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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-06
(54)【発明の名称】シーケンシングライブラリ構築方法と使用
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20241029BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20241029BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241029BHJP
C40B 40/06 20060101ALI20241029BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20241029BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20241029BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z ZNA
C12Q1/6869 Z
C12Q1/686 Z
C40B40/06
C12Q1/6886 Z
C12Q1/6888 Z
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024533124
(86)(22)【出願日】2022-11-18
(85)【翻訳文提出日】2024-07-19
(86)【国際出願番号】 CN2022132866
(87)【国際公開番号】W WO2023098492
(87)【国際公開日】2023-06-08
(31)【優先権主張番号】202111447642.2
(32)【優先日】2021-12-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524208803
【氏名又は名称】江蘇為真生物医薬技術股▲ふん▼有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＪＩＡＮＧＳＵ ＭＩＣＲＯＤＩＡＧ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】Ｒｏｏｍ １０１ Ａｎｄ ２０１， Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １６， Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｓｕｚｈｏｕ Ｎａｎｏ Ｃｉｔｙ， Ｎｏ． ９９， Ｊｉｎｊｉ Ｌａｋｅ Ａｖｅｎｕｅ， Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ， Ｐｉｌｏｔ Ｆｒｅｅ Ｔｒａｄｅ Ｚｏｎｅ Ｓｕｚｈｏｕ Ａｒｅａ， Ｊｉａｎｇｓｕ， ２１５０００， Ｃｈｉｎａ
(71)【出願人】
【識別番号】524208814
【氏名又は名称】蘇州普瑞邁徳医学検験所有限公司
【氏名又は名称原語表記】ＳＵＺＨＯＵ ＰＲＥＭＥＤ ＭＥＤＩＣＡＬ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＣＯ．， ＬＴＤ．
【住所又は居所原語表記】（ＮＷ－１６） Ｂｕｉｌｄｉｎｇ １６， Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａｒｅａ， Ｓｕｚｈｏｕ Ｎａｎｏ Ｃｉｔｙ， ９９ Ｊｉｎｊｉｈｕ Ａｖｅｎｕｅ， Ｓｕｚｈｏｕ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｐａｒｋ， Ｓｕｚｈｏｕ， Ｊｉａｎｇｓｕ ２１５０００， Ｃｈｉｎａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】巴 兆粉
(72)【発明者】
【氏名】宋 如晦
(72)【発明者】
【氏名】張 嘉欣
(72)【発明者】
【氏名】孫 浩
(72)【発明者】
【氏名】王 ▲タオ▼
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ08
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX01
(57)【要約】
【課題】
シーケンシングライブラリの構築方法であって、デオキシリボ核酸の増幅及びライブラリ構築を行うために使用されるプライマー配列断片を提供し、前記プライマー配列断片に対して処理を行って、５’末端がＧである増幅プライマーを得ることを含み、ここで、前記処理は、前記プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧでない場合は、５’末端にＧを連結すること、前記プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧの場合は、５’末端にＧを連結するか又は連結しないこと、５’末端がＧである前記増幅プライマーを用いてサイクリック増幅を行って、３’末端がＣである増幅断片を得ること、デオキシリボ核酸の３’末端にＡを付加すること、及び３’末端にＡを付加した前記増幅断片に、Ｔ粘着末端を含むリンカーを連結して連結産物を生成することを含む。さらに、シーケンシングライブラリ構築用の増幅プライマー、シーケンシングライブラリ、シーケンシングライブラリ構築用のキット、変異部位検出キット、染色体倍数性検出キット、遺伝子融合検出キット、及びシーケンシング方法が開示される。
【選択図】図１
シーケンシングライブラリの構築方法であって、デオキシリボ核酸の増幅及びライブラリ構築を行うために使用されるプライマー配列断片を提供し、前記プライマー配列断片に対して処理を行って、５’末端がＧである増幅プライマーを得ることを含み、ここで、前記処理は、前記プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧでない場合は、５’末端にＧを連結すること、前記プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧの場合は、５’末端にＧを連結するか又は連結しないこと、５’末端がＧである前記増幅プライマーを用いてサイクリック増幅を行って、３’末端がＣである増幅断片を得ること、デオキシリボ核酸の３’末端にＡを付加すること、及び３’末端にＡを付加した前記増幅断片に、Ｔ粘着末端を含むリンカーを連結して連結産物を生成することを含む。さらに、シーケンシングライブラリ構築用の増幅プライマー、シーケンシングライブラリ、シーケンシングライブラリ構築用のキット、変異部位検出キット、染色体倍数性検出キット、遺伝子融合検出キット、及びシーケンシング方法が開示される。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シーケンシングライブラリ構築用の増幅プライマーであって、標的断片に相補的なプライマー配列断片と、前記プライマー配列断片の５’末端に連結された塩基Ｇとを含み、前記増幅プライマーと前記標的断片は前記塩基Ｇにおいて相補的ではない、増幅プライマー。
【請求項2】
前記塩基Ｇは前記プライマー配列断片の５’末端に直接連結される、請求項１に記載の増幅プライマー。
【請求項3】
前記塩基Ｇはリン酸化によって修飾された塩基である、請求項１又は請求項２に記載の増幅プライマー。
【請求項4】
シーケンシングライブラリ構築用のキットの作製における請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の増幅プライマーの使用。
【請求項5】
シーケンシングライブラリの構築方法であって、デオキシリボ核酸の増幅及びライブラリ構築を実行するために使用されるプライマー配列断片を提供し、前記プライマー配列断片は標的断片と相補的であり、
前記プライマー配列断片に対して処理を行って、５’末端に塩基Ｇを有する増幅プライマーを得ることを含み、
ここで、前記処理は、
前記プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧでない場合は、前記プライマー配列断片の５’末端に塩基Ｇを連結すること、又は前記プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧである場合は、前記プライマー配列断片の５’末端に塩基Ｇを連結するか又は連結しないこと、
前記増幅プライマーを使用して前記デオキシリボ核酸に対してサイクリック増幅を行い、３’末端に塩基Ｃを有する増幅断片を得ること、
前記増幅断片の３’末端に塩基Ａを付加すること、及び、
３’末端に塩基Ａが付加された増幅断片にＴ粘着末端を含むアダプターを連結し、前記アダプターはシーケンシングプラットフォームに必要な配列を含むこと、
を含む方法。
【請求項6】
前記デオキシリボ核酸の増幅を行う前に、前記増幅プライマーの５’末端の塩基Ｇをリン酸化することをさらに含む、請求項５に記載のシーケンシングライブラリの構築方法。
【請求項7】
前記デオキシリボ核酸は、サンプルＤＮＡ、サンプルプラスミド、及びサンプルＲＮＡの逆転写によって得られたデオキシリボ核酸からなる群から選択される、請求項５又は請求項６に記載のシーケンシングライブラリの構築方法。
【請求項8】
請求項５乃至請求項７のいずれか一項に記載のシーケンシングライブラリの構築方法によって構築されたシーケンシングライブラリ。
【請求項9】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の増幅プライマーを含む、シーケンシングライブラリ構築用のキット。
【請求項10】
塩基Ａを添加するための試薬、アダプターを添加するための試薬、ＰＣＲ増幅用試薬、及び精製用試薬のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項11】
請求項５乃至請求項７のいずれか一項に記載のシーケンシングライブラリの構築方法を使用してサンプルのシーケンシングライブラリを構築し、シーケンシングを行うことを含む、シーケンシング方法。
【請求項12】
前記サンプルに対して変異部位検出、染色体倍数性検出、遺伝子融合検出、及び病原性微生物検出のうちのいずれか１つを行うために使用される、請求項１１に記載のシーケンシング方法。
【請求項13】
前記変異部位検出は、腸がん変異部位、子宮頸がん変異部位、及び尿路上皮がん変異部位のうち少なくとも１つを含む、請求項１２に記載のシーケンシング方法。
【請求項14】
前記染色体倍数性は、腸がんの染色体倍数性、子宮頸がんの染色体倍数性、及び尿路上皮がんの染色体倍数性のうちの少なくとも1つを含む、請求項１２に記載のシーケンシング方法。
【請求項15】
前記遺伝子融合は、ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子融合、ＣＤ７４－ＲＯＳＩ遺伝子融合、ＣＣＤＣ６－ＲＥＴ遺伝子融合、ＮＣＯＡ４－ＲＥＴ遺伝子融合、及びＴＰＭ３－ＮＴＲＫ１遺伝子融合のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載のシーケンシング方法。
【請求項16】
前記病原性微生物は、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載のシーケンシング方法。
【請求項17】
前記シーケンシングはハイスループットシーケンシングである、請求項１１乃至請求項１６のいずれか一項に記載のシーケンシング方法。
【請求項18】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の増幅プライマーを含む、変異部位検出キット。
【請求項19】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の増幅プライマーを含む、染色体倍数性検出キット。
【請求項20】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の増幅プライマーを含む、遺伝子融合検出キット。
【請求項21】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の増幅プライマーを含む、病原性微生物検出キット。
【請求項22】
請求項１乃至請求項３のいずれか一項に記載の増幅プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の末端にＡを付加する工程を含む、ＴＡクローニング方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願への相互参照
