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特表2024-541593レシオメトリック核酸検出用ルシフェラーゼ－インターカレート色素複合体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-08
(54)【発明の名称】レシオメトリック核酸検出用ルシフェラーゼ－インターカレート色素複合体
(51)【国際特許分類】
C12N 9/02 20060101AFI20241031BHJP
C12Q 1/66 20060101ALI20241031BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241031BHJP
C12Q 1/6848 20180101ALI20241031BHJP
C12N 9/14 20060101ALI20241031BHJP
C12N 9/16 20060101ALI20241031BHJP
C07K 7/00 20060101ALI20241031BHJP
【ＦＩ】
C12N9/02
C12Q1/66 ZNA
C12Q1/686 Z
C12Q1/6848 Z
C12N9/14
C12N9/16 B
C07K7/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024532246
(86)(22)【出願日】2022-11-28
(85)【翻訳文提出日】2024-07-22
(86)【国際出願番号】 NL2022050685
(87)【国際公開番号】W WO2023096493
(87)【国際公開日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】2029944
(32)【優先日】2021-11-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】NL
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501276430
【氏名又は名称】テクニーシェ・ユニバーシタイト・アイントホーベン
(74)【代理人】
【識別番号】100105924
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 賢樹
(72)【発明者】
【氏名】デ スティグター、ヨスタ
(72)【発明者】
【氏名】ロージア、バス
(72)【発明者】
【氏名】メルクス、マールテン
【テーマコード（参考）】
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS24
4B063QS25
4B063QS32
4B063QX02
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA70
4H045DA89
4H045EA20
4H045EA53
(57)【要約】
二本鎖ＤＮＡを検出し、定量するためのプローブが開示される。このプローブは、発光発生ドメインとインターカレート蛍光色素とを含む。プローブは、定量的ＤＮＡ増幅反応に使用することができる。さらに、本明細書に記載のプローブを用いて二本鎖ＤＮＡを検出または定量する方法が開示される。また、ＤＮＡの検出または定量におけるプローブの使用も記載されている。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
二本鎖ＤＮＡの検出用のインターカレート色素プローブであって、前記色素は、１つ以上のインターカレート蛍光色素に結合した発光タンパク質を含むインターカレート色素プローブ。
【請求項2】
前記発光タンパク質が生物発光タンパク質または化学発光を増強するのに使用される酵素である請求項１に記載のインターカレート色素プローブ。
【請求項3】
前記生物発光タンパク質が、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質であり、好ましくはｎａｎｏｌｕｃ、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、カイアシ類ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、深海エビルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、ＴｕｒｂｏＬｕｃルシフェラーゼ、Ａｌｕｃルシフェラーゼ、またはそれらの触媒活性断片から選択される請求項２に記載のインターカレート色素プローブ。
【請求項4】
前記ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１～７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む請求項３に記載のインターカレート色素プローブ。
【請求項5】
前記化学発光を増強するのに使用される酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリンホスファターゼから選択される請求項２に記載のインターカレート色素プローブ。
【請求項6】
前記インターカレート蛍光色素が、アクリシンオレンジ、チアゾールオレンジ、エチジウムブロミド、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲゴールド、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、ＥｖａＲｕｂｙ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ－９、ＴＯＴＯ－１、およびＹＯＹＯ－１から選択される請求項１～５のいずれか１項に記載のインターカレート色素プローブ。
【請求項7】
追加のＤＮＡ結合ドメインをさらに含む請求項１～６のいずれか１項に記載のインターカレート色素プローブ。
【請求項8】
溶液中の二本鎖ＤＮＡの検出方法であって、請求項１～７のいずれか１項に記載のインターカレート色素プローブおよび発光ドメインの適した基質と、前記溶液とインキュベートするステップと、
前記インターカレート蛍光色素によって発せられた光を検出するステップと、
を備える二本鎖ＤＮＡの検出方法。
【請求項9】
二本鎖ＤＮＡの定量に使用され、さらに、前記発光ドメインによって発せられた光を検出するステップと、
前記インターカレート蛍光色素によって発せられた光と前記発光ドメインによって発せられた光の比率に基づいて二本鎖ＤＮＡの量を定量するステップと、を備える請求項８に記載の二本鎖ＤＮＡの検出方法。
【請求項10】
ＤＮＡ増幅反応の前、ＤＮＡ増幅反応の間、および／またはＤＮＡ増幅反応の後に実施される請求項８または９に記載の二本鎖ＤＮＡの検出方法。
【請求項11】
前記ＤＮＡ増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リコンビナーゼ・ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）、ローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）または分岐増幅法（ＲＡＭ）から選択される請求項１０に記載の二本鎖ＤＮＡの検出方法。
【請求項12】
請求項１～７のいずれか１項に記載のインターカレート色素プローブと、発光ドメインの適した基質とを含む部品キット。
【請求項13】
前記基質がルシフェリン、好ましくはフリマジン、ホタルルシフェリン、ラチア（巻き貝）ルシフェリン、細菌ルシフェリン、セレンテラジン、渦鞭毛藻ルシフェリン、ヴァルグリン、３－ヒドロキシヒスピジン、ルミノールまたはＨ２Ｏ２である請求項１２に記載の部品キット。
【請求項14】
二本鎖ＤＮＡの検出方法における請求項１～７のいずれか１項に記載のインターカレート色素プローブの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、二本鎖ＤＮＡを検出するか、かつ／または定量するプローブに関する。本発明は、特に、発光を利用したインターカレートプローブ、およびそのようなプローブを用いて二本鎖ＤＮＡを検出または定量する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
（序論）
ＤＮＡおよびＲＮＡの検出は、ウイルスや細菌などの病原体による感染症の診断や予防の基本である。ＤＮＡ検出の基準はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、このＰＣＲは、標的ＤＮＡの単一断片から大量の同一コピーを迅速に生成することに基づいている。ＰＣＲは、標的ＤＮＡに結合する短いＤＮＡプライマーの結合に依存し、その後ＤＮＡポリメラーゼ酵素が標的の鋳型に基づいて新しいＤＮＡ断片を生成する。この目的のために、ＰＣＲは、反応混合物の温度を５０－９８℃で変化させる３つの異なる熱サイクルステップを必要とする。ＰＣＲ中のＤＮＡをモニターし、定量するために、ＤＮＡに結合すると蛍光が大きく増加するインターカレート色素分子が使用される。蛍光シグナルはレーザーやＬＥＤのような光励起源を用いて生成され、その後、集められた光の強度がＤＮＡ濃度の尺度として用いられる。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）はＤＮＡを高感度で検出できることが示されているが、高価な専用装置（レーザー、光学系、温度コントローラーを含む）の使用が制限されているか、あるいは望ましくない状況、例えばポイント・オブ・ケア診断検査などでは、必要なセットアップが法外になることがある。さらに、蛍光はバックグラウンドシグナルが高いという問題があり、患者の血液のような複雑な媒体中で測定を行う場合に問題となる。
