特表 2024-541769 修飾ＧＣＣ受容体アゴニストの産生のための合成プロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-12

(54)【発明の名称】修飾ＧＣＣ受容体アゴニストの産生のための合成プロセス

(51)【国際特許分類】

   C07K 1/04 20060101AFI20241105BHJP

   C07K 1/06 20060101ALI20241105BHJP

   C07K 1/10 20060101ALI20241105BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20241105BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20241105BHJP

   A61P 13/10 20060101ALI20241105BHJP

【ＦＩ】

C07K1/04 ZNA

C07K1/06

C07K1/10

A61K38/10

A61K38/12

A61P13/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024531062

(86)(22)【出願日】2022-11-22

(85)【翻訳文提出日】2024-07-22

(86)【国際出願番号】 US2022080295

(87)【国際公開番号】W WO2023097207

(87)【国際公開日】2023-06-01

(31)【優先権主張番号】63/282,842

(32)【優先日】2021-11-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/323,552

(32)【優先日】2022-03-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521540818

【氏名又は名称】アイアンウッド ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】レーザイサー， クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】ストルツ， トーマス

(72)【発明者】

【氏名】チェン， リン

【テーマコード（参考）】

4C084

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA06

4C084AA07

4C084BA01

4C084BA09

4C084BA18

4C084BA25

4C084BA26

4C084BA28

4C084DC50

4C084NA14

4C084ZA811

4H045AA20

4H045BA30

4H045BA32

4H045EA20

4H045FA20

4H045FA33

4H045FA58

4H045FA59

4H045FA61

4H045GA21

(57)【要約】

本発明は、配列番号１の合成ペプチドまたはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法に関する。本明細書に記載の方法は、（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、Ｃ末端が固相支持体に結合した直鎖ペプチドを化学的に合成することによって始まり、直鎖ペプチドは、１もしくはそれを超えるアミノ酸および／またはポリアミノ酸シントンに保護基を有する。いくつかの実施形態では、ポリアミノ酸シントンの少なくとも１つのアミン基は、直鎖ペプチドのＮ末端とは異なる保護基を有する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

合成ペプチド、またはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法であって、前記方法が、
（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、Ｃ末端が固相支持体に結合した直鎖ペプチドを化学的に合成することであって、前記直鎖ペプチドが、１またはそれを超えるアミノ酸および／または前記ポリアミノ酸シントンに保護基を有し、
前記ポリアミノ酸シントンの少なくとも１つのアミン基が、前記直鎖状ペプチドのＮ末端とは異なる保護基を有する、化学的に合成することと、
（ｉｉ）前記直鎖ペプチドを前記固相支持体から切断して、保護されたペプチドを生成することと、
（ｉｉｉ）アミノ酸を前記保護されたペプチドのＣ末端にカップリングさせることであって、前記アミノ酸が、保護されていないアミン基、保護されたカルボン酸基、および必要に応じて保護されているアミノ酸側鎖を有する、カップリングさせることと、
（ｉｖ）前記保護されたペプチドの１つのアミン保護基および１つのカルボン酸保護基を除去して、保護されていないアミンおよび保護されていないカルボン酸基を有する部分的に保護されていないペプチドを形成することと、
（ｖ）前記保護されていないアミンと前記保護されていないカルボン酸基とをカップリングして環化ペプチドを形成することと、
（ｖｉ）前記環化ペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得ることと、
（ｖｉｉ）前記全体的に脱保護されたペプチドを折り畳んで、１またはそれを超える追加の架橋を形成して、前記合成ペプチドを得ることと、
（ｖｉｉｉ）必要に応じて、前記合成ペプチドのＮ末端を１またはそれを超える化学部分で修飾することと、
（ｉｘ）前記合成ペプチドを精製することと、を含み、
前記合成ペプチドが、アミノ酸配列：
Ｃｙｓ_１ Ｃｔｈ_２ Ｇｌｕ_３ Ｌｅｕ_４ Ｃｙｓ_５ Ｃｙｓ_６ Ａｓｎ_７ Ｖａｌ_８ Ａｌａ_９ Ｃｙｓ_１０ Ｔｙｒ_１１ Ｇｌｙ_１２ Ｃｙｓ_１３（配列番号１）を含み、
前記合成ペプチドが、前記合成ペプチドの以下：
ａ）Ｃｙｓ_１およびＣｙｓ_６、
ｂ）Ｃｔｈ_２およびＣｙｓ_１０、ならびに
ｃ）Ｃｙｓ_５およびＣｙｓ_１３のアミノ酸残基間に共有結合を含む、方法。

【請求項2】

前記合成ペプチドを、溶液から沈殿させることを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記固相支持体が、Ｗａｎｇ樹脂、トリチル樹脂、およびＲｉｎｋ樹脂からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記固相支持体が、約０．１０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．２０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．３０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．４０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．５０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．６０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．７０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．８０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．９０ｍｍｏｌ／ｇ、または約１．００ｍｍｏｌ／ｇの充填量を有する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記ポリアミノ酸シントンが、下記式：

【化41】

（式中、
Ｐ^１およびＰ^２は、異なるアミン保護基であり、
Ｐ^３は、カルボン酸保護基であり、
Ｐ^４は、チオール保護基である）
によって表される化合物である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

前記保護基が、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）、トリチル、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アリル、２，４－ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、アリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）、および２－ピリジン－スルフェニル（Ｐｙｒ）からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

Ｐ^１がｔｅｒｔ－ブチルオキシカボニル（Ｂｏｃ）保護基であり、Ｐ^２が９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基である、請求項５または６に記載の方法。

【請求項8】

Ｐ^３が、アリル保護基である、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

Ｐ^４が、トリチル保護基である、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記ポリアミノ酸シントンのサブユニットが、Ｄ配置を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記ポリアミノ酸シントンのサブユニットが、Ｌ配置を有する、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記ポリアミノ酸シントンのサブユニットが、Ｄ配置およびＬ配置の両方を有する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

工程（ｉｖ）の前記保護されたカルボン酸が、前記ポリアミノシントンの前記保護されたカルボン酸基に由来する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

工程（ｖ）の前記保護されていないカルボン酸が、前記ポリアミノシントンの前記保護されていないカルボン酸基に由来する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

前記複数のアミノ酸および前記シントンが、カルボジイミド媒介反応によって、または非カルボジイミドカップリング剤：１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、（２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－５－クロロ－ヘキサフルオロホスフェート（１－）、３－オキシド（ＨＣＴＵ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、１－［（１－（シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）－ジメチルアミノ－モルホリノメチレン）］メタナミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＯｘｉｍ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、またはプロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）によって媒介される反応によって結合されて、工程（ｉ）の前記直鎖ペプチドを形成する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

前記複数のペプチドおよび／または前記シントン由来の少なくとも１つのアミノ酸が、カルボジイミド媒介反応によって結合されて、工程（ｉ）の前記直鎖ペプチドを形成する、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記カルボジイミドが、ジイソプロピルカルボキシイミド（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃａｒｂｏｘｉｉｍｉｄｅ）（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の方法。

【請求項18】

前記カルボジイミドが、ＤＩＣである、１７に記載の方法。

【請求項19】

前記カルボジイミド媒介反応が、アミノ酸ラセミ化抑制剤を更に含む、請求項１５～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記ラセミ化抑制剤が、２－ヒドロキシピリジン－Ｎ－オキシド（ＨＯＰＯ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アゾ－ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、および２－シアノ－２－（ヒドロキシイミノ）アセテート）からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ラセミ化抑制剤が、２－シアノ－２－（ヒドロキシイミノ）アセテート）である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記カルボジイミド媒介反応のための溶媒が、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルム、またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）である、請求項１５～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

ピリジンを前記カルボジイミド媒介反応と共に使用して、前記直鎖ペプチドの早すぎる切断を防止する、請求項１５～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

少なくとも１つのアミノ酸が、非カルボジイミドカップリング剤によって結合される、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記非カルボジイミドカップリング剤が、ＴＢＴＵである、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

工程（ｉｉ）で得られた前記保護されたペプチドをそのまま工程（ｉｉｉ）で使用する、請求項１１に記載の方法。

【請求項27】

工程（ｉｉ）における前記直鎖ペプチドが、弱酸溶液で前記固体支持体から切断される、先行する請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

工程（ｖ）の前記環化ペプチドが、溶液中で形成される、請求項１に記載の方法。

【請求項29】

前記全体的な脱保護工程（ｖｉ）が、少なくともヨウ化アンモニウム（ＮＨ_４Ｉ）およびチオアニソールを含むカクテルの添加を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記方法が、前記合成ペプチドのＮ末端を１またはそれを超える化学部分で修飾する必要に応じた（ｖｉｉｉ）工程を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項31】

前記修飾が、前記合成ペプチドのＮ末端のアセチル化である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

工程（ｖｉｉ）の前記ペプチドが、前記修飾工程（ｖｉｉｉ）の前に精製される、請求項３０または３１に記載の方法。

【請求項33】

Ｃｙｓ_１とＣｙｓ_６およびＣｙｓ_５とＣｙｓ_１３との間の前記共有結合が、ジスルフィド結合である、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

Ｃｔｈ_２とＣｙｓ_１０との間の前記共有結合が、チオエーテル結合である、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記沈殿工程が、酸性化工程と、それに続く有機溶媒混合物による希釈工程とを含む、請求項２に記載の方法。

【請求項36】

前記有機溶媒混合物が、アセトニトリルまたはメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）のうちの少なくとも１つを含む、請求項３５に記載の方法。

