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特表2024-541378ラマン分光法を使用した試料中のウイルス力価の決定方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-08
(54)【発明の名称】ラマン分光法を使用した試料中のウイルス力価の決定方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/70 20060101AFI20241031BHJP
G01N 21/65 20060101ALI20241031BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/70
G01N21/65
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024528579
(86)(22)【出願日】2022-11-21
(85)【翻訳文提出日】2024-07-10
(86)【国際出願番号】 US2022050543
(87)【国際公開番号】W WO2023091740
(87)【国際公開日】2023-05-25
(31)【優先権主張番号】63/281,441
(32)【優先日】2021-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(71)【出願人】
【識別番号】514137997
【氏名又は名称】オハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100128761
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 恭子
(72)【発明者】
【氏名】バルス，カリン，エム．
(72)【発明者】
【氏名】シュルツ，ザッカリー
(72)【発明者】
【氏名】モーダー，コートニー，ジェイ．
【テーマコード（参考）】
2G043
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G043AA06
2G043BA17
2G043CA04
2G043EA03
2G043JA01
2G043KA01
2G043KA02
2G043KA09
2G043LA01
2G043NA01
4B063QA01
4B063QQ10
4B063QS39
4B063QX01
(57)【要約】
ラマン分光法を使用して試料中のウイルス力価を定量化する方法が開示される。この方法は、試料を提供することと、試料中のウイルス力価を決定するためのモデルを提供することと、試料を光源で照射することと、試料のラマンスペクトルを取得することと、を含む。方法は、ラマンスペクトルのウイルス成分を、ウイルス力価を決定するためのモデルに適用することによって、試料のウイルス力価を定量化することを更に伴う。本開示の他の態様は、試料中のウイルス力価を定量化するのに好適なモデルを生成するための方法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラマン分光法を使用して試料中のウイルス力価を定量化する方法であって、前記方法が、試料を提供することと、
前記試料中のウイルス力価を決定するためのモデルを提供することと、
前記試料を光源で照射することと、
前記試料のラマンスペクトルを取得することと、
前記ラマンスペクトルのウイルス成分を、ウイルス力価を決定するための前記モデルに適用することによって、前記試料の前記ウイルス力価を定量化することと、
を含む、方法。
【請求項2】
前記試料が、１つ以上のウイルス粒子型を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記試料が、２つ以上のウイルス粒子型を含有する流体試料であり、前記型が、１つ以上の遺伝要素によって異なる、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記１つ以上の遺伝要素が、ウイルス粒子ゲノムへの遺伝子挿入、置換、又は欠失を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記１つ以上の遺伝要素が、前記ウイルス粒子ゲノムへの外来性遺伝子挿入を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ウイルス粒子が、レトロウイルス粒子、レトロウイルス様粒子、アデノウイルス粒子、アデノウイルス様粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス様粒子、単純ヘルペスウイルス粒子、及び単純ヘルペスウイルス様粒子から選択される、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記ウイルス粒子が、レトロウイルス粒子である、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記レトロウイルス粒子が、レンチウイルス粒子である、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ラマン分光法が、表面増強ラマン（ＳＥＲ）分光法である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＳＥＲ分光法が、金属基板を使用して実施され、前記金属が、金、銀、銅、及び白金、並びにそれらの合金から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ＳＥＲ分光法が、金基板上で実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記光源が、５５０～１０６４ｎｍの波長を有する狭帯域幅レーザーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＳＥＲ分光法が、銀基板を使用して実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項14】
前記光源が、４００～１０６４ｎｍの波長を有する狭帯域幅レーザーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ラマンスペクトルから前記ウイルス成分のスコアを抽出することと、前記試料の前記ラマンスペクトルから抽出された前記スコアを前記モデルに適用して、前記試料中の前記ウイルス力価を定量化することと、
を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記モデルが、ウイルス粒子型特異的較正曲線であり、ウイルス粒子型特異的成分のスコアが、抽出され、前記モデルに適用されて、前記試料中のウイルス粒子型特異的力価が定量化される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
試料中のウイルス力価を定量化するのに好適なモデルを生成するための方法であって、前記方法が、２つ以上の試料を提供することであって、各試料が、既知のウイルス型及び既知の力価を含有する、２つ以上の試料を提供することと、
各試料をラマン分光法に供して、各既知のウイルス型及び力価についての参照スペクトルを生成することと、
前記参照スペクトルからウイルス型特異的成分を特定することと、
既知のウイルス型及び既知の力価の各試料についての前記成分のスコアを決定することと、
前記スコアに基づいてウイルス力価を定量化するための前記モデルを生成することと、
を含む、方法。
【請求項18】
各試料についての前記参照スペクトルが、前記試料の２つ以上のスペクトルを分析することによって生成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記特定することの前に、前記参照スペクトルからバックグラウンドスペクトルを減算することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項20】
前記特定することが、計量化学分析を、前記２つ以上の試料から生成された前記参照スペクトルに適用して、前記参照スペクトル間の変動の１つ以上の成分を特定することと、
異なる既知の力価を有する各既知のウイルス型の２つ以上の試料からのスペクトル中の特定された前記１つ以上の成分のスコアを評価することと、
前記評価することに基づいて、前記ウイルス型特異的成分として既知のウイルス力価と相関する前記成分を選択することと、
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項21】
前記計量化学分析が、多変量曲線分析である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
生成された前記モデルが、ウイルス型特異的較正曲線である、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記２つ以上の試料が、少なくとも２つの異なるウイルス型を含み、前記ウイルス型が、１つ以上の遺伝要素によって異なる、請求項１７に記載の方法。
【請求項24】
前記１つ以上の遺伝要素が、ウイルスゲノムへの遺伝子挿入、置換、又は欠失を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記１つ以上の遺伝要素が、前記ウイルスゲノムへの外来性遺伝子挿入を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記ウイルスが、レトロウイルス粒子、レトロウイルス様粒子、アデノウイルス粒子、アデノウイルス様粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス様粒子、単純ヘルペスウイルス粒子、及び単純ヘルペスウイルス様粒子から選択される、請求項１７～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記ウイルスが、レトロウイルス粒子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記レトロウイルス粒子が、レンチウイルス粒子である、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記ラマン分光法が、表面増強ラマン（ＳＥＲ）分光法である、請求項１７に記載の方法。
【請求項30】
前記ＳＥＲ分光法が、金属基板を使用して実施され、前記金属が、金、銀、銅、及び白金、並びにそれらの合金から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記ＳＥＲ分光法が、金基板を使用して実施される、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記供することが、各試料を、５５０～１０６４ｎｍの波長を有する狭帯域幅レーザーで照射することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記波長が、約７８５ｎｍである、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記供することが、約２５０ｍｓの曝露時間および約１．５０ｍＷでスペクトルを取得することを更に含む、請求項３１～３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記ＳＥＲ分光法が、銀基板を使用して実施される、請求項３０に記載の方法。
【請求項36】
前記供することが、各試料を、４００～１０６４ｎｍの波長を有する狭帯域幅レーザーで照射することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記波長が、約５３２ｎｍである、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記供することが、約２５０ｍｓの曝露時間および約０．６ｍＷでスペクトルを取得することを更に含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年１１月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／２８１，４４１号の優先権の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、国立衛生研究所によって与えられたＲ０１ ＧＭ１０９９８８の下で政府支援で行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【0003】
本開示は、ラマン分光法を使用して試料中のウイルス力価を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【0004】
レンチウイルス力価を迅速に特定及び決定する能力は、遺伝子編集から医薬品及びワクチン開発まで、多くの生物医学的課題にとって重要である。レンチウイルスは、細胞を再プログラム化するための遺伝情報を効率的に送達することが示されているエンベロープウイルスであり、これは、免疫療法において特に有用である（Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｈａｖｅ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ Ｃａｎ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ Ｍｅｍｏｒｙ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３（９５）：９５ｒａ７３（２０１１）、Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｂ－Ｃｅｌｌ Ｔｕｍｏｒｓ ｂｙ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｈｕｍａｎ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｃｏ－Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ＣＤ８０ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５，”Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９（３）：２７９－２８６（２００３）、Ｚｕｆｆｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｌｔｉｐｌｙ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ａｃｈｉｅｖｅｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（９）：８７１－８７５（１９９７））。療法のためにこれらのウイルスを産生する場合、レンチウイルスは、細胞を修飾し、意図しない感染を予防するためにウイルスの複製も予防するために必要な情報を含有するように改変される（Ｚｕｆｆｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｌｔｉｐｌｙ Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒ Ａｃｈｉｅｖｅｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｉｎ Ｖｉｖｏ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５（９）：８７１－８７５（１９９７）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｏｆ ＣＡＲ Ｔ Ｃｅｌｌｓ：Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ ３：１６０１５（２０１６））。これは、各形質転換ウイルスが、１つの細胞のみを形質転換することができることを意味する。したがって、形質転換ウイルスの有効な力価を知ることは、療法のための用量及び期待値を知るのに重要である。
【0005】
ウイルスを特性評価し、ウイルス力価を決定する現在の方法としては、ＥＬＩＳＡ（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｉｎｇｌｅ Ｖｉｒｕｓ Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｈ７Ｎ９ Ａｖｉａｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９０（３）：１６８３－１６９０（２０１８））、ＰＣＲ（Ｃａｒｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＲＴ－ＰＣＲ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｗｉｎｅ－ｌｉｎｅａｇｅ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ（Ｈ１Ｎ１）Ｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５（３）：１９６－１９９（２００９）、Ｐｉｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｆｉｒｓｔ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ＨｅｐａＲＧ Ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９（１）：１２９１０（２０１９））、及びｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｇｕｅｒｅｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｉｎ Ｂａｔｃｈ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ＨＥＫ２９３ Ｃｅｌｌｓ，”Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３８（１－３）：８７－９７（２００２））が挙げられる。これらの方法は、ウイルスの検出及び定量化に信頼性が高いが、いくつかの欠点がある。これらの方法は、多くの場合、既知の数の細胞を感染させ、次いでＰＣＲなどの分析を実施して、成功した再プログラム化を決定することを伴う。アッセイ及び細胞培養は、インキュベーション時間を考慮する場合、時間がかかり、かなりの試料調製を必要とする可能性がある。これは、これらの方法が、結果を提供するために数日から数週間かかる可能性があることを意味する。これらのウイルスを迅速に特性評価する能力は、医薬品及びワクチン開発において重要である。
