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▶ ユーシービー ビオファルマ ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】強皮症疾患の治療方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/40 20060101AFI20241024BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241024BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20241024BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241024BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C07K16/40 ZNA
A61P9/00
A61P29/00 101
A61P43/00 105
A61P17/00
A61K39/395 P
A61P37/06
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024529845
(86)(22)【出願日】2022-11-17
(85)【翻訳文提出日】2024-07-18
(86)【国際出願番号】 EP2022082293
(87)【国際公開番号】W WO2023089037
(87)【国際公開日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】2116665.7
(32)【優先日】2021-11-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524150476
【氏名又は名称】ユーシービー ビオファルマ ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ
【氏名又は名称原語表記】ＵＣＢ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ ＳＲＬ
(74)【代理人】
【識別番号】100123788
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 昭夫
(74)【代理人】
【識別番号】100127454
【弁理士】
【氏名又は名称】緒方 雅昭
(72)【発明者】
【氏名】ジョンソン、 ティモシー スコット
(72)【発明者】
【氏名】アトキンソン、 ジョン
(72)【発明者】
【氏名】ディストラー、 ジョルグ ハンス ウィルヘルム
(72)【発明者】
【氏名】アブラハム、 デヴィッド ジョン
【テーマコード（参考）】
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085BB22
4C085EE01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、限局性又は全身性強皮症等の強皮症疾患の治療に使用するための抗トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）抗体に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
強皮症疾患を有する対象の治療又は強皮症疾患の発症予防の使用のための抗トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）抗体。
【請求項2】
前記強皮症疾患が、限局性強皮症、全身性強皮症又は間質性肺疾患を伴う全身性強皮症である、請求項１に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体。
【請求項3】
前記強皮症疾患が、対象のサンプル中のマーカーの増加によって特徴付けられ、前記マーカーが、例えば、ＴＧ２発現又はＴＧ２活性の何れか１つである、前記請求項の何れか一項に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体。
【請求項4】
前記抗体は、ヒトトランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）のコア領域内のエピトープに結合し、ヒトＴＧ２活性を阻害し、前記コア領域は、ヒトＴＧ２のアミノ酸１４３～４７３からなり、阻害されるヒトＴＧ２活性は、Ｎε（γ－グルタミル）リジンのイソペプチド結合によるリジン及びグルタミンのＴＧ２架橋である、前記請求項の何れか一項に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体。
【請求項5】
抗体又はその抗原結合フラグメントが、ａ．インタクトな抗体を含むか又はインタクトな抗体からなる、
ｂ．Ｆｖフラグメント（例えば、単鎖Ｆｖフラグメント又はジスルフィド結合Ｆｖフラグメント）；Ｆａｂフラグメント；及びＦａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ）２フラグメント）からなる群より選択される抗原結合フラグメントを含むか又はそれらからなる、前記請求項の何れか一項に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体。
【請求項6】
前記抗体が以下の配列を含む、前記請求項の何れか一項に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体：（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）。
【請求項7】
前記請求項の何れか一項に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体であって、該抗体は、以下を含む、抗ＴＧ２抗体：ａ）配列番号ＮＯ：１３から配列番号Ｎｏ．２７の何れか１つに定義される配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号ＮＯ．２８から配列番号Ｎｏ．４０の何れか１つに定義される配列を有する重鎖可変ドメイン、
ｂ）配列番号ＮＯ．１３から配列番号Ｎｏ．２７の何れか１つに定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは少なくとも９０％の同一性若しくは類似性又は好ましくは少なくとも９５％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号ＮＯ．２８から配列番号Ｎｏ．４０の何れか１つに定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは少なくとも９０％の同一性若しくは類似性又は好ましくは少なくとも９５％の同一性若しくは類似性を有する重鎖可変ドメイン。
【請求項8】
請求項１から５の何れか一項に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体であって、前記抗体が、請求項６及び７の何れか一項に定義される抗体とＴＧ２への結合と競合する、抗ＴＧ２抗体。
【請求項9】
強皮症疾患を有する対象を治療するための又は対象における強皮症疾患の発症を予防するための方法であって、治療上有効な量の抗ＴＧ２抗体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項10】
強皮症疾患を有する対象の治療のための医薬の製造のための又は対象の強皮症疾患の発症予防のための抗トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野：
本発明は、限局性又は全身性強皮症（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｏｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）等の強皮症疾患（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ ｄｉｓｅａｓｅ）の治療に使用する、酵素のトランスアミダーゼ活性を阻害する抗トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）抗体に関する。
本発明は、限局性又は全身性強皮症（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｏｒ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）等の強皮症疾患（ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ ｄｉｓｅａｓｅ）の治療に使用する、酵素のトランスアミダーゼ活性を阻害する抗トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景：
組織トランスグルタミナーゼ（ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）又はトランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）は、イプシロン（ガンマ－グルタミル）リジンジペプチド結合を介してタンパク質間に架橋を形成する酵素である。ＴＧ２の高発現は、異常なタンパク質架橋を引き起こし、様々なタイプの組織瘢痕化、いくつかの脳疾患における神経原線維のもつれの形成、いくつかの癌における化学療法への抵抗性等、いくつかの病態に関連している。低分子、サイレンシングＲＮＡ又は抗体等の様々なＴＧ２阻害剤（例えば、非特許文献１、非特許文献２、特許文献１、特許文献２又は特許文献３）が、ＴＧ２が介在する疾病（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の可能性のある治療のために開示されている。
組織トランスグルタミナーゼ（ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）又はトランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）は、イプシロン（ガンマ－グルタミル）リジンジペプチド結合を介してタンパク質間に架橋を形成する酵素である。ＴＧ２の高発現は、異常なタンパク質架橋を引き起こし、様々なタイプの組織瘢痕化、いくつかの脳疾患における神経原線維のもつれの形成、いくつかの癌における化学療法への抵抗性等、いくつかの病態に関連している。低分子、サイレンシングＲＮＡ又は抗体等の様々なＴＧ２阻害剤（例えば、非特許文献１、非特許文献２、特許文献１、特許文献２又は特許文献３）が、ＴＧ２が介在する疾病（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の可能性のある治療のために開示されている。
【0003】
強皮症（全身性硬化症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）とも呼ばれる）は、免疫介在性のリウマチ性疾患であり、主に皮膚及び内臓の線維化と血管障害を特徴とする（非特許文献３及び非特許文献４）。強皮症には、全身性強皮症（ＳＳｃ）と局所性強皮症（ＬｏＳ）の２つのカテゴリがこれまでに特定されている（非特許文献３）。ＳＳｃは皮膚硬化と内臓病変を特徴とし、通常、皮膚及び／又はその下の組織に限局している。ＬｏＳは、ＬｏＳのサブタイプによって異なる臨床症状を示す慢性結合組織疾患である。
【0004】
現在、ＳＳｃの治療では免疫抑制療法が中心的な役割を担っており、シクロホスファミドはＳＳｃ間質性肺疾患（ＩＬＤ）治療の第一選択薬であり続け、呼吸機能の安定化に成功している。しかし、無視できるほどの副作用はなく、治療中止後も効果は維持されない（非特許文献５）。したがって、限局性又は全身性強皮症等の強皮症疾患の治療及び予防に使用するための、さらなる有効な治療法を同定する必要性が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】国際公開第２００６／１００６７９号
【特許文献2】国際公開第２０１２／１４６９０１号
【特許文献3】国際公開第２０１３／１７５２２９号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｓｉｅｇｅｌ ２００７
【非特許文献2】Ｗａｎｇ ２０２０
【非特許文献3】Ｃａｒｅｔａ＆Ｒｏｍｉｔｉ ２０１５
【非特許文献4】Ｄｅｎｔｏｎ＆Ｋｈａｎｎａ ２０１７
【非特許文献5】Ｂａｒｓｏｔｔｉ ２０１９
【発明の概要】
【0007】
発明の概要：
本発明の目的は、強皮症疾患の治療に使用するための又は強皮症疾患の発症予防に使用するための抗トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）抗体を提供することである。好ましくは、前記強皮症疾患は、限局性強皮症、全身性強皮症又は間質性肺疾患を伴う全身性強皮症である。
本発明の目的は、強皮症疾患の治療に使用するための又は強皮症疾患の発症予防に使用するための抗トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）抗体を提供することである。好ましくは、前記強皮症疾患は、限局性強皮症、全身性強皮症又は間質性肺疾患を伴う全身性強皮症である。
【0008】
第二の態様において、本発明は、強皮症疾患の治療のための又は発症予防のための方法であって、治療上有効な量の抗ＴＧ２抗体を投与することを含む、方法を提供する。
【0009】
第三の態様において、本発明は、強皮症疾患の治療のための又は強皮症疾患の発症予防のための医薬の製造のための、抗トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）抗体の使用に関する。
【0010】
定義：
