特表 2024-540688 コアラレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-10-31

(54)【発明の名称】コアラレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/867 20060101AFI20241024BHJP

   C12N 15/48 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20241024BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241024BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20241024BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20241024BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20241024BHJP

【ＦＩ】

C12N15/867 Z ZNA

C12N15/48

C12N7/01

C12N5/10

A61K35/17

A61L27/38

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024549250

(86)(22)【出願日】2022-11-07

(85)【翻訳文提出日】2024-07-05

(86)【国際出願番号】 EP2022081009

(87)【国際公開番号】W WO2023083760

(87)【国際公開日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】21207080.9

(32)【優先日】2021-11-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】509002626

【氏名又は名称】フラウンホーファーゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・アンゲバンテン・フォルシュング・エー・ファウ

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(74)【代理人】

【識別番号】100204582

【弁理士】

【氏名又は名称】大栗 由美

(72)【発明者】

【氏名】フリッケ，シュテファン

(72)【発明者】

【氏名】シュミーデル，ドミニク

(72)【発明者】

【氏名】レナー，アレクサンダー

(72)【発明者】

【氏名】ケール，ウルリケ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C081

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA93X

4B065AA97X

4B065AA97Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA21

4B065BB19

4B065BB25

4B065BB34

4B065BC03

4B065BC07

4B065BD15

4B065CA23

4B065CA24

4B065CA44

4C081AB11

4C081CD34

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BB65

4C087NA05

4C087ZB09

4C087ZB26

(57)【要約】

本発明は、少なくとも１つのコアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）をコードする少なくとも１つの核酸を含む、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子、関連する核酸、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子、哺乳動物パッケージング細胞株、形質導入された哺乳動物細胞、ならびに関連する方法および使用に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも１つのコアラレトロウイルス（Koala Retrovirus：ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Envelope glycoprotein：Ｅｎｖ）をコードする少なくとも１つの核酸を含む、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子。

【請求項2】

前記少なくとも１つの核酸が、Ｃ末端Ｒペプチドを欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする、請求項１に記載の発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子。

【請求項3】

融合阻害性Ｒペプチド（Ｒペプチド）を欠くか、または前記Ｒペプチドの一部を欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする、核酸。

【請求項4】

前記少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖが、ＫｏＲＶＡ、ＫｏＲＶＢおよびそれらの組み合わせから選択される、請求項１または２に記載の発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子、または請求項３に記載の核酸。

【請求項5】

（ｉ）前記ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖの配列が、（ａ）配列番号２、（ｂ）配列番号６（配列番号６は、任意選択的に配列番号６のアミノ酸６４５～６５９のうちの１個以上についてＣ末端切断されている）、および（ｃ）シグナルペプチドを欠く（ａ）または（ｂ）の配列から選択され、
（ｉｉ）前記ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖの配列が、（ａ）配列番号４、（ｂ）配列番号８（配列番号８は、任意選択的に配列番号８のアミノ酸６５２～６６６のうちの１つ以上についてＣ末端切断されている）、および（ｃ）シグナルペプチドを欠く（ａ）または（ｂ）の配列から選択され、
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする少なくとも１つの核酸の配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５（配列番号５は、任意選択的に４８個の３’末端ヌクレオチドのうちの１つ以上について３’末端で切断されている）、配列番号７（配列番号７は、任意選択的に前記４８個の３’末端ヌクレオチドのうちの１つ以上について３’末端で切断されている）、または１つ以上のサイレント変異を含むそれらのバリアントのうちの１つ以上を含むか、またはそれらからなる、請求項４に記載の発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子、または請求項４に記載の単離された核酸。

【請求項6】

前記少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする少なくとも１つの核酸が、（ｉ）異種プロモーターおよび／または（ｉｉ）構成的プロモーターおよび／または（ｉｉｉ）ポリＡテール配列に作動可能に連結されている、請求項１、２、４または５のいずれか一項に記載の発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子、または請求項３～５のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項7】

少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖでシュードタイピングされている、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子。

【請求項8】

前記ウイルスベクター粒子が、レンチウイルスまたはガンマレトロウイルスベクター粒子から選択される、請求項１、２、または４～７のいずれか一項に記載のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子。

【請求項9】

目的の異種配列をコードする少なくとも１つのペイロード核酸を含む核酸を更に含む、請求項１、２、または４～８のいずれか一項に記載のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子。

【請求項10】

請求項１、２、または４～９のいずれか一項に記載のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を産生する、哺乳動物パッケージング細胞株。

【請求項11】

前記哺乳動物パッケージング細胞株が、
（ｉ）５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）／セントラル終止配列（ＣＴＳ）、ポリＡテール配列、転写後調節エレメント、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、および３’ＬＴＲの核酸配列のうちの１つ以上、
（ｉｉ）核酸である少なくとも１つのコアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）、ならびに／または
（ｉｉｉ）Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＲｅｖ、および任意選択的にＴａｔのうちの１つ以上から選択されるウイルスパッケージングタンパク質をコードする核酸
を含む、請求項１０に記載の哺乳動物パッケージング細胞株。

【請求項12】

少なくとも１つの哺乳動物細胞への少なくとも１つのペイロード核酸の送達のためのインビトロ方法であって、
（ａ）少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する工程と、
（ｂ）請求項９に記載の少なくとも１つのシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を提供する工程と、
（ｃ）（ａ）の少なくとも１つの哺乳動物細胞を、インビトロで（ｂ）の少なくとも１つのシュードタイピングされたウイルスベクター粒子と接触させる工程と、を含み、
それによって、前記少なくとも１つのペイロード核酸を含む少なくとも１つの形質導入された哺乳動物細胞を得る、インビトロ方法。

【請求項13】

（ｉ）前記少なくとも１つの哺乳動物細胞が、ヒト細胞であり、および／または
（ｉｉ）前記少なくとも１つの哺乳動物細胞が、造血幹細胞、ｉＰＳ細胞、幹細胞、または免疫細胞から選択され、任意選択的に、前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、もしくはそれらの混合物から選択され、および／または
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのペイロード核酸が、目的の１つ以上のタンパク質および／もしくはＲＮＡをコードし、および／または
（ｉｖ）前記少なくとも１つの哺乳動物細胞が、工程（ｃ）の前に活性化されるか、もしくは工程（ｃ）の前に活性化されず、および／または
（ｖ）前記少なくとも１つのペイロード核酸が、哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれ、
任意選択的に、
（ａ）前記少なくとも１つの哺乳動物細胞が、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、もしくはそれらの混合物から選択され、
任意選択的に、
（ｉ）前記Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、もしくはそれらの混合物が、工程（ｃ）の前に活性化されず、および／または
（ｉｉ）前記少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる前記目的の１つ以上のタンパク質が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ケモカイン受容体、ＮＫ細胞受容体、免疫調節タンパク質、サイトカイン、抗体、標的化エンドヌクレアーゼから選択され、および／または前記目的の少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる前記１つ以上のＲＮＡが、リボザイム、ｇＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ ｍｉＲＮＡもしくはそれらの組み合わせから選択され、および／または
（ｉｉｉ）前記少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖが、ＫｏＲＶＡであり、および／または
（ｂ）前記少なくとも１つのウイルスベクター粒子が、レンチウイルスベクター粒子である、請求項１２に記載のインビトロ方法。

【請求項14】

請求項１２または１３に記載の方法によって得ることができる、形質導入された哺乳動物細胞であって、任意選択的に、前記形質導入された哺乳動物細胞が、養子細胞療法または移植に使用するためのものである、形質導入された哺乳動物細胞。

【請求項15】

（ｉ）哺乳動物細胞への目的の１つ以上のタンパク質および／もしくはＲＮＡをコードする少なくとも１つのペイロード核酸の送達、
（ｉｉ）哺乳動物細胞を安定して形質導入する、ならびに／または
（ｉｉｉ）免疫細胞の事前活性化を行わずに哺乳動物免疫細胞を形質導入するための、
少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖ糖タンパク質、ＫｏＲＶ Ｅｎｖ糖タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、または請求項１０または１１に記載の哺乳動物パッケージング細胞株、または請求項１、２、４～６のいずれか一項に記載の発現ベクターもしくは発現カセット、または請求項１、２、または４～９のいずれか一項に記載のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子、または請求項３～６のいずれか一項に記載の核酸のインビトロでの使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、少なくとも１つのコアラレトロウイルス（Koala Retrovirus：ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Envelope glycoprotein：Ｅｎｖ）をコードする少なくとも１つの核酸を含む、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子、関連する核酸、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子、哺乳動物パッケージング細胞株、形質導入された哺乳動物細胞、ならびに関連する方法および使用に関する。

【背景技術】

【0002】

遺伝子療法は、疾患の治療などの治療目的で、対象の標的細胞に核酸を導入することであると定義される。一過性のトランスフェクションには様々な方法が知られており、細胞を遺伝子操作するために使用され得る。

【0003】

しかし、様々な程度の効率、毒性、およびオフターゲット効果など、多くの障害が存在する。使用可能な方法の１つに、エレクトロポレーションがある。更に、永続的で安定した遺伝子導入のためには、ウイルスベクターなどの非細胞粒子が使用可能である。ウイルスベクターおよび関連する非細胞粒子は、一般に、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞を安定的に遺伝子操作することができる。例えば、遺伝子療法は、インビボ、またはエクスビボ、またはインビトロで実施され得る。インビトロ（またはエクスビボ）の遺伝子療法は、対象からの標的細胞の単離を含み、その後、培養され、ウイルスベクターによって保有される所望の核酸により形質導入され、対象（同一または異なる対象であってもよい）に再導入される。このことは、養子細胞導入とも呼ばれる。インビボでの遺伝子療法の間、所望の核酸を含むウイルスベクターを、治療される対象に直接注射してもよく、対象の体内で形質導入を行う。更に、哺乳動物細胞への安定した遺伝子導入は、研究、診断、モニタリング目的などの多くのインビトロ目的にとっても望ましい。

【0004】

しかし、ウイルスベクターもまた、ガンマレトロウイルスベクターによって引き起こされる挿入変異誘発など、ウイルスベクターに基づく遺伝子導入の最適化中に起こり得るいくつかの課題を依然として抱えている。したがって、例えば、レンチウイルスベクターは、細胞を遺伝的に改変するために一般的に使われるツールである。これらは通常、標的細胞の表面と相互作用し得るエンベロープ糖タンパク質によって覆われたレンチウイルスカプセルを含む。内部には、目的の核酸を含むウイルスベクターを保有する。

【0005】

シュードタイピングは、哺乳動物細胞、例えば造血標的細胞の形質導入レベルの改善に大きな役割を果たしている。シュードタイピングとは、ウイルスまたはウイルス粒子が、そのエンベロープタンパク質（例えば、その糖タンパク質）のうちの１つ以上に改変を有することを意味する。例えば、糖タンパク質は、他のエンベロープ化されたウイルスの糖タンパク質によって置き換えられる。これにより、通常はそれぞれのウイルスの糖タンパク質の目的地である細胞以外の標的細胞を標的とすることが可能になる。レンチウイルスベクターのシュードタイピングに一般的に広く使用されているウイルスエンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）は、例えば、水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus：ＶＳＶ）、ネコ白血病ウイルス（feline leukemia virus：ＦｅＬＶ、ＲＤ１１４としても知られる）、麻疹ウイルス、ニパウイルス、コーカルウイルスまたはヒヒ内在性レトロウイルス（Baboon endogenous retrovirus：ＢａＥＶ）に由来するか、またはそれらに基づくＥｎｖである。

【0006】

ＢａＥＶ Ｅｎｖによりシュードタイピングされたレンチウイルスベクターは、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、特許文献１および特許文献２に以前に記載されている。

【0007】

しかし、ＢａＥＶ Ｅｎｖによりシュードタイピングされた上述のレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いる場合であっても、改変することが困難な特定の細胞型が依然として存在する。このことが、このような細胞を標的とする遺伝子療法の開発を非常に困難なものにしている。そのような細胞の例は、哺乳動物細胞、例えば、造血細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem：人工多能性幹）細胞、幹細胞、例えば、造血細胞、または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球またはマクロファージ）である。

【0008】

しかし、上述の細胞型の改変は、多く利点をもたらすだろう。例えば、造血幹細胞は、その遺伝子改変が、造血幹細胞に由来するあらゆる系統に導入され得るため、遺伝子療法において望ましい標的細胞である。Ｔ細胞またはＮＫ細胞を標的とすることで、例えば、がん細胞上の特定のタンパク質を標的とする能力を有するキメラ抗原受容体Ｔ細胞（Chimeric antigen receptor T cell：ＣＡＲ－Ｔ細胞）およびキメラ抗原受容体ナチュラルキラー細胞（Chimeric antigen receptor natural killer cell：ＣＡＲ－ＮＫ細胞）の開発が可能になる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫系の一部であり、刺激を必要とすることなく、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を死滅させ得る。

【0009】

例えば、ＢａＥＶによりシュードタイピングされたレンチウイルスベクターの場合であっても、形質導入の前に、ＮＫ細胞の活性化が必要である。

【0010】

細胞療法および遺伝子療法などの革新的な免疫療法の開発のために、免疫細胞の遺伝子操作のための効率的なツールが必要である。したがって、遺伝子改変された細胞の割合を増加させ、したがって、遺伝子療法の有効性を増加させるために、形質導入プロセス自体を改善する必要がある。適切な形質導入ツールは、効率的であり、迅速かつ正確にそのカーゴを送達することができるものでなければならず、細胞に対して非毒性でなければならず、細胞に対する最小限の操作を必要とするものでなければならない。可能であれば、形質導入前の過度なインビトロでの培養および事前活性化は、回避されるべきである。

【0011】

少なくとも１つのコアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）をコードする少なくとも１つの核酸を含む本発明の発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、上述の全ての問題を解決し、驚くべきことに、目的の哺乳動物細胞の遺伝的操作に有利である。

