特表 2024-541465 免疫原性組成物及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-08

(54)【発明の名称】免疫原性組成物及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/11 20060101AFI20241031BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20241031BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 15/63 20060101ALN20241031BHJP

【ＦＩ】

C12N15/11 Z ZNA

A61K31/7105

A61P37/04

C12N15/63 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2024530489

(86)(22)【出願日】2022-11-23

(85)【翻訳文提出日】2024-07-10

(86)【国際出願番号】 US2022050908

(87)【国際公開番号】W WO2023097003

(87)【国際公開日】2023-06-01

(31)【優先権主張番号】63/283,029

(32)【優先日】2021-11-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】520445473

【氏名又は名称】フラッグシップ パイオニアリング イノベーションズ シックス，エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ネルソン， ジェニファー エー．

(72)【発明者】

【氏名】カーター， エリック ポール

(72)【発明者】

【氏名】メルフィ， マイケル ドナート

【テーマコード（参考）】

4C086

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA05

4C086NA14

4C086ZB09

(57)【要約】

本開示は、ワクチンの開発及び生産において有用な免疫原と多量体化ドメインとをコードする環状ポリリボヌクレオチドに関する組成物、医薬調製物、及び方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

免疫原をコードする配列と多量体化ドメインをコードする配列とを含むオープンリーディングフレームを含む環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項2】

前記オープンリーディングフレームが、以下の５’から３’への並び順で、
（ａ）免疫原をコードする第１の配列及び多量体化ドメインをコードする第２の配列；
（ｂ）免疫原をコードする第１の配列、多量体化ドメインをコードする第２の配列、及び免疫原をコードする第３の配列；
（ｃ）免疫原をコードする第１の配列、多量体化ドメインをコードする第２の配列、免疫原をコードする第３の配列、及び多量体化ドメインをコードする第４の配列；
（ｄ）免疫原をコードする第１の配列、多量体化ドメインをコードする第２の配列、及び多量体化ドメインをコードする第３の配列；
（ｅ）多量体化ドメインをコードする第１の配列及び免疫原をコードする第２の配列；
（ｆ）多量体化ドメインをコードする第１の配列、免疫原をコードする第２の配列、及び多量体化ドメインをコードする第３の配列；
（ｇ）多量体化ドメインをコードする第１の配列、免疫原をコードする第２の配列、多量体化ドメインをコードする第３の配列、及び免疫原をコードする第４の配列；又は
（ｈ）多量体化ドメインをコードする第１の配列、多量体化ドメインをコードする第２の配列、及び免疫原をコードする第３の配列
を含む、請求項１に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項3】

前記多量体化ドメイン又は各多量体化ドメインがＴ４フォルドンドメインを含む、請求項１又は２に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項4】

前記多量体化ドメイン又は各多量体化ドメインがフェリチンドメインを含む、請求項１又は２に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項5】

前記多量体化ドメイン又は各多量体化ドメインがβ－アニュラスペプチドを含む、請求項１又は２に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項6】

前記多量体化ドメイン又は各多量体化ドメインがＡａＬＳペプチドを含む、請求項１又は２に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項7】

前記多量体化ドメイン又は各多量体化ドメインがルマジンシンターゼドメインを含む、請求項１又は２に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項8】

前記オープンリーディングフレームが、以下の５’から３’への並び順で、
（ａ）免疫原をコードする第１の配列及びＴ４フォルドンドメインをコードする第２の配列；
（ｂ）免疫原をコードする第１の配列及びフェリチンドメインをコードする第２の配列；
（ｃ）免疫原をコードする第１の配列及びβ－アニュラスペプチドをコードする第２の配列；
（ｄ）免疫原をコードする第１の配列及びＡａＬＳペプチドをコードする第２の配列；
（ｅ）免疫原をコードする第１の配列、Ｔ４フォルドンドメインをコードする第２の配列、及び免疫原をコードする第３の配列；
（ｆ）免疫原をコードする第１の配列、Ｔ４フォルドンドメインをコードする第２の配列、及びフェリチンドメインをコードする第３の配列；又は
（ｇ）免疫原をコードする第１の配列、フェリチンドメインをコードする第２の配列、及びＴ４フォルドンドメインをコードする第３の配列
を含む、請求項１に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項9】

各免疫原が、独立に、分泌シグナル配列に作動可能に連結されている、請求項１～８のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項10】

前記オープンリーディングフレームが、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項11】

第２のＩＲＥＳに作動可能に連結されている第２のポリペプチドをコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項12】

前記第２のポリペプチドが、ポリペプチド免疫原である、請求項１１に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項13】

前記第２のポリペプチドが、ポリペプチドアジュバントである、請求項１１に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項14】

前記ポリペプチドアジュバントが、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、自然免疫刺激因子、シグナル伝達分子、転写活性化因子、サイトカイン受容体、細菌成分、又は自然免疫系の成分である、請求項１３に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項15】

自然免疫系刺激因子である非コードリボ核酸配列をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項16】

前記自然免疫系刺激因子が、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造化された領域、又はアプタマーから選択される、請求項１５に記載の環状ポリリボヌクレオチド。

【請求項17】

請求項１～１６のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチドと薬学的に許容可能な賦形剤とを含む免疫原性組成物。

【請求項18】

第２の環状ポリリボヌクレオチドをさらに含む、請求項１７に記載の免疫原性組成物。

【請求項19】

前記第２の環状ポリリボヌクレオチドが、免疫原をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１８に記載の免疫原性組成物。

【請求項20】

前記第２の環状ポリリボヌクレオチドが、ポリペプチドアジュバントをコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１８に記載の免疫原性組成物。

【請求項21】

前記第２の環状ポリリボヌクレオチドが、自然免疫系刺激因子である非コードリボ核酸配列を含む、請求項１８に記載の免疫原性組成物。

【請求項22】

対象において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記対象に請求項１～２１のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物を投与することを含む方法。

【請求項23】

対象の疾患、病態、又は障害を治療又は予防する方法であって、前記対象に請求項１～２１のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物を投与することを含む方法。

【請求項24】

前記対象がヒト対象である、請求項２２又は２３に記載の方法。

【請求項25】

前記対象にアジュバントを投与することをさらに含む、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記対象にポリペプチド免疫原を投与することをさらに含む、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

ワクチン接種は、ヒト及び動物の両方の健康に多大な貢献をしてきた。１７９６年に最初のワクチンが発明されて以来、ワクチンは、対象において免疫応答を引き起こすことによって多くの感染症を予防する最も成功した方法と見なされるようになった。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によると、免疫付与は現在、すべての年齢層で毎年２００万人から３００万人の死亡を防止している。今日、ワクチンは、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ、及びはしかを含む２０を超える感染症の蔓延を予防及び制御するために開発され、天然痘の完全な根絶につながった。しかしながら、新規且つ改良された免疫原性組成物及びその使用を開発する必要性が依然として存在する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0002】

本開示は、多量体化ドメインを含む１つ以上の免疫原をコードする環状ポリリボヌクレオチドに関する組成物、医薬調製物、及び方法を提供する。本開示はまた、多量体化ドメインを含む１つ以上の免疫原をコードする環状ポリリボヌクレオチドの使用方法も提供する。本開示はまた、多量体化ドメインを含む免疫原をコードする第１の発現配列と、アジュバントをコードする第２の発現配列とを含む環状ポリリボヌクレオチドも提供する。本開示はまた、多量体化ドメインを含む免疫原をコードする発現配列と、自然免疫系を刺激する非コード配列とを含む環状ポリリボヌクレオチドも提供する。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの組成物及び医薬調製物は、投与時に対象において免疫応答を誘導し得る。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの組成物及び医薬調製物は、対象の疾患、障害、又は病態の治療又は予防に使用し得る。

【0003】

第１の態様において、本開示は、免疫原をコードする配列と、多量体化ドメインをコードする配列とを含むオープンリーディングフレームを含む環状ポリリボヌクレオチドを提供する。

【0004】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、免疫原をコードする第１の配列と、多量体化ドメインをコードする第２の配列とを含む。

【0005】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、免疫原をコードする第１の配列と、多量体化ドメインをコードする第２の配列と、免疫原をコードする第３の配列とを含む。

【0006】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、免疫原をコードする第１の配列と、多量体化ドメインをコードする第２の配列と、免疫原をコードする第３の配列と、多量体化ドメインをコードする第４の配列とを含む。

【0007】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、免疫原をコードする第１の配列と、多量体化ドメインをコードする第２の配列と、多量体化ドメインをコードする第３の配列とを含む。

【0008】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、多量体化ドメインをコードする第１の配列と、免疫原をコードする第２の配列とを含む。

【0009】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、多量体化ドメインをコードする第１の配列と、免疫原をコードする第２の配列と、多量体化ドメインをコードする第３の配列とを含む。

【0010】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、多量体化ドメインをコードする第１の配列と、免疫原をコードする第２の配列と、多量体化ドメインをコードする第３の配列と、免疫原をコードする第４の配列とを含む。

【0011】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、多量体化ドメインをコードする第１の配列と、多量体化ドメインをコードする第２の配列と、免疫原をコードする第３の配列とを含む。

【0012】

一部の実施形態において、多量体化ドメイン又は各多量体化ドメインは、Ｔ４フォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、多量体化ドメイン又は各多量体化ドメインは、フェリチンドメインを含む。一部の実施形態において、多量体化ドメイン又は各多量体化ドメインは、β－アニュラスペプチドを含む。一部の実施形態において、多量体化ドメイン又は各多量体化ドメインは、ＡａＬＳペプチドを含む。一部の実施形態において、多量体化ドメイン又は各多量体化ドメインは、ルマジンシンターゼドメインを含む。

【0013】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、免疫原をコードする第１の配列と、Ｔ４フォルドンドメインをコードする第２の配列とを含む。

【0014】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、免疫原をコードする第１の配列と、フェリチンドメインをコードする第２の配列とを含む。

【0015】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、免疫原をコードする第１の配列と、β－アニュラスペプチドをコードする第２の配列とを含む。

【0016】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、免疫原をコードする第１の配列と、ＡａＬＳペプチドをコードする第２の配列とを含む。

【0017】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、免疫原をコードする第１の配列と、Ｔ４フォルドンドメインをコードする第２の配列と、免疫原をコードする第３の配列とを含む。

【0018】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、免疫原をコードする第１の配列と、Ｔ４フォルドンドメインをコードする第２の配列と、フェリチンドメインをコードする第３の配列とを含む。

【0019】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、以下の５’から３’への並び順で、免疫原をコードする第１の配列と、フェリチンドメインをコードする第２の配列と、Ｔ４フォルドンドメインをコードする第３の配列とを含む。

【0020】

一部の実施形態において、各免疫原は、独立に、分泌シグナル配列に作動可能に連結されている。

【0021】

一部の実施形態において、オープンリーディングフレームは、ＩＲＥＳに作動可能に連結されている。

【0022】

一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第２のＩＲＥＳに作動可能に連結されている第２のポリペプチドをコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含む。

【0023】

一部の実施形態において、第２のポリペプチドは、ポリペプチド免疫原である。一部の実施形態において、第２のポリペプチドは、ポリペプチドアジュバントである。一部の実施形態において、ポリペプチドアジュバントは、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、自然免疫刺激因子、シグナル伝達分子、転写活性化因子、サイトカイン受容体、細菌成分、ウイルス成分又は自然免疫系の成分である。

【0024】

一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自然免疫系刺激因子である非コードリボ核酸配列をさらに含む。一部の実施形態において、自然免疫系刺激因子は、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造化された領域、又はアプタマーから選択される。

【0025】

別の態様において、本開示は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む免疫原性組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、第２の環状ポリリボヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態において、第２の環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原をコードするオープンリーディングフレームを含む。一部の実施形態において、第２の環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドアジュバントをコードするオープンリーディングフレームを含む。一部の実施形態において、第２の環状ポリリボヌクレオチドは、自然免疫系刺激因子である非コードリボ核酸配列を含む。

【0026】

別の態様において、本開示は、対象において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0027】

別の態様において、本開示は、対象の疾患、病態、又は障害を治療又は予防する方法であって、対象に本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物を投与することを含む方法を提供する。

【0028】

一部の実施形態において、対象はヒト対象である。

【0029】

一部の実施形態において、本方法は、対象にアジュバントを投与することをさらに含む。

【0030】

一部の実施形態において、本方法は、対象にポリペプチド免疫原を投与することをさらに含む。

【0031】

定義
本開示は、特定の実施形態に関して及び特定の図を参照して説明されるが、本開示は、それらに限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。これ以降に記載される用語は、一般に、特に示されない限り、それらの一般的な意味で理解されるべきである。

【0032】

本明細書で使用されるとき、「適応免疫応答」という用語は、体液性又は細胞性免疫応答のいずれかを意味する。本開示の目的のために、「体液性免疫応答」は、抗体分子によって媒介される免疫応答を指し、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球及び／又は他の白血球によって媒介されるものである。

【0033】

本明細書で使用されるとき、「アジュバント」という用語は、免疫応答を増加させる、例えば、ある免疫原に対する特異的免疫応答を増加させる組成物（例えば、化合物、ポリペプチド、核酸、又は脂質）を指す。免疫応答を増加させることには、抗体応答及び細胞性免疫応答のいずれか一方又は両方の強化又はその特異性の広域化が含まれる。

【0034】

本明細書で使用されるとき、「担体」という用語は、対象、組織、又は細胞への組成物（例えば、ポリリボヌクレオチド）の輸送又は送達を容易にする化合物、組成物、試薬、又は分子を意味する。担体の非限定的な例には、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン又はグリコーゲン型物質）、ナノ粒子（例えば、環状ポリリボヌクレオチドにカプセル化又は共有結合されるナノ粒子）、リポソーム、フソソーム、生体外で分化した網状赤血球、エキソソーム、タンパク質担体（例えば、ポリリボヌクレオチドに共有結合したタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー又はトランスフェクション試薬）が含まれる。

【0035】

本明細書で使用されるとき、「ｃｉｒｃＲＮＡ」、「環状ポリリボヌクレオチド」、「環状ＲＮＡ」、及び「環状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、互換的に使用され、遊離末端（即ち、遊離３’及び／又は５’末端）を有していない構造を有するポリリボヌクレオチド分子、例えば、共有結合（例えば、共有的に閉じている）又は非共有結合を介して環状又は末端のない構造を形成するポリリボヌクレオチド分子を意味する。環状ポリリボヌクレオチドは、共有結合性閉環状ポリリボヌクレオチドであり得る。

【0036】

本明細書で使用されるとき、「環状化効率」という用語は、得られた環状ポリリボヌクレオチドのその非環状出発物質に対する測定値である。

【0037】

「希釈剤」という用語は、本明細書に記載の組成物（例えば、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物）を希釈又は溶解できる不活性溶媒を含むビヒクルを意味する。希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝剤、等張剤、又はそれらの混合物であり得る。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。液体希釈剤の非限定的な例には、水又は他の溶媒、可溶化剤、及び乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、及びゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、及びソルビタンの脂肪酸エステル、及び１，３－ブタンジオールが含まれる。固体希釈剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、又は粉砂糖が含まれる。

【0038】

本明細書で使用されるとき、「疾患」、「障害」、及び「症状」という用語はそれぞれ、最適でない健康の状態、例えば、医療専門家によって通常は診断又は処置されている、又は診断又は処置されることになる状態を指す。

【0039】

本明細書で使用されるとき、「エピトープ」という用語は、抗体又はＴ細胞受容体によって認識、標的化、又は結合される免疫原の一部又は全体を指す。エピトープは、線状エピトープ、例えば、核酸又はアミノ酸の連続的な配列であり得る。エピトープは、立体構造エピトープ、例えば、タンパク質の折り畳まれた立体構造にエピトープを形成するアミノ酸を含むエピトープであり得る。立体構造エピトープは、一次アミノ酸配列からの不連続なアミノ酸を含み得る。別の例として、立体構造エピトープには、その二次構造又は三次構造に基づいて、免疫原性配列の折り畳まれた立体構造にエピトープを形成する核酸が含まれる。

【0040】

本明細書で使用されるとき、「発現配列」という用語は、産物、例えばペプチド又はポリペプチド（例えば、免疫原）をコードする核酸配列、又は調節核酸である。ペプチド又はポリペプチドをコードする例示的な発現配列は、複数の三連ヌクレオチドを含み得、そのそれぞれは、アミノ酸をコードすることができ、「コドン」と呼ばれる。

【0041】

本明細書で使用されるとき、ポリペプチド又は核酸配列（例えば、ポリペプチド免疫原又はポリペプチド免疫原をコードする核酸配列）に関連して用語「断片」は、ポリペプチド又は核酸の配列の丸ごと全部より短い連続した一部分を指す。ポリペプチド免疫原又はポリペプチド免疫原をコードする核酸配列の断片は、例えば、本明細書に開示される配列などの配列の丸ごと全部より少ない連続した一割合（例えば、全長の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％）を指す。本開示は全てが、本明細書に開示される全ての免疫原の断片（例えば、免疫原性断片）を企図することが理解される。

【0042】

本明細書で使用されるとき、用語「ＧＣ含量」は、核酸配列中のグアニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）の割合を指す。ＧＣ含量の計算式は、（Ｇ＋Ｃ）／（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｕ）×１００％（ＲＮＡについて）又は（Ｇ＋Ｃ）／（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ）×１００％（ＤＮＡについて）である。同様に、用語「ウリジン含量」は、核酸配列中のウリジン（Ｕ）の割合を指す。ウリジン含量の計算式は、Ｕ／（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｕ）×１００％である。同様に、用語「チミジン含量」は、核酸配列中のチミジン（Ｔ）の割合を指す。チミジン含量の計算式は、Ｔ／（Ａ＋Ｇ＋Ｃ＋Ｔ）×１００％である。

【0043】

本明細書で使用されるとき、「自然免疫系刺激剤」という用語は、限定はされないが、Ｉ型インターフェロン（例えば、ＩＦＮα、ＩＮＦβ、及び／又はＩＦＮγ）、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＴＮＦ－α、及び／又はＧＭ－ＣＳＦ）、レチノイン酸誘導性遺伝子－Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ、別名ＤＤＸ５８）、メラノーマ分化関連遺伝子５（ＭＤＡ５、別名ＩＦＩＨ１）、２’－５’オリゴアデニル酸シンターゼ１（ＯＡＳ１）、ＯＡＳ様タンパク質（ＯＡＳＬ）、及び／又はプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）を含め、一部には、自然免疫に関与する１つ又は複数の遺伝子の発現を誘導することによって自然免疫応答を誘導する物質を指す。自然免疫系刺激剤は、（例えば、免疫原をコードするリボヌクレオチドと組み合わせて投与したとき、又はそれと共に製剤化したとき）、アジュバントとして作用し得る。自然免疫系刺激剤は、別個の（例えば、ポリリボヌクレオチド中の配列によってコードされない、又はそうした配列として組み込まれていない）分子実体、例えば、ＳＴＩＮＧ（例えば、ｃａＳＴＩＮＧ）、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ９、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８、及びＭＤＡ－５／ＩＦＩＨ１又はその構成的に活性な突然変異体であってもよい。自然免疫系刺激剤は、ポリリボヌクレオチドによってコードされ得る（例えば、それから発現し得る）。ポリリボヌクレオチドには、或いは、又はさらに、自然免疫系刺激剤として作用するリボヌクレオチド配列（例えば、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造領域、又はアプタマー）が含まれ得る。

【0044】

本明細書で使用されるとき、「不純物」という用語は、組成物（例えば、本明細書に記載の医薬組成物）中に存在する望ましくない物質である。いくつかの実施形態では、不純物は、プロセス関連不純物である。いくつかの実施形態では、不純物は、最終組成物中の所望の産物以外（例えば活性薬物成分、例えば、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチド以外）の産物関連物質である。本明細書で使用されるとき、「プロセス関連不純物」という用語は、本明細書に記載の線状ポリリボヌクレオチド以外の最終組成物、調製物、又は製品では望ましくない、組成物、調製物、又は製品の製造で使用される、存在する、又は生成される物質である。いくつかの実施形態では、プロセス関連不純物は、ポリリボヌクレオチドの合成又は環状化に使用される酵素である。本明細書で使用されるとき、「産物関連物質」という用語は、組成物、調製物、又は製品、又はそれらの任意の中間体の合成中に生成される物質又は副産物である。いくつかの実施形態では、産物関連物質はデオキシリボヌクレオチド断片である。いくつかの実施形態では、産物関連物質は、デオキシリボヌクレオチドモノマーである。いくつかの実施形態では、産物関連物質は、１つ又は複数の本明細書に記載のポリリボヌクレオチドの誘導体又は断片（例えば、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、又は４つのリボ核酸、モノリボ核酸、ジリボ核酸、又はトリリボ核酸）の断片である。

【0045】

本明細書で使用されるとき、「免疫原」という用語は、抗体又はＴ細胞受容体によって認識される、標的化される、又は結合される１つ又は複数のエピトープを含む任意の分子又は分子構造を指す。特に、免疫原は、対象において免疫応答を誘発する（例えば、本明細書で定義される免疫原性である）。免疫原は、対象において免疫応答を誘発することができ、免疫応答は、免疫系が免疫原に遭遇したときに誘発される一連の分子、細胞、及び生物の事象を指す。免疫応答は、体液性及び／又は細胞性免疫応答であり得る。これらには、抗体の産生とＢ細胞及びＴ細胞の増殖が含まれ得る。免疫応答が生じたかどうかを判断し、その経過を観察するために、免疫化された対象を、特定の免疫原に対する免疫反応物質の出現について監視することができる。ほとんどの免疫原に対する免疫応答は、特定の抗体及び特定のエフェクターＴ細胞の両方の産生を誘発する。いくつかの実施形態では、免疫原は、宿主にとって外来性である。いくつかの実施形態では、免疫原は、宿主にとって外来性ではない。免疫原は、ポリペプチド、多糖、ポリヌクレオチド、又は脂質のすべて又は一部を含み得る。免疫原はまた、ポリペプチド、多糖、ポリヌクレオチド、及び／又は脂質の混合物であり得る。例えば、免疫原は、翻訳的に改変されたポリペプチドであり得る。「ポリペプチド免疫原」は、ポリペプチドを含む免疫原を指す。ポリペプチド免疫原は、１つ又は複数の翻訳後修飾を含むこともでき、且つ／又は１つ又は複数の追加の分子と複合体を形成することができ、且つ／又は三次構造又は四次構造を選択することができ、それぞれが、ポリペプチドの免疫原性を決定することができる、又はポリペプチドの免疫原性に影響を与えることができる。

【0046】

本明細書で使用されるとき、「免疫原性」という用語は、特定の免疫応答アッセイにおいて、物質に対して所定の閾値を超える応答を誘発する潜在能力を指す。アッセイは、例えば、特定の炎症マーカーの発現、抗体の産生、又は本明細書に記載の免疫原性のアッセイであり得る。いくつかの実施形態では、生物の免疫系又は特定の種類の免疫細胞が免疫原に曝露されると、免疫応答が誘発され得る。

【0047】

免疫原性応答は、全抗体アッセイ、確認試験、抗体の力価測定及びアイソタイピング、並びに中和抗体評価を使用して、対象の血漿又は血清中の抗体を評価することによって評価することができる。全抗体アッセイは、免疫原が投与された対象の血清又は血漿における免疫応答の一部として生成されたすべての抗体を測定する。抗体を検出するために最も一般的に使用される試験は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）であり、ＥＬＩＳＡは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含む目的の抗体に結合する、試験される血清中の抗体を検出する。免疫原性応答は、確認アッセイによってさらに評価することができる。全抗体評価に続いて、確認アッセイを使用して、全抗体アッセイの結果を確認することができる。競合アッセイを使用して、抗体が標的に特異的に結合していること、及びスクリーニングアッセイでの陽性所見が、試験血清又は検出試薬とアッセイ中の他の物質との非特異的相互作用の結果ではないことを確認することができる。

【0048】

免疫原性応答は、アイソタイピング及び力価測定によって評価することができる。アイソタイピングアッセイを使用して、関連する抗体アイソタイプのみを評価することができる。例えば、予想されるアイソタイプは、ＩｇＭ及びＩｇＧであり得、ＩｇＭ及びＩｇＧは、アイソタイピング及び力価測定によって特異的に検出及び定量して、存在する全抗体と比較することができる。

【0049】

免疫原性応答は、中和抗体アッセイ（ｎＡｂ）によって評価することができる。中和抗体アッセイ（ｎＡｂ）を使用して、免疫原に応答して産生される抗体が、免疫原を中和し、それによって免疫原が標的に影響を与えることを阻害し、異常な薬物動態挙動を引き起こすかどうかを判断することができる。多くの場合、ｎＡｂアッセイは、標的細胞を抗体とともにインキュベートする細胞ベースのアッセイである。限定されるものではないが、細胞増殖、生存率、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、細胞変性効果阻害（ＣＰＥ）、アポトーシス、リガンド刺激細胞シグナル伝達（Ｌｉｇａｎｄ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、酵素活性、レポーター遺伝子アッセイ、タンパク質分泌、代謝活性、ストレス、及びミトコンドリア機能を含む様々な細胞ベースのｎＡｂアッセイを使用することができる。検出の読み出しには、吸光度、蛍光、発光、化学発光、又はフローサイトメトリーが含まれる。リガンド結合アッセイを使用して、免疫原と抗体の結合親和性をインビトロで測定し、中和効果を評価することもできる。

【0050】

さらに、細胞性免疫応答の誘発は、対象から得られたＴ細胞上の細胞マーカーを使用して、対象におけるＴ細胞活性化を測定することによって評価することができる。血液サンプル、リンパ節生検、又は組織サンプルを対象から収集し、サンプルからのＴ細胞を１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、４つ、又はそれ以上）の活性化マーカー：ＣＤ２５、ＣＤ７１、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ１５４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ１３４、ＣＤ６９、ＣＤ６２Ｌ、又はＣＤ４４について評価することができる。Ｔ細胞活性化は、インビボ動物モデルで同じ方法を使用して評価することもできる。このアッセイは、免疫原をインビトロでＴ細胞（例えば、対象、動物モデル、貯蔵所、又は商業的供給源から得たＴ細胞）に添加し、前述のマーカーを測定してＴ細胞活性化を評価することによっても行うことができる。同様のアプローチを使用して、他の免疫細胞、例えば、好酸球（マーカー：ＣＤ３５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ６６、ＣＤ６９、及びＣＤ８１）、樹状細胞（マーカー：ＩＬ－８、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＤ８６）、好塩基球（ＣＤ６３、ＣＤ１３、ＣＤ４、及びＣＤ２０３ｃ）、及び好中球（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３５、ＣＤ６６ｂ、及びＣＤ６３）の活性化に対する効果を評価することができる。これらのマーカーは、フローサイトメトリー、免疫組織化学、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、及び細胞マーカーの測定を可能にする他のアッセイを使用して評価することができる。免疫原の投与前後の結果の比較を使用して、その効果を判断することができる。

【0051】

本明細書で使用されるとき、「免疫応答を誘発する」という用語は、対象による免疫応答を開始すること、増幅すること、又は維持することを指す。免疫応答の誘発は、適応免疫応答又は自然免疫応答を指し得る。免疫応答の誘発は、上記のように測定することができる。

【0052】

本明細書で使用されるとき、「線状対応物」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）を有し、且つ２つの自由末端（即ち、環状ポリリボヌクレオチドの非環状型（及びその断片））を有するポリリボヌクレオチド分子（及びその断片）である。いくつかの実施形態では、線状対応物（例えば、環状化前の型）は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）及び同じ又は類似の核酸修飾を有し、且つ２つの自由末端（即ち、環状ポリリボヌクレオチドの非環状型（及びその断片））を有するポリリボヌクレオチド分子（及びその断片）である。いくつかの実施形態では、線状対応物は、環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）及び異なる核酸修飾を有するか、又は環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似のヌクレオチド配列（例えば、１００％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、又はそれらの間の任意のパーセンテージの配列同一性）を有するが核酸修飾を有しておらず、且つ２つの自由末端（即ち、環状ポリリボヌクレオチドの非環状型（及びその断片））を有するポリリボヌクレオチド分子（及びその断片）である。いくつかの実施形態では、線状対応物であるポリリボヌクレオチド分子の断片は、線状対応物ポリリボヌクレオチド分子よりも短い線状対応物ポリリボヌクレオチド分子の任意の部分である。いくつかの実施形態では、線状対応物は、５’キャップをさらに含む。いくつかの実施形態では、線状対応物は、ポリアデノシン尾部をさらに含む。いくつかの実施形態では、線状対応物は、３’ＵＴＲをさらに含む。いくつかの実施形態では、線状対応物は、５’ＵＴＲをさらに含む。

【0053】

本明細書で使用されるとき、「線状ＲＮＡ」、「線状ポリリボヌクレオチド」、及び「線状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、互換的に使用され、５’及び３’末端を有するポリリボヌクレオチド分子を意味する。５’末端及び３’末端の一方又は両方は、遊離末端であってもよいし、又は別の部分に結合していてもよい。線状ＲＮＡは、環状化されていない（例えば、事前に環状化されていない）ＲＮＡを含み、例えば、スプリントライゲーション、又は化学的、酵素的、リボザイム又はスプライシング触媒による環状化法による環状化のための出発物質として使用することができる。

【0054】

本明細書で使用されるとき、「修飾リボヌクレオチド」という用語は、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合に対して少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチドを意味する。

【0055】

本明細書で使用されるとき、用語「多量体化ドメイン」は、自己集合して多量体（例えば、二量体、三量体、四量体、又はオリゴマー）を形成するポリペプチドドメインを指す。詳細な実施形態において、多量体化ドメインは、ポリペプチド（例えば、ポリペプチド免疫原）に融合することができる。そのような場合、多量体化ドメインに融合する結果、多量体化ドメインに共有結合的に結び付いた免疫原を含むポリペプチドの発現に伴い２つ以上の免疫原を有する多量体免疫原複合体が形成されることになる。

【0056】

本明細書で使用されるとき、「裸の送達」という用語は、担体の助けを借りず、細胞への送達を助ける部分への共有結合修飾も使用しない、細胞への送達のための製剤を意味する。裸の送達製剤には、トランスフェクション試薬、カチオン担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体のいずれも含まれない。例えば、環状ポリリボヌクレオチドの裸の送達製剤は、共有結合修飾なしで環状ポリリボヌクレオチドを含み、担体を含まない製剤である。

【0057】

本明細書で使用されるとき、「ニックＲＮＡ」、「ニック線状ポリリボヌクレオチド」、及び「ニック線状ポリリボヌクレオチド分子」という用語は、互換的に使用され、環状ＲＮＡの切断又は分解から生じる５’及び３’末端を有するポリリボヌクレオチド分子を意味する。

【0058】

本明細書で使用されるとき、「非環状ＲＮＡ」という用語は、全ニックＲＮＡ及び線状ＲＮＡを意味する。

【0059】

「医薬組成物」という用語は、医薬組成物内に含まれる環状ポリリボヌクレオチドを、療法によるヒト又は動物の体の処置に使用できることを開示することも意図している。したがって、医薬組成物は、「療法に使用するための環状ポリリボヌクレオチド」と等価であることを意味する。

【0060】

本明細書で使用されるとき、「ポリヌクレオチド」という用語は、１つ又は複数の核酸サブユニット又はヌクレオチドを含む分子を意味し、「核酸」又は「オリゴヌクレオチド」と互換的に使用することができる。ポリヌクレオチドは、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びウラシル（Ｕ）、又はそれらの変異体から選択される１つ又は複数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドは、ヌクレオシド及び少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上のリン酸（ＰＯ_３）基を含み得る。ヌクレオチドは、核酸塩基、五炭糖（リボース又はデオキシリボースのいずれか）、及び１つ又は複数のリン酸基を含み得る。リボヌクレオチドは、糖がリボースであるヌクレオチドである。ポリリボヌクレオチド又はリボ核酸、又はＲＮＡは、ホスホジエステル結合を介して重合された複数のリボヌクレオチドを含む高分子を指し得る。デオキシリボヌクレオチドは、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドである。

【0061】

「ポリデオキシリボヌクレオチド」、「デオキシリボ核酸」、及び「ＤＮＡ」は、ホスホジエステル結合を介して重合された複数のデオキシリボヌクレオチドを含む高分子を意味する。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸又はヌクレオシドポリリン酸であり得る。ヌクレオチドは、発光タグやマーカーなどの検出可能なタグ（例えば、フルオロフォア）を含む、例えば、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、ウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、及びデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）ｄＮＴＰから選択することができるデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）などのデオキシリボヌクレオシドポリリン酸を意味する。ヌクレオチドは、成長する核酸鎖に組み込むことができる任意のサブユニットを含み得る。このようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、又はＵ、或いは、１つ又は複数の相補的なＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、若しくはＵに特異的であるか、又はプリン（即ち、Ａ又はＧ、又はその変異体）若しくはピリミジン（即ち、Ｃ、Ｔ、又はＵ、又はその変異体）に相補的な任意の他のサブユニットであり得る。いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれらの誘導体若しくは変異体である。場合によっては、ポリヌクレオチドは、いくつか例を挙げると、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｍＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ－ｍＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）であり、ヌクレオチド配列、及び一本鎖、二本鎖、三本鎖、らせん、ヘアピンなどのその任意の構造的実施形態の両方を包含する。場合によっては、ポリヌクレオチド分子は環状である。ポリヌクレオチドは、様々な長さを有し得る。核酸分子は、少なくとも約１０塩基、２０塩基、３０塩基、４０塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、３００塩基、４００塩基、５００塩基、１キロ塩基（ｋｂ）、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、又はそれ以上の長さを有し得る。ポリヌクレオチドは、細胞又は組織から単離することができる。本明細書で具体化されるように、ポリヌクレオチド配列は、単離及び精製されたＤＮＡ／ＲＮＡ分子、合成ＤＮＡ／ＲＮＡ分子、及び合成ＤＮＡ／ＲＮＡ類似体を含み得る。

【0062】

ポリヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチド）は、非標準ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、及び／又は修飾ヌクレオチドを含む１つ又は複数のヌクレオチド変異体を含み得る。修飾ヌクレオチドの例には、限定されるものではないが、ジアミノプリン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ６－アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアミノメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、β－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｄ４６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、５－メチル－２－チオウラシル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６－ジアミノプリンなどが含まれる。場合によっては、ヌクレオチドは、三リン酸部分への修飾を含む、それらのリン酸部分の修飾を含み得る。そのような修飾の非限定的な例としては、より長いリン酸鎖（例えば、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上のリン酸部分を有するリン酸鎖）及びチオール部分の修飾（例えば、α－チオ三リン酸及びβ－チオ三リン酸）が挙げられる。核酸分子はまた、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で（例えば、典型的には相補的ヌクレオチドとの水素結合を形成するのに利用できる１つ又は複数の原子で、及び／又は典型的には相補的なヌクレオチドとの水素結合を形成できない１つ又は複数の原子で）修飾され得る。核酸分子はまた、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）などのアミン反応性部分の共有結合を可能にするために、アミノアリル（ａｍｉｎｏ ａｌｌｙ １）－ｄＵＴＰ（ａａ－ｄＵＴＰ）及びアミノヘキシルアクリルアミド－ｄＣＴＰ（ａｈａ－ｄＣＴＰ）などのアミン修飾基を含み得る。本開示のオリゴヌクレオチドにおける標準的なＤＮＡ塩基対又はＲＮＡ塩基対の代替物は、高い１立方ｍｍ当たりのビット密度、より高い安全性（天然毒素の偶発的又は意図的な合成に対する耐性）、光プログラムされたポリメラーゼにおけるより容易な識別、又は下位二次構造を提供し得る。デノボ及び／又は増幅合成のための天然及び突然変異ポリメラーゼと適合するそのような代替塩基対は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｔｚ Ｋ，Ｍａｌｙｓｈｅｖ ＤＡ，Ｌａｖｅｒｇｎｅ Ｔ，Ｗｅｌｔｅ Ｗ，Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ Ｋ，Ｄｗｙｅｒ ＴＪ，Ｏｒｄｏｕｋｈａｎｉａｎ Ｐ，Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ ＦＥ，Ｍａｒｘ Ａ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ；８（７）：６１２－４に記載されている。

【0063】

本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合ペプチド結合によって一緒に連結されたアミノ酸残基（天然又は非天然）のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用されるとき、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。ポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド、相同体、オルソログ、パラログ、それらの断片及び他の同等物、変異体、及び類似体が含まれ得る。ポリペプチドは、単一分子であってもよいし、又は二量体、三量体、若しくは四量体などの多分子複合体であってもよい。ポリペプチドはまた、単鎖、又は抗体若しくはインスリンなどの多重鎖ポリペプチドを含み得、会合又は連結され得る。最も一般的なジスルフィド結合は、多重鎖ポリペプチドに見られる。ポリペプチドという用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用することができる。

【0064】

本明細書で使用されるとき、「予防する」という用語は、疾患、障害、又は症状が発生する可能性を低減すること、或いは、その後に発生する疾患又は障害の重症度又は徴候の頻度を軽減することを意味する。治療剤は、疾患又は症状の発生を予防する、又はその重症度を軽減するために、一般集団のメンバーと比較して疾患又は障害が発生するリスクが高い対象に投与することができる。治療剤は、予防として（例えば、疾患又は障害の徴候又は発現の発生の前に）投与することができる。

【0065】

本明細書では同義的に使用されるとおり、用語「ポリＡ」及び「ポリＡ配列」は、アデノシン残基からなる、少なくとも５ヌクレオチド長の核酸分子の連続する非翻訳領域を指す。一部の実施形態において、ポリＡ配列は、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、又は少なくとも５０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ポリＡ配列は、オープンリーディングフレーム（例えば、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム）の３’側に（例えば、その下流に）位置し、及びポリＡ配列は、終結エレメント（例えば、終止コドン）の３’側にあるため、ポリＡは翻訳されない。一部の実施形態において、ポリＡ配列は、終結エレメント及び３’非翻訳領域の３’側に位置する。

【0066】

本明細書で使用されるとき、用語「調節エレメント」は、環状ポリリボヌクレオチド内にある発現配列の発現を修飾する核酸配列などの部分である。

【0067】

本明細書で使用されるとき、用語「複製エレメント」は、複製に有用な、又は環状ポリリボヌクレオチドの転写を惹起する配列及び／又はモチーフである。

【0068】

本明細書で使用されるとき、「全身送達」又は「全身投与」という用語は、循環系（例えば、血液系又はリンパ系）への医薬組成物又は他の物質の投与経路を意味する。全身投与には、経口投与、非経口投与、鼻腔内投与、舌下投与、直腸投与、経皮投与、又はそれらの任意の組み合わせが含まれ得る。本明細書で使用されるとき、「非全身送達」又は「非全身投与」という用語は、医薬組成物又は他の物質の全身送達以外の任意の他の投与経路を指すことがある（例えば、送達される物質は、対象の体の循環系（例えば、血液系及びリンパ系）に入らない）。

【0069】

本明細書で使用されるとき、「配列同一性」という用語は、グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用して２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定される。したがって、配列は、それらが（デフォルトパラメータを使用して、例えばプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列された場合）少なくとも特定の最小パーセンテージの配列同一性を共有する場合、「実質的に同一」又は「本質的に類似」と呼ぶことができる。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をその全長にわたって整列させ、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。一般に、ギャップ作成ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ拡張ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）のＧＡＰのデフォルトパラメータが使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトのスコア行列は、ｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア行列であり、タンパク質の場合、デフォルトのスコア行列は、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９２，ＰＮＡＳ ８９，９１５－９１９）。配列アラインメント及び配列同一性パーセンテージのスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｉｎｃ．，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｏａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ ９２１２１－３７５２ ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．３又はＥｍｂｏｓｓＷｉｎ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．１０．０（プログラム「針」を使用）などのコンピュータープログラムを使用して決定することができる。別法又はこれに加えて、パーセント同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用してデータベースで検索することによって決定することができる。配列同一性は、配列の全長にわたる配列同一性を指す。

【0070】

「シグナル配列」は、ポリペプチド配列を分泌経路にターゲティングする新生タンパク質のポリペプチド配列のＮ末端に存在する（例えば、１０～４５のアミノ酸長）のポリペプチド配列を指す。

【0071】

本明細書で使用されるとき、「処置する」又は「処置すること」という用語は、対象の疾患又は障害（例えば、感染症、癌、毒性、又はアレルギー反応）の治療的処置を指す。処置の効果には、疾患又は疾患若しくは障害の１つ若しくは複数の徴候若しくは発現の逆転、軽減、重症度の軽減、治癒、進行の阻害、再発の可能性の低減、疾患又は障害の状態の安定化（即ち、悪化しないこと）、及び／又は治療的処置がない場合の疾患又は障害の状態及び／又は症状と比較して、疾患又は障害の蔓延の防止が含まれ得る。

【0072】

本明細書で使用されるとき、「終結要素」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドにおける発現配列の翻訳を終結させる核酸配列などの部分である。

