(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-08
(54)【発明の名称】新規特異的アンタゴニスト抗ＳＩＲＰｇ抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/00 20060101AFI20241031BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20241031BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20241031BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20241031BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20241031BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20241031BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20241031BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20241031BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20241031BHJP
A61P 1/00 20060101ALI20241031BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20241031BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20241031BHJP
C12P 21/08 20060101ALN20241031BHJP
【ＦＩ】
C07K16/00 ZNA
C12N15/13
A61K39/395 N
A61K48/00
A61P37/02
A61P37/06
A61P29/00
A61P9/00
A61P1/04
A61P1/00
A61P25/00
A61P43/00 121
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024531682
(86)(22)【出願日】2022-11-29
(85)【翻訳文提出日】2024-07-26
(86)【国際出願番号】 EP2022083693
(87)【国際公開番号】W WO2023094698
(87)【国際公開日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】21306660.8
(32)【優先日】2021-11-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517118478
【氏名又は名称】オーエスイー・イミュノセラピューティクス
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】リシア・ベラリフ
(72)【発明者】
【氏名】アリアヌ・ドゥセル
(72)【発明者】
【氏名】カロリーヌ・マリー
(72)【発明者】
【氏名】ニコラ・ポワリエ
(72)【発明者】
【氏名】ヴィルジニー・テプニエ
【テーマコード（参考）】
4B064
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG26
4B064AG27
4B064CA19
4C084AA13
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZA011
4C084ZA361
4C084ZA661
4C084ZA681
4C084ZB021
4C084ZB022
4C084ZB081
4C084ZB082
4C084ZB111
4C084ZB322
4C084ZC542
4C084ZC75
4C085AA14
4C085BB11
4C085EE01
4C085EE03
4H045AA11
4H045CA40
4H045DA75
4H045DA76
4H045EA22
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は免疫療法の分野に関する。本発明は、新規特異的抗SIRPg抗体およびその治療的使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒトSIRPgに特異的に結合する抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントであって：a) 配列番号23のVLCDR1、配列番号24のVLCDR2、および配列番号25のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号26のVHCDR1、配列番号27のVHCDR2、および配列番号28のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
b) 配列番号29のVLCDR1、配列番号30のVLCDR2、および配列番号31のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号32のVHCDR1、配列番号33のVHCDR2、および配列番号34のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
c) 配列番号35のVLCDR1、配列番号36のVLCDR2、および配列番号37のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号38のVHCDR1、配列番号39のVHCDR2、および配列番号40のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
d) 配列番号41のVLCDR1、配列番号42のVLCDR2、および配列番号43のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号44のVHCDR1、配列番号45のVHCDR2、および配列番号46のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、または
e) 配列番号47のVLCDR1、配列番号48のVLCDR2、および配列番号49のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号50のVHCDR1、配列番号51のVHCDR2、および配列番号52のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン
を含む、抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項2】
配列番号1または2からなるポリペプチドに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項3】
ヒトCD47のヒトSIRPgへの結合を阻害する、請求項１または２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項4】
ヒトSIRPaのヒトCD47への結合を阻害せず、好ましくはヒトSIRPaに結合しない、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項5】
特にT細胞、より好ましくは慢性的に活性化したT細胞によるIFNg分泌を、前記抗体がない場合の陰性対照と比較して阻害し、特にIFNg分泌の阻害が、陰性対照と比較して20%超、好ましくは30%超、より好ましくは40%超であり、特に前記IFNg分泌が、T細胞によるIFNg分泌のレベルを決定することにより測定され、好ましくはイムノアッセイにより測定される、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項6】
前記抗体がヒト化モノクローナル抗体であり、特にヒトIgG4重鎖定常領域を含み、好ましくは配列番号103および／またはヒトIgκ軽鎖定常領域を含むか、または配列番号103および／またはヒトIgκ軽鎖定常領域のみからなり、好ましくは配列番号104を含むか、またはそれのみからなる、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項7】
- 配列番号3からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号4からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン；- 配列番号5からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号6からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン；
- 配列番号7からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号8からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン；
- 配列番号9からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号10からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン；または
- 配列番号11からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号12からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン
を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項8】
請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、単離された核酸分子または単離された核酸分子の組み合わせ物。
【請求項9】
請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントまたは請求項８に記載の単離された核酸分子または前記単離された核酸分子の組み合わせ物と、医薬用ビヒクルを含む、医薬組成物。
【請求項10】
薬剤としての使用のための、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項８に記載の単離された核酸分子または単離された核酸分子の組み合わせ物、または請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
T細胞が有害な影響を有する疾患、特にT細胞の増殖および／または活性化および／または遊走および／またはT細胞による組織浸潤が有害な影響を有する疾患の予防および治療における、請求項１０に記載の使用のための、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項８に記載の単離された核酸分子または単離された核酸分子の組み合わせ物、または請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項12】
前記疾患が自己免疫疾患、炎症性疾患、免疫代謝性疾患、全身性炎症に起因する心臓血管疾患、移植機能不全または拒絶反応からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用のための、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項８に記載の単離された核酸分子または単離された核酸分子の組み合わせ物、または請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項13】
前記疾患が移植片対宿主病である、請求項１２に記載の使用のための、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項８に記載の単離された核酸分子または単離された核酸分子の組み合わせ物、または請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項14】
前記炎症性疾患がクローン病または潰瘍性疾患を含む炎症性腸疾患のような慢性炎症性疾患または慢性神経炎症性疾患である、請求項１２に記載の使用のための、請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項８に記載の単離された核酸分子または単離された核酸分子の組み合わせ物、または請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項15】
- 請求項１から７のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント、請求項８に記載の単離された核酸分子または単離された核酸分子の組み合わせ物、または請求項９に記載の医薬組成物；および- 特に医薬として同時、別個、または連続的に使用するための、免疫療法剤、免疫抑制剤、抗生物質、プロバイオティクスおよびそれらの混合物からなる群より選択される第2の治療剤
を含む、組み合わせ製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は免疫療法の分野に関する。本発明は、新規特異的アンタゴニスト抗SIRPg抗体およびその治療的使用に関する。
【背景技術】
【0002】
シグナル制御タンパク質（SIRPs）は、免疫系や中枢神経系に広く発現し、さまざまなシグナルを伝達する膜貫通型糖タンパク質ファミリーを構成する。
【0003】
SIRPファミリーの原型的なメンバーはSIRP-アルファ（SIRPa、SIRPα、CD172aまたはSHPS-1とも呼ばれる）である。ヒトのSIRPaをコードする遺伝子は多型遺伝子であり、ヒト集団にはいくつかの変異体が報告されている。最も一般的なタンパク質の変異体は、SIRPa v1 (アクセッション番号 NP_542970およびP78324)とSIRPa v2 (アクセッション番号 CAA71403)である。
【0004】
SIRPaは単球、組織マクロファージのほとんどの亜集団、顆粒球、リンパ系組織の樹状細胞のサブセット、一部の骨髄前駆細胞、および様々なレベルの神経細胞に発現しており、特に小脳の顆粒層や海馬のようなシナプスの多い脳の領域で高発現している。SIRPaはCD47と結合する抑制性レセプターであり、マクロファージや樹状細胞の機能、成長因子や細胞接着によって誘導されるシグナル伝達経路を調節する。
【0005】
SIRPファミリーの他のメンバーであるSIRP-ベータ（SIRPb、SIRPβ、CD172bまたはSIRPベータ-1とも呼ばれる－アクセッション番号 NM_001083910またはアクセッション番号 Q5TFQ8）も同定された。SIRPファミリーの他のメンバーとは異なり、SIRPbはCD47に結合しないとみられ、そのリガンドは未だわかっていない。
【0006】
SIRPファミリーの3番目のメンバーであるSIRP-ガンマ（SIRPg、SIRPγ、CD172gまたはSIRPベータ-2とも呼ばれる－アクセッション番号 NM_018556またはアクセッション番号 Q9P1W8）が後に同定された。SIRPgは多くのヒト組織で多様に発現しているが、特にT細胞の表面で発現し、CD47に結合する(Piccio et al., Blood, 105:6, 2005)。
【0007】
抗SIRPg抗体は過去に数種類しか使用されていない。抗SIRPa抗体であるKwar23抗体は、SIRPgにも結合することが示されている（WO2017/178653参照）。Brookeらは、マウス抗体OX116、117、118および119の作製を開示している。これらの抗体の中で、mAb OX119がより特異的であるとして選択された。しかしながら、OX119抗体とともに染色された末梢血骨髄性細胞もあり、これは交差反応性の結果であると考えられた。
【0008】
SIRPa/CD47相互作用に影響を与えないアンタゴニストモノクローナル抗体でSIRPg上の特異的エピトープを標的にすることは、前記先行技術の抗体とは反対に、他の免疫細胞への影響を避けてT細胞のみを標的にするためのより特異的な戦略となり得、したがって治療目的の使用における副作用を避けることができる。
【0009】
Stefanidakis M.らは、抗SIRPgであるLSB2.20抗体を用いて、CD47が内皮細胞の細胞間接合部に濃縮されていること、ヒトT細胞SIRPgと相互作用するCD47がin vitroでのT細胞移動の際に重要な役割を果たすことを示した（Stefanidakis M. et al, Blood, 2008, 112 (4)： 1280-1289)。この研究で使用された抗SIRPg LSB2.20抗体は特異的抗体として開示されているが、この抗SIRPgのSIRPaとの交差反応性および拮抗活性については、本文中では正確に検討されていない。本出願人は以前、SIRPgに選択的に結合する抗ヒトSIRPg抗体A1、A5、A8を開発した（WO2020/039049）。しかし、これらの抗体の生産収量は臨床使用のためには十分でないことが判明している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】WO2017/178653
【特許文献2】WO2020/039049
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】Piccio et al., Blood, 105:6, 2005
【非特許文献2】Stefanidakis M. et al, Blood, 2008, 112 (4): 1280-1289
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
したがって、SIRPgに高い親和性を有し、SIRPg-CD47相互作用のアンタゴニストであるが、SIRPa-CD47相互作用のアンタゴニストではなく、特にSIRPaと交差反応しない、抗ヒトSIRPg抗体であって、高い生産収量で生産でき、したがって臨床使用に適切な、改良された抗ヒトSIRPg抗体を開発する必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らは、SIRPg抗原を認識し、高親和性で特異的に結合する新規抗ヒトSIRPg抗体を開発した。これらの抗体は、ヒトSIRPgとヒトCD47との相互作用の強力な阻害剤であるが、ヒトSIRPa-CD47相互作用のアンタゴニストではなく（特にヒトSIRPaに結合しない）、インターフェロンガンマ（IFNg）の分泌の阻害において強力な効果を有する。さらに、これらの抗体の生産収量は、いくつかの先行技術の抗体よりも100倍から10000倍高く、したがって臨床使用に適していることが判明した。
