特表 2024-541368 がんの治療で使用するための薬剤組み合わせ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-08

(54)【発明の名称】がんの治療で使用するための薬剤組み合わせ

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/06 20060101AFI20241031BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241031BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 31/739 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 31/736 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 31/223 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241031BHJP

【ＦＩ】

A61K45/06

A61P43/00 121

A61P35/00

A61K31/7088

A61K31/739

A61K31/736

A61K31/223

A61K39/395 N

A61K39/395 D

A61K39/395 T

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024528499

(86)(22)【出願日】2022-11-03

(85)【翻訳文提出日】2024-07-16

(86)【国際出願番号】 CZ2022050115

(87)【国際公開番号】W WO2023083396

(87)【国際公開日】2023-05-19

(31)【優先権主張番号】63/279,212

(32)【優先日】2021-11-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】524180026

【氏名又は名称】バイオカニム エー．エス．

(74)【代理人】

【識別番号】100130111

【弁理士】

【氏名又は名称】新保 斉

(72)【発明者】

【氏名】ゼンカ ヤン

(72)【発明者】

【氏名】フレイルラホバ アンドレア

(72)【発明者】

【氏名】レンコヴァ ラドカ

(72)【発明者】

【氏名】ウーハー オンドレイ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C085

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C084AA20

4C084MA02

4C084MA55

4C084NA05

4C084ZB26

4C084ZC75

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085GG01

4C086AA01

4C086AA02

4C086DA41

4C086EA01

4C086EA16

4C086EA20

4C086MA03

4C086MA04

4C086MA55

4C086NA05

4C086ZB26

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206FA53

4C206MA03

4C206MA04

4C206MA75

4C206NA05

4C206ZB26

4C206ZC75

(57)【要約】

本発明の目的は、少なくとも１つのＴＬＲリガンド、免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する少なくとも１つの化合物、および少なくとも１つの抗ＣＤ４０抗体、ならびにさらに少なくとも１つのグルタミン代謝阻害剤を含む活性物質の薬剤組み合わせである。薬剤組み合わせの使用は、がんの治療、特に膵臓腺がんなどの固形腫瘍の治療のためのものである。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

がんの治療法で使用するための活性物質の薬剤組み合わせであって、少なくとも１つのＴＬＲリガンド、免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する少なくとも１つの化合物、少なくとも１つの抗ＣＤ４０抗体、およびさらに少なくとも１つのグルタミン代謝阻害剤を含む薬剤組み合わせ。

【請求項2】

前記ＴＬＲリガンドが、レシキモド、酸形態または塩形態のポリイノシン酸：ポリシチジル酸、酸形態または塩形態のリポテイコ酸を含む群から選択される物質である、請求項１に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項3】

前記ＴＬＲリガンドが、レシキモド、酸形態または塩形態のポリイノシン酸：ポリシチジル酸、酸形態または塩形態のリポテイコ酸から選択される少なくとも２つの物質の組み合わせである、請求項１または２に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項4】

自然免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する前記化合物が、デクチン－１、ＭＲ、ＭＢＬ、ＣＲ３、ＣＲ４受容体、ならびにスカベンジャー受容体のＳＲ－Ａ１、ＳＲ－Ａ２、およびＭＡＲＣＯまたはマンナン－ＢＡＭのリガンドからなる群から選択される細胞の貪食受容体のリガンドである、請求項１に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項5】

自然免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する前記化合物がマンナン－ＢＡＭである、請求項１～４のいずれか一項に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項6】

前記グルタミン代謝阻害剤が、アザセリン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、５－ジアゾ－４－オキソ－Ｌ－ノルバリン、アシビシン、アゾトマイシン、ビス－２－（５－フェニルアセトアミド－１，３，４－チアジアゾール－２－イル）エチルスルフィド、エブセレン、チェレリスリン、アポモルフィン、２－（ピリジン－２－イル）－Ｎ－（５－（４－（６－（２－（３－（トリフルオロメトキシ）フェニル）アセトアミド）ピリダジン－３－イル）ブチル）－１，３，４－チアジアゾール－２－イル）アセトアミドを含む群から選択される、請求項１に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項7】

レシキモド、遊離酸形態または塩形態のポリイノシン酸：ポリシチジル酸、遊離酸形態または塩形態のリポテイコ酸、マンナン－ＢＡＭ、抗ＣＤ４０抗体、および少なくとも１つのグルタミン代謝阻害剤を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項8】

レシキモド、遊離酸形態または塩形態のポリイノシン酸：ポリシチジル酸、遊離酸形態または塩形態のリポテイコ酸、マンナン－ＢＡＭ、抗ＣＤ４０抗体、および６－ジアゾ－５－オキソ－ノルロイシンを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項9】

腹腔内、皮下、または腫瘍が存在する組織に腫瘍内投与する、請求項１～８のいずれか一項に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項10】

少なくとも１つのＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンド、免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する少なくとも１つの化合物、および少なくとも１つの抗ＣＤ４０抗体を含む免疫療法のための活性物質の混合物を腫瘍内に投与し、前記混合物の前に、少なくとも１つのグルタミン代謝阻害剤を投与する、請求項１～９のいずれか一項に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項11】

レシキモド、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸、リポテイコ酸、マンナン－ＢＡＭ、抗ＣＤ４０抗体からなる活性物質の混合物を腫瘍内に投与し、前記混合物の前に、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシンを腫瘍内または全身に投与する、請求項１０に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項12】

少なくとも１つのＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンド、免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する少なくとも１つの化合物、および少なくとも１つの抗ＣＤ４０抗体を含む免疫療法のための活性物質の混合物を腫瘍内に投与し、前記混合物に続いて、少なくとも１つのグルタミン代謝阻害剤を投与する、請求項１～９のいずれか一項に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項13】

レシキモド、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸、リポテイコ酸、マンナン－ＢＡＭ、抗ＣＤ４０抗体からなる活性物質の混合物を腫瘍内に投与し、前記混合物に続いて、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシンを腫瘍内または全身に投与する、請求項１２に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項14】

少なくとも１つのＴＬＲリガンド、免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する少なくとも１つの化合物、少なくとも１つの抗ＣＤ４０抗体を含む免疫療法のための活性物質の混合物と、少なくとも１つのグルタミン代謝阻害剤を同時に投与する、請求項１～９のいずれか一項に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項15】

レシキモド、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸、リポテイコ酸、マンナン－ＢＡＭ、抗ＣＤ４０抗体からなる活性物質の混合物を腫瘍内に投与し、同時に６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシンを腫瘍内または全身に投与する、請求項１４に記載の薬剤組み合わせ。