【0073】

本明細書において使用される際、「総リボヌクレオチド分子」という用語は、リボヌクレオチド分子の総量によって測定される際、線状ポリリボヌクレオチド分子、環状ポリリボヌクレオチド分子、モノマーリボヌクレオチド、他のポリリボヌクレオチド分子、そのフラグメント、及びその修飾形態を含むいずれかのリボヌクレオチド分子の総量を意味する。

【0074】

本明細書において使用される際、「翻訳効率」という用語は、リボヌクレオチド転写産物からのタンパク質又はペプチド産生の速度又は量である。ある実施形態では、翻訳効率は、（例えば、所与の翻訳系、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物のようなインビトロ翻訳系において、又は真核細胞若しくは原核細胞のようなインビボ翻訳系において、例えば所与の期間で）、タンパク質又はペプチドをコードする所与の量の１転写産物当たりで生成されるタンパク質又はペプチドの量として表され得る。

【0075】

本明細書で使用されるとき、「翻訳開始配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドにおける発現配列の翻訳を開始させる核酸配列である。

【図面の簡単な説明】

【0076】

【図1】免疫原と１つ以上の多量体化ドメインとをコードする例示的なポリリボヌクレオチド構築物の概略図及び例示的な対応する免疫原複合体である。

【図2】各発現配列がＩＲＥＳに作動可能につながった２つの発現配列を含む、且つ少なくとも一方の発現配列が、多量体化ドメインを含む免疫原であるような例示的環状ＲＮＡの概略図である。

【図3】切断ドメイン（例えば、２Ａ、フューリン部位、又はフューリン－２Ａ）によって分離された２つの発現配列を含む、少なくとも一方の発現配列が、多量体化ドメインを含む免疫原であり、且つ全てがＩＲＥＳに作動可能に連結されているような例示的環状ＲＮＡの概略図である。

【図4】多量体化ドメインを含む免疫原をコードするＯＲＦと、ポリヌクレオチドアジュバント配列（例えば、自然免疫系を刺激する非コードヌクレオチド配列）とを含む環状ＲＮＡの概略図を示す。

【図5】第１の環状ＲＮＡが、多量体化ドメインを含む免疫原をコードするＯＲＦを含み、及び第２の環状ＲＮＡが、第２の免疫原又はポリペプチドアジュバントのいずれかをコードするＯＲＦを含む、複数の環状ＲＮＡの概略図を示す。

【図6】トランスフェクションから２４時間後のＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ）又はフォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ－フォルドン）によるＲＢＤ及びＲＢＤ－フォルドンの発現を示すウエスタンブロットである。アスタリスクは、その試料が変性条件下で泳動したものであることを表す。図６は、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤがＲＢＤ単量体を発現し、Ｔ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするｃｉｒｃＲＮＡがインビトロで三量体構造を発現して形成する（三量体）ことを示している。

【図7】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡ又はフォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡのいずれかを投与した後のマウスの血清中におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原の発現を示す。

【図8】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡ又はフォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡのいずれかの初回用量の投与後（プライミング用量後）１４日、２７日、３５日、及び４２日でマウスの血清中において結合抗体が産生されたことを示す。

【図9】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡ又はフォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡのいずれかの初回用量の投与後（プライミング用量後）４２日でマウスにおいてＴ細胞応答がプライミングされたことを示す。

【図10】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡ又はフォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードする環状ＲＮＡのいずれかの初回用量の投与後（プライミング用量後）４２日でマウスの血清中においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体が産生されたことを示す。

【図11】１００μｇ用量のＬＮＰ製剤化した環状ＲＮＡ又は１０００μｇ用量のＬＮＰ製剤化した環状ＲＮＡを筋肉内注射で投与した後のカニクイザルの血清中におけるＴ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原の発現を示す。

【図12】Ｔ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするＬＮＰ製剤化した環状ポリリボヌクレオチド又はＴ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするアジュバント化した環状ポリリボヌクレオチドのいずれかの初回用量の投与後（プライミング用量後）４２日目でカニクイザルにおいてＲＢＤ特異的抗体がプライミングされたことを示す。

【図13】Ｔ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするＬＮＰ製剤化した環状ポリリボヌクレオチド又はＴ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするアジュバント化した環状ポリリボヌクレオチドのいずれかの初回用量の投与後（プライミング用量後）４２日目でカニクイザルにおいて中和抗体がプライミングされたことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0077】

本開示は、多量体化ドメインを含む１つ以上の免疫原をコードする環状ポリリボヌクレオチドに関する組成物、医薬調製物、及び方法を提供する。本開示はまた、多量体化ドメインを含む１つ以上の免疫原をコードする環状ポリリボヌクレオチドの使用方法も提供する。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの組成物及び医薬調製物は、投与時に対象に免疫応答を誘導し得る。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの組成物及び医薬調製物は、対象の疾患、障害、又は病態の治療又は予防に使用し得る。

【0078】

環状ポリリボヌクレオチド
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載されるエレメントのいずれか１つ以上と、多量体化ドメインを含む免疫原をコードする発現配列とを含み得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）に開示されるとおりの任意の特徴、又は特徴の任意の組み合わせを含む。

【0079】

一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド、又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである。

【0080】

一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５００ヌクレオチド～２０，０００ヌクレオチド、１，０００～２０，０００ヌクレオチド、２，０００～２０，０００ヌクレオチド、又は５，０００～２０，０００ヌクレオチドである。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５００ヌクレオチド～１０，０００ヌクレオチド、１，０００～１０，０００ヌクレオチド、２，０００～１０，０００ヌクレオチド、又は５，０００～１０，０００ヌクレオチドである。

【0081】

免疫原
本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、多量体化ドメインを含む免疫原をコードする少なくとも１つの発現配列を含む。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは複数の発現配列を含んでもよく、ここでは少なくとも１つの発現配列が、多量体化ドメインを含む免疫原をコードする。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の（２、３、４、５、６つ又はそれ以上の）発現配列を含んでもよく、ここでは各発現配列が、多量体化ドメインを含む免疫原をコードする。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、多量体化ドメインを含む免疫原をコードする第１の発現配列と、アジュバントをコードする第２の発現配列とを含み得る。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、多量体化ドメインを含む免疫原をコードする発現配列と、自然免疫系を刺激する非コード配列とを含み得る。

【0082】

免疫原には、所与の抗体又はＴ細胞受容体によって認識され、標的化され、又は結合される１つ又は複数のエピトープが含まれる。エピトープは、線状エピトープ、例えば、核酸又はアミノ酸の連続的な配列であり得る。エピトープは、立体構造エピトープ、例えば、タンパク質の折り畳まれた立体構造にエピトープを形成するアミノ酸を含むエピトープであり得る。立体構造エピトープは、一次アミノ酸配列からの不連続なアミノ酸を含み得る。別の例として、立体構造エピトープには、その二次構造又は三次構造に基づいて、免疫原性配列の折り畳まれた立体構造にエピトープを形成する核酸が含まれる。

【0083】

いくつかの実施形態では、免疫原は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、リボ核タンパク質、炭水化物（例えば、多糖）、脂質（例えば、リン脂質又はトリグリセリド）、又は核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）のすべて又は一部を含む。

【0084】

他の実施形態では、免疫原には、タンパク質免疫原又はエピトープ（例えば、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、リンタンパク質、又はリボ核タンパク質由来のペプチド免疫原又はペプチドエピトープ）が含まれる。免疫原は、アミノ酸、糖、脂質、ホスホリル、又はスルホニル基、又はそれらの組み合わせを含み得る。

【0085】

特定の実施形態では、免疫原は、ポリペプチド免疫原である。

【0086】

ポリペプチド免疫原は、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、ユビキチン化、リン酸化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、アミド化、ヒドロキシル化、硫酸化、又は脂質化を含み得る。

【0087】

ある実施形態では、免疫原は、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、若しくは少なくとも３０のアミノ酸、又はそれ以上のアミノ酸を含むエピトープを含む。ある実施形態では、エピトープは、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、２０以下、２１以下、２２以下、２３以下、２４以下、２５以下、２６以下、２７以下、２８以下、２９以下、若しくは３０以下のアミノ酸、又はそれ以下のアミノ酸を含む。ある実施形態では、エピトープは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個のアミノ酸を含むか又は含有する。ある実施形態では、エピトープは、５個のアミノ酸を含有する。ある実施形態では、エピトープは、６個のアミノ酸を含有する。ある実施形態では、エピトープは、７個のアミノ酸を含有する。ある実施形態では、エピトープは、８個のアミノ酸を含有する。ある実施形態では、エピトープは、約８～約１１個のアミノ酸であり得る。ある実施形態では、エピトープは、約９～約２２個のアミノ酸であり得る。

【0088】

免疫原は、Ｂ細胞によって認識される免疫原、Ｔ細胞によって認識される免疫原、又はそれらの組合せを含み得る。ある実施形態では、免疫原は、Ｂ細胞によって認識される免疫原を含む。ある実施形態では、免疫原は、Ｂ細胞によって認識される免疫原である。る実施形態において、免疫原は、Ｔ細胞によって認識される免疫原を含む。ある実施形態では、免疫原は、Ｔ細胞によって認識される免疫原である。

【0089】

エピトープは、Ｂ細胞によって認識されるもの、Ｔ細胞によって認識される免疫原、又はそれらの組合せを含み得る。ある実施形態では、エピトープは、Ｂ細胞によって認識されるエピトープを含む。ある実施形態では、エピトープは、Ｂ細胞によって認識されるエピトープである。ある実施形態では、エピトープは、Ｔ細胞によって認識されるエピトープを含む。ある実施形態では、エピトープは、Ｔ細胞によって認識されるエピトープである。

【0090】

コンピュータ内で免疫原及びエピトープを同定するための技術は、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｔｒｉｎｃａｄｏ ＪＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｔ－ａｎｄ Ｂ－ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，２０１７：２６８０１６０．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１７／２６８０１６０（２０１７））；Ｇｒｉｆｏｎｉ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｃａｎ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ Ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２，Ｃｅｌｌ Ｈｏｓｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ，２７（４）：６７１－８０（２０２０））；Ｒｕｓｓｉ ＲＣ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＰｍｐＤ：Ｆｉｒｓｔ ｓｔｅｐ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ ｖａｃｃｉｎｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｊ．，４１（２）：１０９－１７（２０１８））；Ｂａｒｕａｈ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ－ａｉｄｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ２０１９－ｎＣｏＶ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，９２（５），ｄｏｉ：１０．１００２／ｊｍｖ．２５６９８（２０２０））に開示されている。

【0091】

いくつかの実施形態では、免疫原は、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、免疫原はポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、免疫原はＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、免疫原はＲＮＡである。いくつかの実施形態では、免疫原はＤＮＡを含む。いくつかの実施形態では、免疫原はＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、環状又は線状ポリリボヌクレオチドにコードされる。

【0092】

本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、様々な免疫原を含むか又はコードする。環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、又はそれ以上の免疫原を含むか又はコードする。

【0093】

ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、例えば、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１５以下、２０以下、２５以下、３０以下、４０以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、１００以下、１２０以下、１４０以下、１６０以下、１８０以下、２００以下、２５０以下、３００以下、３５０以下、４００以下、４５０以下、５００以下、又はそれ以下の免疫原を含むか又はコードする。

【0094】

ある実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００の免疫原を含むか又はコードする。

【0095】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、複数の免疫原をコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、１～１００の免疫原を含む、又はコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、１～５０の免疫原を含む、又はコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、１～１０の免疫原を含む、又はコードする；例えば、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０の免疫原をコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２つの免疫原を含む、又はコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、３つの免疫原を含む、又はコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、４つの免疫原を含む、又はコードする。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、５つの免疫原を含む、又はコードする。

【0096】

いくつかの実施形態では、複数の免疫原はそれぞれ、同じ標的を同定する。別の言い方をすれば、単一の標的は、複数の免疫原のそれぞれを含み得、複数の免疫原のそれぞれは、同じ標的に由来し得、及び／又は複数の免疫原のそれぞれは、標的の一部又は全体と高度な類似性を共有し得る。例えば、標的は、細胞であり得、免疫原のそれぞれは、その細胞のタンパク質に一致し得る。例えば、標的は、特定の癌細胞であり得、免疫原のそれぞれは、その癌に関連する腫瘍抗原に一致し得る。したがって、いくつかの実施形態では、複数の免疫原のそれぞれは、同じ標的からの異なるタンパク質に由来する。

【0097】

いくつかの実施形態では、免疫原は、異なる標的に由来する。いくつかの実施形態では、複数の免疫原は、所与のウイルスの様々なカプシドタンパク質に由来し得る。例えば、１つの免疫原は、オルソポックスウイルス（Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）に由来し得、別の免疫原は、ヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）に由来し得、第３の免疫原は、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）に由来し得る。例えば、ポリリボヌクレオチドは、複数の免疫原をコードし得、各免疫原は、黄熱病ウイルス、チクングンヤ熱（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、ジカ（Ｚｉｋａ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎に由来する。ポリリボヌクレオチドは、黄熱病ウイルス、チクングンヤ熱（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、ジカ（Ｚｉｋａ）、Ａ型肝炎、又はＢ型肝炎のそれぞれに由来する免疫原をコードし得る。ポリリボヌクレオチドは、日本脳炎、チクングンヤ熱（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス、ジカ（Ｚｉｋａ）、Ａ型肝炎、及びＢ型肝炎のそれぞれに由来する免疫原をコードし得る。ポリリボヌクレオチドは、複数の免疫原をコードし得、各免疫原は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ポックスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、又はヒトパピローマウイルスに由来する。ポリリボヌクレオチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ポックスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、及びヒトパピローマウイルスのそれぞれに由来する免疫原をコードし得る。ポリリボヌクレオチドは、複数の免疫原をコードし得、各免疫原は、ヘルペスウイルス（ＣＭＶ、ＥＢＶ、又はＶＺＶ）に由来する。ポリリボヌクレオチドは、ヘルペスウイルス：ＣＭＶ、ＥＢＶ、又はＶＺＶのそれぞれに由来する免疫原をコードし得る。ポリリボヌクレオチドは、複数の免疫原をコードする場合があり、各免疫原は、帯状疱疹（Ｓｉｎｇｌｅｓ）又は西ナイルウイルスに由来する。ポリリボヌクレオチドは、帯状疱疹（Ｓｈｉｎｇｌｅｓ）及び西ナイルウイルスのそれぞれに由来する免疫原をコードし得る。

【0098】

いくつかの実施形態では、免疫原は、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、免疫原はまた、１００％未満の配列同一性も有する。これは、免疫原が遺伝的浮動によって互いに近縁関係にあるとされ、そのため、単一の環状又は線状ポリリボヌクレオチド組成物又は免疫原性組成物が、集団中に様々な突然変異状態で存在する標的に対して免疫応答を誘導することが可能であり得るか、又は免疫原が遺伝的浮動によって近縁関係にあるとされるような同じ免疫原を有する複数の標的に対して免疫応答を誘導し得ることを指し示すものであり得る。例えば、免疫原は、標的ウイルスの遺伝的浮動によって互いに近縁関係にあるとされてもよい。いくつかの実施形態では、複数の免疫原は、ユニークな、しかし近縁関係にあるウイルスからの受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）に由来し得る。

【0099】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、免疫原の変異体をコードする。変異体は、天然に存在する変異体（例えば、異なるウイルス属、種、分離株、又は疑似種からの配列データに同定される変異体）であってもよく、又はインシリコで作成された本明細書に開示されるとおりの誘導体配列（例えば、野生型免疫原又はエピトープと比較して１つ又は複数のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はこれらの組み合わせを有する免疫原又はエピトープ）であってもよい。

【0100】

免疫原は、例えば、ウイルス表面タンパク質、ウイルス膜タンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、ウイルスヌクレオカプシドタンパク質、ウイルススパイクタンパク質、ウイルス侵入タンパク質、ウイルス膜融合タンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルス非構造タンパク質、ウイルス調節タンパク質、ウイルスアクセサリータンパク質、分泌ウイルスタンパク質、ウイルスポリメラーゼタンパク質、ウイルスＤＮＡポリメラーゼ、ウイルスＲＮＡポリメラーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルス糖タンパク質、ウイルスフソゲン、ウイルスらせんカプシドタンパク質、ウイルス正二十面体カプシドタンパク質、ウイルスマトリックスタンパク質、ウイルスレプリカーゼ、ウイルス転写因子、又はウイルス酵素などのウイルスに由来する。

【0101】

いくつかの実施形態では、免疫原は、これらのウイルスのうちの１つに由来する：
オルソミクソウイルス：有用な免疫原は、ヘマグルチニン、ノイラミニダーゼ、又はマトリックスＭ２タンパク質などのインフルエンザＡ、Ｂ、又はＣウイルスに由来し得る。免疫原がＡ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンである場合、この免疫原は、任意のサブタイプ（例えば、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、又はＨ１６）に由来し得る。

【0102】

パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科ウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ニューモウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス）、メタニューモウイルス、及びモルビリウイルス（例えば、麻疹ウイルス）、ヘニパウイルス（例えば、ニパウイルス（Ｎｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ））に由来するものが含まれる。

【0103】

ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）科：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、大痘瘡及び小痘瘡を含むがこれらに限定されない天然痘ウイルスなどのオルソポックスウイルスに由来するものが含まれる。

【0104】

ピコルナウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、エンテロウイルス、ライノウイルス、ヘパルナウイルス、カルディオウイルス、及びアフトウイルスなどのピコルナウイルスに由来するものが含まれる。一実施形態では、エンテロウイルスは、ポリオウイルス（例えば１型、２型及び／又は３型ポリオウイルス）である。別の実施形態では、エンテロウイルスは、ＥＶ７１エンテロウイルスである。別の実施形態では、エンテロウイルスは、コクサッキーＡ又はＢウイルスである。

【0105】

ブニヤウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、カリフォルニア脳炎ウイルスなどのオルソブニヤウイルス、リフトバレー熱ウイルスなどのフレボウイルス、又はクリミア・コンゴ出血熱ウイルスなどのナイロウイルスに由来するものが含まれる。

【0106】

ヘパルナウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）などのヘパルナウイルスに由来するものが含まれる。

【0107】

フィロウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、エボラウイルス（ザイール、コートジボワール、レストン、又はスーダンエボラウイルスを含む）又はマールブルグウイルスなどのフィロウイルスに由来するものが含まれる。

【0108】

トガウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ルビウイルス、アルファウイルス、又はアルテリウイルスなどのトガウイルスに由来するものが含まれる。これには風疹ウイルスが含まれる。

【0109】

フラビウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ダニ媒介性脳炎（ＴＢＥ）ウイルス、デング（１型、２型、３型又は４型）ウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、キャサヌール森林ウイルス、西ナイル脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎ウイルス、ポワッサン脳炎ウイルス、ジカウイルスが含まれる。

【0110】

ペスチウイルス：ウイルス性免疫原には、限定されるものではないが、ウシウイルス性下痢症（ＢＶＤＶ）、豚熱（ＣＳＦＶ）、又はボーダー病（ＢＤＶ）などのペスチウイルスに由来するものが含まれる。

【0111】

ヘパドナウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、Ｂ型肝炎ウイルスなどのヘパドナウイルスに由来するものが含まれる。Ｂ型肝炎ウイルス免疫原は、Ｂ型肝炎ウイルス表面免疫原（ＨＢｓＡｇ）であり得る。

【0112】

他の肝炎ウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、Ｃ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、又はＧ型肝炎ウイルスに由来するものが含まれる。

【0113】

ラブドウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、リッサウイルス（例えば、狂犬病ウイルス及びベシクロウイルス（ＶＳＶ）などのラブドウイルスに由来するものが含まれる。

【0114】

カリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ノーウォークウイルス（ノロウイルス）などのカリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）科、及びハワイウイルス及びスノーマウンテンウイルスなどのノーウォーク様ウイルスに由来するものが含まれる。

【0115】

レトロウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、腫瘍ウイルス、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶ－１又はＨＩＶ－２）又はスプマウイルスに由来するものが含まれる。

【0116】

レオウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、オルソレオウイルス、ロタウイルス、オルビウイルス、又はコルチウイルスに由来するものが含まれる。

【0117】

パルボウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、パルボウイルスＢ１９に由来するものが含まれる。

【0118】

ボカウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ボカウイルスに由来するもの含まれる。

【0119】

ヘルペスウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ヒトヘルペスウイルス由来のもの、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、ＨＳＶ１型及び２型）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ７）、及びヒトヘルペスウイルス８（ＨＨＶ８）が含まれる。

【0120】

パポバウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、パピローマウイルス及びポリオーマウイルスに由来するものが含まれる。（ヒト）パピローマウイルスは、血清型１、２、４、５、６、８、１１、１３、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４１、４２、４７、５１、５７、５８、６３、又は６５（例えば、血清型６、１１、１６及び／又は１８の１つ又は複数）であり得る。

【0121】

オルソハンタウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ハンタウイルスに由来するものが含まれる。

【0122】

アレナウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラッサウイルス、ルジョウイルス、マチュポウイルス、サビアウイルス、又はホワイトウォーターアロヨウイルスに由来するものが含まれる。

【0123】

アデノウイルス：ウイルス免疫原には、アデノウイルス血清型３６（Ａｄ－３６）に由来するものが含まれる。

【0124】

市中感染型呼吸器ウイルス（Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｖｉｒｕｓ）：ウイルス免疫原には、市中感染型呼吸器ウイルスに由来するものが含まれる。

【0125】

コロナウイルス：ウイルス免疫原には、限定されるものではないが、ＳＡＲＳコロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、ＭＥＲＳコロナウイルス、トリ伝染性気管支炎（ＩＢＶ）、マウス肝炎ウイルス（ＭＨＶ）、及び豚伝染性胃腸炎ウイルス（ＴＧＥＶ）に由来するものが含まれる。コロナウイルス免疫原は、スパイクポリペプチド又はスパイクタンパク質の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）であり得る。コロナウイルス免疫原はまた、エンベロープポリペプチド、膜ポリペプチド、又はヌクレオキャプシドポリペプチドであり得る。

【0126】

いくつかの実施形態では、免疫原は、サカナに感染するウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、免疫原は、サカナに感染するウイルスに対する免疫応答を誘発する。例えば、サカナに感染するウイルスは、伝染性サケ貧血ウイルス（ＩＳＡＶ）、サケ膵臓病ウイルス（ＳＰＤＶ）、伝染性膵臓壊死ウイルス（ＩＰＮＶ）、チャネルナマズウイルス（ＣＣＶ）、魚類リンホシスチス病ウイルス（ＦＬＤＶ）、伝染性造血壊死ウイルス（ＩＨＮＶ）、コイヘルペスウイルス、サケピコルナ様ウイルス（ｓａｌｍｏｎ ｐｉｃｏｒｎａ－ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ）（アトランティックサーモンのピコルナ様ウイルスとしても知られる）、陸封サケウイルス（ｌａｎｄｌｏｃｋｅｄ ｓａｌｍｏｎ ｖｉｒｕｓ）（ＬＳＶ）、アトランティックサーモンロタウイルス（ＡＳＲ）、マスストロベリー病ウイルス（ＴＳＤ）、ギンザケ腫瘍ウイルス（ＣＳＴＶ）、又はウイルス性出血性敗血症ウイルス（ＶＨＳＶ）から選択される。

【0127】

いくつかの実施形態では、免疫原は、対象の宿主細胞に由来する。例えば、ウイルスの侵入を遮断する抗体は、ウイルスが侵入因子として使用する宿主細胞の成分からの免疫原又はエピトープを使用することによって生成することができる。

【0128】

免疫原は、例えば、細菌表面タンパク質、細菌膜タンパク質、細菌エンベロープタンパク質、細菌内膜タンパク質、細菌外膜タンパク質、細菌ペリプラズムタンパク質、細菌侵入タンパク質、細菌膜融合タンパク質、細菌構造タンパク質、細菌非構造タンパク質、分泌細菌タンパク質、細菌ポリメラーゼタンパク質、細菌ＤＮＡポリメラーゼ、細菌ＲＮＡポリメラーゼ、細菌プロテアーゼ、細菌糖タンパク質、細菌転写因子、細菌酵素、又は細菌毒素などの細菌に由来する。

【0129】

いくつかの実施形態では、免疫原は、これらの細菌の１つから免疫応答を誘発する：ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群ストレプトコッカス（ｇｒｏｕｐ Ｂ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）又はＧＢＳとしても知られる））、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌（ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ＧＡＳ）とも呼ばれる）；黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）；表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）；梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）；野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）；リッケチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）属；ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）：免疫原には、限定されるものではないが、付着因子、オートトランスポーター、毒素、鉄獲得タンパク質、Ｈ因子結合タンパク質などの膜タンパク質が含まれ；肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；モラクセラ・カタラリース（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）；百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）：免疫原には、限定されるものではないが、百日咳毒素又はトキソイド（ＰＴ）、繊維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）、パータクチン、凝集原２及び３が含まれ；破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）：典型的な免疫原は破傷風トキソイドであり；コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）：典型的な免疫原はジフテリアトキソイドであり；ヘモフィルス・インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）；緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）；肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）；大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（免疫原には、限定されるものではないが、毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）、腸管凝集性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＡｇｇＥＣ）、びまん性付着性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＡＥＣ）、病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＰＥＣ）、腸管外病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥｘＰＥＣ）、及び／又は腸管出血性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＨＥＣ）に由来する免疫原が含まれる）。ＥｘＰＥＣ株には、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＵＰＥＣ）及び髄膜炎／葉血症関連大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＭＮＥＣ）が含まれる。また、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）；ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）又はボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍｓ）；レジオネラ・モフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）；コクシエラ・バーネティー（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉｄ）；ブルセラ（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）属、例えば、Ｂ．アボータス（Ｂ．ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｂ．カニス（Ｂ．ｃａｎｉｓ）、Ｂ．メリテンシス（Ｂ．ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ネオトマエ（Ｂ．ｎｅｏｔｏｍａｅ）、Ｂ．オビス（Ｂ．ｏｖｉｓ）、Ｂ．スイス（Ｂ．ｓｕｉｓ）、及びＢ．ピンニペディエ（Ｂ．ｐｉｎｎｉｐｅｄｉａｅ）；フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、例えば、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、Ｆ．フィロミラジア（Ｆ．ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）、及びＦ．ツラレンシス（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）；淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）；軟性下疽菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）；エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）又はエンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）；スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）；エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）；ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）；チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）；ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）；及びクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属が含まれる。

【0130】

免疫原は、例えば、真菌表面タンパク質、真菌膜タンパク質、真菌エンベロープタンパク質、真菌内膜タンパク質、真菌外膜タンパク質、真菌ペリプラズムタンパク質、真菌侵入タンパク質、真菌膜融合タンパク質、真菌構造タンパク質、真菌非構造タンパク質、分泌真菌タンパク質、真菌ポリメラーゼタンパク質、真菌ＤＮＡポリメラーゼ、真菌ＲＮＡポリメラーゼ、真菌プロテアーゼ、真菌糖タンパク質、真菌転写因子、真菌酵素、又は真菌毒素などの真菌に由来する。

【0131】

いくつかの実施形態では、真菌免疫原は、以下を含む皮膚糸状菌に由来する：エピデルモフィトン・フロクスム（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｕｓｕｍ）、ミクロスポルム・オードウイニ（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ａｕｄｏｕｉｎｉ）、ミクロスポルム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｃａｎｉｓ）、ミクロスポルム・ジストルツム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｄｉｓｔｏｒｔｕｍ）、ミクロスポルム・エクイヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｅｑｕｉｎｕｍ）、ミクロスポルム・ジプスム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｇｙｐｓｕｍ）、ミクロスポルム・ナヌム（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ ｎａｎｕｍ）、トリコフィトン・コンセントリクム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃｕｍ）、トリコフィトン・エクイナム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｅｑｕｉｎｕｍ）、トリコフィトン・ガリナエ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇａｌｌｉｎａｅ）、トリコフィトン・ジプセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｇｙｐｓｅｕｍ）、トリコフィトン・メグニニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｇｎｉｎｉ）、トリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、トリコフィトン・クインケアナム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｑｕｉｎｃｋｅａｎｕｍ）、トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）、トリコフィトン・シェーンレイニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｓｃｈｏｅｎｌｅｉｎｉ）、トリコフィトン・トンスランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）、トリコフィトン・ベルコーサム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）、Ｔ．ベルコーサムアルブム変種（Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ ｖａｒ．ａｌｂｕｍ）、ジスコイデス変種（ｖａｒ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｓ）、オクラセウム変種（ｖａｒ．ｏｃｈｒａｃｅｕｍ）、トリコフィトン・ビオラセウム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）、及び／又はトリコフィトン・ファビホルメ（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｆａｖｉｆｏｒｍｅ）；又はアスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・シドウイ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｙｄｏｗｉ）、アスペルギルス・フラバタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖａｔｕｓ）、アスペルギルス・グラウクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａｕｃｕｓ）、ブラストシゾミセス・カピタツス（Ｂｌａｓｔｏｓｃｈｉｚｏｍｙｃｅｓ ｃａｐｉｔａｔｕｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・エノラーゼ（Ｃａｎｄｉｄａ ｅｎｏｌａｓｅ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ステラトイデ（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔｏｉｄｅａ）、カンジダ・クセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｋｕｓｅｉ）、カンジダ・パラクセイ（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｋｗｓｅｉ）、カンジダ・ルシタニエ（Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ）、カンジダ・プソイドトロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｐｓｅｕｄｏｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉ）、クラドスポリウム・カリオニイ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｒｉｏｎｉｉ）、コクジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ジオトリカム・クレバタム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃｌａｖａｔｕｍ）、ヒストプラズマ・カプスラツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ミクロスポリジア（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、エンセファリトゾーン属（Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎ ｓｐｐ．）、セプタタ・インテスティナリス（Ｓｅｐｔａｔａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、及びエンテロシトゾーン・ビエヌーシ（Ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｏｚｏｏｎ ｂｉｅｎｅｕｓｉ）に由来し；あまり一般的ではないが、ブラチオーラ属（Ｂｒａｃｈｉｏｌａ ｓｐｐ）、ミクロスポリジウム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．）、ノセマ属（Ｎｏｓｅｍａ ｓｐｐ．）、プレイストフォラ属（Ｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、トラキプレイストフォラ属（Ｔｒａｃｈｉｐｌｅｉｓｔｏｐｈｏｒａ ｓｐｐ．）、ビッタホルマ属（Ｖｉｔｔａｆｏｒｍａ ｓｐｐ）、パラコシジオイデス・ブラジリエンシス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、ピシウム・インシディオスム（Ｐｙｔｈｉｕｍｎ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍ）、ピチロスポラム・オバーレ（Ｐｉｔｙｒｏｓｐｏｒｕｍ ｏｖａｌｅ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、サッカロミセス・ブラウディ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、セドスポリウム・アピオスペルム（Ｓｃｅｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ａｐｉｏｓｐｅｒｕｍ）、スポロトリックス・シェンキイ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、トリコスポロン・ベイゲリ（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、ペニシリウム・マルネッフェイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｍａｒｎｅｆｆｅｉ）、マラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｓｐｐ．）、フォンセケア属（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｓｐｐ．）、ワンギエラ属（Ｗａｎｇｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｐｐ．）、バシディオボラス属（Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、コニディオボラス属（Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｓｐｐ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ ｓｐｐ）、ユニケカビ属（Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐｐ）、クワレケカビ属（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ｓｐｐ）、クスダマカビ属（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ ｓｐｐ）、サクセネア属（Ｓａｋｓｅｎａｅａ ｓｐｐ．）、アルタナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｐｐ）、カーブラリア属（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｓｐｐ）、ヘルミントスポリウム属（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ）、モノリニア属（Ｍｏｎｏｌｉｎｉａ ｓｐｐ）、リゾクトニア属（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐｐ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ）、ピソミセス属（Ｐｉｔｈｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ）、及びクラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐｐ．）に由来する。

【0132】

免疫原は、例えば、真核寄生虫表面タンパク質、真核寄生虫膜タンパク質、真核寄生虫エンベロープタンパク質、真核寄生虫侵入タンパク質、真核寄生虫膜融合タンパク質、真核寄生虫構造タンパク質、真核寄生虫非構造タンパク質、分泌型真核生物寄生虫タンパク質、真核生物寄生虫ポリメラーゼタンパク質、真核生物寄生虫ＤＮＡポリメラーゼ、真核生物寄生虫ＲＮＡポリメラーゼ、真核生物寄生虫プロテアーゼ、真核生物寄生虫糖タンパク質、真核生物寄生虫転写因子、真核生物寄生虫酵素、又は真核生物寄生虫毒素に由来する。

【0133】

いくつかの実施形態では、免疫原は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）、又は卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）などのプラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）属からの寄生虫に対する免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、免疫原は、カリギダエ（Ｃａｌｉｇｉｄａｅ）科、特に、レペオフセイラス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ）属及びカリガス（Ｃａｌｉｇｕｓ）属の寄生虫（例えば、レペオフテイルス・サルモニス（Ｌｅｐｅｏｐｈｔｈｅｉｒｕｓ ｓａｌｍｏｎｉｓ）又はカリグス・ロガークレッセイ（Ｃａｌｉｇｕｓ ｒｏｇｅｒｃｒｅｓｓｅｙｉ）などのウオジラミなどの寄生虫）に対する免疫応答を誘発する。いくつかの実施形態では、免疫原は、寄生虫トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）に対する免疫応答を誘発する。

【0134】

いくつかの実施形態では、免疫原は、癌免疫原（ネオエピトープなど）である。例えば、免疫原は、急性白血病、星状細胞腫、胆管癌（ｂｉｌｉａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）（胆管癌（ｃｈｏｌａｎｇｉｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））、骨癌、乳癌、脳幹グリオーマ、細気管支肺胞細胞肺癌、副腎癌、肛門部癌、膀胱癌、内分泌系癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、胸膜／腹膜癌、唾液腺癌、小腸癌、甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵管癌、腎盂癌、膣癌、外陰癌、子宮頸癌、慢性白血病、結腸癌、大腸癌、皮膚黒色腫、上衣腫、類表皮腫、ユーイング肉腫、胃癌、膠芽腫、多形性膠芽腫、神経膠腫、血液悪性腫瘍、肝細胞（肝臓）癌、肝癌、ホジキン病、眼内黒色腫、カポジ肉腫、肺癌、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、多発性骨髄腫、筋肉癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、小児悪性腫瘍、下垂体腺腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、軟部肉腫、神経鞘腫（ｓｃｈｗａｎｏｍａ）、皮膚癌、脊髄軸腫瘍、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、精巣癌、子宮癌、又は上記の任意の癌の難治型を含む腫瘍及びそれらの転移、又はそれらの任意の組み合わせに関連した新抗原及び／又はネオエピトープである。

【0135】

いくつかの実施形態では、免疫原は、以下から選択される腫瘍抗原である：（ａ）ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＳＳＸ２、ＳＣＰ１などの癌精巣抗原、並びにＲＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、及びＭＡＧＥファミリーポリペプチド、例えば、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、及びＭＡＧＥ－１２（例えば、黒色腫、肺、頭頸部、ＮＳＣＬＣ、乳房、胃腸、及び膀胱の腫瘍に対処するために使用することができる）；（ｂ）変異抗原、例えば、ｐ５３（例えば、結腸直腸癌、肺癌、頭頸部癌などの様々な固形腫瘍に関連する）、ｐ２１／Ｒａｓ（例えば、黒色腫、膵臓癌、及び結腸直腸癌に関連する）、ＣＤＫ４（例えば、黒色腫に関連する）、ＭＵＭｌ（例えば、黒色腫に関連する）、カスパーゼ－８（例えば、頭頸部癌に関連する）、ＣＩＡ０２０５（例えば、膀胱癌に関連する）、ＨＬＡ－Ａ２－Ｒ１７０１、βカテニン（例えば、黒色腫に関連する）、ＴＣＲ（例えば、Ｔ細胞非ホジキンリンパ腫に関連する）、ＢＣＲ－ａｂｌ（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、トリオースリン酸イソメラーゼ、ＫＩＡ０２０５、ＣＤＣ－２７、及びＬＤＬＲ－ＦＵＴ；（ｃ）過剰発現抗原、例えば、ガレクチン４（例えば、大腸癌に関連する）、ガレクチン９（例えば、ホジキン病に関連する）、プロテイナーゼ３（例えば、慢性骨髄性白血病に関連する）、ＷＴ１（例えば、様々な白血病に関連する）、炭酸脱水酵素（例えば、腎癌に関連する）、アルドラーゼＡ（例えば、肺癌に関連する）、ＰＲＡＭＥ（例えば、黒色腫に関連する）、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ（例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、及び卵巣癌に関連する）、マンマグロビン、α－フェトプロテイン（例えば、肝癌に関連する）、ＫＳＡ（例えば、大腸癌に関連する）、ガストリン（例えば、膵臓癌及び胃癌に関連する）、テロメラーゼ触媒タンパク質、ＭＵＣ－１（例えば、乳癌及び卵巣癌に関連する）、Ｇ－２５０（例えば、腎細胞癌に関連する）、ｐ５３（例えば、乳癌、結腸癌に関連する）、及び癌胎児性抗原（例えば、乳癌、肺癌、及び大腸癌などの胃腸管の癌に関連する）；（ｄ）共有抗原、例えば、ＭＡＲＴ－ｌ／Ｍｅｌａｎ Ａ、ｇｐｌＯＯ、ＭＣ１Ｒ、メラノサイト刺激ホルモン受容体、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質－１／ＴＲＰ１、及びチロシナーゼ関連タンパク質－２／ＴＲＰ２（例えば、黒色腫に関連する）などの黒色腫－メラノサイト分化抗原；（ｅ）（例えば前立腺癌に関連する）ＰＡＰ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＰＳＨ－Ｐ１、ＰＳＭ－Ｐ１、ＰＳＭ－Ｐ２などの前立腺関連抗原；（ｆ）免疫グロブリンイディオタイプ（例えば、骨髄腫やＢ細胞性リンパ腫に関連する）；（ｇ）新抗原。特定の実施形態では、腫瘍免疫原には、限定されるものではないが、ｐｉ５、Ｈｏｍ／Ｍｅｌ－４０、Ｈ－Ｒａｓ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ、エプスタインバーウイルス抗原、ＥＢＮＡ、Ｅ６及びＥ７を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス抗原、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス抗原、ＴＳＰ－１８０、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｍｎ－２３ＨＩ、ＴＡＧ－７２－４、ＣＡ１９－９、ＣＡ７２－４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ｐｌ６、ＴＡＧＥ、ＰＳＣＡ、ＣＴ７、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、β－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５－３（ＣＡ２７．２９ＹＢＣＡＡ）、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼ＫＰ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇａ７３３（ＥｐＣＡＭ）、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０（Ｍａｃ－２結合タンパク質サイクロフィリンＣ関連タンパク質）、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、及びＴＰＳなどが含まれる。

【0136】

いくつかの実施形態では、免疫原は、以下に対する免疫応答を誘発する：花粉アレルゲン（樹木、ハーブ、雑草、及び草の花粉アレルゲン）；昆虫又はクモ類のアレルゲン（吸入物、唾液、及び毒アレルゲン、例えば、ダニアレルゲン、ゴキブリ、及び小昆虫アレルゲン、膜翅目（ｈｙｍｅｎｏｐｔｈｅｒａ）毒アレルゲン）；動物の毛及びフケアレルゲン（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ネズミ、マウスなどから）；及び食物アレルゲン（例えば、グリアジン）。樹木、草、及びハーブからの重要な花粉アレルゲンは、限定されるものではないが、カバノキ（Ｂｅｔｕｌａ）、ハンノキ（Ａｌｎｕｓ）、ハシバミ（Ｃｏｒｙｌｕｓ）、シデ（Ｃａｒｐｉｎｕｓ）及びオリーブ（Ｏｌｅａ）、スギ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ及びＪｕｎｉｐｅｒｕｓ）、スズカケノキ（Ｐｌａｔａｎｕｓ）を含む分類学上のブナ目（Ｆａｇａｌｅｓ）、モクセイ目（Ｏｌｅａｌｅｓ）、マツ目（Ｐｉｎａｌｅｓ）、及びスズカケノキ科（ｐｌａｔａｎａｃｅａｅ）、ロリウム属（Ｌｏｌｉｕｍ）、プレウム属（Ｐｈｌｅｕｍ）、ポア属（Ｐｏａ）、キノドン属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、ダクティリス属（Ｄａｃｔｙｌｉｓ）、ホルカス属（Ｈｏｌｃｕｓ）、ファラリス属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、セケーレ属（Ｓｅｃａｌｅ）、及びソルガム属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）の草を含むポアレス（Ｐｏａｌｅｓ）目、ブタクサ属（Ａｍｂｒｏｓｉａ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、及びパリエタ属（Ｐａｒｉｅｔａｒｉａ）のハーブを含むキク目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）及びイラクサ目（Ｕｒｔｉｃａｌｅｓ）に由来する。その他の重要な吸入アレルゲンは、ヒョウヒダニ属（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ）及びユーログリフス属（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ）のイエダニ由来のもの、貯蔵庫ダニ（例えば、レピドグリフィス属（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｙｓ）、グリシファガス属（Ｇｌｙｃｙｐｈａｇｕｓ）、及びチロファガス属（Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ））の由来のもの、ゴキブリ、小昆虫、及びノミ（例えば、チャバネゴキブリ属（Ｂｌａｔｅｌｌａ）、ワモンゴキブリ属（Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ）、ユスリカ属（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ）、及びイヌノミ属（Ｃｔｅｎｏｃｅｐｐｈａｌｉｄｅｓ））に由来のもの、ネコ、イヌ、及びウマなどの哺乳動物に由来のもの、ミツバチ（ミツバチ科）、スズメバチ科（Ｖｅｓｐｉｄｅａ）、及びアリ類（Ｆｏｒｍｉｃｏｉｄａｅ）を含む膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）の分類学上の目由来のものなどの刺したり噛んだりする昆虫に由来するものを含む毒アレルゲンが含まれる。

