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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-08
(54)【発明の名称】人工表面を用いたＲＮＡおよびＤＮＡ解析
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6876 20180101AFI20241031BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20241031BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20241031BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20241031BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20241031BHJP
C07K 14/46 20060101ALI20241031BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20241031BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20241031BHJP
C12N 9/24 20060101ALI20241031BHJP
C12N 9/02 20060101ALI20241031BHJP
C12N 9/12 20060101ALI20241031BHJP
C12N 11/08 20200101ALI20241031BHJP
C12N 11/14 20060101ALI20241031BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6876 Z
C12N15/11 Z ZNA
C12Q1/6869 Z
C07K16/00
C12N15/115 Z
C07K14/46
C12N9/16 Z
C12N9/10
C12N9/24
C12N9/02
C12N9/12
C12N11/08
C12N11/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024531038
(86)(22)【出願日】2022-11-23
(85)【翻訳文提出日】2024-07-18
(86)【国際出願番号】 US2022080452
(87)【国際公開番号】W WO2023097295
(87)【国際公開日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】63/282,808
(32)【優先日】2021-11-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/388,036
(32)【優先日】2022-07-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523194477
【氏名又は名称】アリダ・バイオサイエンシーズ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】Ａｌｉｄａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】シュテンゲル，グドルン
(72)【発明者】
【氏名】ユー，ホア
(72)【発明者】
【氏名】プライス，アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】サントス，ジェローム
(72)【発明者】
【氏名】ファン－フー，ユー－シエン
(72)【発明者】
【氏名】パース，バイロン
【テーマコード（参考）】
4B033
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B033NA25
4B033NC04
4B033ND05
4B063QA13
4B063QQ53
4B063QR36
4B063QR62
4B063QS15
4B063QS25
4B063QS36
4B063QS39
4B063QX02
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA54
4H045BA60
4H045BA62
4H045DA89
4H045EA50
4H045FA50
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、トランスクリプトームおよびゲノムにわたるＲＮＡ修飾およびＤＮＡ修飾の多重プロファイリングのための組成物および方法を提供する。この方法は、標的核酸の非カノニカルな特徴（例えば、塩基修飾、骨格修飾、病変、および／または構造的エレメント）の分子認識と、この認識イベントからの情報をバーコードを用いて標的核酸の隣接遺伝子配列内に書き込む工程とを組み合わせている。バーコード化された核酸は、配列決定ライブラリーに変換され、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定法で読み取られる。この工程により、バーコードの配列が明らかになり、標的核酸の非カノニカルな特徴と相関する。本明細書に記載の高速プロファイリング法は、標的核酸における１以上の修飾の同定および／または局在化を可能にする。また、この方法では、複数またはすべてのＤＮＡ／ＲＮＡ修飾の性質および位置を並行して同定できる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｉ）基質、ｉｉ）第１のリンカーを介して該基質に結合する結合ドメイン、および
ｉｉｉ）第２のリンカーを介して該基質に結合するアダプター、
を含む組成物であって、ここで、前記結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、前記アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む、組成物。
【請求項2】
基質が、ビーズ、チップ、プレート、スライド、ディッシュ、ゲルまたは３次元ポリマーマトリックスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
結合ドメインが、抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、抗体の軽鎖（ＶＬ）、抗体の重鎖（ＶＨ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ダイアボディ、ＶＨＨドメイン、ナノボディ、アプタマー、リーダータンパク質、ライタータンパク質、イレイサータンパク質、エンドヌクレアーゼＶ、人工高分子スキャフォールド、人工タンパク質スキャフォールド、または選択的共有結合キャプチャー試薬、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
結合ドメインが、ライタータンパク質またはイレイサータンパク質の触媒的に不活性な変異体を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項5】
リーダータンパク質が、ＮＵＤＴ１６、ＡＬＹＲＥＦまたはＹＴＨドメインタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である、請求項３に記載の組成物。
【請求項6】
ライタータンパク質が、ＤＮＭＴタンパク質、ＮＡＴ１０タンパク質、ＭＥＴＴＬタンパク質、ＴＲＭタンパク質、ＢＭＴタンパク質、ＤＵＳタンパク質、ＰＵＳタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質、またはＮＳＵＮタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である、請求項３に記載の組成物。
【請求項7】
イレイサータンパク質が、ＦＴＯタンパク質、ＡＬＫＢＨタンパク質、またはＴＥＴタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である、請求項３に記載の組成物。
【請求項8】
第１のリンカーまたは第２のリンカーが切断可能である、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項9】
アダプターが切断可能である、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項10】
非カノニカルな特徴が修飾ヌクレオシドである、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項11】
修飾ヌクレオシドが、３－メチルシチジン（ｍ３Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン（Ｉ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）－Ｃａｐ、ジヒドロウリジン（Ｄ）、３－メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、１－メチルグアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチルグアノシン（ｍ２Ｇ）、５－メチルデオキシシチジン（ｍ５ｄＣ）、Ｎ４－メチルデオキシシチジン（４ｍｄＣ）、５－ヒドロキシメチルシチジン（５－ｈｍＣ）、５－ヒドロキシメチルデオキシシチジン（５ｈｍｄＣ）、５－カルボキシデオキシシチジン（５ｃａｄＣ）、５－カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、５－ホルミルシチジン（５ｆＣ）、５－ホルミルデオキシシチジン（５ｆｄＣ）、６－メチルデオキシアデノシン、Ｎ７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２，７，２’－メチルグアノシン、リボースメチル化（Ｎｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン（ｍ２
２Ｇ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチルウリジン（ｎｃｍ５ｍＵ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、ケウオシン（Ｑ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、５－タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（Ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン（ｍｓ２ｔ６Ａ）である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項12】
非カノニカルな特徴が核酸損傷である、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項13】
核酸損傷が酸化プロセスまたは紫外線との接触に起因する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
核酸損傷が、外因性薬剤による嵩高い付加体形成または塩基アルキル化に起因する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項15】
損傷が、８－オキソグアニン（８－ｏｘｏＧ）、１以上の脱塩基部位、シス－プラチン架橋、ベンゾ（ａ）ピレンジオールエポキシド（ＢＰＤＥ）付加体、シクロブテンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、ピリミジン－ピリミドン（６－４）光生成物（６－４ＰＰ）、６－Ｏ－メチルグアニン（Ｏ６－ＭｅｄＧ）、またはＯ６－（カルボキシメチル）－２’－デオキシグアノシン（Ｏ６－ＣＭｄＧ）である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項16】
非カノニカルな特徴が構造的要素である、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項17】
構造的要素が、ヘアピン、ループ、Ｚ－ＤＮＡ構造、Ｇ－四重鎖、三重鎖、Ｉ－モチーフ、バルジ、スリーウェイジャンクション、十字型構造、テトラループ、リボースジッパー、またはシュードノットである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項18】
アダプターがユニバーサルフォワードプライマー（ＵＦＰ）およびユニバーサルリバースプライマー（ＵＲＰ）の少なくとも１つを含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項19】
アダプターが固有の分子バーコード（ＵＭＩ）を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項20】
アダプターが１以上の非天然核酸塩基を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項21】
アダプターが３’末端に２個以上のランダム塩基を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項22】
１以上の非天然核酸塩基が、Ｇクランプ（９－（２－アミノエトキシ）－３Ｈ－ベンゾ［ｂ］ピリミド［４，５－ｅ］［１，４］オキサジン－２（１０Ｈ）－オン）、ｔＣ（３Ｈ－ベンゾ［ｂ］ピリミド［４，５－ｅ］［１，４］オキサジン－２（１０Ｈ）－オン）、ｔＣＯ（３Ｈ－ベンゾ［ｂ］ピリミド［４，５－ｅ］［１，４］オキサジン－２（１０Ｈ）－オン）、イノシン、スーパーＴ（５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン）、スーパーＧ（８－アザ－７－デアザグアノシン）、ウラシル、または８－オキソ－Ｇから独立して選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項23】
アダプターが、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ホスホロチオエート、２’－フルオロリボース、２’－メトキシリボース、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、グアニジノプロピルホスホロアミデート、トリアゾール、グアニジニウム、モルホリノ、スレオース核酸（ＴＮＡ）またはヘキシトール核酸（ＨＮＡ）から選択される１以上の骨格修飾を含む、請求項２から２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項24】
アダプターが１以上の３’または５’ブロッキング基を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項25】
１以上の３’または５’ブロッキング基が、ジデオキシリボース、ホスフェート、逆塩基またはリンカーから独立して選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項26】
結合ドメインが少なくとも１つの修飾ヌクレオシドと接触している、請求項１から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項27】
結合ドメインが修飾ヌクレオチドおよびそれに隣接する１以上のヌクレオチドと接触している、請求項１から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項28】
結合ドメインおよびアダプターが、アダプターまたはアダプター配列のコピーの標的核酸への移行を可能にするように、基質上で空間的に離れて配置されている、請求項１から２７のいずれか一項に組成物。
【請求項29】
結合ドメインがアダプターから２００ｎｍ未満の距離で基質に結合している、請求項２８に記載の組成物。
【請求項30】
組成物が、結合ドメインに結合した塩基編集酵素をさらに含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項31】
塩基編集酵素が結合ドメインに共有結合している、請求項３０に記載の組成物。
【請求項32】
塩基編集酵素が、ペプチドタグ、タンパク質タグ、二次抗体、核酸配列、または生体直交型反応基から選択される標的化部分を介して結合ドメインに結合されている、請求項３０に記載の組成物。
【請求項33】
塩基編集酵素が、アデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、またはジオキシゲナーゼである、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項34】
請求項１から３１のいずれか一項に記載の組成物および結合ドメインに非共有結合または共有結合した標的核酸を含む、複合体。
【請求項35】
複数の標的核酸を分析する方法であって、(ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、請求項１から３３のいずれか一項に記載の組成物と接触させること、ここで、非カノニカルな特徴を含む標的核酸が結合ドメインに結合する；
（ｉｉ）以下のうち１つを実行すること：
（ａ）核酸バーコードを非カノニカルな特徴を含む標的核酸にトランスファーさせて、バーコード化標的核酸を生成すること、または
（ｂ）非カノニカルな特徴を含む標的核酸のバーコード化コピーを生成すること；
（ｉｉｉ）バーコード化標的核酸を増幅させること；および
（ｉｖ）バーコード化標的核酸の配列を決定すること
を含み、ここで、工程（ｉ）および（ｉｉ）は順次または同時に行われる、
方法。
【請求項36】
核酸バーコードが、転移酵素によって標的核酸にトランスファーされる、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
核酸バーコードが、一本鎖ライゲーション、スプリントライゲーション、プライマー伸長、逆転写、または二本鎖ライゲーションによって酵素的に標的核酸にトランスファーされる、請求項３５に記載の方法。
【請求項38】
工程（ｉ）の前に、標的核酸の３’末端もしくは５’末端または両末端にユニバーサル核酸配列をライゲーションすることをさらに含む、請求項３５から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
工程（ｉ）の前に、標的核酸の３’末端を複数の単一型のヌクレオチドで酵素的にテーリングすることをさらに含む、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
酵素的テーリングがポリ（Ａ）ポリメラーゼまたはポリ（Ｕ）ポリメラーゼを用いて行われる、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
アダプターの３’末端が標的核酸の３’末端に結合し、工程（ｉｉ）が修飾特異的バーコードを導入することをさらに含み、ここで、アダプターの３’末端が逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるか、またはアダプターが３’スペーサー配列を含み、かつ標的核酸によって示される合成スペーサー配列に部位特異的に結合し、かつアダプターの３’末端および標的核酸の３’末端の一方または両方が逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、請求項３５から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
３’縮重塩基を有するアダプターが標的核酸をランダムにプライミングし、工程（ｉｉ）が修飾特異的バーコードを導入することをさらに含み、ここで、アダプターの３’末端が逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、請求項３５から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
核酸バーコードが化学的ライゲーションによって標的核酸にトランスファーされる、請求項３５に記載の方法。
【請求項44】
バーコード化標的核酸が、その５’末端を介して基質上に固定化されている、請求項３５から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
バーコード化標的核酸が、その３’末端を介して基質上に固定化されている、請求項３５から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
増幅工程（ｉｉｉ）が基質の表面上で行われる、請求項３５から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
工程（ｉｉｉ）において、標的核酸の同一コピーのクラスターを形成することをさらに含む、請求項３５から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
工程（ｉｖ）において、基質上の標的核酸の同一コピーのクラスターをインサイチュウで配列決定することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項49】
非カノニカルな特徴の位置がバーコード化標的核酸またはそのコピーの一次核酸配列に基づいて同定可能なように、バーコード化標的核酸またはそのコピーを修飾することをさらに含む、請求項３５から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
修飾工程が、請求項３０から３３に記載の組成物のいずれか１つを用いて、結合ドメインが標的核酸に結合している結合部位の１～２０塩基内の塩基を編集することを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項51】
ｉ）基質、ｉｉ）基質に結合された第２の認識エレメント、
ｉｉｉ）第２の認識エレメントに結合するアダプター、および
ｉｖ）結合ドメイン
を含み、ここで、前記結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合するように構成されており、かつ前記結合ドメインは第２の認識エレメントによって固定化されており、前記アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む、組成物。
【請求項52】
組成物が複数の第２の認識エレメントを含み、ここで、前記複数の第２の認識エレメントが互いに異なる第２の認識エレメントを含み、前記アダプターが該複数の第２の認識エレメントの１つに結合され、かつ前記結合ドメインが異なる第２の認識エレメントに結合されている、請求項５１に記載の組成物。
【請求項53】
組成物が複数の第２の認識エレメントを含み、ここで、前記アダプターが複数の第２の認識エレメントの１つに結合され、かつ前記結合ドメインが同じ第２の認識エレメントの別の部分（instance）に結合される、請求項５１に記載の組成物。
【請求項54】
ｉ）基質、ｉｉ）基質に結合された第２の認識エレメント、
ｉｉｉ）第２の認識エレメントを介して基質に結合する結合ドメイン、
ｉｖ）リンカーを介して基質に結合するアダプター、
を含み、ここで、前記結合ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合するように構成されており、前記アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む、組成物。
【請求項55】
ｉ）基質、ｉｉ）基質に結合された第２の認識エレメント、
ｉｉｉ）リンカーを介して基質に結合する結合ドメイン、
ｉｖ）第２の認識エレメントを介して基質に結合するアダプター、
を含み、ここで、前記結合ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡの非共有的特徴に特異的に結合するように構成されており、前記アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む、組成物。
【請求項56】
基質がビーズ、チップ、プレート、スライド、ディッシュ、ゲルまたは３次元ポリマーマトリックスである、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項57】
第２の認識エレメントが、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＡ、プロテインＡＧ、プロテインＡＬ、プロテインＬＧまたは抗体である、請求項５１から５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項58】
第２の認識エレメントが、ペプチドタグ、共有結合ペプチドタグ、タンパク質タグ、または核酸である、請求項５１から５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項59】
第２の認識エレメントが、ストレプトアビジン、アビジンまたはニュートラビジンである、請求項５１から５６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項60】
アダプターが、非カノニカルな特徴への結合ドメインの結合を妨げないアミノ酸部位で、第２の認識エレメントに結合している、請求項５１から５３、および５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項61】
複数のアダプターが第２の認識エレメントに結合されている、請求項５１から６０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項62】
結合ドメインが、抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、抗体の軽鎖（ＶＬ）、抗体の重鎖（ＶＨ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ダイアボディ、ＶＨＨドメイン、ナノボディ、アプタマー、リーダータンパク質、ライタータンパク質、イレイサータンパク質、エンドヌクレアーゼＶ、人工高分子スキャフォールド、人工タンパク質スキャフォールド、または選択的共有結合キャプチャー試薬、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体を含む、請求項５１から６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項63】
結合ドメインが、ライタータンパク質またはイレイサータンパク質の触媒的に不活性な変異体を含む、請求項５１から６１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項64】
リーダータンパク質が、ＮＵＤＴ１６、ＡＬＹＲＥＦまたはＹＴＨドメインタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項65】
リンカーが切断可能である、請求項５４から５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項66】
アダプターが切断可能である、請求項５１から６５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項67】
ライタータンパク質が、ＤＮＭＴタンパク質、ＮＡＴ１０タンパク質、ＭＥＴＴＬタンパク質、ＴＲＭタンパク質、ＢＭＴタンパク質、ＤＵＳタンパク質、ＰＵＳタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質、またはＮＳＵＮタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項68】
イレイサータンパク質が、ＦＴＯタンパク質、ＡＬＫＢＨタンパク質、またはＴＥＴタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である、請求項６２に記載の組成物。
【請求項69】
非カノニカルな特徴が修飾ヌクレオシドである、請求項５１から６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項70】
修飾ヌクレオシドが、３－メチルシチジン（ｍ３Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン（Ｉ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）－Ｃａｐ、ジヒドロウリジン（Ｄ）、３－メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、１－メチルグアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチルグアノシン（ｍ２Ｇ）、５－メチルデオキシシチジン（ｍ５ｄＣ）、Ｎ４－メチルデオキシシチジン（４ｍｄＣ）、５－ヒドロキシメチルシチジン（５－ｈｍＣ）、５－ヒドロキシメチルデオキシシチジン（５ｈｍｄＣ）、５－カルボキシデオキシシチジン（５ｃａｄＣ）、５－カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、５－ホルミルシチジン（５ｆＣ）、５－ホルミルデオキシシチジン（５ｆｄＣ）、６－メチルデオキシアデノシン、Ｎ７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２，７，２’－メチルグアノシン、リボースメチル化（Ｎｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン（ｍ２
２Ｇ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチルウリジン（ｎｃｍ５ｍＵ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、ケウオシン（Ｑ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、５－タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（Ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン（ｍｓ２ｔ６Ａ）である、請求項６９に記載の組成物。
【請求項71】
非カノニカルな特徴が核酸損傷である、請求項５１から６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項72】
核酸損傷が酸化プロセスまたは紫外線との接触に起因する、請求項７１に記載の組成物。
【請求項73】
核酸損傷が、外因性薬剤による嵩高い付加体形成または塩基アルキル化に起因する、請求項７１に記載の組成物。
【請求項74】
損傷が、８－オキソグアニン（８－ｏｘｏＧ）、１以上の脱塩基部位、シス－プラチン架橋、ベンゾ（ａ）ピレンジオールエポキシド（ＢＰＤＥ）付加体、シクロブテンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、ピリミジン－ピリミドン（６－４）光生成物（６－４ＰＰ）、６－Ｏ－メチルグアニン（Ｏ６－ＭｅｄＧ）、またはＯ６－（カルボキシメチル）－２’－デオキシグアノシン（Ｏ６－ＣＭｄＧ）である、請求項７１に記載の組成物。
【請求項75】
非カノニカルな特徴が構造的要素である、請求項５１から６８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項76】
構造的要素が、ヘアピン、ループ、Ｚ－ＤＮＡ構造、Ｇ－四重鎖、三重鎖、Ｉ－モチーフ、バルジ、スリーウェイジャンクション、十字型構造、テトラループ、リボースジッパー、またはシュードノットである、請求項７０に記載の組成物。
【請求項77】
アダプターがユニバーサルフォワードプライマー（ＵＦＰ）およびユニバーサルリバースプライマー（ＵＲＰ）の少なくとも１つを含む、請求項５１から７６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項78】
アダプターが分子バーコード（ＵＭＩ）を含む、請求項５１から７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項79】
アダプターが１以上の非天然核酸塩基を含む、請求項５１から７８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項80】
アダプターが３’末端に２個以上のランダム塩基を含む、請求項５１から７９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項81】
１以上の非天然核酸塩基が、Ｇクランプ、ｔＣ、ｔＣＯ、イノシン、スーパーＴ（５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン）、スーパーＧ（８－アザ－７－デアザグアノシン）、ウラシル、または８－オキソ－Ｇから独立して選択される、請求項７９に記載の組成物。
【請求項82】
アダプターがロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ホスホロチオエート、２’－フルオロリボース、２’－メトキシリボース、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、グアニジノプロピルホスホロアミデート、トリアゾール、グアニジニウム、モルホリノ、スレオース核酸（ＴＮＡ）またはヘキシトール核酸（ＨＮＡ）から選択される１以上の骨格修飾を含む、請求項５１から８１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項83】
アダプターが１以上の３’または５’ブロッキング基を含む、請求項５１から８２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項84】
１以上の３’または５’ブロッキング基が、ジデオキシリボース、ホスフェート、逆塩基またはリンカーから独立して選択される、請求項８３に記載の組成物。
【請求項85】
結合ドメインが少なくとも１つの修飾ヌクレオシドと接触している、請求項５１から８４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項86】
結合ドメインが修飾ヌクレオチドおよびそれに隣接する１以上のヌクレオチドと接触している、請求項５１から８５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項87】
結合ドメインおよびアダプターが、アダプターまたはアダプター配列のコピーの標的核酸へのトランスファーを可能にするように、基質上で空間的に離れて配置されている、請求項５１から８６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項88】
結合ドメインがアダプターから２００ｎｍ未満の距離で基質に結合している、請求項８７に記載の組成物。
【請求項89】
組成物が、結合ドメインに結合した塩基編集酵素をさらに含む、請求項５１から８８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項90】
塩基編集酵素が結合ドメインに共有結合している、請求項８９に記載の組成物。
【請求項91】
塩基編集酵素が、ペプチドタグ、タンパク質タグ、二次抗体、核酸配列、または生体直交型反応基から選択される標的部分を介して結合ドメインに結合される、請求項８９に記載の組成物。
【請求項92】
塩基編集酵素が、アデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、またはジオキシゲナーゼである、請求項８９から９１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項93】
請求項５１から９２のいずれか一項に記載の組成物および結合ドメインに非共有結合または共有結合した標的核酸を含む、複合体。
【請求項94】
複数の標的核酸を分析する方法であって、(ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、請求項５１から９２のいずれか一項に記載の組成物と接触させること、ここで、非カノニカルな特徴を含む標的核酸が結合ドメインに結合する；
（ｉｉ）以下のうち１つを実行すること：
（ａ）核酸バーコードを非カノニカルな特徴を含む標的核酸にトランスファーして、バーコード化標的核酸を生成すること、または
（ｂ）非カノニカルな特徴を含む標的核酸のバーコード化コピーを生成すること；
（ｉｉｉ）バーコード化標的核酸を増幅させること；および
（ｉｖ）バーコード化標的核酸の配列を決定すること
を含み、ここで、工程（ｉ）および（ｉｉ）は順次または同時に行われる、
方法。
【請求項95】
核酸バーコードが、酵素的または化学的トランスファーによって標的核酸にトランスファーされる、請求項９４に記載の方法。
【請求項96】
核酸バーコードが、一本鎖ライゲーション、スプリントライゲーション、プライマー伸長、逆転写、または二本鎖ライゲーションによって酵素的に標的核酸にトランスファーされる、請求項９４に記載の方法。
【請求項97】
工程（ｉ）の前に、標的核酸の３’末端もしくは５’末端または両末端にユニバーサル核酸配列をライゲーションすることをさらに含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項98】
工程（ｉ）の前に、標的核酸の３’末端を複数の単一型ヌクレオチドで酵素的にテーリングすることをさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項99】
酵素的テーリングがポリ（Ａ）ポリメラーゼまたはポリ（Ｕ）ポリメラーゼを用いて行われる、請求項９８に記載の方法。
【請求項100】
アダプターの３’末端が標的核酸の３’末端に結合し、工程（ｉｉ）が修飾特異的バーコードを導入することをさらに含み、ここで、アダプターの３’末端が逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼによって伸長されるか、またはアダプターが３’スペーサー配列を含み、かつ標的核酸によって示される合成スペーサー配列に部位特異的に結合し、かつアダプターの３’末端および標的核酸の３’末端の一方または両方が逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、請求項９４に記載の方法。
【請求項101】
３’縮重塩基を有するアダプターが標的核酸をランダムにプライミングし、工程（ｉｉ）が修飾特異的バーコードを導入することをさらに含み、ここで、アダプターの３’末端が逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、請求項９４に記載の方法。
【請求項102】
核酸バーコードが化学ライゲーションによって標的核酸にトランスファーされる、請求項９４に記載の方法。
【請求項103】
バーコード化標的核酸が、その５’末端を介して基質上に固定化されている、請求項９４に記載の方法。
【請求項104】
バーコード化標的核酸が、その３’末端を介して基質上に固定化されている、請求項９４に記載の方法。
【請求項105】
該方法が、非カノニカルな特徴の位置がバーコード化標的核酸またはそのコピーの一次核酸配列に基づいて識別可能であるように、バーコード化標的核酸またはそのコピーを改変することを含む、請求項９４から１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項106】
修飾工程が、結合部位の１～２０塩基内の塩基を編集することを含み、ここで、結合ドメインは、請求項５１から５５に記載の組成物のいずれか１つを用いて標的核酸に結合される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項107】
増幅工程（ｉｉｉ）が基質の表面上で行われる、請求項９４から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項108】
工程（ｉｉｉ）において、標的核酸の同一コピーのクラスターを形成することをさらに含む、請求項９４から１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項109】
工程（ｉｖ）において、基質上の標的核酸の同一コピーのクラスターをインサイチュウで配列決定することをさらに含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項110】
ｉ）基質、ｉｉ）第１のリンカーまたは第２の認識エレメントを介して基質に結合する結合ドメイン、
ｉｉｉ）第２のリンカーまたは第２の認識エレメントを介して基質に結合するモザイク末端（ＭＥ）アダプター、および
ｉｖ）トランスポザーゼ、
を含む組成物であって、ここで、前記トランスポザーゼは固定化ＭＥアダプターに負荷され、前記結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、かつ前記ＭＥアダプターの少なくとも１つは、非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む、組成物；または
ｉ）基質、
ｉｉ）リンカーまたは第２の認識エレメントを介して基質に結合する結合ドメイン、および
ｉｉｉ）結合ドメインと結合したトランスポザーゼ、
を含む組成物であって、ここで、前記トランスポザーゼはＭＥアダプターに負荷され、前記結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、かつ前記ＭＥアダプターの少なくとも１つは、非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む、組成物。
【請求項111】
トランスポザーゼがＴｎ５トランスポザーゼである、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項112】
トランスポザーゼが、プロテインＬ、プロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＧＡ、プロテインＡＬ、またはプロテインＧＬを介して結合ドメインに結合される、請求項１１０から１１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項113】
トランスポザーゼが、ペプチドタグ、共有結合ペプチドタグ、タンパク質タグ、または核酸を介して結合ドメインに結合される、請求項１１０から１１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項114】
基質が、ビーズ、チップ、プレート、スライド、ディッシュ、ゲルまたは３次元ポリマーマトリックスである、請求項１１０から１１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項115】
結合ドメインが、抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂフラグメント、抗体の軽鎖（ＶＬ）、抗体の重鎖（ＶＨ）、可変フラグメント（Ｆｖ）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ダイアボディ、ＶＨＨドメイン、ナノボディ、アプタマー、リーダータンパク質、ライタータンパク質、イレイサータンパク質、人工高分子スキャフォールド、エンドヌクレアーゼＶ、人工タンパク質スキャフォールド、または選択的共有結合キャプチャー試薬、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体を含む、請求項１１０から１１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項116】
