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▶ ファウンデーション・メディシン・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】コピー数変化を検出するための方法及びシステム
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6827 20180101AFI20241106BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20241106BHJP
C12Q 1/6862 20180101ALI20241106BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20241106BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20241106BHJP
C12Q 1/6886 20180101ALI20241106BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20241106BHJP
G16B 20/10 20190101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6827 Z
C12Q1/686 Z
C12Q1/6862 Z
C12Q1/6851 Z
C12Q1/6869 Z
C12Q1/6886 Z
A61K45/00
A61P35/00
A61P35/02
G16B20/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024520589
(86)(22)【出願日】2022-10-07
(85)【翻訳文提出日】2024-04-15
(86)【国際出願番号】 US2022077781
(87)【国際公開番号】W WO2023060250
(87)【国際公開日】2023-04-13
(31)【優先権主張番号】63/253,972
(32)【優先日】2021-10-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＪＡＶＡ
２．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】517192663
【氏名又は名称】ファウンデーション・メディシン・インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ヒューズ， ジェーソン ディー．
(72)【発明者】
【氏名】フェンドラー， バーナード
(72)【発明者】
【氏名】ニューバーグ， ジャスティン
【テーマコード（参考）】
4B063
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA17
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS24
4B063QS25
4B063QS32
4B063QS34
4B063QS40
4B063QX02
4C084AA17
4C084NA05
4C084ZB26
4C084ZB27
(57)【要約】
グリッドベースのコピー数モデルを配列リードデータに適合させるための方法及びシステムを含む、コピー数変化（ＣＮＡ）を呼び出すための方法及びシステムが本明細書で説明される。方法は、複数の遺伝子座に対する、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成することと、対立遺伝子カバレッジデータを変換することと、コピー数グリッドモデルをデータに適合させることと、を含み得る。次いで、適合されたコピー数グリッドモデルは、コピー数状態を割り当てるか又はコピー数変化を呼び出すために使用され得る。コピー数グリッドモデル及び変換された対立遺伝子カバレッジ比データは、提示されたモデルの検討のために表示され得、より効率的なデータ解釈及びコピー数状態又はコピー数変化の呼び出しを可能にする。
【選択図】図３
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
方法であって、対象からの試料から得られた複数の核酸分子を提供することと、
１つ以上のアダプターを前記複数の核酸分子からの１つ以上の核酸分子上にライゲーションすることと、
前記複数の核酸分子からの前記１つ以上のライゲーションされた核酸分子を増幅することと、
前記増幅された核酸分子から増幅された核酸分子を捕捉することと、
シーケンサーによって、前記捕捉された核酸分子を配列決定して、前記捕捉された核酸分子を表す複数の配列リードを得て、それによって、前記試料のゲノムに関する配列リードデータを生成することと、
１つ以上のプロセッサで、前記配列リードデータを受信することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座に対する、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記ゲノムを複数のゲノムセグメントにセグメント化することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記複数の遺伝子座のうちの遺伝子座に対する、（ｉ）前記メジャー対立遺伝子カバレッジ比と前記マイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）前記メジャー対立遺伝子カバレッジ比と前記マイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含む、コピー数グリッドモデル入力データを生成することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルを前記コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記複数のコピー数グリッドモデルからコピー数グリッドモデルを選択することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて、前記複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態を割り当てることと、を含む、方法。
【請求項2】
前記１つ以上のアダプターが、増幅プライマー、フローセルアダプター配列、基質アダプター配列、又は試料インデックス配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記捕捉された核酸分子が、１つ以上のベイト分子へのハイブリダイゼーションによって前記増幅された核酸分子から捕捉される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記１つ以上のベイト分子が、１つ以上の核酸分子を含み、各核酸分子が、捕捉された核酸分子の領域に相補的な領域を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
核酸分子を増幅することが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技術、非ＰＣＲ増幅技術、又は等温増幅技術を実施することを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記配列決定が、超並列配列決定（ＭＰＳ）技術、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）、全エクソーム配列決定、標的配列決定、直接配列決定、又はサンガー配列決定技術の使用を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記配列決定が超並列配列決定を含み、前記超並列配列決定技術が次世代配列決定（ＮＧＳ）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記配列決定が、次世代シーケンサーを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
方法であって、１つ以上のプロセッサで、対象からの試料から得られた複数の核酸分子と関連付けられた複数の配列リードに対する配列リードデータを受信することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座に対する、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、ゲノムを複数のゲノムセグメントにセグメント化することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記複数の遺伝子座のうちの遺伝子座に対する、（ｉ）前記メジャー対立遺伝子カバレッジ比と前記マイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）前記メジャー対立遺伝子カバレッジ比と前記マイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含む、コピー数グリッドモデル入力データを生成することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルを前記コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記複数のコピー数グリッドモデルからコピー数グリッドモデルを選択することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて、前記複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態を割り当てることと、を含む、方法。
【請求項10】
前記セグメント化が、前記マイナー対立遺伝子カバレッジ比、前記メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づく、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記複数のコピー数グリッドモデルから前記コピー数グリッドモデルを選択することが、各ゲノムセグメントごとに、前記コピー数グリッドモデル入力データの分布を決定することと、
各ゲノムセグメントごとに、前記分布と最も近いコピー数状態との間の距離を識別することと、
前記複数のゲノムセグメントにわたる平均距離に基づいて全体的なモデル適合スコアを決定することと、を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記複数のコピー数グリッドモデルにおける異なるコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記複数のコピー数グリッドモデルを前記コピー数グリッドモデル入力データを適合させることが、各コピー数グリッドモデルごとに、初期腫瘍純度推定値及び初期腫瘍倍数性推定値に基づいて、前記コピー数グリッドモデルの前記許容されるコピー数状態を、コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、
反復的に、
予備コピー数を前記複数のゲノムセグメントの各ゲノムセグメントに割り当てることと、
前記予備コピー数割り当てに基づいて、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値を決定することと、
前記更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値に基づいて、前記許容されるコピー数を前記コピー数グリッドモデル入力データを再適合させることと、を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記初期腫瘍純度が、予め選択された腫瘍純度下限及び予め選択された腫瘍純度上限によって制約される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項15】
前記予め選択された腫瘍純度下限が０であり、前記予め選択された腫瘍純度上限が１である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記初期腫瘍倍数性が、予め選択された腫瘍倍数性下限によって制約される、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記予め選択された腫瘍倍数性下限が、約１．１～約１．５である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記初期腫瘍倍数性が、予め選択された腫瘍倍数性上限によって制約される、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記予め選択された腫瘍倍数性上限が、約６～約１０である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記複数のゲノムセグメントの各々に対する前記割り当てられたコピー数状態が、前記ゲノムセグメントに対する総コピー数カウント、前記ゲノムセグメントに対するマイナー対立遺伝子コピー数カウント、又は前記ゲノムセグメントに対するメジャー対立遺伝子コピー数カウントである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記セグメント化が、円形バイナリセグメンテーション（ＣＢＳ）法、最尤法、隠れマルコフ連鎖法、ウォーキングマルコフ法、ベイズ法、長距離相関法、又は変化点法を使用して実施される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記セグメント化が、変化点法を使用して実施され、前記変化点法が、枝刈り厳密線形時間（ＰＥＬＴ）法である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記選択されたコピー数グリッドモデル及び前記コピー数グリッドモデル入力データを重ねて、オーバーレイを生成することと、前記オーバーレイを表示することと、を更に含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記オーバーレイが、電子ディスプレイを使用して表示される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
１つ以上の割り当てられたコピー数状態又は合計カバレッジ比閾値に基づいて、前記１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出すことを更に含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記１つ以上の遺伝子座又は前記１つ以上のゲノムセグメントに対する前記呼び出されたコピー数変化が、前記対象における疾患の診断又は診断の確認に使用される、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記１つ以上の遺伝子座又は前記１つ以上のゲノムセグメントに対する前記呼び出されたコピー数変化を含む、前記対象に対するゲノムプロファイルを生成することを更に含む、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項28】
前記対象の前記ゲノムプロファイルが、包括的ゲノムプロファイリング試験、遺伝子発現プロファイリング試験、がんホットスポットパネル試験、ＤＮＡメチル化試験、ＤＮＡ断片化試験、ＲＮＡ断片化試験、又はそれらの任意の組み合わせからの結果を更に含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記対象の前記ゲノムプロファイルが、核酸配列決定に基づく試験からの結果を更に含む、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項30】