ＤＮＡおよびＲＮＡの検出は、ウイルスや細菌などの病原体による感染症の診断や予防の基本である。ＤＮＡ検出の基準はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、このＰＣＲは、標的ＤＮＡの単一断片から大量の同一コピーを迅速に生成することに基づいている。ＰＣＲは、標的ＤＮＡに結合する短いＤＮＡプライマーの結合に依存し、その後ＤＮＡポリメラーゼ酵素が標的の鋳型に基づいて新しいＤＮＡ断片を生成する。この目的のために、ＰＣＲは、反応混合物の温度を５０－９８℃で変化させる３つの異なる熱サイクルステップを必要とする。ＰＣＲ中のＤＮＡをモニターし、定量するために、ＤＮＡに結合すると蛍光が大きく増加するインターカレート色素分子が使用される。蛍光シグナルはレーザーやＬＥＤのような光励起源を用いて生成され、その後、集められた光の強度がＤＮＡ濃度の尺度として用いられる。定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）はＤＮＡを高感度で検出できることが示されているが、高価な専用装置（レーザー、光学系、温度コントローラーを含む）の使用が制限されているか、あるいは望ましくない状況、例えばポイント・オブ・ケア診断検査などでは、必要なセットアップが法外になることがある。さらに、蛍光はバックグラウンドシグナルが高いという問題があり、患者の血液のような複雑な媒体中で測定を行う場合に問題となる。
【0003】
ＰＣＲベースの検出戦略の複雑さを軽減し、ポイント・オブ・ケア・アプリケーションに移行するために、いくつかの代替アプローチが研究されてきた。確立された戦略は、一定の温度で増幅できる等温核酸増幅法を用いることで、熱サイクル装置の必要性をなくすことである。最近注目されている２つの例は、ＳＨＥＲＬＯＣＫおよびＤＥＴＥＣＴＲプラットフォームであり、等温増幅法と、高度に特異的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列を認識できるＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を組み合わせたものである。（Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３ａ／Ｃ２ｃ２．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５６，４３８－４４２（２０１７）； Ｃｈｅｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１２ａ ｔａｒｇｅｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｕｎｌｅａｓｈｅｓ ｉｎｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．３６０，４３６－４３９（２０１８））。ＳＨＥＲＬＯＣＫ法は、リコンビナーゼ・ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）による等温増幅を利用するもので、プライマーの結合とその後のＤＮＡ増幅に３種類の酵素を利用する。３７－４２℃の一定温度で行えるため、熱サイクル必要がなくなる。同様に、ＤＥＴＥＣＴＲはループ介在等温増幅法（ＬＡＭＰ）を用いており、これは６０－６５℃の一定温度で行われ、増幅サイクルを促進するために特別に設計されたループ状のプライマーセットに基づいている。ＳＨＥＲＬＯＣＫとＤＥＴＥＣＴＲの両方において、Ｃａｓタンパク質がそれぞれ一本鎖ＲＮＡと二本鎖ＤＮＡに結合し、フルオロフォアと消光剤のペアを含む一本鎖核酸レポーターが切断されると、蛍光出力シグナルが生成される。ポイント・オブ・ケア用途のために、蛍光読み出しに代わる比色測定が実現し、ラテラル・フロー・アッセイに組み込まれた。（Ｐａｔｃｈｓｕｎｇ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃａｓ１３－ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ＲＮＡ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．４，１１４０－１１４９（２０２０））。これらのアッセイは、等温増幅とウイルス核酸源の特異的で超高感度な検出をうまく組み合わせているが、外部励起源やラテラルフローストリップを必要とする蛍光読み出しに依存しており、一般的には定性的な情報しか得られない。
【0004】
生物発光に基づくセンサは、蛍光検出に代わる強力な戦略である。外部からの励起を必要とせずに光を生成する生物発光ルシフェラーゼ酵素を用いることで、高いバックグランドシグナルを回避し、検出のための特殊な光学機器の使用を回避することが可能である。このような生物発光タンパク質は、アクセプターと結合させることで、より一般的に用いられているＦＲＥＴベースのアプローチと同様に、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）を可能にする。この原理は、ＤＮＡヘアピンに接続されたルシフェラーゼとアクセプター色素からなる生物発光分子ビーコンなど、蛍光検出法の類似品を作るためにすでに採用されている。ヘアピンは当初、両成分を近接させ、ＢＲＥＴを促進するが、標的ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡとの複合化で両者を分離する。（Ｅｎｇｅｌｅｎ，Ｗ．，ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｅｌ，Ｋ．Ｍ．，Ｍｅｉｊｅｒ，Ｌ．Ｈ．Ｈ．，Ｓａｈａ，Ｂ．＆ Ｍｅｒｋｘ，Ｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＢＲＥＴ－ｂｅａｃｏｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５３，２８６２－２８６５（２０１７））。また、インターカレート色素は、ルシフェラーゼをＤＮＡ標的ジンクフィンガータンパク質と融合させた生物発光タンパク質と組み合わせて使用されてきた。（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３，８５，１３，６４８５－６４９０）。ジンクフィンガーが標的ｄｓＤＮＡに結合すると、インターカレート色素とルシフェラーゼタンパク質が近接し、ルシフェラーゼから色素へのＢＲＥＴが起こる。ｑＰＣＲにおけるインターカレート色素とは異なり、これらのアプローチはいずれもＤＮＡの特異的な検出に焦点を当てており、新しい標的ＤＮＡごとに新しいプローブを化学合成する必要がある。
【0005】
ポイント・オブ・ケア診断用途の感度を向上させるために、生物発光は標的核酸の等温増幅とも組み合わされてきた。「リアルタイムでの生物発光アッセイ」（ＢＡＲＴ）は、標的ＤＮＡのＬＡＭＰ増幅と、ＤＮＡ重合の副産物の一つを消費または変換して光を発生する酵素に依存している。（Ｇａｎｄｅｌｍａｎ，Ｏ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏｖｅｌ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５，（２０１０））。この方法は、ＤＮＡの単一コピーを検出できることが示されているが、出力シグナルが時間依存性で解釈が難しくなる自動阻害に悩まされている。さらに、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に結合させたスプリットルシフェラーゼによる等温増幅と組み合わせて、特定のＤＮＡ配列の検出が検討されてきた。（Ｃｈａｎｇ，Ｄ．，Ｋｉｍ，Ｋ．Ｔ．，Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ｅ．＆ Ｗｉｎｓｓｉｎｇｅｒ，Ｎ．Ｓｍａｒｔｐｈｏｎｅ ＤＮＡ ｏｒ ＲＮＡ Ｓｅｎｓｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－Ｂａｓｅｄ Ｌｏｇｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ．ＡＣＳ Ｓｅｎｓｏｒｓ ５，８０７－８１３（２０２０））。本明細書では、ローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）の増幅産物上の繰り返し標的配列がシステムによって認識され、スプリットルシフェラーゼのタンデムアセンブリを引き起こし、ＮａｎｏＬｕｃが再構成され、青色発光をもたらす。分子ビーコンおよびジンクフィンガーと同様、この戦略では、新しい標的ＤＮＡごとに新しいプローブを化学合成する必要がある。
【0006】
これらの課題は、添付の特許請求の範囲に記載された本発明によって克服される。
【発明の概要】
【0007】
生物発光に基づく読み出しは、レーザーやＬＥＤに基づく複雑な光学機器を必要とする問題を回避し、外部励起を必要とせずに光を生成するルシフェラーゼ酵素を採用する。本発明者らは、二本鎖ＤＮＡの高感度な非特異的検出と単純な青色対緑色の生物発光読み出しを組み合わせた、インターカレート色素と化学的に結合した耐熱性ルシフェラーゼに基づく新しい生物発光センサタンパク質を紹介する。したがって、本発明は、複雑で非常に特殊な装置を用いることなく、定量的で高感度な二本鎖ＤＮＡ検出を、簡単なデジタルカメラやスマートフォンで記録できる便利な光学的読み出しで行うことを可能にする。
【0008】
したがって、第１の態様では、二本鎖ＤＮＡの検出用インターカレート色素プローブが提供される。該色素は、１つ以上のインターカレート蛍光色素に結合した発光タンパク質を含む。
【0009】
第２の態様では、溶液中の二本鎖ＤＮＡの検出方法が提供され。該方法は、本発明の第１の態様に従うインターカレート色素プローブおよび発光ドメインの適した基質を、溶液とインキュベートするステップと、インターカレート蛍光色素によって発せられた光を検出するステップと、を備える。
【0010】
第３の態様では、部品キット（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）が提供される。該部品キットは、本発明の第１の態様に従うインターカレート色素プローブと、発光ドメインの適した基質とを含む。
【0011】
第４の態様では、二本鎖ＤＮＡの検出方法における本発明の第１の態様に従うインターカレート色素プローブの使用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】生物発光性インターカレート色素の模式図である。このプローブは、システイン－マレイミド化学によってインターカレート色素（緑）に結合したＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ（青、λｍａｘ～４６０ｎｍ）からなる。二本鎖（ｄｓＤＮＡ）がない場合、インターカレート色素の蛍光はほとんどなく、ＮａｎｏＬｕｃの青色発光を見ることができる（左）。ｄｓＤＮＡが存在すると、インターカレート色素はｄｓＤＮＡに結合し、ＢＲＥＴが起こり、緑色に発光する（右）。
