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特表2024-541768修飾ＧＣＣ受容体アゴニストの産生のための合成プロセス
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-12
(54)【発明の名称】修飾ＧＣＣ受容体アゴニストの産生のための合成プロセス
(51)【国際特許分類】
C07K 1/04 20060101AFI20241105BHJP
C07K 1/06 20060101ALI20241105BHJP
C07K 1/10 20060101ALI20241105BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20241105BHJP
A61P 13/10 20060101ALI20241105BHJP
【ＦＩ】
C07K1/04 ZNA
C07K1/06
C07K1/10
A61K38/10
A61P13/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024531058
(86)(22)【出願日】2022-11-22
(85)【翻訳文提出日】2024-07-22
(86)【国際出願番号】 US2022080303
(87)【国際公開番号】W WO2023097210
(87)【国際公開日】2023-06-01
(31)【優先権主張番号】63/282,851
(32)【優先日】2021-11-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521540818
【氏名又は名称】アイアンウッド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】レーザイサー， クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】ステーケーア， グンナー
(72)【発明者】
【氏名】アンビー， ウルフ
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA06
4C084BA01
4C084BA09
4C084BA18
4C084BA25
4C084BA26
4C084BA28
4C084DC50
4C084NA14
4C084ZA811
4H045AA20
4H045BA30
4H045BA32
4H045BA34
4H045EA20
4H045FA20
4H045FA33
4H045FA58
4H045FA59
4H045FA61
4H045GA21
(57)【要約】
本発明は、配列番号１の合成ペプチドまたはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法に関する。本明細書に記載の方法は、（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、固相支持体に結合したそのＣ末端およびそのＮ末端に保護されたアミン基を有する直鎖ペプチドを化学的に合成することによって始まり、直鎖ペプチドは、１もしくはそれを超えるアミノ酸および／または少なくとも１つのポリアミノ酸シントンに保護基を有する。いくつかの実施形態では、シントンは、アセチル化された少なくとも１つのアミン基および少なくとも１つのカルボン酸保護基を有する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
合成ペプチド、またはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法であって、前記方法が、（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、Ｃ末端が固相支持体に結合しており、Ｎ末端に保護されたアミン基を有する直鎖ペプチドを化学的に合成することであって、前記直鎖ペプチドが、１またはそれを超えるアミノ酸および／または前記少なくとも１つのポリアミノ酸シントンに保護基を有し、
前記シントンが、少なくとも１つのアセチル化されたアミン基および少なくとも１つのカルボン酸保護基を有する、化学的に合成することと、
（ｉｉ）前記シントンの前記カルボン酸保護基および前記直鎖ペプチドの前記Ｎ末端の前記アミン基からの前記保護基を除去して、保護されていないアミン基および保護されていないカルボン酸基を有する部分的に保護されていない固相支持体結合ペプチドを形成することと、
（ｉｉｉ）前記保護されていないアミン基と前記保護されていないカルボン酸基とをカップリングして、環化固相支持体結合ペプチドを形成することと、
（ｉｖ）前記環化固相支持体結合ペプチドを前記固相支持体から切断して、環化保護されたペプチドを生成することと、
（ｖ）前記環化保護されたペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得ることと、
（ｖｉ）前記全体的に脱保護されたペプチドを折り畳んで、１またはそれを超える追加の架橋を形成して、前記合成ペプチドを得ることと、
（ｖｉｉ）前記合成ペプチドを精製することと、を含み、
前記合成ペプチドが、アミノ酸配列：
Ａｃ－Ｃｙｓ１ Ｃｔｈ２ Ｇｌｕ３ Ｌｅｕ４ Ｃｙｓ５ Ｃｙｓ６ Ａｓｎ７ Ｖａｌ８ Ａｌａ９ Ｃｙｓ１０ Ｔｙｒ１１ Ｇｌｙ１２ Ｃｙｓ１３（配列番号１）を含み、
前記合成ペプチドが、以下：
ａ）Ｃｙｓ１およびＣｙｓ６、
ｂ）Ｃｔｈ２およびＣｙｓ１０、ならびに
ｃ）Ｃｙｓ５およびＣｙｓ１３
のアミノ酸残基間に共有結合を含む、方法。
【請求項2】
前記合成ペプチドを、溶液から凍結乾燥することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記固相支持体が、Ｗａｎｇ樹脂、トリチル樹脂、およびＲｉｎｋ樹脂からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記固相支持体が、約０．１０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．２０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．３０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．４０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．５０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．６０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．７０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．８０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．９０ｍｍｏｌ／ｇ、または約１．００ｍｍｏｌ／ｇの充填量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ポリアミノ酸シントンが、式：【化27】
Ｐ２は、アミン保護基であり、
Ｐ３は、カルボン酸保護基であり、
Ｐ４は、チオール保護基である）の化合物である、請求項５に記載の方法。
【請求項6】
前記保護基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）、トリチル、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アリル、２，４－ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、アリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）、および２－ピリジン－スルフェニル（Ｐｙｒ）からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
Ｐ２が９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基である、請求項５または６に記載の方法。
【請求項8】
Ｐ３が、アリル保護基である、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
Ｐ４が、トリチル保護基である、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記ポリアミノ酸シントンのサブユニットが、Ｄ配置を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記ポリアミノ酸シントンのサブユニットが、Ｌ配置を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記ポリアミノ酸シントンのサブユニットが、Ｄ配置およびＬ配置の両方を有する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記複数のアミノ酸および前記シントンが、カルボジイミド媒介反応によって、または非カルボジイミドカップリング剤：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、（２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－５－クロロ－ヘキサフルオロホスフェート（１－）、３－オキシド（ＨＣＴＵ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、またはプロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）によって媒介される反応によって結合されて、工程（ｉ）の前記直鎖ペプチドを形成する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記複数のペプチドおよび／または前記シントン由来の少なくとも１つのアミノ酸が、カルボジイミド媒介反応によって結合されて、工程（ｉ）の前記直鎖ペプチドを形成する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記カルボジイミドが、ジイソプロピルカルボキシイミド（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｘｉｉｍｉｄｅ）（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）からなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項16】