前記生成されたゲノムプロファイルに基づいて、抗がん剤を選択すること、抗がん剤を投与すること、又は抗がん治療を前記対象に適用することを更に含む、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記１つ以上の遺伝子座又は前記１つ以上のゲノムセグメントに対する前記呼び出されたコピー数変化が、前記対象に対する示唆される処置決定を行う際に使用される、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記１つ以上の遺伝子座又は前記１つ以上のゲノムセグメントに対する前記呼び出されたコピー数変化が、前記対象に処置を適用又は投与する際に使用される、請求項２５～３１に記載のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
疾患を診断するための方法であって、前記方法が、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化に基づいて、対象が前記疾患を有すると決定することを含み、前記１つ以上の遺伝子座又は前記１つ以上のゲノムセグメントに対する前記呼び出されたコピー数変化が、請求項２５の方法に従って決定される、方法。
【請求項34】
疾患の処置のための臨床試験に適格であると対象を識別する方法であって、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化に基づいて、前記対象が前記疾患前記疾患を有すると決定することを含み、前記１つ以上の遺伝子座又は前記１つ以上のゲノムセグメントに対する前記呼び出されたコピー数変化が、請求項２５の方法に従って決定される、方法。
【請求項35】
前記対象を前記臨床試験に登録することを更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記処置を前記対象に投与することを更に含む、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項37】
前記処置が、抗がん治療である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記疾患が、がん、染色体異数性と関連付けられた疾患、又は脆弱Ｘである、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記疾患が、がんである、請求項３３～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
前記１つ以上の遺伝子座又は前記１つ以上のゲノムセグメントに対する前記呼び出されたコピー数変化に基づいて、前記対象に投与するための抗がん治療を選択することを更に含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
がんを有する対象に対する抗がん治療を選択する方法であって、前記方法が、請求項２５に記載の方法に従って呼び出された前記１つ以上の遺伝子座又は前記１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化に応答して、前記対象に対する抗がん治療を選択することを含む、方法。
【請求項42】
前記１つ以上の遺伝子座又は前記１つ以上のゲノムセグメントに対する前記呼び出されたコピー数変化に基づいて、前記対象に投与するための抗がん治療の有効量を決定することを更に含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記１つ以上の遺伝子座又は前記１つ以上のゲノムセグメントに対する前記呼び出されたコピー数変化に基づいて、前記対象に前記抗がん治療を投与することを更に含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
対象のがんを処置する方法であって、請求項２５に記載の方法に従って呼び出された前記１つ以上の遺伝子座又は前記１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化に応答して、前記対象に有効量の抗がん治療を投与することを含む、方法。
【請求項45】
対象における腫瘍の進行又は再発を監視するための方法であって、前記方法が、請求項２５に記載の方法に従って、第１の時点で前記対象から得られた第１の試料を使用して１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出すことと、
第２の時点で前記対象から得られた第２の試料を使用して１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出すことと、
前記１つ以上の遺伝子座又は前記１つ以上のゲノムセグメントに対する、前記第１の呼び出されたコピー数変化を前記第２の呼び出されたコピー数変化と比較し、それによって、腫瘍の進行又は再発を監視することと、を含む、方法。
【請求項46】
前記第２の試料を使用する際の前記１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する前記呼び出されたコピー数変化が、請求項２５に記載の方法に従って決定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記腫瘍の進行に応答して抗がん治療を調整することを更に含む、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項48】
腫瘍の進行に応答して、前記抗がん治療の投与量を調整すること、又は異なる抗がん治療を選択することを更に含む、請求項４５～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記調整された抗がん治療を前記対象に投与することを更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記第１の時点は、前記対象が抗がん治療を投与される前であり、前記第２の時点は、前記対象が前記抗がん治療を投与された後である、請求項４５～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記対象が、がんを有するか、がんを有するリスクがあるか、がんについて日常的に検査されているか、又はがんを有する疑いがある、請求項４５～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記抗がん治療が、化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、又は外科手術を含む、請求項３０～３２、３７、４０～４４、及び４７～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記がん又は腫瘍が、固形がんである、請求項３８～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記がん又は腫瘍が、血液がんである、請求項３８～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項55】
前記がん又は腫瘍が、Ｂ細胞がん（多発性骨髄腫）、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳がん、中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮頸部がん、子宮内膜がん、口腔のがん、咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸がん、虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん、腺がん、炎症性筋線維芽細胞腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、結腸がん、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、軟部組織肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ血管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭状がん、乳頭腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮がん、胎児性がん、ウィルムス腫瘍、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体細胞腫、血管芽細胞腫、聴神経芽腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肝細胞がん、甲状腺がん、胃がん、頭頸部がん、小細胞がん、本態性血小板血症、原発性骨髄線維症、好酸球増加症候群、全身性肥満細胞症、家族性好酸球増加症、慢性好酸球性白血病、神経内分泌がん、又はカルチノイド腫瘍である、請求項３８～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
前記１つ以上のプロセッサによって、１つ以上のゲノム遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する、前記コピー数状態又は呼び出されたコピー数変化を示すレポートを生成することを更に含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項57】
前記レポートを前記対象又はヘルスケア提供者に送信することを更に含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記レポートが、コンピュータネットワーク又はピアツーピア接続を介して送信される、請求項５６又は５７に記載の方法。
【請求項59】
前記対象が、がんを有することが疑われるか、又はがんを有すると決定される、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項60】
前記対象から前記試料を得ることを更に含む、請求項１～５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項61】
前記試料が、組織生検試料、液体生検試料、又は正常対照を含む、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項62】
前記試料が、液体生検試料であり、かつ血液、血漿、脳脊髄液、痰、便、尿、又は唾液を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記試料が、液体生検試料であり、かつ循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項64】
前記試料が、液体生検試料であり、かつ無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項65】
前記複数の核酸分子が、腫瘍核酸分子と非腫瘍核酸分子との混合物を含む、請求項１～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記腫瘍核酸分子が、不均質組織生検試料の腫瘍部分に由来し、かつ前記非腫瘍核酸分子が、前記不均質組織生検試料の正常部分に由来する、請求項６５に記載の方法。
【請求項67】
前記試料が、液体生検試料を含み、前記腫瘍核酸分子が、前記液体生検試料の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）画分に由来し、前記非腫瘍核酸分子が、前記液体生検試料の非腫瘍無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）画分に由来する、請求項６５に記載の方法。
【請求項68】
システムであって、１つ以上のプロセッサと、
１つ以上のプロセッサに通信可能に結合され、かつ命令を記憶するように構成されたメモリと、を備え、前記命令が、前記１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、前記システムに、
前記１つ以上のプロセッサで、対象からの試料から得られた複数の核酸分子と関連付けられた複数の配列リードに対する配列リードデータを受信することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座に対する、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、ゲノムを複数のゲノムセグメントにセグメント化することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記複数の遺伝子座のうちの遺伝子座に対する、（ｉ）前記メジャー対立遺伝子カバレッジ比と前記マイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）前記メジャー対立遺伝子カバレッジ比と前記マイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含む、コピー数グリッドモデル入力データを生成することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルを前記コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記複数のコピー数グリッドモデルからコピー数グリッドモデルを選択することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて、前記複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態を割り当てることと、を行わせる、システム。
【請求項69】
前記ゲノムが、前記マイナー対立遺伝子カバレッジ比、前記メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づいてセグメント化される、請求項６８に記載のシステム。
【請求項70】
前記システムに、前記選択されたコピー数グリッドモデルを選択させる前記命令が、前記システムに、各ゲノムセグメントごとに、前記コピー数グリッドモデル入力比データの分布を決定することと、
各ゲノムセグメントごとに、前記分布と最も近いコピー数状態との間の距離を識別することと、
前記複数のゲノムセグメントにわたる平均距離に基づいて全体的なモデル適合スコアを決定することと、を行わせる命令を含む、請求項６８又は６９に記載のシステム。
【請求項71】
前記複数のコピー数グリッドモデルにおける異なるコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化される、請求項６８～７０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項72】
前記システムに、許容されるコピー数状態を前記コピー数グリッドモデル入力データに適合させる前記命令が、前記システムに、初期腫瘍純度推定値及び初期腫瘍倍数性推定値に基づいて、前記許容されるコピー数状態を、前記コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、
反復的に、
予備コピー数を前記複数のセグメントの各セグメントに割り当てることと、
前記予備コピー数割り当てに基づいて、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値を決定することと、
前記更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値に基づいて、前記許容されるコピー数を前記コピー数グリッドモデル入力データを再適合させることと、を行わせる命令を含む、請求項６８～７１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項73】
