2024-540756 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

2024-540756酵素固定化担体及びその製造方法、固定化酵素及びその製造方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-01

(54)【発明の名称】酵素固定化担体及びその製造方法、固定化酵素及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

C12N 11/082 20200101AFI20241025BHJP

【ＦＩ】

C12N11/082

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024529623

(86)(22)【出願日】2021-11-19

(85)【翻訳文提出日】2024-05-16

(86)【国際出願番号】 CN2021131878

(87)【国際公開番号】W WO2023087270

(87)【国際公開日】2023-05-25

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524186833

【氏名又は名称】▲遼▼▲寧▼▲凱▼菜英医▲薬▼化学有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100158920

【弁理士】

【氏名又は名称】上野英樹

(72)【発明者】

【氏名】洪浩

(72)【発明者】

【氏名】ジェイムズ，ゲイジ

(72)【発明者】

【氏名】肖毅

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼ 娜

(72)【発明者】

【氏名】ヴィヤーサ，ウィリアムズ

(72)【発明者】

【氏名】▲趙▼ 佳▲東▼

(72)【発明者】

【氏名】潘 ▲竜▼

(72)【発明者】

【氏名】▲馬▼ 利▲騰▼

(72)【発明者】

【氏名】崔瑜霞

【テーマコード（参考）】

4B033

【Ｆターム（参考）】

4B033NA22

4B033NB04

4B033NB15

4B033NB34

4B033NB62

4B033NC03

4B033NC12

4B033ND02

4B033ND12

4B033NF01

4B033NF02

4B033NG09

4B033NH09

(57)【要約】

酵素固定化担体及びその製造方法、固定化酵素及びその製造方法を提供する。当該酵素固定化担体は、樹脂球マトリックスと、化学結合によって樹脂球マトリックスにリンクされた－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基と、配位作用によって－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基にキレートして吸着された金属イオンとを含み、ただし、樹脂球マトリックスは、アミノ型メタクリル樹脂及び／又はエポキシ型メタクリル樹脂であり、樹脂球マトリックスの粒径は、２００～７００μｍである。これにより、酵素固定化担体の酵素に対する適合性は悪く、固定化効果は悪く、且つ固定化酵素の活性は悪く、繰り返し使用する過程で安定性は悪いという従来技術の課題を解決している。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

樹脂球マトリックスと、化学結合によって前記樹脂球マトリックスにリンクされた－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基と、配位作用によって前記－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基にキレートして吸着された金属イオンとを含み、ただし、前記樹脂球マトリックスは、アミノ型メタクリル樹脂又はエポキシ型メタクリル樹脂であり、前記樹脂球マトリックスの粒径は、２００μｍ～７００μｍであることを特徴とする酵素固定化担体。

【請求項2】

前記アミノ型メタクリル樹脂が、Ｃ_２の長さ又はＣ_６の長さの炭素鎖アームであるるアミノ官能基を有し、且つアミノ基の含有量が、３０μｍｏｌ／ｇ～８０μｍｏｌ／ｇであり、
好ましくは、前記アミノ型メタクリル樹脂が、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＨＡ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＰＮ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－ＥＰＨＡ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＡ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８３０９、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８４０９、ＥＳＲ－１、ＥＳＲ－３又はＥＳＱ－１のうちの１種又は複数種であり、より好ましくは、前記アミノ型メタクリル樹脂が、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＨＡ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＰＮ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－ＥＰＨＡ又はＬｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８３０９のうちの１種又は複数種であり、
好ましくは、前記エポキシ型メタクリル樹脂のエポキシ当量が、２μｍｏｌ／ｇ～５μｍｏｌ／ｇであり、より好ましくは、前記エポキシ型メタクリル樹脂が、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＰ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０３Ｂ、ＥＰ２００、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０７Ｂ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＳＷ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＳＤ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０９ｓ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＨＦＡ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２８５、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２０４、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２０９、ＥＳ－１、ＥＳ１０３、ＥＳ－１０１、ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＨＦＡ４０３又はＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＣ－ＨＦＡのうちの１種又は複数種であり、より好ましくは、前記エポキシ型メタクリル樹脂が、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＰ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０９ｓ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＨＦＡ又はＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＣ－ＨＦＡのうちの１種又は複数種であり、
好ましくは、前記金属イオンが、ニッケルイオン、鉄イオン、銅イオン又はコバルトイオンであることを特徴とする請求項１に記載の酵素固定化担体。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の酵素固定化担体と、それに固定された酵素とを含むことを特徴とする固定化酵素。

【請求項4】

前記酵素は、アミノ基転移酵素、ケト還元酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、一原子酸素添加酵素、アルケン還元酵素、イミン還元酵素及びアミノ酸脱水素酵素から選ばれるいずれか１種又は複数種であり、ただし、
前記アミノ基転移酵素は、クロモバクテリウム・ビオラセウム（ＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍＤＳＭ３０１９１）に由来するアミノ基転移酵素、又はアルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｃｉｔｒｅｕｓ）に由来するアミノ基転移酵素、又は放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に由来するアミノ基転移酵素、又はＳｃｉｓｃｉｏｎｅｌｌａｓｐ．ＳＥ３１に由来するアミノ基転移酵素であり、
前記ケト還元酵素は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＣＣＴＣＣＭ２０９０６１に由来するカルボニル還元酵素、又はスポロボロマイセス・サルモニカラー（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）に由来するケト還元酵素であり、
前記アルコール脱水素酵素は、サーモアナエロバクター・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍｂｒｏｃｋｉｉ）に由来するアルコール脱水素酵素であり、
前記ギ酸脱水素酵素は、カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ）に由来するギ酸脱水素酵素であり、
前記グルコース脱水素酵素は、リシニバチルス・スフェリカスＧ１０（ＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓＧ１０）に由来するグルコース脱水素酵素であり、
前記一原子酸素添加酵素は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｐｈｉ１に由来するシクロヘキサノン一原子酸素添加酵素、又はロドコッカス・ルーバー－ＳＤ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ－ＳＤ１）に由来するシクロヘキサノン一原子酸素添加酵素、又はブラキモナス・ペトロレオボランス（Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓｐｅｔｒｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）に由来するシクロヘキサノン一原子酸素添加酵素であり、
前記アルケン還元酵素は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するアルケン還元酵素、又はＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＣＡ４９に由来するアルケン還元酵素であり、
前記イミン還元酵素は、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）に由来するイミン還元酵素、又はバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）に由来するイミン還元酵素であり、
前記アミノ酸脱水素酵素は、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）に由来するロイシン脱水素酵素、又はバチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）に由来するフェニルアラニン脱水素酵素、又はサーモアクチノマイセス・インターメディウスＡＴＣＣ３３２０５（ＴｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＡＴＣＣ３３２０５）に由来するアミノ酸脱水素酵素、又はサーモシントロファ・リポリティカ（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｔｒｏｐｈａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に由来するアミノ酸脱水素酵素であることを特徴とする請求項３に記載の固定化酵素。

【請求項5】

請求項１又は２に記載の酵素固定化担体の製造方法であって、
樹脂球マトリックスを提供するステップと、
前記樹脂球マトリックスにおいて化学結合によって－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせるステップと、
前記－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基において配位作用によって金属イオンをキレートして吸着させて、前記酵素固定化担体を得るステップとを含み、
前記樹脂球マトリックスは、アミノ型メタクリル樹脂又はエポキシ型メタクリル樹脂であり、前記樹脂球マトリックスの粒径は、２００μｍ～７００μｍであることを特徴とする酵素固定化担体の製造方法。