本明細書全体は、統一された開示として関連付けられることを意図しており、本明細書に記載されている特徴の組み合わせは、例えその組み合わせが本明細書の同じ文又は段落又は節に一緒に記載されていなくても、すべて想定されていることを理解されたい。「ａ」又は「ａｎ」を用いて記載又は特許請求され得る本発明の態様に関して、文脈上より限定された意味が明確に要求されない限り、これらの用語は、「１つ又は複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味すると理解すべきである。「又は（ｏｒ）」という用語は、文脈上明確にそうでないことが要求されない限り、代替的な（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）又は一緒の（ｔｏｇｅｔｈｅｒ）項目を包含するものと理解されるべきである。本発明の態様がある特徴を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と記載されている場合、実施形態は、その特徴「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」又は「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とも考えられる。
本明細書全体は、統一された開示として関連付けられることを意図しており、本明細書に記載されている特徴の組み合わせは、例えその組み合わせが本明細書の同じ文又は段落又は節に一緒に記載されていなくても、すべて想定されていることを理解されたい。「ａ」又は「ａｎ」を用いて記載又は特許請求され得る本発明の態様に関して、文脈上より限定された意味が明確に要求されない限り、これらの用語は、「１つ又は複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味すると理解すべきである。「又は（ｏｒ）」という用語は、文脈上明確にそうでないことが要求されない限り、代替的な（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）又は一緒の（ｔｏｇｅｔｈｅｒ）項目を包含するものと理解されるべきである。本発明の態様がある特徴を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と記載されている場合、実施形態は、その特徴「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」又は「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とも考えられる。
【0011】
－ 「組織トランスグルタミナーゼ（ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）」、「トランスグルタミナーゼ２型（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｔｙｐｅ ２）」又は「ＴＧ２」という用語は、イプシロン（ガンマ－グルタミル）リジンジペプチド結合を介してタンパク質間に架橋を形成する酵素を指す。
ＴＧ２は、典型的にはＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ２１９８０（配列番号ＮＯ．４１）に記載されているアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわちヒトＴＧ２を指す。
用語「ＴＧ２」はまた、（ａ）ＴＧ２の活性を保持する配列番号ＮＯ．４１のアミノ酸配列に対して、１つ若しくは複数のアミノ酸置換、修飾、欠失若しくは挿入を有する誘導体又は（ｂ）その変異体であるタンパク質、例えば変異体は、典型的には、配列番号ＮＯ．４１に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％の同一性（又はさらに配列番号ＮＯ．４１に対して約９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性）を保持するタンパク質を指しても良い。
ＴＧ２は、典型的にはＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ２１９８０（配列番号ＮＯ．４１）に記載されているアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわちヒトＴＧ２を指す。
用語「ＴＧ２」はまた、（ａ）ＴＧ２の活性を保持する配列番号ＮＯ．４１のアミノ酸配列に対して、１つ若しくは複数のアミノ酸置換、修飾、欠失若しくは挿入を有する誘導体又は（ｂ）その変異体であるタンパク質、例えば変異体は、典型的には、配列番号ＮＯ．４１に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％の同一性（又はさらに配列番号ＮＯ．４１に対して約９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性）を保持するタンパク質を指しても良い。
【0012】
－ 「抗ＴＧ２抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ＴＧ２と結合し、そのトランスアミダーゼ活性を阻害して架橋を防ぐ抗体分子を意図している。このような抗体の例は、国際公開第２０１３／１７５２２９号に記載されている。限定はしないが、本発明に従って使用できる抗ＴＧ２抗体は、例えば、配列番号ＮＯ．２４で定義される軽鎖可変領域及び配列番号ＮＯ．３７で定義される重鎖可変領域を含む。
【0013】
－ 本明細書で使用する「抗体」という用語には、モノクロ－ナル抗体、ポリクロ－ナル抗体及び当技術分野で知られているような組換え技術によって生成される組換え抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。「抗体」には、あらゆる種の抗体、特に哺乳類の抗体、例えば、あらゆるアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）のヒト抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及び、ＩｇＧＡ１、ＩｇＧＡ２又はＩｇＭのような５量体並びにそれらの修飾バリアントを含むこれらの基本構造の２量体として産生される抗体；非ヒト霊長類抗体、例えば、チンパンジ－、ヒヒ、アカゲザル又はシノモルガン猿由来の抗体；げっ歯類抗体、例えば、マウス又はラット由来の抗体；ウサギ又はヤギ又はウマ抗体；ラクダ類抗体（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）のようなラクダ又はラマ由来の抗体）及びその誘導体；ニワトリ抗体のような鳥類種の抗体；又はサメ抗体のような魚類種の抗体、が含まれる。「抗体」という用語は、少なくとも１つの重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第１部分（ｆｉｒｓｔ ｐｏｒｔｉｏｎ）が第１種（ｆｉｒｓｔ ｓｐｅｃｉｅｓ）由来で、前記重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第２部分（ｓｅｃｏｎｄ ｐｏｒｔｉｏｎ）が第２種（ｓｅｃｏｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）由来である「キメラ」抗体も指す。本明細書で関心のあるキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザル等の旧世界サル）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体が含まれる。「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体由来の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基を、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナ－抗体）の超可変領域［又は相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）（ＣＤＲ）］の残基で置換したヒト抗体（レシピエント抗体）であり、所望の特異性、親和性及び活性を有する。ほとんどの場合、ＣＤＲの外側、すなわちフレ－ムワ－ク領域（ＦＲ）のヒト（レシピエント）抗体の残基は、対応する非ヒト残基でさらに置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナ－抗体にもない残基を含むことがある。これらの修飾は、抗体の特性をさらに洗練させるために行われる。ヒト化によって、ヒト以外の抗体のヒトにおける免疫原性が低下するため、ヒトの疾患治療への抗体の応用が容易になる。ヒト化抗体とその生成技術は当技術分野でよく知られている。また、「抗体」という用語は、ヒト化の代替として生成できるヒト抗体も指す。例えば、内在性マウス抗体の産生がなくても、免疫によりヒト抗体の全レパ－トリ－を産生できるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することは可能である。ヒト抗体／抗体フラグメントをインビトロで得るための他の方法は、ファ－ジディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）やリボソ－ムディスプレイ技術（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等のディスプレイ技術に基づくもので、少なくとも部分的に人工的に生成された、あるいはドナ－の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパ－トリ－から生成された組み換えＤＮＡライブラリ－が使用される。ヒト抗体を生成するためのファ－ジ及びリボソ－ムディスプレイ技術は当技術分野でよく知られている。ヒト抗体はまた、目的の抗原でエクスビボ免疫した単離ヒトＢ細胞から生成することもでき、その後融合させてハイブリド－マを作製し、最適なヒト抗体をスクリ－ニングすることができる。「抗体」という用語は、グリコシル化抗体及びアグリコシル化抗体の両方を指す。さらに、本明細書で使用する「抗体」という用語は、完全長抗体だけでなく、抗体フラグメント、より詳細にはその抗原結合フラグメントも指す。抗体フラグメントは、当該技術分野で知られているように、少なくとも１つの重鎖又は軽鎖免疫グロブリンドメインを含み、１つ又は複数の抗原に結合する。本発明に係る抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ－Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＢｉｓ－ｓｃＦｖフラグメントが含まれる。前記フラグメントは、ダイアボディ、トライボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ｓｄＡｂ、ＶＬ、ＶＨ、ＶＨＨ又はラクダ科抗体（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）のようなラクダ又はラマ由来）のようなシングルドメイン抗体（ｄＡｂ）及びＶＮＡＲフラグメントであることもできる。本発明に係る抗原結合フラグメントはまた、１つ又は２つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂを含むことができ、各ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、同一又は異なる標的（例えば、治療標的を結合する１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖと、例えばアルブミンを結合することによって半減期を増加させる１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖ）を結合する。このような抗体フラグメントの例としては、ＦａｂｄｓｓｃＦｖ（ＢＹｂｅ（登録商標）とも呼ばれる）又はＦａｂ－（ｄｓｓｃＦｖ）２（ＴｒＹｂｅ（登録商標）とも呼ばれ、例えば国際公開第２０１５／１９７７７２号を参照されたい）が挙げられる。上記で定義した抗体分子は、その抗原結合フラグメントを含め、当技術分野で知られている。
【0014】
－ 用語「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、抗体が結合する抗原の領域を指す。エピトープには、構造的に定義されるものと機能的に定義されるものがある。機能性エピトープは、一般に構造性エピトープのサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）であり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、コンフォメーション、すなわち非直線アミノ酸からなることもある。ある実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基又はスルホニル基等の分子の化学的に活性な表面基である決定基を含み得、及び、ある実施形態において、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有し得る。
【0015】
－ 疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｔｅ）の「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語には、（ｉ）疾患状態を抑制すること、すなわち疾患状態又はその臨床症状の発症を阻止すること、又は（ｉｉ）疾患状態を緩和すること、すなわち疾患状態又はその臨床症状を一時的又は永続的な退行を引き起こすことが含まれる。
【0016】
－ 疾患状態の「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」又は「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語には、疾患状態に曝露され得るか又は罹りやすいが、まだ疾患状態の症状を経験していない又は示していない対象において、疾患状態の臨床症状が発現しないようにすることが含まれる。