前記初期腫瘍純度が、予め選択された腫瘍純度下限及び予め選択された腫瘍純度上限によって制約される、請求項７１又は７２に記載のシステム。
【請求項74】
前記予め選択された腫瘍純度下限が０であり、前記予め選択された腫瘍純度上限が１である、請求項７３に記載のシステム。
【請求項75】
前記初期腫瘍倍数性が、予め選択された腫瘍倍数性下限によって制約される、請求項７１～７４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項76】
前記予め選択された腫瘍倍数性下限が、約１．１～約１．５である、請求項７５に記載のシステム。
【請求項77】
前記初期腫瘍倍数性が、予め選択された腫瘍倍数性上限によって制約される、請求項７１～７６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項78】
前記予め選択された腫瘍倍数性上限が、約６～約１０である、請求項７７に記載のシステム。
【請求項79】
前記複数のゲノムセグメントの各々に対する前記割り当てられたコピー数状態が、前記ゲノムセグメントに対する総コピー数カウント、前記ゲノムセグメントに対するマイナー対立遺伝子コピー数カウント、又は前記ゲノムセグメントに対するメジャー対立遺伝子コピー数カウントである、請求項６８～７８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項80】
前記ゲノムが、円形バイナリセグメンテーション（ＣＢＳ）法、最尤法、隠れマルコフ連鎖法、ウォーキングマルコフ法、ベイズ法、長距離相関法、又は変化点法を使用して、複数のゲノムセグメントにセグメント化される、請求項６８～７９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項81】
前記セグメント化ステップが、変化点法を使用して実施され、前記変化点法が、枝刈り厳密線形時間（ＰＥＬＴ）法である、請求項８０に記載のシステム。
【請求項82】
電子ディスプレイを更に備え、前記命令が、前記１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、前記システムに、前記選択されたコピー数グリッドモデル及び前記コピー数グリッドモデル入力データを重ねて、オーバーレイを生成することと、前記オーバーレイを表示することと、を行わせる命令を更に含む、請求項６８～８１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項83】
前記１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、前記システムに、１つ以上の割り当てられたコピー数状態又は合計カバレッジ比閾値に基づいて、前記１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出させる命令を更に含む、請求項６８～８２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項84】
前記１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、前記システムに、１つ以上のゲノム遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する、前記コピー数状態又は呼び出されたコピー数変化を示すレポートを生成させる命令を更に含む、請求項６８～８３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項85】
前記１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、前記システムに、前記対象又はヘルスケア提供者に前記レポートを送信させる命令を更に含む、請求項８４に記載のシステム。
【請求項86】
前記レポートが、コンピュータネットワーク又はピアツーピア接続を介して送信される、請求項８４又は８５に記載のシステム。
【請求項87】
１つ以上のプログラムを記憶する非一時的コンピュータ可読記憶媒体であって、前記１つ以上のプログラムが、命令を含み、前記命令が、システムの１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、前記システムに、前記１つ以上のプロセッサで、対象からの試料から得られた複数の核酸分子と関連付けられた複数の配列リードに対する配列リードデータを受信することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座に対する、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、ゲノムを複数のゲノムセグメントにセグメント化することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記複数の遺伝子座のうちの遺伝子座に対する、（ｉ）前記メジャー対立遺伝子カバレッジ比と前記マイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）前記メジャー対立遺伝子カバレッジ比と前記マイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含む、コピー数グリッドモデル入力データを生成することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルを前記コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記複数のコピー数グリッドモデルから、選択されたコピー数グリッドモデルを選択することと、
前記１つ以上のプロセッサを使用して、前記選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて、前記複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態を割り当てることと、を行わせる、非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項88】
前記ゲノムが、前記マイナー対立遺伝子カバレッジ比、前記メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づいてセグメント化される、請求項８７に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項89】
前記システムに、前記選択されたコピー数グリッドモデルを選択させる前記命令が、前記システムに、各ゲノムセグメントごとに、前記コピー数グリッドモデル入力データの分布を決定することと、
各ゲノムセグメントごとに、前記分布と最も近いコピー数状態との間の距離を識別することと、
前記複数のゲノムセグメントにわたる平均距離に基づいて全体的なモデル適合スコアを決定することと、を行わせる命令を含む、請求項８７又は８８に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項90】
前記複数のコピー数グリッドモデルにおける異なるコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化される、請求項８７～８９のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項91】
前記システムに、許容されるコピー数状態を前記コピー数グリッドモデル入力データに適合させる前記命令が、前記システムに、初期腫瘍純度推定値及び初期腫瘍倍数性推定値に基づいて、前記許容されるコピー数状態を、前記コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、
反復的に、
予備コピー数を前記複数のセグメントの各セグメントに割り当てることと、
前記予備コピー数割り当てに基づいて、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値を決定することと、
前記更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値に基づいて、前記許容されるコピー数を前記コピー数グリッドモデル入力データを再適合させることと、を行わせる命令を含む、請求項８７～９０のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項92】
前記初期腫瘍純度が、予め選択された腫瘍純度下限及び予め選択された腫瘍純度上限によって制約される、請求項９０又は９１に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項93】
前記予め選択された腫瘍純度下限が０であり、前記予め選択された腫瘍純度上限が１である、請求項９２に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項94】
前記初期腫瘍倍数性が、予め選択された腫瘍倍数性下限によって制約される、請求項９０～９３のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項95】
前記予め選択された腫瘍倍数性下限が、約１．１～約１．５である、請求項９４に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項96】
前記初期腫瘍倍数性が、予め選択された腫瘍倍数性上限によって制約される、請求項９０～９５のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項97】
前記予め選択された腫瘍倍数性上限が、約６～約１０である、請求項９６に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項98】
前記割り当てられたコピー数状態が、前記ゲノムセグメントに対する総コピー数カウント、前記ゲノムセグメントに対するマイナー対立遺伝子コピー数カウント、又は前記ゲノムセグメントに対するメジャー対立遺伝子コピー数カウントである、請求項８７～９７のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項99】
前記ゲノムが、円形バイナリセグメンテーション（ＣＢＳ）法、最尤法、隠れマルコフ連鎖法、ウォーキングマルコフ法、ベイズ法、長距離相関法、又は変化点法を使用して、複数のゲノムセグメントにセグメント化される、請求項８７～９８のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項100】
前記セグメント化ステップが、変化点法を使用して実施され、前記変化点法が、枝刈り厳密線形時間（ＰＥＬＴ）法である、請求項９９に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項101】
前記システムが、電子ディスプレイを備え、前記命令が、前記１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、前記システムに、前記選択されたコピー数グリッドモデル及び前記コピー数グリッドモデル入力データを重ねて、オーバーレイを生成することと、前記オーバーレイを表示することと、を行わせる命令を更に含む、請求項８７～１００のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項102】
前記１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、前記システムに、１つ以上の割り当てられたコピー数状態又は合計カバレッジ比閾値に基づいて、前記１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出させる命令を更に含む、請求項８７～１０１のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項103】
前記１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、前記システムに、１つ以上のゲノム遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する、前記コピー数状態又は呼び出されたコピー数変化を示すレポートを生成させる命令を更に含む、請求項８７～１０１のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項104】
前記１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、前記システムに、前記対象又はヘルスケア提供者に前記レポートを送信させる命令を更に含む、請求項１０３に記載の非一時的コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項105】
前記レポートが、コンピュータネットワーク又はピアツーピア接続を介して送信される、請求項１０３又は１０４に記載のシステム。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１０月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２５３，９７２号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１０月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２５３，９７２号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、ゲノムプロファイリングデータを分析するための方法及びシステム、より具体的には、ゲノムプロファイリングを使用するコピー数変化の呼び出しのための方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【0003】
構造的変異体（ＳＶ）は、典型的には、少なくとも５０塩基対（ｂｐ）の長さの変化を含む、大規模ゲノム変化である（Ｍａｈｍｏｕｄ，ｅｔ ａｌ．（２０１９），“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌｉｎｇ：ｔｈｅ ｌｏｎｇ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｈｏｒｔ ｏｆ ｉｔ”，Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０：２４６）。これらの大規模ゲノム変化は、欠失、重複、逆位、挿入、及び転座として分類され、ＤＮＡの獲得、喪失、再配列の異なる組み合わせを説明する。
【0004】
一般に染色体異数性と呼ばれる異常な染色体不均衡、多くの場合、ＤＮＡ修復機構が不十分に監視及び間違いを補正する細胞繁殖中に発生する。染色体異数性が、生殖系列細胞における疾患の徴候となり得るが、体細胞では、コピー数変化（ＣＮＡ）は、多くの場合、腫瘍形成と関連付けられており、主要な遺伝子ドライバーを識別し得、増殖を促進する遺伝子変化に向かう集団圧力の増加につながる。したがって、転移性がんは、概して、コピーミス又は細胞増殖を促進する遺伝子のいずれかを補正する遺伝子経路に影響する染色体異数性の増加を示す。
【0005】
コピー数分析と関連付けられたデータの典型的な表現、すなわち、対立遺伝子頻度又はカバレッジ比は、概して、ゲノム的にソートされ、ｌｏｇ２（Ｒ）への比変換を伴う。多くの場合、対立遺伝子頻度プロットは、マイナー対立遺伝子のみが示されるように、折り畳まれる。カバレッジが保存されるため、マイナー及びメジャー対立遺伝子頻度は、冗長であり、この表現における情報の喪失はない。モデルが適合された後、次いで、予測された比及び対立遺伝子頻度の最上位に、これらのコピー数状態を重ねるのが通例である。カバレッジ比プロットは、概して、コピー数事象と関連付けられた方向性を示す。増幅が生じる場合、カバレッジ比が増加する。欠失が生じる場合、カバレッジ比が減少する。対立遺伝子頻度プロットから増幅及び欠失を解釈することはより困難である。これらの表現は、標的がゲノム的にソートされ、観測量がこのソーティングの関数としてプロットされるため、直感的であるが、それは、多くの場合、コピー数状態、及び対立遺伝子頻度及びカバレッジ比の両方に対応する状態がどの程度良好かを視覚的に識別するのが困難であり得る。