【0137】

いくつかの実施形態では、免疫原は、例えば、ヘビ（例えば、ほとんどの種のガラガラヘビ（例えば、ヒガシダイヤガラガラヘビ）、茶色のヘビの種（例えば、キングブラウンスネーク及びイースタンブラウンスネーク）、ラッセルバイパー、コブラ（例えば、インドコブラ、キングコブラ）、特定の種類のアマガサヘビ（例えば、一般的なアマガサヘビ）、マンバ（例えば、ブラックマンバ）、カーペットバイパー、ブームスラング、デュボアトゲオウミヘビ（ｄｕｂｏｉｓ ｓｅａ ｓｎａｋｅ）、タイパン種（例えば、沿岸タイパン（ｃｏａｓｔａｌ ｔａｉｐａｎ）及び内陸タイパン（ｉｎｌａｎｄ ｔａｉｐａｎ）ヘビ）、ランスヘッド（ｌａｎｃｅｈｅａｄ）種（例えば、フェルドランス及びテルシオペロ）、ブッシュマスター、カッパーヘッド、コットンマウス、サンゴヘビ、デスアダー、ベルチャーウミヘビ、タイガースネーク、オーストラリアブラックスネーク（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｂｌａｃｋ ｓｎａｋｅ））、クモ（例えば、ドクイトグモ、クロゴケグモ、クロドクシボグモ（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｗａｎｄｅｒｉｎｇ ｓｐｉｄｅｒ）、ジョウゴグモ（ｆｕｎｎｅｌ－ｗｅｂ ｓｐｉｄｅｒ）、ボタンスパイダー（ｂｕｔｔｏｎ ｓｐｉｄｅｒ）、オーストラリアセアカゴケグモ、カティポ（ｋａｔｉｐｏ）、ニセゴケグモ（ｆａｌｓｅ ｂｌａｃｋ ｗｉｄｏｗ）、チリドクイトグモ（Ｃｈｉｌｅａｎ ｒｅｃｌｕｓｅ ｓｐｉｄｅｒ）、マウスクモ（ｍｏｕｓｅ ｓｐｉｄｅｒ）、ジョウゴグモ（Ｍａｃｒｏｔｈｅｌｅ）種、シカリウス（Ｓｉｃａｒｉｕｓ）種、エクソフサルマ（Ｅｘｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ）種、タランチュラの特定種）、サソリ及び他のクモ綱（例えば、ファットテールスコーピオン（ｆａｔ－ｔａｉｌｅｄ ｓｃｏｒｐｉｏｎ）、デスストーカースコーピオン（ｄｅａｔｈｓｔａｌｋｅｒ ｓｃｏｒｐｉｏｎ）、インディアン赤サソリ（Ｉｎｄｉａｎ ｒｅｄ ｓｃｏｒｐｉｏｎ）、セントルロイデス（Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ）種、ブラジリアンイエロースコーピオン（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ ｙｅｌｌｏｗ ｓｃｏｒｐｉｏｎ）などのティテュオス（Ｔｉｔｙｕｓ）種）、昆虫（例えば、ミツバチ種、スズメバチ種、ヒアリなどの特定のアリ、鱗翅目の毛虫の一部の種、ムカデの特定の種、レミペド・キシバルバナス・トゥルメンシス（ｒｅｍｉｐｅｄｅ Ｘｉｂａｌｂａｎｕｓ ｔｕｌｕｍｅｎｓｉｓ）、サカナ（例えば、ナマズの特定の種（例えば、ゴンズイ（ｓｔｒｉｐｅｄ ｅｅｌ ｃａｔｆｉｓｈ）及びその他のゴンズイ科（ｅｅｌｔａｉｌ ｃａｔｆｉｓｈ））、アカエイの特定の種（例えば、青斑アカエイ）、ミノカサゴ、オニダルマオコゼ、オニカサゴ、フグ、アイゴ、ゴブリンフィッシュ、ツマジロオコゼ、ストライプブレニー（ｓｔｒｉｐｅｄ ｂｌｅｎｎｙ）、キビレミシマ（ｓｔａｒｇａｚｅｒ）、キマイラ（ｃｈｉｍａｅｒａ）、ハチミシマ（ｗｅｅｖｅｒ）、ツノザメ（ｄｏｇｆｉｓｈ ｓｈａｒｋ））、刺胞動物（例えば、クラゲの特定の種（例えば、イルカンジクラゲ及びハコクラゲ）、ヒドロ虫綱（例えば、カツオノエボシ（Ｐｏｒｔｕｇｕｅｓｅ Ｍａｎ ｏ’Ｗａｒ））、イソギンチャク、サンゴの特定の種）、トカゲ（例えば、アメリカドクトカゲ（ｇｉｌａ ｍｏｎｓｔｅｒ）、メキシコフトアゴヒゲトカゲ（Ｍｅｘｉｃａｎ ｂｅａｒｄｅｄ ｌｉｚａｒｄ）、ヴァラヌス（Ｖａｒａｎｕｓ）の特定の種（例えば、コモドドラゴン）、ペレンティーオオトカゲ（ｐｅｒｅｎｔｉｅ）、及びレースモニター（ｌａｃｅ ｍｏｎｉｔｏｒ））、哺乳動物（例えば、ミナミプラリナトガリネズミ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｓｈｏｒｔ－ｔａｉｌｅｄ ｓｈｒｅｗ）、カモノハシ、ヨーロッパモグラ、ミズトガリネズミ（Ｅｕｒａｓｉａｎ ｗａｔｅｒ ｓｈｒｅｗ）、ミナミミズトガリネズミ（Ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａｎ ｗａｔｅｒ ｓｈｒｅｗ）、プラナリトガリネズミ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｓｈｏｒｔ－ｔａｉｌｅｄ ｓｈｒｅｗ）、エリオットプラリトガリネズミ（Ｅｌｌｉｏｔ’ｓ ｓｈｏｒｔ－ｔａｉｌｅｄ ｓｈｒｅｗ）、特定の種のソレノドン（例えば、キューバソレノドン、ハイチソレノドン）、スローロリス）、軟体動物（例えば、イモガイの特定の種）、頭足類（例えば、タコの特定の種（例えば、ヒョウモンダコ（ｂｌｕｅ－ｒｉｎｇｅｄ ｏｃｔｏｐｕｓ）、イカ、及びコウイカ）、両生類（例えば、ヤドクガエル、ブルーノイシアタマガエル、グリーニングのカエル（Ｇｒｅｅｎｉｎｇ’ｓ ｆｒｏｇ）などのカエル、サンショウウオ（例えば、ファイアサラマンダー（Ｆｉｒｅ ｓａｌａｍａｎｄｅｒ）、イベリリアトゲイモリ（Ｉｂｅｒｉａｎ ｒｉｂｂｅｄ ｎｅｗｔ））からの毒液などの毒液中の毒素に由来する。

【0138】

いくつかの実施形態では、毒素は、植物又は菌類（例えば、キノコ）に由来する。

【0139】

いくつかの実施形態では、毒素免疫原は、シアノトキシン、ジノトキシン（ｄｉｎｏｔｏｘｉｎ）、ミオトキシン、細胞毒素（例えば、リシン、アピトキシン、マイコトキシン（例えば、アフラトキシン）、オクラトキシン、シトリニン、麦角アルカロイド、パツリン、フザリウム、フモニシン、トリコテセン、カルディオトキシン）、テトロドトキシン、バトラコトキシン、ボツリヌス毒素Ａ、破傷風毒素Ａ、ジフテリア毒素、ダイオキシン、ムスカリン、ブホトキシン、サリン、血液毒、フォトトキシン、壊死性毒、腎毒素、及び神経毒（例えば、カルシセプチン、コブロトキシン、カルシクルジン、ファシキュリン－Ｉ、カリオトキシン）などの毒素に由来する。

【0140】

任意の数の微生物又は癌由来の免疫原を、環状又は線状ポリリボヌクレオチドで使用することができる。場合によっては、免疫原は、上記に開示された１つの微生物に関連するか、又はそれによって発現される。いくつかの実施形態では、免疫原は、上記に開示された２つ以上の微生物に関連するか、又はそれらによって発現される。場合によっては、免疫原は、上記に開示された１つの癌に関連するか、又はそれによって発現される。いくつかの実施形態では、免疫原は、上記に開示された２つ以上の癌に関連するか、又はそれらによって発現される。いくつかの実施形態では、免疫原は、上記に開示された毒素に由来する。いくつかの実施形態では、免疫原は、上記に開示された２つ以上の毒素に由来する。

【0141】

２つ以上の微生物は、関連している、又は関連していない。場合によっては、２つ以上の微生物は、系統発生的に関連している。例えば、本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上のウイルス、ウイルスファミリーの２つ以上のメンバー、ウイルスクラスの２つ以上のメンバー、ウイルス系列の２つ以上のメンバー、ウイルス属の２つ以上のメンバー、ウイルス種の２つ以上のメンバー、２つ以上の細菌性病原体由来の免疫原を含む、又はこれらをコードする。いくつかの実施形態では、２つ以上の微生物は、系統発生的に関連していない。

【0142】

場合によっては、２つ以上の微生物は、表現型的に関連している。例えば、本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の呼吸器病原体、２つ以上の選択剤、重い疾患に関連する２つ以上の微生物、免疫不全の対象における有害転帰に関連する２つ以上の微生物、妊娠に関連する有害転帰に関連する２つ以上の微生物、出血熱に関連する２つ以上の微生物に由来する免疫原を含む、又はコードする。

【0143】

本開示の免疫原は、野生型配列を含み得る。免疫原を表す場合、「野生型」という用語は、天然であり、ゲノム（例えば、ウイルスゲノム）によってコードされる配列（例えば、核酸配列又はアミノ酸配列）を指す。ある種（例えば、微生物種）は、１つの野生型配列、又は２つ以上の野生型配列（例えば、参照微生物ゲノム中に存在する１つの標準野生型配列、及び突然変異から生じた存在するさらなる変異体野生型配列を有する）を有し得る。

【0144】

免疫原を表す場合、「誘導体」及び「から誘導される」という用語は、１つ以上の核酸又はアミノ酸が野生型配列と異なる、例えば、野生型配列と比べて１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、及び／又は置換を含有する配列（例えば、核酸配列又はアミノ酸配列）を指す。

【0145】

免疫原誘導体配列は、野生型配列、例えば、野生型核酸、タンパク質、免疫原、又はエピトープ配列に対して、少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の配列同一性を有する配列である。

【0146】

ある実施形態では、免疫原は、コードされるタンパク質の構造に影響を与える１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを含有する。ある実施形態では、免疫原は、コードされるタンパク質の機能に影響を与える１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを含有する。ある実施形態では、免疫原は、細胞によってコードされるタンパク質の発現又はプロセシングに影響を与える１つ以上のアミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せを含有する。

【0147】

いくつかの実施形態では、免疫原は、コードされた免疫原性核酸の構造に影響を与える１つ又は複数の核酸の挿入、欠失、置換、又はそれらの組み合わせを含む。

【0148】

アミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、翻訳後修飾のための部位を導入し得る（例えば、グリコシル化、ユビキチン化、リン酸化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、アミド化、水酸化、硫酸化、若しくは脂質化部位、又は切断のために標的化される配列を導入する）。ある実施形態では、アミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、翻訳後修飾のための部位を除去する（例えば、グリコシル化、ユビキチン化、リン酸化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、アミド化、水酸化、硫酸化、又は脂質化部位、又は切断のために標的化される配列を除去する）。ある実施形態では、アミノ酸挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、翻訳後修飾のための部位を修飾する（例えば、グリコシル化、ユビキチン化、リン酸化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、アミド化、水酸化、硫酸化、若しくは脂質化部位、又は切断の効率又は特性を改変するように部位を修飾する）。

【0149】

アミノ酸置換は、保存的又は非保存的置換であり得る。保存的アミノ酸置換は、類似の生化学的特性（例えば、電荷、サイズ、及び／又は疎水性）の別のアミノ酸の代わりの１つのアミノ酸の置換であり得る。非保存的アミノ酸置換は、異なる生化学的特性（例えば、電荷、サイズ、及び／又は疎水性）を有する別のアミノ酸の代わりの１つのアミノ酸の置換であり得る。保存的アミノ酸変化は、例えば、ポリペプチドの二次又は三次構造に対して最小の影響を与える置換であり得る。保存的アミノ酸変化は、１つの親水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。親水性アミノ酸は、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）及びＡｒｇ（Ｒ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの疎水性アミノ酸から別の親水性アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。疎水性アミノ酸は、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、及びＰｒｏ（Ｐ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの酸性アミノ酸から別の酸性アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。酸性アミノ酸は、Ｇｌｕ（Ｅ）及びＡｓｐ（Ｄ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの塩基性アミノ酸から別の塩基性アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。塩基性アミノ酸は、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）及びＬｙｓ（Ｋ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの極性アミノ酸から別の極性アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。極性アミノ酸は、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｓｅｒ（Ｓ）及びＴｈｒ（Ｔ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの非極性アミノ酸から別の非極性アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。非極性アミノ酸は、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｇｌｙ（Ｇ）及びＡｌａ（Ａ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの芳香族アミノ酸から別の芳香族アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。芳香族アミノ酸は、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）及びＴｒｐ（Ｗ）を含み得る。保存的アミノ酸変化は、１つの脂肪族アミノ酸から別の脂肪族アミノ酸へのアミノ酸変化であり得る。脂肪族アミノ酸は、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）及びＩｌｅ（Ｉ）を含み得る。ある実施形態では、保存的アミノ酸置換は、以下のグループ：グループＩ：ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；グループＩＩ：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；グループＩＩＩ：ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；グループＩＶ：ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；グループＶ：ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ；及びグループＶＩ：ａｓｐ、ｇｌｕのうちの１つの中の、１つのアミノ酸から別のアミノ酸へのアミノ酸変化である。

【0150】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、本明細書に開示される配列（例えば、野生型配列）と比べて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００個のアミノ酸欠失を含む。

【0151】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、本明細書に開示される配列（例えば、野生型配列）と比べて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０個のアミノ酸置換を含む。

【0152】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、本明細書に開示される配列（例えば、野生型配列）と比べて、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、又は５０以下のアミノ酸置換を含む。

【0153】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、本明細書に開示される配列（例えば、野生型配列）と比べて、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～３０、１～４０、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、２～１５、２～２０、２～３０、２～４０、３～３、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～１５、３～２０、３～３０、３～４０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１５、５～２０、５～３０、５～４０、１０～１５、１５～２０、又は２０～２５個のアミノ酸置換を含む。

【0154】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、本明細書に開示される配列（例えば、野生型配列）と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸置換を含む。

【0155】

１つ以上のアミノ酸置換は、アミノ酸配列内の、又はそれらの組合せＮ末端、Ｃ末端にあり得る。アミノ酸置換は、連続、非連続、又はそれらの組合せであり得る。

【0156】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、本明細書に開示される配列（例えば、野生型配列）と比べて、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、５０以下、６０以下、７０以下、８０以下、９０以下、１００以下、１２０以下、１４０以下、１６０以下、１８０以下、又は２００以下のアミノ酸欠失を含む。

【0157】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、野生型配列と比べて、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～３０、１～４０、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、２～１５、２～２０、２～３０、２～４０、３～３、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～１５、３～２０、３～３０、３～４０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１５、５～２０、５～３０、５～４０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２０～３０、３０～５０、５０～１００、又は１００～２００個のアミノ酸欠失を含む。

【0158】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、野生型配列と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸欠失を含む。

【0159】

１つ以上のアミノ酸欠失は、アミノ酸配列内のＮ末端、Ｃ末端、又はそれらの組合せにあり得る。アミノ酸欠失は、連続、非連続、又はそれらの組合せであり得る。

【0160】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、野生型配列と比べて、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、又は少なくとも５０個のアミノ酸挿入を含む。

【0161】

ある実施形態では、本開示の免疫原誘導体又はエピトープ誘導体は、野生型配列と比べて、１以下、２以下、３以下、４以下、５以下、６以下、７以下、８以下、９以下、１０以下、１１以下、１２以下、１３以下、１４以下、１５以下、１６以下、１７以下、１８以下、１９以下、２０以下、２５以下、３０以下、３５以下、４０以下、４５以下、又は５０以下のアミノ酸挿入を含む。

【0162】

ある実施形態では、本開示の抗原誘導体又はエピトープ誘導体は、野生型配列と比べて、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、１～１５、１～２０、１～３０、１～４０、２～３、２～４、２～５、２～６、２～７、２～８、２～９、２～１０、２～１５、２～２０、２～３０、２～４０、３～３、３～４、３～５、３～６、３～７、３～８、３～９、３～１０、３～１５、３～２０、３～３０、３～４０、５～６、５～７、５～８、５～９、５～１０、５～１５、５～２０、５～３０、５～４０、１０～１５、１５～２０、又は２０～２５個のアミノ酸挿入を含む。

【0163】

ある実施形態では、本開示の抗原誘導体又はエピトープ誘導体は、野生型配列と比べて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸挿入を含む。

【0164】

１つ以上のアミノ酸挿入は、アミノ酸配列内のＮ末端、Ｃ末端、又はそれらの組合せにあり得る。アミノ酸挿入は、連続、非連続、又はそれらの組合せであり得る。

【0165】

いくつかの実施形態では、免疫原は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドによって発現される。いくつかの実施形態では、免疫原は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル増幅の産物である。

【0166】

免疫原は、相当な量で産生させることができる。したがって、免疫原は、産生させることができる任意のタンパク質性分子であり得る。免疫原は、細胞から分泌され得るポリペプチド、又は細胞の細胞質、核、若しくは膜分画に局在し得るポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、本明細書に開示される２つ以上の免疫原を含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、エピトープを含む。いくつかの実施形態では、本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、本明細書に開示される２つ以上のエピトープを含む融合タンパク質、例えば、本開示の１つ又は複数の微生物からの複数の予測エピトープを含む人工ペプチド配列を含む。

【0167】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドから発現され得る免疫原は、膜タンパク質であり、例えば、膜タンパク質として一般的に見出されるポリペプチド配列、又は膜タンパク質となるように改変されたポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される環状又は線状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的な免疫原には、細胞内免疫原又は細胞質免疫原が含まれる。

【0168】

いくつかの実施形態では、免疫原は、約４０，０００未満のアミノ酸長、約３５，０００未満のアミノ酸長、約３０，０００未満のアミノ酸長、約２５，０００未満のアミノ酸長、約２０，０００未満のアミノ酸長、約１５，０００未満のアミノ酸長、約１０，０００未満のアミノ酸長、約９，０００未満のアミノ酸長、約８，０００未満のアミノ酸長、約７，０００未満のアミノ酸長、約６，０００未満のアミノ酸長、約５，０００未満のアミノ酸長、約４，０００未満のアミノ酸長、約３，０００未満のアミノ酸長、約２，５００未満のアミノ酸長、約２，０００未満のアミノ酸長、約１，５００未満のアミノ酸長、約１，０００未満のアミノ酸長、約９００未満のアミノ酸長、約８００未満のアミノ酸長、約７００未満のアミノ酸長、約６００未満のアミノ酸長、約５００未満のアミノ酸長、約４００未満のアミノ酸長、約３００未満のアミノ酸長、約２５０未満のアミノ酸長、約２００未満のアミノ酸長、約１５０未満のアミノ酸長、約１４０未満のアミノ酸長、約１３０未満のアミノ酸長、約１２０未満のアミノ酸長、約１１０未満のアミノ酸長、約１００未満のアミノ酸長、約９０未満のアミノ酸長、約８０未満のアミノ酸長、約７０未満のアミノ酸長、約６０未満のアミノ酸長、約５０未満のアミノ酸長、約４０未満のアミノ酸長、約３０未満のアミノ酸長、約２５未満のアミノ酸長、約２０未満のアミノ酸長、約１５未満のアミノ酸長、約１０未満のアミノ酸長、約５未満のアミノ酸長を有し、それらの間の任意のアミノ酸長又はそれ以下が有用であり得る。

【0169】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数の免疫原配列を含み、インビボで対象の細胞において持続的に発現するように構成されている。いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、後の時点における細胞内での１つ又は複数の発現配列の発現が前の時点と同等又はそれよりも高くなるように構成される。そのような実施形態では、１つ又は複数の免疫原配列の発現を、比較的安定したレベルで維持するか、又は経時的に増加させることができる。免疫原配列の発現は、長期間にわたって比較的安定させることができる。免疫原配列の発現は、一過性に、又は限られた時間だけ、例えば、多くとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、又は１０日間、比較的安定させることができる。

【0170】

いくつかの実施形態では、環状又は線状ポリリボヌクレオチドは、（例えば一過性又は長期的に）対象において１つ又は複数の免疫原を発現する。特定の実施形態では、免疫原の発現は、少なくとも約１時間から約３０日間、又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間、又はそれよりも長く、それらの間の任意の時間持続する。特定の実施形態では、免疫原の発現は、約３０分以内から約７日間以内、又は約１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１１時間以内、１２時間以内、１３時間以内、１４時間以内、１５時間以内、１６時間以内、１７時間以内、１８時間以内、１９時間以内、２０時間以内、２１時間以内、２２時間以内、２４時間以内、３６時間以内、４８時間以内、６０時間以内、７２時間以内、４日間以内、５日間以内、６日間以内、７日間以内、８日間以内、９日間以内、１０日間以内、１１日間以内、１２日間以内、１３日間以内、１４日間以内、１５日間以内、１６日間以内、１７日間以内、１８日間以内、１９日間以内、２０日間以内、２１日間以内、２２日間以内、２３日間以内、２４日間以内、２５日間以内、２６日間以内、２７日間以内、２８日間以内、２９日間以内、３０日間以内、６０日間以内、又はそれらの間の任意の時間持続する。

【0171】

免疫原の発現は、少なくとも、本明細書に提供される環状又は線状ポリリボヌクレオチドの領域を翻訳することを含む。例えば、環状又は線状ポリリボヌクレオチドを、本開示の１つ又は複数の免疫原を含むポリペプチドを生成するように対象において翻訳し、それにより対象における適応免疫応答（例えば、抗体応答及び／又はＴ細胞応答）の産生を刺激することができる。いくつかの実施形態では、本開示の環状又は線状ポリリボヌクレオチドを、ヒト又は動物対象における１つ又は複数の免疫原を生成するように翻訳し、それによりヒト又は動物対象における適応免疫応答（例えば、抗体応答及び／又はＴ細胞応答）の産生を刺激する。

【0172】

いくつかの実施形態では、免疫原発現のための方法は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドの全長の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のポリペプチドへの翻訳を含む。いくつかの実施形態では、免疫原発現のための方法は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドの、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも７００アミノ酸、少なくとも８００アミノ酸、少なくとも９００アミノ酸、又は少なくとも１０００アミノ酸のポリペプチドへの翻訳を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質発現のための方法は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドの、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約５０アミノ酸、約１００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約２００アミノ酸、約２５０アミノ酸、約３００アミノ酸、約４００アミノ酸、約５００アミノ酸、約６００アミノ酸、約７００アミノ酸、約８００アミノ酸、約９００アミノ酸、又は約１０００アミノ酸のポリペプチドへの翻訳を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、環状又は線状ポリリボヌクレオチドの、本明細書に提供されるような連続ポリペプチド、本明細書に提供されるような別々のポリペプチド、又は双方への翻訳を含む。

【0173】

いくつかの実施形態では、免疫原発現のための方法は、翻訳産物の修飾、フォールディング、又は他の翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態では、免疫原発現のための方法は、インビボでの、（例えば、細胞機構を介する）翻訳後修飾を含む。

【0174】

多量体化
特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、多量体化ドメインをコードし得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原である第１のポリペプチドと、多量体化ドメインである第２のポリペプチドとをコードし得る。例えば、多量体化ドメインは、免疫原と同じオープンリーディングフレームにコードされ、免疫原との融合タンパク質として発現してもよい。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは２つ以上の免疫原をコードしてもよく、任意選択で、各免疫原が多量体化ドメインに融合していてもよい。多量体化ドメインは、免疫原複合体（例えば、複数の免疫原を含む複合体）の形成を促進し得る。

【0175】

コードされる免疫原の多量体化は、免疫応答の誘導に有益であり得る。免疫原が１つ以上の多量体化エレメント（例えば、二量体化エレメント、三量体化エレメント、四量体化エレメント、及びオリゴマー化エレメント）に融合すると、多量体免疫原複合体の形成（例えば、免疫された対象における発現後の多量体免疫原複合体の形成）につながり得る。一部の実施形態において、多量体免疫原複合体が形成されると、免疫原の免疫原性が増加する。例えば、多量体免疫原複合体が形成されると、複数の潜在的な免疫原が病原体のエンベロープに位置することがよく見られる（例えば、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）免疫原）外因性病原体（例えば、ウイルス）の感染が模倣されることにより、免疫原の免疫原性が増加し得る。一部の実施形態において、多量体化複合体は、少なくとも２、３、４、６、８、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、又は１００個の免疫原を含む。一部の実施形態において、免疫原複合体は、２～１０、２～５０、２～１００、５～１０、５～１５、５～２０、５～５０、５～１００、１０～２０、１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～６０、１０～１００、２０～５０又は２０～１００個の免疫原を含む。一部の実施形態において、免疫原複合体は、免疫原を６コピー含む（例えば、この環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原－フォルドン－免疫原融合タンパク質をコードする）。一部の実施形態において、免疫原複合体は、免疫原を２４コピー含む（例えば、この環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原－フェリチン融合タンパク質をコードする）。一部の実施形態において、免疫原複合体は、免疫原を６０コピー含む（例えば、この環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原－ＡａＬＳ融合タンパク質をコードするか、又は免疫原－β－アニュラスペプチドをコードする）。

【0176】

本開示の文脈で目的のポリペプチド免疫原と組み合わせて使用されるとき、かかる多量体化エレメントは、目的のポリペプチドのＮ端側又はＣ端側に置かれ得る。核酸レベルでは、かかる多量体化エレメントのコード配列は、典型的には同じリーディングフレームにおいて、目的のポリペプチド又はタンパク質のコード配列の５’側又は３’側に置かれる。

【0177】

多量体化ドメインは、１０～５００アミノ酸残基（例えば、１０～４５０、１０～４００、１０～３５０、１０～３００、１０～２５０、１０～２００、１０～１５０、１０～１００、１０～５０、５０～５００、１００～５００、１５０～５００、２００～５００、２５０～５００、３００～５００、３５０～５００、４００～５００、及び４５０～５００残基）を有し得る。一部の実施形態において、多量体化ドメインは、２０～２５００アミノ酸残基（例えば、２０～２５０、２０～２２５、２０～２００、２０～１７５、２０～１５０、２０～１５０、２０～１２５、２０～１００、２０～７５、２０～５０、５０～２５０、７５～２５０、１００～２５０、１２５～２５０、１５０～２５０、１７５～２５０、２００～２５０、及び２２５～２５０残基）を含み得る。

【0178】

一部の実施形態において、多量体化ドメインに融合した免疫原は、その免疫原と比べて免疫原性が（例えば、ヒト対象において）少なくとも２倍、５倍、又は１０倍高い。一部の実施形態において、多量体化ドメインに融合した免疫原は、多量体化ドメインに融合していない免疫原と比べて免疫原性が（例えば、ヒト対象において）少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、３００％、４００％、又は５００％高い。

【0179】

詳細な多量体化エレメントは、オリゴマー化エレメント、四量体化エレメント、三量体化エレメント又は二量体化エレメントである。二量体化エレメントは、例えば、熱ショックタンパク質、免疫グロブリンＦｃドメイン及びロイシンジッパー（塩基性領域ロイシンジッパー転写因子クラスの二量体化ドメイン）の二量体化エレメント／ドメインから選択され得る。三量体化及び四量体化エレメントは、例えば、エンジニアリングされたロイシンジッパー（平行三量体状態をとるエンジニアリングされたαヘリックスコイルドコイルペプチド）、腸内細菌ファージＴ４からのフィブリチンフォルドンドメイン、ＧＣＮ４ｐｌｌ、ＣＣＮ４－ｐＬＩ、及びｐ５３から選択され得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｔ４フォルドンドメインを含む。詳細な実施形態において、Ｔ４フォルドンドメインは、ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号２９）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、Ｔ４フォルドンは、配列番号２９のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、多量体化ドメインは、β－アニュラスペプチドである（Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ａｎｇｅｗ．ＣＨＥＭ．ＩＮＴ．ＥＤ．，４９：９６６２－９６６５を参照のこと）。一部の実施形態において、β－アニュラスペプチドは、Ｃ末端セリン残基が任意選択で存在する又は存在しないＩＮＨＶＧＧＴＧＧＡＩＭＡＰＶＡＶＴＲＱＬＶＧＳ（配列番号３０）のアミノ酸配列を有するか、又は配列番号３０と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＡａＬＳペプチドを含む。詳細な実施形態において、ＡａＬＳペプチドは、ＴＤＩＬＧＫＹＶＩＮＹＬＮＫＬＫＫＫＥＤＩＦＫＥＦＬＫＷ（配列番号３１）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する。一部の実施形態において、ＡａＬＳペプチドは、配列番号３１のアミノ酸配列を有する。

【0180】

オリゴマー化エレメントは、例えば、フェリチン、サーファクタントＤ、パラミクソウイルスのリンタンパク質のオリゴマー化ドメイン、補体阻害薬Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）オリゴマー化ドメイン、ウイルス感染因子（Ｖｉｆ）オリゴマー化ドメイン、ステライルαモチーフ（ＳＡＭ）ドメイン、及びフォン・ヴィレブランド因子タイプＤドメインから選択されてもよい。

【0181】

フェリチンはオリゴマーを形成し、あらゆる動物、細菌、及び植物に見られる高度に保存されているタンパク質である。フェリチンは、２４個の同一のサブユニットで自然発生的にナノ粒子を形成するタンパク質である。フェリチン－免疫原融合構築物は、免疫応答の亢進をもたらし得る免疫原のオリゴマー凝集体又は「クラスター」を形成する可能性がある。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、フェリチンドメインを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、

【化1】

のアミノ酸配列を有するフェリチンドメインを含む。

【0182】

サーファクタントＤタンパク質（ＳＰＤ）は、自然発生的に自己集合してオリゴマーを形成する親水性糖タンパク質である。ＳＰＤ－免疫原融合構築物は、免疫応答の亢進をもたらし得る免疫原のオリゴマー凝集体又は「クラスター」を形成し得る。

【0183】

パラミクソウイルス（マイナス鎖ＲＮＡウイルス）のリンタンパク質は、ウイルスポリメラーゼの転写トランス活性化因子として機能する。リンタンパク質のオリゴマー化は、ウイルスゲノム複製にとって決定的に重要である。リンタンパク質－免疫原融合構築物は、免疫応答の亢進をもたらし得る免疫原のオリゴマー凝集体又は「クラスター」を形成し得る。

【0184】

補体阻害薬Ｃ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）もまた、オリゴマー免疫原凝集体を生じさせる融合パートナーとして使用し得る。Ｃ４ｂｐのＣ末端ドメイン（ヒトでは５７アミノ酸残基及びマウスでは５４アミノ酸残基）は、それに融合したＣ４ｂｐ又は他のポリペプチドのオリゴマー化に必要且つ十分である。Ｃ４ｂｐ－免疫原融合構築物は、免疫応答の亢進をもたらし得る免疫原のオリゴマー凝集体又は「クラスター」を形成し得る。ウイルス感染因子（Ｖｉｆ）多量体化ドメインは、インビトロ及びインビボの両方でオリゴマーを形成することが示されている。Ｖｉｆのオリゴマー化には、Ｃ末端ドメインの残基１５１～１６４と１６１ ＰＰＬＰ １６４モチーフ（ヒトＨＩＶ－１では：ＴＰＫＫＩＫＰＰＬＰ（配列番号３３））との間の配列マッピングが関わる。Ｖｉｆ－免疫原融合構築物は、免疫応答の亢進をもたらし得る免疫原のオリゴマー凝集体又は「クラスター」を形成し得る。

【0185】

ステライルαモチーフ（ＳＡＭ）ドメインは、多くの生物学的過程に関わる多種多様なタンパク質に存在するタンパク質相互作用モジュールである。およそ７０残基にわたって広がるＳＡＭドメインは、多様な真核生物に見られる。ＳＡＭドメインは、ホモ及びヘテロオリゴマー化して、複数の自己会合オリゴマー構造体を形成することが示されている。ＳＡＭ－免疫原融合構築物は、免疫応答の亢進をもたらし得る免疫原のオリゴマー凝集体又は「クラスター」を形成し得る。フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）は、幾つかのタイプＤドメインを含む：Ｄ１及びＤ２はＮ末端プロペプチド内に存在する一方、残りのＤドメインはオリゴマー化に必要である。このドメインは、様々な血漿タンパク質：補体因子Ｂ、Ｃ２、Ｃ３及びＣＲ４；インテグリン（ｌ－ドメイン）；ＶＩ、ＶＩＩ、ＸＩＩ及びＸＩＶ型コラーゲン；及び他の細胞外タンパク質に見られる。ｖＷＦ－免疫原融合構築物は、免疫応答の亢進をもたらし得る免疫原のオリゴマー凝集体又は「クラスター」を形成し得る。

【0186】

一部の実施形態において、多量体化ドメインは、ルマジンシンターゼドメインである。ルマジンシンターゼは、６０コピーのルマジンシンターゼドメインを含む複合体となるように集合することができ、ここでは各ルマジンシンターゼドメインが１つ以上の免疫原に融合し得る。一部の実施形態において、ルマジンシンターゼドメインは、配列番号３４～４４及び１１５のいずれかのアミノ酸配列又は配列番号３４～４４及び１１５のいずれか１つと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
配列番号３４

【化2】

配列番号３５

【化3】

配列番号３６

【化4】

配列番号３７

【化5】

配列番号１１５

【化6】

【0187】

ルマジンシンターゼドメインに１つ以上のシステイン置換を提供して非天然ジスルフィド結合を導入すると、自己集合したサブユニットで形成されるルマジンシンターゼ複合体が安定化する。一部の実施形態において、非天然ジスルフィド結合は、Ｌ１２１Ｃ－Ｋ１３１Ｃ、Ｌ１２１ＣＧ－Ｋ１３１Ｃ、Ｌ１２１ＧＣ－Ｋ１３１Ｃ、Ｋ７Ｃ－Ｒ４０Ｃ、Ｉ３Ｃ－Ｌ５０Ｃ、Ｉ８２Ｃ－Ｋ１３１ＣＧ、Ｅ５Ｃ－Ｒ５２Ｃ、又はＥ９５Ｃ－Ａ１０１Ｃ置換、又はこれらの組み合わせ（Ｉ３Ｃ－Ｌ５０Ｃ及びＩ８２Ｃ－Ｋ１３１ＣＧ；Ｅ５Ｃ－Ｒ５２Ｃ及びＩ８２Ｃ－Ｋ１３１ＣＧ；又はＥ９５Ｃ－Ａ１０１Ｃ及びＩ８２Ｃ－Ｋ１３１ＣＧなど）によって導入される。残基の番号付けは、配列番号３４として示されるルマジンシンターゼサブユニットを基準としている。非限定的な例としては、以下が挙げられる：
配列番号３８（Ｌ１２１Ｃ－Ｋ１３１Ｃ）

【化7】

配列番号３９（Ｌ１２１ＣＧ－Ｋ１３１Ｃ）

【化8】

配列番号４０（Ｌ１２１ＧＣ－Ｋ１３１Ｃ）

【化9】

配列番号４１（Ｋ７Ｃ－Ｒ４０Ｃ）

【化10】

配列番号４２（Ｉ３Ｃ－Ｌ５０Ｃ、Ｉ８２Ｃ－Ｋ１３１ＣＧ）

【化11】

配列番号４３（Ｅ５Ｃ－Ｒ５２Ｃ、Ｉ８２Ｃ－Ｋ１３１ＣＧ）

【化12】

配列番号４４（Ｅ９５Ｃ－Ａ１０１Ｃ、Ｉ８２Ｃ－Ｋ１３１ＣＧ）

【化13】

【0188】

ポリペプチドの様々な多量体化方法については、国際公開第２０２０／０６１５６４号パンフレットの２５頁１行目～２６頁２０行目（これは本明細書において参照により援用される）に記載されている。

【0189】

一部の実施形態において、多量体化ドメインは、リボフラビンシンターゼドメインである。例えば、リボフラビンシンターゼドメインは、ＴＤＩＬＧＫＹＶＩＮＹＬＮＫＬＫＫＫＥＤＩＦＫＥＦＬＫＷ（配列番号１１６）と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。一部の実施形態において、リボフラビンシンターゼドメインは、配列番号１１６のアミノ酸配列を有し得る。

【0190】

一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の多量体化ドメインを含み得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の多量体化ドメインを含み得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２個の多量体化ドメインを含む。２個以上の多量体化ドメインは、互いに隣接していてもよい。或いは、２個以上の多量体化ドメインは、１つ以上の他のエレメントによって分離されていてもよい。例えば、２個の多量体化ドメインは、免疫原によって分離されていてもよい。詳細な実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、フェリチンドメインとＴ４フォルドンドメインとを含み得る。このフェリチン及びＴ４フォルドンドメインは、（例えば、Ｇｌｙ－Ｓｅｒリンカーによって）連結されていてもよい。一部の実施形態において、Ｔ４フォルドンドメインに連結されたフェリチンドメインは、以下のアミノ酸配列を有する：

【化14】

【0191】

好適な多量体化ドメインは、例えば、国際公開第２０１７／０８１０８２号パンフレットの配列番号１１１６～１１６７に係るアミノ酸配列、又はこれらの配列の断片若しくは変異体のリストから選択されてもよい。

【0192】

一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の表１又は表２に記載される、そこにある並び順で、とおりのエレメントを含むオープンリーディングフレーム（例えば、ＩＲＥＳに作動可能に連結されたオープンリーディングフレーム）をコードする。表１又は表２に記載される実施形態について、各免疫原は、任意選択で分泌シグナル配列を含む。表１又は表２の実施形態が複数の免疫原を含む場合、それらの免疫原は同じであっても、又は異なってもよい（例えば、本明細書に記載される免疫原のいずれかから選択される）。表１の実施形態が複数の多量体化ドメインを含む場合、それらの多量体化ドメインは同じであっても、又は異なってもよい（例えば、本明細書に記載される多量体化ドメインのいずれかから選択される）。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは複数のオープンリーディングフレームを含み、ここで各オープンリーディングフレームは表１又は表２に記載される。

【0193】

【表1】

【0194】

【表2】

【0195】

配列内リボソーム進入部位
一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントを含む。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、１つ以上の発現配列に作動可能に連結されている（例えば、各ＩＲＥＳが１つ以上の発現配列に作動可能に連結されており、ここでは各発現配列が、任意選択で、多量体化ドメインを含む免疫原などの免疫原をコードする）。実施形態において、ＩＲＥＳは、異種プロモーターとコード配列（例えば、多量体化ドメインを含む免疫原をコードするコード配列）の５’末端との間に位置する。

【0196】

ポリリボヌクレオチドに含めるのに好適なＩＲＥＳエレメントとしては、真核生物リボソームとの会合能を有するＲＮＡ配列が挙げられる。一部の実施形態において、ＩＲＥＳエレメントは、少なくとも約５ｎｔ、少なくとも約８ｎｔ、少なくとも約９ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約２５０ｎｔ、少なくとも約３５０ｎｔ、又は少なくとも約５００ｎｔである。

【0197】

一部の実施形態において、ＩＲＥＳエレメントは、限定はされないが、ウイルス、哺乳類、及びショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を含めた生物のＤＮＡに由来する。かかるウイルスＤＮＡは、限定はされないが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ｃＤＮＡ及びポリオウイルスｃＤＮＡを含むピコルナウイルス（ｐｉｃｏｍａｖｉｒｕｓ）相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に由来し得る。一実施形態において、ＩＲＥＳエレメントの由来となるショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＤＮＡとしては、限定はされないが、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のアンテナペディア遺伝子が挙げられる。