【請求項6】

前記樹脂球マトリックスがアミノ型メタクリル樹脂である場合には、前記アミノ型メタクリル樹脂とクロロ酢酸ナトリウムを混合して、求核置換反応を行うことにより、前記アミノ型メタクリル樹脂に前記－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせることを特徴とする請求項５に記載の酵素固定化担体の製造方法。

【請求項7】

前記アミノ型メタクリル樹脂と前記クロロ酢酸ナトリウムの水溶液を２０℃～２５℃で３０分間～６０分間撹拌した後に、１ｍｏｌ／Ｌ～２ｍｏｌ／Ｌのアルカリ性の水溶液で反応系のｐＨを９～１０に調整し、次に、温度を７０℃～８０℃に上げて、Ｎ_２雰囲気で２０時間～３０時間反応させることにより、前記アミノ型メタクリル樹脂に前記－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせ、
好ましくは、前記アルカリ性の水溶液が、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム溶液又は水酸化リチウム溶液であることを特徴とする請求項６に記載の酵素固定化担体の製造方法。

【請求項8】

前記樹脂球マトリックスがエポキシ型メタクリル樹脂である場合には、前記エポキシ型メタクリル樹脂とイミノ二酢酸二ナトリウムを混合して、付加反応を行うことにより、前記エポキシ型メタクリル樹脂に前記－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせることを特徴とする請求項５に記載の酵素固定化担体の製造方法。

【請求項9】

前記エポキシ型メタクリル樹脂と前記イミノ二酢酸二ナトリウムの水溶液を２０℃～２５℃で３０分間～６０分間撹拌した後に、温度を６０℃～７０℃に上げて、Ｎ_２雰囲気下で１８時間～２４時間反応させることにより、前記エポキシ型メタクリル樹脂に前記－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせることを特徴とする請求項８に記載の酵素固定化担体の製造方法。

【請求項10】

前記樹脂球マトリックスにおいて化学結合によって前記－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせるステップの後に、反応系に金属塩溶液を加えて、錯化反応を行うことにより、前記－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基において配位作用によって前記金属イオンをキレートして吸着させて、前記酵素固定化担体を得て、
好ましくは、前記錯化反応の過程で、反応温度が２０℃～３０℃であり、反応時間が１時間～４時間であり、
好ましくは、前記金属塩溶液が、塩化ニッケル水溶液、硫酸銅水溶液、塩化第一鉄水溶液又は塩化コバルト水溶液であり、
好ましくは、前記金属塩溶液における金属イオンと前記樹脂球マトリックスの質量比が（０．０５～０．１）：１であることを特徴とする請求項５～９のいずれか一項に記載の酵素固定化担体の製造方法。

【請求項11】

前記クロロ酢酸ナトリウムと前記アミノ型メタクリル樹脂の質量比は、（５～１０）：１であることを特徴とする請求項６に記載の酵素固定化担体の製造方法。

【請求項12】

前記イミノ二酢酸二ナトリウムと前記エポキシ型メタクリル樹脂の質量比は、（５～１０）：１であることを特徴とする請求項８に記載の酵素固定化担体の製造方法。

【請求項13】

請求項３又は４に記載の固定化酵素の製造方法であって、
請求項１又は２に記載の酵素固定化担体と酵素に対して固定化反応を行わせて、前記固定化酵素を得るステップを含むことを特徴とする固定化酵素の製造方法。

【請求項14】

前記固定化酵素の製造方法が、
前記酵素固定化担体を第１溶媒に分散させて分散液を形成させることであって、前記第１溶媒は、リン酸緩衝液、塩化ナトリウム水溶液及びイミダゾール緩衝液の混合溶液であるステップと、
前記分散液と、前記酵素を含む酵素液を反応させることにより、前記酵素と前記酵素固定化担体に対して前記固定化反応を行わせて、前記固定化酵素を得るステップとを含むことを特徴とする請求項１３に記載の固定化酵素の製造方法。

【請求項15】

前記第１溶媒において、前記リン酸緩衝液の濃度は、０．１ｍｏｌ／Ｌ～０．２ｍｏｌ／Ｌであり、前記塩化ナトリウム水溶液の濃度は、０．５ｍｏｌ／Ｌ～１ｍｏｌ／Ｌであり、前記イミダゾール緩衝液の濃度は、０．０５ｍｏｌ／Ｌ～０．１ｍｏｌ／Ｌであることを特徴とする請求項１４に記載の固定化酵素の製造方法。

【請求項16】

前記分散液と前記酵素液が反応する過程において、反応温度は２０℃～２５℃であり、反応時間は１６時間～２４時間であり；好ましくは、１ｇの前記酵素固定化担体が４ｍＬ～８ｍＬの前記酵素液と反応し、且つ前記酵素液中のタンパク質含有量が２０ｍｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬであることを特徴とする請求項１４に記載の固定化酵素の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体触媒の分野に関し、具体的に言えば、酵素固定化担体及びその製造方法、固定化酵素及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生体触媒は、既に薬物のグリーン合成の重要な部分となっており、薬物の構造単位及び中間体の触媒合成で最もフューチャーと応用を有する技術の１つであり、特に、キラル合成のために独特で置き換えにくい方法を提供している。産業的プロセスでは酵素が触媒として用いられることが益々増えているが、酵素の使用条件の穏やかさとそれ自身の変わりやすさにより、酵素には非常に厳しい環境要件を要し、且つリサイクルしにくいため、酵素の産業における使用が大幅に制限されている。固定化酵素技術の開発及び使用はこれらの課題を効果的に解決できるため、よく「生体触媒」と呼ばれる固定化酵素は産業的な有機合成及び生体内変換で幅広く用いられている。

【0003】

酵素の固定化方法は、物理的方法及び化学的方法の２つに大別できる。物理的方法は、主に吸着法及び包埋法を含み、化学的方法は、主に結合法及び架橋法を含む。吸着法は、非共有結合法とも呼ばれ、主に水素結合、ファンデルワールス力、疏水的相互作用、イオン結合などの非共有結合性相互作用によって酵素と吸着媒体を結合させる固定化法である。よく用いられる無機吸着材としては、シリカゲル、酸化アルミニウム、多孔質ガラス、珪藻土などがあり、よく用いられる有機吸着材は、主に、天然のアルギン酸塩、キチン、キトサン、セルロース、デンプンを含み、合成有機材料としては、ポリウレタン、マクロ孔質樹脂などがある。包埋法は、遊離酵素を特定のゲルなどの媒体の孔隙に包埋して固定させることであり、例えば、ポリアクリルアミド、アルギン酸カルシウムなどのゲル媒体を用いる包埋である。包埋法は、より簡単であり、且つ包埋された酵素のタンパク質構造が基本的に変わらず、酵素活性の損失も比較的小さいが、酵素成分の漏洩、酵素の不活化などの欠点がある。結合法は、即ち、共有結合による固定化であり、担体材料の有効な官能基と酵素関連官能基（例えば、アミノ基、カルボキシ基、チオール基、ヒドロキシ基などの酵素タンパク質の側鎖基）との間の反応によって互いに結合することである。共有結合による固定化によって酵素と担体との間の結合がより強くなり、このような酵素と担体との間で生じる強い化学結合は酵素の流失を著しく緩和させ、酵素の再利用率を向上させることができる。しかし、当該方法は条件が厳しく、反応が激しく、酵素活性の損失が大きい（一般的には酵素活性の残存率は３０％程度である）。架橋法とは、二官能性又は多官能性試薬（架橋試薬）によって酵素分子の間で、酵素分子と担体との間で架橋反応を行って、共有結合を形成することにより酵素の固定化を行う方法を指す。よく用いられる架橋試薬としては、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンジアミン、無水シス－２－ブテン二酸、ビスアゾベンゼンなどがある。架橋剤を利用して酵素を架橋させて形成される担体なし酵素凝集体（ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄｅｎｚｙｍｅａｇｇｒｅｇａｔｅｓ、ＣＬＥＡ）についての研究が多く、例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼのＣＬＥＡ固定化及びスクロースホスホリラーゼのＣＬＥＡ固定化である。以上から分かるように、上記の伝統的な酵素の固定化方法には欠点が少なからずあり、例えば、吸着固定化された酵素は流失しやすく、包埋固定化された後の酵素の基質及び生成物は拡散しにくく、共有結合法は、酵素の不活化を引き起こしやすく、架橋酵素の機械的特性は悪いなどである。

