特表 2024-541794 樹状細胞を標的する新規なペプチド、及びこれを含む癌治療用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-13

(54)【発明の名称】樹状細胞を標的する新規なペプチド、及びこれを含む癌治療用組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20241106BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 38/02 20060101ALI20241106BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241106BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 39/106 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20241106BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K14/47

A61K38/10

A61K38/02

A61P35/00

A61P37/04

A61K48/00

A61K39/106

A61K39/00 H

A61K47/64

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024513491

(86)(22)【出願日】2022-10-26

(85)【翻訳文提出日】2024-02-28

(86)【国際出願番号】 KR2022016492

(87)【国際公開番号】W WO2023075421

(87)【国際公開日】2023-05-04

(31)【優先権主張番号】10-2021-0146081

(32)【優先日】2021-10-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】308026861

【氏名又は名称】インダストリー ファウンデーション オブ チョンナム ナショナル ユニバーシティー

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(72)【発明者】

【氏名】イ，ジョン ヘン

(72)【発明者】

【氏名】リ，シ ウン

(72)【発明者】

【氏名】ヴィヴェック，ヴァーマ

(72)【発明者】

【氏名】プース，サオ

(72)【発明者】

【氏名】ホン，ソル ヒ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC06

4C076CC27

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA18

4C084BA41

4C084CA53

4C084NA13

4C084NA14

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB261

4C084ZB262

4C085AA03

4C085BA20

4C085BB01

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045CA40

4H045CA42

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、生体内樹状細胞を標的する新規なペプチド、及びこれを含む癌治療用組成物に関する。具体的には、生体内樹状細胞を標的する新規なペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンを含む癌治療又は予防用組成物に関する。また、本発明の生体内樹状細胞を標的する新規なペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンは、一つのペプチドで連結されるか、それぞれのペプチドに含まれてよい。
【選択図】 図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

樹状細胞を標的とする、配列番号１～配列番号１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項2】

配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項3】

配列番号６、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項4】

配列番号６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項5】

生体内で樹状細胞と結合してその活性を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項6】

腫瘍抗原及びフラジェリンからなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項7】

前記腫瘍抗原４個を連続して含むことを特徴とする、請求項６に記載の癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項8】

前記腫瘍抗原は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項9】

前記フラジェリンは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項10】

配列番号６のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項11】

配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項12】

長期生存を誘導することを特徴とする、請求項６に記載の癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項13】

免疫増強効果を有することを特徴とする、請求項６に記載の癌治療又は予防用ペプチド。

【請求項14】

請求項１～１１のいずれか一項のペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項15】

請求項１のペプチドを含む癌治療又は予防用薬学組成物。

【請求項16】

腫瘍抗原及びフラジェリンからなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載の癌治療又は予防用薬学組成物。

【請求項17】

前記腫瘍抗原４個を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の癌治療又は予防用薬学組成物。

【請求項18】

請求項１のペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンを含み、
前記請求項１のペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンが、一つのペプチドに連結されているか、又は、それぞれのペプチドで含まれることを特徴とする、請求項１６に記載の癌治療又は予防用薬学組成物。

【請求項19】

請求項１のペプチドを含む癌治療又は予防用ワクチン組成物。

【請求項20】

腫瘍抗原及びフラジェリンからなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載の癌治療又は予防用ワクチン組成物。

【請求項21】

前記腫瘍抗原４個を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の癌治療又は予防用ワクチン組成物。

【請求項22】

請求項１のペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンを含み、
前記請求項１のペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンが、一つのペプチドに連結されているか、又は、それぞれのペプチドで含まれることを特徴とする、請求項２０に記載の癌治療又は予防用ワクチン組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、生体内樹状細胞を標的する新規なペプチド（ａ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ）、及びこれを含む癌治療用組成物に関する。具体的には、生体内樹状細胞を標的する新規なペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンを含む癌治療又は予防用組成物に関する。また、本発明の生体内樹状細胞を標的する新規なペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンは一つのペプチドで連結されるか、それぞれのペプチドに含まれてよい。

【背景技術】

【0002】

既存の癌治療方法には、手術、放射線療法、及び抗癌剤を用いた化学療法などで癌細胞を極力除去する方法があり、これらは比較的広範囲に癌治療に利用できるが、副作用を伴うだけでなく完治が難しいため、癌の根本的な治療法にはならない実情である。特に、転移癌や再発癌はたいてい手術が不可能であり、化学的治療剤に抵抗性を有する場合が多いため、このような癌患者のための新しい治療剤の開発が切に望まれる実情である。

【0003】

かかる従来の癌治療法の限界を克服するために、抗癌免疫治療研究が活発に行われており、最近では、世界的に臨床での使用が許可されている。抗癌免疫治療は、体内免疫細胞の特性を用いて癌細胞に対する免疫活性を高めるか、癌細胞が免疫細胞の攻撃から回避する方法を抑制させることによって癌を治療する方法であり、免疫細胞療法（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ）、免疫チェックポイント抑制剤（Ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、治療用癌ワクチン（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ）、抗体治療剤（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）などがある。

【0004】

治療用癌ワクチンは、自然に発生した癌組織（ｉｎｔａｃｔ ｔｕｍｏｕｒ ｃｅｌｌ）、癌細胞株に由来する癌溶解物（ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）又は腫瘍抗原（ｔｕｍｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ）を用いた抗癌ワクチン（ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ）と、癌細胞由来抗原又は癌溶解物を露出させて生成した自己由来樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ，ＤＣ）を用いたＤＣ癌ワクチン（ＤＣ－ｂａｓｅｄ ｃａｎｃｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ）がある。

【0005】

最近に研究開発されている樹状細胞を用いた癌治療剤は、既存のいかなる治療剤よりも患者指向的であり、記憶免疫によって長期効能を示すことができるため、同一癌に対する転移や再発の防止に非常に効果的であると共に安全である。したがって、新しい抗癌免疫治療法として期待され、種々の癌に対する治療用ワクチンとして開発されている。特に、樹状細胞癌ワクチンは、原発癌を手術で除去した後に転移及び再発を防止できる治療剤として用いることができ、癌治療の市場で相当な競争力を持つようになるであろう。

【0006】

樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ，ＤＣ）は、哺乳類免疫系の抗原提示細胞であり、膜性或いは棘のような樹枝状の突起を持っている。樹状細胞の主な機能は、抗原物質を処理して免疫系のＴ細胞に提示することである。したがって、樹状細胞は、非感作Ｔリンパ球を活性化させる主要な抗原標識細胞で、自然免疫体系と適応免疫体系との間でメッセンジャーの役割を担う。現在まで免疫システムを用いた癌治療が多数の動物実験から証明されたし、ヒトのＴリンパ球によって認識される腫瘍特異的抗原の同定が免疫療法の発達を促進している。

【0007】

樹状細胞を標的とする様々な抗癌ワクチン戦略が研究されてきた。一部は、樹状細胞を試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で操作することを基盤とし、残り一部は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で樹状細胞を刺激することを基盤とする。前者では、樹状細胞は、患者から採取した血液細胞から分化される。すなわち、体外において腫瘍抗原ペプチド、腫瘍溶解物（ｌｙｓａｔｅｓ）、死滅腫瘍細胞、又は自己腫瘍から抽出された熱衝撃タンパク質と共に培養及び成熟させ、最終的には、患者に再び注入される。しかしながら、最近の研究結果によれば、未成熟樹状細胞を細胞治療剤として用いる場合に却って癌をより活性化させる結果につながり、十分に成熟した成熟樹状細胞を用いなければならないという問題点がある他、個人に合わせた個別化治療剤であるため高コストとなる短所もある。後者では、樹状細胞の刺激は、ペプチド、タンパク質、放射線照射腫瘍細胞又は樹状細胞をターゲットとする抗原性ペプチドを含有する他のウイルスを患者内に注入した後に行われる。しかし、樹状細胞の活性化は、細胞傷害性Ｔリンパ球を効果的に活性化する能力に影響されるので、樹状細胞活性化の程度は繊細な要素であると判断される。