前記カルボジイミドが、ＤＩＣである、１５に記載の方法。
【請求項17】
前記カルボジイミド媒介反応が、酸化防止剤を更に含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記酸化防止剤が、１，３－ジイソプロピル－２チオウレア（ＤＩＴＵ）またはジチオスレイトールである、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記環化カップリング反応が、非カルボジイミドカップリング剤によって媒介される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記非カルボジイミドカップリング剤が、ＨＡＴＵである、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
工程（ｉｉｉ）の前記環化ペプチドが、チオエーテル結合を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記全体的な脱保護工程（ｖ）が、ヨウ化アンモニウム（ＮＨ４Ｉ）を有するカクテル溶液の添加を含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記折り畳み工程（ｖｉ）が、ヨウ素媒介酸化またはアルカリ媒介酸化によって達成される、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記アルカリ媒介酸化が、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）媒介酸化またはＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）媒介酸化である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
Ｃｙｓ１とＣｙｓ６およびＣｙｓ５とＣｙｓ１３との間の前記共有結合が、ジスルフィド結合である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
式Ｉ：【化28】
（ｉ）保護されたアミノ酸側鎖を有するＣ末端樹脂結合Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓペプチドを式ＩＩ：
【化29】
Ｐ２は、アミン保護基であり、
Ｐ３は、カルボン酸保護基であり、
Ｐ４は、チオール保護基である）
のポリアミノ酸シントンにカップリングして、式ＩＩＩ：
【化30】
（ｉｉ）式ＩＩＩのＰ２保護基を除去して、保護されていないアミン基を有する式ＩＶ：
【化31】
（ｉｉｉ）式ＩＶの遊離アミン基を介してＰ２－アラニンを式ＩＶの前記樹脂結合ペプチドにカップリングして、式Ｖ：
【化32】
（ｉｖ）式ＶのＰ２保護基を除去して遊離アミン基を得て、続いて前記遊離アミン基をＰ２－アミノ酸にカップリングすることであって、
前記Ｐ２アミノ酸の側鎖が、保護されていてもよい、カップリングすることと、
（ｖ）工程（ｉｖ）を更に５回繰り返して、式ＶＩ：
【化33】
少なくとも１つのアミノ酸側鎖が、保護されている、形成することと、
（ｖｉ）前記Ｐ２保護基および前記Ｐ３保護基を除去して、遊離アミン基および遊離カルボン酸基を得ることと、
（ｖｉｉ）前記遊離アミン基と前記遊離カルボン酸基とをカップリングして、式ＶＩＩ：
【化34】
（ｖｉｉｉ）式ＶＩＩの前記ペプチドを前記樹脂から切断して、環化ペプチドを得ることと、
（ｉｘ）前記環化ペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得ることと、
（ｘ）２つのジスルフィド結合を形成することによって、前記全体的に脱保護されたペプチドを折り畳み、式Ｉの前記合成ペプチドを得ることと、を含む、方法。
【請求項21】
式ＶＩの前記Ｇｌｕ、前記Ｃｙｓ、前記Ｃｙｓ、前記Ａｓｎ、前記Ｇｌｙおよび前記Ｃｙｓ残基が、側鎖保護基を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
Ｐ２が、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）、およびアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択される保護基である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項23】
Ｐ２が、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基である、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
Ｐ３が、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アリル、トリチル、２，４－ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、およびベンジル（Ｂｎ）からなる群から選択される保護基である、請求項２０～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
Ｐ３が、アリル保護基である、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
Ｐ４が、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔ－Ｂｕｔ）、３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）、２－ピリジン－スルフェニル（Ｐｙｒ）、およびトリチル（Ｔｒｔ）からなる群から選択される保護基である、請求項２０～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
Ｐ４が、トリチル保護基である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月２４日に出願された米国仮出願第６３／２８２，８５１号の優先権および利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１１月２４日に出願された米国仮出願第６３／２８２，８５１号の優先権および利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
発明の分野
本発明は、配列番号１の合成ペプチドまたはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法に関する。
本発明は、配列番号１の合成ペプチドまたはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法に関する。
【0003】
配列表
本出願は、２０２２年１１月１８日の３：４５ ＰＭに作成され、本明細書と共に電子的に提出された「２２３３５５－５１９４３３．ｘｍｌ」（８．１１キロバイト）と題された配列表ＸＭＬをその全体が参照により組み込む。
本出願は、２０２２年１１月１８日の３：４５ ＰＭに作成され、本明細書と共に電子的に提出された「２２３３５５－５１９４３３．ｘｍｌ」（８．１１キロバイト）と題された配列表ＸＭＬをその全体が参照により組み込む。
【背景技術】
【0004】
発明の背景
間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）は、通常、尿意切迫、頻度の増加および／または夜間頻尿が付随して起こる、膀胱痛を伴う慢性状態である。ＩＣ／ＢＰＳはしばしば尿路感染症と誤診され、抗生物質は一般に無効である。女性の３～７％および男性の３～４％がＩＣ／ＢＰＳの定義を満たすと推定される。ＩＣ／ＢＰＳの原因にはいくつかの寄与因子が存在する場合があり、ＩＣ／ＢＰＳが原発性障害であるか、または別の障害の二次的結果であるかは不明である［Ｈａｎｎｏら、２０１５、１９３；１５４５－１５５３］。ＩＣ／ＢＰＳの診断試験はなく、診断は一般に、膀胱に関連する疼痛を伴う緊急性および頻度の排尿症状に基づく。診断は、一般に、これらの症状を引き起こし得る他の疾患が除外されるまで保留される。
間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）は、通常、尿意切迫、頻度の増加および／または夜間頻尿が付随して起こる、膀胱痛を伴う慢性状態である。ＩＣ／ＢＰＳはしばしば尿路感染症と誤診され、抗生物質は一般に無効である。女性の３～７％および男性の３～４％がＩＣ／ＢＰＳの定義を満たすと推定される。ＩＣ／ＢＰＳの原因にはいくつかの寄与因子が存在する場合があり、ＩＣ／ＢＰＳが原発性障害であるか、または別の障害の二次的結果であるかは不明である［Ｈａｎｎｏら、２０１５、１９３；１５４５－１５５３］。ＩＣ／ＢＰＳの診断試験はなく、診断は一般に、膀胱に関連する疼痛を伴う緊急性および頻度の排尿症状に基づく。診断は、一般に、これらの症状を引き起こし得る他の疾患が除外されるまで保留される。
【0005】
ＩＣ／ＢＰＳに利用可能な承認された治療法はほとんどない。患者は、非薬理学的処置（全身のリラクセーション、ストレス管理、行動修正、および理学療法の手法）による処置を開始することが多い。ＩＣ／ＢＰＳに利用可能なわずかに有効な治療のために、多くの患者は、症状を軽減するために膀胱内注入（すなわち、カテーテルを介して膀胱に直接送達される薬剤の混合物）を含むオフラベルの治療を利用する。ＩＣ／ＢＰＳのためのより効果的で忍容性の高い処置が必要とされている。
【0006】
１３アミノ酸グアニル酸シクラーゼＣ（ＧＣ－Ｃ）アゴニスト合成ペプチドは、ＩＣ／ＢＰＳに関連する膀胱痛、および潜在的に腹部領域の他の内臓痛状態の処置のために開発されている。このペプチドの開発を更に進めるために、効率的な合成および精製プロセスが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
発明の概要