【請求項37】

式Ｉ：

【化42】

の合成ペプチドを調製する方法であって、
（ｉ）Ｃ末端樹脂結合Ｔｙｒ－Ｇｌｙペプチド（前記Ｔｙｒアミノ酸残基は、保護されている）を、式ＩＩ：

【化43】

（式中、
Ｐ^１およびＰ^２は、異なるアミン保護基であり、
Ｐ^３は、カルボン酸保護基であり、
Ｐ^４は、チオール保護基である）
のポリアミノ酸シントンにカップリングさせて式ＩＩＩ：

【化44】

の樹脂結合ペプチドを形成することと、
（ｉｉ）式ＩＩＩの前記Ｐ^２保護基を除去して、保護されていないアミン基を有する式ＩＶ：

【化45】

の樹脂結合ペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）式ＩＶの遊離アミン基を介してＰ^２－アラニンを式ＩＶの前記樹脂結合ペプチドにカップリングして、式Ｖ：

【化46】

の樹脂結合ペプチドを形成することと、
（ｉｖ）式Ｖの前記Ｐ^２保護基を除去して遊離アミン基を得て、続いて前記遊離アミン基をＰ^２－アミノ酸にカップリングさせることであって、
前記アミノ酸の側鎖が、必要に応じて保護されている、カップリングさせることと、
（ｖ）工程（ｉｖ）を更に５回繰り返して、式ＶＩ：

【化47】

の樹脂結合ペプチドを形成することであって、
少なくとも１つのアミノ酸側鎖が、保護されている、形成することと、
（ｖｉ）式ＶＩの前記ペプチドを前記樹脂から切断して、Ｃ末端カルボン酸基を有する直鎖ペプチドを形成することと、
（ｖｉｉ）前記直鎖ペプチドの前記Ｃ末端カルボン酸基をシステインのアミン基にカップリングして式ＶＩＩ

【化48】

の保護されたペプチドを得ることであって、
前記システインが、カルボン酸保護基を含み、
前記システインアミノ酸の前記側鎖が、保護されていてもよく、
式中、Ｐ^５は、Ｐ^３とは異なるカルボン酸保護基である、式ＶＩＩの保護されたペプチドを得ることと、
（ｖｉｉｉ）前記Ｐ^２保護基および前記Ｐ^３保護基を除去して、遊離アミン基および遊離カルボン酸基を得ることと、
（ｉｘ）前記遊離アミン基と前記遊離カルボン酸基とをカップリングして、式ＶＩＩＩ：

【化49】

の環化ペプチドを得ることと、
（ｘ）前記環化ペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得ることと、
（ｘｉ）２つのジスルフィド結合を形成することによって、前記全体的に脱保護されたペプチドを折り畳み、式Ｉの合成ペプチドを得ることと、を含む、方法。

【請求項38】

式Ｉの遊離アミン基をアセチル化して、式ＩＸ：

【化50】

の合成ペプチドを得ることを更に含む、請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

式ＶＩＩの前記Ｇｌｕ、前記Ｃｙｓ、前記Ｃｙｓ、前記Ａｓｎ、前記Ｇｌｙおよび前記Ｃｙｓ残基が、側鎖保護基を有する、請求項３７または３８に記載の方法。

【請求項40】

Ｐ^１およびＰ^２がそれぞれ、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）、およびアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択される保護基である、請求項３７～３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

Ｐ^１が、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基である、請求項４０に記載の方法。

【請求項42】

Ｐ^２が、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基である、請求項４０に記載の方法。

【請求項43】

Ｐ^３が、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アリル、トリチル、２，４－ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、およびベンジル（Ｂｎ）からなる群から選択される保護基である、請求項３７～４２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

Ｐ^３が、アリル保護基である、請求項４３に記載の方法。

【請求項45】

Ｐ^４が、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔ－Ｂｕ）、３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）、２－ピリジン－スルフェニル（Ｐｙｓ）、およびトリチル（Ｔｒｔ）からなる群から選択される保護基である、請求項３７～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

Ｐ^４が、トリチル保護基である、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

Ｐ^４が、ｔｅｒｔ－ブチル保護基である、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

以下の構造式：

【化51】

（式中、
Ｐ^１およびＰ^２は、水素またはアミン保護基であり、ただし、Ｐ^１およびＰ^２の両方がアミン保護基である場合、それらは同じアミン保護基ではなく、
Ｐ^３は、水素またはカルボン酸保護基であり、
Ｐ^４は、水素またはチオール保護基である）
によって表される、化合物、またはその薬学的に許容され得る塩。

【請求項49】

Ｐ^１およびＰ^２が、それぞれアセチル、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）、およびアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択されるアミン保護基である、請求項４８に記載の化合物、またはその薬学的に許容され得る塩。

【請求項50】

Ｐ^１が、アセチル基である、請求項４９に記載の化合物、またはその薬学的に許容され得る塩。

【請求項51】

Ｐ^１が、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）保護基である、請求項４９に記載の化合物、またはその薬学的に許容され得る塩。

【請求項52】

Ｐ^２が、Ｆｍｏｃ保護基である、請求項４９に記載の化合物、またはその薬学的に許容され得る塩。

【請求項53】

Ｐ^３が、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アリル、トリチル、２，４－ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、およびベンジル（Ｂｎ）からなる群から選択されるカルボン酸保護基である、請求項４８～５２のいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容され得る塩。

【請求項54】

Ｐ^３が、アリル保護基である、請求項５３に記載の化合物、またはその薬学的に許容され得る塩。

【請求項55】

Ｐ^４が、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔ－Ｂｕ）、３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）、２－ピリジン－スルフェニル（Ｐｙｒ）、およびトリチル（Ｔｒｔ）からなる群から選択されるチオール保護基である、請求項４８～５４のいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容され得る塩。

【請求項56】

Ｐ^４が、トリチル保護基である、請求項５５に記載の化合物、またはその薬学的に許容され得る塩。

【請求項57】

Ｐ^１、Ｐ^２、Ｐ^３、および／またはＰ^４のうちの少なくとも１つが、水素である、請求項４８に記載の化合物。

【請求項58】

Ｐ^１～Ｐ^４が、それぞれ水素である、請求項４８に記載の化合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１１月２４日に出願された米国仮出願第６３／２８２，８４２号、および２０２２年３月２５日に出願された米国仮出願第６３／３２３，５５２号の優先権および利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

技術分野
本発明は、配列番号１の合成ペプチドまたはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法に関する。

【0003】

配列表
本出願は、２０２２年１１月２１日の９：４９ ＡＭに作成され、本明細書と共に電子的に提出された「２２３３５５－５１９４３２．ｘｍｌ」（７．７３キロバイト）と題された配列表をその全体が参照により組み込む。

【背景技術】

【0004】

発明の背景
間質性膀胱炎／膀胱痛症候群（ＩＣ／ＢＰＳ）は、通常、尿意切迫、頻度の増加および／または夜間頻尿が付随して起こる、膀胱痛を伴う慢性状態である。ＩＣ／ＢＰＳはしばしば尿路感染症と誤診され、抗生物質は一般に無効である。女性の３～７％および男性の３～４％がＩＣ／ＢＰＳの定義を満たすと推定される。ＩＣ／ＢＰＳの原因にはいくつかの寄与因子が存在する場合があり、ＩＣ／ＢＰＳが原発性障害であるか、または別の障害の二次的結果であるかは不明である［Ｈａｎｎｏら、２０１５、１９３；１５４５－１５５３］。ＩＣ／ＢＰＳの診断試験はなく、診断は一般に、膀胱に関連する疼痛を伴う緊急性および頻度の排尿症状に基づく。診断は、一般に、これらの症状を引き起こし得る他の疾患が除外されるまで保留される。

【0005】

ＩＣ／ＢＰＳに利用可能な承認された治療法はほとんどない。患者は、非薬理学的処置（全身のリラクセーション、ストレス管理、行動修正、および理学療法の手法）による処置を開始することが多い。ＩＣ／ＢＰＳに利用可能なわずかに有効な治療のために、多くの患者は、症状を軽減するために膀胱内注入（すなわち、カテーテルを介して膀胱に直接送達される薬剤の混合物）を含むオフラベルの治療を利用する。ＩＣ／ＢＰＳのためのより効果的で忍容性の高い処置が必要とされている。

【0006】

１３アミノ酸グアニル酸シクラーゼＣ（ＧＣ－Ｃ）アゴニスト合成ペプチドは、ＩＣ／ＢＰＳに関連する膀胱痛、および潜在的に腹部領域の他の内臓痛状態の処置のために開発されている。このペプチドの開発を更に進めるために、効率的な合成および精製プロセスが必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

発明の概要
本発明は、合成ペプチド、またはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法に関する。（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、Ｃ末端が固相支持体に結合した直鎖ペプチドを化学的に合成する工程であって、直鎖ペプチドが、１またはそれを超えるアミノ酸および／またはポリアミノ酸シントンに保護基を有し、ポリアミノ酸シントンの少なくとも１つのアミン基が、直鎖状ペプチドのＮ末端とは異なる保護基を有する、化学的に合成する工程と、（ｉｉ）直鎖ペプチドを固相支持体から切断して、保護されたペプチドを生成する工程と、（ｉｉｉ）アミノ酸を保護されたペプチドのＣ末端にカップリングさせる工程と、（ｉｖ）保護されたペプチドの１つのアミン保護基および１つのカルボン酸保護基を除去して、保護されていないアミンおよび保護されていないカルボン酸基を有する部分的に保護されていないペプチドを形成する工程と、（ｖ）保護されていないアミンと保護されていないカルボン酸基とをカップリングして環化ペプチドを形成する工程と、（ｖｉ）環化ペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得る工程と、（ｖｉｉ）全体的に脱保護されたペプチドを折り畳んで、１またはそれを超える追加の架橋を形成して、合成ペプチドを得る工程と、（ｖｉｉｉ）必要に応じて、合成ペプチドのＮ末端を１またはそれを超える化学部分で修飾する工程と、（ｉｘ）合成ペプチドを精製する工程とを有する方法。本明細書に記載される方法によって生成される合成ペプチドは、アミノ酸配列：Ｃｙｓ_１ Ｃｔｈ_２ Ｇｌｕ_３ Ｌｅｕ_４ Ｃｙｓ_５ Ｃｙｓ_６ Ａｓｎ_７ Ｖａｌ_８ Ａｌａ_９ Ｃｙｓ_１０ Ｔｙｒ_１１ Ｇｌｙ_１２ Ｃｙｓ_１３（配列番号１）を含む。合成ペプチドは、合成ペプチドの以下：Ｃｙｓ_１およびＣｙｓ_６、Ｃｔｈ_２およびＣｙｓ_１０、ならびにＣｙｓ_５およびＣｙｓ_１３のアミノ酸残基間に共有結合を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、方法は、（ｖｉｉｉ）合成ペプチドのＮ末端を１またはそれを超える化学部分で修飾するという必要に応じた工程を含む。