【0006】
ＳＥＲＳは、プラズモン金属ナノ構造を利用して分析物のラマン信号を増強し、したがって、分析物の振動モードに基づいて分子フィンガープリントを提供する（Ｋｎｅｉｐｐ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９９（１０）：２９５７－２９７６（１９９９）、Ｍｏｓｋｏｖｉｔｓ，Ｍ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｐｈｙｓｉｃｓ ５７（３）：７８３－８２６（１９８５）、Ｓｔｉｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １（１）：６０１－６２６（２００８））。ＳＥＲＳは、ウイルス粒子を検出し、ウイルスの組成に基づいて分子フィンガープリントを提供する能力を示した（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗｌｙ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８７（２３）：１１６５２－１１６５９（２０１５）、Ｄａｒｄｉｒ ｅｔ．，“ＳＥＲＳ Ｎａｎｏｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃ １２４（５）：３２１１－３２１７（２０２０）、Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂａｓｅｄ ＳＥＲＳ Ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｓｑｕｉｔｏ－Ｂｏｒｎｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｍａｎ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃ １１９（４１）：２３６６９－２３６７５（２０１５）、Ｖｅｒｄｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｏｗｐｅａ Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ Ｍｏｔｔｌｅ Ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｓｓｅｍｂｌｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３（１９）：４３０１－４３０８（１９８４））。異なるインフルエンザ株は、ウイルスのエンベロープ上の異なる表面タンパク質から生じるＳＥＲＳスペクトルの差により区別されてきた（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗｌｙ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８７（２３）：１１６５２－１１６５９（２０１５））。ＳＥＲＳはまた、各ウイルスを構成する異なる核酸及びアミノ酸から生じる信号変化に基づいて、アデノウイルス、ＨＩＶ、及びライノウイルス粒子を区別することができる（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６））。ウイルスの多くのＳＥＲＳ研究は、ウイルスを標的とするために、アプタマー（Ｄａｒｄｉｒ ｅｔ．，“ＳＥＲＳ Ｎａｎｏｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃ １２４（５）：３２１１－３２１７（２０２０）、Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｉｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８６（１４）：６９１１－６９１７（２０１４））、又は抗体（Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ｂａｓｅｄ ＳＥＲＳ Ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｓｑｕｉｔｏ－Ｂｏｒｎｅ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｒａｍａｎ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃ １１９（４１）：２３６６９－２３６７５（２０１５）、Ｄｒｉｓｋｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｏｗ－Ｌｅｖｅｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｂｙ ａ Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｂａｓｅｄ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７７（１９）：６１４７－６１５４（２００５））を用いて、ナノ構造を官能化することによるＳＥＲＳベースのアッセイの開発を伴う。
【0007】
本開示は、ウイルス力価の決定における現在の欠陥を克服することを対象とする。
【発明の概要】
【0008】
本開示の第一の態様は、ラマン分光法を使用して試料中のウイルス力価を定量化する方法を対象とする。この方法は、試料を提供することと、試料中のウイルス力価を決定するためのモデルを提供することと、試料を光源で照射することと、試料のラマンスペクトルを取得することと、を含む。方法は、ラマンスペクトルのウイルス成分を、ウイルス力価を決定するためのモデルに適用することによって、試料のウイルス力価を定量化することを更に伴う。
【0009】
本開示の別の態様は、試料中のウイルス力価を定量化するのに好適なモデルを生成するための方法を対象とする。この方法は、２つ以上の試料を提供することであって、各試料が、既知のウイルス型及び対応する力価を含有する、提供することと、各試料をラマン分光法に供して、各既知のウイルス型及び力価についての参照スペクトルを生成することと、参照スペクトルからウイルス型特異的成分を特定することと、既知のウイルス型及び既知の力価の各試料についての当該成分のスコアを決定することと、を含む。方法は、当該スコアに基づいてウイルス力価を定量化するためのモデルを生成することを更に伴う。
【0010】
ウイルス力価を決定するためのより単純かつ迅速なアプローチを提供するために、ＳＥＲＳの使用を調査した。ＳＥＲＳを使用して、製剤培地中のウイルス粒子を検出及び区別した。２つのウイルス粒子型（１つは挿入遺伝子を含有し、１つはその遺伝子を有しない）を、様々な濃度で分析した。次いで、多変量曲線分解（ＭＣＲ）を使用して、スペクトルを区別し、挿入遺伝子を有する粒子のウイルス力価を決定した。これを、異なる励起波長での銀基板及び金基板の両方を使用して溶液中で実施した。異なる基板及び励起波長の使用から生じるスペクトル差も調査した。
【0011】
添付の実施例に示されるように、ＳＥＲＳは、現在の方法よりも少ない試料調製でウイルス力価を決定するための迅速なアプローチを提供する。ＳＥＲＳは、ウイルス型及び株を区別することが既に示されているが、本明細書に記載される方法論は、直接的なＳＥＲＳ測定を使用してウイルス力価を決定することを可能にする。結果は、レンチウイルス粒子を用いて提示されるが、この同じ方法論を他のウイルス型に適用することができる。この技術はまた、ウイルスゲノムに対する修飾を定量化するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】実験設定の概略図である。２つのウイルス粒子型をＳＥＲＳによって分析した。１つの粒子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするベクターを含有し、１つは含有しない。ＳＥＲＳスペクトルを、多変量曲線分解（ＭＣＲ）を使用して分析して、ＧＦＰベクターから生じる成分スペクトルを決定した。次いで、この成分を使用して、ＧＦＰコード粒子のウイルス力価を決定した。
【図2A】金基板上５０，０００ＴＵ／ｍＬでの、ＧＦＰを有する（灰色）及びＧＦＰを有しない（黒色）ＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルス（図２Ａ）、並びに異なる濃度のＧＦＰを有するＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルス（図２Ｂ）について取得されたＳＥＲＳスペクトルを示す。網掛け領域は、各濃度で得られた全てのスペクトルにわたる標準偏差を示す。
【図2B】金基板上５０，０００ＴＵ／ｍＬでの、ＧＦＰを有する（灰色）及びＧＦＰを有しない（黒色）ＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルス（図２Ａ）、並びに異なる濃度のＧＦＰを有するＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルス（図２Ｂ）について取得されたＳＥＲＳスペクトルを示す。網掛け領域は、各濃度で得られた全てのスペクトルにわたる標準偏差を示す。
【図3】様々な濃度のＧＦＰを有しないＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルスのＳＥＲＳスペクトルを示すグラフである。網掛け領域は、金基板上で取得された全てのスペクトルにわたる標準偏差を示す。
【図4】標準偏差が概説された、金基板上で取得されたＬＶ－ＭＡＸ培地の平均ＳＥＲＳスペクトルを示すグラフである。
【図5A】５００ＴＵ／ｍｌ、５，０００ＴＵ／ｍＬ、及び５０，０００ＴＵ／ｍＬで取得されたスペクトルを使用して開発されたＧＦＰを有するＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルスのＭＣＲモデルを示す。モデルを、１０，０００ＴＵ／ｍＬのスペクトルを使用して検証した。ＭＣＲ分析の前に、各濃度から水のスペクトルを減算した。図５Ａは、モデルの３つの成分負荷のスペクトルを示すグラフである。
【図5D】図５Ｄは、ＧＦＰを有しない粒子の平均スコア（５０，０００ＴＵ／ｍＬ）と比較してプロットされた、ＧＦＰを有しないレンチウイルス粒子の成分２での平均スコア（５０，０００ＴＵ／ｍＬ）及び粒子の保存培地の棒グラフである。
【図6】ＧＦＰを有するレンチウイルス粒子の最高濃度の平均ＳＥＲＳスペクトル（黒色）、及びＧＦＰを有する粒子を定量化するために使用されるＭＣＲモデルの成分スペクトル（灰色）を示すグラフである。
【図7】細胞蛍光によるウイルス力価の決定を示すグラフである。差し込み図は、分析された各濃度で明視野画像上にオーバーレイされた蛍光画像を示す。
【図8A】銀ＳＥＲＳ基板及び５３２ｎｍレーザー励起を使用した、ＧＦＰを有する及び有しないＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルスの分析を示す。図８Ａは、５０，０００ＴＵ／ｍＬでのＧＦＰを有する（灰色）及び有しない（黒色）レンチウイルスの平均ＳＥＲＳスペクトルを示すグラフである。
【図9】ＧＦＰをコードするレンチウイルス粒子（上）、同一であるがＧＦＰ遺伝子を有しないレンチウイルス粒子（中央）、及びキャプシド内にＲＮＡを有しないレンチウイルス粒子（空のキャプシド、下）から収集されたＳＥＲＳスペクトルを示すグラフである。ウイルス中に存在する遺伝子含有量と相関し得る分光学的差が観察される。全てのスペクトルは、金のＳＥＲＳ基板を用いた７８５ｎｍの励起を使用して収集される。
【図10F】図１０Ｆ～Ｈは、互いに対してプロットされた２つの成分を有するＪＬＶ１試料についてのスペクトル成分スコアの比較を示すグラフである：成分１対成分２（図１０Ｆ）、成分１対成分３（図１０Ｇ）、及び成分２対成分３（図１０Ｈ）。
【発明を実施するための形態】
【0013】
定義
本方法を説明する前に、本発明は、記載される特定の方法論に限定されず、これらは変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定のバージョン又は実施形態のみを記述するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本明細書の実施形態の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、本明細書の実施形態の実施形態の実践又は試験に使用することができるが、好ましい方法、デバイス、及び材料をここで説明する。本明細書で言及された全ての刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本明細書の実施形態が、先行発明によってそのような開示に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
本方法を説明する前に、本発明は、記載される特定の方法論に限定されず、これらは変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定のバージョン又は実施形態のみを記述するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本明細書の実施形態の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されるべきである。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、本明細書の実施形態の実施形態の実践又は試験に使用することができるが、好ましい方法、デバイス、及び材料をここで説明する。本明細書で言及された全ての刊行物は、参照によりその全体が組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本明細書の実施形態が、先行発明によってそのような開示に先行する権利を有しないことを認めるものとして解釈されるべきではない。
【0014】
本明細書で使用される場合、及び添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。
【0015】
別段の記載がない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などの任意の数値は、どの場合においても用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、数値は、典型的には、列挙された値の±１０％、又はより具体的には、列挙された値の±５％、又は列挙された値の±３％、±２％、若しくは±１％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度が、０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１％～１０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲は、０．９％（ｗ／ｖ）～１１％（ｗ／ｖ）を含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用には、文脈が別途明確に示さない限り、全ての可能性のある部分範囲、その範囲内の整数、及び値の端数を含む、その範囲内の全ての個々の数値が明示的に含まれる。
【0016】
別段の示唆がない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、一連の要素の中の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、単に通常の実験のみを使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認識するか、又は確認することができるであろう。このような同等物は、本発明によって包含されることが意図される。
【0017】
本明細書で使用される場合、用語「含む」、「含んでいる」、「含まれる」、「含まれている」、「有する」、「有している」、「含有する」、「含有している」、又はそれらの任意の他の変形は、指定された整数若しくは整数の群を含めるが、任意の他の整数若しくは整数の群を除外しないことを暗示するものと理解され、非排他的又は無制限なものとして意図される。例えば、要素のリストを含む、組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されず、明示的に列挙されていない、又はこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、又は装置に固有の他の要素を含むことができる。更に、反対の趣旨に明示的に言及されない限り、「又は」は、排他的又は、ではなく、包括的又は、を指す。例えば、条件Ａ又は条件Ｂは、以下のいずれか１つによって満たされる：Ａが真（又は存在）であり、Ｂが偽（又は存在せず）であり、Ａが偽（又は存在せず）であり、Ｂが真（又は存在）であり、かつＡ及びＢの両方が真（又は存在）である。本明細書で使用される場合、複数の列挙された要素の間の結合用語「及び／又は」は、個々の選択肢及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって結合される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素の適用可能性を指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素の適用可能性を指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素を併せた適用可能性を指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つが、その意味の範囲内にあると理解され、したがって、本明細書で使用される場合、用語「及び／又は」の要件を満たす。複数の選択肢の同時適用性もまた、意味のうちに含まれ、したがって、用語「及び／又は」の要件を満たすと理解される。
【0018】