本発明は、合成ペプチド、またはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法に関する。（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、Ｃ末端が固相支持体に結合しており、Ｎ末端に保護されたアミン基を有する直鎖ペプチドを化学的に合成する工程であって、直鎖ペプチドが、１またはそれを超えるアミノ酸および／または少なくとも１つのポリアミノ酸シントンに保護基を有し、シントンが、少なくとも１つのアセチル化されたアミン基および少なくとも１つのカルボン酸保護基を有する、化学的に合成する工程と、（ｉｉ）シントンのカルボン酸保護基および直鎖ペプチドのＮ末端のアミン基からの保護基を除去して、保護されていないアミン基および保護されていないカルボン酸基を有する部分的に保護されていない固相支持体結合ペプチドを形成する工程と、（ｉｉｉ）保護されていないアミン基と保護されていないカルボン酸基とをカップリングして、環化固相支持体結合ペプチドを形成する工程と、（ｉｖ）環化固相支持体結合ペプチドを固相支持体から切断して、環化保護されたペプチドを生成する工程と、（ｖ）環化保護されたペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得る工程と、（ｖｉ）全体的に脱保護されたペプチドを折り畳んで、１またはそれを超える追加の架橋を形成して、合成ペプチドを得る工程と、（ｖｉｉ）合成ペプチドを精製する工程と、を有する方法。合成ペプチドは、アミノ酸配列：Ａｃ－Ｃｙｓ１ Ｃｔｈ２ Ｇｌｕ３ Ｌｅｕ４ Ｃｙｓ５ Ｃｙｓ６ Ａｓｎ７ Ｖａｌ８ Ａｌａ９ Ｃｙｓ１０ Ｔｙｒ１１ Ｇｌｙ１２ Ｃｙｓ１３（配列番号１）を含む。合成ペプチドは、以下：Ｃｙｓ１およびＣｙｓ６、Ｃｔｈ２およびＣｙｓ１０、ならびにＣｙｓ５およびＣｙｓ１３のアミノ酸残基間に共有結合を含む。
本発明は、合成ペプチド、またはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法に関する。（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、Ｃ末端が固相支持体に結合しており、Ｎ末端に保護されたアミン基を有する直鎖ペプチドを化学的に合成する工程であって、直鎖ペプチドが、１またはそれを超えるアミノ酸および／または少なくとも１つのポリアミノ酸シントンに保護基を有し、シントンが、少なくとも１つのアセチル化されたアミン基および少なくとも１つのカルボン酸保護基を有する、化学的に合成する工程と、（ｉｉ）シントンのカルボン酸保護基および直鎖ペプチドのＮ末端のアミン基からの保護基を除去して、保護されていないアミン基および保護されていないカルボン酸基を有する部分的に保護されていない固相支持体結合ペプチドを形成する工程と、（ｉｉｉ）保護されていないアミン基と保護されていないカルボン酸基とをカップリングして、環化固相支持体結合ペプチドを形成する工程と、（ｉｖ）環化固相支持体結合ペプチドを固相支持体から切断して、環化保護されたペプチドを生成する工程と、（ｖ）環化保護されたペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得る工程と、（ｖｉ）全体的に脱保護されたペプチドを折り畳んで、１またはそれを超える追加の架橋を形成して、合成ペプチドを得る工程と、（ｖｉｉ）合成ペプチドを精製する工程と、を有する方法。合成ペプチドは、アミノ酸配列：Ａｃ－Ｃｙｓ１ Ｃｔｈ２ Ｇｌｕ３ Ｌｅｕ４ Ｃｙｓ５ Ｃｙｓ６ Ａｓｎ７ Ｖａｌ８ Ａｌａ９ Ｃｙｓ１０ Ｔｙｒ１１ Ｇｌｙ１２ Ｃｙｓ１３（配列番号１）を含む。合成ペプチドは、以下：Ｃｙｓ１およびＣｙｓ６、Ｃｔｈ２およびＣｙｓ１０、ならびにＣｙｓ５およびＣｙｓ１３のアミノ酸残基間に共有結合を含む。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【発明を実施するための形態】
【0009】
発明の詳細な説明
合成ペプチド、またはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法が本明細書中に記載される。本明細書中に記載される方法は、
（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、Ｃ末端が固相支持体に結合しており、Ｎ末端に保護されたアミン基を有する直鎖ペプチドを化学的に合成することであって、前記直鎖ペプチドが、１またはそれを超えるアミノ酸および／または前記少なくとも１つのポリアミノ酸シントンに保護基を有し、
前記シントンが、少なくとも１つのアセチル化されたアミン基および少なくとも１つのカルボン酸保護基を有する、化学的に合成することと、
（ｉｉ）前記シントンの前記カルボン酸保護基および前記直鎖ペプチドの前記Ｎ末端の前記アミン基からの前記保護基を除去して、保護されていないアミン基および保護されていないカルボン酸基を有する部分的に保護されていない固相支持体結合ペプチドを形成することと、
（ｉｉｉ）前記保護されていないアミン基と前記保護されていないカルボン酸基とをカップリングして、環化固相支持体結合ペプチドを形成することと、
（ｉｖ）前記環化固相支持体結合ペプチドを前記固相支持体から切断して、環化保護されたペプチドを生成することと、
（ｖ）前記環化保護されたペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得ることと、
（ｖｉ）前記全体的に脱保護されたペプチドを折り畳んで、１またはそれを超える追加の架橋を形成して、前記合成ペプチドを得ることと、
（ｖｉｉ）前記合成ペプチドを精製することと、を含み、
前記合成ペプチドが、アミノ酸配列：
Ａｃ－Ｃｙｓ１ Ｃｔｈ２ Ｇｌｕ３ Ｌｅｕ４ Ｃｙｓ５ Ｃｙｓ６ Ａｓｎ７ Ｖａｌ８ Ａｌａ９ Ｃｙｓ１０ Ｔｙｒ１１ Ｇｌｙ１２ Ｃｙｓ１３（配列番号１）を含み、
前記合成ペプチドが、以下：
ａ）Ｃｙｓ１およびＣｙｓ６、
ｂ）Ｃｔｈ２およびＣｙｓ１０、ならびに
ｃ）Ｃｙｓ５およびＣｙｓ１３
のアミノ酸残基間に共有結合を含む。
合成ペプチド、またはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法が本明細書中に記載される。本明細書中に記載される方法は、
（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、Ｃ末端が固相支持体に結合しており、Ｎ末端に保護されたアミン基を有する直鎖ペプチドを化学的に合成することであって、前記直鎖ペプチドが、１またはそれを超えるアミノ酸および／または前記少なくとも１つのポリアミノ酸シントンに保護基を有し、
前記シントンが、少なくとも１つのアセチル化されたアミン基および少なくとも１つのカルボン酸保護基を有する、化学的に合成することと、
（ｉｉ）前記シントンの前記カルボン酸保護基および前記直鎖ペプチドの前記Ｎ末端の前記アミン基からの前記保護基を除去して、保護されていないアミン基および保護されていないカルボン酸基を有する部分的に保護されていない固相支持体結合ペプチドを形成することと、
（ｉｉｉ）前記保護されていないアミン基と前記保護されていないカルボン酸基とをカップリングして、環化固相支持体結合ペプチドを形成することと、
（ｉｖ）前記環化固相支持体結合ペプチドを前記固相支持体から切断して、環化保護されたペプチドを生成することと、
（ｖ）前記環化保護されたペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得ることと、
（ｖｉ）前記全体的に脱保護されたペプチドを折り畳んで、１またはそれを超える追加の架橋を形成して、前記合成ペプチドを得ることと、
（ｖｉｉ）前記合成ペプチドを精製することと、を含み、
前記合成ペプチドが、アミノ酸配列：
Ａｃ－Ｃｙｓ１ Ｃｔｈ２ Ｇｌｕ３ Ｌｅｕ４ Ｃｙｓ５ Ｃｙｓ６ Ａｓｎ７ Ｖａｌ８ Ａｌａ９ Ｃｙｓ１０ Ｔｙｒ１１ Ｇｌｙ１２ Ｃｙｓ１３（配列番号１）を含み、
前記合成ペプチドが、以下：
ａ）Ｃｙｓ１およびＣｙｓ６、
ｂ）Ｃｔｈ２およびＣｙｓ１０、ならびに
ｃ）Ｃｙｓ５およびＣｙｓ１３
のアミノ酸残基間に共有結合を含む。
【0010】
定義
本明細書で使用される場合、「Ｃｔｈ」は、ペプチド結合を形成することができるスキーム１において「１」および「２」と呼ばれる２つのα－アミノカルボキシル基を有するシスタチオニンを表す。
本明細書で使用される場合、「Ｃｔｈ」は、ペプチド結合を形成することができるスキーム１において「１」および「２」と呼ばれる２つのα－アミノカルボキシル基を有するシスタチオニンを表す。
【化1】
【0011】
しかし、ペプチド配列を記述する際の３文字アミノ酸コードの使用を容易にするために、ペプチド配列中の不連続な位置でα－アミノカルボキシル基のそれぞれ（「１」および「２」と呼ばれる）とペプチド結合を形成して環状チオエーテル架橋を作り出することによって環状ペプチド配列を作り出す場合、１位のα－アミノカルボキシル基によって形成されるペプチド結合は「Ｃｔｈ」と呼ばれ、２位のα－アミノカルボキシル基によって形成されるペプチド結合は「Ｃｙｓ」と呼ばれる。更なる詳細については、「合成ペプチド」と題されたセクションを参照されたい。
【0012】
本明細書で使用される場合、「Ｈｃｙ」または「Ｈｃｙｓ」は、スキーム１に示されるホモシステインを表す。スキーム１から分かるように、シスタチオニンは、ホモシステインとシステインとの組み合わせと見なすことができ、これらの側鎖は硫黄原子を共有する。したがって、ペプチド配列中の不連続な位置でシスタチオニンのα－アミノカルボキシル基のそれぞれとペプチド結合を形成することによって作り出される環状ペプチド配列を指定する代替方法は、１位のα－アミノカルボキシル基によって形成されるペプチド結合を「Ｈｃｙ」と表記し、２位のα－アミノカルボキシル基によって形成されるペプチド結合を「Ｃｙｓ」と表記することである。
【0013】
本明細書で使用される場合、他の指示がない限り、「薬学的に許容され得る」は、動物またはヒトにおけるインビボ使用に生物学的または薬理学的に適合性であることを意味し、好ましくは、連邦または州政府の規制当局によって承認されているか、動物、より具体的にはヒトにおける使用のために米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に収載されていることを意味する。
【0014】
本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味し、これは値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例に従って、１標準偏差以内または１標準偏差を超えることを意味することができる。あるいは、組成物に関して「約」は、最大２０％、好ましくは最大１０％の範囲のプラスまたはマイナスを意味することができる。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、ある値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値は、本出願および特許請求の範囲に記載されており、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味する。
【0015】
合成ペプチド
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって産生される合成ペプチドは、Ａｃ－Ｃｙｓ１ Ｃｔｈ２ Ｇｌｕ３ Ｌｅｕ４ Ｃｙｓ５ Ｃｙｓ６ Ａｓｎ７ Ｖａｌ８ Ａｌａ９ Ｃｙｓ１０ Ｔｙｒ１１ Ｇｌｙ１２ Ｃｙｓ１３（配列番号１）として直線的に表すことができ、「Ａｃ」はＮ末端アミン基がアセチル化されていることを示す。