【請求項16】

がん治療のための請求項１～１５のいずれか一項に記載の薬剤組み合わせの使用。

【請求項17】

前記がんが固形腫瘍である、請求項１６に記載の使用。

【請求項18】

前記がんが膵臓腺がんである、請求項１６または１７に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、薬剤組み合わせ、およびがんの治療、特に固形腫瘍の治療のためのその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍の免疫抵抗性は複数の通常独立した細胞内機構および微小環境機構からなる非常に複雑な過程である。免疫抵抗性の強い腫瘍の一例が膵臓腺がんである。膵臓腺がんは、高密度の間質、低突然変異荷重、および免疫抑制機構といった独特の腫瘍微小環境を有する。間質環境は、免疫細胞や他の細胞に対する重要な生物物理学的障壁を形成し、疾患の侵攻性や薬剤耐性の増強の一因となっている。低突然変異荷重と免疫抑制性の微小環境は、腫瘍細胞の認識を妨げ、抗腫瘍免疫を抑制する。このように、臨床転帰が不良であることから、この診断を受けた患者に希望をもたらす新たな革新的治療法の開発が急務とされている。

【0003】

現在、我々はがん免疫療法の分野で著しい進歩を目の当たりにしている。最も研究されている領域はチェックポイント阻害剤の使用である。また、ＣＡＲ－Ｔリンパ球の使用にも注目が集まっている。チェックポイント阻害剤の分野では、抗ＣＴＬＡ－４抗体から、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１への介入、ならびにチェックポイント阻害剤と他の免疫、化学、および放射線療法との併用に焦点が移りつつある。しかし、チェックポイント阻害剤の使用が有効な患者は、限られた数の診断のうち約２０％にすぎない。チェックポイント阻害剤の有効性が低い主な理由は、免疫攻撃に対する腫瘍の防御が非常に複雑で、たいていは独立したいくつかの機構で構成されているためである。チェックポイント阻害剤とＣＡＲ－Ｔが解決するのは、このモザイクの一部の問題のみである。

【0004】

本発明者らは以前の研究において、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンドと、自然免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する化合物とを含む免疫療法組成物を開発した。この治療用混合物は、メラノーマの治療において良好な結果を示している（非特許文献１、２）。治療が非常に困難な膵臓腺がんや褐色細胞腫の治療では、自然免疫と適応免疫の両方を促進する作用薬、抗ＣＤ４０抗体を治療混合物に加えると非常に有益であることがわかっている（非特許文献３）。

【0005】

この免疫療法は非常に効果的だが、一定の限界と欠点がある。この治療法で大きな腫瘍や大きな転移を完全に除去することは困難または不可能である。したがって、この免疫療法のさらなる改良が求められていた。

【0006】

これまでに知られている免疫療法を改善しようと、この免疫療法に適合し、相乗的に作用する他の治療法が模索されてきた。化学療法や放射線療法といった治療選択肢の多くは免疫系を抑制するため、自然免疫の機能を後押しする免疫療法との併用は逆効果となることから、好適な治療法を見つけることは非常に困難であった。

【0007】

本発明の目的は、治療に使用した場合には進行性の皮下腫瘍を完全に除去でき、さらに長期的な免疫記憶をもたらす、がんの治療で使用するための薬剤組み合わせを開発することである。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｃａｉｓｏｖａ Ｖ，Ｖｉｅｒｕ Ａ，Ｋｕｍｚａｋｏｖａ Ｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ－ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｂ１６－Ｆ１０ ｍｕｒｉｎｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｍｏｄｅｌ，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，ｐ．１－１１，２０１６

【非特許文献2】Ｃａｉｓｏｖａ Ｖ，Ｕｈｅｒ Ｏ，Ｎｅｄｂａｌｏｖａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＬＲ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，ｐ．８６－９６，２０１８

【非特許文献3】Ｃａｉｓｏｖａ Ｖ，Ｌｉ Ｌ，Ｇｕｐｔａ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｒ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｌｅｓｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ａｆｔｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｍａｎｎａｎ－ＢＡＭ，ＴＬＲ ｌｉｇａｎｄｓ，ａｎｄ－ａｎｔｉ－ＣＤ４０，Ｃａｎｃｅｒｓ，ｐ．１－２１，２０１９

【非特許文献4】Ｊａｎｏｔｏｖａ Ｔ，Ｊａｌｏｖｅｃｋａ Ｍ，Ａｕｅｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ａｎｃｈｏｒｅｄ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｏｆ ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｂ１６－Ｆ１０ ｍｕｒｉｎｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｍｏｄｅｌ，ＰＬｏＳ ＯＮＥ，ｐ．１－１４，２０１４

【非特許文献5】Ｃａｉｓｏｖａ Ｖ，Ｕｈｅｒ Ｏ， Ｎｅｄｂａｌｏｖａ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＬＲ ａｇｏｎｉｓｔｓ ｗｉｔｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ，Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．，ｐ．８６－９６，２０１８

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の目的は、免疫療法のための活性物質をがんの治療で使用するための薬剤組み合わせの開発によって達成され、前記組み合わせは、少なくとも１つのＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンド、免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する少なくとも１つの化合物、および少なくとも１つの抗ＣＤ４０抗体を含み、さらに少なくとも１つのグルタミン代謝阻害剤を含む。これらの活性物質は、同時または連続投与が可能である。グルタミンは腫瘍の増殖にとって非常に重要であり、一般的に腫瘍で大量消費される。グルタミンはエネルギーの生成に使用され、核酸やいくつかのアミノ酸の合成における窒素源として機能する。また、細胞の酸化還元ホメオスタシスの調節にも関与している。グルタミナーゼ活性によりグルタミンから生成されたグルタミン酸塩は、さらにα－ケトグルタル酸塩に代謝され、トリカルボン酸の非常に重要なサイクルの炭素源となる。

【0010】

ＴＬＲリガンドは、自然免疫細胞による腫瘍の浸潤とその活性化に関与する物質である。さらに、ＴＬＲリガンドはＴｈ１抗腫瘍環境の形成に寄与し、共刺激分子の形成を促進する。このように、ＴＬＲリガンドは、効率的な抗原提示と適応免疫の関与を促進する。好ましい実施形態では、ＴＬＲリガンドは、レシキモド（Ｒ－８４８）、遊離酸形態または塩形態のポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））、遊離酸形態または塩形態のリポテイコ酸（ＬＴＡ）を含む群から選択される物質であり、より好ましくは、それらの物質の少なくとも２つの組み合わせである。本明細書において酸塩は、酸と、薬学的に許容されるカチオン、特にアルカリ金属カチオン、アルカリ土類金属カチオン、およびアンモニウムカチオンとの塩を示す。

