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▶ シージェイ チェイルジェダン コーポレーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-06
(54)【発明の名称】レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭを製造する方法
(51)【国際特許分類】
C12P 19/56 20060101AFI20241029BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20241029BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20241029BHJP
C12P 19/30 20060101ALN20241029BHJP
【ＦＩ】
C12P19/56 ZNA
C12N15/54
C12N9/10
C12P19/30
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024523245
(86)(22)【出願日】2022-10-18
(85)【翻訳文提出日】2024-04-17
(86)【国際出願番号】 KR2022015809
(87)【国際公開番号】W WO2023068722
(87)【国際公開日】2023-04-27
(31)【優先権主張番号】10-2021-0139473
(32)【優先日】2021-10-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】513178894
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100136629
【弁理士】
【氏名又は名称】鎌田 光宜
(74)【代理人】
【識別番号】100080791
【弁理士】
【氏名又は名称】高島 一
(74)【代理人】
【識別番号】100125070
【弁理士】
【氏名又は名称】土井 京子
(74)【代理人】
【識別番号】100121212
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 弥栄子
(74)【代理人】
【識別番号】100174296
【弁理士】
【氏名又は名称】當麻 博文
(74)【代理人】
【識別番号】100137729
【弁理士】
【氏名又は名称】赤井 厚子
(74)【代理人】
【識別番号】100152308
【弁理士】
【氏名又は名称】中 正道
(74)【代理人】
【識別番号】100201558
【弁理士】
【氏名又は名称】亀井 恵二郎
(72)【発明者】
【氏名】キム、ジョンウン
(72)【発明者】
【氏名】パク、ソンヒ
(72)【発明者】
【氏名】キム、テ ギョン
(72)【発明者】
【氏名】オ、キョンミ
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AF23
4B064AF48
4B064CB01
4B064CC01
4B064CC24
4B064CD12
4B064DA10
(57)【要約】
本出願は、糖転移酵素の反応によりレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭを製造する方法、並びに糖転移酵素を含むレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭ製造用組成物に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の存在下でレバウジオシドＡと反応させてレバウジオシドＤを作製するステップを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である、レバウジオシドＤの製造方法。
【請求項2】
前記グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸は、スクロースとヌクレオチド二リン酸をスクロースシンターゼの存在下で反応させて作製したものである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項3】
前記レバウジオシドＡは、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でステビオシドと反応させて作製したものである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項4】
前記スクロースシンターゼは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項２に記載の製造方法。
【請求項5】
前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項３に記載の製造方法。
【請求項6】
前記糖転移酵素Ｂは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、レバウジオシドＤの異性体（isomer）をさらに作製するものである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項7】
前記製造方法は、同一反応系で連続的に行われるものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項8】
グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の存在下でレバウジオシドＡと反応させてレバウジオシドＤを作製するステップと、前記レバウジオシドＤを糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でグルコースが結合したヌクレオチド二リン酸と反応させてレバウジオシドＭを作製するステップとを含み、
前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である、レバウジオシドＭの製造方法。
【請求項9】
前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項８に記載の製造方法。
【請求項10】
前記グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸は、スクロースとヌクレオチド二リン酸をスクロースシンターゼの存在下で反応させて作製したものである、請求項８に記載の製造方法。
【請求項11】
前記レバウジオシドＡは、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でステビオシドと反応させて作製したものである、請求項８に記載の製造方法。
【請求項12】
前記スクロースシンターゼは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１０に記載の製造方法。
【請求項13】
前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１１に記載の製造方法。
【請求項14】
前記糖転移酵素Ｂは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、レバウジオシドＭの異性体（isomer）をさらに作製するものである、請求項８に記載の製造方法。
【請求項15】
前記製造方法は、同一反応系で連続的に行われるものである、請求項８～１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項16】
スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、スクロースシンターゼ及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を同一反応系で反応させてレバウジオシドＤを作製するステップを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを製造する方法。
【請求項17】
前記糖転移酵素Ｂは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、レバウジオシドＤの異性体（isomer）をさらに作製するものである、請求項１６に記載のレバウジオシドＡからレバウジオシドＤを製造する方法。
【請求項18】
スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、スクロースシンターゼ、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を同一反応系で反応させてレバウジオシドＭを作製するステップを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である、レバウジオシドＡからレバウジオシドＭを製造する方法。
【請求項19】
前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である、請求項１８に記載のレバウジオシドＡからレバウジオシドＭを製造する方法。
【請求項20】
前記糖転移酵素Ｂは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、レバウジオシドＭの異性体（isomer）をさらに作製するものである、請求項１８に記載のレバウジオシドＡからレバウジオシドＭを製造する方法。
【請求項21】
配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を含むレバウジオシドＤ製造用組成物。
【請求項22】
前記糖転移酵素Ｂは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記レバウジオシドＤは、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＤの異性体（isomer）からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２１に記載のレバウジオシドＤ製造用組成物。
