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特表2024-541032ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する薬剤をスクリーニングするための組換えコンストラクト
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-06
(54)【発明の名称】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する薬剤をスクリーニングするための組換えコンストラクト
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20241029BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20241029BHJP
C12Q 1/66 20060101ALI20241029BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20241029BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20241029BHJP
C12N 9/99 20060101ALN20241029BHJP
C12N 9/64 20060101ALN20241029BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63 Z ZNA
C07K19/00
C12Q1/66
C12N15/62 Z
C12N15/50
C12N9/99
C12N9/64
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024525341
(86)(22)【出願日】2022-10-27
(85)【翻訳文提出日】2024-06-25
(86)【国際出願番号】 IN2022050949
(87)【国際公開番号】W WO2023073733
(87)【国際公開日】2023-05-04
(31)【優先権主張番号】202111049482
(32)【優先日】2021-10-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IN
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】508176500
【氏名又は名称】カウンシル オブ サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100093300
【弁理士】
【氏名又は名称】浅井 賢治
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】レイ ウパサナ
(72)【発明者】
【氏名】トリパティ プレム プラカシュ
(72)【発明者】
【氏名】ベグム フェローザ
(72)【発明者】
【氏名】スリヴァスタヴァ アミット クマール
【テーマコード（参考）】
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ20
4B063QQ22
4B063QQ36
4B063QQ79
4B063QR16
4B063QR57
4B063QR66
4B063QS05
4B063QS15
4B063QS38
4B063QX02
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA01
4H045CA40
4H045DA89
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
トリプシン／トリプシン様プロテアーゼは、宿主細胞へのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の侵入を助長することが報告されている。スパイクはＳ１及びＳ２ドメイン間にプロテアーゼ開裂部位を有する。プロテアーゼの開裂特性を使用して、スパイク開裂に対する抗ウイルス性の候補をスクリーニングするための薬剤スクリーニングアッセイを設計することができる。クレームされた発明において、我々は、Ｓ１及びＳ２間でスパイクを開裂するプロテアーゼに対する薬剤をスクリーニングするための概念実証アッセイシステムを開発している。我々は、レポータータンパク質、Ｓ１及びＳ２間のプロテアーゼ開裂部位、並びにセルロース結合ドメインを含有する融合基質タンパク質を設計した。セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）の存在により、基質タンパク質をセルロースに固定することができる。プロテアーゼが基質を開裂すると、ＣＢＤはセルロースに結合したまま、レポータータンパク質が除去される。放出されたレポーターは、プロテアーゼ活性の読み出しとして使用することができる。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質に対する薬剤をスクリーニングするための組換えコンストラクト。
【請求項2】
（ｉ）配列番号１を有する融合タンパク質、（ｉｉ）設計された基質、
（ｉｉｉ）レポータータンパク質、
を含む、請求項１に記載の組換えコンストラクト。
【請求項3】
前記設計された基質が、タンパク質精製のために一端にヘキサヒスチジンタグを有する、請求項２に記載の組換えコンストラクト。
【請求項4】
メチオニンが、ヘキサヒスチジンのＮ末端に付加されている、請求項２に記載の組換えコンストラクト。
【請求項5】
前記レポータータンパク質が、（ａ）ヘキサヒスチジン残基の前記Ｎ末端における開始コドンであるメチオニン、
（ｂ）前記セルロース結合ドメイン配列の３’末端における２つの終止コドン、
を含む、請求項２に記載の組換えコンストラクト。
【請求項6】
ａ．配列番号３を有するレポータータンパク質、ｂ．配列番号４を有するスパイクタンパク質開裂配列、