本開示は、２０２１年１２月０１日に出願された「シーケンシングライブラリ構築方法及び使用」と題する中国特許出願番号２０２１１１４４７６４２２の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書にその全体が組み込まれている。
本開示は、シーケンシング技術の分野、特にシーケンシングライブラリ構築方法及び使用に関する。
本開示は、２０２１年１２月０１日に出願された「シーケンシングライブラリ構築方法及び使用」と題する中国特許出願番号２０２１１１４４７６４２２の優先権を主張するものであり、その内容は参照により本明細書にその全体が組み込まれている。
本開示は、シーケンシング技術の分野、特にシーケンシングライブラリ構築方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
ハイスループットシーケンシングは、超並列シーケンシングまたは次世代シーケンシングとも呼ばれます。ハイスループットシーケンシングでは、１ つのサンプルの複数のターゲット領域または複数のサンプルを一度にシーケンシングすることができ、薬理ゲノミクス、遺伝性疾患の研究とスクリーニング、腫瘍変異遺伝子の検出、臨床微生物学的検出などの臨床での使用も徐々に注目を集めている。
【0003】
全ゲノムシーケンシングは大きな進歩を遂げているが、この技術に関連する解釈データベースが不完全で不正確であることや、シーケンシングコストが高いことなどの問題がまだある。この技術の高コストと技術的な複雑さにより、全ゲノムシーケンシングの使用が制限されている。そのため、特定のゲノム領域に対するターゲット領域エンリッチメントのハイスループットシーケンシングライブラリ構築のさまざまな方法が広く開発され、使用されており、それによってカバレッジが向上し、プロセスの簡素化とコスト削減の目的が達成されている。
【0004】
特定領域に対するターゲットエンリッチメントのライブラリ構築には、プローブハイブリダイゼーションキャプチャとマルチプレックスＰＣＲ増幅の２つの主な方法がある。このうち、マルチプレックスＰＣＲ産物を用いたライブラリ構築には、現在、ライゲーション反応により産物にアダプターを付加する方法と、２回のＰＣＲ（１回目は５’末端にユニバーサル配列を持つプライマーを使用し、２回目はプライマーをアニーリングさせてアダプターを付加）によりアダプターを付加する方法の２つの主な方法がある。マルチプレックスＰＣＲ産物にアダプターを付加するライブラリ構築方法は、主流のライブラリ構築方法である。
【0005】
ＴＡ粘着末端のライゲーション効果は平滑末端よりも優れているため、現在ではＴＡライゲーションによるアダプターの付加が主に使用されている。一部のＤＮＡ ポリメラーゼは、テンプレートに依存せずにＤＮＡ断片の３’末端にＡ塩基を付加することを触媒できる。この発見は、ＴＡクローニングや次世代シーケンシングライブラリ構築などの一連の技術の基礎を築いた。ただし、現在のＤＮＡ断片の３’末端へのＡ塩基の直接触媒付加は効率的ではなく、不安定である。
【発明の概要】
【0006】
これに基づいて、本開示の様々な実施形態によれば、標的断片に相補的なプライマー配列断片と、プライマー配列断片の５’末端に連結された塩基Ｇとを含む、シーケンシングライブラリ構築用の増幅プライマーが提供され、増幅プライマーと標的断片は塩基Ｇにおいて相補的ではない。
【0007】
一実施形態では、塩基Ｇはプライマー配列断片の５’末端に直接連結される。
【0008】
一実施形態では、塩基Ｇはリン酸化によって修飾された塩基である。
【0009】
本開示の様々な実施形態によれば、シーケンシングライブラリを構築用のキットの作製における上記の増幅プライマーの使用が提供される。
【0010】
本開示の様々な実施形態によれば、シーケンシングライブラリの構築方法が提供される。この方法は、以下を含む：
デオキシリボ核酸の増幅及びライブラリ構築を実行するために使用されるプライマー配列断片を提供し、プライマー配列断片は標的断片と相補的であり、
プライマー配列断片に対して処理を行って、５’末端に塩基Ｇを有する増幅プライマーを得ることを含み、処理は以下を含む：
プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧでない場合は、プライマー配列断片の５’末端に塩基Ｇを連結すること、又はプライマー配列断片の５’末端の塩基がＧである場合は、プライマー配列断片の５’末端に塩基Ｇを連結するか又は連結しないこと；
５’末端に塩基Ｇを有する増幅プライマーを使用してデオキシリボ核酸に対してサイクリック増幅を行って、３’末端に塩基Ｃを有する増幅断片を得ること；
増幅断片の３’末端に塩基Ａを付加すること；及び
３’末端に塩基Ａが付加された増幅断片にＴ粘着末端を含むアダプターを連結し、アダプターはシーケンシングプラットフォームに必要な配列を含むこと。
デオキシリボ核酸の増幅及びライブラリ構築を実行するために使用されるプライマー配列断片を提供し、プライマー配列断片は標的断片と相補的であり、
プライマー配列断片に対して処理を行って、５’末端に塩基Ｇを有する増幅プライマーを得ることを含み、処理は以下を含む：
プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧでない場合は、プライマー配列断片の５’末端に塩基Ｇを連結すること、又はプライマー配列断片の５’末端の塩基がＧである場合は、プライマー配列断片の５’末端に塩基Ｇを連結するか又は連結しないこと；
５’末端に塩基Ｇを有する増幅プライマーを使用してデオキシリボ核酸に対してサイクリック増幅を行って、３’末端に塩基Ｃを有する増幅断片を得ること；
増幅断片の３’末端に塩基Ａを付加すること；及び
３’末端に塩基Ａが付加された増幅断片にＴ粘着末端を含むアダプターを連結し、アダプターはシーケンシングプラットフォームに必要な配列を含むこと。
【0011】
一実施形態では、この方法は、デオキシリボ核酸の増幅を行う前に、増幅プライマーの５’末端の塩基Ｇをリン酸化することをさらに含む。
【0012】
一実施形態では、デオキシリボ核酸は、サンプルＤＮＡ、サンプルプラスミド、及びサンプルＲＮＡの逆転写によって得られたデオキシリボ核酸からなる群から選択される。
【0013】
本開示の様々な実施形態によれば、上記のシーケンシングライブラリの構築方法によって構築されたシーケンシングライブラリが提供される。
【0014】
本開示の様々な実施形態によれば、上記増幅プライマーを含む、シーケンシングライブラリを構築するためのキットが提供される。
【0015】
一実施形態では、キットには、塩基Ａを添加するための試薬、アダプターを添加するための試薬、ＰＣＲ増幅用試薬、及び精製用試薬のうち少なくとも１つをさらに含む。
【0016】
本開示の様々な実施形態によれば、上記シーケンシングライブラリの構築方法を使用してサンプルのシーケンシングライブラリを構築し、シーケンシングを行うことを含むシーケンシング方法が提供される。
【0017】
一実施形態では、シーケンシング方法は、サンプルに対して、変異部位検出、変異部位検出、遺伝子融合検出、及び病原性微生物検出のうちのいずれか１つを行うために使用される。
【0018】
一実施形態では、変異部位は、腸がん変異部位、子宮頸がん変異部位、及び尿路上皮がん変異部位のうちの少なくとも１つを含む。
【0019】
一実施形態では、染色体倍数性は、腸がんの染色体倍数性、子宮頸がんの染色体倍数性、及び尿路上皮がんの染色体倍数性のうちの少なくとも１つを含む。
【0020】
一実施形態では、遺伝子融合は、ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子融合、ＣＤ７４－ＲＯＳＩ遺
伝子融合、ＣＣＤＣ６－ＲＥＴ遺伝子融合、ＮＣＯＡ４－ＲＥＴ遺伝子融合、及びＴＰＭ３－ＮＴＲＫ１遺伝子融合のうちの少なくとも１つを含む。
伝子融合、ＣＣＤＣ６－ＲＥＴ遺伝子融合、ＮＣＯＡ４－ＲＥＴ遺伝子融合、及びＴＰＭ３－ＮＴＲＫ１遺伝子融合のうちの少なくとも１つを含む。
【0021】
一実施形態では、病原性微生物は、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のうちの少なくとも１つを含む。
【0022】
一実施形態では、シーケンシングはハイスループットシーケンシングである。
【0023】
本開示の様々な実施形態によれば、上記の増幅プライマーを含む変異部位検出キットが提供される。
【0024】
本開示の様々な実施形態によれば、上記増幅プライマーを含む染色体倍数性検出キットが提供される。
【0025】
本開示の様々な実施形態によれば、上記増幅プライマーを含む遺伝子融合検出キットが提供される。
【0026】
本開示の様々な実施形態によれば、上記増幅プライマーを含む病原微生物検出キットが提供される。
【0027】
本開示の様々な実施形態によれば、上記増幅プライマーを使用してＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の末端にＡを付加する工程を含むＴＡクローニング方法が提供される。
【0028】
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載されている。本開示のその他の特徴、目的及び利点は、明細書、添付の図面、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0029】
本明細書に開示された開示の実施形態及び／又は実施例をより良く説明及び例示するために、１つまたは複数の添付図面を参照することができる。添付図面を説明するために使用される追加の詳細又は実施例は、開示された発明、現在記載されている実施形態及び／又は実施例、及び現在理解されている開示の好ましい態様のいずれかの範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。
【発明を実施するための形態】
【0030】
本開示の理解を容易にするために、本開示は、関連する添付図面を参照して、以下でより詳細に説明される。本開示の様々な実施形態が添付図面に示されている。しかし、本開示は、多くの異なる形態で実施することができ、本明細書で説明される実施形態に限定さ
れない。むしろ、これらの実施形態は、本開示の内容の理解がより徹底的になるように提供される。
れない。むしろ、これらの実施形態は、本開示の内容の理解がより徹底的になるように提供される。
【0031】
本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、特に定義されない限り、本開示が適用される技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で本開示の明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、本開示を制限することを意図するものではない。
【0032】
３’末端ｄＡの付加効率はテンプレートによって異なる。例えば、３’末端ｄＡの付加効率はＤＮＡの３’末端のヌクレオチド塩基組成に依存し、４％から７５％の間で変動する。ＤＮＡの３’末端ヌクレオチドが塩基Ｃ、Ｔ、Ｇ、又はＡである場合にその対応するＡ付加効率は、それぞれ８０～８５％、７５～８０％、４５～５０％、又は２０～３０％である。
【0033】
そのため、異なる末端を持つＤＮＡ断片へのＡの付加効率は異なる。
【0034】
本開示では、フォワードプライマー及びリバースプライマーの５’末端にＧを追加して（プライマーの５’末端に元々Ｇがある場合は、追加する必要はない）、アンプリコンの上部及び下部相補鎖の３’末端が両方ともＣになるようにすることで、テンプレートに依存しない３’末端へのＡの付加を触媒するプロセスにおいて、各鎖へのＡの付加が均等な確率で保証され、３’末端がＣであるため８０～８５％の最大効率が保証され、ＴＡライゲーション効率は改善される。
【0035】
本開示により、より高いＡ付加効率が確保され、ＴＡライゲーションによりより多くのテンプレートにアダプターを付加することができ、ライブラリ変換率が向上する。また、末端修復などのプロセスが削減され、複雑な操作によるＤＮＡ回収率の低下が軽減される。この方法は、低頻度変異の検出にさらに役立つ。
【0036】
また、ＰＣＲ産物のＴＡクローニングの適用において、本方法のクローニング効率も従来の方法よりも優れている。
【0037】
第１の態様において、本開示の実施例は、標的断片に相補的なプライマー配列断片と、プライマー配列断片の５’末端に連結された塩基Ｇとを含む、シーケンシングライブラリ構築用の増幅プライマーを提供し、増幅プライマーと標的断片は塩基Ｇにおいて相補的ではない。