【0008】

一方、鞭毛のフィラメントを構成する構成単位タンパク質をフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）という。フラジェリンは規則的に組み合わされてフィラメントを形成し、バクテリアが動き得るように働く。このようなフラジェリンは、パターン認識受容体を刺激する物質で、ワクチン担体タンパク質又はワクチン補助剤の開発の対象として研究されてきた。抗原とフラジェリンとの融合タンパク質は、肺炎、ウェストナイル発熱、マラリア、結核、及び細菌性歯周疾患をはじめとする様々な感染性疾病に対する実験用ワクチンとして効果的であることが立証され、フラジェリンによるＴＬＲ５活性化は、造血細胞と放射線による胃腸組織を保護し、癌細胞の生存と成長に影響を及ぼすものとして報告されたことがある。また、韓国登録特許第１０－０７９５８３９号において、本発明者らは、敗血症ビブリオ菌の構成成分であるフラジェリン（ＦｌａＢ）が宿主細胞のＴｏｌｌ様受容体５（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５）に作用して強力な免疫調節効果を誘導することにより、優れた粘膜ワクチン補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）の効能を示すことを証明した。

【0009】

したがって、本発明の発明者らは、生体内で樹状細胞を標的する新規なペプチドをバイオパニングによって発掘したし、前記樹状細胞を標的する新規なペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンを含む組換え一体型ポリペプチドワクチンを開発し、癌治療に対してより優れた効果を有する組成物を完成するに至った。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】韓国登録特許第１０－０７９５８３９号

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Ｌｅｅ ＳＥ，Ｋｉｍ ＳＹ，Ｊｅｏｎｇ ＢＣ，Ｋｉｍ ＹＲ，Ｂａｅ ＳＪ，Ａｈｎ ＯＳ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｌａｇｅｌｌｉｎ，Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ＦｌａＢ，ｈａｓ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００６；７４（１）：６９４－７０２．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

本発明は、生体内樹状細胞を標的する新規なペプチドを提供することを目的とする。

【0013】

本発明は、樹状細胞を標的する新規なペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンを含む癌治療又は予防用ペプチドを提供することを目的とする。

【0014】

本発明は、生体内樹状細胞を標的する新規なペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンを含む癌治療又は予防用薬学組成物を提供することを目的とする。

【0015】

本発明は、生体内樹状細胞を標的する新規なペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンを含む癌治療又は予防用ワクチン組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明は、樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドを提供する。

【0017】

また、前記ペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

【0018】

前記樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドは、配列番号１～配列番号１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでよく、好ましくは、ペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含んでよい。より好ましくは、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含んでよく、最も好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列を含んでよい。

【0019】

前記樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドは、生体内で樹状細胞と結合してその活性を誘導するものであってよい。

【0020】

前記樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドは、腫瘍抗原及びフラジェリンからなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むものであってよく、前記腫瘍抗原を４個連続して含むものであってよい。

【0021】

前記腫瘍抗原は、配列番号２２のアミノ酸配列を含んでよく、前記フラジェリンは配列番号２３のアミノ酸配列を含んでよい。

【0022】

前記樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含んでよく、好ましくは、配列番号２５のアミノ酸配列を含んでよい。

【0023】

前記樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドは、長期生存を誘導するものであってよく、免疫増強効果を有するものであってよい。

【0024】

また、本発明は、前記樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドを含む癌治療又は予防用薬学組成物を提供する。

【0025】

また、本発明は、前記樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドを含む癌治療又は予防用ワクチン組成物を提供する。

【0026】

前記樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドを含む癌治療又は予防用薬学組成物、又はワクチン組成物は、腫瘍抗原及びフラジェリンからなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むものであってよく、前記腫瘍抗原を４個連続して含むものであってよい。

【0027】

前記樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドを含む癌治療又は予防用薬学組成物、又はワクチン組成物は、樹状細胞を標的するペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンが一つのペプチドで連結されるか、それぞれのペプチドに含んでよい。

【発明の効果】

【0028】

本発明の生体内樹状細胞を標的する新規なペプチド（ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｖｏ）、腫瘍抗原及びフラジェリンを含む組成物は、強力な樹状細胞の活性化及び免疫増強効能を誘導することで、腫瘍抗原特異抗癌免疫反応を増加させ、優れた癌抑制効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1】本発明の全般を示す図である。

【0030】

【図2】マウスにおける生体内バイオパニング過程の概略図である。

【0031】

【図3】マウスにおいて生体内バイオパニングのラウンドによるファージミド粒子の濃縮及び頻度を示す。

【0032】

【図4】マウスにおいて生体内バイオパニングのラウンドによって得られたペプチドの配列を示す。

【0033】

【図5】マウスにおいて２回の生体内バイオパニング後に選択された６個のペプチドを示す。

【0034】

【図6】骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）において本発明の樹状細胞標的ペプチドの細胞吸収を測定した結果を示す。

【0035】

【図7】リンパ節細胞、脾臓樹状細胞及び骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）において本発明の樹状細胞標的ペプチドの細胞吸収を測定した結果を示す。

【0036】

【図8】マウス鼻腔にペプチドを投与した後、共焦点顕微鏡観察による頸部リンパ節（ｃＬＮ）細胞における本発明のＤＣｐｅｐ６ペプチドの位置を示す。

【0037】

【図9】本発明のペプチド成分の概略図である。

【0038】

【図10】ＦｌａＢ、Ｅ７ΔＮＬＳ、ＥＦ及びＤＥＦのＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット結果を示す。

【0039】

【図11】Ｅ７_ＦＬ、Ｅ７ΔＮＬＳ、ＦｌａＢの単独投与及び混合投与によるマウスの腫瘍体積及びサイズを示す。

【図12】Ｅ７_ＦＬ、Ｅ７ΔＮＬＳ、ＦｌａＢの単独投与及び混合投与によるマウスの腫瘍体積及びサイズを示す。

【0040】

【図13】ＦｌａＢ、ＥＦ及びＤＥＦのＴＬＲ－５刺激によるＮＦ－κＢの活性レベルを示す。

【0041】

【図14】骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）においてＥＦ及びＤＥＦの細胞吸収をフローサイトメトリー分析によって測定した結果を示す。

【0042】

【図15】共焦点顕微鏡観察による骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）及びＲａｗ２６４．７細胞におけるＥＦ及びＤＥＦの位置を示す。

【0043】

【図16】ＥＦ及びＤＥＦ投与後に時間による生体リンパ節内分布を示す。

【0044】

【図17】排液鼠径リンパ節（ｉＬＮ）細胞においてＥＦ及びＤＥＦの細胞吸収を測定した結果を示す。

【0045】

【図18】Ｅ７Ｐｅｐ＋Ｆ、Ｅ７ΔＮＬＳ、ＥＦ及びＤＥＦ投与によるマウスの生存率を示す。

【図19】Ｅ７Ｐｅｐ＋Ｆ、Ｅ７ΔＮＬＳ、ＥＦ及びＤＥＦ投与によるマウスの生存率及び腫瘍体積を示す。

【0046】

【図20】ＥＦ及びＤＥＦによる骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）のＣＤ８０及びＣＤ８６発現程度を示す。