【0198】

一部の実施形態において、ＩＲＥＳ配列は、タウラ症候群ウイルス、サシガメウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス、シミアンウイルス４０、ヒアリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ）ウイルス１、ムギクビレアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ）ウイルス、細網内皮症ウイルス、ヒト（ｆｕｍａｎ）ポリオウイルス１、チャバネアオカメムシ（Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｌ）腸内ウイルス、カシミール蜂ウイルス、ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ－２）、ホマロディスカ・コアギュラテ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）ウイルス－１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ホマロディスカ・コアギュラテ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）ウイルス－１、ヒメトビＰウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、ＧＢ型肝炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、ウマ鼻炎ウイルス、ウスジロエダシャク（Ｅｃｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕａ）ピコルナ様ウイルス、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ショウジョウバエＣウイルス、アブラナ科植物トバモウイルス、コオロギ麻痺ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス１型、ブラッククイーンセルウイルス、アブラムシ致死性麻痺ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス（ＡＥＶ）、急性蜂麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑斑ウイルス、ブタコレラウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡ１、ヒトＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、ショウジョウバエアンテナペディア、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ－ｌ、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ－ＩＡＰｌ、ヒトｃ－ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１α、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐｌ、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ－ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ－ｌ、マウスＲｂｍ３、ショウジョウバエｒｅａｐｅｒ、イヌＳｃａｍｐｅｒ、ショウジョウバエＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ－Ａ、ヒトＸＩＡＰ、サリウイルス、コサウイルス、パレコウイルス、ショウジョウバエｈａｉｒｌｅｓｓ、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＦＩＩＤ、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＡＰ１、ヒトｃ－ｓｒｃ、ヒトＦＧＦ－ｌ、サルピコルナウイルス（ｐｉｃｏｍａｖｉｒｕｓ）、カブクリンクルウイルス、アイチウイルス、クロヒウイルス、エコーウイルス１１、ｅＩＦ４Ｇに対するアプタマー、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）又はコクサッキーウイルスＡ（ＣＶＢ１／２）のＩＲＥＳ配列である。さらに別の実施形態において、ＩＲＥＳは、コクサッキーウイルスＢ３（ＣＶＢ３）のＩＲＥＳ配列である。更なる実施形態において、ＩＲＥＳは、脳心筋炎ウイルスのＩＲＥＳ配列である。更なる実施形態において、ＩＲＥＳは、タイラー脳脊髄炎ウイルスのＩＲＥＳ配列である。

【0199】

ＩＲＥＳ配列は、野生型ＩＲＥＳ配列と比較して修飾された配列を有し得る。一部の実施形態において、野生型ＩＲＥＳの最後のヌクレオチドがシトシン核酸残基でないとき、野生型ＩＲＥＳ配列のその最後のヌクレオチドは、それがシトシン残基であるように修飾されてもよい。例えば、ＩＲＥＳ配列は、末端アデノシン残基がシトシン残基となるように修飾されているＣＶＢ３ ＩＲＥＳ配列であってもよい。一部の実施形態において、修飾されたＣＶＢ３ ＩＲＥＳは、

【化15】

の核酸配列を有し得る。

【0200】

一部の実施形態において、ＩＲＥＳ配列は、エンテロウイルス７１（ＥＶ１７）ＩＲＥＳである。一部の実施形態において、ＥＶ１７ ＩＲＥＳ配列の末端グアノシン残基は、シトシン残基となるように修飾されている。一部の実施形態において、修飾されたＥＶ７１ ＩＲＥＳは、

【化16】

の核酸配列を有し得る。

【0201】

一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの（例えば、２、３、４、５つ又はそれ以上の）発現配列に隣接する少なくとも１つのＩＲＥＳを含む。一部の実施形態において、ＩＲＥＳは、少なくとも１つの（例えば、２、３、４、５つ又はそれ以上の）発現配列の両側に隣接する。一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に１つ以上のＩＲＥＳ配列を含み、結果として得られる０００１ペプチド及び／又はポリペプチドの分離につながる。例えば、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、第１の発現配列（例えば、多量体化ドメインを含む第１の免疫原など、第１の免疫原をコードする）に作動可能に連結された第１のＩＲＥＳと、第２の発現配列（例えば、多量体化ドメインを含む第２の免疫原など、第２の免疫原をコードする）に作動可能に連結された第２のＩＲＥＳとを含み得る。

【0202】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、ＩＲＥＳ（例えば、コード領域に作動可能に連結されたＩＲＥＳ）を含む。例えば、ポリリボヌクレオチドは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬ．ＣＥＬＬ ８１（２０）：４３００－１８，２０２１；Ｊｏｐｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．ＯＮＣＯＧＥＮＥ ２０：２６６４－７０，２００１；Ｂａｒａｎｉｃｋ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １０５（１２）：４７３３－３８，２００８；Ｌａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＴＨＥ ＣＥＬＬ １３（５）：１７９２－１８０１，２００２；Ｄｏｒｏｋｈｏｖ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ９９（８）：５３０１－０６，２００２；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ３３（７）：２２４８－５８，２００５；Ｐｅｔｚ ｅｔ ａｌ．ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ３５（８）：２４７３－８２，２００７；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．ＳＣＩＥＮＣＥ ２６８：４１５－４１７，１９９５；Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．ＮＡＴＵＲＥ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮ １３（１）：３７５１－３７６５，２０２２、及び国際公開第２０２１／２６３１２４号パンフレット（これらの各々は、全体として本明細書によって参照により援用される）に記載されるとおりの任意のＩＲＥＳを含み得る。

【0203】

シグナル配列
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的な免疫原として、分泌タンパク質、例えば、天然にシグナル配列を含むタンパク質（例えば、免疫原）、又は通常はシグナル配列をコードしないが、１つを含むように修飾されるものが挙げられる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる免疫原は、分泌シグナルを含む。例えば、分泌シグナルは、分泌タンパク質における天然にコードされた分泌シグナルであってもよい。別の例では、分泌シグナルは、分泌タンパク質における修飾された分泌シグナルであってもよい。他の実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる免疫原は、分泌シグナルを含まない。

【0204】

一部の実施形態において、シグナル配列は、ＳｅｃＳＰ３８（ＭＷＷＲＬＷＷＬＬＬＬＬＬＬＬＷＰＭＶＷＡ；配列番号１）；ＳｅｃＤ４（ＭＷＷＬＬＬＬＬＬＬＬＷＰＭＶＷＡ；配列番号２）、ｇＬｕｃ（ＭＧＶＫＶＬＦＡＬＩＣＩＡＶＡＥＡＫ；配列番号３）；ＩＮＨＣ１（ＭＡＳＲＬＴＬＬＴＬＬＬＬＬＬＡＧＤＲＡＳＳ；配列番号４）；Ｅｐｏ（ＭＧＶＨＥＣＰＡＷＬＷＬＬＬＳＬＬＳＬＰＬＧＬＰＶＬＧ；配列番号５）；及びＩＬ－２（ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ；配列番号６）から選択される。

【0205】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、同じ免疫原の複数のコピー（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、又はそれ以上）をコードする。いくつかの実施形態では、免疫原の少なくとも１つのコピーは、シグナル配列を含み、免疫原の少なくとも１つのコピーは、シグナル配列を含まない。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、複数の免疫原（例えば、複数の異なる免疫原又は１００％未満の配列同一性を有する複数の免疫原）をコードし、ここで複数の免疫原の少なくとも１つは、シグナル配列を含み、複数の免疫原の少なくとも１つのコピーは、シグナル配列を含まない。

【0206】

いくつかの実施形態では、シグナル配列は、（例えば、内因性に発現されるとき）、野生型シグナル配列であり、対応する野生型免疫原のＮ末端上に存在するものである。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、免疫原に対して異種である（例えば、野生型免疫原が内因性に発現されるとき、存在しない）。免疫原をコードするポリリボヌクレオチド配列は、野生型シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を除去し、且つ／又は異種シグナル配列をコードする配列を付加するように修飾されてもよい。

【0207】

環状ポリリボヌクレオチドは、各々シグナル配列を有する又は有しない１つ又は複数のアジュバントをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのアジュバント及び少なくとも１つの免疫原をコードする。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのコードされるアジュバントはシグナル配列を含み、少なくとも１つのコードされる免疫原はシグナル配列を含まない。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのコードされるアジュバントはシグナル配列を含み、少なくとも１つのコードされる免疫原はシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのコードされるアジュバントはシグナル配列を含まず、少なくとも１つのコードされる免疫原はシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、コードされるアジュバントも、コードされる免疫原も、シグナル配列を含まない。

【0208】

いくつかの実施形態では、シグナル配列は、（例えば内因的に発現したときの）対応する野生型アジュバントのＮ末端に存在する野生型シグナル配列である。いくつかの実施形態では、シグナル配列はアジュバントにとって異種である（例えば、野生型アジュバントが内因的に発現したときに存在しない）。アジュバントをコードするポリリボヌクレオチド配列は、野生型シグナル配列をコードするヌクレオチド配列が取り除かれ、及び／又は異種シグナル配列をコードする配列が付加されるように修飾されてもよい。

【0209】

ポリリボヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（例えば免疫原、又はポリリボヌクレオチドによってコードされるアジュバント）は、免疫原又はアジュバントを分泌経路に導くシグナル配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、免疫原又はアジュバントを特定の細胞小器官（例えば、小胞体、ゴルジ装置、又はエンドソーム）に存在するように導いてもよい。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、免疫原又はアジュバントを細胞から分泌されるように導く。分泌タンパク質の場合、シグナル配列は、分泌後に切断され、成熟タンパク質をもたらし得る。他の実施形態では、シグナル配列は、細胞又は特定の細胞小器官の膜内に包埋されるようになり、タンパク質を細胞、小胞体、又はゴルジ装置の膜に固定する膜貫通セグメントを創出し得る。特定の実施形態では、膜貫通タンパク質のシグナル配列は、ポリペプチドのＮ末端の短い配列である。他の実施形態では、第１の膜貫通ドメインは、タンパク質を膜に標的化する、第１のシグナル配列として作用する。

【0210】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドによってコードされるアジュバントは、分泌シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドによってコードされる免疫原は、分泌シグナル配列、膜貫通挿入シグナル配列を含むか、又はシグナル配列を含まない、のいずれかである。

【0211】

調節要素
環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数の調節要素（例えば、環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する１つ又は複数の配列）を含む。

【0212】

調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含み得る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結され得る。調節要素は、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。ある調節要素を用いて、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数の免疫原及び／又はアジュバントの発現を増加させることができる。同様に、ある調節要素を用いて、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる１つ又は複数の免疫原及び／又はアジュバントの発現を減少させることができる。いくつかの実施形態では、ある調節要素を用いて、免疫原及び／又はアジュバントの発現を増加させることができ、また別の調節要素を用いて、同じ環状ポリリボヌクレオチドに対する別の免疫原及び／又はアジュバントの発現を減少させることができる。さらに、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物（例えば、免疫原又はアジュバント）の量を増加させ得る。したがって、１つの調節要素が、１つ以上の発現配列（例えば、免疫原又はアジュバント）の発現を促進することができる。複数の調節要素がまた、例えば、異なる発現配列の発現を異なって調節するのに使用され得る。

【0213】

ある実施形態では、本明細書において提供される調節要素は、選択的翻訳配列を含み得る。本明細書において使用される際、「選択的翻訳配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、例えば、特定のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始させるか又は活性化する核酸配列を指す。調節要素は、選択的分解配列も含み得る。本明細書において使用される際、「選択的分解配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、又は環状ポリリボヌクレオチドの発現産物の分解を開始させる核酸配列を指す。ある実施形態では、調節要素は、翻訳モジュレータである。翻訳モジュレータは、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレータは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。ある実施形態では、翻訳開始配列は、調節要素として機能し得る。

【0214】

一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、化学量論比の発現産物を産生する。ローリングサークル翻訳は、発現産物を実質的に等しい比で連続して産生する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは化学量論的な翻訳効率を呈し、従って発現産物が実質的に等しい比で産生されることになる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複数の発現産物（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、又はそれ以上の発現配列からの産物）の化学量論的な翻訳効率を呈する。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、実質的に異なる比の発現産物を産生する。例えば、複数の発現産物の翻訳効率は、１：１０，０００；１：７０００、１：５０００、１：１０００、１：７００、１：５００、１：１００、１：５０、１：１０、１：５、１：４、１：３又は１：２の比を呈し得る。一部の実施形態において、複数の発現産物の比は、調節エレメントを用いて修飾されてもよい。

【0215】

調節要素のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１５４］～［０１６１］に記載されている。

【0216】

切断ドメイン
本開示の環状ポリリボヌクレオチドは、切断ドメイン（例えば、スタッガーエレメント又は切断配列）を含み得る。

【0217】

用語「スタッガーエレメント」は、翻訳中にリボソームポージングを誘導するヌクレオチド配列などの部分を指す。一部の実施形態において、スタッガーエレメントは、強力なαヘリックス傾向性のあるアミノ酸の非保存配列にコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（式中、ｘ＝任意のアミノ酸（配列番号７））が続くものである。一部の実施形態において、スタッガーエレメントは、グリセロールなどの化学的部分、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸、又はこれらの任意の組み合わせを含み得る。

【0218】

一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つのスタッガーエレメントを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接するスタッガーエレメントを含む。一部の実施形態において、スタッガーエレメントは、各発現配列の片側又は両側に存在するため、発現産物（例えば、免疫原及び／又はアジュバント）の分離につながる。一部の実施形態において、スタッガーエレメントは、１つ以上の発現配列の一部分である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは１つ以上の発現配列（例えば、免疫原及び／又はアジュバント）を含み、１つ以上の発現配列の各々が、続く発現配列（例えば、免疫原及び／又はアジュバントと環状ポリリボヌクレオチド上でスタッガーエレメントにより分離されている。一部の実施形態において、スタッガーエレメントは、（ａ）単一の発現配列の２ラウンドの翻訳からの、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１ラウンド以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を妨げる。一部の実施形態において、スタッガーエレメントは、１つ以上の発現配列と別の配列である。一部の実施形態において、スタッガーエレメントは、１つ以上の発現配列中のある発現配列の一部分を含む。

【0219】

スタッガーエレメントの例は、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）のパラグラフ［０１７２］～［０１７５］に記載されている。

【0220】

一部の実施形態において、環状リボヌクレオチドによってコードされる複数の免疫原及び／又はアジュバントは、各免疫原の間にあるＩＲＥＳによって分離されていてもよい（例えば、各免疫原が別個のＩＲＥＳに作動可能に連結されている）。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、第１の発現配列に作動可能に連結された第１のＩＲＥＳと、第２の発現配列に作動可能に連結された第２のＩＲＥＳとを含み得る。ＩＲＥＳは、全ての免疫原の間で同じＩＲＥＳであり得る。ＩＲＥＳは、異なる免疫原の間で異なり得る。

【0221】

一部の実施形態において、複数の免疫原及び／又はアジュバントは、２Ａ自己切断型ペプチドによって分離されていてもよい。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、第１の免疫原、２Ａ、及び第２の免疫原をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたＩＲＥＳをコードし得る。

【0222】

一部の実施形態において、複数の免疫原及び／又はアジュバントは、プロテアーゼ切断部位（例えば、フューリン切断部位）によって分離されていてもよい。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、第１の免疫原、プロテアーゼ切断部位（例えば、フューリン切断部位）、及び第２の免疫原をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたＩＲＥＳをコードし得る。

【0223】

一部の実施形態において、複数の免疫原及び／又はアジュバントは、２Ａ自己切断型ペプチド及びプロテアーゼ切断部位（例えば、フューリン切断部位）によって分離されていてもよい。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、第１の免疫原、２Ａ、プロテアーゼ切断部位（例えば、フューリン切断部位）、及び第２の免疫原をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたＩＲＥＳをコードし得る。環状ポリリボヌクレオチドはまた、第１の免疫原、プロテアーゼ切断部位（例えば、フューリン切断部位）、２Ａ、及び第２の免疫原をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたＩＲＥＳもコードし得る。タンデムな２Ａ及びフューリン切断部位は、フューリン－２Ａと称され得る（これには、いずれの向きに並んだ、フューリン－２Ａ又は２Ａ－フューリンも含まれる）。

【0224】

さらには、環状リボヌクレオチドによってコードされる複数の免疫原及び／又はアジュバントは、ＩＲＥＳ配列及び２Ａ配列の両方によって分離されていてもよい。例えば、１つの免疫原及び／又はアジュバントと第２の免疫原及び／又はアジュバントとの間にＩＲＥＳがあってよく、一方、第２の免疫原及び／又はアジュバントと第３の免疫原及び／又はアジュバントとの間に２Ａペプチドがあってもよい。詳細なＩＲＥＳ又は２Ａ自己切断型ペプチドの選択を用いて、ＩＲＥＳ又は２Ａ配列の制御下にある免疫原及び／又はアジュバントの発現レベルを制御し得る。例えば、ＩＲＥＳ及び／又は２Ａペプチドの選択に応じて、ポリペプチド上での発現は高くなり、又は低くなり得る。

【0225】

ローリングサークル翻訳を維持する一方で、連続した発現産物（例えば、免疫原及び／又はアジュバント）の産生を回避するため、スタッガーエレメントを含めることにより翻訳中にリボソームポージングを誘導してもよい。一部の実施形態において、スタッガーエレメントは、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端にある。スタッガーエレメントは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル翻訳中にリボソームを止めるように構成することができる。スタッガーエレメントは、限定はされないが、２Ａ様、又はＣＨＹＳＥＬ（配列番号８）（シス作用ヒドロラーゼエレメント）配列を含み得る。一部の実施形態において、スタッガーエレメントは、Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＥＸ_５ＮＰＧＰ（式中、Ｘ_１は存在しないか、又はＧ若しくはＨであり、Ｘ_２は存在しないか、又はＤ若しくはＧであり、Ｘ_３はＤ又はＶ又はＩ又はＳ又はＭであり、及びＸ_５は任意のアミノ酸である（配列番号９））であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。一部の実施形態において、この配列は、強力なαヘリックス傾向性のあるアミノ酸の非保存配列にコンセンサス配列－Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（配列番号７）（式中、ｘ＝任意のアミノ酸）が続くものを含む。スタッガーエレメントの一部の非限定的な例としては、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１０）、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ（配列番号１１）、ＶＥＰＮＰＧＰ（配列番号１２）、ＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号１３）、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ（配列番号１４）、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ（配列番号１５）、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号１６）、ＧＤＶＥＮＰＧＰ（配列番号１７）、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１８）、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ（配列番号１９）、ＩＥＳＮＰＧＰ（配列番号２０）、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ（配列番号２１）、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ（配列番号２２）、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ（配列番号２３）、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ（配列番号２４）、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ（配列番号２５）、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ（配列番号２６）、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ（配列番号２７）、及びＤＳＥＦＮＰＧＰ（配列番号２８）が挙げられる。

【0226】

一部の実施形態において、本明細書に記載されるスタッガーエレメントは、本明細書に記載されるコンセンサス配列のＧとＰとの間など、発現産物を切断する。一つの非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物を切断するため少なくとも１つのスタッガーエレメントを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接するスタッガーエレメントを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の後ろにスタッガーエレメントを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の片側又は両側に存在するスタッガーエレメントを含むため、各発現配列からの個々のペプチド及び／又はポリペプチドの翻訳につながる。

【0227】

一部の実施形態において、スタッガーエレメントは、翻訳中にリボソームポージングを誘導する１つ以上の修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含む。非天然ヌクレオチドとしては、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックド核酸（ＬＮＡ）、並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を挙げることができる。このような例は、分子の骨格の変化によって天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡと区別される。例示的修飾には、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、連結リン酸に対する／リン酸ジエステル結合に対する／リン酸ジエステル骨格に対する）任意の修飾、及び翻訳中にリボソームポージングを誘導することのできるこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。本明細書に提供される例示的修飾の一部は、本明細書の他の部分に記載される。

【0228】

一部の実施形態において、スタッガーエレメントは、環状ポリリボヌクレオチドに他の形態で存在する。例えば、一部の例示的環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スタッガーエレメントは、環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列の終結エレメントと、第１の発現配列の後続の発現の第１の翻訳開始配列とその終結エレメントを分離するヌクレオチドスペーサー配列とを含む。一部の例において、第１の発現配列の第１のスタッガーエレメントは、環状ポリリボヌクレオチドにおいて第１の発現配列の後続の発現の第１の翻訳開始配列の上流にある（その５’側にある）。ある場合には、第１の発現配列及び第１の発現配列の後続の発現配列は、環状ポリリボヌクレオチドにおいて２つの別個の発現配列である。第１のスタッガーエレメントと第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及びその後続の発現配列の連続した翻訳を可能にするものであり得る。一部の実施形態において、第１のスタッガーエレメントは終結エレメントを含んで第１の発現配列の発現産物をその後続の発現配列の発現産物と分離し、それによって不連続な発現産物を作り出す。ある場合には、環状ポリリボヌクレオチドにおいて後続の配列の第１の翻訳開始配列の上流に第１のスタッガーエレメントを含む環状ポリリボヌクレオチドは連続的に翻訳される一方、第２の発現配列の後続の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２の発現配列のスタッガーエレメントを含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続的には翻訳されない。ある場合には、環状ポリリボヌクレオチドには１つの発現配列しかなく、第１の発現配列及びその後続の発現配列が同じ発現配列である。一部の例示的環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スタッガーエレメントは、環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列の第１の終結エレメントと、その終結エレメントを下流翻訳開始配列と分離するヌクレオチドスペーサー配列とを含む。一部のかかる例では、第１のスタッガーエレメントは、環状ポリリボヌクレオチドにおいて第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流にある（その５’側にある）。ある場合には、第１のスタッガーエレメントと第１の翻訳開始配列との間の距離により、第１の発現配列及び任意の後続の発現配列の連続した翻訳が可能となる。一部の実施形態において、第１のスタッガーエレメントは、第１の発現配列の一つのラウンドの発現産物を第１の発現配列の次のラウンドの発現産物と分離し、それによって不連続な発現産物を作り出す。ある場合には、環状ポリリボヌクレオチドにおいて第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流に第１のスタッガーエレメントを含む環状ポリリボヌクレオチドは連続的に翻訳される一方、対応する環状ポリリボヌクレオチドにおいて第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にスタッガーエレメントを含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続的には翻訳されない。ある場合には、第２のスタッガーエレメントと第２の翻訳開始配列との間の距離は、対応する環状ポリリボヌクレオチドにおいて、環状ポリリボヌクレオチドにおける第１のスタッガーエレメントと第１の翻訳開始との間の距離の少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、又は１０倍大きい。ある場合には、第１のスタッガーエレメントと第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ、又はそれ以上である。一部の実施形態において、第２のスタッガーエレメントと第２の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔであるか、又は第１のスタッガーエレメントと第１の翻訳開始との間の距離よりも大きい。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含む。

【0229】

一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの切断配列を含む。一部の実施形態において、切断配列は、発現配列に隣接する。一部の実施形態において、切断配列は、２つの発現配列の間にある。一部の実施形態において、切断配列は、発現配列に含まれる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２～１０個の切断配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２～５個の切断配列を含む。一部の実施形態において、複数の切断配列は複数の発現配列の間にあり；例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、３個の発現配列、２個の切断配列を、各発現配列の間に切断配列があるようにして含み得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、犠牲性ｃｉｒｃＲＮＡ又は切断可能なｃｉｒｃＲＮＡ又は自己切断型ｃｉｒｃＲＮＡに見られるものなどの切断配列を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは２つ以上の切断配列を含むため、環状ポリリボヌクレオチドが複数の産物（例えば、ｍｉＲＮＡ、線状ＲＮＡ、より小さい環状ポリリボヌクレオチド等）へと分離されることにつながる。

【0230】

一部の実施形態において、切断配列は、リボザイムＲＮＡ配列を含む。リボザイム（リボ核酸酵素由来、別名ＲＮＡ酵素又は触媒ＲＮＡ）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然のリボザイムが、それ自体のリン酸ジエステル結合のうちの１つの加水分解、又は他のＲＮＡにおける結合の加水分解のいずれかを触媒するが、これはまた、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも分かっている。触媒ＲＮＡは、インビトロ方法により「進化」させることができる。上記で考察したリボスイッチ活性と同様に、リボザイム及びその反応産物は遺伝子発現を調節することができる。一部の実施形態において、触媒ＲＮＡ又はリボザイムは、バルク容積からの分子の化学的転換を目的としてリボザイムが細胞内に多コピー数で存在することになるように、より大型の非コードＲＮＡの中に置かれてもよい。一部の実施形態において、同じ非コードＲＮＡにアプタマー及びリボザイムが両方ともコードされてもよい。

【0231】

一部の実施形態において、切断配列は、切断可能なポリペプチドリンカーをコードする。例えば、ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の免疫原をコードし得る（例えば、ここでは２つ以上の免疫原が単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる）。例えば、２つ以上の免疫原が単一のオープンリーディングフレームによってコードされてもよく、その発現はＩＲＥＳによって制御される。一部の実施形態において、ＯＲＦはポリペプチドリンカーをさらにコードし、そのため、例えば、ＯＲＦの発現産物が、ポリペプチドリンカー（例えば、５～２００、５～１００、５～５０、５～２０、５０～１００、又は５０～２００アミノ酸のリンカー）をコードする配列によって各々分離された２つ以上の免疫原をコードすることになる。ポリペプチドリンカーは、切断部位、例えば、プロテアーゼ（例えば、対象へのポリリボヌクレオチドの投与に伴うその対象の内因性プロテアーゼ）によって認識され、切断される切断部位を含み得る。かかる実施形態では、２つ以上の免疫原のアミノ酸配列を含む単一の発現産物が発現時に切断され、そのため発現後に２つ以上の免疫原は分離されていることになる。例示的プロテアーゼ切断部位は当業者に公知であり、例えば、メタロプロテイナーゼ（例えば、ＭＭＰ１～２８のいずれか１つ以上など、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ））、ディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭ２、７～１２、１５、１７～２３、２８～３０及び３３のうちのいずれか１つ以上など、ＡＤＡＭ）、セリンプロテアーゼ（例えば、フューリン）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター、マトリプターゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、又はカテプシンプロテアーゼによって認識されるプロテアーゼ切断部位として働くアミノ酸配列がある。一部の実施形態において、プロテアーゼは、ＭＭＰ９又はＭＭＰ２である。一部の実施形態において、プロテアーゼは、マトリプターゼである。

【0232】

一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、犠牲性環状ポリリボヌクレオチド、切断可能な環状ポリリボヌクレオチド、又は自己切断型環状ポリリボヌクレオチドである。環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを含めた、細胞成分を送達することができる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、（ｉ）自己切断可能なエレメント；（ｉｉ）切断動員部位；（ｉｉｉ）分解性リンカー；（ｉｖ）化学的リンカー；及び／又は（ｖ）スペーサー配列によって分離されたｍｉＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ｃｉｒｃＲＮＡは、（ｉ）自己切断可能なエレメント；（ｉｉ）切断動員部位（例えば、ＡＤＡＲ）；（ｉｉｉ）分解性リンカー（例えば、グリセロール）；（ｉｖ）化学的リンカー；及び／又は（ｖ）スペーサー配列によって分離されたｓｉＲＮＡを含む。自己切断可能なエレメントの非限定的な例としては、ハンマーヘッド型スプライシングエレメント、ヘアピン、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｖａｒｋｕｄサテライト（ＶＳ）、及びｇｌｍＳリボザイムが挙げられる。

【0233】

翻訳開始配列
いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原をコードし、翻訳開始配列（例えば、開始コドン）を含む。いくつかの実施形態では、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。いくつかの実施形態では、翻訳開始配列は、コザック配列を含む。ある実施形態では、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列（例えば、コザック配列）を含む。ある実施形態では、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。ある実施形態では、翻訳開始配列（例えば、コザック配列）は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。ある実施形態では、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。ある実施形態では、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。翻訳開始配列のさらなる例が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１６３］～［０１６５］に記載されている。

【0234】

環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０又は６０を超える開始コドンなどの２つ以上の開始コドンを含んでもよい。翻訳は、第１の開始コドンで開始し得るか、又は第１の開始コドンの下流で開始し得る。

【0235】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、第１の開始コドン（例えば、ＡＵＧ）でないコドンで開始し得る。環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の［０１６４］に記載のような代替的な翻訳開始配列で開始し得る。

【0236】

いくつかの実施形態では、翻訳は、ロカグレートを伴う真核生物開始因子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）の処理によって開始される（翻訳は、４３Ｓスキャニングを遮断し、ＲｏｃＡ－ｅＩＦ４Ａ標的配列を有する転写物からの未成熟な上流の翻訳開始及びタンパク質発現低下を引き起こすことによって抑制される、例えば、ｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎａｔｕｒｅ１７９７８を参照）。

【0237】

非翻訳領域
ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。ある実施形態では、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。ある実施形態では、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。

【0238】

例示的な非翻訳領域が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０１９７］～［２０１］に記載されている。

【0239】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を含む。例示的なポリＡ配列が、全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットの段落［０２０２］～［０２０５］に記載されている。ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている。

【0240】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、アデノシン及びウリジンの１つ又は複数のストレッチが内包されたＵＴＲを含む。これらのＡＵリッチのシグネチャーは、発現産物のターンオーバー速度を増加させ得る。

【0241】

ＵＴＲのＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去、又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性、又は免疫原性（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベル）を調節するのに有用であり得る。特定の環状ポリリボヌクレオチドを改変するとき、ＡＲＥの１つ又は複数コピーを環状ポリリボヌクレオチドに導入してもよく、ＡＲＥのコピーは、発現産物の翻訳及び／又は産生を調節し得る。同様に、ＡＲＥを、同定及び除去し、又は環状ポリリボヌクレオチドに改変することで、細胞内安定性を調節し、ひいては得られるタンパク質の翻訳及び産生に作用することができる。

【0242】

任意の遺伝子からの任意のＵＴＲが環状ポリリボヌクレオチドの各隣接領域に組み込まれてもよいことは理解されるべきである。

【0243】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、３’ＵＴＲを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、終結配列を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ又は複数の発現配列からのタンパク質発現の能力がある。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列：１つ又は複数のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ又は複数の複製タンパク質をコードする配列、外因性遺伝子をコードする配列、治療（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）をコードする配列、調節要素（例えば、翻訳モジュレータ、例えば、翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、内因性遺伝子を標的にする１つ又は複数の調節核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、及び治療的ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列、の１つ又は複数を含む。

【0244】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’ＵＴＲを欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、３’ＵＴＲを欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ配列を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、終結配列を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドが分解感受性を欠いているという事実は、環状ポリリボヌクレオチドがエキソヌクレアーゼによって分解されない、又はエキソヌクレアーゼの存在下で限られた範囲に限って分解される（例えば、エキソヌクレアーゼの不在下で同等又は類似的である）ことを意味し得る。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによって分解されない。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに曝露されるとき、分解が低下している。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合を欠いている。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠いている。

【0245】

終結エレメント
一部の実施形態において、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの終結エレメントを含む。一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチドは、発現配列に作動可能に連結された終結エレメントを含む。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは終結エレメントを欠いている。

【0246】

一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチドは１つ以上の発現配列を含み、各発現配列が終結エレメントを有することも、又は有しないこともある。一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチドは１つ以上の発現配列を含み、これらの発現配列は終結エレメントを欠いているため、ポリリボヌクレオチドは連続して翻訳されることになる。終結エレメントを除くと、ローリングサークル翻訳又は発現産物の連続した発現が起こり得る。

【0247】

一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは１つ以上の発現配列を含み、各発現配列が終結エレメントを有することも、又は有しないこともある。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは１つ以上の発現配列を含み、これらの発現配列は終結エレメントを欠いているため、環状ポリリボヌクレオチドは連続して翻訳されることになる。終結エレメントを除くと、ローリングサークル翻訳又は発現産物の連続した発現（例えば、ペプチド又はポリペプチド、リボソームのストール又は脱落がないことに起因する）が起こり得る。かかる実施形態において、ローリングサークル翻訳では、各発現配列を通じて連続した発現産物が発現する。一部の他の実施形態において、発現配列の終結エレメントは、スタッガーエレメントの一部であり得る。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の発現配列は、終結エレメントを含む。しかしながら、ローリングサークル翻訳又は環状ポリリボヌクレオチド中の後続の（例えば、第２、第３、第４、第５等の）発現配列の発現は実施される。そのような場合、リボソームが終結エレメントに遭遇すると（例えば、終止コドン、及び翻訳を終結させると）、発現産物からリボソームが脱落し得る。一部の実施形態において、リボソーム（例えば、リボソームの少なくとも１つのサブユニット）が環状ポリリボヌクレオチドと接触し続けている間に、翻訳が終結する。

【0248】

一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列の終わりに終結エレメントを含む。一部の実施形態において、１つ以上の発現配列は、２つ以上の終結エレメントを連続して含む。かかる実施形態では、翻訳が終結し、及びローリングサークル翻訳が終結する。一部の実施形態において、リボソームは環状ポリリボヌクレオチドから完全に離脱する。一部のかかる実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の（例えば、第２、第３、第４、第５等の）発現配列の産生には、翻訳の開始前にリボソームが環状ポリリボヌクレオチドと再び会合する必要があり得る。概して、終結エレメントは、翻訳の終結シグナルを送るインフレームのヌクレオチドトリプレット（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧ）を含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の終結エレメントにより、限定はされないが、オフフレーム又は－１及び＋１シフトしたリーディングフレーム（例えば、隠れた終止）など、終結エレメントがフレームシフトを起こし、それによって翻訳が終結し得る。フレームシフトを起こした終結エレメントは、ヌクレオチドトリプレットＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡを含み、これらは発現配列の第２及び第３のリーディングフレームに現れる。フレームシフトを起こした終結エレメントは、細胞にとって有害であることが多いｍＲＮＡの誤読を防ぐ上で重要であり得る。一部の実施形態において、終結エレメントは終止コドンである。

【0249】

一部の実施形態において、発現配列は、ポリＡ配列を（例えば、発現配列の３’末端、例えば終結エレメントの３’側に）含む。一部の実施形態において、ポリＡ配列の長さは１０ヌクレオチド長より長い。一実施形態において、ポリＡ配列は１５ヌクレオチド長より長い（例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、及び３，０００ヌクレオチド以上）。一部の実施形態において、ポリＡ配列は、国際公開第２０１９／１１８９１９Ａ１号パンフレット（これは全体として参照により本明細書に援用される）の［０２０２］～［０２０４］にあるポリＡ配列の説明に従い設計される。一部の実施形態において、発現配列は、（例えば、発現配列の３’末端に）ポリＡ配列を欠いている。

【0250】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡを含むか、ポリＡを欠いているか、又は環状ポリリボヌクレオチドの１つ若しくは複数の特性を調節するための修飾ポリＡを有する。いくつかの実施形態では、ポリＡを欠いているか又は修飾ポリＡを有している環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数の機能特性（例えば、免疫原性（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベル）、半減期、及び／又は発現効率）を改善する。

【0251】

終結エレメントの更なる例は、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレット（本明細書によって全体として参照により援用される）のパラグラフ［０１６９］～［０１７０］に記載されている。

【0252】

スペーサー配列
一部の実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、スペーサー配列を含む。一部の実施形態において、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドは、１つ以上のスペーサー配列を含む。スペーサーとは、２つの隣接するポリヌクレオチド領域の間に距離又は可動性を付与する（例えば、１ヌクレオチド以上の）任意の連続したヌクレオチド配列を指す。スペーサーは、本明細書に記載される核酸エレメントのいずれの間にも存在し得る。スペーサーはまた、本明細書に記載される核酸エレメントの内部にも存在し得る。

【0253】

スペーサーは、例えば、少なくとも５（例えば、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０）リボヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、各スペーサー領域は、少なくとも５（例えば、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０）リボヌクレオチド長である。各スペーサー領域は、例えば、５～５００（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００）リボヌクレオチド長であり得る。第１のスペーサー領域、第２のスペーサー領域、又は第１のスペーサー領域及び第２のスペーサー領域は、ポリＡ配列を含み得る。第１のスペーサー領域、第２のスペーサー領域、又は第１のスペーサー領域及び第２のスペーサー領域は、ポリＡ－Ｃ配列を含み得る。一部の実施形態において、第１のスペーサー領域、第２のスペーサー領域、又は第１のスペーサー領域及び第２のスペーサー領域は、ポリＡ－Ｇ配列を含む。一部の実施形態において、第１のスペーサー領域、第２のスペーサー領域、又は第１のスペーサー領域及び第２のスペーサー領域は、ポリＡ－Ｔ配列を含む。一部の実施形態において、第１のスペーサー領域、第２のスペーサー領域、又は第１のスペーサー領域及び第２のスペーサー領域は、ランダム配列を含む。

【0254】

一部の実施形態において、スペーサー配列は、例えば、少なくとも１０ヌクレオチド長、少なくとも１５ヌクレオチド長、又は少なくとも３０ヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態において、スペーサー配列は、少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５又は３０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、スペーサー配列は、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５又は３０ヌクレオチド長以下である。一部の実施形態においてスペーサー配列は、２０～５０ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、スペーサー配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０ヌクレオチド長である。

【0255】

スペーサー配列は、ポリＡ配列、ポリＡ－Ｃ配列、ポリＣ配列、又はポリＵ配列であってもよい。

【0256】

一部の実施形態において、スペーサー配列は、ポリＡ－Ｔ、ポリＡ－Ｃ、ポリＡ－Ｇ、又はランダム配列であってもよい。

【0257】

例示的スペーサー配列については、国際公開第２０１９／１１８９１９号パンフレットのパラグラフ［０２９３］～［０３０２］に記載されており、この文献は本明細書によって全体として参照により援用される。

【0258】

修飾
環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列、特に、親ポリリボヌクレオチドに対する、１つ又は複数の置換、挿入及び／又は付加、欠失、及び共有結合修飾を含んでもよいことは、本開示の範囲内に含まれる。

【0259】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数の転写後修飾（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリＡ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化、並びにチオール基及びチロシン残基のニトロシル化など）を含む。１つ又は複数の転写後修飾は、ＲＮＡにおいて同定されている１００を超える異なるヌクレオシド修飾のいずれかなどの任意の転写後修飾であり得る（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－９７）。いくつかの実施形態では、第１の単離核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドは、国際特許公開の国際公開第２０１９／１１８９１９Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書中に援用される）の［０３１１］中に記載されるような群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。

【0260】

環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、糖、核酸塩基、又はヌクレオシド間結合（例えば、連結リン酸塩／リン酸ジエステル結合／リン酸ジエステル骨格）に対する任意の有用な修飾を含んでもよい。ピリミジン核酸塩基の１つ又は複数の原子は、任意選択的に置換されたアミノ、任意選択的に置換されたチオール、任意選択的に置換されたアルキル（例えば、メチル又はエチル）、又はハロ（例えば、クロロ又はフルオロ）で置換（ｒｅｐｌａｃｅｄ）又は置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）されてもよい。特定の実施形態では、修飾（例えば、１つ又は複数の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合のそれぞれにおいて存在する。修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）の、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）又はそれらのハイブリッド）への修飾であってもよい。さらなる修飾は、本明細書中に記載されている。

【0261】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳効率を増加させるための少なくとも１つのＮ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含む。いくつかの実施形態では、ｍ６Ａ修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を低下（例えば、免疫又は炎症性応答の１つ又は複数のマーカーのレベルを低下）させ得る。

【0262】

いくつかの実施形態では、修飾は、化学又は細胞誘導修飾を含んでもよい。例えば、細胞内ＲＮＡ修飾のいくつかの非限定例が、Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１７，１８：２０２－１０からのＬｅｗｉｓ ａｎｄ Ｐａｎ、“ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”によって記載されている。

【0263】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドのリボヌクレオチドに対する化学修飾は、免疫逃避を増強し得る。環状ポリリボヌクレオチドは、当該技術分野で十分に確立された方法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ（ここで参照により本明細書中に援用される）に記載されたものによって合成及び／又は修飾されてもよい。修飾は、例えば、末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化（モノ－、ジ－及びトリ－）、コンジュゲーション、逆結合など）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆結合など）、塩基修飾（例えば、安定化塩基、不安定化塩基、又はパートナーの拡大されたレパートリーと塩基対を形成する塩基との置換）、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）、又はコンジュゲート塩基を含む。修飾リボヌクレオチド塩基はまた、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンを含んでもよい。いくつかの実施形態では、塩基修飾は、いくつかの機能的効果を挙げると、環状ポリリボヌクレオチドの、発現、免疫応答、安定性、細胞内局在化を調節し得る。いくつかの実施形態では、修飾は、双直交性のヌクレオチド、例えば、非天然塩基を含む。例えば、Ｋｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），２０１７，５３：１２３０９，ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ７ｃｃ０６６６１ａ（ここで参照により援用される）を参照されたい。