【0017】
発明の詳細な説明：
本発明は、ＴＧ２タンパク質の総量がＳＳｃ対象の皮膚（ｓｋｉｎ）及び肺線維芽細胞で増加し（特に、ＴＧ２の発現レベル及び活性がＳＳｃ線維芽細胞で増加した）、肺病変を有するＳＳｃ対象でより高レベルであるという本発明者の発見に基づく。これに対し、血清及び血漿中のＴＧ２の循環レベルは低く、ＳＳｃ対象及び対照のサブセットでのみ検出可能である。そして本発明者らは、抗ＴＧ２抗体がＳＳｃ線維芽細胞のサブセットにおいて、標準的な２Ｄ培養条件下だけでなく、全層皮膚での３Ｄ培養条件下でも細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の沈着を抑制できることを、驚くべきことに証明することができた。
本発明は、ＴＧ２タンパク質の総量がＳＳｃ対象の皮膚（ｓｋｉｎ）及び肺線維芽細胞で増加し（特に、ＴＧ２の発現レベル及び活性がＳＳｃ線維芽細胞で増加した）、肺病変を有するＳＳｃ対象でより高レベルであるという本発明者の発見に基づく。これに対し、血清及び血漿中のＴＧ２の循環レベルは低く、ＳＳｃ対象及び対照のサブセットでのみ検出可能である。そして本発明者らは、抗ＴＧ２抗体がＳＳｃ線維芽細胞のサブセットにおいて、標準的な２Ｄ培養条件下だけでなく、全層皮膚での３Ｄ培養条件下でも細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の沈着を抑制できることを、驚くべきことに証明することができた。
【0018】
本発明の主な目的は、強皮症疾患の治療に使用するための又は強皮症疾患の発症予防に使用するための抗トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）抗体である。好ましくは、強皮症疾患は、限局性強皮症又は全身性強皮症である。強皮症疾患は、間質性肺疾患を伴う全身性強皮症であることもある。例えば、本発明に係る使用のための抗ＴＧ２抗体は、以下の配列を含むことができる：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
【0019】
本発明はまた、強皮症疾患の治療のための又は発症予防のための方法であって、治療上有効量の抗ＴＧ２抗体を投与することを含む、方法を提供する。好ましくは、前記強皮症疾患は、限局性強皮症又は全身性強皮症である。前記強皮症疾患は、間質性肺疾患を伴う全身性強皮症であることもある。例えば、本発明に係る使用のための抗ＴＧ２は、以下の配列を含むことができる：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
【0020】
また、強皮症疾患の治療における医薬品を製造するための又は強皮症疾患の発症予防のための、抗トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）抗体の使用も記載されている。好ましくは、前記強皮症疾患は、限局性強皮症又は全身性強皮症である。前記強皮症疾患は、間質性肺疾患を伴う全身性強皮症であることもある。例えば、本発明に係る使用のための抗ＴＧ２は、以下の配列を含むことができる：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
【0021】
本発明全体の文脈において、強皮症疾患は、対象のサンプル中のマーカーの増加によって特徴付けられ、マーカーは、例えば、ＴＧ２発現又はＴＧ２活性の何れか１つであり、対象のサンプルは、前記疾患に関連する細胞又は組織（例えば、線維芽細胞又はケラチノサイト）である。ＴＧ２発現の増加（あるいはＴＧ２の過剰発現とも呼ばれる）は、例えば線維芽細胞やケラチノサイトにおける任意の手段によって決定することができる。ある対象のサンプルにおけるマーカーの増加は、典型的には、対象のサンプルにおける前記マーカーのレベルを、同じ組織型の正常細胞における同じマーカーのレベル（すなわち、基底レベル（ｂａｓａｌ ｌｅｖｅｌ）；例えば、基底ＴＧ２活性、基底発現レベル（ｍＲＮＡレベル及び／又はタンパク質レベル）と比較することによって決定される。少なくとも１つのマーカーのレベルが、当該マーカーの基底レベルと比較して、１０％と同一若しくはそれ以上、１５％と同一若しくはそれ以上、２０％と同一若しくはそれ以上、２５％と同一若しくはそれ以上又はさらには３０％と同一若しくはそれ以上である対象のサンプルは、当該マーカーの増加を示すとみなされる。例えば、ＴＧ２発現の増加（あるいはＴＧ２過剰発現と呼ばれる）は、対象の真皮線維芽細胞（ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）又はケラチノサイトにおけるＴＧ２ ｍＲＮＡの量を決定すること（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）によって決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）ことができる。従って、強皮症疾患細胞／組織は、例えば、正常な真皮線維芽細胞又はケラチノサイトと比較しての、対象の真皮線維芽細胞又はケラチノサイトにおけるＴＧ２ ｍＲＮＡの増加量（過剰発現を表す）によって特徴付けられる。ＴＧ２ｍＲＮＡの発現は、基底レベルと比較して、１０％と同一若しくはそれ以上、１５％と同一若しくはそれ以上、２０％若しくがそれ以上、２５％と同一若しくはそれ以上又はさらには３０％と同一若しくはそれ以上等、任意の量だけ増加させることができる。ｍＲＮＡの量は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲ、ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ａｓｓａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ノーザンブロッティング若しくはマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）の使用による、ＲＮＡ配列決定、各種ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ）等、既知の方法を用いて測定することができる。あるいは、過剰発現は、例えば真皮線維芽細胞、ケラチノサイト、肺細胞など、対象者の一部の細胞におけるＴＧ２抗原の量を測定することによって決定することができる。従って、強皮細胞は、例えば、正常な真皮線維芽細胞又はケラチノサイトと比較して、対象の真皮線維芽細胞又はケラチノサイトにおけるＴＧ２タンパク質（又はＴＧ２抗原）の量の増加（過剰発現を表す）によって特徴付けられ得る。ＴＧ２タンパク質の発現は、基底レベルと比較して、１０％と同一若しくはそれ以上、１５％と同一若しくはそれ以上、２０％と同一若しくはそれ以上、２５％と同一若しくはそれ以上又はさらには３０％と同一若しくはそれ以上等、任意の量だけ増加させることができる。タンパク質の量は、本発明の抗ＴＧ２抗体の使用を含め、免疫組織化学、ウェスタンブロッティング、質量分析又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）等の公知の方法を使用して測定することができる。発現を決定するための閾値は、使用する技術によって異なる場合があり、免疫組織化学のスコアに対して検証される場合がある。あるいは、強皮細胞は、対象の真皮線維芽細胞又はケラチノサイトにおいて、同じ組織型の正常細胞と比較してＴＧ２活性が上昇することによって特徴づけられる。ＴＧ２活性は、基底レベルと比較して、１０％と同一若しくはそれ以上、１５％と同一若しくはそれ以上、２０％と同一若しくはそれ以上、２５％と同一若しくはそれ以上又はさらには３０％と同一若しくはそれ以上等、任意の量だけ増加させることができる。ＴＧ２活性は、生検等を介して、既知の方法を用いて測定することができる。
【0022】
使用のための抗ＴＧ２抗体、治療のための方法、又は、本発明に係る抗ＴＧ２の、例えば、対象における強皮症疾患の治療若しくは予防のための、使用は、
従って、（ａ）対象からのサンプル（例えば、線維芽細胞（真皮線維芽細胞など）又はケラチノサイト）におけるＴＧ２発現又はＴＧ２活性を測定する工程、（ｂ）（ａ）から得られた測定結果を、正常な細胞／組織（例えば、線維芽細胞（真皮線維芽細胞など）又はケラチノサイト）における対応する測定結果と比較する工程、及び（ｃ）発現の増加（すなわち、ＴＧ２の過剰発現）又は活性の増加が観察された場合、対象に抗ＴＧ２抗体を投与し、これにより、強皮症疾患を治療又は予防する工程を含むことができる。
工程（ａ）で測定されるＴＧ２発現量は、ｍＲＮＡでもタンパク質量でもよく、その増加は、上述したような発現の増加であれば何でもよい。正常細胞／組織（例えば、線維芽細胞（真皮線維芽細胞など）又はケラチノサイト）における対応する測定値を、比較を行うたびに得る必要はない。前記対応する測定値は、比較が行われる前であればいつでも得ることができ、前記正常細胞／組織（例えば、線維芽細胞（真皮線維芽細胞など）又はケラチノサイト）における平均ＴＧ２発現量又はＴＧ２活性とすることができる。
従って、（ａ）対象からのサンプル（例えば、線維芽細胞（真皮線維芽細胞など）又はケラチノサイト）におけるＴＧ２発現又はＴＧ２活性を測定する工程、（ｂ）（ａ）から得られた測定結果を、正常な細胞／組織（例えば、線維芽細胞（真皮線維芽細胞など）又はケラチノサイト）における対応する測定結果と比較する工程、及び（ｃ）発現の増加（すなわち、ＴＧ２の過剰発現）又は活性の増加が観察された場合、対象に抗ＴＧ２抗体を投与し、これにより、強皮症疾患を治療又は予防する工程を含むことができる。
工程（ａ）で測定されるＴＧ２発現量は、ｍＲＮＡでもタンパク質量でもよく、その増加は、上述したような発現の増加であれば何でもよい。正常細胞／組織（例えば、線維芽細胞（真皮線維芽細胞など）又はケラチノサイト）における対応する測定値を、比較を行うたびに得る必要はない。前記対応する測定値は、比較が行われる前であればいつでも得ることができ、前記正常細胞／組織（例えば、線維芽細胞（真皮線維芽細胞など）又はケラチノサイト）における平均ＴＧ２発現量又はＴＧ２活性とすることができる。
【0023】
本発明全体の文脈において、抗ＴＧ２抗体は、ヒトトランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）のコア領域内のエピトープに結合し、ヒトＴＧ２活性を阻害し、ここで、前記コア領域は、ヒトＴＧ２のアミノ酸１４３～４７３からなり、阻害されるヒトＴＧ２活性が、Ｎε（γ－グルタミル）リジンイソペプチド結合によるリジン及びグルタミンのＴＧ２架橋である。さらに好ましくは、抗体は、ヒトＴＧ２のアミノ酸３０４～３２６を含む若しくはからなる領域又はこの領域の一部に結合する。前記抗体は、インタクトな（ｉｎｔａｃｔ）抗体を含むか又はからなる。
あるいは、Ｆｖフラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖフラグメント又はジスルフィド結合Ｆｖフラグメント）；Ｆａｂフラグメント；及びＦａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ）２フラグメント）等の抗原結合フラグメント（しかし、これらに限定されない）を含むか又はからなることができる。
好ましくは、本発明全体に係る使用する抗ＴＧ２抗体は、
ａ）以下からなる群から選択される６個のＣＤＲを含む：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、
ｂ）配列番号ＮＯ：１３から配列番号Ｎｏ．２７の何れか１つに定義される配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号ＮＯ．２８から配列番号Ｎｏ．４０の何れか１つに定義される配列を有する重鎖可変ドメイン、を含む、
ｃ）配列番号ＮＯ．１３から配列番号Ｎｏ．２７の何れか１つに定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは少なくとも９０％の同一性若しくは類似性又は好ましくは少なくとも９５％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号ＮＯ．２８から配列番号Ｎｏ．４０の何れか１つに定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは少なくとも９０％の同一性若しくは類似性又は好ましくは少なくとも９５％の同一性若しくは類似性を有する重鎖可変ドメイン、を含む、
ｄ）ヒトＴＧ２（配列番号ＮＯ．４１）のアミノ酸３０４～３２６若しくはこの領域の一部を含む又はからなるエピトープと、上記ａ）、ｂ）又はｃ）で定義した抗体との結合を競合させる。
あるいは、Ｆｖフラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖフラグメント又はジスルフィド結合Ｆｖフラグメント）；Ｆａｂフラグメント；及びＦａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ）２フラグメント）等の抗原結合フラグメント（しかし、これらに限定されない）を含むか又はからなることができる。
好ましくは、本発明全体に係る使用する抗ＴＧ２抗体は、
ａ）以下からなる群から選択される６個のＣＤＲを含む：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、
ｂ）配列番号ＮＯ：１３から配列番号Ｎｏ．２７の何れか１つに定義される配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号ＮＯ．２８から配列番号Ｎｏ．４０の何れか１つに定義される配列を有する重鎖可変ドメイン、を含む、
