2024-540644 ジンセノシド化合物Ｋ又は複合ジンセノシド組成物を含む歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-31

(54)【発明の名称】ジンセノシド化合物Ｋ又は複合ジンセノシド組成物を含む歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 8/63 20060101AFI20241024BHJP

   A61P 1/02 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 31/704 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20241024BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20241024BHJP

【ＦＩ】

A61K8/63

A61P1/02

A61K31/704

A61K9/08

A61K9/06

A23L33/105

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024530496

(86)(22)【出願日】2022-08-22

(85)【翻訳文提出日】2024-05-21

(86)【国際出願番号】 KR2022012482

(87)【国際公開番号】W WO2023113139

(87)【国際公開日】2023-06-22

(31)【優先権主張番号】10-2021-0179760

(32)【優先日】2021-12-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514012085

【氏名又は名称】ビーティージン カンパニー，リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110003579

【氏名又は名称】弁理士法人山崎国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100118647

【弁理士】

【氏名又は名称】赤松 利昭

(74)【代理人】

【識別番号】100123892

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 忠雄

(74)【代理人】

【識別番号】100169993

【弁理士】

【氏名又は名称】今井 千裕

(74)【代理人】

【識別番号】100173978

【弁理士】

【氏名又は名称】朴 志恩

(72)【発明者】

【氏名】オー、ジン－ファン

(72)【発明者】

【氏名】ホ、ユル

(72)【発明者】

【氏名】キム、ジン－ヒ

(72)【発明者】

【氏名】リ、ヒュン－チョル

(72)【発明者】

【氏名】ハ、ユ－ジン

【テーマコード（参考）】

4B018

4C076

4C083

4C086

【Ｆターム（参考）】

4B018LE03

4B018LE04

4B018LE05

4B018MD64

4B018MD90

4B018ME14

4B018MF01

4B018MF12

4C076AA06

4C076AA11

4C076BB22

4C076CC09

4C083AD531

4C083AD532

4C083CC41

4C083DD21

4C083DD23

4C083DD31

4C083EE32

4C083FF01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA10

4C086MA01

4C086MA04

4C086MA16

4C086MA28

4C086MA34

4C086NA14

4C086ZA67

(57)【要約】

［課題］副作用が少ないか又はなく、歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制活性を示す天然物由来の組成物を提供すること。
［解決手段］本発明者らは、紅参などに由来するジンセノシド化合物Ｋ、又はジンセノシド化合物Ｋ、ジンセノシドＲｇ３（Ｒ＋Ｓ）、ジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２及びジンセノシドＲｂ１が混合された複合ジンセノシド組成物が、顕著な歯表面細菌膜減少及び歯表面有機酸生成抑制の効果を示すことを確認した。この組成物は、歯磨き粉、口腔洗浄剤をはじめとする口腔用組成物として利用可能であり、その他にもガム、飲料、菓子などの食品組成物にも応用可能である。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（イ）ジンセノシド化合物Ｋ；又は
（ロ）ジンセノシド化合物Ｋ１００重量部に対してジンセノシドＲｇ３（Ｒ＋Ｓ）、ジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２、及びジンセノシドＲｂ１がそれぞれ７重量部以上含まれた複合ジンセノシド組成物；を有効成分として含有する、歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物。

【請求項2】

前記（ロ）の複合ジンセノシド組成物は、
１）紅参を抽出及び濃縮して紅参濃縮物を得る段階；
２）紅参濃縮物を溶解させた後、合成吸着樹脂カラムに通過させて吸着させた後、エタノールで脱離し、ジンセノシドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ及びＲｄを含む複合ジンセノシドを得る段階；
３）複合ジンセノシドをアルファ－ガラクトシダーゼで処理し、発酵複合ジンセノシドを得る段階；及び
４）前記１）段階で得た紅参濃縮物に、前記３）段階で得た発酵複合ジンセノシドを加え、複合ジンセノシド組成物を得る段階；によって得たことを特徴とする、請求項１に記載の歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物。

