特表 2024-540830 分析物の超高感度検出のための単一分子アッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-06

(54)【発明の名称】分析物の超高感度検出のための単一分子アッセイ

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/543 20060101AFI20241029BHJP

   G01N 33/552 20060101ALI20241029BHJP

   G01N 33/545 20060101ALI20241029BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20241029BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALI20241029BHJP

【ＦＩ】

G01N33/543 597

G01N33/552

G01N33/545 Z

G01N33/543 541A

G01N33/53 U

G01N33/53 M

G01N33/53 D

G01N33/53 V

G01N33/53 W

G01N33/53 B

G01N33/53 S

C12Q1/6844 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024520008

(86)(22)【出願日】2022-10-05

(85)【翻訳文提出日】2024-05-31

(86)【国際出願番号】 US2022045798

(87)【国際公開番号】W WO2023059731

(87)【国際公開日】2023-04-13

(31)【優先権主張番号】63/252,440

(32)【優先日】2021-10-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/341,540

(32)【優先日】2022-05-13

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】507044516

【氏名又は名称】プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ

(71)【出願人】

【識別番号】503146324

【氏名又は名称】ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｔｈｅ Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｉｎｃ．

(71)【出願人】

【識別番号】596060697

【氏名又は名称】マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ウォルト， デイビッド アール．

(72)【発明者】

【氏名】ウー， コニー

(72)【発明者】

【氏名】ノヴァク， リチャード

(72)【発明者】

【氏名】ドゥーガン， テイラー

(72)【発明者】

【氏名】アフマド， ルシュディ

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR08

4B063QR55

4B063QR62

4B063QS24

4B063QS28

4B063QS32

4B063QS34

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、試料中の標的分析物の検出および定量のための超高感度法を提供する。方法を多重化して、複数の標的分析物の同時的検出および定量を可能にすることができる。方法は、アトモル濃度の検出限界を達成することができる。本発明はまた、関連する組成物およびキットも提供する。本発明の方法の非常に単純化された読み出しプロセスおよび改善された費用対効果は、ＰＯＣシステムへの潜在的な統合を容易にすることができる。特に、本発明は、アトモル感度を達成し、一般的な検査基盤のみを必要とし、したがって、超高感度タンパク質検出の利用可能性を大きく増大させる、最新式のデジタルＥＬＩＳＡ技術、個別計数化のための分子オンビーズシグナル増幅（ＭＯＳＡＩＣ）を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）前記標的分析物を含有するか、または含有することが疑われる試料を、前記標的分析物に特異的に結合する捕捉部分を含む複数のビーズと、前記試料中の前記標的分析物が前記捕捉部分に結合するのに十分な条件下および時間にわたって接触させるステップであって、
複数の前記ビーズが０個の標的分析物分子と会合し；
複数の前記ビーズが１個の標的分析物分子と会合し；
少なくとも約２０％の前記ビーズが０個または１個の標的分析物分子のいずれかと会合する、ステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、前記標的分析物に結合する検出部分と接触させるステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を、前記検出部分に結合するシグナル増幅部分と接触させて、前記標的分析物を担持するそれぞれのビーズに関する検出可能なシグナルを生成させるステップ；ならびに
（ｄ）フローサイトメトリーによって前記検出可能なシグナルを検出することによって、前記試料中の前記標的分析物を検出するステップ
を含む、方法。

【請求項2】

前記ビーズが、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、非磁気ビーズ、多孔性ビーズ、またはガラスビーズを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記捕捉部分が、抗体、アプタマー、抗体模倣物質、ポリペプチド、核酸、分子インプリントポリマー、受容体、または低分子を含む、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記検出部分が、抗体、アプタマー、抗体模倣物質、ポリペプチド、核酸、分子インプリントポリマー、受容体、結合タンパク質、または低分子を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記シグナル増幅部分が、酵素および／または核酸分子を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記検出可能なシグナルが、ローリングサークル増幅、次いで、相補的な蛍光標識されたＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション；ローリングサークル転写；ハイブリダイゼーション連鎖反応；ループ媒介性等温増幅；ラジカル重合；チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）；酵素触媒近接標識（ＰＬ）重合；蛍光標識された酵素、ナノ粒子もしくは核酸コンカテマーを用いた、前増幅されたシグナルによる標識化；重合に基づくシグナル増幅；または磁気ビーズ－量子ドットイムノアッセイによって生成される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ビーズの少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％が、０個または１個の標的分析物分子のいずれかと会合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記検出部分および前記シグナル増幅部分が直接連結される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記検出部分および前記シグナル増幅部分が、非共有結合性の親和性結合対によって連結され、前記検出部分が、前記非共有結合性の親和性結合対の第１のメンバーに連結され、前記シグナル増幅部分が、前記非共有結合性の親和性結合対の第２のメンバーに連結される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記非共有結合性の親和性結合対が、ビオチン－ストレプトアビジン、ビオチン－アビジン、リガンド－受容体、抗原－抗体、または抗体結合タンパク質－抗体である、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記標的分析物のための前記捕捉部分を含む前記ビーズが、必要に応じて、異なる色、形状、またはサイズを有する、非標的分析物のための捕捉部分を含むビーズと異なる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

フローサイトメトリーによって前記捕捉部分を含む前記ビーズを検出するステップをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

交差反応性または非特異的結合を減少させる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

フローサイトメトリーによって前記ビーズおよび前記検出可能なシグナルを検出することによって、前記交差反応性または非特異的結合を減少させる、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記標的分析物が、タンパク質、核酸、多糖、脂質、細胞、脂肪酸、治療剤、生物、ウイルス、毒素、ペプチド、オリゴ糖、リポタンパク質、糖タンパク質、グリカン、またはホルモンである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記試料が生体試料を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記生体試料が、（ｉ）リンパ、全血、血漿、血清、末梢血単核細胞を含有する血液画分、尿、唾液、精液、汗、涙液、滑液、脳脊髄液、糞便、粘液、膣液、および髄液からなる群から選択される体液、または（ｉｉ）乳房組織、肝組織、膵組織、子宮頸部組織、肺組織、腎組織、結腸組織、脳組織、筋肉組織、滑膜組織、皮膚、毛包、骨髄、腫瘍組織、組織溶解物もしくはホモジネート、または臓器溶解物もしくはホモジネートである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記生体試料が血漿である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記生体試料が唾液である、請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、またはその任意の組合せが、逐次、または同時に実施される、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記試料中の前記標的分析物の濃度を測定するステップをさらに含み、前記試料中の前記標的分析物の前記濃度が、前記検出可能なシグナルのレベルに比例する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記試料中の追加の標的分析物の濃度を検出または測定するステップをさらに含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記追加の標的分析物が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種のまたはそれより多い標的分析物を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記追加の標的分析物が、タンパク質、核酸、多糖、脂質、細胞、脂肪酸、治療剤、生物、ウイルス、毒素、ペプチド、オリゴ糖、リポタンパク質、糖タンパク質、グリカン、またはホルモンである、請求項２２または２３に記載の方法。

【請求項25】

前記試料を、（ｉ）前記追加の標的分析物に特異的に結合する追加の捕捉部分を含む複数のビーズ；（ｉｉ）前記追加の標的分析物に結合する追加の検出部分、および（ｉｉｉ）前記追加の検出部分に結合する追加のシグナル増幅部分と接触させて、追加の検出可能なシグナルを生成させるステップをさらに含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

試料中の第１の標的分析物および第２の標的分析物を検出する方法であって、
（ａ）前記第１の標的分析物および／または前記第２の標的分析物を含有するか、または含有することが疑われる試料を、（ｉ）前記第１の標的分析物に特異的に結合する第１の捕捉部分を含む複数の第１のビーズおよび（ｉｉ）前記第２の標的分析物に特異的に結合する第２の捕捉部分を含む複数の第２のビーズと、前記試料中の前記第１の標的分析物が前記第１の捕捉部分に結合するのに、および、前記試料中の前記第２の標的分析物が前記第２の捕捉部分に結合するのに十分な条件下および時間にわたって接触させるステップであって、
複数の前記第１のビーズが０個の第１の標的分析物分子と会合し；複数の前記第１のビーズが１個の第１の標的分析物分子と会合し；少なくとも約２０％の前記第１のビーズが０個または１個の第１の標的分析物分子と会合し；および
複数の前記第２のビーズが０個の第２の標的分析物分子と会合し；複数の前記第２のビーズが１個の第２の標的分析物分子と会合し；少なくとも約２０％の前記第２のビーズが０個または１個の第２の標的分析物分子と会合する、ステップ；
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、（ｉ）前記第１の標的分析物に結合する第１の検出部分、（ｉｉ）前記第２の標的分析物に結合する第２の検出部分と接触させるステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を、（ｉ）前記第１の標的分析物を担持する各ビーズについての第１の検出可能なシグナルを生成する前記第１の検出部分に結合する第１のシグナル増幅部分、および（ｉｉ）前記第２の標的分析物を担持する各ビーズについての第２の検出可能なシグナルを生成する前記第２の検出部分に結合する第２のシグナル増幅部分と接触させるステップ；ならびに
（ｄ）フローサイトメトリーによって前記第１の検出可能なシグナルおよび前記第２の検出可能なシグナルを検出することによって、前記試料中の前記第１の標的分析物および前記第２の標的分析物を検出するステップ
を含む、方法。

【請求項27】

前記第１の検出可能なシグナルおよび前記第２の検出可能なシグナルが異なるシグナルであり、必要に応じて、異なる色を有する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

フローサイトメトリーによって前記第１の捕捉部分を含む前記第１のビーズおよび前記第２の捕捉部分を含む前記第２のビーズを検出するステップをさらに含む、請求項２６または２７に記載の方法。

【請求項29】

前記第１の捕捉部分を含む前記第１のビーズおよび前記第２の捕捉部分を含む前記第２のビーズが異なるものであり、必要に応じて、異なる色、形状、またはサイズを有する、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

交差反応性または非特異的結合を減少させる、請求項２６～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

約０．１ａＭ～約１ｍＭの検出限界を有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

前記検出限界が、約０．１ａＭ～約１ｍＭ、約０．１ａＭ～約１μＭ、約０．１ａＭ～約１ｎＭ、約０．１ａＭ～約１ｐＭ、約０．１ａＭ～約１ｆＭ、約０．１ａＭ～約９００ａＭ、約０．１ａＭ～約８００ａＭ、約０．１ａＭ～約７００ａＭ、約０．１ａＭ～約６００ａＭ、約０．１ａＭ～約５００ａＭ、約０．１ａＭ～約４００ａＭ、約０．１ａＭ～約３００ａＭ、約０．１ａＭ～約２００ａＭ、または約０．１ａＭ～約１００ａＭである、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記検出限界が、約１ｆＭ、約９００ａＭ、約８００ａＭ、約７００ａＭ、約６００ａＭ、約５００ａＭ、約４００ａＭ、約３００ａＭ、約２００ａＭ、約１００ａＭ、約９０ａＭ、約８０ａＭ、約７０ａＭ、約６０ａＭ、約５０ａＭ、約４０ａＭ、約３０ａＭ、約２０ａＭ、約１０ａＭ、または約１ａＭ、または約０．１ａＭである、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項34】

前記シグナル検出にかかる時間が、試料あたり約１分未満、試料あたり約４５秒未満、または試料あたり約３０秒未満である、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記試料が約２，０００個～約１００，０００個のビーズと接触される、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記試料が約２，０００個のビーズ、約５，０００個のビーズ、約１０，０００個のビーズ、約２０，０００個のビーズ、約５０，０００個のビーズ、または約１００，０００個のビーズと接触される、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記ビーズおよび前記試料が約１分～約４８時間、約１分～約１０時間、または約１時間～約４時間にわたってインキュベートされる、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記ビーズおよび前記試料が、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、または約５時間にわたってインキュベートされる、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年１０月５日に出願された米国仮特許出願第６３／２５２，４４０号および２０２２年５月１３日に出願された米国仮特許出願第６３／３４１，５４０号の優先権を主張する。前述の出願の各々の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられる、ＥＢ０２９７７７の下で政府支援と共に為された。米国連邦政府は、本発明において、一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
タンパク質、核酸、および代謝物などの極端に低レベルの分子を正確に測定できることは、疾患診断、薬物探索、食品中の病原体検出、環境毒素検出、および生体プロセス制御を含む広範な臨床および環境適用にとって必須である。多くの潜在的なバイオマーカーは、現在の検査室方法の検出限界をはるかに下回るレベルで入手可能な生体液中に存在するため、超高感度測定技術が臨床診断において特に重要である（Ｃｏｈｅｎ， Ｌ．； Ｗａｌｔ， Ｄ． Ｒ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１９， １１９ （１）， ２９３－３２１）。デジタル酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などのデジタル測定法は、従来のＥＬＩＳＡなどの伝統的な分析技術と比較して最大で１０００倍のはるかに改善された測定感度を有する（Ｒｉｓｓｉｎ， Ｄ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１０， ２８， ５９５；Ｒｉｓｓｉｎ， Ｄ． Ｍ．； Ｗａｌｔ， Ｄ． Ｒ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００６， １２８ （１９）， ６２８６－６２８７；Ｒｉｓｓｉｎ， Ｄ． Ｍ．； Ｗａｌｔ， Ｄ． Ｒ．， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００６， ６ （３）， ５２０－５２３；Ｙｅｌｌｅｓｗａｒａｐｕ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１９， １１６ （１０）， ４４８９）。

【0004】

しかしながら、デジタル測定技術の感度は、多くの診断適用にとって、特に、疾患関連タンパク質の測定にとっては依然として不十分である。例えば、神経障害に関するいくつかのタンパク質バイオマーカーは、脳脊髄液中で上方調節されることが示されているが、これらの測定のためには高度に侵襲的な腰椎穿刺が必要であり、したがって、初期の疾患検出のために個体をスクリーニングすることを非現実的なものにしている（Ｒｏｂｅｙ， Ｔ． Ｔ．； Ｐａｎｅｇｙｒｅｓ， Ｐ． Ｋ．， Ｆｕｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１９， １４ （１）， ＦＮＬ６；Ｏｌｓｓｏｎ， Ｂ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１６， １５ （７）， ６７３－６８４；Ｇａｌａｓｋｏ， Ｄ． Ｒ．； Ｓｈａｗ， Ｌ． Ｍ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１７， １３ （３）， １３１－１３２；Ｆｏｒｔｅａ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１８， １７ （１０）， ８６０－８６９）。血液脳関門を通過して循環中に入る脳由来タンパク質はほんのわずかであるため、単純な血液検査によって稀なタンパク質バイオマーカーを検出および同定することができる高感度技術は、この満たされない診断的必要性に対処するのに極めて重要である（Ｈａｍｐｅｌ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１８， １４ （１１）， ６３９－６５２；Ｓｉｍｒｅｎ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０２０， ６１， ２９－３９；Ｐａｒｎｅｔｔｉ， Ｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１９， １８ （６）， ５７３－５８６）。分析感度の改善はまた、迅速な診療現場（ＰＯＣ）での診断が有効な医学的介入にとって必須であるが、唾液または尿などの容易に入手可能な生体液が必要とされる他の疾患において大きな課題である。これらの生体液は最小限の血清成分しか含有せず、タンパク質バイオマーカー検出のためには超高感度技術を必要とする。

【0005】

デジタルＥＬＩＳＡにおいて感度の増大を目指す際の１つの主な障壁は、低い試料採取効率である。デジタルＥＬＩＳＡ法は測定感度を改善するために単一分子計数を利用するが、低い試料採取効率は、計数される標的分子の数を制限する。非常に低い標的濃度で、単一事象の計数に由来するポアソンノイズ、√Ｎ（式中、Ｎは計数された分子の数である）は、測定誤差に大きく寄与する。一例として、５％の試料採取効率では、完全な捕捉効率を仮定しても、１０ａＭの試料１００μＬ中の６００個の標的分子のうちのわずか３０個が計数されるであろう。理論的なポアソンノイズ関連変動係数（ＣＶ）、１／√Ｎは、この低い試料採取効率で１８％であり、１００％をはるかに下回る捕捉効率および実験誤差を考慮した場合、実際にははるかにより高い。この高い測定不確実性は、したがって、稀な分子の検出にとって大きな制限を課する。したがって、より多くの標的分子を計数するための試料採取効率の増大は、測定精度および感度を大きく改善することができるが、デジタルＥＬＩＳＡにおいてはいまだ課題である。

【0006】

現行のデジタルＥＬＩＳＡ手法は、単一の標的タンパク質分子を担持する個々のビーズを単離するためにマイクロウェルまたは油中水液滴を利用する（Ｒｉｓｓｉｎ， Ｄ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１０， ２８， ５９５；Ｙｅｌｌｅｓｗａｒａｐｕ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１９， １１６ （１０）， ４４８９；Ｋｉｍ， Ｓ． Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ ２０１２， １２ （２３）， ４９８６－４９９１；Ｗｉｔｔｅｒｓ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ ２０１３， １３ （１１）， ２０４７－２０５４）。デジタルＥＬＩＳＡに関する現在の技術水準は、抗体でコーティングされた常磁性ビーズ上に単一の標的分子を捕捉し、単一分子計数のためにフェムトリットルサイズのマイクロウェル中に個々のビーズを単離する、単一分子アレイ（Ｓｉｍｏａ）である（Ｒｉｓｓｉｎ， Ｄ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１０， ２８， ５９５）。試料中の標的分子の数を上回る大過剰数のビーズを使用して、それぞれのビーズが０個または１個の捕捉された標的分子を有し、ポアソン分布に従う、デジタル測定を確保する。それぞれの捕捉された分子を、ビオチン化された検出抗体で標識して、免疫複合体サンドイッチを形成させた後、酵素コンジュゲートストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）で標識する。続いて、ビーズを、蛍光性酵素基質と共に、それぞれが多くても１個のビーズに適合することができるマイクロウェル中にロードする。マイクロウェルを油で密閉する際に、高い局部濃度の蛍光生成物を、ＳβＧ分子を担持するビーズを含有する各ウェル中で触媒的に生成させる。したがって、標的分子の数は、「オン」および「オフ」ウェルを計数することによって測定される。

【0007】

Ｓｉｍｏａはサブフェムトモル濃度の検出限界を達成することができ、超高感度タンパク質検出のための現在の絶対的基準であるが、その感度は、低い試料採取効率によって制限されている。ビーズの総数のうちのわずか約５％が、重力（またはＱｕａｎｔｅｒｉｘ ＨＤ－Ｘ Ａｎａｌｙｚｅｒの場合、磁気引力）によってマイクロウェル中にロードされ、分析され得る（Ｗｉｌｓｏｎ， Ｄ． Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ ２０１５， ２１ （４）， ５３３－５４７）。電界指向性ビーズローディング、疎水性中親水性マイクロウェルアレイ、およびデジタルマイクロフルイディクスを含む、ビーズのローディングを改善するための他の方法も探索されている（Ｂａｒｂｅｅ， Ｋ． Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ ２００９， ９ （２２）， ３２６８－３２７４；Ｄｅｃｒｏｐ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ＆ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ２０１７， ９ （１２）， １０４１８－１０４２６；Ｄｅｃｒｏｐ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１６， ８８ （１７）， ８５９６－８６０３）。これらの方法は高いビーズローディング効率を有するが、デジタルイムノアッセイ感度のその改善の証明は依然として制限されている。ビーズローディングを増加させるために流体力と磁力との組合せを使用する磁気メニスカススウィーピング（ｍｅｎｉｓｃｕｓ ｓｗｅｅｐｉｎｇ）は、改善された感度を有するが、他の手法と同様、複雑な製作方法およびワークフローが、ＰＯＣ適用におけるその使用を制限する（Ｋａｎ， Ｃ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ ２０２０， ２０ （１２）， ２１２２）。デジタルバイオアッセイにおける試料採取効率を改善するための別の戦略は、油中水液滴中へのビーズ封入である。デジタル液滴に基づくイムノアッセイは、最大で６０％のビーズローディング効率を有することが示されており、現在のＳｉｍｏａ技術の感度と同等か、またはそれよりも最大で一桁高い改善された感度を示した（Ｙｅｌｌｅｓｗａｒａｐｕ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１９， １１６ （１０）， ４４８９）。液滴マイクロフルイディックシステムは、多様な適用についてよく確立されているが、高度に制御された、ハイスループットの液滴生成の必要性が、ＰＯＣシステムに統合する場合により高い複雑性を導入する追加の製作およびプロセシングステップを導入する。さらに、液滴の有意な画分がビーズを含有しないが、依然としてイメージングしなければならないため、イメージング処理量の改善が依然としてＰＯＣインプリメンテーションを目指す別の課題である。
したがって、高い試料採取効率ならびに診療現場（ＰＯＣ）での適用のための単純な製作方法およびワークフローで分析物を検出し、その濃度を測定するために使用することができる高感度かつ定量的な検出手法が依然として当技術分野で必要である。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｃｏｈｅｎ， Ｌ．； Ｗａｌｔ， Ｄ． Ｒ．， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２０１９， １１９ （１）， ２９３－３２１

【非特許文献2】Ｒｉｓｓｉｎ， Ｄ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０１０， ２８， ５９５

【非特許文献3】Ｒｉｓｓｉｎ， Ｄ． Ｍ．Ｗａｌｔ， Ｄ． Ｒ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２００６， １２８ （１９）， ６２８６－６２８７

【非特許文献4】Ｒｉｓｓｉｎ， Ｄ． Ｍ．； Ｗａｌｔ， Ｄ． Ｒ．， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００６， ６ （３）， ５２０－５２３

【非特許文献5】Ｙｅｌｌｅｓｗａｒａｐｕ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１９， １１６ （１０）， ４４８９

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

発明の概要
タンパク質および核酸などの、低レベルの分析物の測定は、臨床診断適用にとって重要であるが、感度が不十分なため依然として困難である。単一分子アレイ（Ｓｉｍｏａ）などの超高感度デジタルＥＬＩＳＡ技術は、非常に低い濃度の疾患関連タンパク質の検出を達成するために開発されたが、大きく複雑な機器、高い費用、および複雑なワークフローなどの制限に依然として直面しており、診療現場での適用を非現実的なものにしている。さらに、現在のデジタル検出法の検出限界を下回って存在する多くの潜在的な疾患バイオマーカーが依然として存在する。