ｃ）配列番号ＮＯ．１３から配列番号Ｎｏ．２７の何れか１つに定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは少なくとも９０％の同一性若しくは類似性又は好ましくは少なくとも９５％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号ＮＯ．２８から配列番号Ｎｏ．４０の何れか１つに定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは少なくとも９０％の同一性若しくは類似性又は好ましくは少なくとも９５％の同一性若しくは類似性を有する重鎖可変ドメイン、を含む、
ｄ）ヒトＴＧ２（配列番号ＮＯ．４１）のアミノ酸３０４～３２６若しくはこの領域の一部を含む又はからなるエピトープと、上記ａ）、ｂ）又はｃ）で定義した抗体との結合を競合させる。
【0024】
【表A-1】
【0025】
【表A-2】
【0026】
【表A-3】
【0027】
ある抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するか又は他の抗体と結合を競合するかは、当該技術分野で知られている日常的な方法を用いて容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、前記参照抗体を飽和条件下でタンパク質又はペプチドに結合させる。次に、試験抗体がタンパク質又はペプチドに結合する能力を評価する。前記参照抗体との飽和結合後、前記試験抗体がタンパク質又はペプチドに結合できる場合、前記試験抗体は前記参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。一方、前記試験抗体が前記参照抗体との飽和結合後にタンパク質又はペプチドに結合できない場合、試験抗体は本発明の参照抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。
抗体が参照抗体と結合競合するかどうかを決定するために、上述の結合方法論（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）は２つの方向で実施される。
第一の方向では、前記参照抗体を飽和条件下でタンパク質／ペプチドに結合させ、その後、前記試験抗体のタンパク質／ペプチド分子への結合を評価する。
第二の方向では、前記試験抗体を飽和条件下でタンパク質／ペプチドに結合させ、その後、前記参照抗体のタンパク質／ペプチドへの結合を評価する。
どちらの方向でも、第一抗体（飽和抗体）のみがタンパク質／ペプチドに結合できる場合、前記試験抗体及び前記参照抗体は、タンパク質／ペプチドへの結合で競合していると結論づけられる。当業者には理解されるように、参照抗体と結合を競合する抗体は、必ずしも前記参照抗体と同一のエピトープに結合するとは限らず、重複又は隣接するエピトープに結合することによって前記参照抗体の結合を立体的に阻害することがある。
抗体が参照抗体と結合競合するかどうかを決定するために、上述の結合方法論（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）は２つの方向で実施される。
第一の方向では、前記参照抗体を飽和条件下でタンパク質／ペプチドに結合させ、その後、前記試験抗体のタンパク質／ペプチド分子への結合を評価する。
第二の方向では、前記試験抗体を飽和条件下でタンパク質／ペプチドに結合させ、その後、前記参照抗体のタンパク質／ペプチドへの結合を評価する。
どちらの方向でも、第一抗体（飽和抗体）のみがタンパク質／ペプチドに結合できる場合、前記試験抗体及び前記参照抗体は、タンパク質／ペプチドへの結合で競合していると結論づけられる。当業者には理解されるように、参照抗体と結合を競合する抗体は、必ずしも前記参照抗体と同一のエピトープに結合するとは限らず、重複又は隣接するエピトープに結合することによって前記参照抗体の結合を立体的に阻害することがある。
【0028】
２つの抗体が同じ又は重複するエピトープに結合するのは、それぞれがもう一方の抗体の抗原への結合を競合的に阻害（ブロック）する場合である。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍又は１００倍過剰の一方の抗体は、競合結合アッセイで測定した場合、他方の抗体の結合を少なくとも５０％、７５％、９０％又はさらに９９％阻害する。
あるいは、抗原内の本質的にすべてのアミノ酸変異が、一方の抗体の結合を減少又は排除し、他方の抗体の結合も減少又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを持つ。
いくつかのアミノ酸変異が、一方の抗体の結合を減少又は排除し、他方の抗体の結合も減少又は排除する場合、２つの抗体は重複するエピトープを持つ。
その後、追加のルーチン実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を実施し、前記試験抗体の結合の欠如が観察されると、実際に前記参照抗体と同じエピトープへの結合によるものなのか又は立体障害（又は別の現象）が、観察された結合の欠如の原因となっているのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー又は当技術分野で利用可能なその他の定量的若しくは定性的抗体結合アッセイを用いて実施することができる。
あるいは、抗原内の本質的にすべてのアミノ酸変異が、一方の抗体の結合を減少又は排除し、他方の抗体の結合も減少又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを持つ。
いくつかのアミノ酸変異が、一方の抗体の結合を減少又は排除し、他方の抗体の結合も減少又は排除する場合、２つの抗体は重複するエピトープを持つ。
その後、追加のルーチン実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を実施し、前記試験抗体の結合の欠如が観察されると、実際に前記参照抗体と同じエピトープへの結合によるものなのか又は立体障害（又は別の現象）が、観察された結合の欠如の原因となっているのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー又は当技術分野で利用可能なその他の定量的若しくは定性的抗体結合アッセイを用いて実施することができる。
【0029】
どのような対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）であっても、本発明に従って治療することができる。対象は人間であることが望ましい。しかし、対象は他の哺乳類動物、例えばヒト以外の霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット又はハムスターであってもよい。
【0030】
本発明全体の文脈において、強皮症疾患は、好ましくは、限局性強皮症又は全身性強皮症である。限局性強皮症には、強皮症（Ｍｏｒｐｈｅａ）、線状強皮症、好酸球性筋膜炎又は毒素誘発症候群が含まれる。全身性強皮症には、限局性強皮症（ｌｉｍｉｔｅｄ ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）、びまん性強皮症及び重複症候群が含まれる。強皮症疾患は、間質性肺疾患を伴う全身性強皮症であることもある。強皮症疾患は、皮膚、肺、肝臓、胃腸、膵臓、心臓及び／又は腎臓等の様々な組織や臓器で起こり得る。
【0031】
本発明に係る任意の抗ＴＧ２抗体は、局所、鼻腔内、皮内、静脈内、皮下又は筋肉内等（ただし、これらに限定されない）、任意の方法で対象に投与するのに適した医薬組成物に組み込むことができる。典型的には、前記医薬組成物は、抗ＴＧ２抗体と、１つ若しくは複数の薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体とを含む。
したがって、本明細書には、限局性強皮症又は全身性強皮症等の強皮症疾患の治療に使用するための医薬組成物も記載され、前記医薬組成物は、抗ＴＧ２抗体と、１つ若しくは複数の薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体とを含む。この医薬組成物は、間質性肺疾患を伴う全身性強皮症の治療に使用することもできる。本発明に係る医薬組成物は、使用説明書及び任意で、それを必要とする個体への静脈内、皮下又は筋肉内投与のための装置を含む、使用説明書付きキットの一部とすることができる。
したがって、本明細書には、限局性強皮症又は全身性強皮症等の強皮症疾患の治療に使用するための医薬組成物も記載され、前記医薬組成物は、抗ＴＧ２抗体と、１つ若しくは複数の薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体とを含む。この医薬組成物は、間質性肺疾患を伴う全身性強皮症の治療に使用することもできる。本発明に係る医薬組成物は、使用説明書及び任意で、それを必要とする個体への静脈内、皮下又は筋肉内投与のための装置を含む、使用説明書付きキットの一部とすることができる。
【0032】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」には、生理学的に適合性であり、本明細書に記載される方法及び使用のための対象への投与に適する、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容される担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等の１つ若しくは複数及びそれらの組み合わせが挙げられる。
投与経路又は製剤の種類（液体、凍結乾燥又は噴霧乾燥製剤など）に応じて、等張化剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、又は、塩化ナトリウムなどを組成物に配合することができる。薬学的に許容される担体には、湿潤若しくは乳化剤、保存剤又は緩衝剤など、抗体又は抗体部分の保存期間や有効性を高める補助物質が少量含まれていてもよい。
投与経路又は製剤の種類（液体、凍結乾燥又は噴霧乾燥製剤など）に応じて、等張化剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、又は、塩化ナトリウムなどを組成物に配合することができる。薬学的に許容される担体には、湿潤若しくは乳化剤、保存剤又は緩衝剤など、抗体又は抗体部分の保存期間や有効性を高める補助物質が少量含まれていてもよい。
【0033】
本発明に係る医薬組成物は、様々な形態であってよい。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射液又は輸液液）、分散液又は懸濁液、粉末及びリポソームなどが含まれる。好ましい形態は、意図する投与様式や治療用途によって異なる。典型的な好ましい組成物は、注射可能又は注入可能な溶液の形態であり、例えば、他の抗体によるヒトの受動免疫に使用されるものと同様の組成物である。
【0034】
本発明に係る抗ＴＧ２抗体の適切な投与量は、熟練した医師によって決定され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量は、特定の対象、組成物及び投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効であり、かつ対象に毒性でない活性成分の量を得るように変化させることができる。選択される投与量は、投与経路、投与時間、抗体の排泄速度、治療期間、特定の抗体と併用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される対象の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態及び既往歴など、さまざまな薬物動態学的要因に依存する。
【0035】
適切な用量は、例えば、治療される対象の約０．０１ｐｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、典型的には約０．１ｐｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲とすることができる。用量レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するために調整することができる。例えば、１回量を投与してもよいし、数回に分けて時間をかけて投与してもよい。本明細書で使用される投与単位形態とは、治療される対象のための単位投与量として適する物理的に離散した単位をいい、各単位は、必要な薬学的アーナと関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。投与は単回投与でも複数回投与でもよい。複数回投与は、同一又は異なる経路で、同一又は異なる部位に行うことができる。
【0036】
本発明全体から見ると、抗ＴＧ２抗体は１つ若しくは複数の他の治療薬と共投与することができる。２種類若しくはそれ以上の薬剤の併用投与は、さまざまな方法で行うことができる。両者は単一の組成物で一緒に投与してもよいし、併用療法の一部として別々の組成物で投与してもよい。例えば、一方を他方の前に投与してもよいし、別々に投与してもよいし、他方の後に投与してもよいし、順次投与してもよいし、他方と同時に投与してもよいし、同時に投与してもよい。
【図面の簡単な説明】
【0037】
【図1】ＴＧ２検出ＭＳＤを使用したＳＳｃ対象及び健常対照サンプルの血清中のＴＧ２検出。データは個々のデータポイント及び平均値±ＳＥＭで示す。
【0038】
【図2】ＴＧ２検出ＭＳＤを使用したＳＳｃ対象及び健常対照サンプルの血漿中のＴＧ２検出。データは、箱髭図（ｂｏｘ ａｎｄ ｗｈｉｓｋｅｒ ｐｌｏｔ）で示し、箱は１０～９０パーセンタイル、個々の値はその外側に示す（＊＊＝ｐ＜０．０１）。
【0039】
【図3】Ａ）ＳＳｃ対象とマッチした健常人のパラフィン包埋皮膚切片におけるＴＧ２免疫蛍光染色。ドット（ｄｏｔ）は個々の対象、横線（ｌｉｎｅ）は平均±標準偏差を示す。Ｂ）ＳＳｃ関連肺線維症を伴う又は伴わないＳＳｃ対象のパラフィン包埋皮膚切片におけるＴＧ２免疫蛍光染色。０（染色なし）、１以上（中程度の染色）、２（強い染色）の範囲の半定量的評価。ドットは個々の対象、横線は平均±標準偏差を表す。
【0040】
【図4】健常及びＳＳｃ対照の凍結切片のＴＧ２免疫蛍光染色。０（染色なし）、１以上（中程度の染色）、２（強い染色）の範囲の半定量的評価。ドットは個々の対象、横線は平均±標準偏差を表す。