【0014】
本開示は、SIRPg、特にヒトSIRPgに特異的に結合する抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、以下：
a) 配列番号23のVLCDR1、配列番号24のVLCDR2、および配列番号25のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号26のVHCDR1、配列番号27のVHCDR2、および配列番号28のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
b) 配列番号29のVLCDR1、配列番号30のVLCDR2、および配列番号31のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号32のVHCDR1、配列番号33のVHCDR2、および配列番号34のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
c) 配列番号35のVLCDR1、配列番号36のVLCDR2、および配列番号37のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号38のVHCDR1、配列番号39のVHCDR2、および配列番号40のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
d) 配列番号41のVLCDR1、配列番号42のVLCDR2、および配列番号43のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号44のVHCDR1、配列番号45のVHCDR2、および配列番号46のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、または
e) 配列番号47のVLCDR1、配列番号48のVLCDR2、および配列番号49のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号50のVHCDR1、配列番号51のVHCDR2、および配列番号52のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン
を含む。
a) 配列番号23のVLCDR1、配列番号24のVLCDR2、および配列番号25のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号26のVHCDR1、配列番号27のVHCDR2、および配列番号28のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
b) 配列番号29のVLCDR1、配列番号30のVLCDR2、および配列番号31のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号32のVHCDR1、配列番号33のVHCDR2、および配列番号34のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
c) 配列番号35のVLCDR1、配列番号36のVLCDR2、および配列番号37のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号38のVHCDR1、配列番号39のVHCDR2、および配列番号40のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
d) 配列番号41のVLCDR1、配列番号42のVLCDR2、および配列番号43のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号44のVHCDR1、配列番号45のVHCDR2、および配列番号46のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、または
e) 配列番号47のVLCDR1、配列番号48のVLCDR2、および配列番号49のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号50のVHCDR1、配列番号51のVHCDR2、および配列番号52のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン
を含む。
【0015】
特定の実施形態において、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1または2を含む、または配列番号1または2のみからなる、特に、配列番号1または2のみからなるポリペプチドに特異的に結合する。
【0016】
本開示によれば、前記抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、上述したように、ヒトCD47とヒトSIRPgとの結合を阻害する。より特定の実施形態では、前記抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、上述したように、ヒトSIRPaとヒトCD47との結合を阻害せず、好ましくはヒトSIRPaに結合しない。
【0017】
好ましい実施形態において、本開示による抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、T細胞、好ましくは慢性的に活性化したT細胞によるIFNg分泌を陰性対照と比較して阻害し、特にIFNg分泌の阻害は20％以上、好ましくは30％以上、より好ましくは40％以上である。
【0018】
特定の実施形態において、本開示による前記抗体またはその抗原結合断片は、ヒト化モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであり、ヒトIgG4重鎖定常領域を含み、好ましくは配列番号103を含むもしくは配列番号103のみからなり、および／またはヒトIgκ軽鎖定常領域を含み、好ましくは配列番号104を含むもしくは配列番号104のみからなる。
【0019】
より好ましい実施形態では、前記抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下：
- 配列番号3からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号4からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン；
- 配列番号5からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号6からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン；
- 配列番号7からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号8からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン；
- 配列番号9からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号10からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン；または
- 配列番号11からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号12からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン
を含む。
- 配列番号3からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号4からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン；
- 配列番号5からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号6からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン；
- 配列番号7からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号8からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン；
- 配列番号9からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号10からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン；または
- 配列番号11からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインおよび配列番号12からなるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメイン
を含む。
【0020】
別の態様において、本開示は、上述した前記抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸分子または単離された核酸分子の組み合わせ物に関する。
【0021】
本開示はまた、上述した前記抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または前記単離された核酸分子もしくは前記単離された核酸分子の組み合わせ物と、医薬用ビヒクルとを含む医薬組成物に関する。
【0022】
このような製品は、いくつかの疾患、特にT細胞が関与する疾患（T細胞が有害な作用を有する疾患）の予防および／または治療における使用、特にT細胞の増殖および／または活性化および／または遊走および／またはT細胞による組織浸潤を調節するための使用、特にT細胞の増殖および／または活性化および／または遊走および／またはT細胞による組織浸潤に作用することが疾患の転帰を改善し得る使用に、特に適している。
【0023】
したがって、本開示はまた、T細胞が有害な効果を有する疾患、特に、T細胞の増殖および／または活性化および／または遊走および／またはT細胞による組織浸潤が有害な効果を有する疾患の治療における使用のための、上述した前記抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメント、前記単離された核酸分子、前記単離された核酸分子の組み合わせ物または前記医薬組成物に関し、好ましくは当該疾患は、自己免疫疾患、炎症性疾患、免疫代謝疾患、全身性炎症に起因する循環器疾患、および移植機能不全または拒絶反応からなる群から選択される。好ましい実施形態において、前記移植機能不全または拒絶反応は、移植片対宿主病である。より好ましい実施形態において、前記炎症性疾患は、クローン病または潰瘍性疾患を含む炎症性腸疾患のような慢性炎症性疾患である。別の特定の実施形態では、前記疾患は慢性神経炎症性疾患である。
【0024】
最後に、本開示は、上述した抗SIRPg抗体、その抗原結合フラグメント、単離された核酸分子、単離された核酸分子の組み合わせ物、または医薬組成物を含む組み合わせ製品に関し；第二の治療薬は免疫療法剤、免疫抑制剤、抗生物質、プロバイオティクスおよびそれらの混合物からなる群から選択され、好ましくは、前記免疫抑制剤は、シクロスポリンA、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、ステロイド、抗TNF剤、抗IL-23剤からなる群より選択される。特定の実施形態において、本開示は、医薬品として同時、別々、または逐次的に使用される組み合わせ製品に関する。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】図1: 1μg/mlの固定化タンパク質SIRPg-Hisに対する結合ELISAアッセイ。A) 抗体13F7、11B5および26F10と先行技術のA1、A5およびKwar23抗体、ならびにB) 抗体11B5、2H9および3H8抗体と先行技術のKwar23抗体の結合分析。可視化はロバ抗ヒト抗体を用いて行い、TMB基質を用いた450nmでの比色測定により可視化した。陰性対照としてアイソタイプ IgG4mを用いた。
【図2】図2: サイトフルオロメトリーによるJurkat細胞上の抗体のSIRPg結合解析。ヒトJurkat細胞（あらかじめヒトFc受容体結合阻害抗体で染色）上の13F7、26F10、2H9、および3H8ならびに先行技術のLSB2.20およびOX119抗体の結合のサイトフルオロメトリーによる評価。A) は陽性のJurkat細胞の割合、B) は平均蛍光強度(MFI)を示す。
【図3】図3: SIRPa結合ELISAアッセイ。抗体13F7、11B5、2H9、3H8、および26F10ならびに先行技術の抗SIRPa抗体およびKwar23抗体の結合分析。可視化はロバ抗ヒト抗体を用いて行い、TMB基質を用いた450nmでの比色測定により可視化した。陰性対照としてアイソタイプ IgG4 mを用いた。
【図4】図4: SIRPaへのCD47と抗体の競合。ELISAによる固定化SIRPa-Hisに対する、(A) LSB2.20およびOX119抗体の、および(B) 13F7、11B5、26F10、2H9、および3H8抗体ならびに先行技術のLSB2.20およびOX119抗体の評価を、異なる濃度で、一定濃度のビオチン化CD47-Fc(3μg/ml)とインキュベートして行った。可視化は、CD47分子を検出するため、ストレプトアビジンペルオキシダーゼを用いて行い、TMB基質を用いた450nmでの比色測定により行った。陰性対照としてアイソタイプIgG1mとIgG4mを用いた。
【図5】図5: CD47を用いた競合ELISAアッセイによる抗SIRPgアンタゴニスト活性。(A) 抗SIRPg抗体13F7、26F10、2H9、および3H8の、ならびに(B) 11B5、13F7、26F10、および3H8抗体の結合解析。ELISAは、異なる濃度の抗体を、一定濃度のビオチン化CD47-Fc（3μg/ml）とインキュベートして行った。可視化は、CD47分子を検出するため、ストレプトアビジンペルオキシダーゼを用いて行い、TMB基質を用いた450nmまたは450-630nmでの比色測定により可視化した。
【図6】図6: 生物学的アッセイにおけるアンタゴニスト活性。3μg/mlの抗CD3（OKT3）および3μg/mlの可溶性抗CD28.2でコートしたプレート中、完全培地中でPBMCを3回刺激した。機能分析では、疲弊したまたは刺激されていないPBMCを、0.5μg/mlの抗CD3（OKT3）および10μg/mlのヒトCD47Fc組み換えタンパク質（#12283-H02H、SinoBiological）でコートしたプレート中で活性化した。次に、抗体を疲弊したまたは刺激されていないPBMCと共にプレート上で、IFNg分泌を測定（#555142, BDBiosciences）するために、2日間インキュベートし、および530nmでのAlamarBlue検出（#DAL1100, Invitrogen）により増殖を測定するために、および5日間、37℃、5％CO2でインキュベートした。(A) 1μg/mLの3H8抗体ならびに先行技術のKwar23、OX119、およびLSB2.20抗体でPBMCを48時間処理した後のIFNg分泌のパーセンテージ；(B) 10μg/mLの11B5、26F10、13F7、2H9抗体および先行技術のKwar23抗体でPBMCを48時間処理した後のIFNg分泌のパーセンテージ。
【発明を実施するための形態】
【0026】
定義
【0027】
本明細書で使用される場合、用語「SIRPg」は、当該技術分野における一般的な意味を有し、哺乳動物SIRPgタンパク質、好ましくはヒトSIRPgを指す。SIRPgは、受容体型膜貫通糖タンパク質であり、受容体チロシンキナーゼ共役シグナル伝達プロセスの負の制御に関与していることが知られており、SIRPg遺伝子（遺伝子ID：55423、2021年7月8日更新）によってコードされる。ヒトSIRPgタンパク質の参照配列は、2021年6月2日に更新されたUniProtKBアクセッション番号Q9P1W8に紐付けされた配列に相当する。
【0028】
本明細書で使用される場合、用語「CD47」は、哺乳動物のCD47タンパク質、好ましくはヒトCD47を指し、細胞外マトリックスへの細胞接着時に起こる細胞内カルシウム濃度の上昇に関与する膜タンパク質である。そのコードされているタンパク質はまた、トロンボスポンジンのC末端細胞結合ドメインの受容体でもあり、膜輸送やシグナル変換において役割を果たしている可能性がある。CD47遺伝子（遺伝子ID：961、2021年11月8日更新）は、2つのアイソフォームをコードしており、それはCD47アイソフォームX2（NCBI参照配列：XP_005247966.1、2021年5月16日更新）とCD47アイソフォームX3（NCBI参照配列：XP_016863025.1、2021年5月16日更新）である。
【0029】
本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗原と特異的に結合する抗原結合部位を有する分子を指す。このように、抗体という用語は、2本の重鎖と2本の軽鎖からなる4鎖抗体などの抗体分子全体を包含し、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体または組換え抗体などである。
【0030】
げっ歯類や霊長類の天然抗体では、2本の重鎖がジスルフィド結合によって互いに結合しており、それぞれの重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖と結合している。軽鎖にはlambda（λ）とkappa（κ）の2種類がある。抗体分子の機能的活性を決定する重鎖クラス（またはアイソタイプ）は主に5種類あり、それはIgM、IgD、IgG、IgA、IgEである。各鎖は異なる配列ドメインを含む。典型的なIgG抗体では、軽鎖は可変ドメイン（VL）と定常ドメイン（CL）の2つのドメインを含む。重鎖は4つのドメイン、可変ドメイン（VH）と3つの定常ドメイン（CH1、CH2、CH3、総称してCH）を含む。軽鎖の可変領域（VL）と重鎖の可変領域（VH）の両方が、抗原に対する結合認識と特異性を決定する。軽鎖の定常領域ドメイン(CL)および重鎖の定常領域ドメイン(CH)は、抗体鎖の会合、分泌、胎盤通過性、補体結合、Fc受容体(FcR)への結合などの重要な生物学的特性を付与する。
【0031】
Fvフラグメントは免疫グロブリンのFabフラグメントのN末端部分であり、1本の軽鎖と1本の重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性により備わる。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（CDR）の残基で構成されている。時には、非超可変領域やフレームワーク領域（FR）の残基が抗体結合部位に関与したり、ドメイン全体の構造に影響を与えたりすることもあり、その結果結合部位に影響を与え得る。