【0010】

上記の課題に対処する超高感度検出法が本明細書に記載される。本発明の方法の非常に単純化された読み出しプロセスおよび改善された費用対効果は、ＰＯＣシステムへの潜在的な統合を容易にすることができる。特に、本発明は、アトモル感度を達成し、一般的な検査基盤のみを必要とし、したがって、超高感度タンパク質検出の利用可能性を大きく増大させる、最新式のデジタルＥＬＩＳＡ技術、個別計数化のための分子オンビーズシグナル増幅（ＭＯＳＡＩＣ）を提供する。本発明は、オンビーズシグナル生成を利用し、したがって、シグナル区画化のためにマイクロウェルまたは液滴などの個別容器へのビーズ単離を必要とせず、複雑な微細加工または液滴生成の要件を除去する。

【0011】

さらに、本発明は、検出手法としてフローサイトメトリーの使用に焦点を当て、フローサイトメトリーは、多くの研究所によって容易に利用可能であり、低コストでマイクロフルイディックシステムに適合させて、本発明を、現行の検査基盤および診療現場形式への迅速な組み込みにより適したものにすることもできる（Ａｓｇｈａｒｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２０１７， ７ （１） １２３４２）。単一分子の局部的シグナル増幅のための方法に、フローサイトメトリーの迅速でハイスループットの検出能力を統合することによって、絶対的基準であるデジタルＥＬＩＳＡ法、Ｓｉｍｏａよりも一桁改善された低アトモル濃度の検出限界が得られた。フローサイトメトリー読み出しを用いた他のデジタル測定戦略が以前に開発されたが、これらの方法は、フェムトモル濃度またはそれより高い検出限界に限定されており、アトモル感度はタンパク質検出についてはまだ証明されていない。以前のデジタルＥＬＩＳＡ法と比較したＭＯＳＡＩＣの重要な利点は、はるかにより迅速な、自動化された－試料あたり１分未満のシグナルの読み出しである。多くのベンチトップ型フローサイトメーターに既に内蔵されている９６ウェルプレート試料採取モードによる自動化は、最新式のワークフローをさらに提供する。

【0012】

迅速なオンビーズシグナル増幅戦略の適用に加えて、ＭＯＳＡＩＣの高い試料採取効率を活用して、感度を増強させるためのアッセイビーズ数を体系的に減少させて、低アトモル濃度のタンパク質濃度を検出することができる。ＭＯＳＡＩＣの改善された感度は、唾液中の低存在量のサイトカインなどの、生体液中の以前には検出不可能であった分析物の測定を可能にする。さらに、単一の試料内で分析することができるビーズ型の数はマイクロウェルまたは他の区画の総数によってもはや制限されないため、ＭＯＳＡＩＣはデジタルＥＬＩＳＡの多重化機能を拡張する。ＭＯＳＡＩＣにおける多重化の増加の例として、８つのタンパク質標的が、少量の血漿を使用して、アトモルから低フェムトモル感度で同時に測定された。

【0013】

現行のデジタルＥＬＩＳＡ法と比較したＭＯＳＡＩＣの増強された感度、単純性、および多用途性は、超高感度タンパク質検出を広く利用可能にし、多様な臨床適用のために以前には検出不可能であったバイオマーカーの探索を目指すかなりの前進をもたらす。

【0014】

したがって、本発明は、一態様では、試料中の標的分析物を検出する方法を提供し、方法は、（ａ）標的分析物を含有するか、または含有することが疑われる試料を、標的分析物に特異的に結合する捕捉部分を含む複数のビーズと、試料中の標的分析物が捕捉部分に結合するのに十分な条件下および時間にわたって接触させるステップであって、複数のビーズが０個の標的分析物分子と会合し；複数のビーズが１個の標的分析物分子と会合し；少なくとも約２０％のビーズが０個または１個の標的分析物分子のいずれかと会合する、ステップ；（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、標的分析物に結合する検出部分と接触させるステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を、検出部分に結合するシグナル増幅部分と接触させて、標的分析物を担持するそれぞれのビーズに関する検出可能なシグナルを生成させるステップ；ならびに（ｄ）フローサイトメトリーによって検出可能なシグナルを検出することによって、試料中の標的分析物を検出するステップを含む。

【0015】

一部の実施形態では、ビーズは、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、非磁気ビーズ、多孔性ビーズ、またはガラスビーズを含む。

【0016】

一部の実施形態では、捕捉部分は、抗体、アプタマー、抗体模倣物質、ポリペプチド、核酸、分子インプリントポリマー、受容体、結合タンパク質または低分子を含む。

【0017】

一部の実施形態では、検出部分は、抗体、アプタマー、抗体模倣物質、ポリペプチド、核酸、分子インプリントポリマー、受容体、結合タンパク質、または低分子を含む。

【0018】

一部の実施形態では、シグナル増幅部分は、酵素および／または核酸分子を含む。

【0019】

一部の実施形態では、検出可能なシグナルは、ローリングサークル増幅、次いで、相補的な蛍光標識されたＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション；ローリングサークル転写；ハイブリダイゼーション連鎖反応；ループ媒介性等温増幅；ラジカル重合；チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）；酵素触媒近接標識（ＰＬ）重合；蛍光標識された酵素、ナノ粒子もしくは核酸コンカテマーを用いた、前増幅されたシグナルによる標識化；重合に基づくシグナル増幅；または磁気ビーズ－量子ドットイムノアッセイによって生成される。

【0020】

一部の実施形態では、ビーズの少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％が、０個または１個の標的分析物分子のいずれかと会合する。

【0021】

一部の実施形態では、検出部分およびシグナル増幅部分は、直接連結される。

【0022】

一部の実施形態では、検出部分およびシグナル増幅部分は、非共有結合性の親和性結合対によって連結され、検出部分が、非共有結合性の親和性結合対の第１のメンバーに連結され、シグナル増幅部分が、非共有結合性の親和性結合対の第２のメンバーに連結される。

【0023】

一部の実施形態では、非共有結合性の親和性結合対は、ビオチン－ストレプトアビジン、ビオチン－アビジン、リガンド－受容体、抗原－抗体、または抗体結合タンパク質－抗体である。

【0024】

一部の実施形態では、標的分析物のための捕捉部分を含むビーズは、必要に応じて、異なる色、形状、またはサイズを有する、非標的分析物のための捕捉部分を含むビーズと異なる。

【0025】

一部の実施形態では、方法は、フローサイトメトリーによって捕捉部分を含むビーズを検出するステップをさらに含む。

【0026】

一部の実施形態では、方法は、交差反応性または非特異的結合を減少させる。一部の実施形態では、フローサイトメトリーによってビーズおよび検出可能なシグナルを検出することによって、交差反応性または非特異的結合を減少させる。

【0027】

一部の実施形態では、標的分析物は、タンパク質、核酸、多糖、脂質、細胞、脂肪酸、治療剤、生物、ウイルス、毒素、ペプチド、オリゴ糖、リポタンパク質、糖タンパク質、グリカン、またはホルモンである。

【0028】

一部の実施形態では、試料は、生体試料、環境試料または合成物質を含む。

【0029】

一部の実施形態では、生体試料は、（ｉ）リンパ、全血、血漿、血清、末梢血単核細胞を含有する血液画分、尿、唾液、精液、汗、涙液、滑液、脳脊髄液、糞便、粘液、膣液、および髄液からなる群から選択される体液、または（ｉｉ）乳房組織、肝組織、膵組織、子宮頸部組織、肺組織、腎組織、結腸組織、脳組織、筋肉組織、滑膜組織、皮膚、毛包、骨髄、腫瘍組織、組織溶解物もしくはホモジネート、または臓器溶解物もしくはホモジネートである。

【0030】

一部の実施形態では、生体試料は、血漿である。

【0031】

一部の実施形態では、生体試料は、唾液である。

【0032】

一部の実施形態では、方法は、試料中の標的分析物の濃度を測定するステップをさらに含み、試料中の標的分析物の濃度が、検出可能なシグナルのレベルに関連する。

【0033】

一部の実施形態では、方法は、試料中の追加の標的分析物の濃度を検出または測定するステップをさらに含む。

【0034】

一部の実施形態では、追加の標的分析物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０種のまたはそれより多い標的分析物を含む。

【0035】

一部の実施形態では、追加の標的分析物は、タンパク質、核酸、多糖、脂質、細胞、脂肪酸、治療剤、生物、ウイルス、毒素、ペプチド、オリゴ糖、リポタンパク質、糖タンパク質、グリカン、またはホルモンである。

【0036】

一部の実施形態では、方法は、試料を、（ｉ）追加の標的分析物に特異的に結合する追加の捕捉部分を含む複数のビーズ；（ｉｉ）追加の標的分析物に結合する追加の検出部分、および（ｉｉｉ）追加の検出部分に結合する追加のシグナル増幅部分と接触させて、追加の検出可能なシグナルを生成させるステップをさらに含む。

【0037】

別の態様では、本発明は、試料中の第１の標的分析物および第２の標的分析物を検出する方法を提供し、方法は、（ａ）第１の標的分析物および／または第２の標的分析物を含有するか、または含有することが疑われる試料を、（ｉ）第１の標的分析物に特異的に結合する第１の捕捉部分を含む複数の第１のビーズおよび（ｉｉ）第２の標的分析物に特異的に結合する第２の捕捉部分を含む複数の第２のビーズと、試料中の第１の標的分析物が第１の捕捉部分に結合するのに、および、試料中の第２の標的分析物が第２の捕捉部分に結合するのに十分な条件下および時間にわたって接触させるステップであって、複数の第１のビーズが０個の第１の標的分析物分子と会合し；複数の第１のビーズが１個の第１の標的分析物分子と会合し；少なくとも約２０％の第１のビーズが０個または１個の第１の標的分析物分子と会合し；および複数の第２のビーズが０個の第２の標的分析物分子と会合し；複数の第２のビーズが１個の第２の標的分析物分子と会合し；少なくとも約２０％の第２のビーズが０個または１個の第２の標的分析物分子と会合する、ステップ；（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、（ｉ）第１の標的分析物に結合する第１の検出部分、（ｉｉ）第２の標的分析物に結合する第２の検出部分と接触させるステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を、（ｉ）第１の標的分析物を担持する各ビーズについての第１の検出可能なシグナルを生成する第１の検出部分に結合する第１のシグナル増幅部分、および（ｉｉ）第２の標的分析物を担持する各ビーズについての第２の検出可能なシグナルを生成する第２の検出部分に結合する第２のシグナル増幅部分と接触させるステップ；ならびに（ｄ）フローサイトメトリーによって第１の検出可能なシグナルおよび第２の検出可能なシグナルを検出することによって、試料中の第１の標的分析物および第２の標的分析物を検出するステップを含む。

【0038】

一部の実施形態では、第１の検出可能なシグナルおよび第２の検出可能なシグナルは、異なるシグナルであり、必要に応じて、異なる色を有する。

【0039】

一部の実施形態では、方法は、フローサイトメトリーによって第１の捕捉部分を含む第１のビーズおよび第２の捕捉部分を含む第２のビーズを検出するステップをさらに含む。

【0040】

一部の実施形態では、第１の捕捉部分を含む第１のビーズおよび第２の捕捉部分を含む第２のビーズは、異なるものであり、必要に応じて、異なる色、形状、またはサイズを有する。

【0041】

一部の実施形態では、方法は、交差反応性または非特異的結合を減少させる。一部の実施形態では、フローサイトメトリーによってビーズおよび検出可能なシグナルを検出することによって、交差反応性または非特異的結合を減少させる。

【0042】

一部の実施形態では、方法は、約０．１ａＭ～約１ｍＭの検出限界を有する。

【0043】

一部の実施形態では、検出限界は、約０．１ａＭ～約１ｍＭ、約０．１ａＭ～約１μＭ、約０．１ａＭ～約１ｎＭ、約０．１ａＭ～約１ｐＭ、約０．１ａＭ～約１ｆＭ、約０．１ａＭ～約９００ａＭ、約０．１ａＭ～約８００ａＭ、約０．１ａＭ～約７００ａＭ、約０．１ａＭ～約６００ａＭ、約０．１ａＭ～約５００ａＭ、約０．１ａＭ～約４００ａＭ、約０．１ａＭ～約３００ａＭ、約０．１ａＭ～約２００ａＭ、または約０．１ａＭ～約１００ａＭである。

【0044】

一部の実施形態では、検出限界は、約１ｆＭ、約９００ａＭ、約８００ａＭ、約７００ａＭ、約６００ａＭ、約５００ａＭ、約４００ａＭ、約３００ａＭ、約２００ａＭ、約１００ａＭ、約９０ａＭ、約８０ａＭ、約７０ａＭ、約６０ａＭ、約５０ａＭ、約４０ａＭ、約３０ａＭ、約２０ａＭ、約１０ａＭ、または約１ａＭ、または約０．１ａＭである。

【0045】

一部の実施形態では、シグナル検出にかかる時間は、試料あたり約１分未満、試料あたり約４５秒未満、または試料あたり約３０秒未満である。

【0046】

一部の実施形態では、試料は、約２，０００個～約１００，０００個のビーズと接触される。一部の実施形態では、試料は、約２，０００個のビーズ、約５，０００個のビーズ、約１０，０００個のビーズ、約２０，０００個のビーズ、約５０，０００個のビーズ、または約１００，０００個のビーズと接触される。

【0047】

一部の実施形態では、ビーズおよび試料は、約１分～約４８時間、約１分～約１０時間、または約１時間～約４時間にわたってインキュベートされる。一部の実施形態では、ビーズおよび試料は、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、または約５時間にわたってインキュベートされる、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【0048】

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかとなる。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】図１は、本発明の例示的な単一分子アッセイ（個別計数化のための分子オンビーズシグナル増幅（ＭＯＳＡＩＣ））の概略図を描写する。単一の標的分子は、それぞれのビーズがポアソン分布に従って０個または１個の標的分子を担持するような、過剰数の抗体でコーティングされた常磁性ビーズを用いて最初に捕捉される。ビオチン化された検出抗体との単一の免疫複合体サンドイッチの形成およびストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートを用いた標識化の際に、ローリングサークル増幅を実行して、それぞれの免疫複合体に結合した長いＤＮＡコンカテマーを生成する。蛍光標識されたＤＮＡプローブをＲＣＡ産物にハイブリダイズさせて、フローサイトメトリーによる「オン」および「オフ」ビーズの計数化を可能にする。

【0050】

【図2-1】図２Ａ～Ｄは、異なる分析物およびアッセイビーズ数にわたるＭＯＳＡＩＣアッセイの分析感度を描写する。図２Ａは、異なるアッセイビーズ数を使用するＩＬ－１０ ＭＯＳＡＩＣアッセイに関する較正曲線を提供する。シグナルの読取り値は、ビーズあたりの平均分子（ＡＭＢ）で示される。図２Ｂは、検出限界（ＬＯＤ）に対するＭＯＳＡＩＣアッセイビーズ数の効果およびＩＬ－１０検出に関するバックグラウンドに対するシグナル（ｓｉｇｎａｌ－ｔｏ－ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）を描写する。ＬＯＤ値を、バックグラウンドＡＭＢを上回る３標準偏差として算出した。それぞれのアッセイビーズ数に関する相対バックグラウンドに対するシグナルを、１０００００個のアッセイビーズを使用する特定のキャリブレータ―のバックグラウンドに対するシグナルに対して正規化された同じキャリブレータ―のバックグラウンドに対するシグナルとして決定した。図２Ｃは、１０００００個のアッセイビーズおよび４０００００個のヘルパービーズを使用した、対応するＩＬ－１０ Ｓｉｍｏａアッセイに関する較正曲線を提供する。図２Ｄは、ＬＯＤに対するＭＯＳＡＩＣアッセイビーズ数の効果および追加の分析物にわたる相対バックグラウンドに対するシグナルを描写する。全てのエラーバーは、ブランクについて実施された６回反復と共に、３回反復の標準偏差を表す。

【図2-2】同上。

【0051】

【図3-1】図３Ａ～Ｄは、試料採取効率の増大が分析感度および精度を改善することを描写する。図３Ａ～３Ｂは、ＩＬ－１０（図３Ａ）およびＩＦＮ－γ（図３Ｂ）に関するＭＯＳＡＩＣ較正曲線から無作為にサンプリングされた様々なビーズ数のサブセットから生成された較正曲線に関する検出限界を記載する。それぞれの色は、出発総アッセイビーズ数を示す。それぞれの点は、１００個の無作為にサンプリングされたサブセットの中央値を表し、エラーバーは四分位範囲を表す。白丸は、上位四分位点が、非常に低いビーズサブセットサイズでの非常に高い測定変動係数（ＣＶ）のため正の無限値を有していた値を示す。図３Ｃ～３Ｄは、ＩＬ－１０（図３Ｃ）およびＩＦＮ－γ（図３Ｄ）に関する様々なビーズ数の無作為にサンプリングされたビーズサブセットに関するバックグラウンドシグナルの測定ＣＶを提供する。

【図3-2】同上。

【0052】

【図4-1】図４Ａ～Ｄは、ＭＯＳＡＩＣおよびＳｉｍｏａを使用したヒト血漿および唾液におけるＩＦＮ－γ濃度の測定を描写する。図４Ａ～４Ｄは、ＭＯＳＡＩＣとＳｉｍｏａアッセイとの間の、１７個のヒト血漿（図４Ａ、図４Ｂ）試料および２６個の唾液（図４Ｃ、図４Ｄ）試料における測定されたＩＦＮ－γ濃度を提供する。示された濃度は、４倍の希釈率を考慮した内因性ＩＦＮ－γ濃度を表し、検出限界（ＬＯＤ）および定量下限（ＬＬＯＱ）も、４倍の希釈率を反映する。ピアソン相関係数は、血漿試料および唾液試料（検出可能な値の間で）について、それぞれ、０．８０および０．３１であった。唾液における低い相関係数は、Ｓｉｍｏａを使用した、ほんのわずかの検出可能な試料ならびにＳｉｍｏａまたはＭＯＳＡＩＣのＬＬＯＱに近いＩＦＮ－γレベルを有する複数の試料に起因し得る。赤色の破線は、バックグラウンド（バッファーのみ）のＡＭＢを上回る３標準偏差として算出されたアッセイのＬＯＤを示す。アッセイのＬＯＤ未満の測定値を有する試料に、ＬＯＤに等しい値を割り当てた。エラーバーは、２回反復の標準偏差を表す。

【図4-2】同上。

【0053】

【図5-1】図５Ａ～Ｄは、ＭＯＳＡＩＣ技術を用いた多重化を描写する。図５Ａは、４重ＭＯＳＡＩＣアッセイと対応する４重Ｓｉｍｏａアッセイとの間でのヒト血漿中のサイトカイン測定値の相関を描写する。濃度、ＬＯＤ、およびＬＬＯＱ値は、両方のアッセイにおいて使用された４倍の希釈率を反映する。アッセイのＬＯＤ未満の測定値を有する試料に、ＬＯＤに等しい値を割り当てた。図５Ｂ～５Ｃは、８重ＭＯＳＡＩＣアッセイ（図５Ｂ）および２つの４重Ｓｉｍｏａアッセイ（図５Ｃ）を使用した、ヒト血漿（上）および唾液（下）における８つのタンパク質分析物の測定された濃度を提供する。示された濃度は、それぞれ、１６倍および８倍希釈された血漿および唾液試料における、測定された濃度の値である。アッセイのＬＯＤ未満の測定値に、ＬＯＤに等しい値を割り当て、白丸で示す。図５Ｄは、ＭＯＳＡＩＣを用いた多重化の概略図を提供する。異なる標的分析物に対する抗体でコーティングされたビーズは、異なる波長、強度を示す異なる蛍光色素を使用すること、および／または複数のビーズサイズを使用することによってコード化される。それぞれのビーズ型上での単一の分析物分子の捕捉、単一の免疫複合体サンドイッチの形成、およびストレプトアビジン－ＤＮＡを用いた標識化の際に、ローリングサークル増幅を実行し、ビーズの混合物をフローサイトメトリーによって分析する。異なる蛍光チャネル中の一連のゲートによってビーズを区別した後、それぞれのビーズ型に関する、ビーズあたりの平均分子を、プローブの色に対応する蛍光チャネルにおける強度から決定する。

【図5-2】同上。

【図5-3】同上。

【図5-4】同上。

【0054】

【図6-1】図６Ａ～６Ｅは、異なるアッセイビーズ数にわたって個々のサイトカインについて実施されたＭＯＳＡＩＣアッセイに関する較正曲線を描写する。エラーバーは、３～６回反復の標準偏差を表す。

【図6-2】同上。

【図6-3】同上。

【0055】

【図7-1】図７Ａ～７Ｅは、個々のサイトカインについて実施されたＳｉｍｏａアッセイに関する較正曲線を描写する。アッセイの検出限界は、赤色の破線で示される。エラーバーは、３回反復およびブランクの６回反復の標準偏差を表す。

【図7-2】同上。

【図7-3】同上。

【0056】

【図8-1】図８Ａ～８Ｃは、４時間の標的捕捉時間で実施されたＭＯＳＡＩＣアッセイを描写する。図８Ａ～８Ｂは、４時間の標的捕捉時間による異なるアッセイビーズ数にわたるＩＬ－１０（図８Ａ）およびＩＦＮ－γ（図８Ｂ）のＭＯＳＡＩＣアッセイに関する較正曲線を提供する。ビーズを４時間にわたって試料と共にインキュベートし、標的捕捉の最後の時間に検出抗体を添加した。エラーバーは、それぞれのキャリブレータ―に関する３回反復およびブランクに関する６回反復の標準偏差を表す。図８Ｃは、４時間の標的捕捉時間によるＩＬ－１０およびＩＦＮ－γのＭＯＳＡＩＣアッセイの検出限界および定量下限を記載する。