【0038】
本明細書において使用される「相補的」という用語は、２つの核酸配列が塩基対形成原理（ワトソン・クリック原理）に従って互いに水素結合を形成し、それによって二重鎖を形成できることを意味する。本開示において、「相補的」という用語は、「実質的に相補的」及び「完全に相補的」を含む。本明細書において使用される「完全に相補的」という用語は、１つの核酸配列のすべての塩基が、ミスマッチやギャップが存在せずに、他の核酸鎖の塩基と対形成できることを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」という用語は、一方の核酸配列の塩基の大部分が、ミスマッチ又はギャップ（例えば、１つ以上のヌクレオチドのミスマッチ又はギャップ）の存在を許容しながら、他方の核酸鎖の塩基と対形成できることを意味する。一般に、核酸のハイブリダイゼーション、アニーリング、又は増幅を可能にする条件下では、「相補的」（例えば、実質的に相補的又は完全に相補的）な２つの核酸配列は、選択的／特異的にハイブリダイズ又はアニーリングして二重鎖を形成する。
【0039】
本明細書において使用される「標的断片」、「標的増幅断片」及び「標的配列」という
用語は、増幅される標的核酸配列を指す。本開示において、「標的断片」、「標的増幅断片」及び「標的配列」という用語は同じ意味を有し、互換的に使用することができる。標的断片がサンプル配列に特異的であることは容易に理解される。言い換えれば、核酸のハイブリダイゼーション、アニーリング又は増幅が可能な条件下では、増幅プライマーは特定の標的断片にのみハイブリダイズ又はアニーリングして特定の断片を増幅し、他の核酸配列にはハイブリダイズ又はアニーリングしない。
用語は、増幅される標的核酸配列を指す。本開示において、「標的断片」、「標的増幅断片」及び「標的配列」という用語は同じ意味を有し、互換的に使用することができる。標的断片がサンプル配列に特異的であることは容易に理解される。言い換えれば、核酸のハイブリダイゼーション、アニーリング又は増幅が可能な条件下では、増幅プライマーは特定の標的断片にのみハイブリダイズ又はアニーリングして特定の断片を増幅し、他の核酸配列にはハイブリダイズ又はアニーリングしない。
【0040】
増幅プライマーが標的断片に相補的であり、プライマー配列断片が標的断片に相補的である場合、増幅プライマーと標的断片の末端は塩基Ｇで相補的ではない。
【0041】
いくつかの実施形態では、塩基Ｇは、他の塩基を間に挟むことなく、相補配列の５’末端に直接連結される。
【0042】
いくつかの実施形態では、塩基Ｇは、リン酸化によって修飾された塩基である。プライマーの５’末端は、二本鎖生成物の５’末端のリン酸化状態を確保するために、リン酸化によって修飾される。プライマーの５’末端のリン酸化は、ライブラリ構築におけるリン酸化反応及び精製ステップを減らすことができ、したがって時間を節約し、複数の操作工程によって引き起こされる分子損失を減らすことができる。プライマーの５’末端にＧの追加及び５’末端のリン酸化の２点が組み合わせることによって、ライブラリ変換率が改善され、損失率を減らすことができる。
【0043】
第２の態様において、本開示の実施例は、上記増幅プライマーのシーケンシングライブラリを構築するためのキットの作製における使用を提供し、これにより、キットがより高いＡ付加効率を達成することを保証し、ＴＡライゲーションによってより多くのテンプレートにアダプターを付加することができ、ライブラリ変換率が向上する。また、キットは末端修復などのプロセスを削減し、複雑な操作によって引き起こされるＤＮＡ回収率の低下を軽減する。
【0044】
第３の態様において、本開示の実施例は、以下を含むシーケンシングライブラリの構築方法を提供する：
デオキシリボ核酸の増幅及びライブラリ構築を行うために使用されるプライマー配列断片を提供し、プライマー配列断片は標的断片と相補的であり、プライマー配列断片に対して処理を行って、５’末端に塩基Ｇを有する増幅プライマーを得ることを含み、処理には以下が含まれる：
プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧでない場合、プライマー配列断片の５’末端に塩基Ｇを連結すること、又は
プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧである場合、プライマー配列断片の５’末端に塩基Ｇを連結するか又は連結しないこと；
増幅プライマーを使用してデオキシリボ核酸に対してサイクリック増幅を行い、３’末端に塩基Ｃを有する増幅断片を得ること；
デオキシリボ核酸の３’末端に塩基Ａを付加すること；そして、
３’末端に塩基Ａが付加された増幅断片にＴ粘着末端を含むアダプターを連結し、該アダプターにはシーケンシングプラットフォームに必要な配列を含むこと。
デオキシリボ核酸の増幅及びライブラリ構築を行うために使用されるプライマー配列断片を提供し、プライマー配列断片は標的断片と相補的であり、プライマー配列断片に対して処理を行って、５’末端に塩基Ｇを有する増幅プライマーを得ることを含み、処理には以下が含まれる：
プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧでない場合、プライマー配列断片の５’末端に塩基Ｇを連結すること、又は
プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧである場合、プライマー配列断片の５’末端に塩基Ｇを連結するか又は連結しないこと；
増幅プライマーを使用してデオキシリボ核酸に対してサイクリック増幅を行い、３’末端に塩基Ｃを有する増幅断片を得ること；
デオキシリボ核酸の３’末端に塩基Ａを付加すること；そして、
３’末端に塩基Ａが付加された増幅断片にＴ粘着末端を含むアダプターを連結し、該アダプターにはシーケンシングプラットフォームに必要な配列を含むこと。
【0045】
３’末端ｄＡの付加効率はテンプレートによって異なることから、３’末端のヌクレオチド塩基が塩基Ｃである場合に、対応するＡ付加効率が最も高くなる。本開示の上記シーケンシングライブラリ構築方法では、ＰＣＲプライマーの５’末端に塩基Ｇ（元々Ｇが存在する場合には追加する必要はない）を付加することにより、ＰＣＲ産物の３’末端がＣとなるようにし、各産物分子のＡ付加効率を同等又はより高くしていると保証される。産物の末端へのＡ付加効率が向上されたため、ＴＡライゲーションにおけるアダプター付加
反応においてライゲーション効率が向上する。プライマー末端に修飾を導入してＡ付加に寄与する増幅産物を得る方法は、従来のライブラリ構築方法と比較して、増幅後の末端修復等のプロセスを削減し、煩雑な操作によるＤＮＡ回収率の低下を軽減し、プロセスが簡単で、試薬を節約でき、アダプターへのライゲーション効率も高い。この方法は、ＰＣＲ産物のＴＡクローニング、変異部位検出、染色体倍数性検出、遺伝子融合検出、病原微生物検出等のシーケンシングを使用した検出方法にも使用できます。
反応においてライゲーション効率が向上する。プライマー末端に修飾を導入してＡ付加に寄与する増幅産物を得る方法は、従来のライブラリ構築方法と比較して、増幅後の末端修復等のプロセスを削減し、煩雑な操作によるＤＮＡ回収率の低下を軽減し、プロセスが簡単で、試薬を節約でき、アダプターへのライゲーション効率も高い。この方法は、ＰＣＲ産物のＴＡクローニング、変異部位検出、染色体倍数性検出、遺伝子融合検出、病原微生物検出等のシーケンシングを使用した検出方法にも使用できます。
【0046】
上記デオキシリボ核酸は、サンプルＤＮＡ、サンプルプラスミド、及びサンプルＲＮＡの逆転写によって得られたデオキシリボ核酸からなる群から選択される。
【0047】
いくつかの実施形態では、シーケンシングライブラリの構築方法は、アダプターの増幅プライマーを使用してライゲーション産物を増幅し、ライブラリの事前増幅を達成する工程をさらに含む。
【0048】
第４の態様において、本開示の実施例は、シーケンシングライブラリの構築方法によって構築されたシーケンシングライブラリを提供する。
【0049】
第５の態様において、本開示の実施例は、シーケンシングライブラリを構築するためのキットを提供する。
【0050】
シーケンシングライブラリを構築するためのキットは、上記の実施例のいずれかの増幅プライマーを含む。
【0051】
「キット」という用語は、少なくとも１つのデバイスを含む任意の物品（パッケージまたは容器など）を指す。該キットは、本明細書に記載の方法またはその工程で使用するための取扱説明書、補助試薬、コンポーネント、またはアセンブリのいずれか１つをさらに含んでもよい。
【0052】
必要に応じて、該キットは、Ａを付加するための試薬、アダプターを付加するための試薬、ＰＣＲ増幅用試薬、及び精製用試薬のいずれか１つ以上も含む。
【0053】
Ａを付加するための試薬は、酵素及びｄＡＴＰを含む。
【0054】
いくつかの実施形態では、３’末端にＡを付加するために使用される酵素は、クレノウェックス（ｋｌｅｎｏｗｅｘ）酵素、Ｔａｑ酵素、及びＴａｑ酵素を有するクレノウェックス酵素からなる群から選択されるいずれか１つ以上である。あるいは、３’末端へのＡの付加とアダプターのライゲーションを１つの反応系で行うことや、３’末端へのＡの付加を行った後に精製してからアダプターにライゲーションを行う。１つの反応系で行うということは、３’末端にＡを付加した後、精製せずにシーケンシングアダプターを直接ライゲーションすることを意味する。３’末端へのＡの付加にはＴａｑ酵素を使用することを好ましい。
【0055】
アダプターを付加するための試薬としては、リガーゼ及びアダプターが挙げられる。
【0056】
リガーゼは、ＨｉＦｉ Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼ、９°ＮＴＭ ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、エレクトロリガーゼ、ブラントエンド／ＴＡリガーゼプレミックス、インスタントスティッキーリガーゼプレミックス、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ ｓｓＤＮＡリガーゼ、５′ＡｐｐＤＮＡ／ＲＮＡ耐熱性リガーゼからなる群から選択される１つ以上である。
【0057】
アダプターは、３’末端に突出したＴ塩基を有し、Ａを付加した後のサンプルＤＮＡ断片との相補的対合に使用される。
【0058】
ＰＣＲ増幅に使用される試薬は、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼバッファーからなる群から選択される１種または複数種であってもよい。
【0059】
さらに、ＤＮＡポリメラーゼは、ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒＴＭＤＮＡポリメラーゼ、ＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓＤＮＡポリメラーゼＩＶ、ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ２．０ ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲＴＭＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＥｐｉＭａｒｋ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ（登録商標）Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼラージフラグメント、ＯｎｅＴａｑ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ポリメラーゼ、及びＱ５（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｑ５（登録商標）ｕｌｔｒａ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ ポリメラーゼ等からなる群から選択される１つまたは２つ以上の酵素の組み合わせである。
【0060】
さらに、ｄＮＴＰの濃度は２．５ ｍＭ、１０ ｍＭなどであってもよい。ＤＮＡポリメラーゼバッファーは、選択されたポリメラーゼに最もよく適合するバッファーとして選択される。
【0061】
ＤＮＡ断片を精製する工程は、当該技術分野における従来の方法、例えば、精製用磁気ビーズを用いて行うことができる。あるいは、精製に用いられる試薬としては、１．８×磁気ビーズ、０．９×磁気ビーズ、及びＥＢ溶液が挙げられる。
