特表 2024-541668 抗ＢＣＭＡナノ抗体及びその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-08

(54)【発明の名称】抗ＢＣＭＡナノ抗体及びその応用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20241031BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241031BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241031BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241031BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 51/10 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 49/16 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 49/22 20060101ALI20241031BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20241031BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20241031BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46

C12N1/15 ZNA

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N15/13

A61P35/00

A61P43/00 121

A61K45/00

A61K39/395 T

A61K48/00

A61K51/10 100

A61K51/10 200

A61K49/16

A61K49/00

A61K49/22

A61K47/68

A61K39/395 L

C12N15/09 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024533063

(86)(22)【出願日】2022-12-02

(85)【翻訳文提出日】2024-05-31

(86)【国際出願番号】 CN2022136074

(87)【国際公開番号】W WO2023098846

(87)【国際公開日】2023-06-08

(31)【優先権主張番号】202111468274.X

(32)【優先日】2021-12-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(31)【優先権主張番号】202211000054.9

(32)【優先日】2022-08-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523079059

【氏名又は名称】山▲東▼先声生物制▲薬▼有限公司

【氏名又は名称原語表記】Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｓｉｍｃｅｒｅ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．

【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１，Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ｒｏａｄ，Ｙａｎｔａｉ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｚｏｎｅ，Ｙａｎｔａｉ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ ２６４００６，Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】付 雅媛

(72)【発明者】

【氏名】游 ▲術▼▲梅▼

(72)【発明者】

【氏名】殷 博薇

(72)【発明者】

【氏名】曹 卓▲暁▼

(72)【発明者】

【氏名】唐 任宏

(72)【発明者】

【氏名】任 晋生

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA25

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C084AA12

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC751

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA25

4C085AA26

4C085BB01

4C085BB33

4C085BB34

4C085BB35

4C085BB36

4C085BB37

4C085CC03

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085HH01

4C085HH03

4C085HH07

4C085HH09

4C085HH11

4C085KA04

4C085KA05

4C085KA27

4C085KA28

4C085KA29

4C085KB82

4C085LL18

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、そのコード核酸、発現ベクター及び発現細胞、製造方法、医薬組成物、及び疾患を治療するための使用、例えば、腫瘍の治療における使用である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインのＨＣＤＲ１を含み、前記ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインのＨＣＤＲ２を含み、且つ前記ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインのＨＣＤＲ３を含む、抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに基づいて確定され、
任意選択的に、前記ＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３７、４０、４２、４５、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６４、６７、７１、７４、７７、８１、８４、８６、８７、１０４、１０７、１１３、１１６、１１９、１２１、１２４、１２７、１３１、１３４、１３８又は１４１に示すアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、３８、４１、４３、４６、４９、５９、６１、６３、６５、６８、７０、７２、７５、７８、７９、８２、８５、８８、８９、９０、９１、１０２、１０５、１０８、１０９、１１１、１１４、１１７、１２０、１２２、１２５、１２８、１２９、１３２、１３５、１３６、１３９、１４２、１４３、１４８、１５０、１５２、１５３、１５５又は１５７に示すアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３９、４４、４７、５１、５３、５５、５７、６０、６２、６６、６９、７３、７６、８０、８３、１０３、１０６、１１０、１１２、１１５、１１８、１２３、１２６、１３０、１３３、１３７、１４０、１４４、１４５、１４６、１４７、１４９、１５１、１５４又は１５６に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３５及び３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８及び３９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１及び３６に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４３及び４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６及び４７、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、４９及び４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、３５及び５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、３８及び５３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、４１及び５１に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３５及び５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、３８及び５７、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、４１及び５５に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、５９及び６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、６１及び６２、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、６３及び６０に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、６５及び６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、６８及び６９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、７０及び６６に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、７２及び７３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、７５及び７６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、７８及び７３に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、７９及び８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、８２及び８３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、８５及び８０に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６、３５及び３６に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、８８及び４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、８８及び４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、８９及び４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、９０及び４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、９１及び４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、１０２及び１０３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、１０５及び１０６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、１０８及び１０３に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、１０９及び１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、１１１及び１１２、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、１０８及び１１０に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１１４及び１１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６、１１７及び１１８、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９、１２０及び１１５に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１、１２２及び１２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４、１２５及び１２６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７、１２８及び１２３に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１２９及び１３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１、１３２及び１３３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４、１３５及び１３０に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１３６及び１３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、１３９及び１４０、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１、１４２及び１３７に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、１４３及び１４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８及び１４５、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１及び１４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、１４３及び１４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、３８及び１４７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、４１及び１４６に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、１４８及び１４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、１５０及び１５１、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、１５２及び１４９に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、１５３及び１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、１５５及び１５６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、１５７及び１５４に示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３は、請求項１又は２に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３に１個、２個又は３個の突然変異が発生するアミノ酸配列を含み、前記突然変異は、挿入、欠失及び／又は置換から選択され、前記置換は、好ましくは、保存的アミノ酸の置換である、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３は、前述ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３に比べて少なくとも８０、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

前記抗体又はその抗原結合断片は、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体を含み、
好ましくは、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すアミノ酸配列に比べて多くとも２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個の突然変異が発生するアミノ酸配列を含み、前記突然変異は、挿入、欠失及び／又は置換から選択され、前記置換は、好ましくは、保存的アミノ酸の置換であり、
任意選択的に、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すアミノ酸配列に比べて少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインにおけるＦＲ領域を含み、
任意選択的に、前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインにおけるＦＲ領域に比べて多くとも１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個の突然変異が発生するアミノ酸配列を含み、前記突然変異は、挿入、欠失及び／又は置換から選択され、前記置換は、好ましくは、保存的アミノ酸の置換であり、
任意選択的に、前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインにおけるＦＲ領域に比べて少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項7】

前記抗体又はその抗原結合断片は、（１）キメラ抗体又はその断片、（２）ヒト化抗体又はその断片、又は（３）完全ヒト抗体又はその断片から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項8】

前記抗体又はその抗原結合断片は、抗体重鎖定常領域を含むか又は含まず、任意選択的に、前記抗体重鎖定常領域は、ヒト、アルパカ、マウス、ラット、ウサギ及びヒツジから選択され、任意選択的に、前記抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤから選択され、任意選択的に、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択され、任意選択的に、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ領域、ＣＨ３領域及び完全な重鎖定常領域から選択され、好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトＦｃ領域であり、好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は重鎖抗体である、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項9】

前記抗体又はその抗原結合断片には、さらに治療剤又はトレーサーがカップリングされており、好ましくは、前記治療剤は、放射性同位体、化学療法薬又は免疫調節剤から選択され、前記トレーサーは、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤及び光増感剤から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項10】

前記抗体又はその抗原結合断片には、さらに他の機能性分子が連結されており、好ましくは、前記他の機能性分子は、シグナルペプチド、タンパク質タグ、サイトカイン、血管新生阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤のうちの一つ又は複数から選択される、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項11】

多重特異性抗原結合分子であって、前記多重特異性抗原結合分子は、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、及びＢＣＭＡ以外の他の抗原に結合する抗原結合分子、又は請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片とは異なるＢＣＭＡエピトープに結合するものを含み、任意選択的に、前記ＢＣＭＡ以外の他の抗原は、ＣＤ３（好ましくは、ＣＤ３εである）、ＣＤ１６、ＣＤ１３７、ＣＤ２５８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、４－１ＢＢ、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ－１Ｒ、ホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、ＰＳ）、Ｃ－Ｍｅｔ、ＨＳＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＭＳＬＮ、血液脳関門受容体、ＧＰＣ３、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＧＤ２、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＦＲα及びＧｕｃｙ２Ｃから選択され、
好ましくは、前記抗原結合分子は、抗体又はその抗原結合断片であり、
好ましくは、前記多重特異性抗原結合分子は、二重特異性、三重特異性又は四重特異性であり、
好ましくは、前記多重特異性抗原結合分子は、２価、３価、４価、５価又は６価である、多重特異性抗原結合分子。

【請求項12】

単離された核酸断片であって、前記核酸断片は、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子をコードする、核酸断片。

【請求項13】

請求項１２に記載の核酸断片を含む、ベクター。

【請求項14】

宿主細胞であって、前記宿主細胞は、請求項１２に記載の核酸断片又は請求項１３に記載のベクターを含み、好ましくは、前記細胞は、原核細胞又は真核細胞、例えば、細菌（例えば、大腸菌）、真菌（例えば、酵母）、昆虫細胞又は哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株又は２９３Ｔ細胞株）である、宿主細胞。

【請求項15】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片又は請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子を製造する方法であって、前記方法は、請求項１４に記載の細胞を培養することと、前記細胞により発現される抗体、抗原結合断片又は多重特異性抗原結合分子を単離することとを含む、方法。

【請求項16】

医薬組成物であって、前記医薬組成物は、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１２に記載の核酸断片、請求項１３に記載のベクター又は請求項１５に記載の方法に従って製造された生成物を含み、任意選択的に、前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤又は助剤をさらに含み、任意選択的に、前記医薬組成物は、追加の抗腫瘍剤をさらに含む、医薬組成物。

【請求項17】

腫瘍又は癌を治療する方法であって、前記方法は、有効量の請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１２に記載の核酸断片、請求項１３に記載のベクター、請求項１５に記載の方法に従って製造された生成物又は請求項１６に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含み、任意選択的に、前記腫瘍又は癌は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍又は癌であり、好ましくは、前記腫瘍又は癌はＢ細胞リンパ腫であり、より好ましくは、多発性骨髄腫（ＭＭ）である、方法。

【請求項18】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１２に記載の核酸断片、請求項１３に記載のベクター、請求項１５に記載の方法に従って製造された生成物又は請求項１６に記載の医薬組成物の、腫瘍又は癌を治療する医薬品の製造における使用であって、任意選択的に、前記腫瘍又は癌は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍又は癌であり、好ましくは、前記腫瘍又は癌はＢ細胞リンパ腫であり、より好ましくは、多発性骨髄腫（ＭＭ）である、使用。

【請求項19】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１２に記載の核酸断片、請求項１３に記載のベクター、請求項１５に記載の方法に従って製造された生成物又は請求項１６に記載の医薬組成物の、腫瘍又は癌を治療するための使用であって、任意選択的に、前記腫瘍又は癌は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍又は癌であり、好ましくは、前記腫瘍又は癌はＢ細胞リンパ腫であり、より好ましくは、多発性骨髄腫（ＭＭ）である、使用。

【請求項20】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１２に記載の核酸断片、請求項１３に記載のベクター、請求項１５に記載の方法に従って製造された生成物又は請求項１６に記載の医薬組成物を含む、キット。

【請求項21】

生物学的試料におけるＢＣＭＡ発現を検出する方法であって、前記方法は、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片とＢＣＭＡとの間で複合体を形成し得る条件下で、前記生物学的試料を前記の抗体又はその抗原結合断片に接触させることを含み、好ましくは、前記方法は、前記複合体の形成を検出し、試料におけるＢＣＭＡの存在又は発現レベルを指示することをさらに含む、方法。

【請求項22】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片の、ＢＣＭＡ検出試薬の製造における使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０２１年１２月０３日に中国国家知識産権局に出願された、特許出願番号が２０２１１１４６８２７４．Ｘであり、発明名称が「ＢＣＭＡナノ抗体及びその応用」である中国特許出願、及び２０２２年０８月１９日に中国国家知識産権局に出願された、特許出願番号が２０２２１１０００５４．９であり、発明名称が「抗ＢＣＭＡナノ抗体及びその応用」である中国特許出願の優先権を主張する。上記先願は、その全体が参照により本出願に組み込まれる。

【0002】

本出願は、バイオ医薬分野に関し、具体的には、抗ＢＣＭＡナノ抗体及びその応用に関する。

【背景技術】

【0003】

多発性骨髄腫（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ、ＭＭ）は、骨髄から発生する悪性形質細胞腫であり、Ｂ細胞リンパ腫の一種であり、形質細胞腫とも呼ばれる。その特徴は、骨髄形質細胞の異常増殖にモノクローナル免疫グロブリン又は軽鎖（Ｍタンパク質）過剰産生を伴うことであり、ごく少数の患者は、Ｍタンパク質を産生しない非分泌型ＭＭであってもよい。多発性骨髄腫は、多発性骨溶解病変、高カルシウム血症、貧血、腎臓損傷を伴うことが多い。正常な免疫グロブリンの産生が抑制されるため、様々な細菌感染が起こりやすい。

【0004】

多発性骨髄腫の発生率は、全ての腫瘍の１％を占め、血液悪性腫瘍の１０～１５％を占める。男女比は１．６：１であり、大多数の患者の年齢は＞４０歳である。多発性骨髄腫の治療は、化学療法及び造血幹細胞移植を含む。ここで、レナリドミドに代表される免疫調節剤及びボルテゾミブに代表されるプロテアーゼ阻害剤は、単剤又は併用の形で良好な薬効を示し、多発性骨髄腫患者の一般的な治療手段となっている。しかし、多発性骨髄腫は依然として治癒不能な疾患と考えられており、現在の治療手段は、多発性骨髄腫の症状を緩和するものに過ぎず、いずれも腫瘍を完全に除去することができず、ほとんどの患者は結局再発する。そのため、新たな治療法には切実な需要がある。

【0005】

Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、ＣＤ２６９又はＴＮＦＲＳＦ１７とも呼ばれ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーであり、１９９０年代初頭に初めて発見された。該受容体は、主に成熟Ｂリンパ球及び形質細胞の表面に発現し、Ｂリンパ球の成熟のマーカータンパク質であり、他の組織細胞ではほとんど発現しない。構造的に、ＢＣＭＡは、細胞外セグメント（ａａ１－５４）、膜貫通領域（ａａ５５－７７）及び細胞内セグメント（ａａ７８－１８４）という３つの主なドメインからなる。Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）及び増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）は、ＢＣＭＡの主なリガンドであり、ＢＣＭＡとの相互作用によって細胞刺激シグナルを伝達し、ＴＲＡＦ依存性ＮＦ－κＢ、ＪＮＫ経路を活性化し、Ｂ細胞の増殖及び生存率を増加させる。ＢＣＭＡは、ＭＭ細胞において高度に発現し、多発性骨髄腫の理想的な抗原標的である。ＢＣＭＡは、ヒトサル相同性が８８％であり、交差結合抗体のスクリーニングには一定の困難がある。