【0032】
相補性決定領域（Complementarity Determining RegionsまたはCDR）とは、天然の免疫グロブリン結合部位の天然のFv領域の結合親和性と特異性を決定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ3つのCDRを有し、それぞれL-CDR1、L-CDR2、L-CDR3およびH-CDR1、H-CDR2、H-CDR3と呼ばれる。したがって、抗原結合部位は通常6個のCDRsを含み、重鎖および軽鎖それぞれの可変(V)領域から設定されたCDRsを含む。
【0033】
フレームワーク領域（FR）とは、CDRの間に入るアミノ酸配列を指す。したがって、軽鎖および重鎖の可変領域は、通常、4個のフレームワーク領域と3個のCDRを以下の配列で含む：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
【0034】
当業者は、抗体の様々な領域／ドメインの位置の決定を、参照番号付けシステム、KABATの番号付けシステムの参照、またはIMGTの「collier de perle」アルゴリズムの適用を含む、この分野で示されている標準的な定義を参照することにより、することができる。この点に関して、本発明の配列を定義する際、領域／ドメインの区切りは、参照するシステムによって異なり得ることに注意が必要である。従って、本発明で定義される領域／ドメインは、抗体の可変ドメインの全長配列内の関連配列の長さまたは位置において、約±10%の変動を示す配列を包含する。
【0035】
本開示による抗SIRPg抗体の予測CDR（KABATの番号付けシステムによる）、例えば2H9、3H8、26F10、13F7、および11B5を、下記表3に記載する。
【0036】
本明細書で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、単一の特異性を持つ抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性と親和性を指す。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来するまたは基づくか、または完全に合成された配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体を示す。モノクローナル抗体の調製方法は、結合特異性には関係しない。一実施形態において、本開示の抗体はモノクローナル抗体である。
【0037】
本明細書で使用される場合、用語「組換え抗体」は、組換え手段により産生、発現、生成または単離される抗体を指し、例えば、宿主細胞に導入された組換え発現ベクターを使用して発現される抗体；組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離される抗体；ヒト免疫グロブリン遺伝子により遺伝子組み換えされた動物（例えばマウス）から単離される抗体；または特定の免疫グロブリン遺伝子配列（例えばヒト免疫グロブリン遺伝子配列）が他のDNA配列とアセンブルされる他の任意の方法で産生、発現、生成または単離される抗体を指す。組換え抗体は、例えば、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む。
【0038】
抗体の「抗原結合フラグメント」（または単に「抗体フラグメント」）という用語は、本明細書で使用される場合、抗原（例えば、SIRPg）に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたはそれ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体のフラグメントでも発揮できることが示されている。
【0039】
抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に包含される結合フラグメントの例としては、VL、VH、CL、およびCH1ドメインからなる一価のフラグメントであるFabフラグメント；ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって結合した2つのFabフラグメントを含む二価フラグメントであるF(ab)2フラグメント；VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント；抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント；VHドメインからなるdAbフラグメント（Wardら、1989 Nature 341:544-546)、またはこのような抗原結合フラグメントを含む任意の融合タンパク質を含む。さらに、Fvフラグメントの2つのドメイン、VLおよびVHは、別々の遺伝子によってコードされているが、これらは、組換え法を用いて、VLおよびVH領域が対になって一価分子を形成する一本鎖タンパク質として作製することを可能にする合成リンカーによって結合され得る(一本鎖Fv (scFv)として知られている；例えば、Birdら、1988 Science 242：423-426；およびHustonら、1988 Proc．Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照)。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に包含されることが意図されている。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の技術を用いて得られ、フラグメントはインタクト抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。
【0040】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」とは、マウスなどの哺乳動物種の生殖細胞系列由来の可変ドメインの配列が、ヒトなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列由来の定常ドメインの配列に接合された抗体を指す。一実施形態では、本開示の抗体はキメラ抗体である。
【0041】
一実施形態において、本開示の抗体はヒト化抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」とは、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖細胞系列由来のCDR配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を指す。
【0042】
本明細書で使用される場合、「修飾抗体」とは、抗体またはその抗原結合フラグメントを含む分子であって、前記抗体またはその機能的フラグメントが機能的に異なる分子と結びついている分子に相当する。本発明の修飾抗体は、融合キメラタンパク質または複合体であり得、抗体または機能的フラグメントの安定性および／または半減期を改善するための、共有結合、グラフト化、化学的または生物学的基との化学結合、またはPEGポリマーのような分子や生体内でのプロテアーゼ切断からの保護に適した他の保護基または保護分子との化学結合を含む、任意の適切な結合形態から生じる。
【0043】
同様の技術、特に化学的カップリングまたはグラフト化により、修飾抗体を生物学的に活性な分子とともに調製することができ、前記活性分子は例えば毒素、特にシュードモナス外毒素A、植物毒素リシンのA鎖またはサポリン毒素、特に治療用活性成分、抗体または機能的フラグメントを人体の特定の細胞または組織にターゲティングするのに適したベクター（特にタンパク質ベクターを含む）から選択され、または、特に抗体のフラグメントが使用される場合、標識またはリンカーと結合することができる。
【0044】
抗体またはその機能的断片のPEG化は、活性物質の宿主への送達条件を改善するため、特に治療用途において興味深い実施形態である。PEG化は、抗体または機能的フラグメントの認識部位への干渉を防ぐために部位特異的に行うことができ、高分子量PEGを用いて行うことができる。PEG化は、抗体または機能的フラグメントの配列中に存在する遊離システイン残基を介して、または抗体または機能的フラグメントのアミノ酸配列中に付加された遊離システイン残基を介して行うことができる。実施形態において、本開示の抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは修飾されており、特定の場合において修飾抗体である。
【0045】
抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメント
【0046】
本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、SIRPg、特にヒトSIRPgに高親和性で特異的に結合する性質を有する。当該抗体またはその抗原結合フラグメントは、本開示の実施例に例示されるように、ヒトCD47とヒトSIRPgとの相互作用を阻害し、インターフェロンガンマ（IFNg）分泌抑制に強い効果を有する。これらの抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトCD47とヒトSIRPaの相互作用を阻害せず、特にSIRPa、好ましくはヒトSIRPaに特異的に結合しない。
【0047】
本開示によれば、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、SIRPg抗原に特異的に結合する。
【0048】
「抗原を認識する抗体」および「抗原に結合する抗体」という表現は、本明細書において互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「認識する」という用語は、抗体またはその抗原結合フラグメントが、抗原上に提示されたエピトープと検出可能的に結合する能力を指し、当該抗原はすなわちSIRPg抗体、特に受容体の細胞外ループ、より具体的には配列番号１または２、好ましくは配列番号２のポリペプチドからなる、またはその配列中に局在するヒトSIRPgのエピトープである。典型的には、結合親和性は、Biacore分析、Blitz分析、ELISAアッセイまたはScatchardプロットのような当技術分野で公知の方法によって測定することができるが、これらに限定されない。
【0049】
特定の実施形態において、本開示による抗体または抗原結合フラグメントは、ELISA結合アッセイによって決定され得るように、100ng/mlまたはそれ未満、好ましくは0.1～100ng/ml、より詳細には5ng/ml～50ng/mlのEC50でヒトSIRPg抗原に特異的に結合する。別の実施形態では、ELISA結合アッセイまたは本発明の実施例に開示される方法（本出願の実施例に詳述される方法1.4および図1に詳述される結果を参照）によって決定され得るように、50ng/mlまたはそれ未満、40ng/mlまたはそれ未満、30ng/mlまたはそれ未満、20ng/mlまたはそれ未満のEC50でヒトSIRPg抗原と結合する。
【0050】
特定の実施形態において、本開示による抗体または抗原結合フラグメントは、サイトフルオロメトリーによる結合アッセイ、または本発明の実施例に開示された方法（本出願の実施例に詳述される方法1.5および表5および図2に詳述される結果を参照）によって決定され得るように、3.5μg/mlまたはそれ未満、特に3μg/mlまたはそれ未満、より詳細には2.5μg/mlまたは未満、2μg/mlまたはそれ未満、1.5μg/mlまたはそれ未満、1μg/mlまたはそれ未満、0.5μg/mlまたはそれ未満のEC50でヒトSIRPg抗原と結合する。
【0051】
本明細書で使用される場合、用語「EC50」は、生物学的または生化学的機能（例えば、SIRPgの機能または活性）を50％引き出す抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメント）の有効性の尺度を意味する。例えば、EC50は、SIRPgの活性を半量引き出すために必要な抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントの量を示す。すなわち、抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントの有効濃度（EC）の最大値の半量（50％）である（50％ECまたはEC50）。EC50は、インビトロで50％の有効性を示すために必要な薬剤の濃度を表す。EC50は、例えば、用量反応曲線を構築し、異なる濃度の抗SIRPg抗体又はその抗原結合フラグメントが抗SIRPg結合などのSIRPg活性に及ぼす影響を調べるなど、当技術分野で公知の技術によって決定することができる。特に、EC50は、実施例に詳述の方法1.3および1.5に記載したELISA結合アッセイまたはサイトフルオロメトリーによる結合アッセイにおいて、結合の50％に到達するための示された抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度を表す。
【0052】
本開示はまた、バイオセンサー分析によって決定され得るように、10E-8Mより高いアフィニティー定数KDでヒトSIRPgに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【0053】
本開示の一実施形態によれば、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、SIRPgに特異的に結合し、例えば、SIRPaおよび／またはSIRPb、特にSIRPa、より詳細にはヒトSIRPaと交差反応しない（結合しない）。
【0054】
「選択的結合」または「特異的結合」とは、典型的には、抗体またはその抗原結合フラグメントが、標的、例えばエピトープなどに対して、より強く結合し、それが他の標的に対する結合と比較して特異的であることを意味する。抗体または抗原結合フラグメントは、その第一の標的に対する親和性が第二の標的に対する親和性よりも高い場合、第二の標的に比べて第一の標的により強く結合する。典型的には、抗体またはその抗原結合フラグメントは、第二の標的に対する前述のEC50よりも低いEC50で第一の標的に結合する場合、第二の標的と比較して第一の標的により強く結合する。最も具体的には、薬剤は第二の標的には意味のある程度では全く結合しない。
【0055】
本明細書で開示する抗体またはその抗原結合フラグメントの選択性結合は、他のSIRPメンバー、例えばSIRPaおよび／またはSIRPb、好ましくは意図する標的タンパク質(SIRPg)と比較したSIRPaに対する交差反応性アッセイを用いて試験することができる。このような交差反応性が検出されない場合、同時に、同じ抗体希釈率で、意図した標的の強いシグナルを与える場合、その抗体またはその抗原結合フラグメントは、通常、選択的であるとみなされる（表6および図3に対応する実施例に詳述した結果を参照）。
【0056】
「抗原と交差反応しない」または「抗原と結合しない」抗体またはその抗原結合フラグメントとは、その抗原、例えばSIRPaおよび／またはSIRPb、好ましくはSIRPaと、ELISA結合アッセイで決定され得るように1000ng/ml超、特に10000ng/ml超のEC50、より詳細には標準的な結合アッセイ(ELISA結合アッセイなど)では決定できないEC50で結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを指すことを意図している。特に、EC50は、実施例に詳述した方法1.3(図3の結果を参照)および1.4に記載したELISA結合アッセイにおいて結合の50%に達するための、示された抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度を表す。好ましい実施形態において、抗原と交差反応しない、または抗原に結合しないこのような抗体またはその抗原結合フラグメントは、標準的な結合アッセイ（ELISA結合アッセイまたはサイトフルオロメトリーによる結合アッセイにより決定され得る）において、SIRPaおよび／またはSIRPb、好ましくはSIRPaのような前記抗原に対して本質的に検出されない結合を示す。
【0057】
別の特定の実施形態では、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、SIRPa-CD47相互作用、好ましくはヒトSIRPa-ヒトCD47相互作用を阻害しない。特定の実施形態において、抗原と交差反応しないそのような抗体またはその抗原結合フラグメントは、本開示の実施例に記載されるように、例えば競合ELISAアッセイによって評価されるように、SIRPaのCD47への結合の本質的に検出されない阻害または防止を示す（実施例に詳述される方法1.6および図4の結果を参照）。
【0058】
いくつかの実施形態において、本開示による抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、競合ELISAアッセイによって決定され得るように、400ng/mlより高い濃度、より詳細には800ng/mlより高い濃度、最も詳細には1000ng/mlより高い濃度において、CD47とSIRPaの物理的結合阻害を20％未満、好ましくは10％未満、より好ましくは5％未満許容する。
【0059】
より特定の実施形態において、本発明による特異的抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、SIRPgの結合に対するEC50値がELISA結合アッセイによって決定され得るように、100ng/mlより低く、より詳細には50ng/mlより低く、SIRPaおよび／またはSIRPbの結合、好ましくはSIRPaの結合に対するEC50値がELISA結合アッセイによって決定され得るように、1000ng/mlより高く、詳細には10000ng/mlより高く、より詳細には、SIRPaおよび／またはSIRPb、好ましくはSIRPaの結合に対するEC50値は、標準的な結合アッセイ（例えば、ELISA結合アッセイまたはサイトフルオロメトリーによる結合アッセイ）では決定できない。
【0060】
本開示によるSIRPgに対する特異的結合を有する抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、典型的には、SIRPg-CD47相互作用、好ましくはヒトSIRPg-ヒトCD47相互作用を阻害または防止する能力によってさらに特徴付けられる。抗体またはその抗原結合フラグメントのアンタゴニスト特性、言い換えれば、そのCD47へのSIRPgの結合を阻害または防止する能力は、例えば、本開示の実施例に記載されるように、競合ELISAアッセイによって評価され得る（実施例に詳述される方法1.6および図5の結果を参照）。