【発明の概要】
【0006】
グリッドベースのコピー数モデル（すなわち、「コピー数グリッドモデル」）を配列リードデータに適合させるための方法及びシステムを含む、コピー数変化（ＣＮＡ）を呼び出すための方法及びシステムが本明細書で説明される。有利には、コピー数グリッドモデルを配列リードデータに適合させることは、データの表示を可能にし、データを解釈すること、及び、多くの場合、正確に呼び出すことが困難である、コピー数状態又はコピー数変化を呼び出すことをより効率的にする。すなわち、コピー数グリッドモデルは、同じグラフ上で、カバレッジ比及び対立遺伝子頻度と関連付けられたデータ、並びにそれらの関連するエラーの視覚化を提供するが、一方で、同時に、より完全な提示のために予測されたコピー数状態を重ねる。結果的に生じるオーバーレイの表示は、ゲノムセグメント若しくはゲノム遺伝子座に対するコピー数を手動で呼び出すこと、又はゲノムセグメント若しくはゲノム遺伝子座に対する呼び出し（例えば、自動化プロセスによって行われる呼び出し）の手動確認を容易にする。
【0007】
いくつかの実施態様では、コピー数変化（ＣＮＡ）を呼び出すための方法は、対象からの試料から得られた複数の核酸分子を提供することと、１つ以上のアダプターを複数の核酸分子からの１つ以上の核酸分子上にライゲーションすることと、複数の核酸分子からの１つ以上のライゲーションされた核酸分子を増幅することと、増幅された核酸分子から増幅された核酸分子を捕捉することと、シーケンサーによって、捕捉された核酸分子を配列決定して、捕捉された核酸分子を表す複数の配列リードを得て、それによって、試料のゲノムに関する配列リードデータを生成することと、１つ以上のプロセッサで、配列リードデータを受信することと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座に対する、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、ゲノムを複数のゲノムセグメントにセグメント化することと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座のうちの遺伝子座に対する、（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含む、コピー数グリッドモデル入力データを生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルをコピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数のコピー数グリッドモデルから、選択されたコピー数グリッドモデルを選択することと、１つ以上のプロセッサを使用して、選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて、複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態を割り当てることと、を含む。
【0008】
いくつかの実施態様では、１つ以上のアダプターは、増幅プライマー、フローセルアダプター配列、基質アダプター配列、又は試料インデックス配列を含む。
【0009】
いくつかの実施態様では、捕捉された核酸分子は、１つ以上のベイト分子へのハイブリダイゼーションによって増幅された核酸分子から捕捉される。いくつかの実施態様では、１つ以上のベイト分子が、１つ以上の核酸分子を含み、各核酸分子が、捕捉された核酸分子の領域に相補的な領域を含む。
【0010】
いくつかの実施態様では、核酸分子を増幅することは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技術、非ＰＣＲ増幅技術、又は等温増幅技術を実施することを含む。
【0011】
いくつかの実施態様では、配列決定は、超並列配列決定（ＭＰＳ）技術、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）、全エクソーム配列決定、標的配列決定、直接配列決定、又はサンガー配列決定技術の使用を含む。例えば、いくつかの実施態様では、配列決定は、超並列配列決定を含み、超並列配列決定技術は、次世代配列決定（ＮＧＳ）を含む。いくつかの実施態様では、配列決定は、次世代シーケンサーを含む。
【0012】
いくつかの実施態様では、コピー数変化（ＣＮＡ）を呼び出すための方法は、１つ以上のプロセッサで、対象からの試料から得られた複数の核酸分子と関連付けられた複数の配列リードに対する配列リードデータを受信することと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座に対する、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、ゲノムを複数のゲノムセグメントにセグメント化することと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座のうちの遺伝子座に対する、（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含む、コピー数グリッドモデル入力データを生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルをコピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数のコピー数グリッドモデルから、選択されたコピー数グリッドモデルを選択することと、１つ以上のプロセッサを使用して、選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて、複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態を割り当てることと、を含む
【0013】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、セグメント化が、マイナー対立遺伝子カバレッジ比、メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づく。
【0014】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、複数のコピー数グリッドモデルからコピー数グリッドモデルを選択することが、各ゲノムセグメントごとに、コピー数グリッドモデル入力データの分布を決定することと、各ゲノムセグメントごとに、分布と最も近いコピー数状態との間の距離を識別することと、複数のゲノムセグメントにわたる平均距離に基づいて全体的なモデル適合スコアを決定することと、を含む。
【0015】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、複数のコピー数グリッドモデルにおける異なるコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化される。
【0016】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、複数のコピー数グリッドモデルをコピー数グリッドモデル入力データを適合させることが、各コピー数グリッドモデルごとに、初期腫瘍純度推定値及び初期腫瘍倍数性推定値に基づいて、コピー数グリッドモデルの許容されるコピー数状態を、コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、反復的に、予備コピー数を複数のゲノムセグメントの各ゲノムセグメントに割り当てることと、予備コピー数割り当てに基づいて、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値を決定することと、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値に基づいて、許容されるコピー数をコピー数グリッドモデル入力データを再適合させることと、を含む。
【0017】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、初期腫瘍純度が、予め選択された腫瘍純度下限及び予め選択された腫瘍純度上限によって制約される。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍純度下限が０であり、予め選択された腫瘍純度上限が１である。
【0018】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、初期腫瘍倍数性が、予め選択された腫瘍倍数性下限によって制約される。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍倍数性下限が、約１．１～約１．５である。いくつかの実施態様では、初期腫瘍倍数性が、予め選択された腫瘍倍数性上限によって制約される。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍倍数性下限が、約６～約１０である。
【0019】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、複数のゲノムセグメントの各々に対する割り当てられたコピー数状態が、ゲノムセグメントに対する総コピー数カウント、ゲノムセグメントに対するマイナー対立遺伝子コピー数カウント、又はゲノムセグメントに対するメジャー対立遺伝子コピー数カウントである。
【0020】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、セグメント化ステップが、円形バイナリセグメンテーション（ＣＢＳ）法、最尤法、隠れマルコフ連鎖法、ウォーキングマルコフ法、ベイズ法、長距離相関法、又は変化点法を使用して実施される。いくつかの実施態様では、セグメント化ステップが、変化点法を使用して実施され、変化点法が、枝刈り厳密線形時間（ｐｒｕｎｅｄ ｅｘａｃｔ ｌｉｎｅａｒ ｔｉｍｅ（ＰＥＬＴ））法である。
【0021】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、方法は、選択されたコピー数グリッドモデル及びコピー数グリッドモデル入力データを重ねて、オーバーレイを生成することを更に含む。次いで、オーバーレイが表示され得る。いくつかの実施態様では、オーバーレイが、電子ディスプレイを使用して表示される。
【0022】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、方法は、１つ以上の割り当てられたコピー数状態又は合計カバレッジ比閾値に基づいて、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出すことを更に含む。いくつかの実施態様では、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化が、対象における疾患の診断又は診断の確認に使用される。
【0023】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、方法は、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化を含む、対象に対するゲノムプロファイルを生成することを更に含む。いくつかの実施態様では、対象のゲノムプロファイルが、包括的ゲノムプロファイリング試験、遺伝子発現プロファイリング試験、がんホットスポットパネル試験、ＤＮＡメチル化試験、ＤＮＡ断片化試験、ＲＮＡ断片化試験、又はそれらの任意の組み合わせからの結果を更に含む。いくつかの実施態様では、対象のゲノムプロファイルが、核酸配列決定に基づく試験からの結果を更に含む。上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、方法は、生成されたゲノムプロファイルに基づいて、抗がん剤を選択すること、抗がん剤を投与すること、又は抗がん治療を対象に適用することを更に含む。
【0024】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、方法は、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化が、対象に対する示唆される処置決定を行う際に使用される。
【0025】
上記の方法のうちのいずれかの実施態様では、方法は、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化が、対象に処置を適用又は投与する際に使用されることを更に含む。
【0026】
疾患を診断するための方法であって、方法が、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化に基づいて、対象が疾患を有すると決定することを含み、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化が、上記の方法のうちのいずれか１つに従って決定される、方法もまた、本明細書で説明される。
【0027】
疾患の処置のための臨床試験に適格であると対象を識別する方法であって、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化に基づいて、対象が疾患疾患を有すると決定することを含み、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化が、上記の方法のうちのいずれか１つに従って決定される、方法もまた、本明細書で説明される。いくつかの実施態様では、方法は、対象を臨床試験に登録することを更に含む。いくつかの実施態様では、方法は、対象に処置を投与することを更に含む。いくつかの実施態様では、処置が、抗がん治療である。
【0028】
いくつかの実施態様では、疾患が、がんである。いくつかの実施態様では、疾患が、遺伝性疾患、例えば、染色体異数性（例えば、ダウン症候群、エドワーズ症候群、又はパトウ症候群）又は脆弱Ｘと関連付けられた疾患である。いくつかの実施態様では、疾患が、がんであり、方法が、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化に基づいて、対象に投与するための抗がん治療を選択することを更に含む。
【0029】
がんを有する対象に対する抗がん治療を選択する方法であって、方法が、上記の方法に従って呼び出された１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化に応答して、対象に対する抗がん治療を選択することを含む、方法もまた、本明細書で説明される。いくつかの実施態様では、方法が、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化に基づいて、対象に投与するための抗がん治療の有効量を決定することを更に含む。いくつかの実施態様では、方法が、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化に基づいて、対象に抗がん治療を投与することを更に含む。
【0030】
対象のがんを処置する方法であって、上記の方法に従って呼び出された１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化に応答して、対象に有効量の抗がん治療を投与することを含む、方法もまた、本明細書で説明される。
【0031】