本明細書で使用される場合、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して使用される、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、又は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」若しくは「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」などの変形は、任意の列挙された整数又は整数の群を含むことを示すが、指定された方法、構造、又は組成物に、追加の整数又は整数の群を追加することはできないことを示す。
【0019】
本明細書で使用される場合、本明細書及び特許請求の範囲全体を通して使用される、用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、又は「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」若しくは「から本質的になること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの変形は、任意の列挙された整数又は整数の群を含むことを示し、かつ指定された方法、構造、又は組成物の基本特性又は新規な特性を実質的に変化させない任意の列挙された整数又は整数の群を含むことを示す。
【0020】
また、好ましい発明の構成要素の寸法又は特性を指す際に、本明細書で使用される用語「約」、「およそ」、「概して」、「実質的に」などの用語は、当業者によって理解されるように、記載される寸法／特性が厳密な境界又はパラメータではなく、機能的に同じ又は類似の軽微な変動を排除しないことを示すことも理解されるべきである。少なくとも、数値パラメータを含むこのような参照は、当技術分野で受け入れられている数学的及び産業的原理（例えば、丸め、測定、又は他の系統的誤差、製造公差など）を使用して、最小の有効桁を変化させない変動が含まれる。
【0021】
試料中のウイルス力価を定量化する方法
本開示の第一の態様は、ラマン分光法を使用して試料中のウイルス力価を定量化する方法を対象とする。この方法は、試料を提供することと、試料中のウイルス力価を決定するためのモデルを提供することと、を含む。試料は、光源で照射され、試料のラマンスペクトルが取得される。方法は、ラマンスペクトルのウイルス成分を、ウイルス力価を決定するためのモデルに適用することによって、試料のウイルス力価を定量化することを更に伴う。
本開示の第一の態様は、ラマン分光法を使用して試料中のウイルス力価を定量化する方法を対象とする。この方法は、試料を提供することと、試料中のウイルス力価を決定するためのモデルを提供することと、を含む。試料は、光源で照射され、試料のラマンスペクトルが取得される。方法は、ラマンスペクトルのウイルス成分を、ウイルス力価を決定するためのモデルに適用することによって、試料のウイルス力価を定量化することを更に伴う。
【0022】
ウイルスは、別の生物の生細胞内部でのみ複製することができる超顕微鏡的な感染因子である（典型的には細菌よりも小さい）。ウイルスは、ＲＮＡ又はＤＮＡベースのゲノムを有し得る。本明細書に記載される方法に従って、ウイルスは、任意の自然発生的ウイルス、修飾ウイルス、又はウイルスベクターを包含する。したがって、任意の野生型ウイルスのウイルス力価は、本開示に従って評価され得るが、本明細書に開示される方法の有用性は、変異又は修飾ウイルス（例えば、野生型若しくは自然発生的ウイルスと比較して１つ以上の核酸置換、挿入、欠失、若しくは転座を含むウイルス、又はウイルスタンパク質をコードする遺伝物質の大部分が存在しない）あるいはウイルスベクターのウイルス力価の評価にまで及ぶことが理解されるであろう。
【0023】
本明細書に開示される方法に従って決定されるウイルス力価は、ウイルス粒子の検出との関連で記載される。ウイルス粒子（ｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅ）又はウイルス粒子（ｖｉｒａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ）は、その宿主とは独立した（すなわち、細胞中には見られない）ウイルスであるが、ウイルスゲノム及びウイルスキャプシド（又はウイルスの外皮）を含む。本明細書に記載される方法はまた、ウイルス様粒子の力価を決定するのに好適である。ウイルス様粒子は、ウイルスの外皮からのある特定のタンパク質を含有するが、ウイルスからの遺伝物質のいずれも又は全てを含有せず、感染を引き起こすことができない小粒子である。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、自然発生的であり得るか、又はウイルス様構造に自己集合するウイルス構造タンパク質の個々の発現によって合成され得る。合成ウイルス様粒子はまた、ウイルスタンパク質、例えば、ウイルス構造タンパク質を提示及び／又は含有するように修飾されたリポソーム又はポリマー粒子を含み得る。本開示の目的で、ウイルス粒子の力価を決定することに言及される場合、これは、ウイルス粒子、及びウイルス様粒子の全ての形態、すなわち、自然発生的ＶＬＰ、合成ＶＬＰ、リポソームベースのＶＬＰ、ポリマー粒子ＶＬＰなどの力価を決定することを包含することが理解されるべきである。
【0024】
いくつかの実施形態では、試料のウイルス力価は、１つ以上のウイルス粒子型を含む試料中で決定される。いくつかの実施形態では、試料は、２つ以上のウイルス粒子型、例えば、２つのウイルス粒子型、３つのウイルス粒子型、４つのウイルス粒子型、５つのウイルス粒子型、又は６つ以上のウイルス粒子型を含有する。
【0025】
いずれの実施形態でも、２つ以上のウイルス粒子型は、１つ以上の遺伝要素によって異なる。例えば、試料中の２つ以上のウイルス粒子型は、ウイルス粒子ゲノム中の１つ以上の遺伝子挿入、置換、転座、又は欠失によって異なり得る。いくつかの実施形態では、２つ以上のウイルス粒子は、遺伝子挿入、例えば、ウイルス粒子ゲノムへの外来性遺伝子又はその一部の挿入によって異なる。ウイルス粒子型間で１つ以上のタンパク質の差も生じさせ得る１つ以上の遺伝的差は、本明細書に記載されるように、ウイルス力価を定量化するのに有用なウイルス型特異的成分を特定するための基礎を提供する。
【0026】
本明細書に開示される方法はまた、試料中のウイルスベクターの力価を決定するのに好適である。ウイルスベクターは、標的細胞（例えば、治療用途の遺伝子）に遺伝物質を導入するために一般的に使用されるウイルスの修飾された非感染型である。したがって、ウイルスベクターは、例えば、遺伝子療法、細胞療法、又は他の分子用途など、特定の有用性があり、それらの産生は、遺伝子療法及び細胞療法産業の中心である。いくつかの実施形態では、試料のウイルス力価は、１つ以上のウイルスベクターを含む試料中で決定される。いくつかの実施形態では、試料は、２つ以上のウイルスベクター、例えば、２つのウイルスベクター、３つのウイルスベクター、４つのウイルスベクター、５つのウイルスベクター、又は６つ以上のウイルスベクターを含有する。
【0027】
任意の実施形態では、パッケージング細胞株によって産生されるウイルスベクターの力価は、本明細書に開示される方法によって監視又は評価され得る。遺伝子療法及び細胞療法分野では、例えば、産生細胞株からの産生などの産生プロセスが正確に監視及び管理され得るように、産生された力価を高感度で測定することができることが特に重要である。したがって、ウイルスは、本明細書に開示される方法によって監視又は評価されるのに十分に機能的又は野生型である必要はない。
【0028】
「ウイルス力価」という用語は、所与の体積中に存在するウイルス（すなわち、ウイルス粒子、ＶＬＰ、及び／又はウイルスベクター）の量を指す。任意のタイプのウイルス力価が本発明で評価され得、例えば、物理的ウイルス力価、機能的ウイルス力価（感染性ウイルス力価とも称される）、又は形質導入ウイルス力価が評価され得る。
【0029】
特定の実施形態では、物理的ウイルス力価が評価され得る。物理的ウイルス力価は、試料中のウイルス粒子の濃度の尺度であり、通常、ウイルスタンパク質又はウイルス核酸、すなわち、ウイルス成分の存在に基づく。物理的力価は、１ｍＬ当たりのウイルス粒子（ＶＰ／ｍＬ）、１ｍＬ当たりのウイルスゲノム（ｖｇ／ｍＬ）、１ｍＬ当たりのウイルスコピー、又は１ｍＬ当たりのＲＮＡコピーとして表され得、本明細書に記載される方法を使用して決定され得る。物理的力価測定は、空のウイルス粒子又は欠陥ウイルス粒子と、細胞に感染することができる粒子とを必ずしも区別するわけではない。したがって、物理的ウイルス力価は、どれだけの産生された粒子が細胞に感染することができるかを判断する機能的力価又は感染性力価、及びどれだけの機能的ウイルス粒子が目的の遺伝子を含有するかを判断する形質導入ウイルス力価（例えば、ウイルスベクターの産生については、形質導入ウイルス力価が関連し得る）と区別され得る。したがって、物理的力価の決定は、試料中の全ての粒子が機能的でない限り、機能的力価の決定と同等ではない。実際に、機能的力価は、多くの場合、物理的力価よりも１００～１０００倍低い。
【0030】
あるいは、機能的力価又は感染性力価は、本発明で測定又は評価され得、機能的力価又は感染性力価は、標的細胞に感染することができる特定の体積中に存在するウイルス粒子の量の尺度である。機能的力価は、１ｍＬ当たりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）、１ｍＬ当たりの感染単位（ｉｆｕ／ｍＬ）、又は１ｍＬ当たりのトランスフェクション単位（ＴＵ／ｍＬ）として表され得る。
【0031】
形質導入力価は、標的細胞に感染することができ、かつ目的の遺伝子を含む、特定の体積中に存在するウイルス粒子の量の尺度である。形質導入力価は、形質導入単位／ｍＬとして表され得、本明細書に記載されるアッセイを使用して評価され得る。当業者は、機能的力価又は形質導入力価が、物理的力価について得られた任意の値をスケールダウンすることによって決定され得ることを理解するであろう。上述のように、物理的力価と機能的力価又は形質導入力価との間の倍率差は、当該技術分野で十分理解されている。したがって、本発明の一態様では、機能的力価又は形質導入力価は、本発明の方法によって間接的に決定され得る（例えば、物理的力価について得られた値をスケールダウンすることを通して）。したがって、本発明の方法は、物理的力価の決定をスケールダウンして、機能的力価又は形質導入力価を決定する追加の工程を含み得る。
【0032】
本発明の方法は、ウイルス力価を監視又は評価することができる。したがって、本発明の方法は、ウイルス力価、例えば、試料中に存在するウイルス粒子のレベル、量、又は濃度を決定することができる。したがって、方法は特に、ウイルスのレベル、量、又は濃度が（例えば、同一又は同等の時点でアッセイされた）異なる試料と比較して、（例えば、異なる時点で試料をアッセイすることによって）経時的に増加する若しくは横ばい状態になるかどうか、又は変動する（例えば、増加する、減少する、若しくは同等である）かどうかを判断することができる。このようにして、本明細書に開示される方法は、例えば、ウイルスの生産方法の効率を評価するために使用され得るか（例えば、高レベルのウイルスの検出若しくは決定が、効率的な方法を示し得、低レベルのウイルスが、準最適な産生方法を示し得る）、又は例えば、他の改変された産生方法（同一の若しくは異なるウイルスについて）で測定されたウイルス力価との比較によって測定されるウイルス力価との比較によって、ウイルスの産生方法における特定の因子の重要性を決定するために使用され得る。
【0033】
本発明の方法はまた、ウイルス産生プロセスの下流の任意のプロセスを評価するために、例えば、任意のそのようなプロセスがウイルス力価に影響を与えたかどうかを判断するために使用され得る。いずれの実施形態でも、本明細書に開示される方法は、精製方法を評価するのに好適であり、これは、そのような精製方法が力価に対して何らかの影響を有したかどうか、例えば、精製前の試料中に存在するウイルス力価と比較して、そのような精製後に力価が増加した、減少した、又は同等のままであったかどうかを判断するために用いられ得る。本明細書に開示される方法は、ウイルスの、例えば、ウイルス粒子、ＶＬＰ、又はウイルスベクターの大規模製造を評価するために更に使用され得、これは、遺伝子療法のためのウイルス粒子又はベクターの製造に特に重要であり得る。
【0034】
本明細書に開示される方法は、別の試料に対するある試料のウイルス力価の増加又は減少を決定することができる。任意の実施形態では、本明細書に開示される方法は、測定が比較されているウイルス力価の約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の増加、及び測定が比較されているウイルス力価の約１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の減少を決定するのに好適である。同等のウイルス力価は、測定が比較されているウイルス力価の５％以内であり得る。
【0035】
これに関して、一部の目的で、ウイルス力価に何らかの変化又は変動が生じたかどうかを判断するために、方法を実施する前、並びに方法の後及び／又は最中にウイルス力価を評価することが望ましい場合があることが理解されるであろう。本明細書に開示される方法は、ウイルス力価の、例えば（同等の若しくは異なる時点での）異なる試料内の、又は異なる時点での同じ試料内のウイルス力価との比較工程を更に含み得る。別の実施形態では、方法は、対象におけるウイルス感染の程度を決定するために、例えば、感染がうまく治療されている又は低減されているかどうかを判断するために使用され得る。そのような方法では、試料、例えば、異なる時点での対象からの同じ型の試料中のウイルス力価を比較して、ウイルス力価が経時的に増加する、減少する、又は同等なままであるかどうかを判断することが望ましい場合がある。代替的又は追加的に、個体からの試料中のウイルス力価を、ある状態について以前に得られており、かつ例えば、感染段階及び／又は予後を示し得るウイルス力価測定値と比較することが望ましい場合がある。
【0036】
代替的に、本明細書に開示される方法は、試料中のウイルスの実際の量、レベル、又は濃度を決定しなくてもよいが、その量、レベル、又は濃度が許容可能な閾値を上回っている又は下回っているかどうかを判断し得、例えば、産生方法について、閾値は、試料内に許容可能なレベルのウイルス粒子が存在するかどうかを判断し得る。本明細書に開示される方法は、ウイルス力価のレベルが以前にアッセイされた試料に対して増加する、減少する、又は同等であるかどうかを判断し得、したがって、特定の用途では、実際のウイルス力価（例えば、存在するウイルスの量又は濃度）を決定する必要がない場合があることが理解されるであろう。
【0037】
本明細書に記載される試料中のウイルス力価を決定する方法に従って、好適な試料は、１つ以上のウイルス粒子、ＶＬＰ、又はウイルスベクターを含有する、又は含有すると予想される任意の試料を含む。試料中のウイルス力価は、ラマン分光法によってｉｎ ｓｉｔｕで、リアルタイムで測定され得るか、又はｅｘ ｓｉｔｕで、試料上で実施され得る。
【0038】
「ｉｎ ｓｉｔｕ」とは、ウイルス粒子を産生することができる培養物中のラマン散乱光の強度を得るための測定が、ウイルス粒子が生成される一次培養環境から行われ、一次培養環境から抽出された試料からではないことを意味する。したがって、測定を「ｉｎ ｓｉｔｕ」で行うことによって、液体取り扱い工程の必要性はない。したがって、その環境からの試料の除去は、本発明の特定の用途に必要とされない場合があり、試料のｉｎ ｓｉｔｕ測定が好ましい場合がある。試料のｉｎ ｓｉｔｕ測定は、試料の一部分が除去される実際の試料採取工程を必要とせずに、試料中のウイルス力価の定期的な評価を可能にし得る。この点におけるウイルス力価評価は、コスト及び誤差をもたらし得る追加の工程を必要とせずに、リアルタイムで正確かつ高感度で測定され得る。
【0039】
あるいは、本明細書に開示される方法は、ｅｘ ｓｉｔｕで、試料上で実施され得る。「ｅｘ ｓｉｔｕ」とは、ウイルス粒子を産生することができる培養物中のラマン散乱光の強度を得るための測定が、ウイルス粒子が１つ以上の液体取り扱い工程の後に産生される一次培養環境から抽出された試料から行われることを意味する。特定の実施形態では、本明細書に開示される方法は、試料採取の工程を含み得る。
【0040】
本明細書に記載される方法で使用される試料の起源は、ウイルスが産生されている細胞培養物であり得る。したがって、試料は、培養培地（例えば、任意選択的に血清、Ｌ－グルタミン、及び／又は他の成分を含む、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ＳＦＩＩ、ＬＶＭＡＸ、Ｔｅｘｍａｃｓ、又はＰＢＳ）のうちの１つであり得、これは、例えば、ウイルス産生プロセス中に採取された場合、パッケージング細胞を追加的に含み得る。代替的に、試料は、ウイルス回収中に得られた、部分的に精製された試料又は細胞を含まない試料であり得る。試料は、例えば、マーケティング、販売、又は使用前に品質検査を必要とする、医学的使用のための試料ウイルスであり得る。試料は更に、ウイルスによって感染している疑いがある対象（例えば、ヒト又は哺乳動物対象）由来の試料であり得る。したがって、試料は、血液、唾液、痰、血漿、血清、脳脊髄液、尿、又は糞便試料などの生物学的試料であり得る。他の試料供給源には、開放水又は公共用水の供給由来のものが含まれる。
【0041】
本明細書に記載される試料中のウイルス力価を決定する方法は、試料を光源で照射することと、試料のラマンスペクトルを取得することと、を伴う。ラマン分光法は、試料によって散乱した単色光の波数の変化を測定して、それらの化学組成、物理的状態、及び環境に関する情報を提供する。これは、入射光量子が、試料を含む分子中に存在する振動モードと相互作用する方法のために可能である。これらのモードは、所与の物理的条件のセットの下で特定の振動周波数及び散乱強度を有し、これにより、所与の目的の分析物の量を定量化することが可能になる。広帯域光源からの異なるエネルギーの光の吸収が測定される赤外吸収分光法とは異なり、ラマン分光法では、散乱光に対する単色入射光のエネルギーの差が測定され、これは、ラマンシフトとして知られている。
【0042】