【発明の概要】

【0012】

上述の目的は、以下に指定される本発明の態様によって解決された。

【0013】

詳細には、コアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）であるＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢ、ならびにそれらの組み合わせであるＫｏＲＶＡＢが、目的の導入遺伝子を含有するウイルスベクター粒子の生成を可能にすることが見出されている。更に、ＫｏＲＶＡまたはＫｏＲＶＢタンパク質およびそれらの組み合わせ（本明細書ではＫｏＲＶＡＢと称される）でエンベロープ化されたレンチウイルスベクター粒子が、形質導入に適していることが見出されている。特に、また、非常に驚くべきことに、ＮＫ細胞のための遺伝子導入は、ＫｏＲＶＡ、ＫｏＲＶＢまたはＫｏＲＶＡＢによりシュードタイピングされたレンチウイルスベクター粒子を用いると極めて効率的であり、特にサイトカインによるＮＫ細胞の事前活性化を必要としないため、ＢａＥＶを含む以前に記載されたウイルスエンベロープよりも更に優れていることが見出された（図３および４を参照されたい）。

【0014】

少なくとも１つのコアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）をコードする少なくとも１つの核酸を含む、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子が提供される。

【0015】

更に、融合阻害性Ｒペプチド（Ｒペプチド）を欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする、核酸が提供される。

【0016】

また、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖでシュードタイピングされている、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子が提供され、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子を生成する、哺乳動物パッケージング細胞株が提供される。

【0017】

更に、少なくとも１つの哺乳動物細胞への少なくとも１つのペイロード核酸の送達のためのインビトロ方法、およびそのような方法によって得ることができる、形質導入された哺乳動物細胞が提供される。

【0018】

最後に、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖ糖タンパク質、またはＫｏＲＶ Ｅｎｖ糖タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、または哺乳動物パッケージング細胞株、発現ベクターもしくは発現カセット、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子、または核酸のインビトロでの使用が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0019】

【図1】全長エンベロープ糖タンパク質ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖ（上）および改変されたエンベロープ糖タンパク質ＫＯＲＶＡ Ｅｎｖ（下）のタンパク質ドメインの概略図。詳細には、両方の形態が、アミノ酸位置１～３５にＮ末端シグナルペプチド、アミノ酸位置３６～６０６に細胞外ドメイン、アミノ酸位置６０７～６２７に膜貫通ドメイン、それらのＣ末端に細胞質ドメインを含む。全長エンベロープ糖タンパク質ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖ（上）は、アミノ酸位置６２８～６５９に完全な細胞質ドメインを含み、アミノ酸位置６４５～６５９にＣ末端Ｒペプチドを含むが、改変されたエンベロープ糖タンパク質ＫｏＲＶＡ ｅｎｖ（下）は、そのようなＣ末端Ｒペプチドを欠き、したがって、細胞質ドメインのアミノ酸位置６２８～６４４のみを含む。そこから生成されたシュードタイピングされたウイルスベクター粒子では、シグナルペプチドが除去されている。シュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、成熟ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖを含む。

【図2】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるシュードウイルス産生、ならびにその後のＮＫ細胞形質導入およびＮＫ細胞における導入遺伝子発現の概略図。詳細には、シュードウイルスは、適切なウイルスヘルパープラスミド（ｇａｇおよびｐｏｌなどの遺伝子をコードする）、特定のペイロード核酸（ここでは導入遺伝子と称され、例えば、ＣＡＲ、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein：ＧＦＰ）など）を保有するウイルスベクター、ならびにＫｏＲＶエンベロープタンパク質を含む少なくとも１つのベクターによるトランスフェクションによって生成されてもよい。このような特徴を保有するウイルスベクターを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、その後、ＫｏＲＶエンベロープタンパク質および導入ベクターを含むウイルスゲノムを含むシュードウイルス（すなわち、本発明のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子）を生成する。このようにして生成されたシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を、目的の哺乳動物細胞（例えば、精製されたＮＫ細胞）に添加する。このことは、市販の形質導入エンハンサー（例えば、Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ）を用いて行われ、これらの哺乳動物細胞（例えば、免疫細胞）に導入遺伝子を導入することができる。

【図3】３名の異なるドナーの末梢血ＮＫ細胞における形質導入効率。単離されたＮＫ細胞を、単離当日に、あるいは５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２および１４０Ｕ／ｍＬのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有するＮＫ ＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で活性化してから３日後、７日後および２１日後に、ＫｏＲＶまたはＢａＥＶでシュードタイピングされたレンチウイルスベクター粒子により形質導入した。形質導入の７２時間後に、蛍光性タンパク質ｍＶｅｎｕｓのフローサイトメトリー分析によって、形質導入効率を決定した。

【図4】新鮮な初代ＮＫ細胞における形質導入効率。末梢血から単離されたＮＫ細胞を、単離当日に、ＫｏＲＶまたはＢａＥＶでシュードタイピングされたレンチウイルスベクター粒子により形質導入した。形質導入の７２時間後に、蛍光性タンパク質ｍＶｅｎｕｓのフローサイトメトリー分析によって、形質導入効率を決定した。３名のドナーにわたって平均された導入効率および標準偏差がプロットされている。統計分析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。＊＝ｐ＜０．０５。

【図5】ＫｏＲＶ－ＡまたはＫｏＲＶ－Ｂによりエンベロープ化されたレンチウイルスによる末梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell：ＰＢＭＣ）の形質導入。６名の健康なドナーの末梢血からＰＢＭＣを単離し、直ちに形質導入した（免疫細胞の集団を分離することなく）。蛍光性レポーター遺伝子ｍＶｅｎｕｓを使用して、形質導入から３日後に、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－ ＮＫ細胞およびＣＤ３＋ Ｔ細胞において形質導入効率を決定した。

【発明を実施するための形態】

【0020】

本発明は、少なくとも１つのコアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）をコードする少なくとも１つの核酸を含む、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を提供する。

【0021】

コアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）は、ガンマレトロウイルス属に属するエンベロープ型レトロウイルスである。今のところ、ＫｏＲＶの標的生物として知られているのは、コアラだけであり、免疫不全症であるコアラ免疫不全症候群（koala immune deficiency syndrome：ＫＩＤＳ）を引き起こす可能性がある。他のレトロウイルスと同様に、ＫｏＲＶは、ウイルスエンベロープを備えており、ウイルスエンベロープは、このウイルスの核酸材料を包み込むウイルスの外層を構成する。構成要素の中でも特に、ＫｏＲＶのウイルスエンベロープは、エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）を含み、今までにＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢなどのいくつかのバリアントが知られている。例えば、当該技術分野で記載されているか、または想定されているＫｏＲＶ Ｅｎｖ配列としては、ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖ、ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖ、ＫｏＲＶＣ Ｅｎｖ、ＫｏＲＶＤ Ｅｎｖ、ＫｏＲＶＥ Ｅｎｖ、ＫｏＲＶＦ Ｅｎｖ、およびＫｏＲＶＪ Ｅｎｖが挙げられる。このようなバリアントは、例えば異なる宿主細胞タンパク質を標的とし得る。例えば、ＫｏＲＶＡは、細胞接着および侵入のためにリン酸トランスポーター（ＰｉＴ１）を使用することが示されているが、一方で、ＫｏＲＶＢは、ＳＬＣ１９Ａ２を介して感染する。

【0022】

「ＫｏＲＶ Ｅｎｖ」という用語は、そのような天然に存在するバリアントのキメラ、例えば、ＫｏＲＶＡ ＥｎｖおよびＫｏＲＶＢ Ｅｎｖのキメラを更に含む。例えば、ＫｏＲＶ Ｅｎｖキメラは、独立して、少なくとも２つの天然に存在するバリアント由来のドメインから組み立てられ得る。Ｅｎｖのドメインとしては、シグナルペプチド、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインが挙げられる。

【0023】

細胞質ドメインは、好ましくは、融合阻害性Ｒペプチド（Ｒペプチド）を欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く。

【0024】

図３および４に示されるように、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子を調製するためのＲペプチドを欠くＫｏＲＶＡ、ペプチドを欠くＫｏＲＶＢ、またはＲペプチドを欠くＫｏＲＶＡおよびペプチドを欠くＫｏＲＶＢの混合物のいずれかを使用して、形質導入することが困難であることが知られているＮＫ細胞の効率的な形質導入を達成することができる。

【0025】

本発明の文脈で、「融合阻害性Ｒペプチド」、「Ｃ末端融合阻害性Ｒペプチド」、「Ｒペプチド」および「Ｃ末端Ｒペプチド」という表現は、同義語として使用され、ビリオン成熟中にウイルスプロテアーゼによって切断され、したがってエンベロープ糖タンパク質の膜融合を増強する、エンベロープ糖タンパク質の細胞質テールドメインのＣ末端部分を指す。

【0026】

ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖタンパク質の融合阻害性Ｒペプチドは、図１に示されるように、全長野生型ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖ配列のアミノ酸６４５～６５９に対応する。全長野生型ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖ配列は、配列番号６に示される。

【0027】

ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖタンパク質の融合阻害性Ｒペプチドは、全長野生型ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖ配列のアミノ酸６５２～６６６に対応する。全長野生型ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖ配列は、配列番号８に示される。

【0028】

発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、少なくとも１つのそのようなＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする少なくとも１つの核酸を含む。

【0029】

「核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid：ＤＮＡ）、リボ核酸（ribonucleic acid：ＲＮＡ）、または例えばペプチド核酸（peptide nucleic acid：ＰＮＡ）のような当業者に公知の人工核酸の任意の形態を記述する。

【0030】

一実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。一実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。

【0031】

本明細書に記載のコアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）をコードする核酸配列、およびこれらのタンパク質の改変された態様を、当該技術分野で周知の方法を用いて決定することができる。すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンを、Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を生成するような様式で組み立てる。そのようなＥｎｖタンパク質をコードする核酸（またはポリヌクレオチド）を、化学合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てることができ、簡単に言うと、Ｅｎｖタンパク質をコードする配列の一部を含有する重複するオリゴヌクレオチドの合成を伴い、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングし、ライゲーションして、次いで、ＰＣＲによって、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドを増幅させる。あるいは、所望の核酸配列の生成および／または増幅は、ＰＣＲ法などの増幅技術を用いて達成することができる。

【0032】

ＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする核酸が入手可能ではないが、タンパク質分子のアミノ酸配列が既知である場合、ＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする核酸を化学合成するか、または適切な供給源（例えば、核酸）から得て、配列の３’および５’末端にハイブリダイゼーション可能な合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、または例えば、Ｅｎｖタンパク質をコードするＤＮＡクローンを特定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって、タンパク質を発現する任意の組織または細胞から単離することができる。次いで、ＰＣＲによって生成された増幅された核酸は、当該技術分野でよく知られている任意の方法を用いて複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。

【0033】

発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子中に含まれる核酸は、少なくとも１つのそのようなＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする少なくとも１つの核酸を含む。

【0034】

好ましくは、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、少なくとも１つのそのようなＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする１つの核酸を含む。好ましくは、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、１つのそのようなＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする１つの核酸を含む。好ましくは、ＫｏＲＶは、ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢから選択される。別の好ましい実施形態では、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、２つ以上のＫｏＲＶ Ｅｎｖ、例えば、２、３、４、５、６、７、またはそれより多くのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする１つの核酸を含む。好ましくは、２つ以上のＫｏＲＶ Ｅｎｖは、ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢ Ｅｎｖを含むか、またはそれらからなる。

【0035】

好ましくは、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子中に含まれる核酸は、少なくとも２つのそのようなＫｏＲＶ Ｅｎｖ、少なくとも３つのそのようなＫｏＲＶ Ｅｎｖまたは少なくとも４つのそのようなＫｏＲＶ Ｅｎｖを含む。

【0036】

これらのＫｏＲＶ Ｅｎｖは、例えば、ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢなどの異なるエンベロープ糖タンパク質バリアントに由来するという点で異なっていてもよく、そのようなバリアントのキメラであってもよく、または同じエンベロープ糖タンパク質バリアントの変異バリアントであるという点で異なっていてもよい。

【0037】

したがって、本発明のＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質は、全長または成熟野生型ＫｏＲＶタンパク質と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の変異を含有し、任意選択的にＣ末端ＲペプチドまたはＣ末端Ｒペプチドの一部を欠くＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質も包含する。したがって、本発明のＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質は、配列番号２、４、６および８のうちのいずれかに示されるＫｏＲＶタンパク質、またはそれらの成熟形態と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の変異を含有するＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質を包含する。

【0038】

したがって、本発明の核酸はまた、全長または成熟野生型ＫｏＲＶタンパク質と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の変異を含有し、任意選択的にＣ末端ＲペプチドまたはＣ末端Ｒペプチドの一部を欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸も包含する。したがって、本発明の核酸は、配列番号２、４、６および８のうちのいずれかに示されるＫｏＲＶタンパク質、またはそれらの成熟形態と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の変異を含有する少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸を包含する。

【0039】

また、例えば、全長ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖをコードする核酸およびＲペプチドもしくはその一部を欠くＫｏＲＶＡ Ｅｎｖをコードする核酸、または例えば、全長ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖをコードする核酸およびＲペプチドもしくはその一部を欠くＫｏＲＶＢ Ｅｎｖをコードする核酸などの同じバリアントの切断されたＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質および全長ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質を使用することも可能である。

【0040】

本発明のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子では、シグナルペプチドは、ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質から除去される。本発明のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、成熟ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質を含む。好ましくは、成熟ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質は、Ｒペプチドを欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く。あるいは、成熟ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質は、完全な細胞質ドメインを含む。

【0041】

本発明のＫｏＲＶタンパク質または本発明の核酸によってコードされるＫｏＲＶタンパク質は、好ましくは、少なくとも１つの哺乳動物細胞膜に結合し、これと融合することができ、それによって、生体材料を上述の活性化されたＮＫ細胞に導入する。少なくとも１つの哺乳動物細胞膜への結合およびそれとの融合を決定するための方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、ヒトＮＫ細胞などのペイロード核酸で哺乳動物細胞を形質導入する能力は、実施例に示すように決定することができる。

【0042】

本発明の第１の態様では、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードするそのような核酸は、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子の一部である。