【0061】
いくつかの実施形態において、本開示による抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、1000ng/mlより低い濃度、より詳細には800ng/mlより低い濃度、最も詳細には400ng/mlより低い濃度で、CD47とSIRPgとの間の物理的結合阻害を60％より高く、より好ましくは70％より高く、より好ましくは80％より高く、最も好ましくは90％より高く可能にする。アンタゴニスト効果は、本出願の実施例に例示した方法1.6を用いて決定することができる。
【0062】
本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、陰性対照と比較して、T細胞増殖、T細胞活性化、T細胞の組織浸潤および／または遊走を阻害することをさらに特徴とし、好ましくは、T細胞増殖および／またはT細胞活性化を阻害する。
【0063】
このような有利な特性を有する本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば以下のアッセイを用いて抗SIRPg抗体の中からスクリーニングすることができる。
【0064】
T細胞の増殖は、H3-チミジンの取り込みによって測定することができる。特に、T細胞の増殖が陰性対照と比較して20％以上減少した場合、抗体またはその抗原結合フラグメントはT細胞の増殖を阻害すると考えられる。
【0065】
T細胞の活性化は、CD25および／またはCD69の発現を、例えばフローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ELISAなどによって分析することによって、および／またはIFNgおよび／またはIL2の分泌を、T細胞を活性化しないことが知られている対照と比較して解析することによって、評価することができる。特に、本開示による抗体または抗原結合フラグメントは、T細胞および／またはナチュラルキラー細胞、詳細にはT細胞、より詳細には慢性的に活性化したT細胞によるインターフェロンガンマ（IFNg）サイトカインの分泌を阻害し、特に陰性対照と比較してT細胞によるIFNg分泌を減少または阻害し、特にIFNg分泌の減少または阻害は、20％より高く、好ましくは30％より高く、より好ましくは40％より高く、さらに好ましくは50％より高く、さらにより好ましくは60％より高い。前記陰性対照は、前記抗体を含まない培地、またはT細胞を活性化しないことが知られている抗体を含む培地とすることができる。慢性的に活性化したT細胞は、有利には、実施例の方法1.7に記載されているように、抗CD3(OKT3)抗体および抗CD28抗体で刺激されたT細胞である。
【0066】
IFNgの分泌レベル（濃度）は、例えば、当業者に公知の任意の方法によって、例えば、本開示の実施例に記載されているように、免疫測定法、特にELISAによってT細胞(例えば、慢性的に活性化したT細胞)によって分泌されるIFNgのレベルを測定することによって評価され得る(本出願の実施例及び図6に詳述されている方法1.7を参照)。
【0067】
T細胞の組織浸潤および遊走は、陰性対照と比較して、本開示による抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントの存在下で、体内の特定の局在（例えば、組織、臓器、体液、分泌腺）内のT細胞の数を経時的に計数することによって評価することができる。T細胞の組織浸潤は、T細胞の数が経時的に増加する場合に陽性とみなされる。T細胞の遊走は、T細胞の数が時間の経過とともに変化する場合に陽性とみなされる。T細胞は、特定のT細胞マーカーを用いるなど、公知の方法に従ってカウントすることができるが、これに限定されない。
【0068】
一実施形態によれば、本開示による抗ヒトSIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の表1に記載されるように、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列によって構造的に特徴付けられる、選択された組換え抗SIRPg抗体2H9、3H8、26F10、13F7、および11B5を含む。
【0069】
【表1】
【0070】
本開示は、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号9、および配列番号11からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変ドメインを含む、および／または配列番号4、配列番号6、配列番号8、配列番号10、および配列番号12からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変ドメインを含む、本開示による抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。
【0071】
特定の実施形態において、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下：
a) 配列番号3のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変領域、および配列番号4のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変領域、
b) 配列番号5のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変領域と、配列番号6のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変領域、
c) 配列番号7のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変領域と、配列番号8のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変領域、
d) 配列番号9のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変領域および配列番号10のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変領域、または
e) 配列番号11のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変領域および配列番号12のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変領域
を含む。
a) 配列番号3のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変領域、および配列番号4のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変領域、
b) 配列番号5のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変領域と、配列番号6のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変領域、
c) 配列番号7のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変領域と、配列番号8のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変領域、
d) 配列番号9のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変領域および配列番号10のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変領域、または
e) 配列番号11のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる軽鎖可変領域および配列番号12のアミノ酸配列を含むまたはそれのみからなる重鎖可変領域
を含む。
【0072】
本開示の特定の実施形態では、上記のような抗体の可変領域は、IgA、IgM、IgE、IgD、またはIgG、例えば、IGg1、IgG2、IgG3、IgG4のような抗体定常領域と関連し得る。前記抗体の可変領域は、好ましくは配列番号103を含むまたはそれのみからなるヒトIgG4重鎖定常領域および／または好ましくは配列番号104を含むまたはそれのみからなるヒトkappa軽鎖定常領域と関連する。
【0073】
選択した組換え抗SIRPg抗体2H9、3H8、26F10、13F7、および11B5の軽鎖および重鎖全長アミノ酸配列を表2に示す。
【0074】
【表2-1】
【表2-2】
【0075】
したがって、特定の実施形態において、本開示による抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号13、15、17、19、および21からなる群より選択される軽鎖アミノ酸配列、および／または配列番号14、16、18、20、および22からなる群より選択される重鎖アミノ酸配列を含む。
【0076】
より特定の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下：
a) 配列番号13の軽鎖アミノ酸配列および配列番号14の重鎖アミノ酸配列、
b) 配列番号15の軽鎖アミノ酸配列および配列番号16の重鎖アミノ酸配列、
c) 配列番号17の軽鎖アミノ酸配列および配列番号18の重鎖アミノ酸配列、
d) 配列番号19の軽鎖アミノ酸配列および配列番号20の重鎖アミノ酸配列、
e) 配列番号21の軽鎖アミノ酸配列および配列番号22の重鎖アミノ酸配列
を含む。
a) 配列番号13の軽鎖アミノ酸配列および配列番号14の重鎖アミノ酸配列、
b) 配列番号15の軽鎖アミノ酸配列および配列番号16の重鎖アミノ酸配列、
c) 配列番号17の軽鎖アミノ酸配列および配列番号18の重鎖アミノ酸配列、
d) 配列番号19の軽鎖アミノ酸配列および配列番号20の重鎖アミノ酸配列、
e) 配列番号21の軽鎖アミノ酸配列および配列番号22の重鎖アミノ酸配列
を含む。
【0077】
上記に定義されたアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも90％、例えば少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するアミノ酸配列を有する抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントもまた本開示の一部であり、典型的には、抗SIRPg抗体は、VHおよびVLからなる前記抗SIRPg抗体、特に2H9、3H8、26F10、13F7および11B5抗体のいずれか1つの、重鎖および軽鎖からなる前記抗SIRPg抗体と比較して、上述のSIRPg-CD47相互作用（および／またはSIRPg結合親和性）に対して少なくとも同等または高いアンタゴニスト活性を有し、SIRPa-CD47相互作用に対して少なくとも同等または低い非アンタゴニスト活性を有する。
【0078】
本明細書中で使用されるように、2つの配列間の同一性の割合は、2つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数×100）である。配列の比較および2つの配列間の同一性の割合の決定は、以下に記載するように、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。
【0079】
2つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の同一性の割合は、ALIGNプログラム（バージョン2）に組み込まれたE. MeyersとW. Millerのアルゴリズム(Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988)を用いて決定することができ、PAM120重量残基表、ギャップ長ペナルティ12、ギャップペナルティ4を用いる。あるいは、2つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列間の同一性の割合は、NeedlemanとWunschのアルゴリズム（J. Mol. ,Biol.48:444-453,1970）を使用して決定することができ、このアルゴリズムは、GCGソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）のGAPプログラムに組み込まれており、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックスのいずれかと、16、14、12、10、8、6、または4のギャップ重み、および1、2、3、4、5、または6の長さの重みを用いる。2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の同一性の割合は、例えば、核酸またはアミノ酸配列用のBLASTNプログラムなどのアルゴリズムを使用して決定することもでき、デフォルトとして11の単語長（W）、10の期待値（E）、M=5、N=4、および両鎖の比較を用いる。
【0080】
定常領域は、Fcレセプターに対する結合能を改変するために、当該技術分野で公知の方法により、さらに変異または改変され得る。
【0081】
本明細書で使用される場合、用語「IgG Fc領域」は、ネイティブ配列のFc領域およびバリアントFc領域を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を決定するために使用される。ヒトIgG重鎖Fc領域は一般に、C226位またはP230の位置からIgG抗体のカルボキシル末端までのアミノ酸残基を含むと定義される。Fc領域の残基の番号付けは、KabatのEUインデックスのものである。
【0082】
治療用抗体を開発するためのいくつかの研究により、抗体の特性を最適化するためにFc領域の設計が行われ、求められる薬理学的活性により適した分子が生成できるようになった。抗体のFc領域は、血清中半減期や、補体依存性細胞傷害性（CDC）、抗体依存性細胞傷害性（ADCC）、抗体依存性細胞貪食性（ADCP）などのエフェクター機能を媒介する。T250Q/M428LやM252Y/S254T/T256E + H433K/N434FなどのCH2ドメインとCH3ドメインの接点に位置するいくつかの変異は、生体内でFcRnへの結合親和性とIgG1の半減期を増加させることが示されている。しかしながら、FcRn結合の増大と半減期の改善には必ずしも直接的な関係があるとは限らない。治療用抗体の有効性を向上させる一つのアプローチは、その血清持続性を向上させ、それにより、より高い循環レベル、より少ない投与頻度、より少ない投与量を可能にすることである。Fc領域の設計は、抗体のエフェクター機能を低下もしくは増加させるために望まれ得る。細胞表面分子、特に免疫細胞上の分子を標的とする抗体では、エフェクター機能を無効にすることが求められている。反対に、腫瘍学的使用を意図した抗体では、エフェクター機能を高めることで治療活性が向上する可能性がある。4種類のヒトIgGアイソタイプは、活性化Fcγ受容体（FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa）、抑制性FcγRIIb受容体、および補体の第一成分（C1q）と異なる親和性で結合し、非常に異なるエフェクター機能をもたらす。IgGのFcγRsまたはC1qとの結合は、ヒンジ領域とCH2ドメインに位置する残基に依存する。CH2ドメインの2つの領域はFcγRsおよびC1qとの結合に重要であり、IgG2とIgG4においてはユニークな配列を有する。
【0083】
使用され得る本開示による他の抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の表3に記載されるように、2H9、3H8、26F10、13F7、および11B5の6つのCDRを含む任意の抗体を含む。
【0084】
【表3】
【0085】
読みやすくするために、軽鎖および重鎖可変ドメインのCDR領域を、以下それぞれVHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3と記載する。
【0086】
本開示は、ヒトSIRPgに特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、以下：
a) 3つのCDR、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含む軽鎖可変（VL）ドメインであって：
- VLCDR1が、配列番号23、配列番号29、配列番号35、配列番号41、および配列番号47からなる群より選択され；および
- VLCDR2が、配列番号24、配列番号30、配列番号36、配列番号42、および配列番号48からなる群より選択され；および
- VLCDR3が、配列番号25、配列番号31、配列番号37、配列番号43、および配列番号49からなる群より選択されるVLドメイン；および
b) 3つのCDR、VHCDR1、VHCR2、およびVHCDR3を含む重鎖可変（VH）ドメインであって：
- VHCDR1が、配列番号26、配列番号32、配列番号38、配列番号44、および配列番号50からなる群より選択され；
- VHCDR2が、配列番号27、配列番号33、配列番号39、配列番号45、および配列番号51からなる群より選択され；および
- VHCDR3が、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、および配列番号52からなる群より選択されるVHドメイン
を含む。
a) 3つのCDR、VLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3を含む軽鎖可変（VL）ドメインであって：
- VLCDR1が、配列番号23、配列番号29、配列番号35、配列番号41、および配列番号47からなる群より選択され；および
- VLCDR2が、配列番号24、配列番号30、配列番号36、配列番号42、および配列番号48からなる群より選択され；および
- VLCDR3が、配列番号25、配列番号31、配列番号37、配列番号43、および配列番号49からなる群より選択されるVLドメイン；および
b) 3つのCDR、VHCDR1、VHCR2、およびVHCDR3を含む重鎖可変（VH）ドメインであって：
- VHCDR1が、配列番号26、配列番号32、配列番号38、配列番号44、および配列番号50からなる群より選択され；
- VHCDR2が、配列番号27、配列番号33、配列番号39、配列番号45、および配列番号51からなる群より選択され；および
- VHCDR3が、配列番号28、配列番号34、配列番号40、配列番号46、および配列番号52からなる群より選択されるVHドメイン