【0041】
【図5】ＩＡ１２を用いた、強皮症疾患スペクトラムの全体及び特定の真皮区画内でのＴＧ２発現パターンの比較。染色の発現と分布を評価し、０（染色なし）から３（最大染色）まで０．５刻みで０～３の間でスコア化した。データは５つの生検サンプルの平均染色スコア±ＳＤを表す。＊＝ｐ，０．０５。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【0042】
【図6】ＳＳｃ対照及びマッチさせた健常ボランティア（ＮＦ）由来の培養ヒト真皮又は肺線維芽細胞におけるＴＧ２抗原。データはウェスタンブロットからの平均±ＳＥＭ濃度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）データを表す。＊＝ｐ＜０．０５（ｔ検定）。
【0043】
【図7】ＳＳｃ患者及びマッチさせた健常人（ＮＦ）由来の培養ヒト真皮線維芽細胞におけるＴＧ２活性（左）。正常細胞では、抗ＴＧ２抗体ＢＢ７を適用するとＴＧ２活性が低下する（右）。ドットは個々の患者を表し、横線は平均値を示す。
【0044】
【図8】別の部位からのＳＳｃ対象及びマッチさせた健常人由来の培養ヒト真皮線維芽細胞におけるＴＧ２活性。限局性皮膚ＳＳｃ及びびまん性皮膚ＳＳｃの比較も示した。ドットは個々の対象を表し、横線は平均値を示す。＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１（ＡＮＯＶＡ）。
【0045】
【図9】肺線維症を伴う又は伴わないＳＳｃ対象由来の培養ヒト真皮線維芽細胞におけるＴＧ２活性。ドットは個々の対象を表し、横線は平均値を示す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１（ＡＮＯＶＡ）。
【0046】
【図10】ＳＳｃ対象及び健常人から分離した培養ヒト真皮線維芽細胞におけるＴＧ２発現。ＳＳｃ対象から採取した５株及びそれぞれの対照から採取した５株のウェスタンブロット（Ａ）及びその後の定量（Ｂ）。ドットは個々の対象、横線は平均±標準偏差を表す。＊＊＝ｐ＜０．０１（ｔ検定）。
【0047】
【図11】ヒト真皮線維芽細胞におけるＢＢ７のＴＧ２活性に対する阻害活性。アイソタイプ抗体９２２を対照として、ヒト真皮線維芽細胞における抗ＴＧ２抗体ＢＢ７の用量滴定。ドットは個々の対象を表し、バー（ｂａｒｓ）は平均値、エラーバーは標準偏差を表す。
【0048】
【図12】ＳＳｃ線維芽細胞におけるＥＣＭ沈着に対するＢＢ７の阻害活性（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ）。抗ＴＧ２抗体ＢＢ７又はアイソタイプ抗体９２２でインキュベートしたＴＧＦβ１刺激ＳＳｃ真皮線維芽細胞におけるフィブロネクチン（Ａ）及びコラーゲンＩ／ＩＩＩ（Ｂ）の沈着をＣＸ５ベースで定量したもの。ドットは個々の対象を表し、バーは平均値、エラーバーは標準偏差を表す。＊＝ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）。
【0049】
【図13】反応性（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）ＳＳｃ線維芽細胞株におけるＢＢ７のコラーゲン沈着の阻害活性。抗ＴＧ２抗体ＢＢ７又は対照アイソタイプ抗体９２２をインキュベートしたＳＳｃ真皮線維芽細胞のコラーゲン（Ｉ及びＩＩＩ型）沈着のＣＸ５ベースの定量化。ドットは１人の反応性対象（ｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｕｂｊｅｃｔ）の細胞の反復培養を表し、バーは平均値、エラーバーは標準偏差を表す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１）（ＡＮＯＶＡ）。
【0050】
【図14】反応性ヒト真皮線維芽細胞「株」におけるＥＣＭ沈着に対するＢＢ７の阻害活性。抗ＴＧ２抗体ＢＢ７を、アイソタイプ抗体９２２を対照として用量滴定を行い、その後ＣＸ５を用いてフィブロネクチン（Ａ）及びＩ型コラーゲン（Ｂ）の沈着を定量した。バーは平均値、エラーバーは技術的反復（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）の標準偏差を表す。＊＝ｐ＜０．０５（ＡＮＯＶＡ）。
【0051】
【図15】ヒト真皮線維芽細胞における線維芽細胞活性化及びＴＧＦβ１－Ｓｍａｄシグナル伝達のｍＲＮＡマーカーに対するＢＢ７の阻害活性。（Ａ）リアルタイムｑＰＣＲで測定したα－平滑筋アクチン（αＳＭＡ、ＡＣＴＡ２）及びＣｏｌ１ａ１のｍＲＮＡレベルに対する抗ＴＧ２抗体ＢＢ７と非標的対照抗体（いずれも濃度１０００ｎＭ）の効果。（Ｂ）リアルタイムｑＰＣＲ及びＳｉｒＣｏｌアッセイでそれぞれ測定した、上清中の代表的なＳｍａｄ標的遺伝子Ｃｔｇｆ及び可溶性コラーゲンのｍＲＮＡレベル。（Ｃ）ｐＳＭＡＤ３に対する免疫蛍光染色の平均蛍光強度の定量化。（Ｄ）Ｉ型コラーゲン、α－平滑筋アクチン（ａ－ＭＡ）及びＣＴＧＦ／ＣＣＮ２の発現をウェスタンブロッティングにより分析し、ＧＡＰＤＨの発現に対して正規化した。ウェスタンブロットの濃度測定解析（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＲＨＳパネル）。バーは平均±ＳＥＭを示す。統計的有意性はＴ－検定で試験され、＊ｐ＜０．０５であった。図Ａ）、Ｂ）及びＣ）において、ドットは個々の対象、バーは平均値及びエラーバーは技術的反復の標準偏差を表す。
【0052】
【図16】ＳＳｃ線維芽細胞及び正常線維芽細胞におけるＥＣＭ成分に対するＢＢ７の阻害活性。画像は、個々のＥＣＭ成分に対するグレイスケール（ｇｒｅｙｓｃａｌｅ）の単一チャンネル免疫蛍光画像又は合成画像である。グラフは、ＢＢ７で処理した場合としない場合のＥＣＭの存在比率を表し、ＢＢ７はＳＳｃ線維芽細胞ではＥＣＭを減少させるが、正常線維芽細胞では減少させないことを示している。
【0053】
【図17】全層皮膚モデルにおけるＥＣＭ沈着に対するＢＢ７の阻害活性。全層皮膚モデルは、分化するヒトケラチノサイトからなる完全に分極化した真皮の上に、３ＤのＥＣＭ内のヒト真皮線維芽細胞で構成されている。（Ａ）三色（Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色した代表的な組織切片と、真皮の厚さの組織学的定量化。（Ｂ）巨視的な定量化におけるゲルの厚さ。（Ｃ）筋線維芽細胞数の定量化。（Ｄ）Ｉ型コラーゲン及びハウスキーピングタンパク質β－アクチンの代表的ウェスタンブロット、（Ｅ）発現の正規化された定量化。ドットは個々の対象を表し、バーは平均値、エラーバーは技術的反復の標準偏差を表す。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）。
【0054】
【図18】ＴＧ２欠失は、皮膚におけるブレオマイシン誘発性組織学的変化からマウスを保護する。ブレオマイシンを皮内注射したＷＴ及びＴＧ２ＫＯマウスの皮膚の厚さ。ドットは個々の動物を表し、マッソン三色染色又はＰＳＲ染色した切片の皮膚の厚さを３回測定した平均値である。個々のｐ値を示す。
【0055】
【図19】（Ａ）健常対照（ＮＦ）（ｎ＝６）及び強皮症線維芽細胞（ｎ＝６）の初代線維芽細胞におけるＴＧ２（ＩＡ１２抗体）の発現をウェスタンブロット法で分析し、ＧＡＰＤＨの発現に対して正規化した。（Ｂ）健常対照（ＮＦ）の初代線維芽細胞（ｎ＝３）におけるＴＧ２発現を、線維芽細胞をＴＧＦβ１（４ｍｇ／ｍｌ）で２４時間処理した後に測定した。
【0056】
【図20】ＴＧ２阻害は、対照及びＳＳｃ真皮線維芽細胞におけるＴＧＦβ１誘導性線維化タンパク質マーカーの発現を抑制する。健常対照（ＮＦ；ｎ＝３）又は強皮症線維芽細胞（ＳＳｃ： ｎ＝１）から単離した真皮線維芽細胞を、単独又は組換えＴＧＦβ１（４ｎｇ／ｍｌ）で培養した後、対照ＩｇＧ、抗体ＢＢ７、汎ＴＧＦβ１阻害抗体の組み合わせ又はＡＬＫ５／ＴＧＦβ１ＲＩの低分子阻害剤の存在下で処理した。コラーゲンタイプＩ及びα－平滑筋アクチン（α－ＳＭＡ）の発現はウェスタンブロット法で分析した。
【0057】
【図21】初代ＳＳｃ真皮線維芽細胞における対照ＩｇＧ及び無処理と比較したＢＢ７のＴＧＦβ１発現阻害活性。データは平均発光±ＳＥＭを表す。
【0058】
【図22】ＴＧ２ノックアウトマウスの皮膚は、偏光下でより薄く、より架橋されていない。野生型及びＴＧ２欠損マウスにおいて、ピクロシリウス・レッド染色後、偏光下で緑、黄、橙及び赤のコラーゲン線維の総パーセンテージを測定した。下部の赤いバー、それに続くオレンジのバー、黄色のバー及び上部の緑のバーは、それぞれ一般的に太く架橋度の高いコラーゲン線維から細いコラーゲン線維までを示す。各群Ｎ＝６マウス。
【0059】
【図23】ＴＧ２欠失は、ブレオマイシンが誘発する皮膚のコラーゲン変化からマウスを保護する。ＷＴ及びＴＧ２ＫＯマウスにおけるブレオマイシン誘発皮膚損傷後の４ｍｍ真皮生検からのＳｉｒＣｏｌアッセイを使用した真皮コラーゲン含量。ドットは個々の対象を表す。測定値は、生理食塩水処理した対照（ＷＴマウス）との相対的な倍数変化で示した。データは、コラーゲンレベルの倍数変化として示す。ｐ＝０．０００１＊＊＊＊（ＡＮＯＶＡ）。
【0060】
【図24】スクラッチ創傷評価を使用した真皮線維芽細胞の遊走の評価。初代真皮線維芽細胞をコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで培養し、単層をスクラッチして単層に単一の損傷を誘発した。左のパネルは創傷後０時間の時点を示す。中央及び右のパネルは、それぞれＷＴとＴＧ２欠損線維芽細胞集団の４８時間後のスクラッチ修復を示す。上及び下のパネルはそれぞれＴＧＦβ１非存在下及び存在下である。パネルは０．５％ＢＳＡ存在下である。
【0061】
【図25】３Ｄコラーゲンゲル収縮アッセイを使用した生体力学的力。摘出皮膚培養由来のＷＴ及びＴＧ２ＫＯ線維芽細胞集団を３Ｄコラーゲンゲルに配置した。収縮のレベルは、ＴＧＦβ１の非存在下又は存在下で４８時間後に評価した。収縮は、収縮後のゲル重量の定量によって決定した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＝ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡ）。
【0062】
実施例：
素材：
抗ＴＧ２抗体：
－ 実施例で使用した抗ＴＧ２ ｍＡｂの一つはＢＢ７であり、配列番号ＮＯ．１９で定義される軽鎖可変領域及び配列番号ＮＯ．３２で定義される重鎖可変領域を含んでいた。
－ 実施例で使用された別の抗ＴＧ２ ｍＡｂは、配列番号ＮＯ．２５で定義される軽鎖可変領域及び配列番号ＮＯ．３８で定義される重鎖可変領域を含んでいた。これはオリジナルのＢＢ７をウサギ化したバージョン（ｒａｂｂｉｔｉｓｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）であり、本明細書では以下の実施例においてｒｂＢＢ７又はｍＡｂ１と命名する。ヒトＴＧ２に対するＩＣ５０は両者とも同程度であるため（データは示さず）、以下の実施例では、入手可能性に応じて両者を使い分けている。
Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂ（ＵＣＢ７８５８としても知られる、抗体ＤＣ１由来）は、配列番号ＮＯ．２４に係る可変軽鎖及び配列番号ＮＯ．３７に係る可変重鎖を有する抗ＴＧ２抗体で、ヒトＴＧ２に特異的に結合するヒト化抗体である。ウサギ、ｍＡｂ１（ｒｂＢＢ７）のような動物モデルでその効果を模倣できるように、ｒｂＢＢ７が開発された。Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂ／ＤＣ１及びｒｂＢＢ７／ＢＢ７は同様の挙動を示すことが示されている。これらは、ＴＧ２コアの同じエピトープ（配列番号Ｎｏ．４１のａａ ３１３－３２５）に結合し、ヒトＴＧ２に対して、ほぼ同じＩＣ５０（０．２５対０．３ｎＭ）及びＫｄ（＜５０対＜６０ｐｍ）を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞ベースの評価においてＥＣＭの蓄積を同等に阻害する。唯一の顕著な違いは、ウサギＴＧ２に対するＺａｍｐｉｌｉｍａｂのＩＣ５０が劣っていることである（１０３対８ｎＭ）。したがって、ＢＢ７／ｒｂＢＢ７を使用した以下の実施例から得られた知見は、Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂ及び本明細書に記載したような他の抗ＴＧ２抗体にも十分に適用可能である。
素材：
抗ＴＧ２抗体：
－ 実施例で使用した抗ＴＧ２ ｍＡｂの一つはＢＢ７であり、配列番号ＮＯ．１９で定義される軽鎖可変領域及び配列番号ＮＯ．３２で定義される重鎖可変領域を含んでいた。
－ 実施例で使用された別の抗ＴＧ２ ｍＡｂは、配列番号ＮＯ．２５で定義される軽鎖可変領域及び配列番号ＮＯ．３８で定義される重鎖可変領域を含んでいた。これはオリジナルのＢＢ７をウサギ化したバージョン（ｒａｂｂｉｔｉｓｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）であり、本明細書では以下の実施例においてｒｂＢＢ７又はｍＡｂ１と命名する。ヒトＴＧ２に対するＩＣ５０は両者とも同程度であるため（データは示さず）、以下の実施例では、入手可能性に応じて両者を使い分けている。
Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂ（ＵＣＢ７８５８としても知られる、抗体ＤＣ１由来）は、配列番号ＮＯ．２４に係る可変軽鎖及び配列番号ＮＯ．３７に係る可変重鎖を有する抗ＴＧ２抗体で、ヒトＴＧ２に特異的に結合するヒト化抗体である。ウサギ、ｍＡｂ１（ｒｂＢＢ７）のような動物モデルでその効果を模倣できるように、ｒｂＢＢ７が開発された。Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂ／ＤＣ１及びｒｂＢＢ７／ＢＢ７は同様の挙動を示すことが示されている。これらは、ＴＧ２コアの同じエピトープ（配列番号Ｎｏ．４１のａａ ３１３－３２５）に結合し、ヒトＴＧ２に対して、ほぼ同じＩＣ５０（０．２５対０．３ｎＭ）及びＫｄ（＜５０対＜６０ｐｍ）を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞ベースの評価においてＥＣＭの蓄積を同等に阻害する。唯一の顕著な違いは、ウサギＴＧ２に対するＺａｍｐｉｌｉｍａｂのＩＣ５０が劣っていることである（１０３対８ｎＭ）。したがって、ＢＢ７／ｒｂＢＢ７を使用した以下の実施例から得られた知見は、Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂ及び本明細書に記載したような他の抗ＴＧ２抗体にも十分に適用可能である。