【請求項3】

前記複合ジンセノシド組成物は、ジンセノシド化合物Ｋ１００ｍｇ／ｇ以上、ジンセノシドＲｇ３（Ｒ＋Ｓ）、ジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２、及びジンセノシドＲｂ１がそれぞれ８ｍｇ／ｇ以上含まれることを特徴とする、請求項１に記載の歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物。

【請求項4】

１）、２）及び４）段階の紅参濃縮物は、粉末状又は液状であることを特徴とする、請求項２に記載の歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物。

【請求項5】

前記ジンセノシドＫ又は複合ジンセノシド組成物は、液状、クリーム状、ペースト状、又は固状であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物。

【請求項6】

請求項１～４のいずれか一項の複合ジンセノシド組成物を含有する歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物を含む歯磨き粉組成物。

【請求項7】

請求項１～４のいずれか一項の複合ジンセノシド組成物を含有する歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物を含む口腔洗浄剤組成物。

【請求項8】

請求項１～４のいずれか一項の複合ジンセノシド組成物を含有する歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物を含む食品組成物。

【請求項9】

請求項１～４のいずれか一項の歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物を含む薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、紅参から抽出及び／又は加工した複合ジンセノシド組成物又はジンセノシド化合物Ｋを含む歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物に関する。

【0002】

本発明は、大韓民国中小ベンチャー企業部の支援で行った課題の結果であることを明らかにする（課題固有番号：１４２５１４７７８０、課題名：抗ムシ歯効能を有する紅参特異サポニン抽出物の事業化及び効能検定）。

【背景技術】

【0003】

ムシ歯は、世界的に最も蔓延する口腔内疾病の一つで、近年、糖類摂取量の増加などの食生活パターンの変化によって罹患率が益々増加している。歯牙齲蝕症（ムシ歯）は、齒苔内細菌、食物、唾液の相互作用によって誘発される多因性疾患で、齒苔内細菌の中でもストレプトコッカスミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ；Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）とストレプトコッカスソブリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ；Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）が主原因菌であり、このムシ歯菌が歯表面に付着して増殖及び酸生成の過程を経ることで、歯牙中の無機質が脱灰し、象牙質が破壊され、歯牙組織の欠損を招く細菌性歯牙硬組織疾患である。また、上のようなムシ歯原因菌によって生成された有機酸が歯質に直接作用するには、酸生成菌が歯表面に滞留しなければならず、そのためには不溶性グルカンが形成されるべきである。これらの細菌が分泌するＧＴａｓｅ（ｇｌｕｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）は、スクロースを用いて、グルコース重合体として９０％以上のα－１，３グルコシド結合（ｇｌｕｃｏｓｉｄｉｃ ｌｉｎｋａｇｅ）と、残りはα－１，６グルコシド結合からなる不溶性グルカンを形成する。これは、水に溶けずに歯の表面に付着する能力があるため、歯表面細菌膜を形成し、菌塊を形成する。この菌塊が歯の表面を覆えば歯表面細菌膜（ｄｅｎｔａｌ ｐｌａｑｕｅ）を形成することになり、齲蝕原因菌によって乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）などの有機酸が歯表面細菌膜内に蓄積され、ｐＨが低下しながら歯牙の脱灰が誘発される。歯表面細菌膜は、唾液中のカルシウム、リン酸が付着しながら硬くなりつつ歯石が形成され、歯石に比例して歯牙齲蝕症が促進される（健康機能食品機能性評価ガイド、食薬処２０１７．１２、ボク等，Ｋｏｒ．Ｊ．Ｆｏｏｄ ＆ Ｎｕｔｒ．１３（２）、１３９（２０００）、キム等，Ｊ．Ｋｏｒ．Ｆｉｓｈ．Ｓｏｃ．３５（２）、１９１（２００２））。