【0004】

しかし、市販されるアフィニティー樹脂は、多くがタンパク質精製樹脂であり、そのマトリックスは一般的にセルロース、架橋グルカン、アガロース、ポリアクリルアミド、多孔質ガラスビーズなどであり、そのうちアガロースゲルの方が最も幅広く使用されている。例えば、金属キレートアフィニティー樹脂は粒子サイズが小さく、大規模な使用とリサイクルが難しく、且つ粒子は高いせん断力で壊れやすいため、伝統的な撹拌タンク反応モードでは使用しにくい。また、その樹脂マトリックスは非常に親水性があり保存条件に対する要求が高く、アルコール溶液で保存し、且つ乾燥も極力避ける必要があるため、固定化酵素として用いることが不適切である。また、その高いコストから固定化酵素の産業的な使用で大きく影響されてしまっている。

【0005】

したがって、酵素に対する適合性がより良く、固定化効果がより良い新規な酵素固定化担体を提供する必要がある。また、化学反応における固定化酵素の使用では、酵素の活性がより多く保持されており、且つ繰り返し使用する過程で安定性が高い。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の主な目的は、酵素固定化担体及びその製造方法、固定化酵素及びその製造方法を提供することにより、酵素固定化担体の酵素に対する適合性が悪く、固定化効果が悪く、且つ固定化酵素の活性が悪く、繰り返し使用する過程で安定性が悪いという従来技術の課題を解決することである。

【課題を解決するための手段】

【0007】

上記の目的を達成するため、本発明の一態様によれば、酵素固定化担体が提供され、酵素固定化担体は、樹脂球マトリックスと、化学結合によって樹脂球マトリックスにリンクされた－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基と、配位作用によって－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基にキレートして吸着された金属イオンとを含み、ただし、樹脂球マトリックスは、アミノ型メタクリル樹脂又はエポキシ型メタクリル樹脂であり、樹脂球マトリックスの粒径は、２００～７００μｍである。

【0008】

さらに、アミノ型メタクリル樹脂では、アミノ型メタクリル樹脂が、Ｃ_２の長さ又はＣ_６の長さの炭素鎖アームであるアミノ官能基を有し、且つアミノ基の含有量が、３０～８０μｍｏｌ／ｇであり；好ましくは、アミノ型メタクリル樹脂が、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＨＡ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＰＮ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－ＥＰＨＡ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＡ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８３０９、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８４０９、ＥＳＲ－１、ＥＳＲ－３又はＥＳＱ－１のうちの１種又は複数種であり；より好ましくは、アミノ型メタクリル樹脂が、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＨＡ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＰＮ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－ＥＰＨＡ又はＬｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８３０９のうちの１種又は複数種であり；好ましくは、エポキシ型メタクリル樹脂のエポキシ当量が、２～５μｍｏｌ／ｇであり；より好ましくは、エポキシ型メタクリル樹脂が、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＰ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０３Ｂ、ＥＰ２００、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０７Ｂ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＳＷ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＳＤ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０９ｓ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＨＦＡ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２８５、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２０４、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２０９、ＥＳ－１、ＥＳ１０３、ＥＳ－１０１、ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＨＦＡ４０３又はＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＣ－ＨＦＡのうちの１種又は複数種であり；より好ましくは、エポキシ型メタクリル樹脂が、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＰ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０９ｓ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＨＦＡ又はＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＣ－ＨＦＡのうちの１種又は複数種であり；好ましくは、金属イオンが、ニッケルイオン、鉄イオン、銅イオン又はコバルトイオンである。

【0009】

上記の目的を達成するため、本発明の一態様によれば、固定化酵素が提供され、固定化酵素は、上記の酵素固定化担体と、それに固定された酵素とを含む。

【0010】

さらに、酵素は、アミノ基転移酵素、ケト還元酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、一原子酸素添加酵素、アルケン還元酵素、イミン還元酵素及びアミノ酸脱水素酵素から選ばれいずれか１種又は複数種であり、ただし、アミノ基転移酵素は、クロモバクテリウム・ビオラセウムＤＳＭ３０１９１（ＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍＤＳＭ３０１９１）に由来するアミノ基転移酵素、又はアルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｃｉｔｒｅｕｓ）に由来するアミノ基転移酵素、又は放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に由来するアミノ基転移酵素、又はＳｃｉｓｃｉｏｎｅｌｌａｓｐ．ＳＥ３１に由来するアミノ基転移酵素であり；ケト還元酵素は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＣＣＴＣＣＭ２０９０６１に由来するカルボニル還元酵素、又はスポロボロマイセス・サルモニカラー（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）に由来するケト還元酵素であり；アルコール脱水素酵素は、サーモアナエロバクター・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍｂｒｏｃｋｉｉ）に由来するアルコール脱水素酵素であり；ギ酸脱水素酵素は、カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ）に由来するギ酸脱水素酵素であり；グルコース脱水素酵素は、リシニバチルス・スフェリカスＧ１０（ＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓＧ１０）に由来するグルコース脱水素酵素であり；一原子酸素添加酵素は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｐｈｉ１に由来するシクロヘキサノン一原子酸素添加酵素、又はロドコッカス・ルーバー－ＳＤ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ－ＳＤ１）に由来するシクロヘキサノン一原子酸素添加酵素、又はブラキモナス・ペトロレオボランス（Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓｐｅｔｒｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）に由来するシクロヘキサノン一原子酸素添加酵素であり；アルケン還元酵素は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するアルケン還元酵素、又はＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＣＡ４９に由来するアルケン還元酵素であり；イミン還元酵素は、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）に由来するイミン還元酵素、又はバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）に由来するイミン還元酵素であり；アミノ酸脱水素酵素は、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）に由来するロイシン脱水素酵素、又はバチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）に由来するフェニルアラニン脱水素酵素、又はサーモアクチノマイセス・インターメディウスＡＴＣＣ３３２０５（ＴｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＡＴＣＣ３３２０５）に由来するアミノ酸脱水素酵素、又はサーモシントロファ・リポリティカ（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｔｒｏｐｈａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に由来するアミノ酸脱水素酵素である。

【0011】

本発明の別の態様によれば、樹脂球マトリックスを提供するステップと、樹脂球マトリックスにおいて化学結合によって－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせるステップと、－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基において配位作用によって金属イオンを吸着させて、酵素固定化担体を得るステップとを含み、ただし、樹脂球マトリックスは、アミノ型メタクリル樹脂又はエポキシ型メタクリル樹脂であり、樹脂球マトリックスの粒径は、２００～７００μｍである、上記の酵素固定化担体の製造方法が提供される。

【0012】

さらに、樹脂球マトリックスがアミノ型メタクリル樹脂である場合には、アミノ型メタクリル樹脂とクロロ酢酸ナトリウムを混合して、求核置換反応を行うことにより、アミノ型メタクリル樹脂に－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせる。

