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特表2024-540639オンターゲット／オフターゲット活性比が改善された新規ＴＡＬＥタンパク質スキャフォールド
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-10-31
(54)【発明の名称】オンターゲット／オフターゲット活性比が改善された新規ＴＡＬＥタンパク質スキャフォールド
(51)【国際特許分類】
C07K 14/195 20060101AFI20241024BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20241024BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241024BHJP
C12N 9/22 20060101ALI20241024BHJP
C12N 9/14 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/55 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241024BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20241024BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20241024BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20241024BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20241024BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP
【ＦＩ】
C07K14/195 ZNA
C12N15/31
C07K19/00
C12N9/22
C12N9/14
C12N15/09 100
C12N15/55
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024530470
(86)(22)【出願日】2022-11-23
(85)【翻訳文提出日】2024-07-11
(86)【国際出願番号】 EP2022082950
(87)【国際公開番号】W WO2023094435
(87)【国際公開日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】63/282,453
(32)【優先日】2021-11-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】PA202270104
(32)【優先日】2022-03-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519350465
【氏名又は名称】セレクティス ソシエテ アノニム
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】デュシャトー フィリップ
(72)【発明者】
【氏名】ジュイラット アレクサンドル
(72)【発明者】
【氏名】ボーイン アレックス
(72)【発明者】
【氏名】カザンジュオール セレーナ
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA27Y
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045BA72
4H045CA11
4H045DA89
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、より高いオンターゲット／オフターゲット活性比を示す、TALEヌクレアーゼおよびTALE塩基エディターなどの配列特異的ゲノム試薬として有用な改善されたTALEタンパク質融合体、の設計に関する。その目標は、特に遺伝子療法においてより安全な試薬を使用するために、異なるタイプの細胞、特に哺乳動物細胞のゲノムを遺伝的に改変するための前記試薬を生成することである。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
AvrBs3様リピートを含むコア結合ドメインを含む転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質であって、前記コア結合ドメインがN末端領域とC末端領域の間に配置され、
ここで、前記N末端領域が、SEQ ID NO:1と少なくとも85％の配列同一性を示すポリペプチド配列を含み、かつ
前記C末端領域が、
ここで、X1、X2、およびX3が、H（ヒスチジン）またはR（アルギニン）残基である、
前記転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質。
【請求項2】
前記C末端領域がSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:4を含む、請求項1記載の転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質。
【請求項3】
前記AvrBs3様リピートのうちの少なくとも1個が、SEQ ID NO:31～34のAvrBs3の正準配列のいずれかに関する位置4および32においてD（アスパラギン酸）残基を含む、請求項1または2記載の転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質。
【請求項4】
前記AvrBs3様リピートのうちの少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個、より好ましくは少なくとも5個、さらにより好ましくは少なくとも10個が、位置4および32においてD（アスパラギン酸）残基を含む、請求項3記載の転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質。
【請求項5】
D4およびD32に加えて、1～5箇所のアミノ酸位置において、少なくとも1個の前記AvrBs3様リピートがさらに変異している、請求項3および4のいずれか一項記載の転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質。
【請求項6】
前記AvrBs3様リピートのうちの少なくとも1個が、配列:ここで、X4X5が、可変性2残基を形成するアミノ酸である、
請求項1～4のいずれか一項記載の転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質。
【請求項7】
表4または表5より選択される1つの配列と少なくとも90％の同一性を有する、請求項1～6のいずれか一項記載の活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質。
【請求項8】
前記TALEが触媒ドメインに融合されてTALE融合タンパク質を形成する、請求項1～7のいずれか一項記載の活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質。
【請求項9】
前記TALEがヌクレアーゼドメインに融合されてTALEヌクレアーゼを形成する、請求項1～8のいずれか一項記載の活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質。
【請求項10】
前記ヌクレアーゼドメインが、Fok-1由来の触媒ドメインを含む、請求項9記載のTALEヌクレアーゼ。
【請求項11】
前記ヌクレアーゼドメインが、SEQ ID NO:109（Fok1触媒ドメイン）と少なくとも85％の同一性、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらにより好ましくは99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項9記載のTALEヌクレアーゼ。
【請求項12】
前記ヌクレアーゼドメインが、SEQ ID NO:109における13、52、57、59、61、65、84、85、88、91、92、95、98、103、109、110、111、113、119、143、148、152、158、159、160、167、169、170、および194位に対応する位置において少なくとも1つのアミノ酸置換を有する、請求項9～11のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼ。
【請求項13】
デアミナーゼドメインに融合されてTALE塩基エディターを形成する、請求項1～7のいずれか一項記載の転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質。
【請求項14】
前記デアミナーゼドメインが、SEQ ID NO:134またはSEQ ID NO:135と少なくとも85％の同一性、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらにより好ましくは少なくとも99％の同一性を示すポリペプチド配列を含む、請求項13記載の転写活性化因子様エフェクター（TALE）塩基エディター。
【請求項15】
転写モジュレータードメインに融合されてTALE転写モジュレーターを形成する、請求項1～7のいずれか一項記載の転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質。
【請求項16】
遺伝性疾患の処置において使用するための、請求項9～15のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼ、TALE塩基エディター、またはTALE転写モジュレーター。
【請求項17】
遺伝子療法において使用するための、請求項9～15のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼ、TALE塩基エディター、またはTALE転写モジュレーター。
【請求項18】
細胞療法において使用するための、請求項9～15のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼ、TALE塩基エディター、またはTALE転写モジュレーター。
【請求項19】
遺伝子編集された細胞の製造において使用するための、請求項9～15のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼ、TALE塩基エディター、またはTALE転写モジュレーター。
【請求項20】
操作された植物細胞の生成において使用するための、請求項9～15のいずれか一項記載のTALEヌクレアーゼ、TALE塩基エディター、またはTALE転写モジュレーター。
【請求項21】
以下の工程を含む、ポリヌクレオチド配列中に遺伝子改変を導入するためのTALEタンパク質を生成するための方法：（d)前記遺伝子改変が意図されるポリヌクレオチド標的配列を選択する工程；
（e)AvrBs3様リピートをコードするポリヌクレオチド配列をアセンブルして、選択された前記ポリヌクレオチド標的配列に結合するためのTALE結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを形成する工程；
（f)前記TALE結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも
(1)SEQ ID NO:1と少なくとも85％の同一性を有する配列を含むN末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、および
(2)配列中のX1、X2、X3がR（アルギニン）またはH（ヒスチジン）を表す、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のポリペプチド配列からなるC末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列
を融合する工程。
【請求項22】
触媒ドメイン、例えばヌクレアーゼまたはデアミナーゼ、をコードするポリヌクレオチド配列を、前記C末端ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合するさらなる工程（d)を含む、請求項21記載の方法。
【請求項23】
NLS（核局在化シグナル）、例えば表1に列挙されるもの、をコードするポリヌクレオチドを、前記N末端ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合するさらなる工程を含む、請求項21または22記載の方法。
【請求項24】
前記AvrBs3様リピートが、前記AvrBs3様リピートのポリペプチド配列の位置4におけるD（D4）および位置32におけるD（D32）を含む、請求項21～23のいずれか一項記載の方法。
【請求項25】
D4およびD32の変異に加えて、1～3箇所のアミノ酸位置において前記AvrBs3様リピートのうちの少なくとも1個がさらに変異している、請求項24記載の方法。
【請求項26】
1～5個の正に荷電したアミノ酸、例えばリジン（K）、アルギニン（R）、またはヒスチジン（H）を導入するように、前記C末端ドメインが変異している、請求項21～25のいずれか一項記載の方法。
【請求項27】
工程（d)のヌクレアーゼ触媒ドメインがFok-1である、請求項22～26のいずれか一項記載の方法。
【請求項28】
SEQ ID NO:109の13、52、57、59、61、65、84、85、88、91、92、95、98、103、109、110、111、113、119、143、148、152、158、159、160、167、169、170、および194位に対応する位置のいずれか1つにおいて、少なくとも1つの置換がFok-1触媒ドメインに導入される、請求項27記載の方法。
【請求項29】
工程（d)のデアミナーゼ触媒ドメインが、分断された細菌シチジンデアミナーゼ毒素である、請求項22～26のいずれか一項記載の方法。
【請求項30】
オンターゲット／オフターゲット活性比をさらに増大させるように前記触媒ドメインが変異している、請求項21～29のいずれか一項記載の方法。
【請求項31】
工程（c)で形成されたポリヌクレオチドを細胞中で発現させる工程をさらに含む、請求項21～30のいずれか一項記載の方法。
【請求項32】
請求項1～20のいずれか一項記載のTALE、TALEヌクレアーゼ、TALE塩基エディター、またはTALE転写モジュレーターをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項33】
請求項32記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項34】
請求項31記載の方法によって取得可能なポリペプチド。
【請求項35】
請求項33～34のいずれか一項記載のポリヌクレオチド、ベクター、またはポリペプチドを含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、より高いオンターゲット／オフターゲット活性比を示す、配列特異的ゲノム試薬として有用な改善されたTALEタンパク質融合体、の設計に関する。その目標は、特に遺伝子療法においてより安全な試薬を使用するために、異なるタイプの細胞、特に哺乳動物細胞のゲノムを遺伝的に改変するための前記試薬を生成することである。
本発明は、より高いオンターゲット／オフターゲット活性比を示す、配列特異的ゲノム試薬として有用な改善されたTALEタンパク質融合体、の設計に関する。その目標は、特に遺伝子療法においてより安全な試薬を使用するために、異なるタイプの細胞、特に哺乳動物細胞のゲノムを遺伝的に改変するための前記試薬を生成することである。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
人工の転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、植物病原性細菌のザントモナス属（Xanthomonas）に元々由来する、DNAに結合することができるタンパク質の特別なクラスを形成する[Kay S. et al. (2007) A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator. Science 318: 648-651（非特許文献1）]。人工のTALEタンパク質は、TALEのアミノ酸配列をその結合ゲノムDNA配列と連結させるDNA認識「コード」の解明に基づいて、柔軟な用途を提供する多用途かつ配列特異的なツールであることが明らかになった[Moscou J.M. et al. (2009) A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors. Science. 326:1501（非特許文献2）]。
人工の転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、植物病原性細菌のザントモナス属（Xanthomonas）に元々由来する、DNAに結合することができるタンパク質の特別なクラスを形成する[Kay S. et al. (2007) A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator. Science 318: 648-651（非特許文献1）]。人工のTALEタンパク質は、TALEのアミノ酸配列をその結合ゲノムDNA配列と連結させるDNA認識「コード」の解明に基づいて、柔軟な用途を提供する多用途かつ配列特異的なツールであることが明らかになった[Moscou J.M. et al. (2009) A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors. Science. 326:1501（非特許文献2）]。
【0003】
TALEの結合は、本質的に2つの位置で異なる一連の33～35アミノ酸の長さのリピート、いわゆる、リピート可変ジペプチド（repeat variable dipeptide）（RVD）によって引き起こされる。DNA標的中の1つの鎖の各塩基に、RVDの直線的配置に起因する予測可能な特異性で、単一リピートが接触する。生化学的な構造-機能研究によって、位置13に存在するアミノ酸は、DNA標的の主溝のヌクレオチドをユニークに特定することが示唆される[Deng D., et al. (2012) Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors. Science 335:720-723（非特許文献3）; Stella S., et al. (2013) Structure of the AvrBs3-DNA complex provides new insights into the initial thymine-recognition mechanism. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 69(9):1707-1716（非特許文献4）]。このDNA-タンパク質相互作用単位は、位置12のアミノ酸によって安定化される。精度および結合親和性が可変性であるTALEの作出のために、従来の6つのRVDが一般に使用される（NG、HD、NI、NK、NH、およびNN）。HDおよびNGは、それぞれシトシン（C）およびチミン（T）に結合する。NNは、グアニン（G）とアデニン（A）の両方に結合親和性を示す縮重RVDであるが、グアニンに対するその特異性がより強いことが報告されている。RVD NIはAと結合し、NKはGと結合する。TALEの結合親和性が標的DNA配列のメチル化状態の影響を受けることは注目すべきである[Streubel J, et al. (2012) TAL effector RVD specificities and efficiencies. Nat Biotechnol 30(7):593-595（非特許文献5）]。メチル化されたシトシンには正準RVDが効率的に結合しない。しかし、これは、Valton J, et al. [Overcoming transcription activator-like effector (TALE) DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation (2012) J. Biol. Chem. 287(46):38427-38432（非特許文献6）]によって記載されているように、TALEにおけるある程度の縮重によって適合させることができる。このコードは、TALEタンパク質と様々な酵素ドメイン、例えば、転写活性化因子、リプレッサー、塩基エディター、またはゲノム配列に作用する潜在能力を有するヌクレアーゼの異なる結合を形成するために、モジュラーアセンブリーを介してTALE DNA結合スキャフォールドの特異性を効果的に操作するために採用された[Voytas et al. (2011) TAL effectors: Customizable proteins for DNA targeting. Science 333(6051):1843-6（非特許文献7）]。ジンクフィンガータンパク質融合体と比較して、TALEタンパク質は、著しい制限なしで単純な暗号によって支配される重要なDNA結合スキャフォールドとして、著しく浮上してきた。幅広いエピジェネティック修飾因子とのその適合性はすばらしく[Laufer B.I., et al. (2015) Strategies for precision modulation of gene expression by epigenome editing: an overview. Epigenetics Chromatin 8(1):34（非特許文献8）]、これらのDNA結合タンパク質を用いて、エピジェネティックなエフェクタードメインをゲノム中の任意の座位にターゲティングすることが可能であると考えられている[Cano-Rodriguez D., Rots M.G. (2016) Epigenetic editing: on the verge of reprogramming gene expression at will. Curr Genet Med Rep 4(4):170-179（非特許文献9）]。
