特表2024-541081 | 知財ポータル「IP Force」

知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」

▶ ネオジンセラピューティクスビー．ブイ．の特許一覧

特表2024-541081低下したＴＧＦ－ベータ受容体シグナル伝達を有する遺伝子操作されたＴ細胞

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

目に優しい文字サイズ小中大 PDF Top

< >

1
2A
2B
3
4A
4B
4C
4D
5
6

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-06

(54)【発明の名称】低下したＴＧＦ－ベータ受容体シグナル伝達を有する遺伝子操作されたＴ細胞

(51)【国際特許分類】

C12N 5/10 20060101AFI20241029BHJP

C12N 5/0783 20100101ALI20241029BHJP

C12N 15/09 20060101ALI20241029BHJP

A61K 35/17 20150101ALI20241029BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20241029BHJP

A61P 37/04 20060101ALI20241029BHJP

C12N 15/12 20060101ALN20241029BHJP

C07K 19/00 20060101ALN20241029BHJP

C07K 16/28 20060101ALN20241029BHJP

C12N 15/113 20100101ALN20241029BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N5/0783

C12N15/09 100

C12N15/09 110

A61K35/17

A61P35/00

A61P37/04

C12N15/12

C07K19/00

C07K16/28

C12N15/113 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024529251

(86)(22)【出願日】2022-11-14

(85)【翻訳文提出日】2024-07-05

(86)【国際出願番号】 EP2022081759

(87)【国際公開番号】W WO2023084073

(87)【国際公開日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】63/279,551

(32)【優先日】2021-11-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/337,091

(32)【優先日】2022-04-30

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522014792

【氏名又は名称】ネオジンセラピューティクスビー．ブイ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002000

【氏名又は名称】弁理士法人栄光事務所

(72)【発明者】

【氏名】ヴァネッサエム．タブ

(72)【発明者】

【氏名】イェルンダブリュ．ジェイ．ファンヘイスト

(72)【発明者】

【氏名】ギャビンエム．ベンドル

【テーマコード（参考）】

4B065

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB37

4C087CA04

4C087CA12

4C087MA65

4C087MA70

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

ＴＧＦＢＲ２遺伝子の遺伝子操作されたゲノム修飾を含むＴ細胞が提供される。ゲノム修飾は、受容体表面発現を低下させ、且つ／又はＴＧＦ－β誘発性シグナル伝達を低下させることができ、及びそのようなＴＧＦＢＲ２破壊を有するＴ細胞が生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下でも増殖し続け、且つ標的腫瘍細胞を死滅させ続けることを可能にする。好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲ又は外来性ＴＣＲを発現するように更に遺伝子操作される。遺伝子操作されたＴ細胞を作製する方法、そのようなＴ細胞の集団を含む医薬組成物及び治療方法も提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＴＧＦＢＲ２遺伝子の遺伝子操作されたゲノム修飾を含むＴ細胞であって、前記遺伝子操作されたゲノム修飾は、対応する対照細胞上の表面発現ＴＧＦＢＲ２のレベルの約２０％～約６０％である、表面発現ＴＧＦＢＲ２又はその検出可能な部分のレベルをもたらす、Ｔ細胞。

【請求項2】

ＣＤ８＋αβ Ｔ細胞、ＣＤ４＋αβ Ｔ細胞又はγδ Ｔ細胞である、請求項１に記載のＴ細胞。

【請求項3】

ヒトＴ細胞である、請求項１又は２に記載のＴ細胞。

【請求項4】

前記表面発現ＴＧＦＢＲ２又はその検出可能な部分は、ＴＧＦ－βに結合することができるが、ＴＧＦＢＲ１をリン酸化することができない、請求項１～３のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項5】

生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βとの前記Ｔ細胞の接触に応じて、Ｓｍａｄ２／３を通して有効にシグナル伝達することができない、請求項１～４のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項6】

前記遺伝子操作されたゲノム修飾は、（ｉ）ＴＧＦＢＲ２遺伝子プロモーターにおける挿入及び／又は欠失、（ｉｉ）前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソンにおけるフレームシフト挿入及び／又は欠失、（ｉｉｉ）前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のコード領域の全体ではなく一部の欠失、（ｉｖ）天然の終止コドンの上流のエキソン中に終止コドンを作り出す置換、挿入及び／又は欠失、並びに（ｖ）前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子内の１つ以上のドナー及び／又はアクセプター部位であるＲＮＡスプライス部位を修飾する置換、挿入及び／又は欠失の１つ以上を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項7】

前記ゲノム修飾は、前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４におけるものである、請求項１～６のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項8】

前記ゲノム修飾は、前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４（配列番号２）の塩基２９４及び２９５、３８９及び３９０、５４３及び５４４、５４７及び５４８又は６７４及び６７５間のＲＮＡガイドヌクレアーゼによる切断によって引き起こされるフレームシフトである、請求項７に記載のＴ細胞。

【請求項9】

外来性ＴＣＲ又はＣＡＲ、好ましくは外来性ＴＣＲを発現する、請求項１～８のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項10】

外来性ＴＣＲを発現する、請求項９に記載のＴ細胞。

【請求項11】

前記外来性ＴＣＲは、腫瘍抗原、好ましくは腫瘍ネオ抗原を認識する、請求項１０に記載のＴ細胞。

【請求項12】

前記腫瘍抗原は、ネオ抗原である、請求項１１に記載のＴ細胞。

【請求項13】

前記腫瘍抗原は、共通の腫瘍ネオ抗原である、請求項１２に記載のＴ細胞。

【請求項14】

前記腫瘍抗原は、非共通の腫瘍ネオ抗原である、請求項１２に記載のＴ細胞。

【請求項15】

標的細胞への少なくとも２回の曝露イベント後、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下において、前記外来性ＴＣＲ又はＣＡＲによって認識される前記抗原を発現する前記標的細胞の集団をインビトロで死滅させる能力を維持する、請求項９～１４のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項16】

生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下において、少なくとも約７２、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１４４、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０又は２８８時間にわたり、前記外来性ＴＣＲ又はＣＡＲによって認識される前記抗原を発現する標的細胞の集団をインビトロで死滅させる能力を維持する、請求項９～１５のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項17】

ＴＧＦＢＲ２遺伝子の遺伝子操作されたゲノム修飾を含むＴ細胞であって、前記修飾は、切断型である表面発現ＴＧＦＢＲ２をもたらす、Ｔ細胞。

【請求項18】

ＣＤ８＋αβ Ｔ細胞、ＣＤ４＋αβ Ｔ細胞又はγδ Ｔ細胞である、請求項１７に記載のＴ細胞。

【請求項19】

ヒトＴ細胞である、請求項１７又は１８に記載のＴ細胞。

【請求項20】

前記切断型表面露出ＴＧＦＢＲ２は、ＴＧＦ－βに結合することができるが、ＴＧＦＢＲ１をリン酸化することができない、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項21】

生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βとの前記Ｔ細胞の接触に応じて、Ｓｍａｄ２／３を通して有効にシグナル伝達することができない、請求項１７～２０のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項22】

前記遺伝子操作されたゲノム修飾は、（ｉ）前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４におけるフレームシフト挿入及び／又は欠失、（ｉｉ）任意選択で、エキソン４の全体的又は部分的な欠失と合わせた前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン５～７の欠失、並びに（ｉｉｉ）未成熟終止コドンを作り出す、エキソン４における置換、挿入及び／又は欠失の１つ以上を含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項23】