【0062】
本開示のキットにおいて、試薬は個別に包装されることが好ましいが、本開示の実施に影響を与えないという前提で、混合包装することもできる。
【0063】
第６の態様では、本開示の実施例は、上記実施例のシーケンシングライブラリの構築方法を使用してサンプルのシーケンシングライブラリを構築し、シーケンシングを行うことを含むシーケンシング方法が提供される。
【0064】
本開示の方法において、サンプルは、シーケンシングされる任意のサンプルであり得る。例えば、特定の実施形態では、サンプルはＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）を含むか、またはＤＮＡである。特定の実施形態では、サンプルはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を含むか、ＲＮＡである。特定の実施形態では、サンプルは核酸の混合物（例えばＤＮＡの混合物、ＲＮＡの混合物、又はＤＮＡとＲＮＡの混合物）を含むか、または核酸の混合物である。
【0065】
本開示の方法では、シーケンシングされる配列は、その配列組成または長さによって制限されない。例えば、シーケンシングされる配列は、ＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）であってもよい。さらに、検出される標的核酸配列は、一本鎖または二本鎖であってもよい。
【0066】
検出されるサンプルまたはシーケンシングされる配列がＲＮＡである場合、本発明の方法を実行する前に、逆転写反応を実行して、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡを取得することが好ましい。逆転写反応の詳細については、例えば、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍ－ｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ． Ｙ． （２００１）を参照のこと。
【0067】
シーケンシングされるサンプルまたシーケンシングされる配列は、原核生物（細菌など）、真核生物（原生動物、寄生虫、真菌、酵母、植物、哺乳類及びヒトを含む動物など）、又はウイルス（ヘルペスウイルス、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、エプスタイン・バーウイルス、肝炎ウイルス、ポリオウイルスなど）、又はウイロイドを含むがこれらに限定されない任意の供給源から取得することができる。シーケンシングされるサンプルまたシーケンシングされる配列は、ゲノム配列、人工的に単離または断片化された配列、合成配列など、任意の形態の核酸配列であってもよい。
【0068】
いくつかの実施形態では、シーケンシングされるサンプルは、血液、血清、血漿、細胞培養上清、唾液、精液、組織または組織溶解物である。
【0069】
本開示のいくつかの実施形態におけるシーケンシング方法は、次世代シーケンシング（「ＮＧＳ」）としても知られるハイスループットシーケンシングである。次世代シーケンシングは、並列シーケンシングプロセスで同時に数千から数百万の配列を生成する。ＮＧＳは、「サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシング」（第１世代シーケンシング）とは区別され、後者は単一のシーケンシング反応における連鎖終結産物の電気泳動分離に基づいている。本開示で使用されえるＮＧＳ用のシーケンスプラットフォームは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉｎｉＳｅｑ、ＮｅｘｔＳｅｑ ５５０、ｌｉｆｅプラットフォームなどを含むがこれらに限定されない、市販されている場合がある。
【0070】
この方法は、遺伝学研究、人種分布、人類の進化その他の分野（典型的にはＳＮＰアプリケーションなど）の研究など、非診断目的に使用することができる。
【0071】
いくつかの実施形態では、本開示の上記実施例のシーケンシング方法は、突然変異部位検出、染色体倍数性検出、遺伝子融合検出、病原性微生物検出、及びその他の目的のためのサンプルに使用することができる。
【0072】
いくつかの実施形態では、突然変異部位は、腸がんの突然変異部位、子宮頸がんの突然変異部位、及び尿路上皮がんの突然変異部位のうちの少なくとも１つを含む。
【0073】
いくつかの実施形態では、染色体倍数性は、腸がんの染色体倍数性、子宮頸がんの染色体倍数性、及び尿路上皮がんの染色体倍数性のうちの少なくとも１つを含む。
【0074】
いくつかの実施形態では、遺伝子融合は、ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子融合、ＣＤ７４－ＲＯＳＩ遺伝子融合、ＣＣＤＣ６－ＲＥＴ遺伝子融合、ＮＣＯＡ４－ＲＥＴ遺伝子融合、及びＴＰＭ３－ＮＴＲＫ１遺伝子融合の少なくとも１つを含む。
【0075】
いくつかの実施形態では、病原性微生物は、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の少なくとも１つを含む。
【0076】
第７の態様において、本開示の実施例は、上記の実施例のいずれかの増幅プライマーを含む突然変異部位検出キットを提供する。
【0077】
第８の態様において、本開示の実施例は、上記の実施例のいずれかの増幅プライマーを含む染色体倍数性検出キットを提供する。
【0078】
第９の態様において、本開示の実施例は、上記の実施例のいずれかの増幅プライマーを含む遺伝子融合検出キットを提供する。
【0079】
第１０の態様において、本開示の実施例は、上記の実施例のいずれかの増幅プライマーを含む病原性微生物検出キットを提供する。
【0080】
第１１の態様において、上記実施例のいずれかの増幅プライマーを使用してＰＣＲ増幅を行い、それによって増幅産物の末端にＡを付加し、ＰＣＲ産物の末端へのＡの付加効率を向上させる工程を含むＴＡクローニング方法を提供する。
【実施例】
【0081】
実施例１： 実験手順と方法
（１） ＮＧＳ 関連実験
１． 従来の方法と本開示の方法を使用したマルチプレックスＰＣＲ 産物によるライブラリ構築。
（１） ＮＧＳ 関連実験
１． 従来の方法と本開示の方法を使用したマルチプレックスＰＣＲ 産物によるライブラリ構築。
【0082】
ＤＮＡのライブラリ構築プロセスは、図１及び図２に示す。
図１：Ａ．従来の方法を用いて高忠実度酵素でライブラリを構築する場合、ＰＣＲ反応後にＰＣＲ産物の５’末端リン酸化及びＡ付加が行われ、両端のＡ付加効率はわずか３０％～３７％であり、その後アダプターが連結される。Ｂ．本開示の方法を用いて高忠実度酵素でライブラリを構築する場合、ＰＣＲ反応後にＰＣＲ産物にＡが直接付加され、両端のＡ付加効率は６４％～７２％であり、その後アダプターが連結される。
図１：Ａ．従来の方法を用いて高忠実度酵素でライブラリを構築する場合、ＰＣＲ反応後にＰＣＲ産物の５’末端リン酸化及びＡ付加が行われ、両端のＡ付加効率はわずか３０％～３７％であり、その後アダプターが連結される。Ｂ．本開示の方法を用いて高忠実度酵素でライブラリを構築する場合、ＰＣＲ反応後にＰＣＲ産物にＡが直接付加され、両端のＡ付加効率は６４％～７２％であり、その後アダプターが連結される。
【0083】
図２：Ａ．従来の方法を用いて非高忠実度酵素でライブラリを構築する場合、ＰＣＲ反応後にＰＣＲ産物はＡ付加が行われ、両端のＡ付加効率はわずか３０％～３７％であり、その後５’末端がリン酸化され、アダプターが連結される。Ｂ．本開示の方法を用いて非高忠実度酵素でライブラリを構築する場合、ＰＣＲ反応後に、ＰＣＲ産物の３’末端にＡが既に付加され、５’末端でリン酸化が行われ、両端のＡ付加効率は６４％～７２％であり、アダプターを直接連結することができる。
【0084】
ＲＮＡのライブラリ構築プロセスは、図３及び図４に示す。
図３：Ａ．従来の方法を使用して高忠実度酵素でライブラリを構築する場合、ＰＣＲ反応を実行する前にｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次にＰＣＲ産物を５’末端リン酸化及びＡ付加が行われ、両端のＡ付加効率はわずか３０％～３７％であり、その後アダプターを連結する。Ｂ．本開示の方法を使用して高忠実度酵素でライブラリを構築する場合、ＰＣＲ反応を実行する前にｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次にＰＣＲ産物にＡを直接付加し、両端のＡ付加効率は６４％～７２％であり、その後アダプターを連結する。
図３：Ａ．従来の方法を使用して高忠実度酵素でライブラリを構築する場合、ＰＣＲ反応を実行する前にｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次にＰＣＲ産物を５’末端リン酸化及びＡ付加が行われ、両端のＡ付加効率はわずか３０％～３７％であり、その後アダプターを連結する。Ｂ．本開示の方法を使用して高忠実度酵素でライブラリを構築する場合、ＰＣＲ反応を実行する前にｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次にＰＣＲ産物にＡを直接付加し、両端のＡ付加効率は６４％～７２％であり、その後アダプターを連結する。
【0085】
図４：Ａ．従来の方法を用いて非高忠実度酵素でライブラリを構築する場合、ＰＣＲ反応を行う前にｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ＰＣＲ反応後にＰＣＲ産物はＡ付加が行われ、両端のＡ付加効率はわずか３０％～３７％であり、その後５’末端をリン酸化してアダプターを連結する。Ｂ．本開示の方法を用いて非高忠実度酵素でライブラリを構築する場合、ＰＣＲ反応を行う前にｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、ＰＣＲ反応後にＰＣＲ産物の３’末端にＡが既に付加され、５’末端でリン酸化が行われ、両端のＡ付加効率は６４％～７２％であり、アダプターを直接連結することができる。
【0086】
２．詳細な実験
１）サンプル採取：
血漿サンプル：全血をＥＤＴＡ採血管に採取し、室温で１時間以内に遠心分離して血漿を得た。遠心分離条件：１，５００ｇで１０分間遠心分離し、上清を吸引して収集し、次に１５，０００ｇで１０分間再度遠心分離した。上清を吸引して収集し、これが分離された血漿であった。
１）サンプル採取：
血漿サンプル：全血をＥＤＴＡ採血管に採取し、室温で１時間以内に遠心分離して血漿を得た。遠心分離条件：１，５００ｇで１０分間遠心分離し、上清を吸引して収集し、次に１５，０００ｇで１０分間再度遠心分離した。上清を吸引して収集し、これが分離された血漿であった。
【0087】
子宮頸部剥離細胞サンプル：子宮頸部剥離細胞サンプルをＴｈｉｎＰｒｅｐ子宮頸部剥離細胞保存液に採取し、４°Ｃで保存し、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を捨て、子宮頸部剥離細胞ペレットを得た。
【0088】
尿サンプル：朝の尿約１５～２５ｍＬを清潔で乾燥した使い捨て尿カップに採取し、５００ｇで１０分間遠心分離した。上清を捨て、尿路上皮細胞ペレットを得た。
【0089】
大腸がん組織サンプル：ＲＮＡｌａｔｅｒで保存した新鮮な大腸がん組織。
【0090】
２）サンプルＤＮＡの抽出及び濃度測定：
血漿ＤＮＡの抽出：血漿サンプルは、ＱＩＡＡＭＰ循環核酸キット （ＱＩＡＧＥＮ－５５１１４）を使用して抽出した。
血漿ＤＮＡの抽出：血漿サンプルは、ＱＩＡＡＭＰ循環核酸キット （ＱＩＡＧＥＮ－５５１１４）を使用して抽出した。
【0091】
子宮頸部剥離細胞からのｇＤＮＡの抽出：ＣＷＢｉｏ Ｂｌｏｏｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＣＷ２０８７Ｍ）を使用し、各サンプルの開始容量は２ｍＬであった。
【0092】
尿サンプルのＤＮＡの抽出：ＣＷＢｉｏ Ｂｌｏｏｄ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＣＷ２０８７Ｍ）を使用して、尿サンプルからＤＮＡを抽出した。
【0093】
大腸がん ＦＦＰＥ サンプルの抽出：ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、大腸がん組織からＤＮＡを抽出した。
【0094】
ＤＮＡの濃度はＱｕｂｉｔで測定した。
【0095】
３）ＰＣＲ標的濃縮：