【図8-2】同上。

【0057】

【図9-1】図９Ａ～９Ｃは、ヒト唾液において実施されたＭＯＳＡＩＣおよびＳｉｍｏａアッセイを描写する。図９Ａ～９Ｂは、希釈バッファーとしてＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する、唾液において実施されたＩＦＮ－γ（図９Ａ）およびＩＬ－１２ｐ７０（図９Ｂ）のＭＯＳＡＩＣおよびＳｉｍｏａアッセイに関する較正曲線を提供する。ＩＦＮ－γに関するアッセイの検出限界（ＬＯＤ）は、ＭＯＳＡＩＣおよびＳｉｍｏａについて、それぞれ２９．６および８６．９ａＭであった。ＩＬ－１２ｐ７０に関するアッセイのＬＯＤは、ＭＯＳＡＩＣおよびＳｉｍｏａについて、それぞれ４４．２および３０４．３ａＭであった。１０，０００個のアッセイビーズを両方のＭＯＳＡＩＣアッセイのために使用し、１００，０００個のアッセイビーズを、４００，０００個のヘルパービーズと共に、対応するＳｉｍｏａアッセイのために使用した。図９Ｃは、ＭＯＳＡＩＣおよびＳｉｍｏａを使用した、２６個の唾液試料中の測定されたＩＬ－１２ｐ７０濃度を描写する。赤色の破線で示された、濃度およびアッセイのＬＯＤは、希釈率で乗算したアッセイ測定値を表す。

【図9-2】同上。

【0058】

【図10-1】図１０Ａ～１０Ｄは、４重ＭＯＳＡＩＣアッセイを描写する。図１０Ａ～１０Ｂは、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＬ－１０、およびＩＦＮ－γに関する４重ＭＯＳＡＩＣ（図１０Ａ）およびＳｉｍｏａ（図１０Ｂ）アッセイに関する較正曲線を提供する。図１０Ｃは、４重ＭＯＳＡＩＣおよびＳｉｍｏａアッセイの検出限界および定量下限を記載する。図１０Ｄは、４重ＭＯＳＡＩＣアッセイにおける各分析物のドロップアウト曲線のグラフを提供する。各グラフは、多重アッセイにおける漸増量の個々の分析物に関するそれぞれのビーズのシグナル応答を示し、エラーバーは二連の測定値の標準偏差を表す。

【図10-2】同上。

【図10-3】同上。

【0059】

【図11-1】図１１Ａ～１１Ｄは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１β、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１８、およびＶＥＧＦに関する８重ＭＯＳＡＩＣアッセイおよび２つの４重Ｓｉｍｏａアッセイに関する代表的な較正曲線を描写する。図１１Ａ～１１Ｂは、血漿（図１１Ａ）および唾液（図１１Ｂ）測定のために使用された試料希釈液で得られた代表的な８重ＭＯＳＡＩＣアッセイの較正曲線を提供する。図１１Ｃ～１１Ｄは、血漿（図１１Ｃ）および唾液（図１１Ｄ）測定のために使用された試料希釈液で得られた対応する４重Ｓｉｍｏａアッセイの較正曲線を提供する。エラーバーは、ブランクについて実施された６回反復と共に、３回反復の標準偏差を表す。

【図11-2】同上。

【図11-3】同上。

【0060】

【図12-1】図１２は、３つの個々のヒト血漿試料における８重ＭＯＳＡＩＣアッセイの希釈線形性を描写する。線形回帰からのｒ^２値の範囲を、各分析物について示す。血漿＃１について、４倍希釈と８倍希釈との間の希釈線形性が弱かったため、４倍の希釈率の測定値を線形回帰から除外した。したがって、全ての報告された血漿測定値について１６倍の最終希釈率を選択して、一貫した測定正確度を確保した。エラーバーは、二連の測定値の標準偏差を表す。

【図12-2】同上。

【図12-3】同上。

【図12-4】同上。

【0061】

【図13-1】図１３は、８重ＭＯＳＡＩＣアッセイにおける各分析物のドロップアウト曲線を描写する。各グラフは、漸増量の個々の分析物に関するそれぞれのビーズのシグナル応答を示し、エラーバーは二連の測定値の標準偏差を表す。

【図13-2】同上。

【図13-3】同上。

【図13-4】同上。

【0062】

【図14-1】図１４Ａ～１４Ｂは、８重ＭＯＳＡＩＣアッセイにおける分析物のそれぞれに関する血漿（図１４Ａ）および唾液（図１４Ｂ）におけるＭＯＳＡＩＣおよびＳｉｍｏａによる測定値の相関を描写する。２つの別々の４重Ｓｉｍｏａアッセイを、比較として実施した。検出限界（ＬＯＤ）および定量下限（ＬＬＯＱ）値は、血漿試料における１６倍の希釈率を考慮した有効なＬＯＤおよびＬＬＯＱ値に対応する。全ての試料の測定された濃度から決定された、ピアソン相関係数を各分析物について示す。濃度がいずれかの方法のＬＬＯＱに近かったか、またはそれ未満であった分析物に関するＭＯＳＡＩＣとＳｉｍｏａとの間のより弱い相関は、ＬＬＯＱまたはＬＯＤに近いより低い測定精度を含む、いくつかの因子に起因し得る。本発明者らはスパイクおよび回収実験ならびに希釈線形性実験によって８重ＭＯＳＡＩＣアッセイを検証したが、ＭＯＳＡＩＣおよびＳｉｍｏａアッセイに対するマトリックス効果の差異は、より低い濃度範囲でより弱い相関に寄与した可能性もある。エラーバーは、二連の測定値の標準偏差を表す。

【図14-2】同上。

【0063】

【図15-1】図１５Ａ～１５Ｄは、ＭＯＳＡＩＣアッセイのためにフローサイトメトリーによってビーズを同定するための代表的なゲーティング戦略を描写する。ゲーティングを、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを使用して実施した。代表的なゲートを、４８８多重ビーズ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ Ｃｏｒｐ．）について示す。図１５Ａは、初期の前方対側方散乱ゲートを適用してデブリの大部分を除去した場合のゲーティング戦略を描写する。図１５Ｂは、ビーズを蛍光チャネルによってさらに同定した場合のゲーティング戦略を描写する。図１５Ｃは、最終ゲートを適用して単一ビーズを同定した場合のゲーティング戦略を描写する。図１５Ｄは、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ標識されたＤＮＡプローブを使用する、２０，０００個のアッセイビーズでの異なるＩＬ－１０濃度に関する蛍光強度の代表的な散乱プロットおよびヒストグラムを提供する。続いて、ビーズあたりの平均分子（ＡＭＢ）値を、実施例に記載されるＰｙｔｈｏｎを使用して蛍光強度値から決定した。

【図15-2】同上。

【図15-3】同上。同上。

【0064】

【図16-1】図１６は、３つの個々のヒト唾液試料における８重ＭＯＳＡＩＣアッセイの希釈線形性を描写する。線形回帰からのｒ^２値の範囲を、各分析物について示す。唾液＃１について、４倍希釈と８倍希釈との間の希釈線形性が弱かったため、４倍の希釈率の測定値を線形回帰から除外した。全ての報告された唾液測定値について８倍の最終希釈率を選択して、一貫した測定正確度を確保した。エラーバーは、二連の測定値の標準偏差を表す。

【図16-2】同上。

【図16-3】同上。

【図16-4】同上。

【0065】

【図17-1】図１７は、８重ＭＯＳＡＩＣアッセイのために使用したビーズゲーティング戦略を描写する。異なる蛍光チャネルにおける一連のゲートを使用して、ビーズ型を識別し、異なるビーズ型からなるあらゆる凝集体を除去した。ピンク色で強調されたゲーティングされた集団は、単一のビーズのさらなるゲーティングおよびプローブチャネルにおける蛍光強度のその後の分析の前のそれぞれのビーズ型を表す。

【図17-2】同上。

【図17-3】同上。

【0066】

【図18】図１８は、非バーコード化多重ＭＯＳＡＩＣおよびバーコード化多重ＭＯＳＡＩＣ形式の両方の概略図を描写する。バーコード化多重ＭＯＳＡＩＣ形式については、独自のＤＮＡ鋳型を多重ＭＯＳＡＩＣアッセイにおいてそれぞれの検出抗体にコンジュゲートし、ＲＣＡ反応において対応する独自の蛍光色素コンジュゲート化プローブと対合させた。対照的に、非バーコード化多重ＭＯＳＡＩＣ形式においては、全ての検出抗体をビオチン化し、同じストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートおよび蛍光プローブで標識し、したがって、交差反応性結合事象をマスクした。

【0067】

【図19】図１９Ａおよび図１９Ｂは、非バーコード化多重ＭＯＳＡＩＣ（図１９Ａ）およびバーコード化多重ＭＯＳＡＩＣ（図１９Ｂ）についての、漸増濃度のそれぞれの個々の標的タンパク質に関するドロップアウト曲線を描写する。バーコード化多重ＭＯＳＡＩＣにおける正確な捕捉ビーズ－プローブの色の対のみの含有は、交差反応シグナルの除去を可能にし、したがって、より正確な多重測定を提供する。

【発明を実施するための形態】

【0068】

発明の詳細な説明
本発明は、標的分析物の濃度の検出または測定のための方法および組成物を提供する。

【0069】

血液または唾液などの最小限に侵襲的な生体液中のタンパク質バイオマーカーの定量的かつ超高感度の検出は、より迅速な疾患診断、処置、モニタリング、および疾患再発モニタリングと共に、医学的診断を革命的に変化させる潜在性を有する。デジタル酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）および単一分子アレイ（Ｓｉｍｏａ）などの技術は、タンパク質、核酸、および他の生物学的に関連する低分子を含む、低存在量分析物の超高感度検出を可能にする。しかしながら、これらの技術は、大きく複雑な機器、高い費用、および複雑なワークフローなどの制限に依然として直面しており、診療現場での適用を非現実的なものにしている。さらに、現在のデジタル検出法の検出限界を下回って存在する多くの潜在的な疾患バイオマーカーが依然として存在する。

【0070】

本発明の発明者らは、低から中アトモル濃度のタンパク質濃度を検出することができる、革新的、ハイスループットで、非常に入手しやすい単一分子測定プラットフォームを開発した。デジタルＥＬＩＳＡ手法における稀な標的分子の試料採取における低効率の課題に対処することによって、現在、超高感度タンパク質検出のための絶対的基準である現在のＳｉｍｏａ技術を１０倍以上上回って感度が増強された。本発明の方法によって達成されたアトモル濃度の検出限界（ＬＯＤ）は、従来のイムノアッセイと比較して少なくとも３～４桁の改善に相当する。標的分子を担持する各ビーズに非拡散性蛍光シグナルを局在化させることによって、このプラットフォームは、シグナル区画化のためにマイクロウェルまたは液滴中へのビーズローディングの必要性を取り除くだけではなく、改善された試料採取効率のために有意により多くのビーズを分析し、それによって、感度を増強させることもできる。

【0071】

この単純な手法は、現在のＳｉｍｏａ技術の約５％の試料採取効率と比較して、全ビーズの平均で約５０～６０％の分析を可能にし、これは約１０倍の増加である。低い試料濃度では、特に、１００％をはるかに下回る捕捉効率（本研究において開発された本発明のアッセイにおける全ての捕捉および標識化ステップにわたって約１～３％）と共に、ポアソンノイズ関連測定ＣＶを最小化するために試料採取の改善が必要不可欠である。本発明の方法の有意に改善された試料採取効率はまた、従来のＳｉｍｏａと比較して少ないアッセイビーズの使用を可能にし、「オン」ビーズの画分を増加させ、それによって、バックグラウンドに対するシグナルを増大させる。より低い解離定数を有する親和性試薬を使用し、親和性試薬およびストレプトアビジン－ＤＮＡ標識の非特異的結合を減少させることによって、感度のさらなる改善を達成することができる。より良好な親和性試薬の開発および非特異的結合を減少させる方法と共に、本発明の方法は、潜在的には、ゼプトモル濃度のタンパク質濃度まで検出することができる。アトモル感度と共に、本発明の方法は、結核などの様々な疾患の基礎となる新しいバイオマーカーおよび生物学的機構の探索を目指す道を開くことができる。

【0072】

本発明の方法での感度の一桁またはそれより多い改善の達成はまた、多くの他のがん型および神経障害に関する新しい血液に基づくバイオマーカーの探索のための重要な意味合いを保持する。アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患のための診断血液検査は、高侵襲性の腰椎穿刺が必要であるため、現在は非常に困難である、幅広いスクリーニングおよび早期診断にとって特に必要不可欠であることがわかっているであろう。バイオマーカーレベルが有意な疾患進行後にのみ検出可能となる多くの場合、本発明の方法の感度の増強は、健康転帰の改善のために初期段階での疾患診断を促進することができる。

【0073】

重要なことに、本発明の方法はまた、デジタルバイオアッセイシグナル読み出しの単純性を増大させ、さらなる開発の際に、潜在的には、ＰＯＣプラットフォームに統合し、したがって、現在のＰＯＣ診断における低感度の課題に対処することができる。デジタルイムノアッセイにおける感度の増強のための試料採取効率の増大はビーズ液滴アレイおよび液滴デジタルＥＬＩＳＡ法においても示されてきたが、これらの方法は、製作およびプロセシングステップにおいてさらなる複雑性をもたらす。対照的に、本発明の方法の読み出しプロセスは、多くの研究室が容易に利用でき、低費用でマイクロフルイディックシステムに適合化させることもできる、フローサイトメトリーのみを必要とし、本発明を、現行の検査基盤および診療現場形式への迅速な組み込みにより適したものにする。

【0074】

さらに、ドロップキャスト単一分子アッセイなどの以前のデジタルＥＬＩＳＡ法と比較した本発明の別の重要な利点は、はるかにより迅速な、自動化されたシグナル読み出しである。ドロップキャスト単一分子アッセイ（ｄＳｉｍｏａ）はビーズ上に捕捉された単一分子を計数するためのビーズドロップキャスト法を可能にしたが、これらの方法は、複数の視野にわたって全てのビーズを捕捉するために、試料あたりの長いイメージング時間を必要とし、したがって、処理量を制限する。対照的に、本発明は、はるかに迅速な試料読み出し速度を可能にする。シグナル読み出しにかかる時間は、試料あたり、約１分未満である。多くのベンチトップ型フローサイトメーターに既に組み込まれている９６ウェルプレート試料採取モードによる自動化は、最新式のワークフローをさらに提供する。

【0075】

定義
本明細書で使用される場合、用語「約」とは、記載される値の１０％上または下の範囲内にある値を指す。

【0076】

「標的分析物」とは、検出、測定、定量、または評価しようとする任意の原子、分子、イオン、分子イオン、化合物、粒子、細胞、ウイルス、複合体、またはそれらの断片を意味する。標的分析物は、試料（例えば、液体試料（例えば、生体試料または環境試料））中に含有されていてもよい。例示的な標的分析物としては、限定されるものではないが、低分子（例えば、有機化合物、ステロイド、ホルモン、ハプテン、生体アミン、抗生物質、マイコトキシン、有機汚染物質、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖、もしくは二次代謝物）、タンパク質（糖タンパク質もしくはプリオン）、核酸、多糖、脂質、脂肪酸、細胞、気体、治療剤、生物（例えば、病原体）、ウイルス、毒素、ペプチド、オリゴ糖、リポタンパク質、糖タンパク質、グリカン、またはホルモンが挙げられる。標的分析物は、天然に存在するか、または合成であってもよい。

【0077】

本明細書で使用される場合、用語「低分子」とは、５０００Ｄａ未満の分子量を有する任意の分子を意味する。例えば、一部の実施形態では、低分子は、有機化合物、ステロイド、ホルモン、ハプテン、生体アミン、抗生物質、マイコトキシン、シアノトキシン、ニトロ化合物、残留薬物、残留殺虫剤、有機汚染物質、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖、または二次代謝物である。

【0078】

本明細書で互換的に使用される用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも２個の共有結合で連結されたヌクレオチド単量体を指す。この用語は、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、そのハイブリッド、およびその混合物を包含する。ヌクレオチドは、典型的にはホスホジエステル結合によって核酸中で連結されているが、用語「核酸」はまた、他の型の連結または骨格（例えば、ホスホロチオエート、ホスホラミド、ホスホロジチオエート、Ｏ－メチルホスホロアミデート、モルホリノ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）連結または骨格など）を有する核酸アナログも包含する。核酸は、一本鎖、二本鎖であってもよいか、または一本鎖配列と二本鎖配列との両方の部分を含有してもよい。核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの任意の組合せ、ならびに例えば、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシルを含む塩基、および改変塩基または非標準塩基の任意の組合せを含有してもよい。

【0079】

本明細書における「タンパク質」とは、少なくとも２つの共有結合で連結されたアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸およびペプチド結合、または合成ペプチド模倣構造で構成されていてもよい。したがって、本明細書で使用される場合、「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、天然に存在するアミノ酸と合成アミノ酸との両方を意味する。例えば、ホモ－フェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明の目的にとってアミノ酸であると考えられる。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）配置であってもよい。一部の実施形態では、アミノ酸は、（Ｓ）またはＬ－配置である。天然に存在しない側鎖が使用される場合、非アミノ酸置換基を使用して、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでの分解を防止するか、または遅延させることができる。用語「部分」は、全長ポリペプチドまたは参照ポリペプチドよりも少ないアミノ酸（例えば、約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％少ないアミノ酸）を含有する、断片（例えば、切断生成物もしくは組換え産生された断片）またはエレメントもしくはドメイン（例えば、活性を有するポリペプチドの領域）などの、タンパク質の任意の領域を含む。

【0080】

本明細書で互換的に使用される、用語「ビーズ」、「粒子」および「ミクロスフェア」は、小さい個別の粒子を意味する。好適なビーズとしては、限定されるものではないが、常磁性ビーズ、磁気ビーズ、非磁気ビーズ、多孔性ビーズ、プラスチックビーズ、セラミックビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、メチルスチレンビーズ、アクリルポリマービーズ、カーボングラファイトビーズ、二酸化チタンビーズ、ラテックスまたは架橋デキストラン、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥビーズ、セルロースビーズ、ナイロンビーズ、架橋ミセル、およびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ビーズが挙げられる。一部の実施形態では、球状ビーズが使用されるが、非球状または不規則な形状のビーズを使用してもよいことが理解されるべきである。

【0081】

本明細書で使用される場合、用語「捕捉部分」とは、標的分析物に特異的に結合することができる任意の分子、粒子などを意味する。捕捉部分は、ビーズにコンジュゲート、捕捉、付着、結合、または固定されてもよい。例えば、一部の実施形態では、捕捉部分は、抗体（例えば、全長抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体）または抗原結合抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’_２、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、もしくはＦｅｂ））、アプタマー、抗体模倣物質（例えば、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、もしくはナノＣＬＡＭＰ）、抗体ＩｇＧ結合タンパク質（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、もしくは組換えタンパク質Ａ／Ｇ）、ポリペプチド、核酸、または低分子である。

【0082】

本明細書で使用される場合、用語「検出部分（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｏｉｅｔｙ）」または「検出部分（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｏｉｅｔｙ）」とは、標的分析物に特異的に結合するか、もしくはそうでなければ標的分析物と特異的に会合することができる任意の分子、粒子など、または標的分析物に結合するか、もしくはそうでなければ標的分析物と会合する別の分子（例えば、捕捉部分）を意味する。例えば、一部の実施形態では、検出部分は、抗体（例えば、全長抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体）または抗原結合抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’_２、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、もしくはＦｅｂ））、アプタマー、抗体模倣物質（例えば、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、もしくはナノＣＬＡＭＰ）、分子インプリントポリマー、受容体、ポリペプチド、核酸、または低分子である。

【0083】

本明細書で使用される場合、用語「シグナル増幅部分」とは、検出部分に特異的に結合する、またはそうでなければそれと特異的に会合することができ、検出を可能にする、検出可能な、例えば、増幅されたシグナルを生成することができる任意の分子、粒子などを意味する。シグナルは、任意の検出可能なシグナル、例えば、フローサイトメトリーもしくは光学アッセイによって検出可能な、光学的に検出可能な標識、例えば、蛍光もしくは化学発光、または比色標識であってもよいか、または任意の他の標識、例えば、非光学アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴もしくは他の方法を使用する）によって検出可能な、金ビーズもしくは他の標識であってもよい。一部の実施形態では、シグナル増幅部分は、酵素および／またはＤＮＡ分子、例えば、ＤＮＡプライマーおよび鋳型、例えば、直列に連結された同じＤＮＡ配列の複数のコピーを含有するコンカテマーまたは長い連続的ＤＮＡ分子を含む。シグナル増幅部分は、生成されたコンカテマーにハイブリダイズすることができる、検出可能な標識を有するプローブ、例えば、蛍光標識されたＤＮＡプローブをさらに含む。

【0084】

第１の部分（例えば、捕捉部分）が、第２の部分（例えば、標的分析物）と、試験試料の他の成分または夾雑物とを区別するのに十分な特異性で第２の部分に結合する場合、第１の部分は、第２の部分に「特異的に結合する」（またはその文法的変化形）。結合は、非特異的結合を除去するための洗浄ステップを含む、アッセイの条件下で結合したままになるのに一般的に十分なものであるが、一部の実施形態では、すなわち、低親和性結合パートナーを検出するためには、洗浄ステップは望ましくない。一部の実施形態では、第１の部分は、約１０^－５Ｍ、１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、１０^－１２Ｍ、１０^－１３Ｍ、１０^－１４Ｍ、１０^－１５Ｍの、またはそれより低い平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）で第２の部分に特異的に結合する。

【0085】

用語「交差反応性」とは、非標的分析物、例えば、異なる分析物、または夾雑物、または試験試料の他の成分との、標的分析物のための捕捉部分を含むビーズの非特異的結合を指す。

