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▶ ユーシービー ビオファルマ ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-01
(54)【発明の名称】進行性慢性間質性肺疾患の治療方法
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20241025BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241025BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20241025BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241025BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20241025BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20241025BHJP
C12Q 1/686 20180101ALN20241025BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALN20241025BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALN20241025BHJP
C12Q 1/6837 20180101ALN20241025BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
A61K39/395 N
A61P11/00
A61P43/00 105
A61P31/14
C12P21/08
C12Q1/686 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6851 Z
C12Q1/6837 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024529180
(86)(22)【出願日】2022-11-17
(85)【翻訳文提出日】2024-07-11
(86)【国際出願番号】 EP2022082299
(87)【国際公開番号】W WO2023089042
(87)【国際公開日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】63/264,276
(32)【優先日】2021-11-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524150476
【氏名又は名称】ユーシービー ビオファルマ ソシエタ ア レスポンサビリタ リミタータ
【氏名又は名称原語表記】ＵＣＢ ＢＩＯＰＨＡＲＭＡ ＳＲＬ
(74)【代理人】
【識別番号】100123788
【弁理士】
【氏名又は名称】宮崎 昭夫
(74)【代理人】
【識別番号】100127454
【弁理士】
【氏名又は名称】緒方 雅昭
(72)【発明者】
【氏名】ジョンソン、 ティモシー スコット
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムス、 イアン トロロペ
(72)【発明者】
【氏名】シム、 パトリシア ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】タッチャー、 トーマス ヘンリー
【テーマコード（参考）】
4B063
4B064
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ53
4B063QR55
4B063QR58
4B063QS32
4B063QS34
4B063QX02
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4C085AA14
4C085BB11
4C085BB31
4C085DD62
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA09
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）等の進行性慢性間質性肺疾患の治療に使用する、酵素のトランスアミダーゼ活性を阻害する抗トランスグルタミナーゼ２型抗体に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
進行性慢性間質性肺疾患を有する対象の治療又は進行性慢性間質性肺疾患の発症予防の使用のための抗トランスグルタミナーゼ２（抗ＴＧ２）抗体。
【請求項2】
前記肺疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、剥離性間質性肺炎（ＤＩＰ）、急性間質性肺炎（ＡＩＰ；或いはＨａｍｍａｎ－Ｒｉｃｈ症候群として知られる）、過敏性肺炎（ＨＳＰ）、非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、呼吸性細気管支炎関連間質性肺疾患（ＲＢ－ＩＬＤ）、特発性器質化肺炎（ＣＯＰ；或いは閉塞性気管支炎器質化肺炎（Ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ Ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）又はＢＯＯＰとも称される）、サルコイドーシス、石綿症及びリンパ性間質性肺炎（ＬＩＰ）からなる群から選択される、請求項１に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体。
【請求項3】
ＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を有する対象の治療又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した対象における肺線維症の発症予防の使用のための抗トランスグルタミナーゼ２（抗ＴＧ２）抗体。
【請求項4】
前記肺疾患又は肺線維症が、対象のサンプル中のマーカーの増加によって特徴付けられ、前記マーカーが、ＴＧ２活性、ＴＧ２をコードするｍＲＮＡ、ＴＧ２抗原、ＴＧ２の輸送の増強又はそれらの任意の組み合わせの群から選択される、前記請求項の何れか一項に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体。
【請求項5】
前記抗体は、トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）のコア領域内のエピトープに結合し、ＴＧ２活性を阻害し、前記コア領域は、ＴＧ２のアミノ酸１４３～４７３からなり、及び、阻害される前記ＴＧ２活性は、Ｎ－ε（γ－グルタミル）リジンのイソペプチド結合によるリジン及びグルタミンとのＴＧ２架橋である、前記請求項の何れか一項に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体。
【請求項6】
前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ａ．インタクトな抗体を含むか又はインタクトな抗体からなる、
ｂ．抗原結合フラグメントを含むか又は抗原結合フラグメントからなる、
前記請求項の何れか一項に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体。
【請求項7】
前記抗体が以下の配列を含む、前記請求項の何れか一項に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体：（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）。
【請求項8】
前記請求項の何れか一項に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体であって、該抗体は、以下を含む、抗ＴＧ２抗体：ａ）配列番号ＮＯ：１３から配列番号Ｎｏ．２７の何れか１つに定義される配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号ＮＯ．２８から配列番号Ｎｏ．４０の何れか１つに定義される配列を有する重鎖可変ドメイン、
ｂ）配列番号ＮＯ．１３から配列番号Ｎｏ．２７の何れか１つに定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは少なくとも９０％の同一性若しくは類似性又は好ましくは少なくとも９５％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号ＮＯ．２８から配列番号Ｎｏ．４０の何れか１つに定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは少なくとも９０％の同一性若しくは類似性又は好ましくは少なくとも９５％の同一性若しくは類似性を有する重鎖可変ドメイン。
【請求項9】
請求項１～６の何れか一項に記載の使用のための抗ＴＧ２抗体であって、前記抗体が、請求項７及び８の何れか一項に定義される抗体とＴＧ２への結合と競合する、抗ＴＧ２抗体。
【請求項10】
進行性慢性間質性肺疾患を有する対象を治療するための又は対象における進行性慢性間質性肺疾患の発症を予防するための方法であって、治療上有効な量の抗ＴＧ２抗体を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項11】
ＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を有する対象を治療するための又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した対象における肺線維症の発症を予防するための方法であって、前記方法が、治療上有効な量の抗ＴＧ２抗体を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項12】
進行性慢性間質性肺疾患を有する対象者の治療のための又は進行性慢性間質性肺疾患の発症予防のための医薬の製造のための抗トランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）抗体の使用。
【請求項13】
ＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を有する対象の治療のための又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した対象における肺線維症の発症予防のための医薬の製造のための、抗トランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野：
本発明は、特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）（ＩＰＦ）等の進行性慢性間質性肺疾患（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）の治療に使用する、酵素のトランスアミダーゼ活性を阻害する抗トランスグルタミナーゼ２型抗体に関する。
本発明は、特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）（ＩＰＦ）等の進行性慢性間質性肺疾患（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｌｕｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ）の治療に使用する、酵素のトランスアミダーゼ活性を阻害する抗トランスグルタミナーゼ２型抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
発明の背景：
組織トランスグルタミナーゼ（ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）又はトランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）は、イプシロン（ガンマ－グルタミル）リジンジペプチド結合を介してタンパク質間に架橋を形成する酵素である。ＴＧ２の高発現は、異常なタンパク質架橋を引き起こし、様々なタイプの組織瘢痕化、線維化、いくつかの脳疾患における神経原線維のもつれの形成、いくつかの癌における化学療法への抵抗性等、いくつかの病態に関連している。低分子、サイレンシングＲＮＡ又は抗体等の様々なＴＧ２阻害剤（例えば、非特許文献１、非特許文献２、特許文献１、特許文献２又は特許文献３）が、ＴＧ２が介在する疾病（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の可能性のある治療のために開示されている。
組織トランスグルタミナーゼ（ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）又はトランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）は、イプシロン（ガンマ－グルタミル）リジンジペプチド結合を介してタンパク質間に架橋を形成する酵素である。ＴＧ２の高発現は、異常なタンパク質架橋を引き起こし、様々なタイプの組織瘢痕化、線維化、いくつかの脳疾患における神経原線維のもつれの形成、いくつかの癌における化学療法への抵抗性等、いくつかの病態に関連している。低分子、サイレンシングＲＮＡ又は抗体等の様々なＴＧ２阻害剤（例えば、非特許文献１、非特許文献２、特許文献１、特許文献２又は特許文献３）が、ＴＧ２が介在する疾病（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）の可能性のある治療のために開示されている。
【0003】
進行性慢性間質性肺疾患には、特発性肺線維症（ＩＰＦ）があり、肺間質に瘢痕組織が沈着して肺胞膜が肥厚し、肺機能が進行性に低下し、最終的には死に至る。ＩＰＦと診断された後の全体的な予後は、病状が着実に進行し、最終的には死に至るため、一般的に不良である。
【0004】
ＴＧ２及びＬＯＸＬ２の増加は、特発性肺線維症等の進行性慢性間質性肺疾患と関連している（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。ＩＰＦ由来の線維芽細胞においてＴＧ２が過剰発現又は過剰活性化すると、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質間のイプシロン（ガンマ－グルタミル）リジン架橋が増加する。
ＴＧ２及びＬＯＸＬ２を、小さな阻害剤の使用又は線維症誘導中のヌルマウスの使用によって操作すると、ブレオマイシン処理動物（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ）における肺の炎症及び線維症が減少する（非特許文献３、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献５を参照されたい）。
例えば、線維芽細胞の接着及び増殖アッセイでは、ＴＧ２とシスタミン（汎ＴＧ阻害剤）の同時添加が、ＴＧ２に関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）接着の増加を阻害することが示されている（非特許文献５を参照されたい）。
線維化リモデリングにおけるＴＧ２架橋活性の主な役割は、ＥＣＭタンパク質にプロテアーゼ耐性の分子内架橋を組み込むことによって細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のターンオーバーを遅らせ、ＴＧＦβ１を局所的に活性化することにあるようであるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで肺線維芽細胞の接着を低下させるシスタミンの使用に代表されるように、肺細胞では、細胞接着におけるＴＧ２の非酵素的な役割は、トランスアミド化活性を阻害することによって調節されるかもしれないという新たな証拠もいくつか出てきている。
ＴＧ２及びＬＯＸＬ２を、小さな阻害剤の使用又は線維症誘導中のヌルマウスの使用によって操作すると、ブレオマイシン処理動物（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ－ｔｒｅａｔｅｄ ａｎｉｍａｌｓ）における肺の炎症及び線維症が減少する（非特許文献３、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献５を参照されたい）。
例えば、線維芽細胞の接着及び増殖アッセイでは、ＴＧ２とシスタミン（汎ＴＧ阻害剤）の同時添加が、ＴＧ２に関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）接着の増加を阻害することが示されている（非特許文献５を参照されたい）。
線維化リモデリングにおけるＴＧ２架橋活性の主な役割は、ＥＣＭタンパク質にプロテアーゼ耐性の分子内架橋を組み込むことによって細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のターンオーバーを遅らせ、ＴＧＦβ１を局所的に活性化することにあるようであるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで肺線維芽細胞の接着を低下させるシスタミンの使用に代表されるように、肺細胞では、細胞接着におけるＴＧ２の非酵素的な役割は、トランスアミド化活性を阻害することによって調節されるかもしれないという新たな証拠もいくつか出てきている。
【0005】
承認された２つの治療薬、ピルフェニドン（ｐｉｒｆｅｎｉｄｏｎｅ）（コラーゲン合成を含むＴＧＦβ１関連経路の調節を介して部分的に機能すると思われる）及びニンテダニブ（ｎｉｎｔｅｄａｎｉｂ）（複数のチロシンキナーゼを標的とする）は、一部の患者において疾患の進行を遅らせるのに有効であり、追加の治療選択肢が緊急に必要とされている（非特許文献９）。
しかしながら、ＩＰＦのような進行性慢性間質性肺疾患の治療及び予防における使用並びにＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を有する対象の治療における使用又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した患者における肺線維症の発症の予防における使用のための、さらなる有効な療法を同定する必要性が残っている。
しかしながら、ＩＰＦのような進行性慢性間質性肺疾患の治療及び予防における使用並びにＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を有する対象の治療における使用又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した患者における肺線維症の発症の予防における使用のための、さらなる有効な療法を同定する必要性が残っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２００６／１００６７９号
【特許文献2】国際公開第２０１２／１４６９０１号