【請求項23】
配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）と、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質である糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）とを含むレバウジオシドＭ製造用組成物。
【請求項24】
前記糖転移酵素Ｂは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記レバウジオシドＭは、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＭの異性体（isomer）からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項２３に記載のレバウジオシドＭ製造用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、糖転移酵素の反応によりレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭを製造する方法、並びに糖転移酵素を含むレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭ製造用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
糖摂取による疾病（肥満）の恐れから１日の糖摂取量を低減することを世界保健機関（ＷＨＯ）が勧告しており、先進国を中心に政府主導の下で様々な糖類摂取量を低減するための政策が盛んに議論されている。また、市場においては砂糖及び高果糖を代替する様々な代替甘味料素材に対するニーズが増加しており、代替甘味料素材の開発、製品化が続けられている。
【0003】
代替甘味料は、合成甘味料（Saccharin、Aspartame、Sucraloseなど）、合成糖アルコール類（Maltitol, Xylitol）、高甘味料（レバウジオシドＡ，Liquorice）と変化を続けている。しかし、持続的な合成甘味料の安定性についての懸念から天然甘味料に対する消費者のニーズが大きくなってきているものの、天然甘味料特有の異味・異臭を有する味質の限界により、従来の合成甘味料中心の低カロリー・ゼロカロリー製品を本格的に代替することができていない現状である。
【0004】
これに関して、近年、多くの注目を集めている天然の高甘味料は、ステビアの葉から抽出したステビア甘味料である。ステビア甘味料は、カロリーがなく、血中グルコース及びインスリンレベルに有益な効果をもたらし、人体に副作用がないことが報告されており、代替甘味料としての潜在力を有しているが、苦味が非常に強いという欠点があるので、砂糖低減用途に限界がある。
【0005】
ステビアは、南米のパラグアイを原産地とするキク科の多年生植物であり、学名はステビアレバウディアナベルトニー（Stevia rebaudiana Bertoni）である。ステビアの葉には砂糖の２００～３００倍以上の甘味を有する成分が存在するので、その甘味成分を抽出して天然甘味料として用いる。ステビア抽出物の甘味成分には、ステビオシド、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥなどの様々なステビオール配糖体が含まれる。
【0006】
ステビア抽出物の甘味成分のうち、ステビオシド（ＳＴＶ）、レバウジオシドＡ（Ｒｅｂ Ａ）、レバウジオシドＣ（Ｒｅｂ Ｃ）は、ステビアの葉に含有量が比較的多く、高純度で抽出、精製して産業化、製品化されているが、苦味が非常に強いという欠点があるので、砂糖低減用途に限界がある。
【0007】
一方、レバウジオシドＤ（Ｒｅｂ Ｄ）、レバウジオシドＭ（Ｒｅｂ Ｍ）は、ＳＴＶ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＣに比べて、苦味が少なく、甘味質に優れ、代替甘味料としての価値が高い。しかし、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭは、ステビアの葉に極めて微量しか存在せず、葉から抽出、精製して製造する方法に高コストを要するという欠点がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】韓国登録特許第１４０４７２８号公報
【特許文献2】国際公開第２０１４／１３３２４８号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444
【非特許文献2】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277
【非特許文献3】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453
【非特許文献4】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387(1984)
【非特許文献5】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)
【非特許文献6】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994
【非特許文献7】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073
【非特許文献8】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math(1981) 2:482
【非特許文献9】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358(1979)
【非特許文献10】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745
【非特許文献11】J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【非特許文献12】F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
本出願人は、レバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する活性を有する酵素を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、従来は糖転移酵素活性が開示されていなかったポリペプチド配列が糖転移酵素活性を有することを見出し、前記ポリペプチドがレバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する糖転移酵素活性を有することを確認し、本出願を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【0011】
本出願は、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の存在下で、レバウジオシドＡと反応させてレバウジオシドＤを作製するステップを含む、レバウジオシドＤの製造方法を提供することを目的とする。
【0012】
また、本出願は、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の存在下でレバウジオシドＡと反応させてレバウジオシドＤを作製するステップと、前記レバウジオシドＤを糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でグルコースが結合したヌクレオチド二リン酸と反応させてレバウジオシドＭを作製するステップとを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である、レバウジオシドＭの製造方法を提供することを目的とする。
【0013】
さらに、本出願は、スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、スクロースシンターゼ及び前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を同一反応系で反応させてレバウジオシドＤを作製するステップを含む、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを製造する方法を提供することを目的とする。
【0014】
さらに、本出願は、スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、スクロースシンターゼ、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及び前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を同一反応系で反応させてレバウジオシドＭを作製するステップを含む、レバウジオシドＡからレバウジオシドＭを製造する方法を提供することを目的とする。
【0015】
さらに、本出願は、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を含むレバウジオシドＤ製造用組成物を提供することを目的とする。
【0016】
さらに、本出願は、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）と、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）とを含むレバウジオシドＭ製造用組成物を提供することを目的とする。
【0017】
さらに、本出願は、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）における、レバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する糖転移酵素としての用途を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【0018】