ＰＣＲには、高忠実度及び非高忠実度のマルチプレックスＰＣＲ酵素をそれぞれ使用した。反応系及び条件は、マルチプレックス酵素の説明書に従った。
ＰＣＲには、高忠実度及び非高忠実度のマルチプレックスＰＣＲ酵素をそれぞれ使用した。反応系及び条件は、マルチプレックス酵素の説明書に従った。
【0096】
４）その後の反応：Ａ付加、リン酸化、ライゲーションなどの反応の詳細については、各実施例を参照のこと。
【0097】
５）ライブラリの濃度測定及び品質評価：
ライブラリ濃度はＱｕｂｉｔで測定し、使用した試薬はＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット、５００アッセイ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｑ３２８５４）であった。
ライブラリ濃度はＱｕｂｉｔで測定し、使用した試薬はＱｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳアッセイキット、５００アッセイ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｑ３２８５４）であった。
【0098】
ライブラリ品質管理：ＫＡＰＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標） Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ（ＫＫ４８２４）を使用してライブラリの有効率を評価した。
【0099】
６）ライブラリの品質検査：
高感度ＤＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ／５０６７－４６２６）を使用して得られたライブラリを２１００品質検査した。
高感度ＤＮＡキット（Ａｇｉｌｅｎｔ／５０６７－４６２６）を使用して得られたライブラリを２１００品質検査した。
【0100】
７）混合サンプルのマシンでのシーケンシング：
Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームのｎｅｘｔ５００またはｎｏｖａｓｅｑを使用してシーケンシングした。
Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームのｎｅｘｔ５００またはｎｏｖａｓｅｑを使用してシーケンシングした。
【0101】
８）オフマシンシーケンシングライブラリ分析：
試験データは、江蘇為真検出ソフトウェアと染色体異常分析ソフトウェアをそれぞれ使用して変異と倍数性について分析され、病原性染色体は為真の社内方法を使用して分析した。
試験データは、江蘇為真検出ソフトウェアと染色体異常分析ソフトウェアをそれぞれ使用して変異と倍数性について分析され、病原性染色体は為真の社内方法を使用して分析した。
【0102】
（２）ＴＡクローニング関連実験
ゼブラフィッシュのｐｕｒｇ遺伝子をＰＣＲ増幅し、産物をＴＡクローニングした。従来のプライマーとさまざまに修飾されたプライマーのＰＣＲ産物のＴＡクローニング効率を調べた。
ゼブラフィッシュのｐｕｒｇ遺伝子をＰＣＲ増幅し、産物をＴＡクローニングした。従来のプライマーとさまざまに修飾されたプライマーのＰＣＲ産物のＴＡクローニング効率を調べた。
【0103】
ゼブラフィッシュは蘇州木レイ生物科技有限公司から購入した。ＤＮＡ抽出はまず、切り分けた尾びれを組織ホモジェナイザーでホモジェナイズし、次にＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、カタログ番号：６９５８２）を使用してＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ濃度をＱｕｂｉｔで測定した。
【0104】
ＰＣＲ反応に使用したキットはＴａｋａｒａ ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオテック）であった。ＰＣＲ反応におけるＤＮＡテンプレートの量は５００ｎｇであり、取扱説明書に推奨されているＰＣＲ反応系および条件に従って増幅を行った。ＰＣＲ産物の精製および回収にはＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用した。２１００を使用して、ＰＣＲ断片のサイズが正しいかどうか、および二量体があるかどうかを確認した。二量体および非特異的増幅があった場合は、ＧｅｎＥｌｕｔｅＴＭゲル回収キット（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してゲル切断回収を行う必要がある。精製産物の濃度はＱｕｂｉｔを使用して決定した。
【0105】
ＴＡクローニングに使用したキットはＭｉｇｈｔｙ ＴＡ－ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオテック）であった。Ｔベクターと挿入するＰＣＲ産物を１：３のモル比で混合し、合計容量が５μＬになるようにした。次に、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｍｉｇｈｔｙ Ｍｉｘ ５ μＬ を加え、穏やかによく混ぜた。反応は１６°Ｃで３０分間行い、すべてを１００μＬのコンピテントセル（Ｅ． ｃｏｌｉ， ＤＨ５α）に加えて形質転換した。次に、細胞をＸ－Ｇａｌ、ＩＰＴＧ、Ａｍｐを含むＬ寒天プレートに塗布し、３７°Ｃで一晩培養した。コロニーを直接ＰＣＲにかけ、組み換え体を確認した。
【0106】
実施例２：ライブラリ有効率
表１の４種類のプライマーを用いてMRC-5細胞DNAを増幅し、異なるプライマーを用いたアンプリコンライブラリ構築のライブラリ有効率を検証した。
表１の４種類のプライマーを用いてMRC-5細胞DNAを増幅し、異なるプライマーを用いたアンプリコンライブラリ構築のライブラリ有効率を検証した。
【0107】
プライマー配列および修飾は表１７に示されており、４種類のプライマー、通常のプライマー（１）、５’末端がリン酸化されている通常のプライマーであるプライマー（２）、５’末端にＧが付加されている通常のプライマーであるプライマー（３）、および５’末端にＧが付加されリン酸化されている通常のプライマーであるプライマー（４）を含み、各種類のプライマープールの各プライマーの濃度は４００ｎＭであった。マルチプレックスＰＣＲＱＩＡＧＥＮマルチ酵素を使用して、以下のシステムでＰＣＲ反応を行った。プライマー混合物１０μＬを加え、テンプレート３０ｎｇを加え、取扱説明書に従って他の成分を加え、最終的に水で５０μＬにした。反応条件は取扱説明書に従って設定した。
生成物はＰＣＲ生成物精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製し、２０μＬで溶出した。塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ前増幅などの反応については、特許ＣＮ１０３２９８９５５Ｂを参照する。
生成物はＰＣＲ生成物精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製し、２０μＬで溶出した。塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ前増幅などの反応については、特許ＣＮ１０３２９８９５５Ｂを参照する。
【0108】
Ｑｕｂｉｔ ｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ、５００アッセイ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｑ３２８５４）およびＫＡＰＡライブラリ定量キットＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）プラットフォーム（ＫＫ４８２４）を使用して、異なるプライマーで構築されたライブラリの有効率を評価した。実際の有効濃度は、ＫＡＰＡライブラリ定量キットを使用して測定されたライブラリ濃度であった。ライブラリ有効率＝実際の有効濃度／ライブラリ濃度（Ｑｕｂｉｔ）。詳細は表１を参照。
【0109】
【表1】
【0110】
結果分析：４種類のプライマーで構築したライブラリのライブラリ濃度と有効率は正常であった。５’末端にＧが付加されリン酸化されているプライマーのライブラリ有効率は、５’末端にＧが付加されているプライマーのライブラリ有効率よりも優れていた。５’末端にＧが付加されているプライマーのライブラリ有効率は、５’末端がリン酸化されているプライマーのライブラリ有効率よりも優れていた。５’末端がリン酸化されているプライマーのライブラリ有効率は、通常のプライマーのライブラリ有効率よりも優れていた。
【0111】
実施例３：市販のｇＤＮＡリファレンスの部位の検出
Ｈｏｒｉｚｏｎの陽性リファレンスＨＤ７３４と陰性リファレンスＨＤ７５２（１００％野生型）を使用して、異なるプライマーを用いたライブラリ構築の検出効果を検証した。
Ｈｏｒｉｚｏｎの陽性リファレンスＨＤ７３４と陰性リファレンスＨＤ７５２（１００％野生型）を使用して、異なるプライマーを用いたライブラリ構築の検出効果を検証した。
【0112】
プライマー配列および修飾は表１７に示されており、４種類のプライマー、通常のプライマー（１）、５’末端がリン酸化されている通常のプライマーであるプライマー（２）、５’末端にＧが付加されている通常のプライマーであるプライマー（３）、および５’末端にＧが付加されリン酸化されている通常のプライマーであるプライマー（４）を含み、各種類のプライマープールの各プライマーの濃度は４００ｎＭであった。キット（Ｐｈｕｓｉｏｎ ＵマルチプレックスＰＣＲマスターミックス、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、次のようにＰＣＲ反応系でマルチプレックスＰＣＲ反応を行った。プライマー混合物１０μＬを加え、テンプレート３０ｎｇを加え、取扱説明書に従って他の成分を加え、最終的に水で５０μＬにした。反応条件は取扱説明書に従って設定した。生成物はＰＣＲ生成物精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製し、２０μＬで溶出した。最初のプライマーを使用して得られた生成物はリン酸化される必要があった。ＮＥＢのＴ４ ＰＮＫ酵素を使用し、反応系と条件は酵素の取扱説明書に従って設定した。生成物はＱＩＡＧＥＮキットで精製した。特許ＣＮ１０３２９８９５５Ｂを参照する。実験は１０回繰り返した。検出結果を表２に示す。
【0113】
【表2】
【0114】
結果分析：野生型リファレンスを検出したところ、４種類のプライマーを使用してもどの部位も検出されなかった。変異頻度が高い部位（ＡＦ≧８％）では、１０回の検出で４種類のプライマーすべてを検出することができた。低頻度部位（１％≦ＭＡＦ≦１．５％
）では、４つの低頻度部位で、通常のプライマーの検出率は５２．５％、５’末端がリン酸化されているプライマーの検出率は６５％、５’末端にＧが付加されているプライマーの検出率は８２．５％、５’末端にＧが付加されリン酸化されているプライマーの検出率は９７．５％であった。結果から、リン酸化修飾と比較して、５’末端にＧを付加することが低頻度検出により効果的であることがわかった。Ｇの付加に加えてリン酸化修飾を行った場合、効果はさらに良くなる。
）では、４つの低頻度部位で、通常のプライマーの検出率は５２．５％、５’末端がリン酸化されているプライマーの検出率は６５％、５’末端にＧが付加されているプライマーの検出率は８２．５％、５’末端にＧが付加されリン酸化されているプライマーの検出率は９７．５％であった。結果から、リン酸化修飾と比較して、５’末端にＧを付加することが低頻度検出により効果的であることがわかった。Ｇの付加に加えてリン酸化修飾を行った場合、効果はさらに良くなる。
【0115】
実施例４：市販のｃｆＤＮＡリファレンスの部位の検出
Ｈｏｒｉｚｏｎの陽性リファレンスＨＤ８１３と陰性リファレンスＨＤ８１５（１００％野生型）を使用して、異なるプライマーを用いたライブラリ構築の検出効果を検証した。
Ｈｏｒｉｚｏｎの陽性リファレンスＨＤ８１３と陰性リファレンスＨＤ８１５（１００％野生型）を使用して、異なるプライマーを用いたライブラリ構築の検出効果を検証した。
【0116】