【0086】

用語「非共有結合性の親和性結合対」とは、分子の対、例えば、非共有結合複合体に結合し、それを形成する、第１のメンバーおよび第２のメンバーを指す。例示的な非共有結合性の親和性結合対としては、限定されるものではないが、ビオチン－ビオチン結合タンパク質（例えば、ビオチン－ストレプトアビジンおよびビオチン－アビジン）、リガンド－受容体、抗原－抗体もしくは抗原結合断片、ハプテン－抗ハプテン、免疫グロブリン（Ｉｇ）結合タンパク質－Ｉｇ、ジゴキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、または他の相補的結合パートナーが挙げられる。非共有結合性の親和性結合対のメンバーは、任意の好適な結合親和性を有してもよい。例えば、親和性結合対のメンバーは、約１０^－５Ｍ、１０^－６Ｍ、１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍ、１０^－１１Ｍ、１０^－１２Ｍ、１０^－１３Ｍ、１０^－１４Ｍ、１０^－１５Ｍの、またはそれより低い平衡解離定数（Ｋ_ＤまたはＫｄ）で結合してもよい。

【0087】

「病原体」は、限定されるものではないが、ウイルス（例えば、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス（例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）））、ヘルペスウイルス、アデノウイルスなど）、細菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、またはＥ．ｃｏｌｉ）、原生動物、真菌、またはプリオンを含む、その宿主に対して疾患または病気を引き起こし得る因子である。

【0088】

本明細書で使用される場合、「対象」とは、任意の動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒトである。対象となり得る他の動物としては、限定されるものではないが、非ヒト霊長類（例えば、サル、ゴリラ、およびチンパンジー）、飼育動物（例えば、ウマ、ブタ、ロバ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ヤク、アルパカ、およびラマ）、ならびにコンパニオンアニマル（例えば、ネコ、トカゲ、ヘビ、イヌ、魚、ハムスター、モルモット、ラット、マウス、および鳥類）が挙げられる。

【0089】

本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」および「マーカー」は、対象の試料におけるそのものの発現または存在を、本明細書に記載の方法によって検出することができ、それが、例えば、予後の決定にとって、または治療剤に対する哺乳動物対象の応答性もしくは感度のモニタリングにとって有用である、分析物（例えば、低分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、炭水化物、または糖脂質に基づく分子マーカー）を互換的に指す。

【0090】

本明細書で使用される場合、「生体試料」とは、体液、体組織（例えば、腫瘍組織）、細胞、または他の供給源を含む、対象から得られた、または対象に由来する任意の生体試料を指す。体液は、例えば、リンパ、全血（新鮮な、凍結された、または乾燥および再水和されたものを含む）、血漿（新鮮な、凍結された、または乾燥および再水和されたものを含む）、血清（新鮮な、凍結された、または乾燥および再水和されたものを含む）、末梢血単核細胞を含有する血液画分、尿、唾液、精液、汗、涙液、滑液、脳脊髄液、糞便、粘液、膣液、および髄液である。試料はまた、乳房組織、肝組織、膵組織、子宮頸部組織、腎組織、結腸組織、脳組織、筋肉組織、滑膜組織、皮膚、毛包、骨髄、腫瘍組織、組織溶解物もしくはホモジネート、または臓器溶解物もしくはホモジネートも含む。哺乳動物から組織生検および体液を取得するための方法は、当技術分野で周知である。

【0091】

「環境試料」とは、環境から得られる任意の試料、例えば、水試料、土壌試料、大気試料、地球外材料などを意味する。環境試料は、生体分子または生物を含有してもよい。

【0092】

本発明の方法
本発明は、試料中の標的分析物を検出する方法を提供する。方法は、試料中の標的分析物の濃度を測定することを含んでもよい。

【0093】

一態様では、本発明は、試料中の標的分析物を検出する方法を提供する。方法は、（ａ）標的分析物を含有するか、または含有することが疑われる試料を、標的分析物に特異的に結合する捕捉部分を含む複数のビーズと、試料中の標的分析物が捕捉部分に結合するのに十分な条件下および時間にわたって接触させるステップであって、複数のビーズが０個の標的分析物分子と会合し；複数のビーズが１個の標的分析物分子と会合し；少なくとも約２０％のビーズが０個または１個の標的分析物分子のいずれかと会合する、ステップ；（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、標的分析物に結合する検出部分と接触させるステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を、検出部分に結合するシグナル増幅部分と接触させて、標的分析物を担持するそれぞれのビーズに関する検出可能なシグナルを生成させるステップ；ならびに（ｄ）フローサイトメトリーによって検出可能なシグナルを検出することによって、試料中の標的分析物を検出するステップを含む。

【0094】

標的分析物を含有するか、または含有することが疑われる試料を、分析物のビーズへの結合を可能にして、ビーズ－分析物複合体を形成させる条件下で、目的の分析物に特異的に結合することができる捕捉部分にコンジュゲートされた複数のビーズと最初に接触させる。ビーズ－分析物複合体が形成されたら、方法は、分析物を、検出部分およびシグナル増幅部分と接触させること、ならびにフローサイトメトリーによる単一の標的分析物を担持する各ビーズの検出を可能にする、オンビーズの非拡散性検出可能シグナル、例えば、蛍光シグナルを生成させることを含む。ビーズ上にシグナルを局在化させることによって、本発明の方法は、マイクロウェルまたは液滴におけるシグナル区画化の必要性を取り除く。

【0095】

一部の実施形態では、本発明の方法のステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、またはその任意の組合せは、逐次、または同時に実施される。

【0096】

一部の実施形態では、ビーズの少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、０個または１個の標的分析物分子のいずれかと会合する。

【0097】

本発明の方法は、試料中の標的分析物の濃度を測定することも含む。一部の実施形態では、濃度は、標的分析物の存在を示す少なくとも１つのシグナルの強度レベルと比例する、例えば、正比例する、または反比例する。

【0098】

一部の実施形態では、本発明の方法は、約０ｍＭ～約５ｍＭ、例えば、約０．１ａＭ～約５ｍＭ、約０．１ａＭ～約４ｍＭ、約０．１ａＭ～約３ｍＭ、約０．１ａＭ～約２ｍＭ、約０．１ａＭ～約１ｍＭ、約０．１ａＭ～約１μＭ、約０．１ａＭ～約１ｎＭ、約０．１ａＭ～約１ｐＭ、約０．１ａＭ～約１ｆＭ、約０．１ａＭ～約９００ａＭ、約０．１ａＭ～約８００ａＭ、約０．１ａＭ～約７００ａＭ、約０．１ａＭ～約６００ａＭ、約０．１ａＭ～約５００ａＭ、約０．１ａＭ～約４００ａＭ、約０．１ａＭ～約３００ａＭ、約０．１ａＭ～約２００ａＭ、または約０．１ａＭ～約１００ａＭの検出限界を有する。一部の実施形態では、本発明の方法の検出限界は、約１ｆＭ、約９００ａＭ、約８００ａＭ、約７００ａＭ、約６００ａＭ、約５００ａＭ、約４００ａＭ、約３００ａＭ、約２００ａＭ、約１００ａＭ、約９０ａＭ、約８０ａＭ、約７０ａＭ、約６０ａＭ、約５０ａＭ、約４０ａＭ、約３０ａＭ、約２０ａＭ、約１０ａＭ、約１ａＭ、または約０．１ａＭである。

【0099】

本発明の方法は、試料中の１つまたは複数の追加の標的分析物の濃度を検出または測定することをさらに含んでもよい。一部の実施形態では、方法は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０種、またはそれより多い異なる標的分析物の濃度を検出または測定することを含んでもよい。

【0100】

一部の実施形態では、標的分析物は、低分子、タンパク質、核酸、多糖、脂質、細胞、脂肪酸、治療剤、生物、ウイルス、毒素、ペプチド、オリゴ糖、リポタンパク質、糖タンパク質、グリカン、またはホルモンである。追加の標的分析物は、本明細書に記載されるまたは当該技術分野で公知の任意の好適な標的分析物であり得る。一部の実施形態では、方法は、試料を、（ｉ）追加の標的分析物に特異的に結合する追加の捕捉部分を有する複数のビーズ；（ｉｉ）追加の標的分析物に結合する追加の検出部分、および（ｉｉｉ）追加の検出部分に結合する追加のシグナル増幅部分と接触させて、追加の検出可能なシグナルを生成させるステップをさらに含む。

【0101】

一態様では、本発明は、試料中の第１の標的分析物および第２の標的分析物を検出する方法を提供し、方法は、（ａ）第１の標的分析物および／または第２の標的分析物を含有するか、または含有することが疑われる試料を、（ｉ）第１の標的分析物に特異的に結合する第１の捕捉部分を含む複数の第１のビーズおよび（ｉｉ）第２の標的分析物に特異的に結合する第２の捕捉部分を含む複数の第２のビーズと、試料中の第１の標的分析物が第１の捕捉部分に結合するのに、および、試料中の第２の標的分析物が第２の捕捉部分に結合するのに十分な条件下および時間にわたって接触させるステップであって、複数の第１のビーズが０個の第１の標的分析物分子と会合し；複数の第１のビーズが１個の第１の標的分析物分子と会合し；少なくとも約２０％の第１のビーズが０個または１個の第１の標的分析物分子と会合し；および複数の第２のビーズが０個の第２の標的分析物分子と会合し；複数の第２のビーズが１個の第２の標的分析物分子と会合し；少なくとも約２０％の第２のビーズが０個または１個の第２の標的分析物分子と会合する、ステップ；（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、（ｉ）第１の標的分析物に結合する第１の検出部分、（ｉｉ）第２の標的分析物に結合する第２の検出部分と接触させるステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を、（ｉ）第１の標的分析物を担持する各ビーズについての第１の検出可能なシグナルを生成する第１の検出部分に結合する第１のシグナル増幅部分、および（ｉｉ）第２の標的分析物を担持する各ビーズについての第２の検出可能なシグナルを生成する第２の検出部分に結合する第２のシグナル増幅部分と接触させるステップ；ならびに（ｄ）フローサイトメトリーによって第１の検出可能なシグナルおよび第２の検出可能なシグナルを検出することによって、試料中の第１の標的分析物および第２の標的分析物を検出するステップを含む。

【0102】

別の態様では、本発明は、試料中の第１の標的分析物、第２の標的分析物および第３のまたはそれ以降の標的分析物を検出する方法であって、（ａ）試料中の第１の標的分析物が第１の捕捉部分に結合する、試料中の第２の標的分析物が第２の捕捉部分に結合する、および試料中の第３のまたはそれ以降の標的分析物が第３のまたはそれ以降の捕捉部分に結合するのに十分な条件下で、および時間にわたって、第１の標的分析物、第２の標的分析物および／または第３のまたはそれ以降の標的分析物を含有する、または含有すると疑われる試料を、（ｉ）第１の標的分析物に特異的に結合する第１の捕捉部分を含む複数の第１のビーズ、（ｉｉ）第２の標的分析物に特異的に結合する第２の捕捉部分を含む複数の第２のビーズ、および（ｉｉｉ）第３のまたはそれ以降の標的分析物に特異的に結合する第３のまたはそれ以降の捕捉部分を含む複数の第３のまたはそれ以降のビーズと接触させるステップであって、ここで、複数の第１のビーズが０個の第１の標的分析物分子と会合し、複数の第１のビーズが１個の第１の標的分析物分子と会合し、第１のビーズの少なくとも約２０％が０個または１個の第２の標的分析物分子のいずれかと会合し、複数の第２のビーズが０個の第２の標的分析物分子と会合し、複数の第２のビーズが１個の第２の標的分析物分子と会合し、第２のビーズの少なくとも約２０％が０個または１個の第２の標的分析物分子のいずれかと会合し、複数の第３のビーズが０個の第３の標的分析物分子と会合し、複数の第３のビーズが１個の第３の標的分析物分子と会合し、第３のビーズの少なくとも約２０％が０個または１個の第３の標的分析物分子のいずれかと会合する、ステップ；（ｂ）ステップ（ａ）の生成物を、（ｉ）第１の標的分析物に結合する第１の検出部分、（ｉｉ）第２の標的分析物に結合する第２の検出部分、および（ｉｉｉ）第３のまたはそれ以降の標的分析物に結合する第３のまたはそれ以降の検出部分と接触させるステップ；（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を、（ｉ）第１の検出部分に結合して第１の標的分析物を担持する各ビーズに関する第１の検出可能なシグナルを生成する第１のシグナル増幅部分、（ｉｉ）第２の検出部分に結合して第２の標的分析物を担持する各ビーズに関する第２の検出可能なシグナルを生成する第２のシグナル増幅部分、および（ｉｉｉ）第３のまたはそれ以降の検出部分に結合して第３のまたはそれ以降の標的分析物を担持する各ビーズに関する第３のまたはそれ以降の検出可能なシグナルを生成する第３のまたはそれ以降のシグナル増幅部分と接触させるステップ；ならびに（ｄ）フローサイトメトリーによって第１の検出可能なシグナル、第２の検出可能なシグナル、および第３のまたはそれ以降の検出可能なシグナルを検出し、それによって、試料中の第１の標的分析物、第２の標的分析物、および第３のまたはそれ以降の標的分析物を検出するステップを含む、方法を提供する。

【0103】

前述の方法はいずれも、試料中の１つまたは複数の標的分析物の濃度に基づいて、対象に関する、疾患、例えば、結核の予後または診断を提供することを含んでもよい。前述の方法はいずれも、試料中の１つまたは複数の標的分析物の濃度に基づいて、患者のための治療を選択することを含んでもよい。前述の方法はいずれも、試料中の１つまたは複数の標的分析物の濃度に基づく、治療により対象を処置することを含んでもよい。例えば、特定の実施形態では、方法を使用して、初期段階で検出および診断できることが活動性結核の発症および疾患の拡散を防止するために必要不可欠である疾患である、結核を予後または診断することができる。

【0104】

一部の実施形態では、本発明の方法は、１つまたは複数の標的分析物、例えば、試料中のＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって発現される１つまたは複数の分子を検出および／または定量することを含む。他の実施形態では、本発明の方法は、試料中の１つまたは複数の標的分析物の存在および／または濃度に基づく対象に関する結核の予後または診断を含む。方法はまた、試料中の１つまたは複数の標的分析物の存在および／または濃度に基づいて、治療を選択すること、または治療により対象を処置することを含んでもよい。

【0105】

ビーズ
本発明の方法は、所望の分析物に結合する捕捉部分にコンジュゲートされたマイクロまたはナノ粒子ビーズの使用を含む。ビーズは、様々な材料から作製することができる。一般に、ポリスチレンおよびポリエチレンなどの材料を含む、任意のポリマー材料またはプラスチック材料を使用して、マイクロ粒子、マイクロビーズ、またはナノ粒子を作出することができる。一部の実施形態では、マイクロ粒子は、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、および／またはポリアミドなどの生体適合性ポリマー材料から形成させることができる。ある特定の実施形態では、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ａｌ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｄ、Ｓｅ、Ｇｅ、Ｐｄ、Ｓｎ、酸化鉄、ＴｉＯ_２、Ａｌ_２Ｏ_３、およびＳｉＯ_２のうちの１つまたは複数から形成される金属、金属酸化物、半導体、および／または半導体酸化物製のマイクロおよび／またはナノ粒子を、多くのサイズで作製し、使用することができる。例えば、単結晶酸化鉄ナノ粒子（ＭＩＯＮ）および架橋酸化鉄（ＣＬＩＯ）粒子を使用することができる。限定されるものではないが、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、非磁気ビーズ、多孔性ビーズ、プラスチックビーズ、セラミックビーズ、ガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、メチルスチレンビーズ、アクリルポリマービーズ、カーボングラファイトビーズ、二酸化チタンビーズ、ラテックスまたは架橋デキストラン、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥビーズ、セルロースビーズ、ナイロンビーズ、架橋ミセル、およびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ビーズなどの、任意の好適なビーズを、本発明の文脈において使用することができる。ある特定の実施形態では、ビーズは、常磁性ビーズである。一部の実施形態では、ビーズは、様々な形状、サイズおよび／または色を有してもよい。一部の実施形態では、例えば、フローサイトメトリーによってビーズを検出または識別して、非特異的結合または交差反応性を除去することができるように、１個の分析物のための捕捉部分を含むビーズは、異なる分析物のためのビーズとは異なる形状、サイズおよび／または色を有する。一部の実施形態では、球状ビーズが使用されるが、非球状または不規則な形状のビーズを使用してもよい。一部の実施形態では、ビーズは、検出可能なシグナルまたは標識、例えば、蛍光標識、化学発光標識、もしくは比色標識を含むか、またはそれにコンジュゲートされる。一部の実施形態では、検出可能なシグナルまたは標識を、フローサイトメトリーもしくは光学アッセイ、または本明細書に記載される、もしくは当技術分野で公知の任意の他の検出方法によって検出することができる。ビーズ上の、標識、例えば、蛍光標識の色は、検出しようとするそれぞれ異なる分析物について異なっていてもよい。

【0106】

前述の方法のいずれかにおいて、ビーズは、磁気ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）である。一部の実施形態では、ビーズは、約０．０１μｍ～約１０μｍ、例えば、約０．０１μｍ、約０．１μｍ、約０．２μｍ、約０．３μｍ、約０．４μｍ、約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１μｍ、約１．５μｍ、約２μｍ、約２．５μｍ、約３μｍ、約３．５μｍ、約４μｍ、約４．５μｍ、約６μｍ、約６．５μｍ、約７μｍ、約７．５μｍ、約８μｍ、約８．５μｍ、約９μｍ、約９．５μｍ、または約１０μｍのサイズ（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、ビーズは、約１μｍ～約５μｍ、約１μｍ～約４μｍ、約１μｍ～約３μｍ、または約１μｍ～約２μｍのサイズを有する。

【0107】

前述の方法はいずれも、試料を、約１，０００個～約５，０００，０００個のビーズ、例えば、約１０００個、約２０００個、約５０００個、約１０，０００個、約２０，０００個、約３０，０００個、約４０，０００個、約５０，０００個、約６０，０００個、約７０，０００個、約８０，０００個、約９０，０００個、約１００，０００個、約２００，０００個、約３００，０００個、約４００，０００個、約５００，０００個、約６００，０００個、約７００，０００個、約８００，０００個、約９００，０００個、約１，０００，０００個、約２，０００，０００個、約３，０００，０００個、約４，０００，０００個、または約５，０００，０００個のビーズと接触させることを含んでもよい。一部の実施形態では、方法は、試料を、約２，０００個～約１００，０００個のビーズ、約１０，０００個～約５，０００，０００個のビーズ、約１０，０００個～約４，０００，０００個の捕捉プローブ、約１０，０００個～約３，０００，０００個のビーズ、約１０，０００個～約２，０００，０００個の捕捉プローブ、約１０，０００個～約１，０００，０００個のビーズ、約１０，０００個～約５００，０００個の捕捉プローブ、約１０，０００個～約４００，０００個のビーズ、約１０，０００個～約３００，０００個のビーズ、約１０，０００個～約２００，０００個のビーズ、または約１０，０００個～約１００，０００個のビーズと接触させることを含んでもよい。一部の実施形態では、方法は、試料を、約２，０００個のビーズ、約５，０００個のビーズ、約１０，０００個のビーズ、約２０，０００個のビーズ、約５０，０００個のビーズ、または約１００，０００個のビーズと接触させることを含んでもよい。一部の実施形態では、方法は、試料を、約２０，０００個のビーズと接触させることを含んでもよい。

【0108】

本発明の方法の感度および／または試料採取効率を、ビーズの数に基づいて調整することができる。一部の実施形態では、ビーズ数の減少は、方法の感度を改善することができる。他の実施形態では、ビーズ数の増加は、方法の感度を改善することができる。使用されるビーズの数を、検出されるそれぞれの分析物について最適化することもできる。

【0109】

捕捉部分、検出部分およびシグナル増幅部分
本発明の方法における使用のためのビーズは、目的の分析物に特異的に結合することができる捕捉部分でコーティングされる、例えば、それにコンジュゲートされる。捕捉部分が標的分析物に結合したら、ビーズ－分析物複合体が形成される。検出部分およびシグナル増幅部分は、単一の標的分析物を担持する各ビーズに関するオンビーズで非拡散性の検出可能なシグナルを生成させるために使用される。

【0110】

捕捉および／または検出部分は、標的分析物に特異的に結合するか、またはそうでなければそれと特異的に会合することができる。任意の好適な捕捉および／または検出部分を、本発明の文脈において使用することができる。例えば、一部の実施形態では、捕捉部分および／または検出部分は、抗体、アプタマー、抗体模倣物質、ポリペプチド、核酸、分子インプリントポリマー、受容体、結合タンパク質、または低分子であってもよい。抗体は、全長抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、もしくはＩｇＭ抗体）または抗原結合抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’_２、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、もしくはＦｅｂ）であってもよい。抗体模倣物質は、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、モノボディ、またはナノＣＬＡＭＰであってもよい。

【0111】

一部の実施形態では、捕捉および／または検出部分は、例えば、分析物がタンパク質またはペプチドである場合、分析物に結合する抗体もしくはその抗原結合部分またはアプタマーである。一部の実施形態では、捕捉および／または検出部分は、目的の核酸の一部と相補的であるオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、捕捉および／または検出部分は、分析物がホルモンなどの分子である場合、タンパク質、例えば、受容体のリガンド結合部分である。

【0112】

方法は、オンビーズシグナル増幅ステップをさらに含む。具体的には、方法は、試料を、検出部分に結合して、単一の標的分析物を担持する各ビーズの検出を可能にする検出可能なシグナルを生成するシグナル増幅部分と接触させることを含む。シグナルは、任意の検出可能なシグナルであってもよい。一部の実施形態では、シグナルは、フローサイトメトリーまたは光学アッセイによって検出可能な、蛍光または化学発光または比色標識などの光学的に検出可能な標識を含む。