【0013】

さらに、アミノ型メタクリル樹脂とクロロ酢酸ナトリウムの水溶液を２０～２５℃で３０～６０分間撹拌した後、１～２ｍｏｌ／Ｌのアルカリ性の水溶液で反応系のｐＨを９～１０に調整し、次に、温度を７０～８０℃に上げて、Ｎ_２雰囲気下で２０～３０時間反応させることにより、アミノ型メタクリル樹脂に－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせ；好ましくは、アルカリ性の水溶液が、炭酸ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウム溶液又は水酸化リチウム溶液である。

【0014】

さらに、樹脂球マトリックスがエポキシ型メタクリル樹脂である場合には、エポキシ型メタクリル樹脂とイミノ二酢酸二ナトリウムを混合して、付加反応を行うことにより、エポキシ型メタクリル樹脂に－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせる。

【0015】

さらに、エポキシ型メタクリル樹脂とイミノ二酢酸二ナトリウムの水溶液を２０～２５℃で３０～６０分間撹拌した後、温度を６０～７０℃に上げて、Ｎ_２雰囲気下で１８～２４時間反応させることにより、エポキシ型メタクリル樹脂に－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせる。

【0016】

さらに、樹脂球マトリックスにおいて化学結合によって－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせるステップの後に、反応系に金属塩溶液を加えて、錯化反応を行うことにより、－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基に配位作用によって金属イオンを吸着させて、酵素固定化担体を得て；好ましくは、錯化反応の過程で、反応温度が２０～３０℃であり、反応時間が１～４時間であり；好ましくは、金属塩溶液が、塩化ニッケル水溶液、硫酸銅水溶液、塩化第一鉄水溶液又は塩化コバルト水溶液であり；好ましくは、金属塩溶液における金属イオンと樹脂球マトリックスの質量比が（０．０５～０．１）：１である。

【0017】

さらに、クロロ酢酸ナトリウムとアミノ型メタクリル樹脂の質量比は、（５～１０）：１である。

【0018】

さらに、イミノ二酢酸二ナトリウムとエポキシ型メタクリル樹脂の質量比は、（５～１０）：１である。

【0019】

本発明の別の態様によれば、上記の酵素固定化担体と酵素に対して固定化反応を行わせて、固定化酵素を得るステップを含む、上記の固定化酵素の製造方法が提供される。

【0020】

さらに、固定化酵素の製造方法は、酵素固定化担体を第１溶媒に分散させて分散液を形成させることであって、第１溶媒は、リン酸緩衝液、塩化ナトリウム水溶液及びイミダゾール緩衝液の混合溶液であるステップと、分散液と、酵素を含む酵素液を反応させることにより、酵素と酵素固定化担体に対して固定化反応を行わせて、固定化酵素を得るステップとを含む。

【0021】

さらに、第１溶媒において、リン酸緩衝液の濃度は、０．１～０．２ｍｏｌ／Ｌであり；塩化ナトリウム水溶液の濃度は、０．５～１ｍｏｌ／Ｌであり；イミダゾール緩衝液の濃度は、０．０５～０．１ｍｏｌ／Ｌである。

【0022】

さらに、分散液と酵素液が反応する過程で、反応温度は２０～２５℃であり、反応時間は１６～２４時間であり；好ましくは、１ｇの酵素固定化担体が４～８ｍＬの酵素液と反応し、且つ酵素液中のタンパク質含有量が２０～２５ｍｇ／ｍＬである。

【発明の効果】

【0023】

本発明の上記の担体は、アミノ型メタクリル樹脂又はエポキシ型メタクリル樹脂を樹脂球マトリックスとし、化学結合によって樹脂球マトリックスに－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基が接続されており、金属イオンは配位作用によって－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基に吸着して接続されている。当該担体を使用すると、第一に、その樹脂球マトリックスの粒径（２００～７００μｍ）は伝統的なアフィニティー樹脂（２０～８０μｍ）よりも大きく、リサイクル性がより良い。また、通常のアフィニティー樹脂と比べてその機械的強度はより高く、高いせん断力で樹脂球マトリックスが破砕する問題が避けられ、そして伝統的な撹拌タンク反応モードでは、固定化酵素の使用寿命がより長く、リサイクル性がより良い。第二に、それによって構成された含窒素ジ酢酸基、金属イオンの金属キレートアフィニティー構造は一般的な共有結合担体と比べて、担体がタンパク質末端のＨｉｓタグとしか結合しないため、酵素に対する適合性はより良く、固定化と同時に酵素活性を最大限に保持することができ、且つ酵素を繰り返し使用する場合の安定性はより高い。また、上記のタイプの樹脂は、コストがより低い。これにより、本発明の上記の担体は、酵素に対する適合性がより良く、固定化効果がより良く、且つ固定化と同時に酵素の活性を最大限に保持することができる。さらに、これを用いて固定化して得られた固定化酵素は、その活性がより良く、繰り返し使用する過程で安定性がより高く、産業的な固定化酵素への使用により好適である。これにより、本発明は、酵素固定化担体の酵素に対する適合性が悪く、固定化効果が悪く、且つ固定化酵素の活性が悪く、繰り返し使用する過程で安定性が悪いという従来技術の課題を効果的に解決している。

【発明を実施するための形態】

【0024】

なお、矛盾がない限り、本願の実施例及び実施例の特徴を互いに組み合わせてもよい。以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明する。

【0025】

背景技術の部分で述べたように、従来技術には、酵素固定化担体の酵素に対する適合性が悪く、固定化効果が悪く、且つ固定化酵素の活性が悪く、繰り返し使用する過程で安定性が悪いという課題がある。

【0026】

本発明は、上記の課題を解決するために、酵素固定化担体を提供し、酵素固定化担体は、樹脂球マトリックスと、化学結合によって樹脂球マトリックスにリンクされた－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基と、配位作用によって－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基にキレートして吸着された金属イオンとを含み、ただし、樹脂球マトリックスは、アミノ型メタクリル樹脂又はエポキシ型メタクリル樹脂であり、樹脂球マトリックスの粒径は、２００～７００μｍである。

【0027】

本発明の上記の担体は、アミノ型メタクリル樹脂又はエポキシ型メタクリル樹脂を樹脂球マトリックスとし、化学結合によって樹脂球マトリックスに－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基が接続されており、金属イオンは配位作用によって－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基に吸着して接続されている。当該担体を使用すると、後の酵素固定化反応の過程で、酵素末端のＨｉｓタグは配位作用によって金属イオンに吸着することができる。具体的には、－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基が金属イオンと配位結合を形成するが、－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基は金属イオンの配位部位の全てを占拠せず、Ｈｉｓタグを持っている酵素は引き続き金属イオンの残っており占拠されていない配位部位を占拠して、配位作用によって担体と固定化酵素を形成する。共有結合と比べると、その結合の過程では主体である酵素と担体とで化学反応が起きているため、主体である酵素が破壊され、且つその固定化酵素の剛性が強くなって、酵素活性が低いことを引き起こす。これと違って、本発明では酵素末端のＨｉｓタグが担体中の金属イオンと配位結合する形態を採用しているため、担体と主体である酵素が反応して接触することはないため、酵素活性の損失はより小さい。