【0004】
そのようなTALEタンパク質融合体は、TALEとトランス活性化ドメインとしての単純ヘルペスウイルス由来16アミノ酸ペプチド（VP16）との融合によって生成されているTALE人工転写因子をもたらし得る[Zhang, F. et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnol. 29:149-153（非特許文献10）]。多くのオフターゲット効果に遭遇したジンクフィンガー結合ドメインと対照的に、TALE転写活性化因子は、エフェクターモジュールがカルボキシル末端に融合した10.5リピートしか有さない効率的な転写モジュレーターである[Miller, J., et al. (2011) A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29, 143-148（非特許文献11）]。活性化因子の形態のTALEは、植物および動物を含めた様々な生物において、化学変化または光刺激のような外部刺激の際に遺伝子発現を制御するために使用することもできる。
【0005】
TALEリプレッサーは、TALEとクルッペル結合ボックス（KRAB）、Sid4、またはEAR抑制ドメイン（SRDX）リプレッサーのいずれかとの融合によって生成することができる[Cong L, et al. (2012) Comprehensive interrogation of natural TALE DNA-binding modules and transcriptional repressor domains. Nat Commun 3(1):968（非特許文献12）]。
【0006】
TALE塩基エディターは、TALEとデアミナーゼ、時折、他のDNA修復タンパク質との融合によって生成することができる。塩基エディター触媒ドメインは、分裂細胞と非分裂細胞の両方のDNA（核またはオルガネラ）またはRNAにおける望ましい座位に一塩基ヌクレオチドバリアントを導入することができる。大まかに、標的点変異をDNAに直接的に誘導するDNA塩基エディターとRNAにおいてあるリボヌクレオチドを別のリボヌクレオチドに変換するRNA塩基エディターとの2つのタイプが存在する。現在利用可能なDNA塩基エディターは、シトシン塩基エディター（CBE）、アデニン塩基エディター（ABE）、CからGへの塩基エディター（CGBE）、二重塩基エディター、およびオルガネラ塩基エディターにさらに分類することができる。例えば、Mok et al. [A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing (2020) Nature. 583:631-637（非特許文献13）]は、細菌のシチジンデアミナーゼ毒素、すなわち、DddAtoxを使用する塩基編集アプローチを最近開発して、インビトロで効率的なCからTへの塩基変換を実証した。このアプローチでは、分断されたDddAtoxの無毒の半分が転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質に融合しており、これは、所定の標的DNA配列を認識するようにカスタム設計することができ、編集ウインドウ内で機能的シトシンデアミナーゼを形成して、ゲノムDNA中の標的部位でCからTへの塩基編集を誘導することができる。そのようなDddA-TALE融合デアミナーゼコンストラクトは、その後マウスにおいてミトコンドリアDNA編集を達成した[Lee, H., et al. (2021) Mitochondrial DNA editing in mice with DddA-TALE fusion deaminases. Nat Commun 12: 1190（非特許文献14）]。
【0007】
TALEヌクレアーゼは、TALEと様々なヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合によって生成することができる。TALEスキャフォールドとFok1制限酵素の触媒ドメインとの融合体としての特異的なヌクレアーゼを提供する、一般に使用されるTALEN（登録商標）システムは、選択された座位で一緒に結合する2つのTALEダイマーを組み合わせるので、多くの研究を通じて、非常に特異的であるということが証明されている。TALENヘテロダイマー（右および左）は、一般に、互いに約10～20pb離れて（スペーサー）逆の鎖に結合して、ヌクレアーゼFok1がダイマー化し、スペーサー内の結合部位の間で二本鎖開裂を誘導することを可能にする。このヘテロダイマー設定によって、2つのTALEの結合部位によって取り囲まれた最大で40塩基対までに及ぶ延長された標的配列に基づいて、配列特異性の増大が可能になる。そのようなTALEヌクレアーゼは、特に同種異系のCAR-T細胞を生成するために、遺伝子療法における治療グレードのヌクレアーゼ試薬として現在開発されている[Poirot et al. (2015) Multiplex Genome-Edited T-cell Manufacturing Platform for “Off-the-Shelf” Adoptive T-cell Immunotherapies Cancer Res 75(18):3853-3864（非特許文献15）; Quasim W. et al. (2017) Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells. Science translational medicine (9)374（非特許文献16）]。古典的なTALENモノマーコンストラクトは、WO2011072246（特許文献1）でVoytasらによって最初に記載されたものなど、Fok1の触媒ドメインに融合した、AvrBs3タンパク質由来のTALE結合ドメインのトランケートバージョンに一般に基づく。本明細書において「正準」と言及されるそのようなTALEヌクレアーゼ融合タンパク質は、典型的には、5’から3’に以下のものを含む：(1)結合ドメインの近位にある少なくとも150アミノ酸を含む、AvrBs3由来のトランケートされたN末端領域；(2)ゲノムヌクレオチド配列を標的にするようにアセンブルされている12～28リピートを一般に含む、操作された中央DNA結合ドメイン；これらの選択されたリピートの後に、標的DNA配列の3'末端に結合するように設計された、AvrBs3由来のわずか20アミノ酸の野生型ハーフリピートが続く；(4)野生型Fok1ヌクレアーゼ触媒ドメインに融合した、(3)AvrBs3のC末端野生型領域由来の少なくとも40アミノ酸のリンカー配列。一般に、融合タンパク質は、トランケートされたN末端領域に融合したAvrBs3の核局在化シグナル（NLS）をさらに含む。これらのプログラム可能なTALE DNA結合ドメインの特異性および有効性を改善することを示した[Juillerat A, et al. (2015) Optimized tuning of TALEN specificity using non-conventional RVDs. Sci Rep 5(1)（非特許文献17）]、追加的なまたは代替のRVDの使用とともに、様々なトランケーションによってコアTALEドメインを増強することが、いくつかの研究で提案されている[Miller, J. C. et al. (2011) A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29, 143（非特許文献11）]。
【0008】
そのような特製のTALEタンパク質は、ほとんどすべての細胞タイプにおいて、関心対象のゲノムDNA配列を標的にするための強力な試薬であるということが証明されている[Weeks D.P,. et al. Use of designer nucleases for targeted gene and genome editing in plants (2016) Plant Biotechnology Journal.14:483-495（非特許文献18）; Mussolino C. et al. (2014) TALENs facilitate targeted genome editing in human cells with high specificity and low cytotoxicity. Nucleic Acids Res 42(10):6762-6773（非特許文献19）]。さらに、この標準的なスキームに従って操作されたTALEタンパク質は、構造および配列同一性の点から互いに非常に類似している。実際に、新規標的配列にスキャフォールドを適合させるためには、中央DNA結合ドメイン中の各リピートの位置12および13のアミノ酸しか異なる必要がない。
【0009】
それにもかかわらず、ヒト遺伝子療法のためのTALEヌクレアーゼの発展にともない、標準的なTALEコンストラクトは、治療上の安全性に必要とされる特異性および効率レベルを必ずしも満たしているとは限らない。ゲノム中で標的にされる配列およびヒト集団におけるその固有の変動性に応じて、TALEスキャフォールドは、時折、潜在的なオフターゲット結合を低減し、その触媒活性を増大させるために、さらなる改良を必要とする。追加的なまたは非従来的なRVDを含むことにある以前の方法は、すべての状況において十分ではない可能性がある。実際に、特異性および触媒活性は釣り合いがとれている（in balance）ことが多く、安全性および効率を保持する良い妥協案を見出すのは困難であり得る。
【0010】
操作されたTALEタンパク質の現在の高い標準を超えるために、本発明者らは、変異の異なるセットを組み合わせる新規TALEスキャフォールドを設計した。これらの新規スキャフォールドに基づいて得られたTALE融合タンパク質は、その触媒活性の大部分を保持しながら、より良好な特異性を示し、任意の標的配列およびRVD調整に適合可能なままである。したがって、本発明者らの発明は、より高い治療グレードのTALE触媒タンパク質の合理的設計のためのプラットフォームを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0011】
【特許文献1】WO2011072246
【非特許文献】
【0012】
【非特許文献1】Kay S. et al. (2007) A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator. Science 318: 648-651
【非特許文献2】Moscou J.M. et al. (2009) A Simple Cipher Governs DNA Recognition by TAL Effectors. Science. 326:1501
【非特許文献3】Deng D., et al. (2012) Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors. Science 335:720-723
【非特許文献4】Stella S., et al. (2013) Structure of the AvrBs3-DNA complex provides new insights into the initial thymine-recognition mechanism. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr 69(9):1707-1716
【非特許文献5】Streubel J, et al. (2012) TAL effector RVD specificities and efficiencies. Nat Biotechnol 30(7):593-595
【非特許文献6】Valton J, et al. [Overcoming transcription activator-like effector (TALE) DNA binding domain sensitivity to cytosine methylation (2012) J. Biol. Chem. 287(46):38427-38432
【非特許文献7】Voytas et al. (2011) TAL effectors: Customizable proteins for DNA targeting. Science 333(6051):1843-6
【非特許文献8】Laufer B.I., et al. (2015) Strategies for precision modulation of gene expression by epigenome editing: an overview. Epigenetics Chromatin 8(1):34
【非特許文献9】Cano-Rodriguez D., Rots M.G. (2016) Epigenetic editing: on the verge of reprogramming gene expression at will. Curr Genet Med Rep 4(4):170-179
【非特許文献10】Zhang, F. et al. Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription. Nature Biotechnol. 29:149-153
【非特許文献11】Miller, J., et al. (2011) A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat Biotechnol. 29, 143-148
【非特許文献12】Cong L, et al. (2012) Comprehensive interrogation of natural TALE DNA-binding modules and transcriptional repressor domains. Nat Commun 3(1):968
【非特許文献13】Mok et al. [A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing (2020) Nature. 583:631-637
【非特許文献14】Lee, H., et al. (2021) Mitochondrial DNA editing in mice with DddA-TALE fusion deaminases. Nat Commun 12: 1190
【非特許文献15】Poirot et al. (2015) Multiplex Genome-Edited T-cell Manufacturing Platform for “Off-the-Shelf” Adoptive T-cell Immunotherapies Cancer Res 75(18):3853-3864
【非特許文献16】Quasim W. et al. (2017) Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells. Science translational medicine (9)374
【非特許文献17】Juillerat A, et al. (2015) Optimized tuning of TALEN specificity using non-conventional RVDs. Sci Rep 5(1)
【非特許文献18】Weeks D.P,. et al. Use of designer nucleases for targeted gene and genome editing in plants (2016) Plant Biotechnology Journal.14:483-495
【非特許文献19】Mussolino C. et al. (2014) TALENs facilitate targeted genome editing in human cells with high specificity and low cytotoxicity. Nucleic Acids Res 42(10):6762-6773
【発明の概要】
【0013】
本発明は、元のザントモナスゲノム配列由来のAvrBs3リピートのアセンブリーに結合ドメインが一般に基づくTALE融合タンパク質の特異性および／または活性を改善することを目的とする。
【0014】
本発明によれば、TALEコア結合ドメインの元のAvrBs3リピートは、X1、X2、およびX3がH（ヒスチジン）またはR（アルギニン）、好ましくはRを表す以下のSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:4：
と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のポリペプチド配列からなるC末端領域と融合させた。X1、X2、およびX3は、同一であってもよいか、または異なっていてもよい。
【0015】
一般に、前記TALEコア結合ドメインはN末端領域に融合しており、N末端領域は、好ましくは、SEQ ID NO:1と少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の同一性を示すポリペプチド配列を含むかまたはそれからなる。
【0016】
好ましい態様によれば、前記TALEコア結合ドメインは、AvrBs3様リピート、例えば、AvrBs3様リピートのポリペプチド配列の位置4におけるD（アスパラギン酸）（D4）および／または位置32におけるD（アスパラギン酸）（D32）アミノ酸置換を含むものを含む。
【0017】
いくつかの態様では、前記AvrBs3様リピートは、以下のポリペプチド配列：
のうちの少なくとも1つを含むかまたはそれからなり、ここで、X4X5は、標的配列中の所与のヌクレオチド塩基対と相互作用する2残基である。X4およびX5は、任意のアミノ酸であってもよいか、またはヌル（RVD中の欠けている残基を指定するために*（星印）として示される）であってもよい。X4およびX5は同一であってもよいか、または異なっていてもよい。
【0018】
