Ｆ８－１、Ｆ８－２であり、総合的に比較すると、Ｆ８－３、Ｆ８－４処方は今回の４０℃加速試験考察における純度、分解、凝集、電荷異性体などにおいて、総合的に他の処方よりも優れており、良好な安定性を示している。したがって、Ｆ８－３、Ｆ８－４処方（それぞれ８％のスクロース（Ｗ／Ｖ）及び８％のトレハロース（Ｗ／Ｖ）を含む）を予備的に選定し、次の界面活性剤のスクリーニング研究を行った。
【0076】
実施例４ 第１ラウンドの界面活性剤のスクリーニング
４．１ 界面活性剤のスクリーニング計画
スクリーニングされた緩衝系、添加物に異なる濃度の界面活性剤を加え、０．０２％、０．０４％、０．０６％、０．０８％のポリソルベート８０を含めて合計８つの処方があり、タンパク質濃度が５０ｍｇ／ｍＬであり、４０℃加速試験により、純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、電荷異性（ｉＣＩＥＦ）、ＤＬＳ、不溶性微粒子を指標として各処方の安定性を考察し、最適な製剤処方をスクリーニングして処方安定性決定実験を行い、最終的な処方を決定した。具体的な処方組成及び考察計画は下記の表９に示される。
４．１ 界面活性剤のスクリーニング計画
スクリーニングされた緩衝系、添加物に異なる濃度の界面活性剤を加え、０．０２％、０．０４％、０．０６％、０．０８％のポリソルベート８０を含めて合計８つの処方があり、タンパク質濃度が５０ｍｇ／ｍＬであり、４０℃加速試験により、純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、電荷異性（ｉＣＩＥＦ）、ＤＬＳ、不溶性微粒子を指標として各処方の安定性を考察し、最適な製剤処方をスクリーニングして処方安定性決定実験を行い、最終的な処方を決定した。具体的な処方組成及び考察計画は下記の表９に示される。
【0077】
【表9】
【0078】
４．２ 界面活性剤のスクリーニングの結果
界面活性剤のスクリーニングの主な結果を、下記の表１０～表１１にまとめる。
界面活性剤のスクリーニングの主な結果を、下記の表１０～表１１にまとめる。
【0079】
【表10】
【0080】
【表11-1】
【0081】
【表11-2】
【0082】
４．３ 界面活性剤のスクリーニングの結論
４０℃で４週間考察すると、純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、電荷異性（ｉＣＩＥＦ）、ＤＬＳ、不溶性微粒子を指標として、ＳＥ－ＨＰＬＣ検出では、メインピーク含有量Ｆ８－３－１、Ｆ８－４－５処方は他の処方よりも優れ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）検出では、Ｆ８－３－１処方は他の処方よりも優れ、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）検出では、Ｆ８－４－５処方は他の処方よりも優れ、他の検出項目は何れも有意差がなく、総合的に比較すると、Ｆ８－３－１、Ｆ８－４－５処方は今回の４０℃加速試験考察において他の処方よりも優れており、良好な安定性を示している。このラウンドのスクリーニングでは、ＳＥ－ＨＰＬＣの高分子量ピークは、ポリソルベート８０の濃度の増加と共に増加した。従って、第２ラウンドの界面活性剤のスクリーニングは、別のタイプの界面活性剤ポロキサマー１８８を使用して行われた。
４０℃で４週間考察すると、純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、電荷異性（ｉＣＩＥＦ）、ＤＬＳ、不溶性微粒子を指標として、ＳＥ－ＨＰＬＣ検出では、メインピーク含有量Ｆ８－３－１、Ｆ８－４－５処方は他の処方よりも優れ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）検出では、Ｆ８－３－１処方は他の処方よりも優れ、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）検出では、Ｆ８－４－５処方は他の処方よりも優れ、他の検出項目は何れも有意差がなく、総合的に比較すると、Ｆ８－３－１、Ｆ８－４－５処方は今回の４０℃加速試験考察において他の処方よりも優れており、良好な安定性を示している。このラウンドのスクリーニングでは、ＳＥ－ＨＰＬＣの高分子量ピークは、ポリソルベート８０の濃度の増加と共に増加した。従って、第２ラウンドの界面活性剤のスクリーニングは、別のタイプの界面活性剤ポロキサマー１８８を使用して行われた。
【0083】
実施例５ 第２ラウンドの界面活性剤のスクリーニング
臨床的な需要の状況に応じて、同時に高濃度でのタンパク質分子の凝集などの状況による不安定を回避し、以下の実施例は、上記製剤処方のスクリーニングに基づいて、タンパク質濃度が高い場合にスクリーニングされた処方結果に対して、タンパク質濃度を低下させて行い、具体的な処方は以下の通りである。
臨床的な需要の状況に応じて、同時に高濃度でのタンパク質分子の凝集などの状況による不安定を回避し、以下の実施例は、上記製剤処方のスクリーニングに基づいて、タンパク質濃度が高い場合にスクリーニングされた処方結果に対して、タンパク質濃度を低下させて行い、具体的な処方は以下の通りである。
【0084】
２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質、２０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン、８％のスクロース（Ｗ／Ｖ）、０．０４％のポロキサマー１８８（Ｗ／Ｖ）、ｐＨ６．０及び２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質、２０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン、８％のトレハロース（Ｗ／Ｖ）、０．０４％のポロキサマー１８８（Ｗ／Ｖ）、ｐＨ６．０の２つの処方の凍結乾燥粉末のガラス転移温度は、それぞれ７４．０６℃及び１１５．４４℃であることを検出して、トレハロース含有処方の凍結乾燥粉末のガラス転移温度は、スクロース含有処方よりもはるかに高いことから、第２ラウンドの界面活性剤のスクリーニングはトレハロースを使用して考察した。
【0085】
５．１ 界面活性剤のスクリーニング計画
スクリーニングにより決定された緩衝系、添加物に異なる濃度の界面活性剤を加え、０．０１％、０．０２％、０．０４％、０．０６％、０．０８％のポロキサマー１８８（Ｗ／Ｖ）を含めて合計５つの処方があり、４０℃加速試験により、純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、電荷異性（ｉＣＩＥＦ）、ＤＬＳ、不溶性微粒子を指標として各処方の安定性を考察し、最適な製剤処方をスクリーニングして処方安定性決定実験を行い、最終的な処方を決定した。具体的な処方組成及び考察計画は下記の表１２に示される。