【0006】

ＢＣＭＡに対するＣＡＲ Ｔ、二重特異性抗体及びＡＤＣなどの治療療法は、重要な進展を遂げ、明るい見通しを示したが、より高効率な次世代のＢＣＭＡ特異性抗体及びそれに基づくバイオ治療製品の開発には依然として差し迫った需要がある。

【発明の概要】

【0007】

本出願は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、多重特異性抗原結合分子、キメラ抗原受容体、免疫エフェクター細胞、核酸断片、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、キット、製造方法及び疾患の治療及びＢＣＭＡの検出におけるその応用を提供する。

【0008】

一態様では、本出願は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインのＨＣＤＲ１を含み、前記ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインのＨＣＤＲ２を含み、且つ前記ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインのＨＣＤＲ３を含む。

【0009】

別の態様では、本出願は、多重特異性抗原結合分子を提供し、ここで、前記多重特異性抗原結合分子は、前述抗体又はその抗原結合断片、及びＢＣＭＡ以外の他の抗原に結合する抗原結合分子、又は前述抗体又はその抗原結合断片とは異なるＢＣＭＡエピトープに結合するものを含む。

【0010】

別の態様では、本出願は、単離された核酸断片を提供し、ここで、前記核酸断片は、前述抗体又はその抗原結合断片又は前述多重特異性抗原結合分子をコードする。

【0011】

別の態様では、本出願は、ベクターを提供し、ここで、前記ベクターは前述核酸断片を含む。

【0012】

別の態様では、本出願は、宿主細胞を提供し、ここで、前記宿主細胞は、前述核酸断片又は前述ベクターを含む。

【0013】

別の態様では、本出願は、前述抗体もしくはその抗原結合断片又は前述多重特異性抗原結合分子を製造する方法を提供し、前記方法は、前述細胞を培養することと、前記細胞により発現される抗体、抗原結合断片又は多重特異性抗原結合分子を単離することとを含む。

【0014】

別の態様では、本出願は、医薬組成物を提供し、ここで、前記医薬組成物は、前述抗体もしくはその抗原結合断片、前述多重特異性抗原結合分子、前述核酸断片、前述ベクター又は前述方法に従って製造された生成物を含む。

【0015】

別の態様では、本出願は、腫瘍又は癌を治療する方法を提供し、ここで、前記方法は、有効量の前述抗体もしくはその抗原結合断片、前述多重特異性抗原結合分子、前述核酸断片、前述ベクター、前述方法に従って製造された生成物又は前述医薬組成物を被験者に投与することを含む。

【0016】

別の態様では、本出願は、前述抗体もしくはその抗原結合断片、前述多重特異性抗原結合分子、前述核酸断片、前述ベクター、前述方法に従って製造された生成物又は前述医薬組成物の、腫瘍又は癌を治療する医薬品の製造における使用を提供する。

【0017】

別の態様では、本出願は、前述抗体もしくはその抗原結合断片、前述多重特異性抗原結合分子、前述核酸断片、前述ベクター、前述方法に従って製造された生成物又は前述医薬組成物の、腫瘍又は癌を治療するための使用を提供する。

【0018】

別の態様では、本出願は、キットを提供し、ここで、前記キットは、前述抗体もしくはその抗原結合断片、前述多重特異性抗原結合分子、前述核酸断片、前述ベクター、前述方法に従って製造された生成物又は前述医薬組成物を含む。

【0019】

別の態様では、本出願は、生物学的試料におけるＢＣＭＡ発現を検出方法を提供し、ここで、前記方法は、前述抗体又はその抗原結合断片とＢＣＭＡとの間で複合体を形成し得る条件下で、前記生物学的試料を前記の抗体又はその抗原結合断片と接触させることを含む。

【0020】

別の態様では、本出願は、前述抗体又はその抗原結合断片の、ＢＣＭＡ検出試薬の製造における使用を提供する。

【0021】

本出願は、ＢＣＭＡ標的に対する高い親和性を有する抗体又はその抗原結合断片を提供し、ＢＣＭＡとそのリガンドＡＰＲＩＬとの結合をより良く遮断することによって、ＢＣＭＡ抗体医薬品及び細胞治療製品により良い選択肢を提供し、多発性骨髄腫、特に再発／難治性多発性骨髄腫の治療手段の不足を補うために重要な意義を持つ。

【図面の簡単な説明】

【0022】

【図1A】対照抗体とヒトＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質との結合反応のＥＬＩＳＡによる検出を示した図である。

【図1B】対照抗体とサルＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質との結合反応のＥＬＩＳＡによる検出を示した図である。

【図2A】ＲＥＧＮ５４５９－ｈＩｇＧ１及びＨＰＮ２１７－ｈＨｃＡｂ抗体によるＨ９２９細胞のＢＣＭＡ発現量の検出のＦＡＣＳ結果を示した図である。

【図2B】ＲＥＧＮ５４５９－ｈＩｇＧ１及びＨＰＮ２１７－ｈＨｃＡｂ抗体によるＵ２６６細胞のＢＣＭＡ発現量の検出のＦＡＣＳ結果を示した図である。

【図3】ＲＥＧＮ５４５９－ｈＩｇＧ１抗体によるＦｌｐ－ｉｎＣＨＯ－ヒトＢＣＭＡ細胞のＢＣＭＡ発現量の検出のＦＡＣＳ結果を示した図である。

【図4】ＲＥＧＮ５４５９－ｈＩｇＧ１抗体によるＦｌｐ－ｉｎＣＨＯ－サルＢＣＭＡ細胞のＢＣＭＡ発現量の検出のＦＡＣＳ結果を示した図である。

【図5】組換え候補抗体とヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質との結合反応のＥＬＩＳＡによる検出を示した図である。

【図6】組換え候補抗体とサルＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質との結合反応のＥＬＩＳＡによる検出を示した図である。

【図7】組換え候補抗体とＨ９２９腫瘍細胞との結合反応のＦＡＣＳによる検出を示した図である。

【図8】組換え候補抗体とＵ２６６腫瘍細胞との結合反応のＦＡＣＳによる検出を示した図である。

【図9】リガンドＡＰＲＩＬとヒトＢＣＭＡタンパク質との結合に対する組換え候補抗体の遮断作用のリガンド結合の競合ＥＬＩＳＡによる検出を示した図である。

【図10】ヒト化候補ナノ抗体とヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質との結合反応のＥＬＩＳＡによる検出を示した図である。

【図11】ヒト化候補ナノ抗体とサルＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質との結合反応のＥＬＩＳＡによる検出を示した図である。

【図12】ヒト化候補ナノ抗体とＨ９２９腫瘍細胞との結合反応のＦＡＣＳによる検出を示した図である。

【図13】ヒト化候補ナノ抗体とＵ２６６腫瘍細胞との結合反応ＦＡＣＳによる検出を示した図である。

【図14】リガンドＡＰＲＩＬとヒトＢＣＭＡタンパク質との結合に対するヒト化候補ナノ抗体の遮断作用のリガンド結合の競合ＥＬＩＳＡによる検出を示した図である。

【図15】キメラ抗体とヒトＢＣＭＡ－ｈｉｓタンパク質との結合反応のＥＬＩＳＡによる検出を示した図である。

【図16A】キメラ抗体とＨ９２９腫瘍細胞との結合反応のＦＡＣＳによる検出を示した図である。

【図16B】キメラ抗体とＵ２６６腫瘍細胞との結合反応のＦＡＣＳによる検出を示した図である。

【図17】リガンドＡＰＲＩＬとヒトＢＣＭＡタンパク質との結合に対するキメラ抗体の阻断作用のリガンド結合の競合ＥＬＩＳＡによる検出を示した図である。

【発明の詳細な説明】

【0023】

用語の定義及び説明
本明細書において特に定義しない限り、本出願に関連する科学用語及び技術用語は、当業者に理解されている意味を有する。

【0024】

また、本明細書において特に説明されていない限り、本明細書における単数形の用語は、複数形を含むべきであり、複数形の用語は、単数形を含むべきである。より具体的には、別途明らかに指摘されていない限り、本明細書及び添付される特許請求の範囲において使用される単数形「１つ」及び「このような」は、複数の指示対象を含む。

【0025】

本明細書における「含む」、「包含する」及び「有する」という用語は、同義的に使用され、スキームの包括性を示すことが意図され、前記スキームには、列挙された要素以外の他の要素が存在し得ることを意味する。同時に、本明細書で使用される「含む」、「包含する」及び「有する」という記述はまた、「……からなる」というスキームを提供することを理解すべきである。

【0026】

「及び／又は」という用語は、本明細書で使用される場合、「及び」、「又は」及び「属する用語によってリンクされる要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。

【0027】

本明細書において、「ＢＣＭＡ」という用語は、Ｂ細胞成熟抗原（Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ）の略語であり、腫瘍坏死因子受容体ファミリーのメンバーに属する。ＢＣＭＡは、主に後期Ｂ細胞、短寿命増殖形質芽細胞及び長寿命形質細胞の表面に発現し、初期Ｂ細胞、ＣＤ３４陽性造血幹細胞及び他の正常組織細胞に発現しないが、ＭＭ細胞において高度に発現し、下流シグナル伝達経路を媒介することによって、ＭＭ細胞の生存、増殖、転移及び薬剤耐性に重要な役割を果たすため、ＢＣＭＡは、ＭＭ治療の理想的な抗原標的である。

【0028】

本明細書において、「特異的結合」という用語は、抗原結合分子（例えば、抗体）が、通常、抗原及び実質的に同じ抗原に高い親和性で特異的に結合するが、関連性のない抗原に高い親和性で結合しないことを指す。親和性は、通常、平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ、ＫＤ）によって反映され、ここで、低いＫＤは、高い親和性を表す。抗体を例として、高い親和性は、通常、約１０^－６Ｍ又はそれ以下、１０^－７Ｍ又はそれ以下、約１０^－８Ｍ又はそれ以下、約１０^－９Ｍ又はそれ以下のＫＤを有することを指す。ＫＤの計算方式は以下のとおりである：ＫＤ＝Ｋｄ／Ｋａ、ここで、Ｋｄは解離速度を表し、Ｋａは結合速度を表す。平衡解離定数ＫＤは、表面プラズモン共鳴法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）又は平衡透析アッセイのような当分野で周知の方法を用いて測定することができる。

【0029】

本明細書において、「抗原結合分子」という用語は、最も広い意味で使用され、抗原に特異的に結合する分子を指す。例示的に、抗原結合分子は、抗体又は抗体模倣体を含むが、それらに限らない。「抗体模倣体」は、抗原に特異的に結合することができるが、抗体構造とは無関係である有機化合物又は結合ドメインを指し、例示的に、抗体模倣体は、ａｆｆｉｂｏｄｙ、ａｆｆｉｔｉｎ、ａｆｆｉｌｉｎ、設計アンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、核酸アプタマー又はＫｕｎｉｔｚ型ドメインペプチドを含むが、それらに限らない。

【0030】

本明細書において、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、免疫グロブリン重鎖可変領域からの十分な配列及び／又は免疫グロブリン軽鎖可変領域からの十分な配列を含み、それによって抗原に特異的に結合することができるポリペプチド又はポリペプチドの組み合わせを指す。本明細書において、「抗体」は、所望の抗原結合活性を示す限り、様々な形態及び様々な構造を包含する。本明細書において、「抗体」は、移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）又はＣＤＲ誘導体を有する代替タンパク質足場又は人工足場を含む。このような足場は、抗体由来の足場（それは、例えば、抗体の三次元構造を安定化するために導入された突然変異を含む）と、例えば、生体適合性ポリマーを含む全合成足場とを含む。例えば、Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，５３（１）：１２１－１２９（２００３）、Ｒｏｑｕｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９－６５４（２００４）を参照されたい。このような足場は、非抗体由来の足場、例えば、当分野に既知の、ＣＤＲ移植に用いられ得る足場タンパク質をさらに含んでもよく、テネイシン、フィブロネクチン、ペプチドアプタマーなどを含むが、それらに限らない。

【0031】

「抗体」という用語は、全抗体及びその任意の抗原結合断片（即ち「抗原結合部分」）又は一本鎖を含む。「抗体」は、ジスルフィド結合を介して互いに連結される少なくとも二本の重（Ｈ）鎖及び二本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（ここではＶＨと略される）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ここではＶＬと略される）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、一つのドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに分けられてもよく、ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保守的な領域に散在している。各ＶＨ及びＶＬは、いずれも３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシル末端へ、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順序で並べられる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用することができる結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと宿主組織又は因子との結合を媒介することができ、該宿主組織又は因子は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）と古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）とを含む。免疫グロブリン重鎖定常領域は、アミノ酸の組成及び配列順序が異なるため、その抗原性も異なる。これにより、本明細書の「免疫グロブリン」を５つのクラスに分けることができ、又は免疫グロブリンのアイソタイプ、即ちＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと呼ばれてもよく、その該当する重鎖は、それぞれμ鎖、δ鎖、γ鎖、α鎖とε鎖である。同じクラスＩｇは、そのヒンジ領域のアミノ酸組成並びに重鎖ジスルフィド結合の数及び位置の違いにより、様々なサブクラスに分けられ得、例えば、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられ得、ＩｇＡはＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けられ得る。軽鎖は、定常領域により、κ鎖又はλ鎖に分けられる。５つのクラスのＩｇのうちの各クラスのＩｇは、いずれもκ鎖又はλ鎖を有し得る。

【0032】

本明細書において、「抗体」は、軽鎖を含まない抗体、例えば、ヒトコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ）、フタコブラクダ（Ｃａｍｅｌｕｓ ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ）、ラマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）、グアナコ（Ｌａｍａ ｇｕａｎｉｃｏｅ）及びアルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａ ｐａｃｏｓ）などのラクダ科動物から産生された重鎖抗体（ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＨＣＡｂｓ）並びにサメなどの軟骨魚綱に見られる免疫グロブリン新抗原受容体（Ｉｇ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩｇＮＡＲ）をさらに含む。