前記ゲノム修飾は、前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４（配列番号２）の塩基２９４及び２９５、３８９及び３９０、５４３及び５４４、５４７及び５４８又は６７４及び６７５間のＲＮＡガイドヌクレアーゼによる切断によって引き起こされるフレームシフトである、請求項２２に記載のＴ細胞。

【請求項24】

外来性ＴＣＲ又はＣＡＲ、好ましくは外来性ＴＣＲを発現する、請求項１７～２３のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項25】

外来性ＴＣＲを発現する、請求項２４に記載のＴ細胞。

【請求項26】

前記外来性ＴＣＲは、腫瘍抗原、好ましくは腫瘍ネオ抗原を認識する、請求項２５に記載のＴ細胞。

【請求項27】

前記腫瘍抗原は、ネオ抗原である、請求項２６に記載のＴ細胞。

【請求項28】

前記腫瘍抗原は、共通の腫瘍ネオ抗原である、請求項２７に記載のＴ細胞。

【請求項29】

前記腫瘍抗原は、非共通の腫瘍ネオ抗原である、請求項２７に記載のＴ細胞。

【請求項30】

標的細胞への少なくとも２回の曝露イベント後、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下において、前記外来性ＴＣＲ又はＣＡＲによって認識される前記抗原を発現する前記標的細胞の集団をインビトロで死滅させる能力を維持する、請求項２４～２９のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項31】

生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下において、少なくとも約７２、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１４４、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０又は２８８時間にわたり、前記外来性ＴＣＲ又はＣＡＲによって認識される前記抗原を発現する標的細胞の集団をインビトロで死滅させる能力を維持する、請求項２４～３０のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項32】

請求項１～３１のいずれか一項に記載のＴ細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項33】

静脈内注入による投与に適合されている、請求項３２に記載の医薬組成物。

【請求項34】

腫瘍内投与に適合されている、請求項３２に記載の医薬組成物。

【請求項35】

Ｔ細胞を遺伝子操作する方法であって、Ｔ細胞ゲノム中のＴＧＦＢＲ２遺伝子を修飾することを含み、遺伝子修飾後、表面発現ＴＧＦＢＲ２又はその検出可能な部分のレベルは、対応する対照細胞上の表面発現ＴＧＦＢＲ２のレベルの約２０％～約６０％である、方法。

【請求項36】

前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋αβ Ｔ細胞、ＣＤ４＋αβ Ｔ細胞又はγδ Ｔ細胞である、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

前記Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である、請求項３５又は３６に記載の方法。

【請求項38】

前記表面発現ＴＧＦＢＲ２又はその検出可能な部分は、ＴＧＦ－βに結合することができるが、ＴＧＦＢＲ１をリン酸化することができない、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記修飾は、前記Ｔ細胞が、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βとの前記Ｔ細胞の接触に応じて、Ｓｍａｄ２／３を通して有効にシグナル伝達することを妨げる、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記修飾は、（ｉ）ＴＧＦＢＲ２遺伝子プロモーターにおける挿入及び／又は欠失、（ｉｉ）前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソンにおけるフレームシフト挿入及び／又は欠失、（ｉｉｉ）前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のコード領域の全体ではなく一部の欠失、（ｉｖ）天然の終止コドンの上流のエキソン中に終止コドンを作り出す置換、挿入及び／又は欠失、並びに（ｖ）前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子内の１つ以上のドナー及び／又はアクセプターＲＮＡスプライス部位を修飾する置換、挿入及び／又は欠失の１つ以上である、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記修飾は、前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４におけるものである、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

修飾することは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのＲＮＡガイドを前記Ｔ細胞に導入することを含む、請求項３５～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４（配列番号２）の塩基２９４及び２９５、３８９及び３９０、５４３及び５４４、５４７及び５４８又は６７４及び６７５間を切断する、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記少なくとも１つのガイドＲＮＡの少なくとも１つは、配列番号８～１２の配列を有する、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

前記所望のゲノム修飾を有するＴ細胞を選択する後続のステップを更に含む、請求項３５～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子を修飾する前又は後に、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲ、好ましくは外来性ＴＣＲを発現するように前記Ｔ細胞を遺伝子操作するステップを更に含む、請求項３５～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記Ｔ細胞は、外来性ＴＣＲを発現するように遺伝子操作される、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

前記外来性ＴＣＲは、腫瘍抗原、好ましくは腫瘍ネオ抗原を認識する、請求項４７に記載の方法。

【請求項49】

前記腫瘍抗原は、ネオ抗原である、請求項４８に記載の方法。

【請求項50】

前記腫瘍抗原は、共通の腫瘍ネオ抗原である、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

前記腫瘍抗原は、非共通の腫瘍ネオ抗原である、請求項４９に記載の方法。

【請求項52】

前記Ｔ細胞は、標的細胞への少なくとも２回の曝露イベント後、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下において、前記外来性ＴＣＲ又はＣＡＲによって認識される前記抗原を発現する前記標的細胞の集団をインビトロで死滅させる能力を維持する、請求項３５～５１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下において、少なくとも約７２、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１４４、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０又は２８８時間にわたり、前記外来性ＴＣＲ又はＣＡＲによって認識される前記抗原を発現する標的細胞の集団をインビトロで死滅させる能力を維持する、請求項３５～５２のいずれか一項に記載のＴ細胞。

【請求項54】

Ｔ細胞を遺伝子操作する方法であって、Ｔ細胞ゲノム中のＴＧＦＢＲ２遺伝子を修飾することを含み、前記修飾は、エキソン４内のものであり、且つ切断型である表面発現ＴＧＦＢＲ２をもたらす、方法。

【請求項55】

前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋αβ Ｔ細胞、ＣＤ４＋αβ Ｔ細胞又はγδ Ｔ細胞である、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である、請求項５４又は５５に記載の方法。

【請求項57】

前記表面発現ＴＧＦＢＲ２又はその検出可能な部分は、ＴＧＦ－βに結合することができるが、ＴＧＦＢＲ１をリン酸化することができない、請求項５４～５６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項58】

前記修飾は、前記Ｔ細胞が、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βとの前記Ｔ細胞の接触に応じて、Ｓｍａｄ２／３を通して有効にシグナル伝達することを妨げる、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項59】

前記切断型表面発現ＴＧＦＢＲ２は、無修飾Ｔ細胞に存在するＴＧＦＢＲ２の量以上のレベルで存在する、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項60】

前記切断型表面発現ＴＧＦＢＲ２は、無修飾Ｔ細胞に存在するＴＧＦＢＲ２のレベルの約２０％～６０％のレベルで存在する、請求項５４～５８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項61】

前記遺伝子操作されたゲノム修飾は、（ｉ）前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４におけるフレームシフト挿入及び／又は欠失、（ｉｉ）任意選択で、エキソン４の全体的又は部分的な欠失と合わせた前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン５～７の欠失、並びに（ｉｉｉ）未成熟終止コドンを作り出す、エキソン４における置換、挿入及び／又は欠失の１つ以上を含む、請求項５４～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

修飾することは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのガイドＲＮＡを前記Ｔ細胞に導入することを含む、請求項５４～６１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４（配列番号２）の塩基２９４及び２９５、３８９及び３９０、５４３及び５４４、５４７及び５４８又は６７４及び６７５間を切断する、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

前記少なくとも１つのガイドＲＮＡの少なくとも１つは、配列番号８～１２の配列を有する、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