本出願による糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を用いたレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭの製造方法は、副産物をほとんど伴うことなく、高純度及び高収率でレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭを提供することができ、安価な原料を用いるので経済的であり、手順が簡単で時間の消耗が少なく、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭの大量生産に有用である。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ＿６）によりレバウジオシドＡがレバウジオシドＤに変換されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。
【図2】糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ＿７）によりレバウジオシドＡがレバウジオシドＤ、レバウジオシドＤの異性体（isomer）及びレバウジオシドＭの異性体（isomer）に変換されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。
【図3】糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ＿８）によりレバウジオシドＡがレバウジオシドＤに変換されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。
【図4】糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ＿６）、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及びスクロースシンターゼによりステビオシドからレバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＩ及びレバウジオシドＡが生成されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。
【図5】糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ＿７）、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及びスクロースシンターゼによりステビオシドからレバウジオシドＭの異性体（isomer）、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＩ及びレバウジオシドＡが生成されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。
【図6】糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ＿８）、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及びスクロースシンターゼによりステビオシドからレバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＩ及びレバウジオシドＡが生成されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。
【図7】糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）によりレバウジオシドＤがレバウジオシドＭに変換されることを示すＨＰＬＣ分析結果である。
【図8】レバウジオシドＤの異性体（isomer）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果である。
【図9】レバウジオシドＤのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果である。
【図10】レバウジオシドＭの異性体（isomer）のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果である。
【図11】レバウジオシドＭのＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果である。
【発明を実施するための形態】
【0020】
以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。さらに、本明細書全体にわたって多くの論文及び特許文献が参照されており、その引用が示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体が本明細書に参照として組み込まれており、それにより本出願の属する技術分野の水準及び本出願の内容がより明確に説明される。
【0021】
本出願の一態様は、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の存在下で、レバウジオシドＡと反応させてレバウジオシドＤを作製するステップを含む、レバウジオシドＤの製造方法を提供する。
【0022】
本出願における「糖転移酵素（UDP(Uridine diphosphate)-glycosyltransferase, UGT）」とは、グリコシル供与体（glycosyl donor）からグリコシル受容体分子（glycosyl acceptor molecule）に単糖類部分を転移（transfer）する活性を有する酵素であって、具体的にはＵＤＰ－糖をグリコシル供与体として用いる酵素を意味する。本出願において、前記糖転移酵素は、「ＵＤＰ－糖転移酵素」及び「ＵＧＴ」と混用される。
【0023】
前記糖転移酵素は、糖転移酵素遺伝子を有するベクターで形質転換された組換え大腸菌、バチルス、酵母、コリネバクテリウム又はアグロバクテリウムから生産されたものであるか、前記大腸菌などから生産されてさらに精製されたものであるか、市販されている商品を購入して用いるが、これらに限定されるものではない。また、前記糖転移酵素は当該技術分野において公知であり、前記糖転移酵素のタンパク質及び遺伝子配列は公知のデータベースから得られ、例えばＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどから得られるが、これらに限定されるものではない。
【0024】
本出願においては、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）がレバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する酵素活性を有することを見出し、ＵＧＴ－Ｂの新たな用途を提供する。
【0025】
具体的には、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号３で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（essentially consisting of）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよい。
【0026】
また、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）は、配列番号１で表されるアミノ酸配列、配列番号２で表されるアミノ酸配列、又は配列番号３で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。さらに、そのような相同性又は同一性を有して本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）も本出願に含まれることは言うまでもない。
【0027】
本出願に「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドもしくはタンパク質」、「特定配列番号で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドもしくはタンパク質」又は「特定配列番号で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドもしくはタンパク質」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本出願に用いられることは言うまでもない。例えば、アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端におけるタンパク質の機能を変更しない配列の付加、自然に発生する突然変異、その非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられる。
【0028】
例えば、アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端及び／又は内部に、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の機能を変更しない配列の付加もしくは欠失、自然に発生する突然変異、非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられる。
【0029】