対象における腫瘍の進行又は再発を監視するための方法であって、方法が、上記の方法に従って、第１の時点で対象から得られた第１の試料を使用して１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出すことと、第２の時点で対象から得られた第２の試料を使用して１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出すことと、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する、第１の呼び出されたコピー数変化を第２の呼び出されたコピー数変化と比較し、それによって、腫瘍の進行又は再発を監視することと、を含む、方法もまた、本明細書で説明される。いくつかの実施態様では、第２の試料を使用する際の１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する呼び出されたコピー数変化が、上記の方法に従って決定される。いくつかの実施態様では、方法が、腫瘍の進行に応答して抗がん治療を調整することを更に含む。いくつかの実施態様では、方法が、腫瘍の進行に応答して、抗がん治療の投与量を調整すること、又は異なる抗がん治療を選択することを更に含む。いくつかの実施態様では、方法が、調整された抗がん治療を対象に投与することを更に含む。いくつかの実施態様では、第１の時点は、対象が抗がん治療を投与される前であり、第２の時点は、対象が抗がん治療を投与された後である。
【0032】
上記の方法のいくつかの実施態様では、対象が、がんを有するか、がんを有するリスクがあるか、がんについて日常的に検査されているか、又はがんを有する疑いがある。
【0033】
上記の方法のいくつかの実施形態では、抗がん治療又は抗がん治療は、化学療法、放射線療法、免疫療法、標的療法、又は外科手術を含む。
【0034】
上記の方法のいくつかの実施態様では、がん又は腫瘍が、固形がんである。上記の方法のいくつかの実施態様では、がん又は腫瘍が、血液がんである。上記の方法のいくつかの実施態様では、がん又は腫瘍が、Ｂ細胞がん（多発性骨髄腫）、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳がん、中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、口腔のがん、咽頭のがん、肝臓がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸がん、虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん、腺がん、炎症性筋線維芽細胞腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、結腸がん、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、赤血球増加症Ｖｅｒａ、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、軟部組織肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ血管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭状がん、乳頭状腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮がん、胎児性がん、ウィルムス腫瘍、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体細胞腫、神経膠芽腫、聴神経芽腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽細胞腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肝細胞がん、甲状腺がん、胃がん、頭頸部がん、小細胞がん、本態性血小板血症、無形成性骨髄化生、好酸球増加症候群、全身性肥満細胞症、家族性好酸球増加症、慢性好酸球性白血病、神経内分泌がん、又はカルチノイド腫瘍である。
【0035】
上記の方法のいくつかの実施態様では、方法が、１つ以上のプロセッサによって、１つ以上のゲノム遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する、コピー数状態又は呼び出されたコピー数変化を示すレポートを生成することを更に含む。上記の方法のいくつかの実施態様では、方法が、レポートを対象又はヘルスケア提供者に送信することを更に含む。いくつかの実施態様では、レポートが、コンピュータネットワーク又はピアツーピア接続を介して送信される。
【0036】
上記の方法のいくつかの実施態様では、対象が、がんを有する疑いがあるか、又はがんを有すると決定される。
【0037】
上記の方法のいくつかの実施態様では、方法が、対象から組織試料を得ることを更に含む。
【0038】
上記の方法のいくつかの実施態様では、試料が、組織生検試料、液体生検試料、又は正常対照を含む。
【0039】
上記の方法のいくつかの実施態様では、試料が、液体生検試料であり、かつ血液、血漿、脳脊髄液、痰、便、尿、又は唾液を含む。
【0040】
上記の方法のいくつかの実施態様では、試料が、液体生検試料であり、かつ循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含む。
【0041】
上記の方法のいくつかの実施態様では、試料が、液体生検試料であり、かつ無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【0042】
上記の方法のいくつかの実施態様では、複数の核酸分子は、腫瘍核酸分子と非腫瘍核酸分子との混合物を含む。いくつかの実施態様では、腫瘍核酸分子が、不均質組織生検試料の腫瘍部分に由来し、かつ非腫瘍核酸分子が、不均質組織生検試料の正常部分に由来する。いくつかの実施態様では、試料が、液体生検試料を含み、腫瘍核酸分子が、液体生検試料の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）画分に由来し、非腫瘍核酸分子が、液体生検試料の非腫瘍無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）画分に由来する。
【0043】
システムであって、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサに通信可能に結合され、かつ命令を記憶するように構成されたメモリと、を備え、命令が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上のプロセッサで、対象からの試料から得られた複数の核酸分子と関連付けられた複数の配列リードに対する配列リードデータを受信することと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座に対する、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、ゲノムを複数のゲノムセグメントにセグメント化することと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座のうちの遺伝子座に対する、（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含む、コピー数グリッドモデル入力データを生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルをコピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数のコピー数グリッドモデルからコピー数グリッドモデルを選択することと、１つ以上のプロセッサを使用して、選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて、複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態を割り当てることと、を行わせる、システムもまた、本明細書で説明される。
【0044】
システムのいくつかの実施態様では、ゲノムが、マイナー対立遺伝子カバレッジ比、メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づいてセグメント化される。
【0045】
システムのいくつかの実施態様では、システムに、選択されたコピー数グリッドモデルを選択させる命令が、システムに、各ゲノムセグメントごとに、コピー数グリッドモデル入力データの分布を決定することと、各ゲノムセグメントごとに、分布と最も近いコピー数状態との間の距離を識別することと、複数のゲノムセグメントにわたる平均距離に基づいて全体的なモデル適合スコアを決定することと、を行わせる命令を含む。
【0046】
システムのいくつかの実施態様では、複数のコピー数グリッドモデルにおける異なるコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化される。
【0047】
システムのいくつかの実施態様では、許容されるコピー数状態を、変換されたカバレッジ比データに適合させる命令が、システムに、初期化腫瘍純度推定値及び初期腫瘍倍数性推定値に基づいて、許容されるコピー数状態を、コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、反復的に、予備コピー数を複数のセグメントの各セグメントに割り当てることと、予備コピー数割り当てに基づいて、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値を決定することと、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値に基づいて、許容されるコピー数をコピー数グリッドモデル入力データを再適合させることと、を行わせる命令を含む。
【0048】
システムのいくつかの実施態様では、初期腫瘍純度が、予め選択された腫瘍純度下限及び予め選択された腫瘍純度上限によって制約される。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍純度下限が０であり、予め選択された腫瘍純度上限が１である。
【0049】
システムのいくつかの実施態様では、初期腫瘍倍数性が、予め選択された腫瘍倍数性下限によって制約される。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍倍数性下限が、約１．１～約１．５である。システムのいくつかの実施態様では、初期腫瘍倍数性が、予め選択された腫瘍倍数性上限によって制約される。システムのいくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍倍数性下限が、約６～約１０である。
【0050】
システムのいくつかの実施態様では、複数のゲノムセグメントの各々に対する割り当てられたコピー数状態が、ゲノムセグメントに対する総コピー数カウント、ゲノムセグメントに対するマイナー対立遺伝子コピー数カウント、又はゲノムセグメントに対するメジャー対立遺伝子コピー数カウントである。
【0051】
システムのいくつかの実施態様では、ゲノムが、円形バイナリセグメンテーション（ＣＢＳ）法、最尤法、隠れマルコフ連鎖法、ウォーキングマルコフ法、ベイズ法、長距離相関法、又は変化点法を使用して、複数のゲノムセグメントにセグメント化される。いくつかの実施態様では、セグメント化ステップが、変化点法を使用して実施され、変化点法が、枝刈り厳密線形時間（ＰＥＬＴ）法である。
【0052】
システムのいくつかの実施態様では、システムが、電子ディスプレイを更に備え、命令が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、選択されたコピー数グリッドモデル及びコピー数グリッドモデル入力データを重ねて、オーバーレイを生成することと、オーバーレイを表示することと、を行わせる命令を更に含む。
【0053】
システムのいくつかの実施態様では、システムが、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上の割り当てられたコピー数状態又は合計カバレッジ比閾値に基づいて、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出させる命令を更に含む。
【0054】
システムのいくつかの実施態様では、システムが、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上のゲノム遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する、コピー数状態又は呼び出されたコピー数変化を示すレポートを生成させる命令を更に含む。いくつかの実施態様では、システムが、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、対象又はヘルスケア提供者にレポートを送信させる命令を更に含む。いくつかの実施態様では、レポートが、コンピュータネットワーク又はピアツーピア接続を介して送信される。
【0055】
１つ以上のプログラムを記憶する非一時的コンピュータ可読記憶媒体であって、１つ以上のプログラムが、命令を含み、命令が、システムの１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上のプロセッサで、対象からの試料から得られた複数の核酸分子と関連付けられた複数の配列リードに対する配列リードデータを受信することと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座に対する、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、ゲノムを複数のゲノムセグメントにセグメント化することと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座のうちの遺伝子座に対する、（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含む、コピー数グリッドモデル入力データを生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルをコピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数のコピー数グリッドモデルから、選択されたコピー数グリッドモデルを選択することと、１つ以上のプロセッサを使用して、選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて、複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態を割り当てることと、を行わせる、非一時的コンピュータ可読記憶媒体もまた、本明細書で説明される。
【0056】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、ゲノムが、マイナー対立遺伝子カバレッジ比、メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づいてセグメント化される。
【0057】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、システムに、選択されたコピー数グリッドモデルを選択させる命令が、システムに、各ゲノムセグメントごとに、コピー数グリッドモデル入力データの分布を決定することと、各ゲノムセグメントごとに、分布と最も近いコピー数状態との間の距離を識別することと、複数のゲノムセグメントにわたる平均距離に基づいて全体的なモデル適合スコアを決定することと、を行わせる命令を含む。