スクリーニングにより決定された緩衝系、添加物に異なる濃度の界面活性剤を加え、０．０１％、０．０２％、０．０４％、０．０６％、０．０８％のポロキサマー１８８（Ｗ／Ｖ）を含めて合計５つの処方があり、４０℃加速試験により、純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、電荷異性（ｉＣＩＥＦ）、ＤＬＳ、不溶性微粒子を指標として各処方の安定性を考察し、最適な製剤処方をスクリーニングして処方安定性決定実験を行い、最終的な処方を決定した。具体的な処方組成及び考察計画は下記の表１２に示される。
【0086】
【表12】
【0087】
５．２ 界面活性剤のスクリーニングの結果
界面活性剤のスクリーニングの主な結果を、下記の表１３～表１４にまとめる。
界面活性剤のスクリーニングの主な結果を、下記の表１３～表１４にまとめる。
【0088】
【表13】
【0089】
【表14-1】
【0090】
【表14-2】
【0091】
５．３ 界面活性剤のスクリーニングの結論
４０℃で４週間考察すると、純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、電荷異性（ｉＣＩＥＦ）、ＤＬＳ、不溶性微粒子を指標として、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）検出では、Ｆ８－４－Ｓ５処方は他の処方よりフラグメントピークがやや高く、軽鎖＋重鎖の割合がやや低く、他の検出項目は何れも有意差がなく、総合的に比較すると、Ｆ８－４－Ｓ１、Ｆ８－４－Ｓ２、Ｆ８－４－Ｓ３、Ｆ８－４－Ｓ４処方は今回の４０℃加速試験考察において他の処方よりも優れており、良好な安定性を示し、生産の操作可能なスペースを考慮して、Ｆ８－４－Ｓ３処方を最終的な処方（２０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン、８％のトレハロース（Ｗ／Ｖ）、０．０４％のポロキサマー１８８（Ｗ／Ｖ）、ｐＨ６．０）として選択した。
４０℃で４週間考察すると、純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ）、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、電荷異性（ｉＣＩＥＦ）、ＤＬＳ、不溶性微粒子を指標として、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）検出では、Ｆ８－４－Ｓ５処方は他の処方よりフラグメントピークがやや高く、軽鎖＋重鎖の割合がやや低く、他の検出項目は何れも有意差がなく、総合的に比較すると、Ｆ８－４－Ｓ１、Ｆ８－４－Ｓ２、Ｆ８－４－Ｓ３、Ｆ８－４－Ｓ４処方は今回の４０℃加速試験考察において他の処方よりも優れており、良好な安定性を示し、生産の操作可能なスペースを考慮して、Ｆ８－４－Ｓ３処方を最終的な処方（２０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン、８％のトレハロース（Ｗ／Ｖ）、０．０４％のポロキサマー１８８（Ｗ／Ｖ）、ｐＨ６．０）として選択した。
【0092】
実施例６ 最終配合法のＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質の凍結乾燥製剤の製造方法
最終配合法２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度のＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質溶液を、無菌的にバイアル瓶に分注し、半分栓をした後、凍結乾燥し、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質凍結乾燥製剤を得た。本実施例は、真空凍結乾燥機を用いてＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質溶液を凍結乾燥し、凍結乾燥ステップは、以下を含む：（１）真空凍結乾燥機の乾燥箱を－４５℃に降温して３時間～５時間保持し、（２）乾燥箱の温度を－５℃に昇温して３時間～５時間保持し、（３）乾燥箱の温度を－４５℃に降温して３時間～５時間保持する。予備凍結の過程において、昇温降温速度を０．５℃～１℃／ｍｉｎに保持し、（４）一次乾燥真空度を０．１ｍＢａｒとし、温度を－３０℃～－２０℃に保持し、このステップの合計時間が３０時間を超える必要があり、（５）一次乾燥後、０．１℃～０．３℃／ｍｉｎの昇温速度で２５℃に昇温して解析乾燥を開始し、真空度を０．１ｍＢａｒに１時間～２時間保持し、その後、到達真空になり、温度を不変に保持し、保持時間が１５時間を超える。ここで、（１）～（３）ステップは予備凍結であり、（４）は一次乾燥であり、（５）は解析乾燥である。
最終配合法２５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度のＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質溶液を、無菌的にバイアル瓶に分注し、半分栓をした後、凍結乾燥し、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質凍結乾燥製剤を得た。本実施例は、真空凍結乾燥機を用いてＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質溶液を凍結乾燥し、凍結乾燥ステップは、以下を含む：（１）真空凍結乾燥機の乾燥箱を－４５℃に降温して３時間～５時間保持し、（２）乾燥箱の温度を－５℃に昇温して３時間～５時間保持し、（３）乾燥箱の温度を－４５℃に降温して３時間～５時間保持する。予備凍結の過程において、昇温降温速度を０．５℃～１℃／ｍｉｎに保持し、（４）一次乾燥真空度を０．１ｍＢａｒとし、温度を－３０℃～－２０℃に保持し、このステップの合計時間が３０時間を超える必要があり、（５）一次乾燥後、０．１℃～０．３℃／ｍｉｎの昇温速度で２５℃に昇温して解析乾燥を開始し、真空度を０．１ｍＢａｒに１時間～２時間保持し、その後、到達真空になり、温度を不変に保持し、保持時間が１５時間を超える。ここで、（１）～（３）ステップは予備凍結であり、（４）は一次乾燥であり、（５）は解析乾燥である。
【0093】
実施例７ 安定性試験