【0011】

好ましい実施形態では、自然免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する化合物は、主に食細胞受容体のリガンド、例えば、デクチン－１、ＭＲ、ＭＢＬ、ＣＲ３、ＣＲ４受容体、ならびにスカベンジャー受容体のＳＲ－Ａ１、ＳＲ－Ａ２、およびＭＡＲＣＯのリガンドである。自然免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する化合物は、好ましくはマンナン－生体適合性膜アンカー（マンナン－ＢＡＭ）複合体である。これらの化合物は腫瘍細胞に結合し、自然免疫細胞攻撃の標的として標識する。自然免疫細胞には、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、およびＮＫ細胞がある。

【0012】

抗ＣＤ４０抗体は自然免疫と適応免疫の両方を促進する。

【0013】

好ましい実施形態では、グルタミン代謝阻害剤は、アザセリン、ＤＯＮと呼ばれる６－ジアゾ－５－オキソ－ノルロイシン、Ｌ－ＤＯＮＶと呼ばれる５－ジアゾ－４－オキソ－Ｌ－ノルバリン、アシビシン、アゾトマイシン、ＢＰＴＥＳと呼ばれるビス－２－（５－フェニルアセトアミド－１，３，４－チアジアゾール－２－イル）エチルスルフィド、エブセレン、チェレリスリン、アポモルフィン、ＣＢ－８３９と呼ばれる２－（ピリジン－２－イル）－Ｎ－（５－（４－（６－（２－（３－（トリフルオロメトキシ）フェニル）アセトアミド（ピリダジン－３－イル）ブチル）－１，３，４－チアジアゾール－２－イル）アセトアミドを含む群から選択される。これらの物質はプロドラッグの形態で投与し得る。プロドラッグは、生体内で反応して活性物質を形成する。本明細書では、プロドラッグも用語「グルタミン代謝阻害剤」に含まれる。

【0014】

好ましくは、本発明は、レシキモド、遊離酸形態または塩形態のポリイノシン酸：ポリシチジル酸、遊離酸形態または塩形態のリポテイコ酸、マンナン－ＢＡＭ、抗ＣＤ４０抗体、および少なくとも１つのグルタミン代謝阻害剤を含む薬剤組み合わせを提供する。

【0015】

好ましい実施形態では、本発明は、レシキモド、遊離酸形態または塩形態のポリイノシン酸：ポリシチジル酸、遊離酸形態または塩形態のリポテイコ酸、マンナン－ＢＡＭ、抗ＣＤ４０抗体、および６－ジアゾ－５－オキソ－ノルロイシン、またはこれらのプロドラッグを含む薬剤組み合わせを提供する。

【0016】

好ましい実施形態では、薬剤組み合わせは、腹腔内、皮下、または腫瘍が存在する組織に腫瘍内投与する。

【0017】

本発明の目的は、がんの治療、特に固形腫瘍の治療、最も好ましくは膵臓腺がんの治療のための医薬組成物の使用であって、少なくとも１つのＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンド、免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する少なくとも１つの化合物、少なくとも１つの抗ＣＤ４０抗体、およびさらに少なくとも１つのグルタミン代謝阻害剤を含む免疫療法のための活性物質の薬剤組み合わせを、そのような治療を必要とするヒトまたは動物の被験体に投与するステップを含む使用によってさらに達成される。

【0018】

好ましい実施形態では、レシキモド、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸、リポテイコ酸、マンナン－ＢＡＭ、抗ＣＤ４０抗体からなる活性物質の薬剤組み合わせを腫瘍内に投与し、前記混合物の前に、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシンを腫瘍内または全身に投与する。

【0019】

好ましい実施形態では、少なくとも１つのＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）リガンド、免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する少なくとも１つの化合物、および少なくとも１つの抗ＣＤ４０抗体を含む免疫療法のための活性物質の薬剤組み合わせを腫瘍内に投与し、前記混合物に続いて、少なくとも１つのグルタミン代謝阻害剤を投与する。

【0020】

好ましい実施形態では、レシキモド、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸、リポテイコ酸、マンナン－ＢＡＭ、抗ＣＤ４０抗体からなる活性物質の薬剤組み合わせを腫瘍内に投与し、前記混合物に続いて、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシンを腫瘍内または全身に投与する。

【0021】

好ましい実施形態では、少なくとも１つのＴＬＲリガンド、免疫細胞攻撃の標的として腫瘍細胞を標識する少なくとも１つの化合物、少なくとも１つの抗ＣＤ４０抗体を含む免疫療法のための活性物質の薬剤組み合わせと、少なくとも１つのグルタミン代謝阻害剤を同時に投与する。

【0022】

好ましい実施形態では、レシキモド、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸、リポテイコ酸、マンナン－ＢＡＭ、抗ＣＤ４０抗体からなる活性物質の薬剤組み合わせを腫瘍内に投与し、同時に６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシンを腫瘍内または全身に投与する。

【0023】

本発明で使用する物質は市販されている。個々の物質またはその部分的組み合わせは当技術分野ですでに知られているが、現在驚くべきことに、これらの活性物質の組み合わせが、すなわち、対応する作用機序の関与に基づく免疫代謝治療が相乗効果をもたらし、腫瘍の増殖を停止、または減少させ、大きな進行性の固形腫瘍であっても生存期間を延長させることが見いだされている。

【0024】

がんの治療で使用するための薬剤組み合わせの利点は、治療に使用した場合には進行性の皮下腫瘍を完全に除去でき、さらに長期的な免疫記憶をもたらすことである。

【0025】

以下に図を用いて本発明を詳細に説明する。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1A】図１Ａ～１Ｃは薬剤組み合わせを使用した膵臓腺がんマウスの免疫代謝治療の結果を示す図であり、図１Ａは腫瘍増殖の抑制を示す。