これらの選択された配列、特にそれらの組み合わせが、TALEタンパク質構造全体を改善し、その標的配列との、より高い特異性を反映するより密接な相互作用につながることが、本発明者らによって見出された。その一方で、この構造は、前記結合ドメインに融合した触媒ドメインの活性を維持して、結合部位の上流または下流のDNAを効率的に処理するのに十分なほど柔軟なままである。
【0019】
本発明は、ゲノム配列を標的にするために、TALE融合タンパク質、例えば、TALEヌクレアーゼ、TALE塩基エディター、またはTALE転写モジュレーターを細胞中で産生するかまたは発現させる方法も包含する。
【0020】
特に、本発明は、以下の工程を含む、ポリヌクレオチド配列中に遺伝子改変を導入するためのTALEタンパク質を設計するための方法を提供する:
（a)遺伝子改変が意図されるポリヌクレオチド標的配列を選択する工程；
（b)AvrBs3様リピートをコードするポリヌクレオチド配列をアセンブルして、選択された前記ポリヌクレオチド標的配列に結合するためのTALE結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを形成する工程；
（c)前記TALE結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも
(1)SEQ ID NO:1と少なくとも85％の同一性を有する配列を含むN末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、および
(2)配列中のX1、X2、X3がR（アルギニン）またはH（ヒスチジン）を表す、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:4と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは99％の同一性を有する配列を含む40～80残基のポリペプチド配列からなるC末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列
を融合する工程；ならびに任意で、
（d)触媒ドメイン、例えばヌクレアーゼまたはデアミナーゼ、をコードするポリヌクレオチド配列を、前記C末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列に融合する工程；
（e)前記N末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列に、NLS（核局在化シグナル）、例えば、表1に列挙されるもの、をコードするポリヌクレオチドを融合する工程。
（a)遺伝子改変が意図されるポリヌクレオチド標的配列を選択する工程；
（b)AvrBs3様リピートをコードするポリヌクレオチド配列をアセンブルして、選択された前記ポリヌクレオチド標的配列に結合するためのTALE結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを形成する工程；
（c)前記TALE結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも
(1)SEQ ID NO:1と少なくとも85％の同一性を有する配列を含むN末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、および
(2)配列中のX1、X2、X3がR（アルギニン）またはH（ヒスチジン）を表す、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:4と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは99％の同一性を有する配列を含む40～80残基のポリペプチド配列からなるC末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列
を融合する工程；ならびに任意で、
（d)触媒ドメイン、例えばヌクレアーゼまたはデアミナーゼ、をコードするポリヌクレオチド配列を、前記C末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列に融合する工程；
（e)前記N末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列に、NLS（核局在化シグナル）、例えば、表1に列挙されるもの、をコードするポリヌクレオチドを融合する工程。
【0021】
本発明の方法は、TALE融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびその発現によって生じるポリペプチドを生成することを目的とする。
【0022】
本発明によるTALEタンパク質は、一般に、先行技術のTALE融合タンパク質と比較して、標的ゲノム配列に対するオンターゲット／オフターゲット活性比の改善を示す。
【0023】
本発明の方法は、標的ゲノム座位において例えば開裂、塩基置換、または転写活性化を得るように新規ポリヌクレオチド配列を細胞で発現させ、かつ、その効率を他のTALEタンパク質と比較してオンターゲット／オフターゲット活性比がより高いものを選択する、工程をさらに含むことができる。
【0024】
本発明の方法は、D4およびD32置換に加えて、1、2、3、最大5箇所までのアミノ酸位置において前記AvrBs3様リピートのうちの少なくとも1個がさらに変異している、工程を含むこともできる。
【0025】
本発明の方法は、先に言及した前記X1、X2、およびX3の位置に加えて、1～5個の正に荷電したアミノ酸、例えばリジン（K）、アルギニン（R）、またはヒスチジン（H）を導入するように、TALEタンパク質のC末端ドメインが変異している、工程を含むこともできる。
【0026】
本発明の方法は、TALEタンパク質の触媒ドメインにアミノ酸置換を導入してその触媒活性を増強する、さらなる工程を含むこともできる。
【0027】
さらなる態様では、本発明は、ミトコンドリアゲノムのようなより小さなゲノムが考慮される状況で、1つまたはいくつかのAvrBs3様リピートを含む、一般に8～20リピート、好ましくは8～18、より好ましくは10～16、あるいは、5～12リピートを含む、組換え転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質に関する。
【0028】
いくつかの態様では、本発明によるTALEタンパク質は、RVDリピート、好ましくは、上記のアミノ酸置換を含むAvrBs3様リピートを、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:4などのC末端配列、およびSEQ ID NO:1を含むN末端配列と組み合わせる。
【0029】
本発明の組換えコアTALEタンパク質は、先行技術（WO2012138939を参照されたい）で既に述べられた様々な触媒ドメイン、特に、ヌクレアーゼ、例えば、Fok1またはTev1、デアミナーゼ、例えば、シチジンデアミナーゼ毒素、および転写モジュレーター、例えば、トランス活性化因子VP16、由来の触媒ドメインに融合されることが意図される。
【0030】
場合によっては、本発明のTALEタンパク質は、SEQ ID NO:109と少なくとも85％の同一性、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、さらにより好ましくは99％の同一性を示すポリペプチド配列を含むTALEヌクレアーゼであり、前記ポリペプチド配列は、TALEヌクレアーゼの開裂活性を増強しかつその特異性を改善するようにアミノ酸置換が導入されたFok-1の触媒ドメインに対応する。
【0031】
本出願は、TCRα、B2m、PD1、CTLA4、CISH、LAG3、TGFBRII、TIGIT、CD38、IgH、GADPH S100A9、PIK3CD、AAVS1、およびCCR5より選択される遺伝子座位に向けられる、「TALE V2」とも称される、本発明の原理に従って生成されるTALEタンパク質、特に、TALE塩基エディターおよびTALEヌクレアーゼの多くの例、例えば、表4および5に列挙されるものを開示する。
【0032】
本発明は、ポリヌクレオチド配列および本発明によって取得可能なポリペプチド配列または試薬を含む、ベクター、ならびに細胞形質転換および遺伝子改変のためのそれらの使用を包含する。
【図面の簡単な説明】
【0033】
【図1】本発明による例示的TALEヌクレアーゼタンパク質融合体の構造。
【図2】実施例で詳述される、VO、V0.1、およびVO.2 TALEタンパク質構造によって得られたインデル％（開裂活性）を比較する図表。
【図3】VOおよびV0.1 TALEタンパク質構造によって得られたオリゴキャプチャー解析（OCA）に由来する全体的なオフサイト開裂を比較する図表。
【図4】本発明によるV1およびV1.2 TALEタンパク質のインデル形成を正準TALE構造VOと比較している図表。A：VO（CS1標的部位での開裂活性が維持されている）と比較したインデル％、B：オフサイト座位OS1で観察されたインデル％、C:オフサイト座位OS2で観察されたインデル％（V1およびV1.2 TALE構造はオフサイト開裂を消失させる）。
【図5】実施例で詳述される、本発明によるV1およびV1.2 TALEタンパク質構造を使用した、全体的なオフサイト開裂の低減を示す図表（オリゴキャプチャーアッセイ）。
【図6-1】図6：X軸に示す位置において（野生型Fok1に対して）Fok1のアミノ酸配列にアラニン置換が導入されている場合の、オンサイト（CS1標的配列）ならびにオフサイト（OS1およびOS2座位）で得られたインデル％を示す図表。
【図7】Fok1触媒ドメインに導入された最良の置換位置を有するTALEヌクレアーゼを使用した場合の、WT Fok1と比較したオンサイトインデル（黒色バー）およびWTと比較し、OS1で観察されたオフサイトインデルの減少倍率（白色バー）を示す図表。
【図8】実施例5に記載されるようにCD52遺伝子を不活性化するための、本発明によるTALE塩基エディタースキャフォールドの概略図。
【図9】オンターゲット（オンサイト）またはオフターゲットサイト（OT#）における、VO-VO、V1.2-V0、またはV1.2-V1.2ヘテロダイマー構造のいずれかを有するTGFBRIIを標的にするTALEヌクレアーゼを用いて得られたインデル％（開裂活性）を比較するヒストグラム。実施例6に詳述されるように、V1.2は本発明によるTALE構造を含む。
【図10】TIGITを標的にするように本発明によって設計されたTALEヌクレアーゼV2をトランスフェクトされた細胞において実施されたオリゴキャプチャーアッセイ（OCA）の結果を示す図表である。
【図11】CISH（3つの異なる標的配列1、2、および3に対する）を標的にするように本発明によって設計されたTALEヌクレアーゼV2をトランスフェクトされた細胞において実施されたオリゴキャプチャーアッセイ（OCA）の結果を示す図表である。
【図12】CD38（2つの異なる標的配列1および2に対する）を標的にするように本発明によって設計されたTALEヌクレアーゼV2をトランスフェクトされた細胞において実施されたオリゴキャプチャーアッセイ（OCA）の結果を示す図表である。
【図13】IgH（2つの異なる標的配列1および2に対する）を標的にするように本発明によって設計されたTALEヌクレアーゼV2をトランスフェクトされた細胞において実施されたオリゴキャプチャーアッセイ（OCA）の結果を示す図表である。
【図14】GAPDH（2つの異なる標的配列1および2に対する）を標的にするように本発明によって設計されたTALEヌクレアーゼV2をトランスフェクトされた細胞において実施されたオリゴキャプチャーアッセイ（OCA）の結果を示す図表である。
【図15】実施例7で提示される本発明によるそれぞれのTALEヌクレアーゼV2をトランスフェクトされた細胞において測定されたインデルのパーセンテージ。
【発明を実施するための形態】
【0034】
表の説明
表1：NLSポリペプチド配列の例
表2：TALE融合タンパク質に含まれ得るリンカーの例
表3：触媒ドメインの例
表4:遺伝子療法または養子免疫細胞療法において有用な本発明によるTALEタンパク質の例
表5：実施例において使用されるポリペプチド配列
表6：実施例において使用されるポリヌクレオチド配列
表1：NLSポリペプチド配列の例
表2：TALE融合タンパク質に含まれ得るリンカーの例
表3：触媒ドメインの例
表4:遺伝子療法または養子免疫細胞療法において有用な本発明によるTALEタンパク質の例
表5：実施例において使用されるポリペプチド配列
表6：実施例において使用されるポリヌクレオチド配列
【0035】
発明の詳細な説明
本明細書において特に定義されない限り、使用されるすべての技術用語および科学用語は、遺伝子療法、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書において特に定義されない限り、使用されるすべての技術用語および科学用語は、遺伝子療法、生化学、遺伝学、および分子生物学の分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【0036】
本明細書で記載されるものと同様または均等なすべての方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができ、適切な方法および材料は本明細書で記載される。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み入れられる。矛盾がある場合には、定義を含めて、本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は、別段の指定がない限り、例示に過ぎず、制限を意図したものではない。
【0037】
本発明の実施は、別段指示がない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技法を用い、これらは、当技術分野の範囲内である。そのような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology [Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, (Sambrook et al, 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al.米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Harries & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); Methods In ENZYMOLOGY (J. Abelson and M. Simon, eds.-in-chief, Academic Press, Inc., New York)のシリーズ、特に、154巻および155巻(Wu et al. eds.)ならびに185巻、"Gene Expression Technology" (D. Goeddel, ed.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986);ならびにManipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986]を参照されたい。
【0038】
したがって、本発明は、目的のために、オフターゲットDNA結合の低減を示すTALEタンパク質を設計および生成するための方法を有し、TALEタンパク質は、非常に特異的かつ活性なTALE融合タンパク質、特に、TALEヌクレアーゼおよびTALE塩基エディターを形成するために、様々な触媒ドメインに融合することができる。
【0039】
いくつかの態様によれば、本発明は、以下の工程の1つまたはいくつかを含む、ポリヌクレオチド配列中に遺伝子改変を導入するためのTALEタンパク質を設計するための方法を提供する：
（a)遺伝子改変が意図されるポリヌクレオチド標的配列を選択する工程；
（b)AvrBs3様リピートをコードするポリヌクレオチド配列をアセンブルして、選択された前記ポリヌクレオチド標的配列に結合するためのTALE結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを形成する工程；
（c)前記TALE結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも
(1)SEQ ID NO:1と少なくとも85％の同一性を有する配列を含むN末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、および
(2)配列中のX1、X2、X3がR（アルギニン）またはH（ヒスチジン）を表す、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:4と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは99％の同一性を有する配列を含む40～80残基のポリペプチド配列からなるC末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列
を融合する工程；および任意で。
（a)遺伝子改変が意図されるポリヌクレオチド標的配列を選択する工程；
（b)AvrBs3様リピートをコードするポリヌクレオチド配列をアセンブルして、選択された前記ポリヌクレオチド標的配列に結合するためのTALE結合ドメインをコードするポリヌクレオチドを形成する工程；
（c)前記TALE結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに、少なくとも
(1)SEQ ID NO:1と少なくとも85％の同一性を有する配列を含むN末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、および
(2)配列中のX1、X2、X3がR（アルギニン）またはH（ヒスチジン）を表す、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:4と少なくとも85％、好ましくは90％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは99％の同一性を有する配列を含む40～80残基のポリペプチド配列からなるC末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列
を融合する工程；および任意で。
【0040】
一般に、上記の工程はインシリコで実施することができ、最終的なポリヌクレオチド配列は、当技術分野において周知である方法、例えばWO2013017950で説明されるものに従って、合成またはクローニングすることができる。
【0041】
≪遺伝子改変≫は、遺伝子発現に対する効果を得ることを考慮して、所与の座位で自発的に誘導される任意の酵素反応、例えば、変異、メチル化、転写モジュレーションが意図される。
【0042】
いくつかの態様によれば、本発明の方法は、以下からなる工程の1つまたはいくつかを含む：
（a)開裂が意図される標的ポリヌクレオチド配列中、例えばゲノム中の開裂部位を選択する工程；
（b)前記開裂部位の5～25bp上流および／または下流に位置するポリヌクレオチド配列を選択する工程；
（c)選択された前記ポリヌクレオチド配列に結合するためのTALE結合ドメインをコードするように、AvrBs3様リピートをコードするポリヌクレオチド配列をアセンブルする工程であって、少なくとも1つのAvrBs3様リピートが、前記AvrBs3様リピートのポリペプチド配列、例えば、SEQ ID NO:5～11より選択される1つの配列の位置4におけるD置換（D4）および位置32におけるD置換（D32）を含む、前記工程；
（d)前記TALE結合ドメインを、少なくとも(1)好ましくは、SEQ ID NO:1と少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含む、N末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、および(2)好ましくは、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のポリペプチド配列のC末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列（これらの配列中のX1、X2、X3が、R（アルギニン）またはH（ヒスチジン）を表す）、に融合する工程；