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって産生される合成ペプチドは、Ａｃ－Ｃｙｓ１ Ｃｔｈ２ Ｇｌｕ３ Ｌｅｕ４ Ｃｙｓ５ Ｃｙｓ６ Ａｓｎ７ Ｖａｌ８ Ａｌａ９ Ｃｙｓ１０ Ｔｙｒ１１ Ｇｌｙ１２ Ｃｙｓ１３（配列番号１）として直線的に表すことができ、「Ａｃ」はＮ末端アミン基がアセチル化されていることを示す。
【0016】
配列番号１の合成ペプチドは、２つのジスルフィド結合を形成する４つのシステイン残基と、定義された連結性（Ｃｙｓ１－Ｃｙｓ６，Ｃｙｓ５－Ｃｙｓ１３，Ｃｔｈ２－Ｃｙｓ１０）を有する内部スルフィド（またはチオエーテル）結合を提供するシスタチオン（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｅ）（Ｃｔｈ）単位（側鎖硫黄（sulfure）原子を共有する、ホモシステインとシステインとを組み合わせる）とを含む。
【0017】
本明細書の目的のために、直鎖配列の２つの部分はＣｔｈ２およびＣｙｓ１０と命名され、チオエーテル結合は、硫黄ホモシステイン（Ｈｃｙ）側鎖とｄｅｓ－ＳＨシステイン側鎖の炭素とを接続し、この二重アミノ酸はシスタチオニン（Ｃｔｈ）残基に対応するが、提案された命名は、シスタチオニンの１位のα－アミノカルボキシル基によって形成されるペプチド結合は「Ｃｔｈ」と命名され、２位のα－アミノカルボキシル基によって形成されるペプチド結合を「Ｃｙｓ」と命名される残基の３文字コード指定を使用する場合の説明を容易にする。
【0018】
あるいは、本明細書の目的のため、構成要素の２つの部分をそれぞれ［Ｈｃｙ］および［Ｃｙｓ］と命名することができ、ホモシステイン（Ｈｃｙ）側鎖の硫黄がシステイン（Ｃｙｓ）の側鎖と共有されてチオエーテル架橋を形成し、この二重アミノ酸はシスタチオニン（Ｃｔｈ）残基に対応するが、提案された命名は、残基の３文字コード命名を使用する場合の説明を容易にする。この代替命名法を使用して、配列番号１は以下のように表される：Ａｃ－Ｃｙｓ１ Ｈｃｙ２ Ｇｌｕ３ Ｌｅｕ４ Ｃｙｓ５ Ｃｙｓ６ Ａｓｎ７ Ｖａｌ８ Ａｌａ９ Ｃｙｓ１０ Ｔｙｒ１１ Ｇｌｙ１２ Ｃｙｓ１３（配列番号１）。
【0019】
いくつかの実施形態では、Ｃｔｈ２－Ｃｙｓ１０またはその任意の変形の命名は、以下に示すようにチオエーテル架橋を形成する配列番号１の２つの非連続アミノ酸の側鎖間の連結を説明することを意味する：
【化2】
【0020】
（配列番号１）いくつかの実施形態では、Ｃｔｈ２－Ｃｙｓ１０またはその任意の変形の命名は、合成ペプチドの２位および１０位でペプチド結合を形成し、チオエーテル架橋を形成するシスタチオニンを説明する。
【0021】
いくつかの実施形態では、配列番号１の合成ペプチドは、式：
（配列番号１）
によって表すことができる。
【化3】
によって表すことができる。
【0022】
合成ペプチドを産生する方法
本明細書に記載の方法は、（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、固相支持体に結合したそのＣ末端およびそのＮ末端に保護されたアミン基を有する直鎖ペプチドを化学的に合成することによって始まり、直鎖ペプチドは、１もしくはそれを超えるアミノ酸および／または少なくとも１つのポリアミノ酸シントンに保護基を有する。いくつかの実施形態では、シントンは、アセチル化された少なくとも１つのアミン基および少なくとも１つのカルボン酸保護基を有する。
本明細書に記載の方法は、（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、固相支持体に結合したそのＣ末端およびそのＮ末端に保護されたアミン基を有する直鎖ペプチドを化学的に合成することによって始まり、直鎖ペプチドは、１もしくはそれを超えるアミノ酸および／または少なくとも１つのポリアミノ酸シントンに保護基を有する。いくつかの実施形態では、シントンは、アセチル化された少なくとも１つのアミン基および少なくとも１つのカルボン酸保護基を有する。
【0023】
いくつかの実施形態では、固相支持体は、Ｗａｎｇ樹脂、トリチル樹脂、およびＲｉｎｋ樹脂からなる群から選択される。
【0024】
いくつかの実施形態では、固相支持体は、約０．１０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．２０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．３０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．４０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．５０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．６０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．７０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．８０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．９０ｍｍｏｌ／ｇ、または約１．００ｍｍｏｌ／ｇの充填量を有する。いくつかの実施形態では、固相は、約０．７０ｍｍｏｌ／ｇの充填量を有する。いくつかの実施形態では、固相は、約０．９０ｍｍｏｌ／ｇの充填量を有する。
【0025】
いくつかの実施形態では、ポリアミノ酸シントンは、式：
（式中、Ｐ２は、アミン保護基であり、Ｐ３は、カルボン酸保護基であり、Ｐ４は、チオール保護基である）によって表される化合物である。
【化4】
【0026】
いくつかの実施形態では、保護基は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）、トリチル、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アリル、２，４－ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、アリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）、および２－ピリジン－スルフェニル（Ｐｙｒ）からなる群から選択される。
【0027】
いくつかの実施形態では、アミン保護基Ｐ２は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、およびカルボキシベンジル（Ｃｂｚ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基である。
【0028】
いくつかの実施形態では、カルボン酸保護基Ｐ３は、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アリル、２，４－ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、ベンジル（Ｂｎ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｐ３は、アリル保護基である。
【0029】
いくつかの実施形態では、Ｐ４は、トリチル保護基である。
【0030】
いくつかの実施形態では、ポリアミノ酸シントンのサブユニットは、Ｄ配置を有し、例えば、シントンはＤ－エナンチオマーである。いくつかの実施形態では、Ｄ配置のサブユニットを有するポリアミノ酸シントンは、下記式によって表すことができる。
【化5】
【0031】
いくつかの実施形態では、ポリアミノ酸シントンのサブユニットは、Ｌ配置を有し、例えば、シントンはＬ－エナンチオマーである。いくつかの実施形態では、Ｌ配置のサブユニットを有するポリアミノ酸シントンは、下記式によって表すことができる。
【化6】
【0032】
いくつかの実施形態では、ポリアミノ酸シントンのサブユニットは、Ｄ配置およびＬ配置の両方を有する。
【0033】
いくつかの実施形態では、直鎖ペプチドのアミノ酸側鎖は、保護基を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸側鎖保護基は、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）、トリチル（Ｔｒｔ）、アリル、シクロヘキシル、２－フェニルイソプロピル、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、４－メチルベンジル（４－ＭｅＢｚｌ）、４－メトキシベンジル（４－ＭｅＯＢｚｌ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、ｔｅｒｔ－ブチルチオ（ｔ－ブチオ）、４－メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、キサンチル（Ｘａｎ）、２，６－ジクロロベンジル（２，６－Ｃｌ２Ｂｚｌ）、および２－ブロモベンジルカーボネート（２－ＢｒＺ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸側鎖保護基は、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）またはトリチル（Ｔｒｔ）である。
【0034】
いくつかの実施形態では、側鎖に保護基を有する直鎖ペプチドのアミノ酸側鎖は、配列番号１のＣｙｓ１、Ｇｌｕ３、Ｃｙｓ５、Ｃｙｓ６、Ａｓｎ７、Ｔｙｒ１１、およびＣｙｓ１３である。
【0035】
いくつかの実施形態では、複数のアミノ酸およびシントンは、カルボジイミド媒介反応によって、または非カルボジイミドカップリング剤：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、（２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－５－クロロ－ヘキサフルオロホスフェート（１－）、３－オキシド（ＨＣＴＵ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、またはプロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）によって媒介される反応によって結合されて、工程（ｉ）の直鎖ペプチドを形成する。
【0036】