【0004】

歯牙齲蝕症の治療、予防製剤の開発のために様々な方法が研究されてきており、有力な方法としては、歯牙に形成されたバイオフィルムの生成を阻害することでムシ歯を抑制する方法がある（保健医療技術研究開発事業報告書、歯牙齲蝕症の予防及び治療剤のためのバイオフィルム制御研究，２０１３）。また、バイオフィルムの形成を防ぐＧＴａｓｅ阻害剤を開発する方法（Ｒｅｎ．Ｚ．等，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２０１５）も頻繁に利用されるバイオフィルム抑制法の一つである。また、歯牙齲蝕症の治療、予防のために、ムシ歯原因菌の増殖を抑制する抗菌製剤の開発（Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ．Ｒｅｓ．，２１（１６ ｓｕｐｐｌ．）３３（１９８６）、Ａｒｃｈ．Ｏｒａｌ Ｂｉｏｌ．，１７，１４７（１９７２）、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔ．Ｒｅｓ．，２１（１６ ｓｕｐｐｌ．）７４（１９８６））が活発になされている。特に、毒性が少なく、安定性に優れた天然抽出物を用いた坑菌活性製剤の開発が活発に行われ、アロエ抽出物（Ｋｏｒ．Ｊ．Ｆｏｏｄ ＆ Ｎｕｔｒ．１３（２）、１３９（２０００））、昆布抽出物（Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ Ｆｉｓｈ．Ｓｏｃ．３５（２）、１９１（２００２））、又は五味子抽出物などを用いたムシ歯抑制剤が研究、開発されている（韓国登録特許１０－０２９６７７５号）。このような天然抽出物は食用植物を原料とするので、毒性がほとんどなく、摂取しやすいという利点がある。しかしながら、天然抽出物は、様々な物質が混合された単純抽出物の形態であるため、特定の薬理活性成分が極微量入っており、しかも、その成分の大量生産及び成分含有量の調節が難しいため薬理効能に対する再現性が強くなく、よって、機能性食品や医薬品への開発が難しいという限界がある。

【0005】

そこで、本発明者らは、歯牙齲蝕の肝心な発生機序である歯表面細菌膜生成と歯表面細菌膜酸性化を抑制してムシ歯を予防する効果的な天然物由来組成物又はこれを用いたムシ歯予防方法を探索することになった。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明は、副作用が少ないか又はなく、歯表面細菌膜減少効果及び／又は歯表面細菌膜酸性化抑制効果を示す天然物質由来組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者らは、紅参又は人参から抽出したジンセノシド化合物Ｋ、又は溶媒を用いて紅参又は人参から複合ジンセノシドを抽出し、これを吸着樹脂に吸着させた後、溶媒で脱離させ、部分精製し、紅参濃縮物を混合した複合ジンセノシド組成物が、歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制の機能を示すことを確認し、これらの組成物を含む歯磨き粉組成物、口腔洗浄剤組成物、食品組成物、及び薬学組成物を発明するに至った。

【発明の効果】

【0008】

本発明のジンセノシドＫ又は複合ジンセノシド組成物は、歯表面細菌膜減少及び歯表面有機酸生成抑制の効果を示した。

【0009】

したがって、本発明のジンセノシドＫ又は複合ジンセノシド組成物は、歯磨き粉、口腔洗浄剤をはじめとする口腔用組成物として利用可能であり、その他にもガム、飲料、菓子などの食品組成物にも応用可能である。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】歯表面細菌膜減少の実験結果と、実験後にガラスチューブに付着した齲蝕菌写真を示すものである（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１は対照群と対比）。

【0011】

【図2】有機酸生成をＨＰＬＣ分析した結果を示すものである。

【0012】

【図3】乳酸（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）標準試料をＨＰＬＣ分析した結果及び濃度別標準曲線を示すものである。

【0013】

【図4】有機酸生成をＨＰＬＣ分析して定量統計処理した結果を示すものである（＊＊＊＊ｐ＜０．０００１は対照群と対比；＊＊ｐ＜０．０１は化合物Ｋ及びＢＴＥＸ－Ｋと対比）。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明は、

【0015】

（イ）ジンセノシド化合物Ｋ；又は

【0016】

（ロ）ジンセノシド化合物Ｋ１００重量部に対してジンセノシドＲｇ３（Ｒ＋Ｓ）、ジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２、及びジンセノシドＲｂ１がそれぞれ７重量部以上含まれた複合ジンセノシド組成物；を有効成分として含有する、歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物に関する。