ラマンスペクトルは、分子の振動状態についての情報を提供することによって、試料の定性的及び定量的な分析を可能にする「分子フィンガープリント」を提供する。多くの分子は、多くの振動状態で存在することができる原子結合を有する。そのような分子は、その許容される振動状態のうちの２つの間の移行に一致する入射放射を吸収し、かつその後に放射線を放出することができる。最も頻繁に、吸収された放射は、レイリー又は弾性散乱と指定されたプロセスである同じ波長で再放射される。いくつかの事例では、再放射された放射は、吸収された放射よりもわずかに多い又はわずかに少ないエネルギーを含有することができる（分子の許容可能な振動状態並びに初期及び最終の振動状態に依存する）。入射放射と再放射された放射との間のエネルギー差の結果は、入射放射と再放射された放射との間の波長のシフトとして現れ、差の程度は、波数（逆の長さ）の単位で測定されるラマンシフト（ＲＳ）に指定される。入射光がレーザー源を使用する場合のように実質的に単色（単一波長）である場合、周波数が異なる散乱光は、レイリー散乱光とより容易に区別され得る。
【0043】
任意の実施形態では、本明細書に開示される方法に従って利用されるラマン分光法は、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）である。ＳＥＲＳは、粗い金属表面（例えば、粗い銀若しくは金の表面）上に吸着された分子によって、又は基板上のプラズモン－磁気シリカナノチューブなどのナノ構造によって、ラマン散乱を増強する表面感受性技術である。
【0044】
任意の実施形態では、本明細書に記載されるウイルス力価を決定する方法におけるＳＥＲＳの適用は、シリコン、石英、又はガラス基板などの平面（又は平坦）基板を使用して実施される。平面基板はまた、半導体（例えば、Ｓｉ、ＧａＡｓ、ＧａＡｓＰ、及びＧｅ）、酸化物（例えば、ＳｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３）、並びにポリマー（例えば、ポリスチレン、ポリアセチレン、ポリエチレンなど）を含むがこれらに限定されない材料で作製され得る。別の実施形態では、基板は、円筒形又は円錐形の基板（例えば、光ファイバー又はピペットチップ）などの非平面基板である。基板は、ドットアレイ、ラインアレイ、若しくはウェルアレイなどのマイクロパターン又は類似のナノパターンなどの規則的なアレイを有する基板など、マイクロ加工又はナノ加工された基板であり得る。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従ったＳＥＲＳは、金属基板を使用して実施され、金属は、金、銀、銅、及び白金、並びにそれらの合金から選択される。一実施形態では、ウイルス力価を決定するためのＳＥＲＳは、金基板上で実施される。別の実施形態では、ウイルス力価を決定するためのＳＥＲＳは、銀基板を使用して実施される。
【0045】
任意の実施形態では、本明細書に開示される方法におけるＳＥＲＳの適用は、ナノ構造を含有するように修飾された基板を使用して実施される。好適なナノ構造としては、ナノロッド、ナノワイヤ、ナノチューブ、ナノスパイラル、ナノスフェア、ナノトライアングル、ナノスター、それらの組み合わせなど、及び各々の均一なアレイが挙げられるが、これらに限定されない。（上記のタイプの）ナノ構造は、金属、金属酸化物、金属窒化物、金属酸窒化物、金属炭化物、ドープ材料、ポリマー、多成分化合物、化合物（例えば、化合物若しくは前駆体化合物、又は有機若しくは無機化合物）、及びそれらの組み合わせなどであるがこれらに限定されない、１つ以上の材料で製造され得る。金属としては、銀、ニッケル、アルミニウム、ケイ素、金、白金、パラジウム、チタン、銅、コバルト、亜鉛、他の遷移金属、それらの複合物、それらの酸化物、それらの窒化物、それらのケイ化物、それらのリン化物、それらの酸窒化物、それらの炭化物、及びそれらの組み合わせが挙げられ得るが、これらに限定されない。任意の実施形態では、材料は、銀又は金である。任意の実施形態では、ナノ構造の組成は、基板材料の組成と同じである。任意の実施形態では、ナノ構造の組成は、基板材料とは異なる。
【0046】
Ｓｉｌｍｅｃｏ ＡｐＳ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｈｏｒｉｂａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、Ｏｃｅａｎ Ｏｐｔｉｃｓ（Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬ）、Ａｔｏ ＩＤ（Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）、Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、及びＳＥＲＳｉｔｉｖｅ（Ｗａｒｓａｗ，Ｐｏｌａｎｄ）から入手可能な様々なＳＥＲＳ基板を含むがこれらに限定されない、多くの市販のＳＥＲＳ基板が、本開示の方法を実施する際に使用され得る。代替的に、当業者であれば当然のことながら、カスタマイズされたＳＥＲＳ基板が代替的に使用され得、これらが、ナノ構造化材料、並びにウイルス粒子結合／配向を促進する任意の表面結合試薬に関してカスタマイズされ得ることを理解するであろう。
【0047】
本開示の方法は、ウイルス力価に関する情報が必要とされる試料を提供することと、試料を基板又は基板上のナノ構造上に導入することと、試料を光源で照射することと、試料中のウイルス力価を決定するために使用される試料のラマンスペクトルを取得することと、を伴う。上述のように、及び実施例において、試料は、未希釈形態で、１つ以上の希釈（１０倍、１００倍などの連続希釈を含む）を使用して、又は両方で評価されるものとする。
【0048】
任意の実施形態では、試料を照射するために利用される光源は、狭帯域幅レーザーである。好適な波長としては、３００～１２００ｎｍ、３５０～１１００ｎｍ、４００～１１００ｎｍ、４００～１０６４ｎｍ、４５０～１０６４ｎｍ、５００～１０６４ｎｍ、５５０～１０６４ｎｍ、６００～１０６４ｎｍ、６５０～１０６４ｎｍ、７００～１０６４ｎｍ、４５０～１１００ｎｍ、又は５００～１１００ｎｍの波長が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、光源は、５５０～１０６４ｎｍの波長を有する狭帯域幅レーザーである。一実施形態では、光源は、４００～１０６４ｎｍの波長を有する狭帯域幅レーザーである。
【0049】
任意の実施形態では、光源は、約８００ｎｍ、約７８５ｎｍ、約７５０ｎｍ、約７２５ｎｍ、約７００ｎｍ、約６７５ｎｍ、約６５０ｎｍ、約６２５ｎｍ、約６００ｎｍ、約５７５ｎｍ、約５５０ｎｍ、約５３２ｎｍ、約５２５ｎｍ、又は約５００ｎｍの波長を有する狭帯域幅レーザーである。好ましくは、光源は、約７８５ｎｍ、約６４０（例えば、６３８ｎｍ）、又は約５３２ｎｍの波長を有する狭帯域幅レーザーである。
【0050】
任意の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って試料からラマンスペクトルを取得する工程は、約１００ｍｓ、１５０ｍｓ、２００ｍｓ、２５０ｍｓ、３００ｍｓ、３５０ｍｓ、４００ｍｓ、４５０ｍｓ、５００ｍｓ、５５０ｍｓ、６００ｍｓ、６５０ｍｓ、７００ｍｓ、７５０ｍｓ、８００ｍｓ、８５０ｍｓ、９００ｍｓ、９５０ｍｓ、１０００ｍｓ、又は１０００ｍｓ超の曝露時間でスペクトルを取得することを含む。任意の実施形態では、ラマンスペクトルは、約２５０ｍｓの曝露時間を使用して取得される。
【0051】
ラマン信号強度は、試料を励起するために使用されるラマンレーザーの出力に正比例する。利用されるレーザー出力が大きいほど、ラマン信号はより大きくなり、利用される特定のレーザー出力は、特定の試料のために最適化され得る。しかしながら、任意の実施形態では、ウイルスを含有する試料のスペクトルは、約１．９ｍＷ、約１．８ｍＷ、約１．７ｍＷ、約１．６ｍＷ、約１．５０ｍＷ、約１．４ｍＷ、約１．３ｍＷ、約１．２ｍＷ、約１．１ｍＷ、約１ｍＷ、約０．９ｍＷ、約０．８ｍＷ、約０．７ｍＷ、０．６ｍＷ、又は０．５ｍＷの出力を有するラマンレーザーを使用して取得され得る。任意の実施形態では、スペクトルは、約１．５０ｍＷの出力を有するラマンレーザーで取得される。任意の実施形態では、スペクトルは、０．６ｍＷの出力を有するラマンレーザーで取得される。
【0052】
続いて、試料を光源で照射することから得られたラマンスペクトルが分析され、ラマンスペクトルからのウイルス成分についてのスコアが、抽出される。特定の波長で、特定のラマンスペクトルについて得られるピークは、ウイルス粒子特異的アミノ酸（例えば、キャプシドタンパク質などに存在する）又は核酸（例えば、ウイルス粒子によって封入されたＲＮＡ若しくはＤＮＡ）に対応し得るか、あるいは非ウイルス性（例えば、培養物中の代謝物）であるが、その中のウイルスの存在から生じる分子／化合物に対応し得る。このようにして、ラマン分光法を利用して、試料中のウイルスの存在を直接又は間接的に検出することができ、その後、これをスコアリングし、試料中のウイルス力価を決定するために利用される対応するモデルに適用することができる。例えば、本明細書に記載されるように、本明細書に記載される方法に従ってウイルス力価を決定するための好適なモデルは、ウイルス粒子特異的較正曲線を含む。したがって、モデルを生成するために利用されるウイルス粒子特異的成分は、実験試料（すなわち、未知のウイルス力価を含有する試料）から得られたラマンスペクトルから分析及びスコアリングされたウイルス成分である。ウイルス粒子特異的成分についてのスコアがラマンスペクトルから抽出されると、これはモデルに適用されて、ウイルス粒子特異的力価が定量化される。
【0053】
本開示の別の態様は、試料中のウイルス力価を定量化するのに好適なモデルを生成するための方法を対象とする。この方法は、２つ以上の試料を提供することであって、各試料は、既知のウイルス型及び対応する力価を含有する、提供することと、各試料をラマン分光法に供して、各既知のウイルス型及び力価についての参照スペクトルを生成することと、を含む。方法は、参照スペクトルからウイルス型特異的成分を特定することと、既知のウイルス型及び既知の力価の各試料についての当該成分のスコアを決定することと、を更に伴う。方法は、決定されたスコアに基づいてウイルス力価を定量化するためのモデルを生成することを更に伴う。
【0054】
試料中のウイルス力価を定量化するのに好適なモデルを生成するために、既知のウイルス型及び既知の量の対応するウイルス力価を含有するいくつかの試料が、ラマン分光法、特にＳＥＲＳを使用して分析される。一部のモデルについて、２つ以上の試料がラマン分光法を使用して分析される。他のモデルを生成するために、３つ以上の試料、４つ以上の試料、５つ以上の試料、６つ以上の試料、７つ以上の試料、８つ以上の試料、９つ以上の試料、１０個以上の試料、１５個以上の試料、又は２０個以上の試料が必要とされる。
【0055】
既知のウイルス型及び既知の量の対応するウイルス力価を含有する各試料についての１つ以上のラマンスペクトルが収集される。いくつかの実施形態では、１つ以上のスペクトルは、これらの試料の各々について収集される。例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、１００個以上、２００個以上、３００個以上、４００個以上、又は５００個以上のスペクトルが、これらの試料の各々について収集される。
【0056】
本開示のこの態様に従って、試料は、上記のようにラマン分光法に供される。任意の実施形態では、ラマン分光法は、上記のような表面増強ラマン分光法であり、スペクトルは、上記のような金属基板（例えば、金若しくは銀）及び／又はナノ構造上の試料から得られる。
【0057】
任意の実施形態では、試料を照射して参照スペクトルを得るために利用される光源は、狭帯域幅レーザーである。好適な波長としては、３００～１２００ｎｍ、３５０～１１００ｎｍ、４００～１１００ｎｍ、４００～１０６４ｎｍ、４５０～１０６４ｎｍ、５００～１０６４ｎｍ、５５０～１０６４ｎｍ、６００～１０６４ｎｍ、６５０～１０６４ｎｍ、７００～１０６４ｎｍ、４５０～１１００ｎｍ、又は５００～１１００ｎｍの波長が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、光源は、５５０～１０６４ｎｍの波長を有する狭帯域幅レーザーである。一実施形態では、光源は、４００～１０６４ｎｍの波長を有する狭帯域幅レーザーである。
【0058】
任意の実施形態では、各試料をラマン分光法に供して、各既知のウイルス型及び力価についての参照スペクトルを生成する工程は、約２５０ｍｓの曝露時間でスペクトルを取得することを含む。いくつかの実施形態では、スペクトルは、約１．９ｍＷ、約１．８ｍＷ、約１．７ｍＷ、約１．６ｍＷ、約１．５ｍＷ、約１．４ｍＷ、約１．３ｍＷ、約１．２ｍＷ、約１．１ｍＷ、約１ｍＷ、約０．９ｍＷ、約０．８ｍＷ、約０．７ｍＷ、約０．６ｍＷ、約０．５ｍＷ、約０．４ｍＷ、約０．３ｍＷ、約０．２ｍＷ、又は約０．１ｍＷで取得される。
【0059】
任意の実施形態では、各試料をラマン分光法に供して、各既知のウイルス型及び力価についての参照スペクトルを生成する工程は、約１００ｍｓ、１５０ｍｓ、２００ｍｓ、２５０ｍｓ、３００ｍｓ、３５０ｍｓ、４００ｍｓ、４５０ｍｓ、５００ｍｓ、５５０ｍｓ、６００ｍｓ、６５０ｍｓ、７００ｍｓ、７５０ｍｓ、８００ｍｓ、８５０ｍｓ、９００ｍｓ、９５０ｍｓ、１０００ｍｓ、又は１０００ｍｓ超の曝露時間でスペクトルを取得することを含む。任意の実施形態では、ラマンスペクトルは、約２５０ｍｓの曝露時間を使用して取得される。
【0060】
任意の実施形態では、各試料をラマン分光法に供して、各既知のウイルス型及び力価についての参照スペクトルを生成する工程は、約１．９ｍＷ、約１．８ｍＷ、約１．７ｍＷ、約１．６ｍＷ、約１．５０ｍＷ、約１．４ｍＷ、約１．３ｍＷ、約１．２ｍＷ、約１．１ｍＷ、約１ｍＷ、約０．９ｍＷ、約０．８ｍＷ、約０．７ｍＷ、約０．６ｍＷ、約０．５ｍＷ、約０．４ｍＷ、約０．３ｍＷ、約０．２ｍＷ、又は約０．１ｍＷの出力を有するラマンレーザーを使用して、スペクトルを取得することを含む。任意の実施形態では、スペクトルは、約１．５０ｍＷ以下の出力を有するラマンレーザーで取得される。任意の実施形態では、スペクトルは、０．６ｍＷ以下の出力を有するラマンレーザーで取得される。
【0061】
次いで、既知のウイルス型及び既知の量の対応するウイルス力価を含有する試料から収集されたラマンスペクトルが分析されて、参照スペクトルからウイルス型特異的成分が特定される。いくつかの実施形態では、各試料についての参照スペクトルは、当該試料の２つ以上のスペクトルを分析することによって生成される。代替的に、各試料についての参照スペクトルは、当該試料の３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、８０個以上、９０個以上、１００個以上のスペクトル、２００個以上、３００個以上、４００個以上、又は５００個以上のスペクトルを分析することによって生成される。
【0062】
いくつかの実施形態では、１つ以上のバックグラウンドラマンスペクトルが収集される。そのようなバックグラウンドスペクトルは、対照試料、すなわち、組成物中のウイルス試料に対応するが、ウイルスを含有しない試料から収集され得る。例えば、好適なバックグラウンドスペクトルは、水、培養培地、又は組成物中のウイルス含有試料と一致するが、ウイルスを含まない他の緩衝液の試料から得られ得る。いくつかの実施形態では、バックグラウンドからの２つ以上のスペクトルが平均化されて、バックグラウンドラマンスペクトルが生成される。いくつかの実施形態では、バックグラウンドスペクトルは、ウイルス含有試料からのスペクトルが分析される前に、参照スペクトルの各々から減算される。
【0063】
いくつかの実施形態では、試料から収集されたスペクトルは、分析される前に切断される。好ましくは、スペクトルは、例えば、３００ｃｍ－１～２０００ｃｍ－１、３００ｃｍ－１～１９００ｃｍ－１、３００ｃｍ－１～１８００ｃｍ－１、３００ｃｍ－１～１７００ｃｍ－１、３００ｃｍ－１～１６００ｃｍ－１、３００ｃｍ－１～１５００ｃｍ－１、３５０ｃｍ－１～１７００ｃｍ－１、３５０ｃｍ－１～１６００ｃｍ－１、４００ｃｍ－１～１７００ｃｍ－１、４００ｃｍ－１～１６００ｃｍ－１、４５０ｃｍ－１～１７００ｃｍ－１、４５０ｃｍ－１～１６００ｃｍ－１、５００ｃｍ－１～１７００ｃｍ－１、５００ｃｍ－１～１６００ｃｍ－１、５５０ｃｍ－１～１７００ｃｍ－１、５５０ｃｍ－１～１６００ｃｍ－１、６００ｃｍ－１～１７００ｃｍ－１、又は６００ｃｍ－１～１６００ｃｍ－１のスペクトル範囲まで切断される。より好ましくは、スペクトルは、５００ｃｍ－１～１６００ｃｍ－１のスペクトル範囲まで切断される。
【0064】
参照スペクトル（すなわち、既知のウイルス型及び既知の力価の試料からのスペクトル）からウイルス型特異的成分を特定するために、計量化学分析を使用して、２つ以上の試料の各々から生成された２つ以上の参照スペクトルを分析（分解）する。この計量化学分析を使用して、参照スペクトル間の変動の１つ以上の成分が特定され、各成分についてのスコアが評価される。試料から生成された参照スペクトルを分析するために利用され得る好適な計量化学分析は、当該技術分野で既知であり、限定されるものではないが、多変量曲線分解、主成分分析、判別分析（例えば、線形判別分析、部分最小二乗判別分析）、Ｋ平均クラスタリング、ニューラルネットワーク分析、回帰分析（例えば、主成分回帰分析、部分最小二乗回帰分析）、及びクラスモデリング方法（例えば、クラス類似性のソフト独立モデリング）が挙げられる（例えば、Ｂｉａｎｃｏｌｉｌｌｏ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｉ，“Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ－Ｂａｓｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｆｒｏｎｔ．Ｃｈｅｍ．６：５７６（２０１８）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。これらの分析に基づいて、特定のウイルス型と相関する１つ以上のスペクトル成分（すなわち、ウイルス型特異的成分）が特定及びスコアリングされる。
【0065】
既知のウイルス型及び既知の量の対応するウイルス力価を含有する各試料についてのウイルス型特異的成分のスコアを使用して、試験試料又は実験試料中の未知のウイルス力価のウイルス力価を定量化するのに好適なモデルを調製する。任意の実施形態では、生成されたモデルは、ウイルス型特異的較正曲線又は標準曲線である。したがって、１つのウイルス粒子特異的成分を別のウイルス粒子特異的成分に対して選択するための基準は、成分が目的のものではないウイルス粒子又は空のキャプシドを、目的のもの並びにウイルス粒子が存在する培地と区別する能力に依存する。また、目的のウイルス粒子、空のキャプシド、又は遺伝物質の特徴（すなわち、特異性）である特徴について成分を調べて、得られたスペクトルが目的のウイルス粒子若しくは空のキャプシドの参照スペクトルのように見えること、又は予想された特徴を有することを確実にすることが重要である。