【図1B】図１Ａ～１Ｃは薬剤組み合わせを使用した膵臓腺がんマウスの免疫代謝治療の結果を示す図であり、図１Ｂは腫瘍増殖の抑制を示す。

【図1C】図１Ａ～１Ｃは薬剤組み合わせを使用した膵臓腺がんマウスの免疫代謝治療の結果を示す図であり、図１Ｃはマウスの生存期間の延長を示す。

【図2A】図２Ａおよび２Ｂは薬剤組み合わせを使用した、非常に進行した膵臓腺がんマウスの免疫代謝治療の結果を示す図であり、図２Ａは腫瘍増殖の抑制を示す。

【図2B】図２Ａおよび２Ｂは薬剤組み合わせを使用した、非常に進行した膵臓腺がんマウスの免疫代謝治療の結果を示す図であり、図２Ｂはマウスの生存期間の延長を示す。

【図3A】図３Ａおよび３Ｂは薬剤組み合わせを使用した膵臓腺がんマウスの免疫代謝治療の結果を示す図であり、図３Ａは腫瘍増殖の抑制を示す。

【図3B】図３Ａおよび３Ｂは薬剤組み合わせを使用した膵臓腺がんマウスの免疫代謝治療の結果を示す図であり、図３Ｂはマウスの生存期間の延長を示す。

【図4A】図４Ａ～４Ｃは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおいて、２つのタイミングで腫瘍内ＭＢＴＡ療法とグルタミン拮抗薬（ＤＯＮ）ｉ．ｐ．投与の薬剤組み合わせを使用した結果を示す図であり、図４Ａは腫瘍増殖の抑制を示す。

【図4B】図４Ａ～４Ｃは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおいて、２つのタイミングで腫瘍内ＭＢＴＡ療法とグルタミン拮抗薬（ＤＯＮ）ｉ．ｐ．投与の薬剤組み合わせを使用した結果を示す図であり、図４Ｂは腫瘍増殖の抑制を示す。

【図4C】図４Ａ～４Ｃは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおいて、２つのタイミングで腫瘍内ＭＢＴＡ療法とグルタミン拮抗薬（ＤＯＮ）ｉ．ｐ．投与の薬剤組み合わせを使用した結果を示す図であり、図４Ｃはマウスの生存期間の延長を示す。

【図5A】図５Ａ～５Ｃは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおいて、異なる用量でＤＯＮをｓ．ｃ．投与した結果を示す図であり、図５Ａは腫瘍増殖の抑制を示す。

【図5B】図５Ａ～５Ｃは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおいて、異なる用量でＤＯＮをｓ．ｃ．投与した結果を示す図であり、図５Ｂは腫瘍増殖の抑制を示す。

【図5C】図５Ａ～５Ｃは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおいて、異なる用量でＤＯＮをｓ．ｃ．投与した結果を示す図であり、図５Ｃはマウスの生存期間の延長を示す。

【図6A】図６Ａ～図６Ｃは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおけるＤＯＮのｉ．ｔ．投与とｉ．ｐ．投与の比較の結果を示す図であり、図６Ａは腫瘍増殖の抑制を示す。

【図6B】図６Ａ～図６Ｃは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおけるＤＯＮのｉ．ｔ．投与とｉ．ｐ．投与の比較の結果を示す図であり、図６Ｂは腫瘍増殖の抑制を示す。

【図6C】図６Ａ～図６Ｃは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおけるＤＯＮのｉ．ｔ．投与とｉ．ｐ．投与の比較の結果を示す図であり、図６Ｃはマウスの生存期間の延長を示す。

【図7A】図７Ａ～７Ｆは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおけるＭＢＴＡ免疫療法とＤＯＮによるグルタミン代謝阻害との組み合わせの結果（副作用の評価）を示す図であり、図７Ａは腫瘍増殖の抑制を示す。

【図7B】図７Ａ～７Ｆは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおけるＭＢＴＡ免疫療法とＤＯＮによるグルタミン代謝阻害との組み合わせの結果（副作用の評価）を示す図であり、図７Ｂは腫瘍増殖の抑制を示す。

【図7C】図７Ａ～７Ｆは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおけるＭＢＴＡ免疫療法とＤＯＮによるグルタミン代謝阻害との組み合わせの結果（副作用の評価）を示す図であり、図７Ｃはマウスの生存期間の延長を示す。

【図7D】図７Ａ～７Ｆは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおけるＭＢＴＡ免疫療法とＤＯＮによるグルタミン代謝阻害との組み合わせの結果（副作用の評価）を示す図であり、図７Ｄは摂食量を示す。

【図7E】図７Ａ～７Ｆは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおけるＭＢＴＡ免疫療法とＤＯＮによるグルタミン代謝阻害との組み合わせの結果（副作用の評価）を示す図であり、図７Ｅは飲水量を示す。

【図7F】図７Ａ～７Ｆは両側Ｐａｎｃ０２モデルにおけるＭＢＴＡ免疫療法とＤＯＮによるグルタミン代謝阻害との組み合わせの結果（副作用の評価）を示す図であり、図７Ｆはマウスの体重を示す。

【図8】左側ＭＢＴＡ未治療並行膵臓腺がん腫瘍（両側Ｐａｎｃ０２モデル）の免疫細胞浸潤に対するＤＯＮの効果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

薬剤組み合わせ
がんの治療法、特に膵臓腺がんなどの固形腫瘍の治療法における活性の試験について以下に説明する薬剤組み合わせは、ポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））およびリポテイコ酸のナトリウム塩形態の２つのＴＬＲリガンド、抗ＣＤ４０抗体、マンナン－ＢＡＭの形態の腫瘍細胞を標識する１つの化合物、ならびに６－ジアゾ－５－オキソ－ノルロイシンの形態の、またはＤＯＮと呼ばれる１つのグルタミン代謝阻害剤を含有していた。別の図示しない実施形態では、薬剤組み合わせは、レシキモド、酸形態または塩形態のポリイノシン酸：ポリシチジル酸、酸形態または塩形態のリポテイコ酸の群から選択される、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのＴＬＲリガンドからなる。別の図示しない実施形態では、薬剤組み合わせは、デクチン－１、マンノース受容体、マンナン結合レクチン、補体受容体３、補体受容体４、およびスカベンジャー受容体クラスＡリガンドの群から選択される、腫瘍細胞を標識する少なくとも１つの化合物からなる。これらの貪食刺激リガンドの数が多いと、腫瘍環境への浸透に関して、および腫瘍細胞の表面への固定に関して最適な分子を選択できる可能性が得られる。別の図示しない実施形態では、薬剤組み合わせは、アザセリン、５－ジアゾ－４－オキソ－Ｌ－ノルバリン、アシビシン、アゾトマイシン、ビス－２－（５－フェニルアセトアミド－１，３，４－チアジアゾール－２－イル）エチルスルフィド、エブセレン、チェレリスリン、アポモルフィン、２－（ピリジン－２－イル）－Ｎ－（５－（４－（６－（２－（３－（トリフルオロメトキシ）フェニル）アセトアミド）ピリダジン－３－イル）ブチル）－１，３，４－チアジアゾール－２－イル）アセトアミドの群から選択される少なくとも１つのグルタミン代謝阻害剤からなる。考えられるグルタミン代謝阻害剤の範囲により、治療ウィンドウが広い物質の特定、すなわち治療上最適な濃度と副作用を引き起こす濃度の区別が可能となる。