前記所望のゲノム修飾を有するＴ細胞を選択する後続のステップを更に含む、請求項５４～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記ＴＧＦＢＲ２遺伝子を修飾する前又は後に、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲ、好ましくは外来性ＴＣＲを発現するように前記Ｔ細胞を遺伝子操作するステップを更に含む、請求項５４～６５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記Ｔ細胞は、外来性ＴＣＲを発現するように遺伝子操作される、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

前記外来性ＴＣＲは、腫瘍抗原、好ましくは腫瘍ネオ抗原を認識する、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

前記腫瘍抗原は、ネオ抗原である、請求項６８に記載の方法。

【請求項70】

前記腫瘍抗原は、共通の腫瘍ネオ抗原である、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記腫瘍抗原は、非共通の腫瘍ネオ抗原である、請求項６９に記載の方法。

【請求項72】

前記Ｔ細胞は、標的細胞への少なくとも２回の曝露イベント後、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下において、前記外来性ＴＣＲ又はＣＡＲによって認識される前記抗原を発現する前記標的細胞の集団をインビトロで死滅させる能力を維持する、請求項５４～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

前記Ｔ細胞は、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下において、少なくとも約７２、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１４４、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０又は２８８時間にわたり、前記外来性ＴＣＲ又はＣＡＲによって認識される前記抗原を発現する標的細胞の集団をインビトロで死滅させる能力を維持する、請求項３５～５２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

請求項３５～７３のいずれか一項に記載の方法によって産生される遺伝子操作されたＴ細胞。

【請求項75】

請求項７４に記載の遺伝子操作されたＴ細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項76】

患者を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１～３１のいずれか一項に記載の遺伝子操作されたＴ細胞又は請求項３２若しくは７５に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む方法。

【請求項77】

前記外来性ＴＣＲ又はＣＡＲは、部位特異的な統合を使用して前記Ｔ細胞に遺伝子操作されている、請求項９～１６若しくは２４～３１のいずれか一項に記載のＴ細胞又は請求項７４に記載の遺伝子操作されたＴ細胞。

【請求項78】

部位特異的な統合は、ＣＲＩＳＰＲ、任意選択でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９で行われる、請求項７７に記載のＴ細胞又は遺伝子操作されたＴ細胞。

【請求項79】

前記外来性ＴＣＲ又はＣＡＲは、前記Ｔ細胞又は遺伝子操作されたＴ細胞のゲノム中の定められた場所に統合される、請求項９～１６若しくは２４～３１のいずれか一項に記載のＴ細胞又は請求項７４に記載の遺伝子操作されたＴ細胞。

【請求項80】

請求項７７～７９のいずれか一項に記載のＴ細胞又は遺伝子操作されたＴ細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項81】

静脈内注入による投与に適合されている、請求項８０に記載の医薬組成物。

【請求項82】

腫瘍内投与に適合されている、請求項８０に記載の医薬組成物。

【請求項83】

前記外来性ＴＣＲ又はＣＡＲは、前記Ｔ細胞のゲノム中の定められた場所に統合される、請求項４６～５３又は６６～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記統合は、ＣＲＩＳＰＲ、任意選択でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して行われる、請求項８３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

キメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）の発現又は外来性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現のいずれかを通して、腫瘍細胞上に発現される抗原を認識するようにリダイレクトされたヒトＴ細胞は、特定の血液癌を治療するのに有効であることが証明された。しかしながら、これまで、ＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔアプローチは、免疫抑制性の腫瘍微小環境の存在が一因で固形腫瘍に対してより乏しい有効性を示した。固形癌の抑制性の腫瘍微小環境を克服することが可能である改善されたＣＡＲ－Ｔ及びＴＣＲ－Ｔ細胞アプローチが必要とされている。

【0002】

トランスフォーミング増殖因子ベータ（「ＴＧＦ－β」）は、進行した転移性の固形癌など、いくつかの固形癌の腫瘍微小環境内に見出される免疫抑制性サイトカインである。状況により、ＴＧＦ－βは、抗腫瘍免疫応答を制限し得る。ＴＧＦ－βの影響について考えられる１つのメカニズムは、Ｔ細胞の細胞傷害性、増殖及びサイトカイン産生を含むＴ細胞の機能の抑制である。本発明を限定することなく、現在、ＴＧＦ－βは、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体２（「ＴＧＦＢＲ２」）の細胞外ドメインに結合し、ＴＧＦＢＲ１とＴＧＦＢＲ２との二量体化を促進すると考えられている。受容体二量体化後、ＴＧＦＢＲ２キナーゼドメインは、ＴＧＦＢＲ１をトランスリン酸化し、ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３の下流のリン酸化並びにＴＧＦ－β応答遺伝子の後続の発現をもたらす。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0003】

本発明者らは、ここで、ＴＧＦＢＲ２遺伝子の標的破壊が受容体表面発現を低下させ、且つ／又はＴＧＦ－β誘発性シグナル伝達を低下させることができ、及びそのようなＴＧＦＢＲ２破壊を有するＴＣＲ－Ｔ細胞が生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下でも増殖し続け、且つ標的腫瘍細胞を死滅させ続けることを可能にすることを発見した。

【0004】

したがって、第１の態様では、本開示は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子の遺伝子操作されたゲノム修飾を含むＴ細胞であって、遺伝子操作されたゲノム修飾は、対応する対照細胞上の表面発現ＴＧＦＢＲ２のレベルの約２０％～約６０％である、表面発現ＴＧＦＢＲ２又はその検出可能な部分のレベルをもたらす、Ｔ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４におけるものである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲ、好ましくは外来性ＴＣＲを発現する。

【0005】

別の態様では、ＴＧＦＢＲ２遺伝子の遺伝子操作されたゲノム修飾を含むＴ細胞であって、修飾は、切断型である表面発現ＴＧＦＢＲ２をもたらす、Ｔ細胞が提示される。いくつかの実施形態では、ゲノム修飾は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４におけるものである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲ、好ましくは外来性ＴＣＲを発現する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ又はＣＡＲは、Ｔ細胞のゲノム中の定めされた場所に統合される。特定の実施形態では、統合は、ＣＲＩＳＰＲ、任意選択でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を使用して行われる。

【0006】

別の態様では、そのような遺伝子操作されたＴ細胞を作製する方法が提供される。別の態様では、そのような遺伝子操作されたＴ細胞を含む医薬組成物が提供される。更なる態様では、患者を治療する方法であって、治療有効量の、遺伝子操作されたＴ細胞又はそのような遺伝子操作されたＴ細胞を含む医薬組成物を患者に投与することを含む方法が提供される。

【0007】

本発明のこれら及び他の特徴、態様及び利点は、以下の説明及び添付の図面を考慮することでよりよく理解されるようになる。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】ヒトＴＧＦ－β受容体２遺伝子（「ＴＧＦＢＲ２」）のエキソン構造を表す概略図を提供する。ヒトＴＧＦＢＲ２遺伝子は、Ｎ末端からＣ末端に、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及びキナーゼドメインをコードする７つのエキソンを含む。ＲＮＡガイドヌクレアーゼをそれぞれエキソン１（ＴＧＦＢＲ２ｇＲＮＡ１～ｇＲＮＡ７）及びエキソン４（ＴＧＦＢＲ２ｇＲＮＡ１５～ｇＲＮＡ２２）に向けるために使用したガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）に対する結合部位を示す。ｇＲＮＡ標的配列を表２に提示する。