【0009】

また、以下の構造式：

【化1】

（式中、Ｐ^１およびＰ^２は、水素またはアミン保護基であり、ただし、Ｐ^１およびＰ^２の両方がアミン保護基である場合、それらは同じアミン保護基ではなく、Ｐ^３は、水素またはカルボン酸保護基であり、Ｐ^４は、水素またはチオール保護基である）によって表される、化合物、またはその薬学的に許容され得る塩が本明細書で開示される。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、配列番号１の合成ペプチドの製造のための例示的なフロー図を示す。

【発明を実施するための形態】

【0011】

発明の詳細な説明
合成ペプチド、またはその薬学的に許容され得る塩を産生する方法が本明細書中に記載される。本明細書中に記載される方法は、
（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、Ｃ末端が固相支持体に結合した直鎖ペプチドを化学的に合成することであって、直鎖ペプチドが、１またはそれを超えるアミノ酸および／またはポリアミノ酸シントンに保護基を有し、
ポリアミノ酸シントンの少なくとも１つのアミン基が、直鎖状ペプチドのＮ末端とは異なる保護基を有する、化学的に合成することと、
（ｉｉ）直鎖ペプチドを固相支持体から切断して、保護されたペプチドを生成することと、
（ｉｉｉ）アミノ酸を保護されたペプチドのＣ末端にカップリングさせることであって、アミノ酸が、保護されていないアミン基、保護されたカルボン酸基、および必要に応じて保護されているアミノ酸側鎖を有する、カップリングさせることと、
（ｉｖ）保護されたペプチドの１つのアミン保護基および１つのカルボン酸保護基を除去して、保護されていないアミンおよび保護されていないカルボン酸基を有する部分的に保護されていないペプチドを形成することと、
（ｖ）保護されていないアミンと保護されていないカルボン酸基とをカップリングして環化ペプチドを形成することと、
（ｖｉ）環化ペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得ることと、
（ｖｉｉ）全体的に脱保護されたペプチドを折り畳んで、１またはそれを超える追加の架橋を形成して、合成ペプチドを得ることと、
（ｖｉｉｉ）必要に応じて、合成ペプチドのＮ末端を１またはそれを超える化学部分で修飾することと、
（ｉｘ）合成ペプチドを精製することと、を含み、
合成ペプチドが、アミノ酸配列：
Ｃｙｓ_１ Ｃｔｈ_２ Ｇｌｕ_３ Ｌｅｕ_４ Ｃｙｓ_５ Ｃｙｓ_６ Ａｓｎ_７ Ｖａｌ_８ Ａｌａ_９ Ｃｙｓ_１０ Ｔｙｒ_１１ Ｇｌｙ_１２ Ｃｙｓ_１３（配列番号１）を含み、
合成ペプチドが、合成ペプチドの以下：ａ）Ｃｙｓ_１およびＣｙｓ_６、ｂ）Ｃｔｈ_２およびＣｙｓ_１０、ならびにｃ）Ｃｙｓ_５およびＣｙｓ_１３のアミノ酸残基間に共有結合を含む。

【0012】

定義
本明細書で使用される場合、「Ｃｔｈ」は、ペプチド結合を形成することができるスキーム１において「１」および「２」と呼ばれる２つのα－アミノカルボキシル基を有するシスタチオニンを表す。

【化2】

【0013】

しかし、ペプチド配列を記述する際の３文字アミノ酸コードの使用を容易にするために、ペプチド配列中の不連続な位置でα－アミノカルボキシル基のそれぞれ（「１」および「２」と呼ばれる）とペプチド結合を形成して環状チオエーテル架橋を作り出することによって環状ペプチド配列を作り出す場合、１位のα－アミノカルボキシル基によって形成されるペプチド結合は「Ｃｔｈ」と呼ばれ、２位のα－アミノカルボキシル基によって形成されるペプチド結合は「Ｃｙｓ」と呼ばれる。更なる詳細については、「合成ペプチド」と題されたセクションを参照されたい。

【0014】

本明細書で使用される場合、「Ｈｃｙ」は、スキーム１に示されるホモシステインを表す。スキーム１から分かるように、シスタチオニンは、ホモシステインとシステインとの組み合わせと見なすことができ、これらの側鎖は硫黄原子を共有する。したがって、ペプチド配列中の不連続な位置でシスタチオニンのα－アミノカルボキシル基のそれぞれとペプチド結合を形成することによって作り出される環状ペプチド配列を指定する代替方法は、１位のα－アミノカルボキシル基によって形成されるペプチド結合を「Ｈｃｙ」と表記し、２位のα－アミノカルボキシル基によって形成されるペプチド結合を「Ｃｙｓ」と表記することである。

【0015】

本明細書で使用される場合、他の指示がない限り、「薬学的に許容され得る」は、動物またはヒトにおけるインビボ使用に生物学的または薬理学的に適合性であることを意味し、好ましくは、連邦または州政府の規制当局によって承認されているか、動物、より具体的にはヒトにおける使用のために米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に収載されていることを意味する。

【0016】

本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味し、これは値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣例に従って、１標準偏差以内または１標準偏差を超えることを意味することができる。あるいは、組成物に関して「約」は、最大２０％、好ましくは最大１０％の範囲のプラスまたはマイナスを意味することができる。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、ある値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値は、本出願および特許請求の範囲に記載されており、特に明記しない限り、「約」という用語は、特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味する。

【0017】

合成ペプチド
いくつかの実施形態では、本開示の方法によって産生される合成ペプチドは、Ｃｙｓ_１ Ｃｔｈ_２ Ｇｌｕ_３ Ｌｅｕ_４ Ｃｙｓ_５ Ｃｙｓ_６ Ａｓｎ_７ Ｖａｌ_８ Ａｌａ_９ Ｃｙｓ_１０ Ｔｙｒ_１１ Ｇｌｙ_１２ Ｃｙｓ_１３（配列番号１）として直線的に表すことができる。

【0018】

配列番号１の合成ペプチドは、２つのジスルフィド結合を形成する４つのシステイン残基と、定義された連結性（Ｃｙｓ_１－Ｃｙｓ_６，Ｃｙｓ_５－Ｃｙｓ_１３，Ｃｔｈ_２－Ｃｙｓ_１０）を有する内部スルフィド（またはチオエーテル）結合を提供するシスタチオン（cystathione）（Ｃｔｈ）単位（側鎖硫黄原子を共有する、ホモシステインとシステインとを組み合わせる）とを含む。

【0019】

本明細書の目的のために、直鎖配列の２つの部分はＣｔｈ_２およびＣｙｓ_１０と命名され、チオエーテル結合は、硫黄ホモシステイン（Ｈｃｙ）側鎖とｄｅｓ－ＳＨシステイン側鎖の炭素とを接続し、この二重アミノ酸はシスタチオニン（Ｃｔｈ）残基に対応するが、提案された命名は、残基の３文字コード指定を使用する場合の説明を容易にし、１位のα－アミノカルボキシル基によって形成されたペプチド結合は「Ｃｔｈ」と命名され、２位のα－アミノカルボキシル基によって形成されたペプチド結合は「Ｃｙｓ」と命名され、上記スキーム１を参照されたい。

【0020】

あるいは、本明細書の目的のため、ビルディングブロックの２つの部分をそれぞれ［Ｈｃｙ］および［Ｃｙｓ］と命名することができ、ホモシステイン（Ｈｃｙ）側鎖の硫黄がシステイン（Ｃｙｓ）の側鎖と共有されてチオエーテル架橋を形成し、この二重アミノ酸はシスタチオニン（Ｃｔｈ）残基に対応するが、提案された指定は、残基の３文字コード指定を使用する場合の説明を容易にする。この代替命名法を使用して、配列番号１は以下のように表すことができる：Ｃｙｓ_１ Ｈｃｙ_２ Ｇｌｕ_３ Ｌｅｕ_４ Ｃｙｓ_５ Ｃｙｓ_６ Ａｓｎ_７ Ｖａｌ_８ Ａｌａ_９ Ｃｙｓ_１０ Ｔｙｒ_１１ Ｇｌｙ_１２ Ｃｙｓ_１３（配列番号１）。

【0021】

いくつかの実施形態では、Ｃｔｈ_２－Ｃｙｓ_１０またはその任意の変形の指定は、以下に示すようにチオエーテル架橋を形成する配列番号１の２つの非連続アミノ酸の側鎖間の連結を説明することを意味する。

【化3】

【0022】

いくつかの実施形態では、Ｃｔｈ_２－Ｃｙｓ_１０またはその任意の変形の指定は、合成ペプチドの２位および１０位でペプチド結合を形成し、チオエーテル架橋を形成するシスタチオニンを説明する。