プライマー配列及び修飾は表１７に示されており、４種類のプライマー、通常のプライマー（１）、５’末端がリン酸化されている通常のプライマーであるプライマー（２）、５’末端にＧが付加されている通常のプライマーであるプライマー（３）、および５’末端にＧが付加されリン酸化されている通常のプライマーであるプライマー（４）を含み、各種類のプライマープールの各プライマーの濃度は４００ｎＭであった。キット（Ｐｈｕｓｉｏｎ ＵマルチプレックスＰＣＲマスターミックス、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、次のようにＰＣＲ反応系マルチプレックスＰＣＲ反応を行った。プライマー混合物１０μＬを加え、テンプレート３０ｎｇを加え、取扱説明書に従って他の成分を加え、最終的に水で５０μＬにした。反応条件は取扱説明書に従って設定した。生成物はＰＣＲ生成物精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製し、２０μＬで溶出した。最初のプライマーを使用して得られた生成物はリン酸化される必要があった。ＮＥＢのＴ４ ＰＮＫ酵素を使用し、反応系と条件は酵素の取扱説明書に従って設定した。生成物はＱＩＡＧＥＮキットで精製した。特許ＣＮ１０３２９８９５５Ｂを参照する。実験は１０回繰り返した。検出結果を表３に示す。
【0117】
【表3】
【0118】
結果分析：野生型リファレンスを検出したところ、４種類のプライマーを使用しても、どの部位も検出されなかった。１％≦ＭＡＦ≦１．５％の部位では、通常のプライマーの検出率は５３．８％、５’末端がリン酸化されているプライマーの検出率は６３．８％、５’末端にＧが付加されているプライマーの検出率は８１．３％、５’末端にＧが付加されリン酸化されているプライマーの検出率は９７．５％であった。プライマー１と２を比較すると、５’末端のリン酸化は低頻度部位の検出に有益であることがわかる。プライマー２とプライマー３を比較すると、５’末端にＧを付加することが低頻度部位の検出に有益であることがわかる。総合的に比較すると、５’末端にＧを付加することとリン酸化とを組み合わせることで、低頻度変異の検出に効果的であった。
【0119】
実施例５：自作リファレンスｇＤＮＡの部位検出
複数の細胞株をブレンドして、複数の変異部位を含むリファレンスＡを調製した。各部位の変異頻度を表２に示す。実施例２の４種類のプライマーを検出に使用した。マルチプレックスＰＣＲ法は実施例２と同じであった。第１プライマーを使用して得られた産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴ４ ＰＮＫキットを使用してリン酸化した後、ＱＩＡＧＥＮキットを使用して精製した。塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ前増幅
などの反応については、特許ＣＮ１０８２５１５１５Ａを参照する。実験は１０回繰り返した。検出結果を表４に示す。
複数の細胞株をブレンドして、複数の変異部位を含むリファレンスＡを調製した。各部位の変異頻度を表２に示す。実施例２の４種類のプライマーを検出に使用した。マルチプレックスＰＣＲ法は実施例２と同じであった。第１プライマーを使用して得られた産物を、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴ４ ＰＮＫキットを使用してリン酸化した後、ＱＩＡＧＥＮキットを使用して精製した。塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ前増幅
などの反応については、特許ＣＮ１０８２５１５１５Ａを参照する。実験は１０回繰り返した。検出結果を表４に示す。
【0120】
結果分析：野生型リファレンスを検出したところ、４種類のプライマーを使用しても、どの部位も検出されなかった。２％≦ＭＡＦ≦５％の部位では、通常のプライマーの検出率は８５％、５’末端リン酸化されているプライマーの検出率は８８．３％、５’末端にＧが付加されたプライマーの検出率は９０％、５’末端にＧが付加されリン酸化されているプライマーの検出率は１００％であった。０．５％≦ＭＡＦ≦１％の部位では、通常のプライマーの検出率は５８．６％、５’末端リン酸化されているプライマーの検出率は７１．４％、５’末端にＧが付加されているプライマーの検出率は８２．１％、プライマー４の検出率は９３．６％であった。総合的に比較すると、５’末端にＧを付加することとリン酸化とを組み合わせることで、低頻度変異の検出に効果的であった。
【0121】
【表4】
【0122】
実施例６：自作リファレンスｃｆＤＮＡの部位検出
抽出した細胞株ＤＮＡを超音波で約１７０ｂｐに断片化した。２１００品質検査に合格した後、複数の細胞株をブレンドして複数の変異部位を含むリファレンスＢを調製した。各部位の変異頻度を表２に示す。検出には実施例２の４種類のプライマーを使用した。マルチプレックスＰＣＲ法は実施例２と同じであった。第１プライマーを使用して得られた産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴ４ ＰＮＫキットを使用してリン酸化した後、ＱＩＡＧＥＮキットを使用して精製した。塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ前増幅などの反応については、特許ＣＮ１０８２５１５１５Ａを参照する。実験は１０回繰り返した。検出結果を表５に示す。
抽出した細胞株ＤＮＡを超音波で約１７０ｂｐに断片化した。２１００品質検査に合格した後、複数の細胞株をブレンドして複数の変異部位を含むリファレンスＢを調製した。各部位の変異頻度を表２に示す。検出には実施例２の４種類のプライマーを使用した。マルチプレックスＰＣＲ法は実施例２と同じであった。第１プライマーを使用して得られた産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴ４ ＰＮＫキットを使用してリン酸化した後、ＱＩＡＧＥＮキットを使用して精製した。塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ前増幅などの反応については、特許ＣＮ１０８２５１５１５Ａを参照する。実験は１０回繰り返した。検出結果を表５に示す。
【0123】
結果分析：野生型リファレンスを検出したところ、４種類のプライマーを使用しても、いずれの部位も検出されなかった。２％≦ＭＡＦ≦５％の部位では、プライマー１の検出率は５２／６０＝８６．７％、プライマー２の検出率は５６／６０＝９３．３％、プライマー３の検出率は９５％、プライマー４の検出率は９８．３３％であった。０．５％≦ＭＡＦ≦１％の部位では、プライマー１の検出率は４９．３％、プライマー２の検出率は５７．１％、プライマー３の検出率は７０％、プライマー４の検出率は８４．３％であった。総合的に比較すると、プライマー４（５’末端にＧを付加することとリン酸化とを組み合わせたもの）の方が、低頻度変異の検出により有利である。
【0124】
【表5】
【0125】
実施例７：ヌクレオソームにおける部位の検出
ＥｐｉＳｃｏｐｅ（登録商標） Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ５３３３）を使用してヌクレオソームを調製した。複数の細胞株から調製したヌクレオソームをブレンドして、複数の変異部位を含む参照Ｃを調製した。各部位の変異頻度を表２に示す。検出には実施例２の４種類のプライマーを使用した。マルチプレックスＰＣＲ法は実施例２と同じであった。第１のプライマーを使用して得られた産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴ４ ＰＮＫキットを使用してリン酸化した後、ＱＩＡＧＥＮキットを使用して精製した。塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ前増幅などの反応については、特許ＣＮ１０８２５１５１５Ａを参照する。実験は１０回繰り返した。検出結果を表６に示す。
ＥｐｉＳｃｏｐｅ（登録商標） Ｎｕｃｌｅｏｓｏｍｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｃｏｄｅ Ｎｏ． ５３３３）を使用してヌクレオソームを調製した。複数の細胞株から調製したヌクレオソームをブレンドして、複数の変異部位を含む参照Ｃを調製した。各部位の変異頻度を表２に示す。検出には実施例２の４種類のプライマーを使用した。マルチプレックスＰＣＲ法は実施例２と同じであった。第１のプライマーを使用して得られた産物をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＴ４ ＰＮＫキットを使用してリン酸化した後、ＱＩＡＧＥＮキットを使用して精製した。塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ前増幅などの反応については、特許ＣＮ１０８２５１５１５Ａを参照する。実験は１０回繰り返した。検出結果を表６に示す。
【0126】
結果分析：野生型リファレンスを検出したところ、４種類のプライマーを使用しても、いずれの部位も検出されなかった。２％≦ＭＡＦ≦５％の部位では、プライマー１の検出率は８６．７％、プライマー２の検出率は９３．３％、プライマー３の検出率は９５％、
プライマー４の検出率は９８．３％でした。０．５％≦ＭＡＦ≦１％の部位では、プライマー１の検出率は５０．７％、プライマー２の検出率は６２．１％、プライマー３の検出率は７５％、プライマー４の検出率は８６．４％であった。総合的に比較すると、プライマー４（５’末端にＧを付加することとリン酸化とを組み合わせたもの）の方が、低頻度変異の検出により有利である。
プライマー４の検出率は９８．３％でした。０．５％≦ＭＡＦ≦１％の部位では、プライマー１の検出率は５０．７％、プライマー２の検出率は６２．１％、プライマー３の検出率は７５％、プライマー４の検出率は８６．４％であった。総合的に比較すると、プライマー４（５’末端にＧを付加することとリン酸化とを組み合わせたもの）の方が、低頻度変異の検出により有利である。
【0127】
【表6】
【0128】
実施例８：腸がん血漿サンプルにおける部位検出
腸がん患者２１例の血漿サンプルと健常者１０例の血漿サンプルを採取した。ＤＮＡを抽出し、表１７の４種類のプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。マルチプレックスＰＣＲ増幅は、Ｖａｚｙｍｅマルチプレックス酵素を用いて行い、ＰＣＲ産物はＫＡＰＡライブラリ構築キットを用い、塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ前増幅などの実験を行った。検出結果を表７に示す。
腸がん患者２１例の血漿サンプルと健常者１０例の血漿サンプルを採取した。ＤＮＡを抽出し、表１７の４種類のプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。マルチプレックスＰＣＲ増幅は、Ｖａｚｙｍｅマルチプレックス酵素を用いて行い、ＰＣＲ産物はＫＡＰＡライブラリ構築キットを用い、塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ前増幅などの実験を行った。検出結果を表７に示す。
【0129】
【表7】
【0130】
４種類のプライマーを用いた検出では、健常者全員が陰性であった。ＣＲＣ検出では、通常のプライマーを用いてアンプリコンライブラリを構築した場合、８検体で検出され（すべて単一部位検出）、検出率は３８．１％であった。５’末端をリン酸化させたプライ
マーを用いた場合、９検体で検出され（すべて単一部位検出）、検出率は４２．９％であった。５’末端にＧを付加したプライマーを用いた場合、１５検体で検出され（２検体で二重部位検出）、検出率は７１．４％であった。５’末端にＧを付加しリン酸化させたプライマーを用いた場合、１６検体で検出され（６検体で二重部位検出）、検出率は７６．２％であった。プライマーの５’末端にＧを付加することで、検出率が大幅に向上することがわかった。Ｇをリン酸化と組み合わせて付加すると、検出はより安定するである
マーを用いた場合、９検体で検出され（すべて単一部位検出）、検出率は４２．９％であった。５’末端にＧを付加したプライマーを用いた場合、１５検体で検出され（２検体で二重部位検出）、検出率は７１．４％であった。５’末端にＧを付加しリン酸化させたプライマーを用いた場合、１６検体で検出され（６検体で二重部位検出）、検出率は７６．２％であった。プライマーの５’末端にＧを付加することで、検出率が大幅に向上することがわかった。Ｇをリン酸化と組み合わせて付加すると、検出はより安定するである
【0131】
実施例９：子宮頸部剥離細胞サンプルにおける部位の検出