【0017】

また、本発明は、前記（ロ）の複合ジンセノシド組成物が、

【0018】

１）紅参を抽出及び濃縮して紅参濃縮物を得る段階；

【0019】

２）紅参濃縮物を溶解させた後、合成吸着樹脂カラムに通過させて吸着させた後、エタノールで脱離させ、ジンセノシドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ及びＲｄを含む複合ジンセノシドを得る段階；

【0020】

３）複合ジンセノシドをアルファ－ガラクトシダーゼで処理し、発酵複合ジンセノシドを得る段階；及び

【0021】

４）前記１）段階で得た紅参濃縮物に、前記３）段階で得た発酵複合ジンセノシドを加え、複合ジンセノシド組成物を得る段階；によって得られることを特徴とする、歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物に関する。

【0022】

前記合成吸着樹脂カラムは、特に限定されないが、多孔性吸着樹脂カラムが好ましく、より好ましくは、ＨＰ２ＭＧ又はＨＰ－２０のいずれ一つ以上であることを特徴とする。

【0023】

また、本発明において、前記複合ジンセノシド組成物は、ジンセノシド化合物Ｋ１００ｍｇ／ｇ以上、ジンセノシドＲｇ３（Ｒ＋Ｓ）、ジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２、及びジンセノシドＲｂ１がそれぞれ、８ｍｇ／ｇ以上、好ましくは８ｍｇ／ｇ以上３０ｍｇ／ｇ以下、より好ましくは１０ｍｇ／ｇ以上３０ｍｇ／ｇ以下で含まれることを特徴とする、歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物に関する。

【0024】

また、本発明において、前記１）、２）及び４）段階の紅参濃縮物は、粉末状又は液状であることを特徴とする、歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物に関する。

【0025】

また、本発明において、前記ジンセノシドＫ又は複合ジンセノシド組成物は、液状、クリーム状、ペースト状、又は固状であることを特徴とする、歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物に関する。

【0026】

また、本発明は、前記歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物を含む、ムシ歯予防又は治療用の薬学組成物に関する。

【0027】

前記ジンセノシド化合物Ｋ及び／又は複合ジンセノシド組成物ＢＴＥＸ－Ｋを有効成分として含有するムシ歯予防又は治療用の薬学組成物は、薬剤学的分野において一般に許容される担体と共に配合し、通常の方法によって注射形態、経口投与、塗布剤の形態などに剤形化できる。例えば、液剤、シロップ剤、カプセル剤、顆粒剤、粉末、軟膏、エマルジョン、ゲル、クリームなどに製剤化でき、これを様々な経路で投与できる。様々な剤形のうち、例えば、注射用組成物は、等張性水溶液又は懸濁液が好ましく、言及した組成物は滅菌され、及び／又は補助剤（例えば、防腐剤、安定化剤、湿潤剤又は乳化剤溶液促進剤、浸透圧調節のための塩／又は緩衝剤）を含有する。また、それらは、その他治療的に有用な物質を含有してよい。薬剤学的に許容可能な担体には、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、澱粉、ガムアカシア、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどが含まれる。前記組成物には、また、潤滑剤、ウェット剤、風味剤、乳化剤、及び防腐剤などがさらに含まれてよい。本発明の組成物は、顆粒剤、散剤、液剤、錠剤、カプセル剤、又は乾燥シロップ剤などの経口用製剤、又は注射剤などの非経口用剤形に製剤化できるが、このような剤形に限定されるものではない。

【0028】

このように製造された薬剤学的製剤は、目的に応じて、皮下投与、筋肉投与、経口投与、静脈投与、口腔塗布、歯肉塗布などで投与でき、用量は、１日投与量が０．００１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇの量を１回又は多回に分けて投与できる。特定患者に対する投与用量レベルは、患者の体重、年齢、性別、健康状態、投与時間、投与方法、疾患の重症度などによって変わってよい。