【0023】

いくつかの実施形態では、配列番号１の合成ペプチドは、式：

【化4】

によって表すことができる。

【0024】

合成ペプチドを産生する方法
本明細書に記載の方法は、（ｉ）複数のアミノ酸および少なくとも１つのポリアミノ酸シントンを使用して、Ｃ末端が固相支持体に結合した直鎖ペプチドを化学的に合成することによって始まり、直鎖ペプチドは、１もしくはそれを超えるアミノ酸および／またはポリアミノ酸シントンに保護基を有する。いくつかの実施形態では、ポリアミノ酸シントンの少なくとも１つのアミン基は、直鎖ペプチドのＮ末端とは異なる保護基を有する。

【0025】

いくつかの実施形態では、固相支持体は、Ｗａｎｇ樹脂、トリチル樹脂、およびＲｉｎｋ樹脂からなる群から選択される。

【0026】

いくつかの実施形態では、固相支持体は、約０．１０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．２０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．３０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．４０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．５０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．６０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．７０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．８０ｍｍｏｌ／ｇ、約０．９０ｍｍｏｌ／ｇ、または約１．００ｍｍｏｌ／ｇの充填量を有する。いくつかの実施形態では、固相は、約０．７０ｍｍｏｌ／ｇの充填量を有する。いくつかの実施形態では、固相は、約０．９０ｍｍｏｌ／ｇの充填量を有する。

【0027】

いくつかの実施形態では、ポリアミノ酸シントンは、式：

【化5】

（式中、Ｐ^１およびＰ^２は、水素またはアミン保護基であり、ただし、Ｐ^１およびＰ^２の両方がアミン保護基である場合、それらは同じアミン保護基ではなく、Ｐ^３は、水素またはカルボン酸保護基であり、Ｐ^４は、水素またはチオール保護基である）によって表される、化合物である。

【0028】

好ましい実施形態では、Ｐ^１およびＰ^２は、異なるアミン保護基であり、Ｐ^３は、カルボン酸保護基であり、Ｐ^４は、チオール保護基である。

【0029】

いくつかの実施形態では、保護基は、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）、トリチル、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アリル（Ａｌｌ）、２，４－ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、ベンジル（Ｂｎ）、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル、アリルオキシカルボニル（ａｌｌｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）、および２－ピリジン－スルフェニル（Ｐｙｒ）からなる群から選択される。

【0030】

いくつかの実施形態では、アミン保護基Ｐ^１およびＰ^２はそれぞれ、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、およびカルボキシベンジル（Ｃｂｚ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｐ^１またはＰ^２は、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカボニル（Ｂｏｃ）保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ^１またはＰ^２は、９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ^１はｔｅｒｔ－ブチルオキシカボニル（Ｂｏｃ）保護基であり、Ｐ^２は９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基である。

【0031】

いくつかの実施形態では、カルボン酸保護基Ｐ^３は、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アリル（Ａｌｌ）、２，４－ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、ベンジル（Ｂｎ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｐ^３は、アリル（Ａｌｌ）保護基である。

【0032】

いくつかの実施形態では、Ｐ^４は、トリチル保護基である。

【0033】

いくつかの実施形態では、ポリアミノ酸シントンのサブユニットは、Ｄ配置を有し、例えば、シントンはＤ－エナンチオマーである。いくつかの実施形態では、Ｄ配置のサブユニットを有するポリアミノ酸シントンは、下記式によって表すことができる。

【化6】

【0034】

いくつかの実施形態では、ポリアミノ酸シントンのサブユニットは、Ｌ配置を有し、例えば、シントンはＬ－エナンチオマーである。いくつかの実施形態では、Ｌ配置のサブユニットを有するポリアミノ酸シントンは、下記式によって表すことができる。

【化7】

【0035】

いくつかの実施形態では、ポリアミノ酸シントンのサブユニットは、Ｄ配置およびＬ配置の両方を有する。

【0036】

いくつかの実施形態では、直鎖ペプチドのアミノ酸側鎖は、保護基を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸側鎖保護基は、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）、トリチル（Ｔｒｔ）、アリル（Ａｌｌ）、シクロヘキシル、２－フェニルイソプロピル、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、４－メチルベンジル（４－ＭｅＢｚｌ）、４－メトキシベンジル（４－ＭｅＯＢｚｌ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、ｔｅｒｔ－ブチルチオ（ｔ－ブチオ）、４－メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、キサンチル（Ｘａｎ）、２，６－ジクロロベンジル（２，６－Ｃｌ_２Ｂｚｌ）、および２－ブロモベンジルカーボネート（２－ＢｒＺ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸側鎖保護基は、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）またはトリチル（Ｔｒｔ）である。

【0037】

いくつかの実施形態では、側鎖に保護基を有する直鎖ペプチドのアミノ酸側鎖は、配列番号１のＣｙｓ_１、Ｇｌｕ_３、Ｃｙｓ_５、Ｃｙｓ_６、Ａｓｎ_７、Ｔｙｒ_１１、およびＣｙｓ_１３である。

【0038】

いくつかの実施形態では、複数のアミノ酸およびシントンは、カルボジイミド媒介反応によって、または非カルボジイミドカップリング剤、例えば、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム３－オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、（２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－５－クロロ－ヘキサフルオロホスフェート（１－）、３－オキシド（ＨＣＴＵ）、Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、１－［（１－（シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ）－ジメチルアミノ－モルホリノメチレン）］メタナミニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）、１－シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデンアミノオキシ－トリス－ピロリジノ－ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＯｘｉｍ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、７－アザベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＡＯＰ）、またはプロパンホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）によって媒介される反応によって結合されて、工程（ｉ）の直鎖ペプチドを形成する。

【0039】

いくつかの実施形態では、複数のペプチドおよび／またはシントン由来の少なくとも１つのアミノ酸は、カルボジイミド媒介反応によって結合されて、工程（ｉ）の直鎖ペプチドを形成する。いくつかの実施形態では、カルボジイミドは、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、カルボジイミドは、ＤＩＣである。

【0040】

いくつかの実施形態では、カルボジイミド媒介反応混合物は、アミノ酸ラセミ化抑制剤を更に含む。いくつかの実施形態では、ラセミ化抑制剤は、２－ヒドロキシピリジン－Ｎ－オキシド（ＨＯＰＯ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１－ヒドロキシ－７－アゾ－ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、および２－シアノ－２－（ヒドロキシイミノ）アセテート）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ラセミ化抑制剤は、２－シアノ－２－（ヒドロキシイミノ）アセテート）である。

【0041】

いくつかの実施形態では、カルボジイミド媒介反応のための溶媒は、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルム、またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）であるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、カルボジイミド媒介反応のための溶媒は、Ｎ－メチルピロリジノン（ＮＭＰ）である。

【0042】

いくつかの実施形態では、ピリジンをカルボジイミド媒介反応と共に使用して、直鎖ペプチドの固体支持体からの早すぎる切断を防止する。

【0043】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、非カルボジイミドカップリング剤によって結合される。いくつかの実施形態では、非カルボジイミドカップリング剤は、ＴＢＴＵである。

【0044】

工程（ｉ）の直鎖ペプチドは、本出願では「直鎖１２ｍｅｒ」と呼ばれる場合があり、下記式：

【化8】

（配列番号２）によって表すことができ、式中、シスタチオニンチオエーテル側鎖架橋－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－は、

【化9】

で表される。いくつかの実施形態では、下線を引いた１またはそれを超えるアミノ酸の側鎖が保護されている。いくつかの実施形態では、下線を引いた全てのアミノ酸の側鎖が保護されている。

【0045】

工程（ｉ）の直鎖ペプチドが形成された後、工程（ｉｉ）において、直鎖ペプチドを（ｉｉ）固相支持体から切断して、保護されたペプチドを生成する。

【0046】

いくつかの実施形態では、直鎖ペプチドは、希酸性溶液での処理によって樹脂から切断される。いくつかの実施形態では、希酸性溶液による処理は、側鎖保護基およびポリアミノ酸シントンの保護基を保存する。いくつかの実施形態では、希酸性溶液は、例えば、希トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）または希ブロモトリメチルシラン（ＴＭＳＢｒ）である。いくつかの実施形態では、希酸溶液はＴＦＡ溶液である。いくつかの実施形態では、希酸溶液は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液中の１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）である。

【0047】

保護されたペプチドを生成するための樹脂からの直鎖ペプチドの切断に続いて、保護されていないアミン基、保護されたカルボン酸基、および必要に応じて保護されたアミノ酸側鎖を有するアミノ酸が、工程（ｉｉｉ）において保護されたペプチドのＣ末端に結合される。

【0048】

いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）で得られた保護されたペプチドは、工程（ｉｉｉ）でそのまま使用される。

【0049】

いくつかの実施形態では、保護されたペプチドのＣ末端に結合したアミノ酸は、システインである。いくつかの実施形態では、システインは、保護されている。いくつかの実施形態では、Ｃ末端に結合したアミノ酸は、Ｓ－トリチル－Ｌ－システイニル－Ｏ－ｔ－ブチル－エステルである。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）で得られた保護されたペプチドは、下記式：

【化10】

によって表され得る。

【0050】

（配列番号３）いくつかの実施形態では、下線を引いた１またはそれを超えるアミノ酸の側鎖が保護されている。いくつかの実施形態では、下線を引いた全てのアミノ酸の側鎖が保護されている。

【0051】

工程（ｉｖ）におけるＣ末端へのアミノ酸のカップリングに続いて、１つのアミン保護基および１つのカルボン酸保護基が、工程（ｉｉｉ）で形成された保護されたペプチドから除去されて、保護されていないアミンおよび保護されていないカルボン酸基を有する部分的に保護されていないペプチドが形成される。