本出願における「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられ、疎水性アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンが挙げられる。また、アミノ酸は、電荷を帯びた（electrically charged）側鎖を有するアミノ酸と、電荷を帯びていない（uncharged）側鎖を有するアミノ酸に分類され、電荷を帯びた側鎖を有するアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられ、電荷を帯びていない側鎖を有するアミノ酸は、さらに非極性（nonpolar）アミノ酸と極性アミノ酸（polar）に分類され、非極性アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンが挙げられ、極性アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンが挙げられる。通常、保存的置換は、生成されるポリペプチドの活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。通常、保存的置換は、タンパク質又はポリペプチドの活性にほとんど又は全く影響を及ぼさない。
【0030】
また、糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失又は付加を含むものであってもよい。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時に（co-translationally）又は翻訳後に（post-translationally）タンパク質の移動（transfer）に関与するタンパク質のＮ末端のシグナル（又はリーダー）配列に結合されてもよい。また、前記ポリペプチドは、ポリペプチドを確認、精製又は合成できるように、他の配列又はリンカーに結合されてもよい。
【0031】
本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が類似する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。
【0032】
保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はポリペプチドの配列相同性又は同一性は標準的な配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全体又は一部分とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドンの縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。
【0033】
任意の２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献１のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献３）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５、６及び７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。
【0034】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドの相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献３などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。
【0035】
本出願の一例として、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）は、レバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する活性を有するものであってもよい。
【0036】
本出願における「相当する（corresponding to）」とは、ポリペプチドにおいて列挙される位置のアミノ酸残基であるか、又はポリペプチドにおいて列挙される残基に類似、同一もしくは相同するアミノ酸残基であることを意味する。相当する位置のアミノ酸を確認することは、特定配列を参照する配列の特定アミノ酸を決定することになる。本出願における「相当領域」とは、一般に関連タンパク質又は参照（reference）タンパク質における類似又は対応する位置を意味する。
【0037】
例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１とアラインメント（align）すると、それに基づいて、前記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基に相当するアミノ酸残基の数、位置を参照してナンバリングすることができる。例えば、本出願における配列アラインメントアルゴリズムは、クエリー配列（「参照配列」ともいう）と比較すると、アミノ酸の位置、又は置換、挿入、欠失などの改変が生じる位置を確認することができる。
【0038】
このようなアラインメントには、例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（非特許文献３）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）などを用いることができるが、これらに限定されるものではなく、当該技術分野で公知の配列アラインメントプログラム、ペアワイズ配列（pairwise sequence）比較アルゴリズムなどを適宜用いることができる。
【0039】
本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドは、上記各配列番号で表されるアミノ酸をコードする塩基配列だけでなく、前記配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を示す塩基配列であって、実質的に上記各タンパク質と同一又は相当する効能を示すタンパク質をコードする遺伝子配列であればいかなるものでもよい。また、そのような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換又は付加された塩基配列も本出願に含まれることは言うまでもない。
【0040】
本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味し、より具体的には前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
【0041】
本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであってもよい。本出願の一例として、前記ポリヌクレオチドは、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の配列を有するものであってもよく、前記配列を含むものであってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、配列番号６、配列番号７又は配列番号８の配列からなるものであってもよく、前記配列から実質的に構成されるものであってもよい。
【0042】
本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号６、配列番号７もしくは配列番号８の配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列を有するものであるか、前記塩基配列を含むものであるか、又は配列番号６、配列番号７もしくは配列番号８の配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、及び１００％未満の塩基配列からなるものであるか、前記塩基配列から実質的に構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。
【0043】
また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば本出願のポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（非特許文献１１、１２参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性もしくは同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。
【0044】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願のポリヌクレオチドには、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。
【0045】
具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検出することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。
【0046】
前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（例えば、非特許文献１１）。
【0047】
本出願の一実施例として、前記グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸は、スクロースとヌクレオチド二リン酸をスクロースシンターゼの存在下で反応させて作製したものであるが、これに限定されるものではない。
【0048】
本出願における「スクロースシンターゼ」は、植物体の代謝において可逆的にフルクトースにヌクレオチド二リン酸が結合したグルコースを転移してスクロースを生産する役割を果たし、本出願においては、５～１０のｐＨ範囲でスクロースとヌクレオチド二リン酸を反応させてグルコースが結合したヌクレオチド二リン酸とフルクトースに分離する活性を示す。
【0049】
前記スクロースシンターゼは、コメ、トウモロコシ、コムギ、タケ、シロイヌナズナ、シバ、オオムギ、モロコシ又はジャガイモに由来するスクロースシンターゼであり、コメ、トウモロコシ、コムギ又はオオムギに由来するスクロースシンターゼが好ましく、コメ、特にＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａに由来するスクロースシンターゼがより好ましい。前記スクロースシンターゼは、スクロースシンターゼ遺伝子を有するベクターで形質転換された組換え大腸菌、バチルス、酵母、コリネバクテリウム又はアグロバクテリウムから生産されたものであるか、前記大腸菌などから生産されてさらに精製されたものであるか、当該技術分野で公知のスクロースシンターゼであるか、市販されているものであるが、これらに限定されるものではない。