【0113】

一部の実施形態では、シグナル増幅部分は、酵素、例えば、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、および／または核酸分子、例えば、ＤＮＡプライマーおよび鋳型、例えば、直列に連結された同じＤＮＡ配列の複数のコピーを含有するコンカテマーまたは長い連続的ＤＮＡ分子を含む。シグナル増幅部分は、生成されたコンカテマーにハイブリダイズすることができる、検出可能な標識を有するプローブ、例えば、蛍光標識されたＤＮＡプローブまたは蛍光標識されたＤＮＡプローブのレシオメトリック（ｒａｔｉｏｍｅｔｒｉｃ）な組合せをさらに含む。一部の実施形態では、検出可能な標識は、異なる標的分析物について異なる色を含む。一部の実施形態では、異なる標的分析物を、異なるビーズ、例えば、異なる色、蛍光強度、形状またはサイズを有するビーズと、異なる検出可能な標識、例えば、異なる色または異なる比の色を有する標識との組合せを使用することによって検出することができ、これをフローサイトメトリーによって識別することができる。

【0114】

一部の実施形態では、方法は、例えば、フローサイトメトリーによってビーズおよび検出可能なシグナルを検出することによって、交差反応性または非特異的結合を減少させる。一部の実施形態では、蛍光標識をコードした捕捉ビーズと、ＤＮＡ鋳型にコンジュゲートされた検出抗体との独自の対が、各分析物について使用される。それぞれの独自のＤＮＡ鋳型にコンジュゲートされた抗体は、ＲＣＡ反応の間に増幅された場合、特異的な蛍光色素とコンジュゲートしたＤＮＡプローブまたは色素とコンジュゲートしたＤＮＡプローブのレシオメトリックな組合せで標識される。それぞれのプローブの色または色のレシオメトリックな組合せを、フローサイトメトリーにおける複数の検出チャネルを使用して識別することができる。ビーズ上での単一の分析物分子の捕捉の際に、独自のプライマー－鋳型配列とコンジュゲートした検出抗体の混合物を添加し、その後、洗浄し、蛍光色素とコンジュゲートしたＤＮＡプローブの混合物を含有するＲＣＡ反応中に再懸濁する。各分析物は、（１）捕捉ビーズの色、蛍光強度、またはサイズと、（２）蛍光プローブの色または色の比との独自の対に対応する。結果として、捕捉ビーズとプローブシグナルとの「正確な」一致した対のみが、各分析物について「オン」ビーズと分類されるが、捕捉ビーズとプローブの色の「誤った」対、すなわち、交差反応性結合事象は、さらなる分析から除外される。

【0115】

一部の実施形態では、検出可能なシグナルは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって生成される。ＲＣＡのために、ストレプトアビジン標識または検出抗体は、ＤＮＡプライマーおよび鋳型とコンジュゲートされる。各ビーズ－分析物複合体に結合した生成されたＤＮＡコンカテマーを、検出のための多数の相補的な蛍光標識されたＤＮＡプローブとハイブリダイズさせることができる。これらの方法では、ＲＣＡの時間を増加または減少させることによって、感度を調整することができる。

【0116】

他の核酸増幅法、例えば、ハイブリダイゼーション連鎖反応、ループ媒介性等温増幅、ラジカル重合、酵素触媒近接標識（ＰＬ）重合（例えば、Ｂｒａｎｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１８， ３６（９）：８８０－８８７を参照されたい）；重合に基づくシグナル増幅（例えば、Ｂａｄｕ－Ｔａｗｉａｈ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ Ｃｈｉｐ， ２０１５， １５， ６５５に記載された、例えば、可視光誘導性重合）；磁気ビーズ－量子ドットイムノアッセイ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， ＡＣＳ Ｓｅｎｓ． ２０１７， ２， ６， ７６６－７７２）；またはイムノシグナルハイブリダイゼーション連鎖反応（ｉｓＨＣＲ）（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１８ Ａｐｒ；１５（４）：２７５－２７８）を使用して、オンビーズシグナルを生成することができる。Ｄｕｎｂａｒ ａｎｄ Ｄａｓ， Ｊ Ｃｌｉｎ Ｖｉｒｏｌ． ２０１９； １１５： １８－３１に記載されたような、分岐ＤＮＡアッセイを使用することもできる。

【0117】

あるいは、増幅されたオンビーズシグナルを、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）、ビオチンリガーゼ、および操作されたアスコルビン酸ペルオキシダーゼなどの近接依存性標識法を使用して生成することができる。触媒リポーター沈着（ＣＡＲＤ）とも称されるＴＳＡは、低存在量で存在する分析物の検出を可能にする高感度法である。ＴＳＡは、免疫組織化学およびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験において使用されており、デジタルＥＬＩＳＡのために使用されてきた（Ａｋａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ２０１６， ８８ （１４）， ７１２３－７１２９）。ＴＳＡでは、ＨＲＰ（例えば、第２の結合部分に結合した）は、標識されたチラミドの、反応性ラジカルへの変換を触媒した後、近隣のチロシン残基に共有結合し、高密度の検出可能なシグナルを生成する。

【0118】

一部の実施形態では、方法は、検出部分を、前増幅させたシグナル、例えば、標識されたポリマーまたはナノ粒子または核酸コンカテマーと接触させることを含む；例えば、Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｓｔ， ２０１３，１３８， ９８１－９９０；Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ． ２００８； ３９２（１－２）： １６７－１７５；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ ２０１７， ２， ７６０－７９０；Ｇｏｒｍｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ． ２０１４， １４， １１， ６３６８－６３７３（酵素または金属イオンによって生成されたラジカルを重合させて、複数の金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）を絡ませるポリマーを形成させる））；Ｍｅｌｎｙｃｈｕｋ ａｎｄ Ｋｌｙｍｃｈｅｎｋｏ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２０１８， １４０， ３４， １０８５６－１０８６５（色素をロードしたポリマー性ナノ粒子）を参照されたい。

【0119】

一部の実施形態では、検出部分は、シグナル増幅部分に直接連結される。一部の実施形態では、検出部分およびシグナル増幅部分は、間接的に、例えば、非共有結合性の親和性結合対によって連結され、ここで、検出部分は、非共有結合性の親和性結合対の第１のメンバーに連結され、シグナル増幅部分は、非共有結合性の親和性結合対の第２のメンバーに連結される。一部の実施形態では、非共有結合性の親和性結合対は、ビオチン－ストレプトアビジン、ビオチン－アビジン、ジゴキシゲニン、ＳＮＡＰタグ、ＣＬＩＰタグ、リガンド－受容体、抗原－抗体、または抗体結合タンパク質－抗体、または当技術分野で公知の任意の他の相補的結合パートナーである。一部の実施形態では、検出部分はビオチン分子に結合され、シグナル増幅部分、例えば、ＤＮＡコンカテマーはストレプトアビジン分子にコンジュゲートされる。

【0120】

検出
本発明は、フローサイトメトリーによるシグナル分子計数化を可能にする単一の捕捉された標的分子からのオンビーズシグナル生成を使用する。非拡散性蛍光シグナルを、標的分子を担持する各ビーズに局在化することによって、この方法は、フローサイトメトリーによって「オン」および「オフ」ビーズを迅速に計数することを可能にする。

【0121】

本発明は、いくつかの点で過去のデジタル検出法とは異なる：（１）シグナルは各ビーズに局在化され、したがって、複雑な微細加工または液滴生成に関する要件を取り除くので、それはシグナル区画化のためにマイクロウェルまたは液滴などの個々の容器中へのビーズ単離を必要としない；（２）それは現在のＳｉｍｏａ技術よりも多いパーセンテージのビーズを計数することができ（約５％と比較して少なくとも３０％）、したがって、検出限界を約一桁改善するため、それは稀な標的分子の試料採取効率を増加させる；（３）フローサイトメトリーは、多くの研究室が容易に利用でき、低費用でマイクロフルイディックシステムに適合化させることもでき、本発明を、現行の検査基盤および診療現場形式への迅速な組み込みにより適したものにする。

【0122】

さらに、本発明は、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイなどの他のフローサイトメトリーに基づくイムノアッセイとは異なる：（１）それは、現行のフローサイトメトリーに基づくイムノアッセイにおけるようにビーズあたり複数の標的分子の代わりに、ビーズ上に単一の標的分子を捕捉することによってデジタル検出を達成し、したがって、数桁のはるかに低い検出限界を可能にする；（２）それは、フローサイトメトリーによって検出可能なシグナルを生成するためにビーズあたり複数の標的分子を必要とする蛍光標識された二次抗体に依拠するのではなく、それぞれ個々の標的分子に関する検出可能なシグナルを得るためにシグナル増幅を使用する。

【0123】

以前のデジタルＥＬＩＳＡ法と比較した本発明の別の重要な利点は、はるかにより迅速な、自動化されたシグナル読み出しである。多くのベンチトップ型フローサイトメーターに既に組み込まれている９６ウェルプレート試料採取モードによる自動化は、最新式のワークフローをさらに提供する。

【0124】

一部の実施形態では、シグナル検出にかかる時間は、試料あたり約５分未満である。一部の実施形態では、シグナル検出にかかる時間は、試料あたり約４分未満である。一部の実施形態では、シグナル検出にかかる時間は、試料あたり約３分未満である。一部の実施形態では、シグナル検出にかかる時間は、試料あたり約２分未満である。一部の実施形態では、シグナル検出にかかる時間は、試料あたり約１分未満である。一部の実施形態では、シグナル検出にかかる時間は、試料あたり約３０秒未満である。

【0125】

本発明の方法によって生成されるオンビーズシグナルを検出および／または定量することができ、検出および／または定量を、試験される試料中の標的分析物の存在、量、および／または濃度を関連付けることができる。

【0126】

一部の実施形態では、オンビーズシグナルは、フローサイトメーターによって検出される。フローサイトメーターは、粒子懸濁液を狭い管の中に供給し、懸濁された粒子を１個ずつ分離し、それぞれの粒子にレーザーを照射し、ならびにレーザーによって励起された粒子からの蛍光放射および粒子によるレーザーの散乱を検出および測定する装置である。

【0127】

本発明における使用のためのフローサイトメーターは特に限定されず、任意の従来のフローサイトメーターをそのまま使用することができる。それは、例えば、１つまたは複数の検出領域中で単一波長の光を放出するレーザー源（例えば、Ｈｅ／Ｎｅまたはアルゴン）を有する。異なる波長で光を放出するレーザー源を、異なる検出領域にインストールすることができる。レーザーを、ビーム整形レンズを使用することによって収束させることができる。

【0128】

レーザーを照射する前に、ビーズを縦一列に集中させる。伝統的なフローサイトメーターでは、シース液（例えば、ＩｓｏＦｌｏｗシース液（商標名、Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒによって製造）、Ｄａｋｏシース液（商標名、Ｄａｋｏ Ｊａｐａｎによって製造）など）、および標的分析物を含有する試料溶液をフローセルに導入し、そこでシース液および試料溶液は相互に混合することなく層流を形成する。フローセルにおける流動中に、試料コアがシース液の間に保持され、それがレーザー照射ゾーンを通過するときにレーザーによって照射されるにつれて、試料溶液は試料コアを形成しながら流動する。しかしながら、Ｄｅａｎフォーカシング、粘弾性フォーカシング、物理的閉じ込め、または他の方法を使用して、ビーズを整列させることもできる。

【0129】

一部の実施形態では、フローサイトメーターは、単一の標的分子に関する検出データの獲得を可能にする。他の実施形態では、フローサイトメーターは、単一の測定操作で複数の標的の同時測定を可能にする。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的分析物を、異なるビーズ、例えば、異なる色、形状またはサイズを有するビーズと、異なる検出可能な標識、例えば、異なる色を有する標識との組合せを使用することによって検出することができ、これをフローサイトメトリーによって識別することができる。

【0130】

本発明における使用のためのフローサイトメーターは、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙによって製造）、ＰＥＲＦＬＯＷ Ａｎａ（Ｔｈｅ Ｆｕｒｕｋａｗａ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって製造）、ＥＰＩＣＳ ＡＬＴＲＡ（Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒによって製造）、ＣｙＡｎ（Ｄａｋｏ Ｊａｐａｎによって製造）、またはＪＳＡＮ（Ｂａｙ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．によって製造）などの市販のフローサイトメーターであってもよい。「フローサイトメーター」はまた、ビーズおよびオンビーズシグナルの検出を可能にするのに十分なフローサイトメーターの一部の、または全部の特徴を再現する他のデバイスも含むことが理解される。

【0131】

標的分析物
当業者によって理解されるように、本発明の方法を使用して、多数の標的分析物を検出し、必要に応じて、定量することができる。任意の好適な標的分析物を、本発明の方法を使用して調査することができる。以下に列挙される標的分析物が非限定例として提供される。標的分析物は、天然に存在するか、または合成であってもよい。

【0132】

一部の実施形態では、標的分析物は、限定されるものではないが、タンパク質（例えば、抗体、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１３、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、ＩＬ－１６、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－２０、ＩＬ－２１、ＩＬ－２２、ＩＬ－２３、ＩＬ－２４、ＩＬ－２５、ＩＬ－２６、ＩＬ－２７、ＩＬ－２８、ＩＬ－２９、ＩＬ－３０、ＩＬ－３１、ＩＬ－３２、ＩＬ－３３、ＩＬ－３５、もしくはＩＬ－３６）、リンホカイン、モノカイン、インターフェロン（ＩＦＮ、例えば、ＩＦＮ－ベータおよびＩＦＮ－ガンマ）、コロニー刺激因子（例えば、ＣＳＦ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦなど）、ケモカイン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－アルファおよびＴＮＦ－ベータを含むＴＮＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）など）、受容体（例えば、インターロイキン受容体、受容体チロシンキナーゼなど）、リガンド、酵素（例えば、ポリメラーゼ、カテプシン、カルパイン、アミノトランスフェラーゼ（例えば、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）もしくはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ））、プロテアーゼ（例えば、カスパーゼ）、リパーゼ、オキシドレダクターゼ、キナーゼ、ヌクレオチドシクラーゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼなど）、もしくはプリオン）、核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、例えば、マイクロＲＮＡ）、多糖、脂質、細胞（例えば、原核細胞（例えば、細菌（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、もしくはＥ．ｃｏｌｉ））もしくは真核細胞（例えば、真菌細胞もしくはヒト細胞）、腫瘍細胞を含む）、脂肪酸、糖タンパク質、生体分子、治療剤（例えば、抗体、融合タンパク質（例えば、Ｆｃ融合タンパク質）、サイトカイン、可溶性受容体など）、生物（例えば、病原体）、ウイルス（例えば、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、レンチウイルスなど）、または低分子を含む。一部の実施形態では、標的分析物は、細菌、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって発現される分子であってもよい。一部の実施形態では、標的分析物は、翻訳後改変（例えば、リン酸化、メチル化、グリコシル化、ユビキチン化など）されていてもよい。

【0133】

一部の実施形態では、標的分析物は、少なくとも約１０００Ｄａ、例えば、少なくとも約１５００Ｄａ、少なくとも約２０００Ｄａ、少なくとも約２５００Ｄａ、少なくとも約３０００Ｄａ、少なくとも約３５００Ｄａ、少なくとも約４０００Ｄａ、少なくとも約４５００Ｄａ、または少なくとも約５０００Ｄａの分子量を有する。

【0134】

一部の実施形態では、標的分析物は、捕捉部分および検出部分によって認識され得る１つまたは複数の結合部位を有してもよい。標的分析物を、本発明の方法に基づくサンドイッチアッセイ形式で検出することができる。一部の実施形態では、ビーズは、０個もしくは１個の標的分析物分子のいずれかと会合し得るか、またはビーズを、１つもしくは複数の、例えば、１、２、３、４、もしくは５個、もしくはそれより多い標的分析物分子と会合してもよい。

【0135】

本明細書に記載される方法はいずれも、例えば、多重化アッセイにおいて、標的分析物を検出すること、および必要に応じて、それを定量することをさらに含んでもよい。例えば、一部の実施形態では、方法は、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０種、またはそれより多い異なる標的分析物を検出し、必要に応じて、定量することを含んでもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的分析物を、異なるビーズ、例えば、異なる色、形状またはサイズを有するビーズと、異なる検出可能な標識、例えば、異なる色を有する標識との組合せを使用することによって検出することができ、これをフローサイトメトリーによって識別することができる。

【0136】

一部の実施形態では、標的分析物は、翻訳後改変（例えば、リン酸化、メチル化、グリコシル化、ユビキチン化など）されていてもよい。

【0137】

前述の方法のいずれかにおいて、試料中の標的分析物の濃度は、約０ｍＭ～約５ｍＭ、例えば、約０．１ａＭ～約５ｍＭ、約０．１ａＭ～約４ｍＭ、約０．１ａＭ～約３ｍＭ、約０．１ａＭ～約２ｍＭ、約０．１ａＭ～約１ｍＭ、約０．１ａＭ～約１μＭ、約０．１ａＭ～約１ｎＭ、約０．１ａＭ～約１ｐＭ、約０．１ａＭ～約１ｆＭ、約０．１ａＭ～約９００ａＭ、約０．１ａＭ～約８００ａＭ、約０．１ａＭ～約７００ａＭ、約０．１ａＭ～約６００ａＭ、約０．１ａＭ～約５００ａＭ、約０．１ａＭ～約４００ａＭ、約０．１ａＭ～約３００ａＭ、約０．１ａＭ～約２００ａＭ、または約０．１ａＭ～約１００ａＭの範囲であってもよい。

【0138】

前述の方法のいずれかにおいて、ビーズおよび試料のためのインキュベーション時間を調整して、バックグラウンドに対するシグナル比（ｓｉｇｎａｌ－ｔｏ－ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｒａｔｉｏ）および分析感度を増強することができる。一部の実施形態では、インキュベートすることを、約１分～約４８時間、約１分～約１０時間、または約１時間～約４時間にわたって実施することができる。一部の実施形態では、インキュベートする時間は、約分、約５分、約１０分、約２０分、約３０分、約４０分、約５０分、約６０分、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約４０時間、または約４８時間である。

【0139】

一部の実施形態では、ビーズおよび試料は、約１０分間、約２０分間、約３０分間、約４０分間、約５０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、または約５時間にわたってインキュベートされる。一実施形態では、インキュベートする時間は、約１時間である。

【0140】

試料
任意の好適な試料を、本発明の文脈において使用することができる。例えば、一部の実施形態では、試料は、液体試料（例えば、生体試料または環境試料）である。例示的な生体試料としては、限定されるものではないが、体液、体組織（例えば、腫瘍組織）、細胞、または他の供給源が挙げられる。例示的な体液としては、限定されるものではないが、例えば、リンパ、全血（新鮮な、または凍結されたものを含む）、血漿（新鮮な、または凍結されたものを含む）、血清（新鮮な、または凍結されたものを含む）、末梢血単核細胞を含有する血液画分、尿、唾液、精液、汗、涙液、滑液、脳脊髄液、糞便、粘液、膣液、および髄液が挙げられる。試料はまた、乳房組織、肝組織、膵組織、子宮頸部組織、肺組織、腎組織、結腸組織、脳組織、筋肉組織、滑膜組織、皮膚、毛包、骨髄、腫瘍組織、組織溶解物もしくはホモジネート、および臓器溶解物もしくはホモジネートも含む。哺乳動物から組織生検および体液を取得するための方法は、当技術分野で周知である。他の実施形態では、試料は、環境試料、例えば、水試料、土壌試料、大気試料、地球外材料などであってもよい。

【0141】

分析される流体試料の体積は、潜在的には、例えば、使用される／利用可能な捕捉プローブの数、検出プローブの数などのいくつかの因子に応じて、様々な範囲の体積内の任意の量であってもよい。非限定例として、試料体積は、約０．０１μｌ、約０．１μｌ、約１μｌ、約５μｌ、約１０μｌ、約１００μｌ、約１ｍｌ、約５ｍｌ、約１０ｍｌなどであってもよい。一部の場合、流体試料の体積は、約０．０１μｌ～約１０ｍｌ、約０．０１μｌ～約１ｍｌ、約０．０１μｌ～約１００μｌ、または約０．１μｌ～約１０μｌである。

【0142】

一部の実施形態では、本明細書に記載の方法における使用の前に流体試料を希釈してもよい。例えば、分析物分子の供給源が体液（例えば、血液、血漿、または血清）である実施形態では、流体を適切な溶媒（例えば、ＰＢＳ緩衝液などの緩衝液）で希釈してもよい。流体試料を、使用前に、約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、またはそれより大きく希釈してもよい。試料を、複数の捕捉プローブもしくは検出可能部分を含む溶液に添加するか、または複数の捕捉プローブもしくは検出可能部分を試料に直接添加するか、もしくは溶液として添加することができる。

【0143】

組成物
本発明は、試料中の標的分析物の検出および必要に応じて、定量において使用することができる組成物を提供する。例えば、本発明は、（ａ）複数の捕捉部分（例えば、抗体）に連結されている、ビーズ（例えば、常磁性ビーズ）、（ｂ）検出部分（例えば、抗体）、この検出部分は、非共有結合性の親和性結合対の第１のメンバー（例えば、ビオチン部分）に連結されている、および（ｃ）シグナル増幅部分（例えば、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡプライマー、ＤＮＡコンカテマー、および蛍光標識されたプローブ）、このシグナル増幅部分（例えば、ＤＮＡコンカテマー）は、非共有結合性の親和性結合対の第２のメンバー（例えば、ストレプトアビジン部分）に連結されている、を含む組成物であって、検出部分がビーズ上の捕捉部分によって捕捉された標的分析物の１つに結合し、シグナル増幅部分が、非共有結合性の親和性結合対の第１のメンバーが非共有結合性の親和性結合対の第２のメンバーに結合することによって検出部分に結合している、組成物を提供する。

【0144】

キット
本発明は、流体試料中の標的分析物の濃度を検出または測定するためのキットを提供する。キットは、例えば、複数のビーズ（例えば、常磁性ビーズ）を含んでもよい。提供される複数のビーズは、本明細書に記載のような、様々な特性およびパラメーターを有してもよい。複数のビーズを、標的分析物に特異的に結合する捕捉部分でコーティングすることができる。また、複数のビーズを、検出のために、検出可能なシグナルまたは標識、例えば、蛍光標識にコンジュゲートすることもできる。キットは、標的分子がビーズ上の捕捉部分によって捕捉されたら、標的分子に特異的に結合することができる検出部分を含んでもよい。キットは、フローサイトメトリーによって検出可能であるオンビーズ非拡散性シグナルを生成することができるシグナル増幅部分をさらに含んでもよい。提供される捕捉部分、検出部分およびシグナル増幅部分は、本明細書に記載されるような、様々な特性およびパラメーターを有してもよい。