いくつかの実施形態では、複数のペプチドおよび／またはシントン由来の少なくとも１つのアミノ酸は、カルボジイミド媒介反応によって結合されて、工程（ｉ）の直鎖ペプチドを形成する。いくつかの実施形態では、カルボジイミドは、ジイソプロピルカルボキシイミド（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｘｉｉｍｉｄｅ）（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、カルボジイミドは、ＤＩＣである。
【0037】
いくつかの実施形態では、カルボジイミド媒介反応は、酸化防止剤を更に含む。いくつかの実施形態では、酸化防止剤は、可溶性チオウレアまたはチオール化合物である。いくつかの実施形態では、酸化防止剤は、１，３－ジイソプロピル－２チオウレア（ＤＩＴＵ）またはジチオスレイトールである。
【0038】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸を、非カルボジイミドカップリング剤によって結合する。いくつかの実施形態では、環化カップリング反応は、非カルボジイミドカップリング剤によって媒介される。いくつかの実施形態では、環化カップリング反応で使用される非カルボジイミドカップリング剤は、ＨＡＴＵである。
【0039】
工程（ｉ）の直鎖ペプチドは、本出願では「直鎖１３ｍｅｒ」と呼ばれる場合があり、下記式：
（配列番号２）によって表すことができ、式中、シスタチオニンチオエーテル側鎖架橋（－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｓ－ＣＨ２－）は、
で表される。いくつかの実施形態では、下線を引いた１またはそれを超えるアミノ酸の側鎖が保護されている。いくつかの実施形態では、下線を引いた全てのアミノ酸の側鎖が保護されている。
【化7】
【化8】
【0040】
直鎖ペプチドが形成された後、（ｉｉ）シントンのカルボン酸保護基および直鎖ペプチドのＮ末端のアミン基からの保護基を除去して、保護されていないアミン基および保護されていないカルボン酸基を有する部分的に保護されていない固相支持結合ペプチドを形成する。いくつかの実施形態では、脱保護は、ＤＭＦ中のＰｄ（ＰＰｈ３）４および１，３－ＤＭＢＡを用いて達成される。
【0041】
いくつかの実施形態では、部分的に保護されていない固相支持体結合ペプチドは、下記式によって表され得る：
【化9】
【0042】
（配列番号３）部分的な脱保護に続いて、（ｉｉｉ）保護されていないアミン基と保護されていないカルボン酸基とを結合させて、環化固相支持体結合ペプチドを形成する。
【0043】
いくつかの実施形態では、環化固相支持体結合ペプチドは、下記式によって表され得る：
【化10】
【0044】
（配列番号４）環化固相支持体結合ペプチドは、（ｉｖ）固相支持体から切断されて、環化保護されたペプチドを生成する。
【0045】
いくつかの実施形態では、直鎖ペプチドは、希酸性処理によって樹脂から切断される。いくつかの実施形態では、希酸性処理は、側鎖保護基およびポリアミノ酸シントンの保護基を保存する。いくつかの実施形態では、希酸性処理は、弱酸溶液、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である。いくつかの実施形態では、希酸溶液はトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液である。いくつかの実施形態では、希酸溶液は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液中の１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である。
【0046】
環化保護されたペプチドが樹脂から切断されると、ペプチドは、（ｖ）全体的に脱保護されて、全体的に脱保護されたペプチドが得られる。いくつかの実施形態では、全体的な脱保護工程（ｖ）は、少なくともヨウ化アンモニウム（ＮＨ４Ｉ）を含むカクテルの添加を含む。いくつかの実施形態では、全体的な脱保護工程（ｖ）は、少なくともヨウ化アンモニウム（ＮＨ４Ｉ）およびトリイソプロピルシランを含むカクテルの添加を含む。
【0047】
環化ペプチドが全体的に脱保護されると、ペプチドは、（ｖｉ）折り畳まれて１またはそれを超える追加の架橋を形成し、Ａｃ－Ｃｙｓ１ Ｃｔｈ２ Ｇｌｕ３ Ｌｅｕ４ Ｃｙｓ５ Ｃｙｓ６ Ａｓｎ７ Ｖａｌ８ Ａｌａ９ Ｃｙｓ１０ Ｔｙｒ１１ Ｇｌｙ１２ Ｃｙｓ１３（配列番号１）の合成ペプチドを得る。
【0048】
本明細書で使用される場合、「折り畳み」および「酸化」は、折り畳みが配列番号１のシステイン残基の酸化を介して達成されるのと同じ工程を指し得る。いくつかの実施形態では、折り畳み工程（ｖｉ）は、ヨウ素媒介酸化またはアルカリ媒介酸化によって達成される。いくつかの実施形態では、アルカリ媒介酸化は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）媒介酸化またはＮ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）媒介酸化である。
【0049】
いくつかの実施形態では、合成ペプチドは、合成ペプチドの以下のアミノ酸残基：Ｃｙｓ１とＣｙｓ６、Ｃｔｈ２とＣｙｓ１０、およびＣｙｓ５とＣｙｓ１３の間の共有結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｙｓ１とＣｙｓ６およびＣｙｓ５とＣｙｓ１３との間の共有結合は、ジスルフィド結合である。いくつかの実施形態では、Ｃｔｈ２とＣｙｓ１０との間の共有結合はチオエーテル結合である。
【0050】
全体的に脱保護されたペプチドのフォールディングに続いて、配列番号１の合成ペプチドを精製する。
【0051】
いくつかの実施形態では、配列番号１の合成ペプチドは、下記式：
（配列番号１）
によって表すことができる。
【化11】
によって表すことができる。
【0052】
また本明細書中に記載されるのは、式Ｉ：
の合成ペプチドを調製する方法であり、この方法は、
（ｉ）保護されたアミノ酸側鎖を有するＣ末端樹脂結合Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓペプチドを式ＩＩ：
（式中、
Ｐ２は、アミン保護基であり、
Ｐ３は、カルボン酸保護基であり、
Ｐ４は、チオール保護基である）
のポリアミノ酸シントンにカップリングして、式ＩＩＩ：
の樹脂結合ペプチドを形成することと、
（ｉｉ）式ＩＩＩのＰ２保護基を除去して、保護されていないアミン基を有する式ＩＶ：
の樹脂結合ペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）式ＩＶの遊離アミン基を介してＰ２－アラニンを式ＩＶの前記樹脂結合ペプチドにカップリングして、式Ｖ：
の樹脂結合ペプチドを形成することと、
（ｉｖ）式ＶのＰ２保護基を除去して遊離アミン基を得て、続いて前記遊離アミン基をＰ２－アミノ酸にカップリングすることであって、
このアミノ酸の側鎖が、保護されていてもよい、カップリングすることと、
（ｖ）工程（ｉｖ）を更に５回繰り返して、式ＶＩ：
の樹脂結合ペプチドを形成することであって、
少なくとも１つのアミノ酸側鎖が、保護されている、形成することと、
（ｖｉ）前記Ｐ２保護基および前記Ｐ３保護基を除去して、遊離アミン基および遊離カルボン酸基を得ることと、
（ｖｉｉ）前記遊離アミン基と前記遊離カルボン酸基とをカップリングして、式ＶＩＩ：
の環化ペプチドを得ることと、
（ｖｉｉｉ）式ＶＩＩの前記ペプチドを前記樹脂から切断して、環化ペプチドを得ることと、
（ｉｘ）前記環化ペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得ることと、
（ｘ）２つのジスルフィド結合を形成することによって、前記全体的に脱保護されたペプチドを折り畳み、式Ｉの前記合成ペプチドを得ることと、を含む。
【化12】
（ｉ）保護されたアミノ酸側鎖を有するＣ末端樹脂結合Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓペプチドを式ＩＩ：
【化13】
Ｐ２は、アミン保護基であり、
Ｐ３は、カルボン酸保護基であり、
Ｐ４は、チオール保護基である）
のポリアミノ酸シントンにカップリングして、式ＩＩＩ：
【化14】
（ｉｉ）式ＩＩＩのＰ２保護基を除去して、保護されていないアミン基を有する式ＩＶ：
【化15】
（ｉｉｉ）式ＩＶの遊離アミン基を介してＰ２－アラニンを式ＩＶの前記樹脂結合ペプチドにカップリングして、式Ｖ：
【化16】
（ｉｖ）式ＶのＰ２保護基を除去して遊離アミン基を得て、続いて前記遊離アミン基をＰ２－アミノ酸にカップリングすることであって、
このアミノ酸の側鎖が、保護されていてもよい、カップリングすることと、
（ｖ）工程（ｉｖ）を更に５回繰り返して、式ＶＩ：
【化17】
少なくとも１つのアミノ酸側鎖が、保護されている、形成することと、
（ｖｉ）前記Ｐ２保護基および前記Ｐ３保護基を除去して、遊離アミン基および遊離カルボン酸基を得ることと、
（ｖｉｉ）前記遊離アミン基と前記遊離カルボン酸基とをカップリングして、式ＶＩＩ：
【化18】
（ｖｉｉｉ）式ＶＩＩの前記ペプチドを前記樹脂から切断して、環化ペプチドを得ることと、
（ｉｘ）前記環化ペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得ることと、
（ｘ）２つのジスルフィド結合を形成することによって、前記全体的に脱保護されたペプチドを折り畳み、式Ｉの前記合成ペプチドを得ることと、を含む。
【0053】
いくつかの実施形態では、式ＶＩのＧｌｕ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｙおよびＣｙｓ残基は、側鎖保護基を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸側鎖保護基は、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）、トリチル（Ｔｒｔ）、アリル（Ａｌｌ）、シクロヘキシル、２－フェニルイソプロピル、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、４－メチルベンジル（４－ＭｅＢｚｌ）、４－メトキシベンジル（４－ＭｅＯＢｚｌ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、ｔｅｒｔ－ブチルチオ（ｔ－ブチオ）、４－メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、キサンチル（Ｘａｎ）、２，６－ジクロロベンジル（２，６－Ｃｌ２Ｂｚｌ）、および２－ブロモベンジルカーボネート（２－ＢｒＺ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸側鎖保護基は、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）またはトリチル（Ｔｒｔ）である。