実施例６の製造方法によりＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質の凍結乾燥製剤を製造し、且つ４０℃加速安定性考察を行った。主に水分、再溶解後の純度、電荷異性、不溶性微粒子、活性などの指標を含む。緩衝系、添加物及び界面活性剤のスクリーニングの結果に基づき、１つの処方を決定した：２５ｍｇ／ｍＬのＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、２０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン、８％のトレハロース（Ｗ／Ｖ）、０．０４％のポロキサマー１８８（Ｗ／Ｖ）、ｐＨ６．０、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥し、ゴム栓とアルミニウム製プラスチック蓋を使用して密閉した包装システムを形成し、１４日間の４０℃安定性試験を行った。
結果は下記の表１５～表１６及び図２～図５に示される。
実施例６の製造方法によりＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質の凍結乾燥製剤を製造し、且つ４０℃加速安定性考察を行った。主に水分、再溶解後の純度、電荷異性、不溶性微粒子、活性などの指標を含む。緩衝系、添加物及び界面活性剤のスクリーニングの結果に基づき、１つの処方を決定した：２５ｍｇ／ｍＬのＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、２０ｍＭのヒスチジン－塩酸ヒスチジン、８％のトレハロース（Ｗ／Ｖ）、０．０４％のポロキサマー１８８（Ｗ／Ｖ）、ｐＨ６．０、バイアル瓶に分注し、凍結乾燥し、ゴム栓とアルミニウム製プラスチック蓋を使用して密閉した包装システムを形成し、１４日間の４０℃安定性試験を行った。
結果は下記の表１５～表１６及び図２～図５に示される。
【0094】
【表15】
【0095】
【表16】
【0096】
４０℃加速安定性を１４日間考察したところ、再溶解後の純度（ＳＥ－ＨＰＬＣ）はわずかに低下し、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、電荷異性、不溶性微粒子、活性は明らかに変化しなかった。本処方におけるタンパク質が比較的良好な安定性を有し、本発明の目的を達成したことが示された。
【0097】
実施例８ 混合リンパ球反応（ＭＬＲ）による、Ｔ細胞増殖及びＩＦＮ－γ分泌に対する試験薬物の影響の検出
実施例８～１１において、「＃６－１」は「用語の定義及び説明」及び「表１」中の＃６－１－２に対応し、「ａＰＤＬ１」はＰＤ－Ｌ１－２－２に対応し、「ａＨｅＬ－ＩＬ１５」は、＃６－１と同じ構造のアイソタイプ対照融合タンパク質であり、抗体可変領域部分のみが抗鶏卵白リゾチーム抗体の可変領域で置換され、残りの部分は配列が同じである。
実施例８～１１において、「＃６－１」は「用語の定義及び説明」及び「表１」中の＃６－１－２に対応し、「ａＰＤＬ１」はＰＤ－Ｌ１－２－２に対応し、「ａＨｅＬ－ＩＬ１５」は、＃６－１と同じ構造のアイソタイプ対照融合タンパク質であり、抗体可変領域部分のみが抗鶏卵白リゾチーム抗体の可変領域で置換され、残りの部分は配列が同じである。
【0098】
融合タンパク質がＴ細胞活性を増強する能力は、混合リンパ球反応（ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＭＬＲ）によって測定される。健康なヒトドナー１の末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ、ＰＢＭＣ）からＣＤ１４＋単核細胞を単離し、組換えヒト顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ．３００－０３）及び組換えヒトインターロイキン４（ｒｈＩＬ－４、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ．２００－０４）を用いて、インビトロで樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ、ＤＣ）への分化を誘導し、培養の６日目にＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ：Ｌ４５１６）を加えてＤＣを刺激して成熟させた。７日目に、ドナー１のＤＣ細胞を、健康なドナー２のＰＢＭＣから濃縮された蛍光標識（Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｃ３４５５７）のＣＤ４＋Ｔ細胞と混合して共培養し、ＤＣ：ＣＤ４＋Ｔ細胞数の割合が１：１０であり、最終濃度２．８ｎＭの試験薬物を加えて４日間共培養した。４日後に細胞を収集し、フローサイトメーターによりＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の割合を検出すると同時に、細胞培養上清を収集し、ＥＬＩＳＡ法により上清中のＩＦＮ－γの含有量を検出した。図６に示されるように（ｏｎｅ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．０００５）、各対照群と比較して、＃６－１融合タンパク質群は、より高いＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖及びＩＦＮ－γの分泌を有する。ここで、＃６－１は、アイソタイプ対照分子ａＨｅｌ－ＩＬ１５と比較して、ＭＬＲ実験におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を顕著に増強し、且つＩＦＮ－γの分泌を顕著に増強することができる。この結果から、＃６－１融合タンパク質は、混合リンパ球反応においてＴ細胞の機能を増強できることが示された。
【0099】
実施例９ ヒト骨髄系由来抑制細胞の増殖に対する試験薬物の影響
凍結保存された市販ヒトＰＢＭＣ（軒鋒、商品番号ＸＦＢ－ＨＰ０５０Ｂ）を蘇生させて遠心分離した後、ＲＰＭＩ １６４０完全培地（配合法：８９％のＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、商品番号７２４０００４７）＋１０％のウシ胎児血清ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、商品番号１００９９－１４１Ｃ）＋１％のマイシリン二重抗体（Ｇｉｂｃｏ、商品番号１５０７００６３））を用いて再懸濁させて細胞懸濁液を得、且つ計数して、細胞密度を６×１０６／ｍＬに調整し、１ウェル当たり１００μＬで９６ウェルＵ底プレートに敷いた。次いで、１００μＬの２×濃度段階希釈された試験薬物＃６－１、＃９－１（構造配列は表１参照）、ａＰＤＬ１をウェルごとに加え、系内の融合タンパク質の最終濃度は、それぞれ、５０００００ｐＭ、１０００００ｐＭ、２００００ｐＭ、４０００ｐＭ、８００ｐＭ、１６０ｐＭ、３２ｐＭ、６．４ｐＭ、１．２８ｐＭ、０．３２ｐＭであった。同時に、陰性対照ウェルＮｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔを設け、即ち１００μＬの完全培地を補充した。系の総体積は２００μＬ／ウェルであり、重複ウェルを設けた。