【特許文献3】国際公開第２０１３／１７５２２９号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｓｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，２００７
【非特許文献2】Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０
【非特許文献3】Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０１１
【非特許文献4】Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、２０２０
【非特許文献5】Ｐｈｉｌｐ ｅｔ ａｌ．、２０１８
【非特許文献6】Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４
【非特許文献7】Ｒａｇｈｕ ２０１７
【非特許文献8】Ｖａｉｄｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１７
【非特許文献9】Ｍａｒｇａｒｉｔｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６
【発明の概要】
【0008】
発明の概要：
本発明の目的は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）等の進行性慢性間質性肺疾患の治療に使用するため又は特発性肺線維症（ＩＰＦ）等の進行性慢性間質性肺疾患の発症予防に使用するための特異的抗トランスグルタミナーゼ２（抗ＴＧ２）抗体を提供することである。或いは、本発明は、ＣＯＶＩＤ感染に関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）肺線維症（ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を有する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の治療又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した患者（ｐａｔｉｅｎｔ）における肺線維症の発症予防に使用するための特異的抗トランスグルタミナーゼ２（抗ＴＧ２）抗体を提供する。
本発明の目的は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）等の進行性慢性間質性肺疾患の治療に使用するため又は特発性肺線維症（ＩＰＦ）等の進行性慢性間質性肺疾患の発症予防に使用するための特異的抗トランスグルタミナーゼ２（抗ＴＧ２）抗体を提供することである。或いは、本発明は、ＣＯＶＩＤ感染に関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）肺線維症（ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）を有する対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の治療又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した患者（ｐａｔｉｅｎｔ）における肺線維症の発症予防に使用するための特異的抗トランスグルタミナーゼ２（抗ＴＧ２）抗体を提供する。
【0009】
第二の態様において、本発明は、進行性慢性間質性肺疾患を治療するための又はその発症を予防するための方法であって、治療上有効な量の抗ＴＧ２抗体を投与することを含む、方法を提供する。
或いは、本発明は、ＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を有する対象を治療するための又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した患者における肺線維症の発症を予防するための方法であって、治療上有効な量の抗ＴＧ２抗体を投与することを含む方法を提供する。
或いは、本発明は、ＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を有する対象を治療するための又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した患者における肺線維症の発症を予防するための方法であって、治療上有効な量の抗ＴＧ２抗体を投与することを含む方法を提供する。
【0010】
第三の態様において、本発明は、進行性慢性間質性肺疾患の治療のための又は特発性肺線維症（ＩＰＦ）等の進行性慢性間質性肺疾患の発症予防のための医薬の製造のための抗ＴＧ２抗体の使用に関する。
あるいは、本発明は、ＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を有する対象の治療又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した患者における肺線維症の発症の予防における医薬の製造のための抗ＴＧ２抗体の使用に関する。
あるいは、本発明は、ＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を有する対象の治療又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した患者における肺線維症の発症の予防における医薬の製造のための抗ＴＧ２抗体の使用に関する。
【0011】
定義：
本明細書全体は、統一された開示として関連付けられることを意図しており、本明細書に記載されている特徴の組み合わせは、例えその組み合わせが本明細書の同じ文又は段落又は節に一緒に記載されていなくても、すべて想定されていることを理解されたい。「ａ」又は「ａｎ」を用いて記載又は特許請求され得る本発明の態様に関して、文脈上より限定された意味が明確に要求されない限り、これらの用語は、「１つ又は複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味すると理解すべきである。「又は（ｏｒ）」という用語は、文脈上明確にそうでないことが要求されない限り、代替的な（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）又は一緒の（ｔｏｇｅｔｈｅｒ）項目を包含するものと理解されるべきである。本発明の態様がある特徴を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と記載されている場合、実施形態は、その特徴「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」又は「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とも考えられる。
本明細書全体は、統一された開示として関連付けられることを意図しており、本明細書に記載されている特徴の組み合わせは、例えその組み合わせが本明細書の同じ文又は段落又は節に一緒に記載されていなくても、すべて想定されていることを理解されたい。「ａ」又は「ａｎ」を用いて記載又は特許請求され得る本発明の態様に関して、文脈上より限定された意味が明確に要求されない限り、これらの用語は、「１つ又は複数（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」を意味すると理解すべきである。「又は（ｏｒ）」という用語は、文脈上明確にそうでないことが要求されない限り、代替的な（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）又は一緒の（ｔｏｇｅｔｈｅｒ）項目を包含するものと理解されるべきである。本発明の態様がある特徴を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と記載されている場合、実施形態は、その特徴「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」又は「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とも考えられる。
【0012】
－ 「組織トランスグルタミナーゼ（ｔｉｓｓｕｅ ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ）」、「トランスグルタミナーゼ２型（ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ ｔｙｐｅ ２）」又は「ＴＧ２」という用語は、イプシロン（ガンマ－グルタミル）リジンジペプチド結合を介してタンパク質間に架橋を形成する酵素を指す。
ＴＧ２は、典型的にはＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ２１９８０（配列番号ＮＯ．４１）に記載されているアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわちヒトＴＧ２を指す。
用語「ＴＧ２」はまた、（ａ）ＴＧ２の活性を保持する配列番号ＮＯ．４１のアミノ酸配列に対して、１つ若しくは複数のアミノ酸置換、修飾、欠失若しくは挿入を有する誘導体又は（ｂ）その変異体であるタンパク質、例えば変異体は、典型的には、配列番号ＮＯ．４１に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％の同一性（又は配列番号ＮＯ．４１に対して約９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性さえも）を保持するタンパク質を指しても良い。タンパク質ＴＧ２は遺伝子Ｔｇｍ２によってコードされている。
ＴＧ２は、典型的にはＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ２１９８０（配列番号ＮＯ．４１）に記載されているアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわちヒトＴＧ２を指す。
用語「ＴＧ２」はまた、（ａ）ＴＧ２の活性を保持する配列番号ＮＯ．４１のアミノ酸配列に対して、１つ若しくは複数のアミノ酸置換、修飾、欠失若しくは挿入を有する誘導体又は（ｂ）その変異体であるタンパク質、例えば変異体は、典型的には、配列番号ＮＯ．４１に対して、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％又は９５％の同一性（又は配列番号ＮＯ．４１に対して約９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性さえも）を保持するタンパク質を指しても良い。タンパク質ＴＧ２は遺伝子Ｔｇｍ２によってコードされている。
【0013】
－ 「抗ＴＧ２抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、ＴＧ２と結合し、そのトランスアミダーゼ活性を阻害して架橋を防ぐ抗体分子を意図している。このような抗体の例は、国際公開第２０１３／１７５２２９号に記載されている。限定はしないが、本発明に従って使用できる抗ＴＧ２抗体は、例えば、配列番号ＮＯ．２４で定義される軽鎖可変領域及び配列番号ＮＯ．３７で定義される重鎖可変領域を含む。
【0014】
－ 本明細書で使用する「抗体」という用語には、モノクロ－ナル抗体、ポリクロ－ナル抗体及び当技術分野で知られているような組換え技術によって生成される組換え抗体が含まれるが、これらに限定されるものではない。「抗体」には、あらゆる種の抗体、例えば、あらゆるアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）のヒト抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＤ及びＩｇＧＡ１、ＩｇＧＡ２又はＩｇＭのような５量体並びにそれらの修飾バリアントを含むこれらの基本構造の２量体として産生される抗体；非ヒト霊長類抗体、例えば、チンパンジ－、ヒヒ、アカゲザル又はシノモルガン猿由来の抗体；げっ歯類抗体、例えば、マウス又はラット由来の抗体；ウサギ又はヤギ又はウマ抗体；ラクダ類抗体（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）のようなラクダ又はラマ由来の抗体）及びその誘導体；ニワトリ抗体のような鳥類種の抗体；又はサメ抗体のような魚類種の抗体、が含まれる。「抗体」という用語は、少なくとも１つの重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第１部分（ｆｉｒｓｔ ｐｏｒｔｉｏｎ）が第１種（ｆｉｒｓｔ ｓｐｅｃｉｅｓ）由来で、前記重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第２部分（ｓｅｃｏｎｄ ｐｏｒｔｉｏｎ）が第２種（ｓｅｃｏｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ）由来である「キメラ」抗体も指す。本明細書で関心のあるキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザル等の旧世界サル）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）」抗体が含まれる。「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体由来の配列を含むキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域の残基を、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、非ヒト霊長類等の非ヒト種（ドナ－抗体）の超可変領域［又は相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）（ＣＤＲ）］の残基で置換したヒト抗体（レシピエント抗体）であり、所望の特異性、親和性及び活性を有する。ほとんどの場合、ＣＤＲの外側、すなわちフレ－ムワ－ク領域（ＦＲ）のヒト（レシピエント）抗体の残基は、対応する非ヒト残基でさらに置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナ－抗体にもない残基を含むことがある。これらの修飾は、抗体の特性をさらに洗練させるために行われる。ヒト化によって、ヒト以外の抗体のヒトにおける免疫原性が低下するため、ヒトの疾患治療への抗体の応用が容易になる。ヒト化抗体とその生成技術は当技術分野でよく知られている。また、「抗体」という用語は、ヒト化の代替として生成できるヒト抗体も指す。例えば、内在性マウス抗体の産生がなくても、免疫によりヒト抗体の全レパ－トリ－を産生できるトランスジェニック動物（例えばマウス）を作製することは可能である。ヒト抗体／抗体フラグメントをインビトロで得るための他の方法は、ファ－ジディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）やリボソ－ムディスプレイ技術（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）等のディスプレイ技術に基づくもので、少なくとも部分的に人工的に生成された、あるいはドナ－の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパ－トリ－から生成された組み換えＤＮＡライブラリ－が使用される。ヒト抗体を生成するためのファ－ジ及びリボソ－ムディスプレイ技術は当技術分野でよく知られている。ヒト抗体はまた、目的の抗原でエクスビボ免疫した単離ヒトＢ細胞から生成することもでき、その後融合させてハイブリド－マを作製し、最適なヒト抗体をスクリ－ニングすることができる。「抗体」という用語は、グリコシル化抗体及びアグリコシル化抗体の両方を指す。さらに、本明細書で使用する「抗体」という用語は、完全長抗体だけでなく、抗体フラグメント、より詳細にはその抗原結合フラグメントも指す。抗体フラグメントは、当該技術分野で知られているように、少なくとも１つの重鎖又は軽鎖免疫グロブリンドメインを含み、１つ又は複数の抗原に結合する。本発明に係る抗体フラグメントの例には、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ、Ｆａｂ－ｄｓＦｖ、Ｆａｂ－Ｆｖ－Ｆｖ、ｓｃＦｖ及びＢｉｓ－ｓｃＦｖフラグメントが含まれる。前記フラグメントは、ダイアボディ、トライボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ｓｄＡｂ、ＶＬ、ＶＨ、ＶＨＨ又はラクダ科抗体（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｙ（登録商標）のようなラクダ又はラマ由来）のようなシングルドメイン抗体（ｄＡｂ）及びＶＮＡＲフラグメントであることもできる。本発明に係る抗原結合フラグメントはまた、１つ又は２つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖに連結されたＦａｂを含むことができ、各ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、同一又は異なる標的（例えば、治療標的を結合する１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖと、例えばアルブミンを結合することによって半減期を増加させる１つのｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖ）を結合する。このような抗体フラグメントの例としては、ＦａｂｄｓｓｃＦｖ（ＢＹｂｅ（登録商標）とも呼ばれる）又はＦａｂ－（ｄｓｓｃＦｖ）２（ＴｒＹｂｅ（登録商標）とも呼ばれ、例えば国際公開第２０１５／１９７７７２号を参照）が挙げられる。上記で定義した抗体分子は、その抗原結合フラグメントを含め、当技術分野で知られている。
【0015】
－ 用語「エピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、抗体が結合する抗原の領域を指す。エピトープには、構造的に定義されるものと機能的に定義されるものがある。機能性エピトープは、一般に構造性エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接寄与する残基を有する。エピトープはまた、コンフォメーション、すなわち非直線アミノ酸からなることもある。ある実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基又はスルホニル基等の分子の化学的に活性な表面基である決定基を含み得、及び、ある実施形態において、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有し得る。
【0016】
－ 疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｔｅ）の「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語には、（ｉ）疾患状態を抑制すること、すなわち疾患状態又はその臨床症状の発症を阻止すること、又は（ｉｉ）疾患状態を緩和すること、すなわち疾患状態又はその臨床症状を一時的又は永続的な退行を引き起こすことが含まれる。