結合ドメインが、ライタータンパク質またはイレイサータンパク質の触媒的に不活性な変異体を含む、請求項１１０から１１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項117】
リーダータンパク質が、ＮＵＤＴ１６、ＡＬＹＲＥＦもしくはＹＴＨドメインタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である、請求項１１５に記載の組成物。
【請求項118】
ライタータンパク質が、ＤＮＭＴタンパク質、ＮＡＴ１０タンパク質、ＭＥＴＴＬタンパク質、ＴＲＭタンパク質、ＢＭＴタンパク質、ＤＵＳタンパク質、ＰＵＳタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質もしくはＮＳＵＮタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である、請求項１１５に記載の組成物。
【請求項119】
イレイサータンパク質が、ＦＴＯタンパク質、ＡＬＫＢＨタンパク質、ＴＥＴタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である、請求項１１５に記載の組成物。
【請求項120】
第１および／または第２のリンカーが切断可能である、請求項１１０から１１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項121】
アダプターが切断可能である、請求項１１０から１１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項122】
非カノニカルな特徴が修飾ヌクレオシドである、請求項１１０から１２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項123】
修飾ヌクレオシドが、３－メチルシチジン（ｍ３Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン（Ｉ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）－Ｃａｐ、ジヒドロウリジン（Ｄ）、３－メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、１－メチルグアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチルグアノシン（ｍ２Ｇ）、５－メチルデオキシシチジン（ｍ５ｄＣ）、Ｎ４－メチルデオキシシチジン（４ｍｄＣ）、５－ヒドロキシメチルシチジン（５－ｈｍＣ）、５－ヒドロキシメチルデオキシシチジン（５ｈｍｄＣ）、５－カルボキシデオキシシチジン（５ｃａｄＣ）、５－カルボキシシチジン（５ｃａＣ）、５－ホルミルシチジン（５ｆＣ）、５－ホルミルデオキシシチジン（５ｆｄＣ）、６－メチルデオキシアデノシン、Ｎ７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２，７，２’－メチルグアノシン、リボースメチル化（Ｎｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン（ｍ２
２Ｇ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチルウリジン（ｎｃｍ５ｍＵ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、ケウオシン（Ｑ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、５－タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（Ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン（ｍｓ２ｔ６Ａ）である、請求項１２２に記載の組成物。
【請求項124】
非カノニカルな特徴が核酸損傷である、請求項１１０から１２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項125】
核酸損傷が酸化プロセスまたは紫外線との接触に起因する、請求項１２４に記載の組成物。
【請求項126】
核酸損傷が、外因性薬剤による嵩高い付加体形成または塩基アルキル化に起因する、請求項１２４に記載の組成物。
【請求項127】
損傷が、８－オキソグアニン（８－ｏｘｏＧ）、１以上の脱塩基部位、シス－プラチン架橋、ベンゾ（ａ）ピレンジオールエポキシド（ＢＰＤＥ）付加体、シクロブテンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、ピリミジン－ピリミドン（６－４）光生成物（６－４ＰＰ）、６－Ｏ－メチルグアニン（Ｏ６－ＭｅｄＧ）、またはＯ６－（カルボキシメチル）－２’－デオキシグアノシン（Ｏ６－ＣＭｄＧ）である、請求項１２４に記載の組成物。
【請求項128】
非カノニカルな特徴が構造的要素である、請求項１１０から１２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項129】
構造的要素が、ヘアピン、ループ、Ｚ－ＤＮＡ構造、Ｇ－四重鎖、三重鎖、Ｉ－モチーフ、バルジ、スリーウェイジャンクション、十字型構造、テトラループ、リボースジッパー、またはシュードノットである、請求項１２８に記載の組成物。
【請求項130】
アダプターがユニバーサルフォワードプライマー（ＵＦＰ）およびユニバーサルリバースプライマー（ＵＲＰ）の少なくとも１つを含む、請求項１１０から１２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項131】
アダプターが分子バーコード（ＵＭＩ）を含む、請求項１１０から１３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項132】
アダプターが１以上の非天然核酸塩基を含む、請求項１１０から１３１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項133】
１以上の非天然核酸塩基が、Ｇクランプ（９－（２－アミノエトキシ）－３Ｈ－ベンゾ［ｂ］ピリミド［４，５－ｅ］［１，４］オキサジン－２（１０Ｈ）－オン）、ｔＣ（３Ｈ－ベンゾ［ｂ］ピリミド［４，５－ｅ］［１，４］オキサジン－２（１０Ｈ）－オン）、ｔＣＯ（３Ｈ－ベンゾ［ｂ］ピリミド［４，５－ｅ］［１，４］オキサジン－２（１０Ｈ）－オン）、イノシン、スーパーＴ（５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン）、スーパーＧ（８－アザ－７－デアザグアノシン）、ウラシル、または８－オキソ－Ｇから独立して選択される、請求項１３２に記載の組成物。
【請求項134】
アダプターが、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ホスホロチオエート、２’－フルオロリボース、２’－メトキシリボース、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、グアニジノプロピルホスホロアミデート、トリアゾール、グアニジニウム、モルホリノ、スレオース核酸（ＴＮＡ）またはヘキシトール核酸（ＨＮＡ）から選択される１以上の骨格修飾を含む、請求項１１０から１３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項135】
アダプターが１以上の３’または５’ブロッキング基を含む、請求項１１０から１３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項136】
１以上の３’または５’ブロッキング基が、ジデオキシリボース、ホスフェート、逆塩基またはリンカーから独立して選択される、請求項１３５に記載の組成物。
【請求項137】
アダプターが１９ｂｐのモザイク末端（ＭＥ）を含む、請求項１１０から１３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項138】
結合ドメインが少なくとも１つの修飾ヌクレオシドと接触している、請求項１１０から１３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項139】
結合ドメインが修飾ヌクレオチドおよびそれに隣接する１以上のヌクレオチドと接触している、請求項１１０から１３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項140】
結合ドメインおよびアダプターが、トランスポザーゼによる標的核酸へのアダプターの転移を可能にするように、基質上で空間的に離れて配置されている、請求項１１０から１３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項141】
結合ドメインがアダプターから２００ｎｍ未満の距離で基質に結合している、請求項１４０に記載の組成物。
【請求項142】
組成物が、結合ドメインに結合した塩基編集酵素をさらに含む、請求項１１０から１４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項143】
塩基編集酵素が結合ドメインに共有結合している、請求項１４２に記載の組成物。
【請求項144】
塩基編集酵素が、ペプチドタグ、タンパク質タグ、二次抗体、核酸配列、または生体直交型反応基から選択される標的部分を介して結合ドメインに結合されている、請求項１４２に記載の組成物。
【請求項145】
塩基編集酵素が、アデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、またはジオキシゲナーゼである、請求項１４２から１４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項146】
請求項１１０から１４５のいずれか一項に記載の組成物および結合ドメインに非共有結合または共有結合した標的核酸を含む、複合体。
【請求項147】
複数の標的核酸を分析する方法であって、(ｉ）標的ＲＮＡ分子を逆転写してＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二本鎖分子を形成するか、標的二本鎖ＤＮＡ分子を供給することにより、複数の標的核酸を供給すること；
（ｉｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、請求項１１０から１４５のいずれか一項に記載の組成物と接触させること、ここで、非カノニカルな特徴を含む標的核酸が結合ドメインに結合している；
（ｉｉｉ）トランスポザーゼを用いて、２つのアダプター（そのうちの少なくとも１つは核酸バーコードを含む）を、非カノニカルな特徴を含む二本鎖標的核酸にトランスファーして、バーコード化標的核酸を生成すること、
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸を増幅すること；および
（ｖ）バーコード化標的核酸の配列を決定すること
を含み、ここで、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は順次または同時に行われる、
方法。
【請求項148】
工程（ｉｉ）がＭｇ２＋イオンの不存在下で行われ、工程（ｉｉ）が工程（ｉｉｉ）の前に行われる、請求項１４７に記載の方法。
【請求項149】
工程（ｉｉｉ）がＭｇ２＋イオンを添加することをさらに含み、工程（ｉｉｉ）が工程（ｉｉ）の後に行われる、請求項１４７または１４８に記載の方法。
【請求項150】
核酸バーコードが転移酵素により標的核酸にトランスファーされる、請求項１４７に記載の方法。
【請求項151】
バーコードを含むＭＥアダプター鎖が、その５’末端を介して基質上に固定化されている、請求項１４７に記載の方法。
【請求項152】
該方法が、非カノニカルな特徴の位置がバーコード化標的核酸またはそのコピーの一次核酸配列に基づいて識別可能であるように、バーコード化標的核酸またはそのコピーを修飾することを含む、請求項１４７～１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項153】
修飾工程が、結合ドメインが標的核酸に結合している結合部位の１～２０塩基以内の塩基を編集することを含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項154】
複数の標的核酸中の複数の非カノニカルな特徴を検出する方法であって、（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を複数の組成物と接触させること；
ここで、複数の組成物はそれぞれ独立して以下から選択される：
（ａ）請求項１から３３のいずれか一項に記載の組成物、
（ｂ）請求項５１から９２のいずれか一項に記載の組成物、
（ｃ）請求項１１０から１４５のいずれか一項に記載の組成物、
ここで、工程（ｉ）で接触される複数の組成物の数は、非カノニカルな特徴の数に等しいか、またはそれよりも多く、前記複数の組成物の結合ドメインは、各々、ＤＮＡもしくはＲＮＡの異なる非カノニカルな特徴に結合しているか、または複数の結合ドメインがＤＮＡもしくはＲＮＡの同じ非カノニカルな特徴に結合しており、かつ前記複数の組成物のアダプターは各々、その組成物の結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の、または結合ドメインに固有の核酸バーコード配列を含む；
（ｉｉ）以下のうち１つを実行すること：
（ａ）複数の組成物の各々の核酸バーコード配列を複数の標的核酸にトランスファーするか、または
（ｂ）複数の標的核酸のバーコード化コピーを生成する；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅させること；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定すること
を含む、方法。
【請求項155】
複数の標的核酸中の複数の非カノニカルな特徴を検出する方法であって、（ｉ）複数の組成物を含むマイクロアレイ、ビーズ、および／または流体デバイスを提供すること；
ここで、複数の組成物はそれぞれ独立して以下から選択される：
（ａ）請求項１から３３のいずれか一項に記載の組成物、
（ｂ）請求項５１から９２のいずれか一項に記載の組成物、
（ｃ）請求項１１０から１４５のいずれか一項に記載の組成物、
ここで、工程（ｉ）で提供される複数の組成物の数は、非カノニカルな特徴の数に等しいか、またはそれよりも多く、前記複数の組成物の結合ドメインは、各々、ＤＮＡもしくはＲＮＡの異なる非カノニカルな特徴に結合しているか、または複数の結合ドメインがＤＮＡもしくはＲＮＡの同じ非カノニカルな特徴に結合しており、かつ前記複数の組成物のアダプターは各々、その組成物の結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の、または結合ドメインに固有の核酸バーコード配列を含む；
（ｉｉ）複数の標的核酸を複数の組成物と接触させ、かつ以下のうち１つを実行すること：
（ａ）複数の組成物の各々の核酸バーコード配列を複数の標的核酸にトランスファーするか、または
（ｂ）複数の標的核酸のバーコード化コピーを生成する；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅すること；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定こと
を含む、方法。
【請求項156】
前記流体デバイスが、複数のチャネルおよび複数の組成物を備え、前記複数のチャネルの各々が、前記複数の組成物のうちの１つを含む、請求項１５５に記載の方法。
【請求項157】
複数の組成物中の各組成物がマイクロアレイ上のスポットである、請求項１５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互参照
本出願は、２０２１年１１月２４日出願の米国仮出願第６３／２８２，８０８号および２０２２年７月１１日出願の米国仮出願第６３／３８８，０３６号に基づく優先権の利益を主張し、これらの開示は引用によりその内容全体を本明細書に包含させる。
本出願は、２０２１年１１月２４日出願の米国仮出願第６３／２８２，８０８号および２０２２年７月１１日出願の米国仮出願第６３／３８８，０３６号に基づく優先権の利益を主張し、これらの開示は引用によりその内容全体を本明細書に包含させる。
【0002】
技術分野
本発明は、一般的に、エピトランスクリプトミック、エピジェネティック、およびＲＮＡおよびＤＮＡを含む核酸の構造に対する他の修飾または非カノニカルな特徴の同定および解析に関する。
本発明は、一般的に、エピトランスクリプトミック、エピジェネティック、およびＲＮＡおよびＤＮＡを含む核酸の構造に対する他の修飾または非カノニカルな特徴の同定および解析に関する。
【0003】
連邦政府資金援助条項
本発明は、米国国立ヒトゲノム研究所から供与された助成金番号１Ｒ４３ＨＧ０１２１７０－０１による米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、米国国立ヒトゲノム研究所から供与された助成金番号１Ｒ４３ＨＧ０１２１７０－０１による米国政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【背景技術】
【0004】
背景
ヌクレオチドの化学変化を含むエピジェネティックな変化は広く存在し、遺伝子発現、遺伝子サイレンシング、ＤＮＡ損傷への応答などの生物学的プロセスにおいて主要な役割を果たしている。同様に、エピトランスクリプトミックな（以下、エピトランスクリプトームという）修飾として知られるＲＮＡの化学修飾は、転写中または転写後に細胞内で頻繁に起こる。ＲＮＡ修飾は、翻訳の開始、翻訳エラー率、選択的スプライシング、ＲＮＡの安定性、フォールディングおよび輸送において重要な役割を果たしている。
ヌクレオチドの化学変化を含むエピジェネティックな変化は広く存在し、遺伝子発現、遺伝子サイレンシング、ＤＮＡ損傷への応答などの生物学的プロセスにおいて主要な役割を果たしている。同様に、エピトランスクリプトミックな（以下、エピトランスクリプトームという）修飾として知られるＲＮＡの化学修飾は、転写中または転写後に細胞内で頻繁に起こる。ＲＮＡ修飾は、翻訳の開始、翻訳エラー率、選択的スプライシング、ＲＮＡの安定性、フォールディングおよび輸送において重要な役割を果たしている。
【0005】
ほとんどすべての種類の癌、認知機能障害、呼吸器系、循環器系、生殖器系、自己免疫系、神経行動系の疾患など、多様な疾患、行動、その他の健康指標がＤＮＡのエピジェネティックな変化と相関している。しかし、ゲノム全体におけるエピジェネティックな変化の分布、特に健康および疾患との関連については、ほとんど知られていない。エピトランスクリプトーム修飾の機能はいくつか知られているが、細胞内ＲＮＡ全体におけるこれらの修飾の位置を特定し定量化する分析法がないため、多くは知られていない。現在のところ、エピトランススクリプトームＲＮＡ修飾の相関レベルおよび細胞内での変化についてはほとんど何もわかっていない。
【0006】
化学的誘導体化法、分子認識法（通常、濃縮および検出の両方に抗体を使用）、逆転写による塩基配列決定法を組み合わせることで、限られた数のＤＮＡおよびＲＮＡの修飾に対するプロファイリング法が提供されてきた。しかし、これらの方法は感度が高くなく、核酸の分解／フラグメント化を引き起こし、一塩基分解能で修飾の位置を同定できないことが多い。さらに、これらの方法は、複数のＤＮＡまたはＲＮＡ修飾を同時に多重検出することはできない。一般的なエピトランスクリプトームＲＮＡ修飾の塩基配列を決定する既存の方法は、検出された修飾の数（一桁以上異なる）および修飾の位置の両方において、しばしば相反する所見を与える。
【0007】
従って、ＤＮＡおよびＲＮＡの修飾を同定、分析、定量、位置特定するための改良された組成物および方法が当技術分野で必要とされている。このような進歩は、健康および疾患における生物学の重要な制御メカニズムの発見、ならびに医学における新しい治療パラダイムの開発に道を開き得る。
【発明の概要】
【0008】
概要
本発明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む核酸の構造に対するエピトランスクリプトーム、エピジェネティック、その他の化学的修飾を同定および分析するための組成物および方法を提供する。本発明は、潜在的に無制限の数のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ修飾を同時にプロファイリングするための、高度に並列化された、高感度、高精度、高速処理の方法を提供する。
本発明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む核酸の構造に対するエピトランスクリプトーム、エピジェネティック、その他の化学的修飾を同定および分析するための組成物および方法を提供する。本発明は、潜在的に無制限の数のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ修飾を同時にプロファイリングするための、高度に並列化された、高感度、高精度、高速処理の方法を提供する。
【0009】
本発明は、ｉ）基質、ｉｉ）第１のリンカーを介して該基質に結合する結合ドメイン、およびｉｉｉ）第２のリンカーを介して該基質に結合するアダプターを含む組成物であって、前記結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、かつ前記アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む組成物を提供する。
【0010】
本発明はまた、ｉ）基質、ｉｉ）基質に結合した第２の認識エレメント、ｉｉｉ）第２の認識エレメントに結合するアダプター、およびｉｖ）結合ドメインを含む組成物であって、ここで、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合するように構成されており、かつ結合ドメインは第２の認識エレメントによって固定化されており、ここで、アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む組成物を提供する。ある側面において、組成物は複数の第２の認識エレメントを含み、ここで、該複数の第２の認識エレメントが互いに異なる第２の認識エレメントを含み、該アダプターが該複数の第２の認識エレメントの１つに結合され、かつ結合ドメインが異なる第２の認識エレメントに結合されている。ある側面において、組成物は複数の第２の認識エレメントを含み、ここで、アダプターは複数の第２の認識エレメントの１つに結合され、かつ結合ドメインは同じ第２の認識エレメントの別の部分（instance）に結合される。
【0011】
また、本明細書では、ｉ）基質、ｉｉ）基質に結合された第２の認識エレメント、
ｉｉｉ）リンカーを介して基質に結合する結合ドメイン、ｉｖ）第２の認識エレメントを介して基質に結合するアダプターを含む組成物であって、ここで、結合ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合するように構成されており、該アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む組成物も提供する。
ｉｉｉ）リンカーを介して基質に結合する結合ドメイン、ｉｖ）第２の認識エレメントを介して基質に結合するアダプターを含む組成物であって、ここで、結合ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合するように構成されており、該アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む組成物も提供する。
【0012】
また、本発明は、ｉ）基質、ｉｉ）第１のリンカーまたは第２の認識エレメントを介して基質に結合する結合ドメイン、ｉｉｉ）第２のリンカーまたは第２の認識エレメントを介して基質に結合するモザイク末端（ＭＥ）アダプター、およびｉｖ）トランスポザーゼを含む組成物であって、ここで、前記トランスポザーゼは固定化ＭＥアダプターに負荷され、前記結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、かつ前記ＭＥアダプターの少なくとも１つは、非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含むか；またはｉ）基質、ｉｉ）リンカーまたは第２の認識エレメントを介して基質に結合する結合ドメイン、およびｉｉｉ）結合ドメインと結合したトランスポザーゼを含む組成物であって、ここで、前記トランスポザーゼはＭＥアダプターに負荷され、前記結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、かつ前記ＭＥアダプターの少なくとも１つは、非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む、組成物、を提供する。
【0013】
また、本発明では、ｉ）基質、ｉｉ）基質に結合された複数の第２の認識エレメント、ｉｉｉ）複数の第２の認識エレメントの１つに結合されたアダプター、およびｉｖ）複数の第２の認識エレメントの別の１つに結合された結合ドメインを含む組成物であって、ここで、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、かつアダプターは結合ドメインによって特異的に結合された非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む組成物も提供する。
【0014】
また、本発明は、本明細書に記載の結合ドメインを含む組成物の１以上および結合ドメインに結合された標的核酸を含む複合体も提供する。
【0015】
また、本明細書に開示され、図面に描かれている組成物および複合体の製造方法も提供される。
【0016】
本発明はまた、複数の標的核酸を分析する方法であって、該方法は、(ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本明細書に記載の組成物と接触させる工程、ここで、非カノニカルな特徴を含む標的核酸が結合ドメインに結合する、工程；（ｉｉ）以下のいずれかを行う工程：（ａ）核酸バーコードを非カノニカルな特徴を含む標的核酸にトランスファーして、バーコード化標的核酸を生成すること、または（ｂ）非カノニカルな特徴を含む標的核酸のバーコード化コピーを生成すること；（ｉｉｉ）バーコード化標的核酸を増幅させる工程；および（ｉｖ）バーコード化標的核酸の配列を決定する工程を含み、ここで、工程（ｉ）および（ｉｉ）は順次または同時に行われる、方法を提供する。ある側面では、３’ 縮重塩基を有するアダプターが標的核酸をランダムにプライミングする。ある側面において、工程（ｉｉ）は修飾特異的バーコードを導入することをさらに含み、ここで、アダプターの３’末端は逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【0017】
また、本発明は、複数の標的核酸を分析する方法であって、該方法は：(ｉ)複数の標的核酸を含む溶液を、本明細書に記載の組成物と接触させる工程であって、非カノニカルな特徴を含む標的核酸が結合ドメインに結合する、工程；（ｉｉ）以下のうちの１つを実施する工程：（ａ）核酸バーコードを、非カノニカルな特徴を含む標的核酸にトランスファーして、バーコード化標的核酸を生成すること、または（ｂ）非カノニカルな特徴を含む標的核酸のバーコード化コピーを生成すること；（ｉｉｉ）バーコード化標的核酸を増幅する工程；および、（ｉｖ）バーコード化標的核酸を配列決定する工程を含み、ここで、工程（ｉ）および（ｉｉ）は順次または同時に行われる、方法を提供する。ある側面では、３’スペーサー配列を有するアダプターは、標的核酸により示される合成スペーサー配列に部位特異的に結合する。ある側面において、工程（ｉｉ）は修飾特異的バーコードを導入することをさらに含み、ここで一方または両方の３’末端は逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【0018】
また、本発明は、複数の標的核酸を分析する方法であって、該方法は、（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本明細書に記載の組成物と接触させる工程であって、非カノニカル特徴を含む標的核酸が結合ドメインに結合する、工程；（ｉｉ）以下のうちの１つを実施する工程：（ａ）核酸バーコードを、非カノニカルな特徴を含む標的核酸にトランスファーして、バーコード化標的核酸を生成すること、または（ｂ）非カノニカルな特徴を含む標的核酸のバーコード化コピーを生成すること；（ｉｉｉ）バーコード化標的核酸を増幅する工程；および、（ｉｖ）バーコード化標的核酸を配列決定する工程を含み、ここで、工程（ｉ）および（ｉｉ）は順次または同時に行われる、方法も提供する。
【0019】
また、本発明は、複数の標的核酸を分析する方法であって、該方法は、（ｉ）標的ＲＮＡ分子を逆転写してＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二本鎖分子を形成させるか、または標的二本鎖ＤＮＡ分子を提供することにより、複数の標的核酸を提供する工程；（ｉｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本明細書に記載の組成物と接触させる工程であって、非カノニカルな特徴を含む標的核酸を結合ドメインに結合させる、工程；（ｉｉｉ）トランスポザーゼを用いて、２つのアダプターであって、そのうちの少なくとも１つは核酸バーコードを含むアダプターを、非カノニカルな特徴を含む二本鎖標的核酸にトランスファーして、バーコード化標的核酸を生成する工程；（ｉｖ）バーコード化標的核酸を増幅する工程；および（ｖ）バーコード化標的核酸を配列決定する工程を含み、ここで、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は同時または逐次的に行われる、方法も提供する。
【0020】
また、本発明は、複数の標的核酸中の複数の非カノニカルな特徴を検出する方法であって、該方法は、（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本明細書に記載の複数の組成物と接触させる工程であって、工程（ｉ）において接触させる複数の組成物の数は、非カノニカルな特徴の数と等しいか、または非カノニカルな特徴の数よりも多く、ここで、複数の組成物の結合ドメインは、各々、ＤＮＡまたはＲＮＡの異なる非カノニカルな特徴に結合するか、または複数の結合ドメインがＤＮＡまたはＲＮＡの同じ非カノニカルな特徴に結合し、かつ複数の組成物のアダプターは各々、その組成物の結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の、または結合ドメインに固有の、核酸バーコード配列を含む；（ｉｉ）以下のうちの１つを実施する：（ａ）複数の組成物の各々の核酸バーコード配列を複数の標的核酸にトランスファーすること、または（ｂ）複数の標的核酸のバーコード化されたコピーを生成すること；（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅する工程；および、（ｉｖ）バーコード化された標的核酸を配列決定する工程、を含む方法を提供する。ある側面では、トランスポザーゼによるアダプター導入も含まれる。
【0021】
また、本発明は、複数の標的核酸中の複数の非カノニカルな特徴を検出する方法であって、該方法は、（ｉ）本明細書に記載の複数の組成物を含むマイクロアレイ、ビーズ、および／または流体デバイスを提供する工程であって、ここで、工程（ｉ）において提供される複数の組成物の数が、非カノニカルな特徴の数と等しいか、または非カノニカルな特徴の数よりも多く、複数の組成物の結合ドメインが、各々、ＤＮＡまたはＲＮＡの異なる非カノニカルな特徴に結合するか、または複数の結合ドメインが、ＤＮＡまたはＲＮＡの同じ非カノニカルな特徴に結合し、かつ、複数の組成物のアダプターが、各々、その組成物の結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の、または結合ドメインに固有の核酸バーコード配列を含む；（ｉｉ）複数の標的核酸を複数の組成物と接触させ、かつ以下のうちの１つを実施する：（ａ）複数の組成物の各々の核酸バーコード配列を複数の標的核酸にトランスファーすること、または（ｂ）複数の標的核酸のバーコード化されたコピーを生成すること；（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅する工程；および、（ｉｖ）バーコード化された標的核酸を配列決定する工程、を含む方法を提供する。ある側面では、トランスポザーゼによるアダプター導入も含まれる。
【0022】
本発明のこれらの面および他の側面は、以下の詳細な説明、図面、特許請求の範囲、態様、手順、化合物、および／または組成物、ならびに関連する背景情報および参考文献を参照することにより明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】図１Ａ－１Ｈは、ＤＮＡアダプターおよび結合ドメインを表面（例えば、基質）に結合させるための種々の分子構造を示す。例示的な態様では、ＤＮＡアダプターは、修飾を同定する目的で標的ＲＮＡにトランスファーされるＲＮＡ修飾特異的バーコードを含む。図１Ａでは、ＤＮＡアダプターおよび結合ドメインは両方とも、同じか直交型（orthogonal）化学反応によって表面に共有結合している。表面結合分子の柔軟性およびアクセス性を高めるために、リンカーが含まれていてもよい。図１Ｂでは、アダプターはＲＮＡ特異的結合ドメインに結合する第２の認識エレメント、例えばプロテインＧ、ＡまたはＬを介して固定化されたＲＮＡ特異的一次抗体、あるいは二次抗体に結合している。図１Ｃは、アダプター固定化のための異なる第２の認識エレメント、例えばストレプトアビジンに結合したビオチン化アダプター分子の層の使用を示す。この例では、結合ドメインはリンカーを介して固定化されている。あるいは、結合ドメインおよびアダプターの両方をストレプトアビジンを介して固定化してもよいか、または結合ドメインが第２の認識エレメントに結合している間にアダプターを基質に共有結合させてもよい。図１Ｄは、結合ドメインおよびアダプターを固定化するための２つの異なる第２の認識エレメントの使用を示す。例えば、抗体結合ドメインはプロテインＧを介して基質に固定化され、ビオチン化アダプターはストレプトアビジンを介して基質に固定化される。図１Ｅは、プロテインＧを介して基質に固定化された２種の抗体を示す。一方の抗体種はアダプターで標識され、核酸とは結合しないが、もう一方の抗体種は核酸の非カノニカルな特徴に特異的であり、標識されていない。図１Ｆは結合ドメインの表面への固定化を示し、結合ドメインは捕捉配列に相補的な核酸に結合している。捕捉配列が（例えば、リンカーを介して）基質上に固定化されると、結合ドメインに結合した核酸配列とハイブリダイズし、その結果、結合ドメインが基質上に固定化される。この例では、アダプターは、標的ＲＮＡまたはｃＤＮＡを表面結合アダプターに酵素的に結合させた後、表面から放出するための切断部位を含む。切断は、ＵＳＥＲ酵素を用いたウラシル修飾アダプター内で起こるか、ＦｐＧ酵素を用いた８－オキソグアニン修飾アダプター内で起こるか、あるいはリンカーの一部、例えば光開裂可能なＰＣまたはジスルフィドリンカーであってもよい。図１Ｇは、結合ドメインに近接した転移(transposition)用モザイク末端（ＭＥ）アダプターを示す基質である。各Ｔｎ５トランスポザーゼ二量体には２つのアダプター分子が包含されている。タグメンテーションによるＤＮＡライブラリー調製には、フォワードプライマー部位およびリバースプライマー部位をそれぞれ有するＭＥアダプターを包含するＴｎ５二量体が含まれる。図１Ｈは、抗体結合ドメインの近傍にＴｎ５分子を連結する別の方法を示す。Ｔｎ５－プロテインＡ融合タンパク質の二量体は、ＭＥアダプターに負荷され、プロテインＡと抗体のＦｃ領域との親和性結合を介して抗体に結合する。
【図2】図２Ａ－２Ｇは、アダプターをＲＮＡ分子またはそれに対応するｃＤＮＡに結合させるための種々の方法を示す。図２Ａは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１によって触媒される、ＲＮＡの３’ＯＨ（アクセプター）とＤＮＡまたはＲＮＡの５’－リン酸（ドナー）の間のライゲーションを示す。関連する例示的なフォーマットには、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２によるプレアデニル化ＲＮＡまたはＤＮＡドナーとＲＮＡアクセプターとのライゲーション、およびＲｔｃＢリガーゼによるＲＮＡの３’リン酸とＲＮＡの５’ＯＨとのライゲーションが含まれる。CircLigase（サークリガーゼ）によって２つの一本鎖ＤＮＡフラグメントをライゲーションできる。図２Ｂは、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２によるニック構造のライゲーションを示す。ドナーおよびアクセプターの両方がＲＮＡであってもよい、ドナーがＤＮＡであってもよい。二本鎖ＤＮＡのニックはＴ４ ＤＮＡリガーゼによって塞がれる。図２Ｃは、標的ＲＮＡをテンプレートとして逆転写酵素を用いたスプリント伸長を示す。このフォーマットでは、バーコード化されたｃＤＮＡが生成される。図２Ｄでは、標的ＲＮＡがプライマーとして作用し、バーコードが付加されている。ＤＮＡポリメラーゼによる伸長には、既知の配列を有する短いスペーサー配列（ＳＰ）のライゲーションが必要である。ある側面において、本発明は、複数回の連続的なバーコードトランスファーを含む方法も含み、例えば、バーコードが標的核酸に直接結合している。図２Ｄに示すような２つのスペーサー領域を有するアダプターは、このような反復バーコード化工程に適するアダプターの一例である。逆転写酵素は、図２Ｇに示すようにアダプターを伸長し、それによってＲＮＡ標的のｃＤＮＡコピーを合成できる。図２Ｅは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによる平滑末端ＤＮＡまたは付着末端ＤＮＡの二本鎖ライゲーションによるバーコード化を示す。図２Ｆは、２つの部分ＡとＢの間で起こる化学的ライゲーションを示す。部分Ａは短いスペーサーの一部で、ＲＮＡ標的にライゲーションして化学的ライゲーションに適した状態にする。図２Ｈは図２Ｇに似ているが、ＲＮＡ標的へのスペーサー配列のライゲーションには依存していない。アダプターの３’末端は、標的ＲＮＡのランダムプライミングを可能にするために縮重塩基を示し、次いで単一または双方向プライマー伸長によってバーコードがトランスファーされる。
【図3】図３は、人工表面（例えばビーズ）を用いたＲＮＡプロファイリングの一般的概要を示す。複数のＲＮＡ鎖を化学的にフラグメント化する。修飾されたＲＮＡフラグメント（六角形で示された修飾）は、ＲＮＡ修飾特異的結合ドメインとの相互作用を介して表面上に富化される。複数のビーズを用いて、各ビーズが同じ結合ドメインおよびバーコードのコピーを示するようすることもできる。この反応には、ＲＮＡの修飾を調べるために、何種ものビーズを使用できる。標的ＲＮＡにバーコードをトランスファーすることで、ＲＮＡの修飾がＤＮＡコードに変換される。ｃＤＮＡライブラリーの塩基配列を決定すると、各ＲＮＡフラグメントの修飾状態がわかる。
【0024】
【図4】図４Ａ－４Ｃは、異なる鎖上の複数の非カノニカルな特徴（例えば、ＲＮＡ修飾）を同じ反応で同時に調べるための、いくつかの表面ベースのアッセイフォーマットを示す。これらのフォーマットは、異なるタイプの結合ドメインと関連するバーコードを空間的に分離し、それらを同じアナライトに曝露して多重分析を可能にすることを目的としている。図４Ａは、プール内で組み合わされた異なるタイプのビーズを示し、各タイプのビーズが特定のＲＮＡ修飾を捕捉し、バーコード化する。ビーズは、フリットカラムでろ過され、または磁化によって回収できる。図４Ｂは、表面介在バーコーディングおよび結合ドメインの捕捉のためのＤＮＡアレイの使用を示す。アレイの各スポットは、少なくとも１つの固有のバーコード化されたアダプターを含み、結合ドメインによって表示されるＤＮＡタグとのハイブリダイゼーションによって、１種の結合ドメインのみを捕捉する。図４Ｃでは、バーコードおよび結合ドメインが共固定化されたモノクローナルパッチが、個々のチャネルを形成するマイクロ流体チップに組み込まれている。各チャンネルには、固定化されたバーコードと、１つのＤＮＡ／ＲＮＡ修飾または非カノニカルな特徴に対する結合ドメインが含まれる。アナライトはサンプル分割によって供給される。
【図5】図５は、３’－固定化アダプターおよびライゲーションによるバーコード化を利用した、完全なＲＮＡ修飾プロファイリングワークフローを示す。ワークフロー工程には、修飾特異的ＲＮＡキャプチャー、一本鎖ライゲーションによるバーコーディング、一本鎖ｃＤＮＡ合成、およびテンプレートスイッチングによる二本鎖合成が含まれる。ＤＮＡアダプターは、表面固定化のための３’アミン、ユニバーサルプライミング部位、固有の分子バーコード、修飾特異的バーコード、および５’リン酸を含む。
【図6】図６は、５’固定化アダプターおよびプライマー伸長によるバーコード化を利用した、完全なＲＮＡ修飾プロファイリングワークフローを示す。この限定されない例では、ショートスペーサー（ＳＰ）が上流にライゲーションされる。スペーサーは表面に結合したアダプターと相補的であり、ＲＮＡ標的と表面に結合したアダプターがアニーリングすることで、逆転写酵素のプライミング部位が形成される。標的のＲＮＡ修飾特異的プルダウンを確実にするため、スペーサー相互作用は弱く、抗体結合がない状態では単独では安定しない。抗体およびスペーサーの同時結合が示されている。ＤＮＡアダプターは、表面固定化のための５’アミン、ユニバーサルプライミング部位、固有の分子バーコード、修飾特異的バーコード、および３’スペーサーを含む。テンプレートスイッチングオリゴの存在下、逆転写酵素によって表面に結合したアダプターを伸長させると、バーコード化された第１鎖ｃＤＮＡが生成され、第２の配列決定アダプターが導入され、ｃＤＮＡが表面に共有結合する。ｃＤＮＡの増幅は、ビーズをインプットするＰＣＲによる別の反応で行われるか、または表面上でインサイチュウにて行われる（それぞれ図７および図８に示される）。
【図7】図７は、標的核酸の同一コピーのクラスターを基質上に形成するために用いられ得る表面ベースのｃＤＮＡ増幅の概略図を示す。溶液ＰＣＲと同様に、このプロセスは温度サイクルを用いてＤＮＡ鎖をアニール、伸長、融解させ、指数関数的な増幅をもたらす。表面ベースの増幅は、最初のｃＤＮＡ鎖の同一コピーの単クローン性クラスターを生成する。それぞれのクラスターは、基質と結合している結合ドメインが非カノニカルな特徴を認識することによってシードされる。結合ドメインの表面密度は、隣接するクラスターの重合を避けるために疎になっている。最初のｃＤＮＡ鎖は、Ｐ５プライマーおよびＰ７プライマーを示す表面を用いて、図６に示すワークフローに従って作製される。低温で、ｃＤＮＡ鎖を相補的な表面プライマーにアニールする。ＤＮＡポリメラーゼが中温でプライマーを伸長させると、親鎖のコピーが生成される。得られた二重鎖は、熱により、および／またはカオトロープ(chaotrope)の添加によって分離され、次のサイクルの出発点となる。同一コピーのクラスターが１つ形成されることもあれば、複数形成されることもある。本発明の方法は、基質上の標的核酸の同一コピーのクラスターのインサイチュウ配列決定を含む。