【0054】
いくつかの実施形態では、Ｐ２は、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）、およびアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択される保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ２は、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基である。
【0055】
いくつかの実施形態では、Ｐ３は、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アリル（Ａｌｌ）、トリチル、２，４－ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、およびベンジル（Ｂｎ）からなる群から選択される保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ３は、アリル（Ａｌｌ）保護基である。
【0056】
いくつかの実施形態では、Ｐ４は、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔ－Ｂｕｔ）、３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）、２－ピリジン－スルフェニル（Ｐｙｒ）、およびトリチル（Ｔｒｔ）からなる群から選択される保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ４は、トリチル保護基である。
【実施例】
【0057】
以下の実施例は、本発明の単なる例示であり、本発明に包含される多くの変形および均等物が本開示を読むと当業者に明らかになることから、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【0058】
略語
ＡＡ： アミノ酸
ＡＡＡ： アミノ酸分析
Ａｃ： アセチル
ＡｃＯＨ： 酢酸
Ａｌｌまたはアリル： ２－プロペニル
ＡＰＩ： 活性医薬成分
ＢＢ： 以下の構造を有する（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ１０＊［Ａｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｈｃｙｓ（Ｓ＊）－ＯＡｌｌ］－ＯＨ）：
Ｃ１８： シリカゲルＣ１８
ＤＢＵ： １，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン
ＤＩＣ： ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ： ジイソプロピルエチルアミン
ＤＩＴＵ： １，３－ジイソプロピル－２－チオウレア（1,3-Diisopropy1-2-thiourea）
１，３－ＤＭＢＡ： １，３－ジメチルバルビツール酸
ＤＭＦ： Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ： ジチオスレイトール
ＥｔＯＨ： エタノール
ｅｑ： 当量
Ｆｍｏｃ： ９－フルオレニルメトキシカルボニル
ＧＣ： ガスクロマトグラフィー
ＧＳＨ／ＧＳＳＧ： グルタチオン（ｒｅｄ．／ｏｘ．）
ＨＡＴＵ： １Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム，１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－，３－オキシド，ヘキサフルオロホスフェート（１－）（１：１）
ＨＤＰＥ： 高密度ポリエチレン
ＨＰＬＣ： 高速液体クロマトグラフィー
ＩＰＡ： イソプロパノール
ＬＣ： 液体クロマトグラフィー
ＭｅＣＮ： アセトニトリル
ＭｅＯＨ： メタノール
ＭＴＢＥ： メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＭＳ： 質量分析
Ｍｗ： 分子量
ＮＨ４ＯＡｃ： 酢酸アンモニウム
ＮＭＭ： Ｎ－メチルモルホリン
ＮＭＰ： Ｎ－メチルピロリドン
ＮＭＲ： 核磁気共鳴
Ｏｘｙｍａ： （ヒドロキシイミノ）シアノ酢酸エチル
ＰＰｈ３： トリフェニルホスフィン
ＳＥＣ ： サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＰＰＳ： 固相ペプチド合成
ｔＢｕ： ｔｅｒｔ－ブチル
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
Ｔｈｚ： チアゾリジン
Ｔｈｚ（Ｍｅ）２： ２，２－ジメチルチアゾリジン
ＴＩＳ： トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ： トリフェニルメチル
Ｔｒｔ－Ｈ： トリフェニルメタン
ＵＶ： 紫外線
ＡＡ： アミノ酸
ＡＡＡ： アミノ酸分析
Ａｃ： アセチル
ＡｃＯＨ： 酢酸
Ａｌｌまたはアリル： ２－プロペニル
ＡＰＩ： 活性医薬成分
ＢＢ： 以下の構造を有する（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ１０＊［Ａｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｈｃｙｓ（Ｓ＊）－ＯＡｌｌ］－ＯＨ）：
【化19】
ＤＢＵ： １，８－ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ－７－エン
ＤＩＣ： ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ： ジイソプロピルエチルアミン
ＤＩＴＵ： １，３－ジイソプロピル－２－チオウレア（1,3-Diisopropy1-2-thiourea）
１，３－ＤＭＢＡ： １，３－ジメチルバルビツール酸
ＤＭＦ： Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ： ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ： ジチオスレイトール
ＥｔＯＨ： エタノール
ｅｑ： 当量
Ｆｍｏｃ： ９－フルオレニルメトキシカルボニル
ＧＣ： ガスクロマトグラフィー
ＧＳＨ／ＧＳＳＧ： グルタチオン（ｒｅｄ．／ｏｘ．）
ＨＡＴＵ： １Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム，１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－，３－オキシド，ヘキサフルオロホスフェート（１－）（１：１）
ＨＤＰＥ： 高密度ポリエチレン
ＨＰＬＣ： 高速液体クロマトグラフィー
ＩＰＡ： イソプロパノール
ＬＣ： 液体クロマトグラフィー
ＭｅＣＮ： アセトニトリル
ＭｅＯＨ： メタノール
ＭＴＢＥ： メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル
ＭＳ： 質量分析
Ｍｗ： 分子量
ＮＨ４ＯＡｃ： 酢酸アンモニウム
ＮＭＭ： Ｎ－メチルモルホリン
ＮＭＰ： Ｎ－メチルピロリドン
ＮＭＲ： 核磁気共鳴
Ｏｘｙｍａ： （ヒドロキシイミノ）シアノ酢酸エチル
ＰＰｈ３： トリフェニルホスフィン
ＳＥＣ ： サイズ排除クロマトグラフィー
ＳＰＰＳ： 固相ペプチド合成
ｔＢｕ： ｔｅｒｔ－ブチル
ＴＦＡ： トリフルオロ酢酸
Ｔｈｚ： チアゾリジン
Ｔｈｚ（Ｍｅ）２： ２，２－ジメチルチアゾリジン
ＴＩＳ： トリイソプロピルシラン
Ｔｒｔ： トリフェニルメチル
Ｔｒｔ－Ｈ： トリフェニルメタン
ＵＶ： 紫外線
【0059】
実施例１
配列番号１の合成ペプチドの製造プロセス
配列番号１のペプチドまたはその薬学的に許容され得る塩は、医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）の規制に従って製造された。
配列番号１の合成ペプチドの製造プロセス
配列番号１のペプチドまたはその薬学的に許容され得る塩は、医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）の規制に従って製造された。
【0060】
材料
ＨＰＬＣ分析用のＦｍｏｃ－Ｄ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（＞９７．０％、ＨＰＬＣ）およびＴＦＡ（＞９９．０％、ＨＰＬＣ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｆｍｏｃ－Ｔｈｚ－ＯＨ（９９．６％、ＨＰＬＣ）およびＦｍｏｃ－Ｔｈｚ（Ｍｅ）２－ＯＨ（＞９９．３％、ＨＰＬＣ；９９．７％ｅｅ）は、ＰｅｐＴｅｃｈから入手した。ＢＢ（＞９８．５％、ＨＰＬＣ）をカスタム合成した。ＢＢ、Ｌ－エナンチオマーの同一性をＮＭＲおよびキラル分析によって確認した。Ｍｏｌｅｋｕｌａ製のＤＩＴＵ、Ｒｉｅｄｅｌ－ｄｅ Ｈａｈｎ製のＤＭＳＯ（ｐａ）、およびＭｅｒｃｋ製のＯ－メチルヒドロキシルアミン塩酸塩を使用した。ＧＳＨおよびＧＳＳＧはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。他の全ての試薬、アミノ酸誘導体、２－ＣＴＣ樹脂および溶媒を保管庫から入手した。全ての材料を受け取ったまま使用した。精製水を使用した。
ＨＰＬＣ分析用のＦｍｏｃ－Ｄ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（＞９７．０％、ＨＰＬＣ）およびＴＦＡ（＞９９．０％、ＨＰＬＣ）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。Ｆｍｏｃ－Ｔｈｚ－ＯＨ（９９．６％、ＨＰＬＣ）およびＦｍｏｃ－Ｔｈｚ（Ｍｅ）２－ＯＨ（＞９９．３％、ＨＰＬＣ；９９．７％ｅｅ）は、ＰｅｐＴｅｃｈから入手した。ＢＢ（＞９８．５％、ＨＰＬＣ）をカスタム合成した。ＢＢ、Ｌ－エナンチオマーの同一性をＮＭＲおよびキラル分析によって確認した。Ｍｏｌｅｋｕｌａ製のＤＩＴＵ、Ｒｉｅｄｅｌ－ｄｅ Ｈａｈｎ製のＤＭＳＯ（ｐａ）、およびＭｅｒｃｋ製のＯ－メチルヒドロキシルアミン塩酸塩を使用した。ＧＳＨおよびＧＳＳＧはＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。他の全ての試薬、アミノ酸誘導体、２－ＣＴＣ樹脂および溶媒を保管庫から入手した。全ての材料を受け取ったまま使用した。精製水を使用した。
【0061】
機器
合成機器
合成機器
【0062】