ｃ．配列番号５を有するセルロース結合ドメイン、
から構成される、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
ｉ．配列番号１を有する融合タンパク質を提供する工程と、ｉｉ．工程（ｉ）で得られる前記融合タンパク質にトリプシン様プロテアーゼ及び試験対象薬剤を添加して反応混合物を得る工程と、
ｉｉｉ．セルロースマトリックス／スラリーを提供する工程と、
ｉｖ．工程（ｉｉ）で得られる前記反応混合物を工程（ｉｉｉ）で得られる前記セルロースマトリックスと混合する工程と、
ｖ．工程（ｉｖ）で得られる前記混合物を遠心分離して、レポーターアッセイのために前記反応上清から前記レポータータンパク質を得る工程と、
ｖｉ．前記レポーターシグナルを測定する工程であって、インヒビターを含まないコントロールと比較したレポーターシグナルの減少が、スクリーニングされる前記薬剤の陽性活性を確認する工程と、
を含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する薬剤スクリーニングのためのインビトロアッセイシステム。
【請求項8】
薬剤が、カモスタットメシル酸塩、カテプシンＢインヒビター、フーリンインヒビターＩＩ、プロテアーゼインヒビター、フーリンインヒビターＩ、トリプシンインヒビター、オボムコイド、クニッツトリプシンインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、ＴＭＰＲＳＳ２インヒビターからなる群から選択される、請求項７に記載のインビトロアッセイシステム。
【請求項9】
セルロースマトリックスが、３３質量／体積％のスラリー組成物における反応に使用されるバッファ中のセルロースから構成される、請求項７に記載のインビトロアッセイシステム。
【請求項10】
前記レポータータンパク質が、ルシフェラーゼ及び蛍光レポーターからなる群から選択される、請求項７に記載のインビトロアッセイシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、レポーターを用いたインビトロのトリプシン／トリプシン様プロテアーゼに基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質開裂アッセイシステムの開発に関する。このアッセイシステムは、ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２スパイクタンパク質に対する薬剤をスクリーニングするための組換えコンストラクトを含む。
【背景技術】
【0002】
トリプシン様プロテアーゼは、コロナウイルス感染（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ等）を助長する重要な役割を担うことが知られている［１－４］。これらの酵素はスパイクタンパク質を開裂して、細胞への侵入に関する宿主受容体との相互作用を促進する。コロナウイルスはＳ１／Ｓ２及びＳ２／Ｓ２’と呼ばれる特異的な開裂部位を有することが知らており、これらは更なるプロセシングのために気道プロテアーゼにより特異的に認識される。Ｋａｍら［２］及びＷｅｂｅｒら［１］は、スパイクタンパク質における潜在的なプロテアーゼ開裂部位を特定するためにそれぞれＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶの研究を行い、タンパク質分解プロセシングを担う２つの部位（Ｓ１／Ｓ２及びＳ２／Ｓ２’）を特定することができた。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクはこれら２つの部位と共に、Ｓ１／Ｓ２付近に特別な多塩基性の開裂部位を有することも知られており、異なるプロテアーゼによる認識に影響を受けやすい［３，４，５］。Ｈｏｆｆｍａｎｎらによれば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクにおいて、Ｓ１／Ｓ２開裂部位は６７６から６８８番残基であり、Ｓ２’部位は８１１から８１８番残基であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＭＥＲＳ－ＣｏＶスパイク開裂配列に類似している［１，２，４］。トリプシンのような気道セリンプロテアーゼは、そのエンベロープ糖タンパク質を開裂することにより、インフルエンザＡウイルス感染を媒介する上で重要であることが知られており、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクを認識して開裂することも示されている［２，５］。ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼＴＴＳＰのような他のセリンプロテアーゼは、コロナウイルススパイクタンパク質のプロセシング、及びその感染力を高める上で重要であることが広く研究されてる［１－４］。同様に、フーリン及びカテプシンのような他のプロテアーゼがあり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２スパイクタンパク質をそのダウンストリームプロセシングに特異的な領域において開裂することも知られている［５］。従って気道プロテアーゼ及びトリプシン様プロテアーゼはコロナウイルスのウイルス感染力を高めるのに重要な役割を担うため、近い将来、抗ウイルス治療の潜在的な標的となり得る。
【発明の概要】
【0003】
本発明の主な目的は、レポーターを用いたインビトロのトリプシン／トリプシン様プロテアーゼに基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質開裂アッセイシステムの開発である。本アッセイシステムは、ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２スパイクタンパク質に対する薬剤をスクリーニングするための組換えコンストラクトを含む。