【0043】

一般に、そのような発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする少なくとも１つの核酸を含む。更に、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子はまた、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする少なくとも２つの核酸、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする少なくとも３つの核酸または少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする少なくとも４つの核酸を含んでいてもよい。例えば、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子はまた、ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖをコードする少なくとも２つの核酸を含んでいてもよい。例えば、ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖをコードする少なくとも２つの核酸は、例えば、全長ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖをコードする核酸、およびＲペプチドまたはその一部を欠くＫｏＲＶＡ Ｅｎｖをコードする核酸を含んでいてもよい。例えば、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子はまた、ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖをコードする少なくとも２つの核酸を含んでいてもよい。例えば、ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖをコードする少なくとも２つの核酸は、例えば、全長ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖをコードする核酸、およびＲペプチドまたはその一部を欠くＫｏＲＶＢ Ｅｎｖをコードする核酸を含んでいてもよい。

【0044】

好ましくは、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子はまた、ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖをコードする少なくとも２つの核酸を含んでいてもよく、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖは、ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖをコードし、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖは、ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖをコードする。好ましくは、両方のＫｏＲＶ Ｅｎｖは、Ｒペプチドを欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く。

【0045】

「発現ベクター」という用語は、本明細書で使用される場合、遺伝子などの所望の核酸配列を標的細胞に導入するために使用され、核酸配列によってコードされるタンパク質（例えば、ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖ）の転写および翻訳が起こる、プラスミドを意味する。したがって、発現ベクターは、一般的に、発現ベクター上の核酸配列の効率的な転写を指示するために、プロモーターおよびエンハンサー領域などの調節配列、ならびに任意選択的にポリアデニル化部位を含む。発現ベクターは、追加の必要な領域または有用な領域、例えば、真核細胞または原核細胞における選択のための選択可能なマーカー、得られたタンパク質の精製のための精製タグ、複数のクローニング部位、または複製起点を更に含んでいてもよい。

【0046】

通常、発現ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターであってもよい。一般に、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルス、ガンマレトロウイルスもしくはアデノウイルスベクターなどの様々な種類のウイルスベクター、またはプラスミドを発現ベクターとして使用してもよい。例えば、細菌中で発現させるためのプラスミドを、本発明のクローニングおよび増幅、または配列および発現カセットに使用してもよい。例えば、ベクターは、哺乳動物細胞における複製および組み込みに適しているだろう。更に、クローニングベクターは、所望の核酸配列の発現に有用な転写および翻訳ターミネーター、開始配列、プロモーターを含有していてもよい。プラスミドの場合、プラスミドは、好ましくは、細胞における発現に適したプロモーターを含む。

【0047】

「発現カセット」という用語は、本明細書で使用される場合、対応するＲＮＡの合成に適した任意のＤＮＡセグメントを意味し、その後に、対応するタンパク質に翻訳されてもよい。したがって、通常、タンパク質コード配列（本発明の場合には、通常は、ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸配列である）、および転写の調節を可能にする調節配列を含む。詳細には、このような調節配列は、例えば、転写の開始点をコードするプロモーター領域、オープンリーディングフレーム（タンパク質コード配列、もしくは目的のＲＮＡを含む）、リボソームのための結合部位、転写の終点をコードするターミネーター領域、または３’非翻訳領域（ポリアデニル化部位など）を含んでいてもよい。

【0048】

本発明のＫｏＲＶ Ｅｎｖの発現のために、各プロモーター中の少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置決めするように機能する。この最もよく知られた例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠くいくつかのプロモーター（例えば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のためのプロモーター、およびＳＶ４０遺伝子のためのプロモーター）では、開始点自体に重なる個別のエレメントが、開始点の固定に役立っている。

【0049】

核酸の発現は、典型的には、目的の遺伝子をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。

【0050】

一般に、本発明の第１の態様による発現カセットは、少なくともタンパク質コード配列（本発明の場合には、ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸配列である）、およびプロモーター領域を含む。任意選択的に、本発明の第１の態様による発現カセットは、オープンリーディングフレーム、リボソームのための結合部位、ターミネーター領域および／または３’非翻訳領域（ポリアデニル化部位など）を更に含んでいてもよい。

【0051】

本発明の第１の態様による発現カセットに使用され得る適切な調節エレメントは、当業者に周知であり、例えば、発現カセットがトランスフェクトされることを意図される宿主細胞の生物の種類に基づいて選択されてもよい。例えば、このような調節エレメントは、哺乳動物細胞（例えば、哺乳動物パッケージング細胞株から）、細菌、酵母、植物および／または昆虫に由来してもよい。好ましくは、本発明の第１の態様による発現カセットに使用され得る適切な調節エレメントは、哺乳動物細胞に由来する。

【0052】

「ウイルスベクター粒子」という用語は、本明細書で使用される場合、任意のウイルス粒子またはウイルス様粒子を意味する。「ウイルスベクター粒子」は、その表面上にＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質を含む。したがって、「ウイルス粒子」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも１つの生細胞、好ましくは少なくとも１つの哺乳動物細胞に感染することができる任意の感染性薬剤を意味する。

【0053】

「ウイルス様粒子」という用語は、本明細書で使用される場合、感染を可能にするウイルス遺伝材料を欠くことに起因して非感染性であるという点で「ウイルス粒子」とは異なる。適切なウイルス粒子またはウイルス様粒子の例は、当業者に周知である。

【0054】

例えば、ウイルスベクター粒子またはウイルス様粒子は、レトロウイルスベクター粒子またはレトロウイルス様粒子（例えば、レンチウイルスベクター粒子またはレンチウイルス様粒子、またはガンマレトロウイルスベクター粒子またはガンマレトロウイルス様粒子）であってもよい。

【0055】

ウイルス様粒子（Virus-like particle：ＶＬＰ）は、ウイルス粒子に似ているが、ウイルス様粒子のタンパク質をコードするウイルス遺伝材料を含まないため、感染または形質導入はしない。特に、レトロウイルスベクターの文脈でのＶＬＰは、ｐｓｉポジティブ核酸分子を含まない。Ｅｎｖなどのウイルス構造タンパク質が発現すると、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の組立が生じ得る。ウイルスベクター粒子と同様に、ＶＬＰも本発明のＫｏＲＶ Ｅｎｖを用いてシュードタイピングされ得る。ＶＬＰを使用して、標的細胞の細胞質に標的核酸を送達してもよい。特に、ＶＬＰは、ワクチンとして有用である。

【0056】

例えば、発現ベクターは、ウイルスベクターであってもよく、好ましくは、レンチウイルスベクター（例えば、レンチウイルス発現ベクター）またはガンマレトロウイルスベクター（例えば、ガンマレトロウイルス発現ベクター）であってもよい。ウイルスベクターは、レンチウイルス導入プラスミド（例えば、裸のＤＮＡとして）を含んでいてもよく、レンチウイルスウイルス粒子またはガンマレトロウイルスウイルス粒子などの感染性ウイルス粒子に含まれていてもよい。

【0057】

クローニング部位、プロモーター、調節エレメント、異種核酸などのエレメントに関して、これらのエレメントの配列は、レンチウイルスまたはガンマレトロウイルスベクター粒子中のＲＮＡ形態で存在していてもよく、ＤＮＡプラスミド中にＤＮＡ形態で存在していてもよいことを理解されたい。

【0058】

「シュードタイピングされたウイルスベクター粒子」という用語は、本明細書で使用される場合、任意のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を意味する。「シュードタイピングされた」という用語は、本明細書で使用される場合、ウイルスベクター粒子またはウイルス様粒子が、そのエンベロープタンパク質の１つ以上に改変を有する（例えば、エンベロープタンパク質が、別のウイルス由来のエンベロープタンパク質で置換されている）ことを意味する。例えば、本発明の場合には、このことは、コアラレトロウイルスに由来しないウイルスベクター粒子またはウイルス様粒子が、ＫｏＲＶＡまたはＫｏＲＶＢなどのＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質、またはそれらの混合物を含むことを意味する。このことは、例えば、図２に示すように達成されてもよい。詳細には、そのウイルスの天然に存在するエンベロープタンパク質をコードする核酸は、ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸に置き換えられてもよい。あるいは、ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質をコードする核酸もまた、そのウイルスの天然エンベロープタンパク質をコードする核酸配列を欠失させることなく、そのような天然ウイルス発現ベクターに導入されてもよい。得られたウイルス発現ベクターは、次いで、細胞にトランスフェクトされ、その後、ＫｏＲＶエンベロープタンパク質および導入ベクターを含むウイルスゲノムを含むシュードタイピングされたウイルスベクター粒子が生成されてもよい。

【0059】

第２世代および第３世代のウイルス発現系、特に、レトロウイルス、より好ましくは、レンチウイルスおよびガンマレトロウイルスベクター系では、ウイルスゲノムの一部が欠失していてもよく、および／または異なる発現ベクター上に存在していることが理解される。例えば、少なくとも１つのＫｏＲＶ核酸は、１つの発現プラスミド上に存在してもよい。例えば、更なるウイルスベクターは、ｇａｇ、ｐｏｌ、および／またはＲＲＥ、ならびに任意選択的にＲｅｖを含んでいてもよい。代替的な実施形態では、Ｒｅｖは、別個のウイルスベクター上に存在していてもよい。更に、導入ベクターと呼ばれる更なる発現ベクターは、ペイロード核酸を含んでいてもよい。

【0060】

例えば、第３世代のレンチウイルスまたはガンマレトロウイルスパッケージングプラスミドは、（ｉ）ｇａｇおよびｐｏｌ、（ｉｉ）ｒｅｖ、および（ｉｉｉ）少なくとも１つのＫｏＲＶタンパク質を発現する発現ベクター、ならびに少なくとも１つのペイロード核酸を含む導入遺伝子導入プラスミドを含んでいてもよい。

【0061】

しかし、発現プラスミド上のエレメントの配置を変えることでも、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子を生成することができる。

【0062】

例えば、特許文献３は、４つのプラスミドではなく、２つのプラスミドを利用して、必要なパッケージングエレメントおよび導入ベクターを細胞に提供し、それによって、本発明のパッケージング細胞株を生成する方法を開示している。本技術に適用されるこのような方法では、哺乳動物細胞は、以下を用いてトランスフェクトされる。ｉ．１．第１のプロモーターの制御下でのビリオンタンパク質の発現のレンチウイルス制御因子（ＲＥＶ）遺伝子、２．第２のプロモーターの制御下でのレンチウイルスエンベロープ遺伝子、および３．第３のプロモーターの制御下でのレンチウイルスグループ特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子の両方をコードする発現カセットを含むパッケージングベクター（発現カセットが、５’および３’末端の両方においてトランスポゾン特異的逆位末端反復（inverted terminal repeat：ＩＴＲ）によって隣接されている）、ならびにｉｉ．１．第４のプロモーターの制御下での目的の遺伝子をコードする核酸配列（核酸配列が、５’および３’末端の両方においてトランスポゾン特異的逆位末端反復（ＩＴＲ）によって隣接されている）を含む導入ベクター。この方法を本発明に適用すると、レンチウイルスエンベロープ遺伝子は、本発明のＫｏＲＶ Ｅｎｖ核酸で置き換えられる。

【0063】

使用可能な発現ベクターとして、更に異なる配置のプラスミドを用いた代替法が特許文献４に記載されている。本方法は、必要なパッケージングエレメントおよび導入ベクターを細胞に提供するために、４つではなく、３つのプラスミドを利用する。本発明に適用されるこのような代替的な方法では、哺乳動物細胞は、以下を用いてトランスフェクトされる。ｉ．第１のプロモーターの制御下でのビリオンタンパク質の発現のレンチウイルス制御因子（ＲＥＶ）遺伝子、および第２のプロモーターの制御下でのエンベロープ糖タンパク質遺伝子をコードする第１の核酸、ｉｉ．第３のプロモーターの制御下での目的の遺伝子をコードする第２の核酸、ならびにｉｉｉ．第４のプロモーターの制御下でのレンチウイルスグループ特異的抗原（ＧＡＧ）遺伝子およびレンチウイルスポリメラーゼ（ＰＯＬ）遺伝子の両方をコードする第３の核酸。この方法を本発明に適用すると、レンチウイルスエンベロープ遺伝子は、本発明のＫｏＲＶ Ｅｎｖ核酸で置き換えられる。

【0064】

したがって、「シュードタイピングされたウイルスベクター粒子」という用語は、ベクターに対して外来性のウイルスエンベロープ糖タンパク質を含むウイルスベクター粒子を指す。

【0065】

「外来性」とは、タンパク質または薬剤が、レンチウイルスまたはガンマレトロウイルスなど、ウイルスベクター粒子の由来となる対応する野生型ウイルスによって構成されるものでもなく、それによってコードされるものでもないと理解される。

【0066】

本発明によるウイルスベクターは、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖによりシュードタイピングされている。

【0067】

好ましくは、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、レンチウイルスまたはガンマレトロウイルスベクター粒子、および少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖを有するウイルスベクター粒子である。このようなシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、例えば、図１に示される。

【0068】

ウイルスベクターは、ウイルス由来の核酸エレメントを含む導入プラスミドなどの核酸分子を含み、典型的には、核酸分子の導入、または核酸分子の導入を媒介する細胞のゲノムへの組み込み、またはウイルスベクター粒子への組み込みを容易にする。ウイルスベクター粒子は、典型的には、核酸に加えて様々なウイルス構成要素を含み、時には宿主細胞構成要素も含む。

【0069】

ガンマレトロウイルスベクターは、主にガンマレトロウイルスに由来する構造的および機能的遺伝子エレメント、またはその一部を含むウイルスベクターまたはプラスミドを含んでいてもよい。レンチウイルスベクターは、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲを含む構造的および機能的遺伝子エレメント、またはその一部を含むウイルスベクターまたはプラスミドを含んでいてもよい。

【0070】

第１の態様では、本発明は、少なくとも１つのコアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）をコードする少なくとも１つの核酸を含む、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子に関する。