病理学的情報が明らかな子宮頸がん１５例、ＣＩＮ３ ５例、ＣＩＮ２ ５例、ＣＩＮ１ ５例を含む子宮頸部剥離細胞サンプルを採取し、表１７の４種類のプライマーを使用して、これら３０サンプルに対してマルチプレックスＰＣＲを実施した。マルチプレックスＰＣＲ増幅は、Ｖａｚｙｍｅマルチプレックス酵素を使用して実施し、ＰＣＲ産物は、ＮＥＢライブラリ構築キットを使用して、塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ前増幅などの実験を行った。検出結果を表８に示す。
病理学的情報が明らかな子宮頸がん１５例、ＣＩＮ３ ５例、ＣＩＮ２ ５例、ＣＩＮ１ ５例を含む子宮頸部剥離細胞サンプルを採取し、表１７の４種類のプライマーを使用して、これら３０サンプルに対してマルチプレックスＰＣＲを実施した。マルチプレックスＰＣＲ増幅は、Ｖａｚｙｍｅマルチプレックス酵素を使用して実施し、ＰＣＲ産物は、ＮＥＢライブラリ構築キットを使用して、塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ前増幅などの実験を行った。検出結果を表８に示す。
【0132】
【表8】
【0133】
子宮頸がんサンプルのライブラリにおいて、プライマー１の検出率は９／１５＝６０％であり、プライマー２でライブラリを構築した場合の子宮頸がんの検出率は１０／１５＝６６．７％であった。プライマー３の検出率は１３／１５＝８６．７％であり、プライマー４でライブラリを構築した場合の子宮頸がんの検出率は１５／１５＝１００％であった。ＣＩＮ３では、プライマー１の検出率は０／５＝０％、プライマー２の検出率は２／５＝４０％であり、プライマー３の検出率は３／５＝６０％であり、プライマー４の検出率は４／５＝８０％であった。ＣＩＮ２では、プライマー１の検出率は０／５＝０％、プライマー２の検出率は１／５＝２０％であった。プライマー３で構築したライブラリの検出率は２／５＝４０％、プライマー４の検出率は３／５＝６０％であった。４種類のプライマーで構築したライブラリを用いたＣＩＮ１サンプルでは部位が検出されなかった。プライマー４（５’末端にＧを付加することとリン酸化とを組み合わせたもの）は、より多くの染色体異常を検出することができた。
【0134】
実施例１０：尿サンプルにおける部位の検出
尿路上皮がん患者の尿サンプル２０個と健常者の尿サンプル１０個を採取した。ＤＮＡを抽出し、４種類のプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。マルチプレックスＰＣＲにはサーモフィッシャー試薬を使用し、ＰＣＲ産物は、Ｖａｚｙｍｅライブラリ構築キットを用いて、塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ増幅などの実験を行った。検出結果を表９に示す。
尿路上皮がん患者の尿サンプル２０個と健常者の尿サンプル１０個を採取した。ＤＮＡを抽出し、４種類のプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。マルチプレックスＰＣＲにはサーモフィッシャー試薬を使用し、ＰＣＲ産物は、Ｖａｚｙｍｅライブラリ構築キットを用いて、塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、ライブラリ増幅などの実験を行った。検出結果を表９に示す。
【0135】
【表9】
【0136】
健常者では全例陰性であった。尿路上皮がんサンプルでの検出では、通常のプライマーを用いてアンプリコンライブラリを構築した場合の検出率は７／２０＝３５％、５’末端をリン酸化させたプライマーを用いてアンプリコンライブラリを構築した場合の検出率は１０／２０＝５０％、５’末端にＧを付加したプライマーを用いてアンプリコンライブラリを構築した場合の検出率は１３／２０＝６５％、５’末端にＧを付加しリン酸化させたプライマーを用いてアンプリコンライブラリを構築した場合の検出率は１６／２０＝８０％となり、最も良好な検出効果を示した。
【0137】
実施例１１：倍数性検出限界
ＦＩＳＨで確認された５番染色体の６コピーを持つ陽性細胞株リファレンスＨｅｌａ細胞を、２コピーを持つ陰性細胞株とを異なる割合で混合し、異なるコピー数のリファレンスを得た。詳細については、表１０を参照してください。増幅には、表１８の４種類のプライマーをそれぞれ使用し、増幅にはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒのマルチプレックス高忠実度酵素を使用した。アンプリコンの塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、およびライブラリ前増幅の実験については、特許ＣＮ１０３２９８９５５Ｂを参照する。検出結果を表１０に示す。
ＦＩＳＨで確認された５番染色体の６コピーを持つ陽性細胞株リファレンスＨｅｌａ細胞を、２コピーを持つ陰性細胞株とを異なる割合で混合し、異なるコピー数のリファレンスを得た。詳細については、表１０を参照してください。増幅には、表１８の４種類のプライマーをそれぞれ使用し、増幅にはＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒのマルチプレックス高忠実度酵素を使用した。アンプリコンの塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、およびライブラリ前増幅の実験については、特許ＣＮ１０３２９８９５５Ｂを参照する。検出結果を表１０に示す。
【0138】
【表10】
【0139】
二重試験の結果、通常のプライマーによる増幅では、最低検出限界が２．８コピーで倍数性が安定して検出できた。５’末端がリン酸化されているプライマーの最低検出限界は２．４コピーであった。５’末端にＧが付加されているプライマーによる増幅では、最低検出限界は２．２コピーであった。５’末端にＧが付加されリン酸化されているプライマーによる増幅では、最低検出限界は２．０４コピーであり、最高の検出効果を示した（
は５番染色体が陽性として検出されたことを示し、×は５番染色体が検出されなかったことを示す）。
【0140】
実施例１２：腸がんＦＦＰＥサンプルにおける倍数性の検出
病理学的情報が明らかな腸がんのＦＦＰＥサンプル２０個を採取した。表１８の４種類のプライマーを用いて増幅を行った。ＰＣＲにはＫＡＰＡ高忠実度酵素を使用し、産物はＫＡＰＡライブラリ構築キットを使用して塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、およびライブラリ前増幅実験を行った。染色体異常を調べた。結果を表１１に示す。
病理学的情報が明らかな腸がんのＦＦＰＥサンプル２０個を採取した。表１８の４種類のプライマーを用いて増幅を行った。ＰＣＲにはＫＡＰＡ高忠実度酵素を使用し、産物はＫＡＰＡライブラリ構築キットを使用して塩基Ａ付加、アダプターライゲーション、およびライブラリ前増幅実験を行った。染色体異常を調べた。結果を表１１に示す。
【0141】
【表11】
【0142】
腸がんＦＦＰＥサンプルの検出において、プライマー１を用いてアンプリコンライブラリ構築を行った場合の染色体倍数性変化の検出率は１１／２５＝４４％、プライマー２を用いてアンプリコンライブラリ構築を行った場合の染色体倍数性変化の検出率は１４／２５＝５６％、プライマー３を用いてアンプリコンライブラリ構築を行った場合の染色体倍数性変化の検出率は１７／２５＝６８％、プライマー４を用いてアンプリコンライブラリ構築を行った場合の染色体倍数性変化の検出率は２２／２５＝８８％であり、プライマー４を用いてアンプリコンライブラリ構築を行った場合の方がより多くの染色体異常を検出できた。
【0143】
実施例１３ 子宮頸部剥離細胞サンプルにおける倍数性の検出
病理学的情報が明らかな子宮頸部剥離細胞サンプルを収集した。子宮頸癌１５例、ＣＩＮ３ ５例、ＣＩＮ２ ５例、ＣＩＮ１ ５例である。これらの３０サンプルを異なる方法に供して倍数性ライブラリを構築した。配列表２の４種類のプライマーを使用した。増幅はＱＩＡＧＥＮマルチプレックス酵素（産物にＡを添加する必要はない）によって行い、アダプターライゲーションおよびライブラリ前増幅にはＫＡＰＡライブラリ構築キットを使用した。検出結果は表１２を参照のこと。
病理学的情報が明らかな子宮頸部剥離細胞サンプルを収集した。子宮頸癌１５例、ＣＩＮ３ ５例、ＣＩＮ２ ５例、ＣＩＮ１ ５例である。これらの３０サンプルを異なる方法に供して倍数性ライブラリを構築した。配列表２の４種類のプライマーを使用した。増幅はＱＩＡＧＥＮマルチプレックス酵素（産物にＡを添加する必要はない）によって行い、アダプターライゲーションおよびライブラリ前増幅にはＫＡＰＡライブラリ構築キットを使用した。検出結果は表１２を参照のこと。
【0144】
【表12】
【0145】
結果分析：子宮頸がんサンプルのライブラリにおいて、プライマー１の検出率は８／１５＝５３．５％であり、プライマー２を用いてアンプリコンライブラリを構築した場合の子宮頸がんの検出率は１０／１５＝６６．７％であった。プライマー３の検出率は１３／１５＝８６．７％であり、プライマー４を用いてアンプリコンライブラリを構築した場合の子宮頸がんの検出率は１５／１５＝１００％であった。ＣＩＮ３では、プライマー１の検出率は０／５＝０％、プライマー２の検出率は２／５＝４０％、プライマー３の検出率は３／５＝６０％、プライマー４の検出率は４／５＝８０％であった。
【0146】
ＣＩＮ２ではプライマー１の検出率は０／５＝０％、プライマー２の検出率は１／５＝２０％、プライマー３で構築したライブラリの検出率は２／５＝４０％、プライマー４の検出率は３／５＝６０％であった。４種類のプライマーで構築したライブラリを使用したＣＩＮ１サンプルでは、部位が検出されなかった。プライマー４（５’末端にＧを付加することとリン酸化とを組み合わせたもの）は、より多くの染色体異常を検出できた。
【0147】
実施例１４ 尿路上皮がんサンプルにおける倍数性の検出
病理情報が明らかな尿路上皮がんサンプル２０例を収集し、異なる方法に供して倍数性ライブラリを構築した。表１８の４種類のプライマーを使用した。ＰＣＲ酵素はＫＡＰＡのマルチプレックス酵素（産物にＡを添加する必要はない）を使用し、アダプターライゲーションとライブラリ前増幅にはＮＥＢライブラリ構築キットを使用した。検出結果を表１３に示す。
病理情報が明らかな尿路上皮がんサンプル２０例を収集し、異なる方法に供して倍数性ライブラリを構築した。表１８の４種類のプライマーを使用した。ＰＣＲ酵素はＫＡＰＡのマルチプレックス酵素（産物にＡを添加する必要はない）を使用し、アダプターライゲーションとライブラリ前増幅にはＮＥＢライブラリ構築キットを使用した。検出結果を表１３に示す。
【0148】
【表13】
【0149】
結果分析：尿路上皮がんサンプルのライブラリにおいて、プライマー１を用いてアンプリコンライブラリ構築を行った場合の染色体倍数性変化の検出率は１４／２５＝５６％であった。プライマー２を用いてアンプリコンライブラリ構築を行った場合の染色体倍数性変化の検出率は１８／２５＝７２％であった。プライマー３を用いてアンプリコンライブラリ構築を行った場合の染色体倍数性変化の検出率は２１／２５＝８４％であった。プライマー４を用いてアンプリコンライブラリ構築を行った場合の染色体倍数性変化の検出率は２３／２５＝９２％であった。プライマー４を用いたアンプリコンライブラリ構築により、より多くの染色体異常が検出される可能性がある。
【0150】
実施例１５：ＲＮＡ融合検出
ＲＮＡ融合リファレンス：Ｓｅｒａｓｅｑ（登録商標） Ｆｕｓｉｏｎ ＲＮＡ Ｍｉｘ ｖ４を、遺伝的背景が確認された野生型（融合陰性）細胞株ＧＭ１２８７８ ＲＮＡと２５ ｎｇ／μＬの濃度で異なる容量で混合し、表１９の４つの異なる修飾プライマーを使用したライブラリ構築方法の検出下限を調査した。ＲＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＶＩＬＯＴＭ ｃＤＮＡ合成キットを使用して逆転写し、ｃＤＮＡ精製にはＱＩＡＧＥＮキットを使用した。ＱＩＡＧＥＮマルチプレックス酵素をマルチプレックスＰＣＲに使用し（産物にＡを添加する必要はない）、Ｖａｚｙｍｅライブラリ構築キットをアダプターライゲーションおよびライブラリ前増幅に使用した。各融合タイプを異なる混合比で１０回検出した。検出結果を表１４に示す。
ＲＮＡ融合リファレンス：Ｓｅｒａｓｅｑ（登録商標） Ｆｕｓｉｏｎ ＲＮＡ Ｍｉｘ ｖ４を、遺伝的背景が確認された野生型（融合陰性）細胞株ＧＭ１２８７８ ＲＮＡと２５ ｎｇ／μＬの濃度で異なる容量で混合し、表１９の４つの異なる修飾プライマーを使用したライブラリ構築方法の検出下限を調査した。ＲＮＡはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＶＩＬＯＴＭ ｃＤＮＡ合成キットを使用して逆転写し、ｃＤＮＡ精製にはＱＩＡＧＥＮキットを使用した。ＱＩＡＧＥＮマルチプレックス酵素をマルチプレックスＰＣＲに使用し（産物にＡを添加する必要はない）、Ｖａｚｙｍｅライブラリ構築キットをアダプターライゲーションおよびライブラリ前増幅に使用した。各融合タイプを異なる混合比で１０回検出した。検出結果を表１４に示す。