【0029】

また、前記ジンセノシド化合物Ｋ及び／又は複合ジンセノシド組成物ＢＴＥＸ－Ｋを有効成分として含有するムシ歯予防又は治療用の薬学組成物は、特に、歯肉塗布又は口腔塗布用の外用剤であることを特徴とする。本発明のムシ歯予防又は治療用の組成物を有効成分とする塗布剤は、通常の製造方法によっていかなる形態でも容易に製造できる。例えば、クリーム型塗布剤を製造する場合には、一般の水中油型（Ｏ／Ｗ）又は油中水型（Ｗ／Ｏ）のクリームベースに本発明の抗炎症組成物を含有させ、ここに香料、キレート剤、色素、酸化防止剤、防腐剤などを必要によって使用する一方、物性改善を目的にタンパク質、ミネラル、ビタミンなどの合成又は天然素材を併用してよい。

【0030】

また、本発明は、前記歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物を含む歯磨き粉組成物に関する。

【0031】

また、本発明は、前記歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物を含む口腔洗浄剤組成物に関する。

【0032】

また、本発明は、前記歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物を含む食品組成物に関する。

【0033】

本発明で使われる用語「食品」とは、栄養素を１種又はそれ以上含有している天然物又は加工品を意味し、好ましくは、ある程度の加工工程を経て直接食べられるような状態のものを意味し、通常の意味として、食品、食品添加剤、機能性食品、健康機能食品、健康補助食品、及び飲料などのいずれをも含んでよい。本発明の食品組成物は、非制限的な例として、各種の飲料、ガム、茶、菓子、ビタミン複合体、健康補助食品などの形態で製造されてよい。本発明の食品組成物の好ましい摂取量は、摂取者の状態、体重、症状の程度、食品形態、摂取期間によって異なり、適切に選択されてよい。本発明の食品組成物は、有効成分が１日に０．２ｍｇ／ｋｇ～２００ｍｇ／ｋｇで摂取されるようにすることが、最適の効果のために好ましい。

【0034】

また、本発明は、前記ジンセノシド化合物Ｋ又は複合ジンセノシド組成物を有効成分として含有する歯磨き粉組成物に関する。マスティックオイル、プロポリス抽出物、ピロリン酸ナトリウム、フルオロ化ナトリウム、酢酸トコフェロール、ヒドロキシアパタイト、甘味剤、粘増剤、研磨剤、湿潤剤、又は界面活性剤などを必要によって付加し、通常の歯磨き粉組成物の製造方法によって剤形化できる。

【0035】

また、本発明は、前記ジンセノシド化合物Ｋ又は複合ジンセノシド組成物を有効成分として含有する口腔洗浄剤組成物に関する。可溶化剤、湿潤剤、界面活性剤、潤滑剤、香料、甘味剤、防腐剤、又は薬効剤などを必要によって付加し、通常の口腔洗浄剤組成物の製造方法によって剤形化でき、ガム（ｇｕｍ）、口腔洗浄剤、口腔清潔剤、口腔用スプレー、口腔用軟膏剤、口腔用パッチ、又はそれらの組合せからなる群から選ばれる剤形に製造できる。

【実施例】

【0036】

以下、本発明の具体的な方法を、実施例を挙げてより詳細に説明する。ただし、本発明の範囲がこれらの実施例の記載によって限定されるものでないことは、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者にとって自明である。

【0037】

【0038】

実施例１：複合ジンセノシド製造

【0039】

韓国産乾燥紅参（４年根）を購入して実験原料とした（チュンチョンナムドクムサン，ドクウォン人参）。複合ジンセノシドは乾燥紅参から抽出した。乾燥紅参１０ｋｇを５０％エタノールで６０℃で１２時間３回反復抽出及び濃縮して紅参濃縮液を得た。

【0040】

紅参濃縮液は合計５．６ｋｇ（６３ｂｒｉｘ）であったし、その５．５ｋｇを水に溶かした後、合成吸着樹脂（ＨＰ２ＭＧ，ミツビシケミカル、又はＨＰ－２０，Ｄｉａｉｏｎ）が充填されているカラムに通過させて吸着させた後に９５％エタノールで脱離させ、ジンセノシドＲｂ１、Ｒｂ２、Ｒｃ及びＲｄなどを含む複合ジンセノシド４６０ｇを得た。