【0071】

本発明の第１の態様の発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子に含まれる核酸は、Ｃ末端ＲペプチドまたはＲペプチドの一部を欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖを更にコードしてもよい。一般に、「Ｃ末端Ｒペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ＫｏＲＶ Ｅｎｖの最Ｃ末端をコードする任意の核酸配列、または膜貫通ドメインをコードする核酸配列のＣ末端の任意の核酸配列を意味する。例えばＫｏＲＶＡの場合、Ｃ末端Ｒペプチドは、ＫｏＲＶＡのアミノ酸位置６４５～６５９に対応する。全長タンパク質ＫｏＲＶＡ配列は、配列番号６に示される。したがって、Ｃ末端Ｒペプチドは、ＫｏＲＶＡのその領域に対応する任意のＫｏＲＶタンパク質中の任意のペプチド領域であってもよい。Ｒペプチドは、配列モチーフの分析によって決定することができる。例えばＫｏＲＶＢの場合、Ｃ末端Ｒペプチドは、ＫｏＲＶＢのアミノ酸位置６５２～６６６に対応する。全長タンパク質ＫｏＲＶＡ配列は、配列番号８に示される。

【0072】

配列番号２、４、６および８に示されるＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質配列は、Ｎ末端シグナルペプチドを含む。

【0073】

本発明のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子では、シグナルペプチドは、ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質から除去され、それによって、成熟ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質を生成する。本発明のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、成熟ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖタンパク質を含む。好ましくは、成熟ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖタンパク質は、Ｒペプチドを欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く。あるいは、成熟ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖタンパク質は、完全な細胞質ドメインを含む。

【0074】

本発明によれば、「成熟ＫｏＲＶ Ｅｎｖ」は、Ｎ末端シグナルペプチドを欠くＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質であると理解される。

【0075】

本発明のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子では、シグナルペプチドは、ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質から除去される。本発明のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、成熟ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質を含む。好ましくは、成熟ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質は、Ｒペプチドを欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く。あるいは、成熟ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質は、完全な細胞質ドメインを含む。

【0076】

更に、好ましくは、Ｃ末端Ｒペプチドを欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする本発明の発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子中に含まれる本発明の核酸は、完全なＣ末端Ｒペプチドを欠いていてもよく、Ｃ末端Ｒペプチドの一部を欠いていてもよく、したがって、様々な長さのものであってもよい。発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子中に含まれる核酸が、Ｃ末端Ｒペプチドの一部を欠く場合、その１つ、２つ、３つ、もしくはそれより多くの配列部分を欠いていてもよく、および／またはこれらの配列部分は、連続していてもよく、分離していてもよい。

【0077】

Ｃ末端Ｒペプチドを欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする核酸は、例えば、Ｃ末端Ｒペプチドをコードする核酸配列を既に欠いている核酸を発現ベクターまたは発現カセットに導入することによって調製されてもよい。更に、Ｃ末端Ｒペプチドを欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする核酸は、全長ＫｏＲＶ Ｅｎｖを発現ベクターまたは発現カセットに導入し、Ｃ末端Ｒペプチドをコードする核酸配列を酵素的に切り出すことによって調製されてもよい。

【0078】

好ましい実施形態では、少なくとも１つの核酸は、Ｃ末端Ｒペプチドを欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする。

【0079】

第２の態様では、本発明は、融合阻害性Ｒペプチド（Ｒペプチド）を欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする、核酸に関する。

【0080】

融合阻害性Ｒペプチド（Ｒペプチド）を欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする、そのような核酸は、本来は天然には存在しない。更に、このような核酸は、当該技術分野では開示されていない。

【0081】

本発明の第２の態様による核酸は、一般に、融合阻害性Ｒペプチド（Ｒペプチド）を欠くか、またはＲペプチドの一部を欠き、様々な長さのものであってもよい、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする任意の核酸分子に関する。本発明の第２の態様による核酸の例としては、限定されないが、プラスミド、ベクター、または例えばイオン交換クロマトグラフィーを含む標準的な分子生物学的手順によって単離することができるあらゆる種類のＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ断片が挙げられる。本発明の第２の態様による核酸は、特定の細胞または生物のトランスフェクションまたは形質導入に使用されてもよい。

【0082】

Ｒペプチドを欠くＫｏＲＶＡ Ｅｎｖをコードする核酸、Ｒペプチドを欠くＫｏＲＶＡ Ｅｎｖをコードする核酸、ならびにＲペプチドを欠くＫｏＲＶＡ Ｅｎｖをコードする核酸およびＲペプチドを欠くＫｏＲＶＢ Ｅｎｖをコードする核酸の組み合わせを、実施例１および２において、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子の生成、およびその後のペイロード核酸によるＮＫ細胞の効率的な形質導入のために首尾良く使用した。

【0083】

本発明に従って使用可能なＫｏＲＶ Ｅｎｖ配列、およびＫｏＲＶ Ｅｎｖ配列をコードする核酸配列を以下の表１に示す。

【0084】

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表1-4】

【表1-5】

【0085】

本発明の第２の態様による核酸分子は、例えば、クローニングによって得られたか、または化学合成技術によって生成されたか、またはそれらの組み合わせによる、ｍＲＮＡもしくはｃＲＮＡなどのＲＮＡの形態であってもよく、または例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含むＤＮＡの形態であってもよい。ＤＮＡは、三本鎖、二本鎖、または一本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡは、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよく、またはアンチセンス鎖とも称される非コード鎖であってもよい。本発明の第２の態様による核酸分子はまた、特に、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡの混合物であるＤＮＡ、ならびに一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖もしくは、より典型的には二本鎖、もしくは三本鎖、もしくは一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であってもよいＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を指していてもよい。加えて、本明細書で使用される核酸分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。

【0086】

加えて、核酸は、１つ以上の改変された塩基を含んでいてもよい。このような核酸はまた、生理学的環境におけるそのような分子の安定性および半減期を増加させるために、例えばリボース－リン酸骨格に改変を含んでいてもよい。したがって、安定性のため、あるいはその他の理由で骨格が改変されたＤＮＡまたはＲＮＡは、その特徴が本明細書で意図されるため、「核酸分子」である。更に、ほんの２つの例を挙げると、イノシンなどの非通常の塩基、またはトリチル化塩基などの改変塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明の文脈内の核酸分子である。ＤＮＡおよびＲＮＡには、当業者に知られている多くの有用な目的を果たすために、多種多様な改変が加えられてきたことが理解されるだろう。本明細書で使用される核酸分子という用語は、このような化学的、酵素的または代謝的に改変された形態の核酸分子、ならびに特に単純な細胞および複雑な細胞を含むウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を包含する。

【0087】

更に、融合阻害性Ｒペプチド（Ｒペプチド）を欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする核酸をコードする本発明の第２の態様による核酸分子は、例えば、融合タンパク質を作製するために、標準的なクローニング技術などの標準的な技術を使用して、調節配列、リーダー配列、異種マーカー配列または異種コード配列などの任意の所望の配列に機能的に連結することができる。

【0088】

本発明の第２の態様の核酸は、元来、一般にエンドヌクレアーゼおよび／もしくはエキソヌクレアーゼおよび／もしくはポリメラーゼおよび／もしくはリガーゼおよび／もしくはリコンビナーゼによる核酸の操作、または核酸を生成するための当業者に公知の他の方法によって、インビトロで、または培養物中の細胞において、形成されてもよい。

【0089】

本発明の第２の態様の核酸は、発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子中に含まれてもよく、核酸は、宿主細胞において核酸の発現を促進することができるプロモーター配列に作動可能に連結される。

【0090】

融合阻害性Ｒペプチド（Ｒペプチド）を欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする第２の態様による核酸はまた、融合阻害性Ｒペプチド（Ｒペプチド）を欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く少なくとも２つのＫｏＲＶ Ｅｎｖ、融合阻害性Ｒペプチド（Ｒペプチド）を欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く少なくとも３つのＫｏＲＶ Ｅｎｖ、あるいは融合阻害性Ｒペプチド（Ｒペプチド）を欠くか、またはＲペプチドの一部を欠く少なくとも４つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードしてもよい。

【0091】

第１および第２の態様では、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖは、任意のＫｏＲＶ Ｅｎｖ種の任意のＫｏＲＶ Ｅｎｖから選択されてもよい。例えば、ＫｏＲＶ Ｅｎｖは、ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖ、ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖ、ＫｏＲＶＣ Ｅｎｖ、ＫｏＲＶＤ Ｅｎｖ、ＫｏＲＶＥ Ｅｎｖ、ＫｏＲＶＦ Ｅｎｖ、ＫｏＲＶＪ Ｅｎｖおよびそれらの任意の組み合わせから選択されてもよい。好ましくは、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖは、ＫｏＲＶＡ、ＫｏＲＶＢおよびそれらの組み合わせまたは混合物から選択されてもよい。

【0092】

第１および第２の態様の好ましい実施形態では、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖは、ＫｏＲＶＡ、ＫｏＲＶＢおよびそれらの組み合わせから選択される。

【0093】

更に、ＫｏＲＶ Ｅｎｖの配列は、（ａ）配列番号２、（ｂ）配列番号６（配列番号６は、任意選択的に配列番号６のアミノ酸６４５～６５９のうちの１個以上についてＣ末端切断されている）、および（ｃ）シグナルペプチドを欠く（ａ）または（ｂ）の配列から選択されてもよい。

【0094】

ＫｏＲＶの場合、シグナルペプチドは、アミノ酸位置１～３５に対応する（図１を参照されたい）。あるいは、シグナルペプチドの一部のみが欠失したＫｏＲＶ Ｅｎｖも包含される。例えば、アミノ酸１～３３または１～３４が欠失していてもよい。

【0095】

更に、ＫｏＲＶ Ｅｎｖの配列が、（ｂ）配列番号６（配列番号６は、配列番号６のアミノ酸６４５～６５９のうちの１個以上についてＣ末端切断されている）から選択される場合、配列番号６のＣ末端がまた、配列番号６のアミノ酸６４５～６５９のうちの２個以上、配列番号６のアミノ酸６４５～６５９のうちの３個以上、配列番号６のアミノ酸６４５～６５９のうちの５個以上、または配列番号６のアミノ酸６４５～６５９のうちの１０個以上について末端切断されていてもよい。例えば、配列番号６のＣ末端は、配列番号６のアミノ酸６４５～６５９のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個について末端切断されていてもよい。

【0096】

更に、ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖの配列は、（ａ）配列番号４、（ｂ）配列番号８（配列番号８は、任意選択的に配列番号８のアミノ酸６５２～６６６のうちの１個以上についてＣ末端切断されている）、および（ｃ）シグナルペプチドを欠く（ａ）または（ｂ）の配列から選択されてもよい。

【0097】

ＫｏＲＶＢの場合、シグナルペプチドは、アミノ酸位置１～３５に対応する。あるいは、シグナルペプチドの一部のみが欠失したＫｏＲＶ Ｅｎｖも包含される。例えば、アミノ酸１～３３または１～３４が欠失していてもよい。

【0098】

更に、ＫｏＲＶ Ｅｎｖの配列が、（ｂ）配列番号８（配列番号８が、配列番号８のアミノ酸６５２～６６６のうちの１個以上についてＣ末端切断されている）から選択される場合、配列番号８のＣ末端がまた、配列番号８のアミノ酸６５２～６６６のうちの２個以上、配列番号８のアミノ酸６５２～６６６のうちの３個以上、配列番号８のアミノ酸６５２～６６６のうちの５個以上、または配列番号８のアミノ酸６５２～６６６のうちの１０個以上について末端切断されていてもよい。例えば、配列番号８のＣ末端は、配列番号８のアミノ酸６５２～６６６のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個について末端切断されていてもよい。

【0099】

少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする少なくとも１つの核酸の配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５（配列番号５は、任意選択的に４８個の３’末端ヌクレオチドのうちの１つ以上について３’末端で切断されている）、配列番号７（配列番号７は、任意選択的に４８個の３’末端ヌクレオチドのうちの１つ以上について３’末端で切断されている）、または１つ以上のサイレント変異を含むそれらのバリアントのうちの１つ以上を含んでいてもよく、またはそれらからなってもよい。

【0100】

少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする少なくとも１つの核酸の配列が、配列番号１、配列番号３、配列番号５のうちの１つ以上を含むか、またはそれらからなる場合、これらの配列の任意の組み合わせを含んでいてもよく、またはそれらからなってもよい。すなわち、配列番号１；配列番号３；配列番号５；配列番号１および配列番号３；配列番号１および配列番号５；配列番号３および配列番号５、または配列番号１、配列番号３および配列番号５を含んでいてもよく、またはそれらからなってもよい。更に、任意の順序で、これらの配列を含むか、またはそれらからなることも意味し得る。更に、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする少なくとも１つの核酸が、配列番号１、配列番号３、配列番号５のうちの２つ以上からなるか、またはそれらからなる場合、これはまた、配列番号１、配列番号３、配列番号５の２倍のうちのいずれか１つからなるか、またはそれらからなることを意味し得る。

【0101】

配列番号５が、４８個の３’末端ヌクレオチドのうちの１つ以上について３’末端で切断されている場合、このことは、配列番号５が、４８個の３’末端ヌクレオチドの１～４８個について、好ましくは、４８個の３’末端ヌクレオチドの２～２４個について、より好ましくは、４８個の３’末端ヌクレオチドの４～１２個について、３’末端で切断されてもよいことを意味する。配列番号５が、４８個の３’末端ヌクレオチドのうちの２つ以上について３’末端で切断されている場合、切断されたヌクレオチドは、隣接していてもよく、または切断の一部ではないヌクレオチドによって分離していてもよい。配列番号７が、４８個の３’末端ヌクレオチドのうちの１つ以上について３’末端で切断されている場合、４８個の３’末端ヌクレオチドのうちの１つ以上について３’末端で切断された配列番号５の上述の特徴と同じことが適用される。

【0102】

「サイレント変異」という用語は、本明細書で使用される場合、そのような核酸によってコードされるタンパク質に何ら影響を及ぼさない任意のヌクレオチド変異を記述する。例えば、サイレント変異は、そのような核酸によってコードされるタンパク質の機能または折り畳みに影響を与え得ない。更なる例では、サイレント変異は、そのアミノ酸配列の修正をもたらさないなど、得られるタンパク質の合成に影響を与え得ない。またはアミノ酸配列の修正をもたらす場合、アミノ酸が類似のアミノ酸と交換され、それによって、その交換がタンパク質の機能に影響を与えない。例えば、サイレント変異は、あるヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されることによる点変異であってもよい。