【0264】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドの１つ又は複数のリボヌクレオチドの糖修飾（例えば、２’位又は４’位）又は糖の置換、並びに骨格修飾は、リン酸ジエステル結合の修飾又は置換を含み得る。環状ポリリボヌクレオチドの具体例として、限定はされないが、リン酸ジエステル結合の修飾又は置換を含む、修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合、例えば、ヌクレオシド間修飾を含む、環状ポリリボヌクレオチドが挙げられる。修飾骨格を有する環状ポリリボヌクレオチドは、特に、骨格内にリン原子を有しないものを含む。本願を意図して、また時として当該技術分野で参照される通り、ヌクレオシド間骨格内にリン原子を有しない修飾ＲＮＡはまた、オリゴヌクレオシドと考えることができる。特定の実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、ヌクレオシド間骨格内にリン原子を有するリボヌクレオチドを含むことになる。

【0265】

修飾された環状ポリリボヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ジチオリン酸、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び正常な３’－５’結合を有するボラノリン酸、これらの２’－５’結合類似体、及びヌクレオシド単位の隣接ペアが、３’－５’と５’－３’又は２’－５’と５’－２’で結合される、反転極性を有するものを含んでもよい。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、負又は正に荷電され得る。

【0266】

環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸塩骨格）に対して修飾され得る。本明細書では、ポリヌクレオチド骨格との関連で、「リン酸塩」及び「リン酸ジエステル」という語句は、互換可能に用いられる。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ又は複数を異なる置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、非修飾リン酸部分の、本明細書に記載のような別のヌクレオシド間結合による大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例として、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられる。ジチオリン酸は、硫黄によって置換された両方の非結合酸素を有する。また、リン酸リンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）による結合酸素の置換によって修飾され得る。

【0267】

ａ－チオ置換リン酸部分は、ＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに非天然ホスホロチオエート骨格結合を介して安定性を与えるように提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、細胞環境下で、増強されたヌクレアーゼ抵抗性と、それに続く延長された半減期を有する。環状ポリリボヌクレオチドに連結されたホスホロチオエートは、細胞の自然免疫分子のより弱い結合／活性化を介して自然免疫応答を低減することが予想される。

【0268】

具体的な実施形態では、修飾ヌクレオシドは、α－チオヌクレオシド（例えば、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－アデノシン、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－シチジン（ａ－チオ－シチジン）、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－グアノシン、５’－Ｏ－（ｌ－チオリン酸）－ウリジン、又は５’－Ｏ－（１－チオリン酸）－プソイドウリジン）を含む。

【0269】

亜リン酸原子を含まないヌクレオシド間結合を含む、本開示に従って用いられてもよい他のヌクレオシド間結合が、本明細書に記載される。

【0270】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ又は複数の細胞傷害性ヌクレオシドを含んでもよい。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドは、二機能性修飾などの環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれてもよい。細胞傷害性ヌクレオシドは、限定はされないが、アデノシンアラビノシド、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、ｌ－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシン、デシタビン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、テガフール及びウラシルの組み合わせ、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－ｌ－（テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（ｌＨ，３Ｈ）－ジオン）、トロキサシタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）、及び６－メルカプトプリンを含んでもよい。さらなる例として、リン酸フルダラビン、Ｎ４－ベヘノイル－ｌ－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１－β－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－ｌ－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－β－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン、及びＰ－４０５５（シタラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。

【0271】

環状ポリリボヌクレオチドは、分子の全長に沿って均一に修飾されてもされなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ又は複数又は全てのタイプ（例えば、天然に存在するヌクレオチド、プリン若しくはピリミジン、又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵの任意の１つ若しくは複数若しくは全て）は、環状ポリリボヌクレオチド、又はその所与の所定の配列領域において均一に修飾されてもされなくてもよい。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、プソイドウリジンを含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、イノシンを含み、それは環状ポリリボヌクレオチドを内因性ＲＮＡとウイルス性のＲＮＡとして特徴づける免疫系に寄与し得る。イノシンの組み込みはまた、ＲＮＡ安定性の改善／分解の減少を媒介し得る。例えば、Ｙｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４（その全体が参照により援用される）を参照されたい。

【0272】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド（又はその所与の配列領域）における全てのヌクレオチドが、修飾される。いくつかの実施形態では、修飾は、発現を増強し得るｍ６Ａ；免疫応答を減弱し得るイノシン；ＲＮＡ安定性、又は翻訳リードスルー（スタガー要素）を増強し得るプソイドウリジン、安定性を増強し得るｍ５Ｃ；及び細胞内転位（例えば、核局在化）を補助する２，２，７－トリメチルグアノシンを含んでもよい。

【0273】

異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）は、環状ポリリボヌクレオチド中の様々な位置に存在してもよい。当業者は、ヌクレオチド類似体又は他の修飾が環状ポリリボヌクレオチドの任意の位置に位置し得ることで、環状ポリリボヌクレオチドの機能が実質的に低下しないことを理解するであろう。修飾はまた、非コード領域修飾であってもよい。環状ポリリボヌクレオチドは、（全ヌクレオチド含量、又はヌクレオチドの１つ若しくは複数のタイプ、即ち、Ａ、Ｇ、Ｕ若しくはＣの任意の１つ若しくは複数のいずれかに対して）約１％～約１００％、又は任意の間の百分率（例えば、１％～２０％＞、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。

【0274】

作製方法
本開示は、例えば、組換え技術又は化学合成を含めた、環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法を提供する。例えば、ＲＮＡ環の作製に使用されるＤＮＡ分子としては、天然に存在する核酸配列のＤＮＡ配列、その修飾されたバージョン、又は通常は天然には見られない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を挙げることができる。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定はされないが、古典的な突然変異誘発技法及び組換え技術、例えば、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するような核酸分子の化学的処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片のライゲーション、核酸配列の選択された領域のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅又は突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び混合物群のライゲーションによる核酸分子の混合物の「構築」並びにこれらの組み合わせなどを含め、種々の技法を用いて修飾することができる。

【0275】

環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが化学合成及び酵素合成を含めた、任意の利用可能な技法により調製し得る。一部の実施形態において、線状の一次構築物又は線状のＲＮＡを環化又はコンカテマー化することにより、本明細書に記載されるｃｉｒｃＲＮＡを作り出してもよい。環化又はコンカテマー化機構は、例えば、化学的、酵素的、スプリントライゲーション、又はリボザイム触媒方法などの方法を通じて起こり得る。新規に形成された５’－３’連結は、分子内連結又は分子間連結であり得る。例えば、スプリントライゲーションには、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼなどのスプリントリガーゼを使用することができる。この方法によれば、一本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡなどの一本鎖ポリヌクレオチド（スプリント）が線状ポリリボヌクレオチドの両方の末端とハイブリダイズするように設計することができ、そのため一本鎖スプリントとのハイブリダイゼーションに伴いこれらの２つの末端が並んで置かれることになり得る。スプリントリガーゼは、このように線状ポリリボヌクレオチドの並んで置かれた２つの末端のライゲーションを触媒することができ、ｃｉｒｃＲＮＡが生じ得る。一部の実施形態において、環状ポリヌクレオチドの合成では、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼが使用されてもよい。非限定的な例として、このリガーゼは、ｃｉｒｃリガーゼ又は環状リガーゼであり得る。

【0276】

別の例では、線状ポリリボヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれかが、リガーゼリボザイム配列をコードすることができ、そのためインビトロ転写時、得られる線状ｃｉｒｃＲＮＡには、線状ポリリボヌクレオチドの５’末端を線状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートする能力を有する活性リボザイム配列が含まれることになる。このリガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、Ｄ型肝炎ウイルス、ヘアピンリボザイムに由来してもよく、又はＳＥＬＥＸ（試験管内進化法）により選択されてもよい。

【0277】

別の例において、線状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの非核酸部分を使用することによって環化又はコンカテマー化されてもよい。例えば、少なくとも１つの非核酸部分は、線状ポリリボヌクレオチドを環化又はコンカテマー化するため、線状ポリリボヌクレオチドの５’末端近傍又は３’末端近傍の領域又は特徴と反応し得る。別の例において、少なくとも１つの非核酸部分は線状ポリリボヌクレオチドの５’末端又は３’末端に、又はその近傍に位置するか、又はそれに連結されていてもよい。非核酸部分は、同種であっても、又は異種であってもよい。非限定的な例として、非核酸部分は、疎水性連結鎖、イオン性連結鎖、生分解性連結鎖、又は切断可能な連結鎖などの連結鎖であり得る。別の非限定的な例として、非核酸部分は、ライゲーション部分である。さらに別の非限定的な例として、非核酸部分は、本明細書に記載されるとおりのアプタマー又は非核酸リンカーなど、オリゴヌクレオチド又はペプチド部分であってもよい。

【0278】

別の例において、線状ポリリボヌクレオチドは、自己スプライシングによって環化又はコンカテマー化されてもよい。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドはループＥ配列を含んで自己ライゲートする。別の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドは、自己環化性イントロン、例えば、５’及び３’スライスジャンクション（ｓｌｉｃｅ ｊｕｎｃｔｉｏｎ）、又はグループＩ、グループＩＩ、若しくはグループＩＩＩイントロンなど、自己環化性触媒イントロンを含み得る。グループＩイントロン自己スプライシング配列の非限定的な例としては、Ｔ４バクテリオファージ遺伝子ｔｄに由来する自己スプライシング並べ替えイントロン－エクソン配列、及びテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）の介在配列（ＩＶＳ）ｒＲＮＡ、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、又はテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレｒＲＮＡを挙げることができる。

【0279】

一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチドは、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片及びグループＩ触媒イントロンの５’側半分断片など、触媒イントロン断片を含み得る。触媒イントロン断片内には、第１及び第２のアニーリング領域が位置し得る。グループＩ触媒イントロンは、２金属イオンホスホリル転移機構によってｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡ前駆体からのその自己切断を触媒する自己スプライシングリボザイムである。重要なことに、ＲＮＡそれ自体が、リガーゼなどの外因性酵素を必要とすることなくイントロン除去を自己触媒する。

【0280】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片及びグループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、又はテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレｒＲＮＡからのものである。

【0281】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片及びグループＩ触媒イントロンの５’側半分断片はシアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子からのものであり、３’エクソン断片は第１のアニーリング領域を含み、５’エクソン断片は第２のアニーリング領域を含む。第１のアニーリング領域は、例えば、５～５０、例えば、１０～１５（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）リボヌクレオチドを含んでもよく、第２のアニーリング領域は、例えば、５～５０、例えば、１０～１５（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５）リボヌクレオチドを含んでもよい。

【0282】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片及びグループＩ触媒イントロンの５’側半分断片はテトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレｒＲＮＡからのものであり、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は第１のアニーリング領域を含み、５’エクソン断片は第２のアニーリング領域を含む。一部の実施形態において、３’エクソンは第１のアニーリング領域を含み、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は第２のアニーリング領域を含む。第１のアニーリング領域は、例えば、６～５０、例えば、１０～１６（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６）リボヌクレオチドを含んでもよく、第２のアニーリング領域は、例えば、６～５０、例えば、１０～１６（例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６）リボヌクレオチドを含んでもよい。

【0283】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片及びグループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は、シアノバクテリアアナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）プレｔＲＮＡ－Ｌｅｕ遺伝子、テトラヒメナ属（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）プレｒＲＮＡ、又はＴ４ファージｔｄ遺伝子からのものである。

【0284】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片及びグループＩ触媒イントロン断片５’側は、Ｔ４ファージｔｄ遺伝子からのものである。３’エクソン断片は第１のアニーリング領域を含んでもよく、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は第２のアニーリング領域を含んでもよい。第１のアニーリング領域は、例えば、２～１６、例えば、１０～１６（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６）リボヌクレオチドを含んでもよく、第２のアニーリング領域は、例えば、２～１６、例えば、１０～１６（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６）リボヌクレオチドを含んでもよい。

【0285】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は、線状ポリヌクレオチドの５’末端である。

【0286】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は、線状ポリリボヌクレオチドの３’末端である。

【0287】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は、

【化17】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0288】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は、

【化18】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0289】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は配列番号９７の配列を有し、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は配列番号９８の配列を有する。

【0290】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は、

【化19】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0291】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は、

【化20】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0292】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は配列番号９９の配列を有し、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は配列番号１００の配列を有する。

【0293】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は、

【化21】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0294】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は、

【化22】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0295】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は配列番号１０１の配列を有し、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は配列番号１０２の配列を有する。

【0296】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は、

【化23】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0297】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は、

【化24】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0298】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は配列番号１０３の配列を有し、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は配列番号１０４の配列を有する。

【0299】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は、

【化25】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0300】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は、

【化26】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0301】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は配列番号１０５の配列を有し、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は配列番号１０６の配列を有する。

【0302】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は、

【化27】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0303】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は、

【化28】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0304】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は配列番号１０７の配列を有し、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は配列番号１０８の配列を有する。

【0305】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は、

【化29】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0306】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は、

【化30】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0307】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は配列番号１０９の配列を有し、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は配列番号１１０の配列を有する。

【0308】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は、

【化31】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0309】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は、

【化32】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0310】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は配列番号１１１の配列を有し、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は配列番号１１２の配列を有する。

【0311】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は、

【化33】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0312】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は、

【化34】

の配列と少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、又は１００％）の配列同一性を有する。

【0313】

一部の実施形態において、グループＩ触媒イントロンの３’側半分断片は配列番号１１３の配列を有し、グループＩ触媒イントロンの５’側半分断片は配列番号１１４の配列を有する。

【0314】

別の例において、線状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドの５’末端及び３’末端にあるか、その近傍にあるか、又はそれに連結した原子間、分子表面間の引力を生じさせる非核酸部分によって環化又はコンカテマー化されてもよい。１つ以上の線状ポリリボヌクレオチドは、分子間力又は分子内力によって環化又はコンカテマー化されてもよい。分子間力の非限定的な例としては、双極子間力、双極子－誘起双極子力、誘起双極子－誘起双極子力、ファンデルワールス力、及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非限定的な例としては、共有結合、金属結合、イオン結合、共鳴結合、アグノスティック結合（ａｇｎｏｓｔｉｃ ｂｏｎｄ）、双極子結合、共役、超共役及び反結合が挙げられる。

【0315】

別の例において、線状ポリリボヌクレオチドは、５’末端近傍及び３’末端近傍にリボザイムＲＮＡ配列を含み得る。リボザイムＲＮＡ配列は、配列がリボザイムの残りの部分に露出しているとき、ペプチドに共有結合的に連結し得る。５’末端及び３’末端近傍でリボザイムＲＮＡ配列に共有結合的に連結したペプチドが互いに会合し、それによって線状ポリリボヌクレオチドの環化又はコンカテマー化が起こり得る。別の例において、５’末端及び３’末端近傍でリボザイムＲＮＡに共有結合的に連結したペプチドは、限定はされないがタンパク質ライゲーションなど、当該技術分野において公知の様々な方法を用いてライゲーションに供された後、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡの環化又はコンカテマー化を引き起こし得る。本発明の線状一次構築物若しくは線状ポリリボヌクレオチドにおける使用のためのリボザイムの非限定的な例又はペプチドを取り込む若しくは共有結合的に連結する方法の網羅的でない一覧については、米国特許出願公開第２００３００８２７６８号明細書（この内容は、本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。

【0316】

さらに別の例において、化学的環化方法を用いて環状ポリリボヌクレオチドを作成してもよい。かかる方法としては、限定はされないが、クリック化学（例えば、アルキン及びアジドベースの方法、又はクリック反応性塩基）、オレフィンメタセシス、ホスホルアミデートライゲーション、ヘミアミナール－イミン架橋、塩基修飾、及びこれらの任意の組み合わせが挙げることができる。

【0317】

別の例において、環状ポリリボヌクレオチドは、無細胞システムで（例えば、インビトロ転写により）転写されるデオキシリボヌクレオチド鋳型を使用して線状ＲＮＡを作製することにより作製し得る。この線状ポリリボヌクレオチドがスプライシング適合性ポリリボヌクレオチドを産生し、これが自己スプライシングすることにより環状ポリリボヌクレオチドが作製され得る。

【0318】

一部の実施形態において、本開示は、線状ポリリボヌクレオチドを提供すること；及び線状ポリリボヌクレオチドの３’及び５’スプライス部位のスプライシングに好適な条件下で線状ポリリボヌクレオチドを自己スプライシングすることであって；それによって環状ポリリボヌクレオチドを作製することにより環状ポリリボヌクレオチドを（例えば、無細胞システムにおいて）作製する方法を提供する。

【0319】

一部の実施形態において、本開示は、線状ポリリボヌクレオチドをコードするデオキシリボヌクレオチドを提供すること；無細胞システムにおいてデオキシリボヌクレオチドを転写して線状ポリリボヌクレオチドを作製すること；任意選択でスプライシング適合性の線状ポリリボヌクレオチドを精製すること；及び線状ポリリボヌクレオチドの３’及び５’スプライス部位のスプライシングに好適な条件下で線状ポリリボヌクレオチドを自己スプライシングすることであって、それによって環状ポリリボヌクレオチドを作製することにより環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法を提供する。

【0320】

一部の実施形態において、本開示は、線状ポリリボヌクレオチドをコードするデオキシリボヌクレオチドを提供すること；無細胞システムにおいてデオキシリボヌクレオチドを転写して線状ポリリボヌクレオチドを作製することにおいて、転写が、線状ポリリボヌクレオチドの３’及び５’スプライス部位のスプライシングに好適な条件下で溶液中で行われることであって、それによって環状ポリリボヌクレオチドを作製することにより環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法を提供する。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドは、５’スプリット－イントロン及び３’スプリット－イントロン（例えば、環状ポリリボヌクレオチドの作製用の自己スプライシング構築物）を含む。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドは、５’アニーリング領域と３’アニーリング領域とを含む。

【0321】

インビトロ転写及び／又は自己スプライシングに好適な条件は、１つ以上の点で生理的条件を模倣する任意の条件（例えば、水性緩衝液又は溶液など、溶液又は緩衝液）を含み得る。一部の実施形態において、好適な条件としては、０．１～１００ｍＭ Ｍｇ２＋イオン又はその塩（例えば、１～１００ｍＭ、１～５０ｍＭ、１～２０ｍＭ、５～５０ｍＭ、５～２０ｍＭ、又は５～１５ｍＭ）が挙げられる。一部の実施形態において、好適な条件としては、１～１０００ｍＭ Ｋ＋イオン又はＫＣｌなど、その塩（例えば、１～１０００ｍＭ、１～５００ｍＭ、１～２００ｍＭ、５０～５００ｍＭ、１００～５００ｍＭ、又は１００～３００ｍＭ）が挙げられる。一部の実施形態において、好適な条件としては、１～１０００ｍＭ Ｃｌ－イオン又はＫＣｌなど、その塩（例えば、１～１０００ｍＭ、１～５００ｍＭ、１～２００ｍＭ、５０～５００ｍＭ、１００～５００ｍＭ、又は１００～３００ｍＭ）が挙げられる。一部の実施形態において、好適な条件としては、０．１～１００ｍＭ Ｍｎ２＋イオン又はＭｎＣｌ２など、その塩（例えば、０．１～１００ｍＭ、０．１～５０ｍＭ、０．１～２０ｍＭ、０．１～１０ｍＭ、０．１～５ｍＭ、０．１～２ｍＭ、０．５～５０ｍＭ、０．５～２０ｍＭ、０．５～１５ｍＭ、０．５～５ｍＭ、０．５～２ｍＭ、又は０．１～１０ｍＭ）が挙げられる。一部の実施形態において、好適な条件としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（例えば、１～１０００μＭ、１～５００μＭ、１～２００μＭ、５０～５００μＭ、１００～５００μＭ、１００～３００μＭ、０．１～１００ｍＭ、０．１～５０ｍＭ、０．１～２０ｍＭ、０．１～１０ｍＭ、０．１～５ｍＭ、０．１～２ｍＭ、０．５～５０ｍＭ、０．５～２０ｍＭ、０．５～１５ｍＭ、０．５～５ｍＭ、０．５～２ｍＭ、又は０．１～１０ｍＭ）が挙げられる。一部の実施形態において、好適な条件としては、０．１ｍＭ～１００ｍＭリボヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）（例えば、０．１～１００ｍＭ、０．１～５０ｍＭ、０．１～１０ｍＭ、１～１００ｍＭ、１～５０ｍＭ、又は１～１０ｍＭ）が挙げられる。一部の実施形態において、好適な条件としては、４～１０のｐＨ（例えば、５～９のｐＨ、６～９のｐＨ、又は６．５～８．５のｐＨ）が挙げられる。一部の実施形態において、好適な条件としては、４℃～５０℃の温度（例えば、１０℃～４０℃、１５℃～４０℃、２０℃～４０℃、又は３０℃～４０℃）が挙げられる、

【0322】

一部の実施形態において線状ポリリボヌクレオチドは、デオキシリボ核酸、例えば、本明細書に記載されるデオキシリボ核酸、例えば、ＤＮＡベクター、線状化ＤＮＡベクター、又はｃＤＮＡなどから作製される。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドは、デオキシリボ核酸から無細胞システムにおける転写（例えば、インビトロ転写）によって転写される。

【0323】

別の例において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞、例えば、原核細胞又は真核細胞で作製されてもよい。一部の実施形態において、細胞に、外因性ポリリボヌクレオチド（例えば、本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチド又は本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチドの転写をコードするＤＮＡ分子）が提供される。線状ポリリボヌクレオチドは、細胞において、細胞に提供された外因性ＤＮＡ分子から転写されてもよい。線状ポリリボヌクレオチドは、細胞において、細胞に一過性に提供された外因性組換えＤＮＡ分子から転写されてもよい。一部の実施形態において、外因性ＤＮＡ分子は、細胞のゲノムに組み込まれない。一部の実施形態において、線状ポリリボヌクレオチドは、細胞において、細胞のゲノムに組み込まれた組換えＤＮＡ分子から転写される。

【0324】

一部の実施形態において、細胞は原核細胞である。一部の実施形態において、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドを含む原核細胞は、細菌細胞又は古細菌細胞であってもよい。例えば、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドを含む原核細胞は、大腸菌（Ｅ ｃｏｌｉ）、好塩性古細菌（例えば、ハロフェラックス・ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉｉ））、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、シアノバクテリア類（例えば、シネココッカス・エロンガツス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、スピルリナ属種（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｓｐｐ．）（アルスロスピラ属種（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．）、及びシネコシスティス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐｐ．））、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、放線菌類（例えば、ノノムラエア属（Ｎｏｎｏｍｕｒａｅａ）、キタサトスポラ属（Ｋｉｔａｓａｔｏｓｐｏｒａ）、又はサーモビフィダ属（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ））、バチルス属種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）（例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ））、ベータプロテオバクテリア（例えば、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ））、アルファプロテオバクテリア（例えば、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ））、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ））、及び腸内細菌であってもよい。原核細胞は培養培地で成長させてもよい。原核細胞は、バイオリアクターに入れてもよい。

【0325】

細胞は真核細胞であってもよい。一部の実施形態において、真核細胞は、単細胞真核細胞である。一部の実施形態において、単細胞真核生物は、酵母細胞（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び他のサッカロマイセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、ブレタノマイセス属種（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、シゾサッカロマイセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）、トルラスポラ属種（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｓｐｐ）、及びピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｐ．））などの単細胞真菌細胞である。一部の実施形態において、単細胞真核細胞は、単細胞動物細胞である。単細胞動物細胞は、多細胞動物から単離して培養下で成長させた細胞であってもよい。一部の実施形態において、単細胞動物細胞は、脱分化型であってもよい。一部の実施形態において、単細胞真核細胞は、単細胞植物細胞である。単細胞植物細胞は、多細胞植物から単離して培養下で成長させた細胞、又はその娘細胞であってもよい。一部の実施形態において、単細胞植物細胞は、脱分化型であってもよい。一部の実施形態において、単細胞植物細胞は、植物カルスからのものである。実施形態において、単細胞の細胞は、植物細胞プロトプラストである。一部の実施形態において、単細胞真核細胞は、単細胞緑藻、珪藻、ユーグレナ藻、又は渦鞭毛藻など、単細胞真核藻類細胞である。目的の単細胞真核藻類の非限定的な例としては、ドゥナリエラ・サリナ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ ｓａｌｉｎａ）、クロレラ・ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ・ゾフィンギエンシス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｚｏｆｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ヘマトコッカス・プルビアリス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｌｕｖｉａｌｉｓ）、ネオクロリス・オレオアバンダンス（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｏｌｅｏａｂｕｎｄａｎｓ）及び他のネオクロリス属種（Ｎｅｏｃｈｌｏｒｉｓ ｓｐｐ．）、プロトシフォン・ボトリオイデス（Ｐｒｏｔｏｓｉｐｈｏｎ ｂｏｔｒｙｏｉｄｅｓ）、ボトリオコッカス・ブラウニイ（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、クリプトコッカス属種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、コナミドリムシ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）及び他のコナミドリムシ属種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）が挙げられる。一部の実施形態において、単細胞真核細胞は、原生生物細胞である。一部の実施形態において、単細胞真核細胞は、原虫細胞である。

【0326】

一部の実施形態において、真核細胞は、多細胞真核生物の細胞である。例えば、多細胞真核生物は、脊椎動物、無脊椎動物、多細胞真菌、多細胞藻類、及び多細胞植物からなる群から選択されてもよい。一部の実施形態において、真核生物は、ヒトである。一部の実施形態において、真核生物は、非ヒト脊椎動物である。一部の実施形態において、真核生物は、無脊椎動物である。一部の実施形態において、真核生物は、多細胞真菌である。一部の実施形態において、真核生物は、多細胞植物である。実施形態において、真核細胞は、ヒトの細胞又は非ヒト哺乳類、例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル、類人猿）、有蹄類（例えば、ウシ、スイギュウ、バイソン、ヒツジ、ヤギ、及びジャコウウシを含めたウシ科動物；ブタ；ラクダ、ラマ、及びアルパカを含めたラクダ科動物；シカ、アンテロープ；並びにウマ及びロバを含めたウマ科動物）、肉食動物（例えば、イヌ、ネコ）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、リス）、又はウサギ類（例えば、ウサギ、ノウサギ）の細胞である。実施形態において、真核細胞は、トリ、例えば鳥類の分類群であるキジ目（Ｇａｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、キジ、ウズラ）、ガンカモ目（Ａｎｓｅｒｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、アヒル、ガチョウ）、古顎下綱（Ｐａｌｅａｏｇｎａｔｈａｅ）（例えば、ダチョウ、エミュー）、ハト目（Ｃｏｌｕｍｂｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、ハト（ｐｉｇｅｏｎ）、ハト（ｄｏｖｅ））、又はオウム目（Ｐｓｉｔｔａｃｉｆｏｒｍｅｓ）（例えば、オウム）のメンバーの細胞である。実施形態において、真核細胞は、節足動物（例えば、昆虫、クモ類、甲殻類）、線虫、環形動物、蠕虫、又は軟体動物の細胞である。実施形態において、真核細胞は、多細胞植物、例えば、被子植物（これは双子葉類又は単子葉類であってもよい）又は裸子植物（例えば、針葉樹、ソテツ、マオウ、イチョウ）、シダ類、トクサ類、ヒカゲノカズラ類、又はコケ類などの細胞である。実施形態において、真核細胞は、真核多細胞藻類の細胞である。

【0327】

真核細胞は培養培地で成長させてもよい。真核細胞はバイオリアクターに入れてもよい。

【0328】

バイオリアクターの例としては、限定なしに、撹拌槽型（例えば、十分に混合される）バイオリアクター及び管型（例えば、栓流）バイオリアクター、エアリフト型バイオリアクター、膜撹拌槽、スピンフィルタ撹拌槽、振動ミキサー、流動床反応器、及び膜型バイオリアクターが挙げられる。バイオリアクターの運転モードは、バッチプロセス又は連続プロセスであり得る。試薬及び生成物の流れが連続的に供給され、システムから抜き取られるとき、バイオリアクターは連続である。バッチバイオリアクターは、連続した再循環流を有するが、試薬の供給又は産物回収は連続でないものであり得る。本開示の一部の方法は、環状ポリリボヌクレオチドの大規模生産に関する。大規模生産方法には、本方法が１リットル（Ｌ）～５０Ｌ、又はそれ以上の（例えば、５Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、３５Ｌ、４０Ｌ、４５Ｌ、５０Ｌ、又はそれ以上の）容積で実施されてもよい。一部の実施形態において、本方法は、５Ｌ～１０Ｌ、５Ｌ～１５Ｌ、５Ｌ～２０Ｌ、５Ｌ～２５Ｌ、５Ｌ～３０Ｌ、５Ｌ～３５Ｌ、５Ｌ～４０Ｌ、５Ｌ～４５Ｌ、１０Ｌ～１５Ｌ、１０Ｌ～２０Ｌ、１０Ｌ～２５Ｌ、２０Ｌ～３０Ｌ、１０Ｌ～３５Ｌ、１０Ｌ～４０Ｌ、１０Ｌ～４５Ｌ、１０Ｌ～５０Ｌ、１５Ｌ～２０Ｌ、１５Ｌ～２５Ｌ、１５Ｌ～３０Ｌ、１５Ｌ～３５Ｌ、１５Ｌ～４０Ｌ、１５Ｌ～４５Ｌ、又は１５～５０Ｌの容積で実施されてもよい。一部の実施形態において、バイオリアクターは少なくとも１ｇの環状ＲＮＡを生産し得る。一部の実施形態において、バイオリアクターは１～２００ｇの環状ＲＮＡ（例えば、１～１０ｇ、１～２０ｇ、１～５０ｇ、１０～５０ｇ、１０～１００ｇ、５０～１００ｇ、５０～２００ｇの環状ＲＮＡ）を生産し得る。一部の実施形態において、生産量は、１リットル当たり（例えば、１リットル当たり１～２００ｇ）、１回のバッチ又は反応当たり（例えば、１回のバッチ又は反応当たり１～２００ｇ）、又は単位時間当たり（例えば、１時間当たり又は１日当たり１～２００ｇ）で測定される。一部の実施形態において、生産能力を増加させるため、２つ以上のバイオリアクターを直列に接続して利用し得る（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９機のバイオリアクターを直列に接続して使用し得る）。

【0329】

本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの作成方法については、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ ＆ Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（２００２）；ｉｎ Ｚｈａｏ，ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＢＩＯＬＯＧＹ：ＴＯＯＬＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇｌｉ ＆ Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＡＮＤ ＢＩＯＬＯＧＹ ＯＦ ＡＲＴＩＦＩＣＩＡＬ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤＳ，（Ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。

【0330】

環状ポリリボヌクレオチドを合成する様々な方法はまた、他にも記載されている（例えば、米国特許第６２１０９３１号明細書、米国特許第５７７３２４４号明細書、米国特許第５７６６９０３号明細書、米国特許第５７１２１２８号明細書、米国特許第５４２６１８０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１３７４０７号明細書、国際公開第１９９２００１８１３号パンフレット、国際公開第２０１００８４３７１号パンフレット、及びＰｅｔｋｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４３：２４５４－６５（２０１５）を参照のこと；これらの各々の内容は、本明細書において全体として参照により援用される）。

【0331】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、精製され、例えば、遊離リボ核酸、線状又はニックＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質などは、除去される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、当該技術分野で一般に用いられる任意の公知の方法によって精製されてもよい。非限定的な精製方法の例として、カラムクロマトグラフィー、ゲル切除、サイズ排除などが挙げられる。

【0332】

免疫化
一部の実施形態において、本開示の方法は、本明細書に開示されるとおりの環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物で対象を免疫化することを含む。一部の実施形態において、免疫原は環状ポリリボヌクレオチドから発現する。一部の実施形態において、免疫化により、環状ポリリボヌクレオチドから発現する免疫原に対する免疫応答が対象に誘導される。一部の実施形態において、免疫化により、対象に免疫応答が誘導される（例えば、環状ポリリボヌクレオチドから発現する免疫原に結合する抗体の産生が誘導される）。一部の実施形態において、免疫化は、対象（例えば、ヒト対象）の疾患、障害、又は病態を治療又は予防することを目的とする。一部の実施形態において、免疫化は、対象において抗体を産生させること（例えば、非ヒト哺乳類の場合にあるような、精製するための抗体を産生させること）を目的とする。一部の実施形態において、免疫原性組成物は、環状ポリリボヌクレオチドと、希釈剤、担体、第１のアジュバント又はこれらの組み合わせとを単一の組成物中に含む。一部の実施形態において、対象は、第２のアジュバントでさらに免疫化される。一部の実施形態において、対象は、第２の免疫原性組成物でさらに免疫化される。

【0333】

対象は、任意の数の環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。対象は、例えば、少なくとも１個の環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。対象は、例えば、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０個の異なる環状ポリリボヌクレオチド、又はそれ以上の異なる環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。一部の実施形態において、対象は、多くても１個の環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。一部の実施形態において、対象は、約１個の環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。一部の実施形態において、対象は、約１～２０、１～１５、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～２０、２～１５、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～２０、３～１５、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～２０、４～１５、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、４～４、４～３、５～２０、５～１５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、５～１０、１０～１５、又は１５～２０個の異なる環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で免疫化される。異なる環状ポリリボヌクレオチドは、互いに異なる配列を有する。例えば、それらは、異なる免疫原、重複する免疫原、類似した免疫原、又は同じ免疫原（例えば、同じ又は異なる調節エレメント、開始配列、プロモーター、終結エレメント、又は本開示の他のエレメントを有する）を含むか、又はそれをコードすることができる。２つ以上の異なる環状ポリリボヌクレオチドを含む１つ以上の免疫原性組成物で対象が免疫化される場合には、それらの２つ以上の異なる環状ポリリボヌクレオチドは、同じ又は異なる免疫原性組成物中にあり、同じ時点又は異なる時点で免疫化することができる。２つ以上の異なる環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物は、同じ解剖学的位置又は異なる解剖学的位置に投与することができる。

【0334】

一部の実施形態において、免疫原性組成物は、環状ポリリボヌクレオチドと、希釈剤、担体、第１のアジュバント、又はこれらの組み合わせとを含む。詳細な実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドと、担体又はいかなる担体も含有しない希釈剤とを含む。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドをいかなる担体も含有しない希釈剤と共に含む免疫原性組成物は、対象への環状ポリリボヌクレオチドのネイキッド送達に使用される。別の詳細な実施形態において、免疫原性組成物は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドと第１のアジュバントとを含む。

【0335】

特定の実施形態において、対象にはさらに第２のアジュバントが投与される。アジュバントは自然免疫応答を亢進させ、ひいては、対象の適応免疫応答を亢進させる。アジュバントは、以下で考察するとおりの任意のアジュバントであってよい。特定の実施形態において、アジュバントは、免疫原性組成物の一部として環状ポリリボヌクレオチドと共に製剤化される。特定の実施形態において、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の一部ではない。特定の実施形態において、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物と別個に投与される。この態様において、アジュバントは、対象に環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物と共投与されるか（例えば、同時に投与される）、又は異なる時点で投与される。例えば、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、又は２４時間後、又はこれらの間のいずれかの分数後若しくは時間数後に投与される。一部の実施形態において、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の１分前、５分前、１０分前、１５分前、３０分前、４５分前、６０分前、９０分前、２時間前、３時間前、４時間前、５時間前、６時間前、７時間前、８時間前、９時間前、１０時間前、１２時間前、１４時間前、１６時間前、１８時間前、２０時間前、２２時間前、又は２４時間前、又はこれらの間のいずれかの分数前若しくは時間数前に投与される。例えば、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、又は８４日後、又はこれらの間のいずれかの日数後に投与される。一部の実施形態において、アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、又は８４日前、又はこれらの間のいずれかの日数前に投与される。アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物と同じ解剖学的位置又は異なる解剖学的位置に投与される。

【0336】

一部の実施形態において、対象は、第２の薬剤、例えば、環状ポリリボヌクレオチドでないワクチン（以下に記載するとおり）でさらに免疫化される。このワクチンは、対象に環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物と共投与されるか（例えば、同時に投与される）、又は異なる時点で投与される。例えば、ワクチンは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の１分後、５分後、１０分後、１５分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後、２時間後、３時間後、４時間後、５時間後、６時間後、７時間後、８時間後、９時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、２２時間後、又は２４時間後、又はこれらの間のいずれかの分数後若しくは時間数後に投与される。一部の実施形態において、ワクチンは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の１分前、５分前、１０分前、１５分前、３０分前、４５分前、６０分前、９０分前、２時間前、３時間前、４時間前、５時間前、６時間前、７時間前、８時間前、９時間前、１０時間前、１２時間前、１４時間前、１６時間前、１８時間前、２０時間前、２２時間前、又は２４時間前、又はこれらの間のいずれかの分数前若しくは時間数前に投与される。例えば、ワクチンは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、又は８４日後、又はこれらの間のいずれかの日数後に投与される。一部の実施形態において、ワクチンは、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物の１、２、３、４、５、６、７、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、又は８４日前、又はこれらの間のいずれかの日数前に投与される。

【0337】

対象は、免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせで、所望の応答を実現するのに好適な任意の回数免疫化されてもよい。例えば、プライム－ブースト免疫化戦略を利用して、全身免疫及び／又は粘膜免疫を引き出すことができる。対象は、本開示の免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせで、例えば、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、又は少なくとも１５回、又はそれより多く免疫化されてもよい。

【0338】

一部の実施形態において、対象は、本開示の免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせで多くても２回、多くても３回、多くても４回、多くても５回、多くても６回、多くても７回、多くても８回、多くても９回、多くても１０回、多くても１５回、又は多くても２０回、又はそれより少なく免疫化されてもよい。

【0339】

一部の実施形態において、対象は、本開示の免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせで約１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、又は２０回免疫化されてもよい。

【0340】

一部の実施形態において、対象は、本開示の免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせで１回免疫化されてもよい。一部の実施形態において、対象は、本開示の免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせで２回免疫化されてもよい。一部の実施形態において、対象は、本開示の免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせで３回免疫化されてもよい。一部の実施形態において、対象は、本開示の免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせで４回免疫化されてもよい。一部の実施形態において、対象は、本開示の免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせで５回免疫化されてもよい。一部の実施形態において、対象は、本開示の免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせで７回免疫化されてもよい。

【0341】

２回以上の免疫化の間を空けるのに好適な時間間隔を選択することができる。時間間隔は、同じ免疫原性組成物、アジュバント、又はワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせによる複数回の免疫化に適用することができ、例えば、同じ免疫原性組成物、アジュバント、又はワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせを同じ量で、又は異なる量で、同じ免疫化経路によるか、又は異なる免疫化経路によって投与することができる。時間間隔は、異なる免疫原性組成物、アジュバント、又はワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせによる複数回の免疫化に適用することができ、例えば、異なる免疫原性組成物、アジュバント、又はワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせを同じ量で、又は異なる量で、同じ免疫化経路によるか、又は異なる免疫化経路によって投与することができる。時間間隔は、異なる薬剤、例えば、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の免疫原性組成物及び第２の環状ポリリボヌクレオチドを含む第２の免疫原性組成物による免疫化に適用することができる。時間間隔は、異なる薬剤、例えば、第１の環状ポリリボヌクレオチドを含む第１の免疫原性組成物及びタンパク質免疫原（例えば、タンパク質サブユニット）を含む第２の免疫原性組成物による免疫化に適用することができる。一部の例において、２回の免疫化の間には、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１７、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６時間、４０時間、４８時間、又は７２時間が経過する。一部の実施形態において、２回の免疫化の間には、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１６、１７、１８、２０、２１日、２４日、２８日、又は３０日が経過する。一部の実施形態において、２回の免疫化の間には、約１、２、３、４、５週間、６週間、７週間、又は８週間が経過する。一部の実施形態において、２回の免疫化の間には、約１、２、３、４、５ヵ月、６ヵ月、７ヵ月、又は８ヵ月が経過する。

【0342】

一部の実施形態において、２回の免疫化の間には、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２４、少なくとも３６、又は少なくとも７２時間、又はそれ以上が経過する。一部の実施形態において、２回の免疫化の間には、多くても１、多くても２、多くても３、多くても４、多くても５、多くても６、多くても７、多くても８、多くても９、多くても１０、多くても１５、多くても２０、多くても２４、多くても３６、又は多くても７２時間、又はそれ未満が経過する。

【0343】

一部の実施形態において、２回の免疫化の間には、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６ 少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、又は少なくとも３０日、又はそれ以上が経過する。一部の実施形態において、２回の免疫化の間には、多くても２、多くても３、多くても４、多くても５、多くても６、多くても７、多くても８、多くても９、多くても１０、多くても１５、多くても２０、多くても２１、多くても２２、多くても２３、多くても２４、多くても２５、多くても２６、多くても２７、多くても２８、多くても２９、多くても３０、多くても３２、多くても３４、又は多くても３６日、又はそれ未満が経過する。