【0063】
抗ＴＧ２抗体ＩＡ１２：
以下の実施例で使用された抗ＴＧ２ ｍＡｂは、配列番号ＮＯ．２６で定義される軽鎖可変領域及び配列番号ＮＯ．３９で定義される重鎖可変領域を含んでいた。以下の実施例ではｍＡｂ２と命名されている。この抗体はＢＢ７／Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂのエピトープとは異なるエピトープに結合する。
以下の実施例で使用された抗ＴＧ２ ｍＡｂは、配列番号ＮＯ．２６で定義される軽鎖可変領域及び配列番号ＮＯ．３９で定義される重鎖可変領域を含んでいた。以下の実施例ではｍＡｂ２と命名されている。この抗体はＢＢ７／Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂのエピトープとは異なるエピトープに結合する。
【0064】
抗体９２２：
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素と結合する対照抗体である。
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ毒素と結合する対照抗体である。
【0065】
方法：
ヒトサンプル：
Ｆｒｉｅｄｅｒｉｃｈ－Ａｌｅｘａｎｄｅｒ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｒｌａｎｇｅｎ－Ｎｕｒｅｍｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｏｙａｌ Ｆｒｅｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｌｏｎｄｏｎより入手した。
ヒトサンプル：
Ｆｒｉｅｄｅｒｉｃｈ－Ａｌｅｘａｎｄｅｒ－Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｒｌａｎｇｅｎ－Ｎｕｒｅｍｂｅｒｇ ａｎｄ Ｒｏｙａｌ Ｆｒｅｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｌｏｎｄｏｎより入手した。
【0066】
血清、血漿及び尿サンプル中のＴＧ２の評価：
ＬＧＣプロトコルを用いたＭＳＤ（登録商標）アッセイを使用した。プレート（ｐｌａｔｅｄ）は、ＭＳＤ ＳＩ６００で測定した。
ＬＧＣプロトコルを用いたＭＳＤ（登録商標）アッセイを使用した。プレート（ｐｌａｔｅｄ）は、ＭＳＤ ＳＩ６００で測定した。
【0067】
組織サンプルの調製：
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した皮膚サンプルを連続切片化し、ＳＳｃ／線維症の程度とＴＧ２を関連付けるために染色した。染色は、コラーゲン量、組織トランスグルタミナーゼ２型タンパク質の発現及び酵素活性によって測定されるＳＳｃ／線維症を評価するために行った。
ホルマリン固定し、パラフィン包埋した皮膚サンプルを連続切片化し、ＳＳｃ／線維症の程度とＴＧ２を関連付けるために染色した。染色は、コラーゲン量、組織トランスグルタミナーゼ２型タンパク質の発現及び酵素活性によって測定されるＳＳｃ／線維症を評価するために行った。
【0068】
ＴＧ２抗原及び活性免疫組織化学：
ＴＧ２抗原及びイソペプチダーゼ活性（ＩＳＡ）は、標準プロトコルに従って、肺組織の凍結スライス（採取時に３０％スクロースで膨潤させ、その後スナップ凍結したもの）を免疫染色することにより検出した。
ＴＧ２抗原及びイソペプチダーゼ活性（ＩＳＡ）は、標準プロトコルに従って、肺組織の凍結スライス（採取時に３０％スクロースで膨潤させ、その後スナップ凍結したもの）を免疫染色することにより検出した。
【0069】
ＴＧ２の発現：
組織学的検査では、経験豊富な科学者によって半定量的に（ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ）スコア化され、ウェスタンブロットでは、濃度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）によって決定された。
組織学的検査では、経験豊富な科学者によって半定量的に（ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ）スコア化され、ウェスタンブロットでは、濃度測定（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）によって決定された。
【0070】
ウェスタンブロット：
ウェスタンブロットは標準プロトコルに従って実施した。膜は、ＴＧ２に対する抗体（１：１００希釈）、β－アクチンに対する抗体（１：５０００希釈）、α－ＳＭＡに対する抗体（７１ｎｇ／ｍＬ）、コラーゲンＩ型／Ｃｏｌ－１に対する抗体（０．４μｇ／ｍＬ）、又はＧＡＰＤＨに対する抗体（０．２μｇ／ｍＬ）と一晩インキュベートした。その後、膜を二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。強化化学発光（ＥＣＬ）を用いてブロットを明らかにした。成長因子処理では、細胞をＴＧＦβ（４ｎｇ／ｍｌ）とインキュベートし、さらに２４時間インキュベートした後、ウェスタンブロット分析用に溶解した。
ウェスタンブロットは標準プロトコルに従って実施した。膜は、ＴＧ２に対する抗体（１：１００希釈）、β－アクチンに対する抗体（１：５０００希釈）、α－ＳＭＡに対する抗体（７１ｎｇ／ｍＬ）、コラーゲンＩ型／Ｃｏｌ－１に対する抗体（０．４μｇ／ｍＬ）、又はＧＡＰＤＨに対する抗体（０．２μｇ／ｍＬ）と一晩インキュベートした。その後、膜を二次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。強化化学発光（ＥＣＬ）を用いてブロットを明らかにした。成長因子処理では、細胞をＴＧＦβ（４ｎｇ／ｍｌ）とインキュベートし、さらに２４時間インキュベートした後、ウェスタンブロット分析用に溶解した。
【0071】
ＴＧ２ ＭＳＤ：
患者血漿中のＴＧ２は、標準プロトコルに従ってＭＳＤアッセイで測定した。
患者血漿中のＴＧ２は、標準プロトコルに従ってＭＳＤアッセイで測定した。
【0072】
細胞外ＴＧ活性評価：
細胞を９６ウェルプレートで７日間培養した。培地を１ｍＭのカルシウムと１００ｕＭのビオチン－カダベリン（ｂｉｏｔｉｎ－ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）を含む培地に交換した。これを３７度で１時間インキュベートした後、１０ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗浄した。その後、細胞を５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＲＩＳ中の０．２５ｍｏｌ／Ｌ水酸化アンモニウム１００μＬで５分間溶解した。溶解した細胞をＰＢＳで洗浄し、５％ＢＳＡで３０分間ブロックした（ｂｌｏｃｋｅｄ）。ブロッキング緩衝液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を除去し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰをＲＴで１時間添加した。その後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬのＴＭＢ溶液を加え、５～１０分間発色させた。５０μＬのストップ液を加え、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
細胞を９６ウェルプレートで７日間培養した。培地を１ｍＭのカルシウムと１００ｕＭのビオチン－カダベリン（ｂｉｏｔｉｎ－ｃａｄａｖｅｒｉｎｅ）を含む培地に交換した。これを３７度で１時間インキュベートした後、１０ｍＭ ＥＤＴＡで２回洗浄した。その後、細胞を５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＴＲＩＳ中の０．２５ｍｏｌ／Ｌ水酸化アンモニウム１００μＬで５分間溶解した。溶解した細胞をＰＢＳで洗浄し、５％ＢＳＡで３０分間ブロックした（ｂｌｏｃｋｅｄ）。ブロッキング緩衝液（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）を除去し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ＨＲＰをＲＴで１時間添加した。その後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬのＴＭＢ溶液を加え、５～１０分間発色させた。５０μＬのストップ液を加え、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【0073】
全層皮膚相当（Ｆｕｌｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｓｋｉｎ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）（３Ｄ皮膚モデル）：
線維芽細胞をコラーゲン中和液（ＤＭＥＭ、子牛胎児血清、ＨＥＰＥＳ及びコンドロイチン硫酸を含む）に懸濁し、Ｉ型ラットコラーゲンと混合した。この溶液をトランズウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）に分注した。コラーゲンを重合させるために３７℃で４５分間インキュベートした後、ＤＭＥＭ－Ｆ１２（熱不活性化ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン及びアムホテリシンＢをさらに含む）をコラーゲンマトリックスの上部の各トランズウェル内に加えた。翌日、ケラチノサイトを加えた。添加する前に、ケラチノサイトをアキュターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて注意深く剥離し、遠心分離して、０．５．１０６ケラチノサイトをＥ２培地（Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＣａＣｌ２を添加したＥｐｉＬｉｆｅ基礎培地）に再懸濁した。トランズウェルの培地もＥ２培地に交換した。翌日、培地をＥ３（２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩及びケラチノサイト増殖因子を添加したＥ２培地）に変更した。培地をトランズウェル上部から除去し、ケラチノサイト層を空気に曝露した。３日目以降、Ｅ３培地は１日おきに交換した。サンプルのサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）では、培地交換ごとにＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍＬ）と抗体（ＢＢ７又は対照抗体、いずれも１０００ｎＭ）を添加した。
線維芽細胞をコラーゲン中和液（ＤＭＥＭ、子牛胎児血清、ＨＥＰＥＳ及びコンドロイチン硫酸を含む）に懸濁し、Ｉ型ラットコラーゲンと混合した。この溶液をトランズウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）に分注した。コラーゲンを重合させるために３７℃で４５分間インキュベートした後、ＤＭＥＭ－Ｆ１２（熱不活性化ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン及びアムホテリシンＢをさらに含む）をコラーゲンマトリックスの上部の各トランズウェル内に加えた。翌日、ケラチノサイトを加えた。添加する前に、ケラチノサイトをアキュターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて注意深く剥離し、遠心分離して、０．５．１０６ケラチノサイトをＥ２培地（Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ペニシリン／ストレプトマイシン及びＣａＣｌ２を添加したＥｐｉＬｉｆｅ基礎培地）に再懸濁した。トランズウェルの培地もＥ２培地に交換した。翌日、培地をＥ３（２－ホスホ－Ｌ－アスコルビン酸三ナトリウム塩及びケラチノサイト増殖因子を添加したＥ２培地）に変更した。培地をトランズウェル上部から除去し、ケラチノサイト層を空気に曝露した。３日目以降、Ｅ３培地は１日おきに交換した。サンプルのサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）では、培地交換ごとにＴＧＦβ（１０ｎｇ／ｍＬ）と抗体（ＢＢ７又は対照抗体、いずれも１０００ｎＭ）を添加した。
【0074】
ＴＧＦβ１評価：
４人のｄｃＳＳＣ患者由来の細胞の初代培養を、１０００ｎＭのＢＢ７又は対照ＩｇＧで処理しながら４８時間培養した。その後培地を除去し、ミンク肺細胞バイオアッセイを用いて活性型ＴＧＦβ１のレベルを一晩測定した（標準プロトコルに従う）。
４人のｄｃＳＳＣ患者由来の細胞の初代培養を、１０００ｎＭのＢＢ７又は対照ＩｇＧで処理しながら４８時間培養した。その後培地を除去し、ミンク肺細胞バイオアッセイを用いて活性型ＴＧＦβ１のレベルを一晩測定した（標準プロトコルに従う）。
【0075】
スクラッチ創傷評価：