本発明の更に別の目的は、トリプシン／トリプシン様プロテアーゼ開裂活性に関するクレームされたアッセイシステムで使用する基質である。
本発明の更に別の目的は、トリプシン／トリプシン様プロテアーゼ開裂活性に関するクレームされたアッセイシステムで使用する基質である。
【0004】
従って、本発明は、レポーターを用いたインビトロのトリプシン／トリプシン様プロテアーゼに基づくＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質開裂アッセイシステムを提供する。本アッセイシステムは、ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２スパイクタンパク質に対する薬剤をスクリーニングするための組換えコンストラクトを含む。
本発明の実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のトリプシン／トリプシン様プロテアーゼ開裂領域、レポータータンパク質及びセルロース結合ドメインを含む基質が設計、使用されている。基質はタンパク質精製の目的で、一端にヘキサヒスチジンタグも有する。タンパク質発現のためにヘキサヒスチジンのＮ末端にメチオニンを添加した。基質に相当するＤＮＡコンストラクトを細菌系における発現のために全体にコドン修飾している。
本発明の実施形態において、アッセイシステムで使用するクレームされた基質は、トリプシン／トリプシン様プロテアーゼにより開裂される。セルロースマトリックス／スラリーはセルロース結合ドメインを捕捉し、開裂された基質からレポータータンパク質が放出され、このレポータータンパク質はその後レポーターアッセイを使用して検出することができる。
本発明の別の実施形態において、基質の設計に使用するレポーターはナノルシフェラーゼである。或いは、他のルシフェラーゼ並びに蛍光レポーターを使用してよい。コンストラクトで使用するＮａｎｏｌｕｃルシフェラーゼは新規の生物発光タンパク質であり、より良好な光放出能を有し、物理的及び生化学的性質が強化されている［６］。その特異的な活性は、以前に報告された他のルシフェラーゼ（例、ホタル又はウミシイタケ）よりも大きい。その高い感度により、Ｎａｎｏｌｕｃルシフェラーゼは、他のルシフェラーゼと比較して、非常に少量でさえ、生物発光シグナルを引き出すことができる。設計したコンストラクトは、特異的な酵素により開裂されると、生物発光を表す際に非常に強力である。設計したアッセイシステムは、より効率的に酵素が基質を開裂し、多くの生物発光シグナルが生成され、任意の酵素特異的インヒビターが導入されるなら、シグナルは使用する薬剤量に比例して減少するという原理に基づくものである。
本発明の実施形態において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質のトリプシン／トリプシン様プロテアーゼ開裂領域、レポータータンパク質及びセルロース結合ドメインを含む基質が設計、使用されている。基質はタンパク質精製の目的で、一端にヘキサヒスチジンタグも有する。タンパク質発現のためにヘキサヒスチジンのＮ末端にメチオニンを添加した。基質に相当するＤＮＡコンストラクトを細菌系における発現のために全体にコドン修飾している。
本発明の実施形態において、アッセイシステムで使用するクレームされた基質は、トリプシン／トリプシン様プロテアーゼにより開裂される。セルロースマトリックス／スラリーはセルロース結合ドメインを捕捉し、開裂された基質からレポータータンパク質が放出され、このレポータータンパク質はその後レポーターアッセイを使用して検出することができる。
本発明の別の実施形態において、基質の設計に使用するレポーターはナノルシフェラーゼである。或いは、他のルシフェラーゼ並びに蛍光レポーターを使用してよい。コンストラクトで使用するＮａｎｏｌｕｃルシフェラーゼは新規の生物発光タンパク質であり、より良好な光放出能を有し、物理的及び生化学的性質が強化されている［６］。その特異的な活性は、以前に報告された他のルシフェラーゼ（例、ホタル又はウミシイタケ）よりも大きい。その高い感度により、Ｎａｎｏｌｕｃルシフェラーゼは、他のルシフェラーゼと比較して、非常に少量でさえ、生物発光シグナルを引き出すことができる。設計したコンストラクトは、特異的な酵素により開裂されると、生物発光を表す際に非常に強力である。設計したアッセイシステムは、より効率的に酵素が基質を開裂し、多くの生物発光シグナルが生成され、任意の酵素特異的インヒビターが導入されるなら、シグナルは使用する薬剤量に比例して減少するという原理に基づくものである。
【0005】
略称
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２
ＭＥＲＳ 中東呼吸器症候群
ＣＢＤ セルロース結合ドメイン
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＴＢＳＴ トリス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ２０
ＴＭＰＲＳＳ２ 膜貫通型セリンプロテアーゼ２
ＣＭ カモスタットメシル酸塩
ＣＢ カテプシンＢ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ 重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２
ＭＥＲＳ 中東呼吸器症候群
ＣＢＤ セルロース結合ドメイン
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＴＢＳＴ トリス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ２０
ＴＭＰＲＳＳ２ 膜貫通型セリンプロテアーゼ２
ＣＭ カモスタットメシル酸塩
ＣＢ カテプシンＢ
【図面の簡単な説明】
【0006】