【0103】

第１および第２の態様の更に好ましい実施形態では、
（ｉ）ＫｏＲＶ Ｅｎｖの配列は、（ａ）配列番号２、（ｂ）配列番号６（配列番号６は、任意選択的に配列番号６のアミノ酸６４５～６５９のうちの１個以上についてＣ末端切断されている）、および（ｃ）シグナルペプチドを欠く（ａ）または（ｂ）の配列から選択され、
（ｉｉ）ＫｏＲＶＢ Ｅｎｖの配列は、（ａ）配列番号４、（ｂ）配列番号８（配列番号８は、任意選択的に配列番号８のアミノ酸６５２～６６６のうちの１個以上についてＣ末端切断されている）、および（ｃ）シグナルペプチドを欠く（ａ）または（ｂ）の配列から選択され、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする少なくとも１つの核酸の配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５（配列番号５は、任意選択的に４８個の３’末端ヌクレオチドのうちの１つ以上について３’末端で切断されている）、配列番号７（配列番号７は、任意選択的に４８個の３’末端ヌクレオチドのうちの１つ以上について３’末端で切断されている）、または１つ以上のサイレント変異を含むそれらのバリアントのうちの１つ以上を含むか、またはそれらからなる。

【0104】

少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする核酸は、更に、（ｉ）異種プロモーターおよび／または（ｉｉ）構成的プロモーターおよび／または（ｉｉｉ）ポリＡテール配列に作動可能に連結されてもよい。

【0105】

「異種プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、自然環境においてポリヌクレオチド配列と通常関連しない任意のプロモーターを意味する。適切な異種プロモーターは、当業者に周知である。例えば、ウイルスサルウイルス４０（simian virus 40：ＳＶ４０）（例えば、初期もしくは後期）、サイトメガロウイルス（cytomegalovirus：ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia virus：ＭｏＭＬＶ）、ラウス肉腫ウイルス（Rous sarcoma virus：ＲＳＶ）、またはヘルペス単純ウイルス（herpes simplex virus：ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが使用されてもよい。

【0106】

「構成的プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、関連する遺伝子の継続的な転写を可能にする、調節されないプロモーターを意味する。適切な構成的プロモーターは、当業者に周知である。例えば、ヒト伸長因子－１アルファ（ＥＦ－１アルファ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（mouse mammary tumor virus：ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バールウイルス最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、またはクレアチンキナーゼプロモーターを使用してもよい。

【0107】

「ポリＡテール配列」という用語は、本明細書で使用される場合、２つ以上のアデノシン一リン酸の付加を意味する。一般に、ポリＡテール配列は、核酸の３’末端に位置する。

【0108】

また、第１および第２の態様の好ましい実施形態では、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖをコードする核酸は、（ｉ）異種プロモーターおよび／または（ｉｉ）構成的プロモーターおよび／または（ｉｉｉ）ポリＡテール配列に作動可能に連結される。

【0109】

第３の態様では、本発明は、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖでシュードタイピングされている、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子に関する。

【0110】

本発明の第１の態様の発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子について上で指定した全ての特徴、および本発明の第２の態様の核酸について上で指定した全ての特徴は、本発明の第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子にも関連すると考えられる。

【0111】

本発明の第３の態様によるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖでシュードタイピングされている。好ましくは、本発明の第３の態様によるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質、例えば、ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖタンパク質でシュードタイピングされている。あるいは、本発明の第３の態様によるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、更に、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くのＫｏＲＶ Ｅｎｖでシュードタイピングされていてもよい。これらのＫｏＲＶ Ｅｎｖは、例えば、ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢなどの異なるエンベロープ糖タンパク質バリアントに由来するという点で異なっていてもよく、そのようなバリアントのキメラであってもよく、単に、同じエンベロープ糖タンパク質バリアントの変異バリアントであるという点で異なっていてもよい。

【0112】

第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を調製するのに適したウイルスベクター粒子は、当業者に周知である。例えば、第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子のためのウイルスベクター粒子は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）またはコーカルウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルス、ニパウイルス）および植物ウイルスなどの任意のウイルス種から選択されてもよく、また、上に述べられたものなどの任意のウイルス種のハイブリッドであってもよい。

【0113】

好ましくは、第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子のウイルスベクター粒子は、レトロウイルス粒子から選択されてもよい。好適なレトロウイルスベクター粒子は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、トリ白血病ウイルス（avian leukosis virus：ＡＬＶ）、呼吸器多核体ウイルス（respiratory syncytial virus：ＲＳＶ）またはＭａｓｏｎ－Ｐｆｉｚｅｒサルウイルス（Mason-Pfizer monkey virus：ＭＰＭＶ）ベクター粒子、レンチウイルス粒子、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えば、ＨＩＶ－１またはＨＩＶ－２、サル免疫不全ウイルス（Simian Immunodeficiency Virus：ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（feline immunodeficiency virus：ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（equine infectious anemia virus：ＥＩＡＶ）およびヤギ関節炎脳脊髄炎ウイルス（caprine arthritis encephalitis virus：ＣＡＥＶ）ベクター粒子、ガンマレトロウイルス粒子およびスプーマウイルスベクター粒子、例えば、ヒトフォーミーウイルス（human foamy virus：ＨＦＶ）ベクター粒子を含む、腫瘍ウイルスベクター粒子からなる群から選択されてもよい。

【0114】

より好ましくは、ウイルスベクター粒子は、レンチウイルスベクター粒子およびガンマレトロウイルスベクター粒子から選択されてもよい。

【0115】

Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅは、一本鎖であり、二倍体のポジティブセンスＲＮＡゲノムを有するウイルス科であり、これがＤＮＡ中間体に逆転写され、次いで、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ由来のウイルスは、直径８０～１２０ｎｍのエンベロープ化された粒子である。以下、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅをレトロウイルスとも呼ぶ。

【0116】

レンチウイルスは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ属の一種であり、ヒトおよび他の哺乳動物種において、長い潜伏期間を特徴とする慢性かつ致死的な疾患を引き起こす。最もよく知られているレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルスＨＩＶであり、非分裂細胞に効率的に感染することができるため、レンチウイルス由来のレンチウイルスベクターは、遺伝子送達の最も効率的な方法の１つである。

【0117】

Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅは、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科の属の一種である。代表的な種は、マウス白血病ウイルスおよびネコ白血病ウイルスである。以下、Ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅをガンマレトロウイルスとも呼ぶ。

【0118】

適切なレンチウイルスベクターは、当該技術分野でよく知られている。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１）、ＨＩＶ－２サル免疫不全ウイルス、非霊長類レンチウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ、およびウシ免疫不全ウイルスなどに由来するレンチウイルスベクターを使用してもよい。

【0119】

更に、ガンマレトロウイルスベクターは、当該技術分野でよく知られている。例えば、ＭｏＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）またはＭＳＣＶ（Murine Stem Cell Virus：マウス幹細胞ウイルス）に由来するガンマレトロウイルスベクターを使用してもよい。

【0120】

第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子の好ましい実施形態では、ウイルスベクター粒子は、レンチウイルスまたはガンマレトロウイルスベクター粒子から選択される。

【0121】

レトロウイルスベクター粒子、レンチウイルスベクター粒子、およびガンマレトロウイルスベクター粒子は、対応するウイルス科に由来する複製欠損ウイルスベクター粒子である。それらは、一本鎖ＲＮＡゲノムであるＧａｇおよびＰｏｌタンパク質を含有し、典型的には、他のウイルスに由来する異種エンベロープタンパク質によりシュードタイピングされる。本発明のウイルスベクター粒子は、少なくとも1つのＫｏＲＶ Ｅｎｖによりシュードタイピングされる。上述のウイルスベクターのＲＮＡゲノムは、ウイルス子孫を生成するためのウイルス遺伝子を何ら含有しないが、好ましくは、ＤＮＡにおける効率的なパッキングおよび逆転写に必要なｐｓｉエレメントおよびＬＴＲを含む。ＤＮＡ中間体は、適切なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）の制御下で目的の異種配列をコードするペイロード核酸を含有していてもよく、目的の異種配列は、上述のＤＮＡを宿主細胞のゲノムに組み込んだときに発現される。宿主細胞に侵入し、ＲＮＡゲノムを送達し、目的の異種配列を組み込み、発現させるプロセスを、形質導入と呼ぶ。ガンマレトロウイルスまたはレンチウイルスベースのウイルスベクターの最小限の要件は、当該技術分野で十分に説明されている。

【0122】

実施例では、ＫｏＲＶ Ｅｎｖタンパク質によりシュードタイピングされたレンチウイルス粒子が、ＮＫ細胞の効率的な形質導入に首尾良く使用された。

【0123】

本発明のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、核酸を含む内腔を更に含む。核酸は、好ましくは、以下の５’ＬＴＲ（例えばＵ５を含み、機能的Ｕ３ドメインを欠く）、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）／セントラル終止配列（ＣＴＳ）（例えば、ＤＮＡフラップ）、ポリＡテール配列、転写後調節エレメント（例えばＷＰＲＥ）、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、および３’ＬＴＲ（例えばＵ５を含み、機能的Ｕ３を欠く）の核酸配列のうちの１つ以上、例えば、全てを含むウイルス核酸を含む。

【0124】

シュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、好ましくは複製不全である。

【0125】

第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、目的の異種配列をコードする少なくとも１つのペイロード核酸を含む核酸を更に含んでいてもよい。

【0126】

「ペイロード核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、目的の異種タンパク質をコードする任意の核酸を意味する。したがって、「異種タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、第３の態様で使用されるウイルスベクター粒子にその自然環境で通常関連しない任意のタンパク質を意味する。好ましくは、「異種タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、そのタンパク質が、加えて、形質導入される哺乳動物細胞中には存在しないことを意味する。一般に、適切なペイロード核酸は、当業者に周知である。例えば、ペイロード核酸は、抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：ＣＡＲ）をコードしてもよく、または抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含んでもよく、もしくはそれから構成されてもよい。

【0127】

少なくとも１つのペイロード核酸を含む核酸は、目的の異種タンパク質の翻訳および形質導入を支援する更なるエレメントを含んでいてもよい。少なくとも１つのペイロード核酸を含む核酸は、「導入ベクター」と称されてもよい。例えば、ペイロード核酸は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターなどのプロモーターに作動可能に連結されていてもよい。例えば、ＣＭＶプロモーターを使用してもよい。

【0128】

本発明の第１または第３の態様の核酸について上で指定した全ての特徴は、本発明の第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子に含まれる核酸にも関連すると考えられる。

【0129】

また、第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子の好ましい実施形態では、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、目的の異種配列をコードする少なくとも１つのペイロード核酸を含む核酸を更に含む。

【0130】

第４の態様では、本発明は、本発明の第１または第３の態様によるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を生成する哺乳動物パッケージング細胞株に関する。

【0131】

「哺乳動物パッケージング細胞株」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、ウイルスベクター粒子をパッケージングすることができるウイルス構造タンパク質および複製酵素（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を安定にまたは一過性に発現するよって、一般にウイルスベクター粒子を生成することができる任意の哺乳動物細胞株を意味する。好適な哺乳動物パッケージング細胞株は、当業者によく知られており、ヒト細胞株、マウス細胞株（マウス細胞株またはラット細胞株など）、ハムスター細胞株、イヌ細胞株またはサル細胞株など、任意の哺乳動物由来の細胞株であってもよい。好ましくは、哺乳動物パッケージング細胞株は、ヒト細胞株である。

【0132】

更に、適切な哺乳動物パッケージング細胞株は、腎臓、卵巣、胎盤、骨髄、肺、結合組織（線維芽細胞など）、肝臓、子宮頸部、結腸、脳または脾臓などの様々な臓器に由来していてもよい。適切な哺乳動物パッケージング細胞株は、更に、マクロファージなどの免疫系の細胞に由来するものであってもよい。また、神経細胞または上皮細胞も適している場合がある。更に、適切な哺乳動物パッケージング細胞株は、健康な生物または疾患に罹患している生物に由来していてもよい。例えば、適切な哺乳動物パッケージング細胞株は、腫瘍に由来していてもよい。最後に、適切な哺乳類パッケージング細胞株はまた、胚細胞または幹細胞に由来していてもよい。

【0133】

適切な哺乳動物細胞株の例は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、Ｃ３Ｈ １０Ｔ１／２細胞、Ｐｓｉ－２細胞、ＢＯＳＣ ２３細胞、ＰＡ３１７細胞、ＷＥＨＩ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＳＣ １細胞、ＢＳＣ ４０細胞、ＢＭＴ １０細胞、ＶＥＲＯ細胞、Ｗ１３８細胞、ＭＲＣ５細胞、Ａ５４９細胞、ＨＴ１０８０細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞、Ｂ－５０細胞、３Ｔ３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｓａｏｓ－２細胞、Ｈｕｈ７細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｗ１６３細胞、２１１細胞、および２１１Ａ細胞である。好ましくは、哺乳動物パッケージング細胞株は、ＨＥＫ ２９３Ｔ細胞である。

【0134】

本発明の第１または第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子について上で指定した全ての特徴は、本発明の第４の態様の哺乳動物パッケージング細胞株に含まれるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子にも関連すると考えられる。

【0135】

本発明の第４の態様による哺乳動物パッケージング細胞株は、本発明の第１の態様による発現ベクターもしくは発現カセット、本発明の第１もしくは第３の態様によるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子、または本発明の第２の態様による核酸を更に含んでいてもよい。第１の態様の発現ベクターもしくは発現カセット、第１もしくは第３の態様によるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子、または第２の態様による核酸について上で指定した全ての特徴は、そのような発現ベクター、発現カセット、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子または核酸を含む哺乳動物パッケージング細胞株にも関連すると考えられる。

【0136】

本発明の第４の態様による哺乳動物パッケージング細胞株は、長い末端反復（long terminal repeat：ＬＴＲ）を含む核酸を含んでいてもよい。

【0137】

更に、第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、長い末端反復（ＬＴＲ）を含む核酸を含んでいてもよい。