【0025】
【図8】図８は、合成による配列決定に適したモノクローナルｃＤＮＡクラスターを生成するプロセスを示し、各クラスターは修飾ＲＮＡ鎖を表す。フラグメント化されたＲＮＡは、ＲＮＡ修飾と結合ドメインとの相互作用に基づいて、フローセル上に分割されシードされる(図６参照)。フローセルはセグメント化されており、各セグメントは異なる修飾を標的としている。例えば、１０の修飾を検出するために、フローセルは適切な結合ドメインおよびアダプター対を有する修飾された１０の領域を含む。増幅時に隣接配列とのコンタミネーションを防ぐため、抗体の表面密度は低い。ＲＮＡ鎖はその修飾に基づいて捕捉され、表面に共有結合され、プライマー伸長によってバーコード化され、次いでクローン増幅が行われる(図７参照)。クローン増幅されたバーコード化ｃＤＮＡは、その後直鎖化され、シーケンシング・バイ・合成（ＳＢＳ）ケミストリー法を用いて直接配列決定される。
【図9】図９は、バーコーディングのためのＴｎ５トランスポザーゼを用いたＲＮＡ修飾の迅速なプロファイリング法を示す。ＲＮＡをＤＮＡ／ＲＮＡのヘテロ二重鎖に逆転写する。ヘテロ二重鎖は、抗体およびモザイク末端（ＭＥ）を有するアダプターを提示する表面（例えば、ビーズ）上に免疫沈降される。ＭＥアダプターに結合したＴｎ５トランスポーズ分子を含むトランスポソームが構成され、Ｔｎ５トランスポザーゼがＭｇ２＋イオンの存在下で、１段階のカット・アンド・ペースト機序でバーコード化されたアダプターを挿入する。ギャップフィルの後にＰＣＲを行うことで、ライブラリー調製のワークフローが完成する。
【図10】図１０は、ＡＤＡＲ酵素による塩基編集によって、同じＲＮＡ鎖内の複数のｍ６Ａ修飾の位置をマーキングするプロセスを示す。ポジションマーキング後、図９に示すように、個々のＲＮＡ鎖はトランスポザーゼによってバーコード化される。同じ親ＲＮＡ分子に由来するＮＧＳ（次世代シーケンシング）リードは、同じバーコードを共有する。“Ａ＞Ｉ”とは、ＡＤＡＲ酵素によって触媒されるアデニンのイノシンへの変異を意味する。
【図11】図１１は、ロングリードフェーズの概念を示す。図１０に示すプロセスによるポジションマーキングおよびバーコード化により、短いシーケンスリードから長い転写産物を再構築できる。同じ親分子に由来する各短い核酸フラグメントをユニークにバーコード化するために、各ビーズは、ＲＮＡ修飾および個々のビーズを示す複数の固有のバーコードを示す。ビーズの表面は小さく、平均してフルサイズの親分子を１つしか捕捉できない。固定化されたトランスポソームは親分子を短いフラグメントに切断し、ビーズに特異的なバーコードを挿入する。短いリードは対照ゲノムにアライメントされ、同じバーコードを示すジャンクションで結合される。“Ａ＞Ｉ”はアデニンのイノシンへの変異を意味する。
【図12】図１２Ａ－１２Ｄは種々のＤＮＡアダプターの構造を示す。図１２Ａは、ＵＦＰまたはＵＲＰを含むアダプターを示す。図１２Ｂは、環状化によるライブラリー調製に用い得るアダプターを示す。図１２Ｃは、ライゲーションによるバーコード導入に用い得るアダプターを示す。図１２Ｄは、プライマー伸長による単一または複数のバーコード転写に用い得るアダプターを示す。スペーサーは特定の塩基配列であってもよいし、ランダムな塩基から構成されていてもよい。凡例に示すように、“ＵＦＰ”はユニバーサルフォワードプライマーの略称であり、“ＵＲＰ”はユニバーサルリバースプライマーの略称であり、“ＭＢＣ”は修飾エンコードバーコードの略称であり、“ＵＭＩ”は分子バーコード（Unique Molecular Identifier）の略称であり、そして“ＣＬＳ”は切断部位の略称である。“ＳＰ”はスペーサーの略称である。
【0026】
【図14】図１４Ａ－１４Ｇは、Biolayer Interferometry （ＢＬＩ）によって測定された異なる抗体の結合曲線および解離曲線を示す。実線は、中央の塩基が修飾された変性ＲＮＡオリゴに対する抗体の結合を示す。点線は、同じ長さの未修飾ＲＮＡオリゴに対する抗体の結合を示す。
【図15】図１５Ａは、レポーター抗体を異なる量のアダプターオリゴで標識し、変性ゲル電気泳動で分離して生成した生成物を示す。この反応では、標識された化学量論分布が生じる。平均標識化学量論は、抗体に対するオリゴのモル過剰が増加するにつれて増加する。図１５Ｂは、表面上のレポーター抗体の数が増加するにつれて、バーコード化率が増加することを示す。データは、ＲＮＡ修飾特異的抗体およびレポーター抗体の混合物をビーズに負荷し、次いで修飾ＲＮＡを末端色素標識で免疫沈降させ、バーコード化反応を開始することによって得られる。バーコード化は、溶出したＲＮＡの変性ゲル電気泳動およびゲルバンドのデンシトメトリーによって定量される。図１５Ｃは、“モノクローナル”ビーズの構成を模式的に示す。モノクローナルビーズは、単一のＲＮＡ修飾特異的抗体およびその抗体を示す単一のアダプター配列を示す。免疫沈降したＲＮＡを効果的にバーコード化するには、アダプターがＲＮＡとアダプター分子の相互作用を可能にする密度で存在する必要がある。
【図16】図１６は、キャピラリー電気泳動を用いた、スペーサーライゲーション前後のフラグメント化ＲＮＡの分析結果である。フラグメントのサイズは、それぞれ１０４ヌクレオチドおよび１０９ヌクレオチド付近に正規分布している。
【図17】図１７Ａは、逆転写によるバーコードの分子構造を示す。３プレックス実験には３種のビーズが含まれる。一方のビーズタイプはｍ６Ａ抗体およびｍ６Ａ特異的アダプター（ＭＢＣ３－Ａｂ０５（ｍ６Ａ））を示し、第２のビーズタイプはイノシン抗体およびイノシン特異的アダプター（ＭＢＣ４－Ａｂ１０（Ｉ））を示し、第３のビーズタイプはｍ５Ｃ抗体およびｍ５Ｃ特異的アダプター（ＭＢＣ５－Ａｂ１６（ｍ５Ｃ））を示す。標的ＲＮＡとアダプターとの間のスペーサーハイブリダイゼーション（ＳＰ－ＳＰ’）により、逆転写酵素による双方向伸長が可能になり、修飾バーコード（ＭＢＣ）がコピーされ、ｃＤＮＡが産生される。逆転写反応にテンプレートスイッチングオリゴ（ＴＳＯ）を含めると、第２の配列決定アダプターが結合される。図１７Ｂおよび１７Ｃは、４つの異なるゲノムからインビトロ転写（ＩＶＴ）によって得られた修飾ＲＮＡを、示した修飾ヌクレオチドの存在下で用いた３－プレックス実験で得られた配列決定結果をまとめたものである。図１７Ｂにまとめた実験ではSuperScript IV逆転写酵素を用いたが、図１７ＣではMaxima Minus逆転写酵素を用いた。各ＭＢＣの正規化画分を各ゲノムについてプロットし、修飾を示す。
【0027】
【図20】図２０Ａは、バーコード化方法としてスプリントライゲーションを示す。スプリント（黒線）はＲＮＡ標的およびアダプターを架橋している。リガーゼがギャップを塞ぎ、アダプターをＲＮＡ標的に連結させる。ｍ６Ａおよびｍ５Ｃを標的とした２種のビーズが示される。図２０Ｂ－２０Ｃは、ｍ６Ａおよびｍ５Ｃの同時検出を示す対応する配列決定データをまとめたものである。アダプターにハイブリダイズするスプリントの部分の長さは７ｎｔであるのに対し、ＲＮＡ標的に面した部分の長さは６ｎｔ（７－６スプリント）または３ｎｔ（７－３スプリント）である。以下の配列が示される： 配列番号： 18 AAAGCTGCACTCA/3SpC3/ 19 ATATAGGCACTCA/3SpC3 20 AAAGCTGCAC/3SpC3/ 21 ATATAGGCAC/3SpC3/
【図21】図２１Ａは、ユニバーサルスペーサーをＲＮＡ標的にライゲートする代替法を示す。プライマー伸長によるバーコーディングのために、ＲＮＡをＡ－テール（ポリＡテール（ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ（配列番号２２））とし、配列ＮＶＴＴＴＴＴＴＴで終わるアダプター配列とハイブリダイズさせる。逆転写およびテンプレートスイッチは上記のように行う。図２１Ｂは、シングルプレックスデータセットの概念実証を示す。
【図22】図２２Ａは、バーコーディングのためにＴｎ５トランスポザーゼを用いてＲＮＡ修飾をプロファイリングする迅速な方法を示す。ＲＮＡをＤＮＡ／ＲＮＡのヘテロ二重鎖に逆転写する。表面（例えば、ビーズ）には抗体およびそこに担持されるＭＥアダプターが含まれる。ヘテロ二重鎖は抗体およびアダプターを提示する表面に免疫沈降される。ビーズを洗浄した後、Ｍｇ２＋不存在下でＴｎ５トランスポザーゼをＭＥアダプターに負荷する。次にＭｇ２＋を含むタグメンテーションバッファーを加え、ビーズに確実に捕捉されたＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖にアダプターを挿入する。ギャップ充填（filling）に続いてＰＣＲを行うことで、ライブラリー調製のワークフローが完成する。図２２Ｂは、ｍ６Ａ特異的ビーズおよび４つの異なるゲノムからの修飾ＩＶＴ ＲＮＡを含む標的プールを用いた実験で得られたカバレッジプロットである。このプロットは、ｍ６Ａを含むフラグメントが有意に濃縮されていることを示しており、ｍ６Ａ修飾ＲＮＡの選択的タグメンテーションを証明している。
【図23】図２３Ａは、バーコード化ＩＰ ＲＮＡおよび非濃縮（インプット）サンプルのテクニカルトリプリケートについて、ＭＢＣ分画で測定したグローバルバーコード表示を示す。図２３Ｂは、遺伝子内のコールされたピークの位置を示す。図２３Ｃは、各修飾および各複製サンプルについてコールされたピークの数をベン図で示す。
【図24】図２４Ａは、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖のタグメンテーションに、抗体およびプロテインＡ－Ｔｎ５融合タンパク質を含む固定化コンジュゲートを用いる方法を示す。表面（例えば、ビーズ）にはプロテインＧが結合しており、抗体およびプロテインＡ－Ｔｎ５分子を含むコンジュゲートを結合する。各Ｔｎ５二量体には、バーコードを含む一対のモザイクエンド（ＭＥ）アダプターが担持されている。転移の基質を作成するために、ＲＮＡをＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖に逆転写し、ビーズ上に免疫沈降させる。ビーズを洗浄し、Ｍｇ２＋含有タグメンテーションバッファーを加えてタグメンテーション反応を開始する。タグ付けされたＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖はギャップ充填され、ＰＣＲ増幅される。その後、ライブラリー調製が行われ、ワークフローが完成する。図２４Ｂは、ｍ６Ａを標的にした実験で得られたインプット（対照）および免疫沈降サンプルのリードカバレッジプロットを比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【0028】
詳細な説明
本発明は、トランスクリプトームおよびゲノムにわたるＲＮＡ修飾およびＤＮＡ修飾の多重プロファイリングのための組成物および方法を提供する。この方法は、標的核酸の非カノニカルな特徴（例えば、塩基修飾、骨格修飾、病変、および／または構造的エレメント）の分子認識と、この認識イベントからの情報をバーコードを用いて標的核酸の隣接遺伝子配列に書き込む工程とを組み合わせる。次いで、得られたバーコード化された核酸は、配列決定ライブラリーに変換され、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定法または他の方法によって読み取られる。この工程により、バーコードの配列が明らかになり、標的核酸の非カノニカルな特徴と相関する。配列決定により、標的核酸中の非カノニカルな特徴の局在を確認することもできる。本明細書に記載される高速プロファイリング法は、複数またはすべてのＤＮＡ／ＲＮＡ修飾の性質および位置を並行して同定することを可能にする。これらの方法はまた、ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾の存在量および化学量論を決定することもできる。
本発明は、トランスクリプトームおよびゲノムにわたるＲＮＡ修飾およびＤＮＡ修飾の多重プロファイリングのための組成物および方法を提供する。この方法は、標的核酸の非カノニカルな特徴（例えば、塩基修飾、骨格修飾、病変、および／または構造的エレメント）の分子認識と、この認識イベントからの情報をバーコードを用いて標的核酸の隣接遺伝子配列に書き込む工程とを組み合わせる。次いで、得られたバーコード化された核酸は、配列決定ライブラリーに変換され、例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定法または他の方法によって読み取られる。この工程により、バーコードの配列が明らかになり、標的核酸の非カノニカルな特徴と相関する。配列決定により、標的核酸中の非カノニカルな特徴の局在を確認することもできる。本明細書に記載される高速プロファイリング法は、複数またはすべてのＤＮＡ／ＲＮＡ修飾の性質および位置を並行して同定することを可能にする。これらの方法はまた、ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾の存在量および化学量論を決定することもできる。
【0029】
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、標的核酸上の修飾を同定するだけでなく、標的核酸上の修飾を１塩基ほどの高分解能で局在化するためにも用いられる。
【0030】
本発明は、以下に、例示的かつ限定されない態様で、かつ添付図面を用いてより詳細に説明される。しかしながら、本発明は、多くの異なる形態で具体化され得るものであり、以下に示す態様に限定して解釈されるべきではない。むしろ、これらの態様は、本明細書の記載を完全にし、当業者に本明細書に記載された範囲を伝えるために提供される。
【0031】
別段の定義がない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の詳細な説明で用いられる用語は、特定の態様を説明するためだけのものであり、限定を意図するものではない。
【0032】
すべての刊行物、特許出願、特許、ＧｅｎＢａｎｋ／Ｕｎｉｐｒｏｔまたは他の受託番号、および本明細書に記載される他の参考文献は、すべての目的のために引用によりその内容全体が本明細書に包含される。
【0033】
定義
以下の用語は、本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる。
以下の用語は、本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる。
【0034】
単数形の“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、複数形も含むものとする。
【0035】
さらに、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、投与量、時間、温度などの測定可能な値に言及するとき、本明細書で用いる用語“約”とは、規定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらに±０．１％の変動を包含することを意味する。
【0036】
また、本明細書で用いる“および／または”は、関連する列挙された項目の１以上の何れかの可能な組み合わせ、ならびに代替的に解釈されるとき、組み合わせの欠失(“または”)を意味し、それらを包含する。
【0037】
他にこれと異なる記載がない限り、本明細書に記載される種々の特徴は、何れかの組み合わせで使用できることが特に意図されている。さらに、いくつかの態様では、本明細書に記載の特徴または特徴の組み合わせのいずれかを除外または省略できる。さらに説明すると、例えば、本明細書において、特定のＤＮＡ塩基がＡ、Ｔ、Ｇおよび／またはＣから選択され得ることが示されている場合、この用語は、その塩基がこれらの塩基の何れかのサブセット、例えばＡ、Ｔ、ＧまたはＣ；Ａ、ＴまたはＣ；ＴまたはＧ；Ｃのみ等から選択され得ることも示しており、かかるサブコンビネーションがそれぞれ本明細書において明示的に記載されているかのように記載される。さらに、かかる用語は、指定された塩基の１以上が除外されうることも示している。例えば、いくつかの態様では、核酸はＡ、ＴまたはＧではない；Ａではない；ＧまたはＣではないなど、そのような可能性のある各除外が本明細書に明示されているかのように記載される。
【0038】
本明細書で用いる用語“減少”、“低減”、“低下”および類似の用語は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３５％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％またはそれ以上の減少を意味する。
【0039】
本明細書で用いる用語“増加”、“改善”、“増強”、“強化”、および類似の用語は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％またはそれ以上の増加を示す。
【0040】
用語“エピジェネティック変化”とは、本明細書では、その細胞または生物のＤＮＡの一次配列（すなわち、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ）にコードされていない、生細胞、生物などにおける表現型の変化を意味するために用いられる。エピジェネティックな変化には、例えば、ヌクレオチドおよび／またはヒストン（すなわち、核内のＤＮＡのコイル化およびパッケージングに関与するタンパク質）の化学的変化が含まれ得る。例示的なＤＮＡヌクレオチド修飾には、一般的なエピジェネティックマーカーである５－メチルシチジン（５ｍＣ）およびその酸化産物である５－ヒドロキシメチルシチジン（５ｈｍＣ）、５－ホルミルシチジン（５ｆＣ）、５－カルボキシメチルシチジン（５ｃａＣ）などが含まれる。５ｍＣは遺伝子サイレンシングにおけるその役割でよく知られているが、５ｍＣの脱メチル化経路における酸化中間体５ｈｍＣ、５ｆＣおよび５ｃａＣの代謝機能を示唆する証拠が増えている。さらに代謝的に関連するＤＮＡ修飾には、酸化、アルキル化、二量体化、架橋、その他ＤＮＡ損傷に関連する化学修飾ヌクレオチドがある。このようなＤＮＡ修飾は毒性（toxicity）を理解する上で重要であるが、損傷が生じた際のゲノム全体におけるその分布はよくわかっていない。ＤＮＡ修飾は、例えばプロモーターおよびゲノムの他の領域におけるＧ－四重鎖の動態に関与するなど、さらなる制御的役割を担っている可能性がある。
【0041】
本明細書で用いる用語“エピトランスクリプトーム変化”とは、転写中または転写後に起こるＲＮＡの化学修飾を意味する。核酸塩基、リボース、ホスホジエステル骨格への化学変化を含め、１７０以上の異なるＲＮＡ修飾が知られている。ＲＮＡ修飾は、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど、全てのＲＮＡタイプに見出だされ、ＲＮＡの構造および動態を変化させたり、タンパク質など他の生体分子によるＲＮＡの分子認識を変化させたりすることによって、細胞の表現型を変化させ得る。エピトランスクリプトームの天然化学ＲＮＡ修飾は、ＲＮＡプロセシング、スプライシング、ポリアデニル化、編集、構造、安定性、局在化、翻訳開始、遺伝子発現など、ＲＮＡ代謝における幅広い機能を制御している。エピトランススクリプトームは、細胞タイプ、代謝状態、健康状態によって異なり、細胞の表現型および機能の分化に重要な役割を果たし（しかし、あまり理解されていない）、同一の一次遺伝配列を有する同一生物の細胞間の劇的な表現型の違いを説明するのに役立っている。エピトランススクリプトームの変化は疾患と相関する。例えば、ｍＲＮＡおよびｎｃＲＮＡの修飾は、がん幹細胞の分化過程において、時空間的な遺伝子発現の変化を制御することが知られており、それによって疾患の進行に組織化した役割を果たしている。さらに、ＲＮＡ修飾は、ＲＮＡウイルス（例えば、コロナウイルス科およびフラビウイルス科）が宿主を裏切り、自然免疫系を回避する重要な機序であることが強く推測される。
【0042】
用語“ゲノム”とは、細胞または細胞集団に含まれるすべてのＤＮＡ、あるいは特定のタイプのＤＮＡ分子（例えば、コーディングＤＮＡ、非コーディングＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、または葉緑体ＤＮＡ）の選択を意味する。用語“トランスクリプトーム”とは、１つの細胞または細胞集団で産生されるすべてのＲＮＡ分子、あるいは完全なトランスクリプトームに含まれる特定の種類のＲＮＡ分子の選択（例えば、ｍＲＮＡ 対 ｎｃＲＮＡ、またはｍＲＮＡトランスクリプトーム内の特定のｍＲＮＡ）を意味する。いくつかの態様では、トランスクリプトームは、コーディングＲＮＡ（すなわち、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ）および非コーディングＲＮＡなどの複数の異なるタイプのＲＮＡを含む。トランスクリプトーム中に見出される様々なタイプのＲＮＡ分子の限定されないリストには、修飾ヌクレオシドを含み得るものが含まれる：７ＳＫ ＲＮＡ、シグナル認識粒子ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ロング非コーディングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、リピート関連ｓｉＲＮＡ、レトロトランスポゾン、リボヌクレアーゼＭＲＰ、リボヌクレアーゼＰ、リボソームＲＮＡ、カハール小体（small Cajal body）特異的ＲＮＡ、小干渉ＲＮＡ、ｓｍＹ ＲＮＡ、小核ＲＮＡ、およびトランス作用ｓｉＲＮＡ。
【0043】
本明細書で用いる用語、核酸の“非カノニカルな特徴”とは、その一次配列とは別個の核酸の特徴を意味する。例えば、非カノニカルな特徴とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡ骨格に対する化学的修飾であり得る。いくつかの態様では、非カノニカルな特徴は、ヘアピンまたはループのような構造配列であってもよい。他の例示的な非カノニカルな構造としては、Ｚ－ＤＮＡ構造、Ｇ－四重鎖、ｉ－モチーフ、バルジ、脱塩基部位、三重鎖、三方向結合、十字形構造、四重ループ、リボースジッパー、シュードノットなどが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡおよびＲＮＡを含む核酸は、多くの非カノニカルな特徴を含む。これらの修飾の頻度はＲＮＡおよび特徴の種類によって大きく異なるが、修飾のクラスターが発生することもある。いくつかの態様では、非カノニカルな特徴はＤＮＡおよび／またはＲＮＡの損傷に起因し得る。本明細書で用いる用語“非カノニカルな特徴”および“改変”とは、当業者であれば文脈上理解されるように、互換的に使用できる。
【0044】
本明細書で用いる用語“標的核酸”とは、１以上の非カノニカルな特徴を含む核酸を意味する。本明細書に記載の核酸結合分子は、分子の結合ドメインが非カノニカルな特徴を認識するとき、標的核酸に結合できる。
【0045】
本明細書で用いる用語“基質”とは、何れかの固体支持体を意味するために用いられる。例えば、基質はビーズ、チップ、プレート、スライド、ディッシュ、ゲル、チューブ、フローセル、マトリックス、アレイ、マイクロ流体デバイスまたはそのコンポーネント、ウェル、カートリッジ、または３次元マトリックスなどである。本明細書に記載されているように、本明細書に記載の結合ドメインは、１以上の基質に結合してもよく、基質は１以上の結合ドメインに結合してもよい。さらに、本明細書に記載のアダプターは１以上の基質に結合してもよく、基質は１以上のアダプターに結合してもよい。基質は種々の材料で形成できる。いくつかの態様では、基質は樹脂、膜、繊維、ポリマーである。いくつかの態様において、基質は、セファロース、アガロース、セルロース、ポリスチレン、ポリメタクリレート、および／またはポリアクリルアミドを含む。いくつかの態様では、基質は合成ポリマーなどのポリマーを含む。合成ポリマーの限定されないリストには、ポリ（エチレン）グリコール、ポリイソシアノペプチドポリマー、ポリ乳酸－コ－グリコール酸、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ乳酸、ポリ（３－ヒドロキシ酪酸－コ－３－ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）、キトサンおよびセルロースが含まれる。
【0046】
本明細書で用いる用語“バーコード”とは、合成産生された核酸を意味する。固有のバーコードを特定の核酸修飾に割り当てて、本明細書に記載の方法においてそれらの修飾を特異的に同定できるようにしてもよい。したがって、バーコードは、本明細書に記載される１以上の方法において、その改変を同定するために特別に用いられるとき、非カノニカルな改変に対して“ユニーク”である。バーコードは、固相オリゴヌクレオチド合成など、当技術分野で知られている方法を用いて製造できる。ある態様では、バーコードはＤＮＡバーコードであってもよい（すなわち、ＤＮＡ配列を含んでいてもよい）。いくつかの態様において、バーコードは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはロック核酸（ＬＮＡ）などの合成ＤＮＡ構造を含んでいてもよい。いくつかの態様では、合成ＤＮＡ構造は、１以上の修飾塩基を含んでいてもよい。ある態様では、合成ＤＮＡ構造は、１以上の修飾塩基を含んでいてもよい。ある態様では、バーコードはＲＮＡバーコードであってもよい（すなわち、ＲＮＡ配列を含んでいてもよい）。バーコードはどのような長さであってもよく、例えば、約４から約１５０ヌクレオチド長の範囲であり得る。いくつかの態様において、バーコードは、約４～約２０ヌクレオチド長、例えば、約４ヌクレオチド長、約５ヌクレオチド長、約６ヌクレオチド長、約７ヌクレオチド長、約８ヌクレオチド長、約９ヌクレオチド長、約１０ヌクレオチド長、約１１ヌクレオチド長、約１２ヌクレオチド長、約１３ヌクレオチド長、約１４ヌクレオチド長、約１５ヌクレオチド長、約１６ヌクレオチド長、約１７ヌクレオチド長、約１８ヌクレオチド長、約１９ヌクレオチド長、または約２０ヌクレオチド長である。通常、バーコードは、既知の生物のゲノムにはない、合理的に設計された配列を含み得る。しかしながら、いくつかの態様では、バーコードは既知の配列を含み得る。例えば、バーコード配列は、病原体または他の生物学的物質に関連するシグネチャーを含み得る。ある態様では、バーコードは、配列決定反応を促進するように構成された配列を含んでいてもよい。用語“バーコード”および“アダプター”とは、本明細書で互換的に用いられ得る。当技術分野で理解されるように、アダプターは、いくつかの態様では、バーコードで構成される。いくつかの態様では、アダプターは、以下に説明され、図１２Ａ－１２Ｄに示されるように、バーコードおよび１以上の追加要素を含み得る。
【0047】
用語“増幅”とは、核酸に関して使われるとき、その核酸のコピーを生成することを意味する。核酸は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅できる。核酸増幅の代替法としては、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＡＤ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）およびローリングサークル増幅（ＲＣＡ）などが含まれる。
【0048】
本明細書で用いる用語“結合（coupled）”とは、互いに関連する２以上の構成要素を表すために用いられ得る。例えば、第２の成分に結合した第１の成分は、共有結合または非共有結合で結合しているか、あるいは他の方法で結合している。
【0049】
本明細書で用いる用語“複合体内アダプタートランスファー”または“複合体内バーコードトランスファー”とは、結合ドメインおよびアダプターが結合している間に、アダプターおよび／またはバーコードが標的核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）にトランスファーすることを意味する。したがって、本明細書中、用語“複合体”とは、標的核酸、結合ドメイン、およびその同族アダプターの間に形成される複合体を意味する。
【0050】
本明細書で用いる用語“クロストーク”、“バーコードクロストーク”、および同様の用語は、核酸バーコードの標的外トランスファーを意味する。例えば、バーコードのクロストークは、アダプターのバーコードが、核酸結合分子の結合ドメインに結合していない核酸にトランスファーされるとき、バーコードのクロストークが起こり得る。
【0051】
用語“ＤＮＡアドレス”とは、プログラム可能な結合エレメントとして用いられ、特定の結合事象を促進するＤＮＡまたはＲＮＡ配列および／またはその相補体を意味する。例えば、デアミナーゼは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、第２のＤＮＡアドレス）に結合するＤＮＡまたはＲＮＡ配列（すなわち、第１のＤＮＡアドレス）に結合し、デアミナーゼをそこに誘導できる。
【0052】
“ＤＮＡ損傷”または“ＲＮＡ損傷”などの“核酸損傷”は、内因性プロセスおよび／または外因性薬剤の結果として起こりうる核酸の化学的修飾である。例えば、ＤＮＡ損傷は、酸化的損傷（８－オキソグアニンなど）、炭化した肉およびタバコの煙に含まれるような親電子物質およびアルキル化剤との反応（ベンゾ［ａ］ピレン付加物およびアルキル化核酸塩基）、紫外線損傷（シクロブタンピリミジン二量体および６－４ピリミジン－ピリミジン光生成物）、金属錯体形成（水銀錯体およびプラチナ架橋）などによって引き起こされる。内因性プロセスによって生じるＤＮＡ損傷は頻繁に起こる。ＤＮＡ損傷は通常、様々な修復酵素によって修復されるか、遺伝暗号の複製中に損傷バイパスポリメラーゼによってバイパスされる。不自然な細胞増殖および成長をもたらす突然変異は、がん発生を駆動する。変異は通常のＤＮＡ配列決定で容易に検出できるが、損傷自体は標準的なＤＮＡ配列決定ワークフローでは検出できない。損傷はゲノム全体に一様に分布しているわけではなく、修復の効果はＤＮＡ遺伝子座および細胞状態に関連している。さらに、最も一般的ながん化学療法薬（シスプラチン、ゲムシタビンなど）はＤＮＡ損傷を誘発し、そのため、ヒトゲノム全体のＤＮＡ損傷をマッピングすることは、老化と癌の病因を理解し、癌化学治療薬の有効性を向上させ、毒性を低下させるための大きな可能性を提供する。
【0053】
表面構造および組成
本明細書には、核酸上の非カノニカルな特徴を同定するためのアダプターおよび結合ドメインを含む組成物が記載されている。本明細書に記載の組成物は、基質上に空間的に分離した結合ドメインおよびアダプターの異なる表面構造を含む。
本明細書には、核酸上の非カノニカルな特徴を同定するためのアダプターおよび結合ドメインを含む組成物が記載されている。本明細書に記載の組成物は、基質上に空間的に分離した結合ドメインおよびアダプターの異なる表面構造を含む。
【0054】
ある態様では、本明細書に記載の結合ドメインは基質に結合している。ある態様では、結合ドメインは基質に直接結合している。ある態様では、結合ドメインはリンカーに結合され、リンカーは基質に結合されている。ある態様では、結合ドメインは基質に共有結合している。ある態様では、結合ドメインは基質に非共有結合している。
【0055】
ある態様では、本明細書に記載のアダプターは基質に結合している。ある態様では、アダプターは基質に直接結合している。ある態様では、アダプターはリンカーに結合され、リンカーは基質に結合されている。ある態様では、アダプターは基質に共有結合している。ある態様では、アダプターは基質に非共有結合している。
【0056】
ある態様において、本発明は、基質、アダプター、および結合ドメインを含む組成物を提供する。ある態様において、組成物は、図１Ａに示すように、基質、結合ドメインおよびアダプターを含む。ある態様では、組成物は、基質に直接結合した結合ドメイン、および基質に直接結合したアダプターを含む。ある態様では、組成物は、リンカーを介して基質に結合する結合ドメイン、および基質に直接結合したアダプターを含む。ある態様では、組成物は、基質に直接結合した結合ドメイン、およびリンカーを介して基質に結合するアダプターを含む。いくつかの態様では、組成物は、第１のリンカーを介して基質に結合する結合ドメイン、および第２のリンカーを介して同じ基質に結合するアダプターを含む。
【0057】
ある態様において、組成物は、
ｉ）基質、
ｉｉ）第１のリンカーを介して該基質に結合する結合ドメイン、および
ｉｉｉ）第２のリンカーを介して該基質に結合するアダプター、
を含む。ある側面では、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、そしてアダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
ｉ）基質、
ｉｉ）第１のリンカーを介して該基質に結合する結合ドメイン、および
ｉｉｉ）第２のリンカーを介して該基質に結合するアダプター、
を含む。ある側面では、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、そしてアダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
【0058】
いくつかの態様において、本発明は、第２の認識エレメント、基質、結合ドメイン、およびアダプターを含む組成物を提供する。
【0059】
ある側面において、本発明は、本明細書に開示され、図面に示される組成物およびコンジュゲートを製造する１以上の方法を含む。一側面において、この方法は、１以上のアダプターを基質に直接的または間接的に結合させること、および１以上の結合ドメインを基質に直接的または間接的に結合させることを含み、ここで、何れかの間接的な結合はリンカーを介していてもよい。例えば、図１Ａを参照のこと。
【0060】
一側面において、前記製造方法は、１以上の第２の認識エレメントを基質に直接的または間接的に結合させること、および１以上の結合ドメインを１以上の第２の認識エレメントに直接的または間接的に結合させること、および１以上のアダプターを１以上の第２の認識エレメントに直接的または間接的に結合させることを含み、ここで、何れかの間接的な結合はリンカーを介していてもよい。例えば、図１Ｂを参照のこと。
【0061】
一側面において、前記製造方法は、１以上の第２の認識エレメントを基質に直接的または間接的に結合させること、および１以上の結合ドメインを基質に直接的または間接的に結合させること、および１以上のアダプターを１つ以上の第２の認識エレメントに直接的または間接的に結合させること、または１以上のアダプターを基質に直接的または間接的に結合させることを含み、ここで、何れかの間接的な結合はリンカーを介していてもよい。例えば、図１Ｃを参照のこと。一側面において、製造方法は、１以上の第２の認識エレメントを基質に直接的または間接的に結合させること、および１以上の結合ドメインを第２の認識エレメントに直接的または間接的に結合させること、および１以上のアダプターを基質に直接的または間接的に結合させることを含み、ここで、何れかの間接的な結合はリンカーを介していてもよい。
【0062】
一側面では、製造方法は、２種以上の第２の認識エレメントを基質に直接的または間接的に結合させること、および１種以上の結合ドメインを第２の認識エレメントの少なくとも１種に直接的または間接的に結合させること、および１種以上のアダプターを１種以上の第２の認識エレメントに直接的または間接的に結合させることを含み、ここで、何れかの間接的結合はリンカーを介していてもよい。例えば、図１Ｄを参照のこと。
【0063】
一側面において、製造方法は、１以上の第２の認識エレメントを基質に直接的または間接的に結合させること、および２以上の結合ドメインを第２の認識エレメントに直接的または間接的に結合させること、および１つの結合ドメイン種がアダプターで標識され、かつ核酸と結合せず、一方、１以上の他の結合ドメイン種が核酸の非カノニカルな特徴に特異的であり標識されないように、１以上のアダプターを結合ドメインの一部に直接的または間接的に結合させることを含み、ここで、何れかの間接的な結合はリンカーを介していてもよい。例えば、図１Ｅを参照のこと。
【0064】
一側面において、製造方法は、２以上の異なるタイプの切断可能なアダプターを基質に直接的または間接的に結合させること、および１以上の捕捉分子を基質に直接的または間接的に結合させること、および捕捉分子の捕捉配列に相補的な核酸が捕捉分子とハイブリダイズするように、捕捉分子の捕捉配列に相補的な核酸に結合した１以上の結合ドメインを提供することを含み、ここで、何れかの間接的結合はリンカーを介していてもよい。例えば、図１Ｆを参照のこと。
【0065】
一側面では、製造方法は、２つのモザイクエンド（ＭＥ）含有アダプター分子を担持したトランスポザーゼ二量体を含むトランスポソームを形成すること、トランスポソームを基質に直接的または間接的に結合させること、１以上の第２の認識エレメントを基質に直接的または間接的に結合させること、１以上の結合ドメインを第２の認識エレメントに直接的または間接的に結合させることを含み、ここで、何れかの間接的結合はリンカーを介していてもよい。例えば、図１Ｇを参照のこと。一側面では、製造方法は、２つのモザイクエンド（ＭＥ）含有アダプター分子を担持したトランスポザーゼ二量体を含むトランスポソームを形成すること、トランスポソームを基質に直接的または間接的に結合させること、および１以上の結合ドメインを基質に直接的または間接的に結合させることを含み、ここで、何れかの間接的な結合はリンカーを介していてもよい。
【0066】
一側面では、製造方法は、第２の認識エレメントを基質に直接的または間接的に結合させること、Ｔｎ５をプロテインＡに融合してＴｎ５－プロテインＡ融合タンパク質を形成すること、融合タンパク質の二量体を形成すること、Ｔｎ５－プロテインＡ融合タンパク質の二量体にＭＥアダプターを負荷すること、結合ドメインを第２の認識エレメントに結合させること、融合タンパク質のプロテインＡを結合ドメイン（例えば、抗体のＦｃ領域）に結合させること、を含み、ここで、何れかの間接的な結合はリンカーを介していてもよい。例えば、図１Ｈを参照のこと。一側面において、製造方法は、第２の認識エレメントを基質に直接的または間接的に結合させること、Ｔｎ５をプロテインＡに融合してＴｎ５－プロテインＡ融合タンパク質を形成すること、融合タンパク質の二量体を形成すること、Ｔｎ５－プロテインＡ融合タンパク質の二量体にＭＥアダプターを負荷すること、結合ドメインを基質に直接的または間接的に結合させること、融合タンパク質のプロテインＡを結合ドメイン（例えば、抗体のＦｃ領域）に結合させること、を含み、ここで、何れかの間接的な結合はリンカーを介して行われる。
【0067】
いくつかの態様では、組成物は、第２の認識エレメント、基質、結合ドメインおよびアダプターを含み、アダプターは図１Ｂに示されるように第２の認識エレメントに結合している。いくつかの態様では、組成物は、第２の認識エレメント、基質、結合ドメインおよびアダプターを含み、アダプターは図１Ｃに示されるように第２の認識エレメントに結合している。いくつかの態様では、組成物は、基質に直接結合された第２の認識エレメントを含む（図１Ｃ）。いくつかの態様では、組成物は、例えばリンカーを介して、基質に間接的に結合した第２の認識エレメントを含む（図１Ｂ）。いくつかの態様では、組成物は、基質に直接結合された第２の認識エレメント、および第２の認識エレメントに直接結合されたアダプターを含む。いくつかの態様では、組成物は、リンカーを介して基質に結合された第２の認識エレメント、および基質に直接結合されたアダプターを含む。いくつかの態様では、組成物は、第１のリンカーを介して基質に結合された第２の認識エレメント、および第２のリンカーを介して基質に結合されたアダプターを含む。
【0068】
いくつかの態様において、組成物は、
ｉ）基質、
ｉｉ）基質に結合された第２の認識エレメント、
ｉｉｉ）第２の認識エレメントに結合するアダプター、および
ｉｖ）結合ドメイン
を含む。ある側面において、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、結合ドメインは第２の認識エレメントによって固定化され、そしてアダプターは、結合ドメインによって特異的に結合された非カノニカルな特徴に特異的な核酸バーコード配列を含む。
ｉ）基質、
ｉｉ）基質に結合された第２の認識エレメント、
ｉｉｉ）第２の認識エレメントに結合するアダプター、および
ｉｖ）結合ドメイン
を含む。ある側面において、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、結合ドメインは第２の認識エレメントによって固定化され、そしてアダプターは、結合ドメインによって特異的に結合された非カノニカルな特徴に特異的な核酸バーコード配列を含む。
【0069】
いくつかの態様では、第２の認識エレメントは単一の結合ドメインに結合できる。いくつかの態様では、第２の認識エレメントは、複数種の異なるタイプの結合ドメインに結合できる。ある側面において、第２の認識エレメントは、ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン、または類似の分子である。ある側面では、第２の認識エレメントはプロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬ、その変異体、または抗体である。
【0070】
いくつかの態様において、組成物は、
ｉ）基質、
ｉｉ）基質に結合された第２の認識エレメント、
ｉｉｉ）第２の認識エレメントに結合するアダプター、および
ｉｖ）結合ドメイン
を含む。ある側面において、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合するように構成され、結合ドメインは第２の認識エレメントによって固定化され、アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。ある側面では、組成物は、基質に直接的にまたはリンカーを介して結合したアダプターを代替的またはさらに含む。
ｉ）基質、
ｉｉ）基質に結合された第２の認識エレメント、
ｉｉｉ）第２の認識エレメントに結合するアダプター、および
ｉｖ）結合ドメイン
を含む。ある側面において、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合するように構成され、結合ドメインは第２の認識エレメントによって固定化され、アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。ある側面では、組成物は、基質に直接的にまたはリンカーを介して結合したアダプターを代替的またはさらに含む。
【0071】
いくつかの態様において、組成物は複数の第２の認識エレメントを含み、複数の第２の認識エレメントは互いに異なる第２の認識エレメントを含み、ここで、アダプターは複数の第２の認識エレメントの１つに結合され、かつ結合ドメインは異なる第２の認識エレメントに結合されている。
【0072】
いくつかの態様において、組成物は複数の第２の認識エレメントを含み、ここで、アダプターは複数の第２の認識エレメントの１つに結合され、かつ結合ドメインは同じ第２の認識エレメントの別の部分（instance）に結合される。
【0073】
いくつかの態様において、組成物は、
ｉ）基質、
ｉｉ）基質に結合された第２の認識エレメント、
ｉｉｉ）第２の認識エレメントを介して基質に結合する結合ドメイン、