【0047】

【図21】Ｅ７ΔＮＬＳ、ＥＦ及びＤＥＦ投与によるマウスの末梢血液ＣＤ８^＋細胞においてＥ７－ＣＴＬエピトープに選択的なテトラマー陽性細胞を測定した結果を示す。

【図22】Ｅ７ΔＮＬＳ、ＥＦ及びＤＥＦ投与によるマウスの末梢血液ＣＤ８^＋細胞においてＥ７－ＣＴＬエピトープに選択的なテトラマー陽性細胞を測定した結果を示す。

【0048】

【図23】Ｅ７ΔＮＬＳ、ＥＦ及びＤＥＦ投与によるマウスの脾臓又は腫瘍リンパ節においてＩＦＮ－γ分泌細胞を測定した結果を示す。

【図24】Ｅ７ΔＮＬＳ、ＥＦ及びＤＥＦ投与によるマウスの脾臓又は腫瘍リンパ節においてＩＦＮ－γ分泌細胞を測定した結果を示す。

【0049】

【図25】ＥＦ及びＤＥＦ投与による野生型（ＷＴ）、ＴＬＲ５欠乏（ＴＬＲ５^－／－）及びＮＬＲＣ４欠乏（ＮＬＲＣ４^－／－）マウスの生存率及び腫瘍体積を示す。

【0050】

【図26】ＥＦ及びＤＥＦ投与による野生型（ＷＴ）及びＮＬＲＣ４欠乏（ＮＬＲＣ４^－／－）マウスのＣＤ８^＋Ｔ細胞の分裂指数を示す。

【発明を実施するための形態】

【0051】

以下、添付の図面を参照して、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように本願の実施態様及び実施例を詳細に説明する。ただし、本願は様々な形態で具現可能であり、ここで説明する実施態様及び実施例に限定されない。

【0052】

本願明細書全体を通じて、ある部分がある構成要素を「含む」としたとき、これは、特に断らない限り、他の構成要素を排除することではなく、他の構成要素をさらに含んでよいことを意味する。

【0053】

本発明は、バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）によって発掘した生体内で樹状細胞を標的する新規なペプチドを提供する。

【0054】

前記生体内樹状細胞を標的する新規なペプチドは、脾臓及びリンパ節から分離された樹状細胞、及び様々な骨髄から誘導された樹状細胞を標的する能力に優れ、生体内で樹状細胞を効果的に活性化させることができる。

【0055】

一実施態様において、本発明の生体内樹状細胞を標的する新規なペプチドは、配列番号１～配列番号１１のアミノ酸配列を含むものであってよく、好ましくは、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むものであってよい。より好ましくは、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むものであってよく、最も好ましくは配列番号６のアミノ酸配列を含むものであってよい。

【0056】

本発明において、「バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）」は、ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）をはじめとするバクテリアディスプレイ（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）又はｍＲＮＡディスプレイ（ｍＲＮＡ ｄｉｓｐｌａｙ）、リボソームディスプレイ（ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ）、酵母ディスプレイ（ｙｅａｓｔ ｄｉｓｐｌａｙ）などのような様々なディスプレイ技術によって構成されたペプチドライブラリー（ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｙ）から与えられたターゲットに親和性を有するペプチドを選別する技術である。

【0057】

本発明の「樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ，ＤＣ）」とは、主要組織適合複合体（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）／ペプチド複合体によってＴ細胞受容体と相互作用してＴ細胞の活性化及び分化を調節することにより、自然免疫反応と適応免疫反応とを連結する上で中核的な役割を担う専門的な抗原提示細胞である。樹状細胞は、ヒト末梢循環血液に由来する場合に、ＣＤ１４が陽性であり、樹状細胞に分化するにつれてＣＤ１１ｃ及びＣＤ６８細胞表示因子が陽性を示すことが知られている。

【0058】

本発明において「ＣＤ１１ｃ」とは、ｉｎｔｅｇｒｉｎ ＣＤ１８ ｆａｍｉｌｙの一つで、ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８の形態でヘテロ二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）形態をなしており、補体レセプター４（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ４）として貪食作用に関与する。ヒトのＣＤ１１ｃは主に、単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）の原形質膜（ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ）、マクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、ナチュラルキラー細胞（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ）、及び大部分の樹状細胞（ｄｅｎｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）に発現することが知られているが、マウスではほとんど樹状細胞にのみ発現し、樹状細胞の最良の標識子（ｍａｒｋｅｒ）として知られている。

【0059】

本発明は、樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドを提供する。

【0060】

また、前記ペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

【0061】

一実施態様において、前記ペプチドは、配列番号１～配列番号１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでよく、好ましくは、ペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含んでよい。より好ましくは、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含んでよく、最も好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列を含んでよい。

【0062】

前記ペプチドは、生体内で樹状細胞と結合してその活性を誘導することができる。

【0063】

前記樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドは、腫瘍抗原及びフラジェリンからなる群から選ばれる一つ以上をさらに含んでよい。

【0064】

一実施態様において、前記ペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含んでよい。

【0065】

一実施態様において、前記ペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を４個連続して含んでよく、好ましくは、配列番号２５のアミノ酸配列（ＤＣｐｅｐ６－４ｘＥ７ΔＮＬＳ－ＦｌａＢ）を含んでよい。

【0066】

前記配列番号２２のアミノ酸配列は腫瘍抗原を示し、前記腫瘍抗原は、腫瘍細胞にのみ発現する腫瘍特異的抗原で、突然変異によるタンパク質、腫瘍特異的癌遺伝子又はウイルス性癌遺伝子であってよい。

【0067】

一実施態様において、前記腫瘍抗原は、ＨＰＶ１６Ｅ７（Ｅ７_ＦＬ）からＮ末端核局在化配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＮＬＳ）が欠失したＥ７ＮＬＳであってよい。

【0068】

前記配列番号２３のアミノ酸配列は、敗血症ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｎｉｇｉｃｕｓ）に由来するフラジェリンＢ（ＦｌａＢ）を示し、前記フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）はバクテリア鞭毛のフィラメントを構成する主要タンパク質であり、鞭毛性細菌が感染された場合に、感染された宿主内で免疫反応を誘導することができる。具体的には、人体の細胞膜の表面に存在するＴｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５；Ｔｏｌｌ ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ５）は、前記フラジェリンとの相互作用によって細胞内信号伝達を誘発し、これによって転写因子であるＮＦ－κＢの発現が増加して先天性免疫信号活性化を誘導するだけでなく、獲得免疫反応を調節することができる。また、人体の細胞内に存在するＮＡＩＰ（ＮＬＲ ｆａｍｉｌｙ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）は、前記フラジェリンとの相互作用によってＮＬＲＣ４（ＮＬＲ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ ｃａｓｐａｓｅ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ ｄｏｍａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ４）インフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）活性化を誘発し、これによって転写因子であるＮＦ－κＢの発現が増加して先天性免疫信号活性化を誘導するだけでなく、獲得免疫反応を調節することができる。

【0069】

一実施態様において、前記フラジェリンは、敗血症ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｎｉｇｉｃｕｓ）に由来するフラジェリンＢ（ＦｌａＢ）であり、韓国登録特許第１０－０７９５８３９号に開示の方法によって製造されてよく、これらの文献はその全文が本発明に参照によって援用される。

【0070】

本発明は、生体内樹状細胞を標的する癌治療用又は予防用ペプチドを含む癌治療又は予防用薬学組成物を提供する。

【0071】

また、本発明は、生体内樹状細胞を標的する癌治療用又は予防用ペプチドを含む癌治療又は予防用ワクチン組成物を提供する。

【0072】

前記樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドを含む癌治療又は予防用薬学組成物、又はワクチン組成物は、腫瘍抗原及びフラジェリンからなる群から選ばれる一つ以上をさらに含んでよい。