【図2A】ＴＧＦＢＲ２遺伝子を破壊するＲＮＡガイドヌクレアーゼ編集により、Ｔ細胞が、ＴＧＦ－βによって誘発されるホスホＳｍａｄ２／３アップレギュレーションに抵抗するようになることを示すデータを提示する。健康なドナーヒトＴ細胞を、１Ｇ４ＴＣＲを発現するように遺伝子操作し、次いで種々のＴＧＦＢＲ２ｇＲＮＡＲＮＰ複合体によりエレクトロポレーションした。１Ｇ４ＴＣＲ発現ＴＧＦＢＲ２編集Ｔ細胞を次いで３０分間、二通り、ＴＧＦ－β（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で培養し、次いでリン酸化されたＳｍａｄ２／３タンパク質を検出する抗体により細胞内を染色した。図２Ａは、ＴＧＦ－βあり（灰色）又はなし（黒色）での処理後のホスホＳｍａｄ２／３発現を表すフローサイトメトリーヒストグラムを提示する。ピークサイズは、曲線ごとに最頻値に対して標準化した。

【図2B】ＴＧＦＢＲ２遺伝子を破壊するＲＮＡガイドヌクレアーゼ編集により、Ｔ細胞が、ＴＧＦ－βによって誘発されるホスホＳｍａｄ２／３アップレギュレーションに抵抗するようになることを示すデータを提示する。健康なドナーヒトＴ細胞を、１Ｇ４ＴＣＲを発現するように遺伝子操作し、次いで種々のＴＧＦＢＲ２ｇＲＮＡＲＮＰ複合体によりエレクトロポレーションした。１Ｇ４ＴＣＲ発現ＴＧＦＢＲ２編集Ｔ細胞を次いで３０分間、二通り、ＴＧＦ－β（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下で培養し、次いでリン酸化されたＳｍａｄ２／３タンパク質を検出する抗体により細胞内を染色した。図２Ｂは、ＴＧＦ－β処理に応じたホスホＳｍａｄ２／３蛍光強度中央値（「ＭＦＩ」）における変化倍数をまとめたものである。エラーバーは、二通りの標準偏差を示す。

【図3】ＲＮＡガイドヌクレアーゼ編集によってＴ細胞におけるＴＧＦＢＲ２遺伝子を破壊することがＴＧＦＢＲ２表面発現の低下をもたらすことを示すデータを提示する。健康なドナーヒトＴ細胞を、１Ｇ４ＴＣＲを発現するように遺伝子操作し、次いでＴＧＦＢＲ２の細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）（ｇＲＮＡ１及び４～７）又は細胞内キナーゼドメイン（「ＩＣＤ」）（ｇＲＮＡ１５～１７、２０及び２２）を標的にする種々の臨床グレードＴＧＦＢＲ２ｇＲＮＡＲＮＰ複合体をエレクトロポレーションした。編集の４日後、ＴＧＦＢＲ２表面発現を抗ＴＧＦＢＲ２抗体による表面染色によって解析した。ＴＧＦＢＲ２発現は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子編集なしで１Ｇ４ＴＣＲを発現するように遺伝子操作したＴ細胞におけるＴＧＦＢＲ２蛍光強度中央値に対して標準化する。エラーバーは、二通りの標準偏差を示す。

【図4A】ＴＧＦＢＲ２遺伝子におけるヌクレアーゼ媒介性の破壊を有するＴ細胞がＴＧＦ－βの存在下で反復腫瘍細胞チャレンジ後に優れた細胞傷害機能を有することを示すデータを提示する。１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞（対照）及びＴＧＦＢＲ２遺伝子に対する種々の編集された破壊を有する１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅプラットフォームを使用する反復細胞傷害性アッセイにかけた。Ｔ細胞は、回収して、合計４回にわたって新しいＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞と再培養する前に、約７２時間にわたり外来性ＴＧＦ－β（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下において５：１のエフェクター対標的の比でＡ３７５－ＧＦＰ^＋標的細胞と培養した。Ａ３７５－ＧＦＰ^＋細胞死滅は、２時間毎に１０×対物レンズを使用して画像化し、培養物中に残っているＧＦＰ^＋細胞をカウントすることによって定量化した。図４Ａは、Ａ３７５－ＧＦＰ^＋標的細胞を、外来性１Ｇ４ＴＣＲを欠き、且つＴＧＦＢＲ２遺伝子に対するいかなる編集もないＴ細胞（「非編集」）、ＴＧＦＢＲ２遺伝子に対する編集を欠いている１Ｇ４発現Ｔ細胞（「１Ｇ４ＴＣＲのみ」）及びＴ細胞なし（「Ｔ細胞なし」）の存在下において、ＴＧＦ－βあり又はなしで培養したときのＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞数を示す。

【図4B】ＴＧＦＢＲ２遺伝子におけるヌクレアーゼ媒介性の破壊を有するＴ細胞がＴＧＦ－βの存在下で反復腫瘍細胞チャレンジ後に優れた細胞傷害機能を有することを示すデータを提示する。１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞（対照）及びＴＧＦＢＲ２遺伝子に対する種々の編集された破壊を有する１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅプラットフォームを使用する反復細胞傷害性アッセイにかけた。Ｔ細胞は、回収して、合計４回にわたって新しいＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞と再培養する前に、約７２時間にわたり外来性ＴＧＦ－β（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下において５：１のエフェクター対標的の比でＡ３７５－ＧＦＰ^＋標的細胞と培養した。Ａ３７５－ＧＦＰ^＋細胞死滅は、２時間毎に１０×対物レンズを使用して画像化し、培養物中に残っているＧＦＰ^＋細胞をカウントすることによって定量化した。図４Ｂは、Ａ３７５－ＧＦＰ^＋標的細胞を、外来性１Ｇ４ＴＣＲを発現し、且つＴＧＦＢＲ２遺伝子がエキソン１ターゲティングｇＲＮＡ（ＴＧＦＢＲ２－１～ＴＧＦＢＲ２－７）を使用して破壊されたＴ細胞の存在下において、ＴＧＦ－βあり又はなしで培養したときのＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞数を示す。

【図4C】ＴＧＦＢＲ２遺伝子におけるヌクレアーゼ媒介性の破壊を有するＴ細胞がＴＧＦ－βの存在下で反復腫瘍細胞チャレンジ後に優れた細胞傷害機能を有することを示すデータを提示する。１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞（対照）及びＴＧＦＢＲ２遺伝子に対する種々の編集された破壊を有する１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅプラットフォームを使用する反復細胞傷害性アッセイにかけた。Ｔ細胞は、回収して、合計４回にわたって新しいＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞と再培養する前に、約７２時間にわたり外来性ＴＧＦ－β（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下において５：１のエフェクター対標的の比でＡ３７５－ＧＦＰ^＋標的細胞と培養した。Ａ３７５－ＧＦＰ^＋細胞死滅は、２時間毎に１０×対物レンズを使用して画像化し、培養物中に残っているＧＦＰ^＋細胞をカウントすることによって定量化した。図４Ｃは、Ａ３７５－ＧＦＰ^＋標的細胞を、外来性１Ｇ４ＴＣＲを発現し、且つＴＧＦＢＲ２遺伝子がエキソン４ターゲティングｇＲＮＡ（ＴＧＦＢＲ２－１５、ＴＧＦＢＲ２－１６、ＴＧＦＢＲ２－１７、ＴＧＦＢＲ２－２０、ＴＧＦＢＲ２－２２）を使用して破壊されたＴ細胞の存在下において、ＴＧＦ－βあり又はなしで培養したときのＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞数を示す。エラーバーは、三通りの標準偏差を示す。