【0028】

材料
組織培地、培地補充物、出芽酵母由来のマンナン、枯草菌由来のリポテイコ酸（ＬＴＡ）、およびポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））のナトリウム塩は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。レシキモド（Ｒ－８４８）はＴｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（英国ブリストル）から供給を受けた。生体適合性細胞膜アンカー（ＢＡＭ、Ｍｗ４０００）はＮＯＦ ＥＵＲＯＰＥ（ベルギー、グロッベンドンク）から入手した。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ラットＩｇＧ２ａ、クローンＰＧＫ４．５／ＰＧＫ４５）は、ＢｉｏＸＣｅｌｌ（米国ニューハンプシャー州ウェスト・レバノン）から供給を受けた。６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン（ＤＯＮ）は、プラハの有機化学・生化学研究所（ＵＯＣＨＢ）から入手したが、市販品の購入も可能である。

【0029】

細胞株とマウス
マウス膵臓腺がん株Ｐａｎｃ０２は、ラルス・イヴォ・パルテック教授（ドイツ、グライフスヴァルト）から提供を受けた。細胞は、１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清と抗生物質（ＰＡＡ、オーストリア、パシング）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した。細胞は、５％の二酸化炭素を含む水蒸気飽和雰囲気中、３７℃で培養した。

【0030】

特定病原体除去Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（ＳＰＦ Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌）とも呼ぶ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ドイツ、ズルツフェルト）から入手した。体重１８～２０ｇのマウスを特定病原体除去環境のバリア施設に収容し、無菌の餌と水を自由に摂取できるようにした。光周期は１２時間明／１２時間暗とした。

【0031】

マンナン－ＢＡＭの合成
マンナン－ＢＡＭの合成は、以前に説明されている通りに実施した（非特許文献４）。

【0032】

腫瘍移植
皮下移植：マウスに、ＤＭＥＭ ０．１ｍＬ中の４×１０^５個のＰａｎｃ０２細胞またはＲＰＭＩ １６４０培地 ０．１ｍＬ中の４×１０^５個のＢ１６－Ｆ１０細胞を無添加で、あらかじめ剃毛した鼠径部（右側または左右両方）に皮下注射した。

【0033】

頭蓋内移植：まず、ケタミン（Ｎａｒｋａｍｏｎ、Ｂｉｏｖｅｔａ、チェコ共和国、１００ｍｇ／ｋｇ）とキシラジン（Ｒｏｍｅｔａｒ、Ｂｉｏｖｅｔａ、チェコ共和国、５ｍｇ／ｋｇ）の混合液をマウスに腹腔内注射して麻酔した。続いて、無添加のＤＭＥＭ ０．０３ｍＬ中１×１０^５個のＰａｎｃ０２細胞をマウスの頭蓋内に注射した。

【0034】

治療およびその評価
ＭＢＴＡ免疫療法：０、１、２、８、９、１０、１６、１７、１８、２４、２５、および２６日目に、０．５ｍｇのＲ－８４８（ＨＣｌ形態）＋０．５ｍｇのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、０．５ｍｇのＬＴＡ、およびＰＢＳ中０．２ｍＭマンナン－ＢＡＭ １ｍＬ当たり０．４ｍｇの抗ＣＤ４０からなる治療混合物５０μＬを腫瘍内に投与した。以下、Ｒ－８４８、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＬＴＡ、マンナン－ＢＡＭ、および抗ＣＤ４０抗体の組み合わせを「ＭＢＴＡ」と呼ぶ。両側Ｐａｎｃ０２腫瘍モデルの場合、ＭＢＴＡ療法は常に右側の皮下腫瘍にのみ注射した。

【0035】

ＤＯＮ代謝介入：１００μＬのＤＯＮ溶液（リン酸緩衝食塩水、いわゆるＰＢＳ １ｍＬ当たり４ｍｇのＤＯＮ）を、後述するように、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。実施例３では、２００μＬのＤＯＮ溶液（４ｍｇ ＤＯＮ／１ｍＬ ＰＢＳ）の皮下（ｓ．ｃ．）投与も行った。さらに、実施例で概説するように、後述の用量およびスケジュールで腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与を検討した。

【0036】

治療ワクチン：Ｐａｎｃ０２－ＭＢＴＡワクチンでは、Ｐａｎｃ０２細胞を、非加熱不活性化ウシ胎仔血清および０．０２ｍＭマンナン－ＢＡＭを含有するＤＭＥＭ培地に再懸濁した。３７℃で２時間培養した後、Ｐａｎｃ０２細胞を洗浄し、０．５ｍｇのＲ－８４８（ＨＣｌ形態）、０．５ｍｇのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、０．５ｍｇのＬＴＡ、およびＰＢＳ中０．２ｍＭマンナン－ＢＡＭ １ｍＬ当たり０．４ｍｇの抗ＣＤ４０からなる治療混合液に再懸濁した（治療混合液１ｍＬ当たり４×１０^６個のＰａｎｃ０２細胞）。Ｐａｎｃ０２－ＰＢＳワクチンでは、Ｐａｎｃ０２細胞をＰＢＳに再懸濁した（ＰＢＳ １ｍＬあたり４×１０^６個のＰａｎｃ０２細胞）。続いて、Ｐａｎｃ０２－ＭＢＴＡおよびＰａｎｃ０２－ＰＢＳワクチン用のＰａｎｃ０２細胞を凍結融解サイクルで死滅させ、細胞の生存率をバイタル染色によって決定した。０、１、２、８、９、１０、１６、１７、１８、２４、２５、および２６日目に、５０μＬのワクチンを、あらかじめ剃毛した下背部（右側腹部）の皮下（ｓ．ｃ．）にパルス投与した。

【0037】

治療の評価：腫瘍の大きさはデジタルノギスを用いて１日おきに測定した。式Ｖ＝（π／６）ＡＢ^２（Ａは最大腫瘍サイズ、Ｂは最小腫瘍サイズ）を用いて腫瘍体積を算出した。