【図10】図１０はカモスタットメシル酸塩（ＴＭＰＲＳＳ２インヒビター）の不存在下及び異なる２つの量での存在下、ＴＭＰＲＳＳ２で基質を消化した（ナノルシフェラーゼアッセイ）。ＣＭ＝カモスタットメシル酸塩。
【発明を実施するための形態】
【0007】
クレームされた薬剤スクリーニングアッセイシステムの作用機序
基質はすべて融合タンパク質として、レポータータンパク質、次にスパイクタンパク質開裂配列及びセルロース結合ドメインを含有する［図１］。トリプシン様プロテアーゼを添加すると、基質は開裂部位で開裂され、レポータータンパク質は除去される。セルロースマトリックス／スラリーのセルロースがこの反応混合物に添加されると、セルロース結合ドメインに結合し、レポータータンパク質は反応上清からレポーターアッセイに利用できる。明確なレポーターシグナルはプロテアーゼによる開裂を示す。開裂バンドは、タンパク質染色染料を用いた染色又はウェスタンブロット分析後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で可視化することもできる［図２］。
アッセイシステムの実用性
このアッセイシステムは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を開裂するトリプシン／トリプシン様プロテアーゼに対する薬剤をスクリーニングするのに使用することができる。この開裂はその宿主細胞にこのウイルスが侵入するプロセスに重要であり、クレームされた薬剤スクリーニングアッセイシステムは、スパイクタンパク質を開裂する際のトリプシン／トリプシン様プロテアーゼの機能に対する薬剤をスクリーニングするのに使用することができる。この薬剤はカモスタットメシル酸塩、カテプシンＢインヒビター、フーリンインヒビターＩＩ、プロテアーゼインヒビター、フーリンインヒビターＩ、トリプシンインヒビター、オボムコイド、クニッツトリプシンインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、ＴＭＰＲＳＳ２インヒビターからなる群から選択される。設計したコンストラクトは、スパイクを開裂することがまだ知られていないプロテアーゼの開裂部位を特定するのに有用となり得る。また、他の未知の宿主プロテアーゼがスパイクタンパク質開裂に関与するかどうかを特定するのに使用することもできる。設計したアッセイシステムは理解し、解釈するのが容易であり、複雑な工程は含まれない。
基質はすべて融合タンパク質として、レポータータンパク質、次にスパイクタンパク質開裂配列及びセルロース結合ドメインを含有する［図１］。トリプシン様プロテアーゼを添加すると、基質は開裂部位で開裂され、レポータータンパク質は除去される。セルロースマトリックス／スラリーのセルロースがこの反応混合物に添加されると、セルロース結合ドメインに結合し、レポータータンパク質は反応上清からレポーターアッセイに利用できる。明確なレポーターシグナルはプロテアーゼによる開裂を示す。開裂バンドは、タンパク質染色染料を用いた染色又はウェスタンブロット分析後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上で可視化することもできる［図２］。
アッセイシステムの実用性
このアッセイシステムは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質を開裂するトリプシン／トリプシン様プロテアーゼに対する薬剤をスクリーニングするのに使用することができる。この開裂はその宿主細胞にこのウイルスが侵入するプロセスに重要であり、クレームされた薬剤スクリーニングアッセイシステムは、スパイクタンパク質を開裂する際のトリプシン／トリプシン様プロテアーゼの機能に対する薬剤をスクリーニングするのに使用することができる。この薬剤はカモスタットメシル酸塩、カテプシンＢインヒビター、フーリンインヒビターＩＩ、プロテアーゼインヒビター、フーリンインヒビターＩ、トリプシンインヒビター、オボムコイド、クニッツトリプシンインヒビター、セリンプロテアーゼインヒビター、ＴＭＰＲＳＳ２インヒビターからなる群から選択される。設計したコンストラクトは、スパイクを開裂することがまだ知られていないプロテアーゼの開裂部位を特定するのに有用となり得る。また、他の未知の宿主プロテアーゼがスパイクタンパク質開裂に関与するかどうかを特定するのに使用することもできる。設計したアッセイシステムは理解し、解釈するのが容易であり、複雑な工程は含まれない。
【実施例】
【0008】
以下の実施例は本発明の説明のために示しているため、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
実施例１
レポーターを用いた基質ＤＮＡ：コンストラクト設計及びクローニング
設計した遺伝子配列を細菌発現系における発現のためにコドン最適化し、融合インサート全体を細菌発現ベクタｐＥＴ３０ａの制限酵素部位ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ間にクローニングした［図３及び４］。
クローニングについての詳細は以下の通りである。
・設計する基質ＤＮＡ（配列番号２）（ＵＲＳＣＲＥＥＮＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＢａｃｔＤＮＡ）は、開始コドン（メチオニン）－ポリｈｉｓタグ（６ｘ）－レポーターコンストラクト（ナノルシフェラーゼ）（配列番号３）（ＵＲＳＣＲＥＥＮＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ＮａｎｏＬｕｃＤＮＡ）－プロテアーゼ開裂部位（配列番号４）（ＵＲＳＣＲＥＥＮＳＡＲＳ－ＣｏＶ２開裂部位ＤＮＡ）－セルロース結合ドメイン（配列番号５）（ＵＲＳＣＲＥＥＮＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ＣＢＤＤＮＡ）－終止コドンからなる［図３］。
・ナノルシフェラーゼに使用されるソース遺伝子配列のアクセッション番号はＡＩＳ２３６６６である［６］。