【図4D】ＴＧＦＢＲ２遺伝子におけるヌクレアーゼ媒介性の破壊を有するＴ細胞がＴＧＦ－βの存在下で反復腫瘍細胞チャレンジ後に優れた細胞傷害機能を有することを示すデータを提示する。１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞（対照）及びＴＧＦＢＲ２遺伝子に対する種々の編集された破壊を有する１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅプラットフォームを使用する反復細胞傷害性アッセイにかけた。Ｔ細胞は、回収して、合計４回にわたって新しいＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞と再培養する前に、約７２時間にわたり外来性ＴＧＦ－β（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下において５：１のエフェクター対標的の比でＡ３７５－ＧＦＰ^＋標的細胞と培養した。Ａ３７５－ＧＦＰ^＋細胞死滅は、２時間毎に１０×対物レンズを使用して画像化し、培養物中に残っているＧＦＰ^＋細胞をカウントすることによって定量化した。図４Ｄは、４回のチャレンジ後のＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞数を集計するヒストグラムである。エラーバーは、三通りの標準偏差を示す。

【図5】ＴＧＦＢＲ２遺伝子にヌクレアーゼ媒介性の破壊を有するＴ細胞がＴＧＦ－βの存在下でその増殖能を維持することを実証するデータを提示する。ＴＧＦＢＲ２破壊１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞を、外来性ＴＧＦ－β（２０ｎｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（１０μＬ／ｍＬ）を使用する反復再刺激にかけた。Ｔ細胞増殖を、毎週、Ｔ細胞をカウントすることによって定量化した。エラーバーは、二通りの標準偏差を示す。

【図6】ＴＧＦＢＲ２遺伝子のヌクレアーゼ媒介性の破壊が外来性ＴＣＲの発現を改変しないことを実証するデータを提示する。細胞を、内在性ＴＣＲ（「ｈｕＴＣＲ」）又はｍｕｒ６エピトープ（「ｍｕｒ６」）によりマークした外来性ＴＣＲを検出する抗体により染色した。ノックインＴＣＲのＦＡＣＳプロットは、エレクトロポレーション後の７日間並びにエレクトロポレーション及びＴＣＲ修復テンプレートを含有する細胞の選択後の１４日間、３つの異なる破壊部位間で同様であった。

【発明を実施するための形態】

【0009】

４．１．定義
「対応する対照細胞」は、科学的に妥当な比較を行うために科学的に許容され且つ実際に使用できるほど修飾細胞と厳密に同一である細胞である。比較の対象であるゲノム修飾以外は、適切な対照細胞は、同じ細胞型、同じ増殖条件及び／又は同じ他の修飾を有していなければならない。当業者は、どのような変数、パラメーター及び条件が、ゲノム修飾に起因するあらゆる差（例えば、表面発現のレベルにおける変化）を決定するために、あらゆる与えられた状況で関係があるのかを理解する。本出願の内容は、特定の状況における適切な対照細胞の例を提供する。

【0010】

４．２．ＴＧＦＢＲ２遺伝子の遺伝子操作されたゲノム修飾を含むＴ細胞
第１の態様では、ＴＧＦＢＲ２遺伝子の遺伝子操作されたゲノム修飾を含むＴ細胞が提供される。遺伝子操作されたゲノム修飾は、対応する対照細胞上の表面発現ＴＧＦＢＲ２のレベルの約２０％～約６０％である、表面発現ＴＧＦＢＲ２又はその検出可能な部分のレベルをもたらす。

【0011】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたゲノム修飾は、対応する対照細胞上の表面発現ＴＧＦＢＲ２のレベルの約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％又は６０％である、表面発現ＴＧＦＢＲ２又はその検出可能な部分のレベルをもたらす。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたゲノム修飾は、対応する対照細胞上の表面発現ＴＧＦＢＲ２のレベルの約２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％又は６０％以下である、表面発現ＴＧＦＢＲ２又はその検出可能な部分のレベルをもたらす。

【0012】

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋αβ Ｔ細胞、ＣＤ４＋αβ Ｔ細胞又はγδ Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ヒトＴ細胞である。いくつかのヒトＴ細胞の実施形態では、Ｔ細胞は、癌患者から得られる。いくつかのヒトＴ細胞の実施形態では、Ｔ細胞は、健康な対象から得られる。いくつかのヒトＴ細胞の実施形態では、Ｔ細胞は、癌患者から得られる又は健康な対象から得られるＴ細胞の子孫細胞である。

【0013】

いくつかの実施形態では、表面発現ＴＧＦＢＲ２又はその検出可能な部分は、ＴＧＦ－βに結合することが可能であるが、ＴＧＦＢＲ１をリン酸化することができない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βとのＴ細胞の接触に応じて、Ｓｍａｄ２／３を通して有効にシグナル伝達することができない。

【0014】

種々の実施形態では、遺伝子操作されたゲノム修飾は、（ｉ）ＴＧＦＢＲ２遺伝子プロモーターにおける挿入及び／又は欠失、（ｉｉ）ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソンにおけるフレームシフト挿入及び／又は欠失、（ｉｉｉ）ＴＧＦＢＲ２遺伝子のコード領域の全体ではなく一部の欠失、（ｉｖ）天然の終止コドンの上流のエキソン中に終止コドンを作り出す置換、挿入及び／又は欠失、並びに（ｖ）ＴＧＦＢＲ２遺伝子内の１つ以上のドナー及び／又はアクセプターＲＮＡスプライス部位を修飾する置換、挿入及び／又は欠失の１つ以上を含む。

【0015】

特定の実施形態では、ゲノム修飾は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン１、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン２、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン３、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン５、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン６又はＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン７におけるものである。特定の実施形態では、ゲノム修飾は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４におけるものである。

【0016】

種々の実施形態では、ゲノム修飾は、ＲＮＡガイドヌクレアーゼによって遂行される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、二本鎖切断誘発ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、一本鎖切断誘発ヌクレアーゼ（ニッカーゼ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、第２の酵素に融合される。特定の実施形態では、第２の酵素は、逆転写酵素である。

【0017】

特定の実施形態では、ゲノム修飾は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４（配列番号２）の塩基２９４及び２９５、３８９及び３９０、５４３及び５４４、５４７及び５４８又は６７４及び６７５間のＲＮＡガイドヌクレアーゼによる切断によって引き起こされるフレームシフトである。

【0018】

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲを発現する。特定の実施形態では、ＴＣＲは、ウイルスによる方法を使用してＴ細胞に導入される。特定の実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞のゲノム中の特異的な部位に外来性ＴＣＲを発現するための遺伝子を統合する方法（例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又は他のＣＲＩＳＰＲ酵素）を使用してＴ細胞に導入される。

【0019】

特定の好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、外来性ＴＣＲを発現する。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、その内在性ＴＣＲを発現し続ける。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、その内在性ＴＣＲを発現しない。

【0020】

特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＡＲを発現する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、第一世代ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、第二世代ＣＡＲである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、米国特許第１０，７０３，７９４号明細書に記載されるものに類似するＣＡＲであり、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、国際公開第２０２１／０５８５６３号パンフレットに記載されるＮＫＧ２ＤベースのＣＡＲであり、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0021】