【図2】図２（Ａ）は、ＮａｎｏＬｕｃ－チアゾールオレンジ（Ｄ１４８Ｃ位、フレキシブルループ）のｄｓＤＮＡを用いた生物発光滴定を示す図である。図２（Ｂ）は、ＮａｎｏＬｕｃ－チアゾールオレンジ（Ｇ１８２Ｃ位、Ｃ末端）のｄｓＤＮＡを用いた生物発光滴定を示す図である。両変異体について：複合体（左、１ｎＭ）を、（ＤＮＡの塩基対で）３９μＭ～１０，０００μＭのサケ精子ＤＮＡの２倍希釈系列に添加した。インキュベーションは１ｘＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、５％ＤＭＳＯ、ｐＨ７．４中、室温で３０分間行った。ＮａｎｏＧｌｏ基質（１０００倍希釈）を添加した後、３９８－６５３ｎｍの発光強度を測定した。
【図3-2】図３（Ｂ）は、２つのインターカレート色素を有し、１（ＮＬ２Ｃ－１Ｋ）、２（ＮＬ２Ｃ－２Ｋ）または３（ＮＬ２Ｃ－３Ｋ）個のリシンを間に挟んだ（Ｇ１８２位置、Ｃ末端）ＮａｎｏＬｕｃ変異体のｄｓＤＮＡを用いた生物発光滴定を示す図である。図３（Ｃ）は、２つのインターカレート色素を有し、２個のリシン（ＮＬ２Ｃ－２Ｋ）または２個のグリシン（ＮＬ２Ｃ－２Ｇ、ネガティブコントロール）を間に挟んだ（位置Ｇ１８２、Ｃ末端）ＮａｎｏＬｕｃ変異体のｄｓＤＮＡを用いた生物発光滴定を示す図である。すべての変異体について：複合体（１ｎＭ）を、（ＤＮＡの塩基対で）０．７６μＭ～５，０００μＭのサケ精子ＤＮＡの２倍希釈系列に添加した。インキュベーションは、１ｘＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、５％ＤＭＳＯ、ｐＨ７．４中、室温で３０分間行った。ＮａｎｏＧｌｏ基質（１０００倍希釈）を添加した後、３９８－６５３ｎｍの発光強度を測定した。
【図4】図４（Ａ）は、正電荷を持つ２個のリシン残基で隔てられた２個のシステインを含むＮａｎｏＬｕｃ変異体の模式図である。図４（Ｂ）は、２つの色素を持つＮａｎｏｌｕｃ－２ｘＴＯプローブの模式図である。このプローブは、正電荷を持つリンカーで隔てられた２つのインターカレート色素（緑）に結合したＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ（青）から構成され、負電荷を持つｄｓＤＮＡバックボーンとの相互作用が期待される。
【図5】図５（Ｂ，Ｄ）は、Ｃ末端（Ｂ）またはフレキシブルループ（Ｄ）に２ｘＴＯを配置したｄｓＤＮＡとＮａｎｏＬｕｃ－２ｘＴＯの生物発光滴定を示す図である。複合体（１ｎＭ）を０．７６μＭから５０００μＭの塩基対の範囲のサケ精子ｄｓＤＮＡの３倍希釈系列に添加した。インキュベーションは、１ｘＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、５％ＤＭＳＯ、ｐＨ７．４中、室温で３０分間行った。ＮａｎｏＧｌｏ基質（１０００倍希釈）を加えた後、３９８－６５３ｎｍの発光強度を測定した。技術的重複（ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）は丸で表し、破線は平均値を結ぶ。図５（Ａ，Ｃ）は、Ｃ末端（Ａ）またはフレキシブルループ（Ｃ）に２ｘＴＯを配置したｄｓＤＮＡとＮａｎｏＬｕｃ－２ｘＴＯの生物発光滴定の全発光スペクトルを示す図である。データポイントは平均値を表す。＊パネルＢのデータは図３ＢＣのデータ（リシン２個のリンカー、青い曲線）と同じである。
【図6】ＮａｎｏＬｕｃ－１ｘＴＯ（緑）、ＮａｎｏＬｕｃ－２ｘＴＯ（青）、ＮａｎｏＬｕｃ－３ｘＴＯ（赤）とｄｓＤＮＡの生物発光滴定の比較を示す図である。複合体（１ｎＭ）を０．７６μＭ－５０００μＭの塩基対の範囲のサケ精子ｄｓＤＮＡの３倍希釈系列に添加した。インキュベーションは、１ｘＰＢＳ＋１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ，５％ＤＭＳＯ，ｐＨ７．４中、室温で３０分間行った。ＮａｎｏＧｌｏ基質（１０００倍希釈）を添加した後、３９８～６５３ｎｍの発光強度を測定した。技術的重複は丸で表し、破線は平均値を結ぶ。
【図7-1】図７（Ａ）は、単一システインＮａｎｏＬｕｃ変異体、１－（２－アミノエチル）マレイミド架橋剤、ＮＨＳ活性化インターカレート色素を含むコンジュゲーションプロセスの概略図である。図７（Ｂ）は、マレイミド活性化架橋剤とＮＨＳ－ＴＯのカップリングの反応スキームである。
【図8】Ｃ末端にシステインを１個導入したＮａｎｏＬｕｃ変異体の色素カップリング前（灰色、ＮＬ２）とカップリング後（黒色、ＮＬ２＋ＴＯ）のＱ－ＴｏＦＬＣ－ＭＳスペクトルを示す図である。＋１８、＋３６のピークは、マレイミド部分の加水分解と色素の光脱離に起因し得る。平均分子量ＮＬ２＝２２１４５．３。計算平均分子量ＮＬ２＋ＴＯ＝２２６７２．２。
【図9】Ｃ末端に２個のシステインを組み込んだＮａｎｏＬｕｃ変異体の色素カップリング前（赤、ＮＬ２ｘＣＹＳ）とカップリング後（黒、ＮＬ２ｘＣＹＳ＋ＴＯ）のＱ－ＴｏＦＬＣ－ＭＳスペクトルを示す図である。＋１８、＋３６のピークは、マレイミド部分の加水分解と色素の光分解に起因し得る。－１０２のピークは、リシン残基とＮＨＳインターカレート色素との結合による酸化的切断または副生成物に起因し得る。計算平均分子量ＮＬ２ｘＣＹＳ＝２２３６７．６.計算平均分子量ＮＬ２＋ＴＯ＝２３４２２．４。
【図10】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｃＤＮＡ検出のための２段階アッセイの開発を示す図である。図１０Ａは、２段階アッセイのセットアップの概略図である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｃＤＮＡを６５℃で３５分間ＬＡＭＰ法で増幅し、１ｎＭのＬＵＭＩＤ－２Ｆセンサと組み合わせて室温で３０分間インキュベートした後、フリマジン（１０００倍希釈）を添加し、プレートリーダーおよび／またはスマートフォンのカメラを使用して生物発光を測定する。図１０Ｂは、検出にプレートリーダーを用いた２段階アッセイのセンサ応答を示す。データは技術的反復を表し、ｎ＝３個の独立したｃＤＮＡを調製した。上：２ａＭ（１．２コピー／μＬ）～２００ｆＭ（１２０，０００コピー／μＬ）の範囲の異なるｃＤＮＡ入力濃度における緑色／青色の比率。緑色／青色の比率は、５３３ｎｍでの生物発光を４５８ｎｍでの発光で割ることによって計算し、平均値±標準偏差で表した。下：バッファー（灰色）、標的ｃＤＮＡを含まないＬＡＭＰ反応（ＮＴＣ、青色）、２００ａＭの標的ｃＤＮＡを含むＬＡＭＰ反応（緑色）で表した全発光スペクトル。ＲＬＵ（相対発光単位）は４５８ｎｍのＮａｎｏＬｕｃピークで規格化し、スペクトル（下）は平均±標準偏差で表した。図１０Ｃは、暗い発泡スチロール箱の中でスマートフォン（Ｘｉａｏｍｉ ｍｉ ９ ｌｉｔｅ）を使用した２段階アッセイのセンサ応答を示す。写真は、２ａＭ（１．２コピー／μＬ）～２００ｆＭ（１２０，０００コピー／μＬ）の範囲の異なる入力濃度のｃＤＮＡに対するセンサ出力を示す。各列は技術的反復を表し、ｎ＝３個の独立したｃＤＮＡを調製した。同じサンプルをスマートフォンのカメラ（右）とプレートリーダー（左）で検出した。図１０Ｄは、プレートリーダーとスマートフォンのカメラから算出された緑色／青色の比率の相関を示す。
【図11】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｃＤＮＡ検出のためのワンポットアッセイの開発を示す図である。図１１Ａは、ワンポットアッセイのセットアップの概略図である。すべての反応成分（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｃＤＮＡ、ＬＵＭＩＤ－２Ｆセンサ、ＮａｎｏＬｕｃ基質、ＬＡＭＰ反応成分）を１つのチューブ中で混合し、６５℃で３５分間インキュベートする。冷却後、プレートリーダーおよび／またはスマートフォンのカメラを用いて結果を直接読み取る。図１１Ｂは、検出にプレートリーダーを使用した、ワンポットアッセイのセンサ反応を示す。データは技術的反復を表し、ｎ＝３個の独立したｃＤＮＡを調製した。左：２０ａＭ（１２コピー／μＬ）～２ｆＭ（１，２００コピー／μＬ）の範囲でｃＤＮＡの入力濃度を変えたときの緑色／青色比。緑色／青色の比率は、５３３ｎｍの生物発光を４５８ｎｍの発光で割って算出し、平均値±標準偏差で表した。丸は個々のデータ点を示す。右：バッファー（灰色）、標的ｃＤＮＡを含まないＬＡＭＰ反応（ＮＴＣ、青）、２００ａＭの標的ｃＤＮＡを含むＬＡＭＰ反応（緑）で表した全発光スペクトル。スペクトル（下）は平均±標準偏差で表した。図１１Ｃは、暗い発泡スチロール箱の中で、従来のデジタルカメラ（Ｓｏｎｙ ＤＳＣ－ＲＸ１００）を使用した１段階アッセイのセンサ反応を示す。写真は、２０ａＭ（１２コピー／μＬ）～２ｆＭ（１，２００コピー／μＬ）の範囲の異なる入力濃度のｃＤＮＡに対するセンサ出力を示す。各列は技術的反復を表し、ｎ＝３個の独立したｃＤＮＡを調製した。同じサンプルをスマートフォンのカメラ（右）とプレートリーダー（左）で検出した。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明は、ＤＮＡの高感度な非特異的検出と、ポイント・オブ・ケア診断に適した単純なカメラベースの読み出しを組み合わせた、新しいクラスの生物発光センサタンパク質を開発しようとしたものである。この目的のために、本発明者らは、基質を添加すると青色光の生物発光を発する耐熱性ＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼに、１種以上のインターカレート色素を化学的に結合させた。ｄｓＤＮＡ非存在下では、インターカレート色素は最小限の蛍光しか発さず、ＮａｎｏＬｕｃの青色光のみが見られる。ｄｓＤＮＡが存在すると、インターカレーター色素はｄｓＤＮＡに結合し、ＮａｎｏＬｕｃから色素への生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）が可能になり、緑色の光が発せられる（図１）。ＮａｎｏＬｕｃの発光とインターカレート色素の発光との比から、サンプル中のｄｓＤＮＡの量を測定することができる。本発明者らは、これらのプローブをＲＰＡやＬＡＭＰのような等温増幅戦略と組み合わせて、アッセイ感度をさらに高めるための前増幅ステップを提供することを目指している。このアプローチによって、ハイテク機器および外部励起源を使用することなく、簡便かつ高感度にＤＮＡを検出することが可能となり、資源または訓練されたスタッフへのアクセスが制限される可能性のあるポイント・オブ・ケアでの応用の可能性が広がる。