・セルロース結合ドメインに使用されるソース遺伝子配列のアクセッション番号はＣＡＡ４８３１２．１である［７］。
・プロテアーゼ開裂部位に使用されるソース遺伝子配列のアクセッション番号はＹＰ＿００９７２４３９０．１である［８］。
・タンパク質翻訳を開始することができるように、開始コドンであるメチオニンを配列に導入した。
・メチオニンに続いて、発現したタンパク質の精製のためにヘキサヒスチジン残基を導入した。
・２つの終止コドン（ＴＡＧ及びＴＡＡ）をセルロース結合ドメイン配列の３’末端に導入した。
・制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ１の開裂部位をメチオニンである開始コドンより前の配列の５’末端に導入した。制限酵素開裂部位がＣＡＴＡＴＧであり、残りの部分、つまりＡＴＧが開始コドンとして利用できるため、ＡＴＧより前に余分に３つのヌクレオチド（ＣＡＴ）を添加しさえすればよかった。
・制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）の開裂部位を終止コドンより後の配列の３’末端に導入した。
・ＩＤＴツール（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ株式会社）を使用して、細菌発現のために融合遺伝子全体をコドン最適化し、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡツールを使用して、（元の及びコドン最適化した）配列をアライメントし、最終的なタンパク質発現における任意の変化を確認した。
・遺伝子配列を細菌発現ベクタＰｅｔ３０ａ＋のＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位間に挿入した。
・ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を使用し、プラスミドＤＮＡの制限消化によりクローニングを更に検証した。
実施例１
レポーターを用いた基質ＤＮＡ：コンストラクト設計及びクローニング
設計した遺伝子配列を細菌発現系における発現のためにコドン最適化し、融合インサート全体を細菌発現ベクタｐＥＴ３０ａの制限酵素部位ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ間にクローニングした［図３及び４］。
クローニングについての詳細は以下の通りである。
・設計する基質ＤＮＡ（配列番号２）（ＵＲＳＣＲＥＥＮＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＢａｃｔＤＮＡ）は、開始コドン（メチオニン）－ポリｈｉｓタグ（６ｘ）－レポーターコンストラクト（ナノルシフェラーゼ）（配列番号３）（ＵＲＳＣＲＥＥＮＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ＮａｎｏＬｕｃＤＮＡ）－プロテアーゼ開裂部位（配列番号４）（ＵＲＳＣＲＥＥＮＳＡＲＳ－ＣｏＶ２開裂部位ＤＮＡ）－セルロース結合ドメイン（配列番号５）（ＵＲＳＣＲＥＥＮＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ＣＢＤＤＮＡ）－終止コドンからなる［図３］。
・ナノルシフェラーゼに使用されるソース遺伝子配列のアクセッション番号はＡＩＳ２３６６６である［６］。
・セルロース結合ドメインに使用されるソース遺伝子配列のアクセッション番号はＣＡＡ４８３１２．１である［７］。
・プロテアーゼ開裂部位に使用されるソース遺伝子配列のアクセッション番号はＹＰ＿００９７２４３９０．１である［８］。
・タンパク質翻訳を開始することができるように、開始コドンであるメチオニンを配列に導入した。
・メチオニンに続いて、発現したタンパク質の精製のためにヘキサヒスチジン残基を導入した。
・２つの終止コドン（ＴＡＧ及びＴＡＡ）をセルロース結合ドメイン配列の３’末端に導入した。
・制限エンドヌクレアーゼＮｄｅ１の開裂部位をメチオニンである開始コドンより前の配列の５’末端に導入した。制限酵素開裂部位がＣＡＴＡＴＧであり、残りの部分、つまりＡＴＧが開始コドンとして利用できるため、ＡＴＧより前に余分に３つのヌクレオチド（ＣＡＴ）を添加しさえすればよかった。
・制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）の開裂部位を終止コドンより後の配列の３’末端に導入した。
・ＩＤＴツール（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ株式会社）を使用して、細菌発現のために融合遺伝子全体をコドン最適化し、ＣＬＵＳＴＡＬ ＯＭＥＧＡツールを使用して、（元の及びコドン最適化した）配列をアライメントし、最終的なタンパク質発現における任意の変化を確認した。
・遺伝子配列を細菌発現ベクタＰｅｔ３０ａ＋のＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位間に挿入した。
・ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を使用し、プラスミドＤＮＡの制限消化によりクローニングを更に検証した。
【0009】
実施例２
基質タンパク質の発現及び精製