【0052】

いくつかの実施形態では、工程（ｉｖ）において脱保護されるカルボン酸は、ポリアミノシントンの保護されたカルボン酸基に由来する。

【0053】

保護基が除去されると、工程（ｖ）において、保護されていないアミンおよび保護されていないカルボン酸基が結合されて、環化ペプチドが形成される。

【0054】

工程（ｖ）における環化ペプチドの形成に続いて、工程（ｖｉ）において、環化ペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得る。いくつかの実施形態では、全体的な脱保護工程（ｖｉ）は、少なくともヨウ化アンモニウム（ＮＨ_４Ｉ）およびチオアニソールを含むカクテルの添加を含む。

【0055】

環化ペプチドが全体的に脱保護されると、工程（ｖｉｉ）において、ペプチドは、折り畳まれて１またはそれを超える追加の架橋を形成し、Ｃｙｓ_１ Ｃｔｈ_２ Ｇｌｕ_３ Ｌｅｕ_４ Ｃｙｓ_５ Ｃｙｓ_６ Ａｓｎ_７ Ｖａｌ_８ Ａｌａ_９ Ｃｙｓ_１０ Ｔｙｒ_１１ Ｇｌｙ_１２ Ｃｙｓ_１３（配列番号１）の合成ペプチドを得る。

【0056】

いくつかの実施形態では、工程（ｖｉｉ）で形成された架橋合成ペプチドは、合成ペプチドの以下のアミノ酸残基：Ｃｙｓ_１とＣｙｓ_６、Ｃｔｈ_２とＣｙｓ_１０、およびＣｙｓ_５とＣｙｓ_１３の間の共有結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｃｙｓ_１とＣｙｓ_６およびＣｙｓ_５とＣｙｓ_１３との間の共有結合は、ジスルフィド結合である。いくつかの実施形態では、Ｃｔｈ_２とＣｙｓ_１０との間の共有結合はチオエーテル結合である。

【0057】

全体的に脱保護されたペプチドのフォールディングに続いて、配列番号１の合成ペプチドを精製する。

【0058】

いくつかの実施形態では、方法は、合成ペプチドのＮ末端を１またはそれを超える化学部分で修飾する必要に応じた工程（ｖｉｉｉ）を含む。いくつかの実施形態では、合成ペプチドのＮ末端はアセチル基で修飾されている。合成ペプチドのＮ末端が１またはそれを超える化学部分で修飾されている場合、合成ペプチドは、折り畳み工程（ｖｉｉ）の直後に１回およびＮ末端修飾の後に１回の２回精製される。

【0059】

いくつかの実施形態では、方法は、溶液から合成ペプチドを沈殿させることを更に含む。いくつかの実施形態では、沈殿工程は、酸性化工程と、それに続く有機溶媒混合物による希釈工程とを含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒混合物は、アセトニトリルまたはメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）のうちの少なくとも１つを含む。

【0060】

式Ｉ：

【化11】

の合成ペプチドを調製する方法も本明細書に記載され、この方法は、
（ｉ）Ｃ末端樹脂結合Ｔｙｒ－Ｇｌｙペプチド（Ｔｙｒアミノ酸残基は、保護されている）を、式ＩＩ：

【化12】

（式中、
Ｐ^１およびＰ^２は、異なるアミン保護基であり、
Ｐ^３は、カルボン酸保護基であり、
Ｐ^４は、チオール保護基である）
のポリアミノ酸シントンにカップリングさせて式ＩＩＩ：

【化13】

の樹脂結合ペプチドを形成する、Ｃ末端樹脂結合Ｔｙｒ－Ｇｌｙペプチドを式ＩＩのポリアミノ酸シントンにカップリングさせることと、
（ｉｉ）式ＩＩＩのＰ^２保護基を除去して、保護されていないアミン基を有する式ＩＶ：

【化14】

の樹脂結合ペプチドを得ることと、
（ｉｉｉ）式ＩＶの遊離アミン基を介してＰ^２－アラニンを式ＩＶの樹脂結合ペプチドにカップリングして、式Ｖ：

【化15】

の樹脂結合ペプチドを形成することと、
（ｉｖ）式ＶのＰ^２保護基を除去して遊離アミン基を得て、続いて遊離アミン基をＰ^２－アミノ酸にカップリングすることであって、
このアミノ酸の側鎖が、保護されていてもよい、カップリングすることと、
（ｖ）工程（ｉｖ）を更に６回繰り返して、式ＶＩ：

【化16】

の樹脂結合ペプチドを形成することであって、
少なくとも１つのアミノ酸側鎖が、保護されている、形成することと、
（ｖｉ）式ＶＩのペプチドを樹脂から切断して、Ｃ末端カルボン酸基を有する直鎖ペプチドを形成することと、
（ｖｉｉ）直鎖ペプチドのＣ末端カルボン酸基をシステインのアミン基にカップリングして式ＶＩＩの保護されたペプチドを得ることであって、
システインが、カルボン酸保護基を含み、
システインアミノ酸の側鎖が、保護されていてもよい、

【化17】

（式中、Ｐ^５は、Ｐ^３とは異なるカルボン酸保護基である）、得ることと、
（ｖｉｉｉ）Ｐ^２保護基およびＰ^３保護基を除去して、遊離アミン基および遊離カルボン酸基を得ることと、
（ｉｘ）遊離アミン基と遊離カルボン酸基とをカップリングして、式ＶＩＩＩ：

【化18】

の環化ペプチドを得ることと、
（ｘ）環化ペプチドを全体的に脱保護して、全体的に脱保護されたペプチドを得ることと、
（ｘｉ）２つのジスルフィド結合を形成することによって、全体的に脱保護されたペプチドを折り畳み、式Ｉの合成ペプチドを得ることと、を含む。

【0061】

本明細書で使用される場合、Ｐ^２－アミノ酸とは、Ｐ^１のアミン保護基とは異なるアミン保護基であるアミン保護基でアミン基が保護されたアミノ酸である。例えば、Ｐ^２－アラニンは、以下の構造式：

【化19】

を有するであろう。

【0062】

いくつかの実施形態では、方法は、式Ｉの遊離アミン基をアセチル化して、式ＩＸ：

【化20】

の合成ペプチドを得ることを更に含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、Ｐ^１はアセチル基であり、工程（ｉ）～（ｉｘ）は上記のように行われる。しかし、全体的な脱保護工程中の工程（ｘ）において、Ｐ^１で表されるアセチル基は除去されず、工程（ｘ）折り畳み工程は式ＩＸで表される化合物を形成する。

【0064】

いくつかの実施形態では、式ＶＩＩのＧｌｕ、Ｃｙｓ、Ｃｙｓ、Ａｓｎ、ＧｌｙおよびＣｙｓ残基は、側鎖保護基を有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸側鎖保護基は、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）、トリチル（Ｔｒｔ）、アリル（Ａｌｌ）、シクロヘキシル、２－フェニルイソプロピル、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、４－メチルベンジル（４－ＭｅＢｚｌ）、４－メトキシベンジル（４－ＭｅＯＢｚｌ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、ｔｅｒｔ－ブチルチオ（ｔ－ブチオ）、４－メトキシトリチル（Ｍｍｔ）、キサンチル（Ｘａｎ）、２，６－ジクロロベンジル（２，６－Ｃｌ_２Ｂｚｌ）、および２－ブロモベンジルカーボネート（２－ＢｒＺ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アミノ酸側鎖保護基は、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）またはトリチル（Ｔｒｔ）である。

【0065】

いくつかの実施形態では、Ｐ^１およびＰ^２はそれぞれ、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）、およびアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択される保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ^１は、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカボニル（Ｂｏｃ）保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ^２は、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基である。

【0066】

いくつかの実施形態では、Ｐ^３は、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アリル（Ａｌｌ）、トリチル、２，４－ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、およびベンジル（Ｂｎ）からなる群から選択される保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ^３は、アリル（Ａｌｌ）保護基である。

【0067】

いくつかの実施形態では、Ｐ^４は、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔ－Ｂｕ）、３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）、２－ピリジン－スルフェニル（Ｐｙｒ）、およびトリチル（Ｔｒｔ）からなる群から選択される保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ^４は、トリチル保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ^４は、ｔｅｒｔ－ブチル保護基である。

【0068】

化合物

【0069】

また、以下の構造式：

【化21】

（式中、
Ｐ^１およびＰ^２は、水素またはアミン保護基であり、ただし、Ｐ^１およびＰ^２の両方がアミン保護基である場合、それらは同じアミン保護基ではなく、
Ｐ^３は、水素またはカルボン酸保護基であり、
Ｐ^４は、水素またはチオール保護基である）
によって表される、化合物、またはその薬学的に許容され得る塩が本明細書で開示される。

【0070】

いくつかの実施形態では、Ｐ^１、Ｐ^２、Ｐ^３、および／またはＰ^４のうちの少なくとも１つは、水素である。いくつかの実施形態では、Ｐ^１～Ｐ^４はそれぞれ水素である。

【0071】

いくつかの実施形態では、Ｐ^１～Ｐ^４は、それぞれ保護基である（例えば、Ｐ^１およびＰ^２はそれぞれアミン保護基であり、Ｐ^３はカルボン酸保護基であり、Ｐ^４はチオール保護基である）。

【0072】

いくつかの実施形態では、Ｐ^１およびＰ^２はそれぞれ、アセチル、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、カルボキシベンジル（Ｃｂｚ）、およびアリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）からなる群から選択されるアミン保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ^１はアセチル基である。いくつかの実施形態では、Ｐ^１は、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカボニル（Ｂｏｃ）保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ^２は、Ｆｍｏｃ保護基である。

【0073】

いくつかの実施形態では、Ｐ^３は、メチル、エチル、ｔｅｒｔ－ブチル、アリル（Ａｌｌ）、トリチル、２，４－ジメトキシベンジル（Ｄｍｂ）、９－フルオレニルメチル（Ｆｍ）、およびベンジル（Ｂｎ）からなる群から選択されるカルボン酸保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ^３は、アリル（Ａｌｌ）保護基である。