【0050】
具体的には、本出願のスクロースシンターゼは、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（essentially consisting of）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよい。
【0051】
前記スクロースは、スクロースシンターゼの基質として作用してヌクレオチド二リン酸にグルコースを供給できるものであればいかなるものでもよく、例えば原糖又は砂糖が用いられるが、これらに限定されるものではない。
【0052】
本出願において、ヌクレオチド二リン酸としては、プリンヌクレオチド又はピリミジンヌクレオチドが用いられ、ウリジン二リン酸が好ましいが、これらに限定されるものではない。
【0053】
前記グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸は、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）によりレバウジオシドＡと反応してレバウジオシドＤを生成するものであってもよい。
【0054】
本出願の一実施例として、前記レバウジオシドＡは、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でステビオシドと反応させて作製したものであるが、これに限定されるものではない。
【0055】
前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸をステビオシドと反応させてレバウジオシドＡを生成するものであってもよい。
【0056】
前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ、Ｂａｍｂｕｓａ ｏｌｄｈａｍｉｉ、Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ、Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ、Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ、Ｚｅａ ｍａｙｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来の糖転移酵素であってもよい。前記糖転移酵素は、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ、Ｂａｍｂｕｓａ ｏｌｄｈａｍｉｉ由来の糖転移酵素であることが好ましい。前記糖転移酵素は、Ｓｔｅｖｉａ ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ由来の糖転移酵素であることがより好ましい。前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、糖転移酵素遺伝子を有するベクターで形質転換された組換え大腸菌、バチルス、酵母、コリネバクテリウム又はアグロバクテリウムから生産されたものであるか、前記大腸菌などから生産されてさらに精製されたものであるか、当該技術分野で公知の糖転移酵素であるか、市販されているものであるが、これらに限定されるものではない。
【0057】
具体的には、本出願の糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（essentially consisting of）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよい。
【0058】
前記ステビオシドは、ステビアレバウディアナ熱水もしくはエタノール水溶液抽出物又はそれらの精製物もしくは抽出物からのレバウジオシドＡ生産の副産物であり、ステビオシド含有量がステビオール配糖体の総重量の１０％重量以上、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上、さらに好ましくは８０重量％以上であるものが用いられるが、これらに限定されるものではない。
【0059】
本出願の一実施例として、前記レバウジオシドＤは、反応式１のように作製したものであるが、これに限定されるものではない。
【0060】
［反応式１］
【0061】
具体的には、前記製造方法は、同一反応系で連続的に行われるものであってもよい。
【0062】
本出願における「同一反応系」とは、１つの反応系又は反応システムにおいて反応が連続的に起こることを意味する。
【0063】
本出願の製造方法は、このような反応式１により、ステビオシドの１３－Ｏ－グルコースのＣ－３’位に特異的に１つのグルコースを結合させてレバウジオシドＡを高収率で合成し、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを合成する連続反応システムを提供する。
【0064】
本出願の一実施例として、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、レバウジオシドＤの異性体（isomer）をさらに作製するものであるが、これに限定されるものではない。
【0065】
例えば、前記レバウジオシドＤは、次の構造式を有するものであるが、これに限定されるものではない。
【0066】
【化1】
【0067】
本出願の他の態様は、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の存在下でレバウジオシドＡと反応させてレバウジオシドＤを作製するステップと、前記レバウジオシドＤを糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でグルコースが結合したヌクレオチド二リン酸と反応させてレバウジオシドＭを作製するステップとを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である、レバウジオシドＭの製造方法を提供する。
【0068】
前記ヌクレオチド二リン酸、糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、レバウジオシドＡ及びレバウジオシドＤについては前述した通りである。
【0069】
本出願の一実施例として、前記グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸は、反応式１に示すように、スクロースとヌクレオチド二リン酸をスクロースシンターゼの存在下で反応させて作製したものであるが、これに限定されるものではない。
【0070】
具体的には、本出願のスクロースシンターゼは、配列番号５で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（essentially consisting of）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよい。
【0071】
本出願の一実施例として、前記レバウジオシドＡは、反応式１に示すように、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸を糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の存在下でステビオシドと反応させて作製したものであるが、これに限定されるものではない。
【0072】
具体的には、前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（essentially consisting of）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよい。
【0073】
本出願の糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、グルコースが結合したヌクレオチド二リン酸をレバウジオシドＤと反応させてレバウジオシドＭを生成するものであってもよい。
【0074】
具体的には、本出願の糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（essentially consisting of）ものであってもよく、前記アミノ酸配列からなるものであってもよい。
【0075】
本出願の一実施例として、前記レバウジオシドＭは、反応式２のように作製したものであるが、これに限定されるものではない。
【0076】
［反応式２］
【0077】
具体的には、前記製造方法は、同一反応系で連続的に行われるものであってもよい。
【0078】
本出願の製造方法は、このような反応式２により、ステビオシドからレバウジオシドＡを高収率で合成し、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを合成し、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭを合成する連続反応システムを提供する。
【0079】
よって、本出願の製造方法は、ステビオシド、レバウジオシドＡなどの入手が容易で安価な原料を用いて、ステビア抽出物に含まれるステビオシド、レバウジオシドＡなどの苦味成分をおいしさ成分であるレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭに変換することができるので、甘味質が良好なステビア甘味料の生産に有用である。
【0080】
本出願の一実施例として、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、レバウジオシドＭの異性体（isomer）をさらに作製するものであるが、これに限定されるものではない。
【0081】
例えば、前記レバウジオシドＭは、次の構造式を有するものであるが、これに限定されるものではない。