【0028】

特に、本発明の上記の樹脂球マトリックスは、アミノ型メタクリル樹脂及び／又はエポキシ型メタクリル樹脂である。これにより、第一に、その樹脂球マトリックスの粒子は伝統的なアフィニティー樹脂よりも大きく、リサイクル性がより良い。また、その機械的強度はより高く、高いせん断力で樹脂球マトリックスが破砕する問題が避けられ、そして伝統的な撹拌タンク反応モードでは、固定化酵素の使用寿命がより長く、リサイクル性がより良い。第二に、それによって構成された担体は、酵素に対する適合性がより良く、固定化と同時に酵素活性を最大限に保持することができ、且つ酵素を繰り返し使用する場合の安定性はより高い。また、上記のタイプの樹脂は、コストがより低い。これにより、本発明の上記の担体は、酵素に対する適合性がより良く、固定化効果がより良く、且つ固定化と同時に酵素の活性を最大限に保持することができる。さらに、これを用いて固定化して得られた固定化酵素は、その活性がより良く、繰り返し使用する過程で安定性がより高く、産業的な固定化酵素への使用により好適である。

【0029】

要するに、本発明は、酵素固定化担体の酵素に対する適合性が悪く、固定化効果が悪く、且つ固定化酵素の活性が悪く、繰り返し使用する過程で安定性が悪いという従来技術の課題を効果的に解決している。

【0030】

好ましくは、アミノ型メタクリル樹脂が、Ｃ_２の長さ又はＣ_６の長さの炭素鎖アームであるアミノ官能基を有し、且つアミノ基の含有量が、３０～８０μｍｏｌ／ｇであり；好ましくは、アミノ型メタクリル樹脂が、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＨＡ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＰＮ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－ＥＰＨＡ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＡ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８３０９、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８４０９、ＥＳＲ－１、ＥＳＲ－３又はＥＳＱ－１のうちの１種又は複数種であり；より好ましくは、アミノ型メタクリル樹脂が、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＨＡ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＰＮ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－ＥＰＨＡ又はＬｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８３０９のうちの１種又は複数種であり；

【0031】

好ましくは、エポキシ型メタクリル樹脂のエポキシ当量が、２～５μｍｏｌ／ｇであり；より好ましくは、エポキシ型メタクリル樹脂が、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＰ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０３Ｂ、ＥＰ２００、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０７Ｂ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＳＷ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＳＤ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０９ｓ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＨＦＡ、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２８５、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２０４、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ（商標）ＥＣＲ８２０９、ＥＳ－１、ＥＳ１０３、ＥＳ－１０１、ＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＨＦＡ４０３又はＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＣ－ＨＦＡのうちの１種又は複数種であり；より好ましくは、エポキシ型メタクリル樹脂が、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＥＰ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０９ｓ、Ｓｅｐｌｉｔｅ（登録商標）ＬＸ－１０００ＨＦＡ又はＲｅｌｉＺｙｍｅ（商標）ＥＣ－ＨＦＡのうちの１種又は複数種である。

【0032】

樹脂球マトリックスは上記のタイプから選ばれ、一方では、その機械的強度がより高く、粒子が伝統的なアフィニティー樹脂よりも大きく、コストがより安いため、より大規模に使用しやすくなり、産業的生産の将来性は明るい。他方では、それによって構成された担体は、酵素に対する適合性がより良く、固定化と同時に酵素活性を最大限に保持することができ、且つ酵素を繰り返し使用する場合の安定性はより高い。上記の樹脂の提供元は、以下のとおりである。

【表1】

【0033】

酵素と担体の結合の安定性を一層向上させるために、好ましくは、金属イオンが、ニッケルイオン、鉄イオン、銅イオン又はコバルトイオンであり；より好ましくは、金属イオンが、ニッケルイオン、銅イオン又はコバルトイオンである。

【0034】

本発明は、また、固定化酵素を提供し、固定化酵素は、上記の酵素固定化担体と、それに固定された酵素とを含む。

【0035】

前述した各理由から、本発明の上記の担体は、酵素に対する適合性がより良く、固定化効果がより良く、且つ固定化と同時に酵素の活性を最大限に保持することができる。さらに、これを用いて固定化して得られた固定化酵素は、その活性がより良く、繰り返し使用する過程で安定性がより高く、産業的な固定化酵素への使用により好適である。

【0036】

本発明の固定化酵素は、酵素に幅広い適合性があり、酵素は、例えば、アミノ基転移酵素、ケト還元酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、一原子酸素添加酵素、アルケン還元酵素、イミン還元酵素及びアミノ酸脱水素酵素のうちのいずれか１種又は複数種を含むがこれらに限られず、なお、次の酵素に対してより好適である。アミノ基転移酵素は、クロモバクテリウム・ビオラセウムＤＳＭ３０１９１（ＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｏｌａｃｅｕｍＤＳＭ３０１９１）に由来するアミノ基転移酵素、又はアルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｃｉｔｒｅｕｓ）に由来するアミノ基転移酵素、又は放線菌門（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）に由来するアミノ基転移酵素、又はＳｃｉｓｃｉｏｎｅｌｌａｓｐ．ＳＥ３１に由来するアミノ基転移酵素であり；ケト還元酵素は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＣＣＴＣＣＭ２０９０６１に由来するカルボニル還元酵素、又はスポロボロマイセス・サルモニカラー（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）に由来するケト還元酵素であり；アルコール脱水素酵素は、サーモアナエロバクター・ブロッキイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍｂｒｏｃｋｉｉ）に由来するアルコール脱水素酵素であり；ギ酸脱水素酵素は、カンジダ・ボイジニ（Ｃａｎｄｉｄａｂｏｉｄｉｎｉｉ）に由来するギ酸脱水素酵素であり；グルコース脱水素酵素は、リシニバチルス・スフェリカスＧ１０（ＬｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓＧ１０）に由来するグルコース脱水素酵素であり；一原子酸素添加酵素は、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．Ｐｈｉ１に由来するシクロヘキサノン一原子酸素添加酵素、又はロドコッカス・ルーバー－ＳＤ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｒｕｂｅｒ－ＳＤ１）に由来するシクロヘキサノン一原子酸素添加酵素、又はブラキモナス・ペトロレオボランス（Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓｐｅｔｒｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）に由来するシクロヘキサノン一原子酸素添加酵素であり；アルケン還元酵素は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するアルケン還元酵素、又はＣｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．ＣＡ４９に由来するアルケン還元酵素であり；イミン還元酵素は、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ．）に由来するイミン還元酵素、又はバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）に由来するイミン還元酵素であり；アミノ酸脱水素酵素は、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）に由来するロイシン脱水素酵素、又はバチルス・スファエリクス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）に由来するフェニルアラニン脱水素酵素、又はサーモアクチノマイセス・インターメディウスＡＴＣＣ３３２０５（ＴｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＡＴＣＣ３３２０５）に由来するアミノ酸脱水素酵素、又はサーモシントロファ・リポリティカ（Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｔｒｏｐｈａｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に由来するアミノ酸脱水素酵素である。本発明の上記の酵素の酵素番号、提供元及び酵素の配列情報は、以下のとおりである。

【表2】

【0037】

なお、上記の酵素配列はいずれも従来技術で開示されている酵素であり、本発明は上記の酵素を用いて本発明の酵素固定化担体の性能を検証するだけである。

【0038】

固定化酵素の活性及び繰り返し使用する場合の安定性を一層向上させるために、より好ましくは、酵素がアミノ基転移酵素である場合には、マトリックス樹脂が、ＬＸ－１０００ＨＡ、ＬＸ－１０００ＥＰＮ、ＬＸ－ＥＰＨＡ又はＬＸ－１０９ｓのうちの１種又は複数種であり；酵素がギ酸脱水素酵素である場合には、マトリックス樹脂が、ＬＸ－１０００ＥＰＮ、ＬＸ－１０９ｓ、ＬＸ－１０００ＨＦＡ、ＥＣＲ８２８５又はＥＣ－ＨＦＡのうちの１種又は複数種であり；酵素がケト還元酵素である場合には、マトリックス樹脂が、ＬＸ－１０９ｓ、ＬＸ－ＥＰＨＡ、ＥＣＲ８２８５、ＬＸ－１０００ＨＡ又はＥＣＲ８４０９のうちの１種又は複数種であり；酵素が一原子酸素添加酵素である場合には、マトリックス樹脂が、ＬＸ－１０９ｓ、ＬＸ－ＥＰＨＡ又はＬＸ－１０００ＨＡのうちの１種又は複数種であり；酵素がイミン還元酵素である場合には、マトリックス樹脂が、ＬＸ－１０９ｓ及び／又はＬＸ－ＥＰＨＡであり；酵素がアミノ酸脱水素酵素、アルコール脱水素酵素又はアルケン還元酵素である場合には、マトリックス樹脂が、ＬＸ－１０９ｓ、ＬＸ－１０００ＥＰＮ、ＬＸ－ＥＰＨＡ又はＬＸ－１０００ＨＡのうちの１種又は複数種である。