【0038】

腫瘍浸潤白血球のフローサイトメトリー解析
腫瘍浸潤白血球の解析は、非特許文献５に記載の通りに実施した。簡単に説明すると、腫瘍をＬｉｂｅｒａｓｅ ＤＬおよびＤｎａｓｅ Ｉ（ともにＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ドイツ）で消化した。以下のモノクローナル抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した。ａ）全白血球－抗マウスＣＤ４５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、クローン３０－Ｆ１１；ｂ）Ｔリンパ球－抗マウスＣＤ３ｅ ＦＩＴＣ、クローン１４５－２Ｃ１１；ｃ）ＣＤ４＋ Ｔリンパ球－抗マウスＣＤ４ ＡＰＣ、クローンＧＫ１．５；ｄ）ＣＤ８＋ Ｔリンパ球－抗マウスＣＤ８ａ、クローン５３－６．７；ｅ）Ｂリンパ球－抗マウスＣＤ１９ＡＰＣ、クローンｅＢｉｏ１Ｄ３；ｆ）ＮＫ細胞－抗マウスＮＫ１．１ＰＥ、クローンＰＫ１３６；ｇ）顆粒球－抗マウスＧｒ－１ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ７００、クローンＲＢ６８Ｃ５；ｈ）マクロファージ－抗マウスＦ４／８０抗原ＰＥ－Ｃｙ７、クローンＢＭ８。解析はＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州サンノゼ）とＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア６．１．３．（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州サンノゼ）を用いて行った。

【0039】

統計解析
曲線下面積（ＡＵＣ）を計算して腫瘍増殖を評価した。得られた値は、一元配置分散分析と不等分散の事後検定（ｕｎｅｑｕａｌ ｐｏｓｔ ｈｏｃ ｔｅｓｔ）により統計学的に評価した。カプランマイヤー生存曲線はログランク検定を用いて評価した。すべての統計的評価にＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ１２ソフトウェア（ＳｔａｔＳｏｆｔ，Ｉｎｃ．、米国オクラホマ州タルサ）を使用した。エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。

【実施例1】

【0040】

ＭＢＴＡ免疫療法とＤＯＮによるグルタミン代謝阻害との相乗効果－膵臓腺がん（Ｐａｎｃ０２）の２腫瘍マウスモデル
薬剤組み合わせを、最悪の腫瘍疾患に属すると考えられている膵臓腺がんの治療用として試験した。進行した腫瘍が２つあるマウスの一方（右側）の腫瘍にＭＢＴＡを腫瘍内投与し、同時にグルタミン代謝阻害剤（この場合は６－ジアゾ－５－オキソ－ノルロイシン（ＤＯＮ）を使用）を腹腔内投与することで治療した。

【0041】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．１ｍＬのＤＭＥＭ中の４×１０^５個のマウス膵臓腺がん細胞Ｐａｎｃ０２を、左右鼠径部の剃毛部位に皮下接種した。腫瘍細胞移植の１４日後、原発腫瘍の平均体積が１００．７±４２．１ｍｍ^３、遠隔腫瘍が１０４．８±４３．２ｍｍ^３となった時点で、マウスを６匹ずつの群に無作為に分け、直ちに治療を開始した。ＭＢＴＡ混合液（５０μＬのＭＢＴＡ混合液：０．５ｍｇのＲ－８４８＋０．５ｍｇのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）＋０．５ｍｇのＬＴＡ＋０．４ｍｇの抗ＣＤ４０／ｍＬ ＰＢＳ中０．２ｍＭマンナン－ＢＡＭ）（対照：ＰＢＳ）を右側の腫瘍内にパルス投与（０、１、２、８、９、１０、１６、１７、１８、２４、２５、２６日目）した。５、１３、２１、２９、３７日目にＤＯＮ（４ｍｇ ＤＯＮ／ｍＬ ＰＢＳの１００μＬ溶液）（対照：ＰＢＳ）を腹腔内投与した。

【0042】

ＭＢＴＡとＤＯＮの免疫代謝的組み合わせが、腫瘍増殖の抑制（図１Ａ、Ｂ）とマウスの生存期間延長（図１Ｃ）の両方で相乗効果を示したのに対し、他の群では腫瘍のない状態が持続したマウスはなかった。この実験を２回行ったが、結果は同等であった。

【0043】

図１Ａ、Ｂ：左右の腫瘍の増殖。統計解析は、一元配置分散分析とテューキーの事後検定を使用し、ＡＵＣ（曲線下面積）値を算出して実施した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、図１Ｃ：生存期間解析、ログランク検定、＊＝ｐ＜０．０５。

【実施例2】

【0044】

ＭＢＴＡ免疫療法とＤＯＮによるグルタミン代謝阻害との相乗効果－非常に進行した膵臓腺がん（Ｐａｎｃ０２）、マウスモデル
薬剤組み合わせを、非常に進行した膵臓腺がんの治療用として試験した。

【0045】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．１ｍＬのＤＭＥＭ中の４×１０^５個のマウス膵臓腺がん細胞Ｐａｎｃ０２を右鼠径部の剃毛部位に皮下接種した。腫瘍細胞移植の２０日後、腫瘍が大きくなった（１４０．８±４６．８ｍｍ^３、範囲：３７．４～２４７．０ｍｍ^３）時点で、マウスを６匹ずつの群に無作為に分け、直ちに適切な治療を開始した。ＭＢＴＡ混合液（５０μＬのＭＢＴＡ混合液：０．５ｍｇのＲ－８４８＋０．５ｍｇのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）＋０．５ｍｇのＬＴＡ＋０．４ｍｇの抗ＣＤ４０／ｍＬ ＰＢＳ中０．２ｍＭマンナン－ＢＡＭ）（対照：ＰＢＳ）を腫瘍内にパルス投与（０、１、２、８、９、１０、１６、１７、１８、２４、２５、２６日目）した。０、７、１４、２１、２８日目にＤＯＮ（４ｍｇ ＤＯＮ／ｍＬ ＰＢＳの１００μＬ溶液）を腹腔内投与した。

【0046】

ＭＢＴＡ療法のみで治療したマウスとＭＢＴＡ療法にＤＯＮを併用したマウスの腫瘍増殖の抑制は同等であった（図２Ａ）。しかし、ＭＢＴＡ療法のみで治療したマウスでは腫瘍のない状態が持続したのが１匹（１／６）のみであったのに対し、ＭＢＴＡ療法にＤＯＮを追加したマウスでは生存期間が改善した（３／６）（図２Ｂ）。