マルチチャンネルピペットで、細胞と試験融合タンパク質を軽くピペッティングして十分に均一に混合し、均一に混合した後、ウェルプレートを５％ＣＯ２インキュベーターに置いて３７℃で３日間培養した。培養終了後、ウェルプレートを取り出し、細胞をマルチチャンネルピペットでピペッティングした後に新しい９６ウェルＶ底プレートに移し、ＤＰＢＳ溶液でウェルプレートを１回洗浄し、且つプレートを洗浄する溶液も対応する９６ウェルに移し、その後、１００μＬ／ウェルのＡｃｃｕｔａｓｅ溶液（Ｓｉｇｍａ、商品番号Ａ６９６４）を加えて３７℃のインキュベーターに置いて接着細胞を１０分間消化し、消化された接着細胞をマルチチャンネルピペットでピペッティングした後に上記９６ウェルＶ底プレートに移し、３５０×ｇで４分間遠心分離し、上清を捨てた。ウェルごとに、１００μＬの希釈したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ａｑｕａ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、商品番号Ｌ３４９６６、ＤＰＢＳで１：５００希釈）加え、４℃で２０分間染色した。染色緩衝液（２％のＦＢＳを含むＤＰＢＳ溶液）で２回洗浄した。３５０ｇで４ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。５０μＬ／ウェルの希釈したＨｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、商品番号４２２３０２、２μＬ／ｔｅｓｔ）を加え、室温で１０分間染色した。次いで、５０μＬ／ウェルの調製済みの表面抗体混合物を直接に加え、表面抗体はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ７００ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、商品番号３００４２４、１μＬ／ｔｅｓｔ）、ＰｅｒＣＰ－ＣｙＴＭ５．５ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－ＤＲ（ＢＤ、商品番号５６０６５２、１μＬ／ｔｅｓｔ）、ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、商品番号２５－０３３８－４２、２μＬ／ｔｅｓｔ）、ＢＶ４２１ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ｂ（ＢＤ、商品番号５６２６３２、１μＬ／ｔｅｓｔ）、ＦＩＴＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、商品番号３０１８０４、１μＬ／ｔｅｓｔ）を含む。４℃で３０分間染色した。染色緩衝液で２回洗浄した。３５０ｇで４ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。ウェルごとに、１００μＬの希釈したＦｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、商品番号００－５５２３－００）中の固定液を加え、４℃で６０分間固定し、キット中の１＊Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ溶液で２回洗浄した。遠心分離速度を４００ｇに上げ、４ｍｉｎ後に上清を捨てた。次いで、１００μＬ／ウェルの調製済みの細胞内抗体ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｋｉ－６７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、商品番号３５０５１４、１μＬ／ｔｅｓｔ）をゆっくりと加え、４℃で４０分間反応させ、且つ同じ質量濃度のＡＰＣ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１、ｋａｐｐａアイソタイプ対照抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、商品番号１７－４７１４－８２）を準備した。細胞を１＊Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ溶液で２回洗浄した。ウェルごとに１５０μＬの染色緩衝液を加えて細胞を再懸濁させ、フローサイトメーターでシグナルを検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。
凍結保存された市販ヒトＰＢＭＣ（軒鋒、商品番号ＸＦＢ－ＨＰ０５０Ｂ）を蘇生させて遠心分離した後、ＲＰＭＩ １６４０完全培地（配合法：８９％のＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、商品番号７２４０００４７）＋１０％のウシ胎児血清ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、商品番号１００９９－１４１Ｃ）＋１％のマイシリン二重抗体（Ｇｉｂｃｏ、商品番号１５０７００６３））を用いて再懸濁させて細胞懸濁液を得、且つ計数して、細胞密度を６×１０６／ｍＬに調整し、１ウェル当たり１００μＬで９６ウェルＵ底プレートに敷いた。次いで、１００μＬの２×濃度段階希釈された試験薬物＃６－１、＃９－１（構造配列は表１参照）、ａＰＤＬ１をウェルごとに加え、系内の融合タンパク質の最終濃度は、それぞれ、５０００００ｐＭ、１０００００ｐＭ、２００００ｐＭ、４０００ｐＭ、８００ｐＭ、１６０ｐＭ、３２ｐＭ、６．４ｐＭ、１．２８ｐＭ、０．３２ｐＭであった。同時に、陰性対照ウェルＮｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔを設け、即ち１００μＬの完全培地を補充した。系の総体積は２００μＬ／ウェルであり、重複ウェルを設けた。マルチチャンネルピペットで、細胞と試験融合タンパク質を軽くピペッティングして十分に均一に混合し、均一に混合した後、ウェルプレートを５％ＣＯ２インキュベーターに置いて３７℃で３日間培養した。培養終了後、ウェルプレートを取り出し、細胞をマルチチャンネルピペットでピペッティングした後に新しい９６ウェルＶ底プレートに移し、ＤＰＢＳ溶液でウェルプレートを１回洗浄し、且つプレートを洗浄する溶液も対応する９６ウェルに移し、その後、１００μＬ／ウェルのＡｃｃｕｔａｓｅ溶液（Ｓｉｇｍａ、商品番号Ａ６９６４）を加えて３７℃のインキュベーターに置いて接着細胞を１０分間消化し、消化された接着細胞をマルチチャンネルピペットでピペッティングした後に上記９６ウェルＶ底プレートに移し、３５０×ｇで４分間遠心分離し、上清を捨てた。