【0344】

一部の実施形態において、２回の免疫化の間には、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、又は少なくとも８週間、又はそれ以上が経過する。一部の実施形態において、２回の免疫化の間には、多くても２、多くても３、多くても４、多くても５、多くても６、多くても７、多くても８週間、又はそれ未満が経過する。

【0345】

一部の実施形態において、２回の免疫化の間には、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、又は少なくとも８ヵ月、又はそれ以上が経過する。一部の実施形態において、２回の免疫化の間には、多くても２、多くても３、多くても４、多くても５、多くても６、多くても７、多くても８ヵ月、多くても９ヵ月、多くても１０ヵ月、多くても１１ヵ月、又は多くても１２ヵ月又はそれ未満が経過する。

【0346】

一部の実施形態において、本方法は、免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫原性応答を改善するため、対象に薬剤を前投与することを含む。一部の実施形態において、この薬剤は、本明細書に開示されるとおりの免疫原（例えば、タンパク質免疫原）である。例えば、本方法は、タンパク質免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを投与する１～７日前にタンパク質免疫原を投与することを含む。一部の実施形態において、タンパク質免疫原は、タンパク質免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを投与する１、２、３、４、５、６、又は７日前に投与される。タンパク質免疫原は、タンパク質調製物として投与される、プラスミド（ｐＤＮＡ）にコードされる、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）の体裁にされる、脂質ナノ粒子に製剤化されるなどであってもよい。

【0347】

一部の実施形態において、本方法は、免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドが対象に投与された後の免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫原性応答を改善するため、対象に薬剤を投与することを含む。一部の実施形態において、この薬剤は、本明細書に開示されるとおりの免疫原（例えば、タンパク質免疫原）である。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質免疫原をコードする配列を含む。例えば、本方法は、免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象に投与してから１年以内に（例えば、１１ヵ月、１０ヵ月、９ヵ月、８ヵ月、７ヵ月、６ヵ月、５ヵ月、４ヵ月、３ヵ月、２ヵ月、及び１ヵ月以内に）タンパク質免疫原を投与することを含む。一部の実施形態において、本方法は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドのいずれか１つ又は本明細書に記載される免疫原性組成物のいずれか１つ及びタンパク質サブユニットを対象に投与することを含む。

【0348】

一部の実施形態において、タンパク質免疫原は、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる免疫原と同じアミノ酸配列を有する。例えば、ポリペプチド免疫原は、環状ポリリボヌクレオチドの配列によってコードされるポリペプチド免疫原とのアミノ酸配列同一性に対応し得る（例えば、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は１００％共有し得る）。一部の実施形態において、タンパク質免疫原は、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる免疫原のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する。例えば、ポリペプチド免疫原は、環状ポリリボヌクレオチドの配列によってコードされるポリペプチド免疫原と９０％未満の（例えば、８０％、７０％、３０％、２０％、又は１０％の）アミノ酸配列同一性を共有し得る。

【0349】

対象は、免疫原性組成物、アジュバント、又はワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせで、任意の好適な数の解剖学的部位に免疫化されてもよい。複数の解剖学的部位に同じ免疫原性組成物、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせを投与することができ、異なる解剖学的部位に同じ又は異なる環状ポリリボヌクレオチド、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）又はこれらの組み合わせを含む異なる免疫原性組成物を投与することができ、同じ解剖学的部位に同じ又は異なる環状ポリリボヌクレオチド、アジュバント、ワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）又はこれらの組み合わせを含む異なる免疫原性組成物を投与することができ、又はこれらの任意の組み合わせであってもよい。例えば、環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物を２つの異なる解剖学的部位に投与することができ、及び／又は環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物を１つの解剖学的部位に投与することができ、及びアジュバントを異なる解剖学的部位に投与することができる。

【0350】

任意の２つ以上の解剖学的経路における免疫化は、同じ免疫化経路（例えば、筋肉内）を経てもよく、又は２つ以上の免疫化経路によってもよい。一部の実施形態において、本開示の環状ポリリボヌクレオチド、アジュバント、又はワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせを含む免疫原性組成物は、対象の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、又は少なくとも６箇所の解剖学的部位に免疫される。一部の実施形態において、本開示の環状ポリリボヌクレオチド、アジュバント、又はワクチン（例えば、タンパク質サブユニットワクチン）、又はこれらの組み合わせを含む免疫原性組成物は、対象の多くても２、多くても３、多くても４、多くても５、多くても６、多くても７、多くても８、多くても９、又は多くても１０箇所の解剖学的部位に、又はそれより少ない箇所に免疫される。一部の実施形態において、本開示の環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物は、又はアジュバントは、対象の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０箇所の解剖学的部位に免疫される。

【0351】

免疫化は、任意の好適な経路によることができる。免疫化経路の非限定的な例としては、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜上、胸骨内、脳内、眼内、病巣内、脳室内、大槽内、又は実質内への、例えば、注射及び注入が挙げられる。ある場合には、免疫化は、吸入によることができる。２回以上の免疫化は、同じ経路によるか、又は異なる経路によって行うことができる。

【0352】

本開示の対象には、任意の好適な量の環状ポリリボヌクレオチドを投与することができる。例えば、対象は、少なくとも約１ｎｇ、少なくとも約１０ｎｇ、少なくとも約１００ｎｇ、少なくとも約１μｇ、少なくとも約１０μｇ、少なくとも約、少なくとも約１００μｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、又は少なくとも約１ｇの環状ポリリボヌクレオチドで免疫化されてもよい。一部の実施形態において、対象は、多くても約１ｎｇ、多くても約１０ｎｇ、多くても約１００ｎｇ、多くても約１μｇ、多くても約１０μｇ、多くても約、多くても約１００μｇ、多くても約１ｍｇ、多くても約１０ｍｇ、多くても約１００ｍｇ、又は多くても約１ｇの環状ポリリボヌクレオチドで免疫化されてもよい。一部の実施形態において、対象は、約１ｎｇ、約１０ｎｇ、約１００ｎｇ、約１μｇ、約１０μｇ、約、約１００μｇ、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、約１００ｍｇ、又は約１ｇの環状ポリリボヌクレオチドで免疫化されてもよい。

【0353】

一部の実施形態において、本方法は、対象を免疫原に対する抗体応答に関して評価することをさらに含む。一部の実施形態において、評価は、免疫原をコードする配列を含む環状ポリリボヌクレオチドの投与前及び／又は投与後である。

【0354】

抗体の産生及び精製
本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、多量体化ドメインを含む免疫原をコードするポリリボヌクレオチド）で対象を免疫化すると、対象において、環状ポリリボヌクレオチドから発現する免疫原に結合する抗体の産生が誘導される（例えば、抗体が作製される）ことになり得る。一部の実施形態において、免疫化は、対象（例えば、ヒト又は非ヒト動物）における抗体の産生を目的とし、この抗体は対象から（例えば、診断又は治療使用のため）定量化又は精製される。このように、本発明の環状ポリリボヌクレオチドは、ポリクローナル又はモノクローナル抗体（例えば、ポリクローナル又はモノクローナル抗体）の産生方法において使用し得る。

【0355】

例えば、本開示は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド（例えば、多量体化ドメインを含む免疫原をコードする）を非ヒト動物（例えば、ヤギ、ブタ、ウサギ、ラット、マウス、ラマ、ラクダ、ウマ、ロバ、又はウシ（乳牛）などの非ヒト哺乳類）に投与することを提供する。環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載される任意の組成物、製剤、経路又は投与、量、又は用量投与レジメンに従い（例えば、任意選択で、同じ組成物で又は用量投与レジメンの一環として投与されるアジュバントと共に）投与されてもよい。一部の実施形態において、非ヒト動物は、ヒト化された免疫系を有する（例えば、ヒト化された免疫系を有するウシ）。

【0356】

環状ポリリボヌクレオチドで免疫化された対象から、本明細書に開示されるとおりの環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物から産生されるポリクローナル抗体を含む血漿を収集することができる。こうしたポリクローナル抗体は、定量化（例えば、ヒト対象における診断目的で）又は精製（例えば、治療方法における使用のため又はモノクローナル抗体の開発のため）することができる。血漿は、当業者に公知の方法により、例えば、プラスマフェレーシスで収集することができる。血漿は、同じ対象から１回又は複数回、例えば、各々免疫化から所与の期間後に複数回、免疫化後複数回、免疫化の間に複数回、又はこれらの任意の組み合わせで収集することができる。

【0357】

本明細書に記載される方法によれば、多量体化ドメインを含む免疫原に特異的に結合する抗体、又はその断片（例えば、ヒト又はヒト化ポリクローナル抗体など、ポリクローナル抗体）が産生され得る。抗体、又はその断片は、血液から（例えば、血漿又は血清から）当業者に公知の方法により精製されてもよい。

【0358】

ポリクローナル抗体は、血漿から当業者に周知の技法を用いて精製し得る。例えば、血漿のｐＨを４．８に調整し（例えば、２０％酢酸を滴下して加えることによる）、カプリル酸により１．０のカプリル酸／全タンパク質比で分画し、次に遠心（例えば、室温にて１０，０００ｇで２０分間）により清澄化する。ポリクローナル抗体（例えば、ＩｇＧポリクローナル抗体）を含有する上清を１ＭトリスでｐＨ７．５に中和し、０．２２μＭフィルタでろ過し、抗ヒト免疫グロブリン特異的カラム（例えば、抗ヒトＩｇＧ軽鎖特異的カラム）でアフィニティー精製する。ポリクローナル抗体は、不純物、例えば、非ヒト動物からの非ヒト抗体に特異的に結合するアフィニティーカラムに通すことによりさらに精製する。このポリクローナル抗体を好適な緩衝液、例えば、１０ｍＭグルタミン酸モノナトリウム塩、２６２ｍＭ Ｄ－ソルビトール、及びＴｗｅｅｎ（登録商標）（０．０５ｍｇ／ｍｌ）からなる滅菌ろ過した緩衝液（ｐＨ５．５）に保存する。精製したポリクローナル抗体の分量及び濃度を決定する。ＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーを行うことにより、凝集体又は多量体が存在するかどうかを決定する。一部の実施形態において、ヒトポリクローナル抗体は、Ｂｅｉｇｅｌ，ＪＨ ｅｔ ａｌ．，ＬＡＮＣＥＴ ＩＮＦＥＣＴ．ＤＩＳ．，１８：４１０－１８（２０１８），ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ａｐｐｅｎｄｉｘ（これは全体として参照により本明細書に援用される）に係るヒト化免疫系を有する非ヒト動物から精製される。

【0359】

本開示はまた、例えば、治療的処置及び／又は診断のため、ヒト対象において抗体を産生する方法も提供する。例えば、本開示は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド又は免疫原性組成物の投与後に対象の抗免疫原抗体レベルを定量化する方法を提供する。定量体化は、当該技術分野において公知の方法により（例えば、抗体力価を実施する）、例えば、対象から血液試料を入手し、及び抗免疫原抗体レベルを酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）などの標準的な技法を用いて定量化することにより実施し得る。抗体はまた、当業者に公知の方法により精製されてもよい。

【0360】

アジュバント
アジュバントは、アジュバント及び／又はアジュバントを含む免疫原性組成物の投与を受けた対象に引き出される免疫応答（体液性及び／又は細胞性）を亢進させる。一部の実施形態において、アジュバントは、本明細書に開示されるとおり対象に投与される。一部の実施形態において、アジュバントは、本明細書に記載される方法において、本明細書に記載されるとおり免疫応答を生じさせるために使用される。詳細な実施形態において、アジュバントを使用して、環状ポリリボヌクレオチドから発現する免疫原に対する対象の免疫応答が促進される。一部の実施形態において、アジュバント及びポリリボヌクレオチドは別個の組成物で共投与される。一部の実施形態において、アジュバントはポリリボヌクレオチドと共に単一の組成物に混合又は製剤化され、対象に投与される。一部の実施形態において、アジュバント及び環状ポリリボヌクレオチドは別個の組成物で共投与される。一部の実施形態において、アジュバントを環状ポリリボヌクレオチドと共に単一の組成物に混合又は製剤化することにより、対象に投与される免疫原性組成物が入手される。

【0361】

アジュバントは、環状ポリリボヌクレオチド（例えば、ポリリボヌクレオチド配列）の一成分であってもよく、ポリリボヌクレオチドの発現配列によってコードされるポリペプチドアジュバントであってもよく、ポリリボヌクレオチドによってコードされない分子（例えば、小分子、ポリペプチド、又は核酸分子）であってもよい。アジュバントは、ポリリボヌクレオチドと共に同じ医薬組成物に製剤化されてもよい。アジュバントは、ポリリボヌクレオチドと組み合わせて別個に（例えば、別個の医薬組成物として）投与されてもよい。

【0362】

一部の実施形態において、アジュバントは環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２個以上のアジュバントをコードする。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、２～１００個のアジュバントをコードする。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２～１０個のアジュバントをコードする。一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２個のアジュバントをコードする。環状ポリリボヌクレオチドによってコードされるアジュバントの１つ以上はＮ末端シグナル配列を含んでもよく、例えば、発現したポリペプチドアジュバントが分泌経路に導かれる。一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチドは、３個のアジュバントをコードする。一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチドは、４個のアジュバントをコードする。一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチドは、５個のアジュバントをコードする。一部の実施形態において、アジュバントは、１つ以上の免疫原をコードするのと同じポリリボヌクレオチドによってコードされる。アジュバント及び免疫原は、同じポリリボヌクレオチド上で共送達されてもよい。一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチドによってコードされるアジュバントは、自然免疫系刺激因子である配列（例えば、ポリリボヌクレオチド配列）である。自然免疫系刺激因子配列は、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、又は少なくとも５００個のリボヌクレオチドを含み得る。自然免疫系刺激因子配列は、５～１０００、１０～５００、２０～５００、１０～１００、２０～１００、２０～５０、１００～５００、５００～１０００、又は１０～１０００個のリボヌクレオチドを含み得る。例えば、自然免疫系刺激因子である配列は、ＧＵリッチモチーフ、ＡＵリッチモチーフ、ｄｓＲＮＡを含む構造化された領域、又はアプタマーから選択され得る。

【0363】

アジュバントは、ＴＨ１アジュバント及び／又はＴＨ２アジュバントであり得る。本開示によって企図される更なるアジュバントとしては、限定はされないが、以下のうちの１つ以上が挙げられる：

【0364】

ミネラル含有組成物。本開示におけるアジュバントとしての使用に好適なミネラル含有組成物としては、アルミニウム塩、及びカルシウム塩など、ミネラル塩が挙げられる。本開示には、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、水酸化リン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩等などのミネラル塩、又は異なるミネラル化合物であって、任意の好適な形態（例えば、ゲル、結晶、アモルファス等）をとる化合物の混合物が含まれる。カルシウム塩としては、リン酸カルシウム（例えば、「ＣＡＰ」）が挙げられる。アルミニウム塩としては、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などが挙げられる。

【0365】

油性エマルション組成物。本開示におけるアジュバントとしての使用に好適な油性エマルション組成物としては、スクアレン－水エマルション、例えば、ＭＦ５９（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０及び０．５％Ｓｐａｎ（登録商標）、マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子となるように製剤化される）、ＡＳ０３（水中油型エマルション中のα－トコフェロール、スクアレン及びポリソルベート８０）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ製剤（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ７２０）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が挙げられる。

【0366】

小分子。本開示におけるアジュバントとしての使用に好適な小分子としては、イミキモド又は８４７、レシキモド又はＲ８４８、及びガーディキモドが挙げられる。

【0367】

ポリマーナノ粒子。本開示におけるアジュバントとしての使用に好適なポリマーナノ粒子としては、ポリ（ａ－ヒドロキシ酸）類、ポリヒドロキシ酪酸類、ポリラクトン類（ポリカプロラクトン類を含む）、ポリジオキサノン類、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル類、ポリ無水物類、ポリシアノアクリレート類、チロシン誘導体ポリカーボネート類、ポリビニル－ピロリジノン類又はポリエステル－アミド類、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

【0368】

サポニン（即ち、グリコシド、１つ以上の糖側鎖に結び付いている多環式アグリコン）。本開示におけるアジュバントとしての使用に好適なサポニン製剤としては、ＱＳ２１などの精製製剤、並びにＩＳＣＯＭ及びＩＳＣＯＭマトリックスなどの脂質製剤が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）という商品名で販売されている。サポニン製剤はまた、コレステロールなど、ステロールも含み得る。サポニンとコレステロールとの組み合わせを使用すると、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれるユニークな粒子を形成することができる。ＩＳＣＯＭはまた、典型的には、ホスファチジルエタノールアミン又はホスファチジルコリンなどのリン脂質も含む。任意の公知のサポニンをＩＳＣＯＭに使用することができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡ及びＱＨＣの１つ以上を含む。任意選択で、ＩＳＣＯＭは、追加的なデタージェントを欠いていてもよい。

【0369】

リポ多糖類。本開示における使用に好適なアジュバントとしては、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性の誘導体が挙げられる。かかる誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、グルコピラノシルリピドＡ（ＧＬＡ）及び３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、４、５又は６本のアシル化鎖を伴う３つの脱Ｏ－アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。他の非毒性ＬＰＳ誘導体としては、アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体、例えば、ＲＣ－５２９など、モノホスホリルリピドＡ模倣体が挙げられる。

【0370】

リポソーム。本開示におけるアジュバントとしての使用に好適なリポソームとしては、ビロソーム及びＣＡＦ０１が挙げられる。

【0371】

脂質ナノ粒子。本開示における使用に好適なアジュバントとしては、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）及びその成分が挙げられる。

【0372】

リポペプチド（即ち、１つ以上の脂肪酸残基及び２つ以上のアミノ酸残基を含む化合物）。本開示におけるアジュバントとしての使用に好適なリポペプチドとしては、Ｐａｍ２（Ｐａｍ２ＣＳＫ４）及びＰａｍ３（Ｐａｍ３ＣＳＫ４）が挙げられる。

【0373】

糖脂質。本開示におけるアジュバントとしての使用に好適な糖脂質としては、コードファクター（トレハロースジミコレート）が挙げられる。

【0374】

ＭＤＰ（Ｎ－アセチル－ムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン）など、グラム陰性菌又はグラム陽性菌に由来する（合成の又は精製された）ペプチド及びペプチドグリカンは、本開示におけるアジュバントとしての使用に好適である。

【0375】

アジュバントとしての使用に好適な炭水化物（炭水化物含有）又は多糖類としては、デキストラン（例えば、分岐微生物多糖）、デキストラン硫酸塩、レンチナン、ザイモサン、βグルカン、デルチン（ｄｅｌｔｉｎ）、マンナン、及びキチンが挙げられる。

【0376】

ＲＮＡベースのアジュバント。本開示における使用に好適なＲＮＡベースのアジュバントは、ポリＩＣ、ポリＩＣ：ＬＣ、５’三リン酸を含む又は含まないヘアピンＲＮＡ、ウイルス配列、ポリＵ含有配列、ｄｓＲＮＡ 天然又は合成ＲＮＡ配列（例えば、ポリＩ：Ｃ）、及び核酸類似体（例えば、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰ又は他の環状ジヌクレオチド、例えば、サイクリックジ－ＧＭＰ、免疫刺激性塩基類似体、例えば、Ｃ８置換及びＮ７，Ｃ８二置換グアニンリボヌクレオチド）である。一部の実施形態において、アジュバントは、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドの線状ポリリボヌクレオチド対応物である。

【0377】

ＤＮＡベースのアジュバント。本開示における使用に好適なＤＮＡベースのアジュバントとしては、ＣｐＧ類（例えば、ＣｐＧ１０１８）、ｄｓＤＮＡ、及び天然又は合成免疫刺激性ＤＮＡ配列が挙げられる。

【0378】

タンパク質又はペプチド。本開示におけるアジュバントとしての使用に好適なタンパク質及びペプチドとしては、フラジェリン融合タンパク質、ＭＢＬ（マンノース結合レクチン）、サイトカイン、及びケモカインが挙げられる。

【0379】

ウイルス粒子。アジュバントとしての使用に好適なウイルス粒子としては、ビロソーム（リン脂質細胞膜二重層）が挙げられる。

【0380】

本開示における使用のためのアジュバントは、フラジェリン、ＬＰＳ、又は細菌毒素（例えば、エンテロトキシン（タンパク質）、例えば、易熱性毒素又はコレラ毒素）など、細菌由来であってもよい。本開示における使用のためのアジュバントは、イミキモドにコンジュゲートしたＣｐＧなど、ハイブリッド分子であってもよい。本開示における使用のためのアジュバントは、キチン又はβグルカンなど、真菌又は卵菌微生物関連分子パターン（ＭＡＭＰ）であってもよい。一部の実施形態において、アジュバントは、金ナノロッド又はシリカベースのナノ粒子（例えば、メソ多孔質シリカナノ粒子（ＭＳＮ））など、無機ナノ粒子である。一部の実施形態において、アジュバントは、多成分アジュバント又はアジュバントシステム、例えば、ＡＳ０１（ＡＳ０１Ｂ）、ＡＳ０３、ＡＳ０４（ＭＬＰ５＋ミョウバン）、ミョウバン（水酸化アルミニウムと水酸化マグネシウムとの混合物）、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント：ＩＦＡ＋ペプチグリカン（ｐｅｐｔｉｇｌｙｃａｎ）＋トレハロースジミコレート）、ＣＡＦ０１（２成分系のカチオン性リポソーム媒体（ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ））を糖脂質免疫調節薬（トレハロース６，６－ジベヘン酸（ＴＤＢ）、これはマイコバクテリア細胞壁に位置するコードファクターの合成変異体であり得る）で安定化させたものなどである。

【0381】

サイトカイン。アジュバントは、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β）、Ｔｈ－１誘導サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８）、又はＴｈ－２誘導サイトカイン（例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３）など、サイトカインをコードする部分的又は完全長ＤＮＡであってもよい。

【0382】

ケモカイン。アジュバントは、ＭＣＰ－１、ＭＩＰ－１α、ＭＩＰ－１β、ランテス、又はＴＣＡ－３など、ケモカインをコードする部分的又は完全長ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド又はｍＲＮＡ）であってもよい。

【0383】

アジュバントは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０－Ｌ、ＣＤ７０、又はＣＤ２７など、共刺激分子をコードする部分的又は完全長ＤＮＡであってもよい。

【0384】

アジュバントは、ＴＬＲ４、ＴＬＲ３、ＴＬＲ３、ＴＬＲ９、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ７、ＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８、又はＭＤＡ－５／ＩＦＩＨ１など、自然免疫系刺激因子（部分的、完全長、又は突然変異型）；又はｃａＴＬＲ４、ｃａＴＬＲ３、ｃａＴＬＲ３、ｃａＴＬＲ９、ｃａＴＬＲ７、ｃａＴＬＲ８、ｃａＴＬＲ７、ｃａＲＩＧ－Ｉ／ＤＤＸ５８、又はｃａＭＤＡ－５／ＩＦＩＨ１など、構成的に活性な（ｃａ）自然免疫刺激因子をコードする部分的又は完全長ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド又はｍＲＮＡ）であってもよい。

【0385】

アジュバントは、アダプター又はシグナル伝達分子、例えば、ＳＴＩＮＧ（例えば、ｃａＳＴＩＮＧ）、ＴＲＩＦ、ＴＲＡＭ、ＭｙＤ８８、ＩＰＳ１、ＡＳＣ、ＭＡＶＳ、ＭＡＰＫｓ、ＩＫＫ－α、ＩＫＫ複合体、ＴＢＫ１、β－カテニン、及びカスパーゼ１をコードする部分的又は完全長ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド又はｍＲＮＡ）であってもよい。

【0386】

アジュバントは、免疫応答を上方制御することのできる転写活性化因子（例えば、ＡＰ１、ＮＦ－κＢ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ１、又はＩＲＦ５）など、転写活性化因子をコードする部分的又は完全長ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド又はｍＲＮＡ）であってもよい。アジュバントは、ＩＬ－２β、ＩＦＮ－γ、又はＩＬ－６など、サイトカイン受容体をコードする部分的又は完全長ＤＮＡであってもよい。

【0387】

アジュバントは、フラジェリン又はＭＢＬなど、細菌成分をコードする部分的又は完全長ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド又はｍＲＮＡ）であってもよい。

【0388】

アジュバントは、自然免疫系の任意の成分をコードする部分的又は完全長ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド又はｍＲＮＡ）であってもよい。

【0389】

一部の実施形態において、対象には、１つ以上の免疫原をコードする環状ポリリボヌクレオチドがアジュバント（例えば、環状ポリリボヌクレオチドと別個の分子実体であるアジュバント又は別個のポリリボヌクレオチドにコードされるアジュバント）と組み合わせて投与される。本明細書の説明全体を通じて使用されるとおりの用語「～と組み合わせて」には、治療レジメンの一環として投与される任意の２つの組成物が含まれる。これには、例えば、単一の医薬組成物として製剤化されたポリリボヌクレオチド及びアジュバントが含まれてもよい。これにはまた、例えば、決められた治療レジメン又は用量投与レジメンに従い別個の組成物として対象に投与されるポリリボヌクレオチド及びアジュバントが含まれてもよい。アジュバントは、ポリリボヌクレオチドの投与前に、実質的に同じ時点で、又はその後に対象に投与されてもよい。アジュバントは、ポリリボヌクレオチドの投与前又は投与後１日、２日、５日、１０日、２０日、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、４ヵ月、５ヵ月、又は６ヵ月以内に投与されてもよい。アジュバントは、ポリリボヌクレオチドと同じ投与経路（例えば、皮内に、筋肉内に、皮下に、静脈内に、腹腔内に、局所的に、又は経口的に）又は異なる経路により投与されてもよい。

【0390】

送達
本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドは、担体を有する医薬組成物又は担体を有しない医薬組成物に含まれてもよい。

【0391】

本明細書に記載の医薬組成物は、例えば、薬学的担体及び／又は高分子担体、例えば、リポソームなどの担体を含むように製剤化され、それを必要とする対象（例えば、ヒト又は非ヒトの農業用又は家畜用動物、例えば、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に公知の方法によって送達されてもよい。そのような方法として、限定はされないが、トランスフェクション（例えば、脂質媒介性、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー）；エレクトロポレーション又は膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、ウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）、マイクロインジェクション、微粒子銃（「遺伝子銃」）、ｆｕｇｅｎｅ、直接音波負荷、細胞圧迫、光学トランスフェクション、プロトプラスト融合、インパレフェクション、マグネトフェクション、エキソソーム媒介移行、脂質ナノ粒子媒介移行、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。送達の方法はまた、例えば、Ｇｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｌｙ ２０１５，２６（７）：４４３－４５１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１５．０７４；及びＺｕｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ ３０；３３（１）：７３－８０に記載されている。

【0392】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、「ネイキッド」送達製剤で送達されてもよい。ネイキッド送達製剤は、担体の補助なしに、また環状ポリリボヌクレオチドの共有結合修飾又は環状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全なカプセル封入を伴わずに、環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達する。

【0393】

ネイキッド送達製剤は、担体から遊離された製剤であり、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を補助する部分に結合する共有結合修飾を伴わず、環状ポリリボヌクレオチドは、部分的でなく、又は完全にカプセル封入される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を補助するタンパク質、小分子、粒子、ポリマー、又は生体高分子などの部分に共有結合的に結合されない。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、プロタミン又はプロタミン塩（例えば、プロタミン硫酸塩）を有する送達製剤で送達されてもよい。

【0394】

細胞への送達を補助する部分に結合する共有結合修飾を伴わないポリリボヌクレオチドは、修飾リン酸基を含まなくてもよい。例えば、細胞への送達を補助する部分に結合する共有結合修飾を伴わないポリリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル若しくはアリールホスホネート、又はホスホトリエステルを含まなくてもよい。

【0395】

いくつかの実施形態では、ネイキッド送達製剤は、トランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体を含まなくてもよい。例えば、ネイキッド送達製剤は、コハク酸フィトグリコーゲンオクテニル、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリン、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－ｂ－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ｌ－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ＼Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣ１）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（ｌ，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンを含まなくてもよい。

【0396】

ネイキッド送達製剤は、非担体賦形剤（ｎｏｎ－ｃａｒｒｉｅｒ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、非担体賦形剤は、活性細胞の透過効果を示さない不活性成分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、非担体賦形剤は、緩衝剤、例えば、ＰＢＳを含んでもよい。いくつかの実施形態では、非担体賦形剤は、溶媒、非水性溶媒、希釈剤、懸濁補助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤、平滑剤、又は油であってもよい。

【0397】

いくつかの実施形態では、ネイキッド送達製剤は、非経口的に許容できる希釈剤などの希釈剤を含んでもよい。希釈剤（例えば、非経口的に許容できる希釈剤）は、液体希釈剤又は固体希釈剤であってもよい。いくつかの実施形態では、希釈剤（例えば、非経口的に許容できる希釈剤）は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝剤、又は等張剤であってもよい。ＲＮＡ可溶化剤の例として、水、エタノール、メタノール、アセトン、ホルムアミド、及び２－プロパノールが挙げられる。緩衝剤の例として、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビストリス、２－［（２－アミノ－２－オキソエチル）－（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ヘペス）、トリス、トリシン、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ビシン、又はリン酸が挙げられる。等張剤の例として、グリセリン、マンニトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、又はスクロースが挙げられる。

【0398】

一部の実施形態において、製剤は細胞透過剤を含む。一部の実施形態において、製剤は局所製剤であり、細胞透過剤を含む。細胞透過剤としては、１つ以上のヒドロキシル官能基を有するアルコール類など、有機化合物を挙げることができる。ある場合には、細胞透過剤としては、限定はされないが、一価アルコール類、多価アルコール類、不飽和脂肪族アルコール類、及び脂環式アルコール類など、アルコールが挙げられる。細胞透過剤としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール、フェノキシエタノール、トリエタノールアミン、フェネチルアルコール、ブタノール、ペンタノール、セチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、変性アルコール、ベンジルアルコール、特殊変性アルコール、グリコール、ステアリルアルコール、セテアリルアルコール、メントール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）－４００、エトキシ化脂肪酸、又はヒドロキシエチルセルロースのうちの１つ以上を挙げることができる。特定の実施形態において、細胞透過剤としては、エタノールが挙げられる。細胞透過剤としては、国際公開第２０２０／１８０７５１号パンフレット又は国際公開第２０２０／１８０７５２号パンフレット（これらは、本明細書によって全体として参照により援用される）に記載されるとおりの、任意の量の、又は任意の製剤中にある任意の細胞透過剤を挙げることができる。

【0399】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるような医薬調製物、本明細書で開示されるような医薬組成物、開示のような医薬品原体、又は本明細書で開示されるような医薬品製剤は、非経口的な核酸送達系に含まれる。親核酸送達系は、本明細書で開示されるような医薬調製物、本明細書で開示されるような医薬組成物、開示のような医薬品原体、又は本明細書で開示されるような医薬品製剤、及び非経口的に許容できる希釈剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、非経口的な核酸送達系における本明細書で開示されるような医薬調製物、本明細書で開示されるような医薬組成物、開示のような医薬品原体、又は本明細書で開示されるような医薬品製剤は、担体を全く含まない。

【0400】

本開示は、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドを含む宿主又は宿主細胞をさらに対象とする。いくつかの実施形態では、宿主又は宿主細胞は、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ヒト）、又は他の生物若しくは細胞である。

【0401】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば、記載された環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチドによって誘起される応答と比較して、低下した宿主の免疫系による望ましくない応答を有するか、又はそれを生成できない。実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主において非免疫原性である。いくつかの免疫応答として、限定はされないが、体液性免疫応答（例えば、免疫原に特異的な抗体の産生）及び細胞媒介免疫応答（例えば、リンパ球増殖）が挙げられる。

【0402】

いくつかの実施形態では、宿主又は宿主細胞は、環状ポリリボヌクレオチドと接触される（例えば、それに送達又は投与される）。いくつかの実施形態では、宿主は、ヒトなどの哺乳動物である。宿主における環状ポリリボヌクレオチド又は線状ポリリボヌクレオチド、発現産物、又は双方の量は、投与後の任意の時点で測定され得る。特定の実施形態では、培養下の宿主成長の時間経過が測定される。成長が環状ポリリボヌクレオチド又は線状ポリリボヌクレオチドの存在下で増強又は低減される場合、環状ポリリボヌクレオチド又は発現産物又は双方は、宿主の成長を増強又は低減するのに有効なものとして同定される。

【0403】

本明細書に記載のような環状ポリリボヌクレオチド分子を細胞、組織、又は対象に送達する方法は、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤を細胞、組織、又は対象に投与することを含む。

【0404】

いくつかの実施形態では、細胞は、真核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、有蹄動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態では、組織は、結合組織、筋肉組織、神経組織、又は上皮組織である。いくつかの実施形態では、組織は、臓器（例えば、肝臓、肺、脾臓、腎臓など）である。

【0405】

いくつかの実施形態では、送達する方法は、インビボ方法である。例えば、本明細書に記載のような環状ポリリボヌクレオチドの送達方法は、非経口的にそれを必要とする対象に、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。別の例として、環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞又は組織に送達する方法は、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤を細胞又は組織に非経口的に投与することを含む。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、対象における生物学的応答を誘発するのに有効な量である。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、対象における細胞又は組織に対する生物学的効果を有するのに有効な量である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤は、担体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤は、希釈剤を含み、担体を全く含まない。

【0406】

いくつかの実施形態では、医薬組成物、医薬品原体、又は医薬品製剤は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物、医薬品原体、又は医薬品製剤は、静脈内に、動脈内に、腹腔内に、皮内に、頭蓋内に、くも膜下腔内に、リンパ内に、皮下に、又は筋肉内に投与される。いくつかの実施形態では、非経口投与は、静脈内、筋肉内、眼科的、皮下、皮内又は局所による。

【0407】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤は、筋肉内に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤は、皮下に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤は、局所的に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物、医薬品原体、又は医薬品製剤は、気管内に投与される。

【0408】

いくつかの実施形態では、医薬組成物、医薬品原体又は医薬品製剤は、注射によって投与される。投与は、全身投与又は局所投与であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような送達方法のいずれかは、担体を用いて実施される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようないずれかの送達方法は、担体又は細胞透過剤の補助なしに実施される。

【0409】

いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物は、投与するステップから少なくとも１日後、少なくとも２日後、少なくとも３日後、少なくとも４日後、又は少なくとも５日後、細胞、組織、又は対象において検出される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物の存在は、投与するステップ前、細胞、組織、又は対象において評価される。いくつかの実施形態では、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された産物の存在は、投与するステップ後、細胞、組織、又は対象において評価される。

【0410】

製剤
本開示の一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）又は本明細書に記載される方法によって調製されたその調製物は、組成物、例えば、細胞、植物、無脊椎動物、非ヒト脊椎動物、又はヒト対象への送達用の組成物、例えば、農業用組成物、動物用組成物、又は医薬組成物に製剤化されてもよい。一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチドは、医薬組成物に製剤化される。一部の実施形態において、組成物は、ポリリボヌクレオチドと、希釈剤、担体、アジュバント、又はこれらの組み合わせとを含む。詳細な実施形態において、組成物は、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチドと、担体又はいかなる担体も含まない希釈剤とを含む。一部の実施形態において、ポリリボヌクレオチドをいかなる担体も含まない希釈剤と共に含む組成物は、対象へのポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）のネイキッド送達に使用される。

【0411】

医薬組成物は、任意選択で、１つ以上の追加の活性物質、例えば、治療的及び／又は予防的に活性な物質を含み得る。医薬組成物は、任意選択で、本明細書に記載される組成物の賦形剤又は媒体として働く不活性物質（例えば、環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物、米国食品医薬品局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：ＦＤＡ）により承認された、不活性成分データベースに収載されている不活性成分のいずれか１つなど）を含み得る。本発明の医薬組成物は、無菌及び／又はパイロジェンフリーであり得る。製剤及び／又は医薬品の製造における一般的な考慮点については、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に援用される）を参照し得る。不活性物質の非限定的な例としては、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散液、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存剤、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、潤滑剤、油、及びこれらの混合物が挙げられる。

【0412】

本明細書に提供される医薬組成物の説明は、主としてヒトへの投与に好適な医薬組成物に関するが、当業者によれば、かかる組成物が概して任意の他の動物、例えば、非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳類への投与に好適であることは理解されるであろう。ヒトへの投与に好適な医薬組成物を修飾して、その組成物を様々な動物への投与に好適なものにすることは良く理解されており、獣医薬理学の当業者であれば、例えあったとしても常法に過ぎない実験法でかかる修飾を設計し及び／又は実施することができる。本医薬組成物の投与が企図される対象としては、限定はされないが、ヒト及び／又は他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、及び／又はラットなど、商業的に価値のある哺乳類を含めた、哺乳類；及び／又は家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、及び／又はシチメンチョウなど、商業的に価値のある鳥類を含めた、鳥類が挙げられる。

【0413】

本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野で公知の又は今後開発される任意の方法により調製されてもよい。一般に、かかる調製方法には、活性成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の補助的原料と会合した状態に至らせる工程、及び次に、必要及び／又は所望に応じて、生産物を分割し、成型し、及び／又は包装する工程が含まれる。

【0414】

一部の実施形態において、調製物中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、線状ポリリボヌクレオチド分子が１ｎｇ／ｍｌ、５ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、３５ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００ｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、又は２ｍｇ／ｍｌを超えて存在しないというものである。

【0415】

一部の実施形態において、調製物中に存在する環状ポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、医薬調製物中の全リボヌクレオチド分子の少なくとも３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、６０％（ｗ／ｗ）、７０％（ｗ／ｗ）、８０％（ｗ／ｗ）、８５％（ｗ／ｗ）、９０％（ｗ／ｗ）、９１％（ｗ／ｗ）、９２％（ｗ／ｗ）、９３％（ｗ／ｗ）、９４％（ｗ／ｗ）、９５％（ｗ／ｗ）、９６％（ｗ／ｗ）、９７％（ｗ／ｗ）、９８％（ｗ／ｗ）、９９％（ｗ／ｗ）、９９．１％（ｗ／ｗ）、９９．２％（ｗ／ｗ）、９９．３％（ｗ／ｗ）、９９．４％（ｗ／ｗ）、９９．５％（ｗ／ｗ）、９９．６％（ｗ／ｗ）、９９．７％（ｗ／ｗ）、９９．８％（ｗ／ｗ）、９９．９％（ｗ／ｗ）、又は１００％（ｗ／ｗ）の分子である。

【0416】

一部の実施形態において、調製物中に存在する線状ポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、線状ポリリボヌクレオチド分子が医薬調製物中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下である。

【0417】

一部の実施形態において、調製物中に存在するニック入りのポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、ニック入りのポリリボヌクレオチド分子が医薬調製物中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、又は１５％（ｗ／ｗ）以下である。

【0418】

一部の実施形態において、調製物中に存在するニック入り及び線状を合わせたポリリボヌクレオチド分子の量の参照基準は、ニック入り及び線状を合わせたポリリボヌクレオチド分子が医薬調製物中の全リボヌクレオチド分子の０．５％（ｗ／ｗ）、１％（ｗ／ｗ）、２％（ｗ／ｗ）、５％（ｗ／ｗ）、１０％（ｗ／ｗ）、１５％（ｗ／ｗ）、２０％（ｗ／ｗ）、２５％（ｗ／ｗ）、３０％（ｗ／ｗ）、４０％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）以下である。一部の実施形態において、医薬調製物は、最終的な環状ポリリボヌクレオチド薬物製品の中間体医薬調製物である。一部の実施形態において、医薬調製物は、原薬又は医薬品有効成分（ＡＰＩ）である。一部の実施形態において、医薬調製物は、対象への投与用の薬物製品である。

【0419】

一部の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの調製物は（線状ＲＮＡの低減前、低減中又は低減後に）さらに処理され、ＤＮＡ、タンパク質夾雑物（例えば、宿主細胞タンパク質などの細胞性タンパク質又はタンパク質処理不純物）、エンドトキシン、モノヌクレオチド分子、及び／又は処理関連の不純物が実質的に除去される。

【0420】

いくつかの実施形態では、本明細書で開示される医薬製剤は、（ｉ）本明細書で開示される化合物（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）；（ｉｉ）緩衝剤；（ｉｉｉ）非イオン界面活性剤；（ｉｖ）等張化剤；及び／又は（ｖ）安定剤を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される医薬製剤は、安定な液体医薬製剤である。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される医薬製剤は、プロタミン又はプロタミン塩（例えば、プロタミン硫酸塩）を含む。

【0421】

本開示は、本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物を提供する。本開示の免疫原性組成物は、希釈剤若しくは担体、アジュバント、又はそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。本開示の免疫原性組成物はまた、１つ又は複数の免疫調節剤、例えば、１つ又は複数のアジュバントを含んでもよい。アジュバントは、以下にさらに考察される、ＴＨ１アジュバント及び／又はＴＨ２アジュバントを含んでもよい。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、担体を全く含まない希釈剤を含み、環状ポリリボヌクレオチドの対象へのネイキッド送達に使用される。