【0074】

いくつかの実施形態では、Ｐ^４は、アセトアミドメチル（Ａｃｍ）、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔ－Ｂｕ）、３－ニトロ－２－ピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）、２－ピリジン－スルフェニル（Ｐｙｒ）、およびトリチル（Ｔｒｔ）からなる群から選択されるチオール保護基である。いくつかの実施形態では、Ｐ^４は、トリチル保護基である。

【0075】

いくつかの実施形態では、化合物またはその薬学的に許容され得る塩は、式Ａ：

【化22】

の化合物である。

【0076】

いくつかの実施形態では、式Ａの化合物に到達するために、以下のスキームに示すように、３つのビルディングブロックを別々に合成し（パートＡ～Ｃ）、組み合わせて（パートＤ）、式Ａの化合物を合成する。
パートＡ：

【化23】

パートＢ：

【化24】

パートＣ：

【化25】

パートＤ：

【化26】

【化27】

【0077】

いくつかの実施形態では、式Ａの化合物に到達するために、以下のスキームに示すように、ジブロック化合物（Ａｌｌｏｃ－ＨＣｙｓ（（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ）３－イル）－ＯＡｌｌ）を最初に合成する。

【化28】

【実施例】

【0078】

以下の実施例は、本発明の単なる例示であり、本発明に包含される多くの変形および均等物が本開示を読むと当業者に明らかになることから、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【0079】

試薬および溶媒

【0080】

特許請求されるペプチドの製造に使用される出発材料、試薬および溶媒をそれぞれ表１～３に列挙する。

【表1-1】

【表1-2】

【表1-3】

【表2】

【表3】

【0081】

実施例１
配列番号１の合成ペプチドの製造プロセス
序論
配列番号１のペプチド、配列番号１のＮ末端修飾ペプチド、またはその薬学的に許容され得る塩は、計画した臨床試験で使用されることになっており、医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）規制に従って製造された。全ての略語をそれぞれ表２（試薬のリスト）および表３（溶媒のリスト）に列挙する。

【0082】

配列番号１のペプチド、配列番号１のＮ末端修飾ペプチドまたはその薬学的に許容され得る塩を、以下に記載される合成スキームに従って製造した。合成経路は、固相ペプチド化学の十分に確立された原理によるペプチド鎖の一部の段階的合成を組み合わせた。これに続いて、Ｃ末端アミノ酸を組み込むための連続工程、チオエーテル架橋を形成するための環化、折り畳み、一次精製、Ｎ末端アセチル化、分取スケールのクロマトグラフィーによる最終精製、および沈殿による固体としての原薬の単離を行った。

【0083】

配列番号１のペプチド、配列番号１のＮ末端修飾ペプチドまたはその薬学的に許容され得る塩のための例示的な製造プロセスを図１に示す。ペプチド一次配列を構成する全ての出発材料は、選択された化学と適合する保護された形態で導入される。全ての光学活性アミノ酸残基は、天然に存在する「Ｌ」形態で使用される。

【0084】

指定されたシステイン残基間の２つのジスルフィド架橋をもたらす折り畳みは、アセンブリの完了後に誘導される。（２位における）ホモシステイン側鎖と（１０位における）システイン側鎖との間のチオエーテル結合は、トリペプチドビルディングブロックにおいて予め形成される。その後の環化は、下記のようにラクタム結合の形成によって誘導される（工程５）。最終的なクロマトグラフィー精製の後、原薬を沈殿および乾燥によって単離する。

【0085】

ペプチド合成
工程１：段階的固相アセンブリ

【0086】

一次アミノ酸配列を、グリシン残基（合成ペプチドのＧｌｙ_１２）を組込み済みの２－クロロトリチル樹脂から始まる反復プロセスによって構築した。表４～５に詳述されている９回の連続サイクルを以下のように行った：
－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の塩基（ピペリジン）で処理し、続いてＤＭＦで徹底的に洗浄することによる、先に導入したアミノ酸残基からのＮ末端Ｆｍｏｃ保護基の除去。この脱保護は、最後の取り込み工程（グルタミン酸）の後に実行されなかった。脱保護反応をＨＰＬＣによってモニターした。
－ＤＩＰＥＡの存在下、ＴＢＴＵの作用により、ＮＭＰ中で行われる第１の反応（樹脂に固定されたグリシンへのチロシンのカップリング）を除いて、Ｏｘｙｍａ（登録商標）の存在下、ＤＩＣの作用により、ＮＭＰ中での次のＦｍｏｃ保護アミノ酸またはビルディングブロック（関連するものとしてその側鎖上に適切に保護されている）のカップリング。カップリング反応をＨＰＬＣによってモニターした。
－ＤＭＦによる徹底的な洗浄。

【表4】

【表5】

【0087】

カップリング

【0088】

ＮＭＰを、アミノ酸、ＤｅＦｍｏｃ溶液を溶解するための溶媒、カップリング剤、キャッピング溶液およびピリジン－キック（ｐｙｒｉｄｉｎｅ－ｋｉｃｋ）を溶解するための溶媒として使用した。ピリジン－キックは、固体支持体からの成長中のペプチドの部分的な切断を回避するための、カップリングサイクルごとの３．６当量のピリジン添加である。以下に考察するようにシステイン残基をカップリングする場合を除いて、全てのカップリング反応でピリジンキックを使用した。ＤＭＦは、カップリングおよびＤｅｆｍｏｃ工程後の洗浄工程にのみ使用した。ＤＭＦではなくＮＭＰを使用したため、カップリング時間は、標準アミノ酸では９０分から１８０分に、トリペプチドビルディングブロックでは１８０分から３６０分に延長する必要があった。標準的なカップリングのために２．０当量の代わりに１．２当量のトリペプチドのみを使用した。標準プロセスのための条件を表４に示す。保護された直鎖ペプチドのＳＰＰＳは、プロトコル（表５）に記載されているように、予め充填されたＨ－Ｇｌｙ－ＣＴ樹脂を用いたＴｒｉｂｕｔｅ自動合成装置で０．７５ｍｍｏｌスケールで実施した。ピリジンキックは、酸性カップリング条件のために、樹脂からのペプチドの早すぎる切断を最小限に抑えるために使用した。

【0089】

分析ＨＰＬＣ ＬＣ－ＭＳ分析は、高含有量の欠失配列についてのヒントを示さない。実験は、１．２当量のトリペプチドビルディングブロックが完全なカップリングに適していることを示した。

【0090】

システインのラセミ化（ピリジン－キック）

【0091】

酸性カップリング条件をもたらすＤＩＣ／Ｏｘｙｍａを使用したＳＰＰＳは、樹脂からのペプチドの部分的な切断を引き起こす可能性がある。したがって、ピリジン－キックが確立された。上記のように、ピリジンキックは、反応を完了させるためのピリジンの一部の添加である。ラセミ化がシステインの基本的なカップリングのために起こり得ることが知られている。したがって、ラセミ化のリスクに関して、システイン残基はアルカリ条件（ピリジンによって誘導される等）に特に感受性であるため、システイン残基のカップリング中にピリジンキックは実施されなかった。そのため、システイン－カップリングのために、Ｌ－トリペプチドの代わりにメチオニンを使用した試験ペプチドを、ピリジンキックありで１回およびなしで１回合成した。

【0092】

全てのカップリングにピリジンキックを使用すると、Ｄ－システイン含有量は１．４９％となり、システイン－カップリングでピリジンキックなしで合成されたペプチドでは１．３５％になる。また、ＳＰＰＳの樹脂収率に影響はなかった。結論として、得られた生成物の収率および品質への影響は最小限であった。しかし、ラセミ化のリスクを減らすために、システイン－カップリングおよびトリペプチド（保護されたシステインに化学的に類似）カップリングにはピリジン－キックを使用しなかった。

【0093】

樹脂の充填量

【0094】

下流での処理のための新しい材料を生成する間、樹脂充填量の影響を調査した。一実験では、０．７ｍｍｏｌ／ｇの充填量で予め充填されたＨ－Ｇｌｙ－ＣＴ樹脂を使用し、一方、別の実験では、０．９ｍｍｏｌ／ｇの充填量で予め充填されたＨ－Ｇｌｙ－ＣＴ樹脂を使用した。粗ペプチドは、樹脂に対して同じ品質および同じ収率を示す。

【0095】

ＳＰＰＳラン

【0096】

構築は、０．６５ｍｍｏｌ／ｇの予め充填したＨ－Ｇｌｙ－２ＣＴ樹脂に対して７．５ｍｍｏｌスケールで行った。各カップリング工程をＫａｉｓｅｒ試験によってモニターした。結果を表６に示す。温和な試験切断を行い、ＵＨＰＬＣによって分析した。８７．３％ＡＮの純度に達した。樹脂に対する収率は９８％であった。

【0097】

第２のＳＰＰＳバッチを自動運転した。スケールは再び７．５ｍｍｏｌであり、樹脂充填量は０．６９ｍｍｏｌ／ｇであった。樹脂に対する定量的（≧１００％）収率で８９．４％ＡＮの純度が達成された。

【表6】

【0098】

工程２：樹脂－ペプチド結合の切断

【0099】

ペプチドは、Ｃｙｓ_１残基の側鎖保護基ならびにＮ－アルファＢｏｃ保護基を保存する温和な酸性処理下で樹脂から切断される。この反応の完了は時間に特異的である。反応混合物を蒸発によって濃縮し、溶媒をＤＭＦに交換する。

【0100】

ガラス製品に付着するゴム状固体の形成を回避するために、Ｃ末端システインの直接カップリングを試験した。これにより、１つの単離工程が省略され、サイクル時間が短縮された。直接カップリングを温和な切断バッチで試験し、ペプチドを沈殿させるために異なる貧溶媒を既に試験した。バッチを油に蒸発させ、ＤＣＭで再構成し、全ての残留貧溶媒を除去するために再び蒸発させた。ＤＣＭで再構成した後、ペプチドをそのままシステインカップリングに使用した。表７は切断条件を示す。