ｉｖ）リンカーを介して基質に結合するアダプター、
を含む。いくつかの態様では、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合するように構成され、アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
ｉ）基質、
ｉｉ）基質に結合された第２の認識エレメント、
ｉｉｉ）第２の認識エレメントを介して基質に結合する結合ドメイン、
ｉｖ）リンカーを介して基質に結合するアダプター、
を含む。いくつかの態様では、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合するように構成され、アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
【0074】
いくつかの態様において、組成物は、
ｉ）基質、
ｉｉ）基質に結合された第２の認識エレメント、
ｉｉｉ）リンカーを介して基質に結合する結合ドメイン、
ｉｖ）第２の認識エレメントを介して基質に結合するアダプター、
を含む。いくつかの態様では、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合するように構成され、アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
ｉ）基質、
ｉｉ）基質に結合された第２の認識エレメント、
ｉｉｉ）リンカーを介して基質に結合する結合ドメイン、
ｉｖ）第２の認識エレメントを介して基質に結合するアダプター、
を含む。いくつかの態様では、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合するように構成され、アダプターは非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
【0075】
いくつかの態様では、組成物は、基質、捕捉分子、アダプター、および結合ドメインを含む。いくつかの態様において、組成物は、図１Ｆに示す基質、捕捉分子、アダプター、および結合ドメインを含む。いくつかの態様では、結合ドメインは捕捉分子によって固定化される。
【0076】
いくつかの態様において、組成物は、
ｉ）基質、
ｉｉ）基質に結合した捕捉分子、
ｉｉｉ）基質に結合されたアダプター、および
ｉｖ）捕捉分子を介して基質に固定化された結合ドメイン
を含む。
ｉ）基質、
ｉｉ）基質に結合した捕捉分子、
ｉｉｉ）基質に結合されたアダプター、および
ｉｖ）捕捉分子を介して基質に固定化された結合ドメイン
を含む。
【0077】
いくつかの態様では、捕捉分子は、図１Ｆに示すような捕捉分子である。いくつかの態様では、捕捉分子は基質に直接結合される。いくつかの態様では、捕捉分子はリンカーを介して基質に結合する。いくつかの態様では、捕捉分子はオリゴヌクレオチドであり、例えば、それに結合した相補的オリゴヌクレオチド配列に結合することによって結合ドメインを捕捉できるオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様では、捕捉分子はポリエチレングリコールであり、ＤＢＣＯ、アジド、アルキン、ｍＴＥＴまたはＴＣＯなどのペンダントクリック化学基を有する。
【0078】
いくつかの態様では、捕捉分子は共有結合または非共有結合機序によって結合ドメインの捕捉をもたらし得る。例えば、共有結合捕捉は、生体直交化学（biorthogonal chemistry）（ＤＢＣＯ／アジド、アルキン／アジド、ｍＴｅｔ／ＴＣＯなど）を用いることで達成できる。非共有結合捕捉は、結合ドメイン上の特定の結合部位を標的とするタンパク質ベースの捕捉分子によって達成される。
【0079】
いくつかの態様において、組成物は、
ｉ）基質、
ｉｉ）基質に結合した捕捉分子、
ｉｉｉ）基質に結合されたアダプター、および
ｉｖ）結合ドメイン
を含み、ここで、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、結合ドメインは捕捉分子によって固定化され、かつアダプターは、結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
ｉ）基質、
ｉｉ）基質に結合した捕捉分子、
ｉｉｉ）基質に結合されたアダプター、および
ｉｖ）結合ドメイン
を含み、ここで、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、結合ドメインは捕捉分子によって固定化され、かつアダプターは、結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
【0080】
ある側面において、本発明は、以下を含む組成物を含む：
ｉ）基質、
ｉｉ）第１のリンカーまたは第２の認識エレメントを介して基質に結合する結合ドメイン、
ｉｉｉ）第２のリンカーまたは第２の認識エレメントを介して基質に結合するモザイク末端（ＭＥ）アダプター、および
ｉｖ）トランスポザーゼ、
ここで、前記トランスポザーゼは固定化ＭＥアダプターに負荷され、前記結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、かつ前記ＭＥアダプターの少なくとも１つは、非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
ｉ）基質、
ｉｉ）第１のリンカーまたは第２の認識エレメントを介して基質に結合する結合ドメイン、
ｉｉｉ）第２のリンカーまたは第２の認識エレメントを介して基質に結合するモザイク末端（ＭＥ）アダプター、および
ｉｖ）トランスポザーゼ、
ここで、前記トランスポザーゼは固定化ＭＥアダプターに負荷され、前記結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、かつ前記ＭＥアダプターの少なくとも１つは、非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
【0081】
ある側面において、本発明は、以下を含む組成物を含む：
ｉ）基質、
ｉｉ）リンカーまたは第２の認識エレメントを介して基質に結合する結合ドメイン、および
ｉｉｉ）結合ドメインと結合したトランスポザーゼ、
ここで、前記トランスポザーゼはＭＥアダプターに負荷され、前記結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、かつ前記ＭＥアダプターの少なくとも１つは、非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
ｉ）基質、
ｉｉ）リンカーまたは第２の認識エレメントを介して基質に結合する結合ドメイン、および
ｉｉｉ）結合ドメインと結合したトランスポザーゼ、
ここで、前記トランスポザーゼはＭＥアダプターに負荷され、前記結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、かつ前記ＭＥアダプターの少なくとも１つは、非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
【0082】
いくつかの態様において、組成物は、基質、第１のリンカーを介して基質に結合されるか、または基質に直接的または間接的に結合される第２の認識エレメントに結合される結合ドメイン、第２のリンカーを介して基質に結合されるモザイク末端（ＭＥ）アダプター、およびトランスポザーゼを含み、ここで、トランスポザーゼはＭＥアダプターに負荷され、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、かつアダプターは結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。例えば、図１Ｇを参照のこと。いくつかの態様では、トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである。図１Ｈは、Ｔｎ５－プロテインＡ融合タンパク質の二量体をＭＥアダプターで負荷し、プロテインＡと抗体のＦｃ領域との親和性結合を介して抗体に結合したものを示す。いくつかの態様において、組成物は、基質、基質に結合された複数の第２の認識エレメント、複数の第２の認識エレメントの１つに結合されたアダプター、および複数の第２の認識エレメントの別の１つに結合された結合ドメインを含み、ここで、結合ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合し、かつアダプターは、結合ドメインによって特異的に結合された非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。例えば、図１Ｄを参照のこと。ある側面において、組成物は、例えば図１５Ｃに示すように、基質としてビーズを含む。本明細書に記載の組成物の側面のいずれかによれば、組成物は、結合ドメインに対して１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、または１５倍過剰のアダプターを含み得る。このような比率は、副生成物を最小限に抑えながら、効率的なバーコーディング収量を提供する。
【0083】
また、本明細書には、本発明の１以上の結合ドメインを含む組成物も提供される。いくつかの態様では、組成物は２以上の異なる結合ドメインを含む。例えば、組成物は、第１の非カノニカルな特徴に結合する第１の結合ドメイン、および第２の非カノニカルな特徴に結合する第２の結合ドメインを含み得る。いくつかの態様において、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７１、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００以上の異なるタイプの結合ドメインを含む。
【0084】
また、本明細書には、１以上の結合ドメインおよび１以上のアダプターを含む組成物が提供され、各アダプターは、各結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に特異的な核酸バーコード配列を含む。例えば、２つの結合ドメインおよび２つのアダプターを含む組成物では、第１のアダプターは、第１の結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含み、第２のアダプターは、第２の結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
【0085】
いくつかの態様において、本発明の組成物は、１以上の基質を含む。いくつかの態様では、組成物は２つの基質を含む。いくつかの態様では、組成物は１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上の基質を含む。
【0086】
本明細書に記載の組成物は、いくつかの態様において、塩基編集酵素をさらに含み得る。いくつかの態様では、塩基編集酵素はアデノシンデアミナーゼ、シトシンデアミナーゼ、グリコシラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、またはジオキシゲナーゼである。いくつかの態様では、塩基編集酵素は塩基を除去する酵素、例えばグリコシラーゼである。塩基編集酵素は、例えば結合ドメインに結合させることができる。結合ドメインに結合した塩基編集酵素を有することで、酵素は結合ドメインに結合した標的核酸に近接する。その後、塩基編集酵素は標的核酸を編集できる。核酸が増幅され、配列決定された後、編集された塩基の位置が決定され、結合ドメインが標的核酸に結合した位置（すなわち、標的核酸上の非カノニカルな特徴の位置）を測定するために使用され得る。
【0087】
いくつかの態様では、塩基編集酵素は結合ドメインに共有結合している。例えば、塩基編集酵素を結合ドメインに融合させることができる（すなわち、融合タンパク質として）。ある態様では、塩基編集酵素は、塩基編集酵素と結合ドメインの両方に融合したリンカーを介して結合ドメインに共有結合していてもよい。いくつかの態様では、塩基編集酵素は標的部分を介して結合ドメインに結合される。標的部分は、例えば、ペプチドタグ、タンパク質タグ、二次抗体、核酸配列、または生体直交型反応基（bioorthogonal reactive group）から選択できる。一つの例示的な態様では、塩基編集酵素を二次抗体に結合させることができ、二次抗体は結合ドメイン（例えば、一次抗体）を認識する。いくつかの態様において、標的部分は、プロテインＡ、プロテインＬ、またはプロテインＧである。いくつかの態様において、標的部分は、塩基編集酵素に結合した核酸であり、塩基編集酵素に結合した核酸は、結合ドメインに結合した核酸と相補的である。
【0088】
いくつかの態様において、本明細書に記載の組成物は、１以上の担体、賦形剤、緩衝剤などを含む。組成物は、約０．５、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、約１０．０、約１０．５、約１１．０、約１１．５、約１２．０、約１２．５、約１３．０、約１３．５、または約１４．０のｐＨを有し得る。いくつかの態様では、組成物は医薬組成物である。
【0089】
アダプター
本明細書で用いる用語“アダプター”とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の末端に結合でき、何らかの機能を付与する何れかの短い核酸配列を意味する。例えば、いくつかの態様では、アダプターはＤＮＡまたはＲＮＡ分子の配列決定および／または同定を容易にできる。ある態様では、アダプターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはＤＮＡおよびＲＮＡの混合配列である。いくつかの例では、核酸アダプターは、骨格修飾、例えばロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ホスホロチオエート、２’－フルオロリボース、２’－メトキシリボースホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、グアニジノプロピルホスホロアミデート、トリアゾール、グアニジニウム、モルホリノ、スレオース核酸（ＴＮＡ）またはヘキシトール核酸（ＨＮＡ）から選択される１以上の骨格修飾を含む。
本明細書で用いる用語“アダプター”とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の末端に結合でき、何らかの機能を付与する何れかの短い核酸配列を意味する。例えば、いくつかの態様では、アダプターはＤＮＡまたはＲＮＡ分子の配列決定および／または同定を容易にできる。ある態様では、アダプターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはＤＮＡおよびＲＮＡの混合配列である。いくつかの例では、核酸アダプターは、骨格修飾、例えばロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ホスホロチオエート、２’－フルオロリボース、２’－メトキシリボースホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、グアニジノプロピルホスホロアミデート、トリアゾール、グアニジニウム、モルホリノ、スレオース核酸（ＴＮＡ）またはヘキシトール核酸（ＨＮＡ）から選択される１以上の骨格修飾を含む。
【0090】
ある態様では、アダプターは５’リン酸を含む。いくつかの態様では、アダプターは３’リン酸を含む。ある態様では、アダプターは５’リン酸および３’リン酸を含む。いくつかの態様では、アダプターは一本鎖である。いくつかの態様では、アダプターは二本鎖である。いくつかの態様では、二本鎖アダプターは、相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズした一本鎖アダプターを含み得る。
【0091】
いくつかの態様では、アダプターは切断可能である。例えば、アダプターは１以上の切断部位を含んでいてもよい。開裂部位は、例えば、１個以上のウラシル塩基、酵素（例えば、制限酵素または他のヌクレアーゼ）によって認識される配列、または合成化学部分を含み得る。いくつかの態様では、図１Ｆに示すように、アダプターは切断可能である。いくつかの態様では、リンカーは、例えばジスルフィド、カテプシンＢ切断部位、光切断などを用いた化学的または酵素的切断によって切断される。ある態様では、アダプターはアダプター内の部位で切断される。例えば、制限部位で（二本鎖形成が必要）、ウラシル／ＵＳＥＲ酵素を用いて、８－ｏｘｏＧ／ＦＰＧ酵素を用いて、あるいは光切断可能なリン酸骨格修飾を介してなどである。
【0092】
いくつかの態様では、アダプターはユニバーサルフォワードプライマー（ＵＦＰ）を含む。いくつかの態様において、アダプターはユニバーサルリバースプライマー（ＵＲＰ）を含む。いくつかの態様では、アダプターはＵＦＰおよびＵＲＰを含む。いくつかの態様では、アダプターはＵＦＰまたはＵＲＰを含む。ＵＦＰ配列およびＵＲＰ配列は、天然には存在しないＤＮＡ配列であり、標的核酸（またはそのコピー）に導入された配列のみを選択的に増幅できる。配列決定中、ＵＦＰおよび／またはＵＲＰはＤＮＡ標的にアニールされ、新しいＤＮＡ分子（すなわち、そのコピー）の伸長のための開始部位を提供する。例示的なＵＦＰおよびＵＲＰのリストは、lslabs.com/resources/universal-primer-listのワールドワイドウェブアドレスで見ることができる。いくつかの態様において、アダプターに用いられる（そして標的核酸にトランスファーされる）ユニバーサルプライマー配列は、確立されたＤＮＡ配列決定プラットフォームと互換性があり、下流のＰＣＲ反応においてIllumina Ｐ５およびＰ７のような表面アダプターを導入するために用いられ得る。
【0093】
いくつかの態様では、アダプターは、修飾コード化バーコード（ＭＢＣ）などのバーコードを含んでいてもよい。ＭＢＣは短いユニークな核酸配列である。各ＭＢＣは、特定のエピジェネティック修飾またはエピトランススクリプトーム修飾に関連して用いられ、その同定および／または解析に役立つ。例えば、ＭＢＣは、特定の非カノニカルな特徴に特異的な結合ドメインに結合したアダプターに用いられ得る。いくつかの態様では、アダプターはバーコードで構成され得る。いくつかの態様では、アダプターはＭＢＣで構成され得る。
【0094】
いくつかの態様では、アダプターは固有の分子バーコード（ＵＭＩ）を含み得る。ＵＭＩは、４ [UMIの長さ] 個のユニークな変異体を有する短いランダム配列で構成されている。例えば、１０塩基長のＵＭＩは１，０４８，５７６（４１０）のユニークな分子をコードできる。ＵＭＩは、ＰＣＲ増幅バイアスおよびエラーを補正するために、配列決定リードの絶対的定量に用いられる。例えば、ＲＮＡサンプルは１００コピーの転写産物Ａおよび１００コピーの転写産物Ｂを含み得る。転写産物Ｂの方がより効率的に増幅するため、ＰＣＲ増幅後、１Ｍコピーの転写産物Ａおよび２Ｍコピーの転写産物Ｂが検出され得る。転写産物Ａに対してＵＭＩを使用するとき、１００ＵＭＩ変異体の１０，０００コピーが検出され、転写産物Ｂに対しては１００ ＵＭＩ変異体の２０，０００コピーが検出される。リード数を数える代わりにＵＭＩ変異体の数を数えることで、分子の絶対数がわかる。
【0095】
いくつかの態様では、アダプターは１以上の非天然核酸塩基を含む。いくつかの態様において、１以上の非天然核酸塩基は、Ｇクランプ（９－（２－アミノエトキシ）－３Ｈ－ベンゾ［ｂ］ピリミド［４，５－ｅ］［１，４］オキサジン－２（１０Ｈ）－オン）、ｔＣ（３Ｈ－ベンゾ［ｂ］ピリミド［４，５－ｅ］［１，４］オキサジン－２（１０Ｈ）－オン）、ｔＣＯ（３Ｈ－ベンゾ［ｂ］ピリミド［４，５－ｅ］［１，４］オキサジン－２（１０Ｈ）－オン）、イノシン、スーパーＴ（５－ヒドロキシブチニル－２’－デオキシウリジン）、スーパーＧ（８－アザ－７－デアザグアノシン）、ウラシル、または８－オキソ－Ｇから独立して選択される、
【0096】
いくつかの態様では、アダプターはその３’末端に２以上のランダム塩基、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上、あるいは２－１２、または３－８、または４－６のランダム塩基を含む。ある側面において、本発明は、そのようなランダム塩基を用いてバーコードを導入するためにＲＮＡをランダムプライミングする方法を含む。この方法では、バーコーディング工程の前に、標的核酸にスペーサー配列をライゲーションする必要がない。
【0097】
ある側面では、アダプターは３’または５’ブロッキング基を含む。ある側面において、３’または５’ブロッキング基は、ジデオキシリボース、リン酸、逆塩基またはリンカーから独立して選択される。
【0098】
図１２Ａ－１２Ｄは、例示的な核酸アダプターの構造を示しており、凡例はそこで使用されている各要素の説明を提供する。これらのアダプターには、参照を容易にするため、タイプＡ、タイプＢ、タイプＣおよびタイプＤのラベルが付けられている。
【0099】
図１２Ａに示すアダプター（タイプＡ）は、ＵＦＰ配列またはＵＲＰ配列のいずれかを含み得る最小限のアダプターを表す。タイプＡアダプターは、非カノニカルな核酸機能の同定または分析に使用できる配列を含まず、代わりにライブラリー構築に用いられる。いくつかの態様では、タイプＡアダプターは非カノニカルな特徴を含まない核酸分子に結合される。いくつかの態様では、タイプＡアダプターは、標的核酸の他端にバーコード化アダプターを導入した後、非カノニカルな特徴を含む核酸分子に結合される。例えば、タイプＡアダプターは、１以上のバーコードが付加された後、ＰＣＲ増幅のために核酸をキャップし、調製するために使用できる。
【0100】
図１２Ｂ－１２Ｄに示したアダプターはそれぞれ、非カノニカルなＤＮＡ／ＲＮＡの１つの特徴（例えば、修飾塩基）に特異的なＭＢＣを含む。図１２Ｂに示すように、タイプＢアダプターは、ｃＤＮＡの環化を伴うライブラリー調製ワークフローに使用できる。これらは切断部位（ＣＬＳ）を含む。タイプＢアダプターの切断はＰＣＲ増幅前に行ってもよい。図１２Ｃに示すように、タイプＣアダプターはＣＬＳを欠き、ユニバーサルプライマー領域を１つだけ含んでいる。タイプＣアダプターは、例えばライゲーション反応によるバーコード導入に使用できる。これらは、Ｓｍａｒｔ－Ｓｅｑ技術によるテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドまたは他のアダプターライゲーションなどの第二鎖合成法と組み合わせてもよい。図１２Ｄに示すように、タイプＤアダプターはプライマー伸長によるエンコード用に特別に設計されている。タイプＤアダプターは、３’末端スペーサー（ＳＰ）を１つ、あるいは両端に２つのスペーサー領域（例えばＳＰ１、ＳＰ２）を有する。反応は、短いスペーサー領域（ＳＰ）を標的核酸の３’末端にライゲーションし、相補的スペーサーを有するタイプＤアダプターを結合させることによって開始される。スペーサーは、すべての核酸結合分子およびサイクルにわたって普遍的であってもよく、核酸結合分子の各タイプに固有であってもよく、またはバーコード化の各サイクルに固有であってもよい。いくつかの態様では、アダプターは、１つ、２つ、３つ、または４つのスペーサーを含む。いくつかの態様では、アダプターは１つのスペーサーを含む。いくつかの態様では、アダプターは２つのスペーサーを含む。いくつかの態様において、スペーサーは、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長または２０ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、スペーサーは６ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、スペーサーは７ヌクレオチド長である。いくつかの態様では、スペーサーは８ヌクレオチド長である。タイプＤアダプターは、例えば、プライマー伸長反応による１回のバーコード転写、または複数の連続したバーコード転写に使用できる。複数サイクルのバーコーディングは、各サイクルにおいて１つだけ、または非カノニカルな特徴のサブセットだけを調べるために使用できる。例えば、第１のコード化サイクルでは、ｍ５Ｃに特異的な核酸結合分子を用いることができる。第２のコード化サイクルでは、ｍ６Ａに特異的な核酸結合分子を用いることができる。第３のコード化サイクルは、イノシンなどに特異的な核酸結合分子を用いることができる。別の態様では、第１サイクルはｍ５Ｃおよびｍ６Ａを調べ、第２サイクルはイノシンを調べることができる。別の態様では、第１のエンコード化サイクルはすべての非カノニカルな特徴を試用し、第２のエンコード化サイクルはすべての非カノニカルな特徴を２回目に試用し得る。
【0101】
いくつかの態様では、アダプターはＵＦＰ、ＵＲＰ、またはＵＦＰおよびＵＲＰを含む。いくつかの態様では、アダプターはＵＦＰおよび／またはＵＲＰを含み、さらにＭＢＣも含む。いくつかの態様では、アダプターは、ＵＦＰおよび／またはＵＲＰ、ＭＢＣ、およびＵＭＩを含む。いくつかの態様では、アダプターは、ＵＦＰおよび／またはＵＲＰ、ＭＢＣ、ＵＭＩおよびＣＬＳを含む。いくつかの態様では、アダプターは、ＵＦＰおよび／またはＵＲＰ、ＭＢＣ、ＵＭＩ、ＣＬＳ、およびＳＰを含む。いくつかの態様では、アダプターは、ＵＦＰ、ＣＬＳ、ＵＲＰ、ＵＭＩ、およびＭＢＣを含む。いくつかの態様では、アダプターは、ＵＦＰ、ＵＭＩ、およびＭＢＣを含む。いくつかの態様では、アダプターは、ＵＲＰ、ＵＭＩ、およびＭＢＣを含む。いくつかの態様では、アダプターは、第１のＳＰ、ＭＢＣ、ＵＭＩ、および第２のＳＰを含む。
【0102】
本明細書に記載のアダプターは、いくつかの態様では、結合ドメインとアダプターの連結を補助するリンカーなど、１以上のリンカーを含んでいてもよい。リンカーとしては、ポリエチレングリコール、炭化水素、ペプチド、ＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。リンカーの長さは様々である。ＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴が核酸配列の５’末端または３’末端から離れた場所にある場合には、より長いリンカーを使用できる。より短いリンカーは、ＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴が核酸配列の５’末端または３’末端に比較的近い位置にある場合に使用される。
【0103】
いくつかの態様では、アダプター、またはその中に含まれるリンカー配列は切断可能である。例えば、アダプターは１以上の切断部位を含んでいてもよい。アダプターは化学的、光化学的、酵素的に切断可能であってもよい。開裂部位は、例えば、１個または数個のウラシル塩基、酵素（例えば、制限酵素または他のヌクレアーゼ）によって認識される配列、または合成化学部分、例えば、ジスルフィド、炭酸エステル、ヒドラゾン、シス－アコニチル、または（β－グルクロニド）を含み得る。
【0104】
以下にさらに詳しく述べるように、アダプターは、バーコード転移反応を用いて、一本鎖または二本鎖の標的核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に融合させることができる。
【0105】
いくつかの態様において、プライマー伸長によるバーコード化は、ＲＮＡ標的に３’ポリ－ｒＡテールを付加することを含む。３’ポリ－ｒＡテールは、何れかの公知のポリ（Ａ）ポリメラーゼ（例えば、大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼ）を用いたポリアデニル化によって付加される。いくつかの態様では、ＲＮＡ標的はポリ（Ａ）ポリメラーゼおよび競合ポリｄＴオリゴヌクレオチドと共にインキュベートされる。ポリ（Ａ）ポリメラーゼと競合するポリｄＴオリゴヌクレオチドとの共処理は、付加された３’ポリ－ｒＡテールの長さを制御する。通常、ポリアデニル化によって、平均３’ポリ－ｒＡテール長は約１５０塩基となる。いくつかの態様において、３’ポリ－ｒＡテールの長さは、約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、または約６０塩基長である。
【0106】
いくつかの態様では、プライマー伸長は、３’ポリ－ＵテールをＲＮＡ標的に付加することを含む。３’ポリ－Ｕテールは、公知のポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（例えば、分裂酵母；Schizosaccharomyces pombe Ｃｉｄ１）を用いてポリウリジル化によって付加される。いくつかの態様では、３’ポリＵテールの長さは、約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、または約６０塩基長である。
【0107】
いくつかの態様では、アダプターは、表４に提供されている配列番号１－５のいずれか１つを含む。いくつかの態様では、アダプターは配列番号１を含む。いくつかの態様では、アダプターは配列番号２を含む。いくつかの態様では、アダプターは配列番号３を含む。いくつかの態様では、アダプターは配列番号４を含む。いくつかの態様では、アダプターは配列番号５を含む。いくつかの態様において、表４に示すアダプター、またはそれに対して１個、２個、３個、４個または５個のアミノ酸置換を有する配列を含む。
【0108】
いくつかの態様では、本明細書に記載のアダプターは、５’－アミン部分（５ＡｍＭＣ６）を含む。いくつかの態様では、アダプターは３’アミノ部分（３ＡｍＭＯ）を含む。いくつかの態様では、アダプターは１８原子のヘキサエチレングリコールスペーサー（ｉＳｐ１８）を含む。いくつかの態様では、アダプターは、ＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）の切断によって基質表面から遊離するためのフィラーＡＴリピートに囲まれた１個のウラシルを含む。いくつかの態様では、アダプターは８塩基バーコードを含む。
【0109】
いくつかの態様において、本明細書に記載のアダプターは、ＴＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステルで基質に官能基化される。いくつかの態様では、アダプターはプロテインＧ、ＡまたはＬを用いて基質に固定化される。
【0110】
【表1-1】
【表1-2】
【表1-3】
【表1-4】
【0111】
結合ドメイン
本明細書で用いる用語“結合ドメイン”とは、修飾ヌクレオシドのような標的核酸の非カノニカルな特徴に結合する核酸、ポリペプチドなどを意味する。用語“結合ドメイン”は、当業者には文脈から理解され得るように、本明細書中、“結合剤”、“認識エレメント”、“抗体”などの用語と互換的に用いられ得る。いくつかの態様では、結合ドメインは標的核酸の非カノニカルな特徴に結合する。いくつかの態様では、結合ドメインは、非カノニカルな特徴に隣接する何れかの核酸特徴にも結合しない。いくつかの態様において、結合ドメインは、（ｉ）標的核酸の非カノニカルな特徴、および（ｉｉ）非カノニカルな特徴に隣接する１以上の核酸特徴（例えば、核酸塩基、糖、リン酸、またはそれらの組み合わせ）の両方に結合する。いくつかの態様では、結合ドメインは保存配列モチーフに結合し得る。例えば、ｍ６Ａはしばしば以下のモチーフに生じる：ＧＧ（ｍ６Ａ）ＣＴ。したがって、結合ドメインがｍ６Ａに結合するとき、それに隣接する１以上の核酸（例えば、ＧＧまたはＣＴ）にも結合し得る。別の例として、結合ドメインはｔＲＮＡのアンチコドンループの全部または一部に結合できる。
本明細書で用いる用語“結合ドメイン”とは、修飾ヌクレオシドのような標的核酸の非カノニカルな特徴に結合する核酸、ポリペプチドなどを意味する。用語“結合ドメイン”は、当業者には文脈から理解され得るように、本明細書中、“結合剤”、“認識エレメント”、“抗体”などの用語と互換的に用いられ得る。いくつかの態様では、結合ドメインは標的核酸の非カノニカルな特徴に結合する。いくつかの態様では、結合ドメインは、非カノニカルな特徴に隣接する何れかの核酸特徴にも結合しない。いくつかの態様において、結合ドメインは、（ｉ）標的核酸の非カノニカルな特徴、および（ｉｉ）非カノニカルな特徴に隣接する１以上の核酸特徴（例えば、核酸塩基、糖、リン酸、またはそれらの組み合わせ）の両方に結合する。いくつかの態様では、結合ドメインは保存配列モチーフに結合し得る。例えば、ｍ６Ａはしばしば以下のモチーフに生じる：ＧＧ（ｍ６Ａ）ＣＴ。したがって、結合ドメインがｍ６Ａに結合するとき、それに隣接する１以上の核酸（例えば、ＧＧまたはＣＴ）にも結合し得る。別の例として、結合ドメインはｔＲＮＡのアンチコドンループの全部または一部に結合できる。
【0112】
本明細書に記載の核酸結合分子は、１以上の結合ドメインを含み、結合ドメインはＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に特異的に結合する。本明細書に記載される結合ドメインは、標的核酸の非カノニカルな特徴を認識して結合できるタンパク質、核酸、またはそのフラグメントもしくは誘導体である。例えば、いくつかの態様において、結合ドメインは、抗体、アプタマー、リーダータンパク質、ライタータンパク質、イレイサータンパク質、エンドヌクレアーゼＶ、人工高分子スキャフォールド、人工タンパク質スキャフォールド、または選択的共有結合キャプチャー試薬、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体を含む。いくつかの態様において、結合ドメインは、ライタータンパク質またはイレイサータンパク質の触媒的に不活性な変異体を含む。ある側面において、リーダータンパク質は、ＮＵＤＴ１６、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＣ２、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である。ある側面において、ライタータンパク質は、ＤＮＭＴタンパク質、ＮＡＴ１０タンパク質、ＭＥＴＴＬタンパク質、ＴＲＭタンパク質、ＢＭＴタンパク質、ＤＵＳタンパク質、ＰＵＳタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質もしくはＮＳＵＮタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である。ある側面において、ライタータンパク質はＤＮＴＭ１、ＤＮＴＭ３Ａ／Ｂ、ＮＡＴ１０、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ８、ＭＥＴＴＬ１４、ＭＥＴＴＬ１６、ＴＲＭ、ＢＭＴ、ＤＵＳ２、ＰＵＳ、もしくはＮＳＵＮ２、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である。ある局面では、イレイサータンパク質は、ＦＴＯタンパク質、ＡＬＫＢＨタンパク質、ＴＥＴタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である。ある局面では、イレイサータンパク質は、ＦＴＯ、ＡＬＫＢＨ３、もしくはＡＬＫＢＨ５、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＩｇＧ抗体、抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、または重鎖もしくは軽鎖単一ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を含む。いくつかの態様において、結合ドメインは、重鎖抗体（ｈｃＡｂ）またはｈｃＡｂのＶＨＨドメイン（ナノボディ）を含む。いくつかの態様において、結合ドメインは、アデクチン、アフィボディ、アフィリン、アンチカリン、アトリマー、アビマー、二環式ペプチド、センチリン、シスノット、ダーピン、フィノマー、クニッツドメイン、オボディまたはプロネクチンなどの人工タンパク質スキャフォールドを含む。
【0113】
ＩｇＧ抗体は免疫グロブリンの主なアイソタイプである。ＩｇＧは２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖を含み、共有結合でジスルフィド結合を介して安定化されている。ＩｇＧは、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変Ｎ末端ドメインおよび６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を介して抗原を認識する。いくつかの修飾ＤＮＡおよびＲＮＡ塩基に結合する抗体は市販されている。例えば、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシチジン（ｈｍ５Ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）に特異的な抗体をActive Motif社およびSigma社など数社が販売している。ユーロジェンテック社（ベルギー）はｍ５Ｃに結合するモノクローナル抗体を販売している。イノシンに結合するモノクローナル抗体は、例えばDiagenode社から購入できる。Megabase Research Products社（米国）は、ｍ５Ｃ ６－メチルアデノシンおよび７－メチルグアノシンに結合するウサギのポリクローナル血清を販売している。Abcam社（米国）は、ＲＮＡ修飾ｍ６Ａ、ａｃ４Ｃ、ｍ１Ａ、ｍ２，２Ｇ、ｍ４Ｃ、ｍ２Ａ、ｍ６，６Ａおよびｍ８Ａに対する組換え抗体を販売している。修飾塩基に結合する抗体は、当業者に公知の方法に従って開発できる。いくつかの態様では、抗体はモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそれらの機能的フラグメントもしくは変異体である。本明細書で用いる用語“抗体”とは、必要な特異性を有する結合ドメインを有するあらゆる特異的結合物質を対象とする。したがって、この用語は、天然か合成か、モノクローナルかポリクローナルかを問わず、免疫グロブリン結合ドメインを含むあらゆるポリペプチドを含む、抗体フラグメント、誘導体、機能的等価物、抗体のホモログをカバーする。免疫グロブリン結合ドメイン、またはそれと同等のものと他のポリペプチドとの融合体からなるキメラ分子も含まれる。
【0114】
いくつかの態様では、結合ドメインはナノボディを含んでいてもよい。ナノボディは、ラクダ類およびいくつかの軟骨魚類が産生するように、重鎖抗体の単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）を含む。ＶＨＨドメインは、ＩｇＧ抗体のＣＤＲに比べて拡大された３つのＣＤＲを含み、ＩｇＧと同程度の大きさ（すなわち、約８００Å２）の抗原相互作用表面を提供する。ナノボディは、ＩｇＧ抗体と同様の親和性で抗原と結合するが、それに対していくつかの利点がある：小さい（１５ｋＤａ）、ジスルフィド結合が少ないため還元環境に弱い、より可溶性である、翻訳後グリコシル化がない。ナノボディは細菌発現系で生産できるため、ファージおよびその他のディスプレイ技術によって親和性および特異性を成熟させることができる。その他の利点としては、熱安定性および溶解性の向上、部位特異的標識への容易なアプローチが挙げられる。ナノボディはサイズが小さいため、凸状のパラトープを形成でき、アクセスしにくい抗原との結合に適している。ナノボディを産生するための例示的な方法には、それぞれの動物（例えば、ラクダ）を目的の抗原で免疫すること、既存のナイーブライブラリーをさらに進化させること、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【0115】
いくつかの態様では、結合ドメインは、リーダータンパク質、ライタータンパク質、またはイレイサータンパク質を含む。“リーダータンパク質”とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ上の特定の化学修飾を選択的に認識して結合するタンパク質である。“ライタータンパク質”とは、ＤＮＡまたはＲＮＡに特定の化学修飾を加えるタンパク質である。“イレイサータンパク質”とは、ＤＮＡまたはＲＮＡから特定の化学修飾を取り除く酵素である。いくつかの態様では、結合ドメインは、リーダータンパク質、ライタータンパク質、またはイレイサータンパク質のフラグメントまたは誘導体を含む。いくつかの態様では、結合ドメインは、核酸結合を保持するが酵素活性を欠くように操作された形態などの、リーダー、ライター、またはイレイサータンパク質の操作された形態を含む。いくつかの態様では、結合ドメインは、ライターまたはイレイサータンパク質の触媒的に不活性な変異体を含む。本明細書に記載の結合ドメインに用いられ得る、例示的なリーダータンパク質、ライタータンパク質、イレイサータンパク質を表１および表２に示す。その他のリーダータンパク質、ライタータンパク質、イレイサータンパク質は、以下のワールド・ワイド・ウェブ・アドレスに掲載されている:rnawre.bio2db.com。
【0116】
【表2】
【0117】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
凡例：Ｗ：ライター、Ｅ：イレイサー、Ｒ：リーダー、ＴＳ：腫瘍抑制因子、Ｏｎｃ：癌遺伝子。
RNA修飾：ｍ１Ａ：１－メチルアデノシン、ｍｓ２ｉ６Ａ：２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン，ｉ６Ａ：Ｎ６－イソペンテニルアデノシン，ｍ６Ａ：Ｎ６－メチルアデノシン，ｍ３Ｃ：３－メチルシトシン、ｍ５Ｃ：５－メチルシトシン、ａｃ４Ｃ：Ｎ４－アセチルシトシン、ｍ７Ｇｐｐ（ｐＮ）：７－メチルグアノシンキャップ、ｍ７Ｇ：７－メチルグアノシン内部、ｍ２，２Ｇ：Ｎ２，Ｎ２，－ジメチルグアノシン、ｍ２Ｇ：Ｎ２－メチルグアノシン、Ｑ：ケウオシン（queuosine）、ｙＷ ｅｔ ａｌ：ウィブトシンおよび誘導体、ｍ５Ｕ：５－メチルウリジン、ｎｃｍ５Ｕ：５－カルバモイル－メチルウリジン、ｍｃｍ５Ｕ：５－メトキシカルボニル－メチルウリジン、ｍｃｍ５ｓ２Ｕ：５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、Ｄ．ジヒドロウリジン、Ψ：シュードウリジン、Ｎｍ：２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、ｍ（ｐＮ）：５’リン酸モノメチル化、Ａ－ｔｏ－Ｉ：アデノシンの脱アミノ化、Ｃ－ｔｏ－Ｕ：シトシンの脱アミノ化。ＲＮＡ修飾酵素：ＡＤＡＲ１－３：アデノシンデアミナーゼ ＲＮＡ特異的1-3、ＡＬＫＢＨ１／３／５／８：ＡｌｋＢホモログ１／３／５／８，ＡＰＯＢＥＣ１／３Ｇ：アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ 編集触媒サブユニット１／３Ｇ，ＢＣＤＩＮ３Ｄ：ＢＣＤＩＮ３ドメイン含有ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ，ＢＵＤ２３：ＲＲＮＡメチルトランスフェラーゼおよびリボソーム成熟因子，ＣＤＫ５ＲＡＰ１：ＣＤＫ５調節サブユニット関連タンパク質１，ＣＭＴＲ１／２：キャップメチルトランスフェラーゼ１／２，ＣＴＵ１／２：細胞質チオウリジラーゼサブユニット１／２，ＤＫＣ１：ディスケリンシュードウリジンシンターゼ１，ＤＮＭＴ２：ｔＲＮＡ アスパラギン酸メチルトランスフェラーゼ１，ＤＵＳ２：ジヒドロウリジンシンターゼ２，ＥＬＰ３：エロンゲーターアセチルトランスフェラーゼ複合体サブユニット３，ＦＴＯ：ＦＴＯα－ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼ、ＨＥＮＭＴ１：ＨＥＮメチルトランスフェラーゼ１、ＭＥＴＴＬ１／２／３／６／８／１４／１６：メチルトランスフェラーゼ様－１／２／３／６／８／１６、ＮＡＴ１０：Ｎ－アセチルトランスフェラーゼ１０、ＮＳＵＮ１－５：ＮＯＰ２／Ｓｕｎ ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ１－５，ＮＵＤＴ１６：Ｎｕｄｉｘヒドロラーゼ１６，ＲＮＭＴ：ＲＮＡグアノシン－７メチルトランスフェラーゼ，ＴＧＴ：クエウイン（Queuine）ＴＲＮＡ－リボシルトランスフェラーゼ触媒サブユニット１，ＴＲＩＴ１：ｔＲＮＡイソペンテニル転移酵素１、ＴＲＭＴ１／２Ａ／２Ｂ１／５／６／１０Ｃ／１１／６１Ａ／６１Ｂ／１１２：ｔＲＮＡメチルトランスフェラーゼサブユニット、ＴＹＷ２：ｔＲＮＡ－ＹＷ合成タンパク質２ホモログ。