【0073】

前記樹状細胞を標的する癌治療又は予防用ペプチドを含む癌治療又は予防用薬学組成物、又はワクチン組成物は、樹状細胞を標的するペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンが一つのペプチドで連結されるか、それぞれのペプチドに含んでよい。

【0074】

一実施態様において、前記薬学組成物又はワクチン組成物は、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むペプチドを含むか、配列番号６のアミノ酸配列を含むペプチド、配列番号２２のアミノ酸配列を有するペプチド、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むペプチドをそれぞれ含んでよい。

【0075】

一実施態様において、前記ペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列を４個連続して含んでよく、好ましくは、配列番号２５のアミノ酸配列（ＤＣｐｅｐ６－４ｘＥ７ΔＮＬＳ－ＦｌａＢ）を含んでよい。

【0076】

本発明の薬学組成物又はワクチン組成物は、抗原非特異的及び特異的免疫誘導物質を含み、生体内での全般的な免疫反応及び特定抗原に対する特異的な免疫反応を誘導できる。

【0077】

本発明の薬学組成物又はワクチン組成物は、抗腫瘍効果を示すことができる。

【0078】

本発明の薬学組成物又はワクチン組成物は、免疫増強効果を示すことができる。

【0079】

本発明の薬学組成物又はワクチン組成物は、前記組成物が投与された対象において長期生存を誘導することができる。

【0080】

本発明に使われた用語「薬学組成物」は、特定の目的のために投与される組成物を意味する。本発明の目的上、本発明の薬学組成物は、生体内樹状細胞を標的するペプチド、腫瘍抗原及びフラジェリンを含む癌治療又は予防用組成物である。

【0081】

本発明に使われた用語「ワクチン」は、宿主であるヒトを含む動物から当該病原体に対する免疫反応を誘導することによって、当該病原体の感染又は再感染の予防、当該病原体による症状の重症度の減少又は症状の除去、又は当該病原体やその病原体による疾患の実質的又は完全な除去を含む意味である。また、本発明に使われる用語「ワクチン」は、宿主であるヒトを含む動物において当該特定抗原に対する免疫反応を調節することによって、当該抗原と関連した疾患症状の重症度の減少又は症状の除去、又は当該疾患の実質的又は完全な除去を含む意味である。したがって、本発明の「ワクチン組成物」は、当該病原体の感染前に予防的に、又は当該病原体の感染後に治療的に、ヒトを含む動物に投与されてよい。

【0082】

本願に使われた用語「治療」は、組成物の投与によって疾患の疑い及び発病個体の症状が好転するか有益に変更される全ての行為を意味し、「予防」は、組成物の投与によって疾患の発病を抑制又は遅延させる全ての行為を意味する。

【0083】

本発明によれば、樹状細胞を効果的に活性化させることができる他にも、腫瘍細胞特異的免疫を効果的に誘導でき、顕著に向上した抗癌免疫を誘導することができる。

【0084】

以下、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、下記の実施例は、単に説明の目的のためのものであり、本願発明の範囲を限定するためのものではない。

【0085】

［実施例１］
樹状細胞標的ペプチドを発掘するための生体内バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）
図２に示すように、本発明の生体内樹状細胞（ＤＣ）を標的するペプチドを発掘するために下記のように行った。

【0086】

生体内バイオパニングのために、１０μｌのＣＰＬ３ペプチドファージミドライブラリー（１０^１２ｐｆｕ／ｍｌ）を、Ｂａｌｂ／ｃマウスの各鼻孔に注入した。ライブラリーファージは３匹のマウスに注入した。生体内パンニング６時間後に、マウスを安楽死させ、頸部リンパ節（ｃＬＮ）を採取した。採取したｃＬＮを遠心分離し、０．２％ ＰＢＳＴで３回以上洗浄した後、１００μｌの０．２Ｍ グリシン－ＨＣｌバッファー、ｐＨ ２．２で１回洗浄した。その後、ｃＬＮを同一のバッファーに入れて常温で１０分間培養した後、グリシンバッファー（ｇｌｙｃｉｎｅ ｂｕｆｆｅｒ）を、冷たい１ｘ ＰＢＳに入れ換えた。ｃＬＮのカプセルを軽く砕け、細胞懸濁液を４０μｍ細胞濾過器（Ｆａｌｃｏｎ，３５２３４０）に通過させた。生成された単一細胞懸濁液を遠心分離し、グリシンバッファーで５分間処理した後、細胞をＰＢＳで洗浄してＭＡＣＳバッファーに懸濁させた。

【0087】

細胞懸濁液は、ＣＤ１１ｃ^＋ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０５２－００１）で標識させ、ＤＣは、メーカーの推奨事項に従って磁場を適用して精製した。精製されたＤＣをグリシンバッファーにさらに５分間入れた後、細胞をＰＢＳＴ（１ｘ ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて３回以上洗浄した。その後、細胞内ファージを溶出するために、１００μｌグリシンバッファーに懸濁して高速遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０分）を用いて５回の凍結解凍サイクルで破壊した。細胞破壊は、トリパンブルー染色で確認した。サイクルの末尾で同一体積の１ｘ ＰＢＳ（ｐＨ ７．５）を添加してグリシンバッファーを中和した。最終的に調製物を遠心分離し、溶出されたファージを含む上澄液を回収して－２０℃で保管した。調製物のファージ力価は、標準プロトコルによって決定された。ファージミドを含む個別バクテリアクローンは、アンピシリン（２００μｇ／ｍｌ）含有のルリア培地（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）でＯＤ_６００値が０．５になるまで培養した。全ての４５個のバクテリアクローンの同一のボリュームを共に混合し、１３時間、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを用いてファージを溶出させた後、大腸菌ＴＧ１で増幅させた。細胞のない上澄液のファージは、ＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿によって回収された（４℃／ｏ／ｎ）。上記（１ラウンド）と類似な方式により、１ラウンドで増幅されたファージを用いて２ラウンドのパンニングを行ったし、ラウンドによって得られたファージのＤＮＡ配列は、ジデオキシ塩基配列法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって決定された。

【0088】

前記２回の生体内バイオパニング後に、ラウンドによるファージ回収率を計算して図３に示し、ラウンドによって得られたペプチドの配列を図４に示した。

【0089】

図３及び図４に示すように、２回の生体内バイオパニング後にファージの回収率は増加し、ペプチド配列の多様性は減少し、反復して現れるペプチド配列を確認した。

【0090】

また、前記２ラウンドでシーケンシングされた５０個のペプチドのうち、樹状細胞（ＤＣ）標的化をテストするために多重決定された６個のペプチドを選択し、下記表１に示した。

【0091】

【表1】

【0092】

樹状細胞標的能力を確認するためにペプチドの視覚化が必要であり、視覚化のためにはビオチン（ｂｉｏｔｉｎ）をタギング（ｔａｇｇｉｎｇ）しなければならない。また、前記ビオチンタギングのためには、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）残基が必要であるが、前記ペプチド１～５はアミノ酸配列中にリジンを含まないため、アミノ酸特性の上、リジンと類似な電気化学的特性を有するアルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）をリジンで置換した。したがって、最終に決定された６個のペプチド（ＤＣｐｅｐ １～６）を、下記表２及び図５に示す。