【0058】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、複数のコピー数グリッドモデルにおける異なるコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化される。
【0059】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、システムに、許容されるコピー数状態を、コピー数グリッドモデル入力データに適合させる命令が、システムに、初期化腫瘍純度推定値及び初期腫瘍倍数性推定値に基づいて、許容されるコピー数状態を、コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、反復的に、予備コピー数を複数のセグメントの各セグメントに割り当てることと、予備コピー数割り当てに基づいて、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値を決定することと、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値に基づいて、許容されるコピー数をコピー数グリッドモデル入力データを再適合させることと、を行わせる命令を含む。
【0060】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、初期腫瘍純度が、予め選択された腫瘍純度下限及び予め選択された腫瘍純度上限によって制約される。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍純度下限が０であり、予め選択された腫瘍純度上限が１である。
【0061】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、初期腫瘍倍数性が、予め選択された腫瘍倍数性下限によって制約される。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍倍数性下限が、約１．１～約１．５である。いくつかの実施態様では、初期腫瘍倍数性が、予め選択された腫瘍倍数性上限によって制約される。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍倍数性下限が、約６～約１０である。
【0062】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、割り当てられたコピー数状態が、ゲノムセグメントに対する総コピー数カウント、ゲノムセグメントに対するマイナー対立遺伝子コピー数カウント、又はゲノムセグメントに対するメジャー対立遺伝子コピー数カウントである。
【0063】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、ゲノムが、円形バイナリセグメンテーション（ＣＢＳ）法、最尤法、隠れマルコフ連鎖法、ウォーキングマルコフ法、ベイズ法、長距離相関法、又は変化点法を使用して、複数のゲノムセグメントにセグメント化される。いくつかの実施態様では、セグメント化ステップが、変化点法を使用して実施され、変化点法が、枝刈り厳密線形時間（ＰＥＬＴ）法である。
【0064】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、システムが、電子ディスプレイを更に備え、命令が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、選択されたコピー数グリッドモデル及びコピー数グリッドモデル入力データを重ねて、オーバーレイを生成することと、オーバーレイを表示することと、を行わせる命令を更に含む。
【0065】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、記憶媒体が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上の割り当てられたコピー数状態又は合計カバレッジ比閾値に基づいて、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出させる命令を更に含む。
【0066】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、記憶媒体が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上のゲノム遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する、コピー数状態又は呼び出されたコピー数変化を示すレポートを生成させることを更に含む。いくつかの実施態様では、記憶媒体が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、対象又はヘルスケア提供者にレポートを送信させる命令を更に含む。いくつかの実施態様では、レポートが、コンピュータネットワーク又はピアツーピア接続を介して送信される。
【図面の簡単な説明】
【0067】
開示される方法、デバイス、及びシステムの様々な態様は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。開示される方法、デバイス、及びシステムの特徴及び利点のより良い理解は、例示的な実施形態の以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【0068】
【図1】メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計に対するメジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差のプロットについての例示的なコピー数グリッド点の集合を提供する。
【図2A】マイナー対立遺伝子コピー数及びメジャー対立遺伝子コピー数が互いに対してプロットされる、コピー数空間内の例示的なコピー数グリッドを示す。
【図2C】
【数1】
【図3】いくつかの実施形態による、変換されたカバレッジ比データを有する選択されたコピー数グリッドモデルを含む例示的なインターフェースを示す。
【図4】いくつかの実施形態による、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数状態を決定するための例示的な方法を示す。
【図5】本明細書に説明されるシステムのいくつかの例による、例示的なコンピューティングデバイスを図示する。
【図6】本明細書に説明されるシステムのいくつかの例による、例示的なコンピュータシステム又はコンピュータネットワークを図示する。
【発明を実施するための形態】
【0069】
グリッドベースのコピー数モデル（すなわち、「コピー数グリッドモデル」）を配列リードデータに適合させるための方法及びシステムを含む、コピー数変化（ＣＮＡ）を呼び出すための方法及びシステムが本明細書で説明される。例えば、対象の腫瘍に対するコピー数変化が呼び出され得る。対象からの試料は、例えば、腫瘍及び非腫瘍核酸分子の混合物を含み得る。健常（例えば、非－腫瘍）組織に対するコピー数状態が、単一の母性対立遺伝子及び単一父性対立遺伝子の正倍数性対象を含むが、腫瘍におけるコピー数変化事象は、特に、試料の腫瘍倍数性及び／又は腫瘍純度が先験的に未知であるとき、腫瘍のコピー数状態の呼び出しをより困難にする。本明細書に説明される方法は、疾患組織（例えば、腫瘍）のゲノム中のゲノムセグメントのコピー数状態を呼び出すことを可能にする。
【0070】
本明細書に説明される方法は、配列リードデータを使用して、複数の遺伝子座ごとに、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子比を生成し得る。ゲノムは、例えば、マイナー対立遺伝子カバレッジ比、メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づいて、複数のゲノムセグメントにセグメント化され得る。マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比は、（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含み得る、コピー数グリッドモデル入力データを生成するために変換され得る。
【0071】
コピー数変化事象が必然的に整数事象であるため、対立遺伝子カバレッジ比の合計に対して対立遺伝子カバレッジ比の間の差をプロットすることは、システムに任意のノイズがない限り、等間隔のグリッド点を提供するはずである。現実には、配列リードデータは、変換されたカバレッジ比データ（すなわち、コピー数グリッドモデル入力データ）とグリッド点との間の完全一致を概して阻止するノイズを含む。複数のコピー数グリッドモデルをコピー数グリッドモデル入力データに適合させることによって、ゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態を識別するために使用され得るコピー数グリッドモデルが選択され得る（例えば、最良適合コピー数グリッドモデル）。コピー数グリッドモデルは、許容されるコピー数状態を含む。本明細書に更に説明されるように、複数のコピー数グリッドモデルにおけるコピー数モデルは、先験的に既知である必要のない、初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値の異なる組み合わせを使用して初期化され得る。選択された数グリッドモデルは、コピー数グリッドモデル入力データと重ねられ得、オーバーレイが、例えば、電子ディスプレイ上のインターフェース出力又は印刷されたレポートに表示される。これは、データの容易な閲覧を可能にし、コピー数変化の手動呼び出し、又は呼び出されたコピー数変化（例えば、自動化プロセスによって呼び出されたコピー数変化）の確認を容易にする。
【0072】
モデルを使用して割り当てられたコピー数状態が、ゲノムセグメントに対する総コピー数カウント、ゲノムセグメントに対するマイナー対立遺伝子コピー数カウント、又はゲノムセグメントに対するメジャー対立遺伝子コピー数カウントであり得る。セグメント化は、セグメント内のゲノム遺伝子座の等しいコピー数の近似に基づき得る。したがって、セグメント内のゲノム遺伝子座が、ゲノムセグメント自体と同じコピー数状態を有すると仮定され得る。１つ以上の遺伝子座に対するコピー数変化は、対応するゲノムセグメントに割り当てられたコピー数状態に基づいて呼び出され得る（例えば、コピー数変化が生じたかどうかの呼び出し、コピー数増加の呼び出し、コピー数増加の呼び出し、又は呼び出し数の呼び出し）。
【0073】
定義
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術的用語の全ては、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
他に定義されない限り、本明細書において使用される技術的用語の全ては、本開示が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【0074】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の言及を含む。本明細書における「又は」への任意の言及は、特に明記しない限り、「及び／又は」を包含することが意図される。
【0075】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」等のｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの任意の形態又は変形）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（並びに「ｈａｖｅ」及び「ｈａｓ」等のｈａｖｉｎｇ任意の形態又は変形）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（並びに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅ等を含む任意の形態又は変形）、又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び「ｃｏｎｔａｉｎｓ」及び「ｃｏｎｔａｉｎ」等のｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの任意の形態又は変形）という用語は、包括的又はオープンエンドであり、追加の列記されていない添加剤、構成要素、整数、要素、又は方法ステップを排除するものではない。
【0076】
本明細書で使用される場合、数又は値の「約」という用語は、その数又は値のプラス又はマイナス１０％の数又は値を指す。範囲の文脈で使用されるときの「約」という用語は、その範囲のその最低値のマイナス１０％及びその最大値のプラス１０％を指す。
【0077】
本明細書で使用される場合、「サブゲノム区間」（又は「サブゲノム配列区間」）という用語は、ゲノム配列の一部分を指す。
【0078】
本明細書で使用される場合、「対象区間」という用語は、サブゲノム区間又は発現サブゲノム区間（例えば、サブゲノム区間の転写配列）を指す。
【0079】
本明細書で使用される場合、「変異体配列」又は「変異体」という用語は、互換的に使用され、対応する「正常な」又は「野生型」配列に対して修飾された核酸配列を指す。いくつかの例では、変異体配列は、「短い変異体配列」（又は「短い変異体」）、すなわち、約５０塩基対未満の長さの変異体配列であり得る。
【0080】
「対立遺伝子頻度」及び「対立遺伝子画分」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ゲノム遺伝子座に対する配列リードの総数に対する特定の対立遺伝子に対応する配列リードの画分を指す。
【0081】
「変異体対立遺伝子頻度」及び「変異体対立遺伝子画分」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ゲノム遺伝子座の配列リードの総数に対する特定の変異体対立遺伝子に対応する配列リードの画分を指す。
【0082】
本明細書で使用される場合、「セグメント化」（又は「配列セグメント化」）という用語は、複数のセグメントの各セグメントが可能な限り均質であり、かつ所与のセグメントと関連付けられた全ての配列リードが同じコピー数を有するように、配列リードデータを、全ての配列リードデータ点をカバーするいくつかの非重複セグメントに分割するためのプロセスを指す。いくつかの例では、セグメント化は、当業者に既知の様々な方法（例えば、Ｂｒａｕｎ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９９８），“Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ”，Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３（２）：１４２－１６２を参照されたい）のうちのいずれかを使用して、整列された配列リードデータ（又は配列リードデータに由来する、他の配列決定関連データ、例えば、カバレッジデータ、対立遺伝子頻度データなど）を処理することによって実施され得る。セグメント化方法の例としては、限定されるものではないが、円形バイナリセグメンテーション（ＣＢＳ）法、最尤法、隠れマルコフ連鎖法、ウォーキングマルコフ法、ベイズ法、長距離相関法、変化点法、又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【0083】
本明細書で使用される場合、「倍数性」という用語は、腫瘍試料中の複数の遺伝子座に対する平均コピー数を指す。いくつかの例では、腫瘍試料の「倍数性」は、腫瘍試料の不均質性（すなわち、腫瘍試料純度の変動）に起因して、細胞内の完全な染色体セットの数、したがって、常染色体遺伝子（すなわち、番号付きの非性染色体に位置する遺伝子）に対する可能な対立遺伝子の数とは異なり得る。
【0084】
本明細書に説明される本発明の態様及び変形は、態様及び変形「からなる」及び／又は「から本質的になる」を含むことが理解される。