【0017】
－ 疾患状態の「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」又は「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語には、疾患状態に曝露され得るか又は罹りやすいが、まだ疾患状態の症状を経験していない又は示していない対象において、疾患状態の臨床症状が発現しないようにすることが含まれる。
【0018】
発明の詳細な説明：
本発明は、ＩＰＦ患者の肺組織において、総ＴＧ２ｍＲＮＡ及び総ＴＧ２タンパク質が増加しているという本発明者の発見に基づく。ＴＧ２は、肺機能低下と相関するコラーゲンレベルの上昇と関連している。また、ＴＧ２を欠損させたマウス（ノックアウト又はＫＯマウスと呼ばれる）は、ブレオマイシン（肺線維症を引き起こす薬剤で、肺線維症の動物モデルに広く用いられている）での誘発（ｐｒｏｖｏｃａｔｉｏｎ）後、間質性肺線維症の発症から保護され、その後肺機能が低下することも発見された。その後、本発明者らは、驚くべきことに、抗ＴＧ２抗体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ヒトＩＰＦ初代細胞によるＥＣＭ沈着を減弱させるだけでなく、抗ＴＧ２抗体（ＴＧ２の細胞外タンパク質架橋活性を阻害する）を予防的に投与すると、ｉｎ ｖｉｖｏ（ウサギ肺珪肺症モデルにおける）における肺線維症を有意に減弱させ、線維症開始２８日後から投与すると線維症のさらなる進行を阻止することを実証することができた。さらに本発明者らは、驚くべきことに、ＣＯＶＩＤ－１９感染（ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２ウイルスにより引き起こされた）で死亡した患者の死後肺サンプルでＴＧ２がアップレギュレートされ、広範なマトリックス沈着の証拠があることを示した。
本発明は、ＩＰＦ患者の肺組織において、総ＴＧ２ｍＲＮＡ及び総ＴＧ２タンパク質が増加しているという本発明者の発見に基づく。ＴＧ２は、肺機能低下と相関するコラーゲンレベルの上昇と関連している。また、ＴＧ２を欠損させたマウス（ノックアウト又はＫＯマウスと呼ばれる）は、ブレオマイシン（肺線維症を引き起こす薬剤で、肺線維症の動物モデルに広く用いられている）での誘発（ｐｒｏｖｏｃａｔｉｏｎ）後、間質性肺線維症の発症から保護され、その後肺機能が低下することも発見された。その後、本発明者らは、驚くべきことに、抗ＴＧ２抗体が、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ヒトＩＰＦ初代細胞によるＥＣＭ沈着を減弱させるだけでなく、抗ＴＧ２抗体（ＴＧ２の細胞外タンパク質架橋活性を阻害する）を予防的に投与すると、ｉｎ ｖｉｖｏ（ウサギ肺珪肺症モデルにおける）における肺線維症を有意に減弱させ、線維症開始２８日後から投与すると線維症のさらなる進行を阻止することを実証することができた。さらに本発明者らは、驚くべきことに、ＣＯＶＩＤ－１９感染（ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２ウイルスにより引き起こされた）で死亡した患者の死後肺サンプルでＴＧ２がアップレギュレートされ、広範なマトリックス沈着の証拠があることを示した。
【0019】
本発明の主な目的は、進行性慢性間質性肺疾患の治療又は進行性慢性間質性肺疾患の発症予防に使用するための抗トランスグルタミナーゼ２（抗ＴＧ２）抗体である。例えば、本発明に係る使用するための抗ＴＧ２抗体は、以下の配列を含むことができる：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
【0020】
本発明はまた、進行性慢性間質性肺疾患の治療のための又は発症予防のための方法であって、治療上有効な量の抗トランスグルタミナーゼ２（抗ＴＧ２）抗体を投与することを含む、方法を提供する。例えば、このような方法で投与することができる前記抗ＴＧ２は、以下の配列を含む：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
【0021】
また、進行性慢性間質性肺疾患の治療のための医薬の製造のための又は進行性慢性間質性肺疾患の発症予防のための抗トランスグルタミナーゼ２（抗ＴＧ２）抗体の使用も記載されている。例えば、本発明に係る使用するための抗ＴＧ２は、以下の配列を含むことができる：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
【0022】
本発明の別の目的は、ＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を有する対象の治療又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した対象における肺線維症の発症予防に使用するための抗トランスグルタミナーゼ２（抗ＴＧ２）抗体である。例えば、本発明に係る使用するための抗ＴＧ２抗体は、以下の配列を含むことができる：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
【0023】
本発明はまた、ＣＯＶＩＤ感染に関連した肺線維症を有する患者を治療するための又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した患者における肺線維症の発症を予防するための方法であって、治療上有効な量の抗トランスグルタミナーゼ２（抗ＴＧ２）抗体を投与する工程を含む、方法を提供する。例えば、このような方法で投与することができる抗ＴＧ２は、以下の配列を含むことができる：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
【0024】
また、ＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を有する対象の治療又はＣＯＶＩＤ感染に罹患した対象における肺線維症の発症予防における医薬の製造のための抗トランスグルタミナーゼ２（抗ＴＧ２）抗体の使用も記載されている。例えば、本発明に係る使用するための抗ＴＧ２は、以下の配列を含むことができる：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、又は、
（ｉｖ）前記（ｉ）～（ｉｉｉ）の何れか１つに記載の抗体と競合する。
【0025】
本発明全体の文脈において、慢性進行性肺線維性疾患（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）は、対象のサンプル中のマーカーの増加によって特徴付けられ、マーカーは、例えば、ＴＧ２活性、ＴＧ２発現（例えばＴＧ２をコードするｍＲＮＡ又はＴＧ２抗原の増加）、ＴＧ２の輸送（ｅｘｐｏｒｔ）又はそれらの任意の組み合わせの何れか１つであり、対象のサンプルは、前記疾患に関連する細胞又は組織（例えば、肺細胞又は肺組織）である。前記マーカーの増加は、前記疾患に関連する細胞／組織において、任意の手段により決定することができる。ある対象のサンプルにおけるマーカーの増加は、典型的には、対象のサンプルにおける前記マーカーのレベルを、同じ組織型の正常細胞における同じマーカーのレベル（すなわち、基底レベル（ｂａｓａｌ ｌｅｖｅｌ）；例えば、基底ＴＧ２活性、基底発現レベル（ｍＲＮＡレベル及び／又はタンパク質レベル）及び／又はＴＧ２輸送の基底レベル）と比較することによって決定される。少なくとも１つのマーカーのレベルが、当該マーカーの基底レベルと比較して、１０％と同一若しくはそれ以上、１５％と同一若しくはそれ以上、２０％と同一若しくはそれ以上、２５％と同一若しくはそれ以上又はさらには３０％と同一若しくはそれ以上である対象のサンプルは、当該マーカーの増加を示すとみなされる。例えば、患者の肺細胞におけるＴＧ２ｍＲＮＡの量を決定すること（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）により、ＴＧ２発現の増加（或いは、ＴＧ２過剰発現とも呼ばれる）を決定する（ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）ことができる。慢性進行性肺線維化細胞／組織は、例えば、対象の肺細胞におけるＴＧ２ｍＲＮＡの量（過剰発現を表す）が、同じ組織型の正常細胞と比較して増加することによって特徴づけられる。ＴＧ２ｍＲＮＡの発現は、基底レベルと比較して、１０％と同一若しくはそれ以上、１５％と同一若しくはそれ以上、２０％若しくがそれ以上、２５％と同一若しくはそれ以上又はさらには３０％と同一若しくはそれ以上等、任意の量だけ増加させることができる。ｍＲＮＡの量は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ－ＰＣＲ）、リアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲ、ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ ａｓｓａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、ノーザンブロッティング若しくはマイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）の使用による、ＲＮＡ配列決定、各種ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ）等、既知の方法を用いて測定することができる。あるいは、患者の肺細胞におけるＴＧ２抗原の量を決定することによって、過剰発現を決定することもできる。従って、慢性進行性肺線維化細胞は、例えば、対象の肺細胞において、同じ組織型の正常細胞と比較等して、ＴＧ２タンパク質（又はＴＧ２抗原）の量が増加する（過剰発現を示す）ことによって特徴付けられる。ＴＧ２タンパク質の発現は、基底レベルと比較して、１０％と同一若しくはそれ以上、１５％と同一若しくはそれ以上、２０％と同一若しくはそれ以上、２５％と同一若しくはそれ以上又はさらには３０％と同一若しくはそれ以上等、任意の量だけ増加させることができる。タンパク質の量は、本発明の抗ＴＧ２抗体の使用を含め、免疫組織化学、ウェスタンブロッティング、質量分析又は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）等の公知の方法を使用して測定することができる。発現を決定するための閾値は、使用する技術によって異なる場合があり、免疫組織化学のスコアに対して検証される場合がある。あるいは、慢性進行性肺線維化細胞は、対象の肺細胞において、同じ組織型の正常細胞と比較してＴＧ２活性が上昇することによって特徴づけられる。ＴＧ２活性は、基底レベルと比較して、１０％と同一若しくはそれ以上、１５％と同一若しくはそれ以上、２０％と同一若しくはそれ以上、２５％と同一若しくはそれ以上又はさらには３０％と同一若しくはそれ以上等、任意の量だけ増加させることができる。ＴＧ２活性は、凍結生検（ＴＧ－ＩＳＡ）、呼気凝縮液（ＥＢＣ）又は気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）等を介して、既知の方法を用いて測定することができる。
【0026】
使用のための抗ＴＧ２抗体、治療もしくは予防のための方法、又は、本発明に係る抗ＴＧ２の、例えば、対象における進行性慢性間質性肺疾患の治療若しくは予防のための又はＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症の治療／予防のための、使用は、
従って、（ａ）対象からのサンプル（例えば肺細胞）におけるＴＧ２発現、ＴＧ２活性又はＴＧ２輸送を測定する工程、（ｂ）（ａ）から得られた測定結果を、正常な細胞／組織（肺細胞など）における対応する測定結果と比較する工程、及び（ｃ）発現の増加（すなわち、ＴＧ２の過剰発現）、活性の増加又は輸送の増加が観察された場合、患者に抗ＴＧ２抗体を投与し、これにより、進行性慢性間質性肺疾患又はＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を治療又は予防する工程を含むことができる。
工程（ａ）で測定されるＴＧ２発現量は、ｍＲＮＡでもタンパク質量でもよく、その増加は、上述したような発現の増加であれば何でもよい。正常細胞／組織における対応する測定値を、比較を行うたびに得る必要はない。前記対応する測定値は、比較が行われる前であればいつでも得ることができ、正常細胞／組織における平均ＴＧ２発現量又はＴＧ２活性とすることができる。
従って、（ａ）対象からのサンプル（例えば肺細胞）におけるＴＧ２発現、ＴＧ２活性又はＴＧ２輸送を測定する工程、（ｂ）（ａ）から得られた測定結果を、正常な細胞／組織（肺細胞など）における対応する測定結果と比較する工程、及び（ｃ）発現の増加（すなわち、ＴＧ２の過剰発現）、活性の増加又は輸送の増加が観察された場合、患者に抗ＴＧ２抗体を投与し、これにより、進行性慢性間質性肺疾患又はＣＯＶＩＤ感染に関連する肺線維症を治療又は予防する工程を含むことができる。
工程（ａ）で測定されるＴＧ２発現量は、ｍＲＮＡでもタンパク質量でもよく、その増加は、上述したような発現の増加であれば何でもよい。正常細胞／組織における対応する測定値を、比較を行うたびに得る必要はない。前記対応する測定値は、比較が行われる前であればいつでも得ることができ、正常細胞／組織における平均ＴＧ２発現量又はＴＧ２活性とすることができる。
【0027】
本発明全体の文脈において、進行性慢性間質性肺疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、剥離性間質性肺炎（ＤＩＰ）、急性間質性肺炎（ＡＩＰ；或いはＨａｍｍａｎ－Ｒｉｃｈ症候群として知られる）、過敏性肺炎（ＨＳＰ）、非特異的間質性肺炎（ＮＳＩＰ）、呼吸性細気管支炎関連間質性肺疾患（ＲＢ－ＩＬＤ）、特発性器質化肺炎（ＣＯＰ；或いは閉塞性気管支炎器質化肺炎（Ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ Ｏｂｌｉｔｅｒａｎｓ Ｏｒｇａｎｉｚｉｎｇ Ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）又はＢＯＯＰとも称される）、サルコイドーシス、石綿症及びリンパ性間質性肺炎（ＬＩＰ）からなる群から選択される。
好ましくは、進行性慢性間質性肺疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）からなる群から選択される。
好ましくは、進行性慢性間質性肺疾患は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）からなる群から選択される。
【0028】
本発明全体の文脈において、抗ＴＧ２抗体は、好ましくは、トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）のコア領域内のエピトープに結合し、ＴＧ２活性を阻害し、ここで、前記コア領域は、ＴＧ２のアミノ酸１４３～４７３（例えば、配列番号Ｎｏ．４１）からなり、阻害されるＴＧ２活性が、Ｎ－ε（γ－グルタミル）リジンイソペプチド結合によるリジン及びグルタミンのＴＧ２架橋である。さらに好ましくは、抗体は、ＴＧ２のアミノ酸３０４～３２６（例えば、配列番号Ｎｏ．４１）を含む若しくはからなる領域又はこの領域の一部に結合する。前記抗体は、インタクトな（ｉｎｔａｃｔ）抗体を含むか又はからなる。
あるいは、Ｆｖフラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖフラグメント又はジスルフィド結合Ｆｖフラグメント）；Ｆａｂフラグメント；及びＦａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ）２フラグメント）、単一ドメイン抗体（又は本明細書で定義される又は当業者によって公知の任意の他のフラグメント）等の抗原結合フラグメント（しかし、これらに限定されない）を含むか又はからなることができる。
好ましくは、本発明全体に係る使用する抗ＴＧ２抗体は、
ａ）以下からなる群から選択される６個のＣＤＲを含む：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、
ｂ）配列番号ＮＯ：１３から配列番号Ｎｏ．２７の何れか１つに定義される配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号ＮＯ．２８から配列番号Ｎｏ．４０の何れか１つに定義される配列を有する重鎖可変ドメイン、を含む、
ｃ）配列番号ＮＯ．１３から配列番号Ｎｏ．２７の何れか１つに定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは少なくとも９０％の同一性若しくは類似性又は好ましくは少なくとも９５％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号ＮＯ．２８から配列番号Ｎｏ．４０の何れか１つに定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは少なくとも９０％の同一性若しくは類似性又は好ましくは少なくとも９５％の同一性若しくは類似性を有する重鎖可変ドメイン、を含む、
ｄ）ＴＧ２（例えば配列番号ＮＯ．４１）のアミノ酸３０４～３２６若しくはこの領域の一部を含む又はからなるエピトープと、上記ａ）、ｂ）又はｃ）で定義した抗体との結合を競合させる。
あるいは、Ｆｖフラグメント（例えば、一本鎖Ｆｖフラグメント又はジスルフィド結合Ｆｖフラグメント）；Ｆａｂフラグメント；及びＦａｂ様フラグメント（例えば、Ｆａｂ’フラグメント又はＦ（ａｂ）２フラグメント）、単一ドメイン抗体（又は本明細書で定義される又は当業者によって公知の任意の他のフラグメント）等の抗原結合フラグメント（しかし、これらに限定されない）を含むか又はからなることができる。
好ましくは、本発明全体に係る使用する抗ＴＧ２抗体は、
ａ）以下からなる群から選択される６個のＣＤＲを含む：
（ｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＶＮＲＬＶＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．２）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＴＨＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．４）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＴＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．６）；又は、
（ｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＬＴＮＲＬＭＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．７）；ＬＱＹＶＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．８）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．９）；ＴＩＳＳＧＧＲＳＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．５）；及び、ＬＩＳＰＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１０）；又は、
（ｉｉｉ）ＫＡＳＱＤＩＮＳＹＬＴ（ＬＣＤＲ１；配列番号ＮＯ．１）；ＲＴＮＲＬＦＤ（ＬＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．１１）；ＬＱＹＤＤＦＰＹＴ（ＬＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．３）；ＳＳＡＭＳ（ＨＣＤＲ１）；ＴＩＳＶＧＧＧＫＴＹＹＰＤＳＶＫＧ（ＨＣＤＲ２；配列番号ＮＯ．９）；及び、ＬＩＳＬＹ（ＨＣＤＲ３；配列番号ＮＯ．１２）、
ｂ）配列番号ＮＯ：１３から配列番号Ｎｏ．２７の何れか１つに定義される配列を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号ＮＯ．２８から配列番号Ｎｏ．４０の何れか１つに定義される配列を有する重鎖可変ドメイン、を含む、
ｃ）配列番号ＮＯ．１３から配列番号Ｎｏ．２７の何れか１つに定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは少なくとも９０％の同一性若しくは類似性又は好ましくは少なくとも９５％の同一性若しくは類似性を有する軽鎖可変ドメイン及び配列番号ＮＯ．２８から配列番号Ｎｏ．４０の何れか１つに定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性若しくは類似性、好ましくは少なくとも９０％の同一性若しくは類似性又は好ましくは少なくとも９５％の同一性若しくは類似性を有する重鎖可変ドメイン、を含む、
ｄ）ＴＧ２（例えば配列番号ＮＯ．４１）のアミノ酸３０４～３２６若しくはこの領域の一部を含む又はからなるエピトープと、上記ａ）、ｂ）又はｃ）で定義した抗体との結合を競合させる。
【0029】
【表A-1】
【0030】
【表A-2】
【0031】
【表A-3】
【0032】
ある抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するか又は他の抗体と結合を競合するかは、当該技術分野で知られている日常的な方法を用いて容易に決定することができる。例えば、試験抗体が本発明の参照抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、前記参照抗体を飽和条件下でタンパク質又はペプチドに結合させる。次に、試験抗体がタンパク質又はペプチドに結合する能力を評価する。前記参照抗体との飽和結合後、前記試験抗体がタンパク質又はペプチドに結合できる場合、前記試験抗体は前記参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論づけることができる。一方、前記試験抗体が前記参照抗体との飽和結合後にタンパク質又はペプチドに結合できない場合、試験抗体は本発明の参照抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。
抗体が参照抗体と結合競合するかどうかを決定するために、上述の結合方法論（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）は２つの方向で実施される。
第一の方向では、前記参照抗体を飽和条件下でタンパク質／ペプチドに結合させ、その後、前記試験抗体のタンパク質／ペプチド分子への結合を評価する。
第二の方向では、前記試験抗体を飽和条件下でタンパク質／ペプチドに結合させ、その後、前記参照抗体のタンパク質／ペプチドへの結合を評価する。
どちらの方向でも、第一抗体（飽和抗体）のみがタンパク質／ペプチドに結合できる場合、前記試験抗体及び前記参照抗体は、タンパク質／ペプチドへの結合で競合していると結論づけられる。当業者には理解されるように、参照抗体と結合を競合する抗体は、必ずしも前記参照抗体と同一のエピトープに結合するとは限らず、重複又は隣接するエピトープに結合することによって前記参照抗体の結合を立体的に阻害することがある。
抗体が参照抗体と結合競合するかどうかを決定するために、上述の結合方法論（ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ）は２つの方向で実施される。
第一の方向では、前記参照抗体を飽和条件下でタンパク質／ペプチドに結合させ、その後、前記試験抗体のタンパク質／ペプチド分子への結合を評価する。
第二の方向では、前記試験抗体を飽和条件下でタンパク質／ペプチドに結合させ、その後、前記参照抗体のタンパク質／ペプチドへの結合を評価する。
どちらの方向でも、第一抗体（飽和抗体）のみがタンパク質／ペプチドに結合できる場合、前記試験抗体及び前記参照抗体は、タンパク質／ペプチドへの結合で競合していると結論づけられる。当業者には理解されるように、参照抗体と結合を競合する抗体は、必ずしも前記参照抗体と同一のエピトープに結合するとは限らず、重複又は隣接するエピトープに結合することによって前記参照抗体の結合を立体的に阻害することがある。
【0033】
２つの抗体が同じ又は重複するエピトープに結合するのは、それぞれがもう一方の抗体の抗原への結合を競合的に阻害（ブロック）する場合である。すなわち、１倍、５倍、１０倍、２０倍又は１００倍過剰の一方の抗体は、競合結合アッセイで測定した場合、他方の抗体の結合を少なくとも５０％、７５％、９０％又はさらに９９％阻害する。
あるいは、抗原内の本質的にすべてのアミノ酸変異が、一方の抗体の結合を減少又は排除し、他方の抗体の結合も減少又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを持つ。
いくつかのアミノ酸変異が、一方の抗体の結合を減少又は排除し、他方の抗体の結合も減少又は排除する場合、２つの抗体は重複するエピトープを持つ。その後、追加のルーチン実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を実施し、前記試験抗体の結合の欠如が観察されると、実際に前記参照抗体と同じエピトープへの結合によるものなのか又は立体障害（又は別の現象）が、観察された結合の欠如の原因となっているのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー又は当技術分野で利用可能なその他の定量的若しくは定性的抗体結合アッセイを用いて実施することができる。
あるいは、抗原内の本質的にすべてのアミノ酸変異が、一方の抗体の結合を減少又は排除し、他方の抗体の結合も減少又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープを持つ。
いくつかのアミノ酸変異が、一方の抗体の結合を減少又は排除し、他方の抗体の結合も減少又は排除する場合、２つの抗体は重複するエピトープを持つ。その後、追加のルーチン実験（例えば、ペプチド変異及び結合解析）を実施し、前記試験抗体の結合の欠如が観察されると、実際に前記参照抗体と同じエピトープへの結合によるものなのか又は立体障害（又は別の現象）が、観察された結合の欠如の原因となっているのかを確認することができる。この種の実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー又は当技術分野で利用可能なその他の定量的若しくは定性的抗体結合アッセイを用いて実施することができる。
【0034】
どのような対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）であっても、本発明に従って治療することができる。対象は人間であることが望ましい。しかし、対象は他の哺乳類動物、例えばヒト以外の霊長類、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット又はハムスターであってもよい。あるいは、対象の代わりに患者（ｐａｔｉｅｎｔ）という用語を無作為に使うこともできる。
【0035】
本発明に係る任意の抗ＴＧ２抗体は、局所、鼻腔内、皮内、静脈内、皮下又は筋肉内等（ただし、これらに限定されない）、任意の方法で対象に投与するのに適した医薬組成物に組み込むことができる。典型的には、前記医薬組成物は、抗ＴＧ２抗体と、１つ若しくは複数の薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体とを含む。
したがって、本明細書には、特発性肺線維症（ＩＰＦ）等の進行性慢性間質性肺疾患の治療に使用するための医薬組成物も記載され、前記医薬組成物は、抗ＴＧ２抗体と、１つ若しくは複数の薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体とを含む。本発明に係る医薬組成物は、使用説明書及び任意で、それを必要とする個体への静脈内、皮下又は筋肉内投与のための装置を含む、使用説明書付きキットの一部とすることができる。
したがって、本明細書には、特発性肺線維症（ＩＰＦ）等の進行性慢性間質性肺疾患の治療に使用するための医薬組成物も記載され、前記医薬組成物は、抗ＴＧ２抗体と、１つ若しくは複数の薬学的に許容されるアジュバント及び／又は担体とを含む。本発明に係る医薬組成物は、使用説明書及び任意で、それを必要とする個体への静脈内、皮下又は筋肉内投与のための装置を含む、使用説明書付きキットの一部とすることができる。
【0036】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」には、生理学的に適合性であり、本明細書に記載される方法及び使用のための対象への投与に適する、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容される担体の例としては、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等の１つ若しくは複数及びそれらの組み合わせが挙げられる。
投与経路又は製剤の種類（液体、凍結乾燥又は噴霧乾燥製剤など）に応じて、等張化剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、又は、塩化ナトリウムなどを組成物に配合することができる。薬学的に許容される担体には、湿潤若しくは乳化剤、保存剤又は緩衝剤など、抗体又は抗体部分の保存期間や有効性を高める補助物質が少量含まれていてもよい。
投与経路又は製剤の種類（液体、凍結乾燥又は噴霧乾燥製剤など）に応じて、等張化剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトール等の多価アルコール、又は、塩化ナトリウムなどを組成物に配合することができる。薬学的に許容される担体には、湿潤若しくは乳化剤、保存剤又は緩衝剤など、抗体又は抗体部分の保存期間や有効性を高める補助物質が少量含まれていてもよい。
【0037】
本発明に係る医薬組成物は、様々な形態であってよい。これらには、例えば、液体溶液（例えば、注射液又は輸液液）、分散液又は懸濁液、粉末及びリポソームなどが含まれる。好ましい形態は、意図する投与様式や治療用途によって異なる。典型的な好ましい組成物は、注射可能又は注入可能な溶液の形態であり、例えば、他の抗体によるヒトの受動免疫に使用されるものと同様の組成物である。
【0038】
本発明に係る抗ＴＧ２抗体の適切な投与量は、熟練した医師によって決定され得る。本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投与量は、特定の患者、組成物及び投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効であり、かつ患者に毒性でない活性成分の量を得るように変化させることができる。選択される投与量は、投与経路、投与時間、抗体の排泄速度、治療期間、特定の抗体と併用される他の薬物、化合物及び／又は材料、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康状態及び既往歴など、さまざまな薬物動態学的要因に依存する。
【0039】
適切な用量は、例えば、治療される患者の約０．０１ｐｇ／ｋｇ～約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、典型的には約０．１ｐｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲とすることができる。用量レジメンは、最適な所望の反応（例えば、治療反応）を提供するために調整することができる。例えば、１回量を投与してもよいし、数回に分けて時間をかけて投与してもよい。本明細書で使用される投与単位形態とは、治療される対象のための単位投与量として適する物理的に離散した単位をいい、各単位は、必要な薬学的アーナと関連して所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含む。投与は単回投与でも複数回投与でもよい。複数回投与は、同一又は異なる経路で、同一又は異なる部位に行うことができる。
本発明全体から見ると、抗ＴＧ２抗体は１つ若しくは複数の他の治療薬と共投与することができる。２種類若しくはそれ以上の薬剤の併用投与は、さまざまな方法で行うことができる。両者は単一の組成物で一緒に投与してもよいし、併用療法の一部として別々の組成物で投与してもよい。例えば、一方を他方の前に投与してもよいし、別々に投与してもよいし、他方の後に投与してもよいし、順次投与してもよいし、他方と同時に投与してもよいし、同時に投与してもよい。
本発明全体から見ると、抗ＴＧ２抗体は１つ若しくは複数の他の治療薬と共投与することができる。２種類若しくはそれ以上の薬剤の併用投与は、さまざまな方法で行うことができる。両者は単一の組成物で一緒に投与してもよいし、併用療法の一部として別々の組成物で投与してもよい。例えば、一方を他方の前に投与してもよいし、別々に投与してもよいし、他方の後に投与してもよいし、順次投与してもよいし、他方と同時に投与してもよいし、同時に投与してもよい。
【図面の簡単な説明】
【0040】
【図1】ＩＰＦ患者の肺生検ではコラーゲン染色が上昇している。（Ａ）成熟した瘢痕組織（ｍａｔｕｒｅ ｓｃａｒ ｔｉｓｓｕｅ）に関連する高密度（ｄｅｎｓｅ）コラーゲン繊維に対してピコシリウスレッド（ｐｉｃｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ）染色が陽性であった組織切片の面積の割合。（Ｂ）総組織切片における気道以外の（ｎｏｎ－ａｉｒｗａｙ）コラーゲンの割合。非線維化性（ｎｏｎ－ｆｉｂｒｏｔｉｃ）（ＩＬＤのない肺生検を必要とする患者）を対照サンプルとして使用した（ｎ＝８）。ＩＰＦ／ＵＩＰサンプルはまとめて平均した（ｎ＝９）。＊ｐ＜０．０５、非対立、両側ｔ検定による（ｂｙ ｕｎｐａｉｒｅｄ， ２－ｓｉｄｅｄ ｔ－ｔｅｓｔｓ）。
【0041】
【図2】ＩＰＦ患者の生検でＴＧ２ｍＲＮＡ（ＲＮＡｓｃｏｐｅ）が上昇している。ホルマリン固定したパラフィン包埋肺組織サンプルを、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術ＲＮＡｓｃｏｐｅを使用してＴｇｍ２の発現をプローブ（ｐｒｏｂｅｄ）した。赤／ピンクの染色は、Ｔｇｍ２ｍＲＮＡ転写物を表す。（Ａ）：生検内のＴｇｍ２陽性細胞の総数。（Ｂ）：染色強度によるＴｇｍ２陽性細胞。染色強度は、１＋（細胞あたり１～６プローブ）、２＋（細胞あたり７～１３プローブ）、３＋（細胞あたり≧１４プローブ）で表す（ｐ＜０．０１５）。分析された１０件の「非線維化性」生検のうち２件のみ表示し、残りは、ＲＮＡ品質ＱＣチェックに不合格であった（ｆａｉｌｅｄ）。
【0042】
【図3】（Ａ）ＩＰＦ患者の生検でＴＧ２抗原が上昇している。非線維化性及びＩＰＦサンプルのパラフィン固定切片のＴＧ２免疫組織化学染色を分析し、ハイコンテンツ画像解析（ｈｉｇｈ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって染色面積の割合を算出した。非線維化性サンプル（ｎ＝７）とＩＰＦ／ＵＩＰサンプル（ｎ＝１０）を平均した。ｐ＝０．０３、非対、両側ｔ検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ，２－ｓｉｄｅｄ ｔ－ｔｅｓｔｓ）による。（Ｂ）患者の肺機能測定、予測率（ｐｅｒｃｅｎｔ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ）として努力肺活量（ＦＶＣ）を使用する（ｎ＝１０）。ＦＶＣとコラーゲン〔ＰＳＲ染色（丸印参照；Ｐ＝０．０１２８、Ｒ２＝０．５５９７）と、ＳＨＧ染色（三角印参照；Ｐ＝０．０９８３、Ｒ２＝０．３０４３）とで決定〕の間に線形回帰を実施した。
【0043】
【図4】ノックアウト（ＫＯ）マウスは、間質性肺疾患のブレオマイシンモデルにおいて、第二高調波発生顕微鏡（ｓｅｃｏｎｄ ｈａｒｍｏｎｉｃ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）、すなわちＳＨＧによって測定されるコラーゲンの増加から保護される。（Ａ）：野生型及びＴＧ２ ＫＯマウスにおける間質コラーゲンの面積の割合。（Ｂ）：野生型及びＴＧ２ ＫＯマウスにおけるブレオマイシンに対する肺間質コラーゲンの倍数増加（Ｆｏｌｄ ｉｎｃｒｅａｓｅ）（ｎ＝９－１２）。
【0044】
【図5】ＴＧ２ノックアウトマウスは、間質性肺疾患のブレオマイシンモデルにおいて、主要な間質性コラーゲンのｍＲＮＡ（ＲＴ ＱＰＣＲ）が上昇していない。Ｎ＝５マウス／群。Ｔｕｋｅｙの事後検定付きＡＮＯＶＡ。
【0045】
【図6】ＴＧ２ノックアウトマウスは、ブレオマイシン間質性肺疾患モデルにおいて肺機能を維持した。（Ａ）：抵抗（Ｒｒｓ＝呼吸器系抵抗（全体）；Ｒｎ＝ニュートン（気道）抵抗）。（Ｂ）：コンプライアンス（Ｃｒｓ＝動的コンプライアンス（呼吸器系のコンプライアンス）、Ｃｓｔ＝準静的コンプライアンス）。（Ｃ）：圧力容積ループ（Ｋ＝ＰＶループの収縮辺縁の曲率、ＰＶ＝圧力容積）。（Ｄ）：エラスタンス（Ｅｒｓ＝呼吸器系のエラスタンス（全体）、Ｈ＝組織のエラスタンス）；＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１、Ｔｕｋｅｙの事後検定付きＡＮＯＶＡによる。
【0046】
【図7】（Ａ）：ＴＧＦβ１刺激細胞の代表的な画像であり、スクラッチ直後（左パネル）、１時間後（中央パネル）及び３時間後（右パネル）の５－ＢＰ（すなわちトランスグルタミナーゼ活性）の取り込みを示し、スクラッチ後最初の１時間以内に活性が失われていることがわかる。 （Ｂ）：フィブロネクチン及びＴＧ２活性は、非線維化（ＮＦ）及び線維化（Ｆ）線維芽細胞に関し、ＴＧＦβ１処理有り及び無しにおいて、（スクラッチから離れた）細胞層及びスクラッチ境界で定量した。スクラッチ傷を導入した直後に５－ＢＰを添加し、１時間後に細胞を固定した。各ポイントは１ウェルでの染色を表す。Ｐ値は示した通りである。（Ｃ）：ＴＧＦβ１処理した肺線維芽細胞の単層をスクラッチし、上記のように直後に５－ＢＰを添加し、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）（左パネル）又はＴＧ２阻害抗体３００ｕＭ ｒｂＢＢ７（右パネル）で処理した。ｒｂＢＢ７は、染色がないことからわかるように、５－ＢＰの取り込みを完全に阻害した。