【0041】

【0042】

実施例２：紅参濃縮液粉末製造

【0043】

実施例１で製造した紅参濃縮液５．６ｋｇのうち１００ｇを別に取って減圧濃縮し、７１ｇの紅参濃縮液粉末を得た。

【0044】

【0045】

実施例３：発酵複合ジンセノシド製造

【0046】

上の実施例１で得た複合ジンセノシド１００ｇを基質にして５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝溶液（ｐＨ ４．５）でアスペルギルス属由来のアルファ－ガラクトシダーゼ（０．７５ｇ）と６０℃恒温水槽で８４時間以上反応させ、発酵複合ジンセノシド（４１ｇ）を製造した。

【0047】

このように製造した発酵複合ジンセノシドには、ジンセノシド化合物Ｋ、ジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２などが含まれている。

【0048】

【0049】

実施例４：複合ジンセノシド組成物（以下、「ＢＴＥＸ－Ｋ」と混用）製造

【0050】

実施例３で製造した発酵複合ジンセノシド１００ｇに、実施例２で調製した紅参濃縮液粉末４０ｇを混合し、複合ジンセノシド組成物ＢＴＥＸ－Ｋを製造した。

【0051】

複合ジンセノシド組成物ＢＴＥＸ－Ｋには、ジンセノシド化合物Ｋ＝１００ｍｇ／ｇの他にもジンセノシドＦ２、ジンセノシドＲｈ２などの様々なジンセノシドが含まれている。

【0052】

［表１］

【0053】

実験例１：歯表面細菌膜減少分析

【0054】

１）５０ｍＬのガラスチューブに、１％スクロースを含有しているＢＨＩ（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）液体培地（ｂｒｏｔｈ）を５ｍＬ入れ、下表２の濃度別試料抽出物を５０ｕｌで入れ、対照群は、試料抽出物の代わりに滅菌水を添加した。

【0055】

［表２］

【0056】

２）Ｓ．ｍｕｔａｎｓが１０^５となるように接種した。３）ガラスチューブを３０゜傾けた状態で３７℃の培養器で２４時間静置培養した。

【0057】

４）培養した後、０．５Ｍ ＮａＯＨ溶液を５ｍＬ加え、壁面に付着している菌体を懸濁させた。

【0058】

５）懸濁液１ｍＬを取り、５５０ｎｍで吸光度を測定した。

【0059】

【0060】

実験例２：歯表面細菌膜有機酸生成量

【0061】

１）２ｍＬ ＢＨＩ（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）液体培地に、下表３の濃度別試料抽出物２０ｕｌを入れ、対照群は、試料抽出物の代わりに滅菌水を添加した。

【0062】

２）菌数が１０^５～１０^６となるようにＳ．ｍｕｔａｎｓを接種した。

【0063】

３）３７℃の培養器で４８時間培養した。

【0064】

４）培地中に分泌された酸生成量を、ＨＰＬＣを用いて測定した。

【0065】

［表３］

【0066】

＊＊ＨＰＬＣ：ダングク大学校産学協力団共同機器研究室（Ｃｉｔｒｉｃ，ｐｙｒｕｖｉｃ，ｓｕｃｃｉｎｉｃ，ｌａｃｔｉｃ，ｆｏｒｍｉｃ，ａｃｅｔｉｃ，ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ，ｉｓｏｂｕｔｙｒｉｃ，ｂｕｔｙｒｉｃ，ｉｓｏｖａｌｅｒｉｃ ａｃｉｄ）分析依頼

【0067】

結果１：歯表面細菌膜減少

【0068】

Ｓ．ｍｕｔａｎｓ菌株接種後に２４時間、３０゜傾けた状態で静置培養した。静置培養後に培養液を慎重に注いで捨てると、ガラスチューブ壁面に菌が付着していることが確認できた（図１、赤矢印）。その後、０．５Ｍ ＮａＯＨを入れて懸濁し、懸濁した溶液１ｍｌを５５０ｎｍで吸光度を測定した結果、５０ｕｇ／ｍｌのＢＴＥＸ－Ｋ濃度から歯表面細菌膜減少が起き始めた。特に、ＢＴＥＸ－Ｋ濃度１００ｕｇ／ｍｌにおいて有意の減少を示した（ｐ＜０．０００１）。