創傷閉鎖評価（ｗｏｕｎｄ ｃｌｏｓｕｒｅ ａｓｓａｙｓ）は、ＷＴマウス又はＴＧ２ＫＯマウスの線維芽細胞の単層を傷つけ、滅菌したプラスチック製ピペットチップでコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な細胞単層上に無細胞株を作製して実施した。その後、クリアリングスペース（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｐａｃｅ）への細胞の移動を４８時間モニターし、標準プロトコルに従って写真を撮った。細胞は、０．５％ＢＳＡ（陰性対照、ＦＢＳなし）又は１０％ＦＢＳ（陽性対照）で、単独又は０．１％ ２ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１とともに処理した。
創傷閉鎖評価（ｗｏｕｎｄ ｃｌｏｓｕｒｅ ａｓｓａｙｓ）は、ＷＴマウス又はＴＧ２ＫＯマウスの線維芽細胞の単層を傷つけ、滅菌したプラスチック製ピペットチップでコンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）な細胞単層上に無細胞株を作製して実施した。その後、クリアリングスペース（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｐａｃｅ）への細胞の移動を４８時間モニターし、標準プロトコルに従って写真を撮った。細胞は、０．５％ＢＳＡ（陰性対照、ＦＢＳなし）又は１０％ＦＢＳ（陽性対照）で、単独又は０．１％ ２ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１とともに処理した。
【0076】
３Ｄコラーゲンマトリックス収縮：
２４ウェル組織培養プレートは、ゲルがプラスチックに結合するのを防ぐため、滅菌した２％ウシ血清アルブミンをＰＢＳに溶かしたもの（２ｍｌ／ウェル）でプレコートした（ｐｒｅｃｏａｔｅｄ）。ゲル収縮評価（Ｇｅｌ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１．０ｍｇ／ｍｌウシＩ型コラーゲン、ＷＴ若しくはＴＧ２ＫＯマウスの線維芽細胞／周皮細胞８×１０４個を加えた２ｍｌのＤＭＥＭを３７℃で３時間ゲル化させた後、皿（ｄｉｓｈ）からゲルを放出して実施した。ゲルの収縮は、４８時間を通してゲル重量の減少とゲル直径の減少によって定量化された。その後、ゲルを１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）又は２ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１を含むＤＭＥＭで処理し、機械的張力が発現するように４８時間維持した。収縮を開始させるために、滅菌ピペットチップを使って培養皿からゲルを静かに放出し、４８時間を通して収縮をモニターした。
２４ウェル組織培養プレートは、ゲルがプラスチックに結合するのを防ぐため、滅菌した２％ウシ血清アルブミンをＰＢＳに溶かしたもの（２ｍｌ／ウェル）でプレコートした（ｐｒｅｃｏａｔｅｄ）。ゲル収縮評価（Ｇｅｌ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙｓ）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１．０ｍｇ／ｍｌウシＩ型コラーゲン、ＷＴ若しくはＴＧ２ＫＯマウスの線維芽細胞／周皮細胞８×１０４個を加えた２ｍｌのＤＭＥＭを３７℃で３時間ゲル化させた後、皿（ｄｉｓｈ）からゲルを放出して実施した。ゲルの収縮は、４８時間を通してゲル重量の減少とゲル直径の減少によって定量化された。その後、ゲルを１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）又は２ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ１を含むＤＭＥＭで処理し、機械的張力が発現するように４８時間維持した。収縮を開始させるために、滅菌ピペットチップを使って培養皿からゲルを静かに放出し、４８時間を通して収縮をモニターした。
【0077】
統計分析：
統計学的有意差は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ８．４３を用い、一元配置分散分析（ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）又は対応のないスチューデントの両側検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）により算出した。ｐ値＜０．０５を有意とした。
統計学的有意差は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ又はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ８．４３を用い、一元配置分散分析（ｏｎｅ ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）又は対応のないスチューデントの両側検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｓｔｕｄｅｎｔ ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ ｔ－ｔｅｓｔ）により算出した。ｐ値＜０．０５を有意とした。
【0078】
実施例１－強皮症患者におけるＴＧ２の発現：
この研究の目的は、コラーゲンの存在とＴＧ２の発現が強皮症及びその重症度と相関しているかどうかを調べることであった。２００人のＳＳｃ対象と２６人の健康なボランティアの血清サンプルにおけるＴＧ２の存在を評価した。ＴＧ２は、２００人のＳＳｃ対象のうち２９人、２６人の健常人のうち２人でしか検出されなかった（図１）。ＴＧ２陽性の対象とＴＧ２陰性の対象とでは、疾患サブタイプ、抗体プロファイル、疾患期間、疾患活動性、臓器病変、潜在的疾患修飾性抗リウマチ薬による治療に関して差はなかった。
上記分析の血清サンプルに加え、７６人のＳＳｃ対象と２０人の健康なボランティアの血漿サンプル中のＴＧ２の存在も評価した。これらのサンプルでは、ＳＳｃ患者の血漿中のＴＧ２が対照と比較して明らかに増加していた（図２）。
その後、３０人のＳＳｃ対象と２０人の健康なボランティアの尿サンプルを分析し、ＴＧ２の存在を検出した。このタンパク質は、どのサンプルからも検出されなかった。
血清、血漿及び尿サンプルから明確な臨床的サブタイプが特定されなかったため、対象を含めるために、認知された臨床的表現型に従って対象を分類した：
・進行性／活動性の疾患、
・疾患が安定又は退行している対象、
・確立した疾患（すなわち＞５年）を有する対象、
・新たに診断された疾患（＜１８ヵ月）を有する対象、
・主要な線維性内臓病変を伴う。
この研究の目的は、コラーゲンの存在とＴＧ２の発現が強皮症及びその重症度と相関しているかどうかを調べることであった。２００人のＳＳｃ対象と２６人の健康なボランティアの血清サンプルにおけるＴＧ２の存在を評価した。ＴＧ２は、２００人のＳＳｃ対象のうち２９人、２６人の健常人のうち２人でしか検出されなかった（図１）。ＴＧ２陽性の対象とＴＧ２陰性の対象とでは、疾患サブタイプ、抗体プロファイル、疾患期間、疾患活動性、臓器病変、潜在的疾患修飾性抗リウマチ薬による治療に関して差はなかった。
上記分析の血清サンプルに加え、７６人のＳＳｃ対象と２０人の健康なボランティアの血漿サンプル中のＴＧ２の存在も評価した。これらのサンプルでは、ＳＳｃ患者の血漿中のＴＧ２が対照と比較して明らかに増加していた（図２）。
その後、３０人のＳＳｃ対象と２０人の健康なボランティアの尿サンプルを分析し、ＴＧ２の存在を検出した。このタンパク質は、どのサンプルからも検出されなかった。
血清、血漿及び尿サンプルから明確な臨床的サブタイプが特定されなかったため、対象を含めるために、認知された臨床的表現型に従って対象を分類した：
・進行性／活動性の疾患、
・疾患が安定又は退行している対象、
・確立した疾患（すなわち＞５年）を有する対象、
・新たに診断された疾患（＜１８ヵ月）を有する対象、
・主要な線維性内臓病変を伴う。
【0079】
染色には抗体ＩＡ１２を使用した。経験豊富な研究者が盲検下で、染色がない場合を０点、中程度の染色を１点、強い染色を２点として切片を採点した。５６人のＳＳｃ対象と１３人の対照の皮膚切片を染色し、半定量的評価（ｓｅｍｉｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）のために観察した（図３Ａ）。その結果、ＳＳｃでは対照と比較して染色性（ｓｔａｉｎｉｎｇ）が増加していることが強調された。びまん性皮膚ＳＳｃ（ｄｃＳＳｃ）は限局性皮膚ＳＳｃ（ｌｃＳＳｃ）と比較して、より強い染色性を示した。さらに、肺線維症を伴うＳＳｃ対象は、肺線維症を伴わないＳＳｃ対象よりも強い染色性を示した（図３Ｂ）。炎症性浸潤におけるＴＧ２染色プロファイルの上昇は、ＤｃＳＳｃの非病変及び病変組織で顕著である（図３Ａ）。疾患期間、炎症サブタイプ、他臓器病変等の他の臨床的特徴は、ＴＧ２発現の変化とは関連しなかった。
【0080】
ＴＧ２が活性を持ち、抗体で標的になるためには、細胞外に存在する必要がある。これは、ＴＧ２（抗原）及びＴＧ２ ＩＳＡ（活性）に対する免疫蛍光を用いて評価することができる。１８人の健常人の皮膚凍結切片を染色したところ、２人の対象で弱から中程度の染色がみられた以外は、ＴＧ２染色がないか、皮膚の表皮層に限定されたＴＧ２染色がみられた（図４）。これに対し、ｄｃＳＳｃ及びＩＬＤに富むＳＳｃ対象からの１４の凍結切片の染色では、表皮だけでなく真皮、特に乳頭状真皮にもＴＧ２染色が認められた（データは示さず）。
【0081】
図５は、強皮症疾患スペクトラムにおけるＴＧ２の発現パターンを比較することを目的とする。真皮線維芽細胞におけるＴＧ２発現の上昇プロファイルは、ＤｃＳＳｃ病変部、確立したＳＳｃ及び２つのタイプの強皮症（Ｍｏｒｐｈｅａ）の真皮で観察されたが、ＬｃＳＳｃ及び非病変性ＤｃＳＳｃでは発現レベルに変化はなかった（図５Ｃ）。ＴＧ２の血管及び血管周囲の染色レベルは、確立したＳＳｃでわずかに増加した以外は、強皮症疾患のスペクトラムにわたって変化しなかった。ＬｃＳＳｃサンプルではＴＧ２血管染色レベルの減少が観察された（図５Ｄ）。炎症性浸潤におけるＴＧ２染色プロファイルの上昇は、ＤｃＳＳｃ非病変及び病変組織、そして確立したＳＳｃで顕著である。しかし、ＬｃＳＳｃの炎症性浸潤におけるＴＧ２染色は変化していなかった（図５Ｂ）。表皮層内のケラチノサイトにおけるＴＧ２発現レベルは、健常対照（ＨＣ）と強皮症組織で均一に分布している。ＤｃＳＳｃの非病変サンプルとＬｃＳＳｃでは、染色レベルのわずかな減少が認められた（図５Ｅ）。ＴＧ２抗原は、ＳＳｃ患者及び健常ボランティアの真皮及び肺線維芽細胞でウェスタンブロット法により測定された。
【0082】
実施例１の結論：
これらの結果は、ＴＧ２が強皮症の病変組織で高発現していること、また皮膚内でＴＧ２が広く分布し、表皮の細胞、線維化した真皮細胞、線維芽細胞様細胞、炎症細胞を含む多くの細胞型と関連していること、さらに微小血管系とも密接に関連していることを示している。
これらの結果は、ＴＧ２が強皮症の病変組織で高発現していること、また皮膚内でＴＧ２が広く分布し、表皮の細胞、線維化した真皮細胞、線維芽細胞様細胞、炎症細胞を含む多くの細胞型と関連していること、さらに微小血管系とも密接に関連していることを示している。
【0083】
実施例２－ヒト初代細胞を用いた介入研究：
最初に、ＴＧ２抗原をｄｃＳＳｃ患者の真皮及び肺線維芽細胞並びにｌｃＳＳｃ患者の真皮線維芽細胞で評価したところ、健常対照の細胞と比較して患者細胞で上昇していることが示された（図６）。ＴＧ２活性も評価され、ＳＳｃ患者の線維芽細胞で上昇していることが示された。正常線維芽細胞におけるＴＧ２活性は、ＢＢ７抗体処理によって低下することが示された（図７）。
最初に、ＴＧ２抗原をｄｃＳＳｃ患者の真皮及び肺線維芽細胞並びにｌｃＳＳｃ患者の真皮線維芽細胞で評価したところ、健常対照の細胞と比較して患者細胞で上昇していることが示された（図６）。ＴＧ２活性も評価され、ＳＳｃ患者の線維芽細胞で上昇していることが示された。正常線維芽細胞におけるＴＧ２活性は、ＢＢ７抗体処理によって低下することが示された（図７）。
【0084】
次に、ＴＧ２活性を２番目の部位の培養ヒト真皮線維芽細胞で評価した。ＳＳｃ線維芽細胞では、健常人の線維芽細胞と比較してＴＧ２活性の上昇が検出された（図８）。さらに、びまん性皮膚ＳＳｃ対象は限局性皮膚ＳＳｃ対照よりも高レベルを示した。
【0085】
数が少なすぎて正確な統計的評価はできなかったが、肺病変のある対象の線維芽細胞はＴＧ２レベルが高い傾向があった（図９）。ＳＳｃ対象及び健常ボランティア由来の真皮線維芽細胞におけるＴＧ２の総レベルをウェスタンブロットで定量した（図１０、図１９Ａ）。ＴＧ２の総レベルは、ＳＳｃ線維芽細胞において、マッチさせた健常人の線維芽細胞と比較して増加していた。ＴＧＦβ１で２４時間前処理すると、健常ボランティアの真皮線維芽細胞ではＴＧ２が増加し、ＳＳｃの真皮細胞の一部でみられるのと同様のレベルになった（図１９Ｂ）。
【0086】
さらに、阻害性ＴＧ２抗体ＢＢ７の阻害活性を、ＴＧ２活性の高い６つの真皮線維芽細胞株で検証した。以下の抗体濃度：１０００、７５０、５００、２５０、１００、５０、２５、１０、５ｎＭでＴＧ２阻害抗体の用量反応を実施し、６つの線維芽細胞株におけるＴＧ２活性に対する抗体の効果を評価した。図１１に示すように、ＢＢ７では用量依存的なＴＧ２活性の低下が観察されたが、対照抗体９２２では観察されなかった。ＴＧＦβ及び抗ＴＧ２抗体ＢＢ７を２５０及び１０００ｎＭの濃度でインキュベートした線維芽細胞株における平均マトリックス沈着（コラーゲンＩ／ＩＩＩ及びフィブロネクチン）の比較では、５つの異なる株において、対照抗体と同濃度でインキュベートした細胞と一定の統計的な差は認められなかった（図１２）。対照ＩｇＧをインキュベートしたいくつかの線維芽細胞株は、特に１０００ｎＭの用量で、フィブロネクチン及びコラーゲンＩ／ＩＩＩの沈着に対して穏やかな阻害効果を示したことは注目に値する。
【0087】
個々の線維芽細胞「株」の解析から、ＴＧ２阻害はフィブロネクチン及びコラーゲンＩ／ＩＩＩの沈着を強く減少させることが示された（図１４）。コラーゲン２，４，５及び６については、同濃度の抗ＴＧ２抗体及び対照抗体との間に差は認められなかった（データは示さず）。