いくつかの実施形態では、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲは、腫瘍抗原を認識する。当業者によって理解されるように、ＴＣＲによって認識される「抗原」は、ペプチド－ＨＬＡ複合体（ｐＨＬＡ）である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、非腫瘍細胞によっても発現される腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、癌／精巣抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ネオ抗原である。特定の実施形態では、ネオ抗原は、共通の、すなわち広く知られている腫瘍ネオ抗原である。特定の実施形態では、ネオ抗原は、非共通の、すなわち個々のネオ抗原である。

【0022】

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、標的細胞への少なくとも２回の曝露イベント後、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下において、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲによって認識される抗原を発現する標的細胞の集団をインビトロで死滅させる能力を維持する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下において、少なくとも約７２、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１４４、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０又は２８８時間にわたり、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲによって認識される抗原を発現する標的細胞の集団をインビトロで死滅させる能力を維持する。

【0023】

別の態様では、ＴＧＦＢＲ２遺伝子の遺伝子操作されたゲノム修飾を含むＴ細胞が提供される。修飾は、切断型である表面発現ＴＧＦＢＲ２をもたらす。

【0024】

【0025】

いくつかの実施形態では、表面発現切断型ＴＧＦＢＲ２は、ＴＧＦ－βに結合することが可能であるが、ＴＧＦＢＲ１をリン酸化することができない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βとのＴ細胞の接触に応じて、Ｓｍａｄ２／３を通して有効にシグナル伝達することができない。

【0026】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたゲノム修飾は、（ｉ）ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４におけるフレームシフト挿入及び／又は欠失、（ｉｉ）任意選択で、エキソン４の全体的又は部分的な欠失と合わせたＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン５～７の欠失、並びに（ｉｉｉ）未成熟終止コドンを作り出す、エキソン４における置換、挿入及び／又は欠失の１つ以上を含む。

【0027】

【0028】

【0029】

【0030】

【0031】

【0032】

【0033】

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、腫瘍抗原を認識する外来性ＴＣＲ又はＣＡＲを発現する。当業者によって理解されるように、ＴＣＲによって認識される「抗原」は、ペプチド－ＨＬＡ複合体（ｐＨＬＡ）である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、非腫瘍細胞によっても発現される腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、癌／精巣抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ネオ抗原である。特定の実施形態では、ネオ抗原は、共通の、すなわち広く知られている腫瘍ネオ抗原である。特定の実施形態では、ネオ抗原は、非共通の、すなわち個々のネオ抗原である。

【0034】

【0035】

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞によって発現されるＴＣＲによって認識される抗原を提示する腫瘍又は他の細胞株への接触又は曝露後、増強されたサイトカイン応答を有する。特定の実施形態では、サイトカインは、インターフェロン－γ、インターロイキン－２又は腫瘍壊死因子－αである。

【0036】

４．３．医薬組成物
別の態様では、本明細書に記載されるＴ細胞及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。好ましい実施形態では、Ｔ細胞は、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲを発現する。

【0037】

種々の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるＴ細胞の集団を含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲを発現する。特定の実施形態では、集団におけるＴ細胞のすべては、同じ外来性ＴＣＲを発現する。特定の実施形態では、集団におけるＴ細胞のすべては、同じＣＡＲを発現する。特定の実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載されるＴ細胞を含み、集団におけるＴ細胞は、複数のＣＡＲを集団で発現する。

【0038】

いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内注入による投与に適合されている。いくつかの実施形態では、組成物は、腫瘍内投与に適合されている。

【0039】

４．４．Ｔ細胞を遺伝子操作する方法
別の態様では、本明細書に記載されるＴＧＦＢＲ２修飾Ｔ細胞を作製する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、Ｔ細胞ゲノム中のＴＧＦＢＲ２遺伝子を修飾することを含み、遺伝子修飾後、表面発現ＴＧＦＢＲ２又はその検出可能な部分のレベルは、対応する対照細胞上の表面発現ＴＧＦＢＲ２のレベルの約２０％～約６０％である。

【0040】

【0041】

【0042】

【0043】

いくつかの実施形態では、修飾は、（ｉ）ＴＧＦＢＲ２遺伝子プロモーターにおける挿入及び／又は欠失、（ｉｉ）ＴＧＦ－βＩＩＲ遺伝子のエキソンにおけるフレームシフト挿入及び／又は欠失、（ｉｉｉ）ＴＧＦＢＲ２遺伝子のコード領域の全体ではなく一部の欠失、（ｉｖ）天然の終止コドンの上流のエキソン中に終止コドンを作り出す置換、挿入及び／又は欠失、並びに（ｖ）ＴＧＦＢＲ２遺伝子内の１つ以上のドナー及び／又はアクセプターＲＮＡスプライス部位を修飾する置換、挿入及び／又は欠失の１つ以上である。特定の実施形態では、修飾は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４におけるものである。

【0044】

いくつかの実施形態では、修飾することは、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ及び少なくとも１つのＲＮＡガイドをＴ細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、二本鎖切断誘発ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、一本鎖切断誘発ヌクレアーゼ（ニッカーゼ）である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、第２の酵素に融合される。特定の実施形態では、第２の酵素は、逆転写酵素である。

【0045】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、ＴＧＦＢＲ２遺伝子のエキソン４（配列番号２）の塩基２９４及び２９５、３８９及び３９０、５４３及び５４４、５４７及び５４８又は６７４及び６７５間を切断する。特定の実施形態では、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、配列番号８～１２の配列を有する。

【0046】

いくつかの実施形態では、方法は、所望のゲノム修飾を有するＴ細胞を選択する後続のステップを更に含む。

【0047】

いくつかの実施形態では、方法は、ＴＧＦＢＲ２遺伝子を修飾する前又は後に、ＣＡＲ又は外来性ＴＣＲを発現するようにＴ細胞を遺伝子操作するステップを更に含む。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、外来性ＴＣＲを発現するように遺伝子操作される。特定の実施形態では、ＴＣＲは、ウイルスによる方法を使用してＴ細胞に導入される。特定の実施形態では、ＴＣＲは、Ｔ細胞のゲノム中の特異的な部位に外来性ＴＣＲを発現するための遺伝子を統合する方法（例えばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又は他のＣＲＩＳＰＲ酵素）を使用してＴ細胞に導入される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、その内在性ＴＣＲを並行して発現する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、その内在性ＴＣＲを発現しないように、更に遺伝子操作されている。

【0048】

いくつかの実施形態では、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲは、腫瘍抗原を認識する。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、非腫瘍細胞によっても発現される腫瘍関連抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、癌／精巣抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、ネオ抗原である。特定の実施形態では、ネオ抗原は、共通の、すなわち広く知られている腫瘍ネオ抗原である。特定の実施形態では、ネオ抗原は、非共通の、すなわち個々のネオ抗原である。

【0049】

種々の実施形態では、ＴＧＦＢＲ２遺伝子の修飾及び更にＣＡＲ又は外来性ＴＣＲを発現するようにＴ細胞を遺伝子操作した後、Ｔ細胞は、標的細胞への少なくとも２回の曝露イベント後、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下において、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲによって認識される抗原を発現する標的細胞の集団をインビトロで死滅させる能力を維持する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、生理学的に適切なレベルのＴＧＦ－βの存在下において、少なくとも約７２、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１４４、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０又は２８８時間にわたり、外来性ＴＣＲ又はＣＡＲによって認識される抗原を発現する標的細胞の集団をインビトロで死滅させる能力を維持する。

【0050】

別の態様では、本明細書に記載されるＴＧＦＢＲ２修飾Ｔ細胞を作製する方法であって、修飾は、エキソン４内のものであり、且つ切断型である表面発現ＴＧＦＢＲ２をもたらす、方法が提供される。