【0422】

本開示の免疫原性組成物を用いて、対象における免疫応答を産生させる。免疫応答は、好ましくは、保護的であり、好ましくは、抗体応答（通常はＩｇＧを含む）及び／又は細胞媒介免疫応答を含む。例えば、対象は、免疫応答を誘導するため、本開示の環状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物で免疫される。別の例では、対象は、免疫原に結合する抗体の産生を刺激するため、免疫原を含む線状ポリリボヌクレオチドを含む免疫原性組成物で免疫される。これらの使用及び方法によって、対象における免疫応答を産生させることにより、対象は、様々な疾患及び／又は感染に対して、例えば、上で考察のような細菌性及び／又はウイルス性疾患に対して保護され得る。特定の実施形態では、免疫原性組成物は、ワクチン組成物である。本開示に従うワクチンは、予防的（即ち、感染を予防するため）又は治療的（即ち、感染を治療するため）のいずれであってもよいが、典型的には予防的となる。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象は、動物、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトである。一実施形態では、対象は、ヒトである。他の実施形態では、対象は、例えば、雌ウシ（例えば、乳牛及び肉牛）、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、イヌ、又はネコから選択される、非ヒト哺乳動物である。他の実施形態では、対象は、鳥類、例えば、雌鳥又は雄鶏、シチメンチョウ、オウムである。いくつかの実施形態では、動物は、マウス又はウサギ又は雌ウシでない。特定の実施形態では、免疫原性組成物が予防用途である場合、ヒトは、小児（例えば、幼児又は乳児）又はティーンエイジャーである。別の実施形態では、免疫原性組成物が治療用途である場合、ヒトは、ティーンエイジャー又は成人である。また、小児用が意図される免疫原性組成物は、例えば、安全性、用量、免疫原性などを評価するため、成人に投与されてもよい。

【0423】

本開示に従って調製された免疫原性組成物を用いて、小児及び成人の双方を治療してもよい。ヒト対象は、１歳未満、５歳未満、１～５歳、５～１５歳、１５～５５歳、又は少なくとも５５歳であってもよい。特定の実施形態では、免疫原性組成物を投与するヒト対象は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、及び≧６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍職員（ａｒｍｅｄ ｓｅｒｖｉｃｅ ａｎｄ ｍｉｌｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ）、妊婦、慢性疾患、又は免疫不全患者である。免疫原性組成物は、これらの群に対して単独で適さないが、集団内でより一般的に使用されてもよい。

【0424】

いくつかの実施形態では、対象は、アジュバントでさらに免疫される。いくつかの実施形態では、対象は、ワクチンでさらに免疫される。

【0425】

保存剤
本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、単回投与のための材料を含み得る、又は複数回投与のための材料（例えば、「多回投与」キット）を含み得る。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。組成物又は医薬組成物は、チオメルサール又は２－フェノキシエタノールなどの１つ又は複数の保存剤を含み得る。保存剤を使用し、使用中の微生物汚染を阻止することができる。好適な保存剤は、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、Ｏｎａｍｅｒ Ｍ、又は当業者に公知の他の薬剤を含む。眼科製品では、例えば、そのような保存剤は、０．００４％～０．０２％のレベルで使用することができる。本明細書に記載の組成物において、保存剤、例えば、塩化ベンザルコニウムは、０．００１％～０．０１％未満、例えば、０．００１％～０．００８％、好ましくは、約０．００５重量％のレベルで使用することができる。

【0426】

ポリリボヌクレオチドは、周囲環境下で大量に存在し得るリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）に感受性を示し得る。本明細書に提供される組成物は、リボヌクレアーゼ活性を阻害し、それによりポリリボヌクレオチドを分解から防ぐ試薬を含み得る。いくつかの場合、組成物又は医薬組成物は、当業者に公知の任意のリボヌクレアーゼ阻害剤を含む。代替的に又は追加的に、本明細書に提供される組成物中のポリリボヌクレオチド、並びに細胞透過剤及び／又は薬学的に許容できる希釈剤若しくは担体、媒体、賦形剤、若しくは他の試薬は、リボヌクレアーゼを含まない環境下で調製され得る。組成物は、リボヌクレアーゼを含まない環境下で製剤化され得る。

【0427】

いくつかの場合、本明細書に提供される組成物は、無菌であり得る。組成物は、当該技術分野で公知の、好適な媒体中の無菌溶液又は懸濁液として製剤化され得る。組成物は、従来の公知の滅菌技術によって滅菌可能であり、例えば、組成物は、滅菌ろ過され得る。

【0428】

塩
いくつかの場合、本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、１つ又は複数の塩を含む。浸透圧を制御するため、ナトリウム塩などの生理学的塩が、本明細書に提供される組成物に含まれ得る。他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、及び／又は塩化マグネシウムなどを含み得る。いくつかの場合、組成物は、１つ又は複数の薬学的に許容できる塩と共に製剤化される。１つ又は複数の薬学的に許容できる塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムイオンなどの無機イオンのものを含み得る。そのような塩は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、酢酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マンデル酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、又はマレイン酸などの無機酸又は有機酸の塩を含み得る。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0429】

緩衝剤／ｐＨ
本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、トリス緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤（例えば、水酸化アルミニウムアジュバントを有する）；又はクエン酸緩衝剤などの１つ又は複数の緩衝剤を含み得る。緩衝剤は、いくつかの場合、５～２０ｍＭの範囲内に含まれる。

【0430】

本明細書に提供される組成物又は医薬組成物は、約５．０～約８．５の間、約６．０～約８．０の間、約６．５～約７．５の間、又は約７．０～約７．８の間のｐＨを有し得る。組成物又は医薬組成物は、約７のｐＨを有し得る。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状のいずれかの形態で存在し得る。

【0431】

洗浄剤／界面活性剤
本明細書で提供される組成物又は医薬組成物は、意図される投与経路に応じて、１種又は複数種の洗浄剤及び／又は界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般に「Ｔｗｅｅｎ（登録商標）」と呼ばれる）、例えば、ポリソルベート２０及びポリソルベート８０；ＤＯＷＦＡＸ（商標）という商品名で販売されているエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー、例えば、線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマー；エトキシ（オキシ－ｌ，２－エタンジイル）基の繰り返し数が異なり得るオクトキシノール、例えば、オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、又はｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ－６３０／ＮＰ－４０）；リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン（レシチン）；ノニルフェノールエトキシレート、例えば、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズ；ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール及びオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪族エーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標）界面活性剤として知られる）、例えば、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ（登録商標） ３０）；並びにソルビタンエステル（一般に、「ＳＰＡＮ（登録商標）」として知られる）、例えば、ソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ（登録商標） ８５）及びソルビタンモノラウレート、オクトキシノール（オクトキシノール－９（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００）又はｔ－オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、又はデオキシコール酸ナトリウムを含むことができる。１種又は複数種の洗浄剤及び／又は界面活性剤は、微量でのみ含まれ得る。いくつかの例では、組成物は、オクトキシノール－１０及びポリソルベート８０のそれぞれを１ｍｇ／ｍｌ未満含むことができる。本明細書では、非イオン性界面活性剤を使用することができる。界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）によって分類することができる。いくつかの例では、界面活性剤は、少なくとも１０、少なくとも１５、及び／又は少なくとも１６のＨＬＢを有する。ポリリボヌクレオチドは、線状又は環状の形態で含まれ得る。

【0432】

希釈剤
いくつかの実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、環状ポリリボヌクレオチド及び希釈剤を含む。

【0433】

希釈剤は、非担体賦形剤であり得る。非担体賦形剤は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドなどの、組成物のためのビヒクル又は媒体として働く。非担体賦形剤の非限定的な例としては、溶媒、水性溶媒、非水性溶媒、分散媒、希釈剤、分散体、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、滑沢剤、油、及びそれらの混合物が挙げられる。非担体賦形剤は、米国食品医薬品局（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）によって承認され、細胞透過効果を示さないＩｎａｃｔｉｖｅ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄａｔａｂａｓｅに列挙された非有効成分のいずれかであり得る。非担体賦形剤は、例えば、獣医学的使用に好適な非ヒト動物への投与に好適な任意の不活性成分であり得る。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な組成物の変更は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとしても通常の実験のみでこのような変更を設計及び／又は行うことができる。

【0434】

ある実施形態では、環状ポリリボヌクレオチドは、希釈剤を含むものなどのネイキッド送達製剤として送達され得る。ネイキッド送達製剤は、担体を用いずに、修飾又は環状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入、キャップされたポリリボヌクレオチド、又はその複合体なしで、環状ポリリボヌクレオチドを細胞に送達する。

【0435】

ネイキッド送達製剤は、担体を含まない製剤であり、ここで、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さず、又は環状ポリリボヌクレオチドの部分的若しくは完全な封入なしである。ある実施形態では、細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さない環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、小分子、粒子、ポリマー、又はバイオポリマーに共有結合されないポリリボヌクレオチドである。細胞への送達を助ける部分に結合する共有結合修飾を有さない環状ポリリボヌクレオチドは、修飾リン酸基を含まない。例えば、細胞への送達を助ける部分に結合する共共有結合修飾を有さない環状ポリリボヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、アルキル又はアリールホスホネート、又はホスホトリエステルを含まない。

【0436】

ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、トランスフェクション試薬、カチオン性担体、炭水化物担体、ナノ粒子担体、又はタンパク質担体のうちのいずれか又は全てを含まない。ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリン、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－β－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－１－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣｌ）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）、高比重リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンを含まない。

【0437】

ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、非担体賦形剤を含む。ある実施形態では、非担体賦形剤は、細胞透過効果を示さない不活性成分を含む。ある実施形態では、非担体賦形剤は、緩衝液、例えばＰＢＳを含む。ある実施形態では、非担体賦形剤は、溶媒、非水性溶媒、希釈剤、懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤、乳化剤、保存料、ポリマー、ペプチド、タンパク質、細胞、ヒアルロニダーゼ、分散剤、造粒剤、崩壊剤、結合剤、緩衝剤、滑沢剤、又は油である。

【0438】

ある実施形態では、ネイキッド送達製剤は、希釈剤を含む。希釈剤は、液体希釈剤又は固体希釈剤であり得る。ある実施形態では、希釈剤は、ＲＮＡ可溶化剤、緩衝液、又は等張剤である。ＲＮＡ可溶化剤の例としては、水、エタノール、メタノール、アセトン、ホルムアミド、及び２－プロパノールが挙げられる。緩衝液の例としては、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ビス－トリス、２－［（２－アミノ－２－オキソエチル）－（カルボキシメチル）アミノ］酢酸（ＡＤＡ）、Ｎ－（２－アセトアミド）－２－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、２－［［１，３－ジヒドロキシ－２－（ヒドロキシメチル）プロパン－２－イル］アミノ］エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス、トリシン、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ、ビシン、又はホスフェートが挙げられる。等張剤の例としては、グリセリン、マンニトール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、トレハロース、又はスクロースが挙げられる。

【0439】

担体
ある実施形態では、本開示の免疫原性組成物は、環状ポリリボヌクレオチド及び担体を含む。

【0440】

特定の実施形態において、免疫原性組成物は、小胞又は他の膜ベースの担体中に本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む。

【0441】

他の実施形態において、免疫原性組成物は、細胞、小胞若しくは他の膜ベースの担体中に又はそれらを介して環状ポリリボヌクレオチドを含む。一実施形態において、免疫原性組成物は、リポソーム又は他の同様の小胞中に環状ポリリボヌクレオチドを含む。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層又は多重膜脂質二重層及び比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層から構成される球形の小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であり得る。リポソームは、生体適合性であり、非毒性であり、親水性及び親油性の両方の薬物分子を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を越えてそのロードを輸送する（例えば、概説については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。

【0442】

小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から作製され得るが；リン脂質が、薬物担体としてリポソームを生成するために、最も一般的に使用される。多重膜小胞脂質の調製のための方法が、当該技術分野において公知である（例えば、多重膜小胞脂質調製に関連するその教示内容が参照により本明細書に援用される、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照されたい）。脂質膜が水溶液と混合されるとき、小胞形成が自然に起こり得るが、それはまた、ホモジナイザー、ソニケーター、又は押し出し装置を用いることによって、振とうの形態の力を加えることによって促進され得る（例えば、概説については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照されたい）。押し出された脂質は、押し出された脂質の調製に関するその教示内容が参照により本明細書に援用される、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７に記載されるように、減少したサイズのフィルタに通して押し出すことによって調製され得る。

【0443】

特定の実施形態において、本開示の免疫原性組成物は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド及び脂質ナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子を含む。脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド分子のための生体適合性及び生分解性送達システムを提供する担体の別の例である。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、ＳＬＮの特性を保持し、薬物安定性及び負荷容量を改善し、薬物漏出を防止する、修飾された固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬物送達の重要な構成要素である。これらのナノ粒子は、薬物送達を、特定の標的に有効に指向し、薬物安定性及び制御薬物放出を改善し得る。リポソーム及びポリマーを組み合わせる新しいタイプの担体である脂質－ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）も、用いられ得る。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの補完的な利点を有する。ＰＬＮは、コア－シェル構造から構成され；ポリマーコアは、安定した構造を提供し、リン脂質シェルは、良好な生体適合性を提供する。したがって、２つの構成要素が、薬物封入効率を増加させ、表面修飾を促進し、水溶性薬物の漏出を防止する。概説については、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。

【0444】

担体のさらなる非限定的な例としては、炭水化物担体（例えば、無水物修飾フィトグリコーゲン若しくはグリコーゲン型材料）、タンパク質担体（例えば、環状ポリリボヌクレオチドに共有結合されたタンパク質）、又はカチオン性担体（例えば、カチオン性リポポリマー又はトランスフェクション試薬）が挙げられる。炭水化物担体の非限定的な例としては、フィトグリコーゲンオクテニルスクシネート、フィトグリコーゲンβ－デキストリン、及び無水物修飾フィトグリコーゲンβ－デキストリンが挙げられる。カチオン性担体の非限定的な例としては、リポフェクタミン、ポリエチレンイミン、ポリ（トリメチレンイミン）、ポリ（テトラメチレンイミン）、ポリプロピレンイミン、アミノグリコシド－ポリアミン、ジデオキシ－ジアミノ－ｂ－シクロデキストリン、スペルミン、スペルミジン、ポリ（２－ジメチルアミノ）エチルメタクリレート、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ（アルギニン）、カチオン化ゼラチン、デンドリマー、キトサン、ｌ，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ｌ－［２－（オレオイルオキシ）エチル］－２－オレイル－３－（２－ヒドロキシエチル）イミダゾリニウムクロリド（ＤＯＴＩＭ）、２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２（スペルミンカルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－ｌ－プロパンアミニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）、３Ｂ－［Ｎ－（Ｎ＼Ｎ’－ジメチルアミノエタン）－カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ－コレステロールＨＣ１）、ジヘプタデシルアミドグリシルスペルミジン（ＤＯＧＳ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（ｌ，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、及びＮ，Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）が挙げられる。タンパク質担体の非限定的な例としては、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低比重リポタンパク（ＬＤＬ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）、又はグロブリンが挙げられる。

【0445】

エキソソームはまた、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は調製物の薬物送達ビヒクルとして使用され得る。レビューのためには、Ｈａ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２０１６．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ４，Ｐａｇｅｓ ２８７－２９６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。

【0446】

エクスビボ分化赤血球はまた、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は調製物の担体として使用され得る。例えば、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレット；国際公開第２０１７／１２３６４６号パンフレット；国際公開第２０１７／１２３６４４号パンフレット；国際公開第２０１８／１０２７４０号パンフレット；国際公開第２０１６／１８３４８２号パンフレット；国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレット；国際公開第２０１８／１５１８２９号パンフレット；国際公開第２０１８／００９８３８号パンフレット；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１３６；米国特許第９，６４４，１８０号明細書；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１７．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ８：４２３；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２０１４．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１１１（２８）：１０１３１－１３６を参照されたい。

【0447】

例えば、国際公開第２０１８／２０８７２８号パンフレットに記載されるようなフソソーム組成物も、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド分子を送達するための担体として使用され得る。

【0448】

ビロソーム及びウイルス様粒子（ＶＬＰ）も、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド分子を標的細胞に送達するための担体として使用され得る。

【0449】

例えば、国際特許公開番号国際公開第２０１１／０９７４８０号パンフレット、国際公開第２０１３／０７０３２４号パンフレット、国際公開第２０１７／００４５２６号パンフレット、又は国際公開第２０２００４１７８４号パンフレットに記載されるような植物ナノ小胞及び植物メッセンジャーパック（ＰＭＰ）も、本明細書に記載される環状ＲＮＡ組成物又は調製物を送達するための担体として使用され得る。

【0450】

マイクロバブルも、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド分子を送達するための担体として使用され得る。例えば、米国特許第７１１５５８３号明細書；Ｂｅｅｒｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００２ Ｏｃｔ １；１０６（１４）：１７５６－５９；Ｂｅｚ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１９ Ａｐｒ；１４（４）：１０１５－２６；Ｈｅｒｎｏｔ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２００８ Ｊｕｎ ３０；６０（１０）：１１５３－６６；Ｒｙｃｈａｋ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１４ Ｊｕｎ；７２：８２－９３を参照されたい。ある実施形態では、マイクロバブルは、アルブミン被覆されたペルフルオロカーボンマイクロバブルである。

【0451】

本明細書に記載の環状ポリリボヌクレオチドを含む担体は、複数の粒子を含み得る。粒子は、３０～７００ナノメートル（例えば、３０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、１００～５００、５０～５００、又は２００～７００ナノメートル）の物品サイズ中央値を有し得る。粒子の大きさは、細胞への環状ポリリボヌクレオチドを含むペイロードの沈着に有利に働くように最適化することができる。特定の細胞型への環状ポリリボヌクレオチドの沈着は、異なる粒径に有利であり得る。例えば、粒径は、抗原提示細胞への環状ポリリボヌクレオチドの沈着のために最適化され得る。粒径は、樹状細胞への環状ポリリボヌクレオチドの沈着のために最適化され得る。さらに、粒径は、流入領域リンパ節細胞への環状ポリリボヌクレオチドの沈着のために最適化され得る。

【0452】

脂質ナノ粒子
本開示によって提供される組成物、方法、及び送達システムは、特定の実施形態において、本明細書に記載の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む任意の好適な担体又は送達モダリティを用い得る。脂質ナノ粒子は、ある実施形態では、１つ以上のイオン性脂質、例えば、非カチオン性脂質（例えば、中性又はアニオン性、又は両性脂質）；１つ以上のコンジュゲート脂質（ＰＥＧコンジュゲート脂質又は全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーにコンジュゲートされた脂質など）；１つ以上のステロール（例えば、コレステロール）を含む。

【0453】

ナノ粒子形成において使用され得る脂質（例えば、脂質ナノ粒子）は、例えば、参照により援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４に記載されるものを含み－例えば、脂質含有ナノ粒子は、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４中の脂質の１つ以上を含み得る。脂質ナノ粒子は、さらなる要素、例えば、ポリマー、例えば、参照により援用される国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載されるポリマーを含み得る。

【0454】

ある実施形態では、コンジュゲート脂質は、存在する場合、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－ｌ－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、及び国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレット（参照により援用される）の表２に記載されるもの、並びに上記のものの組合せのうちの１つ以上を含み得る。

【0455】

ある実施形態では、脂質ナノ粒子に組み込まれ得るステロールとしては、参照により援用される国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書に記載されるものなどの、コレステロール又はコレステロール誘導体の１つ以上が挙げられる。さらなる例示的なステロールとしては、参照により本明細書に援用される、Ｅｙｇｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２０２０）、ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６に記載されるものを含む植物ステロールが挙げられる。

【0456】

ある実施形態では、脂質粒子は、イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質、及びステロールを含む。これらの構成要素の量は、独立して、所望の特性を達成するために変化され得る。例えば、ある実施形態では、脂質ナノ粒子は、総脂質の約２０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％の量のイオン化可能な脂質（他の実施形態において、それは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）又は４０～５０％（ｍｏｌ）；約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％であり得る）、総脂質の約５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の量のコンジュゲート脂質、及び総脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の量のステロールを含む。総脂質対核酸の比率は、必要に応じて変化され得る。例えば、総脂質対核酸（質量又は重量）比は、約１０：１～約３０：１であり得る。

【0457】

ある実施形態では、脂質対核酸比（質量／質量比；ｗ／ｗ比）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、又は約６：１～約９：１の範囲であり得る。脂質及び核酸の量は、所望のＮ／Ｐ比、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のＮ／Ｐ比を得るために調整され得る。一般に、脂質ナノ粒子製剤の全脂質含量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。

【0458】

本明細書に記載される組成物、例えば、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド））の送達のための脂質ナノ粒子を形成するために（例えば、他の脂質成分と組み合わせて）使用され得る脂質化合物のいくつかの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。

【化35】

ある実施形態では、式（ｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0459】

【化36】

ある実施形態では、式（ｉｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0460】

【化37】

ある実施形態では、式（ｉｉｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0461】

【化38】

ある実施形態では、式（ｖ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0462】

【化39】

ある実施形態では、式（ｖｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0463】

【化40】

ある実施形態では、式（ｖｉｉｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0464】

【化41】

ある実施形態では、式（ｉｘ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0465】

【化42】

式中、
Ｘ^１が、Ｏ、ＮＲ^１、又は直接結合であり、Ｘ^２が、Ｃ２～５アルキレンであり、Ｘ^３が、Ｃ（＝Ｏ）又は直接結合であり、Ｒ^１が、Ｈ又はＭｅであり、Ｒ^３が、Ｃ１～３アルキルであり、Ｒ^２が、Ｃ１～３アルキルであり、又はＲ^２が、それが結合される窒素原子及びＸ^２の１～３個の炭素原子と一緒になって、４員、５員、若しくは６員環を形成し、又はＸ^１が、ＮＲ^１であり、Ｒ^１及びＲ^２が、それらが結合される窒素原子と一緒になって、５員若しくは６員環を形成し、又はＲ^２が、Ｒ^３及びそれらが結合される窒素原子と一緒になって、５員、６員、若しくは７員環を形成し、Ｙ^１が、Ｃ２～１２アルキレンであり、Ｙ^２が、

【化43】

から選択され、
ｎが、０～３であり、Ｒ^４が、Ｃ１～１５アルキルであり、Ｚ^１が、Ｃ１～６アルキレン又は直接結合であり、
Ｚ^２が

【化44】

（いずれかの配向で）であるか又は非存在であり、ただし、Ｚ^１が直接結合であり、Ｚ^２が非存在である場合；
Ｒ^５が、Ｃ５～９アルキル又はＣ６～１０アルコキシであり、Ｒ^６が、Ｃ５～９アルキル又はＣ６～１０アルコキシであり、Ｗが、メチレン又は直接結合であり、Ｒ^７が、Ｈ又はＭｅ、又はその塩であり、ただし、Ｒ^３及びＲ^２が、Ｃ２アルキルであり、Ｘ^１が、Ｏであり、Ｘ^２が、直鎖状Ｃ３アルキレンであり、Ｘ^３が、Ｃ（＝０）であり、Ｙ^１が、直鎖状Ｃｅアルキレンであり、（Ｙ^２）ｎ－Ｒ^４が、

【化45】

であり、Ｒ^４が、直鎖状Ｃ５アルキルであり、Ｚ^１が、Ｃ２アルキレンであり、Ｚ^２が、非存在であり、Ｗが、メチレンであり、Ｒ^７が、Ｈである場合、Ｒ^５及びＲ^６が、Ｃｘアルコキシでない。

【0466】

ある実施形態では、式（ｘｉｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0467】

【化46】

ある実施形態では、式（ｘｉ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0468】

【化47】

ある実施形態では、ＬＮＰは、式（ｘｉｉｉ）の化合物及び式（ｘｉｖ）の化合物を含む。

【0469】

【化48】

ある実施形態では、式（ｘｖ）を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【0470】

【化49】

ある実施形態では、式（ｘｖｉ）の製剤を含むＬＮＰが、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を、細胞に送達するのに使用される。

【化50】

【0471】

ある実施形態では、本明細書に記載される組成物、例えば、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド））の送達のための脂質ナノ粒子を形成するのに使用される脂質化合物は、以下の反応のうちの１つによって作製される：

【化51】

【0472】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を細胞に送達するために、式（ｘｘｉ）を含むＬＮＰが使用される。いくつかの実施形態では、式（ｘｘｉ）のＬＮＰは、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットによって記載されるＬＮＰ（例えば、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットの表１の脂質など、式（１）の脂質）である。

【化52】

式中、
各ｎは、独立に、２～１５の整数であり；Ｌ_１及びＬ_３は、各々独立に、－ＯＣ（Ｏ）－^＊又は－Ｃ（Ｏ）Ｏ－^＊であり、式中、「^＊」は、Ｒ_１又はＲ_３との結合点を指し；
Ｒ_１及びＲ_３は、各々独立に、オキソ、ハロ、ヒドロキシ、シアノ、アルキル、アルケニル、アルデヒド、ヘテロシクリルアルキル、ヒドロキシアルキル、ジヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルキルアミノアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、（ヘテロシクリル）（アルキル）アミノアルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、アルキルヘテロアリール、アルキニル、アルコキシ、アミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキルカルボニルアミノ、アミノカルボニルアルキルアミノ、（アミノカルボニルアルキル）（アルキル）アミノ、アルケニルカルボニルアミノ、ヒドロキシカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノアルキルアミノカルボニル、ヘテロシクリルアルキルアミノカルボニル、（アルキルアミノアルキル）（アルキル）アミノカルボニル、アルキルアミノアルキルカルボニル、ジアルキルアミノアルキルカルボニル、ヘテロシクリルカルボニル、アルケニルカルボニル、アルキニルカルボニル、アルキルスルホキシド、アルキルスルホキシドアルキル、アルキルスルホニル、及びアルキルスルホンアルキルからなる群から選択される１つ又は複数の置換基によって任意選択で置換されている、線状又は分枝状Ｃ_９～Ｃ_２０アルキル又はＣ_９～Ｃ_２０アルケニルであり；及び
Ｒ_２は、

【化53】

からなる群から選択される。

【0473】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を細胞に送達するために、式（ｘｘｉｉ）を含むＬＮＰが使用される。いくつかの実施形態では、式（ｘｘｉｉ）のＬＮＰは、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットによって記載されるＬＮＰ（例えば、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットの表２の脂質など、式（２）の脂質）である。

【化54】

式中、
各ｎは、独立に、１～１５の整数であり；
Ｒ_１及びＲ_２は、各々独立に、

【化55】

からなる群から選択され

【0474】

Ｒ_３は、

【化56】

からなる群から選択される。

【0475】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）組成物を細胞に送達するために、式（ｘｘｉｉｉ）を含むＬＮＰが使用される。いくつかの実施形態では、式（ｘｘｉｉｉ）のＬＮＰは、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットによって記載されるＬＮＰ（例えば、国際公開第２０２１１１３７７７号パンフレットの表３の脂質など、式（３）の脂質）である。

【化57】

式中、
Ｘは、－Ｏ－、－Ｓ－、又は－ＯＣ（Ｏ）－^＊から選択され、式中、^＊は、Ｒ_１との結合点を指し；
Ｒ_１は、

【化58】

からなる群から選択され、
及びＲ_２は、

【化59】

からなる群から選択される。

【0476】

ある実施形態では、本明細書に記載される組成物（例えば核酸（例えば環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）又はタンパク質）は、イオン化可能な脂質を含むＬＮＰ中で提供される。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、米国特許第９，８６７，８８８号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１に記載されるようなヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（ＳＭ－１０２）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１３において合成されるような９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（ＬＰ０１）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）実施例７、８、又は９において合成されるようなジ（（Ｚ）－ノナ－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１４及び１６において合成されるような１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、イミダゾールコレステロールエステル（ＩＣＥ）脂質（３Ｓ、１０Ｒ、１３Ｒ、１７Ｒ）－１０、１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２、３、１４、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７－テトラデカヒドロ－ｌＨ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエート、例えば、国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）からの構造（Ｉ）である。

【0477】

ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、カチオン性脂質、イオン化可能なカチオン性脂質、例えば、ｐＨに応じて正荷電若しくは中性形態で存在し得るカチオン性脂質、又は容易にプロトン化され得るアミン含有脂質であり得る。ある実施形態では、カチオン性脂質は、例えば、生理的条件下で、正に荷電することが可能である脂質である。例示的なカチオン性脂質としては、正電荷を有する１つ以上のアミン基を含む。ある実施形態では、脂質粒子は、中性脂質、イオン化可能なアミン含有脂質、生分解性アルキン脂質、ステロイド、多価不飽和脂質を含むリン脂質、構造脂質（例えば、ステロール）、ＰＥＧ、コレステロール及びポリマーコンジュゲート脂質のうちの１つ以上との配合物中のカチオン性脂質を含む。ある実施形態では、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質であり得る。本明細書に開示される例示的なカチオン性脂質は、６．０を超える有効ｐＫａを有し得る。実施形態において、脂質ナノ粒子は、第１のカチオン性脂質と異なる有効ｐＫａ（例えば、第１の有効ｐＫａより高い）を有する第２のカチオン性脂質を含み得る。脂質ナノ粒子は、４０～６０ｍｏｌパーセントのカチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマーコンジュゲート脂質、及び治療剤、例えば、脂質ナノ粒子内に封入されるか又はそれと結合された本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド））を含み得る。ある実施形態では、核酸は、カチオン性脂質と同時に配合される。核酸は、ＬＮＰ、例えば、カチオン性脂質を含むＬＮＰの表面に吸着され得る。ある実施形態では、核酸は、ＬＮＰ、例えば、カチオン性脂質を含むＬＮＰ内に封入され得る。ある実施形態では、脂質ナノ粒子は、例えば、標的化剤で被覆された標的部分を含み得る。実施形態において、ＬＮＰ製剤は、生分解性である。ある実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の脂質、例えば、式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉ）、（ｖｉｉ）及び／又は（ｉｘ）を含む脂質ナノ粒子は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は１００％のＲＮＡ分子を封入する。

【0478】

脂質ナノ粒子製剤に使用され得る例示的なイオン化可能な脂質としては、限定はされないが、参照により本明細書に援用される国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレットの表１に列挙されるものが挙げられる。さらなる例示的な脂質としては、限定はされないが、以下の式の１つ以上：米国特許出願公開第２０１６／０３１１７５９号明細書のＸ；米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１６０１５１２８４号明細書のＩ、ＩＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１７０２１０９６７号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＩ、又はＩＩＡ；米国特許出願公開第２０１５０１４００７０号明細書のＩ－ｃ；米国特許出願公開第２０１３／０１７８５４１号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０３０３５８７号明細書又は米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０１４１６７８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２３９９２６号明細書のＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、又はＶ；米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書のＩ；国際公開第２０１７／１１７５２８号パンフレットのＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１４９８９４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１５／００５７３７３号明細書のＡ；国際公開第２０１３／１１６１２６号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２０１３／００９０３７２号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５２３号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５０４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／００５３５７２号明細書のＡ；国際公開第２０１３／０１６０５８号パンフレットのＡ；国際公開第２０１２／１６２２１０号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２００８／０４２９７３号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６７０号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ；米国特許出願公開第２０１４／０２００２５７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２０３４４６号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０００５３６３号明細書のＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１４／０３０８３０４号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ、ＩＩＤ、又はＩＩＩ～ＸＸＩＶ；米国特許出願公開第２０１３／０３３８２１０号明細書の；国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレットのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ；米国特許出願公開第２０１２／０１０１１４７８号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１２／００２７７９６号明細書のＩ又はＸＸＸＶ；米国特許出願公開第２０１２／００５８１４４号明細書のＸＩＶ又はＸＶＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０３２３２６９号明細書の；米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０２０２８７１号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ；米国特許出願公開第２０１１／００７６３３５号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、又はＸＶＩ；米国特許出願公開第２００６／００８３７８号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／００６４２４２号明細書のＩ又はＸ－Ａ－Ｙ－Ｚ；米国特許出願公開第２０１３／００２２６４９号明細書のＸＶＩ、ＸＶＩＩ、又はＸＶＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１０／００６２９６７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１８９３５１号明細書のＩ～Ｘ；米国特許出願公開第２０１４／００３９０３２号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書のＶ；米国特許出願公開第２０１６／０３１７４５８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１９５９２０号明細書のＩ；米国特許出願公開第１０，２２１，１２７号明細書の５、６、又は１０；国際公開第２０１８／０８１４８０号パンフレットのＩＩＩ－３；国際公開第２０２０／０８１９３８号パンフレットのＩ－５又はＩ－８；米国特許出願公開第９，８６７，８８８号明細書の１８又は２５；米国特許出願公開第２０１９／０１３６２３１号明細書のＡ；国際公開第２０２０／２１９８７６号パンフレットのＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書の１；米国特許出願公開第２０１９／０２４０３４９号明細書のＯＦ－０２；米国特許出願公開第１０，０８６，０１３号明細書の２３；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ（２０２０）のｃＫＫ－Ｅ１２／Ａ６；国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレットのＣ１２－２００；Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０１７）の７Ｃ１；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌの３０４－Ｏ１３又は５０３－Ｏ１３；米国特許第９，７０８，６２８号明細書のＴＳ－Ｐ４Ｃ２；国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレットのＩ；国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレットのＩ；及び国際公開第２０２１／１１３７７７号パンフレットの（１）、（２）、（３）又は（４）が挙げられる。例示的脂質としては、国際公開第２０２１／１１３７７７号パンフレットの表１～表１６のいずれか１つの脂質がさらに挙げられる。

【0479】

ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例９に記載されるようなＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３ｌＺ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３ｌ－テトラエン－ｌ９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１０に記載されるような脂質ＡＴＸ－００２である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１１に記載されるような（ｌ３Ｚ，ｌ６Ｚ）－Ａ，Ａ－ジメチル－３－ノニルドコサ－ｌ３、ｌ６－ジエン－ｌ－アミン（化合物３２）である。ある実施形態では、イオン化可能な脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（全体が参照により本明細書に援用される）の実施例１２に記載されるような化合物６又は化合物２２である。

【0480】

例示的な非カチオン性脂質としては、限定はされないが、ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－モノメチルＰＥなど）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（１６－Ｏ－ジメチルＰＥなど）、ｌ８－ｌ－ｔｒａｎｓ ＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リゾホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、又はそれらの混合物が挙げられる。他のジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用され得ることが理解される。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０～Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。さらなる例示的な脂質としては、特定の実施形態において、限定はされないが、参照により本明細書に援用される、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６に記載されるものが挙げられる。このような脂質としては、ある実施形態では、ｍＲＮＡ（例えば、ＤＧＴＳ）との肝臓トランスフェクションを改善することが分かっている植物脂質が挙げられる。

【0481】

脂質ナノ粒子に使用するのに好適な非カチオン性脂質の他の例としては、限定はされないが、非リン脂質、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル－アリールサルフェートポリエチルオキシ化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、セラミド、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。他の非カチオン性脂質が、国際公開第２０１７／０９９８２３号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（全内容が参照により本明細書に援用される）に記載される。

【0482】

ある実施形態では、非カチオン性脂質は、オレイン酸又は米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（全体が参照により本明細書に援用される）の式Ｉ、ＩＩ、若しくはＩＶの化合物である。非カチオン性脂質は、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を占め得る。ある実施形態では、非カチオン性脂質含量は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の５～２０％（ｍｏｌ）又は１０～１５％（ｍｏｌ）である。実施形態において、イオン化可能な脂質対中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１の範囲（例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、又は８：１）である。

【0483】

ある実施形態では、脂質ナノ粒子は、いずれのリン脂質も含まない。

【0484】

ある態様において、脂質ナノ粒子は、膜完全性を提供するために、ステロールなどの成分をさらに含み得る。脂質ナノ粒子に使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロール及びその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定的な例としては、極性類似体、例えば、５ａ－コレスタノール、５３－コプロスタノール、コレステリル－（２^，－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、及び６－ケトコレスタノール；非極性類似体、例えば、５ａ－コレスタン、コレステノン、５ａ－コレスタノン、５ｐ－コレスタノン、及びデカン酸コレステリル；及びそれらの混合物が挙げられる。ある実施形態では、コレステロール誘導体は、極性類似体、例えば、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテルである。例示的なコレステロール誘導体が、ＰＣＴ公開国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書（これらはそれぞれ、全体が参照により本明細書に援用される）に記載される。

【0485】

ある実施形態では、ステロールなどの、膜完全性を提供する成分は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０－５０％（ｍｏｌ）（例えば、０～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、又は４０～５０％）を占め得る。ある実施形態では、このような成分は、脂質ナノ粒子の総脂質含量の２０～５０％（ｍｏｌ）３０～４０％（ｍｏｌ）である。

【0486】

ある実施形態では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はコンジュゲート脂質分子を含み得る。一般に、これらは、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、及び／又は立体安定化を提供するのに使用される。例示的なコンジュゲート脂質としては、限定はされないが、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、カチオン性ポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられる。ある実施形態では、コンジュゲート脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）コンジュゲート脂質である。

【0487】

例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとしては、限定はされないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（ｌ－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧスクシネートジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－ｌ－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ）など）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－メトキシポリエチレングリコール２０００）－ｌ，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩、又はそれらの混合物が挙げられる。さらなる例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートが、例えば、米国特許第５，８８５，６ｌ３号明細書、米国特許第６，２８７，５９ｌ号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１７５６８２、米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書、及び米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書、及び国際公開第２０１７／０９９８２３号明細書（これらは全て、全内容が参照により本明細書に援用される）に記載される。ある実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（全内容が参照により本明細書に援用される）の式ＩＩＩ、ＩＩＩ－ａ－Ｉ、ＩＩＩ－ａ－２、ＩＩＩ－ｂ－１、ＩＩＩ－ｂ－２、又はＶの化合物である。ある実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書（これらは両方とも、全内容が参照により本明細書に援用される）の式ＩＩのものである。ある実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスタ－５－エン－３［β］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］のうちの１つ以上であり得る。ある実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］を含む。ある実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、

【化60】

から選択される構造を含む。

【0488】

ある実施形態では、ＰＥＧ以外の分子とコンジュゲートされた脂質も、ＰＥＧ－脂質の代わりに使用され得る。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲートなど）、及びカチオン性ポリマー脂質（ＧＰＬ）コンジュゲートが、ＰＥＧ－脂質の代わりに又はそれに加えて使用され得る。

【0489】

例示的なコンジュゲート脂質、すなわち、ＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート及びカチオン性ポリマー－脂質が、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（これらは全て、全内容が参照により本明細書に援用される）の表２に列挙されるＰＣＴ及びＬＩＳ特許出願に記載される。

【0490】

ある実施形態では、ＰＥＧ又はコンジュゲート脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を占め得る。ある実施形態では、ＰＥＧ又はコンジュゲート脂質含量は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０．５～１０％又は２～５％（ｍｏｌ）である。イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質、ステロール、及びＰＥＧ／コンジュゲート脂質のモル比は、必要に応じて変化され得る。例えば、脂質粒子は、組成物のモル又は総重量当たり３０～７０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり０～６０％のコレステロール、組成物のモル又は総重量当たり０～３０％の非カチオン性脂質及び組成物のモル又は総重量当たり１～１０％のコンジュゲート脂質を含み得る。好ましくは、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり３０～４０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり４０～５０％のコレステロール、及び組成物のモル又は総重量当たり１０～２０％の非カチオン性脂質を含む。ある他の実施形態において、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり５０～７５％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり２０～４０％のコレステロール、及び、組成物のモル又は総重量当たり５～１０％の非カチオン性脂質及び組成物のモル又は総重量当たり１～１０％のコンジュゲート脂質である。組成物は、組成物のモル又は総重量当たり６０～７０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり２５～３５％のコレステロール、及び組成物のモル又は総重量当たり５～１０％の非カチオン性脂質を含有し得る。組成物はまた、組成物のモル又は総重量当たり最大で９０％のイオン化可能な脂質及び組成物のモル又は総重量当たり２～１５％の非カチオン性脂質を含有し得る。製剤はまた、例えば、組成物のモル又は総重量当たり８～３０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり５～３０％の非カチオン性脂質、及び組成物のモル又は総重量当たり０～２０％のコレステロール；組成物のモル又は総重量当たり４～２５％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり４～２５％の非カチオン性脂質、組成物のモル又は総重量当たり２～２５％のコレステロール、組成物のモル又は総重量当たり１０～３５％のコンジュゲート脂質、及び組成物のモル又は総重量当たり５％のコレステロール；又は組成物のモル又は総重量当たり２～３０％のイオン化可能な脂質、組成物のモル又は総重量当たり２～３０％の非カチオン性脂質、組成物のモル又は総重量当たり１～１５％のコレステロール、組成物のモル又は総重量当たり２～３５％のコンジュゲート脂質、及び組成物のモル又は総重量当たり１～２０％のコレステロール；或いは組成物のモル又は総重量当たり最大で９０％のイオン化可能な脂質及び組成物のモル又は総重量当たり２～１０％の非カチオン性脂質、或いは組成物のモル又は総重量当たり１００％のカチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子製剤であり得る。ある実施形態では、脂質粒子製剤は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化可能な脂質、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。ある他の実施形態において、脂質粒子製剤は、６０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化可能な脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。