【0118】
いくつかの態様では、結合ドメインはリーダータンパク質を含む。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＮＵＤＴ１６、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＣ２、ＹＴＨＤＦ１またはＹＴＨＤＦ２から選択されるリーダータンパク質を含む。ＮＵＤＴはＵ８ ｓｎｏＲＮＡデキャッピング酵素である（例えば、Uniprotアクセッション番号Q96DE0を参照)。ＹＴＨＤＣ１は、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）含有ＲＮＡを特異的に認識して結合するオルタナティブスプライシングの調節因子である（例えば、Uniprot アクセッション番号Q96MU7を参照）。ＹＴＨＤＣ２は３’－５’ＲＮＡヘリカーゼである（例えば、Uniprotアクセッション番号Q9H6S0を参照)。ＹＴＨＤＦ１はＮ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含むｍＲＮＡを特異的に認識して結合し、その安定性を制御している（例えば、Uniprot アクセッション番号Q9BYJ9を参照）。ＹＴＨＤＦ２はＮ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含むｍＲＮＡを特異的に認識して結合し、その安定性を制御している（例えば、Uniprot アクセッション番号Q9Y5A9を参照）。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＮＵＤＴ１６、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＣ２、ＹＴＨＤＦ１またはＹＴＨＤＦ２のフラグメントまたは誘導体を含む。
【0119】
いくつかの態様では、結合ドメインはライタータンパク質を含む。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＤＮＴＭ１、ＤＮＴＭ３ Ａ／Ｂ、ＮＡＴ１０、ＭＥＴＴＬ３、ＭＥＴＴＬ８、ＭＥＴＴＬ１５、ＴＲＭ、ＢＭＴ、ＤＵＳ２、ＰＵＳ、およびＮＳＵＮ２から選択されるライタータンパク質を含む。ＤＮＭＴ１およびＤＮＴＭ３Ａ／ＢはＤＮＡ（シトシン－５）メチルトランスフェラーゼである。ＮＡＴ１０はＲＮＡシチジンアセチルトランスフェラーゼである（例えば、Uniprotアクセッション番号Q9H0A0を参照)。ＭＥＴＴＬ３は、Ｎ６－アデノシン－メチルトラスフェラーゼ触媒サブユニットである（例えば、Uniprotアクセッション番号Q86U44を参照）。ＮＳＵＮ２はＲＮＡシトシンＣ（５）－メチルトランスフェラーゼである（例えば、Uniprotアクセッション番号Q08J23を参照）。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＮＡＴ１０、ＭＥＴＴＬ３、またはＮＳＵＮ２のフラグメントまたは誘導体であるライタータンパク質を含む。ある側面において、ライタータンパク質は、ＤＮＭＴタンパク質、ＮＡＴ１０タンパク質、ＭＥＴＴＬタンパク質、ＴＲＭタンパク質、ＢＭＴタンパク質、ＤＵＳタンパク質、ＰＵＳタンパク質、ＡＤＡＲタンパク質もしくはＮＳＵＮタンパク質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体である。
【0120】
いくつかの態様では、結合ドメインはイレイサータンパク質を含む。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＦＴＯ、ＡＬＫＢＨ３、およびＡＬＫＢＨ５から選択される操作されたイレイサータンパク質を含む。ＦＴＯはα－ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼである（例えば、Uniprotアクセッション番号Q9C0B1を参照）。ＡＬＫＢＨ３は、α－ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼａｌｋＢホモログ３である（例えば、Uniprotアクセッション番号Q96Q83を参照）。ＡＬＫＢＨ５はＲＮＡ脱メチル化酵素である(例えば、Uniprotアクセッション番号Q6P6C2を参照)。いくつかの態様において、結合ドメインは、ＦＴＯ、ＡＬＫＢＨ３、またはＡＬＫＢＨ５のフラグメントまたは誘導体であるライタータンパク質を含む。
【0121】
結合ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡの非カノニカルな特徴に結合するように選択および／または操作され得る。例えば、非カノニカルな特徴は、修飾された塩基、修飾された骨格、または構造的要素である。いくつかの態様では、結合ドメインは２以上の非カノニカルな特徴に結合し得る。
【0122】
いくつかの態様では、結合ドメインは修飾塩基および／またはヌクレオシドに結合する。いくつかの態様において、結合ドメインは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの修飾ヌクレオシドと接触する。いくつかの態様において、結合ドメインは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドと接触する。いくつかの態様において、結合ドメインは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドおよびそれに隣接する１以上のヌクレオチドと接触する。ヒトおよび他の生物で生じ得る例示的な修飾ヌクレオシドを表３Ａに示す。ヒトにおいて発現することが知られている修飾ヌクレオシドを表３Ｂに示す。その他の修飾塩基およびヌクレオシドは、genesilico.pl/modomics/modificationsのワールドワイドウェブアドレスに掲載されている。
【0123】
【表4】
*当業者には理解されるであろうが、一般的にはＲＮＡ中に存在する修飾塩基／ヌクレオシドがＤＮＡ中に存在することがあり、一般的にはＤＮＡ中に存在する修飾塩基／ヌクレオシドがＲＮＡ中に存在することもある。
【0124】
【表5-1】
【表5-2】
【0125】
いくつかの態様において、結合ドメインは、以下の修飾ヌクレオシドの１以上に結合する：３－メチルシチジン（ｍ３Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン（Ｉ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）－キャップ、ジヒドロウリジン（Ｄ）、３－メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、１－メチルグアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチルグアノシン（ｍ２Ｇ）、５－メチルデオキシシチジン（ｍ５ｄＣ）、Ｎ４－メチルデオキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン（５－ｈｍＣ）、５－ヒドロキシメチルデオキシシチジン（５ｈｍｄＣ）、５－カルボキシデオキシシチジン（５ｃａｄＣ）、５－カルボキシシトジン（５ｃａＣ）、５－ホルミルシチジン（５ｆＣ）、５－ホルミルデオキシシチジン（５ｆｄＣ）、６－メチルデオキシアデノシン、Ｎ７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２，７，２’－メチルグアノシン、リボースメチル化（Ｎｍ）、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン（ｍ２
２Ｇ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－メトキシカルボニルメチルウリジン（ｎｃｍ５ｍＵ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、ケウオシン（Ｑ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、５－タウリノメチルウリジン（τｍ５Ｕ）、５－タウリノメチル－２－チオウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（Ｉ６Ａ）、２－メチルチオ－Ｎ６－トレオニルカルバモイルアデノシン（ｍｓ２ｔ６Ａ）。
【0126】
いくつかの態様において、非カノニカルな特徴は以下である：３－メチルシチジン（ｍ３Ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５Ｃ）、Ｎ４－アセチルシチジン（ａｃ４Ｃ）、シュードウリジン（Ψ）、１－メチルアデノシン（ｍ１Ａ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、イノシン（Ｉ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）－キャップ、ジヒドロウリジン（Ｄ）、３－メチルウリジン（ｍ３Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、１－メチルグアノシン（ｍ１Ｇ）、Ｎ２－メチルグアノシン（ｍ２Ｇ）、５－メチルデオキシシチジン（ｍ５ｄＣ）、Ｎ４－メチルデオキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン（５－ｈｍＣ）、５－ヒドロキシメチルデオキシシチジン（５ｈｍｄＣ）、５－カルボキシデオキシシチジン（５ｃａｄＣ）、５－カルボキシシトジン（５ｃａＣ）、５－ホルミルシチジン（５ｆＣ）、５－ホルミルデオキシシチジン（５ｆｄＣ）、６－メチルデオキシアデノシン、Ｎ７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２，７，２ ’－メチルグアノシン、またはリボースメチル化（Ｎｍ）。
【0127】
いくつかの態様では、結合ドメインは、天然に生じる酸化的もしくは紫外線誘発性損傷、または外因性薬剤による大きな付加体形成もしくは塩基アルキル化に起因する核酸損傷に結合する。いくつかの態様において、核酸損傷は、該損傷が、８－オキソグアニン（８－ｏｘｏＧ）、１以上の脱塩基部位、シス－プラチン架橋、ベンゾ（ａ）ピレンジオールエポキシド（ＢＰＤＥ）付加物、シクロブテンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、ピリミジン－ピリミドン（６－４）光生成物（６－４ＰＰ）、６－Ｏ－メチルグアニン（Ｏ６－ＭｅｄＧ）、またはＯ６－（カルボキシメチル）－２’－デオキシグアノシン（Ｏ６－ＣＭｄＧ）である。いくつかの態様において、非カノニカルな特徴は、天然に生じる酸化的もしくは紫外線誘発性損傷、または外因性薬剤による大きな付加体形成もしくは塩基アルキル化に起因する核酸損傷である。いくつかの態様において、核酸損傷は、該損傷が、８－オキソグアニン（８－ｏｘｏＧ）、１つ以上の脱塩基部位、シス－プラチン架橋、ベンゾ（ａ）ピレンジオールエポキシド（ＢＰＤＥ）付加物、シクロブテンピリミジン二量体（ＣＰＤ）、ピリミジン－ピリミドン（６－４）光生成物（６－４ＰＰ）、６－Ｏ－メチルグアニン（Ｏ６－ＭｅｄＧ）、またはＯ６－（カルボキシメチル）－２’－デオキシグアノシン（Ｏ６－ＣＭｄＧ）である。
【0128】
いくつかの態様では、結合ドメインは構造的要素に結合する。構造的要素は、例えばヘアピンやループであってもよい。他の例示的な構造的要素としては、Ｚ－ＤＮＡ構造、Ｇ－四重鎖、Ｉ－モチーフ、バルジ、脱塩基部位、三重鎖、三方向結合、十字形構造、テトラループ、リボースジッパー、シュードノットなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、複数の組成物が提供され、各組成物は結合ドメインを含み、各結合ドメインは異なるタイプの非カノニカルな特徴に結合する。これにより、多数の非カノニカルな特徴を同時に検出できる多重化アプローチが可能になる。
【0129】
本明細書に記載の結合ドメインは、ＲＮＡと特異的に結合するか、またはＤＮＡと特異的に結合してもよい。いくつかの態様では、結合ドメインはＲＮＡおよびＤＮＡの両方に結合する。いくつかの態様では、結合ドメインは、１以上の非カノニカルな特徴を有する二本鎖核酸に特異的に結合する。いくつかの態様では、結合ドメインは、１以上の非カノニカルな特徴を有する一本鎖核酸に特異的に結合する。
【0130】
いくつかの態様では、標的核酸の非カノニカルな特徴に結合ドメインが結合することで、ＤＮＡアダプターが標的核酸の５’または３’末端に近接する。例えば、図３には結合ドメインに結合した標的核酸が示されており、アダプターは標的核酸の３’末端に近接して配置されている。図５は、第２の認識エレメントに固定化された結合ドメインを示しており、標的核酸が結合ドメインに結合することで、アダプターが標的核酸の３’末端に近接して配置される。いくつかの態様では、標的核酸は結合ドメインに結合され、アダプターを標的核酸の３’末端に近接して配置する。いくつかの態様では、標的核酸は結合ドメインに結合され、アダプターを標的核酸の５’末端に近接して配置する。
【0131】
結合ドメインは、標準的な分子生物学、タンパク質工学、および／または化学的技術を用いて作製できる。
【0132】
アダプター（例えば、リンカーを含むアダプター）は、いくつかの異なる方法を用いて基質に結合させることができる。いくつかの態様では、アダプターは、ランダムなタグ付けによって第２の認識エレメントまたは中間体タンパク質に共有結合できる（例えば、図１Ｂおよび図１Ｅを参照）。例えば、アダプター上のＮＨＳで活性化された残基は、第２の認識エレメントまたは中間体タンパク質の表面に露出したタンパク質リジン残基の１以上のアミン基と反応し得る。同様に、マレイミドで活性化されたアダプターは、第２の認識エレメントまたは中間体タンパク質の天然または人工のシステインと反応し得る。当業者には理解されるように、第２の認識エレメントまたは中間体タンパク質に連結されるアダプターの数は、それぞれ反応性リジン残基またはシステイン残基の数、および反応条件の選択によって変化し得る。いくつかの態様では、アダプターは第２の認識エレメントに非共有結合で結合できる（例えば、図１Ｃおよび図１Ｄ参照）。例えば、５’－ビオチン化アダプターは、基質アンカー化ストレプトアビジン、アビジン、ニュートラビジン、またはそれらの変異体に結合させ得る。
【0133】
部位選択的カップリング法もまた、アダプターを第２の認識エレメントにカップリングさせるために用いることができる（例えば、図１Ｂおよび図１Ｅ参照）。部位選択的方法は、Ｔｎ５トランスポザーゼを結合ドメインに結合させるため（例えば、図１Ｈ参照）、または核酸編集酵素を結合ドメインに結合させるため（例えば、図１０参照）にも使用できる。部位特異的カップリングは、結合ドメイン、第２の認識エレメント、中間体タンパク質の機能への影響を回避し、再現性のある材料製造を可能にする。第２の認識エレメントまたは中間体タンパク質の部位選択的な内部タグ付けは、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素／ｔＲＮＡ対を操作した細胞株を用いて、非天然アミノ酸を遺伝子的に組み込むことで達成できる。組み込まれた非天然アミノ酸は、生体直交型反応を起こし得る部位を示す。一般的に用いられるのは、銅触媒によるアジドアルキン環化付加反応（ＣｕＡＡＣ）、光活性化１，３－双極性環化付加反応、歪み促進アジドアルキン環化付加反応（ＳＰＡＡＣ）、または逆電子要求型ディールス・アルダー環化付加反応（ＩＥＤＤＡ）を起こし得る部位を有するアミノ酸である。結合ドメイン、第２の認識エレメントまたは中間体タンパク質のＣ末端またはＮ末端または内部タグ付けのための例示的で汎用性のある方法は、タンパク質タグまたはペプチドタグの使用を含む。ＳＮＡＰ－ｔａｇ、Ｈａｌｏ－ｔａｇ、Ｓｐｙ－ｔａｇ、Ｓｎｏｏｐ－ｔａｇ、Ｉｓｏｐｅｐｔａｇ、Ｄｏｇ－ｔａｇ、Ｓｄｙ－ｔａｇ、Ｃｌｉｐ－ｔａｇなどのタンパク質タグは、結合ドメイン、第２の認識エレメント、中間体タンパク質をタンパク質－タグ融合タンパク質として発現させるために、あらゆるタンパク質遺伝子にクローニングできる小さなタンパク質またはペプチドである。このようなタンパク質タグは、特定のペプチドまたは基質との共有結合形成を自己触媒し得る。例えば、スパイキャッチャーは１１３残基のタンパク質で、あらゆるＤＮＡ配列に容易に結合できる１３残基のペプチドSpyTagを認識する。いくつかの態様では、スパイキャッチャーは配列番号１２を含む。いくつかの態様において、SpyTagは配列番号１０を含む。結合ドメイン、第２の認識エレメント、中間体タンパク質の分子量によっては、より小さいペプチドタグが好ましい場合もある。ペプチドタグは通常１０－１２アミノ酸長で、酵素を介したカップリング反応で作用する。第２の認識エレメントまたは中間体タンパク質をアダプターに結合させるための酵素を介した反応の例としては、（ａ）ＡＰ－ペプチド標識結合ドメインおよびビオチン－ＤＮＡを結合させるためのビオチンリガーゼの使用（例えば、ビオチンリンカー）、（ｂ）ＬＡＰ－ペプチド標識第２の認識エレメントおよびリポ酸－ＤＮＡを連結するためのリポ酸リガーゼの使用（例えば、リポ酸－リンカー）、（ｃ）Ｔｕｂ－ｔａｇ標識第２の認識エレメントおよびチロシン修飾ＤＮＡを連結するためのチューブリンチロシンリガーゼの使用（例えば、チロシン修飾リンカー）、（ｄ）ＬＰｘＴＧペプチドおよびグリシン修飾ＤＮＡと反応するＳｏｒｔａｓｅ－Ａの使用（例えば、グリシン修飾リンカー）などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、Ｔｎ５トランスポザーゼ－プロテインＡ融合タンパク質を生成し、ＲＮＡ修飾特異的抗体のＦｃ領域に結合させることができる（例えば、図１Ｈ参照）。いくつかの態様では、アデノシンデアミナーゼであるＡＤＡＲ酵素は、プロテインＬと遺伝子融合し、ＲＮＡ修飾特異的抗体のＦｃ領域に結合させることができる（例えば、図１０参照）。いくつかの態様では、ＳｐｙＴａｇは結合ドメインに遺伝子操作され得て、SpyCatcherは核酸編集酵素またはＴｎ５トランスポザーゼに遺伝子操作され得る。ＳｐｙＴａｇ修飾結合ドメインとSpyCatcher修飾核酸編集酵素を混合すると、非カノニカルな特徴の位置をマーキングするために用いられるような、結合ドメインおよび核酸編集酵素を含む共有結合体が生成され得る。ＳｐｙＴａｇ修飾結合ドメインとＴｎ５トランスポザーゼを混合すると、結合ドメインおよびＴｎ５トランスポザーゼを含む共有結合体が生成される。さらに、一群の金属イオン認識タグおよび低分子結合モチーフを用いることもできる。ペプチドタグ付けのもう一つの方法は、内因性の細胞機構をリダイレクトして、組換えタンパク質にアルデヒドを導入することである。この方法は、保存された１３残基のコンセンサス配列内でシステインをホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に共翻訳的に変換するホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を利用する。得られたアルデヒドタグは、ＤＮＡに結合する反応性アミンで容易に修飾できる。
【0134】
いくつかの態様では、アダプターは生体直交型化学反応を介して第２の認識エレメントまたは中間体タンパク質に結合される。いくつかの態様では、第２の認識エレメントまたは中間タンパク質は、バーコードの結合を促進するＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、アミノ、アジド、ビオチン、アルキンで修飾されたものが容易に市販されている。アルキンおよびアジドオリゴは、銅触媒を用いたアジド－アルキン環化付加反応、またはストレインプロモートを用いたアジド－アルキン環化付加反応において、非天然アミノ酸と結合させることができる。アミノオリゴヌクレオチドはホルミルグリシンと反応し、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によって１３アミノ酸（ａａ）の保存配列内の結合ドメインに導入される。
【0135】
本明細書に記載の結合ドメインが標的核酸に結合すると、複合体が形成される。いくつかの態様では、複合体の結合ドメインは標的核酸に共有結合していてもよい。例えば、結合ドメインは標的核酸に化学的および／または光化学的に結合させることができる。
【0136】
第２の認識エレメント
第２の認識エレメントとは、本明細書に記載の結合ドメインを基質表面につなぎとめるために用いられる抗体、タンパク質、またはペプチドである。いくつかの態様では、本明細書に記載の第２の認識エレメントはリンカーに結合され、リンカーは基質に結合される。いくつかの態様では、第２の認識エレメントは抗体結合ドメインに結合する。いくつかの態様では、第２の認識エレメントは、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＡ、プロテインＡＧ、プロテインＡＬ、プロテインＬＧ、または抗体である。いくつかの態様では、抗体は種特異的抗体である。いくつかの態様では、種特異的抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、または非ヒト霊長動物から選択されるが、これらに限定されない。
第２の認識エレメントとは、本明細書に記載の結合ドメインを基質表面につなぎとめるために用いられる抗体、タンパク質、またはペプチドである。いくつかの態様では、本明細書に記載の第２の認識エレメントはリンカーに結合され、リンカーは基質に結合される。いくつかの態様では、第２の認識エレメントは抗体結合ドメインに結合する。いくつかの態様では、第２の認識エレメントは、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＡ、プロテインＡＧ、プロテインＡＬ、プロテインＬＧ、または抗体である。いくつかの態様では、抗体は種特異的抗体である。いくつかの態様では、種特異的抗体は、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、または非ヒト霊長動物から選択されるが、これらに限定されない。
【0137】
いくつかの態様では、アダプターが第２の認識エレメントに結合されている。例えば、いくつかの態様では、第２の認識エレメントは抗体であり、アダプターは抗体のＦｃ領域に結合している。アダプターは、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＮＨＳエステル）を用いてタンパク質のリジンに結合させ得る。アダプターは、マレイミド基またはヨードアセチル基を用いてタンパク質のシステインに結合させ得る。アダプターは抗体または他の糖鎖タンパク質の糖鎖基と反応させ得る。いくつかの態様では、１つのアダプターが第２の認識エレメントに結合されている。いくつかの態様では、２つのアダプターが第２の認識エレメントに結合されている。いくつかの態様では、複数のアダプターが第２の認識エレメントに結合されている。
【0138】
いくつかの態様では、第２の認識エレメントはタンパク質である。いくつかの態様では、第２の認識エレメントはペプチドタグである。ペプチドタグの例としては、Ｆｌａｇ、Ａｖｉ、ＨＡ、Ｈｉｓ、ＭｙｃおよびＳｔｒｅｐ－ｔａｇなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、第２の認識エレメントは共有結合ペプチドタグである。ペプチドタグの例としては、Ｓｐｙタグ、ＳｎｏｏｐタグまたはＤｏｇタグなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、第２の認識エレメントはタンパク質タグである。タンパク質タグの例としては、ＭＢＤ、ＣＬＩＰおよびＨａｌｏなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【0139】
いくつかの態様では、第２の認識エレメントはアビジンタンパク質、例えばストレプトアビジン、ニュートラビジンまたは関連変異体である。例えば、基質をストレプトアビジンでコートし、ビオチン標識アダプターおよびビオチン化プロテインＧで共機能化でき、ここで、プロテインＧはさらに抗体結合ドメインに結合される。
【0140】
アダプター／バーコード転移反応
本明細書に記載の核酸結合分子は、バーコードを含むアダプターのような、アダプターを標的核酸にトランスファーさせるために使用できる。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載の結合ドメインは、標的核酸にバーコードをトランスファーするために使用され得る。バーコードは、ＭＢＣ、すなわち、結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな機能に固有のバーコードであってもよい。アダプターが導入された標的核酸は、本明細書では“標識標的核酸”、“標識標的”または同様の用語で称される。バーコードが転写された標的核酸は、本明細書では“バーコード化標的核酸”、“バーコード化標的”または同様の用語で称される。アダプターが標的核酸に転移される反応を、本明細書では“アダプター転移反応”と呼ぶ。同様に、バーコードが標的核酸にトランスファーされる反応を、本明細書では“バーコード転移反応”と呼ぶ。
本明細書に記載の核酸結合分子は、バーコードを含むアダプターのような、アダプターを標的核酸にトランスファーさせるために使用できる。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載の結合ドメインは、標的核酸にバーコードをトランスファーするために使用され得る。バーコードは、ＭＢＣ、すなわち、結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな機能に固有のバーコードであってもよい。アダプターが導入された標的核酸は、本明細書では“標識標的核酸”、“標識標的”または同様の用語で称される。バーコードが転写された標的核酸は、本明細書では“バーコード化標的核酸”、“バーコード化標的”または同様の用語で称される。アダプターが標的核酸に転移される反応を、本明細書では“アダプター転移反応”と呼ぶ。同様に、バーコードが標的核酸にトランスファーされる反応を、本明細書では“バーコード転移反応”と呼ぶ。
【0141】
アダプター／バーコードトランスファーの目的は、アダプター／バーコードを標的核酸分子、あるいは標的核酸分子のコピーに共有結合させることである。例えば、いくつかの態様では、バーコードは標的核酸の５’末端または３’末端に化学的または酵素的にライゲーションされる。いくつかの態様では、バーコード化は、バーコードを導入するためのテンプレートとしてアダプターを用いて、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によって核酸の３’末端を伸長することによって達成される。いくつかの態様では、標的核酸の３’末端およびアダプターの３’末端はそれぞれ、逆転写酵素によってハイブリダイズされて、同時に伸長される。いくつかの態様では、３’末端に縮重塩基を有するアダプターは、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的をランダムにプライミングし、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によって伸長される。標識／バーコード化された核酸分子は、いくつかの態様では、下流の工程で配列決定され得る。いくつかの態様では、標識標的核酸のコピーを配列決定できる。図２Ａ－２Ｇはアダプター／バーコード転移反応の例を示す。
【0142】
アダプター転移に用いられる酵素はＤＮＡおよびＲＮＡの標的核酸で異なり、アダプターの構造によって変わる。標的ＤＮＡへのアダプター／バーコードの導入は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、サークリガーゼ、Klenowフラグメント、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼまたはＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼなどの１以上の酵素を用いて行うことができる。アダプター／バーコードの標的ＲＮＡへの転移は、例えばＴ４ ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２またはＲｔｃＢリガーゼなどを用いて行うことができる。逆転写酵素を用いて、バーコードのコピーとｃＤＮＡの合成を同時に行うこともできる。この反応は、Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、またはグループＩＩイントロンコード逆転写酵素、例えばInduro（商標）逆転写酵素（ＮＥＢ）によって触媒される。Superscript II RT(Thermo Fisher)、Superscript IV RT(Thermo Fisher)、およびMaxima H Minus RT(Thermo Fisher)などの市販のＭ－ＭＬＶ変異体の中には、テンプレートスイッチング反応を触媒できるものがあり、それらはバーコード転写後に第２のアダプターを導入するために用いられ得る（例えば、図５および図６参照）。
【0143】
例えば、図５は、一本鎖ＤＮＡアダプター（例えば、バーコードを含むか、またはバーコードからなるアダプター）と一本鎖標的核酸とのライゲーションを示す。標的核酸がＲＮＡであるいくつかの態様では、アダプターは５’リン酸を含み、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１によって触媒される。あるいは、アダプターを５’－プレアデニル化し、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ２によってトランスファーさせ、ＡＴＰの必要性をなくし、反応を１回のターンオーバーに制限することもできる。あるいは、リン酸化されていないアダプターを用いてもよく、ＲｔｃＢリガーゼを用いて３’－リン酸化ＲＮＡにトランスファーさせてもよい。標的核酸がＤＮＡであるいくつかの態様では、アダプター／バーコードはサークリガーゼによって触媒される反応でトランスファーされ得る。
【0144】
図６は逆転写酵素によるバーコード化を示す。普遍的なスペーサー配列（ＳＰ）をライゲーションすることで、標的ＲＮＡのアダプターへのハイブリダイゼーションが可能になる一方、結合ドメインはＲＮＡ修飾を捕捉する。ハイブリダイゼーションは、図２Ｇに示した構成で起こる。逆転写酵素がＲＮＡの３’末端を伸長し、修飾バーコードをコピーする。同時に、酵素はアダプターの３’末端を伸長し、ｃＤＮＡを生成する。テンプレートスイッチングオリゴを反応に含めることで、例えばイルミナシーケンスアダプターのような、選択したユニバーサル領域が導入される。
【0145】
スプリント（splint）ライゲーションは、アダプター／バーコードを標的核酸に導入するためにも使用できる。スプリントライゲーションでは、架橋するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いて２つの核酸を結合させ、それらは１以上の酵素によって結合される。例えば、２つのＲＮＡ（例えば、標的ＲＮＡおよびアダプター／バーコード）のスプリントライゲーションは、Ｔ４リガーゼ１と、ＲＮＡに相補的な架橋ＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。例えば、図２Ｂに示すスプリント核酸構築物は、スプリントライゲーションを用いて作成できる。SplintRリガーゼは、ＲＮＡの３’末端を５’－ｐＤＮＡに連結するために用いられ、ＤＮＡまたはＲＮＡ相補体にアニールされる。標的分子がＤＮＡのとき、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌ＤＮＡリガーゼなどの酵素を用いて、スプリントＤＮＡライゲーションを行うことができる。
【0146】
スプリント伸長は、アダプター／バーコードの標的核酸へのトランスファーに使用できる別の方法である。“スプリント”とは、ライゲーションジャンクションに亘る配列のことである。プライマーが用いられるとき、プライマーは一般的に、ライゲーションジャンクションをまたがない。スプリントは、未知の配列の標的核酸との結合を促進するために、ランダム塩基または普遍的合成塩基を示し得る。図２Ｃは、３’塩基のオーバーハングを有する二本鎖アダプターを用いて、標的核酸分子の配列のコピーが作られる、スプリント伸長によるアダプター転移を示す。３’塩基オーバーハングには、ランダム塩基や、無作為（promiscuously）に塩基対を形成する合成ユニバーサル塩基が含まれ得る。標的核酸分子がＲＮＡのとき、この反応はトリ骨髄芽球症ウイルス（Avian Myeloblastosis Virus (AMV)）リバーストランスクリプターゼおよびモロニ－マウス白血病ウイルス（M-MuLV、MMLV）のような逆転写酵素により触媒される。標的分子がＤＮＡであるとき、プライマーは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有するか有しないかに関わらず、何れかの適切なＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る。
【0147】
いくつかの態様では、アダプター／バーコードを標的核酸にトランスファーするために、テンプレート伸長を用い得る。図２Ｇは、標的ＲＮＡへのアダプターのハイブリダイゼーションによって開始される、プライマー伸長による直接アダプタートランスファーを示す。逆転写酵素を用いて、アダプターおよび標的核酸を伸長し、その結果標的ＲＮＡおよびそのｃＤＮＡコピーにバーコードを導入できる（“双方向伸長”）。アダプターは、上流で標的核酸にライゲーションできる短いスペーサー配列（ＳＰ）を介してハイブリダイズしてもよく（図２Ｇ）、またはアダプター配列の一部である縮重塩基を介してランダムにハイブリダイズしてもよい（図２Ｈ）。３’末端のどちらか一方をブロックすることで、プライマーの伸長が一方向性か双方向性かを制御する。図２Ｄに示すような一方向伸長は、２つのスペーサー配列を有するアダプターを用いたマルチサイクルコード化プロセスの一部として、あるいはシングルサイクルとして実行できる。ＤＮＡアダプター／バーコードの場合、標的核酸の伸長はＤＮＡポリメラーゼ、例えばクレノウ（Klenow）フラグメント、Ｔ７、Ｔ４、ＢｓｔまたはＢｓｕ ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される。いくつかの態様では、生成されたバーコード化核酸は、最終工程として下流の増幅のためにユニバーサルプライマーでキャップされる。
【0148】
さらに、二本鎖ライゲーションも、アダプター／バーコードを標的核酸にトランスファーさせるために用い得る。例えば、図２Ｅは、アダプター／バーコードトランスファーのための二本鎖ライゲーションを示す。いくつかの態様では、標的核酸分子は二本鎖ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドであってもよく、平滑末端または粘着末端のいずれかを有していてもよい。二本鎖ＤＮＡの平滑末端および粘着末端のライゲーションは、Ｔ４、Ｔ３、Ｔ７または大腸菌リガーゼによって触媒される。
【0149】
いくつかの態様では、アダプター／バーコードを標的核酸に導入するために、化学的ライゲーションが用いられ得る。
【0150】
いくつかの態様では、標的核酸は、Ｔｎ５トランスポザーゼ（図９および図１３）を用いた酵素的転位によってバーコード化できる。Ｔｎ５とランスポザーゼは、一工程のカット＆ライゲーション機序を用いて、モザイク末端（ＭＥ）アダプターを二本鎖核酸標的に挿入する。適切な標的は、ゲノムＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖である。ＭＥアダプターは、１９ｂｐのＭＥ配列、ＭＢＣ、ＵＭＩ、およびＵＦＰまたはＵＲＰなどのユニバーサル配列を含み得る。転移反応の生成物の例を図１３に示す。トランスポザーゼはホモダイマーを形成し、各トランスポザーゼモノマーは１つのＭＥアダプターを負荷する。標的核酸を切断し、切断部位で遊離した両末端をバーコード化するには、２つのＭＥアダプターを包含するトランスポザーゼ二量体が必要である。
【0151】
結合ドメインによって固定化された標的核酸へのバーコードトランスファーを促進する方法
アダプター／バーコードのトランスファーは、反応に関与する分子（結合ドメイン、アダプター、第２の認識エレメント、中間体たんぱく質など）を空間的に分離することで促進され得る。具体的には、標的核酸に結合した結合ドメインがアダプターに近接し、アダプターの標的核酸へのトランスファーを可能にするように、分子（例えば、アダプターおよび結合ドメイン）、標的核酸、および／または標的核酸に結合した結合ドメインを含む複合体を配置することによって、トランスファーを促進できる。
アダプター／バーコードのトランスファーは、反応に関与する分子（結合ドメイン、アダプター、第２の認識エレメント、中間体たんぱく質など）を空間的に分離することで促進され得る。具体的には、標的核酸に結合した結合ドメインがアダプターに近接し、アダプターの標的核酸へのトランスファーを可能にするように、分子（例えば、アダプターおよび結合ドメイン）、標的核酸、および／または標的核酸に結合した結合ドメインを含む複合体を配置することによって、トランスファーを促進できる。
【0152】
いくつかの態様では、空間的配置は表面固定化によって達成できる。例えば、本明細書に記載の結合ドメインは、基質に結合させることで固定化できる（図１Ａ－１Ｈ参照）。ほとんどの基質フォーマットでは、結合ドメインは１種しかない。アダプターが結合ドメインにも結合している第２の認識エレメントに結合している、図１Ｂに示すフォーマットは、結合ドメインが単一分子間隔で構成されていれば、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、またはそれ以上のタイプの結合ドメインをさらに含んでいてもよい。それぞれの“タイプ”の結合ドメインは、異なる非カノニカルな特徴に結合し、かつ／または異なるバーコードを含む。いくつかの態様では、結合ドメインはアダプターに近接して基質上に配置され、結合ドメインに結合した標的核酸へのアダプターのトランスファーを可能にする。いくつかの態様では、結合ドメインはアダプターに近接して基質上に配置され、アダプター配列のコピーの標的核酸へのトランスファーを可能にする。ライゲーションによるバーコード化には、アダプターをトランスファーする。しかしながら、プライマー伸長によるバーコード化では、アダプターのコピーがトランスファーされる。例えば、結合ドメインおよびアダプターの距離は２００ｎｍ以下、１９０ｎｍ以下、１８０ｎｍ以下、１７０ｎｍ以下、１６０ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１４０ｎｍ以下、１３０ｎｍ以下、１２０ｎｍ以下、１１０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下、９０ｎｍ以下、８０ｎｍ以下、７０ｎｍ以下、６０ｎｍ以下、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、１０ｎｍ以下、または５ｎｍ以下である。
【0153】
結合ドメイン、アダプター、第２の認識エレメント、および／または中間タンパク質が結合され得る例示的な基質には、例えば、ビーズ、チップ、プレート、スライド、ディッシュ、または３次元マトリックスが含まれる。いくつかの態様では、基質は樹脂、膜、繊維、またはポリマーである。いくつかの態様では、基質は、セファロース、アガロース、セルロース、ポリスチレン、ポリメタクリレート、および／またはポリアクリルアミドを含むビーズなどのビーズである。いくつかの態様では、基質は磁気ビーズである。いくつかの態様では、支持体は合成ポリマーなどのポリマーである。合成ポリマーの限定されないリストには、ポリスチレン、ポリ(エチレン)グリコール、ポリイソシアノペプチドポリマー、ポリ乳酸－コ－グリコール酸、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ乳酸、ポリ（３－ヒドロキシ酪酸－コ－３－ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）、キトサンおよびセルロースなどが含まれる。
【0154】
分子（例えば、結合ドメイン、アダプター、第２の認識エレメント、および／または中間タンパク質）は、基質表面に直接結合させることができる。例えば、分子は１以上の共有結合または非共有結合によって基質に直接結合できる。基質が３Ｄマトリックスまたは他の３Ｄ構造である態様では、核酸結合分子は基質の複数の表面に結合していてもよい。
【0155】
いくつかの態様では、核酸結合分子は基質の表面に間接的に結合され得る。例えば、結合分子は捕捉分子を介して間接的に基質表面に結合させることができ、捕捉分子は基質に直接結合される。捕捉分子は、基質と核酸結合分子および／または標的核酸の両方に結合または連結できる核酸、タンパク質、糖、化学リンカーなどであってよい。いくつかの態様では、捕捉分子は結合ドメインまたはアダプター（例えば、アダプターのリンカー）に結合し、基質上に固定化される。
【0156】
いくつかの態様では、各アダプターが１つの標的核酸（すなわち、結合ドメインによって固定化された標的核酸）のみと相互作用できるように、第１のアダプターは基質表面上で第２のアダプターから分離されている。いくつかの態様では、結合ドメインおよびアダプターが基質表面に配置され、アダプターと結合ドメインに結合した標的核酸との相互作用を確実にする。いくつかの態様では、アダプターは結合ドメインから少なくとも１ｎｍ、最大でも３０ｎｍ離れている。例えば、いくつかの態様では、アダプターと結合ドメインは約１５ｎｍ離れている。
【0157】
いくつかの態様では、アダプターの複数のコピーが、約１アダプター／５ｎｍ２から約１アダプター／５０ｎｍ２、例えば１アダプター／２０ｎｍ２の密度で基質に結合される。いくつかの態様では、結合ドメインの複数のコピーが、１０００ｎｍ２あたり約１結合ドメインから１５０００ｎｍ２あたり約１結合ドメイン、例えば８０００ｎｍ２あたり１結合ドメインの密度で、基質に結合される。
【0158】
一般に、結合ドメインを基質に結合させる目的は、結合ドメインに結合した標的核酸へのアダプターおよび／またはバーコードのトランスファーを確実にすることである。図１Ａ－１Ｈは、結合ドメインおよびアダプターを基質に結合させ、固定化する方法の限定されない例を示す。これらの例を以下に詳しく説明する。
【0159】
結合ドメインの基質への結合