を含む。
【0087】
特定の実施形態において、本開示の抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下：
a) 配列番号23のVLCDR1、配列番号24のVLCDR2、および配列番号25のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、
b) 配列番号29のVLCDR1、配列番号30のVLCDR2、および配列番号31のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、
c) 配列番号35のVLCDR1、配列番号36のVLCDR2、および配列番号37のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、
d) 配列番号41のVLCDR1、配列番号42のVLCDR2、および配列番号43のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、または
e) 配列番号47のVLCDR1、配列番号48のVLCDR2、および配列番号49のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
a) 配列番号23のVLCDR1、配列番号24のVLCDR2、および配列番号25のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、
b) 配列番号29のVLCDR1、配列番号30のVLCDR2、および配列番号31のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、
c) 配列番号35のVLCDR1、配列番号36のVLCDR2、および配列番号37のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、
d) 配列番号41のVLCDR1、配列番号42のVLCDR2、および配列番号43のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、または
e) 配列番号47のVLCDR1、配列番号48のVLCDR2、および配列番号49のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン
を含む。
【0088】
より特定の実施形態において、本開示の抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下：
a) 配列番号26のVHCDR1、配列番号27のVHCDR2、および配列番号28のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
b) 配列番号32のVHCDR1、配列番号33のVHCDR2、および配列番号34のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
c) 配列番号38のVHCDR1、配列番号39のVHCDR2、および配列番号40のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
d) 配列番号44のVHCDR1、配列番号45のVHCDR2、および配列番号46のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、または
e) 配列番号50のVHCDR1、配列番号51のVHCDR2、および配列番号52のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン
を含む。
a) 配列番号26のVHCDR1、配列番号27のVHCDR2、および配列番号28のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
b) 配列番号32のVHCDR1、配列番号33のVHCDR2、および配列番号34のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
c) 配列番号38のVHCDR1、配列番号39のVHCDR2、および配列番号40のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
d) 配列番号44のVHCDR1、配列番号45のVHCDR2、および配列番号46のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、または
e) 配列番号50のVHCDR1、配列番号51のVHCDR2、および配列番号52のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン
を含む。
【0089】
より特定の実施形態では、本開示による抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下：
a) 配列番号23のVLCDR1、配列番号24のVLCDR2、および配列番号25のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号26のVHCDR1、配列番号27のVHCDR2、および配列番号28のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
b) 配列番号29のVLCDR1、配列番号30のVLCDR2、および配列番号31のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号32のVHCDR1、配列番号33のVHCDR2、および配列番号34のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
c) 配列番号35のVLCDR1、配列番号36のVLCDR2、および配列番号37のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号38のVHCDR1、配列番号39のVHCDR2、および配列番号40のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
d) 配列番号41のVLCDR1、配列番号42のVLCDR2、および配列番号43のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号44のVHCDR1、配列番号45のVHCDR2、および配列番号46のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、または
e) 配列番号47のVLCDR1、配列番号48のVLCDR2、および配列番号49のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号50のVHCDR1、配列番号51のVHCDR2、および配列番号52のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン
を含む。
a) 配列番号23のVLCDR1、配列番号24のVLCDR2、および配列番号25のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号26のVHCDR1、配列番号27のVHCDR2、および配列番号28のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
b) 配列番号29のVLCDR1、配列番号30のVLCDR2、および配列番号31のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号32のVHCDR1、配列番号33のVHCDR2、および配列番号34のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
c) 配列番号35のVLCDR1、配列番号36のVLCDR2、および配列番号37のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号38のVHCDR1、配列番号39のVHCDR2、および配列番号40のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、
d) 配列番号41のVLCDR1、配列番号42のVLCDR2、および配列番号43のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号44のVHCDR1、配列番号45のVHCDR2、および配列番号46のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン、または
e) 配列番号47のVLCDR1、配列番号48のVLCDR2、および配列番号49のVLCDR3を含む軽鎖可変ドメイン、ならびに配列番号50のVHCDR1、配列番号51のVHCDR2、および配列番号52のVHCDR3を含む重鎖可変ドメイン
を含む。
【0090】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、上記で定義したように、親和結合活性および／またはアンタゴニスト活性についてさらにスクリーニングまたは最適化され得ることがさらに意図される。特に、抗体またはその抗原結合フラグメントは、本明細書で提供されるモノクローナル抗体の1、2、3、4、5、6のCDRのアミノ酸配列に1、2、3、4、5、6またはそれ以上の変異を有し得ることが考えられる。抗体の軽鎖または重鎖可変領域のVJ領域またはVDJ領域のCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、またはCDR6の1位、2位、3位、4位、5位、6位、7位、8位、9位、または10位のアミノ酸は、挿入、欠失、または保存アミノ酸もしくは非保存アミノ酸との置換を有し得ることが考えられる。置換され得るかまたは置換を構成するそのようなアミノ酸は、上記に開示されている。
【0091】
一部の実施形態では、アミノ酸の相違は保存的置換、すなわち、あるアミノ酸を類似の化学的または物理的特性（サイズ、電荷または極性）を有する別のアミノ酸に置換することであり、この置換は一般に抗体の生化学的、生物物理学的および／または生物学的特性に悪影響を及ぼさない。特に、この置換は抗体とSIRPg抗原との相互作用およびアンタゴニスト特性を乱さない。前記保存的置換は、有利には、以下の5つのグループ：グループ1－小さな脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基（A、S、T、P、G）；グループ2－極性、負に荷電した残基およびそのアミド（D、N、E、Q）；グループ3－極性、正に荷電した残基（H、R、K）；グループ4－大きな脂肪族、非極性残基（M、L、I、V、C）；およびグループ5－大きな芳香族残基（F、Y、W）のうちの1つの中から選択される。
【0092】
本開示の特定の態様において、CDRドメインによって上記で定義される抗体またはその抗原結合フラグメントが開示され：
a) 軽鎖可変ドメインは：配列番号53、61、69、77、および85からなる群より選択されるFR1骨格のアミノ酸配列、配列番号54、62、70、78、および86からなる群より選択されるFR2骨格のアミノ酸配列、配列番号55、63、71、79、および87からなる群より選択されるFR3骨格のアミノ酸配列および／または配列番号56、64、72、80、および88からなる群より選択されるFR4骨格のアミノ酸配列を含み；ならびに／または、
b) 重鎖可変ドメインは：配列番号57、65、73、81、および89からなる群より選択されるFR1骨格のアミノ酸配列、配列番号58、66、74、82、および90からなる群より選択されるFR2骨格のアミノ酸配列、配列番号59、67、75、83、および91からなる群より選択されるFR3骨格のアミノ酸配列および／または配列番号60、68、76、84、および92からなる群より選択されるFR4骨格のアミノ酸配列を含む。
a) 軽鎖可変ドメインは：配列番号53、61、69、77、および85からなる群より選択されるFR1骨格のアミノ酸配列、配列番号54、62、70、78、および86からなる群より選択されるFR2骨格のアミノ酸配列、配列番号55、63、71、79、および87からなる群より選択されるFR3骨格のアミノ酸配列および／または配列番号56、64、72、80、および88からなる群より選択されるFR4骨格のアミノ酸配列を含み；ならびに／または、
b) 重鎖可変ドメインは：配列番号57、65、73、81、および89からなる群より選択されるFR1骨格のアミノ酸配列、配列番号58、66、74、82、および90からなる群より選択されるFR2骨格のアミノ酸配列、配列番号59、67、75、83、および91からなる群より選択されるFR3骨格のアミノ酸配列および／または配列番号60、68、76、84、および92からなる群より選択されるFR4骨格のアミノ酸配列を含む。
【0093】
より特定の実施形態において、本開示は、上記のようにCDRドメインによって定義される抗体またはその抗原結合フラグメントに関し：
a) 軽鎖可変ドメインは、以下の骨格：
- 配列番号53のVLFR1、配列番号54のVLFR2、配列番号55のVLFR3、および配列番号56のVLFR4、
- 配列番号61のVLFR1、配列番号62のVLFR2、配列番号63のVLFR3、および配列番号64のVLFR4、
- 配列番号69のVLFR1、配列番号70のVLFR2、配列番号71のVLFR3、および配列番号72のVLFR4、
- 配列番号77のVLFR1、配列番号78のVLFR2、配列番号79のVLFR3、および配列番号80のVLFR4、または
- 配列番号85のVLFR1、配列番号86のVLFR2、配列番号87のVLFR3、および配列番号88のVLFR4、
のアミノ酸配列を含み、ならびに／または
b) 重鎖可変ドメインは、以下の骨格：
- 配列番号57のVHFR1、配列番号58のVHFR2、配列番号59のVHFR3、および配列番号60のVHFR4、
- 配列番号65のVHFR1、配列番号66のVHFR2、配列番号67のVHFR3、および配列番号68のVHFR4、
- 配列番号73のVHFR1、配列番号74のVHFR2、配列番号75のVHFR3、および配列番号76のVHFR4、
- 配列番号81のVHFR1、配列番号82のVHFR2、配列番号83のVHFR3、および配列番号84のVHFR4、または
- 配列番号89のVHFR1、配列番号90のVHFR2、配列番号91のVHFR3、および配列番号92のVHFR4
のアミノ酸配列を含む。
a) 軽鎖可変ドメインは、以下の骨格：
- 配列番号53のVLFR1、配列番号54のVLFR2、配列番号55のVLFR3、および配列番号56のVLFR4、
- 配列番号61のVLFR1、配列番号62のVLFR2、配列番号63のVLFR3、および配列番号64のVLFR4、
- 配列番号69のVLFR1、配列番号70のVLFR2、配列番号71のVLFR3、および配列番号72のVLFR4、
- 配列番号77のVLFR1、配列番号78のVLFR2、配列番号79のVLFR3、および配列番号80のVLFR4、または
- 配列番号85のVLFR1、配列番号86のVLFR2、配列番号87のVLFR3、および配列番号88のVLFR4、
のアミノ酸配列を含み、ならびに／または
b) 重鎖可変ドメインは、以下の骨格：
- 配列番号57のVHFR1、配列番号58のVHFR2、配列番号59のVHFR3、および配列番号60のVHFR4、
- 配列番号65のVHFR1、配列番号66のVHFR2、配列番号67のVHFR3、および配列番号68のVHFR4、
- 配列番号73のVHFR1、配列番号74のVHFR2、配列番号75のVHFR3、および配列番号76のVHFR4、
- 配列番号81のVHFR1、配列番号82のVHFR2、配列番号83のVHFR3、および配列番号84のVHFR4、または
- 配列番号89のVHFR1、配列番号90のVHFR2、配列番号91のVHFR3、および配列番号92のVHFR4
のアミノ酸配列を含む。
【0094】
特定の実施形態において、上記で定義した前記抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、以下の特性の1つまたはそれ以上を有する：
(i) ヒトSIRPgに結合し、好ましくは、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ELISA結合アッセイ、または本発明の実施例に開示される方法（本願の実施例に詳述される方法1.4および図1に詳述される結果を参照）により決定され得るように、100ng/ml以下、好ましくは0.1～100ng/ml、より詳細には5ng/ml～50ng/mlのEC50、またより好ましくは40ng/ml以下、30ng/ml以下、20ng/ml以下のEC50でヒトSIRPgに結合し；および／または前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、サイトフルオロメトリーによる結合アッセイ、または本発明の実施例に開示される方法（本願の実施例に詳述される方法1.5および表5および図2に詳述される結果を参照）により決定され得るように、3.5μg/ml以下、詳細には3μg/ml以下、より詳細には2.5μg/ml以下、2μg/ml以下、1.5μg/ml以下、1μg/ml以下、0.5μg/ml以下のEC50でヒトSIRPgと結合する、
(ii) SIRPg以外の他のSIRPメンバー、例えばSIRPaおよび/またはSIRPb、好ましくはSIRPaと交差反応せず、好ましくは、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ELISA結合アッセイによって決定され得るように、1000ng/mlより大きい、詳細には10000ng/mlより大きいEC50でSIRPaに結合し、より詳細には標準的な結合アッセイ(ELISA結合アッセイなど)では決定できないEC50でSIRPaと結合する；および／または、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、SIRPa-CD47相互作用を阻害せず、好ましくは、前記抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、競合ELISAアッセイにより決定され得るように、400ng/mlより高い濃度、より詳細には800ng/mlより高い濃度、最も詳細には1000ng/mlより高い濃度において、CD47とSIRPaの物理的結合阻害を20％未満、好ましくは10％未満、より好ましくは5％未満可能にする。
(iii) ヒトSIRPgとヒトCD47の相互作用を阻害し、好ましくは、本願の実施例に示される方法（実施例に詳述される方法1.6および図5の結果を参照）を用いて決定されるように、1000ng/mlより低い濃度、より詳細には800ng/mlより低い濃度、最も詳細には400ng/mlより低い濃度で、CD47とSIRPgの物理的結合阻害を60％超、より好ましくは70％超、より好ましくは80％超、最も好ましくは90％超可能にする；