【0151】
【表14】
【0152】
結果分析：５種類の融合タイプの検出を行った。混合濃度が０％の場合、両方の方法で実質的に検出されなかった。混合濃度が１０％の場合、プライマー１の累積検出率は９４％であった。プライマー２の累積検出率は９７．３％、プライマー３の累積検出率は９８．７％、プライマー４の累積検出率は１００％であった。混合濃度５％の場合、プライマー１の累積検出率は８７．３％、プライマー２の累積検出率は９１．３％、プライマー３の累積検出率は９５．３％、プライマー４の累積検出率は１００％であった。２．５％の混合濃度の場合、プライマー１の累積検出率は６１．３％、プライマー２の累積検出率は６７．３％、プライマー３の累積検出率は７８．７％、プライマー４の累積検出率は９２％であった。１．２５％の混合濃度の場合、プライマー１の累積検出率は４２．７％、プライマー２の検出率は５２．６％、プライマー３の累積検出率は６７．３％、プライマー４の累積検出率は８１．３％であった。以上の結果から、低頻度融合を検出する場合、プライマー４の効果がプライマー１よりも優れていることがわかった。
【0153】
実施例１６ 病原微生物の検出
検出対象のアンプリコン領域を、Ｔ７プロモーターを含む同じプラスミドに組み込み、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行った後、ＲＮＡリファレンスを得た。標的断片のサイズと濃度は２１００で検出され、その後コピー数の濃度に変換した。異なるコピー数のリファレンスを使用して、異なる修飾プライマーのアンプリコンの検出能力を評価した。逆転写はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素を使用して実行され、ｃＤＮＡ精製にはＱＩＡＧＥＮキットを使用した。マルチプレックスＰＣＲは、表２０の４種類のプライマーでそれぞれ実行され、マルチプレックスＰＣＲにはＫＡＰＡマルチプレックス酵素が使用され（産物にＡを添加する必要はなく）、アダプターライゲーションとライブラリ前増幅にはＮＥＢライブラリ構築キットを使用した。異なるコピー数で１０回検出した。検出結果を表１５に示します。
検出対象のアンプリコン領域を、Ｔ７プロモーターを含む同じプラスミドに組み込み、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行った後、ＲＮＡリファレンスを得た。標的断片のサイズと濃度は２１００で検出され、その後コピー数の濃度に変換した。異なるコピー数のリファレンスを使用して、異なる修飾プライマーのアンプリコンの検出能力を評価した。逆転写はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素を使用して実行され、ｃＤＮＡ精製にはＱＩＡＧＥＮキットを使用した。マルチプレックスＰＣＲは、表２０の４種類のプライマーでそれぞれ実行され、マルチプレックスＰＣＲにはＫＡＰＡマルチプレックス酵素が使用され（産物にＡを添加する必要はなく）、アダプターライゲーションとライブラリ前増幅にはＮＥＢライブラリ構築キットを使用した。異なるコピー数で１０回検出した。検出結果を表１５に示します。
【0154】
【表15】
【0155】
結果分析：異なるコピー数の３種の病原微生物の検出能力（逆転写反応）を調べたところ、コピー数１０の場合、１０回の試験すべてで検出可能であった。コピー数５の場合、プライマー１の検出率は９３．３％、プライマー２の検出率は９６．７％、プライマー３の検出率は９６．７％、プライマー４の検出率は１００％であった。コピー数２．５の場合、プライマー１の検出率は６６．７％、プライマー２の検出率は７６．７％、プライマ
ー３の検出率は８６．７％、プライマー４の検出率は９６．７％であった。コピー数０の場合、２つのプライマーが陰性であった。プライマー４による低濃度病原微生物の検出はプライマー１よりも優れた効果を示した。
ー３の検出率は８６．７％、プライマー４の検出率は９６．７％であった。コピー数０の場合、２つのプライマーが陰性であった。プライマー４による低濃度病原微生物の検出はプライマー１よりも優れた効果を示した。
【0156】
実施例１７：異なるプライマーによるＰＣＲ産物のＴＡクローニング効率の比較
表２１に示すように異なる方法で合成したプライマーを使用して、ゼブラフィッシュのｐｕｒｇ遺伝子のプロモーター領域を増幅した。プライマーの種類ごとに３つのＴＡクローンを並行して試験した。実施例１の方法に従ってＰＣＲ産物をＴＡクローニングした。白斑数（挿入の確認）およびクローニング効率（白斑率）を以下の表１６に詳述する。
表２１に示すように異なる方法で合成したプライマーを使用して、ゼブラフィッシュのｐｕｒｇ遺伝子のプロモーター領域を増幅した。プライマーの種類ごとに３つのＴＡクローンを並行して試験した。実施例１の方法に従ってＰＣＲ産物をＴＡクローニングした。白斑数（挿入の確認）およびクローニング効率（白斑率）を以下の表１６に詳述する。
【0157】
【表16】
【0158】
結果分析：通常のプライマーは、白斑の数とクローニング効率に最も悪い影響を与え、５’末端にＧを付加し、リン酸化したプライマーは最も良い影響を与えた。実験中の他のすべての制御条件（トランスフェクション、プレーティング、培養条件など）は同じであり、唯一の変数は異なるプライマーであったため、５’末端にＧを付加し、リン酸化したプライマーを使用した産物は、ＴＡライゲーション効率が高いことが示された。
【0159】
各実施例で使用したプライマーは、具体的には以下のとおりである。
【表17】
【0160】
【表18】
【0161】
【表19】
【0162】
【表20】
【0163】
【表21】
【0164】
上述の実施例の技術的特徴の各々は、任意に組み合わせることができる。説明を簡略化するために、上述の実施例の技術的特徴の各々の可能な組み合わせの全てを記載したわけではない。しかし、これらの技術的特徴の全ての組み合わせは、そのような組み合わせが互いに矛盾しない限り、本開示の範囲内であるとみなされるべきである。
【0165】
上述の実施例は、本開示の技術的解決策の具体的かつ詳細な理解を容易にする本開示のいくつかの実施形態を例示しているに過ぎず、本開示の保護範囲を制限するものではない。本開示の概念から逸脱することなく、当業者によって複数の変形および修正が行われる可能性があり、それらはすべて本開示の保護範囲内にあることに留意すべきである。したがって、本開示の保護範囲は、添付の特許請求の範囲に基づくものとし、明細書は特許請求の範囲の内容を解釈するために説明を使用することができる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【手続補正書】
【提出日】2024-07-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
シーケンシングライブラリ構築用の増幅プライマーであって、標的断片に相補的なプライマー配列断片と、前記プライマー配列断片の５’末端に連結された塩基Ｇとを含み、前記増幅プライマーと前記標的断片は前記塩基Ｇにおいて相補的ではない、増幅プライマー。
【請求項2】
前記塩基Ｇは前記プライマー配列断片の５’末端に直接連結される、請求項１に記載の増幅プライマー。
【請求項3】
前記塩基Ｇはリン酸化によって修飾された塩基である、請求項１又は請求項２に記載の増幅プライマー。
【請求項4】
シーケンシングライブラリ構築用のキットの作製における請求項１に記載の増幅プライマーの使用。
【請求項5】
シーケンシングライブラリの構築方法であって、デオキシリボ核酸の増幅及びライブラリ構築を実行するために使用されるプライマー配列断片を提供し、前記プライマー配列断片は標的断片と相補的であり、
前記プライマー配列断片に対して処理を行って、５’末端に塩基Ｇを有する増幅プライマーを得ることを含み、
ここで、前記処理は、
前記プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧでない場合は、前記プライマー配列断片の５’末端に塩基Ｇを連結すること、又は前記プライマー配列断片の５’末端の塩基がＧである場合は、前記プライマー配列断片の５’末端に塩基Ｇを連結するか又は連結しないこと、
前記増幅プライマーを使用して前記デオキシリボ核酸に対してサイクリック増幅を行い、
３’末端に塩基Ｃを有する増幅断片を得ること、
前記増幅断片の３’末端に塩基Ａを付加すること、及び、
３’末端に塩基Ａが付加された増幅断片にＴ粘着末端を含むアダプターを連結し、前記アダプターはシーケンシングプラットフォームに必要な配列を含むこと、
を含む方法。
【請求項6】
前記デオキシリボ核酸の増幅を行う前に、前記増幅プライマーの５’末端の塩基Ｇをリン酸化することをさらに含む、請求項５に記載のシーケンシングライブラリの構築方法。
【請求項7】
前記デオキシリボ核酸は、サンプルＤＮＡ、サンプルプラスミド、及びサンプルＲＮＡの逆転写によって得られたデオキシリボ核酸からなる群から選択される、請求項５又は請求項６に記載のシーケンシングライブラリの構築方法。
【請求項8】
請求項５に記載のシーケンシングライブラリの構築方法によって構築されたシーケンシングライブラリ。
【請求項9】
請求項１に記載の増幅プライマーを含む、シーケンシングライブラリ構築用のキット。
【請求項10】
塩基Ａを添加するための試薬、アダプターを添加するための試薬、ＰＣＲ増幅用試薬、及び精製用試薬のうち少なくとも１つをさらに含む、請求項９に記載のキット。
【請求項11】
請求項５に記載のシーケンシングライブラリの構築方法を使用してサンプルのシーケンシングライブラリを構築し、シーケンシングを行うことを含む、シーケンシング方法。
【請求項12】
前記サンプルに対して変異部位検出、染色体倍数性検出、遺伝子融合検出、及び病原性微生物検出のうちのいずれか１つを行うために使用される、請求項１１に記載のシーケンシング方法。
【請求項13】
前記変異部位検出は、腸がん変異部位、子宮頸がん変異部位、及び尿路上皮がん変異部位のうち少なくとも１つを含む、請求項１２に記載のシーケンシング方法。
【請求項14】
前記染色体倍数性は、腸がんの染色体倍数性、子宮頸がんの染色体倍数性、及び尿路上皮がんの染色体倍数性のうちの少なくとも1つを含む、請求項１２に記載のシーケンシング方法。
【請求項15】
前記遺伝子融合は、ＥＭＬ４－ＡＬＫ遺伝子融合、ＣＤ７４－ＲＯＳＩ遺伝子融合、ＣＣＤＣ６－ＲＥＴ遺伝子融合、ＮＣＯＡ４－ＲＥＴ遺伝子融合、及びＴＰＭ３－ＮＴＲＫ１遺伝子融合のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載のシーケンシング方法。
【請求項16】
前記病原性微生物は、インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス、及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載のシーケンシング方法。
【請求項17】
前記シーケンシングはハイスループットシーケンシングである、請求項１１乃至請求項１６のいずれか一項に記載のシーケンシング方法。
【請求項18】
請求項１に記載の増幅プライマーを含む、変異部位検出キット。
【請求項19】
請求項１に記載の増幅プライマーを含む、染色体倍数性検出キット。
【請求項20】
請求項１に記載の増幅プライマーを含む、遺伝子融合検出キット。
【請求項21】
請求項１に記載の増幅プライマーを含む、病原性微生物検出キット。
【請求項22】
請求項１に記載の増幅プライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の末端に塩基Ａを付加する工程を含む、ＴＡクローニング方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0017】
一実施形態では、シーケンシング方法は、サンプルに対して、変異部位検出、染色体倍数性検出、遺伝子融合検出、及び病原性微生物検出のうちのいずれか１つを行うために使用される。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0027】
本開示の様々な実施形態によれば、上記増幅プライマーを使用してＰＣＲ増幅を行い、増幅産物の末端に塩基Ａを付加する工程を含むＴＡクローニング方法が提供される。
【国際調査報告】