【0033】

本明細書において、「抗体」という用語は、任意の動物に由来してもよく、ヒト及び非ヒト動物を含むが、それらに限らず、前記非ヒト動物は、霊長類動物、哺乳動物、齧歯動物及び脊椎動物、例えば、ラクダ科動物、ラマ、グアナコ、アルパカ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット又は軟骨魚綱（例えば、サメ）から選択される。

【0034】

本明細書において、「重鎖抗体」という用語は、従来の抗体の軽鎖を欠く抗体を指す。該用語は、具体的には、ＣＨ１ドメインの不存在下でＶＨ抗原結合ドメインと、ＣＨ２及びＣＨ３定常ドメインとを含むホモ二量体抗体を含むが、それらに限らない。

【0035】

本明細書において、「ナノ抗体」という用語は、重鎖抗体（ラクダなどの体内に存在する、軽鎖が天然に欠失している重鎖抗体）の可変領域をクローニングして得られた、重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体を指し、ＶＨＨ（Ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とも呼ばれ、それは、最小の機能性抗原結合断片である。

【0036】

本明細書において、「ＶＨＨドメイン」及び「ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」、「単一ドメイン抗体」（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｓｄＡｂ）という用語は、同じ意味を有し、同義的に使用され、重鎖抗体の可変領域をクローニングして、一つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体を構築することを指し、それは、完全な機能を有する最小の抗原結合断片である。通常、軽鎖及び重鎖定常領域１（ＣＨ１）が天然に欠失している重鎖抗体を得てから、抗体重鎖の可変領域をクローニングすることで、一つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体を構築する。

【0037】

「重鎖抗体」及び「単一ドメイン抗体」、「ＶＨＨドメイン」及び「ナノ抗体」に関する更なる説明は、以下を参照されたい：Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎら，Ｎａｔｕｒｅ．１９９３、３６３；４４６－８，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓの概説文章（Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７４：２７７－３０２，２００１）、並びに一般的な背景技術として言及されている以下の特許出願：ＷＯ ９４／０４６７８、ＷＯ ９５／０４０７９及びＷＯ ９６／３４１０３、ＷＯ ９４／２５５９１、ＷＯ ９９／３７６８１、ＷＯ ００／４０９６８、ＷＯ ００／４３５０７、ＷＯ ００／６５０５７、ＷＯ ０１／４０３１０、ＷＯ ０１／４４３０１、ＥＰ １１３４２３１及びＷＯ ０２／４８１９３、ＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ ０１／２１８１７、ＷＯ ０３／０３５６９４、ＷＯ ０３／０５４０１６及びＷＯ ０３／０５５５２７、ＷＯ ０３／０５０５３１、ＷＯ ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０、ＷＯ ０４／０４１８６７、ＷＯ ０４／０４１８６２、ＷＯ ０４／０４１８６５、ＷＯ ０４／０４１８６３、ＷＯ ０４／０６２５５１、ＷＯ ０５／０４４８５８、ＷＯ ０６／４０１５３、ＷＯ ０６／０７９３７２、ＷＯ ０６／１２２７８６、ＷＯ ０６／１２２７８７、ＷＯ ０６／１２２８２５及びこれらの出願に言及されているその他の従来技術。

【0038】

本明細書において、「多重特異性」という用語は、抗体又はその抗原結合断片が、例えば、異なる抗原又は同一の抗原における少なくとも二つの異なるエピトープに結合する能力を指す。そのため、「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」のような用語は、抗体が結合できる異なるエピトープの数を指す。例えば、一般的な単一特異性ＩｇＧ型抗体は、二つの同じ抗原結合部位（相補的部位）を有するため、（異なるエピトープに結合するのではなく）同じエピトープのみに結合することができる。これに対して、多重特異性抗体は、少なくとも二つの異なるタイプの相補的部位／結合部位を有するため、少なくとも二つの異なるエピトープに結合することができる。本明細書で説明したように、「相補性決定領域」は、抗体の抗原結合部位を指す。また、単一「特異性」は、単一抗体における１つ、２つ、３つ又は３つ以上の同じ相補性決定領域を指すことができる（一つの単一抗体分子における相補性決定領域／結合部位の実際の数は「価」と呼ばれる）。例えば、単一の天然ＩｇＧ抗体は、二つの同じ相補的部位を有するため、単一特異的であり、二価である。これに応じて、多重特異性抗体は、少なくとも２つの（異なる）相補性決定領域／結合部位を含む。そのため、「多重特異性抗体」という用語は、一つ超えの相補的部位を有し、２つ又はそれ以上の異なるエピトープに結合する能力を有する抗体を指す。「多重特異性抗体」という用語は、以上で定義されたような二重特異性抗体を特に含むが、通常、タンパク質、例えば、３つ又はそれ以上の異なるエピトープに特に結合する抗体、足場、即ち３つ又はそれ以上の相補的部位／結合部位を有する抗体をさらに含む。

【0039】

本明細書において、「価」という用語は、抗体／抗原結合分子における所定の数の結合部位の存在を示す。そのため、「一価」、「二価」、「四価」及び「六価」という用語は、それぞれ抗体／抗原結合分子における１つの結合部位、２つの結合部位、４つの結合部位及び６つの結合部位の存在を示す。

【0040】

本明細書において、「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書において、同義的に使用され、天然抗体の構造と実質的に似ている構造を有することを指す。

【0041】

本明細書において、「抗原結合断片」及び「抗体断片」という用語は、本明細書において、同義的に使用され、それは、全抗体の全ての構造を有さず、全抗体の局所又は局所的変異体のみを含み、前記局所又は局所的変異体は抗原に結合する能力を有する。例示的に、本明細書において、「抗原結合断片」又は「抗体断片」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）及び単一ドメイン抗体を含むが、それらに限らない。

【0042】

本明細書において、「キメラ抗体」という用語は、一つの供給源生物（例えば、ラット、マウス、ウサギ又はアルパカ）に由来する免疫グロブリンの可変配列、及び異なる生体（例えば、ヒト）に由来する免疫グロブリンの定常領域を有する抗体を指す。キメラ抗体を産生するための方法は、当分野で既知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９（４７１９）：１２０２－７、Ｏｉら，１９８６，Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４－２２１、Ｇｉｌｌｉｅｓら，１９８５ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２を参照されたく、以上は参照により本明細書に組込まれる。

【0043】

本明細書において、「ヒト化抗体」という用語は、遺伝子操作された非ヒト抗体を指し、そのアミノ酸配列が、ヒト抗体の配列との相同性を向上させるように修飾される。通常、ヒト化抗体の全て又は一部のＣＤＲ領域は、非ヒト抗体（ドナー抗体）に由来し、全て又は一部の非ＣＤＲ領域（例えば、可変領域ＦＲ及び／又は定常領域）は、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）に由来する。ヒト化抗体は、通常、ドナー抗体の所望の特性を保持するか又は部分的に保持し、抗原特異性、親和性、反応性、免疫細胞の活性を向上させる能力又は免疫応答を増強する能力などを含むがそれらに限らない。

【0044】

本明細書において、「完全ヒト抗体」は、ＦＲ及びＣＤＲの両方がいずれもヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を指す。また、抗体が定常領域を含む場合、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本明細書において、完全ヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダムもしくは部位特異的誘発又はインビボの体細胞突然変異によって導入された突然変異）を含んでもよい。しかしながら、本明細書において、「完全ヒト抗体」は、別の哺乳動物の類種（例えば、マウス）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含まない。

【0045】

本明細書において、「可変領域」は、抗体の重鎖又は軽鎖において、抗体を抗原に結合させることに関与する領域を指し、「重鎖可変領域」は、「ＶＨ」、「ＨＣＶＲ」と同義的に使用され、「軽鎖可変領域」は、「ＶＬ」、「ＬＣＶＲ」と同義的に使用される。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、一般的には、似ている構造を有し、各ドメインは、四つの保存的フレームワーク領域（ＦＲ）及び三つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐ．９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分である。

【0046】

本明細書において、「相補性決定領域」は、「ＣＤＲ」と同義的に使用され、通常、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメインに見られる超可変領域（ＨＶＲ）を指す。可変ドメインのより保存的な部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。当分野で理解されているように、抗体の超可変領域を表すアミノ酸位置は、文脈及び当分野に既知の様々な定義に応じて変化することができる。可変ドメイン内のいくつかの位置は、一組の規格（例えば、ＩＭＧＴ又はＫＡＢＡＴ）下の超可変領域内にあると考えられる一方、異なる組の規格（例えば、ＫＡＢＡＴ又はＩＭＧＴ）下の超可変領域外にあると考えられてもよいため、ヘテロ接合超可変位置と見なされてもよい。これらの位置のうちの一つ又はそれ以上は、拡張した超可変領域に見出すこともできる。本発明は、これらのヘテロ接合超可変位置に修飾が含まれる抗体を含む。重鎖可変領域ＣＤＲはＨＣＤＲと略されてもよく、軽鎖可変領域はＬＣＤＲと略されてもよい。天然重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主にシート構造を用いる４つのフレームワーク領域を含み、それらは、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を介して連結され、この３つＣＤＲは、シート構造を連結するループを形成し、且ついくつかの場合にシート構造の一部を形成する。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域を介してＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４の順序で緊密に保持され、且つ他の抗体鎖からのＣＤＲと抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．１９８７を参照されたく、それは参照により本明細書に組込まれる）。

【0047】

ＣＤＲに対するさらなる記述は、Ｋａｂａｔら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５２：６６０９－６６１６（１９７７）、Ｋａｂａｔら，米国保健福祉省，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９９１）、Ｃｈｏｔｈｉａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）、Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ Ｂ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７－９４８（１９９７）、ＭａｃＣａｌｌｕｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）、ＡｂｈｉｎａｎｄａｎとＭａｒｔｉｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４５：３８３２－３８３９（２００８）、Ｌｅｆｒａｎｃ Ｍ．Ｐ．ら，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５５－７７（２００３）、及びＨｏｎｅｇｇｅｒとＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３０９：６５７－６７０（２００１）を参照されたい。本明細書において、「ＣＤＲ」は、当分野に周知の方式でラベル付けされ定義されてもよく、Ｋａｂａｔ番号付けシステム、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステム又はＩＭＧＴ番号付けシステムを含むが、それらに限らず、使用されるツールサイトは、ＡｂＲＳＡウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｃａｏ．ｌａｂｓｈａｒｅ．ｃｎ／ＡｂＲＳＡ／ｃｄｒｓ．ｐｈｐ）、ａｂＹｓｉｓウェブサイト（ｗｗｗ．ａｂｙｓｉｓ．ｏｒｇ／ａｂｙｓｉｓ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ｉｎｐｕｔ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ／ｋｅｙ＿ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．ｃｇｉ）及びＩＭＧＴウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ＤＢ／ｃｇｉ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ．ｃｇｉ＃ｒｅｓｕｌｔｓ）を含むが、それらに限らない。本明細書において、ＣＤＲは、異なる定義方式のアミノ酸残基のオーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）及びサブセットを含む。

【0048】

本明細書において、「Ｋａｂａｔ番号付けシステム」という用語は、通常、Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔにより提案された免疫グロブリンアラインメント及び番号付けシステムを指す（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１を参照されたい）。

【0049】

本明細書において、「Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステム」という用語は、通常、Ｃｈｏｔｈｉａらにより提案された免疫グロブリン番号付けシステムを指し、それは、構造のループ領域の位置に基づいてＣＤＲ領域の境界を同定する古典的な規則である（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７、Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３を参照されたい）。

【0050】

本明細書において、「ＩＭＧＴ番号付けシステム」という用語は、通常、Ｌｅｆｒａｎｃらにより提唱された国際免疫遺伝学情報システム（Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ））に基づく番号付けシステムを指し、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐａｒａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５－７７，２００３を参照されたい。

【0051】

本明細書において、「重鎖定常領域」は、抗体重鎖のカルボキシル末端部分を指し、それは、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用のようなエフェクター子機能を表し、抗体の可変ドメインに対してより保存的なアミノ酸配列を有する。「重鎖定常領域」は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はその変異体もしくは断片から選択される。「重鎖定常領域」は、「完全長重鎖定常領域」と「重鎖定常領域断片」とを含み、前者は天然抗体の定常領域と実質的に似ている構造を有する一方、後者は「完全長重鎖定常領域の一部」のみを含む。例示的に、典型的な「完全長抗体重鎖定常領域」は、ＣＨ１ドメイン－ヒンジ領域－ＣＨ２ドメイン－ＣＨ３ドメインからなり、抗体がＩｇＥである場合、それはＣＨ４ドメインをさらに含み、抗体が重鎖抗体である場合、それはＣＨ１ドメインを含まない。例示的に、典型的な「重鎖定常領域断片」は、Ｆｃ又はＣＨ３ドメインから選択される。

【0052】

本明細書において、「軽鎖定常領域」という用語は、抗体軽鎖のカルボキシル末端部分を指し、それは、抗体と抗原との結合に直接関与せず、前記軽鎖定常領域は、定常κドメイン又は定常λドメインから選択される。