【0093】

【表2】

【0094】

［実施例２］
樹状細胞標的ペプチドの標的効率確認
上記の実施例１で決定された６個のペプチドの樹状細胞（ＤＣ）標的効率を確認するために下記のように行った。

【0095】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨及び脛骨をフラッシングして骨髄細胞を分離した後、赤血球（ＲＢＣ）をＡＣＫ溶解（ｌｙｓｉｓ）（Ｇｉｂｃｏ，Ａ１０４９２－０１）によって除去した。細胞を遠心分離した後、７０μｍフィルターで濾過し、１０％熱－不活性化ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ １６４０培地に懸濁した。細胞を、ＧＭ－ＣＳＦ（１０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，４１５－ＭＬ－０１０）及びＩＬ－４（１０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，４１５－ＭＬ－０１０）を含むＲＰＭＩ １６４０培養培地に懸濁し、細胞培養皿に接種して３７℃、５％ ＣＯ_２で培養した。培養培地は２日ごとに新しく入れ換えた。７～８日に、底に弱く付いてある樹状細胞（ＤＣ）を穏やかなピペッティングで収集して骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を準備した。脾臓樹状細胞は、メーカー指示に従ってＣＤ１１^＋ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，１３０－０５２－００１）によって準備した。

【0096】

ペプチドは、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル化学（９－ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いて合成したし、高圧液体クロマトグラフィーを用いて純度９５％以上に精製したし、側鎖にビオチン化させた（韓国、Ａｎｙｇｅｎ Ｉｎｃ．）。ペプチドは、適切な溶媒に０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解させた。合成されたペプチドの樹状細胞（ＣＤ１１ｃ^＋）標的化をテストするために、頸部リンパ節（ｃＬＮ）細胞、脾臓樹状細胞及び骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、ＲＰＭＩ１６４０培地で前記６個のペプチドを処理して２時間培養した。培養した後、細胞を採取して洗浄し、抗マウスＣＤ１１^＋ ＡＰＣ－接合抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｌｏｎｅ： Ｎ４１８，１７０１１４－８２）又はストレプトアビジン－ＡＦ４８８で染色した。ＦＡＣＳを用いて樹状細胞（ＣＤ１１ｃ^＋）集団を分析し、その結果を図６及び図７に示した。

【0097】

図６に示すように、骨髄由来樹状細胞からペプチドの細胞吸収を測定した結果、ＤＣｐｅｐ１、２及び５の標的能力は、陰性対照群の標的能力と類似であったが、ＤＣｐｅｐ３、４及び６は、ＣＤ１１ｃ^＋－ＢＭＤＣを効率的に標的化したことが見られた。特に、ＤＣｐｅｐ６ペプチドが顕著に高い値を示した。

【0098】

また、図７に示すように、前記優れた効率を示す３個のペプチド（ＤＣｐｅｐ ３、４及び６）は、頸部リンパ節細胞、脾臓樹状細胞及び骨髄由来樹状細胞のいずれにおいても増加した様相を示した。特に、ＤＣｐｅｐ６ペプチド（配列番号６）が顕著に高い値を示した。

【0099】

したがって、バイオパニングによって発掘した本発明の樹状細胞標的ペプチドのうちＤＣｐｅｐ３、ＤＣｐｅｐ４及びＤＣｐｅｐ６ペプチドが優れた標的効率を示すことを確認したし、特に、ＤＣｐｅｐ６ペプチド（配列番号６）が最も優れた標的効率を有することが分かる。また、リンパ節及び脾臓から分離された樹状細胞、及び骨髄から誘導された樹状細胞のいずれにも標的することが分かる。

【0100】

［実施例３］
樹状細胞標的ペプチドの標的能力確認
上記の実施例２で選択されたＤＣｐｅｐ６ペプチドの生体内での樹状細胞に対する標的能力を確認するために下記のように行った。

【0101】

ＢＡＬＢ／ｃマウスに１０μｌ／ｎｏｓｔｒｉｌの総体積で適切な濃度のペプチドを鼻腔から投与した。以前に樹状細胞に非特異的に現れたスクランブルされたペプチドを陰性対照群として使用した。接種６．５時間後に、マウスを犠牲させ、頸部リンパ節（ｃＬＮ）を採取した。ｃＬＮのカプセルを優しく破って単一細胞懸濁液を準備した。１ｘ ＰＢＳで優しく洗浄した後、細胞を抗マウスＣＤ１１^＋ ＡＰＣ接合抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｌｏｎｅ： Ｎ４１８，１７０１１４－８２）又はストレプトアビジン－ＡＦ４８８で染色し、ＦＡＣＳを用いて分析した。

【0102】

図８に示すように、陰性対照群と比較して、本発明のＤＣｐｅｐ６ペプチドは、頸部リンパ節においてＣＤ１１ｃ^＋細胞の細胞質に明確に局限されることが見られた。したがって、バイオパニングによって発掘した本発明のＤＣｐｅｐ６ペプチド（配列番号６）の樹状細胞（ＣＤ１１ｃ^＋）標的能力を確認した。

【0103】

［実施例４］
ペプチドの製造
下記表３及び図９に示すように、ＨＰＶ１６Ｅ７による腫瘍形成の可能性を排除するためのＮ末端核局在化配列（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＮＬＳ）が欠失したＨＰＶ１６Ｅ７（Ｅ７_ＦＬ）変異体であるＥ７ＮＬＳペプチドを生産するために、切断されたＥ７に該当するＤＮＡ断片を含むｐＥＴ３０ａ＋プラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，６９９０９－Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を構築した。挿入ＤＮＡ断片は、コドン最適化されたＤＮＡ鋳型と配列番号１４及び１５のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。

【0104】

敗血症ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｎｉｇｉｃｕｓ）由来ＦｌａＢは、Ｌｅｅ ＳＥ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｌａｇｅｌｌｉｎ，Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ ＦｌａＢ，ｈａｓ ａ ｓｔｒｏｎｇ ｍｕｃｏｓａｌ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ．２００６；７４（１）：６９４－７０２に開示された方法によって生産された。

【0105】

４ｘＥ７ΔＮＬＳ－ＦｌａＢ（ＥＦ）のペプチドを生産するために、まず、合成された４ｘＥ７ΔＮＬＳ ＤＮＡ断片（ＮｄｅＩ－Ｅ７ΔＮＬＳ－ＥｃｏＲＩ－Ｅ７ΔＮＬＳ－ＳａｌＩ－Ｅ７ΔＮＬＳ－ＳａｌＩ－Ｅ７ΔＮＬＳ－ＨｉｎｄＩＩＩ）を、ＮｄｅＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの特定制限酵素（ＲＥ）によって認識されるオーバーハングを有するｐＥＴ３０ａ＋プラスミドに複製した。次に、ＦｌａＢのＤＮＡ断片はそれぞれ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩオーバーハングを有する配列番号１８及び１９のプライマーを用いてＰＣＲで生成した。前記ＦｌａＢのＤＮＡ断片は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｈｏＩ制限酵素によって分解され、４ｘＥ７ΔＮＬＳのＣ末端に融合してｐＥＴ３０ａ＋：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢを生成した。

【0106】

ＤＣｐｅｐ６－４ｘＥ７ΔＮＬＳ－ＦｌａＢ（ＤＥＦ）のペプチドを生成するために、３ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢのＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ－ＸｈｏＩ制限酵素を用いてｐＥＴ３０ａ＋：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢから抽出し、ｐＥＴ３０ａ＋プラスミドにクローニングしてｐＥＴ３０ａ＋：：３ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢを生成した。次に、合成されたＤＣｐｅｐ６－Ｅ７ΔＮＬＳ（ＮｄｅＩ－ＤＣｐｅｐ６－Ｅ７ΔＮＬＳ－ＥｃｏＲＩ）のＤＮＡ断片をそれぞれ、ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩオーバーハングを有する配列番号１６及び２０のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ｐＥＴ３０ａ＋：：３ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢのＮ末端にクローニングすることによってｐＥＴ３０ａ＋：：ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢを生成した。