【0051】

【0052】

【0053】

いくつかの実施形態では、切断型表面発現ＴＧＦＢＲ２は、無修飾Ｔ細胞に存在するＴＧＦＢＲ２の量以上のレベルで存在する。いくつかの実施形態では、切断型表面発現ＴＧＦＢＲ２は、無修飾Ｔ細胞に存在するＴＧＦＢＲ２のレベルの約２０％～６０％のレベルで存在する。

【0054】

【0055】

【0056】

【0057】

いくつかの実施形態では、方法は、所望のゲノム修飾を有するＴ細胞を選択する後続のステップを更に含む。

【0058】

【0059】

【0060】

【0061】

別の態様では、本明細書に記載される方法によって産生される遺伝子操作されたＴ細胞が提供される。

【0062】

４．５．疾患を治療する方法
別の態様では、方法は、治療を必要とする対象を治療するために提供される。典型的な実施形態では、対象は、ヒト患者である。方法は、治療有効量の本明細書に記載される遺伝子操作されたＴ細胞又は本明細書に記載される、そのような遺伝子操作されたＴ細胞を含む医薬組成物を対象、典型的にヒト患者に投与することを含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、治療されることになっている患者から得られるＴ細胞から又は患者から得られるＴ細胞の子孫から遺伝子操作される（自家治療）。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、治療されることになっている患者以外の１人以上の個人から得られるＴ細胞から又はその１人以上の個人から得られるＴ細胞の子孫から遺伝子操作される（同種異系治療）。

【0064】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、静脈内注入によって投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、腫瘍内投与によって投与される。

【0065】

いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞によって発現されるＴＣＲによって認識される抗原を提示する腫瘍又は他の細胞株への接触又は曝露後、増強されたサイトカイン応答を有する。特定の実施形態では、サイトカインは、インターフェロン－γ又は腫瘍壊死因子－αである。

【実施例】

【0066】

４．６．１．実施例１：ＴＧＦＢＲ２破壊ＴＣＲ発現Ｔ細胞はＴＧＦ－βシグナル伝達に抵抗する
本実施例は、外来性ＴＣＲを発現するように更に遺伝子操作されるＴ細胞でＴＧＦＢＲ２遺伝子を破壊することにより、ＴＧＦＢＲ２の表面発現を低下させ、Ｔ細胞がＴＧＦ－βシグナル伝達に抵抗するようになることを示す。

【0067】

ヒトＴＧＦＢＲ２エキソン１（ＴＧＦＢＲ２の細胞外ドメイン）又はエキソン４（ＴＧＦＢＲ２のキナーゼドメイン）における種々の部位に遺伝子編集ヌクレアーゼを向けるｇＲＮＡを合成した。図１は、各ｇＲＮＡによって誘導されるヌクレアーゼ切断部位の位置を示す概略図である。エキソン１及び４の配列を下記の表１に提示する。エキソン配列は、ＥｎｓｅｍｂｌｃａｎｏｎｉｃａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔＥＮＳＴ０００００２９５７５４．１０から抽出する。ｇＲＮＡの標的配列を下記の表２に提示するが、ＴＧＦＢＲ２ｇＲＮＡ標的配列は、（５’－３’）で示し、予測される切断部位は（｜）、ＰＡＭ部位は太字で表す。表２は、標的がＴＧＦＢＲ２遺伝子のセンス（＋）鎖又はアンチセンス（－）鎖上にあるかどうかを更に指定する。

【0068】

【表1】

【0069】

【表2】

【0070】

健康なドナーヒトＴ細胞を、Ｌｏｎｚａ４Ｄｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置、プログラムＥＨ－１１５を使用して１μＭＴＧＦＢＲ２ターゲティングＲＮＰ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｇＲＮＡリボ核タンパク質）をエレクトロポレーションする前に、４８時間、３：１の比（ビーズ：ＣＤ３^＋細胞）で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃４０２０３Ｄにより活性化した。同時に、内在性ＴＣＲをノックアウトし、外来性ＴＣＲ（１Ｇ４）の発現を誘発した。５％ヒト血清Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｈ４５２２、１％ｇｌｕｔａｍａｘＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃３５０５００６１、５μｇ／ｍＬゲンタマイシンＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１５７５００３７、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃２００－０７及びＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃２００－１５を含有するＡＩＭ－Ｖ培地ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ３８３０８０１で７日間、Ｔ細胞を増やした後、Ｔ細胞を、リン酸化されたＳＭＡＤ２／３タンパク質ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃５６２６９６を検出する抗体により細胞内を染色する前に、ＴＧＦ－β（２０ｎｇ／ｍＬ）Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、＃２４０－Ｂ－０１０／ＣＦあり又はなしで３０分間処理した。

【0071】

図２Ａ及び２Ｂに示されるように、ＴＧＦＢＲ２編集及び１Ｇ４ＴＣＲ発現の両方を欠いているＴ細胞（「非編集」）並びにＴＧＦＢＲ２編集を欠いているが、外来性１Ｇ４ＴＣＲを発現しているＴ細胞（「１Ｇ４のみ」）は、ＴＧＦ－β処理後、リン酸化されたＳＭＡＤ２／３における増加を見せたのに対して、ＴＧＦＢＲ２破壊１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞の多くは、いかなる増加も実証しなかった。ＴＧＦＢＲ２エキソン１編集１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞のいくつか及びＴＧＦＢＲ２エキソン４編集１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞のすべては、ＴＧＦ－βシグナル伝達に完全に抵抗した。

【0072】

図３に示されるように、ｇＲＮＡ４及び７は、１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞上のＴＧＦＢＲ２表面発現を低下させることに非効率的であった、ＴＧＦＢＲ２遺伝子に対する編集を導いた。試験した他のすべてのＴＧＦＢＲ２ｇＲＮＡは、エキソン４を標的にするすべてのｇＲＮＡを含め、ＴＧＦＢＲ２表面発現の低下をもたらした（図３）。細胞内キナーゼドメイン（エキソン４）を標的にするＴＧＦＢＲ２ｇＲＮＡは、すべて対照細胞と比較してＴＧＦＢＲ２の表面発現を低下させたが、エキソン４編集Ｔ細胞は、表面発現の低下に成功したエキソン１（細胞外ドメイン）編集細胞（ｇＲＮＡＴＧＦＢＲ２－１、ＴＧＦＢＲ２－５及びＴＧＦＢＲ２－６）と比較してＴＧＦＢＲ２表面発現が多い傾向を示した。表面発現データを下記の表３に提示する。

【0073】

【表3】

【0074】

４．６．２．実施例２：ＴＧＦＢＲ２破壊ＴＣＲ発現Ｔ細胞はＴＧＦ－βの存在下で優れた機能を呈する
本実施例は、複数回の抗原曝露を通して細胞傷害活性を維持するＴＧＦＢＲ２破壊Ｔ細胞の能力を示す。

【0075】

１Ｇ４ＴＣＲ発現ＴＧＦＢＲ２破壊Ｔ細胞を、実施例１のように健康なヒトドナーから産出した。５％ヒト血清Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｈ４５２２、１％ｇｌｕｔａｍａｘＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃３５０５００６１、５μｇ／ｍＬゲンタマイシンＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１５７５００３７、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃２００－０７及びＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、＃２００－１５を含有するＡＩＭ－Ｖ培地ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ３８３０８０１で１４日間、Ｔ細胞を増やした後、Ｔ細胞を、ＩｎｃｕＣｙｔｅプラットフォームを使用する反復細胞傷害性アッセイにかけた。