【0053】

本明細書において、「Ｆｃ領域」という用語は、抗体重鎖における、定常領域の少なくとも一部を含有するＣ末端領域を定義するためのものである。該用語は、天然配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。例示的に、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に延びることができる。しかしながら、宿主細胞により産生された抗体は、翻訳後切断を受け、重鎖のＣ末端から一つ又は複数、特に一つ又は二つのアミノ酸を切除することができる。そのため、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞により産生された抗体は、完全長重鎖を含んでもよく、又は完全長重鎖の切断変異体を含んでもよい。重鎖の最後の２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスに従って番号付けされている）である場合に当てはまり得る。そのため、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）は存在しても存在しなくてもよい。典型的に、ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含み、任意選択的に、これに加えて、完全な又は一部のヒンジ領域をさらに含んでもよいが、ＣＨ１ドメインを含まない。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、約位置２３１におけるアミノ酸残基から約位置３４０におけるアミノ酸残基まで延びる。一実施形態において、炭水化物鎖はＣＨ２ドメインに付着している。本明細書におけるＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域における、ＣＨ２ドメインのＣ末端にある残基（即ちＩｇＧの約位置３４１にあるアミノ酸残基から約位置４４７にあるアミノ酸残基まで）を含む。本明細書におけるＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異体ＣＨ３ドメイン（例えば、その一本の鎖に導入された「隆起」「節」、（ｋｎｏｂ）、及び別の鎖に対応して導入された「キャビティ」「ホール」、（ｈｏｌｅ）を有するＣＨ３ドメインであり、米国特許Ｎｏ．５，８２１，３３３を参照されたく、参照により本明細書に明示的に援用される）であってもよい。本明細書で説明されるように、このような変異体ＣＨ３ドメインは、二本の異なる抗体重鎖のヘテロ二量化を促進することに用いられてもよい。

【0054】

本明細書において特に規定されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５^ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに基づいて行われる。

【0055】

本明細書において、「Ｆｃ変異体」という用語は、Ｆｃにおける適切な部位に一つ又は複数のアミノ酸置換、挿入又は欠失突然変異が存在することによってＦｃ構造又は機能の変化を引き起こすことを指す。「Ｆｃ変異体の間の相互作用」は、突然変異によって設計されたＦｃ変異体の間に、空間充填効果、静電誘導、水素結合作用、疎水性相互作用が形成され得ることを指す。Ｆｃ変異体の間の相互作用は、安定した異種二量体タンパク質の形成に役立つ。好ましい突然変異は設計、「Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ」の形態の突然変異設計である。

【0056】

Ｆｃ変異体の突然変異設計技術は、当分野において、二重特異性抗体又は異種二量体のＦｃ融合タンパク質形態の製造に広く応用されている。代表的なものとして、Ｃａｔｅｒら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｏｌ．９ ｎｏ．７ ｐｐ ．６１７－６２１，１９９６）が提案した「Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ」形態；Ａｍｇｅｎ社の技術者が静電誘導（Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ Ｓｔｅｅｒｉｎｇ）を利用して形成したＦｃ含有異種二量体形態（ＵＳ ２０１００２８６３７４ Ａ１）、Ｊｏｎａｔｈａｎ Ｈ．Ｄａｖｉｓら（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｐ．１－８，２０１０）が提案した、ＩｇＧ／Ｉｇ鎖交換によって形成された異種二量体形態（ＳＥＥＤｂｏｄｉｅｓ）、Ｇｅｎｍａｂ社ＤｕｏＢｏｄｙ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７．３１７（５８４４））プラットフォーム技術によって形成された二重特異性分子、Ｘｅｎｃｏｒ社の技術者により、構造計算及びＦｃアミノ酸突然変異を統合し、異なる作用方式を統合して形成された異種二量体タンパク質形態（ｍＡｂｓ ３：６，５４６－５５７；Ｎｏｖｅｍｂｅｒ／Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１１）、蘇州康寧傑瑞社により、電荷ネットワークに基づくＦｃ改造方法（ＣＮ２０１１１０４５９１００．７）で得られた異種二量体タンパク質形態、及びＦｃアミノ酸変化又は機能改造手段に基づいて、異種二量体機能性タンパク質の形成を達成する他の遺伝子操作方法が挙げられる。本発明に記載のＦｃ変異体断片におけるＫｎｏｂ／Ｈｏｌｅ構造は、二本のＦｃ断片がそれぞれ突然変異し、突然変異した後に「Ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅ」の形態で結合し得ることを指す。得られた第１のＦｃ変異体及び第２のＦｃ変異体が「ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ」の形態で一緒に結合して異種二量体を形成することができるように、Ｃａｔｅｒらの「ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ」モデルを用いてＦｃ領域において部位突然変異の改造を行うことが好ましい。特定の免疫グロブリンクラス及びサブクラスから特定の免疫グロブリンＦｃ領域を選択することは、当業者が把握している範囲内である。好ましくは、ヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のＦｃ領域であり、さらに好ましくは、ヒト抗体ＩｇＧ１のＦｃ領域である。第１のＦｃ変異体又は第２のＦｃ変異体からランダムで任意に選択し、そのうちの一方がｋｎｏｂの突然変異を行い、他方がｈｏｌｅの突然変異を行う。

【0057】

本明細書において、「保存的アミノ酸」という用語は、通常、同一のクラスに属するか又は類似している特徴（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性、親水性、主鎖のコンホメーション及び剛性）を有するアミノ酸を指す。例示的に、下記各群のアミノ酸は、互いの保存的アミノ酸残基に属し、群内のアミノ酸残基の置換は保存的アミノ酸の置換に属する：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、及び
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。

【0058】

本明細書において、「同一性」は以下の方式によって計算して得られる：二つのアミノ酸配列又は二つの核酸配列の「同一性」の割合を確定するために、最適な比較を目的として前記配列をアラインメントする（例えば、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸配列又は核酸配列の一方又は両方にギャップを導入するか又は比較するために非相同配列を棄却してもよい）。その後に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列中の対応する位置における同じアミノ酸残基又はヌクレオチドに占められている場合、前記分子はこの位置において同じである。この二つの配列を最適にアラインメントするために導入する必要があるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮して、二つの配列の間の同一性の割合は、前記配列に共通する同じ位置の変化に従って変化する。

【0059】

二つの配列の間の配列比較及び同一性割合の計算は、数学的アルゴリズムを利用して実現され得る。例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａ及びＷｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３）アルゴリズム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックス並びにギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６又は４及び長さ重み１、２、３、４、５又は６を使用して、二つのアミノ酸配列の間の同一性割合を確定する。さらに例えば、ＧＣＧソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰプログラム（ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍから入手可能）、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス並びにギャップ重み４０、５０、６０、７０又は８０及び長さ重み１、２、３、４、５又は６を使用して、二つのヌクレオチド配列の間の同一性割合を確定する。特に好ましいパラメータセット（及び別段の説明がない限り使用されるべきパラメータセット）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ延長ペナルティ４、フレームシフトギャップペナルティ５を用いるＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアマトリックスである。さらに、ＰＡＭ１２０重み付け余数表、ギャップ長さペナルティ１２、ギャップペナルティ４を用い、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒアルゴリズム（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７）を利用して、二つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列の間の同一性割合を確定することができる。

【0060】

追加的に又は代替的に、本発明に記載の核酸配列及びタンパク質配列は、共通データベースに対して検索を実施して、例えば、他のファミリーメンバー配列又は関連する配列を同定するために、「照会配列」としてさらに使用されてもよい。例えば、このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）により実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子と同じヌクレオチド配列を得るために、スコア＝１００、ワード長さ＝１２であるＮＢＬＡＳＴプログラムで実施してもよい。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子と同じアミノ酸配列を得るために、スコア＝５０、ワード長さ＝３であるＸＢＬＡＳＴプログラムで実施してもよい。比較目的のためにギャップありアライメントを得るために、ギャップＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載のように使用してもよい。ＢＬＡＳＴ及びギャップＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、対応するプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照されたい。

【0061】

本明細書において、「核酸」という用語は、ヌクレオチドを含むポリマーの任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基、特にプリン又はピリミジン塩基（即ちシトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（即ちデオキシリボース又はリーボス）及びリン酸基からなる。通常、核酸分子は、塩基の配列により説明され、これにより前記塩基は、核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、通常、５’～３’で表される。本明細書において、核酸分子という用語は、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）とゲノムＤＮＡとを含むデオキシリボース核酸（ＤＮＡ）、リーボス核酸（ＲＮＡ）、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及び二つ又はそれ以上のこれらの分子の混合を含むポリマーを包含する。核酸分子は、線状又は環状であってもよい。また、核酸分子という用語は、センス鎖とアンチセンス鎖の両方、及び一本鎖と二本鎖の形態を含む。そして、本文に記載の核酸分子は、天然に存在するか又は非天然に存在するヌクレオチドを含んでもよい。非天然に存在するヌクレオチドの例としては、誘導体化された糖又はリン酸骨格結合又は化学的に修飾された残基を有する、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子をさらに包含し、ベクターとして本発明の抗体をインビトロ及び／又はインビボで、例えば、宿主又は患者において直接発現することに適する。このようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくても又は修飾されていてもよい。例えば、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を増強するようにｍＲＮＡを化学的に修飾してもよく、それによってｍＲＮＡを被験体に注入して体内で抗体を産生することができる（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ ２０１７年６月１２日，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６又はＥＰ２１０１８２３Ｂ１を参照されたい）。

【0062】

本明細書において、「単離された」核酸は、その天然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、下記細胞に含有される核酸分子を含み、前記細胞は、通常、該核酸分子を含有するが、該核酸分子は、染色体外に存在するか又はその天然染色体位置と異なる染色体位置に存在する。

【0063】

本明細書において、「ベクター」という用語は、それに連結される別の核酸を増幅させることができる核酸分子を指す。該用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及び該ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに統合されるベクターを含む。いくつかのベクターは、それらに操作可能に連結される核酸の発現を指導することができる。このようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。

【0064】

本明細書において、「宿主細胞」は、細胞に外因性核酸が導入された細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それは、継代数を考慮せず、初代の形質転換された細胞及びそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸物質について親細胞と完全に同じではない場合があり、突然変異を含んでもよい。本明細書において、初期に形質転換された細胞からスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫を含む。

【0065】

本明細書において、「薬物組成物」は、それに含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを許容する形態で存在し、且つ前記薬物組成物が投与される被験体に対して許容されない毒性を有する他の成分を含有しない製剤を指す。

【0066】

本明細書において、「薬学的に許容されるキャリア」は、任意及び全ての溶媒、分散媒、コーティング材料、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗菌剤及び抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物安定剤、粘着剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香料、染料など及びそれらの組み合わせを含み、それは当業者に知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，ＭａｃｋＰｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ページ１２８９－１３２９を参照されたい）。活性成分と適合性がない場合を除いて、治療又は薬物組成物におけるいずれかの従来のキャリアの応用は考慮される。

【0067】

本明細書において、「治療」は、外科手術又は薬物処置（ｓｕｒｇｉｃａｌ ｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を指し、その目的は、治療対象における望ましくない生理的変化又は病変、例えば、癌及び腫瘍を予防、減速（減少）させることである。有益な又は望ましい臨床結果は、検出可能であるか検出不可能であるかを問わず、症状の軽減、疾患程度の低下、疾患状態の安定化（即ち、悪化していない）、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分的寛解又は完全な寛解を問わず）を含むが、それらに限らない。治療を必要とする対象は、障害又は疾患に罹患している対象、及び障害又は疾患に罹患しやすい対象、又は障害又は疾患を予防しようとする対象を含む。減速、軽減、低下、緩和、寛解などの用語が言及されている場合、その意味には、除去、消失、発生しないなどの場合も含まれている。

【0068】

本明細書において、「被験体」という用語は、本明細書に記載の特定の疾患又は障害に対する治療を受ける生体を指す。例示的に、「被験体」は、疾患又は障害の治療を受ける哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類動物（例えば、サル）又は霊長類哺乳動物を含む。

【0069】

本明細書において、「有効量」という用語は、細胞、組織又は対象に単独で又は別の治療剤と組み合わせて投与された場合、疾患障害又は該疾患の進行を有効に防止又は寛解することができる治療剤用量を指す。「有効量」はさらに、症状を寛解し、例えば、関連する医学的障害を治療、治癒、防止もしくは寛解するか、又はこれらの障害を治療、治癒、防止もしくは寛解する速度を増加させるのに十分な化合物の用量を指す。活性成分を個体に単独で投与する場合、治療有効用量は該成分のみを指す。ある組み合わせを適用する場合、治療有効用量は、組み合わせ、連続投与又は同時投与のいずれであっても、治療効果を導く活性成分の組み合わせ用量を指す。

【0070】

本明細書において、「癌」という用語は、哺乳動物で典型的に、無秩序な細胞成長を特徴とする生理的状態を指すか又は説明する。この定義には、良性及び悪性の癌が含まれる。本明細書において、「腫瘍」又は「腫」は、悪性又は良性を問わず、全ての腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）細胞成長及び増殖、並びに全ての前がん（ｐｒｅ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）及び癌性細胞及び組織を指す。「癌」及び「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、互いに排他的というわけではない。

【0071】

本明細書において、「ＥＣ５０」という用語は、半最大有効濃度を指し、それは、特定の曝露時間後にベースラインと最大値との間の途中応答を誘導する抗体濃度を含む。ＥＣ５０は、本質的に、その最大作用が観察される抗体濃度の５０％を表し、当分野に既知の方法によって測定することができる。

【発明を実施するための形態】

【0072】

本出願は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片、多重特異性抗原結合分子、キメラ抗原受容体、免疫エフェクター細胞、核酸断片、ベクター、宿主細胞、医薬組成物、キット、製造方法及び疾患の治療及びＢＣＭＡの検出におけるその応用を提供する。

【0073】

第１の態様では、本出願は、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供し、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインのＨＣＤＲ１を含み、前記ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインのＨＣＤＲ２を含み、且つ前記ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインのＨＣＤＲ３を含む。

【0074】

いくつかの具体的な実施形態において、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに基づいて確定される。

【0075】

任意選択的な実施形態において、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４～９１及び１０２～１５７に示すアミノ酸配列から選択される。

【0076】

任意選択的な実施形態において、前記ＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３７、４０、４２、４５、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６４、６７、７１、７４、７７、８１、８４、８６、８７、１０４、１０７、１１３、１１６、１１９、１２１、１２４、１２７、１３１、１３４、１３８又は１４１に示すアミノ酸配列を含む。

【0077】

任意選択的な実施形態において、前記ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、３８、４１、４３、４６、４９、５９、６１、６３、６５、６８、７０、７２、７５、７８、７９、８２、８５、８８、８９、９０、９１、１０２、１０５、１０８、１０９、１１１、１１４、１１７、１２０、１２２、１２５、１２８、１２９、１３２、１３５、１３６、１３９、１４２、１４３、１４８、１５０、１５２、１５３、１５５又は１５７に示すアミノ酸配列を含む。