【0107】

発現ベクトルのＤＮＡ塩基配列は、Ｍａｃｒｏｇｅｎ Ｏｎｌｉｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｏｒｄｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｄｎａ．ｍａｃｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｋｏｒ／）からジデオキシ鎖終結塩基配列法（ｄｉｄｅｏｘｙ－ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で確認した。生成されたプラスミドを適格大腸菌ＢＬ２１細胞に形質転換させた。タンパク質発現は、０．２ｍＭ ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ－β－Ｄ－ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）を処理し、２０℃で１８時間培養して誘導したし、細胞は、遠心分離でペレット化して－８０℃に保管した。バクテリア細胞ペレットは、５０ｍｌの溶解バッファー（ｐＨ８；５０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、０．１％ Ｔｗｅｅｎ、及び２０μＭフッ化フェニルメチルスルホニル）で溶解させた。１８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した後、メーカーの指針に従って無細胞上澄液を、Ｎｉ－ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）含有のカラムにローディングした。

【0108】

組換えペプチドの純度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＢＡＬＢ／ｃマウスから生成された抗Ｅ７又は抗ＦｌａＢ抗体を用いたウェスタンブロットで確認し、その結果を図１０に示した。脂質多糖類（ＬＰＳ）汚染は、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて除去し、残されたＴｒｉｔｏｎＸ－１１４の残余物は、１ｍｌのタンパク質に対して０．３ｇのＢｉｏ－ｂｅａｄｓ（登録商標）－２と共に培養し、メーカーの指針に従ってＢｉｏ－Ｂｅａｄｓ（登録商標）ＳＭ－２（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて除去した。残留ＬＰＳ含有量は、ｇｅｌ－ｃｌｏｔｔｉｎｇ Ｅｎｄｏｓａｆｅ ＬＡＬ ｋｉｔ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｎ，ＳＣ）を用いて決定した。タンパク質製剤のＬＰＳレベルは、ＦＤＡ指針（マウス当たりに０．１５ＥＵ／３０ｇ未満）以下に維持された。

【0109】

【表3】

【0110】

前記方法によって製造されたＥ７_ＦＬ、Ｅ７ΔＮＬＳ（Ｅ）、ＦｌａＢ（Ｆ）、４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）及びＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）のペプチド配列を、下記表４に示す。

【0111】

【表4】

【0112】

［実施例５］
Ｅ７ΔＮＬＳの腫瘍抗原効能評価
７～８週齢の雌ＳＰＦ Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ＯＲＩＥＮＴ（キョンギド・ソンナムシ）から購入し、ＴＣ－１細胞は、３７℃、５％ ＣＯ_２で１０％熱－不活性化ＦＢＳ、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。腫瘍は、各マウスの右横腹中央に１００μｌ ＰＢＳに５×１０^４ＴＣ－１細胞を皮下注射して確立した。腫瘍直径が３～５ｍｍに到達すると、腫瘍を有するマウスを無作為に分け、麻酔後に２００μｌ ＰＢＳ、４μｇ ＦｌａＢ（Ｆ）、１０μｇ Ｅ７_ＦＬ（Ｅ_ＦＬ）、１０μｇ Ｅ７_ＦＬ＋４μｇ ＦｌａＢ（Ｅ_ＦＬ＋Ｆ）、８μｇ Ｅ７ΔＮＬＳ及び８μｇ Ｅ７ΔＮＬＳ＋４μｇ ＦｌａＢ（Ｅ＋Ｆ）を腫瘍周辺に５日間隔で３回投与した。腫瘍サイズは３日間隔で測定し、腫瘍体積は腫瘍体積（Ｖ）＝（腫瘍長さ）×（腫瘍幅）×（腫瘍高さ）／２で計算した。

【0113】

図１１及び図１２に示すように、抗腫瘍活性を測定した結果、Ｅ７ΔＮＬＳ（Ｅ）及びＥ７_ＦＬ（Ｅ_ＦＬ）は類似のレベルで腫瘍抑制を誘導し、フラジェリン（Ｆ）が補強されたＥ７ΔＮＬＳ＋ＦｌａＢ（Ｅ＋Ｆ）及びＥ７_ＦＬ＋ＦｌａＢ（Ｅ_ＦＬ＋Ｆ）は、より優れたレベルで腫瘍抑制を誘導することが見られた。一方、フラジェリン（Ｆ）投与だけでは腫瘍の成長を抑制できていないことが見られた。

【0114】

したがって、本発明のＥ７ΔＮＬＳペプチドが最適の腫瘍抗原であることを確認すると共に、フラジェリン（ＦｌａＢ）が抗原媒介腫瘍抑制を向上させることができることを確認した。

【0115】

［実施例６］
ペプチドのＴＬＲ５活性能力評価
ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）ｈＴＬＲ５細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ｈκｂ－ｈｔｌｒ－５）及びＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（登録商標）検出（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ｈｂ－ｄｅｔ２）分析システムを用いて４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）及びＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）のＴＬＲ５依存的ＮＦ－κＢ刺激活性を測定した。また、ＥＣ_５０は、広範囲なタンパク質濃度（ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔウェブサイト、０．０３７５ｎＭ～１９．２９ｎＭ）で各タンパク質濃度に対して３重ＯＤ ６２０ｎｍ値を用いて計算した。

【0116】

図１３に示すように、ＮＦ－κＢの活性レベルを測定した結果、４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）及びＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）は、容量依存的に活性が増加することが見られ、ＴＬＲ５刺激活性を誘導することを確認した。また、４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）及びＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）のＥＣ_５０はそれぞれ、０．３８ｎＭ及び０．３２ｎＭで、ＦｌａＢのＥＣ_５０（０．７３ｎＭ）に比べて格別に低いことが見られたし、このことから、本発明の４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）及びＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）がＴＬＲ５結合活性を妨害しないでＴＬＲ５結合モチーフを安定化させることが分かる。さらに、ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）が４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）と比較してより優れた効果を示すことが分かる。

【0117】

したがって、本発明のＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）は、構造的又は機能的に他のペプチドを含むにもかかわらず、生物学的活性を安定して保つことを確認した。

【0118】

［実施例７］
ペプチドの樹状細胞（ＣＤ１１^＋）標的能力評価
上記の実施例２と同じ方法によって準備した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、ＲＭＰＩ１６４０培地で各濃度の４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）及びＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）で処理して２時間培養した。ＰＢＳのみを処理した細胞を陰性対照群として使用した。培養した後、細胞を、３％のＦＢＳが含まれた冷たい１ｘ ＰＢＳで２回洗浄し、抗マウスＣＤ１１ｃ^＋抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃｌｏｎｅ：Ｎ４１８，２５－０１１４－８２）で４℃で１時間染色し、室温で１０分間４％パラホルムアルデヒド（Ｔ＆Ｉ，ＢＰＰ－９００４）で固定させた。メーカー指針（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，００－８３３３－５６）に従って細胞を透過キットを用いて透過した後、抗ＦｌａＢ抗体を用いて染色し、ＦＡＣＳを用いて樹状細胞（ＣＤ１１ｃ^＋）集団を分析した。その結果を図１４に示した。

【0119】

また、ＢＭＤＣ又はＲａｗ２６４．７細胞をＲＭＰＩ１６４０培地で２０μｇ／ｍｌの４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）及びＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）で処理して２時間培養した。培養した後、細胞を採取して洗浄し、室温で１５分間１００％メタノールで固定させた後、抗マウスＣＤ１１^＋ ＡＰＣ接合抗体と、核を染色するＤＡＰＩを入れ、室温で１時間染色した。冷たい１ｘ ＰＢＳで２回洗浄した後、共焦点顕微鏡を用いて樹状細胞（ＣＤ１１ｃ^＋）内の位置を観察した。その結果を図１５に示した。