【0014】
このように、専門的な人員や装置を必要としないＤＮＡの簡便な検出方法が提供され、感染症の診断および予防に応用することができる。本発明は、インターカレート色素に直接結合した発光性生物発光タンパク質という２つの部分からなる新規分子プローブについて述べている。プローブがＤＮＡに結合すると、両者が相互作用し、生成される光の色が、例えば青から緑に変化する。プローブをサンプルに単に添加した後、ＤＮＡの存在を示す色の変化を、簡単なカメラやスマートフォンを使って記録し、定量することができる。
【0015】
したがって、第１の態様では、二本鎖ＤＮＡの検出用インターカレート色素プローブが提供される。該色素は、１つ以上のインターカレート蛍光色素に結合した発光タンパク質を含む。発光タンパク質は、生物発光タンパク質または化学発光を増強するのに使用される酵素であり得る。
【0016】
本明細書で、ルシフェラーゼとは、適切な基質の存在下で生物発光を生じることが可能なタンパク質を指す。そのようなタンパク質は、天然に存在するタンパク質（例えば、生物発光を示す生物から単離したタンパク質）またはそれらの修飾もしくは合成変異体であり得る。ルシフェラーゼとは、生物発光（基質の存在下で発光する）を示す能力を共通に有する広範な種々の無関係なタンパク質を指し、それ故に、生物発光を示すことができる任意のタンパク質は、本発明の目的のために生物発光タンパク質とみなされることが理解される。本明細書で、ルシフェラーゼ活性とは、発光（生物発光）をもたらす基質を変換するタンパク質の能力を指す。したがって、一実施形態では、生物発光タンパク質は、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質であり、好ましくは、ｎａｎｏｌｕｃ、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、カイアシ類ルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、渦鞭毛藻ルシフェラーゼ、深海エビルシフェラーゼ、ガウシアルシフェラーゼ、ＴｕｒｂｏＬｕｃルシフェラーゼ、Ａｌｕｃルシフェラーゼ、またはそれらの触媒活性断片から選択される。
【0017】
生物発光タンパク質は、インターカレート色素プローブに直接連結されており、生物発光タンパク質からインターカレート色素への発した光の伝達を可能にし、色素の励起とそれに続く蛍光を生じる。色素は、二本鎖ＤＮＡにインターカレートされたときのみ蛍光を示すので、本明細書で後述するように、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の検出または定量に色素特異的な発光を使用することができる。
【0018】
本明細書で、「連結された」は共有結合を指す。色素をタンパク質に連結する方法は当分野で広く知られている。例えば、色素は、後述するように、タンパク質のシステイン残基に連結し得る。例えば適したシステインが利用できない場合、システインを点変異によってタンパク質に導入し得る。複数の色素への連結を可能にするために、複数のシステインを導入し得ることがさらに理解される。好ましくは、システインは、タンパク質の異なる領域に導入するか、またはリンカー配列、例えばリシン１個のリンカー、リシン２個のリンカーもしくはリシン３個のリンカーを含むことによって、空間的に分離される。さらに、タンパク質中の不適切な位置に存在するシステインを点変異によって除去し得る。したがって、一実施形態では、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質は、配列番号１～７のいずれか１つによって定義されるアミノ酸配列を含む。
【0019】
本願で使用される配列の概要：
上記タンパク質配列は、
開始コドン（Ｍｅｔ、最初のアミノ酸）；
ストレプトアビジン（ＳＴＲＥＰ）タグ－（Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ；アミノ酸２～９）；
改変したＮａｎｏＬｕｃタンパク質配列（アミノ酸１０で開始）；および
６ヒスチジンタグ（最後の６アミノ酸）を含む。
【表1】
開始コドン（Ｍｅｔ、最初のアミノ酸）；
ストレプトアビジン（ＳＴＲＥＰ）タグ－（Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ；アミノ酸２～９）；
改変したＮａｎｏＬｕｃタンパク質配列（アミノ酸１０で開始）；および
６ヒスチジンタグ（最後の６アミノ酸）を含む。
【0020】
上記の配列における変異の番号付けは、天然のｎａｎｏｌｕｃ配列に従っているため、ＳＴＲＥＰタグを除き、提示した配列の１０位のメチオニンから始まっている。
【0021】
代替として、色素を、化学発光を可能にする基質を生成する酵素と結合させ得る。例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼを、過酸化水素を用いてルミノールの酸化の触媒作用を可能にするように結合させ得る。したがって、一実施形態では、化学発光を増強するのに使用される酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリンホスファターゼから選択される。
【0022】
適したインターカレート蛍光色素は当業者に既知である。一実施形態では、インターカレート蛍光色素は、アクリシンオレンジ、チアゾールオレンジ、エチジウムブロミド、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＢＲゴールド、ＳＹＢＲ Ｓａｆｅ、ＥｖａＧｒｅｅｎ、ＥｖａＲｕｂｙ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ－９、ＴＯＴＯ－１、およびＹＯＹＯ－１から選択される。インターカレート色素プローブは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ以上などの１つ以上のインターカレート蛍光色素を含み得ることが理解される。複数の蛍光インターカレート色素を追加して、プローブのＤＮＡターゲティングを強化してもよい。一実施形態では、インターカレート色素プローブは、追加のＤＮＡ結合ドメインをさらに含む。これは、ＤＮＡの結合またはターゲティングをさらに増強するのに好都合であり得る。
第２の態様では、本発明は、溶液中の二本鎖ＤＮＡの検出方法に関する。該方法は、
第１の態様に従うインターカレート色素プローブおよび発光ドメインの適した基質を溶液とインキュベートするステップと、
インターカレート蛍光色素によって発せられた光を検出するステップと、を備える。
第２の態様では、本発明は、溶液中の二本鎖ＤＮＡの検出方法に関する。該方法は、
第１の態様に従うインターカレート色素プローブおよび発光ドメインの適した基質を溶液とインキュベートするステップと、
インターカレート蛍光色素によって発せられた光を検出するステップと、を備える。
【0023】
インターカレート色素は、二本鎖ＤＮＡにインターカレートしたときのみ発光タンパク質によって励起されることから、色素が発した光を検出することで、ｄｓＤＮＡを検出することができる。また、発光タンパク質により発した光を（例えば生物発光タンパク質によって直接、または化学発光を増強する酵素によって間接的に）検出することによって、ｄｓＤＮＡの量を定量できる。したがって、一実施形態では、該方法は、二本鎖ＤＮＡの定量に使用され、該方法は、
発光ドメインによって発せられた光を検出するステップと、
インターカレート蛍光色素によって発せられた光と発光ドメインによって発せられた光の比率に基づいて、二本鎖ＤＮＡの量を定量するステップと、をさらに含む。該方法は、ＤＮＡ増幅反応前、増幅反応中、および／または増幅反応後に実施することができる。該方法は、増幅反応中に１回または連続的に実施することができる。
発光ドメインによって発せられた光を検出するステップと、
インターカレート蛍光色素によって発せられた光と発光ドメインによって発せられた光の比率に基づいて、二本鎖ＤＮＡの量を定量するステップと、をさらに含む。該方法は、ＤＮＡ増幅反応前、増幅反応中、および／または増幅反応後に実施することができる。該方法は、増幅反応中に１回または連続的に実施することができる。
【0024】
該方法は、ｄｓＤＮＡを増幅する増幅反応のいずれのタイプでも実施し得ることが理解される。一実施形態では、増幅反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リコンビナーゼ・ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）、ローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）または分岐増幅法（ＲＡＭ）から選択される。
【0025】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様に従うインターカレート色素プローブと、発光ドメインの適した基質とを含む部品キットに関する。一実施形態では、基質は、ルシフェリン、好ましくはフリマジン、ホタルルシフェリン、ラチア（巻き貝）ルシフェリン、細菌ルシフェリン、セレンテラジン、渦鞭毛藻ルシフェリン、ヴァルグリン、３－ヒドロキシヒスピジンまたはルミノールである。ルシフェリンは、ルシフェラーゼに対する基質として作用する化合物の一般的な用語であることが理解され、したがって、本明細書でルシフェリンとは、本明細書で定義されるルシフェラーゼのいずれの適した基質を指す。
【0026】
第４の態様では、本発明は、二本鎖ＤＮＡの検出方法における本発明の第１の態様に従うインターカレート色素プローブの使用に関する。
【0027】
開示された実現例に対する他の変形例は、図面、開示内容、および添付の特許請求の範囲を検討することにより、特許請求の範囲に記載の発明を実施する際に当業者によって理解され、実施され得る。特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、他の要素またはステップを排除するものではなく、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、複数を排除するものではない。