(iv) T細胞の増殖および／またはT細胞の活性化を阻害し、好ましくは、T細胞を活性化しないことが知られているコントロールと比較して、IFNgの分泌を分析することにより評価されるT細胞の活性化を阻害し、特に、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、陰性コントロールと比較して、T細胞、好ましくは慢性的に活性化したT細胞によるIFNgの分泌を減少または阻害し、特に、IFNg分泌の減少または阻害は、当業者に公知の任意の方法、特に本開示の実施例に記載されるように、例えばT細胞（例えば、慢性的に活性化したT細胞）によって分泌されるIFNgのレベルをイムノアッセイ、特にELISA（本出願の実施例の方法1.7および図6を参照）により測定することによって評価すると、20％超、好ましくは30％超、より好ましくは40％超、さらに好ましくは50％超、さらに好ましくは60％超である。
(i) ヒトSIRPgに結合し、好ましくは、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ELISA結合アッセイ、または本発明の実施例に開示される方法（本願の実施例に詳述される方法1.4および図1に詳述される結果を参照）により決定され得るように、100ng/ml以下、好ましくは0.1～100ng/ml、より詳細には5ng/ml～50ng/mlのEC50、またより好ましくは40ng/ml以下、30ng/ml以下、20ng/ml以下のEC50でヒトSIRPgに結合し；および／または前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、サイトフルオロメトリーによる結合アッセイ、または本発明の実施例に開示される方法（本願の実施例に詳述される方法1.5および表5および図2に詳述される結果を参照）により決定され得るように、3.5μg/ml以下、詳細には3μg/ml以下、より詳細には2.5μg/ml以下、2μg/ml以下、1.5μg/ml以下、1μg/ml以下、0.5μg/ml以下のEC50でヒトSIRPgと結合する、
(ii) SIRPg以外の他のSIRPメンバー、例えばSIRPaおよび/またはSIRPb、好ましくはSIRPaと交差反応せず、好ましくは、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ELISA結合アッセイによって決定され得るように、1000ng/mlより大きい、詳細には10000ng/mlより大きいEC50でSIRPaに結合し、より詳細には標準的な結合アッセイ(ELISA結合アッセイなど)では決定できないEC50でSIRPaと結合する；および／または、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、SIRPa-CD47相互作用を阻害せず、好ましくは、前記抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、競合ELISAアッセイにより決定され得るように、400ng/mlより高い濃度、より詳細には800ng/mlより高い濃度、最も詳細には1000ng/mlより高い濃度において、CD47とSIRPaの物理的結合阻害を20％未満、好ましくは10％未満、より好ましくは5％未満可能にする。
(iii) ヒトSIRPgとヒトCD47の相互作用を阻害し、好ましくは、本願の実施例に示される方法（実施例に詳述される方法1.6および図5の結果を参照）を用いて決定されるように、1000ng/mlより低い濃度、より詳細には800ng/mlより低い濃度、最も詳細には400ng/mlより低い濃度で、CD47とSIRPgの物理的結合阻害を60％超、より好ましくは70％超、より好ましくは80％超、最も好ましくは90％超可能にする；
(iv) T細胞の増殖および／またはT細胞の活性化を阻害し、好ましくは、T細胞を活性化しないことが知られているコントロールと比較して、IFNgの分泌を分析することにより評価されるT細胞の活性化を阻害し、特に、前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、陰性コントロールと比較して、T細胞、好ましくは慢性的に活性化したT細胞によるIFNgの分泌を減少または阻害し、特に、IFNg分泌の減少または阻害は、当業者に公知の任意の方法、特に本開示の実施例に記載されるように、例えばT細胞（例えば、慢性的に活性化したT細胞）によって分泌されるIFNgのレベルをイムノアッセイ、特にELISA（本出願の実施例の方法1.7および図6を参照）により測定することによって評価すると、20％超、好ましくは30％超、より好ましくは40％超、さらに好ましくは50％超、さらに好ましくは60％超である。
【0095】
本明細書で言及される特性の組み合わせ（SIRPgのCD47への結合のアンタゴニスト；SIRPgへの特異的結合；SIRPaのCD47への結合のアンタゴニストなし、特にSIRPaおよび／またはSIRPbへの特異的結合なし、特にSIRPaへの結合なし）は、本開示の抗SIRPg抗体またはその抗体結合フラグメントの配列番号1または配列番号2の配列のアミノ酸残基を含むか、それのみからなるか、またはその中に局在しているエピトープへの結合に起因する。
【0096】
本開示によれば、上記のような抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号1または2、好ましくは配列番号2の中に局在するか、またはそれのみからなるポリペプチドに特異的に結合する。
【0097】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原の部分を意味する。タンパク質抗原のエピトープは、コンフォメーションエピトープと線形エピトープの2つのカテゴリーに分けられる。コンフォメーションエピトープは抗原のアミノ酸配列の不連続の部分に相当する。線形エピトープは抗原のアミノ酸の連続した配列に相当する。
【0098】
先の実施形態と組み合わせることができる特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、上記で定義した抗体の抗体フラグメントである。
【0099】
抗体フラグメントは、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、ユニボディ、およびscFvフラグメント、ダイアボディ、シングルドメインまたはナノボディ、および他のフラグメントを含むが、これらに限定されない。好ましくは、scFvフラグメントのFabのような一価抗体である。
【0100】
「ダイアボディ」という用語は、2つの抗原結合部位を持つ小さな抗体フラグメントを指し、この断片は、軽鎖可変ドメイン（VL）と同じポリペプチド鎖（VH-VL）内で結合している重鎖可変ドメイン（VH）を含む。同一鎖上の2つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合することを余儀なくされ、2つの抗原結合部位が形成される。
【0101】
シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全部もしくは一部、または抗体の軽鎖可変ドメインの全部もしくは一部を含む抗体フラグメントである。特定の実施形態において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体（Domantis, Inc. Waltham, MA; 例えば米国特許番号6,248,516 B1を参照）である。抗体フラグメントは、本明細書に記載されているような組換え宿主細胞による産生だけでなく、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を含む様々な技術によって作製することができるがこれらに限定されない。
【0102】
SIRPg抗体をコードする核酸
【0103】
また、本開示の抗SIRPg抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を本明細書において開示する。
【0104】
典型的には、前記核酸はDNAまたはRNA分子であり、プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターのような任意の適切なベクターに含まれ得る。本明細書で使用する場合、「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、DNAまたはRNA配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入し、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することができるビヒクルを意味する。よって、本開示のさらなる目的は、本明細書に記載の核酸を含むベクターに関する。
【0105】
単離された核酸分子または単離された核酸分子の組み合わせ物の例は、前節で開示した抗SIRPg抗体の可変軽鎖および重鎖のアミノ酸配列をコードするものであり、遺伝暗号を使用し、任意に宿主細胞種に応じてコドンバイアスを考慮するものである。
【0106】
特定の実施形態において、本開示は、配列番号93、95、97、99、および101からなる群から選択される可変軽鎖をコードする配列を含むか、または配列番号93、95、97、99、および101からなる群から選択される可変軽鎖をコードする配列のみからなる第1の単離された核酸分子；および／または配列番号94、96、98、100、および102から選択される可変重鎖をコードする配列を含むか、または配列番号94、96、98、100、および102から選択される可変重鎖をコードする配列のみからなる第2の単離された核酸分子に関する。特定の実施形態において、可変軽鎖および重鎖をコードする配列は、同一の核酸分子に含まれる。
【0107】
典型的には、本開示は、配列番号93および配列番号94の配列をそれぞれ含むか、またはそれらのみからなる2H9抗体の可変重鎖および軽鎖をそれぞれコードする第1および第2の核酸分子、配列番号95および配列番号96の配列をそれぞれ含むかまたはそれらのみからなる3H8抗体の可変重鎖および可変軽鎖をそれぞれコードする第1および第2の核酸分子、配列番号97および配列番号98の配列をそれぞれ含むかまたはそれらのみからなる26F10抗体の可変重鎖および軽鎖をそれぞれコードする第1および第2の核酸分子、配列番号99および配列番号100の配列をそれぞれ含むかまたはそれらのみからなる13F7抗体の可変重鎖および軽鎖をそれぞれコードする第1および第2の核酸分子、並びに配列番号101および配列番号102の配列をそれぞれ含むかまたはそれらのみからなる11B5抗体の可変重鎖および軽鎖をそれぞれコードする第1および第2の核酸分子に関する。特定の実施形態では、可変軽鎖および重鎖をコードする配列は同じ核酸分子に含まれる。
【0108】
本開示の特定の実施形態において、上記のような抗体の可変重鎖および軽鎖領域をコードする第1および第2の核酸分子は、それぞれ重鎖および軽鎖定常領域をコードする核酸配列と関連し得、好ましくは、それぞれ配列番号135および136のヌクレオチド配列を含む。
【0109】
別の特定の実施形態において、本開示は、2H9、3H8、26F10、13F7、および11B5の3つのCDRであるVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3をコードする3つの核酸配列を含む軽鎖可変（VL）ドメインをコードする第1の核酸分子に関し、好ましくは、前記第1の核酸分子は、配列番号105、111、117、123、および129からなる群より選択されるVLCDR1をコードする核酸配列、配列番号106、112、118、124、および130からなる群より選択されるVLCDR2をコードする核酸配列、および配列番号107、113、119、125、および131からなる群より選択されるVLCDR3をコードする核酸配列であり、ならびに2H9、3H8、26F10、13F7、および11B5の3つのCDRであるVHCDR1、VHCDR2およびVHCDR3をコードする3つの核酸配列を含む重鎖可変（VH）ドメインをコードする第2の核酸分子に関し、好ましくは、前記第2の核酸分子は、配列番号108、114、120、126、および132からなる群より選択されるVHCDR1をコードする核酸配列、配列番号109、115、121、127、および133からなる群より選択されるVHCDR2をコードする核酸配列、および配列番号110、116、122、128、および134からなる群より選択されるVHCDR3をコードする核酸配列である。特定の実施形態では、可変軽鎖および重鎖をコードする配列は、同じ核酸分子に含まれる。
【0110】
好ましい実施形態において、本開示は、以下：
- 2H9の3つのCDRであるVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号105～107）を含む軽鎖可変（VL）ドメインをコードする第1の核酸分子、および2H9の3つのCDRであるVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号108～110）を含む重鎖可変（VH）ドメインをコードする第2の核酸分子、
- 3H8の3つのCDRであるVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号111～113）を含む軽鎖可変（VL）ドメインをコードする第1の核酸分子、および3H8の3つのCDRであるVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号114～116）を含む重鎖可変（VH）ドメインをコードする第2の核酸分子、
- 26F10の3つのCDRであるVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号117～119）を含む軽鎖可変（VL）ドメインをコードする第1の核酸分子、および26F10の3つのCDRであるVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号120～122）を含む重鎖可変（VH）ドメインをコードする第2の核酸分子、
- 13F7の3つのCDRであるVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号123～125）を含む軽鎖可変（VL）ドメインをコードする第1の核酸分子、および13F7の3つのCDRであるVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号126～128）を含む重鎖可変（VH）ドメインをコードする第2の核酸分子、または
- 11B5の3つのCDRであるVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号129～131）を含む軽鎖可変（VL）ドメインをコードする第1の核酸分子、および11B5の3つのCDRであるVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号132～134）を含む重鎖可変（VH）ドメインをコードする第2の核酸分子
に関する。
- 2H9の3つのCDRであるVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号105～107）を含む軽鎖可変（VL）ドメインをコードする第1の核酸分子、および2H9の3つのCDRであるVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号108～110）を含む重鎖可変（VH）ドメインをコードする第2の核酸分子、
- 3H8の3つのCDRであるVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号111～113）を含む軽鎖可変（VL）ドメインをコードする第1の核酸分子、および3H8の3つのCDRであるVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号114～116）を含む重鎖可変（VH）ドメインをコードする第2の核酸分子、
- 26F10の3つのCDRであるVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号117～119）を含む軽鎖可変（VL）ドメインをコードする第1の核酸分子、および26F10の3つのCDRであるVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号120～122）を含む重鎖可変（VH）ドメインをコードする第2の核酸分子、
- 13F7の3つのCDRであるVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号123～125）を含む軽鎖可変（VL）ドメインをコードする第1の核酸分子、および13F7の3つのCDRであるVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号126～128）を含む重鎖可変（VH）ドメインをコードする第2の核酸分子、または
- 11B5の3つのCDRであるVLCDR1、VLCDR2、およびVLCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号129～131）を含む軽鎖可変（VL）ドメインをコードする第1の核酸分子、および11B5の3つのCDRであるVHCDR1、VHCDR2、およびVHCDR3をコードする3つの核酸配列（それぞれ、配列番号132～134）を含む重鎖可変（VH）ドメインをコードする第2の核酸分子
に関する。
【0111】
特定の実施形態では、可変軽鎖および重鎖をコードする配列は、同じ核酸分子に含まれる。上記定義されたヌクレオチド配列のいずれか1つに対して少なくとも90％、例えば少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する本開示の抗SIRPg抗体をコードする核酸もまた、本開示の一部である。
【0112】
本開示はまた、哺乳動物細胞、例えばCHOまたはHEK細胞株におけるタンパク質発現に最適化された後者の配列に由来する核酸分子にも関する。
【0113】
本開示のポリヌクレオチド、ベクター、または細胞は、周知の組換えDNA技術を用いた本発明のタンパク質の生産に有用である。本開示によるポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知の標準的な方法によって調製される。例えば、PCRまたはRT-PCRによる核酸配列の増幅によって、相同プローブとのハイブリダイゼーションによるゲノムDNAライブラリーのスクリーニングによって、または全合成または部分化学合成によって産生される。組換えベクターは、当該技術分野で知られている従来の組換えDNAおよび遺伝子工学技術によって構築され、宿主細胞に導入される。