我々はＥ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｃｏ２１コンピテントセル（ニューイングランドバイオラボ、２４０カントリーロード、イプスウィッチ、ＭＡ０１９３８－２７２３、米国から入手）中で基質タンパク質（配列番号１）（ＵＲＳＣＲＥＥＮＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡ精製技術を使用して精製した。基質は可溶性フラクションから精製することができた。基質発現プラスミドをＮｉｃｏ２１細胞中で形質転換し、ＬＢ－Ｋａｎプレートで培養した。プレートを一晩３７℃でインキュベートし、形質転換コロニーの１つを２ｍｌの選択培地に添加した（１次接種）。４～６時間培養後、２次接種を２００ｍｌ培養物で実施し、ＯＤ６００が０．４～０．５に達するまで培養物を培養した。その後、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより培養物を誘導し、振とう条件下、１５℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、４度で培養物を遠心沈殿させることにより細胞を採取した。細胞を２０ｍｌの細胞溶解バッファ（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８）に再懸濁し、超音波分解した（３０アンペア、２０秒オン２０秒オフ条件、６０分）。溶解物を１５０００ｇで３０分間４度で遠心分離することにより可溶性（細胞質）及び不溶性（封入体及び破片）フラクションを分離した。ペレット及び上清を１０％分離ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４％スタッキング使用）で泳動して、タンパク質発現を確認した。ゲルを７０Ｖで１５分間泳動した後、タンパク質ラダーが分離するまで１１０Ｖで泳動した。ゲルをＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅゲル染料（Ｉｎｖｉｔｒоｇｅｎ社）で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃで可視化した。得られた可溶性フラクションを使用し、Ｎｉ－ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）でタンパク質を精製した。まず、カラムを室温でＱＩＡｒａｃｋに配置してカラムの末端に樹脂を下降させた。キャップを開ける前に封を切り、保存バッファを通過させた。１０ｍｌの結合バッファ（使用する結合バッファは細胞溶解バッファと同じであった）を添加することによりカラムを平衡化し、自然落下により通過させた。可溶性フラクションをカラムに添加し、５分間そのままにした後通過させた。洗浄バッファを使用してカラムを洗浄し、溶出バッファを使用してタンパク質を溶出した。洗浄バッファ及び溶出バッファはそれぞれ２０ｍＭイミダゾール及び２５０ｍＭイミダゾールを含有し、細胞溶解バッファと同じ静置条件を維持した。精製後、透析バッファ（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＫＣｌ、２０％グリセロール、７ｍＭのベータメルカプトエタノール）中、一晩４℃でタンパク質を透析した。透析後のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動し、ゲル染色を使用して確認した［図５］。多数のチューブに等分し、－８０℃で保存した。
また、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓ１／Ｓ２抗体並びに抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用し、精製した基質タンパク質を検証した［図６］。精製したタンパク質をＳＤＳゲルローディングダイと共に、１０％分離ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４％スタッキングを使用）にロードした。ゲルを７０Ｖで１５分間泳動した後、ラダーが分離するまで１１０Ｖで泳動した。４００ｍＡ、２時間４℃条件で、転写バッファ（１９０ｍＭのグリシン、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．３、２００ｍｌメタノール）でニトロセルロース膜（細孔サイズ０．４５μｍ）を使用してゲルを転写させた。ポンソー染色液（５％酢酸中に１％ポンソー染色剤）を使用してブロットを染色し、転写の状態を可視化した。タンパク質転写の確認後、室温で２時間、低速振とう条件で、ＴＢＳＴバッファ（２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｈ７．６）中の５％スキムミルクを使用して膜をブロッキングした。一次抗体（ウサギで産生した抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓ２／Ｓ２’部位、Ｇｅｎｅ Ｔｅｘ社ＧＴＸ１３５３８６、５％ブロッキング溶液で１：１０００希釈）（又は抗Ｈｉｓ抗体）をブロットに添加し、４℃で１４時間、低速振とう条件でインキュベートした。ブロットを更に室温で１５分間、振とう条件下、一次抗体中でインキュベートした後、５分間、高速振とう条件で３回、ＴＢＳＴバッファで洗浄した。その後、室温で１時間、低速振とう条件でブロットを二次抗体（ヤギで産生した抗ウサギＩｇＧ、ＮＢＰ１７５３４６、ＴＢＳＴバッファで１：５０００）とインキュベートした。洗浄工程を繰り返した。ＣｌａｒｉｔｙのＥＣＬ基質を使用し、ＣｈｅｍｉＤｏｃでブロットを現像した。
基質タンパク質の発現及び精製