【0145】

キットはまた、検出可能なシグナルにより試料を収集するための反応容器を含んでもよい。反応容器を、試料中のビーズを受け取って、含有するように構成することができる。

【0146】

本明細書に記載されるキットおよび製品を、例えば、実施例において、本明細書に記載される方法またはアッセイのいずれかを実行するために構成することができる。

【0147】

一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の成分の使用のための指示を含んでもよい。すなわち、キットは、例えば、流体試料中の標的分析物（複数可）の濃度の尺度を決定するためのシステムと共に使用するための、ビーズおよび反応容器の使用の記載を含んでもよい。本明細書で使用される場合、「指示」は、指示および／または推奨（ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ）の構成要素を定義し、典型的には、本発明の包装に関する、またはそれと関連する書面による指示を含んでもよい。指示はまた、キットの使用者が、指示がキットと関連することを明確に認識するような任意の様式で提供される任意の口頭の、または電子的な指示を含んでもよい。さらに、キットは、本明細書に記載されるように、特定の適用に応じて他の成分を含んでもよい。

【実施例】

【0148】

本発明は、以下の実施例を参照することによって、より完全に理解される。しかしながら、それらは、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示目的に過ぎず、その観点で様々な改変または変更が当業者に示唆され、本出願の趣旨および範囲内ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることが理解される。

【0149】

（実施例１）
ＭＯＳＡＩＣ：アトモル感度を有するハイスループット高多重デジタルタンパク質検出
多くの臨床診断適用における主要な課題は、血漿または唾液などの生体液中の低存在量のタンパク質および他の生体分子の測定である。デジタル酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などのデジタル技術の出現は、従来のタンパク質検出法と比較して１０００倍の感度の増大を可能にした。しかしながら、現在のデジタルＥＬＩＳＡ技術は、その検出限界未満で存在するバイオマーカーに対する不十分な感度を依然として有しており、特殊な機器または時間消費的なワークフローを必要とし、その幅広いインプリメンテーションを限定してきた。これらの課題に対処するために、本発明者らは、これらの他の方法と比較して、感度の一桁の増強と共に、低アトモル濃度の検出限界を達成する、より高感度、最新式で迅速なデジタルＥＬＩＳＡプラットフォームである、個別計数化のための分子オンビーズシグナル増幅（ＭＯＳＡＩＣ）を開発した。ＭＯＳＡＩＣは、処理量を大きく増加させ、現行の検査基盤に容易に統合される、迅速な、自動化可能なフローサイトメトリー読み出しを使用する。ＭＯＳＡＩＣは稀な標的分子のための高い試料採取効率を提供するため、アッセイビーズ数を容易に調整して、高い測定精度を有してバックグラウンドに対するシグナル比を増強することができる。さらに、ＭＯＳＡＩＣの溶液に基づくシグナル読み出しは、マイクロウェルまたは液滴に基づくデジタル法とは対照的に、フェムトモルまたはそれより下の感度で高次多重化について同時に分析することができるビーズ型の数を拡大する。原理証明の実証として、唾液中の低存在量サイトカインの検出能および血漿中の８種のタンパク質分析物の超高感度多重化測定の改善を目指して、ＭＯＳＡＩＣを適用した。ＭＯＳＡＩＣのアトモル感度、迅速な処理量、および広い多重化機能は、タンパク質バイオマーカー探索ならびに多様な疾患適用のための診断検査を潜在的に促進することができる非常に利用しやすく多用途の超高感度プラットフォームを提供する。

【0150】

ＭＯＳＡＩＣプラットフォームの開発。
迅速なフローサイトメトリーシグナル読み出しを示す超高感度デジタルＥＬＩＳＡプラットフォームを確立するために、過剰数の抗体でコーティングされたビーズ上に捕捉された単一の標的分子から局在化蛍光シグナルを生成するための方法を使用した（図１）^６。ビーズ上での単一の免疫複合体サンドイッチの形成およびＤＮＡプライマー－鋳型対にコンジュゲートしたストレプトアビジンによる標識化の際に、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を実行して、それぞれの免疫複合体サンドイッチに結合したＤＮＡコンカテマーを形成させる。ＲＣＡ反応への蛍光標識されたＤＮＡプローブの組み込みは、コンカテマーへのｉｎ ｓｉｔｕでのハイブリダイゼーションを可能にし、したがって、標的分子を担持する各ビーズ上で強力な蛍光シグナルを産生する。増幅されたシグナルはそれぞれの免疫複合体サンドイッチに結合するため、続いて、個々のビーズを、蛍光「オン」および「オフ」ビーズの計数化のためのフローサイトメトリーによって分析する。

【0151】

この読み出し法を使用して計数する単一分子の実現可能性を評価するために、がん、自己免疫疾患、および感染症全体にわたって多様な役割を有する抗炎症性サイトカインであるインターロイキン－１０（ＩＬ－１０）の検出を目指してＭＯＳＡＩＣを最初に適用した^{１２、１３}。「オン」ビーズは、ＲＣＡコンカテマーの不均一なサイズ分布のため、様々な範囲の蛍光強度に及んだ。期待値最大化を使用して蛍光強度値に２混合ガウスモデルを当てはめることによって、「オン」ビーズと「オフ」ビーズとを識別するためのカットオフ値を決定した^１４。より低い濃度では、ほぼ全てのビーズがより低い（「オフ」）ガウスモデルに入り、それらがこのガウスモデルの平均の５標準偏差より高かった場合、ビーズを「オン」として計数した。より高い濃度では、標識が「オフ」または「オン」ガウスモデルから引き出される尤度に基づいてビーズについてそれらを予測した。このアルゴリズムを使用して、本発明者らは、「オン」ビーズの画分の尺度である、ビーズあたりの平均分子（ＡＭＢ）を一貫して定量することができた。

【0152】

ＭＯＳＡＩＣにおける高い試料採取効率は感度を改善させる。
重要なことに、ほぼ全てのビーズ溶液をフローサイトメトリーによって分析することができるため、ＭＯＳＡＩＣは高い試料採取効率を達成する。試料あたり全初期アッセイビーズの約５０～６０％が分析され、これはＳｉｍｏａと比較して試料採取効率の１０倍を上回る増加に相当する。十分な測定精度を維持しながら、全アッセイビーズの数を減少させること、標的分子のビーズに対する比、それによって、バックグラウンドに対するシグナル比を増大させることによって、ＭＯＳＡＩＣの分析感度を最大化することができる。ＭＯＳＡＩＣにおけるより少ないビーズ数を使用して感度を増強する可能性を活用するために、アッセイビーズ数を、ＩＬ－１０については１００，０００個から２，０００個まで体系的に変化させた。バックグラウンドに対するシグナル比は、ビーズ数の減少と共に改善した（図２Ａ）。バックグラウンドに対するシグナル比の改善を定量するために、０．２ｆＭのキャリブレータ―のバックグラウンドに対するシグナル比を、それぞれの較正曲線において、１００，０００個のビーズの較正曲線のものに対して正規化した。この相対バックグラウンドに対するシグナル比はビーズの数が減少するにつれ増大し、検出限界（ＬＯＤ）の対応する改善が観察され、１００，０００個のビーズと比較して感度が約一桁増強された（図２Ｂ）。しかしながら、ビーズ数を２，０００個のビーズまでさらに減少させたとき、非常に少ないビーズ数での測定精度に対するポアソンノイズの効果の増大に起因して、分析感度はさらに改善しなかった。最大感度は２０，０００個のビーズで達成され、ＬＯＤは１５．９ａＭで、これは、対応するＳｉｍｏａアッセイと比較して１２倍を上回る感度の増強を表している（図２Ｃおよび表１）。標準的なＳｉｍｏａアッセイは、典型的には５００，０００個の全アッセイビーズを使用するが、ＭＯＳＡＩＣとのより密接な比較のために、分析された全ビーズがより少ないにもかかわらず、バックグラウンドに対するシグナル比の改善のために４００，０００個のヘルパービーズと共に１００，０００個のアッセイビーズが使用された。
表１． 様々な分析物に関する最適化されたＭＯＳＡＩＣアッセイおよび対応するＳｉｍｏａアッセイの検出限界（ＬＯＤ）および定量下限 （ＬＬＯＱ）値。ＬＯＤおよびＬＬＯＱ値は、バックグラウンドを上回る、それぞれ３および１０標準偏差として算出される。

【表1】

【0153】

ビーズ数を減らすことが他の分析物についてもＭＯＳＡＩＣの感度を同様に増強することができるかどうかを評価するために、ＭＯＳＡＩＣプラットフォームを追加のサイトカインにも拡大し、各分析物に対するビーズ数の同様の変更を実施した（図２Ｄ、図６Ａ～６Ｅおよび表２）。１００，０００個から１０，０００個へのビーズ数の減少の際のバックグラウンドに対するシグナルの改善は、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、およびインターロイキン－１２ｐ７０（ＩＬ－１２ｐ７０）についても観察され、最適感度はＩＦＮ－γおよびＩＬ－８については１０，０００個のビーズで達成された。ＩＬ－１２ｐ７０については、バックグラウンドに対するシグナルの増大にもかかわらず、感度は全ビーズ数にわたって依然として類似していたが、１００，０００個のアッセイビーズを使用して５．８ａＭの最も低いＬＯＤが達成された。ＩＬ－６およびＩＬ－１βについては、ビーズ数を１００，０００個から減少させると、バックグラウンドに対するシグナルのわずかな増大があった。この観察と一致して、ＬＯＤは、アッセイビーズ数を減少させてもそれほど改善しなかった。バックグラウンドに対するシグナルの増強の欠如から予想される通り、これらの分析物について対応するＳｉｍｏａアッセイと比較して感度のわずか３～５倍の改善が観察された；これらの改善は、試料採取効率の増加に起因し得る。本発明者らの結果は、ＭＯＳＡＩＣが、超高感度タンパク質検出に関する現在の最先端であるＳｉｍｏａと比較して３～１２倍高い感度を達成することを示している（表１および図７Ａ～７Ｅ）。標準的なデジタルＥＬＩＳＡと比較して、ＭＯＳＡＩＣのはるかにより高い試料採取効率に起因して、１０，０００個のビーズまでのはるかにより少ないビーズ数を使用して、十分な測定精度を維持しながら、いくつかの分析物に関するバックグラウンドに対するシグナルを増強することができる。バックグラウンドに対するシグナル改善の程度は特定の抗体ペアに依存するが、各分析物についてアッセイビーズ数を容易に最適化することができる。
表２． 全てのシングルプレックスＭＯＳＡＩＣアッセイについての分析感度。異なるアッセイビーズ数にわたって全てのサイトカインについて実施されたＭＯＳＡＩＣアッセイの検出限界（ＬＯＤ）および定量下限（ＬＬＯＱ）。

【表2-1】

【表2-2】

【0154】

ＭＯＳＡＩＣアッセイの再現性を試験するために、いくつかの選択した曲線に関して異なる日に同一の較正曲線を測定し、同様のＡＭＢ値およびＬＯＤを得た。結果として、２つの別々の較正曲線の平均ＬＯＤがこれらの曲線について報告される。これらのアッセイの再現性のさらなる確認として、全ての反復物の組合せから得られたＬＯＤも、単一の較正曲線中の別々の曲線間で評価し、報告された平均ＬＯＤ値と類似する値を得た。

【0155】

アッセイビーズの数を減らすことは存在する捕捉抗体分子の数も低減するため、捕捉速度はより遅い可能性がある。したがって、より長い標的捕捉時間がバックグラウンドに対するシグナル比および分析感度をさらに増強させることができるかどうかを調査した。しかしながら、ＩＬ－１０とＩＦＮ－γとの両方について、１時間から４時間への標的捕捉時間の増加は、類似するか、またはわずかに悪いＬＯＤをもたらした（図８Ａ～８Ｃ）。したがって、より効率的なワークフローのために、その後の実験においては１時間の標的捕捉時間を使用した。

【0156】

ＭＯＳＡＩＣにおける試料採取効率の改善から生じる感度改善の程度を決定するために、ＩＬ－１０およびＩＦＮ－γについて得られた較正曲線間でビーズのサブセットの無作為な試料採取を実施し、感度および精度に対する分析されるビーズの数の効果を検査した。少ない事象数で生じる高いポアソンノイズと一致して、わずか数百個のビーズを分析した場合に得られたＬＯＤは、全ての出発アッセイビーズ数にわたって非常に高かった（図３Ａ～Ｂ）。各サブセットのサイズについて、無作為の試料採取を１００回繰り返し、これらの低い試料採取効率で予想された低い精度および再現性と一致して、１，０００個またはそれより少ないビーズを分析した場合に、反復サブセット間の算出されたＬＯＤにおいて高い変動が観察された。分析されるアッセイビーズのパーセンテージが増大するにつれて、分析感度はかなり改善すると共に、分析されるビーズの数が数千個を上回って増加するにつれて、感度の増大はより小さくなる。さらに、試料採取効率の増大に伴う感度の改善は、バックグラウンドシグナルの測定変動係数の低下と対応していた（図３Ｃ～３Ｄ）。したがって、これらの結果は、ＭＯＳＡＩＣの感度の増強における試料採取効率の改善の重要な役割を経験的に支持する。

【0157】

ＭＯＳＡＩＣは生体液中の低存在量分析物の検出能を改善する。
次に、ＭＯＳＡＩＣの性能を生体液において活用して、その感度の増強が低存在量のバイオマーカーの検出能を改善することができるかどうかを調査した。代表的なサイトカインとして、ＩＦＮ－γを、ヒト血漿試料のコホート中でＭＯＳＡＩＣと対応するＳｉｍｏａアッセイとの両方を使用して測定した（図４Ａ～４Ｂ）。１０，０００個のアッセイビーズを使用してＭＯＳＡＩＣによって測定されたＩＦＮ－γ濃度は、Ｓｉｍｏａによって測定されたものとの良好な相関を示し、ＭＯＳＡＩＣアッセイの正確度を支持していた。さらに、ＩＦＮ－γは両方法を使用して血漿において一般に検出可能であったが、１７個の血漿試料のうちの１個はＳｉｍｏａによって検出不可能なままであったのに対して、より高感度のＭＯＳＡＩＣアッセイは１００％の検出能を達成した。

【0158】

ＭＯＳＡＩＣのより優れた感度が生体液中の低存在量分析物の検出能を改善することができるかどうかをさらに評価するために、ＭＯＳＡＩＣを唾液に適用した。唾液は血液から唾液腺まで濾過された最小限の血清成分を含有するため、多くの潜在的なバイオマーカーは血液中よりも唾液中にはるかにより低いレベルで存在し、超高感度技術を必要とする。原理証明として、ＭＯＳＡＩＣを使用して、唾液試料のコホート中のＩＦＮ－γのレベルを測定した。ＩＦＮ－γはＳｉｍｏａを使用した場合には唾液試料のわずか４２％（１１／２６）において検出可能であったが、低ビーズＭＯＳＡＩＣアッセイの増強された感度は、６５％（１７／２６）を上回る唾液試料までＩＦＮ－γの検出能を改善させた（図４Ｃ～４Ｄ）。Ｓｉｍｏａを使用した場合に検出可能なＩＦＮ－γレベルを有する全ての唾液試料は、ＭＯＳＡＩＣによって検出可能であり、正に相関した測定値を示した。血漿と比較して唾液におけるＭＯＳＡＩＣとＳｉｍｏａとの測定値間の広い変動性は、異なるアッセイを用いた異なるマトリックス干渉効果に起因し得る。しかしながら、唾液においてスパイクおよび回収実験を実施した場合、７０～１３０％の許容範囲内の回収が観察された（表３）。ＬＯＤよりも上であるにもかかわらずＳｉｍｏａによって検出不可能であったいくつかの唾液試料においてＩＦＮ－γレベルを検出するＭＯＳＡＩＣの能力は、少ないビーズ数でのその増強されたバックグラウンドに対するシグナルおよび感度だけでなく、低い濃度で測定精度を増大させるより高い試料採取効率にも起因し得る。さらに、過剰のストレプトアビジン－ＤＮＡから増幅されるＲＣＡ産物を最小化するための、Ｓｉｍｏａと比較してＭＯＳＡＩＣにおいて実施されるより徹底的な洗浄は、干渉成分の除去の改善に寄与し得る。
表３． ３つの個々のヒト唾液試料の唾液において実施されたＭＯＳＡＩＣアッセイに関するスパイクされた組換えヒトＩＦＮ－γおよびＩＬ－１２ｐ７０タンパク質の回収率。唾液試料はＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（商標） Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で４倍に希釈された。回収率は、二連の測定の平均±標準偏差として報告される。

【表3】

【0159】

Ｓｉｍｏａによって検出不可能であるアトモル濃度の内因性タンパク質を検出するＭＯＳＡＩＣの能力は、非常に低い存在量のバイオマーカーのためのその潜在的な診断有用性を強調する。ＭＯＳＡＩＣを使用した場合、唾液中のさらにより低い存在量の分析物、ＩＬ－１２ｐ７０の検出能の改善も、Ｓｉｍｏａによる０％から約１２％まで、または２６個の唾液試料のうちの３個まで達成された（図９Ａ～９Ｃ）。ＭＯＳＡＩＣの感度は大部分の試験した唾液試料においてＩＬ－１２ｐ７０を検出するには不十分なままであったが、結果は、その増強された感度が、唾液中のそのような稀な分析物の「氷山の一角」を明らかにし始めるだけでなく、さらにより感度の高い方法の必要性も強調することを示している。

【0160】

ＭＯＳＡＩＣの多重化機能。
ＭＯＳＡＩＣの感度の増強に加えて、そのオンビーズシグナル生成戦略およびフローサイトメトリー読み出しは、デジタルＥＬＩＳＡの多重化機能を拡張することができる。現在のデジタルイムノアッセイは、典型的には個々の標的を単離するための区画の総数における制約に一部起因して、多重化することができる分析物の数に限りがある^１５。対照的に、ＭＯＳＡＩＣの溶液に基づく読み出しは、原理的には、各分析物に関するアッセイビーズ数による容易に調整可能な感度およびダイナミックレンジで１個の試料において無限数のビーズ型の分析を可能にする。ＭＯＳＡＩＣの多重化機能を検証するために、本発明者らは最初に、異なる蛍光色素にコードされたビーズを使用して、ＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＬ－１０、およびＩＦＮ－γに関する多重化アッセイを開発した。このアッセイは、ヒト血漿において中から高アトモル感度および許容し得る回収率を示し、血漿中に存在するサイトカインの濃度範囲においてわずかな交差反応性を示した（表４および図１０Ａ～１０Ｄ）。さらなる検証として、血漿におけるその測定値は、特に、両方の方法のＬＬＯＱを優に上回る分析物濃度に関して、対応する４重Ｓｉｍｏａアッセイ（ｆｏｕｒ－ｐｌｅｘ Ｓｉｍｏａ ａｓｓａｙ）のものと良好に相関していた（図５Ａ）。
表４． ４倍希釈でのヒト血漿における図５に報告される４重ＭＯＳＡＩＣアッセイに関するスパイクされた組換えタンパク質の回収率。回収率は、二連の測定の平均±標準偏差として報告される。

【表4】

【0161】

高い正確度で同時に複数の分析物を測定するＭＯＳＡＩＣの能力が確立されたら、異なる蛍光色素および強度を有する追加のビーズを組み込むことによって、ＭＯＳＡＩＣの多重化多用途性の増大を探索した。原理証明として、ＭＯＳＡＩＣアッセイを、サイトカインＩＬ－６、ＩＬ－１β、ＩＬ－１０、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－５、およびＩＬ－１８、ならびに血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）について、デジタルＥＬＩＳＡ法と共に以前に報告されたことがない８重アッセイに統合した。高い分析感度が維持され、ＬＯＤ値は中アトモルから低フェムトモル濃度の範囲であった（図１１Ａ～１１Ｄおよび表５Ａ～５Ｂ）。１６倍の希釈率を使用してヒト血漿にアッセイを適用して、スパイクおよび回収実験における全ての分析物にわたって許容し得る回収率および一貫した希釈線形性を確保した（表６Ａ、６Ｂおよび７ならびに図１２および図１６）。重要なことに、測定された濃度範囲にわたってわずかな交差反応性があった（図１３）。ＭＯＳＡＩＣの格別の感度はさらに、限られた試料体積からのより多くの臨床情報の収集を可能にすることに加えて、交差反応性に起因する潜在的な偽シグナルを最小化するためにより高い希釈率の使用を可能にする。２回反復にわたって１５μＬ未満の血漿を使用して、これらの８種のタンパク質を血漿試料のコホート中で測定し、その測定値を、２つの４重Ｓｉｍｏａアッセイのものと比較した。測定された濃度は、高い検出能を示す分析物に関する２つの方法間で全体として相関し、高多重ＭＯＳＡＩＣアッセイの正確度をさらに支持していた（図５Ｂ～５Ｃおよび図１４Ａ～Ｂ）。したがって、ＭＯＳＡＩＣは、非常に小さい試料体積を使用して、幅広いバイオマーカーパネルの超高感度多重化測定を可能にする。
表５Ａ． 血漿測定のために使用された試料希釈液における８重ＭＯＳＡＩＣアッセイおよび対応する４重Ｓｉｍｏａアッセイの検出限界（ＬＯＤ）および定量下限（ＬＬＯＱ）値。値は、別の日に実施された３つの較正曲線の中央値［範囲］として報告される。ＬＯＤおよびＬＬＯＱ値は、バックグラウンドを上回る、それぞれ、３および１０標準偏差として算出される。

【表5-1】

表５Ｂ． 唾液測定のために使用された試料希釈液における８重ＭＯＳＡＩＣアッセイおよび対応する４重Ｓｉｍｏａアッセイの検出限界（ＬＯＤ）および定量下限（ＬＬＯＱ）値。ＬＯＤおよびＬＬＯＱ値は、バックグラウンドを上回る、それぞれ、３および１０標準偏差として算出される。