【0120】

図１４に示すように、骨髄由来樹状細胞において４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）及びＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）の細胞吸収を測定した結果、ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）は濃度依存的方式で細胞吸収を示したのに対し、４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）ではほとんど見られなかった。

【0121】

また、図１５に示すように、ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）がＣＤ１１ｃ^＋細胞の細胞質に位置し、句読点パターン（ｐｕｎｃｔｕａｔｅｄ ｐａｔｔｅｒｎ）で蓄積されることを確認した。

【0122】

したがって、本発明のＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）は、樹状細胞標的ペプチド（ＤＣｐｅｐ６）を含むことにより、優れた樹状細胞（ＣＤ１１ｃ^＋）標的能力を有することが分かる。

【0123】

［実施例８］
ペプチドの生体内分布確認
精製された４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）及びＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）を、４℃でＦＮＲ６７５－ＮＨＳエステル（ＢｉｏＡｃｔｓ，Ｋｏｒｅａ）と混合し、暗所で一晩撹拌しながら保持した。標識されたＥＦ－ＦＮＲ６７５又はＤＥＦ－ＦＮＲ６７５を遠心フィルター（１０ｋＤａカットオフ）（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ －４，ＵＦＣ８０１０２４）を用いて非接合染料から分離した後、ＰＢＳを用いて洗浄した。その後、ＵＶ－Ｖｉｓ分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（ＵＶ－２７００，Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｊａｐａｎ）を用いてＦＮＲ６７５－ＮＨＳエステルの検量線から、接合されたタンパク質の量を決定した。

【0124】

Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側鼠経部にＰＢＳ、５０μｇ ＥＦ－ＦＮＲ６７５及び５０μｇ ＤＥＦ－ＦＮＲ６７５を皮下投与した。投与して１、６、１２及び２４時間後に排液鼠径リンパ節（ｉＬＮ）を分離し、蛍光イメージングを決定して図１６に示した。また、投与６時間後の排液鼠径リンパ節（ｉＬＮ）細胞を準備し、ＦＡＣＳを用いて樹状細胞（ＣＤ１１ｃ^＋）集団を分析して生体内での樹状細胞標的化を決定し、図１７に示した。

【0125】

図１６に示すように、ＤＥＦ－ＦＮＲ６７５（ＤＥＦ）を投与した場合、投与６時間後に蛍光信号が検出され、投与１２時間後に、より強い蛍光信号が検出されたし、投与２４時間後に蛍光信号が減少したことが見られた。一方、ＥＦ－ＦＮＲ６７５（ＥＦ）はＤＥＦ－ＦＮＲ６７５（ＤＥＦ）と比較してより低い蛍光信号を示した。

【0126】

また、図１７に示すように、ＤＥＦ－ＦＮＲ６７５（ＤＥＦ）を投与した場合に、より高い蛍光信号を示し、投与６時間後にＣＤ１１ｃ^＋細胞から検出されることが見られた。

【0127】

したがって、本発明のＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）は、生体内に投与されると、リンパ循環によって排液リンパ節に効率的に到達するだけでなく、生体内で樹状細胞（ＣＤ１１ｃ^＋）と相互作用できたということを確認した。また、生体内に投与されたＤＥＦは、投与２４時間以内に排液リンパ節から除去されることが分かる。

【0128】

［実施例９］
ペプチドの抗腫瘍効能評価
上記の実施例５と同じ方法によって腫瘍保有マウスに本発明の一体型ワクチンを投与し、マウスの生存率及び腫瘍体積を測定した。陽性対照群としては、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）誘導ペプチドとして知らされたＨＰＶ１６ Ｅ７ ＣＴＬペプチド（アミノ酸４９－５７：ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）を投与した。

【0129】

図１８に示すように、Ｅ７ΔＮＬＳ＋ＦｌａＢ（Ｅ＋Ｆ）及びＤＣｐｅｐ６－４ｘＥ７ΔＮＬＳ－ＦｌａＢ（ＤＥＦ）を投与した群は、Ｅ７ΔＮＬＳ（Ｅ）を投与した群よりも長く生存することが見られたし、特に、ＤＣｐｅｐ６－４ｘＥ７ΔＮＬＳ－ＦｌａＢ（ＤＥＦ）を投与した場合に、最も長い生存を維持することが見られた。また、ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＣＴＬペプチド＋ＦｌａＢ（Ｅ７Ｐｅｐ＋Ｆ）を投与した群に比べても顕著に長い生存を示した。

【0130】

また、図１９に示すように、ＤＣｐｅｐ６－４ｘＥ７ΔＮＬＳ－ＦｌａＢ（ＤＥＦ）を投与した場合に腫瘍体積が最も少なく示されたし、ＨＰＶ１６ Ｅ７ ＣＴＬペプチド＋ＦｌａＢ（Ｅ７Ｐｅｐ＋Ｆ）を投与した群に比べても顕著に少ない体積を示した。

【0131】

したがって、本発明のＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）は、優れた生体内抗腫瘍効能を有することを確認した他にも、長期に生存を維持させ得ることを確認した。また、生体内樹状細胞を標的するペプチド（ＤＣｐｅｐ６）、腫瘍抗原（Ｅ７ΔＮＬＳ）及びフラジェリン（ＦｌａＢ）を含む本発明のペプチドは、腫瘍抗原とフラジェリンのみを含むペプチドに比べてより優れた抗腫瘍効能を有することを確認した。

【0132】

［実施例１０］
ペプチドの免疫反応評価

【0133】

１０－１．抗原提示細胞活性化

【0134】

上記の実施例２と同じ方法によって準備した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を、ＰＢＳ、０．５μｇ／ｍｌ ４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）及び０．５μｇ／ｍｌ ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）で２４時間処理した後、蛍光物質で標識された抗体で氷上で染色した後、フローサイトメトリー分析で分析した。

【0135】

図２０に示すように、ＢＭＤＣ表面上のＣＤ８０及びＣＤ８６発現を測定した結果、ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）はＣＤ８０及びＣＤ８６の発現を向上させたのに対し、４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）は、ＣＤ８０及びＣＤ８６の発現に統計的に有意な変化を誘導しないことが見られた。

【0136】

したがって、本発明のＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）は、抗原提示細胞（Ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ；ＡＰＣ）を活性化させることを確認した。

【0137】

１０－２．抗原特異的Ｔ細胞免疫反応
上記の実施例５と同じ方法によって腫瘍保有マウス及び腫瘍非保有マウスに本発明のペプチドを投与してマウスの末梢血液を収集した。ＲＢＣ溶解（ｌｙｓｉｓ）バッファーを用いてＲＢＣを除去した血液を、テトラマー抗体（ＰＥ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＨＰＶ１６Ｈ－２Ｄｂ－ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、ＴＢ－５００８－１、ＭＢＬ）及びＣＤ８抗体で染色し、フローサイトメトリー分析で分析した。

【0138】

図２１に示すように、腫瘍を保有しているマウスのＣＤ８^＋細胞から細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープ特異的テトラマー＋細胞を測定した結果、ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）を投与した群において、ＰＢＳ、Ｅ７ΔＮＬＳ（Ｅ）及び４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）を投与した群と比較して顕著に高いレベルを示した。

【0139】

また、図２２に示すように、腫瘍を保有していないマウスも、ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）を投与した群において顕著に高いレベルを示した。

【0140】

したがって、本発明のＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）は、抗原特異的Ｔ細胞免疫反応を効果的に誘導することを確認した。