【0076】

Ｔ細胞をおよそ７２時間、外来性ＴＧＦ－β（２０ｎｇ／ｍＬ）Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、＃２４０－Ｂ－０１０／ＣＦの存在下又は非存在下において、１Ｇ４ＴＣＲ同種抗原、ＮＹ－ＥＳＯ－１及びＨＬＡ－Ａ^＊０２：０１のペプチドＨＬＡ（ｐＨＬＡ）複合体を発現するＧＦＰ発現Ａ３７５細胞と５：１のエフェクター対標的比で共培養した。Ｔ細胞を次いで回収し、合計４回の腫瘍チャレンジのために新しいＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞と共培養した。画像を、２時間毎に１０×対物レンズを使用して得て、Ｔ細胞の細胞傷害性を、共培養物中に残っているＧＦＰ^＋Ａ３７５細胞の数を測定することによって決定した。

【0077】

第１ラウンド中、すべての１Ｇ４ＴＣＲ発現Ｔ細胞は、ＴＧＦ－βの存在下又は非存在下でＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞増殖を制御することができた（図４Ａ～４Ｄ）。

【0078】

第２ラウンド中、非ＴＧＦＢＲ２破壊１Ｇ４発現Ｔ細胞（「１Ｇ４ＴＣＲのみ」）は、ＴＧＦ－βの存在下でＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞の増殖をもはや制御することができなかった（図４Ａ）。ＴＧＦＢＲ２発現が低下し、且つＴＧＦ－βシグナル伝達能力が低下したＴＧＦＢＲ２破壊Ｔ細胞は、腫瘍細胞チャレンジの第２及び後続のラウンド中、ＴＧＦ－βが存在するかどうかに関係なく、Ａ３７５－ＧＦＰ^＋細胞を死滅させ続けることができた（図４Ｂ、エキソン１破壊；図４Ｃ、エキソン４破壊）。いくらかの機能的なＴＧＦ－βシグナル伝達をまだ保持していたＴＧＦＢＲ２ｇＲＮＡ４編集Ｔ細胞及びＴＧＦＢＲ２ｇＲＮＡ７編集Ｔ細胞（図２）は、第２ラウンドの死滅の初めに、ＴＧＦ－βの存在下でＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞増殖を制御する能力が低下していた（図４Ｂ）。

【0079】

外来性ＴＧＦ－βの非存在下において、１Ｇ４ＴＣＲのみのＴ細胞は、第３及び第４ラウンドの腫瘍細胞チャレンジ中にその細胞傷害機能をなくしたが、ＴＧＦＢＲ２破壊Ｔ細胞は、ＴＧＦ－βの非存在下でＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞の増殖を制御し続けた（図４Ａ、４Ｂ及び４Ｃ）。最後の第４ラウンドのＡ３７５－ＧＦＰ^＋細胞数を図４Ｄに示す。

【0080】

これらのデータは、ＴＧＦＢＲ２破壊Ｔ細胞が、細胞傷害機能のＴＧＦ－β媒介性の抑制に抵抗し、外来性ＴＧＦ－βの存在下又は非存在下で抗原陽性腫瘍細胞を死滅させるのにより強力であることを示す。

【0081】

４．６．３．実施例３：ＴＧＦＢＲ２破壊ＴＣＲ発現Ｔ細胞はＴＧＦ－βの存在下で増殖能を維持する
本実施例は、ＴＧＦＢＲ２破壊Ｔ細胞がＴＧＦ－βの存在下で増殖の継続が可能であることを示す。

【0082】

１Ｇ４ＴＣＲ発現ＴＧＦＢＲ２破壊Ｔ細胞を、ＴＧＦ－β（２０ｎｇ／ｍＬ）Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ、＃２４０－Ｂ－０１０／ＣＦの存在下又は非存在下において、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（抗ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２）ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃１０９９０を使用する反復再刺激にかけた。Ｔ細胞増殖を、毎週、Ｔ細胞をカウントすることによって定量化した（図５）。１Ｇ４ＴＣＲのみのＴ細胞は、ＴＧＦ－βの存在下で増加することができなかったが、ＴＧＦＢＲ２破壊Ｔ細胞は、ＴＧＦ－βの非存在下と同じ程度に増殖するその能力を維持した。いくらかの機能的なＴＧＦ－βシグナル伝達をまだ保持していたＴＧＦＢＲ２ｇＲＮＡ４編集Ｔ細胞及びＴＧＦＢＲ２ｇＲＮＡ－７編集Ｔ細胞（図２）は、他のＴＧＦＢＲ２破壊Ｔ細胞と比較して、ＴＧＦ－βの存在下でよりゆっくりと増加した。

【0083】

このデータは、ＴＧＦＢＲ２ＫＯＴ細胞が増殖のＴＧＦ－β媒介性の抑制に抵抗し、ＴＧＦ－βの存在下でその増殖能を維持し得ることを示す。

【0084】

４．６．４．実施例４：ＴＧＦＢＲ２破壊ＴＣＲ発現Ｔ細胞は同様のレベルのＴＣＲ発現を有する。
本実施例は、ＴＧＦＢＲ２破壊Ｔ細胞が非破壊細胞と同様のレベルの外来性ＴＣＲを発現することを示す。

【0085】

ＴＣＲノックインＴＧＦＢＲ２破壊Ｔ細胞は、ＴＧＦＢＲ２、ＴＲＡＣ及びＴＲＢＣターゲティングＣａｓ９－ｇＲＮＡリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）並びにＴＲＡＣ遺伝子座に挿入するための相同なアームと、メトトレキサートに対して耐性である突然変異ＤＨＦＲ遺伝子及びＣβドメイン中にｍｕｒ６エピトープを含有する外来性ＴＣＲ（その全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願第１７／５５７，５１４号明細書に記載される）をコードする相同組換え修復ＤＮＡテンプレートを同時にエレクトロポレーションすることによって遺伝子操作した。

【0086】

細胞は、エレクトロポレーション後７日間増やし、次いで米国特許出願公開第２０２２／００４１９９９号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法に従ってメトトレキサートを使用して選択した。内在性ＴＣＲの発現は、ヒトＴＣＲαβ複合体を認識する抗体（抗体クローンＩＰ２６）により染色することによって決定した。外来性ＴＣＲの発現は、ｍｕｒ６エピトープを認識する抗体（Ｈ５７）により検出した。

【0087】

エレクトロポレーションの７日後、Ｔ細胞は、エレクトロポレーションの７日後の選択前及びエレクトロポレーションの１４日後の選択後の両方で、試験したすべての条件（ＴＧＦＢＲ２破壊なし、３つの異なるターゲティング配列によるＴＧＦＢＲ２破壊及びＡＡＶＳ１対照ＫＯ）において同等のレベルで外来性ＴＣＲを発現した（図５）。

【0088】

このデータは、ＴＧＦＢＲ２ＫＯＴ細胞が、外来性ＴＣＲを発現する能力を損なわなかったことを示す。

【0089】

５．均等物及び参照による組み込み
本発明は、特に好ましい実施形態及び様々な代替の実施形態に関して示され、記載されたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、形態及び詳細における様々な変更形態がなされ得ることが当業者によって理解される。

【0090】

本明細書の本文中で引用された参考文献、発行済み特許及び特許出願のすべては、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】