【0491】

ある実施形態では、脂質粒子は、イオン化可能な脂質、非カチオン性脂質（例えばリン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）及びＰＥＧ化脂質を含み、ここで、脂質のモル比は、イオン化可能な脂質では２０～７０モルパーセントの範囲であり、目標は４０～６０であり、非カチオン性脂質のモルパーセントは、０～３０の範囲であり、目標は０～１５であり、ステロールのモルパーセントは、２０～７０の範囲であり、目標は３０～５０であり、ＰＥＧ化脂質のモルパーセントは、１～６の範囲であり、目標は２～５である。

【0492】

ある実施形態では、脂質粒子は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化可能な脂質／非カチオン性脂質／ステロール／コンジュゲート脂質を含む。

【0493】

一態様において、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。

【0494】

ある実施形態では、１つ以上のさらなる化合物も含まれ得る。それらの化合物は、別々に投与され得、又はさらなる化合物は、本発明の脂質ナノ粒子に含まれ得る。言い換えると、脂質ナノ粒子は、核酸又は第１の核酸と異なる少なくとも第２の核酸に加えて、他の化合物を含有し得る。限定はされないが、他のさらなる化合物は、小型若しくは大型有機又は無機分子、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びその誘導体、ペプチド模倣薬、核酸、核酸類似体及び誘導体、生体材料から作製された抽出物、又はそれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。

【0495】

ある実施形態では、ＬＮＰは、生分解性、イオン化可能な脂質を含む。ある実施形態では、ＬＮＰは、（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，ｌ２－ジエノエート（３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－オクタデカ－９，ｌ２－ジエノエート）とも呼ばれる）又は別のイオン化可能な脂質を含む。例えば、国際公開第２０１９／０６７９９２号パンフレット、国際公開第／２０１７／１７３０５４号パンフレット、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット、及び国際公開第２０１４／１３６０８６号パンフレット、並びにその中に提供される参考文献の脂質を参照されたい。ある実施形態では、ＬＮＰ脂質に関するカチオン性及びイオン化可能という用語は、同義的であり、例えば、イオン化可能な脂質は、ｐＨに応じてカチオン性である。

【0496】

ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される、数１０ｎｍ～数１００ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ、又は１５０ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ、又は約９０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。特定の実施形態において、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約８０ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約１００ｎｍであり得る。ある実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ直径は、約ｌｍｍ～約５００ｍｍ、約５ｍｍ～約２００ｍｍ、約１０ｍｍ～約１００ｍｍ、約２０ｍｍ～約８０ｍｍ、約２５ｍｍ～約６０ｍｍ、約３０ｍｍ～約５５ｍｍ、約３５ｍｍ～約５０ｍｍ、又は約３８ｍｍ～約４２ｍｍの範囲である。

【0497】

ＬＮＰは、ある場合には、比較的均質であり得る。多分散指数は、ＬＮＰの均質性、例えば、脂質ナノ粒子の粒度分布を示すのに使用され得る。小さい（例えば、０．３未満の）多分散指数は、一般に、狭い粒度分布を示す。ＬＮＰは、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、又は０．２５の多分散指数を有し得る。ある実施形態では、ＬＮＰの多分散指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。

【0498】

ＬＮＰのゼータ電位は、組成物の界面動電位を示すのに使用され得る。ある実施形態では、ゼータ電位は、ＬＮＰの表面電荷を表し得る。より高度に荷電された種は、身体内の細胞、組織、及び他の要素と不必要に相互作用し得るため、正又は負の比較的低い電荷を有する脂質ナノ粒子が一般に望ましい。ある実施形態では、ＬＮＰのゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、又は約＋５ｍＶ～約＋１０ｍＶであり得る。

【0499】

タンパク質及び／又は核酸の封入の効率は、提供される初期量と比べた、調製後にＬＮＰで封入されるか又は他の形でＬＮＰと結合されるタンパク質及び／又は核酸の量を表す。封入効率は、高い（例えば、ほぼ１００％）のが望ましい。封入効率は、例えば、１つ以上の有機溶媒又は洗浄剤で脂質ナノ粒子を分解する前及び後で脂質ナノ粒子を含有する溶液中のタンパク質又は核酸の量を比較することによって、測定され得る。アニオン交換樹脂が、溶液中の遊離タンパク質又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定するのに使用され得る。蛍光が、溶液中の遊離タンパク質及び／又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定するのに使用され得る。本明細書に記載される脂質ナノ粒子の場合、タンパク質及び／又は核酸の封入効率は、少なくとも５０％、例えば５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％であり得る。ある実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。ある実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。ある実施形態では、封入効率は、少なくとも９５％であり得る。

【0500】

ＬＮＰは、任意に、１つ以上のコーティングを含み得る。ある実施形態では、ＬＮＰは、コーティングを有するカプセル、フィルム、又は錠剤に製剤化され得る。本明細書に記載される組成物を含むカプセル、フィルム、又は錠剤は、任意の有用なサイズ、引張り強さ、硬度又は密度を有し得る。

【0501】

ＬＮＰの追加的な例示的脂質、製剤、方法、及び特徴付けについては、国際公開第２０２０／０６１４５７号パンフレット、国際公開第２０２１／１１３７７７号パンフレット、及び国際公開第２０２１２２６５９７号パンフレット（これらの各々は、本明細書において全体として参照により援用される）により教示されている。ＬＮＰのさらなる例示的脂質、製剤、方法、及び特徴付けについては、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍａｔｅｒ（２０２１）．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５７８－０２１－００３５８－０（全体として参照により本明細書に援用される）により教示されている（例えば、Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．の図２の例示的脂質及び脂質誘導体を参照のこと）。

【0502】

ある実施形態では、インビトロ又はエクスビボ細胞リポフェクションが、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又はＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いて行われる。特定の実施形態において、ＬＮＰは、ＧｅｎＶｏｙ＿ＩＬＭイオン化可能な脂質混合物（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて製剤化される。特定の実施形態において、ＬＮＰは、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ）又はジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノブチレート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）を用いて製剤化され、その製剤及びインビボでの使用が、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５１（３４）：８５２９－３３（２０１２）（全体が参照により本明細書に援用される）に教示される。

【0503】

ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えば、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ ＲＮＰ、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの送達のために最適化されたＬＮＰ製剤が、国際公開第２０１９０６７９９２号パンフレット及び国際公開第２０１９０６７９１０号パンフレット（両方とも参照により援用される）に記載され、環状ポリリボヌクレオチド及び本明細書に記載される線状ポリリボヌクレオチドの送達のために有用である。

【0504】

核酸（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）の送達に有用なさらなる特定のＬＮＰ製剤が、米国特許第８１５８６０１号明細書及び米国特許第８１６８７７５号明細書（両方とも参照により援用される）に記載され、これは、ＯＮＰＡＴＴＲＯの名称で販売されているパチシラン中で使用される製剤を含む。

【0505】

本明細書に記載される免疫原又はポリペプチドの少なくとも一部分（例えば、抗原性部分）をコードするポリリボヌクレオチド（例えば、実施形態において、ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）の例示的投与用量はＬＮＰに製剤化され、ここで、（ａ）ＬＮＰはカチオン性脂質、中性脂質、コレステロール、及びＰＥＧ脂質を含み、（ｂ）ＬＮＰは８０ｎｍ～１６０ｎｍの平均粒径を有し、及び（ｃ）ポリリボヌクレオチドは、（ｉ）５’－キャップ構造；（ｉｉ）５’－ＵＴＲ；（ｉｉｉ）Ｎ１－メチル－プソイドウリジン、シトシン、アデニン、及びグアニン；（ｉｖ）３’－ＵＴＲ；及び（ｖ）ポリＡ領域を含む。実施形態において、ＬＮＰに製剤化されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）は、ワクチンである。

【0506】

ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）の例示的投与用量は、約０．１、０．２５、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０、又は１００ｍｇ／ｋｇ（ＲＮＡ）を含み得る。一部の実施形態において、本明細書に記載されるポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）免疫原性組成物の用量は、３０～２００ｍｃｇ、例えば、３０ｍｃｇ、５０ｍｃｇ、７５ｍｃｇ、１００ｍｃｇ、１５０ｍｃｇ、又は２００ｍｃｇである。ポリリボヌクレオチド（例えば、環状ポリリボヌクレオチド、線状ポリリボヌクレオチド）を含むＡＡＶの例示的投与用量は、約１０^１１、１０^１２、１０^１３、及び１０^１４ｖｇ／ｋｇのＭＯＩを含み得る。

【0507】

キット
一部の態様において、本開示はキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、（ａ）本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド、免疫原性組成物、又は医薬組成物と、任意選択で（ｂ）情報資料とを含む。一部の実施形態において、キットは本明細書に記載されるアジュバントをさらに含み、これは、決められた用量投与レジメンの一環として環状ポリリボヌクレオチド、免疫原性組成物、又は医薬組成物と組み合わせて投与されることになる別個の組成物として提供されてもよい。情報資料は、本明細書に記載される方法及び／又は本明細書に記載される方法のための医薬組成物又は環状ポリリボヌクレオチドの使用に関する説明的な、指導的な、販売促進となる又はその他の資料であり得る。医薬組成物又は環状ポリリボヌクレオチドは、単回投与用の材料を含んでもよく（例えば、単回投薬形態）、又は複数回投与用の材料を含んでもよい（例えば、「マルチ用量」キット）。

【0508】

キットの情報資料は、その形態の点で限定されない。一実施形態において、情報資料は、医薬組成物、医薬原薬、又は医薬薬物製品の生産、医薬組成物、医薬原薬、又は医薬薬物製品の分子量、濃度、有効期限、バッチ又は生産施設情報などに関する情報を含み得る。一実施形態において、情報資料は、ある投薬形態の医薬組成物の投与方法に関する。一実施形態において、情報資料は、ある投薬形態の環状ポリリボヌクレオチドの投与方法に関する。

【0509】

ある投薬形態にある本明細書に記載される医薬組成物及び環状ポリリボヌクレオチドに加えて、キットは、溶媒又は緩衝液、安定剤、保存剤、香味剤（例えば、苦味遮断剤又は甘味料）、芳香剤、色素又は着色剤、例えば、キット中にある１つ以上の成分に色合いを付ける又はそれを着色するためのもの、又は他の美容成分、及び／又は本明細書に記載される病態又は障害の治療用の第２の薬剤など、他の原料を含み得る。或いは、こうした他の原料はキットに含まれてもよいが、本明細書に記載される医薬組成物又は環状ポリリボヌクレオチドと異なる組成物又は容器に含まれる。かかる実施形態において、キットは、本明細書に記載される医薬組成物又は核酸分子（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）及び他の原料を混合するように指示する、又は本明細書に記載される医薬組成物又は核酸分子（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）を他の原料と一緒に使用するように指示する説明書を含み得る。

【0510】

一部の実施形態において、キットの成分は、不活性条件下に（例えば、窒素下又はアルゴンなどの別の不活性ガス下に）保存される。一部の実施形態において、キットの成分は、無水条件下に（例えば、乾燥剤と共に）保存される。一部の実施形態において、成分は、琥珀色のバイアルなど、遮光性容器に保存される。

【0511】

ある投薬形態にある本明細書に記載される医薬組成物又は核酸分子（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は、任意の形態、例えば、液体、乾燥又は凍結乾燥形態で提供されてもよい。本明細書に記載される医薬組成物又は核酸分子（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）は実質的に純粋である及び／又は無菌であることが好ましい。本明細書に記載される医薬組成物又は核酸分子（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）が液体溶液で提供されるとき、液体溶液は好ましくは水溶液であり、滅菌水溶液が好ましい。本明細書に記載される医薬組成物又は核酸分子（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）が乾燥した形態で提供されるとき、再構成は、概して好適な溶媒を加えることによる。キットには、溶媒、例えば、滅菌水又は緩衝液が任意選択で提供されてもよい。

【0512】

キットは、本明細書に記載される投薬形態を入れる組成物用の１つ以上の容器を含み得る。一部の実施形態において、キットには、組成物及び情報資料用の別個の容器、仕切り又は区画が含まれる。例えば、医薬組成物又は環状ポリリボヌクレオチドがボトル、バイアル、又はシリンジに収容されてもよく、情報資料がプラスチック製のクリアファイル又は小袋に収容されてもよい。他の実施形態では、キットの別個の要素が、単一の仕切りのない容器に収容される。例えば、本明細書に記載される医薬組成物又は核酸分子（例えば、環状ポリリボヌクレオチド）の投薬形態は、それに表示の形態の情報資料が貼り付けられたボトル、バイアル又はシリンジに収容される。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載される医薬組成物又は環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の単位投薬形態を各々が収容する複数の（例えば、一包みの）個別の容器を含む。例えば、キットは、本明細書に記載される投薬形態の単一の単位用量を各々が収容する複数のシリンジ、アンプル、フォイル小袋、又はブリスターパックを含む。

【0513】

キットの容器は、気密、防水性（例えば、水分量又は蒸発量の変化に対して不透過性）、及び／又は遮光性であってもよい。

【0514】

キットは、任意選択で、投薬形態の使用に好適な装置、例えば、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、綿棒（例えば、綿棒又は木製スワブ）、又は任意のかかる装置を含む。

【0515】

本発明のキットは、本明細書に記載される初期相レジメン、誘導相レジメン、又は維持相レジメンのうちの１つ以上に好適な用量を対象に提供するため様々な強度の投薬形態を含み得る。或いは、キットは、必要に応じて使用者が分割した用量を投与することができるように、割線入りの錠剤を含み得る。

【実施例】

【0516】

以下の例は、本開示を限定するのでなく、むしろ例示することが意図されるものであり、本明細書に記載される組成物及び方法がどのように使用され、作成され、及び評価され得るかについての説明を当業者に提供するために提示される。これらの例は、単に本開示の例示であることが意図され、本発明者らがその発明であると見なすものの範囲を限定することは意図されない。

【0517】

実施例１：多量体化及び免疫原配列をコードする環状ＲＮＡの設計、生成、及び精製
本例は、多量体化ドメイン（例えば、フェリチン、ｂａｎｎ、Ｔ４フォルドン、又はＡａＬＳフォルドンドメイン）及び免疫原をコードする環状ＲＮＡの設計及びインビトロ生成及び精製について記載する。

【0518】

配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、多量体化ドメインに融合した免疫原をコードするヌクレオチド配列とを含むように環状ＲＮＡを設計した。本例では、ＤＮＡ構築物は、ＩＲＥＳ、ポリヌクレオチドカーゴ、及びスペーサーエレメントを含むように設計した。ポリヌクレオチドカーゴにＯＲＦが含まれた。ＯＲＦには、分泌シグナル配列又は天然リーダー配列と、免疫原及び多量体化ドメインをコードするヌクレオチド配列とが含まれた。Ｔ４フォルドン、ｂａｎｎ、又はフェリチン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原、又はインフルエンザＨＡ免疫原を含む構築物の設計を表３に提供する。

【0519】

【表3-1】

【0520】

【表3-2】

【0521】

【表3-3】

【0522】

【表3-4】

【0523】

【表3-5】

【0524】

【表3-6】

【0525】

【表3-7】

【0526】

【表3-8】

【0527】

修飾されたＣＶＢ３ ＩＲＥＳ（配列番号８０）と、ＯＲＦとしてＴ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＲＳＶ Ｆ免疫原（その天然リーダー配列を含む）又はヒトＭＰＶ Ｆ免疫原（その天然リーダー配列を含む）との組み合わせを含むようなＤＮＡ構築物もまた設計した。

【0528】

本例では、環状ＲＮＡは、本明細書に記載される方法を用いて自己スプライシングにより生成した。７．５ｍＭのＮＴＰの存在下、上記に挙げたモチーフを含むＤＮＡ鋳型からＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して未修飾の線状ＲＮＡをインビトロ転写により合成した。合成された線状ＲＮＡをＲＮＡクリーンアップキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｔ２０５０）で精製した。転写中に自己スプライシングが起こった；追加の反応は不要であった。この環状ＲＮＡを尿素ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素－ＰＡＧＥ）によるか、又は逆相カラムクロマトグラフィーにより精製した。

【0529】

実施例２：多量体化ドメインを有する免疫原のインビトロ発現
本例では、哺乳類細胞における環状ＲＮＡからの多量体化ドメインを含む免疫原の発現を実証する。

【0530】

Ｔ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（核酸配列番号８４；アミノ酸配列番号８５）をコードする環状ＲＮＡドメイン（ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ－フォルドン）を実施例１に記載されるとおり作製した。多量体化ドメインのないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（核酸配列番号８２；アミノ酸配列番号８３）をコードする環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ（単量体））を本明細書に記載される方法により作製し、精製した。両方の構築物とも、ＩＲＥＳエレメントとして

【化61】

の核酸配列を有するＥＭＣＶを含んだ。

【0531】

Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＭＲＮＡ０１５）を製造者の指示に従い使用して環状ＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔにトランスフェクトした。ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ単独（ブランク）を対照として使用した。組換えＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ；４０５９２－Ｖ０８Ｈ）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ三量体タンパク質（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；ＳＰＤ－Ｃ５２Ｍ５－２００ｕｇ）もまた対照として使用した（それぞれ、ＲＢＤ対照及びＲＢＤ三量体対照）。２４時間後に細胞上清を回収した。試料を非変性条件下又は変性条件下（ローディング緩衝液、β－メルカプトエタノール不含対含有）でＳＤＳ－ＰＡＧＥによってゲル上で泳動させた。次に、２Ｇ１抗ＲＢＤモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２７７６２４）を一次抗体とし、及び蛍光「６８０ＣＷ」ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｌｉｃｏｒ、９２６－６８０７０）を二次抗体としてウエスタンブロッティングを実施した。結果は図６に示し、ここでアスタリスクは、変性条件下で泳動した試料（即ち、ローディング緩衝液中にβ－メルカプトエタノールを含んだ試料）を特定している。

【0532】

図６は、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤがＨＥＫ２９３ＴにおいてＲＢＤ単量体を発現すること、及びＴ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするｃｉｒｃＲＮＡが、インビトロで三量体構造を発現して形成する（三量体）ことを示している。

【0533】

実施例３：マウスモデルにおける環状ＲＮＡからの免疫原のインビボ発現
本例では、環状ＲＮＡからの多量体化ドメインを有する及び有しない免疫原のインビボ発現を実証する。

【0534】

フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（核酸配列番号８４；アミノ酸配列番号８５）をコードする環状ＲＮＡドメイン（ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ－フォルドン（三量体））を実施例１に記載されるとおり作製した。多量体化ドメインのないＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（核酸配列番号８２；アミノ酸配列番号８３）をコードする環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ（単量体））を本明細書に記載される方法により作製し、精製した。両方の構築物とも、ＩＲＥＳエレメントとしてＥＭＣＶ（配列番号７９）を含んだ。

【0535】

精製された環状ＲＮＡを脂質ナノ粒子となるように製剤化して、環状ＲＮＡ調製物を入手した。簡潔に言えば、環状ＲＮＡを２５ｍＭ酢酸塩緩衝液ｐＨ＝４（０．２ｕｍフィルタでろ過した）で０．２μｇ／ｕＬの濃度に希釈した。初めにイオン性脂質（例えば、ＡＬＣ０３１５）、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＤＭＧ－ＰＥＧ２０００をエタノール（０．２ｕｍ滅菌フィルタでろ過した）に５０／３８．５／１０／１．５ｍｏｌ％のモル比で溶解することにより、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を製剤化した。最終的なイオン性脂質／ＲＮＡの重量比は６／１ｗ／ｗであった。マイクロフルイディクスシステムを使用して脂質及びＲＮＡ溶液を３／１の緩衝液／エタノールの流量比及び１ｍｌ／分の総流量でマイクロミキサーチップにて混合した。次にＬＮＰをＰＢＳ ｐＨ＝７．４で３時間透析してエタノールを除去した。必要に応じて、ＬＮＰをＡｍｉｃｏｎ遠心フィルタ、１００ｋＤａカットオフを使用して所望のＲＮＡ濃度に濃縮した。

【0536】

０日目（プライミング）及び２８日目（ブースト）に、各群３匹のＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝３）に５μｇ用量の環状ＲＮＡ調製物を筋肉内注射で投与した。プライミングの２４時間後、各マウスから血清試料を収集した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原特異的ＥＬＩＳＡを用いて単量体及び三量体の発現を測定した。ＥＬＩＳＡプレートを捕捉抗体（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０１５０－Ｄ００３）で一晩コーティングした。プレートをＴＢＳＴ＋２％ＢＳＡでブロックし、血清をブロッキング緩衝液で希釈して、次にプレートに加えた。ＨＲＰコンジュゲート検出抗体（４０１５０－Ｄ００１－Ｈ、Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）でＲＢＤを検出した。データは各群３匹の動物の平均値として図７に示す。プライミング後２４時間で血清中に同程度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びＴ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原が検出された。

【0537】

これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びＴ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原がマウスモデルにおいて環状ＲＮＡから同等のレベルで発現したことを示している。

【0538】

実施例４：マウスモデルにおける環状ＲＮＡからの免疫原の免疫原性
本例では、多量体化ドメインを有する免疫原をコードする環状ＲＮＡがマウスにおいて免疫原特異的応答を誘導することを実証する。

【0539】

１４、２７、３５、及び４２日目に、実施例３に記載されるとおり環状ＲＮＡ調製物を投与したマウスから血清試料を単離した。結合抗体応答をＥＬＩＳＡにより以下のとおり測定した：ＲＢＤ特異的ＩｇＧの存在について個別の血清試料をアッセイした。ＥＬＩＳＡプレートを１００μＬの１×コーティング緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２１７０１）中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２－Ｖ０８Ｂ；１００ｎｇ）又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２－ＲＢＤ（Ｓｉｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、４０５９２－Ｖ０８Ｈ）により４℃で一晩コーティングした。次にプレートをブロッキング緩衝液（２％ＢＳＡ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０含有ＴＢＳ）で１時間ブロックした。血清試料を８回段階希釈し（５００から８，１９２，０００までの４倍希釈）、次に各ウェルの１００μＬブロッキング緩衝液に加え、室温で１時間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎ（登録商標）デタージェント（ＴＢＳ－Ｔ）含有の１×トリス緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、プレートを抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ検出抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７０２３）と共に１時間インキュベートし、続いてＴＢＳ－Ｔで３回洗浄し、次にテトラメチルベンゼン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、４２１１０１）を加えた。ＥＬＩＳＡプレートを１０～２０分間反応させておき、次に０．２Ｎ硫酸を使用してクエンチした。光学濃度（Ｏ．Ｄ．）値を４５０ｎｍで決定した。エンドポイント力価は、吸光度値がバックグラウンドの４倍になった最終的な希釈度として定義した。

【0540】

図８は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＲＢＤをコードするｃｉｒｃＲＮＡ又はＴ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするｃｉｒｃＲＮＡによる免疫化後１４、２７、３５及び４２日目の平均エンドポイント力価を示す。注射後４２日目にマウスを犠牲にし、脾臓を回収し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ Ｔ細胞応答に関してＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより製造者のプロトコル（Ｍａｂｔｅｃｈ、３３２１－４ＨＰＴ－１０）に従い試験した。簡潔に言えば、脾臓を摘出し、単一細胞懸濁液となるように処理した。脾細胞をＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔプレートに各ウェル０．５Ｍ細胞で播いた。脾細胞は、刺激していないか、又はＲＢＤ １ｕｇ／ｍＬ若しくはＲＢＤペプチドプール（ＪＰＴ、ＰＭ－ＷＣＰＶ－Ｓ－ＲＢＤ－２）で刺激したかのいずれかであった。細胞を一晩培養し、翌日、製造者のプロトコルに従いプレートを発色させた。

【0541】

これらの結果は、ｃｉｒｃＲＮＡ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びＴ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするｃｉｒｃＲＮＡの両方が、免疫化後のマウスにおいてＴ細胞応答をプライミングすることを示している（図９）。

【0542】

注射後４２日目に収集した血清からの中和抗体力価をプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）で試験した。手短に言えば、血清を段階希釈し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスストックと混合し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に置いた。プレートを低融点アガロースで覆い、３日間インキュベートした後、続いて固定し、クリスタルバイオレットで染色した。中和価をＩＤ５０：血清によってプラーク数が５０パーセント（５０％）減少するときの希釈度として報告した。図１０は、ｃｉｒｃＲＮＡ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ及びＴ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするｃｉｒｃＲＮＡの両方が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する中和抗体を生成したことを示している。

【0543】

この実施例４の結果は、環状ＲＮＡから発現した多量体化ドメインを有する免疫原がマウスにおいて免疫原特異的応答を誘導することを実証している。

【0544】

実施例５：非ヒト霊長類モデルにおける環状ＲＮＡからの免疫原のインビボ発現
本例では、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）における環状ＲＮＡからの多量体化ドメインを有する免疫原のインビボ発現を実証する。

【0545】

Ｔ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原（核酸配列番号８４；アミノ酸配列番号８５）をコードする、及びＩＲＥＳとしてＥＭＣＶ（配列番号７９）を含む環状ＲＮＡを、実施例１に記載されるとおり作製した。

【0546】

環状ＲＮＡを実施例３に記載されるとおりＬＮＰに製剤化した（ＬＮＰ製剤化した環状ＲＮＡ）。環状ＲＮＡはまた、等容積のＡｄｄａＳＯ３（商標）アジュバント溶液と混合することによっても製剤化した（アジュバント化した環状ＲＮＡ）。

【0547】

０日目（プライミング）及び２８日目（ブースト）に、各群３匹のカニクイザル（ｎ＝３）に３０μｇ又は１００μｇ用量のＬＮＰ製剤化した環状ＲＮＡ、又は１０００μｇ用量のアジュバント化した環状ＲＮＡのいずれかを筋肉内注射で投与した。プライミング後６時間、１日目、４日目、６日目、各サルから血清試料を収集した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅイムノアッセイを製造者のプロトコル（ＭＤＳ、Ｓ－ＰＬＥＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅキット、Ｋ１５０ＡＤＪＳ－２）に従い使用して、Ｔ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原レベルを測定した。

【0548】

アジュバント化した環状ＲＮＡを投与したサルの血清中では、Ｔ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原の発現は検出されなかった。１００μｇのＬＮＰ製剤化した環状ＲＮＡの投与を受けたサルの血清中では、Ｔ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原が検出された（図１１、データは各群３匹の動物の平均値として示す）。プライミング後６時間で、Ｔ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原の約３５００ｆｇ／ｍＬというレベルが検出され、試料を収集した期間であるプライミング後６日が経過する中で、Ｔ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原の濃度は低下した。

【0549】

実施例６：非ヒト霊長類モデルにおける環状ＲＮＡからの免疫原の免疫原性
本例では、多量体化ドメインを有する免疫原をコードする環状ＲＮＡが、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において免疫原特異的応答を誘導することを実証する。

【0550】

プライミング後１４、３５、４２、及び５６日目に、実施例５に記載されるとおり１００μｇ用量のＬＮＰ製剤化した環状ＲＮＡ又は１０００μｇ用量のアジュバント化した環状ＲＮＡを投与したサルから血清試料を単離した。

【0551】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅイムノアッセイを製造者のプロトコルに従い使用して（ＭＤＳ、Ｓ－ＰＬＥＸ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクキット、Ｋ１５０ＡＤＪＳ－２）、結合抗体を検出した。ＮＨＰ血清を１：１０００又は１：５０００又は１：５００００で希釈した。プール血清標準を使用して結合抗体濃度を内挿し、結果を１ｍＬ当たりの国際単位幾何平均値として報告した。

【0552】

図１２は、採血前、アジュバント化した環状ＲＮＡ及びＬＮＰ製剤化した環状ＲＮＡによる免疫化後１４日目及び４２日目における抗体の幾何平均値を示す。これらの結果は、ＬＮＰ製剤化した環状ＲＮＡがプライミング後４２日目にＲＢＤ特異的的結合抗体をプライミングしたこと、及びアジュバント化した環状ＲＮＡが、入手されたものと同程度のＲＢＤ特異的的結合抗体をプライミングしたことを示している。

【0553】

採血前、プライミング後１４日目及び４２日目に収集した血清から、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）で中和抗体力価を試験した。手短に言えば、血清を段階希釈し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスストックと混合し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に置いた。プレートを低融点アガロースで覆い、３日間インキュベートした後、続いて固定し、クリスタルバイオレットで染色した。中和価をＩＤ５０：血清によってプラーク数が５０パーセント（５０％）減少するときの希釈度として報告した。データを採血前、並びにブースト後１４日目及び４２日目の中和力価幾何平均値として図１３に示す。

【0554】

図１３は、Ｔ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするＬＮＰ製剤化した環状ＲＮＡ及びＴ４フォルドン多量体化ドメインに融合したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ免疫原をコードするアジュバント化した環状ＲＮＡの両方が、中和ＳＡＲＳ－ＣｏＣ－２中和抗体をプライミングしたことを示している。

【0555】

実施例７：非ヒト霊長類モデルにおける環状ＲＮＡからの免疫原のＴ細胞応答
免疫化前及び免疫化後４２日目に末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を回収し、凍結する。ＰＢＭＣを解凍し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＢＤ特異的Ｔ細胞の存在を検出した。ＩＦＮ－γ又はＩＬ－４ ＥＬＩＳｐｏｔプレート（ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）の各ウェルに０．２Ｍ細胞を播き、未刺激のままか、又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ペプチドプール（ＪＰＴ、ＰＭ－ＷＣＰＶＳ－２）で刺激するかのいずれかとする。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを製造者のプロトコルに従い処理する。

【0556】

実施例８：多量体化及び免疫原配列をコードする環状ＲＮＡの設計、生成、及び精製
本例は、多量体化ドメイン（例えば、フェリチン、ｂａｎｎ、Ｔ４フォルドン、ＡａＬＳ）及び免疫原（例えば、ｇＥ ＶＺＶ免疫原又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ ＲＢＤ免疫原）をコードする環状ＲＮＡの設計及びインビトロ生成及び精製について記載する。ＩＲＥＳ、及び多量体化ドメインに融合したＶＺＶ又は別の免疫原をコードする核酸配列を含むように環状ＲＮＡを設計する。一部の環状ＲＮＡは、天然リーダー配列又は分泌シグナルをコードする。

【0557】

本例では、環状ＲＮＡは、２つの例示的方法の一方により生成し、ＲＮＡ精製システムで再び精製する。

【0558】

例示的方法１：ＤＮＡ－スプリントライゲーション
この方法では、環状ＲＮＡはスプリントライゲーションにより作製される。ＲｐｐＨ処理した線状ＲＮＡをスプリントＤＮＡを使用して環化する。非修飾線状ＲＮＡをインビトロ転写によりＤＮＡセグメントからＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成する。転写されたＲＮＡをＲＮＡ精製システム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で精製し、ＲＮＡ ５’ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３５６）で製造者の指示に従い処理する。それに代えて、又は加えて、ＧＴＰに対してＧＭＰ過剰でＲＮＡを転写する。

【0559】

スプリントライゲーションは、以下のとおり実施する：転写された線状ＲＮＡ及び１０～４０ヌクレオチド長のＤＮＡスプリントをＲＮＡリガーゼを使用して処理することにより、環状ＲＮＡを生成する。この環状ＲＮＡを精製するため、ライゲーション混合物を４％変性ＰＡＧＥで分離し、各環状ＲＮＡに対応するＲＮＡバンドを切り出す。切り出したＲＮＡゲル断片を潰し、ＲＮＡをゲル溶出緩衝液（０．５Ｍ酢酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）により３７℃で１時間溶出する。それに代えて、又は加えて、環状ＲＮＡはカラムクロマトグラフィーにより精製する。上清を回収し、潰したゲルにゲル溶出緩衝液を加えることにより再びＲＮＡを溶出し、１時間インキュベートする。遠心フィルタによりゲルの残屑を除去し、エタノールで沈殿させる。アガロースゲル電気泳動を純度及び環化を検証するための品質管理尺度として用いる。

【0560】

例示的方法２：イントロンの自己スプライシングによる環化
この方法では、環状ＲＮＡは自己スプライシングにより作製される。環状ＲＮＡをインビトロで生成する。上記に挙げた全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から、非修飾の線状ＲＮＡをインビトロ転写する。インビトロ転写反応には、１μｇの鋳型ＤＮＡ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、１０×のＴ７反応緩衝液、７．５ｍＭ ＡＴＰ、７．５ｍＭ ＣＴＰ、７．５ｍＭ ＧＴＰ、７．５ｍＭ ＵＴＰ、１０ｍＭ ＤＴＴ、４０Ｕ ＲＮアーゼ阻害薬、及びＴ７酵素が含まれた。転写を３７℃で４時間実行する。転写されたＲＮＡは、１ＵのＤＮアーゼＩによって３７℃で１５分間処理したＤＮアーゼである。自己スプライシングによる環化に有利に働くように、２ｍＭの最終濃度となるように追加のＧＴＰを加え、５５℃で１５分間インキュベートする。次にＲＮＡをカラム精製し、尿素－ＰＡＧＥによって可視化する。

【0561】

実施例９：多量体化ドメインを有する免疫原のインビトロ発現
本例は、哺乳類細胞における環状ＲＮＡからの免疫原の発現について記載する。多量体化ドメインを有するＲＮＡ構築物からの免疫原の発現を測定するため、免疫原をコードする環状ＲＮＡを本明細書に記載される方法のとおりに作製し、精製する。ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＭＲＮＡ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔに環状ＲＮＡ（１ピコモル）をトランスフェクトする（無血清培地が入った２４ウェルプレートの各ウェルにつき２００，０００細胞）。２４時間後に細胞上清を回収する。ＥＬＩＳＡを以下のとおり実施する：捕捉抗体をＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ ４４２４０４、９６ウェル）に１００μＬ ＰＢＳ中４℃で一晩コーティングする。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、プレートをブロッキング緩衝液（２％ＦＢＳ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ２０含有ＴＢＳ）で１時間ブロックする。次に１００μＬブロッキング緩衝液が入った各ウェルに上清希釈液を加え、室温で１時間インキュベートする。ＴＢＳ－Ｔで３回洗浄した後、プレートをＨＲＰ検出抗体と共に室温で１時間インキュベートする。各ウェルにテトラメチルベンゼン（Ｐｉｅｒｃｅ ３４０２１）を加えて５～１５分間反応させておき、次に２Ｎ硫酸でクエンチする。光学濃度（ＯＤ）値は４５０ｎｍで決定することになる。免疫原多量体化が成功したという確認は、多量体化ドメインを有する又は有しない免疫原をコードする環状ＲＮＡをトランスフェクトした細胞からの上清を非変性Ｂｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅ ＰＡＧＥにおいて泳動させることにより決定する。ウエスタンブロッティングのためＢｌｕｅ Ｎａｔｉｖｅゲルをポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に転写し、免疫原を特異的一次抗体、続いて蛍光タグを付加した抗アイソタイプ二次抗体でプローブする。多量体化した免疫原は、多量体化していない免疫原よりも高い分子量として現れることが期待されることになる。

【0562】

実施例１０：マウスモデルにおける環状ＲＮＡからの免疫原のインビボ発現
本例では、環状ＲＮＡからの多量体化ドメインを有する及び有しない免疫原のインビボ発現を実証する。環状ＲＮＡを実施例８に記載されるとおり設計し、作製する。環状ＲＮＡを脂質ナノ粒子となるように製剤化して、環状ＲＮＡ調製物を入手する。様々な異なる濃度の環状ＲＮＡ調製物を、多量体化ドメインをコードしない環状ＲＮＡによる群を含め、各群３匹のマウスに投与する。環状ＲＮＡ調製物は０日目にマウスに筋肉内投与し、２回目の投与を４週間後に行う。対照群のマウスは溶媒により環状ＲＮＡなしで治療する。全時間経過を通じて血液試料を採取し、ＥＬＩＳＡにより血清中の免疫原特異的抗体価をモニタする。投与後１日、２日、３日、及び７日の時点で、次に毎週９週間にわたり、各マウスから顎下腺出血により血液（約１００μｌ）を収集して乾燥したチューブに入れる。４℃にて１，３００ｇで２５分間遠心することにより血清を収集し、免疫原レベルをＥＬＩＳＡにより製造者の指示に従い測定する。

【0563】

最後の時点後にマウスを犠牲にする。脾臓及び血液を回収し、脾細胞及び血清を免疫原特異性に関してフローサイトメトリー及びＥＬＩＳｐｏｔにより試験する。収集した血清を感染阻害アッセイで試験して、血清抗体の中和能を決定する。

【0564】

実施例１１：マウスモデルにおけるアジュバントと共に送達した環状ＲＮＡからの免疫原のインビボ発現
本例では、ＡｄｄａＳＯ３（商標）アジュバントなど、アジュバントと一緒に送達することによる免疫亢進と併せた、環状ＲＮＡからの多量体化ドメインを有する及び有しない免疫原のインビボ発現を実証する。環状ＲＮＡを実施例８に記載されるとおり設計し、作製する。等容積のＡｄｄａＳＯ３（商標）アジュバント溶液と混合することにより、環状ＲＮＡを製剤化する。この環状ＲＮＡ／アジュバント調製物を０日目にマウスに筋肉内投与し、２回目の投与を４週間後に行う。対照群のマウスは溶媒により環状ＲＮＡなしで治療する。ＬＮＰに製剤化した、環状ＲＮＡを含有するがアジュバント又は環状ＲＮＡのない追加の対照群を含めてもよい。全時間経過を通じて血液試料を採取して、ＥＬＩＳＡにより血清中の免疫原特異的抗体価をモニタする。投与後１日、２日、３日、及び７日の時点で、次に毎週９週間にわたり、各マウスから顎下腺出血により血液（約１００μｌ）を収集して乾燥したチューブに入れる。４℃にて１，３００ｇで２５分間遠心することにより血清を収集し、免疫原レベルをＥＬＩＳＡにより製造者の指示に従い測定する。

【0565】

最後の時点後にマウスを犠牲にする。脾臓を回収し、脾細胞を免疫原特異的Ｔ細胞に関してフローサイトメトリー及びＥＬＩＳｐｏｔにより試験する。収集した血清を感染阻害アッセイで試験して、血清抗体の中和能を決定する。

【0566】

実施例１２：フォルドンドメインを有する及び有しないときのマウスにおける様々な異なる用量のＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）環状ＲＮＡの評価
本例は、フォルドン配列を有する及び有しない様々な異なる製剤及び様々な異なる用量のＲＢＤコード環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を筋肉内又は皮内注射したマウスにおける免疫応答を測定する。マウスを１３の等しい群に分割する：環状ＲＮＡのないＰＢＳを注射した対照、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ ０．１μｇ ＬＮＰ製剤、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ １．０μｇ ＬＮＰ製剤、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ ０．１μｇでフォルドン有りのＬＮＰ製剤、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ １．０μｇでフォルドン有りのＬＮＰ製剤、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ ０．１μｇ ＡｄｄａＳＯ３製剤、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ １．０μｇ ＡｄｄａＳＯ３製剤、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ ０．１μｇでフォルドン有りのＡｄｄａＳＯ３製剤、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ １．０μｇでフォルドン有りのＡｄｄａＳＯ３製剤、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ ０．１μｇ ＣｐＧ＋ミョウバン製剤、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ １．０μｇ ＣｐＧ＋ミョウバン製剤、ｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ ０．１μｇでフォルドン有りのＣｐＧ＋ミョウバン製剤、及びｃｉｒｃＲＮＡ－ＲＢＤ １．０μｇでフォルドン有りのＣｐＧ＋ミョウバン製剤。複数の抗原の発現をコードする環状ＲＮＡの投与により生じる抗体応答を実証するその能力に関して、これらの製剤を評価する。

【0567】

注射の４時間後に、各マウスから顎下腺出血により血液（約１００μｌ）を収集して乾燥したチューブに入れる。注射の２４時間後に各群から２匹のマウスを殺処分し、残りのマウスは１４、２８、及び３５日目に試料用に採血する。４９日目にマウスを最終的な放血で犠牲にし、脾臓を収集する。脾臓を回収し、ＲＢＤ免疫原特異的Ｔ細胞に関してフローサイトメトリー及びＥＬＩＳｐｏｔにより試験する。

【0568】

他の実施形態
記載された本発明の組成物、方法及び使用の様々な変更及び変形は、当業者であれば、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく明らかであろう。本発明を特定の実施形態に関連して説明してきたが、特許請求される本発明がそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことを理解されたい。実際、当業者に明らかな、本発明を実施するための記載されたモードの様々な変更は、本発明の範囲内であることが意図される。

【0569】

全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許、又は特許出願がその全体を参照することにより本明細書に組み込まれることが具体的且つ個々に示されたのと同程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【国際調査報告】