【実施例】
【0028】
（材料および方法）
クローニング
Ｎ末端にＳｔｒｅｐ－タグ、Ｃ末端にヘキサヒスチジン－タグを有するＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼをコードするＤＮＡを含有するｐＥＴ２８ａベクターをＧｅｎＳｃｒｉｐｔから取り寄せた。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用い、製造者の説明書に従って特定のプライマーを使用して、天然のシステインをセリン（Ｃ１６６Ｓ）に変異させ、新しいシステイン残基およびリシン残基を導入する部位特異的な変異誘発を実施した。すべてのクローニングおよび変異誘発結果をサンガー配列決定（ＢａｓｅＣｌｅａｒ）によって確認した。
クローニング
Ｎ末端にＳｔｒｅｐ－タグ、Ｃ末端にヘキサヒスチジン－タグを有するＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼをコードするＤＮＡを含有するｐＥＴ２８ａベクターをＧｅｎＳｃｒｉｐｔから取り寄せた。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用い、製造者の説明書に従って特定のプライマーを使用して、天然のシステインをセリン（Ｃ１６６Ｓ）に変異させ、新しいシステイン残基およびリシン残基を導入する部位特異的な変異誘発を実施した。すべてのクローニングおよび変異誘発結果をサンガー配列決定（ＢａｓｅＣｌｅａｒ）によって確認した。
【0029】
タンパク質発現および精製
ＮａｎｏＬｕｃをコードするプラスミドを化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加した２ＹＴ培地（１Ｌ当たり１６ｇペプトン、５ｇのＮａＣｌ、１０ｇ酵素抽出物）で培養した。ＯＤ６００＝０．６で、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて、タンパク質発現を２０℃で一晩誘導した。その後、遠心分離で細胞を回収し、ベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加したＢｕｇｂｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて溶解した。Ｎｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーでタンパク質を精製した後、溶出画分を保存用緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に交換した。タンパク質の純度および正確な質量は、それぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＱ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳで確認した。精製したタンパク質をコンジュゲーションまで－８０℃で保存した。
ＮａｎｏＬｕｃをコードするプラスミドを化学的にコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換し、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加した２ＹＴ培地（１Ｌ当たり１６ｇペプトン、５ｇのＮａＣｌ、１０ｇ酵素抽出物）で培養した。ＯＤ６００＝０．６で、１ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて、タンパク質発現を２０℃で一晩誘導した。その後、遠心分離で細胞を回収し、ベンゾナーゼエンドヌクレアーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を添加したＢｕｇｂｕｓｔｅｒタンパク質抽出試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて溶解した。Ｎｉ２＋－ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーでタンパク質を精製した後、溶出画分を保存用緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）に交換した。タンパク質の純度および正確な質量は、それぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＱ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳで確認した。精製したタンパク質をコンジュゲーションまで－８０℃で保存した。
【0030】
ＮＨＳ活性化色素と１－（２－アミノエチル）マレイミド架橋剤とのコンジュゲーション
チアゾールオレンジ（ＴＯ）とアクリシンオレンジ（ＡＯ）のアミン反応性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルをＢｉｏｔｉｕｍ社から入手し、それぞれ最終濃度２０ｍＭになるようにＤＭＳＯに溶解した。その後、３当量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）と０．８当量の１－（２－アミノエチル）マレイミド架橋剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、４５０ｒｐｍで連続的に振とうしながら室温で一晩インキュベートした（図７Ｂ）。コンジュゲーション後の正しい質量は、ＬＣ－ＭＳを用いて確認した（図７Ｃ）。マレイミド活性化色素は、さらに使用するまで－３０℃で保存した。
チアゾールオレンジ（ＴＯ）とアクリシンオレンジ（ＡＯ）のアミン反応性Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルをＢｉｏｔｉｕｍ社から入手し、それぞれ最終濃度２０ｍＭになるようにＤＭＳＯに溶解した。その後、３当量のＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）と０．８当量の１－（２－アミノエチル）マレイミド架橋剤（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、４５０ｒｐｍで連続的に振とうしながら室温で一晩インキュベートした（図７Ｂ）。コンジュゲーション後の正しい質量は、ＬＣ－ＭＳを用いて確認した（図７Ｃ）。マレイミド活性化色素は、さらに使用するまで－３０℃で保存した。
【0031】
マレイミド活性化色素とＮａｎｏＬｕｃとのコンジュゲーション
マレイミド活性化色素にＮａｎｏＬｕｃを結合させる前に、まずタンパク質を５ｍＭのＴＣＥＰと５００ｒｐｍで連続的に振とうしながら室温で１時間インキュベートすることで還元し、続いてＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ ＮａＰｉ，２５μＭ ＴＣＥＰ，ｐＨ７．０）に緩衝液交換した。次に、マレイミドで活性化したＴＯとＡＯをともに１０μＭの還元型ＮａｎｏＬｕｃに１０倍モル過剰で添加し、５００ｒｐｍで連続的に振とうしながら室温で２時間反応させた。ＮａｎｏＬｕｃ－色素複合体をＰＤ－１０脱塩カラムで精製して過剰の色素を除去し、同時にＰＢＳ（１００ｍＭ ＮａＰｉ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）に緩衝液交換した。色素－タンパク質複合体を４７０ｎｍの青色光で励起し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてカップリングと精製をチェックした。最後に、Ｑ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳによって、ＮａｎｏＬｕｃ－色素複合体のカップリング効率と正しい質量を確認した。
マレイミド活性化色素にＮａｎｏＬｕｃを結合させる前に、まずタンパク質を５ｍＭのＴＣＥＰと５００ｒｐｍで連続的に振とうしながら室温で１時間インキュベートすることで還元し、続いてＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてリン酸ナトリウム緩衝液（１００ｍＭ ＮａＰｉ，２５μＭ ＴＣＥＰ，ｐＨ７．０）に緩衝液交換した。次に、マレイミドで活性化したＴＯとＡＯをともに１０μＭの還元型ＮａｎｏＬｕｃに１０倍モル過剰で添加し、５００ｒｐｍで連続的に振とうしながら室温で２時間反応させた。ＮａｎｏＬｕｃ－色素複合体をＰＤ－１０脱塩カラムで精製して過剰の色素を除去し、同時にＰＢＳ（１００ｍＭ ＮａＰｉ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）に緩衝液交換した。色素－タンパク質複合体を４７０ｎｍの青色光で励起し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いてカップリングと精製をチェックした。最後に、Ｑ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳによって、ＮａｎｏＬｕｃ－色素複合体のカップリング効率と正しい質量を確認した。
【0032】
生物発光アッセイ
生物発光アッセイを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製フラットホワイト３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅにて、総容量２０μＬ中センサタンパク質濃度１ｎＭで行った。２０００ｂｐ超の断片化サケ精子ｄｓＤＮＡ断片をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社に注文し、０．７μＭ～５ｍＭの濃度範囲に希釈した（塩基対の数で測定）。センサタンパク質とｄｓＤＮＡ断片を室温で０．５時間インキュベートした後、ＮａｎｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｎ１１１０）を最終希釈１：１０００で添加した。生物発光スペクトルをプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍ）で記録し、ステップサイズ１５ｎｍ、バンド幅２５ｎｍ、積分時間２５０ｍｓで３９８ｎｍから６５３ｎｍの間の全スペクトルを記録した。