（e)（d)において得られたポリヌクレオチド配列を、ヌクレアーゼ、例えば、II型エンドヌクレアーゼ、特にFok1、をコードする別のポリヌクレオチド配列と融合する工程。
（a)開裂が意図される標的ポリヌクレオチド配列中、例えばゲノム中の開裂部位を選択する工程；
（b)前記開裂部位の5～25bp上流および／または下流に位置するポリヌクレオチド配列を選択する工程；
（c)選択された前記ポリヌクレオチド配列に結合するためのTALE結合ドメインをコードするように、AvrBs3様リピートをコードするポリヌクレオチド配列をアセンブルする工程であって、少なくとも1つのAvrBs3様リピートが、前記AvrBs3様リピートのポリペプチド配列、例えば、SEQ ID NO:5～11より選択される1つの配列の位置4におけるD置換（D4）および位置32におけるD置換（D32）を含む、前記工程；
（d)前記TALE結合ドメインを、少なくとも(1)好ましくは、SEQ ID NO:1と少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の同一性を有する配列を含む、N末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列、および(2)好ましくは、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のポリペプチド配列のC末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列（これらの配列中のX1、X2、X3が、R（アルギニン）またはH（ヒスチジン）を表す）、に融合する工程；
（e)（d)において得られたポリヌクレオチド配列を、ヌクレアーゼ、例えば、II型エンドヌクレアーゼ、特にFok1、をコードする別のポリヌクレオチド配列と融合する工程。
【0043】
本方法は、前記触媒ドメインにアミノ酸置換を導入するように、例えば、TALEタンパク質に融合されかつ触媒ドメインをコードするポリヌクレオチド配列が変異していてもよい、任意の工程を含むこともできる。このアプローチは、本発明によるTALEヌクレアーゼの最適なヌクレアーゼ活性を得るという効果を伴ってFok1触媒ドメイン（SEQ ID NO:109）においてアミノ酸がアラニン残基によって置換されている、本出願の実験部分に例示される。Fok1触媒ドメインにおける、オフサイト活性を低下させることが分かっているそのような個々の置換は、特に、SEQ ID NO:109における位置13、52、57、59、61、65、84、85、88、91、92、95、98、103、109、110、111、113、119、143、148、152、158、159、160、167、169、170、および194のものであった。好ましい置換は、SEQ ID NO:109における、位置84、85、88、95、98、91、103、109、148、152、および158に存在し、最も好ましい置換は、位置84、88、91、103、および152に存在する。
【0044】
「TALEタンパク質」は、植物病原性ザントモナス・カンペストリス（Xanthomonas campestris）由来の転写活性化因子様（TAL）エフェクターのファミリーの原型に相当する野生型AvrBs3[TalC Uniprot-G7TLQ9とも呼ばれる]のDNA結合ドメインと少なくとも50％、好ましくは少なくとも60％、70％、80％、または90％の同一性を有するコアDNA結合ドメインを典型的には含むポリペプチドを本明細書において意味する。そのようなDNA結合ドメインは、位置12および13に通常見出される可変性2残基を含む約30および34アミノ酸のリピート配列を特徴とする。RVDとも呼ばれる、これらのリピートのコンセンサス配列は、各標的塩基A、C、G、およびTについて確立されており、これらは、それぞれ、
Aを標的にするための
、Cを標的にするための
、Gを標的にするための
、Tを標的にするための
である。
Aを標的にするための
【0045】
「AvrBs3様リピート」は、上記のコンセンサスAvrBs3リピートと同様に、A、C、G、またはTと相互作用する可変性2残基を位置12および13に典型的には含む、約30～33アミノ酸の人工アレイを意味する。換言すれば、AvrBs3様リピートは類似しており、AvrBs3リピートと組み合わせることができるが、一般に、コンセンサスまたは野生型AvrBs3リピートと同一ではない。場合によっては、[Valton et al. (2012) Overcoming Transcription Activator-like Effector (TALE) DNA Binding Domain Sensitivity to Cytosine Methylation. DNA and Chromosomes. 287(46):38427]によって記載されているように、位置12または13の2残基は、ゲノムDNA中のメチル化された塩基に適合させるために存在しない－いわゆる*（星印）－可能性があることに留意されたい。
【0046】
本発明のAvrBs3様リピートは、一般に、SEQ ID NO:31～34の上記のAvrBs3コンセンサスリピート配列のいずれかと少なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、75％、80％、90％、または95％の同一性を示す。これらは、一般に、本発明の以下のリピート配列SEQ ID NO:5～11:
中などにD4およびD32置換を含み、ここで、X4X5は、標的配列中の所与のヌクレオチド塩基対と相互作用する2残基である。X4およびX5は任意のアミノ酸であってもよいか、またはヌル（RVD中の欠けている残基を指定するために*（星印）として示される）であってもよい。X4およびX5は、同一であってもよいか、または異なっていてもよい。
【0047】
AvrBs3様リピートは、一般に、X4およびX5が、SEQ ID NO:24、25、26、および27中などのそれぞれNI（好ましくは、標的Aに対する）、HD（好ましくは、標的Cに対する）、（好ましくは、標的Gに対する）NNおよびNG（好ましくは、標的Tに対する）であるポリペプチド配列によって代表される。
【0048】
「同一性」は、本明細書全体を通して、2つの核酸分子またはポリペプチド間の配列同一性を指す。同一性は、比較の目的で整列させられていてもよい各配列中の位置を比較することによって決定することができる。比較される配列中の位置が同じ塩基で占められている場合、分子はその位置で同一である。核酸配列またはアミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、核酸配列に共通の位置で同一のまたはマッチするヌクレオチドの数の関数である。GCG配列解析パッケージ（University of Wisconsin、Madison、Wis.）の一部として入手可能であり、例えば、デフォルト設定で使用することができる、FASTA、またはBLASTを含めて、様々なアライメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを使用して、2つの配列間の同一性を計算することができる。本明細書は、一般に本明細書で記載される特定のポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列と少なくとも70％、85％、90％、95％、98％、または99％の同一性を有し、実質的に同じ機能を示すか、または同等と考えることができる、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを包含する。
【0049】
いくつかの態様では、本発明は、上記のポリヌクレオチド配列SEQ ID NO:NO:5～11中などに位置4および32においてD（アスパラギン酸）残基を含む1つまたはいくつかのAvrBs3様リピートを含む組換え転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質も提供する。D4およびD32位置を含めて、またはD4およびD32位置に加えて、1～5箇所のアミノ酸位置において、そのようなAvrBs3様リピートがさらに変異していてもよい。そのような組換え転写活性化因子様エフェクター（TALE）タンパク質は、ミトコンドリアゲノムのようなより小さなゲノムが考慮される状況で、一般に8～20リピート、好ましくは8～18、より好ましくは10～16、あるいは、5～12リピートを含むポリペプチドを形成するために、そのようなリピートの1つまたはいくつかを含むことができる。
【0050】
AvrBs3様リピート中に存在し、異なるヌクレオチドの認識と関連する可変性2残基（X4X5）は、一般に、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNN、A、C、G、またはTを認識するためのNS、Tを認識するためのHG、Tを認識するためのIG、Gを認識するためのNK、Cを認識するためのHA、Cを認識するためのND、Cを認識するためのHI、Gを認識するためのHN、Gを認識するためのNA、GまたはAを認識するためのSN、およびTを認識するためのYG、Aを認識するためのTL、AまたはGを認識するためのVT、およびAを認識するためのSWである。より好ましくは、ヌクレオチドC、T、A、G/A、およびGの認識と関連するRVDはそれぞれ、Gを認識するためのNNまたはNK、Cを認識するためのHD、NGを認識するためのT、およびAを認識するためのNI、Aを認識するためのTL、AまたはGを認識するためのVT、およびAを認識するためのSWからなる群より選択される。より一般的には、ヌクレオチドCの認識と関連するRVDはN*からなる群より選択され、ヌクレオチドTの認識と関連するRVDはN*およびH*からなる群より選択され、*は、RVDの第2の位置にアミノ酸残基がないことに対応する、リピート配列中のギャップを示すことができる。いくつかの態様では、X4X5は、Juillerat et al. [Optimized tuning of TALEN specificity using non-conventional RVDs (2015) Sci Rep 5:8150]に記載されるように、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対するその特異性をモジュレートするための異常なまたは非定型のアミノ酸残基を表すことができる。
【0051】
必須ではないが、コアDNA結合ドメインは、一般に、C末端に位置する20アミノ酸でできているハーフRVDを含む。したがって、前記コアDNA結合ドメインは、8.5～30.5個のRVD、より好ましくは8.5～20.5個のRVD、さらにより好ましくは10,5～15.5個のRVDを含む。
【0052】
本発明によれば、好ましくはD4および／またはD32置換を有するRVDを含む、前述のコアDNA結合ドメインは、N末端配列およびC末端配列が隣接しており、前記N末端配列およびC末端配列は、好ましくは、以下で詳述される下記の特色のうちの1つを有する。
【0053】
いくつかの態様では、N末端配列は、AvrBs3などの天然に存在するTALエフェクターのN末端ドメインに由来する。別の態様では、前記さらなるN末端ドメインは、天然に存在するTALエフェクターN末端ドメインの全長N末端ドメインである。さらなる態様では、前記さらなるN末端ドメインは、いわゆる「RVD0」（すなわち、第1の潜在性リピート）と関連する配列制約、例えば、結合核酸配列上の第1塩基として必要とされるTを有する必要性などを克服することを可能にするバリアントである。
【0054】
別の態様では、前記N末端配列は、天然に存在するTALエフェクターまたはそのバリアントに由来する。別の態様では、前記N末端配列は、そのような天然に存在するTALエフェクターまたはバリアントのトランケートされたN末端である。別の態様では、前記さらなるドメインは、AvrBs3 TALエフェクターのトランケートバージョンである、別の態様では、前記トランケートバージョンは、コアTALE結合ドメインから遠位にあるそのN末端セグメント、例えば、野生型AvrBs3の最初の152N末端アミノ酸残基、または少なくとも152アミノ酸残基を欠く。
【0055】
いくつかの好ましい態様では、前記N末端配列は、SEQ ID NO:1と少なくとも85％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の同一性を示すポリペプチド配列を含む。
【0056】
いくつかの態様では、C末端配列は、AvrBs3などの天然に存在するTALエフェクターの完全なまたは好ましくはトランケートされたC末端領域に対応する。一般に、前記C末端配列は、コアTALE結合ドメインの近位にあるAvrBs3 TALエフェクターのトランケートバージョン、例えば、SEQ ID NO:28（40アミノ酸）、SEQ ID NO:29（50アミノ酸）、もしくはSEQ ID NO:30（60アミノ酸）、またはこれらの天然バリアントである。したがって、前記C末端配列は、一般に、以下のSEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、またはSEQ ID NO:4：
と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のポリペプチド配列を含むかまたはそれからなる。
【0057】
上記の配列中、X1、X2、およびX3は、元のKの代わりに、好ましくは、R（アルギニン）またはH（ヒスチジン）残基、最も好ましくは、Rである、野生型AvrBs3のC末端ポリペプチド配列に導入されたアミノ酸置換を表す。X1、X2、およびX3は、同一であってもよいか、または異なっていてもよい。
【0058】
前記N末端配列またはC末端配列は、生物、組織、または細胞内の所与のオルガネラに前記キメラタンパク質をターゲティングすることを可能にする局在化配列（またはシグナル）を含むことができる。そのような局在化シグナルの非限定例は、核局在化シグナル、葉緑体局在化シグナル、またはミトコンドリア局在化シグナルである。別の態様では、前記さらなるN末端ドメインは、葉緑体またはミトコンドリアなどのオルガネラを標的にするのを支援するように、核局在化シグナルの反対の効果を有する核外輸送シグナルを含むことができる。いくつかの局在化シグナルの組み合わせを有するさらなるC末配列端またはN末端配列も本発明の範囲内に包含される。そのような組み合わせは、非限定例として、本発明の前記融合タンパク質を組織特異的細胞の核に移行させる（address）のを支援するための核局在化シグナル（NLS）および／または組織特異的シグナルであり得る。好ましい態様では、NLSは、一般に、TALEタンパク質のN末端領域に含まれる。好ましいNLS配列は、SV40に由来するSEQ ID NO:12、C-Mycに由来するSEQ ID NO:13、またはヌクレオプラスミンに由来するSEQ ID NO:14ポリペプチド配列を含む。
【0059】
（表１）NLS配列の例
【0060】
「TALE融合タンパク質」は、TALEタンパク質に触媒活性を与えるポリペプチドドメインに連結しているTALEタンパク質を意味する。TALE融合タンパク質は、例えば、TALE結合ドメインによって指定される座位でDNAをプロセッシングする、配列特異的な試薬であり得る。TALEタンパク質との融合は、既存のタンパク質、例えば、DNAプロセシング酵素、特に、ヌクレアーゼ活性、ポリメラーゼ活性、デアミナーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、メチラーゼ活性、トポイソメラーゼ活性、インテグラーゼ活性、トランスポゼース活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、逆転写酵素、およびリコンビナーゼ活性からなる群より選択される活性を有するもの由来の触媒ドメインを用いて行うことができる。
【0061】
いくつかの態様では、本発明によるTALE融合タンパク質は、触媒ドメインを前述のコアスキャフォールドに融合するために、またはより好ましくは、前記TALEタンパク質のC末端またはN末端を前記触媒ドメインに連結するために、ペプチドリンカーを含むことができる。そのようなリンカーは一般に柔軟である。例えば、以下の表2（SEQ ID NO:35～108）に例示されるような、任意で、3～28アミノ酸の可変領域を取り囲むN末端およびC末端のいずれかまたは両方にSGGSGSストレッチを含む、NFS1、NFS2、CFS1、RM2、BQY、QGPSG、LGPDGRKA、1a8h_1、1dnpA_1、1d8cA_2、1ckqA_3、1sbp_1、1ev7A_1、1alo_3、1amf_1、1adjA_3、1fcdC_1、1al3_2、1g3p_1、1acc_3、1ahjB_1、1acc_1、1af7_1、1heiA_1、1bia_2、1igtB_1、1nfkA_1、1au7A_1、1bpoB_1、1b0pA_2、1c05A_2、1gcb_1、1bt3A_1、1b3oB_2、16vpA_6、1dhx_1、1b8aA_1、1qu6A_1からなる群より選択される1つのリンカー配列である。
【0062】
（表２）ペプチドリンカーの例
【0063】
いくつかの態様では、前記ペプチドリンカーは、カルシウム刺激下でTALE融合タンパク質のコンフォメーションを変化させるカルモジュリンドメインを含むことができる。特定の代謝物相互作用下でコンフォメーション変化を誘導する他のタンパク質ドメインも使用することができる。そのようなリンカーは、例えば、光刺激下で、折り畳まれた不活性状態から折り畳まれていない活性状態への変化、またはその逆を可能にする光感受性ドメインを含むことができる。「スイッチ」リンカーの他の例は、ダイマー化の化学誘導物質（Chemical Inducers of Dimerization）（CID）などの小分子に反応し得る。
【0064】
好ましい態様では、前述の好ましいC末端配列とともに本明細書で例示されるように、TALE融合タンパク質の最適なコンフォメーションを達成するのに十分な柔軟性をC末端配列が有し得るので、リンカーは、TALEコア結合ドメインを触媒ドメインと融合するのに必要でない可能性がある。
【0065】
本発明は、様々な機能ドメイン、例えば、異なる酵素から取得可能な触媒ドメインを含むTALE融合タンパク質を包含する。そのような触媒ドメインは、非特異的エンドヌクレアーゼ、例えば、Fok-1、clo51、もしくはI-Tev1など、または特異的エンドヌクレアーゼ、例えば、操作されたメガヌクレアーゼ（例えば、I-Cre1、I-Onu1、I-Bmo1、HmuIなどに由来する）、エキソヌクレアーゼ、例えば、ヒトTrex2、転写リプレッサー（例えば、KRAB）、もしくは転写活性化因子、例えば、VP64もしくはVP16、デアミナーゼ、例えば、シトシンデアミナーゼ1（pCDM）など、アデノシンデアミナーゼ、例えば、TadA ou TadA7.10、アポリポタンパク質B mRNA編集酵素触媒ポリペプチド様（APOBEC）、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（AICDA）、ウラシルグリコシラーゼインヒビター（UGI）と関連する可能性があるDddA（二本鎖DNAシチジンデアミナーゼ）、Cas9もしくはCpf1に由来するニッカーゼ、トランスポゼース、インテグラーゼ、トポイソメラーゼ、および逆転写酵素（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスRT酵素）、それらの機能的変異体、バリアント、または誘導体であり得る。
【0066】
本発明のTALE融合タンパク質中に含めることができる例示的なポリペプチド配列は、表3（SEQ ID NO:109～137）に列挙される。
【0067】
（表３）本発明のTALEタンパク質の例示的な触媒ドメイン
【0068】
別の態様では、本発明によるTALE融合タンパク質は、SEQ ID NO:109～137のいずれかと少なくとも80％、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである触媒ドメインを含む。
【0069】