【0082】
【化2】
【0083】
本出願のさらに他の態様は、スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、スクロースシンターゼ及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を同一反応系で反応させてレバウジオシドＤを作製するステップを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤを製造する方法を提供する。
【0084】
前記スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、スクロースシンターゼ、糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、レバウジオシドＤ及び同一反応系については前述した通りである。
【0085】
本出願の一実施例として、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、レバウジオシドＤの異性体（isomer）をさらに作製するものであるが、これに限定されるものではない。
【0086】
本出願のさらに他の態様は、スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、スクロースシンターゼ、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を同一反応系で反応させてレバウジオシドＭを作製するステップを含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である、レバウジオシドＡからレバウジオシドＭを製造する方法を提供する。
【0087】
前記スクロース、ヌクレオチド二リン酸、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＤ、スクロースシンターゼ、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）、糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、同一反応系及びレバウジオシドＭについては前述した通りである。
【0088】
具体的には、前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるが、これに限定されるものではない。
【0089】
本出願の一実施例として、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、レバウジオシドＭの異性体（isomer）をさらに作製するものであるが、これに限定されるものではない。
【0090】
本出願のさらに他の態様は、糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を含み、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質であるレバウジオシドＤ製造用組成物を提供する。
【0091】
前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）及びレバウジオシドＤについては前述した通りである。
【0092】
本出願の一実施例として、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記レバウジオシドＤは、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＤの異性体（isomer）からなる群から選択される少なくとも１種であるが、これらに限定されるものではない。
【0093】
本出願のさらに他の態様は、糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）と、糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）とを含み、前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）は、配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）は、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質であるレバウジオシドＭ製造用組成物を提供する。
【0094】
前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）、糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）及びレバウジオシドＭについては前述した通りである。
【0095】
本出願の一実施例として、前記糖転移酵素Ｂは、配列番号１、配列番号２又は配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記レバウジオシドＭは、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＭの異性体（isomer）からなる群から選択される少なくとも１種であるが、これらに限定されるものではない。
【0096】
本出願の組成物は、アミノ酸生産用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【0097】
本出願のさらに他の態様は、配列番号１～３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種のタンパク質である糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）における、レバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する糖転移酵素としての用途を提供する。
【0098】
前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）、糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＭなどについては前述した通りである。
本出願
本出願
【実施例】
【0099】
以下、実施例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示する好ましい実施形態にすぎず、本出願がこれらに限定されるものではない。なお、本明細書に記載されていない技術的事項は、本出願の技術分野又は類似技術分野における熟練した技術者が十分に理解し、容易に実施することのできるものである。
【実施例1】
【0100】
培養条件
本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを導入して組換え微生物を作製し、その後糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を発現させて反応に用いた。組換え微生物の培養条件は次の通りである。
本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）をコードするポリヌクレオチドを導入して組換え微生物を作製し、その後糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を発現させて反応に用いた。組換え微生物の培養条件は次の通りである。
【0101】
実施例１－１．大腸菌の培養条件
組換え大腸菌の培養は、５０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを含むＬＢ培地５ｍｌを入れた試験管に接種し、６００ｎｍにおける吸光度が２．０になるまで３７℃の培養器にて種菌を培養した。５０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを含むＬＢ培地５００ｍｌを入れたフラスコに、種菌を培養した培養液を添加し、本培養を行った。また、６００ｎｍにおける吸光度が０．４になったら、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加して酵素の大量発現をそれぞれ誘導した。上記過程において、攪拌速度１８０ｒｐｍ、培養温度３７℃が保持されるように調節し、ＩＰＴＧ添加後は、攪拌速度１２０ｒｐｍで培養した。
組換え大腸菌の培養は、５０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを含むＬＢ培地５ｍｌを入れた試験管に接種し、６００ｎｍにおける吸光度が２．０になるまで３７℃の培養器にて種菌を培養した。５０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを含むＬＢ培地５００ｍｌを入れたフラスコに、種菌を培養した培養液を添加し、本培養を行った。また、６００ｎｍにおける吸光度が０．４になったら、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加して酵素の大量発現をそれぞれ誘導した。上記過程において、攪拌速度１８０ｒｐｍ、培養温度３７℃が保持されるように調節し、ＩＰＴＧ添加後は、攪拌速度１２０ｒｐｍで培養した。
【0102】
実施例１－２．コリネバクテリウムの培養条件
１０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを含む培地（Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎ １０ｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，Ｓｏｙｔｏｎｅ ５ｇ／Ｌ）に、組換えコリネバクテリウムを初期濃度Ｏ．Ｄ．６００＝０．１で接種し、３０℃で２４時間培養して酵素の発現を誘導した。１０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを含む培地（グルコース８０ｇ／Ｌ，ｓｏｙｔｏｎｅ ２０ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４１．２ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４ １．４ｇ／Ｌ）を入れた発酵槽に、前述したように得られた培養液をＯ．Ｄ．６００＝０．６で接種し、３０℃で２４時間培養した。