【0047】

さらに、ＭＢＴＡ／ＤＯＮ群で生き残った３匹のマウスに、続いて１×１０^５個のＰａｎｃ０２細胞を頭蓋内投与した（頭蓋内投与はＰａｎｃ０２細胞の初回接種から１７４日後に行った）。３匹すべて、この再移植に完全に抵抗性があった。一方、対照群のすべてのマウス（ｎ＝８）が、Ｐａｎｃ０２頭蓋内移植の１１～１４日後に死亡した（データは示さず）。頭蓋内腫瘍移植に対する抵抗性は、この併用療法に、中枢神経系のような免疫特権部位においても長期間持続する全身性免疫記憶を誘導する能力があることを実証した。

【0048】

図２Ａ：腫瘍の増殖。統計解析は、一元配置分散分析とテューキーの事後検定を使用し、ＡＵＣ（曲線下面積）値を算出して実施した。＊＊＝ｐ＜０．０１、図１Ｂ：生存期間解析、ログランク検定、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１。

【実施例3】

【0049】

ＭＢＴＡ免疫療法とＤＯＮによるグルタミン代謝阻害との相乗効果－膵臓腺がん（Ｐａｎｃ０２）、マウスモデル、ワクチン接種
薬剤組み合わせを、膵臓腺がんの治療用として試験した。進行性腫瘍を左側に有するマウスに、ＭＢＴＡ中のＰａｎｃ０２死細胞懸濁液を皮下注射（右側腹部）し、同時にグルタミン代謝阻害剤ＤＯＮを腹腔内／皮下投与した。

【0050】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．１ｍＬのＤＭＥＭ中の４×１０^５個のマウス膵臓腺がん細胞Ｐａｎｃ０２を左鼠径部の剃毛部位に皮下接種した。腫瘍細胞移植の１４日後、マウスを６匹ずつの群に無作為に分け、直ちに適切な治療を開始した。凍死Ｐａｎｃ０２細胞のＭＢＴＡ懸濁液（５０μＬのＭＢＴＡ／ＰＢＳ懸濁液：４ｍｉｌのＰａｎｃ０２死細胞＋０．５ｍｇのＲ－８４８＋０．５ｍｇのｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）＋０．５ｍｇのＬＴＡ＋０．４ｍｇの抗ＣＤ４０／ｍＬ ＰＢＳ中０．２ｍＭマンナン－ＢＡＭ）（対照：ＰＢＳ）を右鼠径部の剃毛部位の皮下にパルス投与（０、１、２、８、９、１０、１６、１７、１８、２４、２５、２６日目）した。ＤＯＮを腹腔内（ｉ．ｐ．）（４ｍｇ ＤＯＮ／ｍＬ ＰＢＳの１００μＬ溶液）および皮下（ｓ．ｃ．）（４ｍｇ ＤＯＮ／ｍＬ ＰＢＳの２００μＬ溶液）に、いずれも５、１３、２１、２９、３７日目に投与した。

【0051】

ＭＢＴＡとＤＯＮの薬剤組み合わせは、腫瘍増殖の抑制に相乗効果を示し（図３Ａ）、ＤＯＮの皮下投与では、マウスの生存期間の延長にも相乗効果が認められた（図３Ｂ）。

【0052】

図３Ａ：腫瘍の増殖。統計解析は、一元配置分散分析とテューキーの事後検定を使用し、ＡＵＣ（曲線下面積）値を算出して実施した。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＊＊＝ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００５、図３Ｂ：生存期間解析、ログランク検定、＊＝ｐ＜０．０５。

【実施例4】

【0053】

両側Ｐａｎｃ０２モデルにおける２つのタイミングでの腫瘍内ＭＢＴＡ療法とグルタミン拮抗薬（ＤＯＮ）のｉ．ｐ．投与の組み合わせ
ＭＢＴＡ／ＤＯＮ併用療法の治療成績を向上させるため、ＤＯＮの腹腔内投与と腫瘍内ＭＢＴＡ療法の組み合わせを試験した。ＤＯＮの総量（２ｍｇ／マウス／治療）は、後述する２種類の治療計画で投与した。

【0054】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左右側腹部両方にＰａｎｃ０２細胞をｓ．ｃ．接種した。１２日後、マウスを次の４群（ｎ＝６／群）に無作為に分けた：右側腫瘍にＰＢＳを投与して治療した群、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与して治療した群、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与し、ＤＯＮをｉ．ｐ．投与して治療した群（１３回投与）、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与し、ＤＯＮをｉ．ｐ．投与して治療した群（５回投与、赤）。ＭＢＴＡ（対照群：ＰＢＳ）は０、１、２、８、９、１０、１６、１７、１８、２４、２５、および２６日目にパルス投与した。ＤＯＮは５、１３、２１、２９、３７日目（４００μｇ）および１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５日目（１５４μｇ）にそれぞれｉ．ｐ．投与した。

【0055】

図４Ａ、Ｂに示すように、ＤＯＮ投与を行った治療計画の両方で、腫瘍増殖の抑制に同様の効果が示された。両方の治療計画でマウスの生存期間の延長（図４Ｃ）は明らかであったが、統計的に有意ではなかった。しかし、２番目の治療計画（ＤＯＮを１日おきに投与）では攻撃的すぎることがわかり、３匹のマウスが早期に死亡した。

【0056】

図４Ａ、Ｂ：左右の腫瘍の増殖。統計解析は、一元配置分散分析とテューキーの事後検定を使用し、ＡＵＣ（曲線下面積）値を算出して実施した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊＊ｐ＜０．０００５）、図４Ｃ：生存期間解析。

【実施例5】

【0057】

両側Ｐａｎｃ０２モデルにおける異なる投与量でのＤＯＮのｓ．ｃ．投与
ＤＯＮの皮下投与と腫瘍内ＭＢＴＡ療法の組み合わせを試験した。ＤＯＮは２種類の濃度で試験した。１番目の治療計画では、実施例４と同量のＤＯＮ（２ｍｇ／マウス／治療）を、ＭＢＴＡ療法（４００μｇ／マウス／注射）と並行して５回皮下注射した。２番目の治療計画では、低用量（８０μｇ／マウス／注射）で同じタイミングとした。