遺伝子編集試薬がゲノム中で意図されない妨害を引き起こす可能性があるので、遺伝子編集は極めて重要であり、マルチプレックス方法がより広く使用されるようになるにしたがって、オフターゲットの可能性およびそのようなオフターゲット活性の下流への影響が大きくなる。そのような望ましくない開裂（オフターゲット）を最小限にすることは、特に、治療領域において、任意のゲノムエンジニアリング適用にとって、極めて重要な事項である。ゲノム中の望ましくない二本鎖切断は、染色体転座および細胞毒性につながる可能性がある[Cantoni O., et al. (1996) Cytotoxic impact of DNA single vs double strand breaks in oxidatively injured cells. Arch Toxicol Suppl 18:223-235]。現在、Tsai S., et al. [CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets (2017) Nat Methods 14(6):607-614], Hockemeyer D, et al. [Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases (2011) Nat. Biotechnol. 29(8):731-734] and Wienert B, et al. [Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq (2019) Science 364(6437):286-289]によって記載されているものなど、二次的な標的位置を解析し、オンターゲット／オフターゲット比を確定することによって、オフターゲットを予測および定量化するために利用可能な様々な技法が存在する。
【0070】
先に言及したように、TALEタンパク質は、はっきり定義されたDNA塩基対選択を有し、科学研究者および技術者がゲノム改変のためにTALE融合タンパク質を設計および構築する基本ストラテジーを提供する。TALEリピートタンデムは、個々のDNA塩基対の認識に関与する。そのようなタンデムは、ソレノイドの形状のRVDの3残基のループによって連結された1対のαヘリックスで構成されている。精度および結合親和性が可変性であるTALEタンパク質の作出のために、従来の6つのRVD（NG、HD、NI、NK、NH、およびNN）が頻繁に使用される。HDおよびNGは、それぞれシトシン（C）およびチミン（T）と結合する。これらの結合は強くかつおよび排他的である[Streubel J, et al. (2012) TAL effector RVD specificities and efficiencies. Nat Biotechnol 30(7):593-595]。NNは縮重RVDであり、通常、グアニン（G）とアデニン（A）の両方に結合親和性を示すが、グアニンに対するその特異性がより強いことが報告されている。RVD NIはAと結合し、NKはGと結合する。これらの結合は排他的であるが、これらの対の間の結合親和性は低く、そのため、結合は弱いと考えられる。したがって、中程度の親和性でGと結合するRVD NHを使用することが推奨される。TALEの結合親和性が標的DNA配列のメチル化状態の影響を受けるということも注目に値する。
【0071】
TALENのコードは縮重であり、これは、ある特定のRVDが、多様な範囲の効率で複数のヌクレオチドに結合することができることを意味する。NN（AおよびGに対する）ならびにNS（A、C、およびG）リピート可変性2残基の結合能力により、TALEタンパク質が、標的DNAに対して縮重をコードすることが可能になる。この縮重は、高頻度可変性部位を標的にするのに有用であり得るが。TALEタンパク質技術は、ゲノム中のエスケープ変異に対して容易に使用することができる方法で操作することができる、唯一の公知のゲノム編集ツールである。このユニークな特色によって、これは、特に臨床適用におけるゲノム編集の分野において、予測される変異を許容するための、より柔軟かつ信頼できるツールになる[Strong CL, et al. (2015) Damaging the integrated HIV proviral DNA with TALENs. PLoS One 10(5):e0125652.]。
【0072】
典型的なTALEタンパク質は、通常、34アミノ酸の18リピートからなる。TALENの対は、FokIは作用するためにダイマー化を必要とするので、オフセットとしての14～20ヌクレオチドの「スペーサー」によって分離された、反対側の標的部位に結合しなければならない。全体として、そのような長い（およそ36bp）DNA結合部位は、非常にまれなものとしてゲノム中に出現すると予想される。
【0073】
特異的TALEヌクレアーゼの開発
上記の教示に従うことによって、本発明に従って非常に特異的なTALEヌクレアーゼを生成することができ、多様な細胞タイプ、特に、植物または哺乳動物の細胞において、高度な開裂特異性および低い細胞毒性を可能にする。
上記の教示に従うことによって、本発明に従って非常に特異的なTALEヌクレアーゼを生成することができ、多様な細胞タイプ、特に、植物または哺乳動物の細胞において、高度な開裂特異性および低い細胞毒性を可能にする。
【0074】
いくつかの態様によれば、本発明のTALE融合タンパク質は、本明細書で記載されるTALEタンパク質と、例えば、Beurdeley, M. et al. [Compact designer TALENs for efficient genome engineering (2013) Nat Commun 4:1762]において古典的なTALEスキャフォールドで記載されるようなFok-1（SEQ ID NO:109）またはTev-1（SEQ ID NO:114）などの非特異的ヌクレアーゼのヌクレアーゼ触媒ドメインとの融合によって得られるTALEヌクレアーゼである。好ましい態様では、実施例において本明細書で例示されるように、前記ヌクレアーゼ触媒ドメインはFok1であり、すなわち、SEQ ID NO.1と少なくとも80％の同一性を示し、より好ましくは、SEQ ID NO:109における13、52、57、59、61、65、84、85、88、91、92、95、98、103、109、110、111、113、119、143、148、152、158、159、160、167、169、170、および194のアミノ酸置換のうちの少なくとも1つを含むポリペプチドを含む。好ましい置換は、位置84、85、88、95、98、91、103、109、148、152、および158に導入され、最も好ましい置換は、位置84、88、91、103、および152に存在する。
【0075】
いくつかの態様によれば、本発明のTALE融合タンパク質は、本明細書で記載されるTALEタンパク質とニッカーゼ、特に、Cas9ニッカーゼとの融合によって得られるTALEヌクレアーゼである。そのようなCas9ニッカーゼは、一般に、例えば、RuvCに変異D10AおよびHNHに変異H840Aを導入することによって、そのRuvCまたはHNHドメインにおいて変異している、Cas9タンパク質である。一般に、TALE-Cas9ニッカーゼ融合体は、古典的なTALEスキャフォールドでGuilinger, J., et al. [Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification (2014) Nat. Biotechnol. 32, 577-582]によって以前に記載されたように、対で使用される。
【0076】
いくつかの他の態様では、本発明のTALE融合タンパク質は、本明細書で記載されるTALEタンパク質と特異的なヌクレアーゼ、好ましくは、カスタマイズされたレアカッティングエンドヌクレアーゼ、例えば、メガヌクレアーゼバリアントとの融合によって得られるTALEヌクレアーゼである。好ましい態様では、前記レアカッティングエンドヌクレアーゼは、例えば、EP3320910およびEP3004338で以前に記載されたように、LADLIDADGのバリアント、例えば、I-creIまたはI-OnuIであり得る。
【0077】
一方で、本発明によるTALEヌクレアーゼはミトコンドリアの病原性変異によって誘発されるヒトミトコンドリア疾患を処置するための処置として、mtDNA（ミトコンドリアDNA）を効率的に操作する能力も有する。いわゆる「Mito-TALEN」（ミトコンドリア標的TALEN）は、mtDNA変異の影響を受けるヒトミトコンドリア障害、例えば、レーバー遺伝性視神経萎縮症、運動失調症、神経原性筋疲労、および網膜素性を効果的に処置するということが証明されている[Gammage, P.A., et al. (2018) Mitochondrial Genome Engineering: The Revolution May Not Be CRISPR-Ized. Trends in Genetics, 34(2):101-110]。プラスチドエンジニアリングも、作物の改良について様々な植物で十分な結果を実証している[Piatek AA, Lenaghan SC, Neal Stewart C. (2018) Advanced editing of the nuclear and plastid genomes in plants. Plant Sci 273:42-49]。
【0078】
本発明によるTALEヌクレアーゼの多くの例は、ヒト細胞、特に血液細胞における遺伝子の選択において非常に特異的な開裂を誘導するための治療試薬として使用されるために、本明細書において記載される。より詳細には、初代細胞において、特に、T細胞またはNK細胞において、例えば、TCRα、B2m、PD1、CTLA4、CISH、LAG3、TGFBRII、TIGIT、CD38、IgH、GADPH、およびCCR5などの遺伝子標的を開裂させるために、改善されたTALEヌクレアーゼ試薬が本教示に従って合成され、試験された。
【0079】
本発明によって得られたこれらのTALEタンパク質、ならびにそれらの標的配列（2つの左および右ヘテロダイマー結合部位にまたがるポリヌクレオチド配列）のポリペプチド配列は、以下の表4および5ならびに実施例セクションの表5および6に列挙される。
【0080】
（表４）療法において有用なTALEタンパク質の例
【0081】
（表４）（続き）上記のTALEタンパク質によって標的にされるゲノムポリヌクレオチド配列
【0082】
いくつかの好ましい態様では、本発明のTALEタンパク質は、対で使用することができ、この対の各メンバーは、特定の座位で触媒ドメインによって誘導される触媒活性を導く効果を有してゲノム中に共局在するような方法で、互いの近くで、並んで、または反対側のDNA鎖でDNAに結合する。例えば、「左」および「右」TALEヌクレアーゼモノマーとも称される、ホモダイマー化Fok1ヌクレアーゼドメインに融合した1対のTALEタンパク質は、DNA二本鎖切断開裂を誘導するヘテロダイマーを形成する。そのような場合、本発明は、本発明による1つのモノマーを、正準AvrBs3配列を使用した従来のTALEヌクレアーゼスキャフォールドに基づく別のモノマーとともに使用することができることを提供する。実際に、本明細書の実験セクションに示すように、本発明の1つのTALEヌクレアーゼモノマーは、ヘテロダイマーの特異性に対して全体的な効果を及ぼすのに十分である。
【0083】
したがって、本発明は、インビボまたはインビトロでの遺伝子治療的修飾におけるその使用のために、および治療用細胞のエクスビボ調製のために、ヌクレアーゼまたはデアミナーゼドメインと融合したそのようなタンパク質を含む、表Xに列挙されるTALEタンパク質に基づくいくつかの新規TALE融合モノマーを提供する。
【0084】
特定の局面によれば、本発明は、CTLA4遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:231を含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:138またはSEQ ID NO:139を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:174およびSEQ ID NO:175より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0085】
特定の局面によれば、本発明は、CISH遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:232を含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:140またはSEQ ID NO:141を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:176およびSEQ ID NO:177より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0086】
特定の局面によれば、本発明は、遺伝子改変、好ましくは、LAG3遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:233を含む標的配列中に変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:142またはSEQ ID NO:143を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:178およびSEQ ID NO:179より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0087】
特定の局面によれば、本発明は、TGFBRII遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:234を含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:144またはSEQ ID NO:145を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:180およびSEQ ID NO:181より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0088】
特定の局面によれば、本発明は、CCR5遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:235含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:146またはSEQ ID NO:147を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:182およびSEQ ID NO:183より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0089】
特定の局面によれば、本発明は、B2m遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:236またはSEQ ID NO:237を含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、またはSEQ ID NO:151を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、およびSEQ ID NO:187より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0090】
特定の局面によれば、本発明はTCRα遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:238を含む標的配列中に、遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:152またはSEQ ID NO:153を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:188およびSEQ ID NO:189より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0091】
特定の局面によれば、本発明は、PD1遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:239を含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:154またはSEQ ID NO:155を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:190およびSEQ ID NO:191より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0092】
特定の局面によれば、本発明は、PIK3CDex8遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:240を含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:156またはSEQ ID NO:157を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:192およびSEQ ID NO:193より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0093】
特定の局面によれば、本発明は、PIK3CDex17遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:241を含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:158またはSEQ ID NO:159を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:194およびSEQ ID NO:195より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0094】
特定の局面によれば、本発明は、S100A9遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:242を含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:160またはSEQ ID NO:161を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:196およびSEQ ID NO:197より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0095】
特定の局面によれば、本発明は、AAVS1遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:243を含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:162またはSEQ ID NO:163を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:198およびSEQ ID NO:199より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0096】
特定の局面によれば、本発明は、CD52遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:244を含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:164またはSEQ ID NO:165を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:200およびSEQ ID NO:201より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0097】