【0039】

本発明は、また、樹脂球マトリックスを提供するステップと、樹脂球マトリックスにおいて化学結合によって－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせるステップと、－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基において配位作用によって金属イオンを吸着させて、酵素固定化担体を得るステップとを含む、上記の酵素固定化担体の製造方法を提供する。

【0040】

【0041】

一つの好ましい実施形態では、樹脂球マトリックスがアミノ型メタクリル樹脂である場合には、アミノ型メタクリル樹脂とクロロ酢酸ナトリウムを混合して、求核置換反応を行うことにより、アミノ型メタクリル樹脂に－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせる。より好ましくは、アミノ型メタクリル樹脂とクロロ酢酸ナトリウムの水溶液を室温で３０～６０分間撹拌した後、１～２ｍｏｌ／Ｌのアルカリ性の水溶液で反応系のｐＨを９～１０に調整し、次に、温度を７０～８０℃に上げて、Ｎ_２雰囲気下で２０～３０時間反応させることにより、アミノ型メタクリル樹脂に－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせ；好ましくは、アルカリ性の水溶液が炭酸ナトリウム水溶液、希水酸化ナトリウム溶液又は水酸化リチウム溶液である。これにより、本発明は、アミノ型メタクリル樹脂球マトリックスの転化率がより高く、且つ反応の過程がより穏やかである。

【0042】

一つの好ましい実施形態では、樹脂球マトリックスがエポキシ型メタクリル樹脂である場合には、エポキシ型メタクリル樹脂とイミノ二酢酸二ナトリウムを混合して、付加反応を行うことにより、エポキシ型メタクリル樹脂に－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせる。より好ましくは、エポキシ型メタクリル樹脂とイミノ二酢酸二ナトリウムの水溶液を２０～２５℃で３０～６０分間撹拌した後に、温度を６０～７０℃に上げて、Ｎ_２雰囲気下で１８～２４時間反応させることによりエポキシ型メタクリル樹脂に－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせる。これにより、本発明は、エポキシ型メタクリル樹脂球マトリックスの転化率がより高く、且つ反応の過程がより穏やかである。

【0043】

一つの好ましい実施形態では、樹脂球マトリックスにおいて化学結合によって－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基をリンクさせるステップの後に、反応系に金属塩溶液を加えて、錯化反応を行うことにより、－Ｎ（ＣＨ_２ＣＯＯＨ）_２基に配位作用によって金属イオンを吸着させて、酵素固定化担体を得る。好ましくは、錯化反応の過程で、反応温度が２～３０℃であり、反応時間が１～４時間であり；金属塩溶液は、塩化ニッケル、硫酸銅、塩化第一鉄、塩化コバルトなどである。これにより、反応条件はより適切であり、反応して得られた酵素固定化担体は収率がより高く、純度がより高い。より好ましくは、金属塩溶液における金属イオンと樹脂球マトリックスの質量比が（０．０５～０．１）：１である。

【0044】

アミノ型マトリックス樹脂の転化率を一層向上させるために、好ましくは、クロロ酢酸ナトリウムとアミノ型メタクリル樹脂の質量比が（５～１０）：１である。

【0045】

エポキシ型マトリックス樹脂の転化を一層向上させるために、好ましくは、イミノ二酢酸二ナトリウムとエポキシ型メタクリル樹脂の質量比が（５～１０）：１である。

【0046】

本発明は、また、上記の酵素固定化担体と酵素に対して固定化反応を行わせて、固定化酵素を得るステップを含む、上記の固定化酵素の製造方法を提供する。

【0047】

【0048】

好ましくは、固定化酵素の製造方法が、酵素固定化担体を第１溶媒に分散させて分散液を形成させることであって、第１溶媒は、リン酸緩衝液、塩化ナトリウム水溶液及びイミダゾール緩衝液の混合溶液であるステップと、分散液と、酵素を含む酵素液を反応させることにより、酵素と酵素固定化担体に対して固定化反応を行わせて、固定化酵素を得るステップとを含む。第１溶媒は、固定化のためのより穏やかで適切な環境を作っており、酵素の活性を保護し、酵素の固定化効果を強化させ、酵素液中の非標的タンパク質が固定されることを防ぐことができる。これにより、上記の担体の酵素に対する適合性を一層向上させており、且つ酵素の固定化効果はより良く、活性はより良い。

【0049】

固定化酵素の活性及び繰り返し使用する場合の安定性を一層向上させるために、好ましくは、第１溶媒で、リン酸緩衝液の濃度が０．１～０．２ｍｏｌ／Ｌであり；好ましくは、塩化ナトリウム水溶液の濃度が０．５～１ｍｏｌ／Ｌであり；好ましくは、イミダゾール緩衝液の濃度が０．０５～０．１ｍｏｌ／Ｌである。

【0050】

反応の過程における安定性を向上させるとともに、反応効率を向上させるために、好ましくは、分散液と酵素液が反応する過程で、反応温度が２０～２５℃であり、反応時間が１６～２４時間である。より好ましくは、１ｇの酵素固定化担体が４～８ｍＬの酵素液に対応し、且つ酵素液中のタンパク質含有量が２０～２５ｍｇ／ｍＬである。これは、酵素がより充分に固定されることを促進し、負荷能力を提供し、固定化酵素に、より高い触媒活性を持たせるために役立つ。

【0051】

以下、特定の実施例を用いて本願を一層詳細に記述し、これらの実施例を本願の主張する保護範囲に対する制限と理解することができない。

【0052】

（実施例１）
酵素固定化担体におけるアミノ基転移酵素の固定化及び使用
アミノ型メタクリル樹脂を樹脂球マトリックスとする酵素固定化担体の製造：
５ｇのアミノ型メタクリル樹脂球マトリックスを取り出して、２５０ｍＬの四つ口フラスコに加え、７５ｍＬの脱イオン水及び２２．５ｇのクロロ酢酸ナトリウムを加え、室温下１２０ｒｐｍで機械的に撹拌して、担体を均一に分散させ、３０分間撹拌した後に、１ＭのＮａ_２ＣＯ_３溶液でｐＨを９～１０に調整し、次に、温度を７０℃に上げてＮ_２保護下で２０時間反応させた（途中でｐＨを複数回調整して、ｐＨを９～１０に維持させた）。反応終了後に、系を室温に冷却して中性になるまで水で洗浄した。系から液体を除去して、修飾後の担体を脱イオン水で２回洗浄し、１００ｍＬの５ｍｏｌ／ＬＮｉＣｌ水溶液を加えて、３時間撹拌し、金属イオン系を除去して、脱イオン水で２回洗浄した。