【0114】
宿主細胞
【0115】
本開示のさらなる目的は、本発明による核酸および／またはベクターによってトランスフェクト、感染または形質転換された宿主細胞に関する。本明細書で使用する場合、「形質転換」という用語は、宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して所望の物質、典型的には導入された遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素を産生するように、「外来」（すなわち、外因性、または細胞外）遺伝子、DNAまたはRNA配列を宿主細胞に導入することを意味する。導入されたDNAまたはRNAを受容して発現する宿主細胞は、「形質転換」されたという。
【0116】
前記宿主細胞は、サル、ヒト、イヌおよびげっ歯類の細胞を含む哺乳動物細胞などの真核細胞であってもよい。本開示の抗体を発現するための哺乳動物宿主細胞としては、DHFR選択可能マーカー（KaufmanおよびSharp、1982に記載）と共に使用されるdhfr-CHO細胞（UrlaubおよびChasin、1980に記載）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO細胞）、CHOK1 dhfr＋細胞株、NSO骨髄腫細胞、COS細胞およびSP2細胞、例えばGS XceedTM遺伝子発現システム（Lonza）と共に使用されるGS CHO細胞株、HEK-293細胞（ATCC CRL-1573）が挙げられる。好ましい実施形態において、前記宿主細胞は、CHO細胞、またはHEK-293細胞である。
【0117】
抗体を産生する方法
【0118】
本開示の抗体は、例えば、当該技術分野でよく知られているように、組換えDNA技術と遺伝子導入法の組み合わせを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマで産生することができる（Morrison、1985）。軽鎖および重鎖を発現させるためには、重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術により宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」という用語の様々な形態は、原核または真核の宿主細胞に外来性DNAを導入するために一般的に用いられる様々な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラントランスフェクションなどを包含することを意図している。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入されると、宿主細胞における抗体の発現に十分な期間宿主細胞を培養することにより、抗体が産生され、任意で、宿主細胞が増殖している培養液中に抗体が分泌される。抗体は、例えば標準的なタンパク質精製法を用いて、分泌後の培養液から回収・精製することができる（Shukla et al., 2007）。
【0119】
医薬組成物
【0120】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示される抗体、その抗原結合フラグメント、単離された核酸分子および／または単離された核酸分子の組み合わせ物、例えば、2H9、3H8、26F10、13F7、および11B5からなる群から選択される抗体またはその抗原結合フラグメント、または前記抗体または抗原結合フラグメントをコードする核酸分子を含み、薬学的に許容される担体とともに製剤化した組成物、例えば、医薬組成物を提供する。
【0121】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」とは、動物および／またはヒトへの使用について、規制当局または欧州薬局方などの公認薬局方によって承認されていることを意味する。用語「賦形剤」は、治療薬剤とともに投与される希釈剤、アジュバント、担体、またはビヒクルを指す。
【0122】
薬学的に許容される任意の適切な担体、希釈剤または賦形剤は、医薬組成物の調製に使用することができる（例えば、Remington： The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (編) Mack Publishing Company, 1997年4月、を参照）。医薬組成物は通常、無菌であり、製造および保存の条件下で安定である。医薬組成物は、溶液（例えば、生理食塩水、ブドウ糖溶液、緩衝溶液、または他の薬学的に許容される滅菌液）、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高濃度の生成物を収容するのに適した他の秩序構造（例えば、微粒子またはナノ粒子）として製剤化され得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、必要な粒子径の維持、分散液の場合にはさらに界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムなどを組成物に含めることが好ましいであろう。
【0123】
一実施形態において、医薬組成物は、静脈内投与、動脈内投与、皮下投与、腹腔内投与または筋肉内投与に適した組成物を含む非経口医薬組成物である。これらの医薬組成物はただの例であり、他の非経口および経口投与経路に適した医薬組成物を制限するものではない。本明細書に記載の医薬組成物は、単回単位用量または多回用量形態で包装することができる。
【0124】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤として薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、等張液、無菌液、食塩溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウム等、またはこれらの塩の混合物）、または乾燥した、特に凍結乾燥した組成物であってよく、場合によっては、滅菌水または生理食塩水を添加することにより、注射可能な溶液を構成することができる。
【0125】
治療的使用
【0126】
アンタゴニスト抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントは、T細胞の増殖および／または活性化を減少または阻害することができることから、免疫抑制環境を促進することができ、T細胞が有害な影響を及ぼすあらゆる疾患、特に自己免疫疾患、移植機能障害、炎症性疾患の治療に有用である。実際、免疫反応は傷害や疾患に対する宿主の正常な防御反応である一方で、宿主の細胞に敵対する場合には、望ましくない損傷を引き起こすこともある。
【0127】
特定の態様において、本開示は、前記実施形態のいずれか1つに記載の抗体、その抗原結合フラグメント、単離された核酸分子、単離された核酸分子の組み合わせ物、および／または医薬組成物の治療のための使用を提供し、好ましくは、T細胞が有害な影響を及ぼす疾患、特に自己免疫疾患、慢性炎症性疾患などの炎症性疾患、慢性神経炎症性疾患、免疫代謝性疾患、全身性炎症に起因する心臓血管疾患、または移植機能不全を治療、予防、または進行抑制するための使用を提供する。
【0128】
T細胞が有害な影響を及ぼす疾患又は障害には、したがって、T細胞の増殖および／または活性化および／または遊走および／またはT細胞による組織浸潤が有害な作用を有する任意の疾患または障害、好ましくは、T細胞の増殖および／または活性化が有害な影響を及ぼす疾患または障害が含まれ得る。
【0129】
免疫抑制剤で、したがって本開示による抗SIRPg抗体またはその抗原結合フラグメントで治療することができる疾患は、当技術分野で周知であり、特に、T細胞が有害な影響を及ぼす疾患または障害は、以下：
- 自己免疫疾患、特に関節リウマチ、I型糖尿病、狼瘡、乾癬、
- 炎症性疾患、例えば慢性炎症性疾患、特にクローン病や潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患；または慢性神経炎症性疾患、特に多発性硬化症、脳脊髄炎、
- 免疫代謝疾患、特にII型糖尿病、
- 全身性炎症に起因する心臓血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症、および
- 移植機能障害または拒絶反応、特に移植片対宿主病、
- リンパ増殖性疾患、特にT細胞リンパ腫または移植後リンパ増殖性疾患
からなる群から選択することができる。
- 自己免疫疾患、特に関節リウマチ、I型糖尿病、狼瘡、乾癬、
- 炎症性疾患、例えば慢性炎症性疾患、特にクローン病や潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患；または慢性神経炎症性疾患、特に多発性硬化症、脳脊髄炎、
- 免疫代謝疾患、特にII型糖尿病、
- 全身性炎症に起因する心臓血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症、および
- 移植機能障害または拒絶反応、特に移植片対宿主病、
- リンパ増殖性疾患、特にT細胞リンパ腫または移植後リンパ増殖性疾患
からなる群から選択することができる。
【0130】
特定の実施形態において、T細胞の増殖および／または活性化および／または遊走および／または組織浸潤が有害な影響を有する疾患または障害は、移植機能障害、特に移植片対宿主病、特にT細胞リンパ腫または移植後リンパ増殖性疾患である。
【0131】
本明細書で使用される場合、用語「対象」または「患者」は、哺乳類を指す。開示された治療方法から恩恵を受けることができる哺乳動物種は、ヒト、類人猿、チンパンジー、サル、およびオランウータンなどのヒト以外の霊長類、イヌおよびネコを含む家畜化動物、ならびにウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、およびヤギなどの家畜、または限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ハムスターなどを含む他の哺乳動物種、を含むがこれらに限定されない。
【0132】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」または「処置する」という用語は、疾患の治療、防止、予防および遅延など、患者の健康状態を改善することを意図した任意の行為を指す。特定の実施形態において、このような用語は、疾患又は疾患に関連する症状の改善又は根絶を指し、例えば、本開示によれば、免疫抑制環境の促進、特にT細胞の増殖および／または活性化および／または遊走および／またはT細胞による組織浸潤の予防または阻害を指す。他の実施形態では、この用語は、このような疾患を有する対象への1つ以上の治療薬の投与によって生じる疾患の拡大または悪化を最小限に抑えることを指す。
【0133】
さらなる態様において、それを必要とする対象において、上記のようなT細胞が有害な影響を有する疾患または障害を治療、予防または緩和する方法に関し、その方法は、治療有効量の上述の抗体および／またはその抗原結合フラグメントおよび／または単離された核酸分子および／または単離された核酸分子の組み合わせ物および／または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【0134】
さらなる態様において、本開示は、本開示による治療有効量の抗SIRPg抗体および／またはその抗原結合フラグメントおよび／または単離された核酸分子および／または単離された核酸分子の組み合わせ物および／または医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む疾患の治療方法に関し、前記疾患は、以下：自己免疫疾患、炎症性疾患、免疫代謝疾患、全身性炎症に起因する心臓血管疾患、および移植機能不全または拒絶反応からなる群より選択され、特に、T細胞の増殖および／または活性化および／または遊走および／またはT細胞による組織浸潤を阻害することによる。
【0135】
さらなる態様において、本開示は、本開示による治療有効量の抗SIRPg抗体および／またはその抗原結合フラグメントおよび／または単離された核酸分子および／または単離された核酸分子の組み合わせ物および／または医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む疾患の治療方法に関し、前記疾患は、以下：自己免疫疾患、炎症性疾患、免疫代謝疾患、全身性炎症に起因する心臓血管疾患、および移植機能不全または拒絶反応からなる群より選択され、前記疾患は、T細胞の増殖および／または活性化および／または遊走および／またはT細胞による組織浸潤に関する。
【0136】
さらなる態様において、対象は、T細胞の増殖および／または活性化および／または遊走および／またはT細胞による組織浸潤に伴って生じる、自己免疫疾患、炎症性疾患、免疫代謝疾患、全身性炎症に起因する心臓血管疾患、および移植機能不全または拒絶反応からなる群から選択される疾患を有する。
【0137】
本発明の文脈において、「有効量」とは、治療において有効な量を意味する。本明細書で使用される場合、「治療有効量」とは、所望の治療結果、例えばT細胞が有害な影響を有する疾患または障害の予防または治療などを達成するために必要な投与量および期間において有効な量を意味する。本発明の製品またはそれが含む医薬組成物の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、体重などの因子、および製品または医薬組成物の、個体において所望の応答を得る能力に応じて変化し得る。用法・用量は、最適な治療反応を提供するように調整され得る。治療有効量とはまた、典型的には、製品または医薬組成物の毒性または有害作用を、治療上有益な効果が上回る量である。
【0138】
本開示の製品は、典型的には、医薬組成物または医薬品に、任意選択で医薬担体、希釈剤および／またはアジュバントと組み合わせて含まれることになる。このような組成物または医薬品製品は、所望の治療効果を提供するのに十分な有効量の本開示の製品、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
【0139】
一実施形態では、治療的使用のための抗体および／またはその抗原結合フラグメント、および／または単離された核酸分子および／または単離された核酸分子の組み合わせ物、および／または医薬組成物は、非経口経路、特に静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内経路によって、対象または患者に投与される。
【0140】
対象または患者に投与される本開示の製品の量は、個体の年齢、性別、および体重、疾患の性質および病期、疾患の攻撃性、投与経路、および／または対象または患者に処方された併用薬を含む、個々の対象または患者の特定の状況に応じて変化し得る。用法・用量は、最適な治療反応を提供するように調整され得る。
【0141】
任意の特定の対象について、特定の用法・用量は、個々の要求および組成物を投与する者または投与を監督する者の専門的判断に従って、経時的に調整され得る。本明細書に記載される用量範囲は例示的なものにすぎず、医療従事者が選択し得る用量範囲を制限するものではない。
【0142】
抗体またはその抗原結合フラグメント、単離された核酸分子、単離された核酸分子の組み合わせ物、および／またはその医薬組成物は、約1ng/kg体重から約30mg/kg体重、またはそれ以上の有効量で提供され得る。具体的な実施形態において、投与量は、1μg/kg～約20mg/kg、任意選択で10μg/kg～10mg/kg、または100μg/kg～5mg/kgの範囲であり得る（kg：対象または患者の体重）。
【0143】
本方法の特定の実施形態において、本開示の抗SIRPg抗体、その抗原結合フラグメント、単離された核酸分子、単離された核酸分子の組み合わせ物、および／またはその医薬組成物の投与は、陰性対照と比較して20％超、より詳細には50％超、最も好ましくは70％超、T細胞の増殖を減少または阻害する。
【0144】
別の特定の実施形態において、本開示の抗SIRPg抗体、その抗原結合フラグメント、単離された核酸分子、単離された核酸分子の組み合わせ物、および／またはその医薬組成物の投与は、T細胞の活性化を阻害し、特に、T細胞によるインターフェロンガンマ（IFNg）サイトカインの分泌を阻害し、特に、陰性対照と比較して、T細胞によるIFNg分泌を減少または阻害し、特に、IFNg分泌の減少または阻害は、20％超、好ましくは30％超、好ましくは40％超、より好ましくは50％超である。前記陰性対照は、前記抗体を含まない培地またはT細胞を活性化しないことが知られている抗体であり得る。
【0145】
本開示はまた、上記のようなT細胞が有害な作用を有する疾患または障害、特にヒト疾患またはヒト障害の予防および／または治療のための医薬の製造における、本開示による特異的抗SIRPg抗体、その抗原結合フラグメント、単離された核酸分子、単離された核酸分子の組み合わせ物、および／または医薬組成物の使用に関する。
【0146】
さらなる態様において、本発明は、T細胞応答、特にT細胞の増殖および／またはT細胞の活性化および／またはT細胞の遊走および／またはT細胞による組織浸潤、より詳細にはIFNg分泌（T細胞および／またはNK細胞、特にT細胞、より詳細には慢性的に活性化したT細胞による）を阻害するための方法に関し、当該方法は以下：
- T細胞が有害な影響を有する障害を有する患者を選択すること；および
- 本開示による有効量の抗SIRPg抗体および／またはその抗原結合フラグメントおよび／または単離された核酸分子および／または単離された核酸分子の組み合わせ物および／または医薬組成物を当該患者に投与すること
を含む。
- T細胞が有害な影響を有する障害を有する患者を選択すること；および
- 本開示による有効量の抗SIRPg抗体および／またはその抗原結合フラグメントおよび／または単離された核酸分子および／または単離された核酸分子の組み合わせ物および／または医薬組成物を当該患者に投与すること
を含む。
【0147】
さらなる態様において、本発明は、T細胞応答、特にT細胞の増殖および／またはT細胞の活性化および／またはT細胞の遊走および／またはT細胞による組織浸潤、より詳細にはIFNg分泌（T細胞および／またはNK細胞、特にT細胞、より詳細には慢性的に活性化したT細胞による）を阻害するための方法に関し、当該方法は本開示による有効量の抗SIRPg抗体および／またはその抗原結合フラグメントおよび／または単離された核酸分子および／または単離された核酸分子の組み合わせ物および／または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【0148】