【0085】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間の各介在値、及びその状態範囲内の任意の他の記載値又は介在値は、本開示の範囲内に含まれることを理解されたい。記載された範囲が上限又は下限を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかを除外した範囲も本開示に含まれる。
【0086】
本明細書に説明される分析方法のいくつかは、配列を参照配列にマッピングすること、配列情報を決定すること、及び／又は配列情報を分析することを含む。相補配列が容易に決定及び／又は分析され得、本明細書において提供される説明は、相補配列に関して行われる分析方法を包含することが当該技術分野において十分に理解されている。
【0087】
本明細書において使用されるセクションの見出しは、編成のみを目的としており、記載された主題を限定するものと解釈されるべきではない。説明は、当業者が本発明を製造及び使用することを可能にするために提示され、特許出願及びその要件の文脈で提供される。記載された実施形態に対する様々な変更は、当業者にとって容易に明らかであり、本明細書の一般的な原理は、他の実施形態に適用されてもよい。したがって、本発明は、示された実施形態に限定されることを意図するものではなく、本明細書に説明された原理及び特徴と一致する最も広い範囲が与えられるべきである。
【0088】
図は、様々な実施形態にかかるプロセスを示している。例示的なプロセスでは、いくつかのブロックは、任意に組み合わされ、いくつかのブロックの順序は、任意に変更され、いくつかのブロックは、任意に省略される。いくつかの例では、例示的なプロセスと組み合わせて追加の工程が実行され得る。したがって、図示されている（及び以下により詳細に説明されている）動作は、本質的に例示的なものであり、したがって、限定するものとみなされるべきではない。
【0089】
本明細書で参照される全ての刊行物、特許、及び特許出願の開示は、それぞれ、参照によりその全体が本明細書に援用される。参照により援用される参考文献が本開示と矛盾する限り、本開示が優先するものとする。
【0090】
コピー数を決定する方法
本明細書に説明される方法は、対象の試料からのゲノムの１つ以上のゲノムセグメントのコピー数状態の決定を提供する。対象からの試料から得られた複数の核酸分子と関連付けられた配列決定リードデータは、複数の遺伝子座ごとに、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成するために使用され得る。対象のゲノムは、例えば、マイナー対立遺伝子カバレッジ比、メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づいて、複数のゲノムセグメントにセグメント化され得る。遺伝子座の各々に対するマイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比は、（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含み得る、コピー数グリッドモデル入力データを生成するために変換され得る。許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルは、コピー数グリッドモデル入力データに適合され得る。複数のコピー数グリッドモデルにおける異なるコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化され得る。数グリッドモデルが、複数のコピー数グリッドモデルから選択され得る。次いで、複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態が、選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて割り当てられ得る。
本明細書に説明される方法は、対象の試料からのゲノムの１つ以上のゲノムセグメントのコピー数状態の決定を提供する。対象からの試料から得られた複数の核酸分子と関連付けられた配列決定リードデータは、複数の遺伝子座ごとに、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成するために使用され得る。対象のゲノムは、例えば、マイナー対立遺伝子カバレッジ比、メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づいて、複数のゲノムセグメントにセグメント化され得る。遺伝子座の各々に対するマイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比は、（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含み得る、コピー数グリッドモデル入力データを生成するために変換され得る。許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルは、コピー数グリッドモデル入力データに適合され得る。複数のコピー数グリッドモデルにおける異なるコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化され得る。数グリッドモデルが、複数のコピー数グリッドモデルから選択され得る。次いで、複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態が、選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて割り当てられ得る。
【0091】
メジャー及びマイナー対立遺伝子頻度（例えば、ＳＮＰ対立遺伝子頻度）並びに総カバレッジ比（すなわち、正規化因子によって正規化された、メジャー及びマイナー対立遺伝子カバレッジの合計）は、配列リードデータから決定され得る。試料に対するカバレッジ比データ（例えば、患者腫瘍試料）は、例えば、試料中及び対照中（例えば、一対の正常対照、プロセスマッチド対照、又は「パネルオブノーマル」対照）の１つ以上のサブゲノム区間内の１つ以上の遺伝子座が重複する複数の配列リードを参照ゲノム（例えば、ＧＲＣｈ３８ヒト参照ゲノム）にアラインメントし、腫瘍試料に対するカバレッジを対照におけるカバレッジに正規化するために、試料中及び対照中の１つ以上のサブゲノム区間内の１つ以上の遺伝子座の各々が重複する配列リードの数を決定することによって決定され得る。いくつかの例では、例えば、一対の正常対照試料が利用可能ではない場合、プロセスマッチド対照（例えば、複数のＨａｐＭａｐ細胞株からのＤＮＡの混合物）が、カバレッジを正規化するために、一対の正常対照の代わりに使用され得る。いくつかの例では、例えば、一対の正常対照試料が利用可能ではない場合、「パネルオブノーマル」対照が、カバレッジを正規化するために、一対の正常対照の代わりに使用され得る。
【0092】
いくつかの例では、「パネルオブノーマル」又は「タンジェント正規化」対照法が、配列決定カバレッジを正規化するために使用され得る（例えば、Ｔａｂａｋ，ｅｔ ａｌ．（２０１９）“Ｔｈｅ Ｔａｎｇｅｎｔ ｃｏｐｙ－ｎｕｍｂｅｒ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅ ａｎａｌｙｓｅｓ”，ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／５６６５０５ｖ１．ｆｕｌｌ．ｐｄｆを参照されたい）。タンジェント正規化法は、データ内のノイズに対処するために腫瘍データを正規化する方法である。具体的には、タンジェント法は、腫瘍及び／又はそれらの正常対照からの配列決定データが生成された実験条件の差から結果的に生じるシステミックノイズを低減することに対処する。タンジェント正規化法が従来の正規化法よりもノイズのより大きい低減をもたらすことが示されている。
【0093】
例示的なタンジェント正規化法では、ｎＮを正常試料の数、ｎＴを腫瘍試料の数とする。ｉを集合｛１，２，…，ｎＮ｝の要素、ｊを集合｛１，２，…，ｎＴ｝の要素とする。Ｎｉをｉ番目の正常試料のゲノム順位におけるｌｏｇ２コピー比強度のベクトルと定義する。同様に、Ｔｊをｊ番目の腫瘍試料のゲノム順位におけるｌｏｇ２コピー比強度のベクトルと定義する。正常試料ベクトル及び腫瘍試料ベクトルは、全ての可能なカバレッジプロファイルのＭ次元ベクトル空間の要素である。ここで、全ての可能なカバレッジプロファイルのベクトル空間の参照部分空間Ｎを、正常試料のベクトルの全ての線形結合｛Ｎ１，Ｎ２，…，ＮｎＮ｝を含む空間と定義する。Ｎは、「ノイズ空間」と呼ばれ、（ｎＮ－１）次元平面である。
【0094】
この設定を考慮すると、タンジェント正規化法は、次のように進む。各腫瘍試料ベクトルＴｊごとに、ユークリッド計量法を使用して、ノイズ空間ＮにおけるＴｊに最も近いベクトルを決定することによって始まる。このベクトルをｐ（Ｔｊ）と表記し、ＴｊのＮへの投影である。ｐ（Ｔｊ）は、Ｔｊと同様の条件下で特徴化された正常試料のプロファイルを表す。ここで、Ｔｊの正規化は、ＴｊとＴｊのＮへの投影ｐ（Ｔｊ）との間の差を計算することによって算出され得る：
Ｔｊの正規化＝Ｔｊ－ｐ（Ｔｊ）
投影ｐ（Ｔｊ）は、標準線形代数技術を使用して直接算出され得る。
Ｔｊの正規化＝Ｔｊ－ｐ（Ｔｊ）
投影ｐ（Ｔｊ）は、標準線形代数技術を使用して直接算出され得る。
【0095】
いくつかの例では、試料（例えば、患者腫瘍試料）に対する対立遺伝子画分データは、試料中の１つ以上のサブゲノム区間内の１つ以上の遺伝子座が重複する複数の配列リードを参照ゲノム（例えば、ＧＲＣｈ３８ヒト参照ゲノム）にアラインメントし、試料中の１つ以上のサブゲノム区間内の１つ以上の遺伝子座に存在する異なる対立遺伝子の数を検出し、所与の対立遺伝子配列に対して識別された配列リードの数を、遺伝子座に対して識別された配列リードの総数で除算することによって、１つ以上の遺伝子座に存在する異なる対立遺伝子に対する対立遺伝子画分を決定することによって、決定される。
【0096】
メジャー及びマイナー対立遺伝子画分並びに所与の遺伝子座に対するカバレッジ比を考慮すると、半数体カバレッジ比（すなわち、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比）は、配列リードデータから生成され得る。マイナー対立遺伝子カバレッジ比は、マイナー対立遺伝子頻度及び総カバレッジ比に比例する。同様に、メジャー対立遺伝子カバレッジ比は、メジャー対立遺伝子頻度及び総カバレッジ比に比例する。スケーリング因子が、例えば、総カバレッジ比及び対立遺伝子頻度の積を２で乗算することによって、マイナー及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を総カバレッジ比にスケールするために使用され得る。例えば、メジャー対立遺伝子カバレッジ比（ＲＡ）及びマイナー対立遺伝子カバレッジ比（ＲＢ）は、次のように決定され得る。ＲＡ＝２＊Ｒ＊ＦＡ及びＲＢ＝２＊Ｒ＊ＦＢ、式中Ｒは、総カバレッジ比であり、ＦＡ及びＦＢは、それぞれ、メジャー対立遺伝子画分及びマイナー対立遺伝子画分である。
【0097】
試料に対するゲノム（例えば、患者腫瘍試料）は、ゲノムセグメントにセグメント化され得る。遺伝子座は、したがって、ゲノムセグメント内でビニングされる。ゲノムは、例えば、試料中の１つ以上のサブゲノム区間内の１つ以上の遺伝子座が重複する複数の配列リードを参照ゲノム（例えば、ＧＲＣｈ３８ヒト参照ゲノム）にアラインメントし、セグメント化アルゴリズム（例えば、円形バイナリセグメンテーション（ＣＢＳ）法、最尤法、隠れマルコフ連鎖法、ウォーキングマルコフ法、ベイズ法、長距離相関法、変化点法、又はそれらの任意の組み合わせ）を使用して、整列された配列リードデータ（又は配列リードデータに由来する、他の配列決定関連データ、例えば、総カバレッジ比データ、対立遺伝子頻度データなど）を処理して、所与のセグメントと関連付けられた配列が同じコピー数を有するように、複数の非重複セグメントを生成することによって、セグメント化され得る。いくつかの例では、試料（例えば、患者腫瘍試料）に対するセグメント化データは、整列された配列リードデータ（又は配列リードデータに由来する、他の配列決定関連データ、例えば、カバレッジ比データ、対立遺伝子頻度データなど）を適切に考慮するために必要なセグメントの数を決定するために、枝刈り厳密線形時間（ＰＥＬＴ）法を使用して生成され得、各セグメント（及びセグメントと関連付けられた配列リード）が同じコピー数を有する。
【0098】
遺伝子座に対する対立遺伝子カバレッジ比が、対立遺伝子コピー数、試料の腫瘍純度（すなわち、非腫瘍起源に対する、腫瘍起源の試料中の核酸分子の割合）、及び腫瘍倍数性の関数である。すなわち、
ｐは、腫瘍純度（腫瘍画分とも呼ばれる）であり、Ψは、腫瘍倍数性であり、ｘは、メジャー対立遺伝子（Ａ）又はマイナー対立遺伝子（Ｂ）を指し得る。腫瘍純度、腫瘍倍数性、及びコピー数が直接検出されない（かつ先験的に既知ではない）ため、モデル適合は、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比に基づいて、これらの値の近似を可能にする。
【数2】
【0099】
データマイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比は、コピー数グリッドモデルがデータに適合され得るため、変換されたカバレッジ比データ（すなわち、コピー数グリッドモデル入力データ）を生成するために変換され得る。変換されたカバレッジ比データは、（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差（すなわち、ＲＡ－ＲＢ）、及び（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計（すなわち、ＲＡ＋ＲＢ）を含み得る。メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差は、次のように、コピー数、腫瘍純度、及び倍数性に関連する。
メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差は、メジャー対立遺伝子及びマイナー対立遺伝子のコピーの数が等しいとき（任意のノイズ分散を除いて）、ゼロとなり、コピー数に対する変化は、
の等しいステップで増加するはずである。メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計は、次のように、コピー数、腫瘍純度、及び倍数性に関連する。
メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計の最小値は、
であり、コピー数に対する変化は、
の等しいステップで増加するはずである。したがって、システムにノイズがないと仮定すると、各遺伝子座は、メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差が、メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立マイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計に対してプロットされるとき、等間隔グリッド点の集合のうちの１つに位置する、変換されたデータ点を有するはずである。メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計に対するメジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差のプロットについての例示的なコピー数グリッド点の集合が図１に示される。
【数3】
【数4】
【数5】
【数6】
【0100】