ウェルごとに、１００μＬの希釈したＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ａｑｕａ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、商品番号Ｌ３４９６６、ＤＰＢＳで１：５００希釈）加え、４℃で２０分間染色した。染色緩衝液（２％のＦＢＳを含むＤＰＢＳ溶液）で２回洗浄した。３５０ｇで４ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。５０μＬ／ウェルの希釈したＨｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、商品番号４２２３０２、２μＬ／ｔｅｓｔ）を加え、室温で１０分間染色した。次いで、５０μＬ／ウェルの調製済みの表面抗体混合物を直接に加え、表面抗体はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標） ７００ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、商品番号３００４２４、１μＬ／ｔｅｓｔ）、ＰｅｒＣＰ－ＣｙＴＭ５．５ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＨＬＡ－ＤＲ（ＢＤ、商品番号５６０６５２、１μＬ／ｔｅｓｔ）、ＰＥ－Ｃｙａｎｉｎｅ７ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ３３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、商品番号２５－０３３８－４２、２μＬ／ｔｅｓｔ）、ＢＶ４２１ Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＣＤ１１ｂ（ＢＤ、商品番号５６２６３２、１μＬ／ｔｅｓｔ）、ＦＩＴＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＣＤ１４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、商品番号３０１８０４、１μＬ／ｔｅｓｔ）を含む。４℃で３０分間染色した。染色緩衝液で２回洗浄した。３５０ｇで４ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨てた。ウェルごとに、１００μＬの希釈したＦｏｘｐ３／転写因子染色緩衝液キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、商品番号００－５５２３－００）中の固定液を加え、４℃で６０分間固定し、キット中の１＊Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ溶液で２回洗浄した。遠心分離速度を４００ｇに上げ、４ｍｉｎ後に上清を捨てた。次いで、１００μＬ／ウェルの調製済みの細胞内抗体ＡＰＣ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ Ｋｉ－６７ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、商品番号３５０５１４、１μＬ／ｔｅｓｔ）をゆっくりと加え、４℃で４０分間反応させ、且つ同じ質量濃度のＡＰＣ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１、ｋａｐｐａアイソタイプ対照抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、商品番号１７－４７１４－８２）を準備した。細胞を１＊Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ溶液で２回洗浄した。ウェルごとに１５０μＬの染色緩衝液を加えて細胞を再懸濁させ、フローサイトメーターでシグナルを検出した（Ｔｈｅｒｍｏ Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ）。
【0100】
図７のＡ図は、ヒト骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）の増殖を分析するためのゲーティング戦略、ヒトＭＤＳＣ（ＨＬＡＤＲｌｏｗＣＤ３３＋ＣＤ１１ｂ＋）細胞におけるＫｉ－６７の割合を分析するものを示す。図に示されるのは、最高濃度＃９－１で処理したサンプルであり、ＭＤＳＣ細胞に比較的明らかなＫｉ－６７陽性細胞集団があることが認められる。Ｂ図及びＣ図は、ＭＤＳＣ細胞増殖に対する３つの試験薬物の影響曲線であり、Ｂ図はＫｉ－６７パーセントを示し、Ｃ図はＭＤＳＣ細胞の絶対細胞計数であり、結果により、＃９－１がヒトＣＤ３３＋ＭＤＳＣｓ細胞の増殖を促進できるが、＃６－１はほとんど効果がなく、＃６－１分子は免疫抑制細胞を活性化しないことが示された。
【0101】
実施例１０ マウス体内での試験薬物の薬効の優位性の評価
ＮＰＧマウス（北京維通達生物技術有限公司から購入）の右後背部皮下に、ヒト黒色腫細胞Ａ３７５細胞（北納生物から購入、商品番号：ＢＮＣＣ１００２６６）を５×１０６個／１００μＬで接種し、Ａ３７５を接種した後翌日、凍結保存されたＰＢＭＣ（上海儒百生物科技有限公司から購入、商品番号：ＰＢＭＮＣ１００Ｃ）を蘇生させ、５×１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬの量でＮＰＧマウスに尾静脈注射した。ＰＢＭＣ接種の６日後に４０μＬ採血してｈＣＤ４５＋細胞の割合を検出し、腫瘍が約６３ｍｍ３に成長した後、体重、ｈＣＤ４５＋細胞の割合、腫瘍体積が大きすぎる及び小さすぎるものを除去し、腫瘍体積に応じて、ＰＢＳ群、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ群（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ＋ａＨｅｌ－ＩＬ１５群（３．４ｍｇ／ｋｇ＋４．５ｍｇ／ｋｇ）、ａＨｅｌ－ＩＬ１５群（３ｍｇ／ｋｇ）及び＃６－１群（３ｍｇ／ｋｇ）の合計５つの群にランダムにマウスを分け、各群８匹で、合計４０匹であった。投与方式は腹腔内投与であり、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ＋ａＨｅｌ－ＩＬ１５群（３．４ｍｇ／ｋｇ＋４．５ｍｇ／ｋｇ）、ａＨｅｌ－ＩＬ１５群（３ｍｇ／ｋｇ）及び＃６－１群（３ｍｇ／ｋｇ）の群分けに従って群分けの当日に投与を行い、合計１回投与し、ＰＢＳ群及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑ群（１０ｍｇ／ｋｇ）は週に２回、合計４回投与した。腫瘍体積を週に３回測定し、データを記録した。腫瘍体積（長径×短径２／２）と増殖抑制率（ＴＧＩＴＶ（％）＝［１－（投与ｉ日目の治療群の腫瘍体積平均値－投与０日目の治療群の腫瘍体積平均値）／（投与ｉ日目の溶媒対照群の腫瘍体積平均値－投与０日目の溶媒対照群の腫瘍体積平均値）］×１００％）を算出し、群分け投与の１５日目に、投与群は何れも腫瘍体積において顕著な抑制効果があり、統計学的差異があった（Ｐ＜０．０５）。