我々はＥ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎｉｃｏ２１コンピテントセル（ニューイングランドバイオラボ、２４０カントリーロード、イプスウィッチ、ＭＡ０１９３８－２７２３、米国から入手）中で基質タンパク質（配列番号１）（ＵＲＳＣＲＥＥＮＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）を発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡ精製技術を使用して精製した。基質は可溶性フラクションから精製することができた。基質発現プラスミドをＮｉｃｏ２１細胞中で形質転換し、ＬＢ－Ｋａｎプレートで培養した。プレートを一晩３７℃でインキュベートし、形質転換コロニーの１つを２ｍｌの選択培地に添加した（１次接種）。４～６時間培養後、２次接種を２００ｍｌ培養物で実施し、ＯＤ６００が０．４～０．５に達するまで培養物を培養した。その後、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加することにより培養物を誘導し、振とう条件下、１５℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、４度で培養物を遠心沈殿させることにより細胞を採取した。細胞を２０ｍｌの細胞溶解バッファ（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８）に再懸濁し、超音波分解した（３０アンペア、２０秒オン２０秒オフ条件、６０分）。溶解物を１５０００ｇで３０分間４度で遠心分離することにより可溶性（細胞質）及び不溶性（封入体及び破片）フラクションを分離した。ペレット及び上清を１０％分離ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４％スタッキング使用）で泳動して、タンパク質発現を確認した。ゲルを７０Ｖで１５分間泳動した後、タンパク質ラダーが分離するまで１１０Ｖで泳動した。ゲルをＳｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅゲル染料（Ｉｎｖｉｔｒоｇｅｎ社）で染色し、ＣｈｅｍｉＤｏｃで可視化した。得られた可溶性フラクションを使用し、Ｎｉ－ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ社）でタンパク質を精製した。まず、カラムを室温でＱＩＡｒａｃｋに配置してカラムの末端に樹脂を下降させた。キャップを開ける前に封を切り、保存バッファを通過させた。１０ｍｌの結合バッファ（使用する結合バッファは細胞溶解バッファと同じであった）を添加することによりカラムを平衡化し、自然落下により通過させた。可溶性フラクションをカラムに添加し、５分間そのままにした後通過させた。洗浄バッファを使用してカラムを洗浄し、溶出バッファを使用してタンパク質を溶出した。洗浄バッファ及び溶出バッファはそれぞれ２０ｍＭイミダゾール及び２５０ｍＭイミダゾールを含有し、細胞溶解バッファと同じ静置条件を維持した。精製後、透析バッファ（５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４、１００ｍＭのＫＣｌ、２０％グリセロール、７ｍＭのベータメルカプトエタノール）中、一晩４℃でタンパク質を透析した。透析後のタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで泳動し、ゲル染色を使用して確認した［図５］。多数のチューブに等分し、－８０℃で保存した。
また、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓ１／Ｓ２抗体並びに抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット分析を使用し、精製した基質タンパク質を検証した［図６］。精製したタンパク質をＳＤＳゲルローディングダイと共に、１０％分離ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（４％スタッキングを使用）にロードした。ゲルを７０Ｖで１５分間泳動した後、ラダーが分離するまで１１０Ｖで泳動した。４００ｍＡ、２時間４℃条件で、転写バッファ（１９０ｍＭのグリシン、２５ｍＭのトリス、ｐＨ８．３、２００ｍｌメタノール）でニトロセルロース膜（細孔サイズ０．４５μｍ）を使用してゲルを転写させた。ポンソー染色液（５％酢酸中に１％ポンソー染色剤）を使用してブロットを染色し、転写の状態を可視化した。タンパク質転写の確認後、室温で２時間、低速振とう条件で、ＴＢＳＴバッファ（２０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｐｈ７．６）中の５％スキムミルクを使用して膜をブロッキングした。一次抗体（ウサギで産生した抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２Ｓ２／Ｓ２’部位、Ｇｅｎｅ Ｔｅｘ社ＧＴＸ１３５３８６、５％ブロッキング溶液で１：１０００希釈）（又は抗Ｈｉｓ抗体）をブロットに添加し、４℃で１４時間、低速振とう条件でインキュベートした。ブロットを更に室温で１５分間、振とう条件下、一次抗体中でインキュベートした後、５分間、高速振とう条件で３回、ＴＢＳＴバッファで洗浄した。その後、室温で１時間、低速振とう条件でブロットを二次抗体（ヤギで産生した抗ウサギＩｇＧ、ＮＢＰ１７５３４６、ＴＢＳＴバッファで１：５０００）とインキュベートした。洗浄工程を繰り返した。ＣｌａｒｉｔｙのＥＣＬ基質を使用し、ＣｈｅｍｉＤｏｃでブロットを現像した。
【0010】
実施例３
開裂アッセイ
我々はまずトリプシンを使用し、基質が開裂されるかどうか、またルシフェラーゼが活性かどうかを確認した。我々はセルローススラリー（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌセルロースタイプ５０を使用してバッファ中にスラリーを作製し、３３質量／体積％のスラリー組成物で反応に使用した）を使用し、トリプシン処理に続いて遠心分離及び上清の回収を行った後、基質のセルロース結合ドメインを捕捉した。発光を記録した。酵素処理を行わない基質と比較し、酵素処理した基質の場合に多くのルシフェラーゼ活性が観察された。このアッセイを独立した５回に対してそれぞれ３回実施して再現性を確実にした。このように、我々の基質は活性であることが立証された［図７］。基質の開裂を更に確認するために、我々は１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで開裂アッセイ反応（３７℃で１時間、５０μｌの０．１Ｍのトリス、ｐＨ７．４５で反応させる）も行った。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をコントロールとして使用し、開裂が非特異的であるかどうかを確認した。ゲル泳動後、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙタンパク質染色剤でゲルを染色した。我々はゲル染色後、予測した分子量の開裂バンドをはっきりとみることができた［図８］。従って、可視分析並びにルシフェラーゼアッセイの両方を用いることにより基質開裂を確認した。