生物発光アッセイを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製フラットホワイト３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅにて、総容量２０μＬ中センサタンパク質濃度１ｎＭで行った。２０００ｂｐ超の断片化サケ精子ｄｓＤＮＡ断片をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社に注文し、０．７μＭ～５ｍＭの濃度範囲に希釈した（塩基対の数で測定）。センサタンパク質とｄｓＤＮＡ断片を室温で０．５時間インキュベートした後、ＮａｎｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｎ１１１０）を最終希釈１：１０００で添加した。生物発光スペクトルをプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍ）で記録し、ステップサイズ１５ｎｍ、バンド幅２５ｎｍ、積分時間２５０ｍｓで３９８ｎｍから６５３ｎｍの間の全スペクトルを記録した。
【0033】
２段階ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｃＤＮＡアッセイ
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子のｃＤＮＡ配列をターゲットとするＬＡＭＰプライマーを、ＮＥＢ ＬＡＭＰ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌを用いて設計し、ＩＤＴ社に注文した。Ｎ遺伝子の配列は配列番号８にて見られる。プライマーを、１６μＭのインナープライマー、２μＭのアウタープライマー、４μＭのループプライマーを含む１０倍濃縮ストックに希釈した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｃＤＮＡ配列を含むプラスミドをＦｒｅｅ Ｇｅｎｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔを通じて入手し、特異的プライマーを用いて、ヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子配列をこのプラスミドからＰＣＲ増幅した。Ｎ遺伝子ターゲットＤＮＡは、５ａＭから５ｐＭの範囲の２５ｘ濃縮ストックに連続希釈した。１×等温増幅バッファー（ＮＥＢ社製）、６ｍＭのＭｇＳＯ４（ＮＥＢ社製）、１．４ｍＭのｄＮＴＰｓ（ＮＥＢ社製）、１×ＬＡＭＰプライマーミックス、１×ターゲットＤＮＡを総量２４μＬになるように合わせて、ＵＶ ＰＣＲキャビネット内で陽性ＬＡＭＰ反応を行った。非テンプレートコントロールでは、ターゲットＤＮＡをＭｉｌｌｉＱ水に交換しただけで、同様の条件を使用した。全アセンブリープロセスの間、反応を氷上で保持した。反応を開始するために、Ｂｓｔ ２．０ポリメラーゼ（８Ｕ、ＮＥＢ）を添加し、その後６５℃で３５分間インキュベートした。次に、各ＬＡＭＰ反応液１０μＬを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ｆｌａｔ ｗｈｉｔｅ ３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅに入れたＬＵＭＩＤ－２Ｆセンサ（ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５％ＤＭＳＯ）中２ｎＭ）１０μＬと合わせた。陰性コントロールとして、ＬＡＭＰ反応をＰＢＳ緩衝液で代用した。室温で３０分間インキュベートした後、ＮａｎｏＧｌｏ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｎ１１１０）を最終希釈１：１０００で添加した。発光スペクトルをプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍ）で３９８ｎｍ～６５３ｎｍで、ステップサイズ１５ｎｍ、バンド幅２５ｎｍ、積分時間１００ｍｓで記録した。緑色／青色の比率は、５３３ｎｍの生物発光を４５８ｎｍの発光で割って算出した。また、発光シグナルを、周囲の光を除くために発泡スチロールの箱の穴を通してスマートフォン（Ｘｉａｏｍｉ ｍｉ ９ ｌｉｔｅ）のカメラで記録した。写真は露光時間３２秒、ＩＳＯ値３２００で撮影した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子のｃＤＮＡ配列をターゲットとするＬＡＭＰプライマーを、ＮＥＢ ＬＡＭＰ Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌを用いて設計し、ＩＤＴ社に注文した。Ｎ遺伝子の配列は配列番号８にて見られる。プライマーを、１６μＭのインナープライマー、２μＭのアウタープライマー、４μＭのループプライマーを含む１０倍濃縮ストックに希釈した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｃＤＮＡ配列を含むプラスミドをＦｒｅｅ Ｇｅｎｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔを通じて入手し、特異的プライマーを用いて、ヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子配列をこのプラスミドからＰＣＲ増幅した。Ｎ遺伝子ターゲットＤＮＡは、５ａＭから５ｐＭの範囲の２５ｘ濃縮ストックに連続希釈した。１×等温増幅バッファー（ＮＥＢ社製）、６ｍＭのＭｇＳＯ４（ＮＥＢ社製）、１．４ｍＭのｄＮＴＰｓ（ＮＥＢ社製）、１×ＬＡＭＰプライマーミックス、１×ターゲットＤＮＡを総量２４μＬになるように合わせて、ＵＶ ＰＣＲキャビネット内で陽性ＬＡＭＰ反応を行った。非テンプレートコントロールでは、ターゲットＤＮＡをＭｉｌｌｉＱ水に交換しただけで、同様の条件を使用した。全アセンブリープロセスの間、反応を氷上で保持した。反応を開始するために、Ｂｓｔ ２．０ポリメラーゼ（８Ｕ、ＮＥＢ）を添加し、その後６５℃で３５分間インキュベートした。次に、各ＬＡＭＰ反応液１０μＬを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ ｆｌａｔ ｗｈｉｔｅ ３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅに入れたＬＵＭＩＤ－２Ｆセンサ（ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５％ＤＭＳＯ）中２ｎＭ）１０μＬと合わせた。陰性コントロールとして、ＬＡＭＰ反応をＰＢＳ緩衝液で代用した。室温で３０分間インキュベートした後、ＮａｎｏＧｌｏ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｎ１１１０）を最終希釈１：１０００で添加した。発光スペクトルをプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍ）で３９８ｎｍ～６５３ｎｍで、ステップサイズ１５ｎｍ、バンド幅２５ｎｍ、積分時間１００ｍｓで記録した。緑色／青色の比率は、５３３ｎｍの生物発光を４５８ｎｍの発光で割って算出した。また、発光シグナルを、周囲の光を除くために発泡スチロールの箱の穴を通してスマートフォン（Ｘｉａｏｍｉ ｍｉ ９ ｌｉｔｅ）のカメラで記録した。写真は露光時間３２秒、ＩＳＯ値３２００で撮影した。
【0034】
ワンポットＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｃＤＮＡアッセイ
ＬＡＭＰ反応を２段階アッセイで説明したように構築したが、１μＬのＬＵＭＩＤ－２Ｆセンサ（ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５％ＤＭＳＯ）中２５ｎＭ）および１μＬのＮａｎｏＧｌｏ基質（１：４０希釈）を加えた。反応を開始するために、Ｂｓｔ２．０ポリメラーゼ（８Ｕ、ＮＥＢ）を添加し、続いて６５℃で３５分間インキュベートした。デジタルカメラ（ＳＯＮＹ ＤＳＣ－ＲＸ１００）を用いて、反応温度の維持のために加熱プレートを入れた発泡スチロールの暗箱のホールを通して、リアルタイム発光をモニターした。インキュベーション後、反応を室温に移し、５分間冷却してから発光シグナルを記録した。発光スペクトルを、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍ）で、３９８ｎｍ～６５３ｎｍで、ステップサイズ１５ｎｍ、バンド幅２５ｎｍ、積分時間１００ｍｓで記録した。緑色／青色の比率を、５３３ｎｍの生物発光を４５８ｎｍの発光で割って算出した。また、リアルタイム発光モニタリング用のセットアップを用いて、発光シグナルを記録した。写真を、露光時間３０秒、ＩＳＯ値６４００で撮影した。
ＬＡＭＰ反応を２段階アッセイで説明したように構築したが、１μＬのＬＵＭＩＤ－２Ｆセンサ（ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５％ＤＭＳＯ）中２５ｎＭ）および１μＬのＮａｎｏＧｌｏ基質（１：４０希釈）を加えた。反応を開始するために、Ｂｓｔ２．０ポリメラーゼ（８Ｕ、ＮＥＢ）を添加し、続いて６５℃で３５分間インキュベートした。デジタルカメラ（ＳＯＮＹ ＤＳＣ－ＲＸ１００）を用いて、反応温度の維持のために加熱プレートを入れた発泡スチロールの暗箱のホールを通して、リアルタイム発光をモニターした。インキュベーション後、反応を室温に移し、５分間冷却してから発光シグナルを記録した。発光スペクトルを、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ １０Ｍ）で、３９８ｎｍ～６５３ｎｍで、ステップサイズ１５ｎｍ、バンド幅２５ｎｍ、積分時間１００ｍｓで記録した。緑色／青色の比率を、５３３ｎｍの生物発光を４５８ｎｍの発光で割って算出した。また、リアルタイム発光モニタリング用のセットアップを用いて、発光シグナルを記録した。写真を、露光時間３０秒、ＩＳＯ値６４００で撮影した。
【0035】
（結果と考察）
単一色素ＮａｎｏＬｕｃ変異体