特に、患者は、自己免疫疾患、炎症性疾患、免疫代謝疾患、全身性炎症に起因する心臓血管疾患、および移植機能障害または拒絶反応からなる群から選択される疾患を有する。
【0149】
さらなる態様において、患者は、T細胞の増殖および／または活性化および／または遊走および／またはT細胞による組織浸潤に伴って生じる、自己免疫疾患、炎症性疾患、免疫代謝疾患、全身性炎症に起因する心臓血管疾患、および移植機能障害または拒絶反応からなる群から選択される疾患を有する。
【0150】
組み合わせ製品
【0151】
上記の抗SIRPg抗体、その抗原結合フラグメント、単離された核酸分子、単離された核酸分子の組み合わせ物及び／又は医薬組成物は、単独で又は別の治療薬、例えば、第2のヒトモノクローナル抗体又はその抗原結合フラグメントと組み合わせて投与することができる。例えば、上記の抗SIRPg抗体、その抗原結合フラグメント、単離された核酸分子、単離された核酸分子の組み合わせ物、および／または医薬組成物は、別の薬剤、例えば、免疫療法剤、免疫抑制剤、赤血球生成促進因子（ESA）、プロアポトーシス剤、抗生物質、プロバイオティクス、治療用細胞組成物との組み合わせ物などとともに投与される。
【0152】
一実施形態において、本開示は、上記に記載した使用のための上記の抗SIRPg抗体、その抗原結合フラグメント、単離された核酸分子、単離された核酸分子の組み合わせ物、および／または医薬組成物に関し、上記の抗SIRPg抗体、その抗原結合フラグメント、単離された核酸分子、単離された核酸分子の組み合わせ物、および／または医薬組成物は、第2の治療薬と組み合わされる。
【0153】
第2の薬剤の投与は、本開示による特定の製品の投与と同時でも同時でなくてもよい。第2の薬剤の性質に応じて、共投与剤を「コンボ」としても知られる配合剤の形態で調製することができる。コンボは固定用量の配合剤であり、単一の剤形に組み合わされた2つ以上の活性医薬成分を含み、固定用量で製造および分配される。しかし、用法・用量や投与経路が異なることもある。
【0154】
好ましい実施形態において、この第2の治療剤は、免疫治療剤、免疫抑制剤、プロアポトーシス剤、抗生物質、およびプロバイオティクスからなる群より選択される。
【0155】
好ましい実施形態において、この第2の治療剤は、シクロスポリンA、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン、ステロイド、抗TNF剤、抗IL-23剤からなる群から選択される免疫抑制剤である。
【0156】
本開示はまた、以下：
- 上記の特異的抗SIRPg抗体、その抗原結合フラグメント、単離された核酸分子、単離された核酸分子の組み合わせ物、および／または医薬組成物、および
- 免疫療法剤、免疫抑制剤、プロアポトーシス剤、抗生物質およびプロバイオティクスからなる群より選択される第2の治療剤
を含む、医薬としての同時、別個または連続的な使用のための、特に、T細胞の活性化および／または増殖が有害な影響を有する疾患または障害の予防および／または治療のための組み合わせ製品に関する。
- 上記の特異的抗SIRPg抗体、その抗原結合フラグメント、単離された核酸分子、単離された核酸分子の組み合わせ物、および／または医薬組成物、および
- 免疫療法剤、免疫抑制剤、プロアポトーシス剤、抗生物質およびプロバイオティクスからなる群より選択される第2の治療剤
を含む、医薬としての同時、別個または連続的な使用のための、特に、T細胞の活性化および／または増殖が有害な影響を有する疾患または障害の予防および／または治療のための組み合わせ製品に関する。
【0157】
このような目的での投与は、必要に応じて繰り返すことができ、例えば、毎日、半週ごと、毎週、半月ごと、毎月、または再発時に必要に応じて繰り返すことができる。
【0158】
キット
【0159】
別の態様において、本開示はさらに、本発明の抗体または抗原結合フラグメント、核酸、宿主細胞または医薬組成物を1つまたは複数の容器に含むキットに関する。キットは、キット内に含まれる製品を患者に投与する方法を記載する説明書または包装材料を含み得る。キットの容器は、任意の適切な材料、例えば、ガラス、プラスチック、金属など、および任意の適切なサイズ、形状、または構造であり得る。特定の実施形態では、キットは、適切な液体または溶液の形態の本発明の製品が入っている1つまたは複数のアンプルまたはシリンジを含み得る。
【0160】
次に、本発明を、添付の図を参照しながら、限定的ではない以下の実施例により例示する。
【実施例】
【0161】
１．方法
【0162】
１．１ マウス抗ヒトSIRPgモノクローナル抗体の調製、選別および特性解析
【0163】
マウスをヒトSIRPg His（Hisタグを有する組換えヒトSIRPgタンパク質、#11828-H08H、Sino Biological）で免疫化し、標準的方法に従ってモノクローナル抗体を誘導した。免疫付与プロトコルはDiaclone SAS（Besancon、フランス）により行った：1μgのヒトSIRPgタンパク質を3匹のBALB/c系統マウスにfootpad法で投与し、最初の3回の注射は週に1日、4回目の注射は2週間後に行い、その1週間後に最後の注射を行った。35日目の5回目の注射は、神経節細胞を採取する前のブーストと見なした。ハイブリドーマを、神経節細胞をマウス骨髄腫X63/AG.8653と融合させることによって得た。ハイブリドーマをまず、分泌モノクローナル抗体がビオチン化ヒトSIRPgタンパク質（#11828-H08H、Sino Biological、DiaCloneによってビオチンを結合した）と特異的に結合する能力、およびヒトTリンパ球Jurkat細胞株表面のヒトSIRPgタンパク質と特異的に結合する能力によってスクリーニングした。次に、ハイブリドーマが、分泌されたモノクローナル抗体がビオチン化ヒトSIRPgタンパク質には特異的に結合するが、ヒトSIRPa His（Hisタグを有する組換えヒトSIRPaタンパク質、#11612-H08H、Sino Biological）には結合しないこと、および、Jurkat細胞には特異的に結合するが、SIRPa陽性のU937ヒト単球細胞株および陰性対照のRAJIヒトBリンパ腫細胞株には結合しないことを確認した。選択後、ハイブリドーマをクローニングし、RPMI完全培地で培養した。上清をプロテインAアフィニティクロマトグラフィー（DiaClone, Besancon, France）で、グリシン0.1M pH2.8溶出緩衝液を用いて精製した。精製抗体の活性を、ヒトSIRPタンパク質に対するELISA、SIRP細胞株およびヒト初代血球細胞に対するフローサイトメトリーアッセイで測定した。
【0164】
１．２ キメラ抗体の調製
【0165】
抗SIRPガンマAbの重鎖を構築するために、2H9、3H8、11B5、13F7または26F10配列から可変ドメインVHを合成し、ヒンジ領域を安定化するために変異（S228P）させたヒトIgG4のFcを含むpcDNA3.4CHIg-hG4m発現プラスミド（pcDNA3.4ベクター、Invitrogen、Toulouse）にEcoRVを用いてクローニングした。抗SIRPガンマAbの軽鎖を構築するために、2H9、3H8、11B5、13F7または26F10配列から同一の可変ドメインVLを合成し、ヒトCLkappaを含むpcDNA3.4CLIg-hk発現プラスミド（pcDNA3.4ベクター、Invitrogen、Toulouse）にBsiWIを用いてクローニングした。HEK 293 Freestyle細胞において、本発明者らは、lipofectamine法により、VH2H9-FcG4、VH3H8-FcG4、VH11B5-FcG4、VH13F7-FcG4、またはVH26F10-FcG4を含むプラスミドを、VL-CLkappaを含むプラスミドと共導入した。6日間インキュベートした後、上清を回収し、クエン酸0.1M pH3溶出緩衝液を用いてプロテインAアフィニティクロマトグラフィー（HiTrap, GE healthcare）で精製した。精製した抗体をPBSで透析し、濃縮した。UV（A280nm）で定量し、SIRPgに対する活性アッセイで試験した。
【0166】
１．３ キメラ抗体のELISA SIRPa結合アッセイ
【0167】
ヒトSIRPa結合アッセイのために、組換えヒトSIRPa（#11612-H08H、Sino Biological）を炭酸緩衝液（pH9.2）中0.5μg/ml（SIRPa）でプラスチック上に固定した。飽和後、精製した抗体を（初期濃度10μg/mlからの）範囲内で添加し、結合を測定した。インキュベーションと洗浄を行った後、ペルオキシダーゼ標識ロバ抗ヒトIgG（#709-035-149、Jackson Immunoresearch）を添加し、標準的方法により可視化した。
【0168】
１．４ キメラ抗体のELISA ヒトSIRPg結合アッセイ
【0169】
ヒトSIRPg結合アッセイのために、精製した抗体をホウ酸緩衝液中2μg/mlで固定したコートされたロバ抗ヒトIgG（H+L）（#709-005-098、Jackson Immunoresearch）で（初期濃度5μg/mlからの）範囲内で捕捉した。洗浄した後、ビオチン化SIRPg（#11828-H08H、Sino Biological、ビオチン化はOse Immunotherapeuticsにより実施）を1μg/mlで添加し、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ（#016-030-084、Jackson Immunoresearch）で可視化した。
【0170】
１．５ サイトフルオロメトリーによるヒトJurkatへのヒトSIRPg結合アッセイ
【0171】
マウス抗hSIRPgのヒト細胞株への結合を測定するために、まず細胞を冷PSE（2％の熱不活化ウシ血清、2mM EDTAを含むリン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、50倍に希釈したヒトFc-ブロック（#564220、BD Pharmingen）と20倍に希釈/熱不活化したヒト血清（SAB、# H4522-100、Sigma Aldrich）の混合液で室温で30分間ブロッキングし、次に氷上で10分間インキュベートして細胞の代謝を遅くさせた。範囲内の抗体を氷上で30分間インキュベートし、細胞を冷PSEで洗浄してから5μg/mlのAlexa 647標識ヤギ抗マウスIgG（#A21236; Fisher Scientific、Illkirch、France）を用いて氷上で30分間染色した。サンプルはCytoFlexサイトフルオロメーター（Beckman Coulter France, Villepinte）で分析した。
【0172】
１．６ ELISAにより測定したヒトSIRPgとヒトSIRPaのアンタゴニスト活性
【0173】
アンタゴニスト活性ELISAアッセイのために、組換えヒトSIRPg（#11828-H08H、Sino Biological）または組換えヒトSIRPa（#11612-H08H、Sino Biological）を、それぞれ2μg/ml（SIRPg）および0.5μg/ml（SIRPa）の炭酸緩衝液（pH9.2）中でプラスチック上に固定した。飽和の間、ビオチン化ヒトCD47（#CD7-H82F6、Acrobio）を独自の濃度（最終濃度3μg/ml）で範囲内の精製抗体と室温で15分間プレインキュベートした。次に、プレインキュベートした[CD47-biot/精製抗体]混合物を固定化SIRPg上（室温でO/N）または固定化SIRPa上（37℃で2時間）でインキュベートした。インキュベーションおよび洗浄後、ストレプトアビジン-ペルオキシダーゼ（#016-030-084、Jackson Immunoresearch）を添加し、標準的方法により可視化した。
【0174】
１．７ 機能分析
【0175】
疲弊したT細胞について、3μg/mlの抗CD3（OKT3）と3μg/mlの可溶性抗CD28.2をコートしたプレート中で、完全培地中で3回PBMCを刺激した。機能分析では、疲弊したまたは刺激されていないPBMCを、0.5μg/mlの抗CD3（OKT3）と10μg/mlのヒトCD47Fc組み換えタンパク質（#12283-H02H、SinoBiological）でコートしたプレート中で活性化した。次に、抗体を、疲弊したまたは刺激されていないPBMCと共にプレート上で2日間インキュベートし、IFNg分泌を測定し（#555142、BDBiosciences）、また、37℃、5％CO2で5日間インキュベートし、530nmでのAlamarBlue検出（#DAL1100、Invitrogen）により増殖を測定した。
【0176】
２．結果
【0177】
２．１ 2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体のより高い生産性
【0178】
2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体の生産性を先行技術A1、A5、およびA8抗体（WO2020/039049）と比較した。哺乳動物細胞における生産収量を以下の表4に示す：
【表4】
【0179】
2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体の生産収量は、先行技術の抗SIRPg抗体A1、A5およびA8の100～100,000倍であり、臨床用途に適している。
【0180】
２．２ 2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体のSIRPgへの高い結合親和性
【0181】
ELISAヒトSIRPg結合アッセイで測定した精製2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体の結合親和性を、先行技術の抗体Kwar23（国際出願WO2015/138600に開示された配列に基づいて自製した）、A1およびA5抗体と比較した。図1に示すように、2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体は、抗SIRPα抗体およびγKwar23抗体と同様の結合親和性を示し、先行技術のA1抗体およびA5抗体と比較してSIRPgに対してより高い結合親和性を示した。
【0182】
精製2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体のヒトJurkat細胞への結合親和性を、先行技術のLSB2.20（Biolegend、参照番号336602）およびOX119抗体（SantaCruz 参照番号sc-53114）と比較した。図2および以下の表5に示すように、サイトフルオロメトリーによるヒトJurkat細胞上のヒトSIRPg結合アッセイで測定した2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7のSIRPgに対する結合親和性は、先行技術のLSB2.20抗体およびOX119抗体よりも高い。
【0183】
【表5】
【0184】
２．３ 2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体はSIRPg特異的である（SIRPaに結合せず、SIRPa-CD47相互作用へのアンタゴニスト活性を有しない）
【0185】
2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体の交差反応性を調べるために、ELISA SIRPa結合アッセイを行った。図3に示すように、Kwar23抗体はSIRPaに結合親和性を示したが、2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体はSIRPaに結合しなかった。これらの結果は、以下の表6に示すように、U937細胞への結合アッセイとBLITZアッセイにより確認された：
【表6】
【0186】
SIRPa-CD47相互作用に対するヒトSIRPaアンタゴニスト活性をELISAにより測定した。図4に示すように、抗SIRPα抗体およびγKwar23抗体は、SIRPa-CD47の相互作用を阻害し、同様にOX119抗体はより低い程度で阻害するが、2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体はSIRPa-CD47の相互作用を阻害しなかった。
【0187】
これらの結果は、2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体はSIRPgに選択的に結合し、SIRPaとは交差反応性を示さないことを示している。実際のところ、これらの抗体はヒトSIRPaには結合せず、ヒトSIRPa-CD47相互作用に対するアンタゴニスト活性も示さない。
【0188】
２．４ 2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体のSIRPg-CD47相互作用に対する効率的なSIRPgアンタゴニスト活性
【0189】
2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体のSIRPg-CD47相互作用に対するヒトSIRPgアンタゴニスト活性をELISAにより測定した。図5に示すように、2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体はSIRPg-CD47の相互作用を効果的に阻害した。
【0190】
２．５ 機能分析―2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体によるT細胞活性化阻害
【0191】
生物学的アッセイでは、CD47依存性であらかじめ活性化されたPBMC（CD3-CD28）を、CD47と抗CD3のコーティング上で刺激した。この細胞は上清中においてIFNgサイトカインの分泌を誘導した。このCD47依存性の生物学的アッセイにおいて、図6に示すように、本発明者らは、抗SIRPα抗体およびγKwar23抗体（SIRPa-CD47相互作用のアンタゴニスト）のように、抗SIRPg 2H9、3H8、11B5、26F10、および13F7抗体が、先行技術のLSB2.20およびOX119抗体とは対照的に、IFNgの分泌を効率的に阻害できることを観察した。
【産業上の利用可能性】
【0192】
結論として、先行技術の抗体とは異なり、本開示の抗体は、臨床使用に適した高い収量で製造することができ、さらに、SIRPgに選択的に結合し、SIRPaと交差反応せず、SIRPa-CD47相互作用のアンタゴニストではないが、SIRPg-CD47相互作用の有力な阻害剤である。本開示の抗体のSIRPg-CD47相互作用に対する前記アンタゴニスト活性は、IFNg分泌の減少によって示されるように、T細胞の活性化を低下させる。したがって、前記抗体は、T細胞が有害な作用を有する疾患の予防および治療に適切である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】
【国際調査報告】