【0066】
試料中のウイルス力価を定量化するのに好適なモデルを開発するために利用される参照スペクトルは、好ましくは、既知の目的のウイルス型を含む２つ以上の試料から生成される。いくつかの実施形態では、２つ以上の試料は、２つ以上の異なるウイルス型、例えば、１つ以上の遺伝要素（例えば、遺伝子挿入、欠失、置換、又は転座）によって異なるウイルス型を含む。例えば、試料中のウイルス力価を定量化するのに好適なモデルが、外来性遺伝子挿入を含むレンチウイルスを特定するのに好適である場合、モデルを開発するために利用される参照スペクトルは、既知の量の目的の修飾レンチウイルスを含む試料、及び任意選択的に、既知の量の野生型レンチウイルスを含む試料から収集される。これにより、野生型レンチウイルスと比較して修飾レンチウイルスに特異的であるスペクトル成分の特定、及び試料中の修飾レンチウイルスの力価を決定するために特異的な較正曲線の生成が可能となる。
【0067】
上記のように、試料中のウイルス力価を定量化するのに好適なモデルを生成する方法は、既知の型及び量の任意のウイルス型を含む試料を利用して実施される。例えば、好適な試料としては、レトロウイルス粒子、レトロウイルス様粒子、アデノウイルス粒子、アデノウイルス様粒子、アデノ随伴ウイルス粒子、アデノ随伴ウイルス様粒子、単純ヘルペスウイルス粒子、及び単純ヘルペスウイルス様粒子を含有する試料が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルスは、レンチウイルス粒子などのレトロウイルス粒子である。
【実施例】
【0068】
以下の実施例は、本開示の実施形態の実施を例示することを意図しているが、決してその範囲を限定することを意図するものではない。
【0069】
実施例１及び２のための材料及び方法
材料及び試薬：金及び銀のＳＥＲＳ基板をＳｉｌｍｅｃｏから購入した（ＳＥＲＳｔｒａｔｅ）。超純水（１８．２ＭΩｃｍ）をＭｉｌｌｉ－Ｑシステムから取得した。内径７５．９μｍ及び外径１５０．０μｍの溶融シリカキャピラリーを、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。塩酸、ＬＶ－ＭＡＸ産生培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、並びに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する及びＧＦＰを有しないヒト非標的化、ＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルスを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ヒトＨＴ－１０８０線維肉腫細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１２１）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。ポリブレン及びイソプロパノールを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｏｒａｎｇｅ Ｔｏｕｇｈ樹脂を、Ｐｒｕｓａ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。
材料及び試薬：金及び銀のＳＥＲＳ基板をＳｉｌｍｅｃｏから購入した（ＳＥＲＳｔｒａｔｅ）。超純水（１８．２ＭΩｃｍ）をＭｉｌｌｉ－Ｑシステムから取得した。内径７５．９μｍ及び外径１５０．０μｍの溶融シリカキャピラリーを、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。塩酸、ＬＶ－ＭＡＸ産生培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、並びに緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する及びＧＦＰを有しないヒト非標的化、ＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルスを、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ヒトＨＴ－１０８０線維肉腫細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１２１）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から得た。ポリブレン及びイソプロパノールを、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｏｒａｎｇｅ Ｔｏｕｇｈ樹脂を、Ｐｒｕｓａ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。
【0070】
試料調製：全てのウイルス溶液をＬＶ－ＭＡＸ産生培地中で調製した。ＳＥＲＳ較正のために、各々５００ＴＵ／ｍＬ～５０，０００ＴＵ／ｍＬの範囲の濃度で、ＧＦＰを有する及びＧＦＰを有しないヒト非標的化、ＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルスの溶液を調製した。
【0071】
３Ｄプリント：３ＤプリントされたＳＥＲＳ基板ホルダーを、金基板と使用するためにＯｒｉｇｉｎａｌ Ｐｒｕｓａ ＳＬ１を使用して生成した。銀基板については、３Ｄプリントされたフローセルを開発及び使用した。ＣＡＤ設計は、Ａｕｔｏｄｅｓｋ Ｆｕｓｉｏｎ ３６０で生成し、次いで、ＰｒｕｓａＳｌｉｃｅｒソフトウェアを使用してスライスした。Ｏｒａｎｇｅ Ｔｏｕｇｈ樹脂を全てのプリントされた物体に使用した。次いで、物体をイソプロパノール中で１０分間洗浄し、２分間乾燥させ、Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｐｒｕｓａ ＣＷ１ Ｃｕｒｉｎｇ ａｎｄ Ｗａｓｈｉｎｇ Ｍａｃｈｉｎｅで２分間硬化させた。次いで、物体をＭｉｌｌｉ－Ｑ水ですすいだ。
【0072】
ＳＥＲＳフローセル調製：銀及び金の基板をホットプレート上で１７５℃において１０分間加熱した。金のＳｉｌｍｅｃｏ基板を、上部に溶融シリカキャピラリーが固定された、３ＤプリントされたＳＥＲＳ基板ホルダーに入れた。次いで、この基板ホルダーを、ガラススライドの代わりに前述のシース流ＳＥＲＳセルに入れた（Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｆｌｏｗ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｕｓｉｎｇ Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８５（２１）：１０１５９－１０１６６（２００３）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。銀のＳｉｌｍｅｃｏ基板を３Ｄプリントされたフローセルに入れ、次いでこれを、透明なＧｏｒｉｌｌａグルーを使用して一緒に接着した。ラマン検出の前に、０．１ＭのＨＣｌを銀基板上に流して、表面上に残ったいかなる汚染物質も洗い流した。水をフローセルに通して、ラマン測定前に銀表面及び金表面の両方をすすいだ。
【0073】
ラマン測定：ラマン分光法を、自家製機器を使用して実施した。７８５ｎｍ又は５３２ｎｍのレーザー（Ｏｘｘｉｕｓ）を、４０×水浸漬対物レンズ（ＮＡ＝０．８）を使用してＳＥＲＳ基板上に集束させた。ラマン散乱を、同じ対物レンズを通して収集し、ＰｒｏＥＭ：１６００２ ｅＸｃｅｌｏｎ ３ ＣＣＤ検出器（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を備えたＩｓｏｐｌａｎｅ ＳＣＴ－３２０分光器に向けた。スペクトルを、試料において２５０ｍｓの曝露時間及び１．５０ｍＷ（７８５ｎｍ）又は０．６０ｍＷ（５３２ｎｍ）のレーザー出力で取得した。取得毎に２４０個のスペクトルを連続して取得した。金基板を使用した実験のために、ウイルス試料を、ウォーターシース流体を用いて溶融シリカキャピラリーを通して注入した。ＳＥＲＳスペクトル取得の前及び最中に、シース及び試料の流れを停止させた。スペクトル取得後、シース流を再開し、試料流を水に切り替えて表面を洗浄した後、次の試料を注入した。
【0074】
データ分析：全てのスペクトルを、Ｍａｔｌａｂ Ｒ２０１８ｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）を使用して処理した。ＭａｔｌａｂでＰＬＳ Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）を使用して、多変量曲線分解（ＭＣＲ）を実施した。ＭＣＲ分析の前に、ＳＥＲＳ基板上の水のバックグラウンドスペクトルを、各レンチウイルススペクトルから減算し、次いで、スペクトルを、５００ｃｍ－１～１６００ｃｍ－１のスペクトル範囲まで切断した。成分２での平均スコアを濃度に対してプロットして、較正曲線を作成した。
【0075】
レンチウイルス形質導入：ＨＴ－１０８０細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＥＭＥＭ中で培養した。１０，０００個の細胞を、９６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１００μＬの培養培地中に播種し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気及び３７℃の温度で一晩インキュベートした。ＧＦＰを有するヒト非標的化、ＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ（商標）ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルスを、氷上で１時間解凍した後、形質導入した。形質導入培地は、ＦＢＳを補充したＥＭＥＭにポリブレンを８μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加することによって調製した。ウイルス溶液を形質導入培地に連続希釈することによって、４対数連続希釈物を３連で調製した。培地を細胞から除去し、１００μＬの各希釈物をウェルに添加した。プレートを５分間旋回させてウイルスを分布させた。次いで、細胞を２４時間インキュベートした。次に、レンチウイルス形質導入培地を、１０％ＦＢＳを補充したＥＭＥＭで置き換え、次いで、細胞を更に２４時間インキュベートした。次いで、培地を細胞から除去し、撮像前にＰＢＳで置き換えた。
【0076】
蛍光撮像：細胞を、励起のためのＧＦＰフィルターキューブ及び青色ＬＥＤ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ）を使用して、直立型Ｏｌｙｍｐｕｓ顕微鏡で撮像した。ＩｍａｇｅＪを使用して明視野及び蛍光の画像のデータ分析を実施し、細胞カウンタープラグインを使用して細胞をカウントした。次いで、レンチウイルス力価を、以下の式１を使用して計算した。
【数1】
【0077】
実施例１：金のＳＥＲＳ基板を使用したレンチウイルス粒子の検出及び区別
実験設計は、図１に示される。ＧＦＰ遺伝子をコードする又は有しないのいずれかのレンチウイルス粒子からのＳＥＲＳスペクトルを、ＬＶ－ＭＡＸウイルス産生培地で取得した。各ウイルス型をＳＥＲＳ基板に培地中で注入し、流れなしで測定した。培地中で測定することによって、必要な試料の前処理は最小限である。追加的に、水性環境は、励起されたナノ構造からの熱放散を改善し、これは、試料又は基板への熱損傷なしに改善された信号生成を可能にすることが示されている（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｈｅａｔｉｎｇ ｉｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃ １２１（２１）：１１６２３－１１６３１（２０１７）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
実験設計は、図１に示される。ＧＦＰ遺伝子をコードする又は有しないのいずれかのレンチウイルス粒子からのＳＥＲＳスペクトルを、ＬＶ－ＭＡＸウイルス産生培地で取得した。各ウイルス型をＳＥＲＳ基板に培地中で注入し、流れなしで測定した。培地中で測定することによって、必要な試料の前処理は最小限である。追加的に、水性環境は、励起されたナノ構造からの熱放散を改善し、これは、試料又は基板への熱損傷なしに改善された信号生成を可能にすることが示されている（Ｚｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈｏｔｏｔｈｅｒｍａｌ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｎａｎｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｐａｃｔ ｏｆ Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｈｅａｔｉｎｇ ｉｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃ １２１（２１）：１１６２３－１１６３１（２０１７）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【0078】
粒子のＳＥＲＳ測定から得られたスペクトルを使用して、ＧＦＰ遺伝子を含有する粒子の数を表す多変量曲線分解（ＭＣＲ）モデルを生成した。ＳＥＲＳ取得の前に、フローセルを水ですすぎ、表面及びキャピラリーを洗浄し、次いで、ウイルス試料を、キャピラリーを通して注入し、シース及び試料の流れの両方を停止させた。ＳＥＲＳ取得後、基板の表面を、水を使用して洗浄した。基板上の水のスペクトルを、各濃度を分析する前に取得し、次いで、基板のバックグラウンド信号を説明するために、分析前にＳＥＲＳスペクトルから減算した。
【0079】
レンチウイルス試料を、金基板を有するシース流ＳＥＲＳセルに注入することによって取得されたウイルス粒子のＳＥＲＳスペクトルが、図２Ａ～２Ｂに示される。図２Ａは、分析された最高濃度での、ＧＦＰ遺伝子を有する及び有しないウイルスから取得された平均ＳＥＲＳスペクトルを比較する。ウイルス粒子の各型のスペクトルは、アミノ酸及び核酸に関連するラマンバンドを示す。２つの型の粒子間で共有された共通のピークは、ＲＮＡ中のリン酸骨格伸長に関連する８１３ｃｍ－１（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、チロシンに割り当てられた８５１ｃｍ－１（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、フェニルアラニンに割り当てられた１００７ｃｍ－１（Ａｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“ｐＨ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ α－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒａｍａｎ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｐｌｏｔｓ ａｎｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｗｉｎｄｏｗｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９７４（１－３）：１３２－１３８（２０１０）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、シトシンに割り当てられた１０４６ｃｍ－１（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）、Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｈｉｇｈ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｂｙ ＳＥＲＳ，”Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １３８（１７）：４８７７－４８８４（２０１３）（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））、アミドＩＩＩ伸長から生じる１２４２ｃｍ－１（Ａｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“ｐＨ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ α－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒａｍａｎ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｐｌｏｔｓ ａｎｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｗｉｎｄｏｗｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９７４（１－３）：１３２－１３８（２０１０）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、並びにグルタミン酸及びアスパラギン酸のＣＨ２はさみ振動に関連する１４７５ｃｍ－１（Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｎｌｉｎｅ ＳＥＲＳ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ２０ Ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ｌ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １３９（２２）：５９８９－５９９８（２０１４）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））のバンドを含む。２つの異なるウイルス粒子の類似の構造にもかかわらず、図２Ａはまた、ＳＥＲＳ信号に差があることを示す。スペクトルの顕著な差は、ＧＦＰを有する粒子について、リン酸骨格（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、及びアデニン（Ｓｕｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｂａｓｅｓ Ａｄｓｏｒｂｅｄ ｏｎ Ｓｉｌｖｅｒ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８（１６）：４７１１－４７１８（１９８６）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）から生じる８１２及び９２１ｃｍ－１の強いピークを含む。これらの追加のバンドは、ＧＦＰを有しないものと比較して、これらの粒子中の追加のＲＮＡに起因して生じ得る。また、フェニルアラニン及びトリプトファンから生じる１１６４ｃｍ－１のショルダーを有する１１４１ｃｍ－１の強いバンドが、ＧＦＰを有する粒子のスペクトルにおいて観察される（Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｎｌｉｎｅ ＳＥＲＳ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ２０ Ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ｌ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １３９（２２）：５９８９－５９９８（２０１４）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。追加的に、それぞれアルギニン、ヒスチジン、及びフェニルアラニン／チロシンから生じる１２８０、１４１０、及び１５６７ｃｍ－１のバンドは、ＧＦＰを含有する粒子のスペクトルにおいて強く見られる（Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｎｌｉｎｅ ＳＥＲＳ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ２０ Ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ｌ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １３９（２２）：５９８９－５９９８（２０１４）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。これらの差は、ＳＥＲＳが、５０，０００ＴＵ／ｍＬの濃度でウイルス粒子内の遺伝物質の修飾を検出することができることを示す。