更に我々は少数の他のプロテアーゼ、つまりＴＭＰＲＳＳ２［図９、１０］、フーリン［図１１、１２］及びカテプシンＢ［図１３、１４］も使用して我々のアッセイシステムを検証した。我々はこれらのプロテアーゼのインヒビターも使用しており、インヒビターを使用すると、酵素活性が確かに阻害されることを示している。試験を行う追加の各酵素に相当する典型的な結果が得られる。
開裂アッセイ
我々はまずトリプシンを使用し、基質が開裂されるかどうか、またルシフェラーゼが活性かどうかを確認した。我々はセルローススラリー（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌセルロースタイプ５０を使用してバッファ中にスラリーを作製し、３３質量／体積％のスラリー組成物で反応に使用した）を使用し、トリプシン処理に続いて遠心分離及び上清の回収を行った後、基質のセルロース結合ドメインを捕捉した。発光を記録した。酵素処理を行わない基質と比較し、酵素処理した基質の場合に多くのルシフェラーゼ活性が観察された。このアッセイを独立した５回に対してそれぞれ３回実施して再現性を確実にした。このように、我々の基質は活性であることが立証された［図７］。基質の開裂を更に確認するために、我々は１５％ＳＤＳ－ＰＡＧＥで開裂アッセイ反応（３７℃で１時間、５０μｌの０．１Ｍのトリス、ｐＨ７．４５で反応させる）も行った。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をコントロールとして使用し、開裂が非特異的であるかどうかを確認した。ゲル泳動後、Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙタンパク質染色剤でゲルを染色した。我々はゲル染色後、予測した分子量の開裂バンドをはっきりとみることができた［図８］。従って、可視分析並びにルシフェラーゼアッセイの両方を用いることにより基質開裂を確認した。
更に我々は少数の他のプロテアーゼ、つまりＴＭＰＲＳＳ２［図９、１０］、フーリン［図１１、１２］及びカテプシンＢ［図１３、１４］も使用して我々のアッセイシステムを検証した。我々はこれらのプロテアーゼのインヒビターも使用しており、インヒビターを使用すると、酵素活性が確かに阻害されることを示している。試験を行う追加の各酵素に相当する典型的な結果が得られる。
【0011】
以降、ルシフェラーゼアッセイを検討して、このアッセイシステムを高スループット形態に向上させる。
１．アッセイシステムの作用機序の概念を設計する。
２．アッセイシステムで使用する基質のための融合タンパク質コンストラクトを設計する。
３．細菌における発現のためにＤＮＡをコードする基質をコドン修飾する。
４．細菌の発現プラスミドにおける基質遺伝子のクローニング、及び基質タンパク質発現後、細菌培養物から精製を行う。
５．代表的な酵素としてトリプシン、ＴＭＰＲＳＳ２、フーリン及びカテプシンＢを使用してトリプシン／トリプシン様プロテアーゼによる基質開裂を検証する。
６．ゲルを使用した検出並びにレポーターアッセイの両方により開裂アッセイを検証する。
１．アッセイシステムの作用機序の概念を設計する。
２．アッセイシステムで使用する基質のための融合タンパク質コンストラクトを設計する。
３．細菌における発現のためにＤＮＡをコードする基質をコドン修飾する。
４．細菌の発現プラスミドにおける基質遺伝子のクローニング、及び基質タンパク質発現後、細菌培養物から精製を行う。
５．代表的な酵素としてトリプシン、ＴＭＰＲＳＳ２、フーリン及びカテプシンＢを使用してトリプシン／トリプシン様プロテアーゼによる基質開裂を検証する。
６．ゲルを使用した検出並びにレポーターアッセイの両方により開裂アッセイを検証する。
【0012】
利点
１．インビトロアッセイシステムである。
２．基質を細菌培養物から精製するため、精製が容易である。
３．基質開裂アッセイは動物又はヒトの細胞培養物を必要としない。
４．感染性ウイルスが関与しないため、アッセイシステムは安全である。
５．アッセイシステムは独立した動物細胞培養であるため、時間の消費が少ない。
６．アッセイシステムを高スループットシステムにアップグレードすることができるため、一度に多数の薬剤をスクリーニングするのに役立つ。
７．他の未知の宿主プロテアーゼが、スパイクタンパク質開裂に関与するかどうかを特定するのに使用することもできる。設計したアッセイシステムは、理解及び解釈するのが容易であり、複雑な工程は含まれない。
〔参考文献〕
１．インビトロアッセイシステムである。
２．基質を細菌培養物から精製するため、精製が容易である。
３．基質開裂アッセイは動物又はヒトの細胞培養物を必要としない。
４．感染性ウイルスが関与しないため、アッセイシステムは安全である。
５．アッセイシステムは独立した動物細胞培養であるため、時間の消費が少ない。
６．アッセイシステムを高スループットシステムにアップグレードすることができるため、一度に多数の薬剤をスクリーニングするのに役立つ。
７．他の未知の宿主プロテアーゼが、スパイクタンパク質開裂に関与するかどうかを特定するのに使用することもできる。設計したアッセイシステムは、理解及び解釈するのが容易であり、複雑な工程は含まれない。
〔参考文献〕
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【国際調査報告】