１０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを含む培地（Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎ １０ｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，Ｓｏｙｔｏｎｅ ５ｇ／Ｌ）に、組換えコリネバクテリウムを初期濃度Ｏ．Ｄ．６００＝０．１で接種し、３０℃で２４時間培養して酵素の発現を誘導した。１０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを含む培地（グルコース８０ｇ／Ｌ，ｓｏｙｔｏｎｅ ２０ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４１．２ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４ １．４ｇ／Ｌ）を入れた発酵槽に、前述したように得られた培養液をＯ．Ｄ．６００＝０．６で接種し、３０℃で２４時間培養した。
【実施例2】
【0103】
レバウジオシドＡ原料に対する糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の酵素活性の測定
実施例２－１．糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の精製
レバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ；配列番号１、配列番号２又は配列番号３）は、本出願の糖転移酵素Ｂをコードする遺伝子（配列番号６、配列番号７又は配列番号８）を含む組換えプラスミド（ベクター－ｐＥＴ２８ａ）をそれぞれ作製し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にクローニングして各酵素を大量発現させ、その後精製して用いた。
実施例２－１．糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の精製
レバウジオシドＡをレバウジオシドＤに変換する本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ；配列番号１、配列番号２又は配列番号３）は、本出願の糖転移酵素Ｂをコードする遺伝子（配列番号６、配列番号７又は配列番号８）を含む組換えプラスミド（ベクター－ｐＥＴ２８ａ）をそれぞれ作製し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）にクローニングして各酵素を大量発現させ、その後精製して用いた。
【0104】
具体的には、組換え菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養は、ＬＢ培地５ｍｌを入れた試験管に接種し、６００ｎｍにおける吸光度が２．０になるまで３７℃の培養器にて種菌を培養した。ＬＢ培地５００ｍｌを入れたフラスコに、種菌を培養した培養液を添加し、本培養を行った。また、６００ｎｍにおける吸光度が０．４になったら、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）を添加して酵素の大量発現をそれぞれ誘導した。上記過程において、攪拌速度１８０ｒｐｍ、培養温度３７℃が保持されるように調節し、ＩＰＴＧ添加後は、攪拌速度１２０ｒｐｍ、培養温度１６℃で培養した。前述したように形質転換した菌株の培養液を６０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離し、細胞上清のみ酵素液として分離した。酵素の特性を正確に把握するために、Ｎｉ－ＮＴＡ ｓｕｐｅｒｆｌｏｗカラムを用いて精製した。
【0105】
配列番号６、配列番号７又は配列番号８を含む組換えプラスミドを用いて大量発現させた各酵素をＵＧＴ－Ｂ＿６、ＵＧＴ－Ｂ＿７、ＵＧＴ－Ｂ＿８と命名した。
【0106】
一方、１０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを含む培地（Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎ １０ｇ／Ｌ，Ｂａｃｔｏ－ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ，Ｓｏｙｔｏｎｅ ５ｇ／Ｌ）に、組換えコリネバクテリウムを初期濃度Ｏ．Ｄ．６００＝０．１で接種し、３０℃で２４時間培養して酵素の発現を誘導した。１０μｇ／ｍｌの濃度のカナマイシンを含む培地（グルコース８０ｇ／Ｌ，ｓｏｙｔｏｎｅ ２０ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １０ｇ／Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ １．２ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４ １．４ｇ／Ｌ）を入れた発酵槽に、前述したように得られた培養液をＯ．Ｄ．６００＝０．６で接種し、３０℃で２４時間培養した。
【0107】
実施例２－２．レバウジオシドＡ原料に対する糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の酵素活性の測定
実施例２－１で作製した各酵素を用いて、レバウジオシドＡ原料に対する糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の酵素活性を測定した。
実施例２－１で作製した各酵素を用いて、レバウジオシドＡ原料に対する糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の酵素活性を測定した。
【0108】
具体的には、酵素反応に用いる原料は、レバウジオシドＡ（デピョン社）であり、水に２ｍＭになるように溶解して用いた。実施例２－１で作製した、微生物において発現した各酵素を用いて、３７度で１６時間反応を行い、その後ＨＰＬＣで分析した。前記原料の水溶液は、ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ又はＵＤＰ（Uridine-diphosphate）を２ｍＭ含むものである。
【0109】
ＨＰＬＣ分析条件は次の通りである。
・Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２１０ｎｍ
・Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ｍｌ／ｍｉｎ
・Ｓａｍｐｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．：１０μｌ
・Ｃｏｌｕｍｎ：Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ ＭＧ ＩＩ（Shiseido, ２５０×４．６ｍｍ, ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ：５μｍ）
・Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ３０％
・Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２１０ｎｍ
・Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ｍｌ／ｍｉｎ
・Ｓａｍｐｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．：１０μｌ
・Ｃｏｌｕｍｎ：Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ ＭＧ ＩＩ（Shiseido, ２５０×４．６ｍｍ, ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ：５μｍ）
・Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ３０％
【0110】
測定結果を表１及び図１～３に示す。
【0111】
【表1】
【0112】
表１及び図１～３に示すように、本出願の糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ＿６及びＵＧＴ－Ｂ＿８）により、レバウジオシドＡからレバウジオシドＤに変換されることが確認され、本出願の糖転移酵素（ＵＧＴ－Ｂ＿７）により、レバウジオシドＡからレバウジオシドＭの異性体（isomer）、レバウジオシドＤの異性体（isomer）及びレバウジオシドＤに変換されることが確認された。
【実施例3】
【0113】
ステビオシド原料に対する糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の酵素活性の測定
糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及びスクロースシンターゼは、先行技術文献（特許文献２）の方法により精製して用いた。その配列をそれぞれ配列番号４及び配列番号５に示す。
糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及びスクロースシンターゼは、先行技術文献（特許文献２）の方法により精製して用いた。その配列をそれぞれ配列番号４及び配列番号５に示す。
【0114】