特定の局面によれば、本発明は、TCRα遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:245を含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:166またはSEQ ID NO:167を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:202およびSEQ ID NO:203より選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％または99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0098】
特定の局面によれば、本発明は、TGFBRII遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:246、247、または248を含む標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。前記TALEタンパク質は、好ましくは、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、またはSEQ ID NO:173を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、およびSEQ ID NO:209よりそれぞれ選択される配列と少なくとも90％、好ましくは、95％もしくは99％同一のポリペプチド配列からなるか、または前記ポリペプチド配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0099】
特定の局面によれば、本発明は、TIGIT遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:289を含むかまたはそれからなる標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:269および／もしくはSEQ ID NO:270と少なくとも90％、好ましくは、95％もしくは99％の同一性を有するポリペプチド配列からなるか、または前記ポリペプチド配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0100】
特定の局面によれば、本発明は、CISH遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:290、291、および／もしくは292を含むかまたはそれからなる標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:271、SEQ ID NO:272、SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:275および／もしくはSEQ ID NO:276と少なくとも90％、好ましくは、95％もしくは99％の同一性を有するポリペプチド配列からなるか、または前記ポリペプチド配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0101】
特定の局面によれば、本発明は、CD38遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:293および／もしくはSEQ ID NO:294を含むかまたはそれからなる標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:277、SEQ ID NO:278、SEQ ID NO:279、および／もしくはSEQ ID NO:280と少なくとも90％、好ましくは、95％もしくは99％の同一性を有するポリペプチド配列からなるか、または前記ポリペプチド配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0102】
特定の局面によれば、本発明は、IgH遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:295および／もしくはSEQ ID NO:296を含むかまたはそれからなる標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:281、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:283、および／もしくはSEQ ID NO:284と少なくとも90％、好ましくは、95％もしくは99％の同一性を有するポリペプチド配列からなるか、または前記ポリペプチド配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。
【0103】
特定の局面によれば、本発明は、GADPH遺伝子座位中に、好ましくは、SEQ ID NO:297および／もしくはSEQ ID NO:298を含むかまたはそれからなる標的配列中に遺伝子改変、好ましくは、変異を導入するためのTALEタンパク質モノマーを提供し、前記TALEタンパク質は、(1)SEQ ID NO:5～11を含む少なくとも3、好ましくは少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、または15リピートを含むTALE結合ドメイン、および(2)SEQ ID NO:2、3、または4と少なくとも85％の同一性を有する配列を含む40～80残基のC末端ポリペプチド配列を含む。特に、本発明は、SEQ ID NO:285、SEQ ID NO:286、SEQ ID NO:287、および／もしくはSEQ ID NO:288と少なくとも90％、好ましくは、95％もしくは99％の同一性を有するポリペプチド配列からなるか、または前記ポリペプチド配列を含むTALEヌクレアーゼモノマーを提供する。「変異」は、一般に、細胞のゲノム配列における、特徴づけされたポリヌクレオチド配列（野生型）中の1つまたは複数のヌクレオチドの任意の変化を本明細書において意味し、前記変化は、前記ヌクレオチド（または塩基対）の欠失または置換、ポリヌクレオチド断片、オリゴヌクレオチド、または外来配列、例えば、導入遺伝子の欠失挿入、組み込み、または転座を含む。そのような変異は、一般に、ゲノムが改変される細胞による機能の修正、喪失、または獲得につながる。
【0104】
TALE転写因子の開発
先の教示に従って、内在性遺伝子発現の制御を考慮して、本発明によるTALEタンパク質を望ましい転写活性化因子およびリプレッサータンパク質ドメインに融合して、特異的なトランス活性化因子またはリプレッサー試薬を作出することもできる。
先の教示に従って、内在性遺伝子発現の制御を考慮して、本発明によるTALEタンパク質を望ましい転写活性化因子およびリプレッサータンパク質ドメインに融合して、特異的なトランス活性化因子またはリプレッサー試薬を作出することもできる。
【0105】
一例として、Miller J.C., et al. [A TALE nuclease architecture for efficient genome editing (2011) Nat Biotechnol 29(2):143-148]によって記載されているように、本発明のTALEタンパク質と単純ヘルペスウイルス由来のVP64または16アミノ酸ペプチドVP16（SEQ ID NO:120）との融合によって、人工転写因子を得ることができる。
【0106】
遺伝子の抑制を達成するために、本発明のTALEタンパク質を、例えば、強い多面的リプレッサーであると以前に報告された[Cong L, et al. (2012) Comprehensive interrogation of natural TALE DNA-binding modules and transcriptional repressor domains. Nat Commun 3(1):968]、クルッペル結合ボックス（KRAB）、Sid4、またはEAR抑制ドメイン（SRDX）と融合することができる。
【0107】
TALE塩基エディターの開発
先の教示に従って、本発明によるTALEタンパク質を望ましい塩基エディターに融合することもできる。
先の教示に従って、本発明によるTALEタンパク質を望ましい塩基エディターに融合することもできる。
【0108】
本明細書において使用する場合、用語「塩基エディター」は、ある塩基を別の塩基（例えば、AをG、AをC、AをT、CをT、CをG、CをA、GをA、GをC、GをT、TをA、TをC、TをG）に変換する、核酸配列内の塩基（例えば、A、T、C、G、またはU）に対して修飾を行うことができる触媒ドメインを指す。アデニンおよびシトシン塩基エディター触媒ドメインは、例えば、Rees & Liu [Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells (2018) Nat. Rev. Genet. 19(12):770-788]に記載されている。
【0109】
触媒塩基エディターは、標的C/GをT/Aに変換するシチジンデアミナーゼ、および標的A/TをG/Cに変換するアデニン塩基エディターを含むことができる。好ましいシトシンデアミナーゼは、シトシンデアミナーゼ1（pCDM）または活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（AICDA）であり得る。好ましいアデノシンデアミナーゼは、TadA（SEQ ID NO:121）またはJeong, Y.K., et al. [Adenine base editor engineering reduces editing of bystander cytosines (2021) Nat. Biotechnol. https://doi.org/10.1038/s41587-021-00943]によって記載されているそのバリアントTadA7.10であり得る。アポリポタンパク質B mRNA編集酵素（APOBEC）ファミリーの異なるメンバー、例えば、マウスrAPOBEC1、およびLee et al. [Single C-to-T substitution using engineered APOBEC3G-nCas9 base editors with minimum genome- and transcriptome-wide off-target effects (2020) Science Advances. 6(29)]によって開発されたヒトAPOBEC3G（SEQ ID NO:130）を、シチジンをチミジンに変換するために使用することができる。
【0110】
好ましい態様では、塩基エディター触媒ドメインは、CをTに変換し（シチジンデアミナーゼ）、これは、化学反応「シトシン+H2O-＞ウラシル+NH3」または「5-メチル-シトシン+H2O-＞チミン+NH3」を触媒する。反応式から明らかであり得るように、そのような化学反応は、CからU/Tへの核酸塩基の変化をもたらす。遺伝子の文脈では、そのようなヌクレオチドの変化または変異は、次に、タンパク質のアミノ酸変化につながる可能性があり、これは、機能喪失または機能獲得など、タンパク質の機能に影響を及ぼす可能性がある。
【0111】
いくつかの態様では、本発明によるTALE塩基エディターは、「UGI」と称される、ウラシルグリコシラーゼを阻害するドメイン、および／または核局在化シグナルを含むことができる。本明細書において使用する場合、用語「ウラシルグリコシラーゼインヒビター」または「UGI」は、ウラシル-DNAグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することができるタンパク質を指す。いくつかの態様では、UGIドメインは、野生型UGIまたはSEQ ID NO:136に示される正準UGIを含む。いくつかの態様では、本明細書で提供されるUGIタンパク質は、SEQ ID NO:136に示されるアミノ酸配列の少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％を含むアミノ酸配列を含む、UGIの断片およびUGIまたはUGI断片に相同なタンパク質を含む。UGIを含む、本発明によるTALE塩基エディターは、所定の座位で実施される塩基編集の特異性を改善するのに有用である。
【0112】
いくつかの態様では、塩基エディター触媒ドメインは、二本鎖切断（DSB）でDNAを破壊するのではなく、ヌクレオチド変化を正確に組み込む、および／または病原性変異を修正するための二本鎖DNAデアミナーゼ（「DddA」）である。好ましい態様では、DddAtoxは、一般に、不活性断片に分断され、これらは、標的編集部位の両側などの部位でDddAの各断片を共局在化させる別々のTALE塩基エディターコンストラクト上の標的脱アミノ化部位に別々に送達され得、ここで、これらは、二本鎖DNA分子上の標的部位を脱アミノ化することができる機能的DddAを再形成する。ある特定の態様では、DddAドメインがミトコンドリア中に移動させられるような方法で1つまたは複数のミトコンドリアの局在化シグナル（MLS）を含むように、プログラム可能なDNA結合タンパク質を操作することができ、それによって、ミトコンドリアゲノムに対して塩基編集を直接的に行う手段を提供する。
【0113】
DddAの断片は、特定のアミノ酸残基、例えば、62、71、73、84、94、108、110、122、135、138、148、および155を含む群より選択されるアミノ酸残基でDddAtoxをトランケートする（すなわち、DddAタンパク質を分割または分断する）ことによって形成することができる。好ましい態様では、DddAのトランケーションは、残基148で生じる。ある特定の態様では、これらの分断部位のうちの1つでDddAを分割することによってDddAを2つの断片に分離して、「DddA-Nハーフ」および「DddA-Cハーフ」と称され得る、DddAのN末端部分およびC末端部分を形成することができる。好ましい態様によれば、前記「DddA-Nハーフ」および「DddA-Cハーフ」は、それぞれ、アミノ酸配列SEQ ID NO.134およびSEQ ID NO:135と少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％が共通であるアミノ酸配列を含む。図8に示すように、N-DddAハーフおよびC-DddAハーフをそれぞれ含む対で作用する2つのTALEタンパク質は、共局在化させ、オンサイト核酸塩基変化を誘導するために使用することができる。
【0114】
本発明のTALE塩基エディターは、1つの正確な座位で所与の塩基編集反応を得ることを考慮して、各メンバーが異なるが相補的な触媒ドメインを含む対で使用することもできる。
【0115】
TALE-トランスポゼースまたはインテグラーゼの開発
先の教示に従って、ゲノム中への導入遺伝子の部位特異的組み込みを実施するために、本発明によるTALEタンパク質をトランスポゼースまたはインテグラーゼに融合することもできる。
先の教示に従って、ゲノム中への導入遺伝子の部位特異的組み込みを実施するために、本発明によるTALEタンパク質をトランスポゼースまたはインテグラーゼに融合することもできる。
【0116】
一例として、本発明によるTALEタンパク質を、例えば、Owens, J.B. et al. [Transcription activator like effector (TALE)-directed piggyBac transposition in human cells (2013) N.A.R. 41(19):9197-9207]によって記載されるPiggyBacトランスポゼースに融合することができる。PiggyBacトランスポゼースは、そのようなシステムで自律的に機能的であり、その結果、コトランスフェクトされたトランスポゾンが、TALEタンパク質によって指定された任意のゲノム位置に組み込まれ得る。このシステムは、多数の成分、例えば、複数の導入遺伝子、インスレーター、および誘導性または内在性プロモーターをコードする大きなカセット（＞100kb）を永続的に導入することができ、ほとんどすべてのゲノム領域への組込みを潜在的に標的にすることを可能にする。このシステムは、安全な単一標的挿入をエクスビボで検証し、細胞を増幅し、患者に再注入する必要がある状況で特に価値がある。標的転位は、内在コード領域を意図的に破壊するために、または使用者が定めたゲノムセーフハーバーへの挿入を導いて、未知の染色体位置効果からカーゴを保護する、および標的細胞の偶然の変異を回避するために使用することができる。
【0117】
エピゲノムを編集するためのTALEタンパク質の開発
先の教示にさらに従って、特にクロマチンのリモデリングによってDNA配列を変化させることなく遺伝子の発現をモジュレートすることができる触媒ドメインとの融合によって、TALEタンパク質融合体を作製することができる。
先の教示にさらに従って、特にクロマチンのリモデリングによってDNA配列を変化させることなく遺伝子の発現をモジュレートすることができる触媒ドメインとの融合によって、TALEタンパク質融合体を作製することができる。
【0118】
この関連で、本発明によるTALEタンパク質を、ヒストンメチル化を得るためのメチルトランスフェラーゼ、および／またはヒストンアセチルトランスフェラーゼを増強するp300エフェクタードメインに融合することができる。
【0119】
逆に、DNAメチル化を消失させ、遺伝子発現を誘導するために、TALEタンパク質を触媒ドメインチミジンDNAグリコシラーゼ（TDG）に融合することができる。不必要なDNAメチル化は、多くの神経変性疾患と関連する。一例として、エピジェネティックにサイレンシングされた癌遺伝子（ICAM-1）を標的にし、癌性細胞でその発現を誘導ために、TALEタンパク質をTETドメイン（10;11転座メチルシトシンジオキシゲナーゼ2（ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 2））に融合することができる。TET1は、糖尿病（β細胞複製の誘導）および癌（細胞増殖の阻害）のような多くの疾患の処置において使用することもできる[Ou K., et al. (2019) Targeted demethylation at the CDKN1C/p57 locus induces human β cell replication. J Clin Invest 129(1):209-214]。
【0120】
本発明は、ポリヌクレオチド、特に、前述のポリペプチドおよびタンパク質をコードするDNAまたはRNA、ならびに、本明細書で記載される方法の任意の局面および工程に関与する任意の中間生成物を包含する。これらのポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞で発現されることを考慮して、ベクター、より詳細には、プラスミドまたはウイルス中に含めることができる。
【0121】
用語「ベクター（vector）」または「ベクター（vectors）」は、それに連結した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。本発明における「ベクター」としては、限定されないが、ウイルスベクター、プラスミド、RNAベクター、または染色体核酸、非染色体核酸、半合成核酸、もしくは合成核酸からなり得る直鎖状もしくは環状のDNAもしくはRNAが挙げられる。好ましいベクターは、自律複製（エピソームベクター）および／またはそれに連結している核酸の発現（発現ベクター）ができるものである。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、特に、AAV6ベクター、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、マイナス鎖RNAウイルス、例えば、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹およびセンダイ）、プラス鎖RNAウイルス、例えば、ピコルナウイルスおよびアルファウイルス、ならびに二本鎖DNAウイルス、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス1型および2型、エプスタイン-バーウイルス、サイトメガロウイルス）、ならびにポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、およびカナリアポックス）が挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポーバウイルス、ヘパドナウイルス、および肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、トリ白血病肉腫、哺乳動物C型、B型ウイルス、D型ウイルス、HTLV-BLV群、レンチウイルス、スプマウイルスが挙げられる（Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996）。