【0053】

エポキシ型メタクリル樹脂を樹脂球マトリックスとする酵素固定化担体の製造：
５ｇのエポキシ型メタクリル樹脂球マトリックスを取り出して、２５０ｍＬの四つ口フラスコに加え、７５ｍＬの２Ｍイミノ二酢酸二ナトリウム水和物溶液を加え、室温下１２０ｒｐｍで機械的に撹拌して、担体を均一に分散させ、３０分間撹拌した後、次に、温度を６０℃に上げてＮ_２保護下で１８時間反応させた。反応終了後に、室温に冷却して中性になるまで水で洗浄した。系から液体を除去して、修飾後の担体を脱イオン水で２回洗浄し、１００ｍＬの５ｍｍｏｌ／ＬＮｉＣｌ水溶液を加えて、３時間撹拌し、金属イオン系を除去して、脱イオン水で２回洗浄した。

【0054】

アミノ型メタクリル樹脂を樹脂球マトリックスとする酵素固定化担体におけるアミノ基転移酵素の固定化：
１ｇの上記の酵素固定化担体を秤量して０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．５ＭのＮａＣｌ及び０．０５Ｍのイミダゾール緩衝液で複数回洗浄し、緩衝液を除去して、担体を保持して使用する。次に、４ｍＬの酵素溶液を加え（タンパク質含有量が２０～２５ｍｇ／ｍＬになるよう、０．２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．８ＭのＮａＣｌ及び０．０５Ｍのイミダゾール緩衝液で酵素溶液を調製し、補因子ＰＬＰが入っている）、２０℃で１６～２４時間インキュベートして、緩衝液を除去した。０．５ＭのＮａＣｌを含有する２０Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）及び０．０５Ｍのイミダゾール緩衝液で３回洗浄し、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．５ＭのＮａＣｌ緩衝液で１回洗浄し、緩衝液を除去して、固定化酵素を保持して使用する。

【0055】

エポキシ型メタクリル樹脂を樹脂球マトリックスとする酵素固定化担体におけるアミノ基転移酵素の固定化：
エポキシ型メタクリル樹脂におけるアミノ基転移酵素の固定化であって、１ｇのエポキシ型樹脂を秤量して０．２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．８ＭのＮａＣｌ緩衝液で複数回洗浄し、緩衝液を除去して、樹脂を保持して使用する。次に、０．２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．８ＭのＮａＣｌ緩衝液及び０．１ｇの酵素粉末で調製された４ｍＬの酵素溶液を加え（補因子のピリドキサールリン酸ＰＬＰが入っている）、２０℃で３６～４８時間インキュベートして、緩衝液を除去した。０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．５ＭのＮａＣｌ緩衝液で３回洗浄し、緩衝液を除去して、固定化酵素を保持して使用する。

【0056】

アミノ型メタクリル樹脂におけるアミノ基転移酵素の固定化であって、１ｇのアミノ型樹脂を秤量して０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で複数回洗浄し、緩衝液を除去して、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び最終濃度が２％であるグルタルアルデヒド溶液を加えた。次に、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．１ｇの酵素粉末で調製された４ｍＬの酵素液を加え（補因子ＰＬＰが入っている）、２０℃で１６～２４時間インキュベートして、緩衝液を除去した。０．５ＭのＮａＣｌを含有する２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で３回洗浄し、緩衝液を除去して、固定化酵素を保持して使用する。

【0057】

従来技術によるアフィニティークロマトグラフィー樹脂の市販品におけるアミノ基転移酵素の固定化：

【表3】

１ｇのバイオ・ラッドＩＭＡＣ－Ｎｉ又はピュロライトＭＩＤＡ－Ｎｉ固定化担体を秤量して０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．５ＭのＮａＣｌ及び０．０５Ｍのイミダゾール緩衝液で複数回洗浄し、緩衝液を除去して、担体を保持して使用する。次に、４ｍＬの酵素溶液を加え（タンパク質含有量が２０～２５ｍｇ／ｍＬになるよう、０．２Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．８ＭのＮａＣｌ及び０．０５Ｍのイミダゾール緩衝液で酵素溶液を調製し、補因子ＰＬＰが入っている）、２０℃で１６～２４時間インキュベートして、緩衝液を除去した。０．５ＭのＮａＣｌを含有する２０Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）及び０．０５Ｍのイミダゾール緩衝液で３回洗浄し、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び０．５ＭのＮａＣｌ緩衝液で１回洗浄し、緩衝液を除去して、固定化酵素を保持して使用する。

【0058】

固定化されたアミノ基転移酵素の活性及び繰り返し使用試験：
（一）

【化1】

【0059】

１０ｍＬの反応フラスコに、０．１ｇの主原料１を加え、４ｅｑのイソプロピルアミン塩酸塩及び１ｍｇのＰＬＰを加え、反応液の最終体積が１ｍＬになるよう、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を補足し、さらに０．０１ｇの酵素粉末、又は０．０１ｇの酵素粉末で製造された固定化酵素を加え、３０℃で１６～２０時間撹拌した。転化率を測定し、１回の反応終了後毎に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用することで、繰り返し使用回数を検討する。系に対してＨＰＬＣで転化率を検出し、反応データは、表１のとおりである。

【表4】

【0060】

（二）：

【化2】

【0061】

１０ｍＬの反応フラスコに、０．０５ｇのＤＭＳＯを加え、０．０３ｇの主原料２を溶解して、３ｅｑのイソプロピルアミン塩酸塩及び１ｍｇのＰＬＰを加え、反応液の最終体積が１ｍＬになるよう、０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を補足し、さらに０．０１ｇの酵素粉末、又は０．０１ｇの酵素粉末で製造された固定化酵素を加え、３０℃で１６～２０時間撹拌した。転化率を測定し、１回の反応終了後毎に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用することで、繰り返し使用回数を検討する。系に対してＨＰＬＣで転化率を検出し、反応データは、表２のとおりである。

【表5】

【0062】

（実施例２）
酵素固定化担体におけるギ酸脱水素酵素の固定化及び使用
実施例１との違いは、アミノ基転移酵素をギ酸脱水素酵素と同じ質量置き換え、補因子を同じ質量のＮＡＤ^＋と置き換えることだけであった。

【0063】

固定化されたＦＤＨの活性及び繰り返し使用試験：

【化3】

【0064】

５０ｍＬの反応フラスコに、５ｍＬの０．１ＭＴｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０～９．０）を加え、１００ｍｇの主原料３を溶解し、１０８ｍｇの塩化アンモニウム、８０ｍｇのアンモニウム塩を加えて、ｐＨを７．５～８．０に調整し、次に、１０ｍｇのＮＡＤ^＋、１００ｍｇのＡＡＤＨ－Ｂｃ遊離酵素及び５ｍｇのＦＤＨ酵素粉末又は５ｍｇの酵素粉末で製造された固定化ＦＤＨを加えた。３０℃で１６～２０時間撹拌した。１回の反応終了後毎に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用することで、繰り返し使用回数を検討する。系に対してＨＰＬＣで転化率を検出し、反応データは、表３のとおりである。

【表6】

【0065】

（実施例３）
酵素固定化担体におけるケト還元酵素の固定化及び使用
実施例１との違いは、アミノ基転移酵素をケト還元酵素と等量で置き換え、補因子を同じ質量のＮＡＤ^＋と置き換えることだけであった。

【0066】

固定化されたケト還元酵素の活性及び繰り返し使用試験：

【化4】

【化5】

【0067】

１０ｍＬの反応フラスコに、０．５ｍＬのイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）を加え、０．１ｇの原料４又は５を溶解し、０．５ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及び１０ｍｇのＮＡＤ^＋を加え、さらに１０ｍｇの酵素粉末又は１０ｍｇの酵素粉末で製造された固定化酵素を加え、３０℃で１６～２０時間撹拌した。１回の反応終了後毎に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用することで、繰り返し使用回数を検討する。反応データは、表４のとおりである。