【0047】
【図8】ウサギ肺珪肺症試験計画。ニュージーランド白ウサギには、気管支鏡で右肺下葉に傷をつけた後、生理食塩水又はシリカを投与した。６つの実験群を設定した。５匹（群１）は、「健常」群として、生理食塩水を投与し、５６日間放置した。４０匹にシリカを投与した。１０匹（群２）は２８日後に投与を中止し、治療投与開始時の疾患の指標として使用した。１０匹の動物をビヒクル（群３、ｎ＝５）又は対照ＩｇＧ ｒｂ９２２（群４、ｎ＝５）で処理し、「未処理」対照として５６日間実施した（ビヒクルと対照ＩｇＧ群の結果は本質的に類似していたため、この群を１０匹の未処理対照の単一群にまとめた）。１０匹の動物を治療的投与群として２８日目から５６日目までＴＧ２阻害ウサギ抗体ｒｂＢＢ７で処理し（群５）、１０匹の動物を「予防的」投与群として１日目から５６日目までｒｂＢＢ７で処理した。ｒｂＢＢ７は５日ごとに投与した。末端分析は、ＴＧ２活性（ＴＧ ＩＳＡ）、ＴＧ２抗原（ＴＧ２ Ａｎｔ）、Ｐｉｃｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色（ＰＳＲ）、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色（ＭＴ）、肺コラーゲンの第二高調波発生定量（ＨＧ）及び各種メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）で構成された。
【0048】
【図9】ウサギ珪肺症モデルにおけるｒｂＢＢ７血清暴露。予防的投与（１日目から、プロットＡ及びＢ）と治療的投与（２６日目から５６日目まで、プロットＣ及びＤ）は、２回に分けて行われたため、個別にプロットした。
【0049】
【図10】ＩＬＤのウサギ珪肺症モデルにおいて、ｒｂＢＢ７はＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ染色で測定した場合、肺の総コラーゲンを減少させた。コラーゲンは、「実質細胞」（疾患過程とは無関係な既存のコラーゲンを含む大きな気道は除く）（Ａ）及び活動性の線維化病変内（Ｂ）で測定された。シリカｄ２８及びシリカｄ５６群は、それぞれ２８日目又は５６日目に投与を中止し、何も投与しない（ｄ２８）か、ビヒクル／対照ＩｇＧを投与して（ｄ５６）、薬剤による処理はしない。シリカ＋ｒｂＢＢ７（ｄ２８－ｄ５６）は、２８日目から５６日目までｒｂＢＢ７を投与する治療投与群である。シリカ＋ｒｂＢＢ７（１～５６日目）は、シリカ注入の１日前からｒｂＢＢ７を投与する予防投与群である。各ポイントはウサギ１羽を表す。群間の統計は、一元配置スチューデントｔ検定（１－ｗａｙ Ｓｔｕｄｅｎｔｓ ｔ－ｔｅｓｔｓ）であり、予防と治療群の両方で線維化が抑制されていることを示している。ＡＮＯＶＡで分析したところ、全体的な治療効果は有意であった（病変部のコラーゲンはｐ＝０．００２、実質部のコラーゲンはｐ＝０．００３７）。
【0050】
【図11】ＩＬＤのウサギ珪肺症モデルにおいて、第二高調波発生顕微鏡（ＳＨＧ）で測定したところ、ｒｂＢＢ７は総肺コラーゲンを減少させた。シリカｄ２８群及びシリカｄ５６群は、それぞれ２８日目又は５６日目に投与を中止し、何も投与しない（ｄ２８）か、ビヒクル／対照ＩｇＧを投与して（ｄ５６）薬剤による処理はしない。シリカ＋ｒｂＢＢ７（ｄ２８－ｄ５６）は、２８日目から５６日目までｒｂＢＢ７を投与する治療投与群である。シリカ＋ｒｂＢＢ７（１～５６日目）は、シリカ注入の１日前からｒｂＢＢ７を投与する予防投与群である。各ポイントは、ウサギ１羽を表す。群間の統計は一元配置スチューデントｔ検定であり、予防群と治療群の両方で線維化が抑制されていることを示している。
【0051】
【0052】
【図13】ＣＯＶＩＤ－１９感染（ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２ウイルスにより引き起こされた）で死亡した患者の死後肺サンプルでは、ＴＧ２ｍＲＮＡ（ＲＮＡｓｃｏｐｅ）がアップレギュレートしていた。ホルマリン固定したパラフィン包埋肺組織サンプルを、ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術ＲＮＡｓｃｏｐｅを用いてＴｇｍ２の発現をプローブした。黒い点／染色はＴｇｍ２ｍＲＮＡ転写物を表す。ＴＧ２ｍＲＮＡの発現を正常肺組織とＩＰＦ肺組織とで比較した。
【0053】
【図14】死後牛（Ｃｏｖｉｄ）肺におけるＴｇｍ２の発現。Ｔｇｍ２の発現は、正常、ＩＰＦ、及びＣＯＶＩＤ感染の結果死亡した対象からの肺組織で評価した。発現は、Ｔｇｍ２に染色された組織切片の面積率として計算した。Ｔｇｍ２は、健康な対照組織と比較して、死後のＣＯＶＩＤ組織で有意に上昇した（＊＝ＡＮＯＶＡによるＰ＜０．０５）。
【実施例】
【0054】
材料：
抗ＴＧ２抗体：
以下の実施例で使用した抗ＴＧ２ｍＡｂは、配列番号ＮＯ．２５で定義される軽鎖可変領域及び配列番号ＮＯ．３８で定義される重鎖可変領域を含んでいた。これはオリジナルのＢＢ７をウサギ化したバージョン（ｒａｂｂｉｔｉｓｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）で、以下の実施例ではｒｂＢＢ７と呼ぶ。
Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂ（ＵＣＢ７８５８としても知られる、抗体ＤＣ１由来）は、配列番号ＮＯ．２４に係る可変軽鎖及び配列番号ＮＯ．３７に係る可変重鎖を有する抗ＴＧ２抗体で、ヒトＴＧ２に特異的に結合するヒト化抗体である。ウサギのような動物モデルでその効果を模倣できるように、ｒｂＢＢ７が開発された。Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂ／ＤＣ１及びｒｂＢＢ７／ＢＢ７は同様の挙動を示すことが示されている。これらは、ＴＧ２コアの同じエピトープ（配列番号Ｎｏ．４１のａａ ３１３－３２５）に結合し、ヒトＴＧ２に対して、ほぼ同じＩＣ５０（０．２５対０．３ｎＭ）及びＫｄ（＜５０対＜６０ｐｍ）を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞ベースの評価においてＥＣＭの蓄積を同等に阻害する。唯一の顕著な違いは、ウサギＴＧ２に対するＺａｍｐｉｌｉｍａｂのＩＣ５０が劣っていることである（１０３対８ｎＭ）。したがって、ｒｂＢＢ７を使用した以下の実施例から得られた知見は、Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂ及び本明細書に記載したような他の抗ＴＧ２抗体にも十分に適用可能である。
抗ＴＧ２抗体：
以下の実施例で使用した抗ＴＧ２ｍＡｂは、配列番号ＮＯ．２５で定義される軽鎖可変領域及び配列番号ＮＯ．３８で定義される重鎖可変領域を含んでいた。これはオリジナルのＢＢ７をウサギ化したバージョン（ｒａｂｂｉｔｉｓｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）で、以下の実施例ではｒｂＢＢ７と呼ぶ。
Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂ（ＵＣＢ７８５８としても知られる、抗体ＤＣ１由来）は、配列番号ＮＯ．２４に係る可変軽鎖及び配列番号ＮＯ．３７に係る可変重鎖を有する抗ＴＧ２抗体で、ヒトＴＧ２に特異的に結合するヒト化抗体である。ウサギのような動物モデルでその効果を模倣できるように、ｒｂＢＢ７が開発された。Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂ／ＤＣ１及びｒｂＢＢ７／ＢＢ７は同様の挙動を示すことが示されている。これらは、ＴＧ２コアの同じエピトープ（配列番号Ｎｏ．４１のａａ ３１３－３２５）に結合し、ヒトＴＧ２に対して、ほぼ同じＩＣ５０（０．２５対０．３ｎＭ）及びＫｄ（＜５０対＜６０ｐｍ）を有し、ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞ベースの評価においてＥＣＭの蓄積を同等に阻害する。唯一の顕著な違いは、ウサギＴＧ２に対するＺａｍｐｉｌｉｍａｂのＩＣ５０が劣っていることである（１０３対８ｎＭ）。したがって、ｒｂＢＢ７を使用した以下の実施例から得られた知見は、Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂ及び本明細書に記載したような他の抗ＴＧ２抗体にも十分に適用可能である。
【0055】
実施例１－ＩＰＦにおけるコラーゲン及びＴＧ２の発現：
この研究の目的は、コラーゲンの存在及びＴＧ２の発現が、ヒト患者の肺線維症と関連しているかどうかを調べることであった。
この研究の目的は、コラーゲンの存在及びＴＧ２の発現が、ヒト患者の肺線維症と関連しているかどうかを調べることであった。
【0056】
方法：
ヒト組織：
肺生検サンプルは、ＮＩＨ及びロチェスター大学から入手した。非線維化患者１０人及びＩＰＦ患者１０人の検体を分析した。
ヒト組織：
肺生検サンプルは、ＮＩＨ及びロチェスター大学から入手した。非線維化患者１０人及びＩＰＦ患者１０人の検体を分析した。
【0057】
組織サンプルの調製：
ホルマリン固定したパラフィン包埋ヒトサンプルを連続切片化し、線維化の程度とＴＧ２とを相関させるために染色した。染色は、コラーゲン含有量及びトランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）のｍＲＮＡとタンパク質の発現によって測定される線維化を評価するために実施した。
ホルマリン固定したパラフィン包埋ヒトサンプルを連続切片化し、線維化の程度とＴＧ２とを相関させるために染色した。染色は、コラーゲン含有量及びトランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）のｍＲＮＡとタンパク質の発現によって測定される線維化を評価するために実施した。
【0058】
ピクロシリウス・レッド染色（ＰＳＲ）：
サンプル切片をピクロシリウス・レッドで染色した。ピクロシリウス・レッドはコラーゲン線維を明るい赤色に染色し、コラーゲン以外の部分はピンク色又は黄褐色に染色する。Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ ２．６（Ｂｌｕｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）ソフトウェアを使用し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｚ．１スキャナーでスライド全体のスキャンを行った。画像は、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを用いて多相分析で処理した。画像処理では、病変（活動性線維症）、実質組織（前線維症）、白斑（ｗｈｉｔｅ ｓｐａｃｅ）又は気道コラーゲン等の領域を識別するために、組織のマスクを作成した。各マスク内のＰＳＲ陽性染色率は以下のように計算された：
（［マスクの面積率％］×［マスク内の陽性染色率％］）／１００＝領域内のコラーゲン率％。
病変部と実質部の領域内のコラーゲン含有率の合計は、生検内の非気道コラーゲン含有率の合計を示す。
サンプル切片をピクロシリウス・レッドで染色した。ピクロシリウス・レッドはコラーゲン線維を明るい赤色に染色し、コラーゲン以外の部分はピンク色又は黄褐色に染色する。Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ ２．６（Ｂｌｕｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）ソフトウェアを使用し、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｚ．１スキャナーでスライド全体のスキャンを行った。画像は、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを用いて多相分析で処理した。画像処理では、病変（活動性線維症）、実質組織（前線維症）、白斑（ｗｈｉｔｅ ｓｐａｃｅ）又は気道コラーゲン等の領域を識別するために、組織のマスクを作成した。各マスク内のＰＳＲ陽性染色率は以下のように計算された：
（［マスクの面積率％］×［マスク内の陽性染色率％］）／１００＝領域内のコラーゲン率％。
病変部と実質部の領域内のコラーゲン含有率の合計は、生検内の非気道コラーゲン含有率の合計を示す。
【0059】
ＴＧ２タンパク質の発現：
ＴＧ２の免疫組織化学は、自動染色プラットフォームＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ＲＸを用いて、Ｄｅｗａｘ（Ｂｏｎｄ Ｄｅｗａｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、７２℃、３０分）、Ｈ１（２０）抗原回収（Ｂｏｎｄ ＥＲ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １で１００℃）及びＤＡＢ ３０ Ｍｉｎ Ｍａｒｋｅｒ検出（マウス抗ＴＧ２抗体ＤＨ２（ＵＣＢ、内部抗体）を８３ｎｇ／ｍｌで使用）の染色プロトコルで行った。染色は、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ ｔｉｓｓｕｅ ｓｔｕｄｉｏソフトウェアの多相領域解析を用いて定量化した。
ＴＧ２の免疫組織化学は、自動染色プラットフォームＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ＲＸを用いて、Ｄｅｗａｘ（Ｂｏｎｄ Ｄｅｗａｘ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、７２℃、３０分）、Ｈ１（２０）抗原回収（Ｂｏｎｄ ＥＲ ｓｏｌｕｔｉｏｎ １で１００℃）及びＤＡＢ ３０ Ｍｉｎ Ｍａｒｋｅｒ検出（マウス抗ＴＧ２抗体ＤＨ２（ＵＣＢ、内部抗体）を８３ｎｇ／ｍｌで使用）の染色プロトコルで行った。染色は、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ ｔｉｓｓｕｅ ｓｔｕｄｉｏソフトウェアの多相領域解析を用いて定量化した。
【0060】
ＴＧ２ｍＲＮＡ：
ＴＧ２ｍＲＮＡは、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織において、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）アッセイを用い、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ＲＸ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒにＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．５ ＬＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｒｅｄ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製）及びＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｒｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、製造元の指示に従って評価した。組織の質は、ハウスキーピング遺伝子Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｍＲＮＡのｍＲＮＡについてＲＮＡｓｃｏｐｅ分析を行うことによって評価した。切片は５μｍの厚さでＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ Ｇｏｌｄスライドに採取し、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ＲＸ ｆａｃｔｏｒｙの‘Ｂａｋｅ ａｎｄ Ｄｅｗａｘ’プロトコルに従って３７℃で一晩乾燥させた。スライドは前処理なしでＬｅｉｃａ ＢＯＮＤ ＲＸの染色ラックに置き、６０℃で、定位置でベークした後、エタノールを使用して再水和する前に脱脂した。熱によるＲＮＡ回収は、回収バッファーＥＲ２（ｐＨ９、ＡＲ９６４０ Ｌｅｉｃａ）で９５℃、１５分間インキュベートした後、プロテアーゼ処理（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を１５分間行い、前処理の間に蒸留水で２回すすいでペルオキシダーゼブロッキングを行った。簡単に説明すると、関連するゲノム核タンパク質遺伝子を標的とする２０のＺＺプローブペアが設計され（標的ヌクレオチドＴａｒｇｅｔ １６０－２５６３）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社によって合成された。切片をＩＳＨ標的プローブに曝露し、４２℃で２時間インキュベートした。Ｈｓ－ＴＧＭ２（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。細菌遺伝子ＤａｐＢ ｍＲＮＡに対するプローブを各ラン（ｒｕｎ）の陰性対照として用いた。水洗後、ＩＳＨシグナルを会社提供のＰｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｅｒとアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合したＡｍｐｌｉｆｉｅｒを用いて増幅し、赤色基質－発色液とともに室温で１０分間インキュベートした。その後、切片をヘマトキシリンで対比染色し、風乾した後、Ｅｃｏｍｏｕｎｔ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）でマウントした。画像はオリンパスのスライドスキャナーで取得し、イメージング専門会社Ｏｒａｃｌｅ Ｂｉｏ社のＨａｌｏ画像解析ソフトウェアを用いて、ＴＧ２ｍＲＮＡ陽性に染色された細胞数と各細胞内の染色強度（プローブ数）に基づいて定量化した。