【0078】

任意選択的な実施形態において、前記ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３９、４４、４７、５１、５３、５５、５７、６０、６２、６６、６９、７３、７６、８０、８３、１０３、１０６、１１０、１１２、１１５、１１８、１２３、１２６、１３０、１３３、１３７、１４０、１４４、１４５、１４６、１４７、１４９、１５１、１５４又は１５６に示すアミノ酸配列を含む。

【0079】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３５及び３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８及び３９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１及び３６に示すアミノ酸配列を含む。

【0080】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４３及び４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６及び４７、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、４９及び４４に示すアミノ酸配列を含む。

【0081】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、３５及び５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、３８及び５３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、４１及び５１に示すアミノ酸配列を含む。

【0082】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３５及び５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、３８及び５７、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、４１及び５５に示すアミノ酸配列を含む。

【0083】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、５９及び６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、６１及び６２、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、６３及び６０に示すアミノ酸配列を含む。

【0084】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、６５及び６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、６８及び６９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、７０及び６６に示すアミノ酸配列を含む。

【0085】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、７２及び７３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、７５及び７６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、７８及び７３に示すアミノ酸配列を含む。

【0086】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、７９及び８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、８２及び８３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、８５及び８０に示すアミノ酸配列を含む。

【0087】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６、３５及び３６に示すアミノ酸配列を含む。

【0088】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、８８及び４４に示すアミノ酸配列を含む。

【0089】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、８８及び４４に示すアミノ酸配列を含む。

【0090】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、８９及び４４に示すアミノ酸配列を含む。

【0091】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、９０及び４４に示すアミノ酸配列を含む。

【0092】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、９１及び４４に示すアミノ酸配列を含む。

【0093】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、１０２及び１０３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、１０５及び１０６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、１０８及び１０３に示すアミノ酸配列を含む。

【0094】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、１０９及び１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、１１１及び１１２、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、１０８及び１１０に示すアミノ酸配列を含む。

【0095】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１１４及び１１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６、１１７及び１１８、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９、１２０及び１１５に示すアミノ酸配列を含む。

【0096】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１、１２２及び１２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４、１２５及び１２６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７、１２８及び１２３に示すアミノ酸配列を含む。

【0097】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１２９及び１３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１、１３２及び１３３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４、１３５及び１３０に示すアミノ酸配列を含む。

【0098】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１３６及び１３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、１３９及び１４０、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１、１４２及び１３７に示すアミノ酸配列を含む。

【0099】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、１４３及び１４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８及び１４５、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１及び１４４に示すアミノ酸配列を含む。

【0100】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、１４３及び１４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、３８及び１４７、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、４１及び１４６に示すアミノ酸配列を含む。

【0101】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、１４８及び１４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、１５０及び１５１、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、１５２及び１４９に示すアミノ酸配列を含む。

【0102】

好ましい実施形態において、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムによれば、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、１５３及び１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、１５５及び１５６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、１５７及び１５４に示すアミノ酸配列を含む。

【0103】

いくつかの具体的な実施形態において、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３は、前述ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３に１個、２個又は３個の突然変異が発生するアミノ酸配列を含み、前記突然変異は、挿入、欠失及び／又は置換から選択され、前記置換は、好ましくは、保存的アミノ酸の置換である。

【0104】

いくつかの具体的な実施形態において、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３は、前述ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３に比べて少なくとも８０、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0105】

いくつかの具体的な実施形態において、前記抗体又はその抗原結合断片は、前述ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体を含む。

【0106】

いくつかの具体的な実施形態において、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１から選択されるいずれか一つの配列に示すアミノ酸配列を含む。

【0107】

任意選択的な実施形態において、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示す配列に比べて多くとも２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個の突然変異が発生するアミノ酸配列を含み、前記突然変異は、挿入、欠失及び／又は置換から選択され、前記置換は、好ましくは、保存的アミノ酸の置換である。

【0108】

任意選択的な実施形態において、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示す配列に比べて少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0109】

いくつかの具体的な実施形態において、前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインにおけるＦＲ領域を含む。

【0110】

任意選択的な実施形態において、前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインにおけるＦＲ領域に比べて多くとも１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個の突然変異が発生するアミノ酸配列を含み、前記突然変異は、挿入、欠失及び／又は置換から選択され、前記置換は、好ましくは、保存的アミノ酸の置換であり、

【0111】

任意選択的な実施形態において、前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインにおけるＦＲ領域に比べて少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0112】

いくつかの具体的な実施形態において、前記抗体又はその抗原結合断片は、（１）キメラ抗体又はその断片、（２）ヒト化抗体又はその断片、又は（３）完全ヒト抗体又はその断片から選択される。

【0113】

いくつかの具体的な実施形態において、前記抗体又はその抗原結合断片は、抗体重鎖定常領域を含むか又は含まず、任意選択的に、前記抗体重鎖定常領域は、ヒト、アルパカ、マウス、ラット、ウサギ及びヒツジから選択され、任意選択的に、前記抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤから選択され、任意選択的に、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択され、任意選択的に、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ領域、ＣＨ３領域及び完全な重鎖定常領域から選択され、好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトＦｃ領域であり、好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は重鎖抗体である。

【0114】

いくつかの具体的な実施形態において、前記抗体又はその抗原結合断片にはさらに、治療剤又はトレーサーがカップリングされており、好ましくは、前記治療剤は、放射性同位体、化学療法薬又は免疫調節剤から選択され、前記トレーサーは、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤及び光増感剤から選択される。

【0115】

いくつかの具体的な実施形態において、前記抗体又はその抗原結合断片にはさらに、他の機能性分子が連結されており、好ましくは、前記他の機能性分子は、シグナルペプチド、タンパク質タグ、サイトカイン、血管新生阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤のうちの一つ又は複数から選択される。

【0116】

第２の態様では、本出願は、多重特異性抗原結合分子をさらに提供し、前記多重特異性抗原結合分子は、前述の抗体又はその抗原結合断片、及びＢＣＭＡ以外の他の抗原に結合する抗原結合分子、又は前述抗体又はその抗原結合断片とは異なるＢＣＭＡエピトープに結合するものを含み、任意選択的に、前記ＢＣＭＡ以外の他の抗原は、ＣＤ３（好ましくは、ＣＤ３εである）、ＣＤ１６、ＣＤ１３７、ＣＤ２５８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、４－１ＢＢ、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ－１Ｒ、ホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、ＰＳ）、Ｃ－Ｍｅｔ、ＨＳＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＭＳＬＮ、血液脳関門受容体、ＧＰＣ３、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＧＤ２、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＦＲα及びＧｕｃｙ２Ｃから選択される。

【0117】

好ましい実施形態において、前記抗原結合分子は、抗体又はその抗原結合断片である。

【0118】

好ましい実施形態において、前記多重特異性抗原結合分子は、二重特異性、三重特異性又は四重特異性であってもよい。

【0119】

好ましい実施形態において、前記多重特異性抗原結合分子は、２価、３価、４価、５価又は６価であってもよい。

【0120】

第３の態様では、本出願は、単離された核酸断片をさらに提供し、前記核酸断片は、前述抗体もしくはその抗原結合断片又は多重特異性抗原結合分子をコードする。

【0121】

第４の態様では、本出願は、ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）をさらに提供し、前記ベクターは前述核酸断片を含む。

【0122】

第５の態様では、本出願は、宿主細胞をさらに提供し、前記宿主細胞は前述のベクターを含み、好ましくは、前記細胞は、原核細胞又は真核細胞、例えば、細菌（例えば、大腸菌）、真菌（例えば、酵母）、昆虫細胞又は哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株又は２９３Ｔ細胞株）である。

【0123】

第６の態様では、本出願は、前述抗体もしくはその抗原結合断片又は多重特異性抗原結合分子を製造する方法をさらに提供し、前記方法は、前述細胞を培養することと、前記細胞により発現される抗体、抗原結合断片又は多重特異性抗原結合分子を単離することとを含む。

【0124】

第７の態様では、本出願は、医薬組成物をさらに提供し、前記医薬組成物は、前述の抗体もしくはその抗原結合断片、多重特異性抗原結合分子、核酸断片、ベクター又は前述方法に従って製造された生成物を含み、任意選択的に、前記薬物組成物は、薬学的に許容されるキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）、希釈剤又は助剤をさらに含み、任意選択的に、前記薬物組成物は、追加の抗腫瘍剤をさらに含む。

【0125】

いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容可能なキャリアは、免疫細胞の生存性及び機能を低下させず、抗体又はその抗原結合断片と抗原との特異的結合に影響を及ぼしないキャリアであり、細胞培地、緩衝液、生理食塩水及び平衡塩溶液などを含むが、それらに限らない。緩衝液の例としては、等張性リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩等が挙げられる。具体的な実施形態において、前記薬学的に許容可能なキャリアは、１％血清を含有するリン酸塩緩衝液である。

【0126】

前記抗腫瘍剤は、例えば、様々な化学療法薬、例えば、シクロホスファミド、イソシクロホスファミド、メルファラン、カルムスチン、ロムスチン、ニムスチン、フォテムスチンなどを含むが、それらに限らないアルキル化剤化学療法薬、メトトレキサート、フルオロウラシル、テガフール、カルモフール、フルオロデオキシウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン、ラルチトレキセドなどを含むが、それらに限らない代謝拮抗性化学療法薬、アクチノマイシンＤ、マイトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ピランドキソルビシンなどを含むが、それらに限らない抗癌性抗生物質、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、イリノテカン、トポテカン、パクリタキセル、ドセタキセルなどを含むが、それらに限らない植物系化学療法薬、ダカルバジン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチンなどを含むが、それらに限らない雑類である。

【0127】

第８の態様では、本出願は、腫瘍又は癌を治療する方法をさらに提供し、前記方法は、有効量の前述的抗体もしくはその抗原結合断片、多重特異性抗原結合分子、核酸断片、ベクター、前述方法に従って製造された生成物又は前述医薬組成物を被験者に投与することを含み、任意選択的に、前記腫瘍又は癌は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍又は癌であり、好ましくは、Ｂ細胞リンパ腫であり、より好ましくは、多発性骨髄腫（ＭＭ）である。

【0128】

第９の態様では、本出願は、前述抗体もしくはその抗原結合断片、多重特異性抗原結合分子、核酸断片、ベクター、前述方法に従って製造された生成物又は医薬組成物の、腫瘍又は前述癌を治療する医薬品の製造における使用をさらに提供し、任意選択的に、前記腫瘍又は癌は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍又は癌であり、好ましくは、Ｂ細胞リンパ腫であり、より好ましくは、多発性骨髄腫（ＭＭ）である。

【0129】

第１０の態様では、本出願は、前述抗体もしくはその抗原結合断片、多重特異性抗原結合分子、核酸断片、ベクター、前述方法に従って製造された生成物又は前述医薬組成物の、腫瘍又は癌を治療するための使用をさらに提供し、任意選択的に、前記腫瘍又は癌は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍又は癌であり、好ましくは、Ｂ細胞リンパ腫であり、より好ましくは、多発性骨髄腫（ＭＭ）である。

【0130】

第１１の態様では、本出願はキットをさらに提供し、前記キットは、前述の抗体もしくはその抗原結合断片、多重特異性抗原結合分子、核酸断片、ベクター、前述方法に従って製造された生成物又は前述医薬組成物を含む。

【0131】

第１２の態様では、本出願は、生物学的試料におけるＢＣＭＡ発現を検出する方法をさらに提供し、前記方法は、前述の抗体又はその抗原結合断片とＢＣＭＡとの間で複合体を形成し得る条件下で、前記生物学的試料を前記の抗体又はその抗原結合断片と接触させることを含み、好ましくは、前記方法は、前記複合体の形成を検出し、試料におけるＢＣＭＡの存在又は発現レベルを指示することをさらに含む。

【0132】

第１３の態様では、本出願は、前述抗体又はその抗原結合断片の、ＢＣＭＡ検出試薬の製造における使用をさらに提供する。

【0133】

実施例
以下では、具体的な実施例を参照しながら本出願をさらに説明し、本出願の利点及び特徴は説明により明らかになるであろう。実施例に具体的な条件が明記されていない場合、従来の条件又はメーカーが提案した条件に従って実施する。使用される試薬又は機器はメーカーが明記されていない場合、いずれも市販で購入することができる一般的な製品である。

【0134】

本明細書の実施例は、例示に過ぎず、本出願の範囲を制限するものではない。当業者であれば、本出願の精神及び範囲を逸脱することなく本出願の技術案の詳細及び形態に対して修正又は置換を行うことができるが、これらの修正及び置換がいずれも本出願の保護範囲内に含まれることを理解するであろう。

【0135】

実施例１ 対照抗体の製造、内因性細胞の同定及び過剰発現細胞株の製造
（Ａ）対照抗体の製造
ＲＥＧＮ５４５９及びＨＰＮ２１７は、いずれもヒトＢＣＭＡタンパク質を認識する抗体であり、ここで、ＲＥＧＮ５４５９配列は、米国特許公開第ＵＳ２０２０／００２４３５６Ａ１号に由来し、ＨＰＮ２１７配列は、米国特許公開第ＵＳ２０１９０１１２３８１Ａ１号に由来する。ＲＥＧＮ５４５９の重鎖可変領域（ＶＨ）をシグナルペプチドとヒト由来抗体ＩｇＧ１重鎖定常領域とを含む発現ベクターに組換え、軽鎖可変領域（ＶＬ）配列をシグナルペプチドとヒト由来抗体ＩｇＧ１軽鎖定常領域とを含む発現ベクターに組換えして、組換えプラスミドを得て、合成された抗体をＲＥＧＮ５４５９－ｈＩｇＧ１と命名した。ＨＰＮ２１７のＶＨＨ配列をシグナルペプチドとヒト由来抗体ＩｇＧ１ Ｆｃとを含む発現ベクターに組換えして、組換えプラスミドを得て、合成された抗体をＨＰＮ２１７－ｈＨｃＡｂと命名した。陰性対照抗体ｈＩｇＧ１は、Ｈｅｎ Ｅｇｇ Ｌｙｓｏｚｙｍｅ鶏卵リゾチームに対する抗体ａｎｔｉ－ｈｅｌ－ｈＩｇＧ１（百英から購入、カタログ番号：Ｂ１１７９０１）であり、以下ではｈＩｇＧ１と略称される。