【0122】
本発明によれば、細胞中に効果的に送達するために、TALEタンパク質またはそれをコードするポリヌクレオチド、特にmRNAをナノ粒子中に装填することもできる。特定の組織の細胞タイプを標的にするための様々なナノ粒子が当技術分野において記載されている[Friedman A.D. et al. (2013) The Smart Targeting of Nanoparticles Curr Pharm Des. 19(35): 6315-6329]。好ましいナノ粒子は正に荷電したナノ粒子、例えば、シリカベースのナノ粒子、または他のタイプのヌクレアーゼとともに当技術分野において記載されているLNP（脂質ナノモルナノ粒子（Lipid nanomolar nanoparticles））[Conway, A. et al. (2019) Non-viral Delivery of Zinc Finger Nuclease mRNA Enables Highly Efficient In Vivo Genome Editing of Multiple Therapeutic Gene Targets, Molecular Therapy 27(4):866-877]である。
【0123】
あるいは、特にmRNAの形態の、本発明の本TALEタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、例えば、参照により本明細書に組み入れられるWO2013176915の29頁および30頁に記載されている工程を使用することによって、エレクトロポレーションによって、血液細胞中に直接エレクトロポレーションすることができる。
【0124】
本発明は、標的核酸開裂から標的遺伝子調節に及ぶ様々な適用のための、前述のポリペプチド、ポリヌクレオチド、およびタンパク質の使用ための方法にも関する。ゲノム操作実験では、本特許出願において言及されるヌクレアーゼ融合タンパク質の効率、例えば、望ましい事象（相同遺伝子ターゲティング、標的変異誘発、配列の除去または切除、塩基編集）をある座位で誘導する能力は、ヌクレアーゼの比活性、おそらく標的の接近可能性、ならびに望ましい事象をもたらす修復経路（遺伝子ターゲティングのための相同修復、標的変異誘発のためのNHEJ経路）の有効性および成果を含めて、いくつかのパラメーターに依存し、これらは、当技術分野において公知である標準的な技法によって評価することができる。本発明は、より詳細には、本発明の1つのTALE融合タンパク質を使用して、核酸標的配列内の、または核酸標的配列に隣接する、細胞の遺伝物質を修飾するための方法に関する。例えば、TALEヌクレアーゼによって引き起こされる二本鎖切断は、一般に、非相同末端結合（NHEJ）を通じて修復される。NHEJは、少なくとも2つの異なプロセスを含む。機序は、直接再ライゲーションを通じた、またはいわゆるマイクロホモロジー媒介末端結合を介した、2つのDNA末端の残存するものの再結合をともなう。非相同末端結合（NHEJ）を介した修復は、しばしば、小さな挿入または欠失をもたらし、特異的な遺伝子ノックアウトの作出のために使用することができる。
【0125】
本開示の他の局面は、本発明の方法によって取得可能なTALEタンパク質の様々な成分（例えば、TALEヌクレアーゼ、TALEデアミナーゼ、TALE転写酵素、TALEメチラーゼ、TALEトランスポゼースなど）のいずれかを含む薬学的組成物に関する。
【0126】
本明細書において使用する場合、用語「薬学的組成物」は、薬学的使用のために製剤化された組成物を指す。いくつかの態様では、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの態様では、薬学的組成物は、（例えば、特異的送達、半減期の増加、または他の治療用化合物のための）さらなる剤を含む。
【0127】
いくつかの態様では、薬学的組成物は、インビボまたはエクスビボで、特に、遺伝子療法において、使用することができる、遺伝的欠損を修正する試薬として、提供される。
【0128】
好ましい態様では、本発明のTALEタンパク質は、エクスビボで血液細胞、特に免疫細胞、例えば、T細胞およびNK細胞、好ましくは、初代細胞を遺伝的に改変して、免疫療法のための治療用細胞を生成するために使用される。
【0129】
いくつかの態様では、薬学的組成物は、対象（例えばヒト）への静脈内または皮下投与に適している組成物として、通例の手順に従って製剤化される。いくつかの態様では、注射による投与のための薬学的組成物は、無菌等張水性緩衝液中の溶液剤である。必要に応じて、前記薬学的組成物は、可溶化剤および注射部位の疼痛を和らげるために、リドカインなどの局所麻酔を含むこともできる。一般に、成分は、別々か、または単位剤形中に一緒に混合されてかのいずれかで、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたは小袋などの密封容器に入れられた凍結乾燥粉末または水非含有濃縮物として供給される。前記薬学的組成物が注入によって投与される場合、これは、無菌の薬学的グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて調剤することができる。
【0130】
脂質粒子またはベジクル、例えば、リポソームまたは微結晶中に前記薬学的組成物を含めることができ、これも非経口投与に適している。粒子は、組成物がその中に含まれる限り、単層または多層などの任意の適切な構造であり得る。融合性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、低レベル（5～10mol％）のカチオン性脂質を含み、ポリエチレングリコール（PEG）コーティングによって安定化された「安定化プラスミド脂質粒子」（SPLP）（Zhang Y. P. et ah, Gene Ther. 1999, 6:1438-47）中に化合物を封入することができる。正に荷電した脂質、例えば、N-[l-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル]-N,N,N-トリメチル-アンモニウムメチルスルフェート、すなわち「DOTAP」が、そのような粒子およびベジクルにとって特に好ましい。そのような脂質粒子の調製は周知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,880,635号；同第4,906,477号；同第4,911,928号；同第4,917,951号；同第4,920,016号；および同第4,921,757号を参照されたい。
【0131】
本明細書で記載される薬学的組成物は、例えば、単位用量として、投与また包装することができる。本開示の薬学的組成物に関連して使用される場合、用語「単位用量」は、対象に対する単位投薬量として適する、物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要とされる希釈剤；すなわち、担体またはビヒクルとともに、望ましい治療効果をもたらすように計算された所定の量の活性材料を含む。
【0132】
さらに、前記薬学的組成物は、例えば、(a)凍結乾燥形態の本発明の化合物を含む容器；および(b)注射用の薬学的に許容される希釈剤（例えば、滅菌水）を含む第2の容器を含む、薬学的キットとして提供することができる。薬学的に許容される希釈剤は、本発明の凍結乾燥された化合物の再構成または希釈のために使用することができる。薬学的または生物学的生成物の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって定められた形態の通知を、そのような容器に任意で付随させることができ、この通知は、ヒト投与のための、製造、使用、または販売の機関による承認を反映する。
【実施例】
【0133】
実施例1：方法
TALEヌクレアーゼヘテロダイマーの構築
デノボ合成（Integrated DNA TechnologiesまたはGenescript）を使用して、DNAターゲティングモジュール、リンカードメイン、またはFokIドメイン中に変異を導入し、標準的な分子生物学技法、例えば、酵素による制限消化、ライゲーション、細菌形質転換を使用して、TALEヌクレアーゼモノマーをアセンブルした。サンガーシークエンシングによって、すべての配列の完全性を評価した。
TALEヌクレアーゼヘテロダイマーの構築
デノボ合成（Integrated DNA TechnologiesまたはGenescript）を使用して、DNAターゲティングモジュール、リンカードメイン、またはFokIドメイン中に変異を導入し、標準的な分子生物学技法、例えば、酵素による制限消化、ライゲーション、細菌形質転換を使用して、TALEヌクレアーゼモノマーをアセンブルした。サンガーシークエンシングによって、すべての配列の完全性を評価した。
【0134】
TALEヌクレアーゼ融合mRNAの生成
標準的な分子生物学手順に従って、TALEヌクレアーゼヘテロダイマーをコードするプラスミドでXL1 Blueコンピテント細菌を形質転換する。少なくとも2つのコロニーをミニプレップ培養としてアガロースプレートから選び、製造業者のプロトコール（Qiagen）に従って、QIAprep 96 plus MiniprepキットによってDNAを抽出した。配列が検証されたプラスミドを標準的な分子生物学的技法を使用して直鎖状にし、Nucleospin Gel and PCR Clean-upキット（Macherey-Nagel）を使用して精製した。製造業者のプロトコール（NEB）に従ってHiScribe T7 ARCA mRNAキットを使用して、mRNAを生成し、これを、製造者の指示書に従って、KingFisher Flex System（Thermo Fisher Scientific）でMag-Bind Total Pure NGS 磁気ビーズ（Omega）を用いて精製した。
標準的な分子生物学手順に従って、TALEヌクレアーゼヘテロダイマーをコードするプラスミドでXL1 Blueコンピテント細菌を形質転換する。少なくとも2つのコロニーをミニプレップ培養としてアガロースプレートから選び、製造業者のプロトコール（Qiagen）に従って、QIAprep 96 plus MiniprepキットによってDNAを抽出した。配列が検証されたプラスミドを標準的な分子生物学的技法を使用して直鎖状にし、Nucleospin Gel and PCR Clean-upキット（Macherey-Nagel）を使用して精製した。製造業者のプロトコール（NEB）に従ってHiScribe T7 ARCA mRNAキットを使用して、mRNAを生成し、これを、製造者の指示書に従って、KingFisher Flex System（Thermo Fisher Scientific）でMag-Bind Total Pure NGS 磁気ビーズ（Omega）を用いて精製した。
【0135】
細胞
IL-2（Miltenyi Biotech,）およびヒト血清AB（Seralab）を含むX-vivo-15培地（Lonza Group）中で、凍結保存したヒトPBMCを培養した。提供者のプロトコールに従って、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation（Thermo Fisher Scientific）を使用して、T細胞を3日間活性化してから、新鮮な培地に継代した。
IL-2（Miltenyi Biotech,）およびヒト血清AB（Seralab）を含むX-vivo-15培地（Lonza Group）中で、凍結保存したヒトPBMCを培養した。提供者のプロトコールに従って、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation（Thermo Fisher Scientific）を使用して、T細胞を3日間活性化してから、新鮮な培地に継代した。
【0136】
TALEヌクレアーゼのエレクトロポレーション
2つの異なるプロトコールを実験の異なるセットで択一的に使用した。
(A)活性化から4日後、AgilePulse MAXシステム（Harvard Apparatus）を使用して、エレクトロポレーションによってヒトTリンパ球がトランスフェクトされた。細胞をペレットにし、サイトポーレーション（cytoporation）培地Tに＞28×106細胞/mlで再懸濁した。合計で10μgの示されるTALEヌクレアーゼmRNA（各5ugの左モノマーおよび右モノマー）と5×106細胞を0.4cmキュベット中で混合した。並行して、モックトランスフェクション（mRNAなし）を行った。エレクトロポレーションは、800Vで2回の0.1msパルス、それに続く、130Vで4回の0.2msパルスからなっていた。エレクトロポレーションに続いて、細胞を半分に分断し、別々のプレートの1.2mLの新鮮な温かい培養培地に希釈し、30℃/5％CO2で一晩インキュベートした。細胞を完全培地に継代し、37℃/5％CO2で2日間維持した。
(B)あるいは、活性化から4日後、Lonza 4D Nucleofector（Lonza）を使用して、エレクトロポレーション（プログラムコードEO 115）によってヒトTリンパ球がトランスフェクトされた。細胞をペレットにし、PBSで洗浄し、P3 Primary Cell 4D-Nucleofector Xキット（Lonza）を使用して＞50×106細胞/mlで再懸濁した。4D Nucleofectorシステム用の96-well Shuttleアドオン（Lonza）中で、1×106細胞を1～3μgの全mRNA（各0.5～1.5ugの左モノマーおよび右モノマー）と混合した。並行して、モックトランスフェクション（mRNAなし）を行った。エレクトロポレーションに続いて、温かい新鮮な温かい培養培地を含む96ウェルまたは48ウェル培養プレート中に細胞を移し、これを30℃/5％CO2で一晩インキュベートした。細胞を完全培地に継代し、37℃/5％CO2で2日間維持した。
2つの異なるプロトコールを実験の異なるセットで択一的に使用した。
(A)活性化から4日後、AgilePulse MAXシステム（Harvard Apparatus）を使用して、エレクトロポレーションによってヒトTリンパ球がトランスフェクトされた。細胞をペレットにし、サイトポーレーション（cytoporation）培地Tに＞28×106細胞/mlで再懸濁した。合計で10μgの示されるTALEヌクレアーゼmRNA（各5ugの左モノマーおよび右モノマー）と5×106細胞を0.4cmキュベット中で混合した。並行して、モックトランスフェクション（mRNAなし）を行った。エレクトロポレーションは、800Vで2回の0.1msパルス、それに続く、130Vで4回の0.2msパルスからなっていた。エレクトロポレーションに続いて、細胞を半分に分断し、別々のプレートの1.2mLの新鮮な温かい培養培地に希釈し、30℃/5％CO2で一晩インキュベートした。細胞を完全培地に継代し、37℃/5％CO2で2日間維持した。
(B)あるいは、活性化から4日後、Lonza 4D Nucleofector（Lonza）を使用して、エレクトロポレーション（プログラムコードEO 115）によってヒトTリンパ球がトランスフェクトされた。細胞をペレットにし、PBSで洗浄し、P3 Primary Cell 4D-Nucleofector Xキット（Lonza）を使用して＞50×106細胞/mlで再懸濁した。4D Nucleofectorシステム用の96-well Shuttleアドオン（Lonza）中で、1×106細胞を1～3μgの全mRNA（各0.5～1.5ugの左モノマーおよび右モノマー）と混合した。並行して、モックトランスフェクション（mRNAなし）を行った。エレクトロポレーションに続いて、温かい新鮮な温かい培養培地を含む96ウェルまたは48ウェル培養プレート中に細胞を移し、これを30℃/5％CO2で一晩インキュベートした。細胞を完全培地に継代し、37℃/5％CO2で2日間維持した。
【0137】
細胞を遠心分離によってペレットにし、製造者の指示書に従って、KingFisher Flex System（Thermo Fisher Scientific）でMag-Bind Blood & Tissue DNA HDQ 96 Kit（Omega）を使用して、ゲノムDNAを抽出した。
【0138】
Phusion High Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer（NEB）を使用して内在性座位の標的PCRを行って、TALEヌクレアーゼの切断部（cut on）の周囲約300bpの領域を増幅した。製造者の指示書に従って、KingFisher Flex System（Thermo Fisher Scientific）でMag-Bind Total Pure NGS 磁気ビーズ（Omega）を使用して、PCR産物を精製した。ディープシークエンシング（Illumina）によって、増幅産物をさらに解析した。
【0139】
TALEヌクレアーゼの開裂特異性の評価
オリゴキャプチャーアッセイは、（Tsai et al., GUIDE-seq paper）から適合させ、Fluentオートメーションワークステーションリキッドハンドラーロボット（Tecan）で行った。
オリゴキャプチャーアッセイは、（Tsai et al., GUIDE-seq paper）から適合させ、Fluentオートメーションワークステーションリキッドハンドラーロボット（Tecan）で行った。
【0140】
TALEヌクレアーゼをPCRによって増幅可能な非特異的オリゴヌクレオチドとともにコエレクトロポレーションし、温かい新鮮な温かい培養培地を含む96ウェルまたは48ウェル培養プレート中に細胞を移し、これを30℃/5％CO2で一晩インキュベートした。細胞を完全培地に継代し、37℃/5％CO2で2日間維持した。細胞を遠心分離によってペレットにし、製造者の指示書に従って、KingFisher Flex System（Thermo Fisher Scientific）でMag-Bind Blood & Tissue DNA HDQ 96 Kit（Omega）を使用して、ゲノムDNAを抽出した。
【0141】
ディープシークエンシング（Illumina）によって、最終的なライブラリーをさら解析した。
【0142】
実施例2：C末端ドメインの変異の効果
49塩基対の配列をヒトCS1遺伝子（SEQ ID NO:228）中にターゲティングすることによって、Christian et al. [Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases (2010) Genetics 186:757-761]によって記載されているヘテロダイマーTALE-Fok1ヌクレアーゼ（V0）を含む正準TALEヌクレアーゼ融合体（SEQ ID:210およびSEQ ID NO:211）から始めて、位置K37およびK38（正準AvrBs3 C40SEQ ID NO:109に対する）でDNA結合コアとFokI触媒頭部の間のC末端配列に2セットの置換(i)2つのヒスチジン（HH、V0.1；SEQ ID NO:212およびSEQ ID NO:213）ならびに(ii)2つのアルギニン（RR、V0.2；SEQ ID NO:214およびSEQ ID NO:215）を導入した。