前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）、前記スクロースシンターゼ、及び実施例２－１で作製した各糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を用いて、ステビオシド原料に対する糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）及び糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）の酵素活性を測定した。
【0115】
具体的には、酵素反応に用いる原料としては、２ｍＭステビオシド（haigen社）、５０ｍＭ砂糖（CJ第一製糖）水溶液を用いた。微生物において発現した前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）、前記スクロースシンターゼ、及び実施例２－１で作製した各糖転移酵素Ｂ（ＵＧＴ－Ｂ）を用いて、３７度で２４時間反応を行い、その後ＨＰＬＣで分析した。前記原料の水溶液は、ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ又はＵＤＰ（Uridine-diphosphate）を２ｍＭ含むものである。
【0116】
ＨＰＬＣ分析条件は次の通りである。
・Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２１０ｎｍ
・Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ｍｌ／ｍｉｎ
・Ｓａｍｐｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．：１０μｌ
・Ｃｏｌｕｍｎ：Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ ＭＧ ＩＩ（Shiseido, ２５０×４．６ｍｍ, ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ：５μｍ）
・Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ３０％
・Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２１０ｎｍ
・Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ｍｌ／ｍｉｎ
・Ｓａｍｐｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．：１０μｌ
・Ｃｏｌｕｍｎ：Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ ＭＧ ＩＩ（Shiseido, ２５０×４．６ｍｍ, ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ：５μｍ）
・Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ３０％
【0117】
測定結果を表２及び図４～６に示す。
【0118】
【表2】
【0119】
表２及び図４～６に示すように、ステビオシドからレバウジオシドＭの異性体（isomer）、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＩ及びレバウジオシドＡにモル濃度で１００％変換されることが確認された。
【実施例4】
【0120】
レバウジオシドＤ原料に対する糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）の酵素活性の測定
実施例３の糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）を用いて、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭへの変換率を測定した。
実施例３の糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）を用いて、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭへの変換率を測定した。
【0121】
具体的には、酵素反応に用いる原料としては、レバウジオシドＤ（haigen社）を水に１ｍＭになるように溶解して用いた。微生物において発現した前記糖転移酵素Ａ（ＵＧＴ－Ａ）を用いて、３７度で１６時間反応を行い、その後ＨＰＬＣで分析した。前記原料水溶液は、ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ又はＵＤＰ（Uridine-diphosphate）を２ｍＭ含むものである。
【0122】
ＨＰＬＣ分析条件は次の通りである。
・Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２１０ｎｍ
・Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ｍｌ／ｍｉｎ
・Ｓａｍｐｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．：１０μｌ
・Ｃｏｌｕｍｎ：Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ ＭＧ ＩＩ（Shiseido, ２５０×４．６ｍｍ, ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ：５μｍ）
・Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ３０％
・Ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ：２１０ｎｍ
・Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ：１ｍｌ／ｍｉｎ
・Ｓａｍｐｌｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌ．：１０μｌ
・Ｃｏｌｕｍｎ：Ｃａｐｃｅｌｌ ｐａｋ Ｃ１８ ＭＧ ＩＩ（Shiseido, ２５０×４．６ｍｍ, ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ：５μｍ）
・Ｓｏｌｖｅｎｔ：Ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ ３０％
【0123】
測定結果を図７に示す。
【0124】
図７に示すように、本出願の糖転移酵素Ａにより、レバウジオシドＤからレバウジオシドＭにほとんど変換されることが確認された。
【実施例5】
【0125】
レバウジオシドＤの異性体（isomer）及びレバウジオシドＭの異性体（isomer）の液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による分析
実施例２及び実施例３で変換した化合物がレバウジオシドＤの異性体（isomer）又はレバウジオシドＭの異性体（isomer）であるか否かを確認するために、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による分析を用いて、実施例２及び実施例３で変換したレバウジオシドＤの異性体（isomer）及びレバウジオシドＭの異性体（isomer）をそれぞれレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭと比較した。
実施例２及び実施例３で変換した化合物がレバウジオシドＤの異性体（isomer）又はレバウジオシドＭの異性体（isomer）であるか否かを確認するために、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）による分析を用いて、実施例２及び実施例３で変換したレバウジオシドＤの異性体（isomer）及びレバウジオシドＭの異性体（isomer）をそれぞれレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭと比較した。
【0126】
具体的には、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Waters社）及びＸｅ－ｖｏ Ｇ２－ＸＳ Ｑ－Ｔｏｆ質量分析器を用いた。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析条件を表３に示し、溶出条件を表４に示し、ＭＳ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓを表５に示す。
【0127】
【表3】
【0128】
【表4】
【0129】
【表5】
【0130】
その結果、図８及び図９に示すように、ＲｅｂＤ ＳｔａｎｄａｒｄとｆｒａｃｔｉｏｎしたＵｎｋｎｏｗｎ ｐｅａｋ１を比較した結果、ＲｅｂＤ ｓｔａｎｄａｒｄとＵｎｋｎｏｗｎ ｐｅａｋ１が同一分子量であり、ＭＳＭＳ Ｆｒａｇｍｅｎｔが一致するが、ＰｅａｋのＲｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅが異なることから、Ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｅａｋ１はＲｅｂＤのＩｓｏｍｅｒであることが確認された。
【0131】
また、図１０及び図１１に示すように、ＲｅｂＭ ＳｔａｎｄａｒｄとｆｒａｃｔｉｏｎしたＵｎｋｎｏｗｎ ｐｅａｋ２を比較した結果、ＲｅｂＭ ｓｔａｎｄａｒｄとＵｎｋｎｏｗｎ ｐｅａｋ２が同一分子量であり、ＭＳＭＳ Ｆｒａｇｍｅｎｔが一致するが、ＰｅａｋのＲｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅが異なることから、Ｕｎｋｎｏｗｎ ｐｅａｋ２はＲｅｂＭのＩｓｏｍｅｒであることが確認された。
【0132】
以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれる変更又は変形された形態が全て含まれるものと解釈すべきである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】