【0141】

１０－３．細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）ペプチド特異的免疫反応

【0142】

上記の実施例５と同じ方法によって腫瘍保有マウス及び腫瘍非保有マウスに本発明のペプチドを投与し、マウスの脾臓（ＳＰＬ）又は腫瘍リンパ節（ＴＤＬＮ）での単一細胞懸濁液を準備した。１×１０^６ ＳＰＬ又は２．５×１０^５ ＴＤＬＮ細胞を９６ウェル濾過（Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｅｒｃ，ＨＡＭＡＳ４５１０）に入れ、１μｇ／ｍｌ Ｅ７ＣＴＬペプチド（アミノ酸４９－５７：ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）で刺激した。１０ｎｇ／ｍｌコンカナバリンＡで刺激された細胞を陽性対照群として使用した。脾臓（ＳＰＬ）から分離した細胞は、培養２日後又は腫瘍リンパ節（ＴＤＬＮ）から分離した細胞は培養５日後に、メーカーの指針に従ってマウスＩＦＮ－γ ＥＬＩＳｐｏｔセット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，５５１０８３）を用いてＩＦＮ－γ生産細胞を検出した。ＩＦＮ－γ生産細胞（ＳＰＯＴ）は、ＣＴＬ－ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔアナライザー及びＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン５．０（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＯＨ，ＵＳＡ）を用いて分析した。

【0143】

図２３に示すように、腫瘍を保有しているマウスの脾臓（ＳＰＬ）及び腫瘍リンパ節（ＴＤＬＮ）からＩＦＮ－γ分泌細胞を測定した結果、ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）を投与した群において、ＰＢＳ、Ｅ７ΔＮＬＳ（Ｅ）及び４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）を投与した群と比較して顕著に高いレベルを示した。

【0144】

また、図２４に示すように、腫瘍を保有していないマウスも、ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）を投与した群において顕著に高いレベルを示した。

【0145】

したがって、本発明のＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）は、ＣＴＬペプチドによる特異的免疫反応を効果的に誘導することを確認した。

【0146】

結果として、本発明のＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）は、生体内で抗原特異的免疫反応を効果的に誘導することを確認したし、このような免疫調節活性誘導によって優れた抗腫瘍免疫反応を誘導できることが分かる。

【0147】

［実施例１１］
ペプチド媒介免疫反応の信号伝達経路評価
野生型（ＷＴ）、ＴＬＲ５欠乏（ＴＬＲ５^－／－）及びＮＬＲＣ４欠乏（ＮＬＲＣ４^－／－）マウスグループの右側横腹中央にＴＣ－１細胞を移植し、腫瘍サイズの直径が約３～５ｍｍに到達した時に、ＰＢＳ単独２００μｌ、４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）２０μｇ、及びＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）２０μｇを５日間隔で３回、腫瘍周囲に投与した。腫瘍保有マウスの腫瘍体積及び生存を測定し、図２５に示した。さらに、ＴＬＲ５又はＮＬＲＣ４欠乏（ノックアウト）がＴＣ－１腫瘍成長に影響を及ぼさないことを、事前実験から確認した。

【0148】

図２５に示すように、ＴＬＲ５欠乏（ＴＬＲ５^－／－）マウスにおいて、ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）を投与した場合に、ＰＢＳグループと比較して有意により長い生存を誘導し、腫瘍体積が減少することが見られたが、野生型マウスにおける場合と比較して顕著に低いレベルだった。また、ＮＬＲＣ４欠乏（ＮＬＲＣ４^－／－）マウスでは、ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）を投与した場合に、腫瘍体積及び生存期間が改善されていないことが見られた。

【0149】

したがって、本発明のＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）のアジュバント（補助剤）機能、すなわち、ＦｌａＢ（Ｆ）が、ＴＬＲ５よりはＮＬＲＣ４インフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）媒介活性化によって作用することを確認した。

【0150】

［実施例１２］
ペプチド媒介ＣＤ８^＋Ｔ細胞活性化評価
上記の実施例２と同じ方法によって準備した骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）に、１μｇ／ｍＬの４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＥＦ）及びＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）で２４時間活性化させた。ＴＣ－１腫瘍保有マウスのＣＤ８^＋脾臓細胞は、メーカーの指示に従ってＭａｇｎｉＳｏｒｔ（登録商標） Ｍｏｕｓｅ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，８８０４－６８２２）を用いて製造したし、５μＭ ＣＦＳＥで標識した。ＥＦ又はＤＥＦで刺激したＢＭＤＣは、１０％牛胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ－ｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）と５０ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，５１６７３２）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地で３日間１：５の割合で、ＣＦＳＥで染色されたＣＤ８^＋細胞と共同培養した。ＣＤ８^＋Ｔ細胞増殖は、フローサイトメトリー分析を用いてＣＦＳＥ希釈によって評価した。

【0151】

図２６に示すように、ＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）で刺激した場合に、野生型（ＷＴ）マウスにおいてＣＤ８^＋Ｔ細胞の分裂指数が顕著に増加したが、ＮＬＲＣ４欠乏（ＮＬＲＣ４^－／－）マウスでは却って減少することが見られた。

【0152】

したがって、本発明のＤＣｐｅｐ６：：４ｘＥ７ΔＮＬＳ：：ＦｌａＢ（ＤＥＦ）がＣＤ８^＋Ｔ細胞を活性化させることを確認したし、これは、ＮＬＲＣ４インフラマソーム（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）信号伝達経路の影響を受けることが分かる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【配列表】

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【手続補正書】

【提出日】2024-09-27

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１～配列番号１１からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項2】

配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項3】

配列番号６、配列番号９及び配列番号１０からなる群から選ばれるいずれか一つのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項4】

配列番号６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項5】

生体内で樹状細胞と結合してその活性を誘導することを特徴とする、請求項１に記載の樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項6】

腫瘍抗原及びフラジェリンからなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項7】

前記腫瘍抗原４個を連続して含むことを特徴とする、請求項６に記載の樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項8】

前記腫瘍抗原は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項9】

前記フラジェリンは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項10】

配列番号６のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、及び配列番号２３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項６に記載の樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項11】

配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項12】

長期生存を誘導することを特徴とする、請求項６に記載の樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項13】

免疫増強効果を有することを特徴とする、請求項６に記載の樹状細胞を標的とするペプチド。

【請求項14】

請求項１～１１のいずれかに記載の樹状細胞を標的とするペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。

【請求項15】

請求項１～１３のいずれかに記載の樹状細胞を標的とするペプチドを含む癌治療又は予防用薬学組成物。

【請求項16】

腫瘍抗原及びフラジェリンからなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことを特徴とする、請求項１５に記載の癌治療又は予防用薬学組成物。

【請求項17】

前記腫瘍抗原４個を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の癌治療又は予防用薬学組成物。

【請求項18】

前記腫瘍抗原及び前記フラジェリンを含み、
前記樹状細胞を標的とするペプチド、前記腫瘍抗原及び前記フラジェリンが、１つのペプチドに連結されているか、又は、それぞれ別のペプチドで含まれることを特徴とする、請求項１６に記載の癌治療又は予防用薬学組成物。

【請求項19】

請求項１～１３のいずれかに記載の樹状細胞を標的とするペプチドを含む癌治療又は予防用ワクチン組成物。

【請求項20】

腫瘍抗原及びフラジェリンからなる群から選ばれる一つ以上をさらに含むことを特徴とする、請求項１９に記載の癌治療又は予防用ワクチン組成物。

【請求項21】

前記腫瘍抗原４個を含むことを特徴とする、請求項２０に記載の癌治療又は予防用ワクチン組成物。

【請求項22】

前記腫瘍抗原及び前記フラジェリンを含み、
前記樹状細胞を標的とするペプチド、前記腫瘍抗原及び前記フラジェリンが、１つのペプチドに連結されているか、又は、それぞれ別のペプチドで含まれることを特徴とする、請求項２０に記載の癌治療又は予防用ワクチン組成物。

【国際調査報告】