【0069】

【0070】

結果２：歯表面細菌膜有機酸生成量

【0071】

２ｍＬ ＢＨＩ（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）液体培地に、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ菌株を１×１０^５ＣＦＵ／ｍｌ濃度で接種し、一定量の試料濃度を接種した後、４８時間培養した。培養液を１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄液を新しいチューブに移し、０．４５ｕｍシリンジフィルターでフィルタリングした後、ＨＰＬＣ分析を行った。ＨＰＬＣ分析条件は、次の通りである。移動相（Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ ｅｌｕｔｉｏｎ） １０ｍＭ第1リン酸カリウム（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｍｏｎｏｂａｓｉｃ）（ｐＨ ３、リン酸塩）／ＭｅＯＨ＝（９８／２）；カラムオーブン温度 ３０℃；流れ速度 １ｍＬ／ｍｉｎ；波長 ２２０ｎｍ；注射量 １０ｕＬ

【0072】

歯表面細菌膜減少実験から確認できるように、１００ｕｇ／ｍｌのジンセノシド化合物Ｋと１００ｕｇ／ｍｌのＢＴＥＸ－Ｋの濃度においてＳ．ｍｕｔａｎｓ菌株の成長が抑制された。

【0073】

ＨＰＬＣ分析の結果、これらの濃度において対照群に比して、４．６分に出るピーク（ｐｅａｋ）が減少した。有機酸標準試料と比較したとき、乳酸（Ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）が同一の保持時間に検出されることを確認した。

【0074】

乳酸標準試料濃度グラフを作成した後、対照群と実験群の乳酸含有量の差異を分析して統計処理した結果、ジンセノシド化合物Ｋは、対照群に比して乳酸含有量が約２倍減少した結果を得たし（ｐ＜０．０００１）、ＢＴＥＸ－Ｋでは、対照群に比して約３．２倍減少した結果を得た（ｐ＜０．０００１）。

【0075】

その他、対照群のＨＰＬＣ結果、６～６．５分帯にピーク（ｐｅａｋ）がジンセノシド化合物ＫとＢＴＥＸ－Ｋにおいて減少することが見られるが、有機酸標準試料と比較した結果、一致する有機酸はなかった。

【0076】

その他、ジンセノシド化合物ＫとＢＴＥＸ－ＫのＨＰＬＣピーク中、１３．５分帯の保持時間で確認されるピークが対照群では確認されなかった。

【0077】

歯表面細菌膜減少は、ジンセノシド化合物ＫとＢＴＥＸ－Ｋにおいてそれぞれ、２０ｕｇ／ｍｌと１００ｕｇ／ｍｌで減少が確認された。

【0078】

【0079】

また、歯表面有機酸生成抑制は、ＨＰＬＣ方法で分析した。１０個の有機酸標準試料を使用してジンセノシド化合物ＫとＢＴＥＸ－Ｋを濃度別に液体培地に添加した後、一定量のＳ．ｍｕｔａｎｓを接種し、４８時間、３７℃で培養した後、対照群と比較して培養液に生成された有機酸の変化を観察した結果、対照群に比べて、高濃度（１００ｕｇ／ｍｌ）の紅参抽出物、ジンセノシド化合物Ｋ及びＢＴＥＸ－Ｋを添加した液体培養培地のＨＰＬＣ結果に差異か見られた。

【0080】

ＨＰＬＣ保持時間を基準に約４．６分で検出されるピークは、ジンセノシド化合物ＫとＢＴＥＸ－Ｋが添加された培養液で減少することを確認した。標準試料との比較結果、４．６分保持時間帯に検出されるピークは乳酸（ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）として確認された。

【産業上の利用可能性】

【0081】

本発明のジンセノシドＫ又は複合ジンセノシド組成物は、歯磨き粉、口腔洗浄剤をはじめとする口腔用組成物として利用可能であり、その他にもガム、飲料、菓子などの食品組成物にも応用可能である。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4】

【手続補正書】

【提出日】2024-05-21

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項9】

請求項１～４のいずれか一項の歯表面細菌膜減少及び歯表面細菌膜酸性化抑制用の組成物を含む薬学組成物。

【国際調査報告】