ＮＰＧマウス（北京維通達生物技術有限公司から購入）の右後背部皮下に、ヒト黒色腫細胞Ａ３７５細胞（北納生物から購入、商品番号：ＢＮＣＣ１００２６６）を５×１０６個／１００μＬで接種し、Ａ３７５を接種した後翌日、凍結保存されたＰＢＭＣ（上海儒百生物科技有限公司から購入、商品番号：ＰＢＭＮＣ１００Ｃ）を蘇生させ、５×１０６ｃｅｌｌｓ／２００μＬの量でＮＰＧマウスに尾静脈注射した。ＰＢＭＣ接種の６日後に４０μＬ採血してｈＣＤ４５＋細胞の割合を検出し、腫瘍が約６３ｍｍ３に成長した後、体重、ｈＣＤ４５＋細胞の割合、腫瘍体積が大きすぎる及び小さすぎるものを除去し、腫瘍体積に応じて、ＰＢＳ群、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ群（１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ＋ａＨｅｌ－ＩＬ１５群（３．４ｍｇ／ｋｇ＋４．５ｍｇ／ｋｇ）、ａＨｅｌ－ＩＬ１５群（３ｍｇ／ｋｇ）及び＃６－１群（３ｍｇ／ｋｇ）の合計５つの群にランダムにマウスを分け、各群８匹で、合計４０匹であった。投与方式は腹腔内投与であり、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ＋ａＨｅｌ－ＩＬ１５群（３．４ｍｇ／ｋｇ＋４．５ｍｇ／ｋｇ）、ａＨｅｌ－ＩＬ１５群（３ｍｇ／ｋｇ）及び＃６－１群（３ｍｇ／ｋｇ）の群分けに従って群分けの当日に投与を行い、合計１回投与し、ＰＢＳ群及びＴｅｃｅｎｔｒｉｑ群（１０ｍｇ／ｋｇ）は週に２回、合計４回投与した。腫瘍体積を週に３回測定し、データを記録した。腫瘍体積（長径×短径２／２）と増殖抑制率（ＴＧＩＴＶ（％）＝［１－（投与ｉ日目の治療群の腫瘍体積平均値－投与０日目の治療群の腫瘍体積平均値）／（投与ｉ日目の溶媒対照群の腫瘍体積平均値－投与０日目の溶媒対照群の腫瘍体積平均値）］×１００％）を算出し、群分け投与の１５日目に、投与群は何れも腫瘍体積において顕著な抑制効果があり、統計学的差異があった（Ｐ＜０．０５）。
【0102】
【表17】
【0103】
体重モニタリング及び観察の結果は、ａＨｅｌ－ＩＬ１５（３ｍｇ／ｋｇ）群及び＃６－１（３ｍｇ／ｋｇ）群の実験動物が、投与期間に活動状態及び摂食状態が良好であり、体重が減少する傾向があることを示し、Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ＋ａＨｅｌ－ＩＬ１５（３．４ｍｇ／ｋｇ＋４．５ｍｇ／ｋｇ）群では投与の１５日目に動物の死亡が発生し、マウスの死亡はＩＬ１５により引き起こされるリンフォカインストームに相関する可能性がある（図９、表１８を参照）ことを示した。
【0104】
【表18】
【0105】
腫瘍モニタリングの結果は、抗ＰＤ－Ｌ１－ＩＬ１５融合タンパク質＃６－１がＡ３７５腫瘍皮下移植腫瘍増殖に対する顕著な抑制効果を有することを示し（表１７、図８）、＃６－１（３ｍｇ／ｋｇ）群はＴｅｃｅｎｔｒｉｑ（１０ｍｇ／ｋｇ）群及びａＨｅｌ－ＩＬ１５（３ｍｇ／ｋｇ）群と比較して腫瘍抑制効果が顕著により強く、融合タンパク質薬効の優位性を示し、＃６－１（３ｍｇ／ｋｇ）群はＴｅｃｅｎｔｒｉｑ＋ａＨｅｌ－ＩＬ１５（３．４ｍｇ／ｋｇ＋４．５ｍｇ／ｋｇ）併用群と比較して腫瘍体積において抑制効果が同等であるが、安全性がより良好であった（表１８、図９）。
【0106】
実施例１１ 酵素結合免疫吸着反応（ＥＬＩＳＡ）による、腫瘍組織における試験薬物の含有量の検出
ＮＰＧマウス（北京維通達生物技術有限公司から購入）の右前部の腋下付近皮下に、ヒト結腸癌細胞ＲＫＯ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２５７７）を７×１０６個／１００μＬで接種し、ＲＫＯを接種した後、腫瘍が３００ｍｍ３～５００ｍｍ３に成長した後、体重、腫瘍が大きすぎる及び小さすぎる個体を除去し、腫瘍体積に応じてマウスを４つの群にランダムに分け、各群２０匹で、合計８０匹であり、詳細な群分け、投与、サンプリング実験計画は下記の表１９に示される。表１９の計画に従って群分け投与を完了した後、計画された時間でマウスを採血し、且つ安楽死させ、完全な腫瘍を取って、ＰＢＳで洗浄した後に十字切開し、腫瘍組織の一部を取り、溶解液（Ｔ－ＰＥＲＴＭＴｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ：ｔｈｅｒｍｏ、７８５１０＋プロテアーゼ阻害剤混合物：碧云天、Ｐ１０４６＋ヌクレアーゼ：ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｅ１０１４）を加えてホモジナイズして溶解し、ＥＬＩＳＡ定量分析のための組織溶解液を得た。さらに別の組織を取って、外科用ハサミで細かく切り、組織消化酵素（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９５－９２９）を加えて３０ｍｉｎ振とうして培養し、消化終了後、停止液（９８％のＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０２５６）及び２％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１００９９－１４１Ｃ））を加え、セルストレーナー（ｔｈｅｒｍｏ、７０ｕｍ、３５２３５０、Ｆａｌｃｏｎ）を通して単細胞懸濁液を収集し、０．５×１０６個の単細胞を取ってフローサイトメトリーに使用した。
ＮＰＧマウス（北京維通達生物技術有限公司から購入）の右前部の腋下付近皮下に、ヒト結腸癌細胞ＲＫＯ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２５７７）を７×１０６個／１００μＬで接種し、ＲＫＯを接種した後、腫瘍が３００ｍｍ３～５００ｍｍ３に成長した後、体重、腫瘍が大きすぎる及び小さすぎる個体を除去し、腫瘍体積に応じてマウスを４つの群にランダムに分け、各群２０匹で、合計８０匹であり、詳細な群分け、投与、サンプリング実験計画は下記の表１９に示される。表１９の計画に従って群分け投与を完了した後、計画された時間でマウスを採血し、且つ安楽死させ、完全な腫瘍を取って、ＰＢＳで洗浄した後に十字切開し、腫瘍組織の一部を取り、溶解液（Ｔ－ＰＥＲＴＭＴｉｓｓｕｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ：ｔｈｅｒｍｏ、７８５１０＋プロテアーゼ阻害剤混合物：碧云天、Ｐ１０４６＋ヌクレアーゼ：ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｅ１０１４）を加えてホモジナイズして溶解し、ＥＬＩＳＡ定量分析のための組織溶解液を得た。さらに別の組織を取って、外科用ハサミで細かく切り、組織消化酵素（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９５－９２９）を加えて３０ｍｉｎ振とうして培養し、消化終了後、停止液（９８％のＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３０２５６）及び２％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、１００９９－１４１Ｃ））を加え、セルストレーナー（ｔｈｅｒｍｏ、７０ｕｍ、３５２３５０、Ｆａｌｃｏｎ）を通して単細胞懸濁液を収集し、０．５×１０６個の単細胞を取ってフローサイトメトリーに使用した。