【表7】

【0068】

（実施例４）
酵素固定化担体における一原子酸素添加酵素の固定化及び使用
実施例１との違いは、アミノ基転移酵素を一原子酸素添加酵素と等量で置き換え、補因子を同じ質量のＮＡＤＰ^＋と置き換えることだけであった。

【0069】

固定化された一原子酸素添加酵素の活性及び繰り返し使用試験：

【化6】

【0070】

１０ｍＬの反応フラスコに０．３ｍＬのイソプロピルアルコールを加え、そして１００ｍｇの基質６、５ｍｇのＮＡＤＰ^＋、３ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、次に２ｍｇのアルコール脱水素酵素ＡＤＨ－Ｔｂ遊離酵素及び２０ｍｇのシクロヘキサノン一原子酸素添加酵素遊離酵素又は２２ｍｇの遊離酵素で製造された固定化酵素を加えた。３０℃で１６～２０時間反応させて、転化率を測定し、１回の反応終了後毎に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用することで、繰り返し使用回数を検討する。系に対してガスクロマトグラフィーで転化率を検出し、反応データは、表５のとおりである。

【表8】

【0071】

（実施例５）
アフィニティー修飾後のアミノ型及びエポキシ型メタクリル樹脂におけるイミン還元酵素の固定化及び使用
実施例１との違いは、アミノ基転移酵素をイミン還元酵素と等量で置き換え、補因子を同じ質量のＮＡＤ^＋と置き換えることだけであった。

【0072】

固定化されたイミン還元酵素の活性及び繰り返し使用試験：

【化7】

【0073】

２ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０～８．０）を１０ｍＬの球形反応器に加え、次に１００ｍｇの上記の基質７、１０ｍｇのＮＡＤ^＋、６０ｍｇのギ酸アンモニウム、１０ｍｇのＦＤＨ及び１０ｍｇのＩＲＥＤ遊離酵素又は１０ｍｇの遊離酵素で製造された固定化ＩＲＥＤ酵素又は１０ｍｇのＦＤＨ及び１０ｍｇのＩＲＥＤ遊離酵素で製造された共固定化酵素を加えた。３０℃で２０時間反応させた後に、転化率を検出し、１回の反応終了後毎に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用することで、繰り返し使用回数を検討する。系に対してＨＰＬＣで転化率を検出し、測定結果は、表６のとおりである。

【表9】

【0074】

（実施例６）
アフィニティー修飾後のアミノ型及びエポキシ型メタクリル樹脂におけるＧＤＨの固定化及び使用
実施例１との違いは、アミノ基転移酵素をグルタミン酸脱水素酵素と等量で置き換え、補因子を同じ質量のＮＡＤＰ^＋と置き換えることだけであった。

【0075】

固定化されたＧＤＨの活性及び繰り返し使用試験：

【化8】

【0076】

１０ｍＬの反応フラスコに、０．１２５ｍＬのメタノールを加え、０．２５ｇの主原料８、４ｅｑのグルコース及び１ｍｇのＮＡＤＰ^＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を溶解し、反応液の最終体積が２ｍＬになるよう、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を補足し、さらに０．３ｇのＡＤＨ－Ｔｂ酵素粉末及び１０ｍｇのＧＤＨ酵素粉末又は１０ｍｇのＧＤＨ酵素粉末で製造された固定化酵素を加え、３５℃で２０時間撹拌した。１回の反応終了後毎に固定化酵素を分離して、次回の反応に投入して繰り返し使用することで、繰り返し使用回数を検討する。系に対してＨＰＬＣで転化率を検出し、反応データは、表７のとおりである。

【表10】

【0077】

（実施例７）
アフィニティー修飾後のアミノ型及びエポキシ型メタクリル樹脂におけるアルコール脱水素酵素の固定化及び使用
実施例１との違いは、アミノ基転移酵素をアルコール脱水素酵素と等量で置き換え、補因子を同じ質量のＮＡＤＰ^＋と置き換えることだけであった。

【0078】

固定化されたアルコール脱水素酵素の活性及び繰り返し使用試験：

【化9】

【0079】

１０ｍＬの反応フラスコに、０．１２５ｍＬのメタノールを加え、０．２５ｇの主原料８を溶解して、４ｅｑのグルコース及び１ｍｇのＮＡＤＰ^＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）を加え、反応液の最終体積が２ｍＬになるよう、０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）を補足し、さらに１０ｍｇのＧＤＨ酵素粉末及び０．３ｇのＡＤＨ酵素粉末又は０．３ｇのＡＤＨ酵素粉末で製造された固定化酵素又は０．３ｇのＡＤＨ及び１０ｍｇのＧＤＨ酵素粉末で製造された固定化酵素を加え、３５℃で２０時間撹拌した。１回の反応終了後毎に固定化酵素を分離して、次回の反応に投入して繰り返し使用することで、繰り返し使用回数を検討する。系に対してＨＰＬＣで転化率を検出し、反応データは、表８のとおりである。

【表11】

【0080】

（実施例８）
アフィニティー修飾後のアミノ型及びエポキシ型メタクリル樹脂におけるアルケン還元酵素の固定化及び使用
実施例１との違いは、アミノ基転移酵素をアルケン還元酵素と等量で置き換え、補因子を同じ質量のＮＡＤ（Ｐ）^＋と置き換えることだけであった。

【0081】

固定化されたアルケン還元酵素の活性及び繰り返し使用試験：

【化10】

【0082】

３ｍＬの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、次に、１００ｍｇの基質９を加え、続いて１０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）^＋、８０ｍｇのギ酸アンモニウム、２ｍｇのＦＤＨ及び１０ｍｇのＥＲＥＤ遊離酵素又は１０ｍｇのＥＲＥＤ遊離酵素で製造された固定化酵素又は２ｍｇのＦＤＨ及び１０ｍｇのＥＲＥＤ遊離酵素で製造された固定化酵素を加えた。３０℃で１６～２０時間反応させて、転化率を測定し、１回の反応終了後毎に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用することで、繰り返し使用回数を検討する。系に対してガスクロマトグラフィーで転化率を検出し、反応データは、表９のとおりである。

【表12】

【0083】

（実施例９）
アフィニティー修飾後のアミノ型及びエポキシ型メタクリル樹脂におけるアミノ酸脱水素酵素の固定化及び使用
実施例１との違いは、アミノ基転移酵素をアミノ酸脱水素酵素と等量で置き換え、補因子を同じ質量のＮＡＤ^＋と置き換えることだけであった。

【0084】

固定化されたアミノ酸脱水素酵素の活性及び繰り返し使用試験：

【化11】

【化12】

【0085】

２０ｍＬの反応フラスコに、５ｍＬの０．１ＭＴｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ８．０～９．０）を加えて、１００ｍｇの主原料１０又は主原料１１を溶解し、１０８ｍｇの塩化アンモニウムを加えて、ｐＨを７．５～８．０に調整し、次に、１０～５０ｍｇのＮＡＤ^＋、１５０ｍｇのグルコース、５ｍｇのＧＤＨ及び１０ｍｇのＡＡＤＨ遊離酵素又は１０ｍｇのＡＡＤＨ遊離酵素で製造された固定化酵素又は５ｍｇのＧＤＨ及び１０ｍｇのＡＡＤＨ遊離酵素で製造された共固定化酵素を加えた。３０℃で１６～２０時間撹拌した。転化率を測定し、１回の反応終了後毎に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用することで、繰り返し使用回数を検討する。系に対してＨＰＬＣで転化率を検出し、反応データは、表１０のとおりである。

【表13】