【0058】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左右側腹部両方にＰａｎｃ０２細胞をｓ．ｃ．接種した。１２日後、マウスを次の４群（ｎ＝６／群）に無作為に分けた：右側腫瘍にＰＢＳを投与した群、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与した群、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与し、低用量のＤＯＮをｓ．ｃ．投与した群、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与し、高用量のＤＯＮをｓ．ｃ．投与した群。ＭＢＴＡ（対照群：ＰＢＳ）は０、１、２、８、９、１０、１６、１７、１８、２４、２５、および２６日目にパルス投与した。ＤＯＮ（それぞれ８０μｇおよび４００μｇ用量）は１、９、１７、２５、３３日目にｓ．ｃ．投与した。

【0059】

図５Ａ、Ｂに示すように、腫瘍増殖の抑制は、ＤＯＮのｉ．ｐ．投与（実施例４、図４Ａ、Ｂ）に比べてあまり明らかではなかった。治療マウスの早期死亡は観察されなかった（図５Ｃ）。

【0060】

図５Ａ、Ｂ：左右の腫瘍の増殖。統計解析は、一元配置分散分析とテューキーの事後検定を使用し、ＡＵＣ（曲線下面積）値を算出して実施した。（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊＊ｐ＜０．０００５）、図５Ｃ：生存曲線解析（＊ｐ＜０．０５）。

【実施例6】

【0061】

両側Ｐａｎｃ０２モデルにおけるＤＯＮのｉ．ｔ．およびｉ．ｐ．投与の比較
１番目はＤＯＮを遠位のＭＢＴＡ未治療腫瘍に注射する治療、２番目はＤＯＮを腹腔内投与する治療の２つの治療計画を比較した。

【0062】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左右側腹部両方にＰａｎｃ０２細胞をｓ．ｃ．接種した。１２日後、マウスを次の４群（ｎ＝６／群）に無作為に分けた：右側腫瘍にＰＢＳを投与した群、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与した群、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与し、左側腫瘍にＤＯＮを投与した群、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与し、ＤＯＮをｉ．ｐ．投与した群。ＭＢＴＡ（対照群：ＰＢＳ）は０、１、２、８、９、１０、１６、１７、１８、２４、２５、および２６日目にパルス投与した。ＤＯＮ（４００μｇ）は１、８、１５、２２、２９日目にｉ．ｔ．またはｉ．ｐ．投与した。

【0063】

ＤＯＮの腫瘍内投与は、治療マウスの生存期間を有意に延長したｉ．ｐ．投与とは対照的に、治療効果を改善しなかった（図６Ａ、Ｂ、Ｃ）。

【0064】

図６Ａ、Ｂ：左右の腫瘍の増殖。統計解析は、一元配置分散分析とテューキーの事後検定を使用し、ＡＵＣ（曲線下面積）値を算出して実施した。（＊＊ｐ＜０．０１、クラスカル・ウォリス検定）、図６Ｃ：生存曲線解析（＊ｐ＜０．０５）。

【実施例7】

【0065】

両側Ｐａｎｃ０２モデルにおけるＭＢＴＡ免疫療法とＤＯＮによるグルタミン代謝阻害との組み合わせ－副作用の評価
実施例４～６から、ＤＯＮの最適な投与方法は、各投与間に十分な間隔をあけたｉ．ｐ．投与であることが示された。この治療計画では治療マウスの早期死亡は観察されなかったが、この投与が治療マウスの健康状態に影響を与えないことを確認したかった。

【0066】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左右側腹部両方にＰａｎｃ０２細胞をｓ．ｃ．接種した。１２日後、マウスを次の３群（ｎ＝６／群）に無作為に分けた：右側腫瘍にＰＢＳを投与した群、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与した群、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与し、ＤＯＮをｉ．ｐ．投与した群。ＭＢＴＡ（対照群：ＰＢＳ）は０、１、２、８、９、１０、１６、１７、１８、２４、２５、および２６日目にパルス投与した。ＤＯＮ（４００μｇ）は１、８、１５、２２、２９日目にｉ．ｐ．投与した。

【0067】

ＭＢＴＡ療法とＤＯＮのｉ．ｐ．投与の組み合わせは、図７Ｄ～Ｆに示すように、ＤＯＮ投与が、治療マウスの飲水量と摂食量および体重に影響を与えることなく両方の腫瘍の増殖を抑制し、治療マウスの生存期間を有意に延長した（図７Ａ～Ｃ）。

【0068】

図７Ａ、Ｂ：左右の腫瘍の増殖。統計解析は、一元配置分散分析とテューキーの事後検定を使用し、ＡＵＣ（曲線下面積）値を算出して実施した。（＊ｐ＜０．０５）、図７Ｃ：生存曲線解析（＊ｐ＜０．０５）、図７Ｄ、Ｅ、Ｆ：実験中のマウスの摂食量と飲水量および体重変化の評価。

【実施例8】

【0069】

左側ＭＢＴＡ未治療並行膵臓腺がん腫瘍の免疫細胞浸潤に対するＤＯＮの効果、両側Ｐａｎｃ０２モデル
ＤＯＮ投与の副作用の可能性を検討しつつ、ＤＯＮが遠位腫瘍の浸潤に悪影響を及ぼすかどうかを検討した。

【0070】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左右側腹部両方にＰａｎｃ０２細胞をｓ．ｃ．接種した。１４日後、マウスを次の４群（ｎ＝１６／群）に無作為に分けた：右側腫瘍にＰＢＳを投与し、ＰＢＳをｉ．ｐ．投与した群、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与し、ＰＢＳをｉ．ｐ．投与した群、右側腫瘍にＰＢＳを投与し、ＤＯＮをｉ．ｐ．投与した群、右側腫瘍にＭＢＴＡを投与し、ＤＯＮをｉ．ｐ．投与した群。ＭＢＴＡ（対照群：ＰＢＳ）は０、１、２、８、９、１０、１６、１７、１８、２４、２５、および２６日目にパルス投与した。ＤＯＮ（４００μｇ）は５、１３、２１、２９日目にｉ．ｐ．投与した。７、１５、２３、３１日目にフローサイトメトリー解析を実施した。

【0071】

図８に示すように、唯一の例外（２３日目の顆粒球数）を除き、ＭＢＴＡ療法にＤＯＮを加えたことによる有意な変化は観察されなかった。

【0072】

図８：両側Ｐａｎｃ０２モデルにおける左側ＭＢＴＡ未治療並行膵臓腺がん腫瘍の免疫細胞浸潤に対するＤＯＮ投与の効果。

【産業上の利用可能性】

【0073】

本発明によるがんの治療で使用するための薬剤組み合わせは、がんの治療、特に転移性マウス膵臓腺がんのような固形腫瘍の治療に使用できる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図7F】

【図8】

【国際調査報告】