【0107】
ＥＬＩＳＡ分析方法と結果：酵素結合免疫吸着反応（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ、ＥＬＩＳＡ）により、異なる時点での腫瘍溶解液中の薬物濃度を検出して、試験分子の異なる用量での腫瘍組織内部の濃縮程度及び傾向を比較する。試験分子のＦｃ領域を抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ、＃１０９－００６－０９８）で捕捉し、標準品及び腫瘍溶解液試験物を加えた後、酵素標識抗ヒト抗ヒトＦ（ａｂ）２抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ、＃１０９－０３５－０９７）を試験分子のＦａｂ領域に結合することにより腫瘍溶解液中のヒト化抗体の濃度を測定し、且つ下記式により、各個体の動物の腫瘍組織における試験薬物の含有量を算出する：個体の腫瘍における試験薬物の含有量（ｎｇ）＝腫瘍溶解液中の試験薬物の濃度（ｎｇ／ｍＬ）×溶解液の体積（ｍＬ）／溶解部分の腫瘍重量（ｍｇ）×個体の総腫瘍重量（ｍｇ）。
【0108】
図１０のＡ及びＢの結果に示されるように、ａＨｅｌ－ＩＬ１５アイソタイプ対照と比較して、＃６－１融合タンパク質は腫瘍組織内部のＰＤ－Ｌ１＋腫瘍細胞に特異的に標的化され得、且つａＰＤ－Ｌ１末端標的化作用によって腫瘍組織内部に薬物濃度の優位性をもたらし、用量の増加と共に濃度が上昇し、且つ６時間～７２時間にわたって持続的に濃縮される傾向を示す。（Ｔ検定、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００５）
【0109】
フローサイトメトリー検出方法と結果：単細胞懸濁液を遠心分離した後、ＰＢＳで再懸濁させてからライヴ／デッド色素（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２３１１４）を加えて２０分間染色し、終了後に染色緩衝液で２回洗浄し、ブロッキング抗体（ＢＤ、５５３１４）を加えて１５分間後に、染色抗体ＣＤ４７（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３２３１２４）とＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４１０７０８）を加える（注記：ＣＤ４７はＲＫＯ細胞を標識するために用いられ、抗ヒトＦｃ蛍光抗体は薬物のＦｃに特異的に結合できる）。染色終了後、フローサイトメトリー検出に用いられ、結果はＲＫＯ細胞（ＣＤ４７＋細胞集団）中のＰＥ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃの陽性率と示した。
【0110】
図１１に示されるように、フローサイトメトリー検出の結果は、ａＨｅｌ－ＩＬ１５と比較して、＃６－１融合タンパク質が腫瘍細胞に特異的に結合することができ、高用量でも低用量でも何れも良好な用量関係を示し、且つ６時間～７２時間にわたってステップで濃縮される傾向を示すことを示した。融合タンパク質の設計目標を達成した。
【0111】
融合タンパク質＃６－１－１を用いて実施例６－１１の実験を行い、得られた結果が＃６－１－２（即ち、実施例８－１１に記載される＃６－１）と全く同じ傾向を示すことを確認し、類似のグラフは繰り返し示さないとする。
【0112】
【表19】
【0113】
以上をまとめると
タンパク質のＰＫａ、グリコシル化の状況、（配列及び高次構造により決定される）親疎水性の性質、等電点などの様々な基本物理化学的パラメータは、異なる製剤処方の安定性の状況に影響を与える。
本願はスクリーニングを経て、突然変異後のＩＬ－１５融合タンパク質に対して、安定な製剤処方をスクリーニングし、考察期間内の様々な条件の加速実験下で、ｉＣＩＥＦ、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、ＤＬＳ、不溶性微粒子などのパラメータの考察結果は明らかに変化しなかった。
タンパク質のＰＫａ、グリコシル化の状況、（配列及び高次構造により決定される）親疎水性の性質、等電点などの様々な基本物理化学的パラメータは、異なる製剤処方の安定性の状況に影響を与える。
本願はスクリーニングを経て、突然変異後のＩＬ－１５融合タンパク質に対して、安定な製剤処方をスクリーニングし、考察期間内の様々な条件の加速実験下で、ｉＣＩＥＦ、ＳＥ－ＨＰＬＣ、ＣＥ－ＳＤＳ（ＮＲ）、ＣＥ－ＳＤＳ（Ｒ）、ＤＬＳ、不溶性微粒子などのパラメータの考察結果は明らかに変化しなかった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-10-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
医薬組成物であって、前記医薬組成物はＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、緩衝液、タンパク質安定剤及び界面活性剤を含み、前記ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質は、以下のドメイン：
（１）ＩＬ－１５突然変異体、
（２）ＩＬ－１５突然変異体と融合される免疫グロブリン分子、
（３）ＩＬ－１５Ｒα、を含み、
前記ＩＬ－１５突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号５、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６又は配列番号７に示され、前記野生型ＩＬ－１５のアミノ酸配列は、配列番号１に示され、
前記ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質における各ドメインの連結順序は、Ｎ末端からＣ末端へ：免疫グロブリン分子、ＩＬ－１５Ｒα、ＩＬ－１５突然変異体であり、
ＩＬ－１５Ｒα又はＩＬ－１５突然変異体は、免疫グロブリン分子と融合される場合、免疫グロブリン分子のＦｃ領域のＣ末端に融合され、