【0136】

【表1】

【0137】

対照抗体とヒトＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏから購入、カタログ番号：ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ）及びサルＢＣＭＡ－Ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏから購入、カタログ番号：ＢＣＡ－Ｃ５２Ｈ７）との結合活性は、ＥＬＩＳＡにより検出された。具体的な方法は以下のとおりである：抗原タンパク質をＰＢＳにより最終濃度１μｇ／ｍＬに希釈し、そして５０μｌ／ウェルで９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加えた。プラスチックフィルムで密封し、４℃で一晩インキュベートし、翌日、ＰＢＳでプレートを２回洗浄し、封入液［ＰＢＳ＋２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ］を加え、室温で２時間ブロッキングした。封入液を捨て、１００ｎＭの勾配希釈された対照抗体又は陰性対照抗体を５０μｌ／ウェルで加えた。３７℃で２時間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識される二次抗体（Ｍｅｒｃｋから購入、カタログ番号：ＡＰ１１３Ｐ）を加え、３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを５回洗浄した。ＴＭＢ基質を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１０分間インキュベートした後、停止液（１．０Ｍ ＨＣｌ）を５０μｌ／ウェルで加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、ＥｎＳｉｇｈｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入）によりＯＤ４５０ｎｍの数値を読み取った。結果は表２、３及び図１Ａ、１Ｂに示すとおりであり、ＲＥＧＮ５４５９－ｈＩｇＧ１抗体は、ヒトＢＣＭＡタンパク質及びサルＢＣＭＡタンパク質の両方に対して良好な結合活性を有し、ＨＰＮ２１７－ｈＨｃＡｂは、ヒトＢＣＭＡタンパク質と良好な結合活性を有するが、サルＢＣＭＡタンパク質と結合しない。

【0138】

【表2】

【0139】

【表3】

【0140】

（Ｂ）ＢＣＭＡタンパク質を内因的に発現する細胞株の同定
Ｈ９２９細胞及びＵ２６６細胞をＴ－７５細胞培養フラスコ中で対数増殖期まで拡大培養し、単細胞懸濁液になるまで細胞をピペッティングした。細胞を計数した後、遠心分離し、細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清）により２×１０^６細胞／ミリリットルまで再懸濁させ、５０μｌ／ウェルで９６ウェルのＦＡＣＳ反応プレートに加え、ＲＥＧＮ５４５９－ｈＩｇＧ１及びＨＰＮ２１７－ｈＨｃＡｂ抗体を一次抗体とし、ＡＰＣで標識されるヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎから購入、カタログ番号：１０９－６０５－０８８）とし、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＴＭ、ＢＤ社から購入）により検出し分析した。結果は、表４並びに図２Ａ及び２Ｂに示すとおりであり、Ｈ９２９細胞及びＵ２６６細胞は、ＲＥＧＮ５４５９－ｈＩｇＧ１及びＨＰＮ２１７－ｈＨｃＡｂ抗体の両方に結合できることが示された。

【0141】

【表4】

【0142】

（Ｃ）ヒトＢＣＭＡタンパク質及びサルＢＣＭＡタンパク質のＦｌｐ－ｉｎＣＨＯ組換え細胞株の製造
ヒトＢＣＭＡ及びサルＢＣＭＡアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列をそれぞれｐｃＤＮＡ５／ＦＲＴベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）にクローニングした。ヒトＢＣＭＡ ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：６０８、サルＢＣＭＡ ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：７１２２１２。Ｆｌｐ－ｉｎＣＨＯ細胞株（中国科学院典型的培養物寄託委員会細胞バンクから購入）をそれぞれトランスフェクトした後（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ３０００ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、カタログ番号：Ｌ３０００－０１５）、６００μｇ／ｍｌ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，カタログ番号：１０６８７０１０）を含有する１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＥｘＣｅｌｌ Ｂｉｏ、カタログ番号：ＦＮＤ５００）含有Ｆ１２Ｋ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号：２１１２７０３０）培地において２週間選択的に培養し、ＲＥＧＮ５４５９－ｈＩｇＧ１及びヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号：１０９６０５０８８）を用いて、フローサイトメータＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入）において検出し、発現量が高く、単一のピーク形状を有する細胞を増幅し、増幅後の細胞をフローサイトメトリー分析法により再検出した。成長が良く、蛍光強度が高く、均一性が高い陽性細胞集団を選択して拡大培養し続け、液体窒素で凍結保存した。表５は、ヒトＢＣＭＡ陽性発現のＦｌｐ－ｉｎＣＨＯ高発現細胞集団及びサルＢＣＭＡ陽性発現のＦｌｐ－ｉｎＣＨＯ高発現細胞集団がそれぞれ製造されたことを示した。図３及び図４において、横座標は、細胞蛍光強度であり、縦座標は細胞数である。

【0143】

【表5】

【0144】

実施例２ ＢＣＭＡに対するアルパカナノ抗体の製造
（Ａ）動物免疫及び血清力価の測定
免疫動物は、アルパカ１匹（Ａｌｐａｃａ、番号ＮＢ２５４）であり、免疫前に予め１０ｍＬ採血して陰性対照とし、初回免疫では、０．５ｍｇのヒトＢＣＭＡ（Ｍｅｔ１－Ａｌａ５４）－ｈＦｃタンパク質（Ａｃｒｏから購入、カタログ番号：ＢＣ７－Ｈ５２５４）とフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）１ｍＬを均一に混合した後に皮下注射し、２１日目に２回目の免疫を行い、０．２５ｍｇのヒトＢＣＭＡ－ｈＦｃタンパク質とフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）１ｍＬを均一に混合した後に皮下注射し、４２日目に３回目の免疫を行い、ヒトＢＣＭＡ－ｈＦｃタンパク質及びカニクイザルＢＣＭＡ（Ｍｅｔ１－Ａｌａ５３）－ｈＦｃタンパク質（Ａｃｒｏから購入、カタログ番号：ＢＣＡ－Ｃ５２５３）をそれぞれ０．２５ｍｇでＩＦＡ １ｍＬと均一に混合した後に皮下注射し、その後、３回目の免疫の方法に従って３週間ごとに追加免疫を行った。

【0145】

各追加免疫から１週間後に採血し、ＥＬＩＳＡにより血清抗体の力価及び特異性を検出し、結果は６に示すとおりである。ヒトＢＣＭＡ－ｈＦｃ及びカニクイザルサルＢＣＭＡ－ｈＦｃタンパク質で免疫化されたアルパカの血清は、いずれも免疫原に対して異なる程度の結合を示し、抗原抗体反応を呈することが示された。ここで、空白対照群は１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡであり、ここで、４回目の免疫及び５回目の免疫は、それぞれ４回目及び５回目の免疫後の７日目のアルパカ血清を指し、表中のデータはＯＤ４５０ｎｍ値であり、ｋは１０００を表す。

【0146】

【表6】

【0147】

（Ｂ）ファージライブラリーの構築
リンパ球単離液の取扱説明書に従って、４回目の免疫及び５回目の免疫後に採集した５０ｍＬの末梢血からＰＢＭＣを単離した。ＲＮＡｉｓｏ Ｐｌｕｓ試薬によりＮＢ２５４の４回目の免疫及び５回目の免疫のＰＢＭＣの総ＲＮＡを抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^TMＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、カタログ番号：６２１０Ａ）キットを用いて逆転写し、取扱説明書に従って逆転写してｃＤＮＡを製造し、合計５μｇのＲＮＡを転写した。４回目の免疫及び５回目の免疫のｃＤＮＡ原液を同じ割合で混合した後に５倍希釈してネステッド増幅を行い、タッピングによりＶＨＨ断片を回収した。ベクター及び目的断片に対してそれぞれＳｆｉＩにより５０℃で一晩酵素切断を行った後に回収した。ベクターと目的断片を１：３の割合で連結した。連結生成物に対して１０回のエレクトロポレーションによる形質転換を行い、エレクトロポレーションの直後にエレクトロポレーションカップに１ｍＬの２ＹＴ培地（３７℃で予熱した）を加えて蘇生し、エレクトロポレーション生成物を吸い出し、２ＹＴ培地でエレクトロポレーションカップを洗浄し、３７℃、１８０ｒｐｍで４５ｍｉｎ蘇生し、１００μＬを取り、１０^－３及び１０^－４に勾配希釈し、ライブラリーにおける形質転換体の数を測定し、９０ｍｍのプレートに塗布し、残りを遠心分離し、８ｍＬの２ＹＴ培地を加えて再懸濁させ、８枚の２００ｍｍのプレートに塗布した。翌日、計数し、ライブラリー容量を計算して２．１４×１０^９である。４８個のクローンをランダムに選択して培養し、ＰＣＲにより検出してその挿入率が１００％である。

【0148】

大腸菌ライブラリーを、その初期ＯＤ６００＝０．１～０．２になるまで２×３００ｍＬの２ＹＴ（Ａｍｐ：１００μｇ／ｍｌ、Ｇｌｕ：１％）培地に入れ、３７℃、２３０ｒｐｍでＯＤ６００＝０．８以上になるまで培養した。ＯＤ６００に基づいて、加えたヘルパーファージＭ１３Ｋ０７の量（Ｍ１３Ｋ０７：大腸菌＝２０：１）を計算し、３７℃で３０ｍｉｎ静置し感染させた後、３７℃、１８０ｒｐｍで３０ｍｉｎ培養した。５０００ｒｐｍで遠心分離して上清を除去し、２ＹＴ（１００μｇ／ｍＬ Ａｍｐ＋５０μｇ／ｍＬ Ｋａｎ）培地を交換し、３０℃、２２０ｒｐｍで一晩培養した。ＮＥＢ公式ウェブサイトの手順に従ってファージライブラリーを沈殿させ、その力価を測定した。

【0149】

（Ｃ）ＢＣＭＡナノ抗体に対するパニング
マイクロウェルプレートをヒトＢＣＭＡ－ｈＦｃタンパク質により０．５μｇ／ウェルでコーティングし、合計８個のウェルであり、ファージライブラリーの投入量は２．２×１０^１１であり、第１ラウンドの溶出生成物の力価が１．８５×１０^７であると測定した。ＥＬＩＳＡによる同定によれば、第１ラウンドのパニング生成物は、ヒトＢＣＭＡタンパク質との結合の陽性率が８９．５８％であり、サルＢＣＭＡタンパク質との結合の陽性率が４．２％であり、ヒト、サルＢＣＭＡタンパク質との交差結合の陽性率が４．２％である。一般的な手順で第１ラウンドのパニング溶出生成物を増幅し、その増幅ファージの力価が１．１４×１０^１３であると測定した。第２ラウンドのパニングにおいて、マイクロウェルプレートをサルＢＣＭＡタンパク質により０．２μｇ／ウェルでコーティングし、合計４個のウェルであり、ファージライブラリーの投入量は２．２×１０^１１であり、溶出生成物の力価が１．３２×１０^７であると測定した。ＥＬＩＳＡによる同定によれば、第２ラウンドのパニング生成物は、ヒトＢＣＭＡタンパク質との結合の陽性率が９２．１％であり、サルＢＣＭＡタンパク質との結合の陽性率が３９．３％であり、ヒト、サルＢＣＭＡタンパク質との交差結合の陽性率が３９．３％である。

【0150】

（Ｄ）シーケンシング
パニングにより合計７０個のヒトサル交差陽性クローンを得て、陽性クローンに対してシーケンシング分析を行い、ＶＨＨコードタンパク質配列に基づいて系統樹配列を構築し、クラスタリング分析により、７０本の配列が３つの生殖系列に属することを発見し、それぞれＬａｂ０１、０２、０３、０４、０５、０６、０７及び０８号の合計８個のクローンを選択して構築し、発現させ、同定した。

【0151】

実施例３ 組換え候補抗体の構築、発現
目標ＶＨＨ配列をヒトＩｇＧ１ Ｆｃの発現ベクターに組換えして、組換えプラスミド（ヒトＩｇＧ１Ｆｃの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を参照されたい）を得た。組換え候補抗体プラスミド及びトランスフェクト試薬ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入、カタログ番号：２４７６５－１）をＯＰＴＩ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１０５８０２１）に加えて均一に混合した後に１５ｍｉｎ静置し、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（メーカー：Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号：Ａ１４５２７）に加え、５％ ＣＯ_２、１２０ｒｐｍ、３７℃のシェーカーに入れて培養した。トランスフェクション翌日、ＯＰＭ－２９３ ＰｒｏＦｅｅｄ（上海奥浦邁、カタログ番号：Ｆ０８１９１８－００１）及び６ｇ／Ｌグルコース（メーカー：Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｇ７５２８）を加えた。トランスフェクション６日目、細胞上清を収集した。上清を収集して培養し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティーにより精製し、用いたフィーラーはＭａｂｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（番号１００５４１２０、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）であり、緩衝液はＭａｂアフィニティー平衡液（ＰＢＳ Ｂｕｆｆｅｒ）、Ｍａｂアフィニティー淋洗液（１Ｍ ＮａＣｌを含有するＰＢＳ緩衝液）及びＭａｂアフィニティー溶出液（クエン酸塩緩衝液）である。超微量分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ８０００、Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて濃度測定を行った。ＳＥＣ－ＨＰＬＣ法により測定対象タンパク質試料を分析して、タンパク質の分子サイズ均一性及び純度を特徴付けた。用いたＨＰＬＣはＡｇｉｌｅｎｔ １２６０であり、クロマトグラフィーカラムＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷＸＬはＴｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入され、移動相は２００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ ７．０／イソプロピルアルコール（ｖ／ｖ ９：１）（ロット番号：２０２１０５１９００１）であり、検出温度は２５℃であり、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎであり、検出波長は２８０ｎｍである。ＳＥＣ－ＨＰＬＣデータは、手動積分法によりクロマトグラムを分析し、面積正規化法に従ってタンパク質の純度を計算し、メインピークはモノマーであると考えられ、メインピーク前のクロマトグラフィーピークは凝集体と称され、メインピーク後のクロマトグラフィーピークはフラグメントと称される。結果は表７に示すとおりであり、候補抗体の最終製品の純度は高かった。