【表5-2】

表６Ａ． ８倍希釈でのヒト血漿における８重ＭＯＳＡＩＣアッセイに関するスパイクされた組換えヒトタンパク質の回収率。回収率は、二連の測定の平均±標準偏差として報告される。

【表6-1】

表６Ｂ． ８倍希釈でのヒト唾液における８重ＭＯＳＡＩＣアッセイに関するスパイクされた組換えヒトタンパク質の回収率。回収率は、二連の測定の平均±標準偏差として報告される。

【表6-2】

表７． １６倍希釈でのヒト血漿における８重ＭＯＳＡＩＣアッセイに関するスパイクされた組換えヒトタンパク質の回収率。回収率は、二連の測定の平均±標準偏差として報告される。

【表7】

【0162】

考察
非常に低いレベルのタンパク質バイオマーカーを測定する能力は、がん、感染症、および神経変性疾患の診断などの臨床適用において依然として重要な課題である。デジタル測定技術は感度の１０００倍の増加を可能にしたが、アトモルまたはそれより低い濃度のタンパク質は依然として利用可能ではなく、初期段階においてバイオマーカーレベルが非常に低い場合がある疾患のバイオマーカー探索および早期検出における努力を制限してきた。１つの注目に値する例は、非侵襲的に収集され、潜在的な診断価値がある多様なタンパク質を含有するが、血漿中よりもはるかに低いレベルで含有する唾液であり、現行のデジタルＥＬＩＳＡ技術に対する格別の課題である。唾液中のＩＦＮ－γおよびＩＬ－１２ｐ７０の原理証明測定は、稀なバイオマーカー候補の未知の領域を明らかにする際のＭＯＳＡＩＣの潜在的な有用性を強調する。重要なことに、ＭＯＳＡＩＣの高い試料採取効率のため、本発明者らは、アッセイビーズの数を減少させて、十分な測定精度を維持しながら、バックグラウンドに対するシグナルを増強することができた。ビーズ数の減少は異なる分析物に関して異なる程度で感度を改善したが、その結果は、特定の適用にとって必要とされる所望の感度およびダイナミックレンジに従って各分析物についてビーズ数を容易に調整することができることを示している。

【0163】

重要なことに、ＭＯＳＡＩＣは、デジタルＥＬＩＳＡ技術の幅広いインプリメンテーションを制限してきた、特殊な機器の要件を回避する。ビーズを個々の区画に単離する必要性を取り除くことにより、ＭＯＳＡＩＣはフローサイトメトリーを使用した単一分子計数化を可能にし、したがって、デジタルＥＬＩＳＡを、現行の広く利用可能な検査基盤に変える。最近開発されたドロップキャスト単一分子アッセイおよび液滴デジタルＥＬＩＳＡを含む、以前のデジタルＥＬＩＳＡ法と比較したＭＯＳＡＩＣの重要な利点は、はるかにより迅速で、自動化された－試料あたり１分未満のシグナルの読み出しである。ドロップキャスト単一分子アッセイ（ｄＳｉｍｏａ）は、ビーズ上に捕捉された単一分子を計数化するための単純なビーズドロップキャスト法を可能にし、試料採取効率および分析感度を約１０倍増加させた。しかしながら、これらの方法は、複数の視野にわたって全てのビーズを捕捉するために、試料あたりに長いイメージング時間を必要とし、したがって、処理量を制限する。多くのベンチトップ型フローサイトメーターに既に組み込まれている９６ウェルプレート試料採取モードによる自動化は、最新式のワークフローをさらに提供する。

【0164】

感度の増強および利用しやすいワークフローに加えて、ＭＯＳＡＩＣはデジタルＥＬＩＳＡに対して多重化機能の増大を導入する。単一の試料中の複数の分析物を同時に測定する能力は、試料処理能力およびバイオマーカーシグネチャー探索を加速することができ、新生児の唾液またはフィンガープリック血液などの限られた試料体積を用いた適用において特に重要である。デジタルＥＬＩＳＡならびに最近開発された超高感度平面ＥＬＩＳＡプラットフォームにおける多重化は、様々な診断適用において大きな有用性を示したが^{１６～１８}、ビーズ閉じ込め法において同時に分析することができるビーズ型の数は、区画の総数および低いビーズ分析効率によって制限されている。対照的に、ＭＯＳＡＩＣの溶液に基づく読み出しは、単一の試料において分析することができるビーズ型の総数に関するこの物理的制約を除去する。ＭＯＳＡＩＣにおける試料採取効率はビーズの総数によって影響されないため、多重ＭＯＳＡＩＣアッセイにおける各分析物の所望のダイナミックレンジは、アッセイビーズ数によって容易に調整可能であり、各試料中のビーズの数またはビーズ型に関する上限はない。色および蛍光強度による多重化に加えて、多用途のフローサイトメトリー読み出しは、ビーズをサイズによって識別する能力を提供し、したがって、多重化可能なビーズ型のパレットを拡張する。交差反応性はより高次の多重アッセイにおいては依然として潜在的な制限を有するが、アトモル感度のＭＯＳＡＩＣは、良好な標的検出能を維持しながら、より高い希釈率の使用を可能にし、したがって、交差反応性が最小限である濃度範囲に測定値を保持することができる。さらに、より小さい多重パネルを、シグナル読み出し、ならびに連続的標的捕捉のために単一の試料中の全ビーズのその後の組合せと共に使用することができる^１９。

【0165】

ＭＯＳＡＩＣの低アトモル感度にもかかわらず、稀な分析物に関するさらにより高い感度および検出能を達成するためには、さらなる研究が必要である。より高親和性の試薬の開発およびスクリーニングを用いて、サブアトモル濃度のＬＯＤを達成することができる。さらに、現在のＭＯＳＡＩＣワークフローにおける洗浄ステップはマイクロプレートウォッシャーを使用して自動化されているが、さらなる研究は、測定精度の改善のために自動化液体取り扱いプラットフォームへのアッセイ全体の統合を探索する。

【0166】

まとめると、オンビーズシグナル増幅の力およびフローサイトメトリーの多面的能力を利用することにより、ＭＯＳＡＩＣは、フローサイトメーターを有する任意の研究室が利用しやすい、アトモル感度、より高次の多重化、および迅速なハイスループット読み出しを有する超高感度タンパク質検出法を提供する。

【0167】

方法
材料
本研究において使用される全ての親和性試薬、組換えタンパク質、およびＤＮＡオリゴは、以下に列挙される。バッファーおよび常磁性ビーズは、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＢａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。カスタムＤＮＡオリゴは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａから購入した。

【表10-1】

【表10-2】

【0168】

捕捉および標識化試薬の調製。
５０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心式フィルター（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）を使用して、捕捉抗体をＢｅａｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）で緩衝液交換した。フィルター中の抗体溶液にＢｅａｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを５００μＬまで添加した後、１４，０００×ｇで５分間、３回遠心分離することによって緩衝液交換を実行し、遠心分離サイクル間に４５０μＬのＢｅａｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加した。フィルターを新しい管中で反転させること、１０００×ｇで２分間遠心分離すること、フィルターを５０μＬのＢｅａｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒですすぐこと、および１０００×ｇで２分間、もう１回遠心分離することによって、緩衝液交換された抗体を回収した。次いで、緩衝液交換された抗体の濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を使用して測定した。各ビーズ型について、ビーズを３００μＬのＢｅａｄ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）で３回および３００μＬのＢｅａｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）で２回洗浄した後、冷Ｂｅａｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中に再懸濁した。各分析物に関するビーズ数およびコンジュゲーション条件は、以下の表に示される。１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（ＥＤＣ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１ｍｇのバイアルを、１００μＬの冷Ｂｅａｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒに溶解し、所望の体積をビーズに添加した。ビーズを室温または４℃のいずれかで３０分間振とうさせた。ビーズ上のカルボキシル基のＥＤＣ活性化後、ビーズを、３００μＬの冷Ｂｅａｄ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄した後、緩衝液交換された抗体溶液中に再懸濁した。室温または４℃のいずれかで２時間ビーズを振とうした後、３００μＬのＢｅａｄ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄することにより、抗体コンジュゲーションを実行した。次いで、抗体にカップリングしたビーズを、３００μＬのＢｅａｄ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）で振とうしながら、室温で３０分間ブロッキングクした。３００μＬのＢｅａｄ Ｗａｓｈ ＢｕｆｆｅｒおよびＢｅａｄ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）でそれぞれ１回洗浄した後、ビーズを、Ｂｅａｄ Ｄｉｌｕｅｎｔ中に再懸濁し、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｚ１ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて計数し、４℃で保存した。
表８． 本実施例で使用された抗体でコーティングされた捕捉ビーズのカップリング条件。８重ＭＯＳＡＩＣアッセイとＳｉｍｏａとの比較のために、Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ からの、それぞれ、４８８、６４７、７００、および７５０多重ビーズを使用するＩＬ－６、ＶＥＧＦ、ＩＬ－１８、およびＩＬ－１２ｐ７０に関する４重アッセイを実施した。

【表8】

【0169】

非改変形態で得られたＩＦＮ－γ検出抗体を除いて、検出抗体をビオチン化形態で得た。Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）中で１ｍｇ／ｍＬに再構成させ、水中に新鮮に溶解された４０倍モル過剰のＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加することにより、ＩＦＮ－γ検出抗体をビオチン化した。ビオチン化反応を室温で３０分間にわたって実行した後、５０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心式フィルターを用いてビオチン化抗体を精製した。サイクル間に４５０μＬのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを添加して、１４，０００×ｇで５分間の５回の遠心分離サイクルを実施した後、フィルターの新しい管中での反転および１０００×ｇで２分間の遠心分離によって精製された抗体を回収した。次いで、フィルターを５０μＬのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒですすいだ後、１０００×ｇで２分間、もう１回遠心分離し、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて抗体濃度を定量した。

【0170】

ストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートの調製。
９５℃で２分間にわたってＮＥＢＮｅｘｔ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で３３．８μＭのプライマーおよび４０．６μＭの鋳型の溶液を加熱し、９０分かけて室温まで冷却することにより、５’アジド改変プライマーをＲＣＡのためのＤＮＡ鋳型にアニーリングさせた。次いで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、室温で３時間インキュベートしてライゲーションを実施した。次いで、ライゲーション反応物を６５℃で１０分間加熱して、リガーゼを不活化した後、室温まで冷却した。ライゲーション反応物を、７Ｋ ＭＷＣＯ Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で緩衝液交換した。コンジュゲーションのために、ストレプトアビジン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ ２８０３０２）を、１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心式フィルターを使用してＰＢＳで緩衝液交換し、２０倍モル過剰のジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）と共に、室温で３０分間インキュベートし、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中、１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心式フィルターを用いて精製した。次いで、２倍モル過剰のライゲーションしたプライマー－鋳型をＤＢＣＯ改変ストレプトアビジンに添加し、４℃で一晩インキュベートした。コンジュゲートを、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ、および０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中、－８０℃でアリコートで保存した。

【0171】

ＭＯＳＡＩＣアッセイ
Ｈｏｍｅｂｒｅｗ Ｓａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）で所望の濃度に希釈された抗体でコーティングされたビーズおよび検出抗体を用いて、９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、６５５０９６）中でＭＯＳＡＩＣアッセイを実施した。１０μＬの抗体でコーティングされたビーズと共に、１００μＬの試料体積を使用した。２ステップのアッセイのために、１０μＬの検出抗体を各試料に添加した。プレートを密閉し、標的捕捉のために１時間振とうした後、ＢｉｏＴｅｋ ４０５ ＴＳ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｗａｓｈｅｒを使用してＳｙｓｔｅｍ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）を用いて洗浄した。３ステップアッセイのために、１００μＬの検出抗体を、標的捕捉および洗浄ステップの後にビーズに添加した後、１０分間インキュベートし、さらに洗浄した。次いで、５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ中に希釈した１００μＬのコンジュゲートをビーズに添加し、所望の時間にわたって振とうすることにより、免疫複合体サンドイッチをストレプトアビジン－ＤＮＡで標識した。次いで、試料をＳｙｓｔｅｍ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １で８サイクルにわたって洗浄し、新しい９６ウェルプレートに移し、２００μＬのＳｙｓｔｅｍ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １でさらに１回洗浄した後、６０μＬのＲＣＡ反応混合物中に再懸濁した。ＲＣＡ混合物は、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、および１０ｍＭのＭｇＣｌ_２中の０．５ｍＭのデオキシヌクレオチドミックス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、０．３３Ｕ／μＬのｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｕｃｉｇｅｎ）、０．２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１ｎＭの蛍光標識されたＤＮＡプローブ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０からなっていた。ＡＴＴＯ－６４７ＮおよびＡＴＴＯ－５６５標識されたＤＮＡプローブを、それぞれ、単一標的および多重ＭＯＳＡＩＣアッセイのために使用した。各試料へのＲＣＡ混合物の添加の際に、プレートを３７℃で１時間振とうした後、０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０および５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１５０μＬのＰＢＳを添加して、反応を停止させた。試料を、２００μＬの同じＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－ＥＤＴＡ緩衝液で１回洗浄し、０．１％ＢＳＡを添加した１００μＬの緩衝液中に再懸濁した。試料を、管またはプレート試料採取モードのいずれかで、６個のレーザーを備えたＣｙｔｏＦｌｅｘ ＬＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して測定した。漂白剤および緩衝液ウェルを、異なる試料間に含めて、潜在的な試料のキャリーオーバーを最小化した。多重ＭＯＳＡＩＣアッセイを、同じ試料中で異なる蛍光色素にコードされたビーズを組み合わせて、シングルプレックスＭＯＳＡＩＣアッセイと同じプロトコールに従って実行した。

【0172】

血漿および唾液試料を、プロテアーゼ阻害剤（Ｈａｌｔ（商標）Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む、それぞれ、Ｓａｍｐｌｅ ＤｉｌｕｅｎｔまたはＳｔａｒｔｉｎｇＢｌｏｃｋ（商標）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に希釈した。血漿試料を、ＢｉｏＩＶＴおよびＭａｓｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂｒｉｇｈａｍ Ｂｉｏｂａｎｋから取得し、唾液試料を、ＢｉｏＩＶＴから取得した。全てのヒト試料を匿名化し、Ｍａｓｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂｒｉｇｈａｍによる施設内審査委員会の承認の下で実験を実施した。全ての血漿および唾液試料を、４℃で、それぞれ、２０００×ｇで１０分間または２１０００×ｇで２０分間遠心分離した後、測定のために希釈した。
表９． 本実施例におけるＭＯＳＡＩＣおよびＳｉｍｏａアッセイのために使用されるアッセイ条件。同じ検出抗体濃度および標的捕捉時間をそれぞれの対応するＭＯＳＡＩＣおよびＳｉｍｏａアッセイのために使用した。

【表9】

【0173】

Ｓｉｍｏａアッセイ
全てのＳｉｍｏａアッセイを、自動化試料プロセシング、イメージ分析、およびビーズあたりの平均酵素（ＡＥＢ）の算出を備えた、ＨＤ－Ｘ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）で実施した。シングルプレックスＭＯＳＡＩＣアッセイにおいて使用した同じ抗体でコーティングされたビーズを、全てのＳｉｍｏａアッセイのために使用し、ＭＯＳＡＩＣアッセイと同じ検出抗体濃度を用いた。１００，０００個の抗体でコーティングされたビーズおよび４００，０００個のヘルパー（非コンジュゲート化）ビーズを、それぞれの単一Ｓｉｍｏａアッセイのために使用したが、分析物あたり１２５，０００個の抗体でコーティングされたビーズを、それぞれの４重Ｓｉｍｏａアッセイのために使用した。ストレプトアビジン－β－ガラクトシダーゼ（ＳβＧ）濃縮物（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）を、ＳβＧ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）で、各アッセイのための望ましい濃度に希釈した。全てのアッセイ試薬および消耗品を、製造業者の指示に従ってＨＤ－Ｘ Ａｎａｌｙｚｅｒにロードした。

【0174】

データ分析
フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏ（商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いて最初に分析した；前方散乱、側方散乱、およびビーズ蛍光に関するゲートを使用してビーズを同定した。前方散乱を使用して、単一のビーズをさらにゲーティングした（図１５Ａ～Ｄ）。それぞれのビーズ集団に関するプローブ蛍光強度を、パッケージｊａｘ、ｎｕｍｐｙ、ｐａｎｄａｓ、ｓｃｉｋｉｔ－ｌｅａｒｎ、およびｗａｌｔｌａｂｔｏｏｌｓを用いてＰｙｔｈｏｎで分析した。２つのガウス混合モデルを、期待値最大化を使用して各ウェルに関する対数変換された蛍光強度に当てはめた。「オン」ビーズを計数する２つの方法を算出した。第１の方法では、ビーズを、期待値最大化アルゴリズムに従って一方または他方のガウシアンにおけるその予測メンバーシップに基づいて「オン」または「オフ」と割り当てた。第２の方法では、ビーズが低い方の（「オフ」）ガウシアンピークの平均よりも少なくとも５標準偏差上であった場合、それらを「オン」と計数した。２つのピークが同定可能であった場合、第１の方法がより良好な結果をもたらしたが、「オン」ビーズの数が非常に少ない場合、高い方のガウシアンは当てはめるのがより困難であり、したがって、第２の方法がより信頼できる推定値をもたらした。したがって、使用した測定基準は、正弦重み関数を用いた、２つの加重平均であった：第１の方法の重みは、ｓｉｎ^４（πｆ／２）（式中、ｆは、第１の方法（ガウス混合割り当て）に従う「オン」ビーズの画分である）によって与えられる。次いで、「オン」ビーズの画分を、ポアソン統計を使用してビーズあたりに結合した分析物分子の平均数に変換し、４パラメーターロジスティック較正曲線を使用して濃度に対してマッピングした。ＬＯＤおよびＬＬＯＱを、それぞれ、バックグラウンドより３および１０標準偏差上と算出し、ここで、補正率ｃ_４（ｎ）を標準偏差の不偏推定に適用した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、ピアソンの相関係数を算出した。

【0175】

方法のより詳細なバージョンは、以下の補足方法のセクションに見出すことができる。

【0176】

補足方法
抗体でコーティングされた捕捉ビーズの調製
１．ビーズを３０秒間ボルテックスし、それらを振とう器上に置く。
２．抗体が凍結乾燥されている場合、ＭＥＳ緩衝液中で０．２ｍｇ／ｍＬに再構成する。
３．抗体が溶液中にある場合、緩衝液交換する。
ｉ．分光光度計または製造業者の分析証明書を使用して抗体ストック濃度または質量を測定する。８０ｍｇの抗体を含有する抗体ストック溶液の体積を算出する。
ｉｉ．この体積を、十分なＭＥＳ緩衝液を用いて５００μＬの総体積にして、Ａｍｉｃｏｎマイクロ遠心管中の清浄な５０Ｋ Ａｍｉｃｏｎフィルターに添加する。１４，０００×ｇで５分間遠心分離する。
ｉｉｉ．フロースルーを廃棄し、４５０μＬのＭＥＳ緩衝液をＡｍｉｃｏｎフィルターに迅速に添加する。１４，０００×ｇで５分間遠心分離する。合計３回の５分間の遠心分離をもう１回繰り返す。
ｉｖ．フロースルーを廃棄する。Ａｍｉｃｏｎフィルターの頂部を上にして清浄なＡｍｉｃｏｎ管を素早く反転させる。１，０００×ｇで２分間、反転させたＡｍｉｃｏｎフィルターと共に管を遠心分離する。
ｖ．５０μＬのＭＥＳ緩衝液でフィルター膜をすすぐ。繰り返し混合する。１，０００×ｇで２分間、反転させたＡｍｉｃｏｎフィルターと共に管を遠心分離する。
ｖｉ．ＭＥＳ緩衝液でブランキングして、分光光度計を使用して抗体濃度を測定する。精製された抗体の体積をピペットで測定する。抗体をＭＥＳ緩衝液で希釈して、０．２ｍｇ／ｍＬにする。
４．ビーズを洗浄する。
ｉ．粒径分析装置または製造業者の分析証明書を使用してビーズ計数を決定する。４．２×１０^８個のビーズを含有するビーズストック溶液の体積を算出する。
ｉｉ．上の表に与えられたビーズの体積を、試験管に移す。試験管を磁気分離装置上に置く。
ｉｉｉ．吸引し、磁気分離装置から取り出し、３００μＬのＢｅａｄ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、ボルテックスし、パルススピンし、磁気分離装置に戻す。Ｂｅａｄ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒでさらに２回およびＭＥＳ緩衝液で２回繰り返した。
ｉｖ．吸引し、磁気分離装置から取り出し、３００μＬのＭＥＳ緩衝液を３回目に添加し、ボルテックスし、パルススピンし、ビーズを懸濁液中に残した。
５．ビーズを活性化する。
ｉ．ＥＤＣの１個のバイアルを注意深く開き、１００μＬのＭＥＳ緩衝液をゆっくり添加する。すぐにキャップを取り替え、溶解するまで手短にボルテックスする。
ｉｉ．９ｐＬの再構成されたＥＤＣをビーズの管に添加し、ボルテックスし、４℃で３０分間振とうする。
６．抗体をビーズにコンジュゲートさせる。
ｉ．パルススピンし、磁気分離装置上にビーズを置き、吸引し、磁石から取り出し、３００μＬのＭＥＳ緩衝液を添加し、ボルテックスし、パルススピンし、磁気分離装置に戻す。
ｉｉ．吸引し、磁気分離装置から取り出し、緩衝液交換した抗体の達成バッチ体積を添加し、ボルテックスする。４℃で２時間振とうする。
７．ビーズをブロックする。
ｉ．パルススピンし、ビーズを磁気分離装置上に置く。
ｉｉ．吸引し、磁気分離装置から取り出し、３００μＬのＢｅａｄ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、ボルテックスし、パルススピンし、磁気分離装置に戻す。１回繰り返す。
ｉｉｉ．吸引し、磁気分離装置から取り出し、３００μＬのＢｅａｄ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、ボルテックスする。室温で４５分間振とうする。
８．最後の洗浄および再懸濁を実施する。
ｉ．パルススピンし、ビーズを磁気分離装置上に置く。
ｉｉ．吸引し、磁気分離装置から取り出し、３００μＬのＢｅａｄ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、ボルテックスし、パルススピンし、磁気分離装置に戻す。１回繰り返す。
ｉｉｉ．吸引し、磁気分離装置から取り出し、３００μＬのＢｅａｄ Ｄｉｌｕｅｎｔを添加し、ボルテックスし、パルススピンする。
ｉｖ．粒径分析装置を使用して最終的なビーズ計数を決定する。
注記：あるいは、２．８×１０^８個の出発ビーズを使用するビーズカップリングを室温で実施することができ、ＥＤＣ活性化および抗体コンジュゲーションステップを室温で実施する。