前記免疫グロブリン分子は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体又は抗原結合断片であり、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖は、配列番号１９又は配列番号２０に示される配列を有し、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖は、配列番号２１に示される配列を有する、
ことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項2】
前記ＩＬ－１５突然変異体は、リンカーペプチドを介してＩＬ－１５Ｒαと融合され、さらに免疫グロブリン分子又はその一部と融合される、ことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記リンカーペプチドの配列は、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号１６に示される、ことを特徴とする、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質は、前記抗ＰＤ－Ｌ１抗体の重鎖を含み、それぞれ配列番号２２、２３に示される配列を有する単量体１、配列番号２１に示される配列を有する抗ＰＤ－Ｌ１抗体の軽鎖、を含む、
ことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質の濃度は、１ｍｇ／ｍＬ～１００ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは２５ｍｇ／ｍＬ～９５ｍｇ／ｍＬであり、より好ましくは５０ｍｇ／ｍＬ又は２５ｍｇ／ｍＬである、ことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記緩衝液は、酢酸－酢酸ナトリウム緩衝液、クエン酸－クエン酸ナトリウム緩衝液、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液から選択され、好ましくはヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液であり、前記緩衝液の濃度は、１０ｍＭ～１００ｍＭであり、好ましくは１５ｍＭ～３０ｍＭであり、より好ましくは２０ｍＭである、ことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記タンパク質安定剤は、塩化ナトリウム、グリシン、塩酸アルギニン、スクロース、トレハロース、マンニトール、ソルビトールから選択され、好ましくはスクロース、トレハロースであり、前記タンパク質安定剤の濃度は、１％～１０％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは２％（ｗ／ｖ）、４．５％（ｗ／ｖ）又は８％（ｗ／ｖ）であり、より好ましくは８％（ｗ／ｖ）である、ことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項8】
前記界面活性剤は、ポリソルベート、ポロキサマー、グリセリン脂肪酸エステルから選択され、好ましくはポロキサマー１８８であり、前記界面活性剤の濃度は、０．０１％～０．１％（ｗ／ｖ）であり、好ましくは０．０２％（ｗ／ｖ）、０．０４％（ｗ／ｖ）、０．０６％（ｗ／ｖ）又は０．０８％（ｗ／ｖ）である、ことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項9】
前記医薬組成物のｐＨは、約４．５～７．５であり、好ましくは４．５～６．５であり、より好ましくは６である、ことを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項10】
ａ）濃度が２５ｍｇ／ｍＬ～９５ｍｇ／ｍＬであるＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質、ｂ）濃度が１５ｍＭ～３０ｍＭで、ｐＨが５．５～６．５であるヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液、
ｃ）濃度が２％～８％（ｗ／ｖ）であるトレハロース、及び
ｄ）濃度が０．０４％（ｗ／ｖ）であるポロキサマー１８８、を含み
好ましくは、前記医薬組成物は、液体形態又は凍結乾燥粉末製剤である、
請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物を製造する方法であって、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質溶液を緩衝液により置換するステップを含み、前記緩衝液は、ヒスチジン－塩酸ヒスチジン緩衝液であり、前記緩衝液の濃度は、２０ｍＭであり、前記緩衝液のｐＨは、好ましくは６であり、
好ましくは、製造方法は、凍結乾燥のステップをさらに含み、
前記凍結乾燥ステップは、以下を含む：（１）真空凍結乾燥機の乾燥箱を－４５℃に降温して３時間～５時間保持し、（２）乾燥箱の温度を－５℃に昇温して３時間～５時間保持し、（３）乾燥箱の温度を－４５℃に降温して３時間～５時間保持し、ステップ（１）～（３）の予備凍結の過程において、昇温降温速度を０．５℃～１℃／ｍｉｎに保持し、（４）一次乾燥真空度を０．１ｍＢａｒとし、温度を－３０℃～－２０℃に保持し、このステップの合計時間が３０時間を超える必要があり、（５）一次乾燥後、０．１℃～０．３℃／ｍｉｎの昇温速度で２５℃に昇温して解析乾燥を開始し、真空度を０．１ｍＢａｒに１時間～２時間保持し、その後、到達真空になり、温度を不変に保持し、保持時間が１５時間を超える、
方法。
【請求項12】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物を凍結乾燥することによって得られる、ＩＬ－１５突然変異体融合タンパク質を含む凍結乾燥製剤。
【請求項13】
個体における疾患を予防及び／又は治療する薬物の製造における、請求項１～１０のいずれか一項に記載の医薬組成物、請求項１１に記載の方法によって製造される製品、又は請求項１２に記載の凍結乾燥製剤の用途であって、前記疾患は、好ましくは腫瘍又は炎症性疾患であり、好ましくは、前記腫瘍は、膠芽腫、前立腺癌、血液癌、Ｂ細胞腫瘍、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌、黒色腫、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃癌と食道癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌及び扁平上皮頭頸部癌から選択される、
用途。
【国際調査報告】