ルシフェラーゼ－インターカレート色素プローブの合成は、ヘテロ二官能性１－（２－アミノエチル）マレイミド架橋剤を介して、単一システインＮａｎｏＬｕｃ変異体をインターカレート色素チアゾールオレンジ（ＴＯ）またはアクリシンオレンジ（ＡＯ）のＮＨＳ活性型に結合させることによって行った。ｄｓＤＮＡとの複合体形成による蛍光の大幅な増加（３０００倍超）、ＮａｎｏＬｕｃとの適切なスペクトルオーバーラップ（ｅｍ．Ｎａｎｏｌｕｃ ４６０ｎｍ，ｅｘ．ＴＯ ５１４ｎｍ）、ＮＨＳ活性型が市販されていることからＴＯを選択した。ＡＯは、二本鎖核酸と一本鎖核酸とを識別するプローブとして使用されてきた代替インターカレート色素である。ＡＯは溶液中ではすでに蛍光を発し、ｄｓＤＮＡ結合による蛍光の固有増加は小さいが、その強い固有蛍光を利用してコンジュゲーション手順を分析した。部位特異的な結合を可能にするため、ＮａｎｏＬｕｃの生物発光特性を阻害することなく、コンジュゲーションに適した位置であることが知られているＮａｎｏＬｕｃのフレキシブルループ領域（Ｄ１４８）とＣ末端（Ｇ１８２）にシステイン変異を導入した。Ｃ末端のヘキサヒスチジンタグは、シングルシステインＮａｎｏＬｕｃ変異体の精製を容易にするために含まれている（ＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびタンパク質変異体のリストは上記の表にある）。まず、１－（２－アミノエチル）マレイミド架橋剤をＮＨＳ活性化インターカレート色素に結合させ、その後反応生成物をＮａｎｏＬｕｃに結合させた（図３、図７）。Ｑ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳ分析により、光退色およびマレイミド官能基の加水分解に起因するマイナーピークが観察されたものの、合成が成功したことが明らかになった（図８）。
単一色素ＮａｎｏＬｕｃ変異体
ルシフェラーゼ－インターカレート色素プローブの合成は、ヘテロ二官能性１－（２－アミノエチル）マレイミド架橋剤を介して、単一システインＮａｎｏＬｕｃ変異体をインターカレート色素チアゾールオレンジ（ＴＯ）またはアクリシンオレンジ（ＡＯ）のＮＨＳ活性型に結合させることによって行った。ｄｓＤＮＡとの複合体形成による蛍光の大幅な増加（３０００倍超）、ＮａｎｏＬｕｃとの適切なスペクトルオーバーラップ（ｅｍ．Ｎａｎｏｌｕｃ ４６０ｎｍ，ｅｘ．ＴＯ ５１４ｎｍ）、ＮＨＳ活性型が市販されていることからＴＯを選択した。ＡＯは、二本鎖核酸と一本鎖核酸とを識別するプローブとして使用されてきた代替インターカレート色素である。ＡＯは溶液中ではすでに蛍光を発し、ｄｓＤＮＡ結合による蛍光の固有増加は小さいが、その強い固有蛍光を利用してコンジュゲーション手順を分析した。部位特異的な結合を可能にするため、ＮａｎｏＬｕｃの生物発光特性を阻害することなく、コンジュゲーションに適した位置であることが知られているＮａｎｏＬｕｃのフレキシブルループ領域（Ｄ１４８）とＣ末端（Ｇ１８２）にシステイン変異を導入した。Ｃ末端のヘキサヒスチジンタグは、シングルシステインＮａｎｏＬｕｃ変異体の精製を容易にするために含まれている（ＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびタンパク質変異体のリストは上記の表にある）。まず、１－（２－アミノエチル）マレイミド架橋剤をＮＨＳ活性化インターカレート色素に結合させ、その後反応生成物をＮａｎｏＬｕｃに結合させた（図３、図７）。Ｑ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳ分析により、光退色およびマレイミド官能基の加水分解に起因するマイナーピークが観察されたものの、合成が成功したことが明らかになった（図８）。
【0036】
ｄｓＤＮＡに対するＮａｎｏＬｕｃ－チアゾールオレンジプローブの分析性能を調べるために、ｄｓＤＮＡを用いた生物発光滴定を行った（図２）。その結果、ｄｓＤＮＡの量を増やすと緑色光（～５３３ｎｍ）の発光が増加することから、両プローブはｄｓＤＮＡにインターカレートできることが明らかになった（図２ＡＢ、中央）。また、チアゾールオレンジの発光（５３３ｎｍ）とＮａｎｏＬｕｃの発光（４５８ｎｍ）の比、または「ＢＲＥＴ比」は、ｄｓＤＮＡの濃度が高くなるにつれて増加し、センサのｄｓＤＮＡ依存性をさらに裏付けている（図２ＡＢ、右）。それにもかかわらず、ＢＲＥＴは高濃度のｄｓＤＮＡ（～ｍＭの範囲）でしか現れず、ｄｓＤＮＡに対するプローブの親和性が低いことを示している。ｄｓＤＮＡ添加によるＢＲＥＴ比の増加は、色素をＣ末端に配置したコンストラクト（図２Ｂ、＜２倍）に比べ、色素をフレキシブルループ領域に配置したコンストラクト（図２Ａ、４倍）で大きかった。ＢＲＥＴは距離依存性が強いので、この違いは両変異体における色素とＮａｎｏＬｕｃの活性部位との距離に起因する、すなわち、色素をフレキシブルなＣ末端（Ｇ１８２Ｃ）に配置すると、Ｄ１４８Ｃ変異体と比較して活性部位までの距離が大きくなり、それ故にＢＲＥＴ効率が低下すると考えられる。
【0037】
複数色素ＮａｎｏＬｕｃ変異体－リンカー最適化
プローブの全体的な親和性を高める有望な工学的戦略は、複数の色素を組み込むことによって、現在のシステムに多価性を導入することである。二量体のチアゾールオレンジ色素（ＴＯＴＯ）の開発によって、ｄｓＤＮＡに対する親和性が、単量体のものに比べて約３桁増加することが示されている１３。同様に、ｄｓＤＮＡとの静電的相互作用を付加する２個のリシン残基で隔てられた２つのアクリシンオレンジ色素を含む小さなペプチドは、色素の親和性を２～３桁増加させることが示された１４。正電荷を持つリンカーを有する複数の色素という概念をプローブに応用するために、Ｎａｎｏｌｕｃ（Ｃ１８０）のＣ末端にある最初のインターカレート色素に近接して、リシン残基で隔てられた２番目のインターカレート色素を組み込んだ。リシンの量は、色素がｄｓＤＮＡに結合してインターカレートする最適な距離を見つけるために、１個から３個まで変化させ、正電荷の必要性を確認するために、対照としてグリシン残基を組み込んだ（図３Ａ）。
プローブの全体的な親和性を高める有望な工学的戦略は、複数の色素を組み込むことによって、現在のシステムに多価性を導入することである。二量体のチアゾールオレンジ色素（ＴＯＴＯ）の開発によって、ｄｓＤＮＡに対する親和性が、単量体のものに比べて約３桁増加することが示されている１３。同様に、ｄｓＤＮＡとの静電的相互作用を付加する２個のリシン残基で隔てられた２つのアクリシンオレンジ色素を含む小さなペプチドは、色素の親和性を２～３桁増加させることが示された１４。正電荷を持つリンカーを有する複数の色素という概念をプローブに応用するために、Ｎａｎｏｌｕｃ（Ｃ１８０）のＣ末端にある最初のインターカレート色素に近接して、リシン残基で隔てられた２番目のインターカレート色素を組み込んだ。リシンの量は、色素がｄｓＤＮＡに結合してインターカレートする最適な距離を見つけるために、１個から３個まで変化させ、正電荷の必要性を確認するために、対照としてグリシン残基を組み込んだ（図３Ａ）。
【0038】
ｄｓＤＮＡを用いた生物発光滴定では、リシン２個のリンカーがｄｓＤＮＡに最も高い親和性と最も高いダイナミックレンジで反応することが明らかになった（図３Ｂ、青）。リシン３個のリンカーを持つ変異体は、親和性は同程度であったが、ダイナミックレンジが小さかった。これは、色素が両方ともｄｓＤＮＡに効果的にインターカレートできず、緑色の蛍光が少なくなったためと考えられる（図３Ｂ、赤）。最も低い親和性とダイナミックレンジは、リシン１個のリンカーで観察された。これは、正電荷の量が少ないことに加えて、色素がｄｓＤＮＡに結合する距離が最適でないことによって説明できる（図３Ｂ、緑）。グリシン２個のリンカーを用いた対照実験では、リシン２個のリンカーに比べて親和性が１００倍程度低く、正電荷がｄｓＤＮＡ結合の向上に不可欠であることを示している（図３Ｃ）。
【0039】
複数色素ＮａｎｏＬｕｃ変異体－２個の色素
次に、ＮａｎｏＬｕｃのＣ末端およびフレキシブルループ領域に、最も性能の良い２－リシンリンカーで隔てられた２個のシステインを組み込んだ（ＮａｎｏＬｕｃ－２ｘＴＯ、図４）。Ｑ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳ分析によって、光退色およびマレイミド官能基の加水分解に起因するピークが観察されたが、カップリング反応が完了していたことが明らかになった（図９）。
次に、ＮａｎｏＬｕｃのＣ末端およびフレキシブルループ領域に、最も性能の良い２－リシンリンカーで隔てられた２個のシステインを組み込んだ（ＮａｎｏＬｕｃ－２ｘＴＯ、図４）。Ｑ－ＴｏＦ ＬＣ－ＭＳ分析によって、光退色およびマレイミド官能基の加水分解に起因するピークが観察されたが、カップリング反応が完了していたことが明らかになった（図９）。
【0040】
ｄｓＤＮＡに対するＮａｎｏＬｕｃ－２ｘＴＯセンサの分析性能を調べるために、再びｄｓＤＮＡを用いた生物発光滴定を行った（図５）。ｄｓＤＮＡの濃度を上げると、チアゾールオレンジの発光（５３３ｎｍ）とＮａｎｏＬｕｃの発光（４５８ｎｍ）との比率（ＢＲＥＴ比）の増加が観察された。ＢＲＥＴは低μＭの範囲ですでに現れ、ＴＯを１つだけ含むセンサの変異体と比較して親和性が１０００倍増加したことを示している（図２と比較）。Ｃ末端に２ｘＴＯを持つ変異体ではＢＲＥＴ比が４倍と中程度の増加が観察され、フレキシブルループに２ｘＴＯを持つ変異体では９倍の増加が観察された（図５ＢとＤを比較）。図２の単一色素変異体で得られた結果と同様に、これらの結果は、ＢＲＥＴ効率が距離に強く依存し、フレキシブルループにインターカレート色素を配置することでＢＲＥＴ効率が増加することを示している。
【0041】
興味深いことに、全発光スペクトルによって、全発光強度とｄｓＤＮＡの量との間に正の相関があることが明らかになった。第２の色素の添加は系の疎水性を増加させ、それによってＮａｎｏＬｕｃ－２ｘＴＯの溶解度を低下させ、シグナル強度を低下させるという仮説が成り立つ。負に帯電した大量のｄｓＤＮＡは、タンパク質と色素のコンストラクトを安定化させるか、または凝集体の形成を防ぐように作用し、絶対シグナルの観察された増加につながった可能性がある。
【0042】
複数色素ＮａｎｏＬｕｃ変異体－３色素
また、２－リシンリンカーで隔てられた第３の色素をＮａｎｏＬｕｃのＣ末端に付加した場合のセンサの性能も評価した（ＮａｎｏＬｕｃ－３ｘＴＯ、図６）。ｄｓＤＮＡを用いた滴定から、２つの色素を用いた変異体と比較して、低い検出限界（ＬｏＤ）と高い親和性が観察された。さらに、曲線はｄｓＤＮＡ濃度のより広い範囲にわたって引き伸ばされ、ＢＲＥＴ比の倍数変化はより小さくなっているようである。これは、異なる親和性バインダーの混合物が存在し、不完全な色素のカップリング反応に起因することを示している可能性がある。その結果、異なる濃度領域でｄｓＤＮＡに結合する１つ、２つまたは３つの色素を持つＮａｎｏＬｕｃ変異体が得られた。