【0101】

【表7】

【0102】

工程３：Ｃ末端残基の組み込みおよび保護基のＧｌｕ_３からのＩｎ－Ｓｉｔｕ脱保護

【0103】

工程２からの切断されたペプチド溶液をＤＩＣ／ＨＯＰＯによって活性化し、Ｈ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯｔＢｕとのカップリングを、塩基としてＤＩＥＡの存在下、ＤＭＦ中で行った。反応が完了したら、ＨＰＬＣによってモニターしたところ、Ｎ－αＧｌｕ_３残基のＦｍｏｃ保護基を、ピペリジンを反応混合物に直接添加することによって切断した。ＨＰＬＣによってモニターされる反応の完了の際に、反応の生成物を抽出、沈殿、濾過および乾燥によって単離した。表８は、システインカップリング条件を示す。

【表8】

【0104】

工程４：Ｈｃｙ_２からの保護基除去

【0105】

その後、Ｃ－アルファ－Ｈｃｙ_２のＯ－アリルエステル保護基を、それをＤＣＭに溶解し、捕捉剤としてのフェニルシランの存在下でパラジウム含有触媒（Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４）でＯ－アリルエステルを切断することによって除去した。反応の進行をＨＰＬＣによってモニターした。脱アリル（DeAllyl）条件は以下のとおりである。
１）Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４（０．０５当量）をＤＣＭに溶解する
２）フェニルシラン（２当量）および１３ｍｅｒをＰｄ（ＰＰｈ_３）_４／ＤＣＭ溶液に添加する
３）１時間撹拌し、ＨＰＬＣによって反応の進行をモニターする
４）脱アリル化が完了すると、溶液は次の工程の準備ができている。

【0106】

工程５：Ｈｃｙ_２→Ｇｌｕ_３カップリングによる環化

【0107】

工程４が完了したら、ＨＯＰＯおよびＤＩＣを反応混合物に直接添加して、Ｈｃｙ_２のカルボン酸官能基とＧｌｕ_３のアミン官能基との間のカップリングによって環化を誘導した。この反応をＨＰＬＣによってモニターした。表９は環化条件を示す。

【0108】

全ての環化濃度（５、１０、２５または５０ｍｇ／ｍＬ）について、クロマトグラムでオリゴマーのピークは見えなかった。４つ全ての実験を同じスケールで実行し、各実験の粗収量は４０±２ｍｇであった。５０ｍｇ／ｍＬでの環化について最大ピーク面積が得られ、これは、粗製物にペプチドの最大量が含まれることを示した。

【0109】

環化も１００ｍｇ／ｍＬで試験した。これを達成するために、カップリング剤を脱アリル溶液に直接添加した。クロマトグラムからで判定して、オリゴマー化を示すピークは見られない。両方の環化濃度（５０ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍＬ）は、非常に類似した結果を与える。より高い濃度は、純度に関していかなる利益ももたらさなかった。

【表9】

【0110】

工程６：全体的な脱保護

【0111】

Ｐｄ除去

【0112】

環化が完了したら、反応混合物を真空下での蒸発によって濃縮し（元の体積の約５０％まで）、Ｐｄ系触媒の除去に特異的な捕捉剤であるＳｉ－チオールによって処理した。複合体化したＰｄ捕捉剤を濾別し、回収した濾液を蒸発によって更に濃縮した。表１０はＰｄ除去条件を示す。

【表10】

【0113】

次いで、依然として保護された環化１３ｍｅｒペプチドを、ＴＦＡ中のＤＴＴ、水、チオアニソール、ＴＩＳおよびＮＨ_４Ｉの混合物の添加によって完全な脱保護に供した。反応が完了したら、粗製の脱保護されたペプチドをｎ－ヘプタンおよびＭＢＴＥ中で沈殿させることによって回収した。得られた固体を真空下で乾燥させた。表１１は、全体的な脱保護条件を示す。

【表11】

【0114】

工程７：ジスルフィド架橋による折り畳み

【0115】

工程６からの粗製脱保護されたペプチドを重炭酸アンモニウムに添加し、ＤＭＳＯを添加して、それぞれＣｙｓ_１およびＣｙｓ_６、ならびにＣｙｓ_５およびＣｙｓ_１３の側鎖間の２つのジスルフィド架橋の形成によって折り畳みを誘導した。折り畳み反応をＨＰＬＣによってモニターした。表１２は折り畳み工程に用いた条件を示す。

【表12】

【0116】

工程８：１次（１回目の）精製

【0117】

工程７が完了したら、反応混合物をＴＦＡで酸性化し、セライトを濾過助剤として添加し、得られたスラリーを濾過する。透明な濾液を、Ｃ１８（３）固定相を充填した分取ＨＰＬＣカラムに直接ロードした。アセトニトリル中０．１％ＴＦＡおよびアセトニトリル：水（５：９５ｖ／ｖ）中０．１％ ＴＦＡにおける勾配溶出によって精製を行った。個々の画分を収集し、選択は分析ＨＰＬＣモニタリングに基づいた：≧９０％（面積％）の純度を示す画分をプールする。

【0118】

工程９：Ｎ末端アセチル化

【0119】

折り畳み溶液中の折り畳まれたペプチドの直接アセチル化を試験した。１５当量のＡｃＯＳｕを添加した後、ごくわずかの変換しか検出されなかった。ｐＨ調整および追加のＡｃＯＳｕ投入の後、依然として実質的な変換は得られなかった。これを、第２の折り畳み溶液を用いて繰り返し、同じ結果が得られた。Ａｃ_２Ｏの添加は、より良好な変換をもたらさなかった。

【0120】

この化合物のアセチル化反応について所見を得るために、１５当量のＡｃＯＳｕおよび２当量のＡｃ_２Ｏをそれぞれ使用して、２つの実験を一晩実行した。両反応は有望な結果を示し、ＡｃＯＳｕとの反応は１５時間後に完了しなかった。

【0121】

Ａｃ_２Ｏ、それぞれ３当量および４当量の増加した当量を用いて反応を繰り返し、１８時間後にモニターした。より多量のアセチル化剤は、反応を完了させるようであり、反応時間の短縮は、特に遅く溶出する２つの最大の不純物についての、副反応の量を減少させるようであった。

【0122】

したがって、最終プロセスは、４．０当量のＡｃ_２Ｏで実行すると確定した。したがって、アセチル化工程９を、ＤＭＳＯを含有する重炭酸アンモニウム溶液に希釈した一次（１回目の）精製工程８から収集したプールから実行し、次いで、Ｎ－αＣｙｓ_１残基を無水酢酸によってアセチル化した。反応をＨＰＬＣによってモニターした。表１３はアセチル化工程の条件を示す。

【表13】

【0123】

工程１０：二次精製

【0124】

アセチル化反応混合物を酢酸アンモニウム溶液で１／１に希釈し、３０％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム水溶液でｐＨを７～８に調整し、Ｃ１８（３）固定相を充填した分取ＨＰＬＣカラムに注入することによって最終精製に供した。精製は、アセトニトリルと２５ｍＭ水性酢酸アンモニウム：アセトニトリル（９５：５、ｖ／ｖ）の勾配溶出によって行った。

【0125】

個々の画分を収集し、選択は分析ＨＰＬＣモニタリングに基づいた：９５％（面積％）以上の純度を示し、１．０％（面積％）超の単一不純物を示さない画分をプールする。

【0126】

出発材料を０．１％未満に減少させるために最適化されたアセチル化条件で、２回目の精製は、材料のわずかな研磨を提供し、トリフルオロアセテートからアセテートへのイオン交換を促進した。

【0127】

工程１１：沈殿、濾過による単離および乾燥

【0128】

二次精製工程から収集した精製プールを真空下での蒸発によって５０～１００ｍｇ／ｍＬの目標濃度まで濃縮した。次いで、生成物を酸性化（酢酸）、アセトニトリルで希釈、およびＭＢＴＥの添加によって沈殿させた。沈殿物を、０．２μｍフィルタを通して回収し、ＭＢＴＥ／アセトニトリル溶液で徹底的に洗浄した。条件を表１４に示す。

【0129】

固体を３０％（ｖ／ｖ）水性アセトニトリル、続いて水で加湿し、真空下での最終乾燥によって単離して、配列番号１の合成ペプチドを得た。

【表14】

【0130】

実施例２
Ａｌｌｏｃ－ＨＣｙｓ（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ）－３－イル）－ＯＡｌｌの調製
以下の反応スキームは、表題化合物の調製を示す。

【化29】

【0131】

Ａｌｌｏｃ－Ｈｓｅｒ－ＯＡｌｌの合成

【化30】

【0132】

５Ｌ三口フラスコ中、５００ｇの（Ｓ）－３－アミノジヒドロフラン－２（３Ｈ）－オン臭化水素酸塩を１Ｌの水に溶解した。１Ｌの水中の２３０ｇのＮａＯＨの溶液を添加した。反応をＴＬＣでモニターした。反応終了後、濃ＨＣｌを添加してｐＨを７．５に調整した。２３０ｇのＮａ_２ＣＯ_３を添加し、混合物を０℃に冷却した。３３１ｇのアロキシカルボニルクロリド（Ａｌｌｏｃ－Ｃｌ）を滴下添加し、その間、温度を０～１０℃に保ち、ｐＨを７．５に保った。混合物を一晩撹拌した。次いで、溶媒を除去し、次いで、２５００ｍＬのＤＭＦを添加した。２３０ｇのＮａＨＣＯ_３を添加した後、６６５ｇの臭化アリルを添加した。混合物を一晩撹拌した後、７０００ｍＬの水を添加して反応をクエンチした。混合物をＭＴＢＥ（５Ｌ×３）で抽出し、合わせた有機相を８００ｍＬのＮａＨＣＯ_３、８００ｍＬのＫＨＳＯ_４および８００ｍＬのブラインで順次洗浄した。溶媒ＭＴＢＥを除去した後、残留物をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２）によって精製して、２７３．９ｇ油状生成物を得た。¹H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 6.02 － 5.65 (m, 3H), 5.39 － 5.07 (m, 4H), 4.58 － 4.17 (m, 4H), 3.80 － 3.52 (m, 2H), 3.08 (s, 1H), 2.77 － 2.17 (m, 1H), 2.17 － 2.01 (m, 1H), 1.88 － 1.64 (m, 1H)。ＥＳＩ－ＭＳ Ｃ１１Ｈ１７ＮＯ５ ［Ｍ＋Ｈ］^＋の計算値：２４４．１２；実測値：２４４．０８．