いくつかの態様では、結合ドメインは基質に直接的または間接的に結合している。いくつかの態様では、複数の結合ドメインが、部位特異的化学を用いて基質上に固定化され得る。例えば、いくつかの態様では、結合ドメインは、基質上に固定化できる部位を含んでいてもよい。結合ドメインの基質表面への結合は、結合ドメインの末端に自己触媒タンパク質タグ（例えば、スパイキャッチャー、ソルターゼＡ、ＳＮＡＰタグ、ＨａｌｏタグおよびＣＬＩＰタグ）を融合させることによって促進される。結合ドメイン上のこれらのタンパク質タグは、基質表面上の同族反応性部位と共有結合で反応させることができる。例えば、スパイキャッチャータンパク質を結合ドメインに人工的に組み込むことができる。スパイタグ（Spytag）はスパイタグタンパク質（１３ａａペプチド）と共有結合を形成する。スパイタグが基質表面に結合している場合、スパイキャッチャー（Spycatcher）に結合した結合ドメインおよびスパイタグの反応は、結合ドメインを基質に共有結合させる役割を果たす。同様に、結合ドメインをソルターゼＡタグと融合させ、基質表面に結合したペンタグリシンと反応させることもできる。別の例として、結合ドメインをＳＮＡＰタグと融合させ、基質表面に結合したＯ６－ベンジルグアニンと反応させることもできる。いくつかの態様では、結合ドメインはＣＬＩＰタグと融合され、基質表面に結合したＯ２－ベンジルシトシンと反応するために使用され得る。いくつかの態様では、結合ドメインはＨａｌｏタグと融合され、基質表面に存在するハロゲン化アルキルと反応するために用いられ得る。
いくつかの態様では、結合ドメインは基質に直接的または間接的に結合している。いくつかの態様では、複数の結合ドメインが、部位特異的化学を用いて基質上に固定化され得る。例えば、いくつかの態様では、結合ドメインは、基質上に固定化できる部位を含んでいてもよい。結合ドメインの基質表面への結合は、結合ドメインの末端に自己触媒タンパク質タグ（例えば、スパイキャッチャー、ソルターゼＡ、ＳＮＡＰタグ、ＨａｌｏタグおよびＣＬＩＰタグ）を融合させることによって促進される。結合ドメイン上のこれらのタンパク質タグは、基質表面上の同族反応性部位と共有結合で反応させることができる。例えば、スパイキャッチャータンパク質を結合ドメインに人工的に組み込むことができる。スパイタグ（Spytag）はスパイタグタンパク質（１３ａａペプチド）と共有結合を形成する。スパイタグが基質表面に結合している場合、スパイキャッチャー（Spycatcher）に結合した結合ドメインおよびスパイタグの反応は、結合ドメインを基質に共有結合させる役割を果たす。同様に、結合ドメインをソルターゼＡタグと融合させ、基質表面に結合したペンタグリシンと反応させることもできる。別の例として、結合ドメインをＳＮＡＰタグと融合させ、基質表面に結合したＯ６－ベンジルグアニンと反応させることもできる。いくつかの態様では、結合ドメインはＣＬＩＰタグと融合され、基質表面に結合したＯ２－ベンジルシトシンと反応するために使用され得る。いくつかの態様では、結合ドメインはＨａｌｏタグと融合され、基質表面に存在するハロゲン化アルキルと反応するために用いられ得る。
【0160】
いくつかの態様では、結合ドメインはビオチン部分を含んでいてもよい。このような結合分子は、ビオチンと結合する捕捉分子（例えば、ストレプトアビジン）によって基質表面に固定化できる。
【0161】
結合ドメインはＳｐｙｔａｇ－Ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ相互作用を介して基質に結合していてもよい。これは、標準的なＮＨＳ化学を用いて、適切な表面密度で基質をＳｐｙｔａｇペプチドで官能基化することで達成できる。Ｓｐｙｔａｇは１３ａａの短いペプチドである（ＡＨＩＶＭＶＤＡＹＫＰＴＫ；配列番号１１）。スパイキャッチャーは１３９アミノ酸のタンパク質で、ほとんどの結合ドメインに遺伝子操作できる: msyyhhhhhh dydipttenl yfqgamvdtl sglsseqgqs gdmtieedsa thikfskrde dgkelagatm elrdssgkti stwisdgqvk dfylypgkyt fvetaapdgy evataitftv neqgqvtvng katkgdahi （配列番号１０）。スパイキャッチャーで修飾された結合ドメインをスパイタグでコーティングされた表面に曝すと、スパイタグのＣ末端とスパイキャッチャーのＮ末端が自発的に反応してイソペプチド結合を形成し、結合ドメインが固定化される。
【0162】
市販のストレプトアビジンおよびプロテインＧビーズは、結合ドメインを固定化するのに有用な基質である。いくつかの態様では、ストレプトアビジンビーズは、ビオチン化アダプターとビオチン化プロテインＧの混合物で官能化される。第２工程において、プロテインＧは、親和性結合によって抗体結合ドメインにさらに結合される（図１Ｄ）。ビオチン化アダプターとプロテインＧの表面密度は、高収率で特異的なバーコードトランスファーを達成するために調整できる。いくつかの態様では、トランスポザーゼビーズは、５’ビオチン化ＭＥアダプターをストレプトアビジンビーズに結合させ、次いでＭＥアダプターにＴｎ５トランスポザーゼを負荷することによって調製できる（図１Ｇ）。いくつかの態様では、プロテインＧビーズは、タンパク質のリジンとアミノ修飾アダプターの化学的コンジュゲーションを用いて、アダプターによって官能化される。第２工程において、プロテインＧに抗体結合ドメインを結合させる（図１Ｂ）。ここで、プロテインＧとアダプターの標識化学量論は、プロテインＧが抗体に結合する能力を維持するために制御されなければならない。いくつかの態様では、トランスポザーゼビーズは、最初に抗体結合ドメインを負荷し、次いでＴｎ５トランスポアーゼ－プロテインＡ融合タンパク質を抗体に結合させることによって、プロテインＧビーズから調製できる（図１Ｈ）。
【0163】
基質
いくつかの態様において、本明細書の組成物は、１つの基質を含む。いくつかの態様において、本明細書の組成物は、２種以上の基質を含む。いくつかの態様では、組成物は複数の基質を含み、各基質は同じ材料から形成されている。いくつかの態様では、組成物は複数の基質を含み、各基質は異なる材料から形成されている。いくつかの態様では、基質はビーズ、チップ、プレート、チューブ、スライド、ディッシュ、ゲル、または３次元ポリマーマトリックスである。基質は様々な材料で形成できる。いくつかの態様では、基質は樹脂、膜、繊維、ポリマーである。いくつかの態様において、基質は、セファロース、アガロース、セルロース、ポリスチレン、ポリメタクリレート、および／またはポリアクリルアミドを含む。いくつかの態様では、基質は合成ポリマーなどのポリマーである。合成ポリマーの限定されないリストには、ポリ(エチレン)グリコール、ポリイソシアノペプチドポリマー、ポリ乳酸－コ－グリコール酸、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ乳酸、ポリ（３－ヒドロキシ酪酸－コ－３－ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）、キトサンおよびセルロースが含まれる。
いくつかの態様において、本明細書の組成物は、１つの基質を含む。いくつかの態様において、本明細書の組成物は、２種以上の基質を含む。いくつかの態様では、組成物は複数の基質を含み、各基質は同じ材料から形成されている。いくつかの態様では、組成物は複数の基質を含み、各基質は異なる材料から形成されている。いくつかの態様では、基質はビーズ、チップ、プレート、チューブ、スライド、ディッシュ、ゲル、または３次元ポリマーマトリックスである。基質は様々な材料で形成できる。いくつかの態様では、基質は樹脂、膜、繊維、ポリマーである。いくつかの態様において、基質は、セファロース、アガロース、セルロース、ポリスチレン、ポリメタクリレート、および／またはポリアクリルアミドを含む。いくつかの態様では、基質は合成ポリマーなどのポリマーである。合成ポリマーの限定されないリストには、ポリ(エチレン)グリコール、ポリイソシアノペプチドポリマー、ポリ乳酸－コ－グリコール酸、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ乳酸、ポリ（３－ヒドロキシ酪酸－コ－３－ヒドロキシバレレート）（ＰＨＢＶ）、キトサンおよびセルロースが含まれる。
【0164】
いくつかの態様では、標的核酸は結合ドメインを介して基質に間接的に結合され得る。いくつかの態様では、アダプターは結合ドメインを含む表面活性化ビーズに結合される。表面活性化ビーズは、共有結合のためにエポキシ基、トシル基、カルボン酸基、またはアミン基を提示し得る。カルボキシビーズは通常、ペプチド結合形成を促進するためにカルボジイミドと反応させる必要があり、アミンビーズは通常、二官能性ＮＨＳ－リンカーを必要とする。いくつかの態様では、ビーズの表面は非特異的結合を防ぐために不動態化（passivated）されている。不動態化(passivation)は、いくつかの態様では、同じ連結化学を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を共移植することによって達成できる。例えば、結合ドメインおよびアミノ末端ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、平均して、ほとんどの基質部位が結合ドメインを空間的に分離させる役割を果たすＰＥＧ分子によって占有されるように用いられる。ＰＥＧを過剰に使用した場合、結合ドメインは平均して互いに空間的に離れる。結合ドメインの表面密度は、結合ドメインとＰＥＧ分子の比率を変えることで、調整できる。
【0165】
いくつかの態様では、ビーズはｍＴｅｔ（テトラジン）およびカルボキシ－ＰＥＧで作られたセファロースビーズである。ｍＴｅｔ対カルボキシＰＥＧの比率を下げると、標的核酸間の架橋が減少する。いくつかの態様において、ｍＴｅｔ：カルボキシ－ＰＥＧ比は、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、１：１１００、１：１２００、１：１３００、１：１４００、１：５００または１：２０００である。いくつかの態様において、ｍＴｅｔ：カルボキシ－ＰＥＧ比は１：１０００である。
【0166】
いくつかの態様では、基質は複数の同じ結合ドメインを含む。いくつかの態様では、基質は複数の同じアダプターを含む。
【0167】
核酸分析法
本明細書に記載の組成物（例えば、結合ドメイン、アダプター、および基質を含む組成物）は、核酸を分析する種々の方法において、特に標的核酸上の非カノニカルな特徴を認識するために用い得る。従って、本発明は、トランスクリプトームおよびゲノムにわたるＲＮＡ修飾およびＤＮＡ修飾の多重プロファイリング法を含む、標的核酸上の非カノニカルな特徴を分析する方法を提供する。これらの方法では、ＲＮＡまたはＤＮＡの非カノニカルな特徴が結合ドメインによって認識される。次いで、アダプターまたはその一部（例えば、バーコード）を基質から標的核酸に（すなわち、標識／バーコード化標的核酸を生成するために）、あるいは標的核酸のコピーに転移させる。バーコードは標的核酸によって結合された特定の非カノニカルな特徴に固有であるため、この工程は認識イベントからの情報を標的核酸の核酸配列に書き込む役割を果たす。バーコード化された標的核酸は、配列決定ライブラリーに変換され、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定法で読み取られる。この工程により、バーコードの配列が明らかになり、標的核酸の非カノニカルな特徴と相関する。塩基配列決定により、標的核酸中の非カノニカルな特徴の局在を確認することもできる。本明細書に記載される高速プロファイリング法は、いくつかの、あるいはすべてのＤＮＡ／ＲＮＡ修飾を並行して同定することを可能にする。
本明細書に記載の組成物（例えば、結合ドメイン、アダプター、および基質を含む組成物）は、核酸を分析する種々の方法において、特に標的核酸上の非カノニカルな特徴を認識するために用い得る。従って、本発明は、トランスクリプトームおよびゲノムにわたるＲＮＡ修飾およびＤＮＡ修飾の多重プロファイリング法を含む、標的核酸上の非カノニカルな特徴を分析する方法を提供する。これらの方法では、ＲＮＡまたはＤＮＡの非カノニカルな特徴が結合ドメインによって認識される。次いで、アダプターまたはその一部（例えば、バーコード）を基質から標的核酸に（すなわち、標識／バーコード化標的核酸を生成するために）、あるいは標的核酸のコピーに転移させる。バーコードは標的核酸によって結合された特定の非カノニカルな特徴に固有であるため、この工程は認識イベントからの情報を標的核酸の核酸配列に書き込む役割を果たす。バーコード化された標的核酸は、配列決定ライブラリーに変換され、ＤＮＡ／ＲＮＡ配列決定法で読み取られる。この工程により、バーコードの配列が明らかになり、標的核酸の非カノニカルな特徴と相関する。塩基配列決定により、標的核酸中の非カノニカルな特徴の局在を確認することもできる。本明細書に記載される高速プロファイリング法は、いくつかの、あるいはすべてのＤＮＡ／ＲＮＡ修飾を並行して同定することを可能にする。
【0168】
本明細書に記載する方法は、以下に記載する一連の工程を含む。当業者には理解されるように、いくつかの態様では、様々な工程が省略され、および／または異なる順序で実行され得る。
【0169】
結合ドメインと標的核酸との接触
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の組成物（例えば、基質、結合ドメイン、およびアダプター）を１以上の標的核酸と接触させる工程を含む。標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせを含む。標的核酸は、例えば、生物の細胞または組織から単離できる。いくつかの態様では、標的核酸はフラグメント化されていてもよい。
いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載の組成物（例えば、基質、結合ドメイン、およびアダプター）を１以上の標的核酸と接触させる工程を含む。標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせを含む。標的核酸は、例えば、生物の細胞または組織から単離できる。いくつかの態様では、標的核酸はフラグメント化されていてもよい。
【0170】
本明細書に記載の組成物と標的核酸との接触は、溶液中で起こりうる。例えば、１以上の標的核酸を含む組成物を、基質、結合ドメイン、アダプターを含む１以上の組成物と接触させることができる。いくつかの態様では、接触は希薄溶液中で起こり、１つの結合ドメインのみが各標的核酸と相互作用できる。
【0171】
いくつかの態様では、１以上の結合ドメインが基質に結合され、１以上の標的核酸が、基質に結合する結合ドメインと接触され得る。
【0172】
標的核酸は、１種の結合ドメインのみと接触させてもよく（すなわち、１種の非カノニカルな特徴を検出するため）、またはいくつかの態様では、標的核酸は、複数の非カノニカルな特徴を検出するために、２種以上の結合ドメインと接触させてもよい。例えば、標的核酸は、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種、少なくとも２０種、少なくとも３０種、少なくとも４０種、少なくとも５０種、少なくとも６０種、少なくとも７０種、少なくとも８０種、少なくとも９０種、少なくとも１００種、少なくとも１５０種、または少なくとも２００種以上の異なるタイプの結合ドメインと接触させることができる。いくつかの態様において、標的核酸は、１～５、５～１０、１０～２５、２５～５０、５０～１００、１００～１５０、１５０～１７５、１７５～２００、またはそれ以上の異なるタイプの結合ドメインと接触させることができる。複数種の結合ドメインを用いるとき、接触は同時に行ってもよいか（すなわち、標的核酸は、異なる非カノニカルな特徴を認識する複数の結合ドメインと同時に接触させられる）、または接触は順次行ってもよい（すなわち、標的核酸を、第１の非カノニカルな特徴を認識する第１の結合ドメインと接触させ、その後、第２の非カノニカルな特徴を認識する第２の結合ドメインと接触させる)。
【0173】
バーコードトランスファー
各結合ドメインは、標的核酸の非カノニカルな特徴と特異的に結合し、結合ドメインに近接して結合したアダプターは、標的核酸の３’末端または５’末端のいずれかとアダプターとの相互作用を可能にする。その後、アダプター（例えば、バーコードを含む、またはバーコードからなるアダプター）を標的核酸にトランスファーすることができる。いくつかの態様では、アダプターは切断可能なリンカーによって基質に結合されている。いくつかの態様では、アダプターが標的核酸に結合すると、アダプターは切断部位で放出される。いくつかの態様では、転写は、バーコード化核酸のオフターゲット生成を実質的に防止する環境下で行われる。このような環境は、例えば、アダプターおよび結合ドメインが定義された密度にあり、各結合ドメインおよびその同族アダプターが、第２の結合ドメインおよびその同族アダプターとは別の定義された空間を占める（例えば、各結合ドメインおよびアダプターのペアは、第２の結合ドメインおよびアダプターのペアと相互作用できない別のビーズ、スポット、またはアレイ上にある）環境である。いくつかの態様では、トランスファーは標的核酸をコピーすることによって行われ、標的核酸の標識／バーコード化コピーを生成する。例えば、少なくともバーコードおよびユニバーサルプライマー部位を含むアダプターが標的核酸にトランスファーされた場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて標的核酸のバーコード化コピーを生成できる。
各結合ドメインは、標的核酸の非カノニカルな特徴と特異的に結合し、結合ドメインに近接して結合したアダプターは、標的核酸の３’末端または５’末端のいずれかとアダプターとの相互作用を可能にする。その後、アダプター（例えば、バーコードを含む、またはバーコードからなるアダプター）を標的核酸にトランスファーすることができる。いくつかの態様では、アダプターは切断可能なリンカーによって基質に結合されている。いくつかの態様では、アダプターが標的核酸に結合すると、アダプターは切断部位で放出される。いくつかの態様では、転写は、バーコード化核酸のオフターゲット生成を実質的に防止する環境下で行われる。このような環境は、例えば、アダプターおよび結合ドメインが定義された密度にあり、各結合ドメインおよびその同族アダプターが、第２の結合ドメインおよびその同族アダプターとは別の定義された空間を占める（例えば、各結合ドメインおよびアダプターのペアは、第２の結合ドメインおよびアダプターのペアと相互作用できない別のビーズ、スポット、またはアレイ上にある）環境である。いくつかの態様では、トランスファーは標的核酸をコピーすることによって行われ、標的核酸の標識／バーコード化コピーを生成する。例えば、少なくともバーコードおよびユニバーサルプライマー部位を含むアダプターが標的核酸にトランスファーされた場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて標的核酸のバーコード化コピーを生成できる。
【0174】
標的核酸（またはそのコピー）の修飾
いくつかの態様において、本方法は、バーコード化標的核酸（複数可）またはそのバーコード化コピー（複数可）を修飾する工程を含み得る。この修飾は、結合ドメインが非カノニカルな特徴に結合した後に起こり得て、いくつかの態様では、バーコードが標的核酸にトランスファーされた（または標的核酸のバーコード化コピーが生成された）後に起こり得る。
いくつかの態様において、本方法は、バーコード化標的核酸（複数可）またはそのバーコード化コピー（複数可）を修飾する工程を含み得る。この修飾は、結合ドメインが非カノニカルな特徴に結合した後に起こり得て、いくつかの態様では、バーコードが標的核酸にトランスファーされた（または標的核酸のバーコード化コピーが生成された）後に起こり得る。
【0175】
修飾は、非カノニカルな特徴の位置がバーコード化標的核酸またはそのバーコード化コピーの一次核酸配列に基づいて識別可能であり、したがって下流の配列決定工程で検出され得るように行われる。この目的のために、多くの異なるタイプの修飾が行われる。例えば、いくつかの態様において、修飾は、標的核酸（またはそのバーコード化コピー）のコピー中のポリメラーゼバイパスを防止し得る。
【0176】
いくつかの態様において、修飾は、部分的には、結合ドメインを化学的に修飾することによって達成される。これは、いくつかの態様では、結合ドメインが結合している間、標的核酸のコピー中に切断を誘導し得る。
【0177】
いくつかの態様において、修飾は、結合ドメイン（または結合ドメインなどのそのフラグメント）を標的核酸（またはそのバーコード化コピー）に光化学的に連結することを含む。核酸およびタンパク質を光化学的に連結する方法は当業者に知られている。例えば、光化学的結合は、結合ドメインおよび標的核酸を含む複合体を紫外線（ＵＶ）に曝すことによって誘導できる。
【0178】
いくつかの態様において、修飾は、結合ドメインが標的核酸に結合する部位またはその近傍の、例えば１～２０塩基以内を編集することを含む。例えば、シトシンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼを用いて塩基を編集できる。塩基編集分子は、第２の認識エレメントを介して結合ドメインに結合できる。いくつかの態様では、シトシンデアミナーゼはプロテインＡに遺伝的に融合し、抗体結合ドメインのＦｃ領域に結合させることができる。いくつかの態様では、シトシンデアミナーゼはSpycatcherと遺伝子融合し、Spytag標識結合ドメインに結合させることができる。アデノシンデアミナーゼはアデノシン（Ａ）をイノシン（Ｉ）に変換し、増幅酵素はシトシン（Ｃ）と塩基対を形成してチミン（Ｔ）からシトシン（Ｃ）への変異を導入する。シトシンデアミナーゼは、修飾部位の近くにあるシトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換し、グアニン（Ｇ）からアデノシン（Ａ）への変異を導入する。非カノニカルな特徴を局在化するもう一つの方法は、ＮＥＢ（登録商標）社のＵＳＥＲ（商標）(ウラシル脱グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの混合酵素）によってウラシル（Ｕ）を切断することである。
【0179】
増幅および配列決定
標的核酸（またはそのバーコード化コピー）が改変された後、それを増幅し、配列決定できる。この工程によってバーコードの配列が明らかになり、標的核酸中の結合ドメインがもともと結合していた非カノニカルな特徴と相関する。塩基配列の決定により、切断フラグメントの長さも明らかになり、これにより標的核酸中の非カノニカルな特徴を局在化できる。塩基配列の決定によって、非カノニカルな特徴の近くに変異が見つかることもあり、そこから非カノニカルな特徴の位置が情報的に導き出されることもある。変異は、脱アミナーゼ酵素による塩基編集の結果であり得るか、核酸標的の非カノニカルな特徴をコピーアンドペーストするために用いられる酵素（標的がＤＮＡの場合はＤＮＡポリメラーゼ、標的がＲＮＡの場合は逆転写酵素）の塩基挿入エラー率が増加した結果かもしれない。非カノニカルな特徴は、酵素的バイパスエラー率を自然に増加させるかもしれないし、非カノニカルな特徴を化学的に修飾することによって効果を増幅させるかもしれない。
標的核酸（またはそのバーコード化コピー）が改変された後、それを増幅し、配列決定できる。この工程によってバーコードの配列が明らかになり、標的核酸中の結合ドメインがもともと結合していた非カノニカルな特徴と相関する。塩基配列の決定により、切断フラグメントの長さも明らかになり、これにより標的核酸中の非カノニカルな特徴を局在化できる。塩基配列の決定によって、非カノニカルな特徴の近くに変異が見つかることもあり、そこから非カノニカルな特徴の位置が情報的に導き出されることもある。変異は、脱アミナーゼ酵素による塩基編集の結果であり得るか、核酸標的の非カノニカルな特徴をコピーアンドペーストするために用いられる酵素（標的がＤＮＡの場合はＤＮＡポリメラーゼ、標的がＲＮＡの場合は逆転写酵素）の塩基挿入エラー率が増加した結果かもしれない。非カノニカルな特徴は、酵素的バイパスエラー率を自然に増加させるかもしれないし、非カノニカルな特徴を化学的に修飾することによって効果を増幅させるかもしれない。
【0180】
したがって、ある態様では、本明細書に記載の方法は、バーコード化標的核酸またはそのコピーを配列決定する工程を含み得る。配列決定工程は、当技術分野で知られている何れかの適切な方法を用いて実施できる。例えば、配列決定は、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）法、超並列シーケンシング法、またはディープシーケンシング法を用いて実施できる。本発明の方法で使用できるＮＧＳプラットフォームは多数ある。例えば、Illumina(登録商標） (Solexa(登録商標）)のシーケンシングは、各塩基が蛍光シグナルを発すると同時にＤＮＡ塩基を識別し、核酸鎖に加えることで機能する。Roche(登録商標） 454シークエンシングは、ポリメラーゼによってヌクレオチドがＤＮＡの新しい鎖に組み込まれた後、蛍光を用いてピロリン酸の遊離を検出する技術であるパイロシーケンシングに基づく。Ion Torrent（プロトン／ＰＧＭシーケンス）は、ＤＮＡポリメラーゼによる個々のヌクレオチドの組み込みからプロトン（Ｈ＋）の直接放出を測定する。
【0181】
いくつかの態様では、標的核酸を検出するために配列決定は必須ではない。例えば、ＰＣＲを用いて標的核酸を検出できる。例えば、ＰＣＲは、標的核酸（例えば、バーコード）が存在するかどうかを検出するために使用できる。いくつかの態様では、標的核酸は、蛍光プローブ（例えば、蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブ）を用いて検出される。いくつかの態様では、マイクロアレイまたは他の核酸アレイを用いて標的核酸を検出する。
【0182】
いくつかの態様では、核酸結合分子を介する反応によるバーコードの付加を検出するために、配列決定は必要とされない。例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾の存在は、核酸電気泳動、蛍光ハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲ、ローリングサークル増幅、ＬＡＭＰ、またはバーコードによって誘発され得る他の核酸増幅法を用いて、関連するバーコードを検出することによって確認され得る。
【0183】
標的核酸上の非カノニカルな特徴の同定および定量のための例示的方法
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、標的核酸上の修飾（すなわち、非カノニカルな特徴）を同定するだけでなく、存在する修飾の数を定量するためにも用いることができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、複数の標的核酸上の複数の修飾（すなわち、非カノニカルな特徴）を同定し、存在する各修飾の数を定量するために使用される。
いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、標的核酸上の修飾（すなわち、非カノニカルな特徴）を同定するだけでなく、存在する修飾の数を定量するためにも用いることができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の方法は、複数の標的核酸上の複数の修飾（すなわち、非カノニカルな特徴）を同定し、存在する各修飾の数を定量するために使用される。
【0184】
いくつかの態様において、標的核酸中の非カノニカルな特徴を検出する方法は、（ｉ）標的核酸を本明細書に記載の組成物と接触させる工程；（ｉｉ）（ａ）核酸バーコードを標的核酸にトランスファーしてバーコード化標的核酸を生成するか、または（ｂ）標的核酸のバーコード化コピーを生成する工程；および、（ｉｉｉ）標的核酸またはそのコピー中のバーコードの存在を検出する工程、を包含する。
【0185】
いくつかの態様において、複数の標的核酸中の２以上の非カノニカルな特徴を検出し、および／または定量するための方法は、（ｉ）標的核酸を少なくとも２つの組成物と接触させる工程、ここで、各組成物は、結合ドメインおよびアダプターを含み、各核酸結合分子の結合ドメインは、ＤＮＡまたはＲＮＡの異なる非カノニカルな特徴に結合し、かつアダプターは、各結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に特異的な核酸バーコード配列を含む；（ｉｉ）（ａ）核酸バーコードを標的核酸にトランスファーしてバーコード化標的核酸を生成するか、または（ｂ）標的核酸のバーコード化コピーを生成する工程；（ｉｉｉ）バーコード化標的核酸またはそのバーコード化コピーを、非カノニカル特徴の位置がバーコード化標的核酸またはそのバーコード化コピーの一次核酸配列に基づいて同定できるように改変する工程；および、（ｉｖ）バーコード化標的核酸の配列を決定する工程、を含む。一部の態様では、本方法は、配列決定前にバーコード化標的核酸またはそのコピーを増幅することを含む。
【0186】
いくつかの態様において、複数の標的核酸を分析する方法は、（ｉ）標的核酸を本明細書に記載される組成物と接触させる工程；（ｉｉ）（ａ）核酸バーコードを標的核酸にトランスファーしてバーコード化標的核酸を生成するか、または（ｂ）標的核酸のバーコード化コピーを生成する工程；（ｉｉｉ）バーコード化標的核酸またはそのバーコード化コピーを、非カノニカル特徴の位置がバーコード化標的核酸またはそのバーコード化コピーの一次核酸配列に基づいて同定できるように改変する工程；および、（ｉｖ）バーコード化標的核酸を配列決定する工程、を含む。
【0187】
いくつかの態様では、上記の工程のいずれか１以上が少なくとも１回（例えば、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、またはそれ以上）繰り返される。ある側面において、上記の工程の１以上は、同時または逐次的に実行され得る。いくつかの態様では、工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を反復するたびに、同じまたは異なる結合ドメインが用いられる。一部の態様では、本方法は、配列決定前にバーコード化標的核酸またはそのコピーを増幅することを含む。
【0188】
ある態様では、修飾ＲＮＡ転写物および非修飾ＲＮＡ転写物を含むＲＮＡサンプルが提供される。ＲＮＡサンプルの各転写物は、非カノニカルな特徴を含んでいてもいなくてもよい。次に、ＲＮＡ転写物をビーズと接触させ、ビーズを非カノニカルな特徴に特異的な結合ドメイン（すなわち、図４Ａのタイプ１、タイプ２およびタイプＩＩＩのビーズ）に直接的または間接的に結合させる。修飾されたＲＮＡ分子はビーズに結合するが、未修飾のＲＮＡは上清に残る。ＲＮＡ修飾のレベルを定量するために、両画分（基質結合画分および上清画分）を処理し、配列決定ライブラリーに変換できる。未修飾ＲＮＡ分子は、ＵＦＰおよびＵＲＰを含むアダプターで両端をキャップされ、一方、修飾ＲＮＡ分子は、その修飾を示す（すなわち、それはビーズに結合したアダプターからトランスファーされる）バーコードを受け取る。
【0189】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、基質がビーズである基質を含む。いくつかの態様では、基質はビーズのプールである。いくつかの態様では、各ビーズは異なる結合ドメインを含む。いくつかの態様では、各ビーズは異なるアダプターを含む。いくつかの態様では、各ビーズは異なる結合ドメインおよびアダプターを含み、アダプターは結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。
【0190】
本発明は、複数の標的遺伝子を基質と接触させることを含む標的遺伝子の測定方法を提供し、ここで、基質はマイクロアレイ上に固定化されている。いくつかの態様では、マイクロアレイはスポット型（spotted）マイクロアレイである。ある態様では、マイクロアレイはプリント型（printed）マイクロアレイである。マイクロアレイの一例は、図４Ｂに示されている。いくつかの態様では、マイクロアレイ上の各スポットは、異なる結合ドメインおよびアダプターを含み、アダプターは、結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に特異的な核酸バーコード配列を含む。いくつかの態様では、マイクロアレイ上の各スポットは、本明細書に記載される異なる組成物を含む。
【0191】
本発明は、複数の標的遺伝子を基質と接触させることを含む標的遺伝子の測定方法を提供し、ここで、基質はマイクロ流体デバイスのチャネルに固定化されている。いくつかの態様では、マイクロ流体デバイスは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、または５０チャンネルからなる。マイクロ流体デバイスの一例は、図４Ｃに示されている。いくつかの態様では、マイクロ流体デバイスの各チャンネルは、異なる結合ドメインおよびアダプターを含み、アダプターは、結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含む。いくつかの態様では、マイクロ流体デバイスの各チャンネルは、本明細書に記載される異なる組成物を含む。
【0192】
いくつかの態様において、本明細書の方法は、複数の標的核酸を分析することを含む。いくつかの態様において、本方法は、複数の標的核酸を本明細書に記載の何れかの組成物と接触させることを含む。
【0193】
ある側面において、本発明は、複数の標的核酸を分析するための方法を含み、該方法は、
（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本発明の組成物と接触させること、ここで、非カノニカルな特徴を含む標的核酸が結合ドメインに結合する；
（ｉｉ）以下のうち1つを実行すること：
（ａ）核酸バーコードを非カノニカルな特徴を含む標的核酸にトランスファーして、バーコード化標的核酸を生成すること、または
（ｂ）非カノニカルな特徴を含む標的核酸のバーコード化コピーを生成すること；
（ｉｉｉ）バーコード化標的核酸を増幅させること；および
（ｉｖ）バーコード化標的核酸の配列を決定すること
を含み、ここで、工程（ｉ）および（ｉｉ）は順次または同時に行われる。
（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本発明の組成物と接触させること、ここで、非カノニカルな特徴を含む標的核酸が結合ドメインに結合する；
（ｉｉ）以下のうち1つを実行すること：
（ａ）核酸バーコードを非カノニカルな特徴を含む標的核酸にトランスファーして、バーコード化標的核酸を生成すること、または
（ｂ）非カノニカルな特徴を含む標的核酸のバーコード化コピーを生成すること；
（ｉｉｉ）バーコード化標的核酸を増幅させること；および
（ｉｖ）バーコード化標的核酸の配列を決定すること
を含み、ここで、工程（ｉ）および（ｉｉ）は順次または同時に行われる。
【0194】
ある側面において、本発明は、複数の標的核酸を分析するための方法を含み、該方法は、
（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本発明の組成物と接触させること、ここで、非カノニカルな特徴を含む標的核酸が結合ドメインに結合する；
（ｉｉ）以下のいずれか１つを実施すること：
（ａ）核酸バーコードを非カノニカルな特徴を含む標的核酸にトランスファーして、バーコード化標的核酸を生成するか、または
（ｂ）非カノニカルな特徴を含む標的核酸のバーコード化コピーを生成すること；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅すること；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定すること、
を含み、ここで、工程（ｉ）および（ｉｉ）は順次または同時に行われる。
（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本発明の組成物と接触させること、ここで、非カノニカルな特徴を含む標的核酸が結合ドメインに結合する；
（ｉｉ）以下のいずれか１つを実施すること：
（ａ）核酸バーコードを非カノニカルな特徴を含む標的核酸にトランスファーして、バーコード化標的核酸を生成するか、または
（ｂ）非カノニカルな特徴を含む標的核酸のバーコード化コピーを生成すること；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅すること；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定すること、
を含み、ここで、工程（ｉ）および（ｉｉ）は順次または同時に行われる。
【0195】
ある側面において、本発明は、複数の標的核酸を分析するための方法を含み、該方法は、
（ｉ）標的ＲＮＡ分子を逆転写してＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二本鎖分子を形成するか、標的二本鎖ＤＮＡ分子を供給することにより、複数の標的核酸を供給すること；
（ｉｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本発明の組成物と接触させること、ここで、非カノニカルな特徴を含む標的核酸が結合ドメインに結合する；
（ｉｉｉ）トランスポザーゼを用いて、２つのアダプター（そのうちの少なくとも１つは核酸バーコードを含む）を、非カノニカルな特徴を含む二本鎖標的核酸にトランスファーして、バーコード化標的核酸を生成すること、
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸を増幅すること；および
（ｖ）バーコード化標的核酸の配列を決定すること
を含み、ここで、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は順次または同時に行われる、
（ｉ）標的ＲＮＡ分子を逆転写してＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二本鎖分子を形成するか、標的二本鎖ＤＮＡ分子を供給することにより、複数の標的核酸を供給すること；
（ｉｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本発明の組成物と接触させること、ここで、非カノニカルな特徴を含む標的核酸が結合ドメインに結合する；
（ｉｉｉ）トランスポザーゼを用いて、２つのアダプター（そのうちの少なくとも１つは核酸バーコードを含む）を、非カノニカルな特徴を含む二本鎖標的核酸にトランスファーして、バーコード化標的核酸を生成すること、
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸を増幅すること；および
（ｖ）バーコード化標的核酸の配列を決定すること
を含み、ここで、工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は順次または同時に行われる、
【0196】
ある側面において、本発明は、複数の標的核酸中の複数の非カノニカルな特徴を検出するための方法を含み、該方法は、
（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本発明の複数の組成物と接触させる工程；
ここで、工程（ｉ）で接触される複数の組成物の数は、非カノニカルな特徴の数に等しいか、またはそれよりも多い；
ここで、複数の組成物の結合ドメインは、各々、ＤＮＡもしくはＲＮＡの異なる非カノニカルな特徴に結合するか、または複数の結合ドメインがＤＮＡもしくはＲＮＡの同じ非カノニカルな特徴に結合する；および
ここで、複数の組成物のアダプターは各々、その組成物の結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の、または結合ドメインに固有の核酸バーコード配列を含む；
（ｉｉ）以下のうちの１つを実施する工程：（ａ）複数の組成物の各々の核酸バーコード配列を複数の標的核酸にトランスファーするか、または（ｂ）複数の標的核酸のバーコード化されたコピーを生成する；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅する工程；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定する工程
を含む。
いくつかの態様では、トランスファーはトランスポザーゼによるアダプター転移である。
（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本発明の複数の組成物と接触させる工程；
ここで、工程（ｉ）で接触される複数の組成物の数は、非カノニカルな特徴の数に等しいか、またはそれよりも多い；
ここで、複数の組成物の結合ドメインは、各々、ＤＮＡもしくはＲＮＡの異なる非カノニカルな特徴に結合するか、または複数の結合ドメインがＤＮＡもしくはＲＮＡの同じ非カノニカルな特徴に結合する；および
ここで、複数の組成物のアダプターは各々、その組成物の結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の、または結合ドメインに固有の核酸バーコード配列を含む；
（ｉｉ）以下のうちの１つを実施する工程：（ａ）複数の組成物の各々の核酸バーコード配列を複数の標的核酸にトランスファーするか、または（ｂ）複数の標的核酸のバーコード化されたコピーを生成する；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅する工程；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定する工程
を含む。
いくつかの態様では、トランスファーはトランスポザーゼによるアダプター転移である。
【0197】
ある側面において、本発明は、複数の標的核酸中の複数の非カノニカルな特徴を検出するための方法を含み、該方法は、
（ｉ）本発明の複数の組成物を含むマイクロアレイ、ビーズ、および／または流体デバイスを提供すること；
ここで、工程（ｉ）で提供される複数の組成物の数は、非カノニカルな特徴の数に等しいか、またはそれよりも多い；
ここで、前記複数の組成物の結合ドメインは、各々、ＤＮＡもしくはＲＮＡの異なる非カノニカルな特徴に結合しているか、または複数の結合ドメインがＤＮＡもしくはＲＮＡの同じ非カノニカルな特徴に結合している；および
ここで、複数の組成物のアダプターは各々、その組成物の結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の、または結合ドメインに固有の核酸バーコード配列を含む；
（ｉｉ）複数の標的核酸を複数の組成物と接触させ、かつ以下のうちの１つを実施すること：（ａ）複数の組成物の各々の核酸バーコード配列を複数の標的核酸にトランスファーするか、または（ｂ）複数の標的核酸のバーコード化コピーを生成する；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅すること；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定こと
を含む。
（ｉ）本発明の複数の組成物を含むマイクロアレイ、ビーズ、および／または流体デバイスを提供すること；
ここで、工程（ｉ）で提供される複数の組成物の数は、非カノニカルな特徴の数に等しいか、またはそれよりも多い；
ここで、前記複数の組成物の結合ドメインは、各々、ＤＮＡもしくはＲＮＡの異なる非カノニカルな特徴に結合しているか、または複数の結合ドメインがＤＮＡもしくはＲＮＡの同じ非カノニカルな特徴に結合している；および
ここで、複数の組成物のアダプターは各々、その組成物の結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の、または結合ドメインに固有の核酸バーコード配列を含む；