また、２－リシンリンカーで隔てられた第３の色素をＮａｎｏＬｕｃのＣ末端に付加した場合のセンサの性能も評価した（ＮａｎｏＬｕｃ－３ｘＴＯ、図６）。ｄｓＤＮＡを用いた滴定から、２つの色素を用いた変異体と比較して、低い検出限界（ＬｏＤ）と高い親和性が観察された。さらに、曲線はｄｓＤＮＡ濃度のより広い範囲にわたって引き伸ばされ、ＢＲＥＴ比の倍数変化はより小さくなっているようである。これは、異なる親和性バインダーの混合物が存在し、不完全な色素のカップリング反応に起因することを示している可能性がある。その結果、異なる濃度領域でｄｓＤＮＡに結合する１つ、２つまたは３つの色素を持つＮａｎｏＬｕｃ変異体が得られた。
【0043】
本発明は、発光ルシフェラーゼタンパク質に１つ以上のインターカレート色素を結合させた、ｄｓＤＮＡ検出用の包括的な生物発光センサについて述べている。プローブあたり１つ以上の色素の多価ＤＮＡ結合と、色素間の短い正電荷リシンリンカーの使用を組み合わせることで、単純な生物発光読み出しで高親和性ＤＮＡ検出プローブが得られた。その結果、ｄｓＤＮＡはμＭ程度の親和性（塩基対で測定）で検出でき、ＢＲＥＴ比は４～９倍変化した。多くの増幅法では、１００～２００ｂｐのｄｓＤＮＡ断片が生成され、このことは、今回開発されたセンサは、低ｎＭ領域ですでにそのような断片を検出できることを示唆している。
【0044】
本発明は、一般的な風邪の原因となるライノウイルスや、非常に関連性が高く破壊的なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを用いて、血液や唾液などの患者サンプル中のウイルスＤＮＡまたはＲＮＡを検出するために使用することを想定している。この目的のために、本明細書に記載された生物発光インターカレートタンパク質を増幅技術（例えば、ＲＰＡまたはＬＡＭＰ）と組み合わせることができ、患者サンプル中のＤＮＡを直接検出するために必要なアッセイの感度を高めるために、最初の前増幅ステップを実施する簡単な方法を提供する。ＮａｎｏＬｕｃの熱安定性から、ＮａｎｏＬｕｃ－ＴＯ複合体はワンポット反応におけるＲＰＡ（Ｔ＝４２℃）の進行をリアルタイムでモニターするために使用できると期待される。さらに、本発明では、ループ位置での２価のＴＯ標識とＣ末端での２価の標識とを組み合わせることによって、ｄｓＤＮＡに対するルシフェラーゼ－ＴＯ複合体の親和性をさらに高めることが想定される。さらに、ＮａｎｏＬｕｃドメインと一般的なｄｓＤＮＡ結合ドメインとの融合によって、感度をさらに向上させることも想定される。
【0045】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２相補的ＤＮＡの２段階アッセイ
ｄｓＤＮＡ断片は通常１００～２００塩基対の長さであることから、今回開発したセンサはこのような断片を低ナノモル範囲で検出できることが示唆される。ウイルス核酸検出のような診断用途の多くは、アトモルの感度を必要とするため、開発した生物発光プローブとさまざまな等温増幅ステップを組み合わせて、ポイント・オブ・ケアで使用できる単純で高感度なアッセイプラットフォームを開発することを検討した。その結果、非特異的増幅を最小限に抑えながらｄｓＤＮＡの収量が高い（非特異的読み出しを採用する場合、大きなバックグラウンドシグナルを避けることが不可欠である）ことからＬＡＭＰ法が最も適していることがわかった。現在進行中のＣＯＶＩＤ－１９パンデミックに触発され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を標的にするようにＬＡＭＰ反応を設計し、ウイルス検出のための迅速なポイント・オブ・ケア検出におけるＬＵＭＩＤプローブの実現可能性を探った。
ｄｓＤＮＡ断片は通常１００～２００塩基対の長さであることから、今回開発したセンサはこのような断片を低ナノモル範囲で検出できることが示唆される。ウイルス核酸検出のような診断用途の多くは、アトモルの感度を必要とするため、開発した生物発光プローブとさまざまな等温増幅ステップを組み合わせて、ポイント・オブ・ケアで使用できる単純で高感度なアッセイプラットフォームを開発することを検討した。その結果、非特異的増幅を最小限に抑えながらｄｓＤＮＡの収量が高い（非特異的読み出しを採用する場合、大きなバックグラウンドシグナルを避けることが不可欠である）ことからＬＡＭＰ法が最も適していることがわかった。現在進行中のＣＯＶＩＤ－１９パンデミックに触発され、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのヌクレオカプシド（Ｎ）遺伝子の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列を標的にするようにＬＡＭＰ反応を設計し、ウイルス検出のための迅速なポイント・オブ・ケア検出におけるＬＵＭＩＤプローブの実現可能性を探った。
【0046】
まず、連続希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｃＤＮＡをＬＡＭＰ法で増幅し、その後、生物発光検出を容易にするためにＬＵＭＩＤ－２Ｆと組み合わせる２段階アッセイを開発した（図１０Ａ）。この目的のために、ＬＡＭＰ反応を製造業者の指示に従って６５℃で３５分間行い、その後１：１（ｖ／ｖ）で２ｎＭのセンサタンパク質と結合させた。３０分間のインキュベーションと基質の添加後、２００ａＭ（１２０コピー／μＬ）までのＤＮＡ濃度は、緑色／青色の発光比が２．５倍変化することで、非テンプレート対照（ＮＴＣ）と識別できた（図１０Ｂ）。ポイント・オブ・ケアへの応用の可能性を示すため、標準的なスマートフォンのカメラ（Ｘｉａｏｍｉ ｍｉ ９ ｌｉｔｅ）を用いて、発泡スチロールの暗箱の中でシグナルを記録した。プレートリーダー測定に使用したのと同じサンプルを撮影した写真では、２００ａＭまでのすべてのＤＮＡ濃度で、青から緑への明確な色の変化が視覚的に確認された（図１０Ｃ）。スマートフォンのＲＧＢ画像の青色と緑色のチャンネルから正確な発光比を計算したところ、プレートリーダー測定で得られた比と直線的な相関を示し（図１０Ｄ）、ピアソン係数は０．９９６であった。このことから、発光比率の絶対的な変化は異なるものの、スマートフォンのカメラの性能はプレートリーダーの性能と同等であることが明らかになった。どちらの検出方法においても、ＮＴＣの緑色光量はバッファーだけを用いたコントロールよりも高いことがわかった。これは、ＬＡＭＰ反応で使用される長い（～４０ｂｐ）プライマーが、増幅を伴わずに検出可能な二次ｄｓＤＮＡ構造を形成するためと考えられる。このプライマー関連のバックグラウンドシグナルはアッセイのダイナミックレンジを減少させるが、観察された発光比の変化は頑健で、一般的なＢＲＥＴベースのセンサと同等である。これらの結果は、ＬＵＭＩＤセンサをＬＡＭＰと組み合わせることで、スマートフォンを使った簡単な検出によって約１時間で結果が得られる高感度核酸アッセイプラットフォームを構築できることを示している。
【0047】
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２相補的ＤＮＡのワンポットアッセイ
次に、すべてのアッセイ成分を１本のチューブにまとめることができるかどうかを評価し、１段階のポイント・オブ・ケア診断ツールとしてのこのプラットフォームの実行可能性を実証した。このアプローチは、実験手順を簡略化するだけでなく、増幅後の反応液の移し替えの際に交差汚染の結果として生じる可能性のある偽陽性のリスクを低減する。したがって、ＬＡＭＰ反応成分を、連続希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｃＤＮＡ、ＬＵＭＩＤ－２Ｆセンサ（１ｎＭ）、ＮａｎｏＬｕｃ基質（１０００倍希釈）と共に１本のチューブに入れた後、６５℃で３５分間インキュベートした（図１１Ａ）。ＮａｎｏＬｕｃは６５℃の反応温度では不活性であったが、室温で５分間冷却すれば酵素活性は完全に回復した。この短いクールダウンのステップを用いると、２０ａＭ（１２コピー／μＬ）までのＤＮＡ濃度は、緑色／青色の発光比の２．１倍の変化で非テンプレートコントロール（ＮＴＣ）と識別できた（図１１Ｂ）。また、プレートリーダー測定に使用したのと同じサンプルを撮影した写真では、ＤＮＡ濃度が２０ａＭまで視覚的な色の変化が見られた（図１１Ｃ）。このことは、ワンポットアッセイに移行しても感度が損なわれず、２段階アッセイで報告されたアトモル感度が維持されたことを示している。見かけ上１０倍の親和性上昇が観察されたが、これはＬＡＭＰ反応に内在する反応間変動によるものと思われる。
次に、すべてのアッセイ成分を１本のチューブにまとめることができるかどうかを評価し、１段階のポイント・オブ・ケア診断ツールとしてのこのプラットフォームの実行可能性を実証した。このアプローチは、実験手順を簡略化するだけでなく、増幅後の反応液の移し替えの際に交差汚染の結果として生じる可能性のある偽陽性のリスクを低減する。したがって、ＬＡＭＰ反応成分を、連続希釈したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｃＤＮＡ、ＬＵＭＩＤ－２Ｆセンサ（１ｎＭ）、ＮａｎｏＬｕｃ基質（１０００倍希釈）と共に１本のチューブに入れた後、６５℃で３５分間インキュベートした（図１１Ａ）。ＮａｎｏＬｕｃは６５℃の反応温度では不活性であったが、室温で５分間冷却すれば酵素活性は完全に回復した。この短いクールダウンのステップを用いると、２０ａＭ（１２コピー／μＬ）までのＤＮＡ濃度は、緑色／青色の発光比の２．１倍の変化で非テンプレートコントロール（ＮＴＣ）と識別できた（図１１Ｂ）。また、プレートリーダー測定に使用したのと同じサンプルを撮影した写真では、ＤＮＡ濃度が２０ａＭまで視覚的な色の変化が見られた（図１１Ｃ）。このことは、ワンポットアッセイに移行しても感度が損なわれず、２段階アッセイで報告されたアトモル感度が維持されたことを示している。見かけ上１０倍の親和性上昇が観察されたが、これはＬＡＭＰ反応に内在する反応間変動によるものと思われる。
【図1】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】