【0133】

Ａｌｌｏｃ－Ａｂｕ（４－Ｂｒ）－ＯＡｌｌの合成

【化31】

【0134】

１０Ｌの三口フラスコ中で、３７８ｇのＡｌｌｏｃ－ＨＳｅｒ－ＯＡｌｌおよび２１６ｇのＥｔ_３Ｎを３４００ｍＬのＤＣＭに溶解した。次いで、２１５ｇのメシルクロリド（ＭｓＣｌ）を滴下添加し、その間、温度を０～１０℃に維持した。反応終了後、アセトン３４００ｍＬを加え、続いて１３５６ｇのＬｉＢｒを少しずつ加えた。反応物を２５～３０℃で一晩維持した。２００ｇのＬｉＢｒおよび５２０ｍＬのアセトンを添加して、反応を完了させた。次いで、溶媒を除去し、残留物を１５３ｇのＡｌｌｏｃ－ＨＳｅｒ－ＯＡｌｌから出発する別のバッチと合わせた。５７２ｇのＡｌｌｏｃ－Ａｂｕ（４－Ｂｒ）－ＯＡｌｌをカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２）後に得た。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 5.99 － 5.75 (m, 2H), 5.52 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.40 － 5.11 (m, 4H), 4.63 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.55 (d, J = 5.4 Hz, 2H), 4.48 (td, J = 8.4, 5.1 Hz, 1H), 3.42 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.50 － 2.34 (m, 1H), 2.33 － 2.13 (m, 1H)。ＥＳＩ－ＭＳ Ｃ１１Ｈ１６ＢｒＮＯ４ ［Ｍ＋Ｈ］^＋の計算値：３０６．０３；実測値：３０６．１１。

【0135】

（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ－Ｏ（ｔ－Ｂｕ））_２の合成

【化32】

【0136】

２１０ｇのＬ－シスチン（Ｌ－Ｃｙｓｔｉｎｅ）および４ｋｇの酢酸ｔ－ブチルを５Ｌの三口フラスコ中で混合した。３０１．２ｇのＨＣｌＯ_４を滴下添加した。混合物を一晩撹拌した。２．３ｋｇのＫ_２ＣＯ_３および４．０ｋｇの水を添加した。混合物を一晩撹拌し、次いで、２０ｇのセライトに通して濾過した。分離後、有機層を１Ｌのブラインで洗浄し、次いで濃縮して２５８．８ｇの油状残留物を得た。残留物を２４００ＬのＴＨＦに溶解した後、４３０ｇのＦｍｏｃ－ＯＳｕを加えた。その後、１２６ｇのＮ－メチルモルヒネを滴下添加した。反応混合物を２時間撹拌した。ＴＨＦの溶媒を除去し、１５００ｍＬのＤＣＭを加えて残留物を溶解した。有機溶液を１０％クエン酸溶液、飽和ＮａＨＣＯ_３およびブラインで順次洗浄した。溶媒を除去した後、５００ｍＬのＥｔＯＡｃを添加した。混合物を２時間スラリー化した（slurred）後、濾過した。濾過ケークを乾燥させて、４５３．３ｇの（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ－Ｏ（ｔ－Ｂｕ））_２を得た。収率は６５％であった。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.75 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J = 7.3 Hz, 2H), 7.29 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 5.79 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.74 － 4.53 (m, 1H), 4.50 － 4.29 (m, 2H), 4.29 － 4.17 (m, 1H), 3.37 － 3.07 (m, 2H), 1.50 (s, 9H)。

【0137】

Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ－Ｏ（ｔ－Ｂｕ）の合成

【化33】

【0138】

４３００ｍＬのＴＨＦ中の３６７ｇの（Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ－Ｏ（ｔ－Ｂｕ））_２の溶液に、１７０ｍＬの（ｔ－Ｂｕ）_３Ｐを添加した。混合物を２時間撹拌した後、５５０ｍＬの水を添加して反応をクエンチした。混合物を一晩撹拌した。ＴＨＦの溶媒を除去し、１５００ｍＬのＥｔＯＡｃを添加した。混合物を０．５時間撹拌し、有機物を４５０ｍＬの１０％クエン酸および４５０ｍＬのブラインで順次洗浄した。有機溶液を次の工程で直接使用した。

【0139】

Ａｌｌｏｃ－ＨＣｙｓ（（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－Ｏ（ｔ－Ｂｕ））－３－イル）－ＯＡｌｌの合成

【化34】

【0140】

１０Ｌの４つ口フラスコに、１０８０ｇのテトラブチルアンモニウムブロミドを３３５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ_３に溶解した。ＥｔＯＡｃ中の２５７ｇのＡｌｌｏｃ－Ａｂｕ（４－Ｂｒ）－ＯＡｌｌの５００ｍＬの溶液および最後の工程から得られた２．８ＬのＦｍｏｃ－Ｃｙｓ－Ｏ（ｔ－Ｂｕ）溶液を添加した。混合物を一晩撹拌した。１Ｌのブラインで洗浄した後、有機溶液を濃縮した。カラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２）により４１８ｇの油状残留物を得た。収率は８０％であった。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.31 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 5.97 － 5.81 (m, 2H), 5.70 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 5.43 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.37 － 5.12 (m, 4H), 4.63 (d, J = 5.8 Hz, 1H), 4.61 － 4.43 (m, 4H), 4.39 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 4.23 (t, J = 7.1 Hz, 1H), 4.12 (q, J = 7.1 Hz, 1H), 3.08 － 2.85 (m, 2H), 2.72 － 2.47 (m, 2H), 2.22 － 2.07 (m, 1H), 2.02 － 1.86 (m, 1H), 1.49 (s, 9H)。ＥＳＩ－ＭＳ Ｃ３３Ｈ４０Ｎ２Ｏ８Ｓ［Ｍ＋Ｎａ］^＋についての計算値：６４７．２４；実測値：６４７．２４．

【0141】

Ａｌｌｏｃ－ＨＣｙｓ（（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ）－３－イル）－ＯＡｌｌの合成

【化35】

【0142】

５Ｌフラスコに３０８ｇのＡｌｌｏｃ－ＨＣｙｓ（（Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－Ｏ（ｔ－Ｂｕ）－３－イル）－ＯＡｌｌ、２４３０ｍＬのＴＦＡおよび５３ｇのｉ－Ｐｒ_３ＳｉＨを加えた。溶液を２０～２５℃で一晩撹拌した後、溶媒を除去した。５２０ｍＬのＤＣＭを添加し、溶液を濃縮して残りのＴＦＡを除去した。５２０ｍＬのＤＣＭを添加し、溶液を濃縮して残りのＴＦＡを除去した。１ＬのＭＴＢＥを添加して残留物を溶解した。有機溶液を４Ｌの飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液で中和した。混合物を濾過した後、固体を３ＬのＤＣＭに溶解した。有機溶液を１Ｌの２０％クエン酸溶液で洗浄して酸性化した。得られた有機溶液を９００ｍＬの１０％クエン酸溶液、５００ｍＬのブラインで順次洗浄した。有機層を１５０ｇのＭｇＳＯ_４で乾燥させ、次に、混合物を濾過した。溶媒を除去し、残留物を撹拌して固化させ、２３７ｇの固体生成物を得た。収率は８４．４％であった。¹H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ 7.75 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.60 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.39 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.30 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 6.43 (s, 3H), 5.99 － 5.79 (m, 3H), 5.55 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 5.39 － 5.13 (m, 4H), 4.76 － 4.28 (m, 8H), 4.23 (dd, J = 7.0 Hz, 1H), 3.22 － 2.76 (m, 2H), 2.74 － 2.48 (m, 2H), 2.14 (s, 1H), 1.97 (s, 1H)。ＥＳＩ－ＭＳ Ｃ２９Ｈ３２Ｎ２Ｏ８Ｓ ［Ｍ＋Ｈ］^＋の計算値：５６９．２０；実測値：５６９．１２。

【0143】

実施例３
Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｃｔｈ［３－Ｂｏｃ－Ｌ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），４－Ｏアリル］－ＯＨビルディングブロックの調製
Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｃｔｈ［３－Ｂｏｃ－Ｌ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ），４－Ｏアリル］－ＯＨビルディングブロックに到達するために、以下のスキームに示すように、３つのビルディングブロックを別々に合成し（パートＡ～Ｃ）、組み合わせて（パートＤ）、表題化合物を合成する。
パートＡ：

【化36】

パートＢ：

【化37】

パートＣ：

【化38】

パートＤ：

【化39】

【化40】

【0144】

他の実施形態
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態によって限定されない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な修正は、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかになる。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されている。全ての値は近似値であり、説明のために提供されていることを更に理解されたい。

【0145】

全ての特許、特許出願、刊行物、製品説明およびプロトコルは、本出願を通して引用され、その開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【図1】

【配列表】

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【国際調査報告】