（ｉｉ）複数の標的核酸を複数の組成物と接触させ、かつ以下のうちの１つを実施すること：（ａ）複数の組成物の各々の核酸バーコード配列を複数の標的核酸にトランスファーするか、または（ｂ）複数の標的核酸のバーコード化コピーを生成する；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅すること；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定こと
を含む。
【0198】
いくつかの態様において、複数の標的核酸を分析する方法は、複数の標的核酸を含む溶液を、本明細書に記載の複数の組成物と接触させることを含み、各組成物の基質は、図４Ａに示されるようなビーズである。
【0199】
いくつかの態様において、複数の標的核酸を分析する方法は、
（ｉ）マイクロ流体デバイスを、複数の標的核酸を含む溶液と接触させる工程であって、ここで、前記マイクロ流体デバイスが、複数のチャネルを含み、各チャネルが、本明細書に記載の組成物を含み、前記アダプターが、結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含み、かつ組成物の各々が、異なる非カノニカルな特徴を結合し、それにより、標的核酸上の複数の非カノニカルな特徴を結合する、工程；
（ｉｉ）（ａ）核酸バーコードを標的核酸にトランスファーしてバーコード化標的核酸を生成するか、または（ｂ）標的核酸のバーコード化コピーを生成する工程のいずれか；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅する工程；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定する工程
を含む。
（ｉ）マイクロ流体デバイスを、複数の標的核酸を含む溶液と接触させる工程であって、ここで、前記マイクロ流体デバイスが、複数のチャネルを含み、各チャネルが、本明細書に記載の組成物を含み、前記アダプターが、結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の核酸バーコード配列を含み、かつ組成物の各々が、異なる非カノニカルな特徴を結合し、それにより、標的核酸上の複数の非カノニカルな特徴を結合する、工程；
（ｉｉ）（ａ）核酸バーコードを標的核酸にトランスファーしてバーコード化標的核酸を生成するか、または（ｂ）標的核酸のバーコード化コピーを生成する工程のいずれか；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅する工程；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定する工程
を含む。
【0200】
いくつかの態様において、複数の標的核酸を分析する方法は、複数の標的核酸を含む溶液を、本明細書に記載される複数の組成物と接触させることを含み、各組成物の基質は、図４Ｂに示されるようにマイクロアレイ上に固定化される。
【0201】
いくつかの態様において、複数の標的核酸を分析する方法は、
（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本明細書に記載の複数の組成物と接触させる工程であって、ここで、各組成物は、アダプターが、結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に特異的な核酸バーコード配列を含むマイクロアレイ上に固定化されており、かつ各組成物は、異なる非カノニカルな特徴を結合し、それによって標的核酸上の複数の非カノニカルな特徴を結合する、工程；
（ｉｉ）（ａ）核酸バーコードを標的核酸にトランスファーしてバーコード化標的核酸を生成するか、または（ｂ）標的核酸のバーコード化コピーを生成する工程のいずれか；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅する工程；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定する工程
を含む。
（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本明細書に記載の複数の組成物と接触させる工程であって、ここで、各組成物は、アダプターが、結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に特異的な核酸バーコード配列を含むマイクロアレイ上に固定化されており、かつ各組成物は、異なる非カノニカルな特徴を結合し、それによって標的核酸上の複数の非カノニカルな特徴を結合する、工程；
（ｉｉ）（ａ）核酸バーコードを標的核酸にトランスファーしてバーコード化標的核酸を生成するか、または（ｂ）標的核酸のバーコード化コピーを生成する工程のいずれか；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅する工程；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定する工程
を含む。
【0202】
いくつかの態様において、複数の標的核酸を分析する方法は、複数の標的核酸を含む溶液を、本明細書に記載の複数の組成物と接触させることを含み、各組成物の基質は、図４Ｃに示されるように、マイクロ流体デバイスのチャネルに固定化される。
【0203】
複数の標的核酸中の複数の非カノニカルな特徴を検出する方法であって、該方法は、
（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本明細書に記載の複数の組成物と接触させる工程；
ここで、複数の組成物の結合ドメインは、各々、ＤＮＡもしくはＲＮＡの異なる非カノニカルな特徴に結合するか、または複数の結合ドメインがＤＮＡもしくはＲＮＡの同じ非カノニカルな特徴に結合する；
ここで、工程（ｉ）で接触される複数の組成物の数は、非カノニカルな特徴の数に等しいか、またはそれよりも多い、
ここで、複数の組成物のアダプターはそれぞれ、その組成物の結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の、または結合ドメインに固有の核酸バーコード配列を含み；
（ｉｉ）以下のいずれか１つを実施する工程：
（ａ）複数の組成物の各々の核酸バーコード配列を複数の標的核酸にトランスファーするか、または
（ｂ）複数の標的核酸のバーコード化コピーを生成する；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅する工程；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定する工程、を含む。
（ｉ）複数の標的核酸を含む溶液を、本明細書に記載の複数の組成物と接触させる工程；
ここで、複数の組成物の結合ドメインは、各々、ＤＮＡもしくはＲＮＡの異なる非カノニカルな特徴に結合するか、または複数の結合ドメインがＤＮＡもしくはＲＮＡの同じ非カノニカルな特徴に結合する；
ここで、工程（ｉ）で接触される複数の組成物の数は、非カノニカルな特徴の数に等しいか、またはそれよりも多い、
ここで、複数の組成物のアダプターはそれぞれ、その組成物の結合ドメインによって特異的に結合される非カノニカルな特徴に固有の、または結合ドメインに固有の核酸バーコード配列を含み；
（ｉｉ）以下のいずれか１つを実施する工程：
（ａ）複数の組成物の各々の核酸バーコード配列を複数の標的核酸にトランスファーするか、または
（ｂ）複数の標的核酸のバーコード化コピーを生成する；
（ｉｉｉ）バーコード化された標的核酸を増幅する工程；および
（ｉｖ）バーコード化された標的核酸の塩基配列を決定する工程、を含む。
【0204】
そのため、この方法では、それぞれが独自のバーコードを示す複数の結合ドメインで、同じ修飾を検出することが可能となる。
【0205】
いくつかの態様では、正規化プローブ（対照）は、標的核酸を含む溶液（表面結合、上清）にスパイクして、相対定量を可能にする。さらに、アダプター中に存在する可能性のある固有の分子バーコードをカウントすることによって、絶対定量を達成できる。多くのＲＮＡ修飾は低いコピー数で起こる。従って、標的核酸の修飾画分および非修飾画分を、所定のシーケンシング深度で低コピー数の転写産物に対して最適な感度を提供する比率で組み合わせることができる。このアプローチにより、ＲＮＡ修飾の化学量論および存在量を測定できる。“化学量論”は相対数であり、非カノニカルな特徴を含む特定の遺伝子座のコピー数を、その遺伝子座の全コピー数で割ったものとして計算される。“存在量”とは、ある遺伝子座における核酸の非カノニカルな特徴の絶対出現数のことである。
【0206】
いくつかの態様では、複数の標的核酸を分析する方法は、ライゲーションによるバーコードトランスファーによるＲＮＡプロファイリングと、ｃＤＮＡ切断による非カノニカルな特徴の局在化とを含み得る。その後、本明細書に記載される１以上の組成物をＲＮＡサンプルに添加できる。組成物の結合ドメインがＲＮＡ修飾を認識し、アダプター（例えば、ＤＮＡバーコードを含むアダプター）がＲＮＡ標的の末端に結合される。いくつかの態様では、逆転写酵素が認識エレメントを越えてコピーするのを防ぐマーク（すなわち、修飾）を生成するために、標的ＲＮＡおよび結合ドメインを架橋（例えば、光化学的架橋）することができる。いくつかの態様では、ポリメラーゼ－ＲＮＡ相互作用を破壊する、および／または同じ目的のために関与できる付加的な反応性基を提示する認識エレメントを選択し、操作することによって、架橋することなく停止点を作成できる。その後、一本鎖アダプターライゲーションを使って逆転写のためのプライマー結合部位を提供し、プライマー伸長によってｃＤＮＡを合成できる。ｃＤＮＡは、転写物の末端がＲＮＡ修飾の位置を示すように合成される。修飾が局在化する分解能は、切断メカニズムの性質に依存する。
【0207】
ｃＤＮＡ分子は環化されていてもよい。例えば、タイプＢアダプターを有するｃＤＮＡ分子は、サイクリガーゼによって環化できる。環化されたｃＤＮＡを切断すると、鎖特異的な直鎖状ｃＤＮＡフラグメントが得られ、ＰＣＲ増幅を用いて配列決定ライブラリーに容易に変換できる。プライマーは、配列決定などの下流工程に有用なアダプターピースを導入するために使用され得る。
【0208】
いくつかの態様では、複数の標的核酸を分析する方法を用いて、反応ごとに１種のＤＮＡまたはＲＮＡ修飾を検出／定量できる。いくつかの態様では、複数の標的核酸を分析する方法は、サンプル分割によって複数のＤＮＡ修飾またはＲＮＡ修飾を検出するために適合され得る。
【0209】
いくつかの態様では、トランスポザーゼは、本明細書に記載されるように、基質に結合している。ある態様では、タグメンテーションはバーコード化に用いられる。いくつかの態様では、図９に示すように、タグメンテーションがバーコード化に用いられる。トランスポザーゼは、原核生物および真核生物の両方に存在し、'カット・アンド・ペースト’メカニズムで、定義されたＤＮＡエレメント（トランスポゾン）をゲノムの別の場所に移動させる触媒となる。トランスポザーゼ分子には、特定のＲＮＡ修飾を示す二本鎖ＤＮＡアダプターが負荷されている。トランスポザーゼは二本鎖ＤＮＡアダプターに結合し、二本鎖ＤＮＡ基質の５’末端にライゲーションすることでアダプターを切断し挿入する。３’末端にはタグを付けず、生じたギャップはポリメラーゼ反応によって埋めることができる。いくつかの態様では、トランスポザーゼはＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖を基質として用い得る。タグメンテーション反応は一般的に、３０－２００ｎｔの長さのフラグメントを生成し、サンプルインプットによって最適化できる。いくつかの態様では、結合ドメイン－トランスポザーゼ複合体を、フラグメント化されていない全ＲＮＡまたは濃縮／欠失したＲＮＡに添加する。修飾されたＲＮＡ塩基を認識すると、トランスポザーゼは特定のバーコードをＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に挿入し、ユニバーサルプライマー部位およびリバースプライマー部位を付加する。適切なポリメラーゼを用いてギャップを埋めることで、ライブラリー調製は完了する。タグメンテーションは、特定のバーコードによってＲＮＡ修飾部位をフレーミングし、位置情報は、位置分解能を最適化する長さにトランスポザーゼ・リンカーを操作することによって得られる。いくつかの態様では、トランスポーズはＴｎ５トランスポザーゼである。
【0210】
トランスポザーゼは多くの生物医学的適用に広く用いられている。例えば、大腸菌由来の高活性Ｔｎ５トランスポザーゼは、二本鎖の合成１９ｂｐモザイク末端（ＭＥ）認識配列に結合でき、この配列はあらゆる配列決定アダプターに付加できる。いくつかの態様において、ＭＥ－アダプターは、ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ（配列番号１６）を含む。いくつかの態様において、ＭＥ－アダプターは、ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号２４）を含む。いくつかの態様において、ＭＥ－アダプターは、ＴＴＴＧＴＧＡＵＧＣＧＡＴＧＡＡＣＴＣＡＧＡＧＴＧＣＴＴＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号５２）を含み、ここで、Ｎはバーコードである。いくつかの態様において、配列番号１６を含むモザイク末端は、配列番５２を含むＭＥ－アダプターにハイブリダイズされる。各トランスポザーゼ分子は同時に２つのＭＥタグ付きアダプターを付加する。Ｔｎ５トランスポザーゼは、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖を基質とするインビトロタグメンテーション反応（標的配列をフラグメント化し、配列決定アダプターで同時にタグ付けする）に利用されてきた。タグメンテーションの大きな利点は、使用する核酸の量を減らし、アッセイワークフローを大幅に簡略化できることである。タグメンテーションは一般的にピコグラム単位のＤＮＡまたはＲＮＡを用いて行われ、単一細胞アプローチに成功している。
【0211】
いくつかの態様では、結合ドメイン－酵素コンジュゲートは、ＲＮＡ修飾、ＤＮＡ修飾、またはＲＮＡおよびＤＮＡ修飾の両方の修飾に特異的に結合し、トランスポザーゼを標的核酸に誘導する結合ドメインを含む。修飾特異的結合ドメインに結合したトランスポザーゼは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖に特異的バーコードを挿入し、ユニバーサルプライマー部位およびリバースプライマー部位を付加する。タグメンテーションはマグネシウムイオンに依存しており、マグネシウムイオンの添加によってタグメンテーションが誘発され得る。タグ付けされた二重鎖の長さは反応条件によって異なり、３０塩基対という短さに最適化できる。したがって、標的化タグメンテーションは、ＤＮＡまたはＲＮＡ修飾を最大３０塩基対の塩基分解能で検出できる。
【0212】
いくつかの態様では、トランスポザーゼはＤＮＡ／ＲＮＡ修飾を認識する結合ドメインに直接テザー結合または融合されないことがある。いくつかの態様において、トランスポザーゼは、ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾を認識する結合ドメインの構造的要素に共有結合的または非共有結合的に結合するペプチドまたはタンパク質ドメインにテザー結合または融合され得る。いくつかの態様では、結合ドメイン、例えば抗体はスパイタグ（Spy-tag）ペプチドと遺伝子融合しており、一方トランスポザーゼはスパイキャッチャー（SpyCatcher）タンパク質と遺伝子融合している。スパイタグおよびスパイキャッチャーは自発的に共有結合を形成し、トランスポザーゼを修飾部位に標的化する。いくつかの態様では、トランスポザーゼはプロテインＡ、Ｇ、またはＬに遺伝的に融合している。いくつかの態様では、トランスポザーゼはプロテインＧに遺伝的に融合している。いくつかの態様では、トランスポザーゼはプロテインＬに遺伝的に融合している。プロテインＡ、Ｇ、またはＬは、ＩｇＧ抗体の特定の領域に結合し、トランスポザーゼ活性をＤＮＡまたはＲＮＡ修飾結合抗体に向ける。
【0213】
いくつかの態様では、トランスポザーゼは結合ドメインに共有結合したＭＥタグ付きアダプターに結合できる。アダプターはＭＥタグ付き一本鎖として存在し、ＭＥ相補体のハイブリダイゼーションがトランスポザーゼのインサイチュウでのローディングを誘発する。結合ドメインは２以上のＭＥアダプター分子を提示し、トランスポザーゼに２つのアダプターを付加できるようにできる。いくつかの態様では、ＭＥ－アダプター分子は同じ配列を有する。いくつかの態様では、ＭＥアダプター分子は異なる配列を有する。いくつかの態様では、ＭＥ－アダプターはＤＮＡまたはＲＮＡ修飾に特異的なバーコードを含む。
【0214】
本明細書に記載の方法は、疾患、障害、または状態を診断するために使用できる。例えば、いくつかの態様において、本方法は、それを必要とする対象において癌を診断するために用いられ得る。いくつかの態様では、キットは、１以上の治療に対する反応など、疾患、障害または状態を経時的にモニタリングするために用いられ得る。例えば、本キットは、がんの治療（すなわち、化学療法、放射線療法など）を受けている対象におけるエピジェネティックおよび／またはエピトランススクリプトームの経時的変化をモニタリングするために使用できる。いくつかの態様では、本方法は、それを必要とする対象からの細胞または組織を分析するために用いられ得る。例えば、血液サンプル、生検サンプル、剖検サンプルなどから単離された細胞や組織における非カノニカルな特徴を検出するために、本方法を用い得る。
【0215】
いくつかの態様において、本方法は、工業的発酵に用いられる細胞など、１以上の製品の生産に商業的に用いられる細胞におけるエピジェネティックな変化を検出および／またはモニタリングするために用いられ得る。いくつかの態様において、本方法は、植物細胞または組織におけるエピジェネティックな変化を検出および／またはモニタリングするために用いられ得る。
【0216】
核酸分析用キット
本明細書に記載の組成物は、キットで（例えば、キットの構成成分として）提供できる。例えば、キットは、組成物、またはその１以上の成分、および情報資料を含み得る。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載される２以上の組成物を含む。情報資料は、例えば、本明細書に記載の方法および／または組成物の使用に関する説明資料、教示資料、販売資料、またはその他の資料であり得る。キットの情報資料の形式は限定されない。いくつかの態様において、情報提供材は、組成物の製造に関する情報、分子量、濃度、有効期限、バッチまたは生産地情報などを含み得る。いくつかの態様では、情報資料は、キットを用いて診断または評価され得る障害および／または病状のリストを含み得る。
本明細書に記載の組成物は、キットで（例えば、キットの構成成分として）提供できる。例えば、キットは、組成物、またはその１以上の成分、および情報資料を含み得る。いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載される２以上の組成物を含む。情報資料は、例えば、本明細書に記載の方法および／または組成物の使用に関する説明資料、教示資料、販売資料、またはその他の資料であり得る。キットの情報資料の形式は限定されない。いくつかの態様において、情報提供材は、組成物の製造に関する情報、分子量、濃度、有効期限、バッチまたは生産地情報などを含み得る。いくつかの態様では、情報資料は、キットを用いて診断または評価され得る障害および／または病状のリストを含み得る。
【0217】
いくつかの態様では、組成物は、本明細書に記載の方法に使用するのに適切な方法（例えば、使いやすいチューブ、適切な濃度など）で提供され得る。いくつかの態様では、キットは使用前に組成物の何らかの調製または操作を必要とし得る。いくつかの態様において、組成物は、液体、乾燥、または凍結乾燥の形態で提供される。いくつかの態様では、組成物は水溶液で提供される。いくつかの態様では、組成物は、滅菌されたヌクレアーゼを含まない溶液で提供される。いくつかの態様では、組成物は、分子自体を構成し得る核酸以外に核酸を実質的に含まない。
【0218】
いくつかの態様において、キットは、１以上のシリンジ、チューブ、アンプル、ホイルパッケージ、またはブリスターパックを含み得る。キットの容器は、気密性、防水性（すなわち、水分または蒸発の変化を防ぐ）、および／または遮光性を備え得る。
【0219】
いくつかの態様では、キットは、標的核酸の集団を分析する方法など、本明細書に記載の方法の１以上を実施するために用いられ得る。いくつかの態様において、キットは疾患、障害または病状を診断するために使用できる。例えば、いくつかの態様では、キットは癌の診断に使用できる。いくつかの態様では、キットは、１以上の治療に対する反応など、疾患、障害、または状態を経時的にモニタリングするために用いられ得る。例えば、本キットは、癌の治療を受けている対象のエピジェネティックおよび／またはエピトランススクリプトームの経時的変化をモニタリングするために使用できる。
【実施例】
【0220】
以下の限定されない例は、本発明の組成物および方法の態様をさらに例示する。
【0221】
実施例１：結合ドメインの選択
シュードウリジン、イノシン、ｍ５Ｃ、およびｍ６Ａに特異的な結合ドメインは、バイオレイヤー干渉計（ＢＬＩ）で測定した結合速度（オンレート）および解離速度（オフレート）に基づいて選択される。最初に、市販の抗体のスクリーニングを行う。目標は、オフレートを最小限に抑え、特異性の高い抗体を同定することである。
シュードウリジン、イノシン、ｍ５Ｃ、およびｍ６Ａに特異的な結合ドメインは、バイオレイヤー干渉計（ＢＬＩ）で測定した結合速度（オンレート）および解離速度（オフレート）に基づいて選択される。最初に、市販の抗体のスクリーニングを行う。目標は、オフレートを最小限に抑え、特異性の高い抗体を同定することである。
【0222】
ＢＬＩ装置（Gator Prime）にプロテインＧプローブ（Gator Bio、カタログ番号160006）を装填した。プロテインＧプローブは、ほとんどのアイソフォームのＩｇＧ抗体に０．０２～２０００μｇ／ｍＬ結合する能力を有する。ＩｇＧ抗体は、ＢＬＩシグナルの１ｎｍシフトに相当する密度でプロテインＧプローブ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中５μｇ／μＬ抗体）上に固定化される。抗原のリアルタイムオンレートは、１以上の修飾を示すＲＮＡ標的の１～２５０ｎＭ溶液にＢＬＩプローブを浸漬することで得られる。オフレートは、抗原を含まないＰＢＳ緩衝液にプローブを移すことによって生じる。同じ手順を、修飾されていないＲＮＡ鎖で繰り返す。試験ＲＮＡアナライトの分子量によっては、例えばストレプトアビジンと結合したビオチン標識ＲＮＡを用いるなど、高分子量のレポーター分子をＲＮＡに結合させることによってシグナルを増幅させる必要がある。オフレートが最も低く、特定の標的に対するオフレート選択性が最も高い抗体（オフレート特異的／オフレート非特異的）が、さらなる特性解析のために選択される。
【0223】
実施例２：抗体およびＤＮＡアダプター分子を共有結合させたビーズの作製
本実施例では、抗体およびＤＮＡアダプターを共有結合させたビーズ表面の調製について概説する（図１Ａ）。抗体は活性を維持するために部位特異的に連結され、抗体およびＤＮＡアダプターの密度は独立して調整可能である。抗体に対してアダプターを１０倍過剰に使用することで、副生成物を最小限に抑えながら、効率的なバーコーディング収率を実現する。
本実施例では、抗体およびＤＮＡアダプターを共有結合させたビーズ表面の調製について概説する（図１Ａ）。抗体は活性を維持するために部位特異的に連結され、抗体およびＤＮＡアダプターの密度は独立して調整可能である。抗体に対してアダプターを１０倍過剰に使用することで、副生成物を最小限に抑えながら、効率的なバーコーディング収率を実現する。
【0224】
標準的な１－エチル－３－（－３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を用いて、カルボキシル化磁性ビーズ（Thermo Fisher, Dynabeads（登録商標）M-270 Carboxylic Acid）をアミンカップリング用に活性化させる。ＥＤＣで活性化された表面は、不動態化（passivating）分子（ＣＯＯＨ－ＰＥＧ４－アミン、Broadpharm カタログ番号 BP-20423）、抗体反応性リンカー（ＤＢＣＯ－ＰＥＧ１０－アミン、Broadpharm カタログ番号 BP-24181）、ＤＮＡ反応性リンカー（ｍＴＥＴ－ＰＥＧ３－アミン、Broadpharm カタログ番号 BP-26276）の３成分系（ternary）混合物で官能化されている。抗体はサイト－クリックケミストリー(Thermo Fisher, カタログ番号 S20026）を用いてＤＢＣＯカップリング用に活性化される。サイト－クリックケミストリーは、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域のグリコシル化部位にアジド基を導入する。アミノ修飾ＤＮＡアダプターはＴＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル （Broadpharm,カタログ番号 BP-22418）で官能化されている。
【0225】
３’固定化ライゲーションバーコードを有する表面を生成するために、以下の一般的な構築技術のアダプターが用いられる（配列番号１）：
５’末端は酵素的ライゲーションを可能にするためにリン酸化されており、次いでＲＮＡ修飾を示す７ｂバーコード(下線)、少なくとも３塩基の固有の分子バーコード（ＮＮＮ、Ｎは何れかのヌクレオチド）が続き、イルミナアダプター(太字)、１８原子のヘキサエチレングリコールスペーサー(iSp18)、ＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）の切断によって表面から遊離するためのフィラーＡＴリピートに囲まれた１個のウラシル、および３’アミノ部分(3AmMO)が続く。
【0226】
５’固定化プライマー伸長バーコードを有する表面は、配列番号２
の一般的な構築技術を用いて調製され、ここで５ＡｍＭＣ６は５’－アミン部分であり、ＣＡＣＴＣＡＧＴ配列はプライマー伸長によるバーコード化のためのスペーサーである。
【0227】
ビーズの最終的な官能基化は段階的に行われる。まず、アジド活性化抗体をＤＢＣＯ部位に固定化し、続いてｍＴｅｔ部位をＴＣＯアダプターで充填する。
【0228】
実施例３：アダプターを負荷したプロテインＧおよび抗体を提示するビーズの調製
本実施例では、実施例２の代替法を説明する。ＤＮＡアダプターをビーズ表面に直接固定化する代わりに、プロテインＧに付着させる（図１Ｂ）。プロテインＧはまた、親和性結合によってＩｇＧ抗体を固定する役割も果たしている。
本実施例では、実施例２の代替法を説明する。ＤＮＡアダプターをビーズ表面に直接固定化する代わりに、プロテインＧに付着させる（図１Ｂ）。プロテインＧはまた、親和性結合によってＩｇＧ抗体を固定する役割も果たしている。
【0229】
磁気ビーズ（Thermo Fisher）表面のプロテインＧのリジン残基は、Ｓ－ＨｙＮｉｃリンカー（Vector Labs、カタログ番号 50-204-5741）で標識されている。連鎖球菌から単離された全長のプロテインＧのサイズは６３ｋＤａであるが、市販のものはＩｇＧ抗体との親和性をサブナノモル（subnanomolar）に維持しながら、より小さくなるように設計されている（例えば、Abcam, Uniprot ID: P19909）。プロテインＧのＩｇＧ結合部位を機能的損傷から保護するために、ＨｙＮｉｃ反応は標識後０．２ＭグリシンｐＨ２で溶出される犠牲的な（sacrificial）ＩｇＧ抗体の存在下で行われる。ＨｙＮｉｃ修飾はＳ－４ＦＢリンカー（Vector Labs, カタログ番号50-204-5743）でアミン基が活性化されたＤＮＡアダプター（例えば、配列番号１または２）と速やかに反応する。
【0230】
犠牲的抗体を除去し、目的のＲＮＡ修飾特異的抗体を負荷すれば、ビーズの調製は完了である。
【0231】
実施例４：抗体の平面アレイの調製
本実施例では、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを介して抗体を平面上に固定化するＤＮＡマイクロアレイ技術を用いる（図１Ｆおよび図４Ｂ）。パターニング後、表面には４８のスポットが形成され、各スポットにはＲＮＡ修飾特異的抗体が１つずつ、ＲＮＡ修飾特異的バーコード化ｉ７アダプターおよびユニバーサルｉ５イルミナアダプターと共に配置される。本実施例では、ｉ７アダプターはＵＳＥＲ酵素ミックスで切断するための１個のウラシルを含み、ｉ５アダプターはＦｐＧ酵素で切断するための１個の８－ｏｘｏＧを含む。目標は、パターン化された表面をフローセルに組み込み、捕捉した核酸配列のクローン増幅とそれに続くインサイチュウ配列決定を可能にすることである。フォワード鎖またはリバース鎖の選択的切断は、それぞれリード１およびリード２に先行する鎖の直線化に不可欠な工程である。フローセルをペルチェ（Peltier）素子にマウントし、ポンプ駆動の流路系（fluidics system）に接続することで、温度制御および液体交換の自動化が可能になる。これらの機能は、実施例６で概説したように、完全に自動化されたライブラリー調製ワークフローを構築するために利用される。
本実施例では、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを介して抗体を平面上に固定化するＤＮＡマイクロアレイ技術を用いる（図１Ｆおよび図４Ｂ）。パターニング後、表面には４８のスポットが形成され、各スポットにはＲＮＡ修飾特異的抗体が１つずつ、ＲＮＡ修飾特異的バーコード化ｉ７アダプターおよびユニバーサルｉ５イルミナアダプターと共に配置される。本実施例では、ｉ７アダプターはＵＳＥＲ酵素ミックスで切断するための１個のウラシルを含み、ｉ５アダプターはＦｐＧ酵素で切断するための１個の８－ｏｘｏＧを含む。目標は、パターン化された表面をフローセルに組み込み、捕捉した核酸配列のクローン増幅とそれに続くインサイチュウ配列決定を可能にすることである。フォワード鎖またはリバース鎖の選択的切断は、それぞれリード１およびリード２に先行する鎖の直線化に不可欠な工程である。フローセルをペルチェ（Peltier）素子にマウントし、ポンプ駆動の流路系（fluidics system）に接続することで、温度制御および液体交換の自動化が可能になる。これらの機能は、実施例６で概説したように、完全に自動化されたライブラリー調製ワークフローを構築するために利用される。
【0232】
顕微鏡スライドは、合成ＤＮＡプローブのインクジェットプリントによってパターン化され、一般的な接着手順でフローセルに組み込まれる。顕微鏡スライドには４８のスポットがあり、各スポットには３つの異なるオリゴヌクレオチドが混合されている。ｉ７アダプターは、図２Ｄに従ってプライマー伸長によるバーコード化を可能にするため、３’末端に８ｂスペーサー領域を示す。ＤＮＡプローブの密度は、バーコーディングを容易にするために実験的に最適化されている。ＲＮＡ修飾特異的抗体は、サイト－クリックケミストリー（Thermo Fisher）を用いてＤＮＡアドレスで部位特異的に標識されている。抗体は、ＤＮＡアドレスを介して捕捉プローブにハイブリダイゼーションすることでアレイに負荷される。
【0233】
実施例５：ビーズプールを用いたライゲーションによるＲＮＡ修飾特異的バーコード化
本実施例では、実施例２に従って調製したビーズプールを用いてＲＮＡ修飾をプロファイリングするワークフローを説明する。各ビーズタイプには、１種のＲＮＡ修飾を標的とする抗体およびバーコードがライゲーションによって標的ＲＮＡに転写されるＤＮＡアダプターが提示される（図５）。バーコードの同一性は次世代シーケンシングによって決定され、ＲＮＡ修飾の特性が明らかになる。
本実施例では、実施例２に従って調製したビーズプールを用いてＲＮＡ修飾をプロファイリングするワークフローを説明する。各ビーズタイプには、１種のＲＮＡ修飾を標的とする抗体およびバーコードがライゲーションによって標的ＲＮＡに転写されるＤＮＡアダプターが提示される（図５）。バーコードの同一性は次世代シーケンシングによって決定され、ＲＮＡ修飾の特性が明らかになる。
【0234】
４種のビーズが用意される：ビーズタイプ１は、ｍ６Ａ抗体およびライゲーションによるバーコーディング用ＤＮＡアダプター（配列番号１）を提示する。さらに３種のビーズが、ｍ５Ｃ、シュードウリジン、イノシンに対する抗体、ならびに異なるバーコードを有するＤＮＡアダプターを用いて生成される（配列番号３－５）。ビーズはプールされ、化学的に平均１００ｂのサイズにフラグメント化され、脱リン酸化された１００ｎｇのＲＮＡサンプルと共にインキュベートされる。未修飾ＲＮＡを洗浄した後、修飾ＲＮＡの３’末端は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１の作用により、表面に結合したアダプターに連結される。ＤＮＡアダプターをプライミングし、ｄＮＴＰｓ、ＤＴＴ、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド（ＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧｒＧｒＧｒＧ、ここでｒはリボヌクレオチドを表す；配列番号６）、SuperScript IV逆転写酵素、および適切な酵素バッファーを含む単一の反応で、第１鎖および第２鎖合成を行う。得られたｃＤＮＡライブラリーは、illuminaの完全なアダプターを導入するためにＰＣＲ増幅され、塩基配列が決定される。
【0235】
実施例６：フローセル上でのプライマー伸長とその後の増幅によるＲＮＡ修飾特異的バーコード化
本実施例では、実施例４に従って作製したパターン化アレイをＲＮＡ修飾のプロファイリングに用いる。パターン化されたアレイの利点は、流路系（fluidics system）に組み込むことで、完全自動化されたライブラリー調製ワークフローを可能にすることである。本実施例では、ｍＲＮＡに存在する８つのＲＮＡ修飾（ｍ５Ｃ、ｍ６Ａ、ｍ７Ｇ、ｍ１Ａ、ｍ３Ｃ、ａｃ４Ｃ、イノシン、シュードウリジン）をすべて検出する。それぞれの修飾について、アレイは少なくとも３つの同族抗体のスポットを示す。
本実施例では、実施例４に従って作製したパターン化アレイをＲＮＡ修飾のプロファイリングに用いる。パターン化されたアレイの利点は、流路系（fluidics system）に組み込むことで、完全自動化されたライブラリー調製ワークフローを可能にすることである。本実施例では、ｍＲＮＡに存在する８つのＲＮＡ修飾（ｍ５Ｃ、ｍ６Ａ、ｍ７Ｇ、ｍ１Ａ、ｍ３Ｃ、ａｃ４Ｃ、イノシン、シュードウリジン）をすべて検出する。それぞれの修飾について、アレイは少なくとも３つの同族抗体のスポットを示す。
【0236】
ＲＮＡサンプルを、９５℃にて塩化マグネシウムで処理することにより化学的にフラグメント化する。ＲＮＡフラグメントを、エビアルカリホスファターゼおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで脱リン酸化させる。ＲＮＡ溶液を抗体アレイに接触させて、修飾されたＲＮＡ鎖が抗体によって特異的に捕捉され、ＲＮＡフラグメントが修飾度によってスポットに分離される。ＲＮＡ鎖の３’スペーサーはIllumina i７アダプターにハイブリダイズし、アダプターはSuperscript IV逆転写酵素によって伸長され、バーコード化ｃＤＮＡ鎖が生成される（図６）。ｉ５アダプター相補体は、実施例５に記載されているように、逆転写反応にテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含めることによって、第１鎖の３’末端に付加される。表面を０．１Ｍ水酸化ナトリウムで処理すると、ＲＮＡが加水分解され、抗体が剥がれ落ちる。ＤＮＡは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔポリメラーゼ）の存在下、温度サイクルによって増幅される（図７）。温度プロトコールは３段階を含む：（１）３７℃でのＤＮＡおよび表面結合アダプターのアニーリング、（２）６０℃でのアダプターの伸長、（３）融解温度を下げるためのホルムアミド、エチレングリコール、ベタイン、プロパンジオールなどの変性剤の存在により、６０～９５℃での変性。この工程により、バーコード化されたｃＤＮＡのクローンコピーが作成される。抗体の密度が低い状態でこのプロセスを実施すると、合成による直接配列決定（ＳＢＳ）に適した、空間的に分離したモノクローナルクラスターが生成される（図８）。
【0237】
実施例７：固定化されたトランスポザーゼを用いたｍ６Ａ修飾ＲＮＡのバーコード化
本実施例では、ＲＮＡ修飾の抗体を介したプルダウンと、その後の転移酵素を利用して、迅速なワンステップ反応で修飾ＲＮＡフラグメントにバーコードを導入する（図９および図２２Ａ）。
本実施例では、ＲＮＡ修飾の抗体を介したプルダウンと、その後の転移酵素を利用して、迅速なワンステップ反応で修飾ＲＮＡフラグメントにバーコードを導入する（図９および図２２Ａ）。
【0238】
タグメンテーションは、ＮＧＳライブラリー調製のための確立されたプロセスであり、Ｔｎ５トランスポザーゼのＭｇイオン依存性の“カット＆ライゲーション”活性を意味する。トランスポザーゼは１９ｂｐの短い“モザイク末端（ＭＥ）”二重鎖に選択的に結合し、この二重鎖はタグメンテーションに用いるＤＮＡアダプターに付加できる。
【0239】
本実施例では、ビーズの表面にトランスポソームが担持されている（図１Ｇ）。トランスポソームは、２つのモザイクエンド（ＭＥ）含有アダプター分子を担持するトランスポザーゼ二量体から構成される。本明細書で用いるＭＥおよびＭＥ’（それぞれモザイク末端およびモザイク末端プライム）は、Ｔｎ５トランスポザーゼが自発的に結合する二本鎖配列５’－ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＴＴ ＡＴＡ ＣＡＣ ＡＴＣ Ｔ－３’（配列番号７）を表すために用いられる。この配列は、例えばユニバーサルプライマー部位またはイルミナアダプターフラグメントなど、何れかのＤＮＡ配列に融合させることができる（例えば、図１３参照）。
【0240】
ストレプトアビジンビーズに、等モル比のイルミナｉ５およびｉ７ ＭＥアダプターを、ｍ６Ａ抗体と共に、全ローディング能の５％、１０％、２０％または４０％で負荷した（図１Ｇ）。ｉ７ ＭＥアダプターの配列は、以下の通りであった:
dｉ５ ＭＥアダプターの配列は以下の通りであった:
ＭＥ配列は太字で示し、ＮＮＮＮＮＮＮＮはバーコードを示す。
【0241】
ビーズ調製後、Superscript IV逆転写酵素を用いて、非修飾ＩＶＴ ＲＮＡおよびｍ６Ａ修飾ＩＶＴ ＲＮＡの混合物を逆転写した。その後、逆転写したＲＮＡサンプルを、ＭＥアダプターおよびｍ６Ａ抗体を共固定化したストレプトアビジンビーズを用いて免疫沈降させた。ビーズを洗浄した後、Ｔｎ５トランスポザーゼ（Diagenode, カタログ番号C01070010-10）を、結合バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）(ポリソルベート)－２０）中でＭＥアダプターに負荷した。Ｍｇ２＋含有タグメンテーションバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ ８．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％ ＤＭＦ）を加えると、捕捉したＤＮＡ－ＲＮＡ二重鎖にアダプターが挿入される。このフォーマットでは、タグメンテーション産物は確実にビーズ上に捕捉され、ギャップフィルＰＣＲ（０．５ｕＭフォワードプライマー、０．５ｕＭリバースプライマー、NEBNext Ultra II Q5 (カタログ番号M0544X, New England Biolabs）を１７－１９サイクル（７２℃で５分、９８℃で２分、９８℃で１０秒－６５℃で７５秒のサイクルをｎサイクル、および最終伸長は６５℃で５分）行った。ＤＮＡライブラリーの塩基配列を決定し、バーコードのデコンボリューションおよび配列アライメントを行った。
【0242】
カバレッジプロット（図２２Ｂ）は、ｍ６Ａ修飾ＲＮＡの選択的タグメンテーションを証明する、ｍ６Ａを含むフラグメントの有意な濃縮を示す。ＭＥアダプターを全結合能の５％または１０％でビーズに負荷すると、ＭＥ密度が高い場合よりも濃縮のシグナル対ノイズがわずかに向上し、ライブラリー調製収率も高くなった（データ示さず）。この実験は、ＭＥアダプターおよびｍ６Ａ抗体を共固定化したビーズを用いて、ｍ６Ａ修飾ＲＮＡを検出することが可能であることを示す。複数のＲＮＡ修飾を検出するには、それぞれ１種の抗体を示す複数のビーズタイプ、および抗体をコードするバーコードを有するＭＥアダプターを混合すればよい。
【0243】
実施例８：複数のｍ６Ａ修飾を有する長鎖ＲＮＡのリードフェージング
本実施例は、同じ種類の複数の修飾の位置をマークするためのベース編集工程を導入することで、実施例７を拡張したものである（図１０）。
本実施例は、同じ種類の複数の修飾の位置をマークするためのベース編集工程を導入することで、実施例７を拡張したものである（図１０）。
【0244】
全長ＲＮＡ鎖は逆転写され、ｍ６Ａ抗体およびビオチン標識ＭＥアダプターを提示するビーズで捕捉される。洗浄後、ＡＤＡＲ－プロテインＬコンジュゲートを導入する。プロテインＬはＩｇＧ抗体の軽鎖に特異的かつ高い親和性で結合する。ＡＤＡＲ酵素は二本鎖ＲＮＡと、Ａ＞Ｉ（イノシン）変異を有するＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二本鎖中のＤＮＡ鎖を編集する。ＡＤＡＲ－プロテインＬコンジュゲートの連結構造は、ＡＤＡＲ活性をｍ６Ａ修飾の直接近傍に限定するようなものである。ＡＤＡＲによって導入されたアデニンからイノシンへの変異（Ａ－ｔｏ－Ｉ）はｍ６Ａの位置を示す。塩基編集後、Ｔｎ５トランスポザーゼが表面に連結されたＭＥアダプターに結合することで、トランスポソームが構築される。転移タグ配列決定は、同じバーコードで同じ分子に由来するリードを識別し、短いシーケンスリードから長い転写産物を再構築することを可能にする（図１１）。
【0245】
実施例９：結合ドメイン選択
シュードウリジン、イノシン、ｍ５Ｃ、ｍ６Ａに特異的な結合ドメインは、バイオレイヤー干渉計（ＢＬＩ）で測定された結合速度（オンレート）および解離速度（オフレート）に基づいて選択された。最初に、市販の抗体のスクリーニングが行われた。その目的は、抗体のオンレート・オフレートを測定し、抗体の特性とバーコードアッセイでの性能との相関を調べることであった。
シュードウリジン、イノシン、ｍ５Ｃ、ｍ６Ａに特異的な結合ドメインは、バイオレイヤー干渉計（ＢＬＩ）で測定された結合速度（オンレート）および解離速度（オフレート）に基づいて選択された。最初に、市販の抗体のスクリーニングが行われた。その目的は、抗体のオンレート・オフレートを測定し、抗体の特性とバーコードアッセイでの性能との相関を調べることであった。
【0246】
ＢＬＩ装置（Gator Prime）にストレプトアビジンプローブ（カタログ番号160002、Gator Bio）を添加した。ｍ５Ｃ、イノシン、ｍ６Ａまたはシュードウリジン塩基を中心に有する５’ビオチン化ＲＮＡオリゴは、１：１の抗体：ＲＮＡ複合体の形成を確実にするため、疎な表面被覆で固定化した。塩基を修飾していないオリゴを陰性対照とした。抗体の１～２５０ｎＭ溶液にＢＬＩプローブを浸漬することにより、抗原のリアルタイムオンレートを得た。オフレートは、抗体を含まないＰＢＳ緩衝液にプローブを移動させることによって得た。同じ手順を修飾されていないＲＮＡ鎖で繰り返した。