【0152】

【表7】

【0153】

実施例４ 組換え候補抗体の同定
（Ａ）ＢＣＭＡ組換え候補抗体とヒトＢＣＭＡタンパク質との結合及びサルＢＣＭＡタンパク質との交差結合の酵素結合免疫吸着アッセ（ＥＬＩＳＡ）による検出
具体的な方法は以下のとおりである：ヒトＢＣＭＡタンパク質（Ａｃｒｏから購入、カタログ番号：ＢＣＡ－Ｈ５２２ｙ）及びサルＢＣＭＡタンパク質（Ａｃｒｏから購入、カタログ番号：ＢＣＡ－Ｃ５２Ｈ７）をそれぞれＰＢＳにより最終濃度１μｇ／ｍＬに希釈し、そして５０μｌ／ウェルで９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加えた。プラスチックフィルムで密封し、４℃で一晩インキュベートし、翌日、ＰＢＳでプレートを２回洗浄し、封入液［ＰＢＳ＋２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ］を加え、室温で２時間ブロッキングした。封入液を捨て、ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、１００ｎＭの勾配希釈されたＢＣＭＡナノ組換えキメラ抗体又は陰性対照抗体を５０μｌ／ウェルで加えた。３７℃で２時間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識される二次抗体（Ｍｅｒｃｋから購入、カタログ番号：ＡＰ１１３Ｐ）を加え、３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを５回洗浄した。ＴＭＢ基質を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１０分間インキュベートした後、停止液（１．０Ｍ ＨＣｌ）を５０μｌ／ウェルで加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、ＥｎＳｉｇｈｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入）によりＯＤ４５０ｎｍの数値を読み取った。結果は図５、図６に示すとおりであり、全ての抗体はいずれもヒトＢＣＭＡタンパク質と結合し、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０６及びＢＣＭＡ－Ｌａｂ０７は、サルＢＣＭＡタンパク質に対する結合活性がなく、他の組換え候補抗体は、いずれもサルＢＣＭＡタンパク質と交差結合活性を有し、ＩｇＧサブタイプ対照はヒトＩｇＧ１である。

【0154】

（Ｂ）ＢＣＭＡ組換え候補抗体とＢＣＭＡ発現内因性細胞との結合のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による検出
必要な細胞をＴ－７５細胞培養フラスコ中で対数増殖期まで拡大培養し、単細胞懸濁液になるまで細胞をピペッティングした。細胞を計数した後、遠心分離し、細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清）により２×１０^６細胞／ミリリットルまで再懸濁させ、５０μｌ／ウェルで９６ウェルのＦＡＣＳ反応プレートに加え、候補抗体の測定対象試料を５０μｌ／ウェルで加え、４℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液で３回遠心分離し洗浄し、二次抗体ａｎｔｉ－ｈＩｇＧ（Ｆｃ）Ａｌｅｘａ ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎから購入、カタログ番号：１０９－６０５－０９８）を５０μｌ／ウェルで加え、氷上で１時間インキュベートした。ＰＢＳ緩衝液で３回遠心分離し洗浄し、１００μｌを取り、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＴＭ、ＢＤ社から購入）により検出し、結果を分析した。ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）によってデータを分析し、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。次にソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８）によって分析し、データフィッティングを行い、ＥＣ５０を計算した。結果は、表８及び図７、図８に示すとおりであり、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０５、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０６、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０８は、Ｈ９２９及びＵ２６６細胞との結合が悪く、他の抗体は良好に機能した。

【0155】

【表8】

【0156】

（Ｃ）リガンドＡＰＲＩＬとヒトＢＣＭＡタンパク質との結合に対する組換え候補抗体の遮断作用のリガンド結合の競合ＥＬＩＳＡによる検出
抗原タンパク質をＰＢＳにより最終濃度１μｇ／ｍＬに希釈し、そして５０μｌ／ウェルで９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートに加えた。プラスチックフィルムで密封し、４℃で一晩インキュベートし、翌日、ＰＢＳでプレートを２回洗浄し、封入液［ＰＢＳ＋２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ］を加え、室温で２時間ブロッキングした。封入液を捨て、ＰＢＳでプレートを３回洗浄し、２００ｎＭの勾配希釈されたＢＣＭＡナノ組換えキメラ抗体又は陰性対照抗体を５０μｌ／ウェルで加えた。ｈＡＰＲＩＬ－ｂｉｏｔｉｎ（Ａｃｒｏから購入、カタログ番号：ＡＰＬ－Ｈ８２Ｆ５）を０．５μｇ／ｍＬに希釈し、５０μｌ／ウェルである。３７℃で１．５時間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを３回洗浄した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識される二次抗体（Ｓｉｇｍａから購入、カタログ番号：Ｓ２４３８－２５０μｇ）を加え、３７℃で１時間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを５回洗浄した。ＴＭＢ基質を５０μｌ／ウェルで加え、室温で１０分間インキュベートした後、停止液（１．０Ｍ ＨＣｌ）を５０μｌ／ウェルで加えた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、ＥｎＳｉｇｈｔ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから購入）によりＯＤ４５０ｎｍの数値を読み取った。結果は図９に示すとおりであり、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０５、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０６及びＢＣＭＡ－Ｌａｂ０８は遮断効果が普通であり、他の抗体は遮断効果が良好である。

【0157】

実施例５ ＢＣＭＡ組換え候補抗体の親和性の検出
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａチップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２９－１２７－５５８）を用いて抗ＢＣＭＡ組換え候補抗体を捕捉した。試料及びランニング緩衝液はＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＢＲ－１００６－６９）である。フローセルを２５℃に設定した。試料ブロックを１６℃に設定した。両方はいずれもランニング緩衝液で予め処理された。各サイクルにおいて、まずＰｒｏｔｅｉｎ Ａチップで検出対象抗体を捕捉し、そして単一濃度のＢＣＭＡ抗原タンパク質を注入し、抗体と抗原タンパク質との結合及び解離過程を記録し、最後にＧｌｙｃｉｎｅ ｐＨ１．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；ＢＲ－１００３－５４）でチップの再生を完了した。溶液における異なる濃度のヒトＢＣＭＡ－Ｈｉｓを２４０秒間注射し続けることによって結合を測定し、ここで、流速は３０μＬ／分間であり、２００ｎＭから開始し（試験の実際の濃度は詳細な結果を参照）、１：１で希釈し、合計５個の濃度があった。解離相を６００秒間までモニタリングし、試料溶液からランニング緩衝液への切り替えによって誘発された。１０ｍＭのグリシン溶液（ｐＨ １．５）を用いて３０μＬ／分間の流速で３０秒間洗浄することによって、表面を再生させた。ヤギ抗ヒトＦｃ表面から得られた応答を減算することによってバルク屈折率（Ｂｕｌｋ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｉｎｄｅｘ）の差異を補正した。ブランク注射（＝二重参照）をも減算した。見かけのＫＤ及び他の動態学的パラメータを計算するために、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１モデルを用いた。組換え候補抗体とヒトＢＣＭＡタンパク質との結合速度（Ｋ_ａ）、解離速度（Ｋ_ｄｉｓ）及び結合親和性（ＫＤ）は表に示すとおりであり、ここで、ＲＥＧＮ５４５９－ｈＩｇＧ１抗体を対照として用いた。表９に示すように、組換え候補抗体とヒトＢＣＭＡタンパク質とのＫＤ値はいずれも１Ｅ－７Ｍ以下である。

【0158】

【表9】

【0159】

一連の実験によりスクリーニングした後、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１及びＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２アルパカ抗体を選択して後続のヒト化改変を行った。ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１～ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０８アルパカ抗体配列は、表１０に示すとおりであり、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ、Ｃｈｏｔｈｉａ方式により分析されたＣＤＲ配列は、表１１に示すとおりである。

【0160】

【表10】

【0161】

【表11】

【0162】

実施例６ ナノ抗体のヒト化
ＩＭＧＴ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ）ヒト抗体重軽鎖可変領域の生殖系列遺伝子データバンクをアラインメントすることによって、それぞれＶＨＨナノ抗体と相同性の高い重鎖可変領域の生殖系列遺伝子を選択してテンプレートとし、ＶＨＨナノ抗体のＣＤＲをそれぞれ対応するヒト由来テンプレートに移植し、順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４である可変領域配列を形成した。必要に応じて、骨格配列における鍵となるアミノ酸に対して復帰突然変異を行ってＶＨＨナノ抗体に対応するアミノ酸を形成して、元の親和性を保証すれば、ヒト化モノクローナル抗体を得た。ここで、抗体のＣＤＲアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにより確定され、注釈された。

【0163】

（Ａ）ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１抗体のヒト化
ＶＨＨナノ抗体ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１のヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ３－６４＊０４及びＩＧＨＪ３＊０１であり、ＶＨＨナノ抗体ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１のＣＤＲをそれぞれそのヒト由来テンプレートに移植すれば、対応するヒト化バージョンを得た。必要に応じて、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１のヒト化抗体のＦＲ領域配列における鍵となるアミノ酸に対して復帰突然変異を行ってＶＨＨナノ抗体に対応するアミノ酸を形成して、元の親和性を保証し、抗体には化学的修飾が発生しやすい部位が存在し、これらの部位に対して点突然変異を行って修飾リスクを解消した。具体的な突然変異設計は表１２に示すとおりであった。

【0164】

【表12】

【0165】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１ヒト化抗体の可変領域の具体的な配列は以下のとおりである：
ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１－ＶＨＨ１ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５に示すとおりである：

【化1】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１－ＶＨＨ２ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６に示すとおりである：

【化2】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１－ＶＨＨ３ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７に示すとおりである：

【化3】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１－ＶＨＨ４ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８に示すとおりである：

【化4】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１－ＶＨＨ５ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９に示すとおりである：

【化5】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１－ＶＨＨ６ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０に示すとおりである：

【化6】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１－ＶＨＨ７ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１に示すとおりである：

【化7】

ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＶ３－６４＊０４アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２に示すとおりである：

【化8】

ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＪ３＊０１アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３に示すとおりである：

【化9】

Ｋａｂａｔ番号付けシステムによると、上記ヒト化ナノ抗体ＶＨＨ配列の分析結果は表１３に示すとおりである。

【0166】

【表13】

【0167】

（Ｂ）ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２抗体のヒト化
ＶＨＨ単一ドメイン抗体ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２のヒト化重鎖テンプレートはＩＧＨＶ３－７＊０１及びＩＧＨＪ６＊０１であり、ＶＨＨ単一ドメイン抗体ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２のＣＤＲをそれぞれヒト由来テンプレートに移植すれば、対応するヒト化バージョンを得た。必要に応じて、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２のヒト化抗体のＦＲ領域配列における鍵となるアミノ酸に対して復帰突然変異を行ってＶＨＨ単一ドメイン抗体に対応するアミノ酸を形成して、元の親和性を保証し、抗体には化学的修飾が発生しやすい部位が存在し、これらの部位に対して点突然変異を行って修飾リスクを解消した。具体的な突然変異設計は表１４に示すとおりである。

【0168】

【表14】

【0169】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２ヒト化抗体の可変領域の具体的な配列は以下のとおりである：
ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ１ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４に示すとおりである：

【化10】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ２ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５に示すとおりである：

【化11】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ３ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６に示すとおりである：

【化12】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ４ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７に示すとおりである：

【化13】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ５ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８に示すとおりである：

【化14】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ６ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に示すとおりである：

【化15】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ７ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０に示すとおりである：

【化16】

ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ８ アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に示すとおりである：

【化17】

ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＶ３－７＊０１アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２に示すとおりである：

【化18】

ヒト化重鎖テンプレートＩＧＨＪ６＊０１アミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３に示すとおりである：

【化19】

Ｋａｂａｔ番号付けシステムによると、上記ヒト化単一ドメイン抗体ＶＨＨ配列の分析結果は表１５に示すとおりである。

【0170】

【表15】

【0171】

実施例７ ヒト化候補ナノ抗体の構築、発現及び純度測定
具体的な操作方法は実施例３を参照されたく、目標ヒト化ＶＨＨ配列をヒトＩｇＧ１ Ｆｃの発現ベクターに組換えして、組換えプラスミド（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃの配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４を参照されたい）を得た。ヒト化ＶＨＨ－Ｆｃキメラ抗体を発現させて収集して細胞上清を得て、得られた抗体の純度に対してＳＥＣ－ＨＰＬＣにより定性分析を行い、結果は１６に示すとおりであり、ここで「／」は検出されていないことを表す。

【0172】

【表16】

【0173】

実施例８ ＢＣＭＡヒト化候補ナノ抗体の同定
（Ａ）ＢＣＭＡヒト化候補ナノ抗体とヒトＢＣＭＡタンパク質との結合及びサルＢＣＭＡタンパク質との交差結合の酵素結合免疫吸着アッセ（ＥＬＩＳＡ）による検出
具体的な方法は実施例４（Ａ）と同様であり、結果は図１０、図１１に示すとおりであり、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ１及びＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ２は、ヒトＢＣＭＡ及びサルＢＣＭＡタンパク質のいずれにも結合せず、残りのヒト化候補ナノ抗体はいずれも、ヒトＢＣＭＡと良好に結合し、サルＢＣＭＡタンパク質と交差結合活性を有し、ＩｇＧサブタイプ対照はヒトＩｇＧ１である。

【0174】

（Ｂ）ヒト化候補ナノ抗体とＢＣＭＡ発現内因性細胞との結合のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）による検出
具体的な方法は実施例４（Ｂ）と同様であり、結果は表１７及び図１２、図１３に示すとおりであり、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ１及びＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ２は、Ｈ９２９及びＵ２６６細胞に結合せず、残りのヒト化候補ナノ抗体は、Ｈ９２９及びＵ２６６細胞と良好に結合した。