小規模のＳＰＰＳおよび切断／脱保護のために、フィルタを備えた特別な栓付きシリンジを使用した。それらの内容物を含むシリンジを周囲温度（２０～２５℃）で、自動で振盪した。
【0063】
より大規模なＳＰＰＳは、オーバーヘッド撹拌器を備えたジャケット付き反応器を利用した。クライオスタット（Ｊｕｌａｂｏ）を備えたジャケット付き反応器内で温度を制御した。
【0064】
５ｇ超のペプチド樹脂から出発する切断／脱保護をガラス製品または密閉ＨＤＰＥ瓶内で行った。
【0065】
ヨウ素媒介酸化（ジスルフィド形成）を、シリンジポンプおよび適切なＴＥＦＬＯＮ（登録商標）管を用いて行った。
【0066】
そうでなければ、標準的な実験室機器／器具を合成作業に使用した。
【0067】
時折、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心分離機（３７５０～４０００ｒｐｍ、１０分）を切断された／脱保護されたペプチドの小規模沈殿のために使用した。
【0068】
分析機器
【0069】
ＨＰＬＣは、ＸＳｅｌｅｃｔペプチド１３０Ａ １５０×４．６ｍｍ ２．５μカラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔシステムを用いて３０℃で実行した。移動相Ａ：０．１ ％ＴＦＡ（水溶液）；移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡ（ＭｅＣＮ）
【0070】
ＬＣ／ＭＳは、ＥＳＩ Ｔｈｅｒｍｏ Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＭＳ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒに接続されたＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｖａｎｑｕｉｓｈ Ｈｏｒｉｚｏｎ ＵＨＰＬＣの同じカラムを使用した。ＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎソフトウェアをＨＰＬＣ／ＭＳ評価に使用した。
【0071】
キラルＡＡＡを、Ｃ．Ａ．Ｔ．ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｅおよびＡｎａｌｙｓｅｎｔｅｃｈｎｉｋ ＫＧ（ドイツ国チュービンゲン）で作製した。
【0072】
ＮＭＲ分析は、ＲＥＤ ＧＬＥＡＤ ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ ＡＢ（Ｍｅｄｉｃｏｎ Ｖｉｌｌａｇｅ、スウェーデン国ルンド２２３ ８１）によって行った。
【0073】
ペプチド合成
ＳＰＰＳ
ＳＰＰＳ
【0074】
図１は、固体に結合した１３ｍｅｒのＳＰＰＳ合成のフロー図を示す。
【0075】
標準的なプロトコルを使用した。乾燥後、全てのペプチド樹脂を冷凍庫で保存した。
【0076】
Ｌ－Ｈ－Ｃｙｓ－２－ＣＴ樹脂またはＤ－Ｈ－Ｃｙｓ－２－ＣＴ樹脂
【0077】
Ｌ－ＣｙｓまたはＤ－Ｃｙｓを、ガラスフィルタを備えたＳＰＰＳ反応器内で２０～２５℃で約５時間、２－ＣＴＣ樹脂に結合させ、樹脂上の残っている結合部位をメタノールでキャップした。排出／洗浄後、ＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで処理することによって（２×１０分）Ｆｍｏｃ基を除去した。ピペリジンの除去を示すクロラニル試験陰性まで樹脂をＤＭＦで洗浄し、次いでイソプロパノールで洗浄し、最後に２０～２５℃で１～２日間真空乾燥した。
Ｌ－Ｈ－Ｃｙｓ－２－ＣＴ樹脂；１０２．０ｇ、０．４２ｍｍｏｌ／ｇ（トリフェニルメタン）
Ｄ－Ｈ－Ｃｙｓ－２－ＣＴ樹脂；１４．５ｇ、０．４０ｍｍｏｌ／ｇ（トリフェニルメタン）
Ｌ－Ｈ－Ｃｙｓ－２－ＣＴ樹脂；１０２．０ｇ、０．４２ｍｍｏｌ／ｇ（トリフェニルメタン）
Ｄ－Ｈ－Ｃｙｓ－２－ＣＴ樹脂；１４．５ｇ、０．４０ｍｍｏｌ／ｇ（トリフェニルメタン）
【0078】
Ｆｍｏｃ（７－１３）－２－ＣＴ樹脂
【0079】
Ｌ－Ｃｙｓ１３バージョンでは、ジャケット付き反応器を使用した。Ｄ－Ｃｙｓ１３の場合、２０℃（Ｔジャケット）、２０～２５℃で反応を行った。
【0080】
カップリングは、ＤＭＦ中またはＮＭＰ中のいずれかで行った。Ｃｙｓ１３充填量に対して、ＢＢ（１．５当量）を除いて、約２．０当量のＡＡ誘導体を使用した。約２．２当量のＯｘｙｍａ／ＤＩＣ、および約０．２当量。ＤＩＴＵを使用した。グリシンを１時間事前活性化した。追加のＤＩＣ（約２．２当量）を、概して、しばらくしてから加えた。総カップリング時間は、一般に２～３時間であり、ＢＢについては約５時間であった。
【0081】
グリシンを事前活性化してＧｌｙカップリングを加速し、したがってわずかに酸性のＯｘｙｍａまたはアミノ酸による酸感受性２－ＣＴ樹脂からのＣｙｓの意図しない脱離を回避し、ｅｎｄｏ－Ｃｙｓおよびｄｅｓ－Ｃｙｓを潜在的にもたらした。
【0082】
各カップリング後、反応器を空にし、樹脂をＤＭＦで洗浄した。合成を一晩休止した場合に、ペプチド樹脂を反応器中で保存した（５～１０℃）。操作温度を上昇させた後、合成を続けた。
【0083】
ＤＭＦ中２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンで処理することによって（２×１０分）Ｆｍｏｃ基を除去し、クロラニル試験で陰性になるまで樹脂を十分に洗浄し、これは、ピペリジンの完全な除去を示した。
【0084】
配列が完成したら、ＤＭＦおよびイソプロパノールで洗浄した。次いで、樹脂を２０～２５℃で１～２日間真空乾燥した。
【0085】
シス誘導性配座による環化を促進するために、Ｃｙｓ（５または６）の１つをシュードプロリンとして組み込んだ。選択される適切な誘導体は、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｔｈｚ－ＯＨ（ＣＡＳ番号［１３３０５４－２１－４］）およびＦｍｏｃ－Ｌ－Ｔｈｚ（Ｍｅ２）－ＯＨ（ＣＡＳ番号［８７３８４２－０６－９］）であり得る。Ｔｈｚは、６位もしくは５位、または両方の位置でＣｙｓ（Ｔｒｔ）を置換することができた。したがって、４つの異なるＦｍｏｃ（３－１３）－２－ＣＴ樹脂ペプチドを以下に示すように合成した：
理論製品重量に基づく収率。
【化20】
【0086】
閉環／ラクタム化
【0087】
Ｆｍｏｃ（３－１３）－２－ＣＴ樹脂をシリンジ内で、ＤＭＦで膨潤させた。排出後、Ｆｍｏｃを２０％ピペリジンで除去した（＞１０分＋＞２０分）。クロラニル試験が陰性になるまで樹脂を十分に洗浄した。Ｈｃｙｓのアリルエステルを、ＤＭＦ中約１０ｍｏｌ％のＰｄ（ＰＰｈ３）４および約１０当量の１，３－ＤＭＢＡを用いて一晩酸に変換した。樹脂を排出し、ＤＭＦで洗浄し、約２当量のＨＡＴＵおよび２．７当量のＮＭＭで閉環した。Ｋａｉｓｅｒ試験は、４～５時間以内に完全な反応を示した。上記のようにして最終的な洗浄および乾燥を行った。
【0088】
切断／脱保護
【0089】
分析スケールの切断／脱保護は、シリンジ内で以下に記載されるように行った。ＴＦＡ溶液を氷冷（－１８℃）ジエチルエーテルに濾過した。沈殿物を遠心分離し、上清をデカントし、残渣をジエチルエーテルで磨砕し、固体を再度遠心分離した。
【0090】
分取スケール（Ａｃ－Ｃｙｓ（Ｈ）－Ｈｃｙｓ（Ｓ１－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ（Ｈ）－Ｃｙｓ（Ｈ）－Ａｓｎ－Ｖａｌ－Ａｌａ－Ｃｙｓ＊－Ｔｙｒ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｈ）－ＯＨ）：
閉環ペプチド樹脂Ｃｙｓ５および６（Ｔｒｔ）（５．４１ｇ）を、１．８ｇのＤＴＴ、１．７ｇのＮＨ４Ｉ、４．５ｍＬのＴＩＳ、１．８ｍＬの水および５０ｍＬのＴＦＡと混合した。混合物を３時間撹拌した。樹脂を濾別し、２×１５ｍＬのＴＦＡで洗浄した。合わせた濾液を冷却し（１０℃）、氷冷（－１８℃）ジエチルエーテル（３６０ｍＬ）を撹拌しながら１０～１５分間（Ｔ．２３℃）少しずつ添加した。撹拌を０℃で約５分間続けた。固体を濾過し（１６～４０μｍ）、ジエチルエーテル（２×１００ｍＬ）で洗浄した。次いで、これを２０～２５℃で２日間真空乾燥した。これにより、粗環状ペプチド（遊離－ＳＨ）１．８０ｇが得られた。
閉環ペプチド樹脂Ｃｙｓ５および６（Ｔｒｔ）（５．４１ｇ）を、１．８ｇのＤＴＴ、１．７ｇのＮＨ４Ｉ、４．５ｍＬのＴＩＳ、１．８ｍＬの水および５０ｍＬのＴＦＡと混合した。混合物を３時間撹拌した。樹脂を濾別し、２×１５ｍＬのＴＦＡで洗浄した。合わせた濾液を冷却し（１０℃）、氷冷（－１８℃）ジエチルエーテル（３６０ｍＬ）を撹拌しながら１０～１５分間（Ｔ．２３℃）少しずつ添加した。撹拌を０℃で約５分間続けた。固体を濾過し（１６～４０μｍ）、ジエチルエーテル（２×１００ｍＬ）で洗浄した。次いで、これを２０～２５℃で２日間真空乾燥した。これにより、粗環状ペプチド（遊離－ＳＨ）１．８０ｇが得られた。
【0091】
酸化（Ｓ－Ｓ架橋の形成）
【0092】
これらの実験は、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＢＢ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－２ＣＴＣ－樹脂から得られた粗環状ペプチド（遊離－ＳＨ）を用いて行った。全ての酸化は２０～２５℃で行った。
【0093】
ヨウ素酸化
【0094】
粗環化ペプチドのＤＭＳＯ中溶液（１０ｇ／Ｌ）を作製した。溶液を２０％ＭｅＣＮ（水溶液）で１０倍希釈すると、わずかに濁った（ｐＨ約４）。この溶液に、ヨウ素を含むＭｅＣＮ（１％ｗ／ｖ）を、黄色／褐色が持続するまで約１時間かけて滴下添加した。ヨウ素を水性アスコルビン酸（０．５Ｍ）でクエンチした。３．５％ＮＨ３（水溶液）を用いてｐＨを７～７．５に上げた。ＧＳＨ／ＧＳＳＧを異なる時点で添加した（１～３．５ｍＭ）。
【0095】
ＤＭＳＯ酸化
【0096】
透明な溶液を、ＤＭＳＯを用いて作製した。これらを水（ｐＨ約４）で３０％ＤＭＳＯに希釈して、１～３．３ｇ／Ｌの濃度にした。このわずかに濁った混合物を６０℃で撹拌するか、または３．５％ＮＨ３（水溶液）でｐＨを７．５～８に調整した。後者のｐＨで、溶液は再び完全に透明になった。必要に応じて、ＧＳＨ／ＧＳＳＧを添加した。
【0097】
ＮＭＰ酸化
【0098】
０．５ｇ粗製物／ｍｌ ＮＭＰの透明溶液を作製した。
【0099】
結果および考察
Ｈ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－２－ＣＴ樹脂およびＦｍｏｃ（７－１３）－２－ＣＴ樹脂
Ｈ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－２－ＣＴ樹脂およびＦｍｏｃ（７－１３）－２－ＣＴ樹脂