ＴＧ２ｍＲＮＡは、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織において、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＩＳＨ）アッセイを用い、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ＲＸ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒにＲＮＡｓｃｏｐｅ ２．５ ＬＳ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｒｅｄ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ製）及びＬｅｉｃａ Ｂｏｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｒｅｆｉｎｅ Ｒｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、製造元の指示に従って評価した。組織の質は、ハウスキーピング遺伝子Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ Ｃ ｍＲＮＡのｍＲＮＡについてＲＮＡｓｃｏｐｅ分析を行うことによって評価した。切片は５μｍの厚さでＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ Ｇｏｌｄスライドに採取し、Ｌｅｉｃａ Ｂｏｎｄ ＲＸ ｆａｃｔｏｒｙの‘Ｂａｋｅ ａｎｄ Ｄｅｗａｘ’プロトコルに従って３７℃で一晩乾燥させた。スライドは前処理なしでＬｅｉｃａ ＢＯＮＤ ＲＸの染色ラックに置き、６０℃で、定位置でベークした後、エタノールを使用して再水和する前に脱脂した。熱によるＲＮＡ回収は、回収バッファーＥＲ２（ｐＨ９、ＡＲ９６４０ Ｌｅｉｃａ）で９５℃、１５分間インキュベートした後、プロテアーゼ処理（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を１５分間行い、前処理の間に蒸留水で２回すすいでペルオキシダーゼブロッキングを行った。簡単に説明すると、関連するゲノム核タンパク質遺伝子を標的とする２０のＺＺプローブペアが設計され（標的ヌクレオチドＴａｒｇｅｔ １６０－２５６３）、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社によって合成された。切片をＩＳＨ標的プローブに曝露し、４２℃で２時間インキュベートした。Ｈｓ－ＴＧＭ２（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）。細菌遺伝子ＤａｐＢ ｍＲＮＡに対するプローブを各ラン（ｒｕｎ）の陰性対照として用いた。水洗後、ＩＳＨシグナルを会社提供のＰｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｅｒとアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合したＡｍｐｌｉｆｉｅｒを用いて増幅し、赤色基質－発色液とともに室温で１０分間インキュベートした。その後、切片をヘマトキシリンで対比染色し、風乾した後、Ｅｃｏｍｏｕｎｔ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ（Ｂｉｏｃａｒｅ Ｍｅｄｉｃａｌ）でマウントした。画像はオリンパスのスライドスキャナーで取得し、イメージング専門会社Ｏｒａｃｌｅ Ｂｉｏ社のＨａｌｏ画像解析ソフトウェアを用いて、ＴＧ２ｍＲＮＡ陽性に染色された細胞数と各細胞内の染色強度（プローブ数）に基づいて定量化した。
【0061】
結果：
コラーゲンの存在（図１）：
ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色を用いてコラーゲンを可視化した。全生検スキャンでは、非線維化サンプルと比較して、ＩＰＦ生検では組織が高密度で、空隙（ａｉｒｓｐａｃｅ）が少ないことが示されたが、これらの「非線維化性」対照の中には、明らかにリモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）が起こっているものもあった（写真は示していない）。組織内に次の４つの領域が定義された：（１）活性線維性病変領域（ａｃｔｉｖｅ ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎ ａｒｅａ）は、赤色コラーゲン線維の高密度さに基づいて割り当てられ、（２）総実質組織（ｔｏｔａｌ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ）は、コラーゲンを含まない組織のピンク色又は黄色の染色が支配的な領域における赤色コラーゲン線維の低密度さによって定義され、（３）空隙は、組織周辺部内のスライドの白い間隔又は染色されていない領域によって定義され、そして（４）気道コラーゲンは、気道を取り囲むコラーゲンの密集した領域として定義された（これは肺組織病理の正常な特徴であり、線維性疾患ではあまり変化しないと予想される）。
ＩＰＦと非ＩＰＦの切片を比較すると、病変の大きさと高密度コラーゲン領域が増大し、空隙と実質組織領域が縮小した。組織内の気道以外のコラーゲンの割合も有意に増加した（図１Ａ／Ｂ）。
コラーゲンの存在（図１）：
ピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）染色を用いてコラーゲンを可視化した。全生検スキャンでは、非線維化サンプルと比較して、ＩＰＦ生検では組織が高密度で、空隙（ａｉｒｓｐａｃｅ）が少ないことが示されたが、これらの「非線維化性」対照の中には、明らかにリモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）が起こっているものもあった（写真は示していない）。組織内に次の４つの領域が定義された：（１）活性線維性病変領域（ａｃｔｉｖｅ ｆｉｂｒｏｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎ ａｒｅａ）は、赤色コラーゲン線維の高密度さに基づいて割り当てられ、（２）総実質組織（ｔｏｔａｌ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ）は、コラーゲンを含まない組織のピンク色又は黄色の染色が支配的な領域における赤色コラーゲン線維の低密度さによって定義され、（３）空隙は、組織周辺部内のスライドの白い間隔又は染色されていない領域によって定義され、そして（４）気道コラーゲンは、気道を取り囲むコラーゲンの密集した領域として定義された（これは肺組織病理の正常な特徴であり、線維性疾患ではあまり変化しないと予想される）。
ＩＰＦと非ＩＰＦの切片を比較すると、病変の大きさと高密度コラーゲン領域が増大し、空隙と実質組織領域が縮小した。組織内の気道以外のコラーゲンの割合も有意に増加した（図１Ａ／Ｂ）。
【0062】
ＴＧ２の発現（図２及び３）：
組織トランスグルタミナーゼ２は、Ｔｇｍ２遺伝子によってコードされている。対応するｍＲＮＡを定量したところ、ＩＰＦ生検では面積当たりのＴＧ２ｍＲＮＡ陽性細胞数が全体的に有意に増加していた（図２Ａ）。細胞あたりのプローブ数も、細胞あたり低、中、高ＴＧ２ ＲＮＡを発現している細胞を細分化して（ｓｕｂｄｉｖｉｄｉｎｇ）定量した（図２Ｂ）。ＩＰＦ群では、ＴＧ２ｍＲＮＡ高発現細胞数が非線維化群と比較して有意に３倍増加した。ＴＧ２の免疫組織化学染色により、組織内でのタンパク質発現の局在が確認された。観察によると、ＴＧ２陽性染色は非線維化組織では上皮に局在し、ＩＰＦサンプルでは線維化領域に強く局在していた。ＩＰＦサンプルでは、非線維化サンプルと比較して、全生検でＴＧ２陽性染色面積が４２％の増加を示した（図３Ａ）。図３Ｂに示すように、努力肺活量（ＦＶＣ）の減少は、ＰＳＲ染色によって決定された非気道コラーゲンの割合と有意に関連していた（丸印；Ｐ＝０．０１２８、Ｒ２＝０．５５９７）。ＦＶＣの低下もＳＨＧで検出されたコラーゲンと関連していたが、有意ではなかった（三角印、Ｐ＝０．０９８３、Ｒ２＝０．３０４３）。
組織トランスグルタミナーゼ２は、Ｔｇｍ２遺伝子によってコードされている。対応するｍＲＮＡを定量したところ、ＩＰＦ生検では面積当たりのＴＧ２ｍＲＮＡ陽性細胞数が全体的に有意に増加していた（図２Ａ）。細胞あたりのプローブ数も、細胞あたり低、中、高ＴＧ２ ＲＮＡを発現している細胞を細分化して（ｓｕｂｄｉｖｉｄｉｎｇ）定量した（図２Ｂ）。ＩＰＦ群では、ＴＧ２ｍＲＮＡ高発現細胞数が非線維化群と比較して有意に３倍増加した。ＴＧ２の免疫組織化学染色により、組織内でのタンパク質発現の局在が確認された。観察によると、ＴＧ２陽性染色は非線維化組織では上皮に局在し、ＩＰＦサンプルでは線維化領域に強く局在していた。ＩＰＦサンプルでは、非線維化サンプルと比較して、全生検でＴＧ２陽性染色面積が４２％の増加を示した（図３Ａ）。図３Ｂに示すように、努力肺活量（ＦＶＣ）の減少は、ＰＳＲ染色によって決定された非気道コラーゲンの割合と有意に関連していた（丸印；Ｐ＝０．０１２８、Ｒ２＝０．５５９７）。ＦＶＣの低下もＳＨＧで検出されたコラーゲンと関連していたが、有意ではなかった（三角印、Ｐ＝０．０９８３、Ｒ２＝０．３０４３）。
【0063】
実施例１の結論：
肺コラーゲンの総量（ｔｏｔａｌ ｌｕｎｇ ｃｏｌｌａｇｅｎ）は、ＩＰＦ組織で有意に増加し、肺機能の低下と相関し（Ｒ２ ０．５６、ｐ＝０．０１）、これは予想される疾患表現型（ｄｉｓｅａｓｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）及びこれまでの報告と一致していた。ＩＰＦ肺組織では、ＴＧ２ｍＲＮＡの発現及び固定サンプルで検出可能なＴＧ２タンパク質が増加していた。
肺コラーゲンの総量（ｔｏｔａｌ ｌｕｎｇ ｃｏｌｌａｇｅｎ）は、ＩＰＦ組織で有意に増加し、肺機能の低下と相関し（Ｒ２ ０．５６、ｐ＝０．０１）、これは予想される疾患表現型（ｄｉｓｅａｓｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）及びこれまでの報告と一致していた。ＩＰＦ肺組織では、ＴＧ２ｍＲＮＡの発現及び固定サンプルで検出可能なＴＧ２タンパク質が増加していた。
【0064】
実施例２－ノックアウト動物モデル
ＴＧ２ノックアウトマウスは、間質性肺疾患の肺ブレオマイシンモデルにおいて線維性リモデリングから保護されることが、以前示された（Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかし、ＴＧ２が減少した場合の肺における組織学的保護と機能的利益とを関連付ける絶対的な必要性が残っている。
ＴＧ２ノックアウトマウスは、間質性肺疾患の肺ブレオマイシンモデルにおいて線維性リモデリングから保護されることが、以前示された（Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかし、ＴＧ２が減少した場合の肺における組織学的保護と機能的利益とを関連付ける絶対的な必要性が残っている。
【0065】
方法：
すべての動物処置（ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）は、承認された認定のもとで実施された。
野生型マウスとＴＧ２ノックアウトマウス：
これらの実験に使用したマウスは、市販の雄若しくは雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、ｎ＝２０）又は自家繁殖のＴＧ２ノックアウトマウス（ｎ＝２１）である。ＴＧ２ノックアウトマウスは、Ｔｇｍ２ｔｍ１．１Ｒｍｇｒ（Ｖｉｃｔｏｒ Ｃｈａｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）株で、Ｔｇｍ２遺伝子のエクソン６－８をＣｒｅ媒介組換え（Ｃｒｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって除去した。この株はその後、Ｃ５６ＢＬ／６Ｊに少なくとも１０世代戻し交配され、ゲノムスキャンによって確認された。
すべての動物処置（ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）は、承認された認定のもとで実施された。
野生型マウスとＴＧ２ノックアウトマウス：
これらの実験に使用したマウスは、市販の雄若しくは雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製、ｎ＝２０）又は自家繁殖のＴＧ２ノックアウトマウス（ｎ＝２１）である。ＴＧ２ノックアウトマウスは、Ｔｇｍ２ｔｍ１．１Ｒｍｇｒ（Ｖｉｃｔｏｒ Ｃｈａｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ製）株で、Ｔｇｍ２遺伝子のエクソン６－８をＣｒｅ媒介組換え（Ｃｒｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって除去した。この株はその後、Ｃ５６ＢＬ／６Ｊに少なくとも１０世代戻し交配され、ゲノムスキャンによって確認された。
【0066】
ブレオマイシンモデル：
マウスは、イソフルラン麻酔下で、２Ｕ／ｋｇのブレオマイシン（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ製）を４０μｌの生理食塩水で又は４０μｌの生理食塩水だけを、口腔咽頭吸引した。２１日後、米国獣医師会の安楽死に関するパネルによる最新のガイドラインに沿った方法でマウスを安楽死させた。心臓及び肺は一括摘出した。右気管支を切断し、右肺葉を液体窒素で凍結した。左肺を２％低融点アガロースで膨張させ、１０％中性緩衝ホルマリンに入れるか、又は中性緩衝ホルマリンで膨張させ、一晩ホルマリンに入れた。
マウスは、イソフルラン麻酔下で、２Ｕ／ｋｇのブレオマイシン（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｋａｂｉ製）を４０μｌの生理食塩水で又は４０μｌの生理食塩水だけを、口腔咽頭吸引した。２１日後、米国獣医師会の安楽死に関するパネルによる最新のガイドラインに沿った方法でマウスを安楽死させた。心臓及び肺は一括摘出した。右気管支を切断し、右肺葉を液体窒素で凍結した。左肺を２％低融点アガロースで膨張させ、１０％中性緩衝ホルマリンに入れるか、又は中性緩衝ホルマリンで膨張させ、一晩ホルマリンに入れた。
【0067】
組織学：
マウスの肺片を１０％中性緩衝ホルマリンで一晩固定し、その後７０％エタノールに移し、パラフィンに包埋した。５ミクロンの切片を標準的な方法でＨ＆Ｅ、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ又はＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄで染色した。一部の実験では、コラーゲン染色をＯｒａｃｌｅ Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ Ｔｉｓｓｕｅ ｓｔｕｄｉｏソフトウェアで定量化した。
マウスの肺片を１０％中性緩衝ホルマリンで一晩固定し、その後７０％エタノールに移し、パラフィンに包埋した。５ミクロンの切片を標準的な方法でＨ＆Ｅ、Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ又はＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ Ｒｅｄで染色した。一部の実験では、コラーゲン染色をＯｒａｃｌｅ Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ Ｔｉｓｓｕｅ ｓｔｕｄｉｏソフトウェアで定量化した。
【0068】
肺機能検査：
肺機能検査では、マウスに麻酔をかけ、気管にカニュレーションをし、ＦｌｅｘｉＶｅｎｔ装置（ＳｃｉＲｅｑ製）に接続した人工呼吸器に接続した。マウスは２ｍｇ／ｋｇのベクロニウム臭化物（ｖｅｃｕｒｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与して麻痺させ、自発的な呼吸努力を妨げ、ＦｌｅｘｉＶｅｎｔにより、通常、約１０分間続く、一連の強制換気操作を実施し、肺機能パラメータを導出するのに使用した。マウスを人工呼吸器から外し、安楽死させ、組織を採取した。
肺機能検査では、マウスに麻酔をかけ、気管にカニュレーションをし、ＦｌｅｘｉＶｅｎｔ装置（ＳｃｉＲｅｑ製）に接続した人工呼吸器に接続した。マウスは２ｍｇ／ｋｇのベクロニウム臭化物（ｖｅｃｕｒｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与して麻痺させ、自発的な呼吸努力を妨げ、ＦｌｅｘｉＶｅｎｔにより、通常、約１０分間続く、一連の強制換気操作を実施し、肺機能パラメータを導出するのに使用した。マウスを人工呼吸器から外し、安楽死させ、組織を採取した。
【0069】
ＲＮＡ定量：
右中肺葉は安楽死時に液体窒素で瞬間凍結し、ＲＮＡ精製まで－８０℃で保存した。ＲＮＡ精製には、Ｑｉａｚｏｌ抽出を用い、ビュレットブレンダー（ｂｕｌｌｅｔ ｂｌｅｎｄｅｒ）で組織を粉砕した後、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ製）を用い、メーカーのプロトコルに従って精製した。ｃＤＮＡへの逆転写はｉＳｃｒｉｐｔ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）を用いて完了した。リアルタイムＰＣＲは、１ｎｇのサンプルｃＤＮＡと、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、フィブロネクチン、Ｔｇｍ２及びＧＡＤＰＨ（ハウスキーピング遺伝子）をターゲットとする、事前検証済みのウサギのプライマーを用いて実施した。
右中肺葉は安楽死時に液体窒素で瞬間凍結し、ＲＮＡ精製まで－８０℃で保存した。ＲＮＡ精製には、Ｑｉａｚｏｌ抽出を用い、ビュレットブレンダー（ｂｕｌｌｅｔ ｂｌｅｎｄｅｒ）で組織を粉砕した後、ＲＮＡｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ製）を用い、メーカーのプロトコルに従って精製した。ｃＤＮＡへの逆転写はｉＳｃｒｉｐｔ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ製）を用いて完了した。リアルタイムＰＣＲは、１ｎｇのサンプルｃＤＮＡと、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、フィブロネクチン、Ｔｇｍ２及びＧＡＤＰＨ（ハウスキーピング遺伝子）をターゲットとする、事前検証済みのウサギのプライマーを用いて実施した。
【0070】
結果：
肺コラーゲン発現（図４及び５）：
肺コラーゲンの第二高調波発生法による評価（図４）は、ブレオマイシン処理後のＴＧ２ ＫＯマウスでは、野生型Ｃ５６ＢＬ／６マウスと比較してコラーゲンレベルの増加が抑制されているという、以前の細胞化学染色による評価を確認した（Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかし、ＴＧ２の欠損は、線維化におけるＴＧ２の作用機序に関する現在の理解からすると、現実的に予想されるよりも大きな、間質性コラーゲン遺伝子発現の明確かつ有意な減少をもたらした（図５）。
肺コラーゲン発現（図４及び５）：
肺コラーゲンの第二高調波発生法による評価（図４）は、ブレオマイシン処理後のＴＧ２ ＫＯマウスでは、野生型Ｃ５６ＢＬ／６マウスと比較してコラーゲンレベルの増加が抑制されているという、以前の細胞化学染色による評価を確認した（Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかし、ＴＧ２の欠損は、線維化におけるＴＧ２の作用機序に関する現在の理解からすると、現実的に予想されるよりも大きな、間質性コラーゲン遺伝子発現の明確かつ有意な減少をもたらした（図５）。
【0071】
ブレオマイシン処理後の肺機能（図６）：