【0177】

検出抗体のビオチン化
１．抗体が凍結乾燥されている場合、ＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍＬに再構成する。
２．抗体が溶液中にある場合、緩衝液交換する。
ｉ．分光光度計または製造業者の分析証明書を使用して抗体ストック濃度または質量を測定する。１３０ｍｇの抗体を含有する抗体ストック溶液の体積を算出する。
ｉｉ．この体積を、十分なＰＢＳを用いて５００μＬの総体積にして、Ａｍｉｃｏｎマイクロ遠心管中の清浄な５０Ｋ Ａｍｉｃｏｎフィルターに添加する。１４，０００×ｇで５分間遠心分離する。
ｉｉｉ．フロースルーを廃棄し、４５０μＬのＰＢＳをＡｍｉｃｏｎフィルターに迅速に添加する。１４，０００×ｇで５分間遠心分離する。合計３回の５分間の遠心分離をもう１回繰り返す。
ｉｖ．フロースルーを廃棄する。Ａｍｉｃｏｎフィルターの頂部を上にして清浄なＡｍｉｃｏｎ管を素早く反転させる。１，０００×ｇで２分間、反転させたＡｍｉｃｏｎフィルターと共に管を遠心分離する。
ｖ．５０μＬのＰＢＳでフィルター膜をすすぐ。繰り返し混合する。１，０００×ｇで２分間、反転させたＡｍｉｃｏｎフィルターと共に管を遠心分離する。
ｖｉ．ＰＢＳでブランキングして、分光光度計を使用して抗体濃度を測定する。精製された抗体の体積をピペットで測定する。抗体をＰＢＳで希釈して、１ｍｇ／ｍＬにする。
３．検出抗体をビオチン化する。
ｉ．３８３μＬの脱イオン水を添加することによって８．９ｍＭのストック濃度にビオチンを再構成する。
ｉｉ．１００μＬの抗体および３μＬのビオチンを清浄な試験管に添加し、ボルテックスし、パルススピンし、室温で３０分間インキュベートする。
４．ビオチン化された抗体を精製する。
ｉ．ビオチン化反応管の内容物を、Ａｍｉｃｏｎマイクロ遠心管中の清浄なＡｍｉｃｏｎフィルターに移す。４００μＬのＰＢＳでビオチン化反応管を洗浄し、それを同様にＡｍｉｃｏｎフィルターに移す。１４，０００×ｇで５分間遠心分離する。
ｉｉ．フロースルーを廃棄し、４５０μＬのＰＢＳをＡｍｉｃｏｎフィルターに迅速に添加する。１４，０００×ｇで５分間遠心分離する。合計５回の５分間の遠心分離をもう３回繰り返す。
ｉｉｉ．フロースルーを廃棄する。Ａｍｉｃｏｎフィルターの頂部を上にして清浄なＡｍｉｃｏｎ管を素早く反転させる。１，０００×ｇで２分間、反転させたＡｍｉｃｏｎフィルターと共に管を遠心分離する。
ｉｖ．５０μＬのＰＢＳでフィルター膜をすすぐ。繰り返し混合する。１，０００×ｇで２分間、反転させたＡｍｉｃｏｎフィルターと共に管を遠心分離する。
ｖ．ＰＢＳでブランキングして、分光光度計を使用して抗体濃度を測定する。

【0178】

ストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートの調製
１．１×Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ中で３５．８μＭのプライマーおよび４３．０μＭの鋳型の溶液を作製する。
２．９５℃で２分間、溶液を加熱し、９０分かけて室温まで冷却させる。
３．Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（１００μＬの反応混合物あたり２，０００，０００Ｕ／ｍＬの６μＬ）を添加し、室温で３時間インキュベートする。
４．６５℃で１０分間加熱して、リガーゼを不活化した後、室温まで冷却する。
５．Ｚｅｂａスピン脱塩カラムを使用して、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳに緩衝液交換する。
６．プライマーおよび鋳型の分子量ならびにライゲーション反応中の初期プライマー濃度を使用して、分光光度計を用いて濃度を測定して、緩衝液交換されたプライマー濃度を決定する。
７．１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎフィルターを使用してＰＢＳにストレプトアビジンを緩衝液交換し、分光光度計を用いて濃度を測定する。
８．室温で３０分間、ジメチルスルホキシド中で５ｍｇ／ｍＬに溶解された、２０倍モル過剰のＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳと共にストレプトアビジンをインキュベートする。
９．１４，０００×ｇで５分間の４回の遠心分離サイクルおよび１４，０００×ｇで１０分間の最後の遠心分離サイクルを用いる、１ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中の１０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ遠心分離フィルターを用いてＤＢＣＯ改変されたストレプトアビジンを精製する。分光光度計を用いて濃度を測定する。
１０．２倍モル過剰のライゲーションしたプライマー－鋳型（ステップ５で決定されたプライマー濃度に対して算出されたモル過剰）をＤＢＣＯ改変ストレプトアビジンに添加し、４℃で一晩インキュベートする。
１１．コンジュゲートを、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ、および０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中、－８０℃でアリコートで保存する。

【0179】

ＭＯＳＡＩＣアッセイ手順
プレートウォッシャー上での全ての洗浄のために、Ｓｙｓｔｅｍ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ １を使用し、ビーズが磁気結合によってプレートの底部に保持されることを確保する。それぞれの洗浄サイクルは１７０μＬである。
１．ビーズを３０秒間ボルテックスし、Ｂｅａｄ Ｄｉｌｕｅｎｔを適切な濃度に希釈して、１０μＬ／試料中に所望の数のビーズを得る。本発明者らは、２×１０^６個のビーズ／ｍＬである、２０，０００個のビーズ／試料から開始するのを推奨する。多重化のために、一致する量の各ビーズ型を混合する。
２．較正曲線のために試料希釈液でのタンパク質標準の段階希釈を実施する。
３．試料を遠心分離し、試料希釈液で希釈する。本発明者らは、以下を推奨する：
ａ．血漿／血清：２，０００×ｇで１０分間遠心分離し、４～１６倍希釈する。
ｂ．唾液：２１，０００×ｇで２０分間遠心分離し、４～１６倍希釈する。
ｃ．尿：１０，０００×ｇで５分間遠心分離し、１～２倍希釈する。
４．１００μＬの希釈した試料（またはキャリブレータ―）および１０μＬのビーズを各ウェルに添加する。
５．２ステップのアッセイを実施する場合、ビオチン化された検出抗体を３．６μｇ／ｍＬに希釈する。１０μＬの検出抗体を各ウェルに添加する。
６．プレートを密封し、室温で１時間、６５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートする。
７．３ステップのアッセイを実施する場合：
ｉ．プレートウォッシャー上で試料を３回洗浄する。
ｉｉ．ビオチン化された検出抗体を０．３μｇ／ｍＬに希釈する。
ｉｉｉ．プレートをプレート磁石上に置いて、ウェルの一方の側にビーズを引き寄せる。吸引し、１００μＬの検出抗体を各ウェルに添加する。
ｉｖ．プレートを密封し、室温で１０分間、６００ｒｐｍで振とうしながらインキュベートする。
８．プレートウォッシャー上で試料を６回洗浄する。
９．プレートをプレート磁石上に置いて、ウェルの一方の側にビーズを引き寄せる。吸引し、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む試料希釈液で３００ｐＭ（２ステップのアッセイに関する）または１５０ｐＭ（３ステップのアッセイに関する）に希釈された、１００μＬのストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートを各ウェルに添加する。
１０．プレートを密封し、室温で１５分間（２ステップのアッセイに関する）または１０分間（３ステップのアッセイに関する）、６５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートする。
１１．Ｚｅｂａ脱塩カラムを用いてｐｈｉ２９ポリメラーゼを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、および０．５％ＮＰ－４０で緩衝液交換して、ジチオトレイトールを除去する。
１２．ＲＣＡ反応混合物を作製する：
－ ０．５ｍＭのｄＮＴＰミックス
－ ０．３３Ｕ／μＬのｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ
－ ０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ
－ １ｎＭの蛍光標識されたＤＮＡプローブ
－ ０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）－２０
－ ５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ
－ １０ｍＭの硫酸アンモニウム
－ １０ｍＭの塩化マグネシウム
１３．プレートウォッシャー上で試料を８回洗浄する。
１４．ピペットで混合して、ビーズを再懸濁し、試料を新しい９６ウェルプレートに移す。
１５．プレートをプレート磁石上に置いて、ウェルの一方の側にビーズを引き寄せる。吸引し、２００μＬのＳｙｓｔｅｍ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを添加する。吸引し６０μＬのＲＣＡ反応混合物中に再懸濁する。
１６．プレートを密封し、３７℃で１時間、６５０ｒｐｍで振とうしながらインキュベートする。
１７．０．１％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０および５ｍＭ ＥＤＴＡを含む１５０μＬのＰＢＳを各ウェルに添加して、反応を停止させた。プレートをプレート磁石上に置いて、ウェルの一方の側にビーズを引き寄せ、吸引する（完全に乾燥しないように吸引する）。２００μＬの同じＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－ＥＤＴＡ緩衝液を添加し、吸引し、０．１％ＢＳＡを添加した１００μＬの緩衝液中に再懸濁する。
１８．２４時間以内にフローサイトメーター上で試料を測定する。漂白剤および緩衝液または水を、異なる試料間で泳動させて、潜在的な試料のキャリーオーバーを最小化する。
１９．フローサイトメトリー分析ソフトウェアを使用してビーズ集団を同定する。本発明者らは、サイズ／形状（前方および側方散乱）、次いで、蛍光に基づいてビーズをゲーティングすることを推奨する。
２０．フローサイトメトリー分析ソフトウェアまたはｗａｌｔｌａｂｔｏｏｌｓ．ｍｏｓａｉｃ Ｐｙｔｈｏｎモジュール中のゲートを使用してオフビーズからオンビーズを分離する。
２１．ｗａｌｔｌａｂｔｏｏｌｓ Ｐｙｔｈｏｎパッケージなどのソフトウェアを使用して：
ｉ．各試料のオンビーズの画分を、ビーズあたりの平均分子数（ＡＭＢ）に変換する：ＡＭＢ＝－ｌｏｇ（１－ｆ_ｏｎ）。
ｉｉ．４パラメーターロジスティック較正曲線を、較正濃度およびＡＭＢに回帰させる。
ｉｉｉ．較正曲線を使用して、試料の濃度を算出する。

【0180】

インキュベーション時間；試料の希釈および希釈液；アッセイプロトコール（２ステップ対３ステップ）；ならびにビーズ、検出抗体、およびストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートの濃度を、各アッセイまたは適用のために最適化することができる。
参考文献
１ Ｒｉｓｓｉｎ， Ｄ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ ｄｅｔｅｃｔｓ ｓｅｒｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｔ ｓｕｂｆｅｍｔｏｍｏｌａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２８， ５９５－５９９， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１６４１ （２０１０）．
２ Ｃｏｈｅｎ， Ｌ． ＆ Ｗａｌｔ， Ｄ． Ｒ． Ｈｉｇｈｌｙ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１９， ２９３－３２１， ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ｃｈｅｍｒｅｖ．８ｂ００２５７ （２０１９）．
３ Ｙｅｌｌｅｓｗａｒａｐｕ， Ｖ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｂｉｌｅ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｓｕｂ－ｐｉｃｏｇｒａｍ－ｐｅｒ－ｍｉｌｌｉｌｉｔｅｒ， ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ， ｄｉｇｉｔａｌ ｄｒｏｐｌｅｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１６， ４４８９， ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１８１４１１０１１６ （２０１９）．
４ Ｃｏｈｅｎ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ａｔｔｏｍｏｌａｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｕｓｉｎｇ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ． ＡＣＳ Ｎａｎｏ １４， ９４９１－９５０１， ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｎａｎｏ．０ｃ０２３７８ （２０２０）．
５ Ｃｈａｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ： Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３７８， １０２－１１５， ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１２．０２．０１１ （２０１２）．
６ Ｗｕ， Ｃ．， Ｇａｒｄｅｎ， Ｐ． Ｍ． ＆ Ｗａｌｔ， Ｄ． Ｒ． Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｔｔｏｍｏｌａｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｂｙ Ｄｒｏｐｃａｓｔ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｓｓａｙｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １４２， １２３１４－１２３２３， ｄｏｉ：１０．１０２１／ｊａｃｓ．０ｃ０４３３１ （２０２０）．
７ Ｍａｌｅｙ， Ａ． Ｍ．， Ｇａｒｄｅｎ， Ｐ． Ｍ． ＆ Ｗａｌｔ， Ｄ． Ｒ． Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｕｓｉｎｇ Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ． ＡＣＳ Ｓｅｎｓｏｒｓ ５， ３０３７－３０４２， ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｓｅｎｓｏｒｓ．０ｃ０１６６１ （２０２０）．
８ Ｋａｎ， Ｃ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｄｉｇｉｔａｌ ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ ｓｕｂ－ａｔｔｏｍｏｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｌｏｗ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｃａｐｔｕｒｅ ｂｅａｄｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｂｅａｄ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ ２０， ２１２２－２１３５， ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｄ０ＬＣ００２６７Ｄ （２０２０）．
９ Ｓｍｉｔｈ， Ｌ． Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ｕｓｉｎｇ Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ Ｏｐｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ． ＡＣＳ Ｎａｎｏ １４， ２３２４－２３３５， ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｎａｎｏ．９ｂ０９４９８ （２０２０）．
１０ Ａｋａｍａ， Ｋ．， Ｓｈｉｒａｉ， Ｋ． ＆ Ｓｕｚｕｋｉ， Ｓ． Ｄｒｏｐｌｅｔ－Ｆｒｅｅ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ Ｂａｓｅｄ ｏｎ ａ Ｔｙｒａｍｉｄｅ Ｓｉｇｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８８， ７１２３－７１２９， ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．６ｂ０１１４８ （２０１６）．
１１ Ｙａｎｇ， Ｋ． Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ａｌｌｏｗｓ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｖａｓｉｖｅ ＩＰＭＮ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １６０， １３４５－１３５８．ｅ１３１１， ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０２０．１１．０４６ （２０２１）．
１２ Ｉｙｅｒ， Ｓ． Ｓ． ＆ Ｃｈｅｎｇ， Ｇ． Ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １０ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２， ２３－６３， ｄｏｉ：１０．１６１５／ｃｒｉｔｒｅｖｉｍｍｕｎｏｌ．ｖ３２．ｉ１．３０ （２０１２）．
１３ Ｍｏｏｒｅ， Ｋ． Ｗ．， ｄｅ Ｗａａｌ Ｍａｌｅｆｙｔ， Ｒ．， Ｃｏｆｆｍａｎ， Ｒ． Ｌ． ＆ Ｏ’Ｇａｒｒａ， Ａ． Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１０ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９， ６８３－７６５， ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｉｍｍｕｎｏｌ．１９．１．６８３ （２００１）．
１４ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ， Ｄ． ｉｎ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ （ｅｄｓ Ｓｔａｎ Ｚ． Ｌｉ ＆ Ａｎｉｌ Ｊａｉｎ） ６５９－６６３ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ＵＳ， ２００９）．
１５ Ｒｉｖｎａｋ， Ａ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｆｕｌｌｙ－ａｕｔｏｍａｔｅｄ， ｓｉｘ－ｐｌｅｘ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｂｌｏｏｄ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４２４， ２０－２７， ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｉｍ．２０１５．０４．０１７ （２０１５）．
１６ Ａｈｍａｄ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｒａｐｉｄ ｔｒｉａｇｅ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ａｃｔｉｖｅ ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｃｏｕｇｈ． Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １１， ｅａａｗ８２８７， ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｗ８２８７ （２０１９）．
１７ Ｎｏｒｍａｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｕｌｔｒａ－Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈｉｇｈ－Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉ－ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｅａｒｌｙ Ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ＣＯＶＩＤ－１９ Ｐａｔｉｅｎｔｓ． ｍｅｄＲｘｉｖ， ２０２０．２００４．２０２８．２００８３６９１， ｄｏｉ：１０．１１０１／２０２０．０４．２８．２００８３６９１ （２０２０）．
１８ Ｔｏｂｏｓ， Ｃ． Ｉ．， Ｓｈｅｅｈａｎ， Ａ． Ｊ．， Ｄｕｆｆｙ， Ｄ． Ｃ． ＆ Ｒｉｓｓｉｎ， Ｄ． Ｍ． Ｃｕｓｔｏｍｉｚａｂｌｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ Ａｔｔｏｍｏｌａｒ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９２， ５６１３－５６１９， ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．０ｃ００６３１ （２０２０）．
１９ Ｇｉｌｂｏａ， Ｔ．， Ｍａｌｅｙ， Ａ． Ｍ．， Ｏｇａｔａ， Ａ． Ｆ．， Ｗｕ， Ｃ． ＆ Ｗａｌｔ， Ｄ． Ｒ． Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃａｐｔｕｒｅ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｒｒａｙｓ： Ａ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｃｒｏｓｓ－Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｎ／ａ， ２００１１１１， ｄｏｉ：１０．１００２／ａｄｈｍ．２０２００１１１１ （２０２０）．

【0181】

（実施例２）
バーコード化多重ＭＯＳＡＩＣアッセイ
本実施例は、バーコード化多重ＭＯＳＡＩＣアッセイを記載する。バーコード化多重ＭＯＳＡＩＣアッセイでは、蛍光色素にコードされた捕捉ビーズと、ＤＮＡ鋳型バーコード化検出抗体との独自の対を、各分析物について使用した（図１８）。捕捉ビーズを、本明細書に記載のように調製し、抗体－ＤＮＡコンジュゲートを以下に詳述されるように調製した。それぞれの独自のＤＮＡ鋳型にコンジュゲートされた抗体は、ＲＣＡ反応の間に増幅された場合、特異的な蛍光色素とコンジュゲートしたＤＮＡプローブまたは色素とコンジュゲートしたＤＮＡプローブのレシオメトリックな組合せで標識された。それぞれのプローブの色または色のレシオメトリックな組合せを、フローサイトメトリーにおける複数の検出チャネルを使用して識別することができる。ビーズ上での単一の分析物分子の捕捉の際に、独自のプライマー－鋳型配列とコンジュゲートした検出抗体の混合物を添加し、続いて洗浄し、蛍光色素とコンジュゲートしたＤＮＡプローブの混合物を含有するＲＣＡ反応物中に再懸濁した。各分析物は、（１）捕捉ビーズの色、蛍光強度、またはサイズと、（２）蛍光プローブの色または色の比との独自の対に対応していた。結果として、捕捉ビーズとプローブシグナルとの「正確な」一致した対のみが、各分析物について「オン」ビーズと分類されたが、捕捉ビーズとプローブの色の「誤った」対、すなわち、交差反応性結合事象は、さらなる分析から除外される。対照的に、非バーコード化多重ＭＯＳＡＩＣ形式においては、全ての検出抗体をビオチン化し、同じストレプトアビジン－ＤＮＡコンジュゲートおよび蛍光プローブで標識した。

【0182】

図１９Ａおよび図１９Ｂは、非バーコード化多重ＭＯＳＡＩＣ（図１９Ａ）およびバーコード化多重ＭＯＳＡＩＣ（図１９Ｂ）についての、漸増濃度のそれぞれの個々の標的タンパク質に関するドロップアウト曲線を描写する。図面によって示されるように、バーコード化多重ＭＯＳＡＩＣにおける正確な捕捉ビーズ－プローブの色の対のみの含有は、交差反応シグナルの除去を可能にし、したがって、より正確な多重測定を提供する。

【0183】

抗体－ＤＮＡコンジュゲートの調製
それぞれの検出抗体について、９５℃で２分間にわたってＮＥＢＮｅｘｔ Ｑｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）中で３０μＭのプライマーおよび３０．３μＭの鋳型の溶液を加熱し、９０分かけて室温まで冷却することにより、５’アジド改変プライマーを独自のＤＮＡ鋳型にアニーリングさせた。次いで、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを添加し、室温で２時間インキュベートしてライゲーションを実施した。ライゲーション反応物を、７Ｋ ＭＷＣＯ Ｚｅｂａスピン脱塩カラム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、１ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に緩衝液交換した。コンジュゲーションのために、検出抗体を、凍結乾燥形態からＰＢＳ中で再構成させたか、または５０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心式フィルターを使用してＰＢＳに緩衝液交換し、２０倍モル過剰のジベンゾシクロオクチン－ＰＥＧ４－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）と共に、室温で３０分間インキュベートし、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ中、５０Ｋ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬ遠心式フィルターを用いて精製した。次いで、２倍モル過剰のライゲーションしたプライマー－鋳型をＤＢＣＯ改変抗体に添加し、４℃で一晩インキュベートした。コンジュゲートを、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ、および０．０２％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ中、－８０℃でアリコートで保存した。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図5-3】

【図5-4】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7-1】

【図7-2】

【図7-3】

【図8-1】

【図8-2】

【図9-1】

【図9-2】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【図12-1】

【図12-2】

【図12-3】

【図12-4】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図13-4】

【図14-1】

【図14-2】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図16-1】

【図16-2】

【図16-3】

【図16-4】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図18】

【図19】

【国際調査報告】