【0100】
０．５ｍｍｏｌ／ｇ樹脂のＣｙｓ充填量を目標とした。Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨの消費に続いて反応溶液のＨＰＬＣを行った。約０．６ｍｍｏｌ／ｇに相当する５４ｍｍｏｌが組み込まれた段階（約５時間）で、洗浄することによって反応を中断した。充填量は、０．４２ｍｍｏｌ／ｇであることが分かった。
【0101】
このＣｙｓ樹脂から、本発明者らは中間体Ｆｍｏｃ（７－１３）樹脂を作製し、これは樹脂の閉環について提案された（３－１３）候補全てに共通である。
【0102】
Ｆｍｏｃ充填量（０．１９９ｍｍｏｌ／ｇ）に基づいて、Ｆｍｏｃ（７－１３）－２－ＣＴ樹脂（６１．９ｇ）の収率は８１．６％であった。側鎖保護なしの切断されたＦｍｏｃ（７－１３）ＯＨの純度は、（ＨＰＬＣによって測定する場合）約８５％であった。
【0103】
いくつかのペプチドは、２－ＣＴへのエステル結合が酸に感受性であるため、わずかに酸性のＯｘｙｍａの長期作用によって切断される可能性がある。ＤＭＦ中約３当量のＯｘｙｍａでＦｍｏｃ（７－１３）－２－ＣＴ樹脂を２１時間（２０～２５℃）処理したが、ペプチドの損失は生じなかった。
【0104】
ＤＭＦを全体を通して使用したが、カップリングを行う場合にＮＭＰも試験した。後者の溶媒は改善をもたらさなかった。
【0105】
Ｄ－Ｈ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－２－ＣＴ樹脂（０．４０ｍｍｏｌ／ｇ）および［Ｄ－Ｈ－Ｃｙｓ１３（Ｔｒｔ）］Ｆｍｏｃ（７－１３）－２－ＣＴ樹脂（０．１７５ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ｌ－Ｃｙｓ１３バージョンと同じ方法で作製した。
【0106】
Ｆｍｏｃ（３－１３）－２－ＣＴ樹脂
【0107】
Ｆｍｏｃ（３－１３）－２－ＣＴペプチドのシリンジ合成を、それぞれ７．５ｇのＦｍｏｃ（７－１３）樹脂から行った。Ｏｘｙｍａ／ＤＩＣを用いて３～５時間カップリングを行い、およそ２時間後に追加のＤＩＣを加えた。
理論製品重量に基づく収率。
【化21】
【0108】
最終的な洗浄／乾燥の後、小さな試料を切断／脱保護し、更なる分析に供した。５位および６位の両方でＣｙｓ（Ｔｒｔ）を使用して最良の結果が認められた。既に組み込まれたＴｈｚへのカップリングはより遅かった（４～５時間）。Ｔｈｚ（Ｍｅ）２バリアントは、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｌｅｕを欠く。
【0109】
Ｈ－Ｔｈｚ（Ｍｅ２）５－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＢＢ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－２－ＣＴ樹脂のカップリング継続に対する抵抗（ｒｅｌｕｃｔａｎｃｅ）を克服するために、これを再びＤＭＦ中で膨潤させ、ＨＡＴＵ／ＮＭＭおよびＦｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨで３０℃にて一晩処理した。活性化Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＡｔが形成され、ヒンダードアミンに対してより反応性であると考えられる。残念ながら、これは成功しなかった。
【0110】
ベースラインＦｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－Ｌｅｕ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｖａｌ－Ａｌａ－ＢＢ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－２ＣＴ樹脂の推定収率は、Ｈ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－２－ＣＴ樹脂と比較して（Ｆｍｏｃ充填量ならびに（７－１３）および（３－１３）中間体の純度に基づいて）４８％であった。
【0111】
樹脂上の閉環（ラクタム化）
【0112】
環化は、最初に（３－１３）樹脂からＦｍｏｃを除去し、続いてＨｃｙｓのＰｄ触媒脱アリル化およびＨＡＴＵ支援環化（－Ｈｃｙ－ＯＨのＨ－Ｇｌｕ－へのカップリング）を４～５時間行うことによって行った。反応工程は、以下の樹脂を用いて行った：
【化22】
【0113】
ａｌｌ－Ｌ類似体の中で、ベースライン樹脂は最も純粋なラクタムをもたらしたが、Ｋａｉｓｅｒ試験は環化速度の大きな差を示さなかった。不完全なカップリングのために、直鎖Ｔｈｚ樹脂の純度はベースライン樹脂と比較して幾分低かったことを想起されたい。
【0114】
ベースライン樹脂の推定収率は、Ｆｍｏｃ／Ｔｒｔ充填量および（７－１３）、（３－１３）および（１－１３）中間体の純度に基づいて、３２％（Ｈ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－２－ＣＴ樹脂に対して）であった。
【0115】
ベースライン樹脂（５．４１ｇ）から、環化し、続いて切断／脱保護／沈殿すると、以下に示すラクタムが１．８０ｇの量で得られた。
【化23】
【0116】
ベースラインラクタム中のＤ－Ｃｙｓの測定された含有量は、Ｃｙｓ１３のエピマー化が少なくともあまり顕著ではないことを示す。
【0117】
酸化（Ｓ－Ｓ架橋の形成）
【0118】
酸化が最後の工程である。
【0119】
ベースラインＡｃ（１－１３）－ＯＨ環化生成物は、ＨＰＬＣ分析のためにＤＭＦに十分に可溶性であるが、１０ｇ／Ｌ溶液を作製することは困難であるようである。これは、ＭｅＣＮ、２０～８０％ＭｅＣＮ（ＡｃＯＨを含むまたは含まない水溶液）、純正のＡｃＯＨ、２５％ＡｃＯＨ（水溶液）、水、ＥｔＯＨおよびＭｅＯＨに非常に不溶性のようである。これはＤＭＳＯに非常に可溶性であり、溶液は５～１０℃、更には２５℃で数日間（ＨＰＬＣ）維持した場合に安定である。２０％ＭｅＣＮ（水溶液）で１０倍希釈すると、得られた混合物がいくらか濁る（hazens）が、濾過の際のペプチド損失はなかった（ＨＰＬＣ）。それは、ＮＭＰ（１０ｇ／Ｌ）には容易に溶解するが、すぐに反応する。
【0120】
アルカリ性ＤＭＳＯ酸化は、最も簡単な方法であった。粗濃度を３ｇ／Ｌから１ｇ／Ｌに低下させると、実質的に同じ結果が得られ、３ｇ／Ｌ実験と比較して純度の増加は観察されなかった。粗ラクタムの濃度に関係なく、折り畳み時間を１日から２日に延長してもＨＰＬＣプロファイルに変化はなかった。
【0121】
ＧＳＨ／ＧＳＳＧが実際にヨウ素酸化の際の折り畳みに影響を及ぼすかどうか、またはｐＨの上昇のみがＨＰＬＣプロファイルを変化させるかどうかは明らかではなく、少なくともアルカリ性ＤＭＳＯ酸化の場合、ＧＳＨ－ＧＳＳＧは識別可能な役割を果たさなかった。
【0122】
ペプチドが不確定の混合物に非常に迅速に反応したため、溶媒としてのＮＭＰは有用ではなかった。高い反応性は、酸化条件下（空気）でのエージングにおいてＮＭＰ中に形成されるＮＭＰ（５－ＯＯＨ）に起因する可能性が最も高い。
【0123】
結論
図１に示す戦略、例えばアミノ酸を所望の配列にアセンブルするための標準的なＳＰＰＳプロトコルを使用して、配列番号１の合成ペプチドを合成し、続いてＨｃｙｓとＧｌｕとの間のＨＡＴＵ支援アミド結合形成による環化を行って、以下に示す樹脂上に大環状保護されたペプチドを得ることができる。
図１に示す戦略、例えばアミノ酸を所望の配列にアセンブルするための標準的なＳＰＰＳプロトコルを使用して、配列番号１の合成ペプチドを合成し、続いてＨｃｙｓとＧｌｕとの間のＨＡＴＵ支援アミド結合形成による環化を行って、以下に示す樹脂上に大環状保護されたペプチドを得ることができる。
【化24】
【0124】
Ｈ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－２－ＣＴ樹脂に基づく樹脂上のこの環状ペプチドの推定収率は３２％であった。これは、６７％の環化収率に相当する。
【0125】
５もしくは６の位置または両方におけるＴｈｚとの類似体は、利点をもたらさなかった。既に組み込まれたＴｈｚへのカップリングは、完了するのにより多くの時間を必要とする。これらのＣｙｓ類似体での置換は、ジスルフィド架橋構築の前に、水性ＭｅＯＮＨ２でメチレン架橋を除去してホルムアルデヒドを取り除く追加のプロセス工程を更に必要とするであろう。それらはＴＦＡカクテルによって脱保護されなかった。
【0126】
別のＣｙｓ誘導体、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｚ（Ｍｅ）２－ＯＨも調べた。これは、ＴＦＡ脱保護によってＣｙｓに容易に変換されるが、ペプチド配列に組み込まれた場合、更なるカップリングは不可能であった。
【0127】
したがって、上に示される環化ベースライン樹脂が最良の選択である。中間ペプチド配列にＴｈｚがなければ、残留ホルムアルデヒドの可能性を検出する分析方法は不要であろう。
【0128】
閉環の際、切断／脱保護／沈殿（５．４１ｇのベースライン樹脂から１．８０ｇ）によって以下：
に示すラクタムを得て、これは、下記式によって表すこともできる。
【化25】
【化26】
【0129】
酸化、例えば上記ラクタムからのジスルフィドの形成を、ヨウ素によるかまたはＤＭＳＯ含有溶液中のいずれかで行った。正確に折り畳まれた生成物が形成された（これまでの最良の選択は、アルカリ性ＤＭＳＯ酸化（ＨＰＬＣ／ＳＥＣ）であった）。
【0130】
他の実施形態
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態によって限定されない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかになる。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。全ての値は近似値であり、説明のために提供されていることを更に理解されたい。
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態によって限定されない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかになる。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。全ての値は近似値であり、説明のために提供されていることを更に理解されたい。
【0131】
全ての特許、特許出願、刊行物、製品説明およびプロトコルは、本出願を通して引用され、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図1】
【配列表】
【国際調査報告】