【0247】
図１４Ａ－１４Ｇは、ｍ６Ａ、ｍ５Ｃ、イノシンおよびシュードウリジンに対するいくつかの市販抗体のオンレートおよびオフレートを示す（Ａｂ０２（ｍ６Ａ）＝ＭＡ５－３３０３０、Thermo Fisher；Ａｂ０５（ｍ６Ａ）＝３４５Ｅ１１、Synaptic Systems；Ａｂ０８（ｍ６Ａ）＝Ｒｂ２１２Ｂ１１、Synaptic Systems；Ａｂ０９（ｍ６Ａ）＝Ｃ１５２０００８２－５０、Diagenode；Ａｂ１０（イノシン）＝Ｃ１５２００２５１、Diagenode；Ａｂ１６（ｍ５Ｃ）＝ＭＡ５－２４６９４、Thermo Fisher；Ａｂ１９（シュードウリジン）＝Ｄ３４７－３、MBL）。特異的抗原結合のオンレートは１０４から１０５Ｍ－１ｓ－１であるのに対し、オフレートは１０－４から１０－２ｓ－１の間で変動が大きい。対応する解離定数ＫＤは３．５～１５０ｎＭである。一般的に、陰性オリゴ対照ではごくわずかな結合しか観察されず、標的特異性が確認された。ＥＬＩＳＡデータに基づくと、ほとんどの抗体は修飾されていないＲＮＡに弱く結合し、そのＫＤは特異的標的に対するそれよりも１００－５００倍大きい。
【0248】
図１４Ａ－１４Ｇに示された抗体はすべて、抗体を介したバーコーディングアッセイに有用であり（実施例６を参照）、この方法が様々な抗体特性に適合することを示している。ナノモル親和性の抗体は、ハイブリドーマ技術によって容易に入手可能であり、この方法の多様性を証明している。ＫＤ値が１５０ｎＭを超えると、ＲＮＡ標的の捕捉効率が低くなる。
【0249】
実施例１０：修飾核酸の免疫沈降およびバーコーディング用ビーズの調製
本実施例では、２種のＩｇＧ抗体を親和性結合でプロテインＧ磁性ビーズに負荷した。ある抗体は、あるタイプの核酸修飾に特異的に結合する。もう一方の抗体は核酸結合活性を有さないが、ＤＮＡアダプターで標識されている（レポーター抗体）（図１Ｅ）。アダプター設計の一部は、修飾バーコード（ＭＢＣ）である。以下の実施例では、核酸修飾は抗体介在反応でＭＢＣを標的核酸にトランスファーさせることで検出した。このビーズ構造、特にレポーター抗体の目的は、抗体を直接標識することなく、アダプターから標的核酸へのバーコードのトランスファーを顕著に容易にする空間的な方向でＤＮＡアダプターを提示することである（図１Ｅ参照）。各ビーズは“モノクローナル”であり、単ー一種の修飾特異的抗体およびユニークなＭＢＣを有する単一タイプのＲＥＰＡを含むように負荷された（図１５Ｃ）。
本実施例では、２種のＩｇＧ抗体を親和性結合でプロテインＧ磁性ビーズに負荷した。ある抗体は、あるタイプの核酸修飾に特異的に結合する。もう一方の抗体は核酸結合活性を有さないが、ＤＮＡアダプターで標識されている（レポーター抗体）（図１Ｅ）。アダプター設計の一部は、修飾バーコード（ＭＢＣ）である。以下の実施例では、核酸修飾は抗体介在反応でＭＢＣを標的核酸にトランスファーさせることで検出した。このビーズ構造、特にレポーター抗体の目的は、抗体を直接標識することなく、アダプターから標的核酸へのバーコードのトランスファーを顕著に容易にする空間的な方向でＤＮＡアダプターを提示することである（図１Ｅ参照）。各ビーズは“モノクローナル”であり、単ー一種の修飾特異的抗体およびユニークなＭＢＣを有する単一タイプのＲＥＰＡを含むように負荷された（図１５Ｃ）。
【0250】
レポーター抗体は、ｍＴＥＴ-ＰＥＧ５-ＮＨＳエステル（カタログ番号BP-22945、Broadpharm）。核酸結合活性を有さないＩｇＧ抗体であれば何れも使用可能であり、例えば、モノクローナル抗ウシ血清アルブミン抗体を用い得る（カタログ番号MA1-82941、Thermo Fisher）。ｍＴＥＴ-ＮＨＳエステルおよびレポーター抗体のカップリングは、最大１mgの抗体および３０ｍｏｌ等量のリンカーを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で行った。反応を２５℃で１２時間進行させ、得られた抗体－リンカー複合体を７ｋＤＡ ＭＷＣＯ Ｚｅｂａ脱塩カラムで精製した（カタログ番号89882、Thermo Fisher）で過剰のリンカーを除去した。別の反応において、アダプターＤＮＡオリゴ（例えば、/5AmMC6/T/iSp18//iSp18//AGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNCAGCTTTCACTCAGT、5AmMC6は５’アミノ修飾であり、iSp18はＰＥＧスペーサー（配列番号２３）である、Integrated DNA Technologies）を、トランス－シクロオクテン（ＴＣＯ）－ＰＥＧ４－ＮＨＳエステル（カタログ番号BP-22418、Broadpharm）、ＰＢＳ緩衝液中、２５℃、１２時間であった。最終生成物はアセトン沈殿で精製した。iSp18リンカーユニットは、空間的柔軟性およびリーチの両方を提供し、記載されたフォーマットでのバーコード化に必要である。最終的なアダプター標識レポーター抗体は、ｍＴＥＴ抗体を化学量論当量のＴＣＯと共にインキュベートすることで調製した。抗体はｍＴＥＴで高標識されているため、最終的な標識率は、定量的収率で反応するＴＣＯ標識アダプターのモル当量によって決定された。得られた抗体－オリゴ複合体のサイズを変性ＳＤＳゲル電気泳動で分析すると、標識化学量論がＴＣＯ－オリゴ過剰に比例して滴定することがわかる（図１５Ａ）。３．５倍モル過剰のＴＣＯ－オリゴは、プロテインＧの結合を阻害し得る過剰標識を防ぎながら、未修飾抗体の発生をなくすため理想的である。この手順により、ＩｇＧサブタイプおよびアダプター配列に関係なく、平均２－３個のアダプターを表示するレポーター抗体を作製した。
【0251】
標準的なバーコーディング反応では、２μＬのプロテインＧ ダイナビーズ（カタログ番号10004D、Thermo Fisher）に、修飾特異的抗体およびレポーター抗体を含む合計０．５ｕｇの混合物を負荷した。抗体はＰＢＳＴに室温で３０分間負荷し、余分な抗体はＰＢＳＴで３回洗浄して除去した。通常、核酸特異的抗体とレポーター抗体の５０：５０の混合物を用いた。比率を変えても、レポーター抗体の２０％から８０％の範囲では、バーコーディング特異性に大きな影響はないが、バーコーディングの収率は変わる。色素標識修飾ＲＮＡの捕捉、バーコード化、溶出、変性ゲル電気泳動で測定すると、バーコード化収率（バーコード化されたＲＮＡ分子を捕捉されたＲＮＡ分子で割った比率）は、レポーター抗体の表面密度が高くなるにつれて増加する（図１５Ｂ）。
【0252】
実施例１１：修飾塩基を真理モデルとしたインビトロ転写ＲＮＡの作製
本実施例では、修飾含量が既知のＲＮＡ標的の調製について説明する。得られた修飾ＲＮＡ標的は、下記のバーコーディング実験において真理セットとして用いた。
本実施例では、修飾含量が既知のＲＮＡ標的の調製について説明する。得られた修飾ＲＮＡ標的は、下記のバーコーディング実験において真理セットとして用いた。
【0253】
インビトロ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡは、HiScribe（商標）T7 High Yield RNA Synthesis キット（カタログ番号E2040S, New England Biolabs）のマニュアルに従った。ＩＶＴ反応に用いるテンプレートＤＮＡアンプリコンは、Ｔ７プロモーター配列を有するプライマーを用いてゲノムファージまたは細菌ＤＮＡの領域を増幅し、PureLink（商標）PCR Purification キット（カタログ番号K310001、Thermo Fisher）を用いてアンプリコンを精製することにより作製した。Ｔ７タグアンプリコン作製には以下のゲノムを用いた（New England Biolabs）：ΦＸ１７４ウイルスＤＮＡ（カタログ番号N3023S）、Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（カタログ番号N4040S）、ラムダＤＮＡ（カタログ番号N3011S）およびＦＬｕｃ対照プラスミド（カタログ番号E2040S）である。ＩＶＴ反応は、ＰＣＲアンプリコンを示すＴ７プロモーターをインプットとし、天然のＮＴＰの１０～５０％をメチルアデノシン－５’－三リン酸（ｍ６ＡＴＰ、カタログ番号N-1013-5、Trilink）、イノシン－５’－三リン酸（ＩＴＰ、カタログ番号N-1020、TriLink）、５－メチルシチジン－５’－三リン酸（ｍ５ＣＴＰ、カタログ番号N-1014、TriLink）またはシュードウリジン－５’－三リン酸（ＹＴＰ、カタログ番号N-1019、TriLink）などの修飾ＮＴＰで置換した。ＩＶＴ反応はＤＮＡｓｅ Ｉで処理した（カタログ番号M0303S, New England Biolabs）を用いてＤＮＡテンプレートを除去し、Monarch（登録商標）RNA Cleanup Columns（カタログ番号T2047L、New England Biolabs）を用いて精製した。
【0254】
この手順で、異なるゲノムに由来するＩＶＴ ＲＮＡからなるモデル標的プールを作製した。例えば、PhiX RNAは修飾されておらず、Fluc RNAはｍ６Ａを含み、M13mp18 RNAはｍ５Ｃを含み、Lambda RNAはイノシンを含んでいた。
【0255】
修飾がわかっているモデルＲＮＡプールをバーコーディング実験に用いて、塩基配列を決定した。バーコーディングの特異性は、免疫沈降したサンプルおよびバーコーディングしたサンプルのリードをアライメントし、正しい修飾バーコード（ＭＢＣ）を示すＲＮＡフラグメントの数を数え、結果を入力サンプルに対して正規化することによって決定される。
【0256】
実施例１２：ユニバーサルスペーサー配列の付加による下流修飾分析用ＲＮＡサンプルの調製
本実施例は、ＲＮＡ分子のプールにスペーサー配列を付加するプロトコールを提供する。プロキシミティ・エンコーディング（proximity encoding）の間、スペーサーはビーズアンカー型アダプターのスペーサー’相補体に結合し、ＤＮＡポリメラーゼ（図２Ｄ）または逆転写酵素（図２Ｇ）によって伸長される。
本実施例は、ＲＮＡ分子のプールにスペーサー配列を付加するプロトコールを提供する。プロキシミティ・エンコーディング（proximity encoding）の間、スペーサーはビーズアンカー型アダプターのスペーサー’相補体に結合し、ＤＮＡポリメラーゼ（図２Ｄ）または逆転写酵素（図２Ｇ）によって伸長される。
【0257】
ＲＮＡは、１Ｘ Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼＩ緩衝液（New England Biolabs）で９０℃、８－２５分間インキュベートしてフラグメント化した。この処理により、フラグメントのピークサイズは６０－１５０塩基となった。その後、ＲＮＡの３’末端をＲＮａｓｅ阻害剤（カタログ番号AM2694, Thermo Fisher）存在下で、３７℃で３０分間、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（カタログ番号T4PK-200、MCLab）の添加により脱リン酸化した。ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によるプライマー伸長によって、スペーサーをライゲーションしてＲＮＡをバーコード化する。０．３ユニット／ｕＬ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩ、１０ｕＭスペーサー（/5Phos/NNACTGAGTG）、１Ｘ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼＩバッファー、１ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭ ＤＴＴ、１５％ ＰＥＧ－８０００、０．２ユニット/ｕＬ ＲＮアーゼ阻害剤を含む反応において、２０℃にて１時間、スペーサーを結合させた。スペーサーをライゲーションしたＲＮＡは、１Ｘ ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰビーズ（カタログ番号A63987、Beckman Coulter）で精製した後、バーコーディングアッセイに用いる準備をした。図１６は、１．５ｋｂのＩＶＴ ＲＮＡフラグメントの混合物をフラグメント化した後、スペーサーをライゲーションして得られたフラグメントサイズを示す。スペーサーの添加により、見かけのフラグメントサイズは１０４ｎｔから１０９ｎｔに増加した。
【0258】
実施例１３：逆転写によるコード化、テンプレートスイッチングおよびプロテインＧビーズを用いたｍ６Ａ、イノシンおよびｍ５Ｃの多重検出
本実施例では、ＲＮＡ修飾を検出するためのバーコーディング工程を統合した、エンドトゥエンド（end-to-end）のライブラリー調製ワークフローについて説明する。バーコーディングは、逆転写酵素を用いたＲＮＡ標的およびアダプターの双方向伸長によって達成される（図１７Ａ）。
本実施例では、ＲＮＡ修飾を検出するためのバーコーディング工程を統合した、エンドトゥエンド（end-to-end）のライブラリー調製ワークフローについて説明する。バーコーディングは、逆転写酵素を用いたＲＮＡ標的およびアダプターの双方向伸長によって達成される（図１７Ａ）。
【0259】
ＲＮＡサンプル中のｍ５Ｃ、ｍ６Ａおよびイノシンを検出するには、最低３種のビーズが必要であり、実施例１０に従って調製する。第１のビーズタイプは抗ｍ６Ａ（カタログ番号345E11、Synaptic Systems）およびＭＢＣ－３
を含むアダプターに結合したレポーター抗体を提示する。第２のビーズタイプは抗イノシン作用（カタログ番号C15200251、Diagenode）およびＭＢＣ－４
を含むアダプターに結合したレポーター抗体を示す。第３のビーズタイプは抗ｍ５Ｃ抗体（カタログ番号MA5-24694、Thermo Fisher）およびＭＢＣ－５
を含むアダプターを有するレポーター抗体である。
【0260】
アダプターには、スペーサー’配列(３’末端の太字）、ＭＢＣ（下線）、ＵＭＩ（ＮＮＮ)およびｉ７イルミナアダプター（ＵＭＩの５’配列）が含まれた。
【0261】
サンプルごとに、等容量の各負荷したビーズタイプを組み合わせた。最初のアッセイ工程は、実施例４に従って調製したスペーサー結合ＲＮＡの免疫沈降（ＩＰ）であった。ビーズプール、０．５～５０ｎｇのＲＮＡ、１０ユニット/ｕＬのＲＮａｓｅ阻害剤を１ＸＰＢＳＴ中でインキュベートした。インキュベーション後、ビーズをＰＢＳＴバッファーで洗浄し、１Ｘ Superscript IV逆転写バッファー（カタログ番号18090050、Thermo Fisher）に再懸濁した。洗浄によって非特異的に結合したＲＮＡは除去され、特異的なＲＮＡ修飾－抗体複合体は保存された。次の工程では、ｉ７アダプターおよびユニバーサルｉ５アダプターを含むＭＢＣを標的ＲＮＡに加えた。この工程では、逆転写酵素がＲＮＡ標的の３’末端を伸長してＭＢＣおよびｉ７アダプターをコピーし、同時にアダプターの３’末端を伸長してｃＤＮＡを合成する。テンプレートのスイッチには、Ｍ－ＭＬＶ変異体のSuperscript IIまたはIV（カタログ番号18064014 または 18090200, Thermo Fisher）、マキシマＨマイナス（カタログ番号EP0751、Thermo Fisher）またはSmartscribe逆転写酵素（カタログ番号18064014、Takara Bio）などの、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性を有する逆転写酵素が必要であった。ＴｄＴ活性はＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖の末端にＣ－テールを付加し、イルミナｉ５アダプターを含み、３つのＧ塩基で終わるテンプレートスイッチングオリゴ（ＴＳＯ）の結合およびコピーを可能にする。
【0262】
ＩＰビーズを逆転写反応（１Ｘ ＳＳＩＶ緩衝液、０．５ｕ／ｕＬ Superase-In、５ｕ／ｕＬ ＳＳＩＶ逆転写酵素、１ｍＭ ｄＮＴＰ、２ｕＭテンプレートスイッチングオリゴ“ＴＳＯ”）に加え、２３℃にて１５分間、次いで５０℃にて６０分間インキュベートした。ＴＳＯのいくつかのバージョンは、例えば、ＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴｒＧｒＧ＋Ｇ（ｒＧは、ｒｉｂｏＧであり、＋ＧはＬＮＡ－Ｇである）（配列番号２８）、ＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴｒＧｒＧｒＧ（配列番号２９）、または
のように、良好に機能した。反応完了後、上清を標準的なIlluminaインデックスプライマー（０．５ｕＭフォワードプライマー、０．５ｕＭリバースプライマー、NEBNext Ultra II Q5（カタログ番号M0544X, New England Biolabs）を１０～１３サイクル行った（９８℃で３０秒、９８℃で１０秒、６５℃で７５秒、および６５℃で５分をｎサイクル）。
【0263】
ライブラリーの塩基配列が決定され、各ＲＮＡフラグメントに付加されたＭＢＣのバイオインフォマティックなデコンボリューションにより、ＲＮＡ修飾が同定され、特定の遺伝子座に局在した。図１７Ｂは、５ｎｇのプールされたＩＶＴをインプットとして、およびSuperScript IV逆転写酵素を使用した、記載したバーコード法で得られた配列決定結果を示す。図１７Ｃは、エンコーディングにMaxima Minus逆転写酵素を用いた同じ結果を示す。この実施例では、ＩＶＴ ＲＮＡプールは７０％の非修飾ＰｈｉＸ ＲＮＡ、１０％のｍ６Ａ修飾ＦＬｕｃ－ＲＮＡ、１０％のイノシン修飾Ｌａｍｂｄａ ＲＮＡ、１０％のｍ５Ｃ修飾Ｍ１３ ＲＮＡから構成されていた。このプロットは、各ＭＢＣのほとんどが正しいゲノムに結合していることを示しており、SuperScript IVデータセットはより良いシグナル対ノイズ比を示した。
【0264】
実施例１４：エンコード用ＤＮＡポリメラーゼを用いたｍ６Ａ、イノシンおよびｍ５Ｃの多重検出
本実施例では、プライマー伸長によるバーコーディングの異なるバージョンについて説明し、テンプレートスイッチングによるライブラリー調製に代わる方法を提供する。逆転写によるバーコーディングと同様に、このワークフローでは、上流のＲＮＡプールにスペーサー配列をライゲーションする必要がある。スペーサー伸長ＲＮＡを免疫沈降させた後、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow fragment exo-）を用いて、上鎖のプライマー伸長により標的ＲＮＡにバーコードを付加した（図１９Ａ）。
本実施例では、プライマー伸長によるバーコーディングの異なるバージョンについて説明し、テンプレートスイッチングによるライブラリー調製に代わる方法を提供する。逆転写によるバーコーディングと同様に、このワークフローでは、上流のＲＮＡプールにスペーサー配列をライゲーションする必要がある。スペーサー伸長ＲＮＡを免疫沈降させた後、ＤＮＡポリメラーゼ（Klenow fragment exo-）を用いて、上鎖のプライマー伸長により標的ＲＮＡにバーコードを付加した（図１９Ａ）。
【0265】
ＲＮＡサンプル中のｍ５Ｃ、ｍ６Ａおよびイノシンを検出するために、実施例１０に記載のように３種のビーズを調製した。しかしながら、この実施例では、アダプター配列の３’末端は、例えば/3SpC3/（Integrated DNA Technologiesによる命名法を参照）によって伸長が阻止された。ビーズローディングおよびＩＰは、実施例１３で説明したのと同じプロトコールに従った。ＩＰ洗浄後、捕捉したＲＮＡを示すビーズを１Ｘ Klenowバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．９、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Tween（登録商標）－２０）に再懸濁し、同量のバーコーディングミックス（２００ｕＭ ｄＮＴＰ、０．５ユニット／ｕＬ Klenow フラグメント エキソ－ （カタログ番号KPIM-200、MCLAB）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．９、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Tween（登録商標）－２０）を添加した。クレノウ（Klenow）反応を室温にて５分間行った。バーコード化ＲＮＡは、５ｍＭ ＤＴＴおよび１ｍＭ ＥＤＴＡを添加した水中で３７℃にて５分間インキュベートすることによりビーズから溶出した。溶出したＲＮＡを、ｉ５アダプター（２ｕＭ Ｉ５ ＲＮＡアダプター(/5SpC3/rCrUrArCrArCrGrArCrGrCrUrCrUrUrCrCrGrArUrCrU)(配列番号３１）、１ＸＴ４ ＲＮＡリガーゼバッファー、１ｍＭ ＡＴＰ、１０％ ＰＥＧ－８０００、０．５ｕ／ｕＬ Superase-in、１ｕ／ｕＬ Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、１ｕ／ｕＬ Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ１）を添加し、室温にて１時間インキュベートした。３Ｘアンピュア（Ampure）ビーズで洗浄した後、アダプターをライゲーションしたＲＮＡを５５℃にて１０分間逆転写した（１ｕＭ ｃＤＮＡプライマー（ＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧ）（配列番号３２）、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、１Ｘ ＳＳＩＶバッファー、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｕ／ｕＬ ＲＮＡｓｅＯＵＴ、１０ｕ／ｕＬ SuperScript IV逆転写酵素）。要すれば、この時点でｃＤＮＡをＮａＯＨ処理し、中和し、そして３Ｘ Ampureビーズで洗浄してもよいし、インデックスＰＣＲ（ｃＤＮＡ、０．５ｕＭフォワードプライマー、０．５ｕＭリバースプライマー、NEBNext Ultra II Q5）のインプットとしてそのまま１０～１３サイクル(９８℃で３０秒間、次いで９８℃で１０秒間、６５℃で７５秒間、および６５℃で５分間のサイクルをｎサイクル繰り返す）を使用してもよい。
【0266】
このワークフローを用いて、ＢＬＩで特徴付けられた抗体をシングルプレックス実験でスクリーニングした（実施例９および図１４Ａ－１４Ｇ）。すなわち、修飾特異的抗体およびレポーター抗体を負荷した１種のビーズを、ｍ６Ａ修飾Ｆｌｕｃ ＲＮＡ、イノシン修飾Ｌａｍｂｄａ ＲＮＡおよび５Ｃ標識Ｍ１３ ＲＮＡ、ならびに場合によっては非修飾ＰｈｉＸ ＲＮＡを含むＩＶＴ ＲＮＡプールに暴露する。各抗体について、配列決定解析に基づくと、ＭＢＣの少なくとも８０％が正しいゲノムと関連していた（図１８Ａ－１８Ｇ）。３プレックス反応（図１９Ａ）で３種のビーズを組み合わせると、対応するシングルプレックス反応（図１９Ｂ）に比べてバックグラウンドがわずかに上昇するが、同様の結果が得られた。
【0267】
実施例１５：実施例15：コード化のためのスプリントライゲーションを用いたｍ６Ａおよびｍ５Ｃの同時検出
本実施例は、プライマー伸長ではなく、酵素的ライゲーションによって修飾特異的バーコードを導入する。具体的には、この実施例は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって触媒されるＤＮＡスプリントライゲーションを用いる（図２０Ａ）。
本実施例は、プライマー伸長ではなく、酵素的ライゲーションによって修飾特異的バーコードを導入する。具体的には、この実施例は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによって触媒されるＤＮＡスプリントライゲーションを用いる（図２０Ａ）。
【0268】
この実施例では、アダプターを３’－アミン基を介してレポーター抗体に結合させ、ライゲーションのために５’-リン酸を示した（実施例１０参照）。さらに、必要に応じてアダプター鎖を切断できるようにウラシル塩基を導入した。 （ＭＢＣ３：/5Phos/CAGCTTTNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCT/ideoxyU/ATATATA/iSp18//iSp18//iSp18//iSp18/T/3AmMO/（配列番号３３）；および、ＭＢＣ４：/5Phos/CCTATATNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTTAATATTTAATAT/ideoxyU/ATATAT/iSp18//iSp18//iSp18//iSp18/T/3AmMO/）（配列番号３４）。
【0269】
１つはＭＢＣ３およびＡｂ０５を有するレポーター抗体（ｍ６Ａ）と、もう１つはＭＢＣ４およびＡｂ１６を有するレポーター抗体（ｍ５Ｃ）の２種のビーズを調製した。スペーサー修飾ＲＮＡサンプルのＩＰは上記のように行った。スプリントオリゴヌクレオチドの混合物を含むライゲーションミックスにＲＮＡを負荷し、洗浄したビーズを添加して、バーコード化を誘導した。スプリントは、片側が標的ＲＮＡのスペーサー領域にハイブリダイズし、もう片側がアダプターの７ｎｔ長のＭＢＣ３またはＭＢＣ４に相補的になるように設計した。スプリントの１セットはスペーサー領域の６塩基（AAAGCTGCACTCA/3SpC3/ (7-6 MBC3) (配列番号１８）およびATATAGGCACTCA/3SpC3/ (7-6 MBC4) (配列番号１９））にハイブリダイズし、もう１セットはスペーサー領域の３塩基（AAAGCTGCAC/3SpC3/ (7-3 MBC3) (配列番号２０）および ATATAGGCAC/3SpC3/ (7-3 MBC4) (配列番号２１））に結合する。スプリントの両側、ユニバーサルスペーサーおよびアダプターの相補体の長さおよび配列は、近接ライゲーションによるコード化を確実にするために、抗体による修飾認識以外の機構による結合安定化を阻止するように調整された。エンコーディングのためにプライマー伸長に依存するワークフローでは、スペーサーおよびスペーサー補体はＩＰ工程中に存在した（すなわち、図１７Ａおよび図１９Ａに示す）が、このプロトコールではＩＰ後にスプリントを追加し、核酸ハイブリダイゼーションとＩＰを区別した。ｍ６Ａおよびｍ５Ｃを同時に検出するために、ライゲーションミックスは０．５ｕＭのＭＢＣ３およびＭＢＣ４スプリント、１０ユニット／ｕＬのＴ４ ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＡＴＰ、１０％のＰＥＧ８０００が含まれた。アダプターライゲーション完了後、ｉ７アダプターをプライミングし、次いで実施例１３に記載したように、テンプレートのスイッチングを伴う逆転写およびＰＣＲ増幅を行った。ライブラリーの塩基配列を決定し、各ＲＮＡフラグメントに付加されたＭＢＣをバイオインフォマティックにデコンボリューションすることによって、ＲＮＡ修飾を同定し、特定の遺伝子座に局在させた（図２０Ｂおよび２０Ｃ）。このワークフローは、逆転写によるコード化で報告されているのと同様の特異性で、ｍ６Ａおよびｍ５Ｃを検出できた（実施例１３）。
【0270】
実施例１６：Ａ－テーリングおよびエンコーディング例
本実施例では、プライマー伸長によるコード化のためのユニバーサル配列が、ＲＮＡの３’末端のＡ－テーリングによって導入され（図２１Ａ）、その結果、一本鎖スペーサーライゲーション（実施例１２）の必要性がなくなった。Ａ－テーリング反応は、一本鎖ライゲーションよりも収率が高く、不偏的であることが知られており、トランスクリプトームカバレッジを向上させるという意味で、アッセイ感度に有利である。
本実施例では、プライマー伸長によるコード化のためのユニバーサル配列が、ＲＮＡの３’末端のＡ－テーリングによって導入され（図２１Ａ）、その結果、一本鎖スペーサーライゲーション（実施例１２）の必要性がなくなった。Ａ－テーリング反応は、一本鎖ライゲーションよりも収率が高く、不偏的であることが知られており、トランスクリプトームカバレッジを向上させるという意味で、アッセイ感度に有利である。
【0271】
１．５ｋｂのＩＶＴ ＲＮＡを、１Ｘ Ｔ４ ＲＮＡ リガーゼ Ｉバッファー（New England Biolabs）で９０℃にて２０分間インキュベートして１５０塩基にフラグメント化した。ＲＮＡの３’末端は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（カタログ番号T4PK-200、MCLab）存在下、ＲＮａｓｅ阻害剤（カタログ番号AM2694, Thermo Fisher）を３７℃にて３０分間添加して脱リン酸化した。反応液に５ユニットの大腸菌ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（カタログ番号M0276L, New England Biolabs）、０．９５ｍＭ ＡＴＰ、０．０５ｍＭ ｄＡＴＰ、１Ｘ 大腸菌ポリ（Ａ） ポリメラーゼ緩衝液を加え、３７℃にて１０分間インキュベートした。Ａ-テール化 ＲＮＡを１．８倍量のRNAClean ＸＰビーズで精製した。
【0272】
ＲＮＡサンプル中のｍ６Ａを検出するために、Ａｂ０５（ｍ６Ａ）およびｍ６Ａ（ＭＢＣ０００）を識別するバーコードを含むアダプターに結合したレポーター抗体
を提示するビーズを調製した。アダプター構造は、Ａ－テール ＲＮＡにハイブリダイズするポリ（ｄＴ）配列、ＭＢＣ（下線部）、ＵＭＩ（ＮＮＮＮＮＮＮＮ）、ｉ７イルミナアダプター（ＵＭＩの５’配列）を含む。
【0273】
各サンプルについて、ビーズを負荷し、実施例１３と同じ方法でＡ－テール化ＲＮＡフラグメントのＩＰを行った。簡潔には、ビーズ、０．０５～５０ｎｇのＲＮＡ、１０ユニット／ｕＬのＲＮａｓｅ阻害剤を１Ｘ ＰＢＳＴ中でインキュベートした。インキュベーション後、ビーズを洗浄し、固定化したイルミナｉ７アダプターの伸長によって逆転写した。ＴＳＯによるテンプレートスイッチングにより、ＰＣＲ増幅および配列決定に必要なイルミナｉ５アダプターが導入された。反応終了後、上清を、標準的なイルミナインデックスプライマー（１ｕＭフォワードプライマー、１ｕＭリバースプライマー、NEBNext Ultra II Q5（カタログ番号M0544X, New England Biolabs）を用いてＰＣＲを１０～１３サイクル行った（９８℃で３０秒、次いで９８℃で１０秒、６５℃で７５秒および最終に伸長を６５℃で５分間のサイクルをｎサイクル）。ライブラリーの塩基配列が決定され、各ＲＮＡフラグメントに付加されたＭＢＣのバイオインフォマティックなデコンボリューションにより、ＲＮＡ修飾が同定され、特定の遺伝子座に局在した。
【0274】
図２１Ｂは、０．５ｎｇのプールされたＩＶＴをインプットとして用いて、記載したバーコーディング法で得られた配列決定結果を示す。この実施例では、ＩＶＴ ＲＮＡプールは７０％の非修飾ＰｈｉＸ ＲＮＡ、１０％のｍ６Ａ修飾ＦＬｕｃ－ＲＮＡ、１０％のイノシン修飾Ｌａｍｂｄａ ＲＮＡ、１０％のｍ５Ｃ修飾Ｍ１３ ＲＮＡから構成されていた。プロットは、ＭＢＣが正しいゲノムと関連していることを示す。
【0275】
実施例１７：逆転写によるコード化、テンプレートスイッチング、ストレプトアビジンビーズを用いたｍＲＮＡ中のｍ６Ａ、イノシンおよびｍ５Ｃの多重検出
本実施例では、ヒト肺がん不死化細胞株（Ａ５４９、カタログ番号６３６１４１、Takara）由来のｍＲＮＡ濃縮サンプル中のＲＮＡ修飾を検出するための、統合バーコード化工程を含むエンドトゥエンド（end-to-end）のライブラリー調製ワークフローについて説明する。バーコーディングは、逆転写酵素を用いたＲＮＡ標的およびアダプターの双方向伸長によって達成される（図１７Ａ）。
本実施例では、ヒト肺がん不死化細胞株（Ａ５４９、カタログ番号６３６１４１、Takara）由来のｍＲＮＡ濃縮サンプル中のＲＮＡ修飾を検出するための、統合バーコード化工程を含むエンドトゥエンド（end-to-end）のライブラリー調製ワークフローについて説明する。バーコーディングは、逆転写酵素を用いたＲＮＡ標的およびアダプターの双方向伸長によって達成される（図１７Ａ）。
【0276】
ＲＮＡサンプル中のｍ５Ｃ、ｍ６Ａおよびイノシンを検出するには、最低３種のビーズが必要である。ビオチン化アダプターおよびプロテインＧをストレプトアビジンコートしたビーズ（カタログ番号６５３０５、Thermo Fisher）、次いで修飾特異的抗体をアフィニティー結合させた（図１Ｄ）。第１のビーズタイプは抗ｍ６Ａ（カタログ番号MA5-3303、Thermo Fisher）およびＭＢＣ－１１１
を含むアダプターを提示する。第２のビーズタイプは抗イノシン（カタログ番号PM098、MBL）およびＭＢＣ－１１２
を含むアダプターを示した。第３のビーズタイプは抗ｍ５Ｃ（カタログ番号MA5-24694、Thermo Fisher）およびＭＢＣ－１１３
を含むアダプターを特徴付けた。
を含むアダプターを提示する。第２のビーズタイプは抗イノシン（カタログ番号PM098、MBL）およびＭＢＣ－１１２
を含むアダプターを示した。第３のビーズタイプは抗ｍ５Ｃ（カタログ番号MA5-24694、Thermo Fisher）およびＭＢＣ－１１３
を含むアダプターを特徴付けた。
【0277】
アダプターには、スペーサー配列（３’末端の太字）、ＭＢＣ（下線）、ＵＭＩ（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ）、ｉ５イルミナアダプター（ＵＭＩの５’側の配列）が含まれた。
【0278】
サンプルごとに、等量の各ビーズを組み合わせてＩＰの基質とした。最初のアッセイ工程は、実施例１２に従って調製したスペーサーライゲーションＲＮＡのＩＰである。ビーズプールを１０ｕＬの５０ｎｇのＲＮＡおよび１０ユニット／ｕＬのＲＮａｓｅ阻害剤と共に１ＸＴＢＳＴ中で混合し、３０分間インキュベートする。インキュベーション後、ビーズを１ＸＴＢＳＴバッファーで洗浄し、１Ｘ Superscript IV逆転写バッファー（カタログ番号18090050, Thermo Fisher）に再懸濁した。洗浄により非特異的に結合したＲＮＡを除去し、特異的ＲＮＡ修飾－抗体複合体を保持した。逆転写酵素はＲＮＡ標的の３’末端を伸長し、それによってＭＢＣおよびｉ５アダプターをコピーし、同時にアダプターの３’末端を伸長してｃＤＮＡを合成した。
【0279】
ＩＰビーズを逆転写反応（１Ｘ Superscript IVバッファー、０．５ｕ／ｕＬ Superase-In、５ｕ／ｕＬ Superscript IV逆転写酵素、１ｍＭ ｄＮＴＰ、２ｕＭテンプレートスイッチングオリゴ、“ＴＳＯ”（AGACGTGTGCTCTTCCGATCTrGrGrG)（配列番号９）に加え、２３℃にて１５分間、次いで５０℃にて６０分間インキュベートした。反応終了後、ビーズを１ＸＴＢＳＴで洗浄し、０．１Ｎ ＮａＯＨで変性させてＲＮＡを除去し、さらに１ＸＴＢＳＴで洗浄して中和した。ビーズに付着させたｃＤＮＡを、標準的なイルミナインデックスプライマー（０．５ｕＭフォワードプライマー、０．５ｕＭリバースプライマー、NEBNext Ultra II Q5 （カタログ番号M0544X、New England Biolabs)）を含む反応混合物にビーズを直接加えて、１７～１９サイクル（９８℃で３０秒、その後９８℃で１０秒、６５℃で７５秒および６５℃で５分のサイクルをｎサイクル）でＰＣＲ増幅した。
【0280】
ライブラリーをイルミナシーケンサーで配列決定し、各ＲＮＡフラグメントに付加されたＭＢＣのバイオインフォマティックデコンボリューションにより、ＲＮＡ修飾を同定し、特定の遺伝子座に局在させた。図２３Ａは、ＩＰ ＲＮＡのテクニカルトリプリケートおよび非濃縮（インプット）サンプルのグローバルバーコード表示を示す。ｍＲＮＡのｍ６Ａ修飾は、イノシンまたはｍ５Ｃよりも５－１０倍頻繁に起こることが知られているため、予想通り、ＩＰサンプルはＭＢＣ１１１リードの濃縮を示す。リードをアライメントし、各バーコードのリードのスタックアップをＩＰサンプルと入力サンプルで比較し、ＭＡＣＳ２でピークをコールした。図２３Ｂに遺伝子内のコールされたピークの位置を示す。MＢＣ１１１－ｍ６Ａのピークコールが３’末端側にシフトしているのは、ｍ６Ａの修飾が３’ＵＴＲ（非翻訳領域）側に起こるという既知のバイアスと一致する。図２３Ｃは、各修飾および各複製サンプルについてコールされたピークの数をベン図で示したものである。信頼度の高いピークの数、すなわち３つの複製すべてに出現したピークの数は、ｍ６Ａで６，８０５、イノシンで７７３、ｍ５Ｃで２７４１であり、これは他の方法で報告されたこれらの修飾の修飾部位の数と一致している。
【0281】
実施例１８：抗体－プロテインＡ－Ｔｎ５複合体を用いたｍ６Ａの検出
本実施例では、ｍ６Ａ修飾部位に特異的なＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二重鎖のタグメンテーションのための、抗体およびプロテインＡ－Ｔｎ５融合タンパク質を含む固定化コンジュゲートの使用について説明する（図１Ｈ）。タグメンテーション反応は、ＲＮＡ修飾を識別するバーコードを導入する。このフォーマットの利点は、トランスポザーゼが抗体と直接結合しているため、タグメンテーション活性がＲＮＡ修飾部位に限定されることである。
本実施例では、ｍ６Ａ修飾部位に特異的なＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二重鎖のタグメンテーションのための、抗体およびプロテインＡ－Ｔｎ５融合タンパク質を含む固定化コンジュゲートの使用について説明する（図１Ｈ）。タグメンテーション反応は、ＲＮＡ修飾を識別するバーコードを導入する。このフォーマットの利点は、トランスポザーゼが抗体と直接結合しているため、タグメンテーション活性がＲＮＡ修飾部位に限定されることである。
【0282】
ｍ６Ａ特異的ビーズは、ｍ６Ａ抗体およびプロテインＡ－Ｔｎ５分子を含むコンジュゲートを形成することにより調製した（Diagnode, カタログ番号C01070002）を溶液に溶解し、プロテインＧビーズに固定化した（図１Ｈおよび２４Ａ）。プロテインＧと同様に、プロテインＡも抗体のＦｃ領域と強く結合するため、Ｔｎ５はｍ６Ａ抗体結合ポケットに直接近接してビーズ上に固定化される。各Ｔｎ５ダイマーには、ｍ６Ａを示すバーコードを含む一対のモザイク末端（ＭＥ）アダプターが負荷された（Ｉ７ ＭＥアダプター）：５’Phos- CTGTCTCTTATACACATCT (配列番号１６）をCAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-NNNNNNNN-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG (配列番号３９）にハイブリダイズさせた；i5 MEアダプター:5'Phos- CTGTCTCTTATACACATCT (配列番号１６）をAATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-NNNNNNNN-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG (配列番号４０）にハイブリダイズさせた。
【0283】
まず、Superscript IV逆転写酵素およびポリ－ｄＴオリゴプライマーを用いて、非修飾IVT RNAおよびｍ６Ａ修飾Ａ－テール化 ＩＶＴ ＲＮＡ（実施例１１参照）の混合物を含むＲＮＡを逆転写した。次に、ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二重鎖をＩＰバッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１Ｍ ＥＤＴＡ、０．０５％ Tween（登録商標）-20）中のビーズに加え、３０分間免疫沈降（ＩＰ）させた。この工程で、ｍ６Ａ抗体はｍ６Ａ修飾ＲＮＡに選択的に結合した。ビーズを洗浄し、Ｍｇ２＋含有タグメンテーションバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８．５, ５ｍＭ ＭｇＣｌ２, １０％ ＤＭＦ）を加えてタグメンテーション反応を開始した。タグメンテーションされたＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二重鎖をギャップ充填し、標準的なイルミナインデックスプライマーまたはライブラリー増幅プライマー（０．５ｕＭフォワードプライマー、０．５ｕＭリバースプライマー、NEBNext Ultra II Q5（カタログ番号M0544X、New England Biolabs）を含む反応混合物を用いて１７～１９サイクル（７２℃で５分、９８℃で２分、その後９８℃で１０秒、６５℃で７５秒のサイクルをｎサイクル、最終伸長６５℃で５分）でＰＣＲ増幅させた。ライブラリーはIlluminaシークエンサーで配列決定され、ＲＮＡ修飾は、各ＲＮＡフラグメントに付加されたバーコードのバイオインフォマティックデコンボリューションによって同定され、特定の遺伝子座に局在した。
【0284】
図２４Ｂは、インプット（対照）および免疫沈降サンプルのリードカバレッジプロットを比較したものである。ｍ６Ａ修飾領域は、免疫沈降されたサンプルにおいて顕著なリードの濃縮を示すが、他の領域はＲＮＡインプットと比較して枯渇している。最適なプロテインＡ－Ｔｎ５の負荷比率を決定するため、抗体に対して２倍、４倍、８倍過剰のプロテインＡ－Ｔｎ５を用いて実験を行った。すべての条件でｍ６Ａの特異的濃縮が見られたが、プロテインＡ－Ｔｎ５比が高くなると特異性が改善されることなくライブラリー収量に悪影響が出たため、プロテインＡ－Ｔｎ５の２－４倍過剰が理想的であると結論した。これらの実験から、抗体－ｐＡ－Ｔｎ５複合体によるＩＰとタグメンテーションの組み合わせは、複合体ＲＮＡプール中のｍ６Ａを検出するのに効果的であることが証明された。
【0285】
本開示の主題は、特徴の様々な組み合わせおよびサブ組み合わせを含む特定の例示的な態様を参照してかなり詳細に説明および示されてきたが、当業者であれば、本開示の範囲内に包含されるものとして、他の態様ならびにその変形および変更を容易に理解するであろう。さらに、このような態様、組合せ、およびサブ組合せの記載は、特許請求される主題が、特許請求の範囲に明示的に記載された特徴以外の特徴または特徴の組合せを必要とすることを伝えることを意図するものではない。したがって、本開示の範囲は、以下の添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に包含されるすべての修正および変形を含むことを意図している。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5】
【図6-1】
【図6-2】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【図11】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図14-3】
【図14-4】
【図15-1】
【図15-2】
【図16】
【図17-1】
【図17-2】
【図17-3】
【図18-1】
【図18-2】
【図18-3】
【図18-4】
【図18-5】
【図18-6】
【図18-7】
【図19-1】
【図19-2】
【図20-1】
【図20-2】
【図20-3】
【図21-1】
【図21-2】
【図22-1】
【図22-2】
【図23-1】
【図23-2】
【図23-3】
【図23-4】
【図23-5】
【図24-1】
【図24-2】
【配列表】
【国際調査報告】