49塩基対の配列をヒトCS1遺伝子（SEQ ID NO:228）中にターゲティングすることによって、Christian et al. [Targeting DNA Double-Strand Breaks with TAL Effector Nucleases (2010) Genetics 186:757-761]によって記載されているヘテロダイマーTALE-Fok1ヌクレアーゼ（V0）を含む正準TALEヌクレアーゼ融合体（SEQ ID:210およびSEQ ID NO:211）から始めて、位置K37およびK38（正準AvrBs3 C40SEQ ID NO:109に対する）でDNA結合コアとFokI触媒頭部の間のC末端配列に2セットの置換(i)2つのヒスチジン（HH、V0.1；SEQ ID NO:212およびSEQ ID NO:213）ならびに(ii)2つのアルギニン（RR、V0.2；SEQ ID NO:214およびSEQ ID NO:215）を導入した。
【0143】
変異を有するいずれかのモノマーまたは両方を含む、得られたTALEヌクレアーゼの活性を、実施例1に記載されるように、一次T細胞において評価した。上記の置換HHおよびRRをそれぞれ有する単一ヘテロダイマーの存在は、インデル頻度で実証されるように、より高い活性につながった（図2）。両方のRR変異TALEヌクレアーゼヘテロダイマーの存在下でTALEヌクレアーゼ活性も改善された。
【0144】
重要なことに、HHを有する単一変異TALEモノマーで活性が増強されたと同時に、オリゴキャプチャーアッセイで評価したゲノムワイドな特異性プロファイルも改善された（図3）。
【0145】
実施例3：DNAターゲティングリピートおよびC末端ドメインにおけるアミノ酸変化の効果
CS1（SEQ ID NO:228）中の49塩基対の標的配列を標的にする同じ正準TALEヌクレアーゼヘテロダイマー（SEQ ID NO:210およびSEQ ID NO:211）から始めて、DNA結合リピート（SEQ ID NO:24～27）中に一連の置換を導入し、V1ヘテロダイマーTALEヌクレアーゼ（SEQ ID NO:216およびSEQ ID:217）を得た。
CS1（SEQ ID NO:228）中の49塩基対の標的配列を標的にする同じ正準TALEヌクレアーゼヘテロダイマー（SEQ ID NO:210およびSEQ ID NO:211）から始めて、DNA結合リピート（SEQ ID NO:24～27）中に一連の置換を導入し、V1ヘテロダイマーTALEヌクレアーゼ（SEQ ID NO:216およびSEQ ID:217）を得た。
【0146】
V1から始めて、C末端配列中の位置K37およびK38にアルギニン（R）変異をさらに導入して、V1.2（SEQ ID NO:218およびSEQ ID NO:219）を得た。
【0147】
得られたTALEヌクレアーゼV1およびV1.2ならびに元のTALEN（V0）の活性を、実施例1に記載されるように、一次T細胞において評価した。V0 TALENにマッチする活性は、インデル頻度で実証されるように、V1.2 TALEヌクレアーゼを使用することで回復した（図4）。2つのオフサイト標的、OS1およびOS2（SEQ ID NO:229およびSEQ ID NO:230）に対して、インデル頻度をさらに評価した。図5は、V1 TALEヌクレアーゼとV1.2 TALEヌクレアーゼの両方を使用することによって、両方の標的に対するインデル頻度がバックグラウンドまで低減したことを示す。
【0148】
最後に、オリゴキャプチャーアッセイで評価したゲノムワイドな特異性プロファイルは、VOと比較した場合に、V1およびV1.2ヘテロダイマー構造を使用することにより改善され（図6）、活性は、特異的な元のCS1標的配列でのみ検出された。
【0149】
実施例4：FokI触媒頭部におけるアミノ酸変化の効果
VO構造（SEQ ID NO:210）のモノマーのライブラリーを、野生型FokI触媒ドメイン（SEQ ID NO:109）の各アミノ酸を1つずつアラニンで置換することによって作出した。
VO構造（SEQ ID NO:210）のモノマーのライブラリーを、野生型FokI触媒ドメイン（SEQ ID NO:109）の各アミノ酸を1つずつアラニンで置換することによって作出した。
【0150】
SEQ ID NO:210の得られた置換V0モノマーおよび他の元のままのモノマーのそれぞれによって形成されるヘテロダイマーによって生じるTALEヌクレアーゼ活性を、「オンサイト」標的（SEQ ID NO:228）ならびに2つの「オフサイト」標的、OS1およびOS2（SEQ ID NO:229およびSEQ ID NO:230）におけるインデル形成によって評価した。
【0151】
ライブラリーの各バリアントについての「オンサイト」および「オフサイト」におけるインデルの検出を、野生型Fok1（pCLS32855およびpCLS31911）（SEQ ID NO:210およびSEQ ID NO:211）によって得られたインデルに対して正規化した（図6）。
【0152】
図7に示すように、Fok1触媒ドメイン中へのいくつかの置換は、予測されたオフターゲットOS1におけるインデル形成の減少と相関し、同時に、野生型Fok1配列と比較して70％を超える実質的なヌクレアーゼ活性を維持することが分かった。SEQ ID NO:109中へのこれらのアラニン置換は、アミノ酸位置13、52、57、59、61、65、84、85、88、91、92、95、98、103、109、110、111、113、119、143、148、152、158、159、160、167、169、170、および194に関するものであった。いくつかの置換は、インデル形成を減少させ、同時に、位置84、85、88、95、98、91、103、109、148、152、および158に導入された置換のように完全なヌクレアーゼ活性を維持し、さらに、位置84、88、および91においてヌクレアーゼ活性の増加（100％を超える活性）をもたらすことが分かった。
【0153】
実施例5：CD52遺伝子中にナンセンス変異を導入するためのTALE塩基エディター
TALE塩基エディターヘテロダイマーの構築
表6でも言及されるCD52標的配列SEQ ID NO:249～252を標的にし、これらの標的配列において1つまたは複数の核酸塩基CをTに変換するように、ポリヌクレオチド配列を設計し、これは、スプライス部位を破壊するか、またはそれらの標的配列中に変異を導入し、一次T細胞におけるCD52の表面提示を不活性化することを目的として、図8で図示されるヘテロダイマー構造を発現することを考慮した。
TALE塩基エディターヘテロダイマーの構築
表6でも言及されるCD52標的配列SEQ ID NO:249～252を標的にし、これらの標的配列において1つまたは複数の核酸塩基CをTに変換するように、ポリヌクレオチド配列を設計し、これは、スプライス部位を破壊するか、またはそれらの標的配列中に変異を導入し、一次T細胞におけるCD52の表面提示を不活性化することを目的として、図8で図示されるヘテロダイマー構造を発現することを考慮した。
【0154】
1つのポリヌクレオチド配列は、そのN末端でNLSに、およびそのC末端でN-分断DddAデアミナーゼ+UGIに融合したTALEタンパク質（それぞれ、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:224、およびSEQ ID NO:226）を含む第1のモノマーをコードする。
【0155】
他のポリヌクレオチド配列はそのN末端でNLSに、およびそのC末端でC-分断DddAデアミナーゼ+UGIに融合したTALEタンパク質（それぞれ、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:225およびSEQ ID NO:227）を含む、第2のモノマーをコードする。
【0156】
酵素による制限消化、ライゲーション、および細菌形質転換を使用する標準的な分子生物学技法を使用して、上記のTALEタンパク質のポリヌクレオチド配列をアセンブルした。サンガーシークエンシングによって、すべてのポリヌクレオチド配列の完全性を評価した。
【0157】
XL1-Blueなどの適切な細菌における産生のために、上記のモノマーをコードするポリヌクレオチド配列をプラスミドにクローニングした。
【0158】
TALEヌクレアーゼ融合mRNAの生成
標準的な分子生物学手順に従って、TALEヌクレアーゼヘテロダイマーをコードするプラスミドでXL1 Blueコンピテント細菌を形質転換する。少なくとも2つのコロニーをミニプレップ培養としてアガロースプレートから選び、製造業者のプロトコール（Qiagen）に従って、QIAprep 96 plus MiniprepキットによってDNAを抽出した。配列が検証されたプラスミドを標準的な分子生物学的技法を使用して直鎖状にし、Nucleospin Gel and PCR Clean-upキット（Macherey-Nagel）を使用して精製した。製造業者のプロトコール（NEB）に従ってHiScribe T7 ARCA mRNAキットを使用して、mRNAを生成し、これを、製造者の指示書に従って、KingFisher Flex System（Thermo Fisher Scientific）でMag-Bind Total Pure NGS 磁気ビーズ（Omega）を用いて精製した。
標準的な分子生物学手順に従って、TALEヌクレアーゼヘテロダイマーをコードするプラスミドでXL1 Blueコンピテント細菌を形質転換する。少なくとも2つのコロニーをミニプレップ培養としてアガロースプレートから選び、製造業者のプロトコール（Qiagen）に従って、QIAprep 96 plus MiniprepキットによってDNAを抽出した。配列が検証されたプラスミドを標準的な分子生物学的技法を使用して直鎖状にし、Nucleospin Gel and PCR Clean-upキット（Macherey-Nagel）を使用して精製した。製造業者のプロトコール（NEB）に従ってHiScribe T7 ARCA mRNAキットを使用して、mRNAを生成し、これを、製造者の指示書に従って、KingFisher Flex System（Thermo Fisher Scientific）でMag-Bind Total Pure NGS 磁気ビーズ（Omega）を用いて精製した。
【0159】
細胞
IL-2（Miltenyi Biotech,）およびヒト血清AB（Seralab）を含むX-vivo-15培地（Lonza Group）中で、凍結保存したヒトPBMCを培養した。提供者のプロトコールに従って、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation（Thermo Fisher Scientific）を使用して、T細胞を3日間活性化してから、新鮮な培地に継代した。
IL-2（Miltenyi Biotech,）およびヒト血清AB（Seralab）を含むX-vivo-15培地（Lonza Group）中で、凍結保存したヒトPBMCを培養した。提供者のプロトコールに従って、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation（Thermo Fisher Scientific）を使用して、T細胞を3日間活性化してから、新鮮な培地に継代した。
【0160】
TALE塩基エディターヌクレアーゼのエレクトロポレーション
活性化から4日後、AgilePulse MAXシステム（Harvard Apparatus）を使用して、エレクトロポレーションによってヒトTリンパ球がトランスフェクトされた。細胞をペレットにし、サイトポーレーション培地Tに＞28×106細胞/mlで再懸濁した。合計で10μgの示されるTALEヌクレアーゼmRNA（各5ugの左モノマーおよび右モノマー）と5×106細胞を0.4cmキュベット中で混合した。並行して、モックトランスフェクション（mRNAなし）を行った。エレクトロポレーションは、800Vで2回の0.1msパルス、それに続く、130Vで4回の0.2msパルスからなっていた。エレクトロポレーションに続いて、細胞を半分に分断し、別々のプレートの1.2mLの新鮮な温かい培養培地に希釈し、30℃/5％CO2で一晩インキュベートした。細胞を完全培地に継代し、37℃/5％CO2で2日間維持した。
活性化から4日後、AgilePulse MAXシステム（Harvard Apparatus）を使用して、エレクトロポレーションによってヒトTリンパ球がトランスフェクトされた。細胞をペレットにし、サイトポーレーション培地Tに＞28×106細胞/mlで再懸濁した。合計で10μgの示されるTALEヌクレアーゼmRNA（各5ugの左モノマーおよび右モノマー）と5×106細胞を0.4cmキュベット中で混合した。並行して、モックトランスフェクション（mRNAなし）を行った。エレクトロポレーションは、800Vで2回の0.1msパルス、それに続く、130Vで4回の0.2msパルスからなっていた。エレクトロポレーションに続いて、細胞を半分に分断し、別々のプレートの1.2mLの新鮮な温かい培養培地に希釈し、30℃/5％CO2で一晩インキュベートした。細胞を完全培地に継代し、37℃/5％CO2で2日間維持した。
【0161】
細胞を遠心分離によってペレットにし、製造者の指示書に従って、KingFisher Flex System（Thermo Fisher Scientific）でMag-Bind Blood & Tissue DNA HDQ 96 Kit（Omega）を使用して、ゲノムDNAを抽出した。
【0162】
製造者の指示書に従って、Phusion High Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer（NEB）を使用して内在性座位の標的PCRを行って、CD52標的配列（SEQ ID NO:249、250、251、および252）にまたがる約300bpの領域を増幅した。変異事象（核酸塩基の変換）の検出のために、ディープシークエンシング（Illumina）によって、増幅産物をさらに解析した。
【0163】
実施例6：TGFBRII遺伝子配列を標的にするTALEヌクレアーゼの特異性の改善
TGFBRIIを標的にするTALEヌクレアーゼのオフターゲット解析
TGFBRII遺伝子配列（SEQ ID NO:234）を標的にするTALENモノマーの「古典的」バージョン（V0）をタンデムDD-RR変異を含む本発明による改善されたTALENモノマーバージョンV1.2と比較し、オリゴキャプチャーアッセイによってその特異性を試験した。
TGFBRIIを標的にするTALEヌクレアーゼのオフターゲット解析
TGFBRII遺伝子配列（SEQ ID NO:234）を標的にするTALENモノマーの「古典的」バージョン（V0）をタンデムDD-RR変異を含む本発明による改善されたTALENモノマーバージョンV1.2と比較し、オリゴキャプチャーアッセイによってその特異性を試験した。
【0164】
TGFBRII遺伝子配列SEQ ID NO:234を標的にする「古典的」TALEヌクレアーゼ（V0）モノマーおよびDD-RR（V1.2）モノマーをコードするmRNAは、Poirot et al. [Cancer Res (2015) 75 (18): 3853-3864]に記載されるように、mMessage mMachine T7 Ultraキット（Life Technologies）の使用によるものであり、RNeasyカラム（Qiagen）で精製し、水またはサイトポーレーション培地T（Harvard Apparatus）に溶出した。
【0165】
予測されたオフサイトゲノム位置でオリゴキャプチャーアッセイ解析を実施するために、ヘテロダイマー対V0-V0、V0-V1.2、およびV1.2-V1.2をそれぞれPCRによって増幅可能な非特異的オリゴヌクレオチドとともにコエレクトロポレーションした。これらの予測されたオフサイト位置は、V0-V0 TALENモノマーについて以前に特定されていた。
【0166】
左モノマーおよび右モノマーのポリペプチド配列を以下の表5に提供する。
【0167】
IL-2（Miltenyi Biotech,）およびヒト血清AB（Seralab）を含むX-vivo-15培地（Lonza Group）中で、凍結保存したヒトPBMCを培養した。提供者のプロトコールに従って、Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation（Thermo Fisher Scientific）を使用して、T細胞を活性化した。活性化から6日後、同じTGFBRII標的配列（SEQ ID NO:234）を標的にする異なるTALEヌクレアーゼバージョンを用いて、AgilePulse MAXシステム（Harvard Apparatus）を使用してTリンパ球をエレクトロポレーションした。使用したTALEヌクレアーゼは、SEQ ID NO:267およびSEQ ID NO:268に対応する変異を含んでいなかった（VO-VO）か、またはSEQ ID NO:181およびSEQ ID NO:268に対応するDD-RR変異（V1.2-V0）を含むハーフTALEヌクレアーゼ、もしくは最終的に、SEQ ID NO:181およびSEQ ID NO:180に対応するDD-RR変異（V1.2-V1.2）を含む両方のハーフTALEヌクレアーゼを含んでいたかのいずれかであった。T細胞をペレットにし、サイトポーレーション培地Tに再懸濁し、0.5μgの示される各ハーフTALEヌクレアーゼで106細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションは、800Vで2回の0.1msパルス、それに続く、130Vで4回の0.2msパルスからなっていた。エレクトロポレーションに続いて、細胞を30℃/5％CO2で18時間インキュベートした。細胞を完全培地に継代し、37℃/5％CO2で1日維持し、18日間増殖させた。製造業者のプロトコールに従って、Qiagen DNeasy blood & tissueキットを使用して、ゲノムDNA（gDNA）を抽出した。表6に列挙されるプライマーを使用して、200ngのgDNAをオンおよびオフサイト座位のHigh fidelity PCR増幅に使用した。所定のオフサイト座位における潜在的な挿入を特定するために、ディープシークエンシング（Illumina）によって、増幅産物をさらに解析した。
【0168】
図9のグラフ表示に示すように、オンサイトで各TALEヌクレアーゼによって誘導されるインデルのパーセンテージは同等であったが、解析した異なるオフターゲットサイト（OT#）で誘導されるインデルは、タンデムDD-RR変異を含む少なくとも1つのV1.2 TALEヌクレアーゼモノマーをトランスフェクトされたT細胞ではもはや検出されず、それによって、本発明によるTALENモノマーの特異性の改善が実証された。
【0169】
実施例7：TIGIT、CISH、CD38、IgH、およびGADPH遺伝子配列を標的にする、V1.2の下で設計されたTALEヌクレアーゼ
それぞれのTIGIT、CISH、CD38、IgH、およびGADPHヒト遺伝子のゲノム配列を標的にするために、実施例1に記載されるように、TALEヌクレアーゼを設計し、その特異性について試験した。これらの遺伝子中で標的にされるポリヌクレオチド配列を表6に示す。左および右のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーのポリペプチド配列を表5に提供する。各TALEN V2／標的配列カップルについてのオリゴキャプチャーアッセイの結果を図10～14に示し、これは、本発明のTALEスキャフォールドの高い特異性、および常に高い活性（50％より高い、たいていは70％を超える活性％が図15に示される）を示す。
それぞれのTIGIT、CISH、CD38、IgH、およびGADPHヒト遺伝子のゲノム配列を標的にするために、実施例1に記載されるように、TALEヌクレアーゼを設計し、その特異性について試験した。これらの遺伝子中で標的にされるポリヌクレオチド配列を表6に示す。左および右のTALEヌクレアーゼヘテロダイマーのポリペプチド配列を表5に提供する。各TALEN V2／標的配列カップルについてのオリゴキャプチャーアッセイの結果を図10～14に示し、これは、本発明のTALEスキャフォールドの高い特異性、および常に高い活性（50％より高い、たいていは70％を超える活性％が図15に示される）を示す。
【0170】
（表５）実施例において使用されるポリペプチド配列
【0171】
（表６）実施例において使用されるポリヌクレオチド配列
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図6-4】
【図6-5】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】