組織採取の前に、ＦｌｅｘｉＶｅｎｔ装置を用いてマウスの肺機能を測定した。強制換気（ｆｏｒｃｅｄ ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ）に対する呼吸器系の抵抗を２段階で測定した。最初のＲｒｓあるいは総抵抗は、強制換気に対する呼吸器系全体の抵抗である。Ｒｒｓはブレオマイシンに反応してＣ５７ＢＬ／６マウスで有意に増加したが、ＴＧ２ ＫＯマウスでのわずかな増加は有意ではなく、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＲｒｓより有意に低かった（図６Ａ）。２つ目のＲｎあるいはニュートン抵抗は、総システム抵抗のうち、気道抵抗の変化（喘息における気道狭窄など）に起因するものがどの程度あるかを推定するものである。野生型及びＴＧ２ ＫＯマウスの両方において、ニュートン抵抗性は、ブレオマイシンに影響されなかった（図６Ａ）。胸壁もブレオマイシンの影響を受けなかったと仮定すると、Ｒｒｓにおける野生型及びＫＯマウスの明らかな違いは、肺実質組織（すなわち間質性肺疾患）の抵抗性の変化によるものでなければならない。
組織採取の前に、ＦｌｅｘｉＶｅｎｔ装置を用いてマウスの肺機能を測定した。強制換気（ｆｏｒｃｅｄ ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ）に対する呼吸器系の抵抗を２段階で測定した。最初のＲｒｓあるいは総抵抗は、強制換気に対する呼吸器系全体の抵抗である。Ｒｒｓはブレオマイシンに反応してＣ５７ＢＬ／６マウスで有意に増加したが、ＴＧ２ ＫＯマウスでのわずかな増加は有意ではなく、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＲｒｓより有意に低かった（図６Ａ）。２つ目のＲｎあるいはニュートン抵抗は、総システム抵抗のうち、気道抵抗の変化（喘息における気道狭窄など）に起因するものがどの程度あるかを推定するものである。野生型及びＴＧ２ ＫＯマウスの両方において、ニュートン抵抗性は、ブレオマイシンに影響されなかった（図６Ａ）。胸壁もブレオマイシンの影響を受けなかったと仮定すると、Ｒｒｓにおける野生型及びＫＯマウスの明らかな違いは、肺実質組織（すなわち間質性肺疾患）の抵抗性の変化によるものでなければならない。
【0072】
コンプライアンスは、呼吸器系の拡張のし易さを表す。線維化では肺が硬くなり、瘢痕化し、拡張しにくくなるため、一般的にコンプライアンスが低下する。動的コンプライアンスは、潮汐呼吸中に測定される。静的コンプライアンスは、ヒトの患者では、深い息止め操作中に測定される。マウスはコマンドで息を止めることができないため、Ｆｌｅｘｉｖｅｎｔ装置では、人工呼吸器による１回の深い膨張中に準静的コンプライアンスを測定する（マウスはコマンドで息を止めることができないため）。ブレオマイシンは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、動的及び準静的コンプライアンスを著しく失った（図６Ｂ）。ＴＧ２ ＫＯマウスもまたコンプライアンスが低下したが、これはＣ５７ＢＬ／６と比較すると保たれており、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの約半分のコンプライアンスしか失っていなかった。
【0073】
ＰＶループ面積は、強制換気操作によって肺胞を呼吸にリクルートする（ｒｅｃｒｕｉｔ）能力を反映し、ＰＶループ面積が小さいほどリクルート可能な肺胞容積が少ないことを示す。ＫはＰＶループの収縮辺縁の曲率を測定する。Ｋの減少は、呼吸後の初期収縮がより速いことを示唆し、これは弾性剛性の増加と一致する（肺は膨張時にそれほど伸びないので、収縮時に速く潰れる）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスでは、ブレオマイシンに反応して、Ｋ ＰＶ曲線及びＰＶループ面積の両方が有意に低下した（図６Ｃ）。対照的に、ＴＧ２ ＫＯマウスはこの低下から保護され、どちらも有意な低下は見られなかった。
【0074】
エラスタンスは、肺組織の弾性剛性を測定するもので、コンプライアンスの逆数である。Ｅｒｓは、呼吸器系全体のエラスタンスで、組織、胸壁、気道からの寄与を含み、Ｈは組織のみのエラスタンスで、肺組織の２つの異なる数学モデルから計算される。生理食塩水で処理したマウスと比較して、ブレオマイシンはＣ５７ＢＬ／６マウスの肺組織の弾性剛性を有意に増加させたが、ＴＧ２ ＫＯマウスでは増加させなかった（図６Ｅ）。この総系統のエラスタンス（Ｅｒｓ）の変化は、組織のエラスタンス（Ｈ）に関連する所見と同様に、肺組織の変化に起因する。まとめると、ＴＧ２ ＫＯマウスは、呼吸機能を評価するために用いられたすべてのパラメータにおいて、ブレオマイシン間質性肺疾患モデルにおいて機能的に保護されていた。野生型マウスに比べ、総抵抗の増加もなく、弾性剛性の増加もなく、圧容積ループの損失もなく、コンプライアンスの損失は有意に減少した。
【0075】
実施例２の結論：
ＴＧ２ ＫＯマウスは、ブレオマイシン誘発性間質性肺線維症後の肺機能喪失から保護されるという所見であった。保護の大きさは特に驚くべきものであった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ブレオマイシンの投与により、コンプライアンスの低下、弾性剛性の増大、組織抵抗の増大及び気腔のリクルートメントの低下を示したが、これらはすべてヒトのＩＰＦや他の線維化性ＩＬＤと一致していた。それどころか、ＴＧ２ ＫＯマウスはこれらの影響から保護され、気道のリクルートメント及び抵抗に変化はなく、コンプライアンスの低下は約５０％減少し、エラスタンスは、増加した。これらの驚くべきエキサイティングな結果は、ＴＧ２欠損が組織の組織学的変化だけでなく、最も重要な肺機能にも影響を及ぼすことを示している。
ＴＧ２ ＫＯマウスは、ブレオマイシン誘発性間質性肺線維症後の肺機能喪失から保護されるという所見であった。保護の大きさは特に驚くべきものであった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ブレオマイシンの投与により、コンプライアンスの低下、弾性剛性の増大、組織抵抗の増大及び気腔のリクルートメントの低下を示したが、これらはすべてヒトのＩＰＦや他の線維化性ＩＬＤと一致していた。それどころか、ＴＧ２ ＫＯマウスはこれらの影響から保護され、気道のリクルートメント及び抵抗に変化はなく、コンプライアンスの低下は約５０％減少し、エラスタンスは、増加した。これらの驚くべきエキサイティングな結果は、ＴＧ２欠損が組織の組織学的変化だけでなく、最も重要な肺機能にも影響を及ぼすことを示している。
【0076】
実施例３－抗ＴＧ２抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ阻害活性：
方法：
スクラッチ創傷実験：
初代肺線維芽細胞をカルシウム添加ＡＴＣＣ ＲＰＥ培地で７日間培養した。一部の細胞は未処理のまま、一部の細胞は示されているように、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβで処理した。単層膜をスクラッチし、２５０μＭのＴＧ２基質５－ＢＰを直ちに、１時間後に、又は３時間後に添加した。その後、細胞を採取し、洗浄後、５－ＢＰ添加１時間後にメタノールで固定した（全細胞マウント（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｍｏｕｎｔ））。フィブロネクチンは抗体染色で検出し、ＴＧ２活性は、５－ＢＰラベルを検出するためにＨＲＰ－ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で検出した。蛍光シグナルの強度は、スクラッチ境界とスクラッチから離れた細胞層で定量した。使用した短いインキュベーション時間では、５－ＢＰは細胞外又は細胞表面のＴＧ２活性を検出するだけで、細胞内活性は検出しない。
方法：
スクラッチ創傷実験：
初代肺線維芽細胞をカルシウム添加ＡＴＣＣ ＲＰＥ培地で７日間培養した。一部の細胞は未処理のまま、一部の細胞は示されているように、１ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβで処理した。単層膜をスクラッチし、２５０μＭのＴＧ２基質５－ＢＰを直ちに、１時間後に、又は３時間後に添加した。その後、細胞を採取し、洗浄後、５－ＢＰ添加１時間後にメタノールで固定した（全細胞マウント（ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌ ｍｏｕｎｔ））。フィブロネクチンは抗体染色で検出し、ＴＧ２活性は、５－ＢＰラベルを検出するためにＨＲＰ－ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で検出した。蛍光シグナルの強度は、スクラッチ境界とスクラッチから離れた細胞層で定量した。使用した短いインキュベーション時間では、５－ＢＰは細胞外又は細胞表面のＴＧ２活性を検出するだけで、細胞内活性は検出しない。
【0077】
結果：
スクラッチ評価におけるＴＧ２活性の定量と阻害（図７）：
スクラッチ評価は、異なるヒトドナー由来の８つの細胞初代細胞株（８ ｃｅｌｌ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）（非線維化３株及びＩＰＦ５株）を用いて、ネイティブ及びＴＧＦβ１処理状態の両方で実施した。ＴＧ２活性はスクラッチ後に急速に上昇し、生の蛍光強度によって可視化されたトランスグルタミナーゼ基質５－ビオチン化ペンチルアミン（５ＢＰ）の細胞外マトリックスへの取り込みによって示された（図７Ａ左パネル）。しかし、時間を決めて基質を投与し、５ＢＰの基質投与１時間後に実験を中止したところ、この活性化は一過性であり、スクラッチから１時間以内にすべての活性が消失することが示され、スクラッチ１時間後に５ＢＰを投与した場合には活性は記録されなかった（図７Ａ中、右パネル）。予想されたように、ＩＰＦ細胞株は非線維化株よりも多くのフィブロネクチンを発現した。線維化株も非線維化株もスクラッチ後にＴＧ２活性の増加を示し、ＩＰＦ株は非線維化株よりも有意に活性が高かった。ＴＧ２の活性化はＴＧＦβによって増強され、ＩＰＦ線維芽細胞では非線維化線維芽細胞よりも大きい（図７Ｂ）。これはＩＰＦにおけるＴＧ２の役割に示唆を与える重要な発見である。ＴＧ２阻害抗体（ｒｂＢＢ７）を投与すると、スクラッチに沿ったＴＧ活性の上昇を完全にブロックすることができ、このことから、活性の上昇はＴＧ２のみによるものであり、ＴＧ２は傷に反応して細胞外で上昇することが確認された。
スクラッチ評価におけるＴＧ２活性の定量と阻害（図７）：
スクラッチ評価は、異なるヒトドナー由来の８つの細胞初代細胞株（８ ｃｅｌｌ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ）（非線維化３株及びＩＰＦ５株）を用いて、ネイティブ及びＴＧＦβ１処理状態の両方で実施した。ＴＧ２活性はスクラッチ後に急速に上昇し、生の蛍光強度によって可視化されたトランスグルタミナーゼ基質５－ビオチン化ペンチルアミン（５ＢＰ）の細胞外マトリックスへの取り込みによって示された（図７Ａ左パネル）。しかし、時間を決めて基質を投与し、５ＢＰの基質投与１時間後に実験を中止したところ、この活性化は一過性であり、スクラッチから１時間以内にすべての活性が消失することが示され、スクラッチ１時間後に５ＢＰを投与した場合には活性は記録されなかった（図７Ａ中、右パネル）。予想されたように、ＩＰＦ細胞株は非線維化株よりも多くのフィブロネクチンを発現した。線維化株も非線維化株もスクラッチ後にＴＧ２活性の増加を示し、ＩＰＦ株は非線維化株よりも有意に活性が高かった。ＴＧ２の活性化はＴＧＦβによって増強され、ＩＰＦ線維芽細胞では非線維化線維芽細胞よりも大きい（図７Ｂ）。これはＩＰＦにおけるＴＧ２の役割に示唆を与える重要な発見である。ＴＧ２阻害抗体（ｒｂＢＢ７）を投与すると、スクラッチに沿ったＴＧ活性の上昇を完全にブロックすることができ、このことから、活性の上昇はＴＧ２のみによるものであり、ＴＧ２は傷に反応して細胞外で上昇することが確認された。
【0078】
実施例３の結論：
培養中の初代ヒト肺線維芽細胞は、ＴＧ２を細胞外に輸送するが、スクラッチ傷によって活性化されない限り不活性である。活性化は一過性で、持続時間は１時間未満である。ＩＰＦドナーの線維芽細胞は、非線維化線維芽細胞よりも多くのＴＧ２活性を輸送する。この活性はｒｂＢＢ７によって完全に阻害される。このデータは、ＩＰＦにおける活性化ＴＧ２を、ｒｂＢＢ７及びＺａｍｐｉｌｉｍａｂ等の抗ＴＧ２抗体で阻害できるという証拠を示している。このデータは、初代ヒト肺細胞におけるＺａｍｐｉｌｉｍａｂの抗線維化反応を構成している。
培養中の初代ヒト肺線維芽細胞は、ＴＧ２を細胞外に輸送するが、スクラッチ傷によって活性化されない限り不活性である。活性化は一過性で、持続時間は１時間未満である。ＩＰＦドナーの線維芽細胞は、非線維化線維芽細胞よりも多くのＴＧ２活性を輸送する。この活性はｒｂＢＢ７によって完全に阻害される。このデータは、ＩＰＦにおける活性化ＴＧ２を、ｒｂＢＢ７及びＺａｍｐｉｌｉｍａｂ等の抗ＴＧ２抗体で阻害できるという証拠を示している。このデータは、初代ヒト肺細胞におけるＺａｍｐｉｌｉｍａｂの抗線維化反応を構成している。
【0079】
実施例４－抗ＴＧ２抗体のｉｎ ｖｉｖｏ阻害活性：
方法：
ｒｂＢＢ７、ビヒクル又は対照抗体処理による介入試験：
全体的な研究デザイン（図８）は、４５匹の動物（ウサギ）を用い、１０ｍｇのシリカを５６日間にわたって予防的及び治療的に投与するものであった。
・ ５羽のウサギには、生理食塩水を投与し、５６日目に採取した（健常群）。
・ １０羽のウサギには、シリカを投与をし、２８日目に採取した（治療開始時の罹病レベル）。
・ １０羽のウサギには、シリカを投与し、２８日目にｒｂＢＢ７（１００ｍｇ／ｋｇ）による処理を開始し、５６日目に採取した（治療投与）。
・ １０羽のウサギには、シリカ注入の１日前にｒｂＢＢ７（１００ｍｇ／ｋｇ）による処理を開始し（すなわち－１日目に処理）、５６日目に採取した（予防投与）。
・ ５羽のウサギには、シリカを投与し、シリカ注入の１日前にｒｂ９２２対照抗体（１００ ｍｇ／ｋｇ）による処理を開始し、５６日目に採取した（対照抗体）。
・ ５羽のウサギには、シリカを投与し、シリカ注入の１日前からビヒクルによる処理を開始し、５６日目に採取した（ビヒクル対照）
方法：
ｒｂＢＢ７、ビヒクル又は対照抗体処理による介入試験：
全体的な研究デザイン（図８）は、４５匹の動物（ウサギ）を用い、１０ｍｇのシリカを５６日間にわたって予防的及び治療的に投与するものであった。
・ ５羽のウサギには、生理食塩水を投与し、５６日目に採取した（健常群）。
・ １０羽のウサギには、シリカを投与をし、２８日目に採取した（治療開始時の罹病レベル）。
・ １０羽のウサギには、シリカを投与し、２８日目にｒｂＢＢ７（１００ｍｇ／ｋｇ）による処理を開始し、５６日目に採取した（治療投与）。
・ １０羽のウサギには、シリカ注入の１日前にｒｂＢＢ７（１００ｍｇ／ｋｇ）による処理を開始し（すなわち－１日目に処理）、５６日目に採取した（予防投与）。
・ ５羽のウサギには、シリカを投与し、シリカ注入の１日前にｒｂ９２２対照抗体（１００ ｍｇ／ｋｇ）による処理を開始し、５６日目に採取した（対照抗体）。
・ ５羽のウサギには、シリカを投与し、シリカ注入の１日前からビヒクルによる処理を開始し、５６日目に採取した（ビヒクル対照）
【0080】
この計画により、抗体対照とビヒクル対称を組み合わせて、群間に違いがない場合には１０匹の動物からなる未処理群を形成することができる。ウサギに、ｒｂＢＢ７、ｒｂ９２２対照抗体又はビヒクルを５日ごとに頸部皮下に注射した。注射前にウサギの体重を測定し、１００ｍｇ／ｋｇの投与量が得られるように抗体の注射量を適宜調整した。対照用ビヒクルを投与されたウサギは、抗体を投与された場合の体重と同じ量のビヒクルを投与された。ウサギの飼い始めの平均体重は２．５ｋｇ、５６日後の平均体重は３．２ｋｇであった。
【0081】
薬物動態：
ｒｂＢＢ７で処理中のウサギから５日又は１０日ごとに血液を採取した。最初の採血は最初のｒｂＢＢ７注射の５日後であった。動物のリスクを最小限に抑えるために、各ウサギから最大４回サンプルを採取した。トラフ（最小）曝露値を計算するために、ｒｂＢＢ７の次回の予定された注射の直前に常に採血を実施した。採血は、トラフ（ｔｒｏｕｇｈ）（最小）暴露値を計算するために、ｒｂＢＢ７を次に注射する予定の直前に常に実施した。予防的投与（１日目から、プロットＡ及びＢ）と治療的投与（２６日目から５６日目まで、プロットＣ及びＤ）は、２回に分けて実施したため、個別にプロットした。血液を室温で４５分間凝固させた後、３００×ｇで１５分間遠心分離した。血清をデカントし、－８０℃で凍結保存した。ｒｂＢＢ７は質量分析を用いて血清中で定量した。
ｒｂＢＢ７で処理中のウサギから５日又は１０日ごとに血液を採取した。最初の採血は最初のｒｂＢＢ７注射の５日後であった。動物のリスクを最小限に抑えるために、各ウサギから最大４回サンプルを採取した。トラフ（最小）曝露値を計算するために、ｒｂＢＢ７の次回の予定された注射の直前に常に採血を実施した。採血は、トラフ（ｔｒｏｕｇｈ）（最小）暴露値を計算するために、ｒｂＢＢ７を次に注射する予定の直前に常に実施した。予防的投与（１日目から、プロットＡ及びＢ）と治療的投与（２６日目から５６日目まで、プロットＣ及びＤ）は、２回に分けて実施したため、個別にプロットした。血液を室温で４５分間凝固させた後、３００×ｇで１５分間遠心分離した。血清をデカントし、－８０℃で凍結保存した。ｒｂＢＢ７は質量分析を用いて血清中で定量した。
【0082】
組織処理：
肺は、凍結保護剤として、気管を通してＰＢＳ中の３０％スクロースで膨張させて、切断刃に対する抵抗力を与え、簡単に破れたり潰れたりしないようにした。右下葉はカスタムブロック（ｃｕｓｔｏｍ ｂｌｏｃｋ）に入れ、各厚さ約４ｍｍに５～６分割した。中心片を１０％ホルマリンに２４時間漬け、その後７０％エタノールに移し、組織学的に処理した。
左右（中央と遠位（ｄｉｓｔａｌ））のスライスは、後の解析のために－８０℃で凍結した。
肺は、凍結保護剤として、気管を通してＰＢＳ中の３０％スクロースで膨張させて、切断刃に対する抵抗力を与え、簡単に破れたり潰れたりしないようにした。右下葉はカスタムブロック（ｃｕｓｔｏｍ ｂｌｏｃｋ）に入れ、各厚さ約４ｍｍに５～６分割した。中心片を１０％ホルマリンに２４時間漬け、その後７０％エタノールに移し、組織学的に処理した。
左右（中央と遠位（ｄｉｓｔａｌ））のスライスは、後の解析のために－８０℃で凍結した。
【0083】
組織学と分析：
ホルマリン固定した肺スライスを１枚として処理し、１つの大きなパラフィンブロックに包埋した。切片を切り出し、Ｈ＆Ｅ、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ（ＰＳＲ）で染色し、Ｏｌｙｍｐｕｓ又はＺｅｉｓｓのスライドスキャナーで画像化した。コラーゲンの定量化のために、ＰＳＲの全スライド画像をＤｅｆｉｎｉｅｎｓ Ｔｉｓｓｕｅ ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを用いて多相分析処理した。このソフトウェアにより、細胞密度と非染色空胞の消失に基づいて、「病変（ｌｅｓｉｏｎ）」と非病変（ｎｏｎ－ｌｅｓｉｏｎ）／非影響実質細胞（ｕｎａｆｆｅｃｔｅｄ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ））領域を識別するアルゴリズムを実行した。次に、病変及び非病変領域のコラーゲン（明赤色に染色された線維）を、全領域面積に対する割合として定量した。同じパラフィン切片の分析を、多光子顕微鏡／第二高調波発生（ＳＨＧ）を用いて繰り返し、Ｇｅｎｅｓｉｓ ２００スキャナーを用いてコラーゲンを定量化した。ＳＨＧ顕微鏡は２光子（２Ｐ）顕微鏡の一種で、外来性ラベルなしで線維性コラーゲンを検出することができる。線維形成コラーゲンは、コラーゲンタイプ１－３、５、１１、２４及び２７を含む。Ｉ、ＩＩＩ及びＶ型等のこれらの線維性コラーゲンのいくつかは、肺線維症の主要な担い手である（Ｋｏｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）。