【0138】

「長い末端反復」という用語は、本明細書で使用される場合、例えば、２００～３０００個の塩基対を有する反復核酸配列を意味し、通常、遺伝子に隣接し、そのゲノムへの転移を可能にする。適切なＬＴＲは、当業者に周知であり、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（myeloproliferative sarcoma virus：ＭＰＳＶ）、マウス胚性幹細胞ウイルス（murine embryonic stem cell virus：ＭＥＳＶ）、マウス幹細胞ウイルス（murine stem cell virus：ＭＳＣＶ）、脾限局巣形成ウイルス（spleen focus forming virus：ＳＦＦＶ）、またはアデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus：ＡＡＶ）に由来していてもよい。適切なＬＴＲは、例えば、５’ＬＴＲおよび／または３’ＬＴＲであってもよい。適切な５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲは、当業者によく知られており、例えばＵ５を含み、機能的Ｕ３ドメインを欠いていてもよい。

【0139】

本発明の第４の態様による哺乳動物パッケージング細胞株はまた、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来し得る、例えば、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）を含む核酸を含んでいてもよい。更に、第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）に由来し得る、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）を含む核酸を含んでいてもよい。

【0140】

本発明の第４の態様による哺乳動物パッケージング細胞株はまた、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）／セントラル終止配列（ＣＴＳ）（例えば、ＤＮＡ－フラップ）を含む核酸を含んでいてもよい。更に、第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）／セントラル終止配列（ＣＴＳ）（例えば、ＤＮＡ－フラップ）を含む核酸を含んでいてもよい。一般に、ｃＰＰＴまたはＣＴＳは、少なくとも９個の核酸の配列を含み、これらは各々、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドのいずれかである。通常、ｃＰＰＴは、コードされた目的の遺伝子（例えば、異種タンパク質）の下流に位置し、３’ＬＴＲが位置し得る位置の上流にある。ＣＴＳは、インテグラーゼのオープンリーディングフレーム内のウイルスゲノムの中心に位置し得る。本発明の第４の態様による哺乳動物パッケージング細胞株、または第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子中の核酸は、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）もしくはセントラル終止配列（ＣＴＳ）、またはその両方を含む核酸を含んでいてもよい。ｃＰＰＴまたはＣＴＳに適したヌクレオチド配列は、当業者によく知られている。例えば、ｃＰＰＴおよびＣＴＳは、それらの間にＤＮＡ－フラップを形成する能力に依存して選択されてもよい。

【0141】

本発明の第４の態様による哺乳動物パッケージング細胞株はまた、ポリＡテール配列を含む核酸を含んでいてもよい。更に、第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、ポリＡテール配列を含む核酸を含んでいてもよい。第１の態様による発現ベクター、発現カセットまたはシュードタイピングされたウイルスベクター粒子中の核酸、または第２の態様による核酸に連結され得るポリＡテール配列について上で指定した全ての特徴は、本発明の第４の態様の哺乳動物パッケージング細胞株中に含まれる核酸中に含まれるポリＡテール配列にも関連すると考えられる。

【0142】

本発明の第４の態様による哺乳動物パッケージング細胞株はまた、転写後調節エレメントを含む核酸を含んでいてもよい。更に、第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、転写後調節エレメントを含んでいてもよい。「転写後調節エレメント」という用語は、本明細書で使用される場合、通常は三次元構造を作製し、転写されると、イントロンを含まない異種遺伝子発現の増強を可能にする、核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）を意味する。適切な転写後調節エレメントは、当業者に周知であり、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス（Woodchuck Hepatitis virus：ＷＰＲＥ）またはＢ型肝炎ウイルス（Hepatitis B virus：ＨＰＲＥ）に由来していてもよい。

【0143】

本発明の第４の態様による哺乳動物パッケージング細胞株はまた、例えば、ヒト免疫不全ウイルスに由来してもよい、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む核酸を含んでいてもよい。更に、第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、例えば、例えば、ヒト免疫不全ウイルスに由来してもよい、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）を含む核酸を含んでいてもよい。通常、ＲＲＥは、スプライシングされていないウイルスｍＲＮＡおよび部分的にスプライシングされたウイルスｍＲＮＡのＥｎｖコード領域に位置する。

【0144】

本発明の第４の態様による哺乳動物パッケージング細胞株は、以下の５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）／セントラル終止配列（ＣＴＳ）、ポリＡテール配列、転写後調節エレメント、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、および３’ＬＴＲの核酸配列のうちの１つ以上を含んでいてもよい。更に、第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、以下の５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）／セントラル終止配列（ＣＴＳ）、ポリＡテール配列、転写後調節エレメント、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、および３’ＬＴＲの核酸配列のうちの１つ以上を含んでいてもよい。

【0145】

本発明の第４の態様による哺乳動物パッケージング細胞株はまた、少なくとも１つのコアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）をコードする少なくとも１つの核酸をコードする核酸を含んでいてもよい。例えば、本発明の第４の態様による哺乳動物パッケージング細胞株は、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれより多くのコアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）をコードする少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれより多くの核酸をコードする１つ、２つ、３つ、４つ、もしくはそれより多くの核酸を含んでいてもよい。本発明の第１もしくは第３の態様による使用される核酸、または本発明の第２の態様による核酸について上で指定した全ての特徴は、本発明の第４の態様の哺乳動物パッケージング細胞株に含まれる核酸にも関連すると考えられる。

【0146】

本発明の第４の態様による哺乳動物パッケージング細胞株は、ウイルスパッケージングタンパク質をコードする核酸を更に含んでいてもよい。適切なウイルスパッケージングタンパク質は、当業者によく知られており、任意のウイルス種から選択されてもよく、好ましくは、レンチウイルスなどレトロウイルスから選択されてもよい。適切なウイルスパッケージングタンパク質の例は、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＲｅｖおよびＴａｔである。好ましくは、哺乳動物パッケージング細胞株は、第４の態様に従って含み、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＲｅｖ、ならびに任意選択的にＴａｔのうちの１つ以上から選択されるウイルスパッケージングタンパク質をコードする核酸を含む。

【0147】

このような哺乳動物パッケージング細胞株を作製するための方法は、当業者に周知であり、例えば、一般的なトランスフェクション法を含み、以下の実施例に例示的に記載されているように、ＴｒａｎｓＩＴ ＶｉｒｕｓＧｅｎ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）などのトランスフェクション試薬を使用することによって支援されてもよい。

【0148】

本発明の第４の態様の哺乳動物パッケージング細胞株の好ましい実施形態では、哺乳動物パッケージング細胞株は、
（ｉ）５’ＬＴＲ、Ｐｓｉパッケージングエレメント（Ｐｓｉ）、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）／セントラル終止配列（ＣＴＳ）、ポリＡテール配列、転写後調節エレメント、Ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）、および３’ＬＴＲの核酸配列のうちの１つ以上、
（ｉｉ）少なくとも１つのコアラレトロウイルス（ＫｏＲＶ）エンベロープ糖タンパク質（Ｅｎｖ）をコードする核酸、および／または
（ｉｉｉ）Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＲｅｖ、ならびに任意選択的にＴａｔのうちの１つ以上から選択されるウイルスパッケージングタンパク質をコードする核酸、
を含む。

【0149】

第５の態様では、本発明は、少なくとも１つの哺乳動物細胞への少なくとも１つのペイロード核酸の送達のためのインビトロ方法であって、
（ａ）少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する工程と、
（ｂ）第３の態様による少なくとも１つのシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を提供する工程と、
（ｃ）（ａ）の少なくとも１つの哺乳動物細胞を、インビトロで（ｂ）の少なくとも１つのシュードタイピングされたウイルスベクター粒子と接触させる工程と、を含み、
それによって、少なくとも１つのペイロード核酸を含む少なくとも１つの形質導入された哺乳動物細胞を得る、インビトロ方法に関する。

【0150】

工程（ｂ）におけるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、目的の異種配列をコードする少なくとも１つのペイロード核酸を含む核酸を含む。

【0151】

好ましくは、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、レンチウイルスまたはガンマレトロウイルスベクター粒子から選択される。

【0152】

本発明の第５の態様におけるインビトロ方法は、少なくとも１つの哺乳動物細胞への少なくとも１つのペイロード核酸の送達に関する。

【0153】

本発明の第１および第３の態様の文脈においてペイロード核酸について上で指定した全ての特徴は、本発明の第５の態様のインビトロ方法に使用されるペイロード核酸にも関連すると考えられる。そのような少なくとも１つのペイロード核酸の送達は、例えば、哺乳動物細胞へのそのようなペイロード核酸の導入を意味する。

【0154】

第５の態様による少なくとも１つの哺乳動物細胞への少なくとも１つのペイロード核酸の送達のためのインビトロ方法は、少なくとも３つの工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む。

【0155】

工程（ａ）
第５の態様による方法の工程（ａ）は、少なくとも１つの哺乳動物細胞を提供する工程である。少なくとも１つの哺乳動物細胞が、少なくとも２つの哺乳動物細胞である場合、これらは、同一であってもよく、または様々な哺乳動物細胞の混合物であってもよい。哺乳動物細胞は、当業者によく知られている細胞培養皿などの様々な反応容器で提供されてもよい。

【0156】

工程（ｂ）
第５の態様による方法の工程（ｂ）は、第３の態様による少なくとも１つのシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を提供する工程である。これはまた、第３の態様による２つ、３つ、４つ、またはそれより多くの異なるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を提供することを含んでいてもよい。本発明の第１および第３の態様のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子について上で指定した全ての特徴は、本発明の第５の態様のインビトロ方法に使用されるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子にも関連すると考えられる。

【0157】

工程（ｃ）
第５の態様による方法の工程（ｃ）は、（ａ）の少なくとも１つの哺乳動物細胞を、インビトロで（ｂ）の少なくとも１つのシュードタイピングされたウイルスベクター粒子と接触させることを含む。哺乳動物細胞およびシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を接触させるインビトロ方法は、当業者によく知られている。例えば、少なくとも１つのシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を、工程（ａ）について記載された少なくとも１つの哺乳動物細胞を含む反応容器に添加してもよい。

【0158】

少なくとも３つの工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を含む、第５の態様による少なくとも１つの哺乳動物細胞への少なくとも１つのペイロード核酸の送達のためのインビトロ方法では、少なくとも１つのペイロード核酸を含む少なくとも１つの形質導入された哺乳動物細胞が得られる。

【0159】

ウイルスベクター粒子の適切な形質導入方法は、当業者に周知であり、例えば以下の実施例に記載されている。例えば、カチオン性ポリマー、脂質またはペプチドなどの形質導入エンハンサーを使用することによって、形質導入が更に改善されてもよい。例えば、ヒスチジンを豊富に含むカチオン性両親媒性短鎖ペプチドであるＶｅｃｔｏｆｕｓｉｎ－１を使用してもよく、ＢａＥＶおよびＧＡＬＶなどの特定のシュードタイピングされたＬＶによる形質導入を増強する。

【0160】

第５の態様のインビトロ方法によって標的化可能な適切な哺乳動物細胞は、一般に、ヒト細胞、マウス細胞（マウス細胞もしくはラット細胞など）、ハムスター細胞、イヌ細胞またはサル細胞などの全ての哺乳動物細胞である。

【0161】

好ましくは、少なくとも１つの哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。

【0162】

ペイロード核酸が送達され得る適切な哺乳動物細胞は、腎臓、卵巣、胎盤、骨髄、肺、結合組織（線維芽細胞など）、肝臓、子宮頸部、結腸、脳または脾臓などの様々な臓器の細胞であってもよい。ペイロード核酸が送達され得る適切な哺乳動物細胞は、マクロファージなどの免疫系の細胞であってもよい。更に、ペイロード核酸が送達され得る適切な哺乳動物細胞は、様々な腫瘍の細胞であってもよい。更に、ペイロード核酸が送達され得る適切な哺乳動物細胞は、非腫瘍細胞および／または非増殖細胞である細胞であってもよい。ペイロード核酸が送達され得る適切な哺乳動物細胞はまた、胚細胞であってもよい。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト胚細胞ではない。ペイロード核酸が送達され得る適切な哺乳動物細胞は、更に、造血細胞、ｉＰＳ（人工多能性幹）細胞、幹細胞、または免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球またはマクロファージ）であってもよい。好ましくは、少なくとも１つの哺乳動物細胞は、造血細胞、ｉＰＳ細胞、幹細胞、または免疫細胞から選択され、任意選択的に、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、またはそれらの混合物から選択される。より好ましくは、少なくとも１つの哺乳動物細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞から選択される。更により好ましくは、少なくとも１つの哺乳動物細胞は、Ｔ細胞である。

【0163】

実施例１では、エンベロープタンパク質ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢ、ならびにＫｏＲＶＡＢと称されるそれらの組み合わせは、ＮＫ細胞の非常に効率的な形質導入を可能にすることが見出され、これは、ＮＫ細胞の単離日にＢａＥＶを含む既に記載されているウイルスエンベロープよりも、すなわち、以前に活性化されなかったＮＫ細胞に対して、更に良好であった。実施例１の結果と同様に、実施例２のデータは、ＫｏＲＶＡ、ＫｏＲＶＢ、またはＫｏＲＶＡＢによりエンベロープ化されたレンチウイルスベクター粒子の各々の新鮮な初代ＮＫ細胞における形質導入効率が、ＢａＥＶシュードタイピングされたレンチウイルスベクター粒子と比較して優れていることを確認するものである。

【0164】

更に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、実施例３において、ＫｏＲＶ－ＡまたはＫｏＲＶ－Ｂによりエンベロープ化されたレンチウイルスによって首尾良く改変された。したがって、ＰＢＭＣ試料は、哺乳動物細胞の混合物の一例を表す。更に、ＰＢＭＣ、Ｂ細胞（本実施例ではＣＤ１９＋ Ｂ細胞）、単球（本実施例ではＣＤ１４＋単球）、ＮＫ細胞（本実施例ではＣＤ５６＋／ＣＤ３－ ＮＫ細胞）、およびＴ細胞（本実施例ではＣＤ３＋ Ｔ細胞）における全ての細胞型を、ＫｏＲＶＡまたはＫｏＲＶＢによりエンベロープ化されたレンチウイルスを使用して改変することができることが見出された。特に、単球およびＢ細胞は、ＮＫ細胞およびＴ細胞よりも、ＫｏＲＶＡまたはＫｏＲＶＢ媒介性の遺伝子導入がより起こりやすいことが見出された。