【0080】
様々な濃度でのＧＦＰを有するウイルス粒子のスペクトルが、標準偏差がその周囲で網掛けされて図２Ｂに示される。ウイルス粒子の構造が複雑であるため、同じ粒子型について得られた平均信号に変動がある。トリプトファン（Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｎｌｉｎｅ ＳＥＲＳ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ２０ Ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ｌ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １３９（２２）：５９８９－５９９８（２０１４）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、及びアミドＩＩＩ伸長（Ａｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“ｐＨ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ α－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒａｍａｎ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｐｌｏｔｓ ａｎｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｗｉｎｄｏｗｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９７４（１－３）：１３２－１３８（２０１０）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））から生じる１１６４及び１２５９ｃｍ－１のピークが、４つ全ての濃度で検出された。８１３ｃｍ－１（リン酸骨格）（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、９２３ｃｍ－１（アデニン）（Ｓｕｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｂａｓｅｓ Ａｄｓｏｒｂｅｄ ｏｎ Ｓｉｌｖｅｒ，”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８（１６）：４７１１－４７１８（１９８６）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、１０９５ｃｍ－１（リン酸骨格）（Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｈｉｇｈ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｂｙ ＳＥＲＳ，”Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １３８（１７）：４８７７－４８８４（２０１３）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、１４７５ｃｍ－１（グルタミン酸／アスパラギン酸）（Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｎｌｉｎｅ ＳＥＲＳ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ２０ Ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ｌ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １３９（２２）：５９８９－５９９８（２０１４）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、及び１５７５ｃｍ－１（トリプトファン）（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）のピークは、最高濃度における強度の最大の増加を示した。平均で一貫して示されるピークは、ウイルス粒子の表面又はキャプシド上に見られるタンパク質から生じる可能性が高い。一方、強度の増加を示すピークの大部分は、キャプシド内の遺伝物質の核酸及びリン酸骨格から生じる。ウイルス粒子は、遺伝物質を含有するキャプシドを包囲するタンパク質及び脂質をそれらの表面上に含有する。予想どおり、キャプシド内の分子からよりも、ウイルスの表面上の分子から生じるモードが、より多く観察された。これは、ウイルスの表面がＳＥＲＳ基板と直接相互作用することに起因する。しかしながら、芳香族核酸は、ＳＥＲＳによって検出される基板に十分に近いことが予想される。異なる濃度のウイルス粒子についての平均信号の差は、ＳＥＲＳ活性表面上の粒子の異なる配向、又はホットスポット内にあるウイルスの異なる分子成分から生じ、見られる振動モードの異なる増強につながり得る。分析されたウイルス粒子は、球状から楕円形であり、直径が８０～１００ｎｍであり、ＳＥＲＳ基板上のホットスポットに関連するおよそ１ｎｍ３の体積よりもはるかに大きいサイズであり、したがって、ウイルス粒子の一部分のみが、所与のホットスポット内にある。各濃度についての平均スペクトルは、観察されたバンドの差を示し、濃度依存性を決定する単変量分析の使用を複雑にする。ＧＦＰを有しないレンチウイルス粒子の各濃度についての平均ＳＥＲＳスペクトルが、図３に示され、同様の傾向を示す。
【0081】
レンチウイルス粒子を希釈し、ＬＶ－ＭＡＸ産生培地中に保存した。純粋なＬＶ－ＭＡＸ培地をフローセルに注入し、取得されたスペクトルが、図４に示される。培地は、６５３ｃｍ－１及び１０３０ｃｍ－１のピークを示し、したがって、レンチウイルス粒子について得られた信号は、培地ではなくウイルス粒子自体から生じる。
【0082】
ウイルス力価を決定するために、多変量曲線分解（ＭＣＲ）を実施して、ＧＦＰベクターと相関する成分を抽出した。図５Ａ～５Ｄは、５００ＴＵ／ｍＬ、５，０００ＴＵ／ｍＬ、及び５０，０００ＴＵ／ｍＬの濃度での、ＧＦＰを有するレンチウイルス粒子から取得されたスペクトルを使用して開発された３つの成分モデルを示す。このモデルは、データにおける分散の９５．４７％を捕捉した。１０，０００ＴＵ／ｍＬのＧＦＰ粒子スペクトルを使用して、このモデルを検証した。モデルは、成分２でのスコアとＧＦＰを有するレンチウイルスの濃度との間の線形関係を示す（図５Ｂ）。次いで、各濃度についての成分２での平均スコアをウイルス力価に対してプロットして、ウイルス力価を決定するための較正を生成した（図５Ｃ）。この曲線上のエラーバーは、測定値の標準偏差を表す。
【0083】
成分２についての負荷は、分析された最高濃度でＧＦＰベクターを含有するレンチウイルス粒子と類似したスペクトルを示す（図６）。成分２で観察されたＳＥＲＳバンドについてのピーク割り当てが、表１に示される。この成分スペクトルが、ＧＦＰを有する粒子から生じることを更に確認するために、５０，０００ＴＵ／ｍＬの濃度でのＧＦＰを有しない粒子のスペクトルをモデルで試験した。これらのスペクトルは、同じ濃度でのＧＦＰを有する粒子よりも成分２で低く、差は、統計的に有意である。これは更に、この成分が、ＧＦＰベクターに関連していることを示唆する。図４に示されるＬＶ－ＭＡＸ培地のスペクトルもモデルで試験し、成分２でのこれらのスペクトルについてのスコアは、両方のレンチウイルス粒子型よりもはるかに低い。図５Ｄに示される棒グラフは、これらの試料の各々についてのスコアを比較し、ＳＥＲＳが、挿入遺伝子を有する及び有しないウイルス粒子を区別することができることを示す。ＧＦＰを有しない粒子のスコアは、成分２で平均２５００を有し、これは、５，０００及び１０，０００ＴＵ／ｍＬの濃度でのＧＦＰを有する粒子についてのスコアと同等である。これは、定量化を妨げる可能性があるＧＦＰ遺伝子を有しない粒子からの高レベルの散乱に起因する。しかしながら、一般的に使用されるウイルス力価は、１０５ＴＵ／ｍＬ以上であり、これは、この研究で示される力価よりも大きい（Ｐｉｖｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｆｉｒｓｔ Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ＨｅｐａＲＧ Ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ９（１）：１２９１０（２０１９）、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗｌｙ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８７（２３）：１１６５２－１１６５９（２０１５）、Ｂａｇｎａｌｌ ｅｔ ａｌ．，“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｙｎａｍｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ，”Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７（６）：７１３－７２５（２０１５）、Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｅｌ－Ｆｒｅｅ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｗｉｔｃｈ－Ｏｎ Ｃｅｌｌ－Ｂａｓｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，”ＡＣＳ Ｓｅｎｓｏｒｓ ４（６）：１６５４－１６６１（２０１９）（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。
【表1】
【0084】
蛍光撮像を使用して、ＳＥＲＳによって決定されたウイルス力価を検証した。ＨＴ－１０８０線維肉腫細胞を、ＧＦＰをコードするレンチウイルスで形質導入した。用量応答曲線（図７）を、蛍光であった細胞の割合及び形質導入に使用されたレンチウイルス粒子の量の対数を使用して生成した。これらの結果は、ＳＥＲＳ実験に使用されたウイルス力価を確認する。また、これらの画像は、使用されたレンチウイルスが、１０４ＴＵ／ｍＬを超える濃度で高度に感染性であることを示し、これらの濃度は、２つの粒子型を区別するためにＳＥＲＳを使用した濃度と類似している。
【0085】
実施例２：銀ＳＥＲＳ基板を使用したレンチウイルス粒子の検出及び区別
レンチウイルス粒子を検出及び区別するＳＥＲＳ法を、銀ＳＥＲＳ基板及び５３２ｎｍ励起も使用して実施した。以前に研究したのと同じレンチウイルスを使用して、５０，０００ＴＵ／ｍＬの濃度での各粒子型についての参照スペクトルを収集した。ＧＦＰ遺伝子を有する及び有しないレンチウイルス粒子の収集された生スペクトルが、図８Ａに示される。３成分ＭＣＲモデルを、各粒子について収集された全てのスペクトル、各型について合計７４０個のスペクトルを使用して構築した。このモデルについての負荷スペクトルが、図８Ｂに示され、各成分についてのスコアが、図８Ｃに示される。このモデルでは、成分１、２、及び３は、それぞれ、データの総分散の５３．６７％、４４．７４％、及び１．２９％を占めた。成分３で高いスコアを得る唯一のスペクトルは、ＧＦＰを有するレンチウイルス粒子からのスペクトルである。これらのスペクトルは、ＧＦＰを有しないレンチウイルス粒子のスペクトルから分離され得るため、この成分は、ＧＦＰベクターに関連し得る。スペクトルの大部分は、成分１及び２で同様のスコアを有し、したがって、挿入遺伝子の検出が、レンチウイルス自体からのバックグラウンド信号によって複雑になり得ることを示している。ウイルス粒子の大規模かつ複雑な分子構造は、多くの光を散乱させ、複雑なＳＥＲＳ信号を生成し得る。したがって、これらの信号は、挿入遺伝子を示すスペクトルを複雑にし、この遺伝子の検出及び定量化をより困難にし得る。両方のレンチウイルスについてのスペクトルの大部分は、成分１及び２で同様のスコアを有するが、成分３を利用して、挿入遺伝子を検出することができる。
レンチウイルス粒子を検出及び区別するＳＥＲＳ法を、銀ＳＥＲＳ基板及び５３２ｎｍ励起も使用して実施した。以前に研究したのと同じレンチウイルスを使用して、５０，０００ＴＵ／ｍＬの濃度での各粒子型についての参照スペクトルを収集した。ＧＦＰ遺伝子を有する及び有しないレンチウイルス粒子の収集された生スペクトルが、図８Ａに示される。３成分ＭＣＲモデルを、各粒子について収集された全てのスペクトル、各型について合計７４０個のスペクトルを使用して構築した。このモデルについての負荷スペクトルが、図８Ｂに示され、各成分についてのスコアが、図８Ｃに示される。このモデルでは、成分１、２、及び３は、それぞれ、データの総分散の５３．６７％、４４．７４％、及び１．２９％を占めた。成分３で高いスコアを得る唯一のスペクトルは、ＧＦＰを有するレンチウイルス粒子からのスペクトルである。これらのスペクトルは、ＧＦＰを有しないレンチウイルス粒子のスペクトルから分離され得るため、この成分は、ＧＦＰベクターに関連し得る。スペクトルの大部分は、成分１及び２で同様のスコアを有し、したがって、挿入遺伝子の検出が、レンチウイルス自体からのバックグラウンド信号によって複雑になり得ることを示している。ウイルス粒子の大規模かつ複雑な分子構造は、多くの光を散乱させ、複雑なＳＥＲＳ信号を生成し得る。したがって、これらの信号は、挿入遺伝子を示すスペクトルを複雑にし、この遺伝子の検出及び定量化をより困難にし得る。両方のレンチウイルスについてのスペクトルの大部分は、成分１及び２で同様のスコアを有するが、成分３を利用して、挿入遺伝子を検出することができる。
【0086】
銀及び金の基板上のＧＦＰ遺伝子に関連する成分スペクトルが、図８Ｄに示される。これらの成分スペクトルは、多くのスペクトル差を示し、同じ周波数であるが強度が異なる３つのピークのみを共有する。ピークは、それぞれアミドＩＩＩ伸長（Ａｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“ｐＨ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ α－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒａｍａｎ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｐｌｏｔｓ ａｎｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｗｉｎｄｏｗｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９７４（１－３）：１３２－１３８（２０１０）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、アルギニン（Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｎｌｉｎｅ ＳＥＲＳ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ２０ Ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ ｌ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １３９（２２）：５９８９－５９９８（２０１４）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、及びトリプトファン（Ａｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“ｐＨ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ α－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒａｍａｎ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｐｌｏｔｓ ａｎｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｗｉｎｄｏｗｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９７４（１－３）：１３２－１３８（２０１０）（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））に対応する１２６０、１２８１、及び１３５４ｃｍ－１である。ピーク割り当ての全リストが、表１及び表２に示される。銀基板上のスペクトルは、金基板と比較して、アミノ酸よりも核酸に関連するより多くのバンドを示す。