ホルマリン固定した肺スライスを１枚として処理し、１つの大きなパラフィンブロックに包埋した。切片を切り出し、Ｈ＆Ｅ、Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ、Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄ（ＰＳＲ）で染色し、Ｏｌｙｍｐｕｓ又はＺｅｉｓｓのスライドスキャナーで画像化した。コラーゲンの定量化のために、ＰＳＲの全スライド画像をＤｅｆｉｎｉｅｎｓ Ｔｉｓｓｕｅ ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを用いて多相分析処理した。このソフトウェアにより、細胞密度と非染色空胞の消失に基づいて、「病変（ｌｅｓｉｏｎ）」と非病変（ｎｏｎ－ｌｅｓｉｏｎ）／非影響実質細胞（ｕｎａｆｆｅｃｔｅｄ ｐａｒｅｎｃｈｙｍａ））領域を識別するアルゴリズムを実行した。次に、病変及び非病変領域のコラーゲン（明赤色に染色された線維）を、全領域面積に対する割合として定量した。同じパラフィン切片の分析を、多光子顕微鏡／第二高調波発生（ＳＨＧ）を用いて繰り返し、Ｇｅｎｅｓｉｓ ２００スキャナーを用いてコラーゲンを定量化した。ＳＨＧ顕微鏡は２光子（２Ｐ）顕微鏡の一種で、外来性ラベルなしで線維性コラーゲンを検出することができる。線維形成コラーゲンは、コラーゲンタイプ１－３、５、１１、２４及び２７を含む。Ｉ、ＩＩＩ及びＶ型等のこれらの線維性コラーゲンのいくつかは、肺線維症の主要な担い手である（Ｋｏｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１５）。
【0084】
ＴＧ２抗原及び活性の免疫組織化学：
ＴＧ２抗原は、標準的なプロトコルに従って、肺組織の凍結スライス（採取時に３０％スクロースで膨潤させ、その後スナップ冷凍した）を免疫染色することにより検出した。トランスアミダーゼ（架橋）活性は、既述のようにビオチン化カダベリンの組み込みを使用したトランスグルタミナーゼｉｎ ｓｉｔｕ活性（ＴＧ ＩＳＡ）評価法を用いて、肺組織の凍結スライスで測定した。肺を膨潤するためにスクロースを使用すると、この評価が妨害され、スクロースを除去するために必要な余分な洗浄サイクルが、測定されたＴＧ活性をかなり低下させた。絶対的なＴＧ２活性は、スクロースを使用しない同様の実験よりも低いにもかかわらず、すべての組織が同じように処理されたため、群間の相対的な差は同じであるはずである。
ＴＧ２抗原は、標準的なプロトコルに従って、肺組織の凍結スライス（採取時に３０％スクロースで膨潤させ、その後スナップ冷凍した）を免疫染色することにより検出した。トランスアミダーゼ（架橋）活性は、既述のようにビオチン化カダベリンの組み込みを使用したトランスグルタミナーゼｉｎ ｓｉｔｕ活性（ＴＧ ＩＳＡ）評価法を用いて、肺組織の凍結スライスで測定した。肺を膨潤するためにスクロースを使用すると、この評価が妨害され、スクロースを除去するために必要な余分な洗浄サイクルが、測定されたＴＧ活性をかなり低下させた。絶対的なＴＧ２活性は、スクロースを使用しない同様の実験よりも低いにもかかわらず、すべての組織が同じように処理されたため、群間の相対的な差は同じであるはずである。
【0085】
結果：
ＲｂＢＢ７を用いた介入試験：
４５匹中４３匹が実験レジメンを成功裏に完了した（２匹のウサギは最初のシリカ注入中に死亡したが、これは麻酔の影響によるものと思われる）。ｒｂＢＢ７を投与したウサギに有害な影響は見られなかった。対照ウサギと同程度の体重増加を示し（データは示さず）、治療用抗体の反復注射に関連した身体的問題は生じなかった。
ＲｂＢＢ７を用いた介入試験：
４５匹中４３匹が実験レジメンを成功裏に完了した（２匹のウサギは最初のシリカ注入中に死亡したが、これは麻酔の影響によるものと思われる）。ｒｂＢＢ７を投与したウサギに有害な影響は見られなかった。対照ウサギと同程度の体重増加を示し（データは示さず）、治療用抗体の反復注射に関連した身体的問題は生じなかった。
【0086】
薬物動態（図９）：
最初のｒｂＢＢ７注射の５日後（シリカ投与後４日目、トラフＰＫのための最初のサンプル）、血清レベルは平均３９５μｇ／ｍｌであった。次のサンプリングポイント（１９日目）までに、ｒｂＢＢ７レベルは７００μｇ／ｍｌの領域にあり、平均６００～７００μｇ／ｍｌの定常状態を維持した（トラフで前回の注射から５日後に測定した場合）。アレルギー反応及び抗抗体反応の発現を示唆するような、５６日間にわたる抗体レベルの有意な低下は見られなかった。このレベルはウサギのモデルで治療効果が期待できる。動物へのストレスを軽減するため、サンプリングはすべての治療後に行わなかった。
最初のｒｂＢＢ７注射の５日後（シリカ投与後４日目、トラフＰＫのための最初のサンプル）、血清レベルは平均３９５μｇ／ｍｌであった。次のサンプリングポイント（１９日目）までに、ｒｂＢＢ７レベルは７００μｇ／ｍｌの領域にあり、平均６００～７００μｇ／ｍｌの定常状態を維持した（トラフで前回の注射から５日後に測定した場合）。アレルギー反応及び抗抗体反応の発現を示唆するような、５６日間にわたる抗体レベルの有意な低下は見られなかった。このレベルはウサギのモデルで治療効果が期待できる。動物へのストレスを軽減するため、サンプリングはすべての治療後に行わなかった。
【0087】
線維症の組織学的分析（図１０）：
Ｈ＆Ｅ又はＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄで染色したウサギの肺切片は、シリカ処理ウサギにおける線維症の存在を示している（写真は示していない）。線維化の程度を定量化するために、ＰＳＲ染色切片に対してＤｅｆｉｎｉｅｎｓ画像解析を行った。このソフトは、コラーゲン（赤）染色を、病変領域だけでなく肺葉全体も（すなわち正常実質組織又は非病変領域プラス病変領域）定量化した（写真は示していない）。葉全体の染色を見ると、２８日目まではＰＳＲ染色に明確な変化はなかったが、２８日目から５６日目の間に平均３５％増加した（図１０Ａ）。ｒｂＢＢ７はコラーゲン量を減少させる有意な治療効果を示した。葉全体の染色を見ると、コラーゲンの増加は保護的及び治療的投与群の両方で５０％減少したが、これは保護的レジメンでのみ有意になった。病変だけのコラーゲンＰＳＲ染色の評価でも、２８日目と５６日目の間のコラーゲンの９２％増加が顕著に減少し、治療群と保護群でそれぞれ５８％と４８％の有意な減少を示した（図１０Ｂ）。
Ｈ＆Ｅ又はＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ ｒｅｄで染色したウサギの肺切片は、シリカ処理ウサギにおける線維症の存在を示している（写真は示していない）。線維化の程度を定量化するために、ＰＳＲ染色切片に対してＤｅｆｉｎｉｅｎｓ画像解析を行った。このソフトは、コラーゲン（赤）染色を、病変領域だけでなく肺葉全体も（すなわち正常実質組織又は非病変領域プラス病変領域）定量化した（写真は示していない）。葉全体の染色を見ると、２８日目まではＰＳＲ染色に明確な変化はなかったが、２８日目から５６日目の間に平均３５％増加した（図１０Ａ）。ｒｂＢＢ７はコラーゲン量を減少させる有意な治療効果を示した。葉全体の染色を見ると、コラーゲンの増加は保護的及び治療的投与群の両方で５０％減少したが、これは保護的レジメンでのみ有意になった。病変だけのコラーゲンＰＳＲ染色の評価でも、２８日目と５６日目の間のコラーゲンの９２％増加が顕著に減少し、治療群と保護群でそれぞれ５８％と４８％の有意な減少を示した（図１０Ｂ）。
【0088】
第二高調波発生（ＳＨＧ）顕微鏡によるコラーゲン含量の分析（図１１）：
ＳＨＧを用いて、シリカ処理葉の総繊維状コラーゲンを検出した。ウサギの肺組織切片をスキャンし、コラーゲンを定量化した。ＳＨＧは、シリカ注入後２８日目にはコラーゲンの増加を検出しなかったが、これはコラーゲンがＳＨＧで検出できるほど成熟していないことを反映しているのかもしれない。しかし、検出可能な線維性コラーゲンのレベルは、シリカ注入後２８日目から５６日目の間に２倍以上に増加した。ｒｂＢＢ７により処理をすると、早期及び遅期の処理群ともにコラーゲンの蓄積が著しく減少した。ＳＨＧ検出可能コラーゲンの平均レベルをベースラインとすると、両処理群で５２％の減少がみられたが、有意差に達したのは保護的処理群のみであった。
ＳＨＧを用いて、シリカ処理葉の総繊維状コラーゲンを検出した。ウサギの肺組織切片をスキャンし、コラーゲンを定量化した。ＳＨＧは、シリカ注入後２８日目にはコラーゲンの増加を検出しなかったが、これはコラーゲンがＳＨＧで検出できるほど成熟していないことを反映しているのかもしれない。しかし、検出可能な線維性コラーゲンのレベルは、シリカ注入後２８日目から５６日目の間に２倍以上に増加した。ｒｂＢＢ７により処理をすると、早期及び遅期の処理群ともにコラーゲンの蓄積が著しく減少した。ＳＨＧ検出可能コラーゲンの平均レベルをベースラインとすると、両処理群で５２％の減少がみられたが、有意差に達したのは保護的処理群のみであった。
【0089】
ＴＧ２活性の変化（図１２）：
凍結肺切片の１枚から凍結切片を作製し、ＴＧ２抗原と活性を測定した。ＴＧ２抗原レベルは、シリカの注入によって変化せず、ｒｂＢＢ７処理によって影響を受けなかった（図１２Ａ）。肺を膨張させるための液体にスクロースを使用し、ＴＧ ＩＳＡ評価を著しく損なうにもかかわらず、ＴＧ活性は、シリカ注入後２８日目及び５６日目の両方で、シリカ処理により２．３倍に有意に増加した。ＲｂＢＢ７はどちらのシリカ群でもＴＧ２活性を低下させた（図１２Ｂ）。治療的投与群における４５％の減少は有意ではなかったが（変動が大きかったためと思われる）、保護的投与群における８５％の減少は有意であり、正常肺のレベルと同程度であった。
凍結肺切片の１枚から凍結切片を作製し、ＴＧ２抗原と活性を測定した。ＴＧ２抗原レベルは、シリカの注入によって変化せず、ｒｂＢＢ７処理によって影響を受けなかった（図１２Ａ）。肺を膨張させるための液体にスクロースを使用し、ＴＧ ＩＳＡ評価を著しく損なうにもかかわらず、ＴＧ活性は、シリカ注入後２８日目及び５６日目の両方で、シリカ処理により２．３倍に有意に増加した。ＲｂＢＢ７はどちらのシリカ群でもＴＧ２活性を低下させた（図１２Ｂ）。治療的投与群における４５％の減少は有意ではなかったが（変動が大きかったためと思われる）、保護的投与群における８５％の減少は有意であり、正常肺のレベルと同程度であった。
【0090】
実施例４の結論：
この実施例の驚くべき発見は、１）早期の予防的処理（シリカ注入の前日から５日ごとに投与する治療）と遅期の処理（シリカ注入の２８日後から５日ごとに投与する治療）の両方が組織学的線維化の抑制に有効であったこと、２）細胞外ＴＧ２のみを標的とすることができる抗体阻害剤として、（マウスモデルの）全ＴＧ２ノックアウトと同様に動物を線維化から保護することができたことであり、肺線維化が主に細胞外ＴＧ２活性に起因することを示している。線維化の減少は、肺組織のコラーゲンを分析する２つの方法（ＰＳＲ染色とＳＨＧ顕微鏡検査）により独立して確認した。抗ＴＧ２抗体は、凍結肺切片で検出されたＴＧ２酵素活性もブロックした。言い換えれば、抗ＴＧ２抗体（ＴＧ２の細胞外タンパク質架橋活性を阻害する）は、珪肺症モデルのウサギに予防的に投与すると肺線維症を有意に抑制し、肺のリモデリング開始２８日後から投与すると線維症のさらなる進行を阻止することができた。
この実施例の驚くべき発見は、１）早期の予防的処理（シリカ注入の前日から５日ごとに投与する治療）と遅期の処理（シリカ注入の２８日後から５日ごとに投与する治療）の両方が組織学的線維化の抑制に有効であったこと、２）細胞外ＴＧ２のみを標的とすることができる抗体阻害剤として、（マウスモデルの）全ＴＧ２ノックアウトと同様に動物を線維化から保護することができたことであり、肺線維化が主に細胞外ＴＧ２活性に起因することを示している。線維化の減少は、肺組織のコラーゲンを分析する２つの方法（ＰＳＲ染色とＳＨＧ顕微鏡検査）により独立して確認した。抗ＴＧ２抗体は、凍結肺切片で検出されたＴＧ２酵素活性もブロックした。言い換えれば、抗ＴＧ２抗体（ＴＧ２の細胞外タンパク質架橋活性を阻害する）は、珪肺症モデルのウサギに予防的に投与すると肺線維症を有意に抑制し、肺のリモデリング開始２８日後から投与すると線維症のさらなる進行を阻止することができた。
【0091】
実施例５－ＴＧ２はＣＯＶＩＤ－１９感染でアップレギュレートされる
方法：
ヒト組織：
肺組織サンプルは、Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．から入手した。ＣＯＶＩＤ－１９感染で死亡した患者２２人のサンプルと、正常肺及びＩＰＦ患者の組織サンプル６つとを分析した。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む既知の肺疾患を有する患者は除外した。
組織サンプルの調製：
ホルマリン固定したパラフィン包埋ヒトサンプルを連続切片化し、トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）のｍＲＮＡ発現を評価するために染色を実施した。
ＴＧ２ｍＲＮＡ（ＲＮＡｓｃｏｐｅ）：
実施例１で詳述したものと同様のプロトコルを使用した。
方法：
ヒト組織：
肺組織サンプルは、Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．から入手した。ＣＯＶＩＤ－１９感染で死亡した患者２２人のサンプルと、正常肺及びＩＰＦ患者の組織サンプル６つとを分析した。慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含む既知の肺疾患を有する患者は除外した。
組織サンプルの調製：
ホルマリン固定したパラフィン包埋ヒトサンプルを連続切片化し、トランスグルタミナーゼ２型（ＴＧ２）のｍＲＮＡ発現を評価するために染色を実施した。
ＴＧ２ｍＲＮＡ（ＲＮＡｓｃｏｐｅ）：
実施例１で詳述したものと同様のプロトコルを使用した。
【0092】
結果：
図１３及び図１４に示すように、ＴＧ２ｍＲＮＡ発現は、正常肺組織における発現と比較して、ＣＯＶＩＤ－１９で死亡した患者から得られた死後組織サンプルにおいて有意に上昇した（Ｐ＜０．０５）。ＩＰＦのサンプルは、参考としてのみ含む。この高発現は、広範なマトリックス沈着の証拠（ピクロシルスレッド染色－データは示さず）を伴う。
図１３及び図１４に示すように、ＴＧ２ｍＲＮＡ発現は、正常肺組織における発現と比較して、ＣＯＶＩＤ－１９で死亡した患者から得られた死後組織サンプルにおいて有意に上昇した（Ｐ＜０．０５）。ＩＰＦのサンプルは、参考としてのみ含む。この高発現は、広範なマトリックス沈着の証拠（ピクロシルスレッド染色－データは示さず）を伴う。
【0093】
実施例５の結論：
重症のＳＡＲＳ－ｃｏｖ２ウイルス感染で起こる肺組織の炎症反応とリモデリングの間に、ＴＧ２がＣＯＶＩＤ－１９感染で死亡した患者の死後肺サンプルの大部分で非常に高発現することが本発明者らによって示された。抗ＴＧ２抗体、例えば、Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂは、急性期だけでなく、ＣＯＶＩＤ疾患の長期慢性期においてもリモデリングを遅らせることができると期待されている。
重症のＳＡＲＳ－ｃｏｖ２ウイルス感染で起こる肺組織の炎症反応とリモデリングの間に、ＴＧ２がＣＯＶＩＤ－１９感染で死亡した患者の死後肺サンプルの大部分で非常に高発現することが本発明者らによって示された。抗ＴＧ２抗体、例えば、Ｚａｍｐｉｌｉｍａｂは、急性期だけでなく、ＣＯＶＩＤ疾患の長期慢性期においてもリモデリングを遅らせることができると期待されている。
【0094】
参考文献：
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２）Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０２０，３ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１０：２８７
３）国際公開第２００６／１００６７９号
４）国際公開第２０１２／１４６９０１号
５）国際公開第２０１３／１７５２２９号
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７）Ｏｌｓｅｎ ２０２０，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，２０１：Ａ１９６３
８）Ｐｈｉｌｐ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５８（５）：５９４－６０３
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１０）Ｒａｇｈｕ，２０１７，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｖ．２０１７；２６：１７００７１
１１）Ｖａｉｄｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２４：１－２０
１２）Ｍａｒｇａｒｉｔｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃｏｒｅ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ，１１：１１－２２
１３）国際公開第２０１５／１９７７７２号
１４）Ｋｏｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｒｅｓｐ．Ｒｅｓ．，１６：６１
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９）Ｏｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５０（４）：７３７－７４７
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１１）Ｖａｉｄｙａ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２４：１－２０
１２）Ｍａｒｇａｒｉｔｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃｏｒｅ Ｅｖｉｄｅｎｃｅ，１１：１１－２２
１３）国際公開第２０１５／１９７７７２号
１４）Ｋｏｔｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｒｅｓｐ．Ｒｅｓ．，１６：６１
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6E】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】