【0088】
最も抗ＴＧ２反応性の高い細胞株を、用量滴定試験、リン酸化ＳＭＡＤ ２／３の変化並びにＳＭＡ、コラーゲン１及びＣＴＧＦの細胞産生の測定に使用した（図１４－１５）。抗ＴＧ２抗体でインキュベートした線維芽細胞株では、対照抗体と比較してｐＳＭＡＤ２／３のレベルに差は検出されなかった（図１５Ｃ）。ＴＧ２阻害は、ｐＳＭＡＤ２／３の基底レベルを減少させることも、ＴＧＦβ１によって誘導されたｐＳＭＡＤ２／３の蓄積を減少させることもなかった（図１５Ｃ）。さらに、抗ＴＧ２抗体でインキュベートした線維芽細胞では、対照抗体と比較してＣＴＧＦ ｍＲＮＡの減少は検出されなかった（図１５Ｂ）。しかしながら、対照抗体ではＣＴＧＦ ｍＲＮＡの穏やかなダウンレギュレーションが観察された。ＣＴＧＦ ｍＲＮＡの結果と同様に、ＣＯＬ１Ａ１ ｍＲＮＡ及びＡＣＴＡ２ ｍＲＮＡのレベルも、対照抗体と比較して、抗ＴＧ２抗体でインキュベートした線維芽細胞間で差がなかった（図１５Ａ）。ＣＴＧＦに関しては、対照抗体はＣＯＬ１Ａ１及びＡＣＴＡ２のｍＲＮＡを軽度減少させた。
【0089】
ｍＲＮＡレベルでは強い効果は観察されなかったが、図１５Ｄで強調した結果は、ＢＢ７で処理することにより、強皮症線維芽細胞によるＣｏｌ－１、α－ＳＭＡ及びＣＴＧＦタンパク質の発現が劇的かつ有意に減少したことを示している。強皮症由来の線維芽細胞における３つのマーカーのタンパク質発現レベルは、ＢＢ７非存在時の７０～９０％に低下していることがわかった。ＢＢ７で処理すると、真皮線維芽細胞をＴＧＦβ１で培養した場合にも、Ｃｏｌ－１及びα－ＳＭＡの発現が減少した（図２０）。この減少は、汎ＴＧＦβ１阻害抗体（ｐａｎ ＴＧＦβ１ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）及びＡＬＫ５の低分子阻害剤と同様であった。この減少は、健常対照（ＮＦ）から得た線維芽細胞でも、強皮症線維芽細胞でも明らかであった。健常対照線維芽細胞と比較して、強皮症線維芽細胞はＴＧＦβ１を添加しなくてもＣｏｌ－１及びα－ＳＭＡの顕著な基底レベルを示した（図２０Ｂ）。ＩｇＧ対照で処理しても、対照及び強皮症線維芽細胞には影響を与えなかった。
【0090】
これらの驚くべき発見は、ＴＧ２活性を阻害することによって、ＴＧＦβ１が駆動するＳＭＡＤシグナル伝達が変化することを示していた。これを確認するため、ＢＢ７に暴露した細胞の培地中の活性ＴＧＦβ１のレベルを、ミンク肺バイオアッセイ（ｍｉｎｋ ｌｕｎｇ ｂｉｏａｓｓａｙ）を用いて測定したところ、＞８０％減少していることが示された（図２１）。
【0091】
個々のＥＣＭ成分は免疫蛍光法で染色し、自動画像解析で定量化した。フィブロネクチン、コラーゲン１及び２（一緒に分析）、コラーゲンＩＶはすべて、ＳＳｃ線維芽細胞にＢＢ７を適用すると減少したが、健常線維芽細胞では減少しなかった（図１６）。
【0092】
実験は、皮膚複合モデルで再現した。このようなモデル化には、ＴＧ２が重要な役割を果たすと思われる、特定された臨床表現型からの初代培養液を使用した。このいわゆる全層皮膚モデル（ｆｕｌｌ－ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｓｋｉｎ ｍｏｄｅｌ）では、線維芽細胞は通常、３次元コラーゲンマトリックス中で増殖する。真皮様部分には、表皮ケラチノサイトが重なり、分化と極性化が誘導され、１週間以内に、機能的な基底膜によって真皮から分離された、完全に極性化した表皮が形成される。ＳＳｃ線維芽細胞だけでなく、健常人の線維芽細胞も使用できる。皮膚における２つの主要な細胞集団間のクロストーク（ｃｒｏｓｓｔａｌｋ）を研究する機会以外に、このモデルの大きな利点は、従来の培養皿の硬いプラスチック表面によって線維芽細胞がそれ自体あらかじめ活性化されないことである。
【0093】
架橋酵素としてのＴＧ２の作用様式を考え、この作用様式は、硬いプラスチック表面上での線維芽細胞の標準的な２Ｄ培養よりも、皮膚における線維芽細胞の生理学的環境によく似た３Ｄ培養環境において、より適切であるかもしれないという仮説を立てた。４つの異なる線維芽細胞「株」を試験した。線維芽細胞「株」を２Ｄで予備試験し、ＴＧ２阻害に対して少なくとも軽度の反応を示した株のみを、全層皮膚モデルでのさらなる検証のために選択した。これらの４つの「株」には、軽度から中等度の反応を示した上記の２つの線維芽細胞「株」と、別の６つのＳＳｃ「株」のスクリーニングによって同定された２つの「株」が含まれる（スクリーニングされた１１株中４株）。抗ＴＧ２抗体（１０００ｎＭ）の存在下では、有意な抗線維化作用が観察され、ＴＧＦβ１誘導性のゲル肥厚、真皮肥厚、筋線維芽細胞数、コラーゲンＩ沈着が、未処理の皮膚等価物と比較して、また１０００ｎＭの対照抗体でインキュベートした皮膚等価物と比較して、統計学的に有意に減少した（図１７）。この実験環境では、対照抗体の穏やかな効果も観察された。
【0094】
実施例２の結論：
ＴＧ２阻害のターゲットは、従来の２Ｄ培養系及び全層３Ｄ皮膚モデルにおけるＳＳｃ線維芽細胞「株」のサブセットにおけるＥＣＭ沈着に関して有望であることがわかった。その効果は、全層皮膚モデルにおいてより顕著であったことから、ＴＧ２阻害の治療可能性を評価するためには、標準的な細胞培養アプローチが最適ではない可能性が示された。これらの抗線維化作用は、ＴＧＦβ１／ＳＭＡＤシグナルとは無関係のようである。
ＴＧ２阻害のターゲットは、従来の２Ｄ培養系及び全層３Ｄ皮膚モデルにおけるＳＳｃ線維芽細胞「株」のサブセットにおけるＥＣＭ沈着に関して有望であることがわかった。その効果は、全層皮膚モデルにおいてより顕著であったことから、ＴＧ２阻害の治療可能性を評価するためには、標準的な細胞培養アプローチが最適ではない可能性が示された。これらの抗線維化作用は、ＴＧＦβ１／ＳＭＡＤシグナルとは無関係のようである。
【0095】
実施例３－ＴＧ２ノックアウトによる皮膚線維症モデルの保護：
真皮線維症の発症に対するＴＧ２欠失の影響を調べるため、グローバル（ｇｌｏｂａｌ）ＴＧ２ ＫＯマウスで、ブレオマイシン誘発皮膚リモデリングの程度を調べた。この目的のために、野生型（ＷＴ）又はトランスグルタミナーゼ２ノックアウト（ＴＧ２ＫＯ）マウスに、生理食塩水（対照）又は２Ｕ／ｍＬのブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）５０μＬを背中の１ｃｍ×１ｃｍの皮膚パッチに１日おきに２８日間皮内注射した。２８日後、動物は飼育を中止し、組織学、コラーゲンアッセイ、ＴＧ２架橋定量化のために皮膚を採取した。
真皮線維症の発症に対するＴＧ２欠失の影響を調べるため、グローバル（ｇｌｏｂａｌ）ＴＧ２ ＫＯマウスで、ブレオマイシン誘発皮膚リモデリングの程度を調べた。この目的のために、野生型（ＷＴ）又はトランスグルタミナーゼ２ノックアウト（ＴＧ２ＫＯ）マウスに、生理食塩水（対照）又は２Ｕ／ｍＬのブレオマイシン（Ｂｌｅｏ）５０μＬを背中の１ｃｍ×１ｃｍの皮膚パッチに１日おきに２８日間皮内注射した。２８日後、動物は飼育を中止し、組織学、コラーゲンアッセイ、ＴＧ２架橋定量化のために皮膚を採取した。
【0096】
皮膚の切片をマッソン三色染色（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）とピクロシリウス・レッド染色し、それぞれＥＣＭ及びコラーゲンを可視化した。その後、真皮の厚さを測定し、断面全体で３回の平均値をとった。ピクロシリウス・レッドで染色した切片を偏光下に置き、コラーゲンの厚みを可視化した。
【0097】
ＷＴ動物－ＴＧ２が正常レベルの動物は、ブレオマイシン傷害に反応して皮膚の厚みが有意に増加した（コラーゲン染色で表される）（図１８）。これに対し、ＴＧ２欠損マウス（ＴＧ２ ｎｕｌｌ ｍｏｕｓｅ）の線維化反応は明らかに減弱しており、生理食塩水又はブレオマイシンで処理したＴＧ２欠損マウスの間で、真皮コラーゲン量に有意差や変化は認められなかった。皮膚の厚さの所見は、ブレオマイシン傷害に対する真皮コラーゲン量の測定によって確認した（図２３）。ブレオマイシンを注射したＷＴマウスは、生理食塩水を注射したＷＴマウス及びＴＧ２ＫＯマウス、ブレオマイシンを注射したＷＴマウスと比較して、真皮コラーゲンの増加が有意に高かった。
【0098】
偏光下で見ると、太いコラーゲン線維は赤く見え、次第に細くなり、オレンジ、黄色、そして最も細いコラーゲン線維は緑色に見える。コラーゲン繊維の太さの分布率を計算した（図２２）。ＷＴの皮膚は赤色及びオレンジ色が優勢に見えたが、これは太いコラーゲン線維の割合が高かったことを意味する。ＴＧ２ＫＯマウスの皮膚は緑色と黄色が優勢で、これは細いコラーゲン線維の割合が高いことを意味する。この観察は走査型電子顕微鏡で確認され、ＷＴの皮膚に最もよく見られる太い「明るい」コラーゲン線維は、ＴＧ２ＫＯマウスでは全く見られない（データは示さず）。ＴＧ２ＫＯマウスにブレオマイシンを投与すると、ブレオマイシンを投与したＷＴマウスに見られるような真皮の変化は見られなかった。
【0099】
ＴＧ２欠失の影響は、線維芽細胞の遊走とＴＧＦβ１に対する反応を調べるために、スクラッチ試験を使用して機能的にも調べた（図２４）。線維芽細胞単層への傷害の後、ＷＴ線維芽細胞は傷の隙間に移動し、６時間後からスクラッチ傷を修復し始め、４８時間後にはかなりの数の細胞が傷の部位に存在することが観察された。同じ４８時間の間に、創傷部位に入り込んだＴＧ２ＫＯ線維芽細胞はわずかであった。ＴＧＦβ１の添加はＴＧ２ＫＯ線維芽細胞の遊走に影響を与えなかった。ＴＧ２ＫＯ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養すると、ＷＴ細胞よりも遊走能の低下を示した。
【0100】
真皮のＷＴ及びＴＧ２ＫＯ線維芽細胞集団の収縮能力を、３Ｄ Ｉ型コラーゲンゲル収縮アッセイを用いて調べた（図２５）。ＴＧＦβ１は、線維芽細胞を刺激して弛緩したコラーゲンゲルを収縮させるが、このプロセスは、遊走する細胞の牽引力と収縮性線維芽細胞（筋線維芽細胞）への分化に依存している。ＷＴ群はＴＧ２ＫＯ群に比べ、担体単独でインキュベートした場合に有意に収縮した（Ｐ＜０．０００１）。ＴＧＦβ１存在下でインキュベートしたＴＧ２ＫＯ細胞のゲル収縮は、担体のみでインキュベートしたＴＧ２ＫＯ細胞の収縮よりも有意に大きかった（Ｐ＜０．０００１）。このことは、ＴＧ２遺伝子のノックアウトがゲルの収縮に大きく影響したことを示しており、細胞の遊走及び分化が損なわれていることが確認され、外因性ＴＧＦβ１を添加することにより、線維芽細胞の遊走機能が回復し、収縮促進作用が回復したことを示している。
【0101】
線維芽細胞によるＴＧ２発現の欠損は、細胞遊走やＴＧ２欠損細胞のＩ型コラーゲン３Ｄマトリックスのリモデリング能力への影響によって示されるように、瘢痕形成や線維化に重要ないくつかの機能障害をもたらした。スクラッチ創傷後のこれらの線維芽細胞の遊走が有意に減少し、コラーゲンゲルを効果的に収縮させることができないことから、細胞の接着、付着及び運動性に変化が生じ、線維芽細胞が活性化された収縮性筋線維芽細胞への遊走に障害があることが示唆される。これらの驚くべき発見は、線維形成及び強皮症におけるＴＧ２の役割についての理解を深めるものである。
【0102】
全体的な結論：
これらの研究は、ＴＧ２発現と皮膚線維症との関連性を示す良い証拠となり、また、関連する潜在的な分子メカニズムについてもある程度の洞察を与えるものである。これらのことから、結合組織線維症の有効な治療法として、本明細書で示したような抗ＴＧ２抗体等によるＴＧ２阻害が有望であることが示唆される。このデータは、ＴＧ２と線維化病態との関連を支持する証拠を追加するものであり、強皮症の組織線維化を促進するＴＧ２の潜在的役割についてさらなる手がかりを与えるものである。
これらの研究は、ＴＧ２発現と皮膚線維症との関連性を示す良い証拠となり、また、関連する潜在的な分子メカニズムについてもある程度の洞察を与えるものである。これらのことから、結合組織線維症の有効な治療法として、本明細書で示したような抗ＴＧ２抗体等によるＴＧ２阻害が有望であることが示唆される。このデータは、ＴＧ２と線維化病態との関連を支持する証拠を追加するものであり、強皮症の組織線維化を促進するＴＧ２の潜在的役割についてさらなる手がかりを与えるものである。
【0103】
参考文献：
Ｓｉｅｇｅｌ＆Ｋｈｏｓｌａ（２００７），Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１１５（２）：２３２－２４５
Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２０）３ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０：２８７
国際公開第２００６／１００６７９号
国際公開第２０１２／１４６９０１号
国際公開第２０１３／１７５２２９号
Ｃａｒｅｔａ＆Ｒｏｍｉｔｉ（２０１５），Ａｎ．Ｂｒａｓ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９０（１）：６２－７３．
Ｄｅｎｔｏｎ＆Ｋｈａｎｎａ（２０１７），Ｌａｎｃｅｔ，３９０：１６８５－９９
Ｂａｒｓｏｔｔｉ ｅｔ ａｌ．（２０１９），Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，３７（Ｓｕｐｐｌ．１１９）：Ｓ３－Ｓ１４
国際公開第２０１３／１７５２２９号
国際公開第２０１５／１９７７７２号
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国際公開第２００６／１００６７９号
国際公開第２０１２／１４６９０１号
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国際公開第２０１３／１７５２２９号
国際公開第２０１５／１９７７７２号
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図17C】
【図17D】
【図17E】
【図18】
【図19A)】
【図19B)】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【配列表】
【国際調査報告】