【0165】

少なくとも１つの哺乳動物細胞は、工程（ｃ）の前に活性化されていてもよく、または工程（ｃ）の前に活性化されなくてもよい。哺乳動物細胞を活性化するのに適した方法は、当業者によく知られている。例えば、哺乳動物細胞、特に、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球またはマクロファージなどの免疫細胞を活性化してもよい。免疫細胞を活性化するのに適した薬剤は、当業者によく知られており、通常は、細胞型に依存する。例えば、ＮＫ細胞を活性化するために、ＩＬ－２および／またはＩＬ－１５などのインターロイキンを使用してもよい。マクロファージは、例えばリポ多糖類およびＩＦＮ－ガンマなどのインターフェロン（interferon：ＩＦＮ）を用いて活性化されてもよい。Ｔ細胞は、例えば、抗原提示細胞（antigen-presenting cell：ＡＰＣ）、抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体を用いて活性化されてもよい。好ましくは、少なくとも１つの哺乳動物細胞は、工程（ｃ）の前に活性化されるか、または工程（ｃ）の前に活性化されない。より好ましくは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、またはそれらの混合物は、工程（ｃ）の前に活性化されない。

【0166】

実施例１および２では、ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢ Ｅｎｖは、活性化されなかったＮＫ細胞に対して、ＮＫ細胞の優れた形質導入が見出された。

【0167】

本明細書で使用される「活性化」という用語は、標的細胞の機能、増殖および／または分化を増加させる生理学的変化を細胞に誘導することを指す。

【0168】

哺乳動物免疫細胞、特にＮＫ細胞の活性化は、例えば特許文献２に記載されているように達成することができる。特に、ＮＫ細胞の活性化は、少なくとも１つのサイトカイン、フィーダー細胞もしくはフィーダー細胞の膜粒子の添加によって、または上述のＮＫ細胞へのＮＫ細胞活性化試薬を用いて、達成することができる。上述の少なくとも１つのサイトカインは、ＩＬ－２および／もしくはＩＬ－１５、またはＩＬ－２および／もしくはＩＬ－１５とＩＬ－１ファミリーサイトカインとの組み合わせであってもよく、上述のＩＬ－１ファミリーサイトカインは、ＩＬ－１８、ＩＬ－３３またはＩＬ－１ベータである。

【0169】

少なくとも１つのペイロード核酸は、目的の１つ以上のタンパク質および／またはＲＮＡをコードしてもよい。更に、少なくとも１つのペイロード核酸は、目的の２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多くのタンパク質および／またはＲＮＡをコードしてもよい。

【0170】

少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる目的の１つ以上のタンパク質は、任意のタンパク質であってもよい。例えば、少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる目的の１つ以上のタンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（T cell receptor：ＴＣＲ）、ケモカイン受容体、ＮＫ細胞受容体、免疫調節タンパク質、サイトカイン、抗体および／または標的化エンドヌクレアーゼから選択される。更に、２つ以上の目的のタンパク質が、少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる場合、これらは、同じタンパク質の異なるバリアント（例えば、変異体）から選択されてもよく、またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ケモカイン受容体、ＮＫ細胞受容体、免疫調節タンパク質、サイトカイン、抗体および／または標的化エンドヌクレアーゼの混合物であってもよい。更に、２つ以上の目的のタンパク質が、少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる場合、これらはまた、２つのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、２つのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、２つのケモカイン受容体、２つのＮＫ細胞受容体、２つの免疫調節タンパク質、２つのサイトカイン、２つの抗体および／または２つの標的化エンドヌクレアーゼなどのこれらの同じ種類の２つから選択されてもよい。

【0171】

少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる目的の１つ以上のＲＮＡは、任意のＲＮＡであってもよい。例えば、目的の１つ以上の（少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる）ＲＮＡは、リボザイム、ｇＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ ｍｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0172】

好ましくは、少なくとも１つのペイロード核酸は、目的の１つ以上のタンパク質および／またはＲＮＡをコードする。

【0173】

好ましくは、少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる目的の１つ以上のタンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ケモカイン受容体、ＮＫ細胞受容体、免疫調節タンパク質、サイトカイン、抗体、標的化エンドヌクレアーゼから選択され、および／または目的の少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる１つ以上のＲＮＡは、リボザイム、ｇＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ ｍｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから選択される。

【0174】

少なくとも１つのペイロード核酸は、哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれてもよい。更に、２つ以上のペイロード核酸が使用される場合、これらは、部分的に哺乳動物細胞ゲノムに導入され、部分的に哺乳動物細胞ゲノムに導入されなくてもよい。ペイロード核酸を哺乳動物細胞のゲノムに組み込むための方法は、当業者によく知られている。特に、本発明のシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、形質導入後、ゲノムへの安定な組み込みを媒介してもよい。好ましくは、少なくとも１つのペイロード核酸は、哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれる。好ましくは、少なくとも１つのペイロード核酸は、哺乳動物細胞ゲノムに安定して組み込まれる。

【0175】

更に、本発明の第１、第２、第３または第４の態様の少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖについて上で指定した全ての特徴は、本発明の第５の態様のインビトロ方法に使用される少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖにも関連すると考えられる。好ましくは、第５の態様のインビトロ方法に使用される少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖは、ＫｏＲＶＡである。

【0176】

更に、本発明の第１または第３の態様の少なくとも１つのウイルスベクター粒子について上で指定した全ての特徴は、本発明の第５の態様のインビトロ方法に使用される少なくとも１つのウイルスベクター粒子にも関連すると考えられる。好ましくは、少なくとも１つのウイルスベクター粒子は、レンチウイルスベクター粒子である。

【0177】

好ましくは、
（ｉ）少なくとも１つの哺乳動物細胞は、ヒト細胞であり、および／または
（ｉｉ）少なくとも１つの哺乳動物細胞は、造血細胞、ｉＰＳ細胞、幹細胞、もしくは免疫細胞から選択され、任意選択的に、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、もしくはそれらの混合物から選択され、および／または
（ｉｉｉ）少なくとも１つのペイロード核酸は、目的の１つ以上のタンパク質および／もしくはＲＮＡをコードし、および／または
（ｉｖ）少なくとも１つの哺乳動物細胞は、工程（ｃ）の前に活性化されるか、もしくは工程（ｃ）の前に活性化されず、および／または
（ｖ）少なくとも１つのペイロード核酸は、哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれる。

【0178】

任意選択的に、
（ａ）少なくとも１つの哺乳動物細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、もしくはそれらの混合物から選択され、
任意選択的に、
（ｉ）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、もしくはそれらの混合物は、工程（ｃ）の前に活性化されず、および／または
（ｉｉ）少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる目的の１つ以上のタンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ケモカイン受容体、ＮＫ細胞受容体、免疫調節タンパク質、サイトカイン、抗体、標的化エンドヌクレアーゼから選択され、および／または目的の少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる１つ以上のＲＮＡは、リボザイム、ｇＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ ｍｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから選択され、および／または
（ｉｉｉ）少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖは、ＫｏＲＶＡであり、および／または
（ｂ）少なくとも１つのウイルスベクター粒子は、レンチウイルスベクター粒子である。

【0179】

第５の態様の方法の好ましい実施形態では、
（ｉ）少なくとも１つの哺乳動物細胞は、ヒト細胞であり、および／または
（ｉｉ）少なくとも１つの哺乳動物細胞は、造血細胞、ｉＰＳ細胞、幹細胞、もしくは免疫細胞から選択され、任意選択的に、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、もしくはそれらの混合物から選択され、および／または
（ｉｉｉ）少なくとも１つのペイロード核酸は、目的の１つ以上のタンパク質および／もしくはＲＮＡをコードし、および／または
（ｉｖ）少なくとも１つの哺乳動物細胞は、工程（ｃ）の前に活性化されるか、もしくは工程（ｃ）の前に活性化されず、および／または
（ｖ）少なくとも１つのペイロード核酸は、哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれ、
任意選択的に、
（ａ）少なくとも１つの哺乳動物細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、もしくはそれらの混合物から選択され、
任意選択的に、
（ｉ）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、マクロファージ、もしくはそれらの混合物は、工程（ｃ）の前に活性化されず、および／または
（ｉｉ）少なくとも１つのペイロード核酸によってコードされる目的の１つ以上のタンパク質は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ケモカイン受容体、ＮＫ細胞受容体、免疫調節タンパク質、サイトカイン、抗体、標的化エンドヌクレアーゼから選択され、および／または１つ以上のＲＮＡは、リボザイム、ｇＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ ｍｉＲＮＡ、またはそれらの組み合わせから選択され、および／または
（ｉｉｉ）少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖは、ＫｏＲＶＡであり、および／または
（ｂ）少なくとも１つのウイルスベクター粒子は、レンチウイルスベクター粒子である。

【0180】

第６の態様では、本発明は、第５の態様の方法によって得ることができる、形質導入された哺乳動物細胞であって、任意選択的に、形質導入された哺乳動物細胞が、養子細胞療法または移植に使用するためのものである、形質導入された哺乳動物細胞に関する。

【0181】

本発明の第５の態様のインビトロ方法について上で指定した全ての特徴は、本発明の第６の態様に使用される方法にも関連すると考えられる。

【0182】

「養子細胞療法」という用語は、本明細書で用いられる場合、身体が疾患（例えば、がん）と闘うのを助けるために患者にＴ細胞が投与される任意の種類の免疫療法を意味する。例えば、がん療法では、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、マクロファージなどの免疫細胞、または腫瘍由来の細胞を患者から単離し、実験室で育成し、成長させて数を増やし、その後、改変し、次いで、患者に導入してもよい。育成された細胞の修正は、例えばそれぞれ、本発明の第１および第２の態様による発現ベクター、発現カセットまたは核酸を含む、例えば、本発明の第１または第３の態様に記載されるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子を使用して、実行されてもよい。患者から単離された細胞を修正するための方法は、当業者に周知であり、本発明の第５の態様または以下の実施例にも例示的に記載されている。養子細胞療法の例は、例えば、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ Ｔ細胞）療法または腫瘍浸潤リンパ球（tumor-infiltrating lymphocyte：ＴＩＬ）療法である。ドナー由来のＮＫ細胞、Ｔ細胞、またはマクロファージなどの免疫細胞を使用する養子細胞療法は、ある種のがんおよびいくつかの感染症の治療にも使用されることがある。したがって、養子細胞療法では、自家細胞、同種細胞、または異種細胞を使用してもよい。

【0183】

「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」または「移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用される場合、レシピエントの身体における欠損、損傷または機能不全の臓器、組織または細胞を置き換えるための、ドナーの身体からレシピエントの身体への臓器、組織または細胞の何らかの除去を意味する。

【0184】

第７の態様では、本発明は、
（ｉ）哺乳動物細胞への目的の１つ以上のタンパク質および／もしくはＲＮＡをコードする少なくとも１つのペイロード核酸の送達、
（ｉｉ）哺乳動物細胞を安定して形質導入する、ならびに／または
（ｉｉｉ）免疫細胞の事前活性化を行わずに哺乳動物免疫細胞を形質導入するための、
少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖ糖タンパク質、ＫｏＲＶ Ｅｎｖ糖タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、または本発明の第４の態様の哺乳動物パッケージング細胞株、または本発明の第１の態様による発現ベクターもしくは発現カセット、または本発明の第１もしくは第３の態様によるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子、または本発明の第２の態様の核酸のインビトロでの使用に関する。

【0185】

例えば、本方法は、目的の少なくとも１つの異種配列を安定して組み込むことによって、目的の哺乳動物細胞を改変し、遺伝子操作するために使用することができる。このようにして得られた形質導入された哺乳動物細胞は、スクリーニング目的などの研究目的に使用されてもよい。あるいは、このようにして得られた形質導入された哺乳動物細胞、上述のように、治療または診断目的、例えば養子細胞療法または移植に使用されてもよい。形質導入された哺乳動物細胞は、育成され、それによって増幅され、任意選択的に、更に使用するまで保存されてもよい。

【0186】

少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖ糖タンパク質、またはＫｏＲＶ Ｅｎｖ糖タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、または本発明の第４の態様の哺乳動物パッケージング細胞株、または本発明の第１の態様による発現ベクターもしくは発現カセット、または本発明の第１もしくは第３の態様によるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子、または本発明の第２の態様による核酸について上で指定した全ての特徴は、本発明の第７の態様におけるインビトロ使用にも関連すると考えられる。

【0187】

少なくとも１つのＫｏＲＶ Ｅｎｖ糖タンパク質、ＫｏＲＶ Ｅｎｖ糖タンパク質をコードする少なくとも１つの核酸、または本発明の第４の態様の哺乳動物パッケージング細胞株、または本発明の第１の態様による発現ベクターもしくは発現カセット、または本発明の第１もしくは第３の態様によるシュードタイピングされたウイルスベクター粒子、または本発明の第２の態様の核酸のインビトロでの使用は、
（ｉ）哺乳動物細胞への目的の１つ以上のタンパク質および／もしくはＲＮＡをコードする少なくとも１つのペイロード核酸の送達、
（ｉｉ）哺乳動物細胞を安定して形質導入する、ならびに／または
（ｉｉｉ）免疫細胞の事前活性化を行わずに哺乳動物免疫細胞を形質導入するためのものであってもよい。

【0188】

第５の態様における哺乳動物細胞への目的の１つ以上のタンパク質および／またはＲＮＡをコードする少なくとも１つのペイロード核酸の送達について上で指定した全ての特徴は、本発明の第７の態様におけるインビトロ使用にも関連すると考えられる。

【0189】

更に、少なくとも５、１０、１５、２０または３０回の細胞分裂サイクルのために、少なくとも１つのペイロード核酸が哺乳動物細胞のゲノム中で維持される場合、哺乳動物細胞の形質導入は、安定して形質導入されたと考えられ得る。