【表2】
【0087】
実施例１及び２の考察：
結果は、ＳＥＲＳが、ＧＦＰ遺伝子の挿入によってのみ異なる単一のウイルス粒子型を検出及び定量化することができることを示す。これらの結果は、既存の技術よりも少ない試料調製で、特定の遺伝子をコードするようにうまく形質転換されたウイルス粒子を定量化する、有意により迅速な方法を提供する。これらの粒子の定量化は、ＳＥＲＳ活性基板の表面上のホットスポットと相互作用するウイルス粒子に依存する。観察されたスペクトルは、ホットスポットと相互作用するウイルスの配向及び特定の部分に依存するため、定量化は、単一のピークを使用して達成することが困難であり得る。ＭＣＲは、ＳＥＲＳスペクトルを成分に分解することによって、これらの複雑な信号の定量化に有用であり、その結果、スコアを使用して、存在するウイルスの量を決定することができることが示される。基板表面を官能化することはまた、信号の均一性を改善するためにウイルスの特定の配向を強制するために調査され得る。
結果は、ＳＥＲＳが、ＧＦＰ遺伝子の挿入によってのみ異なる単一のウイルス粒子型を検出及び定量化することができることを示す。これらの結果は、既存の技術よりも少ない試料調製で、特定の遺伝子をコードするようにうまく形質転換されたウイルス粒子を定量化する、有意により迅速な方法を提供する。これらの粒子の定量化は、ＳＥＲＳ活性基板の表面上のホットスポットと相互作用するウイルス粒子に依存する。観察されたスペクトルは、ホットスポットと相互作用するウイルスの配向及び特定の部分に依存するため、定量化は、単一のピークを使用して達成することが困難であり得る。ＭＣＲは、ＳＥＲＳスペクトルを成分に分解することによって、これらの複雑な信号の定量化に有用であり、その結果、スコアを使用して、存在するウイルスの量を決定することができることが示される。基板表面を官能化することはまた、信号の均一性を改善するためにウイルスの特定の配向を強制するために調査され得る。
【0088】
ＧＦＰ遺伝子を含有する粒子に関連する信号は、ＳＥＲＳ基板に使用される励起波長及び金属に応じて異なる。５３２ｎｍの励起レーザー及び銀基板を使用する場合、７８５ｎｍの励起及び金基板を使用するスペクトルと比較して、より多くのピークが、核酸に関連している。ウイルス粒子に対するＳＥＲＳの以前の研究は、７８５ｎｍの励起を伴う銀基板を使用しており、核酸及びアミノ酸の両方が、検出され得ることを示す（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。しかしながら、７８５ｎｍの励起を伴う金基板を使用した研究は、ＳＥＲＳ信号の大部分が、ウイルスエンベロープのアミノ酸及び脂質成分から生じることを示す（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗｌｙ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８７（２３）：１１６５２－１１６５９（２０１５）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。銀基板上のＧＦＰを有するウイルスの成分スペクトルは、金基板上のものよりも多くの核酸信号を示す。しかしながら、核酸及びアミノ酸の信号は、両方のタイプの基板で観察される。
【0089】
金属と分析物との間の相互作用はまた、分子が表面に吸着する方法にも影響し得、これはしたがって、観察されたＳＥＲＳ信号に影響を与える。これは、表面上への分析物の好ましい配向に起因し得、これは、表面に最も近いバンドを基板から更に離れているバンドよりも増強させる。赤血球のＳＥＲＳスペクトルは、銀ナノ粒子が金の代わりに使用される場合に異なるように見え、これは、分析物と各金属との間の異なる相互作用によって説明される（Ｄｒｅｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，“ＳＥＲＳ Ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｌｖｅｒ ａｎｄ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｗｉｔｈ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ａｎｄ Ｒｅｄ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ，”Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ １５：５３６４－５３７３（２０１３）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。類似の効果が、銀及び金の基板上のＧＦＰを含有するウイルス粒子の異なる信号の原因である可能性が高い。
【0090】
ＳＥＲＳは、現在の方法よりも少ない試料調製で、ウイルス力価の決定へのより迅速なアプローチを提供する。ＳＥＲＳは、ウイルス型及び株を区別すること（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）、Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｗｌｙ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８７（２３）：１１６５２－１１６５９（２０１５）（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））、並びにウイルス変異を検出するためのＤＮＡヘアピンを使用すること（Ｄａｒｄｉｒ ｅｔ．，“ＳＥＲＳ Ｎａｎｏｐｒｏｂｅ ｆｏｒ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｖｉｒａｌ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃ １２４（５）：３２１１－３２１７（２０２０）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））が既に示されている。直接的なＳＥＲＳ測定を使用したウイルス力価の決定のための本出願に記載される方法は、他のウイルス型に適用され得る。これはまた、ウイルスゲノムに対する修飾を定量化するために使用され得る。
【0091】
結論
先行する実施例で実証されるように、ウイルス力価は、ＳＥＲＳ基板への修飾なく決定され得、したがって、市販のＳＥＲＳ基板を使用した迅速かつ単純な方法を提供する。ウイルス粒子構造の複雑さにより、計量化学分析、例えば、ＭＣＲは、ウイルス特異的成分が決定され、定量化に使用され得るように、スペクトルを分解するのに有用である。先行する実施例で使用されるウイルス力価は、生物医学的用途で一般的に使用される力価よりも１桁低い。これらの粒子を分析するための異なる金属及び励起波長の使用も研究され、５３２ｎｍの励起を伴う銀基板が、７８５ｎｍの励起を伴う金基板よりも多くの核酸特徴を有するスペクトルを生成したことを示した。ＳＥＲＳは、最小限の試料調製でウイルス力価を決定する迅速な方法を提供し、これらの結果は、この方法が、様々なウイルス型に適用され得ることを確認する。
先行する実施例で実証されるように、ウイルス力価は、ＳＥＲＳ基板への修飾なく決定され得、したがって、市販のＳＥＲＳ基板を使用した迅速かつ単純な方法を提供する。ウイルス粒子構造の複雑さにより、計量化学分析、例えば、ＭＣＲは、ウイルス特異的成分が決定され、定量化に使用され得るように、スペクトルを分解するのに有用である。先行する実施例で使用されるウイルス力価は、生物医学的用途で一般的に使用される力価よりも１桁低い。これらの粒子を分析するための異なる金属及び励起波長の使用も研究され、５３２ｎｍの励起を伴う銀基板が、７８５ｎｍの励起を伴う金基板よりも多くの核酸特徴を有するスペクトルを生成したことを示した。ＳＥＲＳは、最小限の試料調製でウイルス力価を決定する迅速な方法を提供し、これらの結果は、この方法が、様々なウイルス型に適用され得ることを確認する。
【0092】
実施例３：完全なレンチウイルスキャプシド及び空のレンチウイルスキャプシドの検出及び区別
完全なレンチウイルスキャプシド又は空のレンチウイルスキャプシドのいずれかを含有するレンチウイルスの分析のために、金のＳＥＲＳ基板を伴う７８５ｎｍ励起を使用して、ＳＥＲＳスペクトルを取得した。市販のレンチウイルス（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する及びＧＦＰを有しないヒト非標的化、ＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルス）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、金のＳＥＲＳ基板を、完全なレンチウイルス測定のためにＳｉｌｍｅｃｏから購入した。空のキャプシドレンチウイルスをＳｉｇｎａＧｅｎから購入した。熱的に蒸発した金基板を、前述の手順を使用して生成し、空のキャプシド実験に使用した（Ａｓｉａｌａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｔｓｐｏｔｓ ｉｎ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ａｎａｌｙｓｔ １３６（２１）：４４７２－４４７９（２０１１）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。自家製ラマン機器を使用して、４０倍の水浸漬対物レンズ（ＮＡ＝０．８）を通してＳＥＲＳ基板上にレーザーを集束させることによって、ラマン分光法を実施した。ラマン散乱を、ＰｒｏＥＭ：１６００２ ｅＸｃｅｌｏｎ ３ ＣＣＤ検出器（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を有するＩｓｏｐｌａｎｅ ＳＣＴ－３２０分光器に向けた。ウイルス溶液をＳＥＲＳ基板に注入し、スペクトルを、完全なレンチウイルスについては２５０ｍｓの曝露時間及び１．５０ｍＷのレーザー出力で、並びに空のレンチウイルスについては５００ｍｓの曝露時間及び０．５０ｍＷのレーザー出力で取得した。図９に示されるスペクトルは、７２０個のスペクトルの平均である。完全なウイルス粒子と空のウイルス粒子との間のＳＥＲＳ信号の差は、キャプシド内の遺伝物質の非存在に関連し得る。灰色のボックスによって強調表示されたピークは、３つ全てのウイルス粒子にわたって見られ（表３）、チロシン（８５３ｃｍ－１）、フェニルアラニン（１００４ｃｍ－１）、トリプトファン（１１２７ｃｍ－１）、及びアミドＩＩＩ伸長（１２４０ｃｍ－１）に対応する（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）、Ａｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“ｐＨ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ α－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒａｍａｎ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｐｌｏｔｓ ａｎｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｗｉｎｄｏｗｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９７４（１－３）：１３２－１３８（２０１０）、Ｖｅｒｄｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｏｗｐｅａ Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ Ｍｏｔｔｌｅ Ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｓｓｅｍｂｌｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３（１９）：４３０１－４３０８（１９８４）（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。空のキャプシドスペクトルに見られる追加のバンド（表４）は、７１９ｃｍ－１（ν（Ｃ－Ｓ）、トリプトファン）、１３６２ｃｍ－１（トリプトファン）、１４５４ｃｍ－１（タンパク質のＣＨ２変形、トリプトファン）、及び１５６５ｃｍ－１（フェニルアラニン／トリプトファン、アミドＩＩ）を含む（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）、Ａｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“ｐＨ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ α－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒａｍａｎ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｐｌｏｔｓ ａｎｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｗｉｎｄｏｗｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９７４（１－３）：１３２－１３８（２０１０）、Ｖｅｒｄｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｏｗｐｅａ Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ Ｍｏｔｔｌｅ Ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｓｓｅｍｂｌｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３（１９）：４３０１－４３０８（１９８４）、Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｎｌｉｎｅ ＳＥＲＳ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ２０ Ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ Ｌ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １３９（２２）：５９８９－５９９８（２０１４）、Ｓｚｅｋｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，“ＳＥＲＳ Ｐｒｏｂｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅｓ，”Ｆｒｏｎｔ．Ｃｈｅｍ．７：３０（２０１９）（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。ＲＮＡのリン酸骨格伸長から生じる８１２ｃｍ－１、アデニンから生じる９２１ｃｍ－１、及びシトシンから生じる１０４６ｃｍ－１のバンドなど、完全なキャプシドスペクトルと空のキャプシドスペクトルとの間の差は、ウイルス内の遺伝物質の存在に関連し得る（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）、Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｈｉｇｈ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｂｙ ＳＥＲＳ，”Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １３８（１７）：４８７７－４８８４（２０１３）、Ｓｕｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｂａｓｅｓ Ａｄｓｏｒｂｅｄ ｏｎ Ｓｉｌｖｅｒ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １０８（１６）：４７１１－４７１８（１９８６）（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。