【0175】

【表17】

【0176】

（Ｃ）リガンドＡＰＲＩＬとヒトＢＣＭＡタンパク質との結合に対するヒト化候補ナノ抗体の遮断作用のリガンド結合の競合ＥＬＩＳＡによる検出
具体的な方法は実施例４（Ｃ）と同様であり、結果は図１４に示すとおりであり、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ１及びＢＣＭＡ－Ｌａｂ０２－ＶＨＨ２は、リガンドＡＰＲＩＬとヒトＢＣＭＡタンパク質との結合を遮断することができず、ＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１ＶＨＨ１及びＢＣＭＡ－Ｌａｂ０１ＶＨＨ２は、リガンドＡＰＲＩＬとヒトＢＣＭＡタンパク質との結合に対する遮断作用が悪く、残りのヒト化候補ナノ抗体は遮断作用が良好である。

【0177】

実施例９ ＢＣＭＡヒト化候補ナノ抗体の親和性の検出
具体的な操作方法は実施例５を参照されたい。ヒト化候補ナノ抗体とヒトＢＣＭＡタンパク質との結合速度（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄｉｓ）及び結合親和性（ＫＤ）は表１８に示すとおりであり、ここで、ＲＥＧＮ５４５９－ｈＩｇＧ１抗体を対照として用いた。表１８に示すように、ヒト化候補ナノ抗体とヒトＢＣＭＡタンパク質とのＫＤ値はいずれも１Ｅ－８Ｍ以下である。

【0178】

【表18】

【0179】

実施例１０ ＢＣＭＡに対するナノ抗体のパニング及び組換え候補抗体の同定
（Ａ） ＢＣＭＡに対するナノ抗体のパニング
実施例２（Ｃ）の方法に従って、ヒトＢＣＭＡに結合する陽性クローンをさらにパニングし、Ｌａｂ０９～１８の合計１０個のクローンを選択して構築し、発現させ、同定した。

【0180】

（Ｂ） 組換え候補抗体の構築、発現
実施例３における方法に従って、ＶＨＨ－ＩｇＧ１の組換え候補抗体を得て、それとともにＳＥＣ－ＨＰＬＣにより同定して、候補抗体最終製品の純度はいずれも高かった。

【0181】

（Ｃ） ＢＣＭＡ組換え候補抗体とヒトＢＣＭＡタンパク質との結合のＥＬＩＳＡによる検出
実施例４（Ａ）における方法を参照して、ＥＬＩＳＡを用いて組換え候補抗体とヒトＢＣＭＡとの結合を検出し、結果は図１５に示すとおりである。図１５により、全ての抗体は、いずれもヒトＢＣＭＡタンパク質に結合し、陽性対照抗体ＨＰＮ２１７－ｈＨｃＡｂと同等であることが示された。

【0182】

（Ｄ） ＢＣＭＡ組換え候補抗体とＢＣＭＡ発現内因性細胞との結合のＦＡＣＳによる検出
実施例４（Ｂ）における方法に従って、ＦＡＣＳを用いて、組換え候補抗体とＢＣＭＡ発現内因性細胞との結合を同定し、結果は、図１６Ａ、１６Ｂ及び表１９に示すとおりである。結果によると、Ｈ９２９との結合が弱く、Ｕ２６６と結合しないＢＣＭＡ－Ｌａｂ０９を除いて、残りの抗体は、Ｈ９２９及びＵ２６６細胞との結合がいずれも強く、陽性対照抗体より強いか又は陽性対照抗体と同等である。

【0183】

【表19】

【0184】

（Ｅ） リガンドＡＰＲＩＬとヒトＢＣＭＡタンパク質との結合に対する組換え候補抗体の遮断作用のリガンド結合の競合ＥＬＩＳＡによる検出
実施例４（Ｃ）における方法に従って、リガンドの競合ＥＬＩＳＡを用いて、リガンドＡＰＲＩＬとヒトＢＣＭＡタンパク質との結合に対する組換え抗体の遮断作用を検出し、結果は図１７に示すとおりである。結果によると、リガンドＡＰＲＩＬとヒトＢＣＭＡタンパク質との結合を遮断できないＢＣＭＡ－Ｌａｂ０９を除いて、残りの抗体は、いずれもリガンドＡＰＲＩＬとヒトＢＣＭＡタンパク質との結合を良好に遮断することができ、陽性対照抗体と同等である。

【0185】

実施例１１ ＢＣＭＡ組換え候補抗体の親和性の検出
実施例５における方法に従って、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて、組換え抗体とヒトＢＣＭＡタンパク質との親和性を検出し、結果は表２０に示すとおりである。結果により、全ての抗体は、ヒトＢＣＭＡタンパク質との親和性がいずれも強いことが示された。ナノ抗体の配列は表２１に示すとおりであり、そのＣＤＲ配列は表２２に示すとおりである。

【0186】

【表20】

【0187】

【表21】

【0188】

【表22-1】

【表22-2】

【図1AB】

【図2AB】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16AB】

【図17】

【配列表】

2024541668000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-06-04

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、前記抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含み、前記ＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインのＨＣＤＲ１を含み、前記ＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインのＨＣＤＲ２を含み、且つ前記ＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインのＨＣＤＲ３を含む、抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、Ｋａｂａｔ、ＩＭＧＴ又はＣｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに基づいて確定され、
任意選択的に、前記ＨＣＤＲ１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３７、４０、４２、４５、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６４、６７、７１、７４、７７、８１、８４、８６、８７、１０４、１０７、１１３、１１６、１１９、１２１、１２４、１２７、１３１、１３４、１３８又は１４１に示すアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記ＨＣＤＲ２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５、３８、４１、４３、４６、４９、５９、６１、６３、６５、６８、７０、７２、７５、７８、７９、８２、８５、８８、８９、９０、９１、１０２、１０５、１０８、１０９、１１１、１１４、１１７、１２０、１２２、１２５、１２８、１２９、１３２、１３５、１３６、１３９、１４２、１４３、１４８、１５０、１５２、１５３、１５５又は１５７に示すアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記ＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３９、４４、４７、５１、５３、５５、５７、６０、６２、６６、６９、７３、７６、８０、８３、１０３、１０６、１１０、１１２、１１５、１１８、１２３、１２６、１３０、１３３、１３７、１４０、１４４、１４５、１４６、１４７、１４９、１５１、１５４又は１５６に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３５及び３６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８及び３９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１及び３６に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、４３及び４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６及び４７、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８、４９及び４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、３５及び５１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２、３８及び５３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４、４１及び５１に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、３５及び５５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、３８及び５７、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、４１及び５５に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、５９及び６０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、６１及び６２、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、６３及び６０に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４、６５及び６６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７、６８及び６９、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、７０及び６６に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、７２及び７３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、７５及び７６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、７８及び７３に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、７９及び８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１、８２及び８３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４、８５及び８０に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６、３５及び３６に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７、８８及び４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、８８及び４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、８９及び４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、９０及び４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２、９１及び４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、１０２及び１０３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、１０５及び１０６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、１０８及び１０３に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、１０９及び１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、１１１及び１１２、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、１０８及び１１０に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１１４及び１１５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６、１１７及び１１８、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９、１２０及び１１５に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１、１２２及び１２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４、１２５及び１２６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７、１２８及び１２３に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１２９及び１３０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１、１３２及び１３３、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４、１３５及び１３０に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、１３６及び１３７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、１３９及び１４０、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１、１４２及び１３７に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、１４３及び１４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、３８及び１４５、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、４１及び１４４に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、１４３及び１４６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、３８及び１４７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８、４１及び１４６に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４、１４８及び１４９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７、１５０及び１５１、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０、１５２及び１４９に示すアミノ酸配列を含み、
好ましくは、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、１５３及び１５４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、１５５及び１５６、又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、１５７及び１５４に示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３は、請求項１又は２に記載のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３に１個、２個又は３個の突然変異が発生するアミノ酸配列を含み、前記突然変異は、挿入、欠失及び／又は置換から選択され、前記置換は、好ましくは、保存的アミノ酸の置換である、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３は、前述ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及び／又はＨＣＤＲ３に比べて少なくとも８０、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

前記抗体又はその抗原結合断片は、請求項１又は２に記載のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む単一ドメイン抗体を含み、
好ましくは、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すアミノ酸配列を含み、
任意選択的に、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すアミノ酸配列に比べて多くとも２０個、１９個、１８個、１７個、１６個、１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個の突然変異が発生するアミノ酸配列を含み、前記突然変異は、挿入、欠失及び／又は置換から選択され、前記置換は、好ましくは、保存的アミノ酸の置換であり、
任意選択的に、前記単一ドメイン抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すアミノ酸配列に比べて少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインにおけるＦＲ領域を含み、
任意選択的に、前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインにおけるＦＲ領域に比べて多くとも１５個、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個又は１個の突然変異が発生するアミノ酸配列を含み、前記突然変異は、挿入、欠失及び／又は置換から選択され、前記置換は、好ましくは、保存的アミノ酸の置換であり、
任意選択的に、前記抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７～２１、２４～３１及び９２～１０１のうちのいずれか一つの配列に示すＶＨＨドメインにおけるＦＲ領域に比べて少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項7】

前記抗体又はその抗原結合断片は、（１）キメラ抗体又はその断片、（２）ヒト化抗体又はその断片、又は（３）完全ヒト抗体又はその断片から選択される、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項8】

前記抗体又はその抗原結合断片は、抗体重鎖定常領域を含むか又は含まず、任意選択的に、前記抗体重鎖定常領域は、ヒト、アルパカ、マウス、ラット、ウサギ及びヒツジから選択され、任意選択的に、前記抗体重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤから選択され、任意選択的に、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択され、任意選択的に、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ領域、ＣＨ３領域及び完全な重鎖定常領域から選択され、好ましくは、前記重鎖定常領域は、ヒトＦｃ領域であり、好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片は重鎖抗体である、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項9】

前記抗体又はその抗原結合断片には、さらに治療剤又はトレーサーがカップリングされており、好ましくは、前記治療剤は、放射性同位体、化学療法薬又は免疫調節剤から選択され、前記トレーサーは、放射線造影剤、常磁性イオン、金属、蛍光標識、化学発光標識、超音波造影剤及び光増感剤から選択される、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項10】

前記抗体又はその抗原結合断片には、さらに他の機能性分子が連結されており、好ましくは、前記他の機能性分子は、シグナルペプチド、タンパク質タグ、サイトカイン、血管新生阻害剤及び免疫チェックポイント阻害剤のうちの一つ又は複数から選択される、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項11】

多重特異性抗原結合分子であって、前記多重特異性抗原結合分子は、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、及びＢＣＭＡ以外の他の抗原に結合する抗原結合分子、又は請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片とは異なるＢＣＭＡエピトープに結合するものを含み、任意選択的に、前記ＢＣＭＡ以外の他の抗原は、ＣＤ３（好ましくは、ＣＤ３εである）、ＣＤ１６、ＣＤ１３７、ＣＤ２５８、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、４－１ＢＢ、ＣＤ４０、ＣＤ６４、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ＩＧＦ－１Ｒ、ホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、ＰＳ）、Ｃ－Ｍｅｔ、ＨＳＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＭＳＬＮ、血液脳関門受容体、ＧＰＣ３、ＰＳＭＡ、ＣＤ３３、ＧＤ２、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＦＲα及びＧｕｃｙ２Ｃから選択され、
好ましくは、前記抗原結合分子は、抗体又はその抗原結合断片であり、
好ましくは、前記多重特異性抗原結合分子は、二重特異性、三重特異性又は四重特異性であり、
好ましくは、前記多重特異性抗原結合分子は、２価、３価、４価、５価又は６価である、多重特異性抗原結合分子。

【請求項12】

単離された核酸断片であって、前記核酸断片は、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片又は請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子をコードする、核酸断片。

【請求項13】

請求項１２に記載の核酸断片を含む、ベクター。

【請求項14】

宿主細胞であって、前記宿主細胞は、請求項１２に記載の核酸断片又は請求項１３に記載のベクターを含み、好ましくは、前記細胞は、原核細胞又は真核細胞、例えば、細菌（例えば、大腸菌）、真菌（例えば、酵母）、昆虫細胞又は哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞株又は２９３Ｔ細胞株）である、宿主細胞。

【請求項15】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片又は請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子を製造する方法であって、前記方法は、請求項１４に記載の細胞を培養することと、前記細胞により発現される抗体、抗原結合断片又は多重特異性抗原結合分子を単離することとを含む、方法。

【請求項16】

医薬組成物であって、前記医薬組成物は、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１２に記載の核酸断片、請求項１３に記載のベクター又は請求項１５に記載の方法に従って製造された生成物を含み、任意選択的に、前記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリア、希釈剤又は助剤をさらに含み、任意選択的に、前記医薬組成物は、追加の抗腫瘍剤をさらに含む、医薬組成物。

【請求項17】

腫瘍又は癌を治療するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１２に記載の核酸断片、請求項１３に記載のベクター、請求項１５に記載の方法に従って製造された生成物又は請求項１６に記載の医薬組成物であって、任意選択的に、前記腫瘍又は癌は、ＢＣＭＡを発現する腫瘍又は癌であり、好ましくは、前記腫瘍又は癌はＢ細胞リンパ腫であり、より好ましくは、多発性骨髄腫（ＭＭ）である、抗体もしくはその抗原結合断片、多重特異性抗原結合分子、核酸断片、ベクター、生成物又は医薬組成物。

【請求項18】

請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体もしくはその抗原結合断片、請求項１１に記載の多重特異性抗原結合分子、請求項１２に記載の核酸断片、請求項１３に記載のベクター、請求項１５に記載の方法に従って製造された生成物又は請求項１６に記載の医薬組成物を含む、キット。

【請求項19】

生物学的試料におけるＢＣＭＡ発現を検出する方法であって、前記方法は、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片とＢＣＭＡとの間で複合体を形成し得る条件下で、前記生物学的試料を前記の抗体又はその抗原結合断片に接触させることを含み、好ましくは、前記方法は、前記複合体の形成を検出し、試料におけるＢＣＭＡの存在又は発現レベルを指示することをさらに含む、方法。

【国際調査報告】