【0190】

好ましくは、このような安定した形質導入は、免疫細胞を事前活性化することなく達成される。以上説明したように、驚くべきことに、ＫｏＲＶ Ｅｎｖ糖タンパク質をコードする核酸を用いてヒトＮＫ細胞を効率よく形質導入することが可能であることが見出された。したがって、好ましい実施形態では、免疫細胞は、事前に活性化されることなく形質導入される。この文脈では、第５の態様の方法に適用され得る免疫細胞の事前活性化について上で指定した全ての特徴は、本発明の第７の態様におけるインビトロ使用にも関連すると考えられる。

【0191】

この文脈では、本発明の第１、第２または第３の態様について上で指定した全ての特徴は、適用可能な場合、本発明の第４、第５、第６または第７の態様、例えば、発現ベクター、発現カセット、シュードタイピングされたウイルスベクター粒子、ＫｏＲＶ Ｅｎｖまたは核酸に関連する特徴にも適用される。

【0192】

一般に、本開示は、様々に変動し得るため、本明細書に記載された特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されない。更に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでない場合を除き、複数形の参照物を含む。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「包含する（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ）」という単語は、排他的ではなく包括的に解釈される。

【0193】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語ならびに任意の略語は、本開示の分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料は、本明細書に提示された実施において使用することができるが、具体的な方法および材料は本明細書に記載されている。

【0194】

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語ならびに任意の略語は、本開示の分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料は、本明細書に提示された実施において使用することができるが、具体的な方法および材料は本明細書に記載されている。

【実施例】

【0195】

一般的な方法
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＫｏＲＶシュードウイルス生成、およびＮＫ細胞の形質導入
ウイルスベクター粒子は、２９３Ｔ細胞におけるいわゆる第２世代または第３世代のウイルスベクター系によって生成される。ウイルスパッケージングエレメントを含有するベクター、および導入遺伝子を含有する導入プラスミド、ならびにＫｏＲＶＡまたはＫｏＲＶＢの改変されたエンベロープタンパク質のいずれかを含有する、ここに記載される新しく開発された配列を、トランスフェクションに使用する（図２）。両方のベクター（ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢ）の混合物も、首尾良く使用することができる。

【0196】

詳細には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、トランスフェクションの２４～４８時間前に播種し、トランスフェクション当日に５０～７０％のコンフルエンス密度に達するようにして、ＤＭＥＭ培地＋１０％のＦＣＳ＋１％のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐ中で成長させた。トランスフェクションの当日に、ペイロード核酸（ここでは、目的の遺伝子（gene of interest：ＧＯＩ）と称される）、およびウイルスパッケージング機構をコードするプラスミドを比５：４：１：１（ＧＯＩ：ｇａｇ／ｐｏｌ：ｒｅｖ：ＫｏＲＶ）で含有するレンチウイルスベクターを用いて、ＤＮＡ混合物を調製した。例えば、１００ｍｍの組織培養皿において１０ｍＬのウイルス上清を生成するために、これらのベクターは、５μｇのＥＦ１ａ－ｍＶｅｎｕｓ－Ｈ２Ｂ－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ：４μｇのｐＭＤＬｇ－ｐＲＲＥ－ｇａｇ／ｐｏｌ：１μｇのｐＲＳＶ－Ｒｅｖ：１ μｇのＫｏＲＶＡ＿ｐＴｗｉｓｔ＿ＣＭＶ＿ＢｅｔａＧｌｏｂｉｎ＿ＷＰＲＥ＿ＮｅｏまたはＫｏＲＶＢ＿ｐＴｗｉｓｔ＿ＣＭＶ＿ＢｅｔａＧｌｏｂｉｎ＿ＷＰＲＥ＿Ｎｅｏ、または類似のものであってもよい。ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢを同時に使用した場合には、これらを１：１の比で混合した。プラスミド混合物を無血清培地に添加し、混合し、次いで、適切なトランスフェクション試薬、例えば、ＴｒａｎｓＩＴ ＶｉｒｕｓＧｅｎ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を添加した。静かにピペッティングして混合し、室温で１５分間インキュベートした。この混合物を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を含有する細胞培養皿の異なる領域に滴下して加えた。培養容器を前後左右に優しくゆすり、複合体化したＤＮＡを均一に分散させた。３７℃、５％ＣＯ２で１２～１８時間インキュベートし、成長培地を交換し、更に４８～６０時間インキュベートした。ウイルスを含有する上清を新しいチューブに集め、１０分間、３００×ｇ、４℃で遠心分離し、細胞および細胞残屑を除去し、新しい滅菌容器に移した。上清は、すぐに使用するか、後で使用するために－８０℃で凍結させた。

【0197】

ＮＫ細胞は、ＮＫ ＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で、１ｍＬ当たり５００万個で調製した。例えば、４８ウェルプレートに１２５０００個のＮＫ細胞を使用し、そこで、これを１回の形質導入当たり２５μＬで再懸濁させ、十分に混合した。４８ウェルプレートに、各々の形質導入のために、ウェル当たり２５０μＬのウイルス上清をピペッティングした。１：１００のＶｅｃｔｏｆｕｓｉｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）形質導入エンハンサーを上清に加え、次いで、２５μＬのＮＫ細胞懸濁液を各ウェルに加えた。４００×ｇ、３７℃で６０分間、スピンフェクションを行った。２５０μＬのＮＫ ＭＡＣＳ培地を加え、３７℃のインキュベーター内に約３日間置き、次いで、フローサイトメトリーを用いて導入遺伝子の発現を分析した。

【0198】

他の哺乳動物免疫細胞を、同様の方法で形質導入することができる。

【0199】

実験に使用したレンチウイルスベクターＥＦ１ａ－ｍＶｅｎｕｓ－Ｈ２Ｂ－ＩＲＥＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏは、２つのヒトプロモーターを含み、それぞれ２つの蛍光マーカーと１つの選択マーカーをコードする３つのペイロード核酸をコードする。

【0200】

ＫｏＲＶ Ｅｎｖ配列
ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢ Ｅｎｖは、コアラレトロウイルスの２つのＥｎｖバリアントであり、ＮＫ細胞への首尾良くかつ効率的な遺伝子導入を可能にするウイルス表面構造として、首尾良く特定された。加えて、ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢ Ｅｎｖは、機能増強のために首尾良く更に改変された。この目的のために、Ｃ末端Ｒペプチドが除去された。これは、ウイルスベクター粒子と標的細胞との融合活性を可能にするために、同様のウイルスでは通常、ウイルスの寿命の間にタンパク質分解によって切断される（ドメイン構造ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢ Ｅｎｖを示す図１を参照されたい）。本明細書の実施例では、Ｃ末端Ｒペプチドが除去されるＫｏＲＶＡ Ｅｎｖをコードする配列（配列番号２）および／またはＣ末端Ｒペプチドが除去されるＫｏＲＶＢ Ｅｎｖをコードする配列（配列番号４）を使用した。ＫｏＲＶＡ ＥｎｖおよびＫｏＲＶＢ Ｅｎｖの組み合わせ（本明細書ではＫｏＲＶＡＢと称される）を使用する場合、配列番号２および配列番号４の配列が、別個のベクターに含まれ、トランスフェクトされた。しかし、ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖ配列およびＫｏＲＶＢ Ｅｎｖ配列を含む単一のベクターを使用することも可能である。配列番号２および６の配列は、Ｎ末端シグナルペプチドを含む。本発明で生成されたシュードタイピングされたウイルスベクター粒子では、ＫｏＲＶＡ ＥｎｖおよびＫｏＲＶＢ Ｅｎｖからそれぞれシグナルペプチドが除去される。生成されたシュードタイピングされたウイルスベクター粒子は、成熟ＫｏＲＶＡ ＥｎｖまたはＫｏＲＶＢ Ｅｎｖを含み、更に、Ｃ末端Ｒペプチドが除去される。

【0201】

ＢａＥＶ配列
本明細書では、比較のためにＢａＥＶ Ｅｎｖ配列を使用した。ＢａＥＶ Ｅｎｖの配列を、非特許文献１によって以前に公開されたように使用した。このＢａＥＶエンベロープは、活性化されたＮＫ細胞を形質導入するために以前の刊行物でも使用された（非特許文献２、および非特許文献３。特許文献１および特許文献２も参照されたい）。本明細書で比較のために用いたＢａＥＶ Ｅｎｖ配列も、Ｃ末端Ｒペプチドを欠く。

【0202】

［実施例１］末梢血ＮＫ細胞におけるＫｏＲＶＡ、ＫｏＲＶＢ、ＫｏＲＶＡＢおよびＢａＥＶによりエンベロープ化されたシュードウイルスの形質導入効率の比較
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＫｏＲＶシュードウイルス生成、およびＮＫ細胞の形質導入を、上に記載したように行った。各々のエンベロープタンパク質（ＫｏＲＶＡ、ＫｏＲＶＢ、それらの混合物およびＢａＥＶ）の場合、３名の異なるドナーについて、形質導入効率を調べた。

【0203】

詳細には、単離されたＮＫ細胞を、単離当日に、あるいは５００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２および１４０Ｕ／ｍＬのＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を含有するＮＫ ＭＡＣＳ培地（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）中で活性化してから３日後、７日後および２１日後に、ＫｏＲＶまたはＢａＥＶでシュードタイピングされたレンチウイルスベクター粒子により形質導入した。形質導入の７２時間後に、蛍光性タンパク質ｍＶｅｎｕｓのフローサイトメトリー分析によって、形質導入効率を決定した。

【0204】

エンベロープタンパク質ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢ、ならびにＫｏＲＶＡＢと称されるそれらの組み合わせは、目的の導入遺伝子（すなわち、ペイロード核酸）を含有するシュードタイピングされたウイルスベクター粒子の効率的な生成を可能にし、したがって、形質導入に適していることが見出された。更に、驚くべきことに、ＮＫ細胞の形質導入が、非常に効率的であり、ＮＫ細胞の単離日にＢａＥＶを含む既に記載されているウイルスエンベロープを含め、すなわち、以前に活性化されなかったＮＫ細胞に対して、以前に記載されたウイルスエンベロープよりも更に優れていることが見出された。特に、ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢの組み合わせは、単離当日の活性化されていないＮＫ細胞の形質導入において優れていることがわかった（図３）。したがって、ＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢ Ｅｎｖは、活性化されなかったＮＫ細胞に対して、ＮＫ細胞の優れた形質導入が見出された。

【0205】

［実施例２］新鮮な初代ＮＫ細胞におけるＫｏＲＶＡ、ＫｏＲＶＢ、ＫｏＲＶＡＢおよびＢａＥＶによりエンベロープ化されたシュードウイルスの形質導入効率の比較
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＫｏＲＶシュードウイルス生成、およびＮＫ細胞の形質導入を、上に記載したように行った。各々のエンベロープタンパク質（ＫｏＲＶＡ、ＫｏＲＶＢ、それらの混合物およびＢａＥＶ）の場合、３名の異なるドナーについて、形質導入効率を調べた。

【0206】

詳細には、末梢血から単離されたＮＫ細胞を、単離当日に、ＫｏＲＶまたはＢａＥＶでシュードタイピングされたレンチウイルスベクター粒子により形質導入した。形質導入の７２時間後に、蛍光性タンパク質ｍＶｅｎｕｓのフローサイトメトリー分析によって、形質導入効率を決定した。３名のドナーにわたって平均された導入効率および標準偏差がプロットされている。統計分析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて行った。＊＝ｐ＜０．０５。

【0207】

実施例１の結果と同様に、実施例２のデータは、ＫｏＲＶＡ、ＫｏＲＶＢ、またはＫｏＲＶＡＢによりエンベロープ化されたレンチウイルスベクター粒子の各々の新鮮な初代ＮＫ細胞における形質導入効率が、ＢａＥＶシュードタイピングされたレンチウイルスベクター粒子と比較して優れていることを確認するものである。その後の形質導入のためにシュードタイピングされたレンチウイルスベクター粒子を調製するためのＫｏＲＶＡおよびＫｏＲＶＢの混合物は、更に、ＢａＥＶ Ｅｎｖによりシュードタイピングされたレンチウイルスベクター粒子と比較して、形質導入効率がほぼ倍増した。ＫｏＲＶＡ Ｅｎｖによりシュードタイピングされたレンチウイルスベクター粒子を用いて、同様の有利な結果が得られた。

【0208】

［実施例３］ＫｏＲＶ－ＡまたはＫｏＲＶ－Ｂによりエンベロープ化されたレンチウイルスによる末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の形質導入
６名の健康なドナーの末梢血からＰＢＭＣを単離し、直ちに形質導入した（免疫細胞の集団を分離することなく）。蛍光性レポーター遺伝子ｍＶｅｎｕｓを使用して、形質導入から３日後に、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、ＣＤ１４＋単球、ＣＤ５６＋／ＣＤ３－ ＮＫ細胞およびＣＤ３＋ Ｔ細胞において形質導入効率を決定した。

【0209】

ＫｏＲＶＡおよび／またはＫｏＲＶＢによりエンベロープ化されたレンチウイルスを使用して、全ての細胞型を改変することができることが見出された。特に、単球およびＢ細胞は、ＮＫ細胞およびＴ細胞よりも、ＫｏＲＶＡまたはＫｏＲＶＢ媒介性の遺伝子導入がより起こりやすいことが見出された。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0210】

【特許文献1】ＷＯ２０１３／０４５６３９

【特許文献2】ＷＯ２０１９／１２１９４５

【特許文献3】ＷＯ２０２１／０４１３２２

【特許文献4】ＷＯ２０２１／１２７０７６

【非特許文献】

【0211】

【非特許文献1】Girard-Gagnepain A. et al. (“Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs”), Blood (2014) 124 (8): 1221-1231; doi: 10.1182/blood-2014-02-558163.

【非特許文献2】Bari R. et al. (“A Distinct Subset of Highly Proliferative and Lentiviral Vector (LV)-Transducible NK Cells Define a Readily Engineered Subset for Adoptive Cellular Therapy”), Frontiers in Immunology, 2019, 10:2001. doi: 10.3389/fimmu.2019.02001. Erratum in: Front Immunol. 2019 Dec 04;10:2784.

【非特許文献3】Colamartino A.B.L. et al., (“Efficient and Robust NK-Cell Transduction With Baboon Envelope Pseudotyped Lentivector”), Frontiers in Immunology, 2019, 10:2873. doi: 10.3389/fimmu.2019.02873.

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

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【国際調査報告】