完全なレンチウイルスキャプシド又は空のレンチウイルスキャプシドのいずれかを含有するレンチウイルスの分析のために、金のＳＥＲＳ基板を伴う７８５ｎｍ励起を使用して、ＳＥＲＳスペクトルを取得した。市販のレンチウイルス（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を有する及びＧＦＰを有しないヒト非標的化、ＬｅｎｔｉＡｒｒａｙ ＣＲＩＳＰＲ陰性対照レンチウイルス）を、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入し、金のＳＥＲＳ基板を、完全なレンチウイルス測定のためにＳｉｌｍｅｃｏから購入した。空のキャプシドレンチウイルスをＳｉｇｎａＧｅｎから購入した。熱的に蒸発した金基板を、前述の手順を使用して生成し、空のキャプシド実験に使用した（Ａｓｉａｌａ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｏｔｓｐｏｔｓ ｉｎ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ａｎａｌｙｓｔ １３６（２１）：４４７２－４４７９（２０１１）（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。自家製ラマン機器を使用して、４０倍の水浸漬対物レンズ（ＮＡ＝０．８）を通してＳＥＲＳ基板上にレーザーを集束させることによって、ラマン分光法を実施した。ラマン散乱を、ＰｒｏＥＭ：１６００２ ｅＸｃｅｌｏｎ ３ ＣＣＤ検出器（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を有するＩｓｏｐｌａｎｅ ＳＣＴ－３２０分光器に向けた。ウイルス溶液をＳＥＲＳ基板に注入し、スペクトルを、完全なレンチウイルスについては２５０ｍｓの曝露時間及び１．５０ｍＷのレーザー出力で、並びに空のレンチウイルスについては５００ｍｓの曝露時間及び０．５０ｍＷのレーザー出力で取得した。図９に示されるスペクトルは、７２０個のスペクトルの平均である。完全なウイルス粒子と空のウイルス粒子との間のＳＥＲＳ信号の差は、キャプシド内の遺伝物質の非存在に関連し得る。灰色のボックスによって強調表示されたピークは、３つ全てのウイルス粒子にわたって見られ（表３）、チロシン（８５３ｃｍ－１）、フェニルアラニン（１００４ｃｍ－１）、トリプトファン（１１２７ｃｍ－１）、及びアミドＩＩＩ伸長（１２４０ｃｍ－１）に対応する（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）、Ａｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“ｐＨ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ α－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒａｍａｎ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｐｌｏｔｓ ａｎｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｗｉｎｄｏｗｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９７４（１－３）：１３２－１３８（２０１０）、Ｖｅｒｄｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｏｗｐｅａ Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ Ｍｏｔｔｌｅ Ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｓｓｅｍｂｌｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３（１９）：４３０１－４３０８（１９８４）（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。空のキャプシドスペクトルに見られる追加のバンド（表４）は、７１９ｃｍ－１（ν（Ｃ－Ｓ）、トリプトファン）、１３６２ｃｍ－１（トリプトファン）、１４５４ｃｍ－１（タンパク質のＣＨ２変形、トリプトファン）、及び１５６５ｃｍ－１（フェニルアラニン／トリプトファン、アミドＩＩ）を含む（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）、Ａｓｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，“ｐＨ－Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｓ ｉｎ α－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｔｗｏ－Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｒａｍａｎ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ Ｖａｒｉａｎｃｅ Ｐｌｏｔｓ ａｎｄ Ｍｏｖｉｎｇ Ｗｉｎｄｏｗｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ９７４（１－３）：１３２－１３８（２０１０）、Ｖｅｒｄｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｏｗｐｅａ Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ Ｍｏｔｔｌｅ Ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｓｓｅｍｂｌｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３（１９）：４３０１－４３０８（１９８４）、Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｏｎｌｉｎｅ ＳＥＲＳ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ２０ Ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ Ｌ－Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ Ｓｅｐａｒａｔｅｄ ｂｙ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｚｏｎｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，”Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １３９（２２）：５９８９－５９９８（２０１４）、Ｓｚｅｋｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，“ＳＥＲＳ Ｐｒｏｂｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｇｏｌｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅｓ，”Ｆｒｏｎｔ．Ｃｈｅｍ．７：３０（２０１９）（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。ＲＮＡのリン酸骨格伸長から生じる８１２ｃｍ－１、アデニンから生じる９２１ｃｍ－１、及びシトシンから生じる１０４６ｃｍ－１のバンドなど、完全なキャプシドスペクトルと空のキャプシドスペクトルとの間の差は、ウイルス内の遺伝物質の存在に関連し得る（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）、Ｎｅｇｒｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒｓ Ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｈｉｇｈ Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｉｎ Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｂｙ ＳＥＲＳ，”Ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｔ １３８（１７）：４８７７－４８８４（２０１３）、Ｓｕｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｂａｓｅｓ Ａｄｓｏｒｂｅｄ ｏｎ Ｓｉｌｖｅｒ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １０８（１６）：４７１１－４７１８（１９８６）（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。
【表3】
【表4】
【0093】
実施例４：修飾レンチウイルス粒子についての較正曲線の作成
ＪＬＶ１に指定される、修飾レンチウイルス粒子のＳＥＲＳスペクトルを、６３８ｎｍの励起及び市販の金のＳＥＲＳ基板（Ｓｉｌｍｅｃｏ）を用いたＳｎｏｗｙ Ｒａｎｇｅ Ｓｉｅｒｒａ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して取得した。ウイルス溶液を、３Ｄプリントされたフローセルを通してＳＥＲＳ基板に注入し、スペクトルを、２５０ｍｓの曝露時間及び０．５０ｍＷのレーザー出力で取得した。図１０Ａに示されるスペクトルは、２００個のスペクトルの平均である。全てのスペクトルを、分析前にＳＥＲＳ基板のシリコンバッキングから生じる５２０ｃｍ－１ピークに対して正規化した。ＭＣＲを使用して、図１０Ｂ及び１０Ｃ、並びに図１０Ｆ～Ｈ（成分１、２、及び３についてのスコアの比較）に示されるように、ウイルス力価を決定するための較正モデルを構築した。図１０Ｃは、例えば、グアニン（６５８及び１３８０ｃｍ－１）、ＲＮＡのリン酸骨格（８１１及び１１７３ｃｍ－１）、ウラシル（１０５９及び１２９６ｃｍ－１）、アデニン（１３２８ｃｍ－１）、並びにトリプトファン（１１１５、１３８０、及び１５２４ｃｍ－１）など、ウイルスを構成するアミノ酸及び核酸から生じるピークを有するこのモデルの成分１負荷スペクトルを示す（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）、Ｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ＤＮＡ Ｂａｓｅｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ １７（３）：２８９－２９８（１９８６）、Ｓｕｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｂａｓｅｓ Ａｄｓｏｒｂｅｄ ｏｎ Ｓｉｌｖｅｒ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １０８（１６）：４７１１－４７１８（１９８６）、Ｓｌｏａｎ－Ｄｅｎｎｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｒｉｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｓｏｎａｎｔ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｒａｄｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ，”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃ １２４（１７）：９５４８－９５５８（２０２０）、Ｖｅｒｄｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｏｗｐｅａ Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ Ｍｏｔｔｌｅ Ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｓｓｅｍｂｌｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３（１９）：４３０１－４３０８（１９８４）（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。負荷スペクトルに強く現れるピークは、各力価の平均スペクトルにも同様に強く現れ、この成分が、レンチウイルス粒子に関連していることが確認される。次いで、成分１での各試料についての平均スコアを、ウイルス力価に対してプロットして（図１０Ｄ～Ｅを参照されたい）、較正曲線を作成する。分析された最高力価である１０６ＴＵ／ｍＬでは、ＳＥＲＳ信号は、減少する（図１０Ｄ）。これは、表面が試料で飽和していることに起因する可能性が高く、したがって、追加のレンチウイルス粒子がホットスポットを占領することを遮断し、ＳＥＲＳ信号の一部が観察される。しかしながら、その力価レベルを下回ると、成分１でのスコアとウイルス力価との間に線形傾向があり、これを、図１０Ｅに示されるＪＬＶ１のウイルス力価を決定するための較正を作成するために使用した（Ｒ２＝０．９７４）。エラーバーは、ＳＥＲＳ測定値の標準偏差を表す。
ＪＬＶ１に指定される、修飾レンチウイルス粒子のＳＥＲＳスペクトルを、６３８ｎｍの励起及び市販の金のＳＥＲＳ基板（Ｓｉｌｍｅｃｏ）を用いたＳｎｏｗｙ Ｒａｎｇｅ Ｓｉｅｒｒａ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを使用して取得した。ウイルス溶液を、３Ｄプリントされたフローセルを通してＳＥＲＳ基板に注入し、スペクトルを、２５０ｍｓの曝露時間及び０．５０ｍＷのレーザー出力で取得した。図１０Ａに示されるスペクトルは、２００個のスペクトルの平均である。全てのスペクトルを、分析前にＳＥＲＳ基板のシリコンバッキングから生じる５２０ｃｍ－１ピークに対して正規化した。ＭＣＲを使用して、図１０Ｂ及び１０Ｃ、並びに図１０Ｆ～Ｈ（成分１、２、及び３についてのスコアの比較）に示されるように、ウイルス力価を決定するための較正モデルを構築した。図１０Ｃは、例えば、グアニン（６５８及び１３８０ｃｍ－１）、ＲＮＡのリン酸骨格（８１１及び１１７３ｃｍ－１）、ウラシル（１０５９及び１２９６ｃｍ－１）、アデニン（１３２８ｃｍ－１）、並びにトリプトファン（１１１５、１３８０、及び１５２４ｃｍ－１）など、ウイルスを構成するアミノ酸及び核酸から生じるピークを有するこのモデルの成分１負荷スペクトルを示す（Ｓｈａｎｍｕｋｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｖｉｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｉｌｖｅｒ Ｎａｎｏｒｏｄ Ａｒｒａｙ ＳＥＲＳ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，”Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ６（１１）：２６３０－２６３６（２００６）、Ｏｔｔｏ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ ＤＮＡ Ｂａｓｅｓ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ １７（３）：２８９－２９８（１９８６）、Ｓｕｈ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ－Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｂａｓｅｓ Ａｄｓｏｒｂｅｄ ｏｎ Ｓｉｌｖｅｒ，”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １０８（１６）：４７１１－４７１８（１９８６）、Ｓｌｏａｎ－Ｄｅｎｎｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｕｒｆａｃｅ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｒｉｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｓｏｎａｎｔ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｒａｄｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ，”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｃ １２４（１７）：９５４８－９５５８（２０２０）、Ｖｅｒｄｕｉｎ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｏｗｐｅａ Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ Ｍｏｔｔｌｅ Ｖｉｒｕｓ ｆｏｒ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｓｓｅｍｂｌｙ，”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３（１９）：４３０１－４３０８（１９８４）（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））。負荷スペクトルに強く現れるピークは、各力価の平均スペクトルにも同様に強く現れ、この成分が、レンチウイルス粒子に関連していることが確認される。次いで、成分１での各試料についての平均スコアを、ウイルス力価に対してプロットして（図１０Ｄ～Ｅを参照されたい）、較正曲線を作成する。分析された最高力価である１０６ＴＵ／ｍＬでは、ＳＥＲＳ信号は、減少する（図１０Ｄ）。これは、表面が試料で飽和していることに起因する可能性が高く、したがって、追加のレンチウイルス粒子がホットスポットを占領することを遮断し、ＳＥＲＳ信号の一部が観察される。しかしながら、その力価レベルを下回ると、成分１でのスコアとウイルス力価との間に線形傾向があり、これを、図１０Ｅに示されるＪＬＶ１のウイルス力価を決定するための較正を作成するために使用した（Ｒ２＝０．９７４）。エラーバーは、ＳＥＲＳ測定値の標準偏差を表す。
【0094】
前述に基づき、較正曲線を同じ設定で使用して、試料希釈なしの１０５ＴＵ／ｍＬ未満のウイルス力価、及び任意選択的に所定の試料希釈（例えば、１０倍、１００倍、又はそれ以上）でのより高いウイルス力価を評価することができる。希釈試料及び未希釈試料の両方を、任意選択的に並行して評価することができる。
【0095】
本明細書では好ましい実施形態が詳細に示され、記載されているが、本開示の趣旨から逸脱することなく、様々な修正、追加、置換などを行うことができ、したがって、これらは、以下の特許請求の範囲に定義される本開示の範囲内にあるとみなされることが、当業者には明らかである。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図8C】
【図8D】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図10F】
【図10G】
【図10H】
【国際調査報告】