コピー数グリッドモデルは、倍数性及び腫瘍純度値の関数としてスケール及び変換されたコピー数空間を表す。図２Ａは、マイナー対立遺伝子コピー数及びメジャー対立遺伝子コピー数が互いに対してプロットされる、コピー数空間内の例示的なコピー数グリッドを示す。コピー数は、必然的に整数値であり、そのため、プロットは、等間隔グリッドを提供する。すなわち、コピー数グリッドモデルは、グリッド点によって表されるように、許容されるコピー数状態（すなわち、メジャー対立遺伝子コピー数及びマイナー対立遺伝子コピー数の各々に対する整数値）を含み得る。コピー数グリッドモデルパラメータβ０（変換パラメータ）及びβ１（スケーリングパラメータ）は、次のように定義され得る。
【数7】
【0101】
スケーリングコピー数グリッドモデルパラメータは、マイナー対立遺伝子コピー数及びメジャー対立遺伝子コピー数軸をスケールするために使用され得る。コピー数軸は、追加の因子、例えば、
又は
によってスケールされ得る。コピー数軸に他のスケーリング因子が使用されてもよい。図２Ｂは、
によってスケールされた例示的なコピー数グリッドを示す（例示される例では、０．９５の純度及び２の倍数性を仮定する）。次いで、スケールされたコピー数グリッドが、図２Ｃに示されるように、
によって回転され得る。更に、コピー数グリッドは、図２Ｄに示されるように、変換パラメータβ０によって変換され得る（例示的な例では、β０は、ｙ軸からの分離を緩和するために２０倍にスケールされた）。
【数8】
【数9】
【数10】
【数11】
【0102】
コピー数グリッドを生成することによって、非線形パラメータ空間（ｐ，Ψ）が、線形パラメータ空間（β０、β１）に変換された。更に、おそらくこの表現のより重要な態様は、縮退解に関して、有意なコピー数事象を呼び出す際の安定性である。コピー数グリッド座標系は、β１が、隣接する状態間の距離又は状態の密度を表すことを可能にする。更に、コピー数グリッドは、どのコピー数グリッドモデルが、変換されたデータに適合されても、β０が、ゼロコピーを有するコピー数状態に対して必ず同じままとなるように、「ゼロレベル」を確立し得る。この変換の利点は、２つある。第１に、検索する２つのパラメータが依然として存在している間、全ての解が同じゼロレベル解を含有することになる。コピー数事象の分離の間に依然として縮退が存在するが、グリッドの開始点は、変化せず、グリッド点間の分離のみが変化する。推論パラメータのうちの１つを固定最小比に拘束することによって、検索は、状態間の分離に簡素化された。更に、システムは、有意なコピー数事象のための呼び出し方法を提供する。ここで、有意性は、分離にかかわらず、ゼロレベル（固定パラメータ）によって定義され得る。この方法論下では、もはや、コピー数変化呼び出しを行うために、コピー数を精密に知る必要はない。
【0103】
試料に対する倍数性及び腫瘍純度値が、先験的に未知である。したがって、複数のコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化され得る。
【0104】
いくつかの実施態様では、初期腫瘍純度推定値が、予め選択された初期腫瘍純度推定値下限によって制約される、及び／又は予め選択された初期腫瘍純度推定値上限を上回る。いくつかの実施態様では、予め選択された初期腫瘍純度推定値下限は、０、０．００１、０．００５、０．０１、又はこれらの範囲の間の任意の値である。いくつかの実施態様では、予め選択された初期腫瘍純度推定値下限が０である。いくつかの実施態様では、予め選択された初期腫瘍純度推定値上限は、１、０．９９９、０．９９５、０．９９、又はこれらの範囲の間の任意の値である。いくつかの実施態様では、予め選択された初期腫瘍純度推定値上限が１である。
【0105】
いくつかの実施態様では、初期腫瘍倍数性推定値が、予め選択された初期腫瘍倍数性推定値下限によって制約される、及び／又は予め選択された初期腫瘍倍数性推定値上限を上回る。いくつかの実施態様では、予め選択された初期腫瘍倍数性推定値下限が、約１．１～約１．５、例えば、１．２に設定される。いくつかの実施態様では、初期腫瘍倍数性推定値下限が１．２である。いくつかの実施態様では、予め選択された初期腫瘍倍数性推定値上限が、約６～約１０である。いくつかの実施態様では、予め選択された初期腫瘍倍数性推定値上限が８である。
【0106】
いくつかの実施態様では、初期腫瘍純度推定値及び／又は腫瘍倍数性は、物理的空間によって制約されるが（例えば、物理的な腫瘍純度が、決して、０を下回ることができないか、又は１を上回ることができず、予め選択された腫瘍純度推定値下限及び腫瘍純度推定値上限が０及び１又は０～１に設定され得る）、初期又はモデル化された腫瘍純度推定値及び／又は腫瘍倍数性推定値は、物理的空間に限定される必要はない。モデル縮退に起因して、非物理的空間内で解法可能であるコピー数モデルが存在し得る（例えば、純度＞１．０）。これらの解は、非物理的であるが、非物理的空間でモデルを適合させ、縮退解間の関係を使用して物理的な値を見つけ得る。すなわち、非物理的純度は、物理的純度又は物理的倍数性に再び変換され得る。いくつかの実施態様では、複数のコピー数グリッドモデルに対する初期腫瘍純度及び／又は初期腫瘍倍数性が、非物理的腫瘍純度推定値及び／又は非物理的腫瘍倍数性を含み得る。いくつかの実施態様では、複数のコピー数グリッドモデルに対する初期腫瘍純度及び／又は初期腫瘍倍数性が、虚数腫瘍純度推定値及び／又は虚数腫瘍倍数性推定値を含み得る。
【0107】
次いで、異なるコピー数グリッドモデルは、変換されたカバレッジ比データに適合され得る。例として、任意の所与のコピー数グリッドモデルに対して、コピー数グリッドモデルの許容されるコピー数状態は、初期腫瘍純度推定値及び初期腫瘍倍数性推定値に基づいて、変換されたカバレッジ比データに適合され得る。予備コピー数は、複数のゲノムセグメントの各ゲノムセグメントに割り当てられ得る。ゲノムセグメント内の遺伝子座は、同じコピー数を有すると仮定されるが、ゲノムセグメント内の遺伝子座の変換されたカバレッジ比データは、２Ｄガウス分布を形成する。割り当ては、例えば、ゲノムセグメントに対する最も近い許容されるコピー数状態に基づき得る。例えば、許容されるコピー数状態からのマハラノビス距離などの距離は、ゲノムセグメント内の遺伝子座の変換されたカバレッジ比データの場所に基づいて、遺伝子セグメントに対して決定され得る。予備コピー数割り当てがゲノムセグメントに対して行われると、それに応じて、ゲノムセグメント内に遺伝子座が存在し、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値が決定され得る。次いで、許容されるコピー数状態は、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値に基づいて、変換されたカバレッジ比データに再適合され得る。しかしながら、更新された腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値が決定されると、最適コピー数状態割り当ては、もはや、最適ではない可能性がある。したがって、予備コピー数を複数のゲノムセグメントの各ゲノムセグメントに割り当てることと、予備コピー数割り当てに基づいて、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値を決定することと、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値に基づいて、許容されるコピー数をコピー数グリッドモデル入力データを再適合させることとのプロセスは、収束（すなわち、局所的適合最大値）まで反復的に実施され得る。
【0108】
複数のコピー数グリッドモデルを適合させた後、コピー数グリッドモデルは、複数から選択され得る。上記に論じられるように、ゲノムセグメント内の遺伝子座の変換されたカバレッジ比データは、決定され得る２Ｄガウス分布を形成する。方法のいくつかの実施態様では、割り当てられたコピー数状態からの各ゲノムセグメントに対するマハラノビス距離などの距離が割り当てられ得る。全体的なモデル適合スコアは、複数のゲノムセグメントと対応する割り当てられたコピー数状態との間の平均距離に基づいて決定され得る。モデルは、全体的なモデル適合スコアに基づいてランク付けされ得るが、選択されるモデルは、最高の全体的なモデル適合スコアを有するモデルである必要はない。例えば、１つ以上のフィルタが、特定のモデルを除外するためにモデルに適用され得る。すなわち、単独の最適な適合が最良のモデルを示さない場合がある。例えば、モデルは、（ｉ）予め選択された倍数性範囲、（ｉｉ）予め選択された純度範囲、（ｉｉｉ）モデル内で間隔を有するノイズパラメータとコピー数状態との間の差、（ｉｖ）対応する低倍数性モデルが実行可能であるときに予め選択された値を上回る倍数性を有するモデル、又は他の所望のフィルタリングパラメータのうちの１つ以上によってフィルタリングされ得る。
【0109】
いくつかの実施態様では、モデルは、モデルが予め選択された腫瘍純度下限を下回る、及び／又は予め選択された腫瘍純度上限を上回る腫瘍純度を有する場合、除外され得る。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍純度下限は、０、０．００１、０．００５、０．０１、又はこれらの範囲の間の任意の値である。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍純度下限が０である。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍純度上限は、１、０．９９９、０．９９５、０．９９、又はこれらの範囲の間の任意の値である。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍純度上限が１である。
【0110】
いくつかの実施態様では、モデルは、モデルが予め選択された腫瘍倍数性下限を下回る、及び／又は予め選択された腫瘍倍数性上限を上回る腫瘍倍数性を有する場合、除外され得る。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍倍数性下限が、約１．１～約１．５、例えば、１．２に設定される。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍倍数性下限が１．２である。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍倍数性上限が、約６～約１０である。いくつかの実施態様では、予め選択された腫瘍純度上限が８である。
【0111】
次いで、選択されたコピー数グリッドモデルが、ゲノムセグメントのうちの少なくとも一部分、又は全てに対してコピー数状態を割り当てるために使用され得る。割り当てられたコピー数状態は、例えば、対象の腫瘍又はがんに対する、総コピー数カウント（すなわち、メジャー対立遺伝子コピー数とマイナー対立遺伝子コピー数との合計）、マイナー対立遺伝子コピー数カウント、又はメジャー対立遺伝子コピー数カウントであり得る。割り当ては、例えば、ゲノムセグメントに対応する遺伝子座に対する、変換されたカバレッジ比データの分布を考慮して、ゲノムセグメントに対する最も近い許容されるコピー数状態に基づき得る。例えば、許容されるコピー数状態からのマハラノビス距離などの距離は、ゲノムセグメント内の遺伝子座の変換されたカバレッジ比データの場所に基づいて、遺伝子セグメントに対して決定され得る。
【0112】
本明細書に説明される方法の特定の利点は、コピー数グリッドモデルが、対立遺伝子画分及び対立遺伝子カバレッジデータを用いて生成され得ることである（例えば、電子ディスプレイ上のインターフェース出力を使用して）。したがって、特定のゲノムセグメント又は特定のゲノム遺伝子座が、コピー数状態の容易な視覚化のために選択され得る。変換されたカバレッジ比データを有する選択されたコピー数グリッドモデルを含む例示的なインターフェースが、図３に示される。
【0113】
図３に示されるインターフェースでは、複数の遺伝子座に対する変換されたカバレッジ比データが、プロットで黒点として提示される。コピー数グリッドモデル３０２は、変換されたカバレッジ比データとともに提示される。ノイズレスシステムでは、変換されたカバレッジ比データは、整数のコピー数状態を表す、グリッド点（グリッド線の交点）に完全に集束することになる。グリッド線の間隔及びグリッドの転座は、提示された例では、それぞれ０．６１４及び３．７３９の決定された純度及び倍数性の値に依存する。ゲノムセグメントを表す点もまた、インターフェース内に含まれ得、これらは、任意選択的に、ゲノムセグメント内のゲノム遺伝子座に対する変換されたカバレッジ比データの分布に比例する。これは、ゲノムセグメントコピー数状態が、許容されるコピー数状態からどの程度近いかの容易な視覚化を可能にする。
【0114】
コピー数グリッドモデルはまた、１つ以上のゲノム遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出すことを容易にし、素の品質を改善する。一実施態様では、コピー数変化は、非二倍体である１つ以上のゲノム遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する割り当てられたコピー数状態に基づいて呼び出され得る。一実施態様では、コピー数変化は、所定のコピー数閾値を上回る１つ以上のゲノム遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する割り当てられたコピー数状態に基づいて呼び出され得る。所定のコピー数閾値は、所望のリスク許容度に基づいて、又は特定の遺伝子に対して選択され得る。例えば、特定の遺伝子は、他の遺伝子よりも高い所定のコピー数閾値を有し得る。いくつかの実施態様では、合計カバレッジ比（すなわち、メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計）閾値は、コピー数変化を呼び出すために使用され得る。例示的な合計カバレッジ比３０６が、図３に示され、３．５に設定される。図３では、閾値３０６を超えるゲノムセグメント３０８は、破線で丸付けされ、コピー数変化は、これらのゲノムセグメントに対して呼び出され得る。
【0115】
図４は、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数状態を決定するための例示的な方法を示す。４０２では、複数の配列リードに対する配列リードデータが、例えば、電子（例えば、コンピュータ）システムの１つ以上のプロセッサで受信される。配列リードデータは、対象からの試料から得られた複数の核酸分子と関連付けられる。試料は、例えば、腫瘍組織からの核酸分子と非－腫瘍組織からの核酸分子との混合物を含み得るか、又は無細胞腫瘍ＤＮＡ及び無細胞非－腫瘍ＤＮＡを含む無細胞ＤＮＡを含み得る。４０４では、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比は、例えば、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座に対して生成される。４０６では、ゲノム（例えば、対象に対して適切な参照ゲノム）が、例えば、１つ以上のプロセッサを使用して、複数のゲノムセグメントを生成するためにセグメント化される。セグメント化は、例えば、マイナー対立遺伝子カバレッジ比、メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づき得る。ゲノムのセグメント化は、同様のカバレッジ比を有することに基づいて、一緒にグループ化され、したがって、同様のコピー数状態を有すると推定される、ゲノムの連続部分を識別し得る。したがって、ゲノムセグメント内の遺伝子座は、同じコピー数状態を有すると仮定され得る。４０８では、遺伝子座に対するマイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比が、コピー数グリッドモデル入力データを生成するために、例えば、１つ以上のプロセッサを使用して変換され得る。コピー数グリッドモデル入力データは、（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含み得る。４１０では、複数のコピー数グリッドモデルが、コピー数グリッドモデル入力データに適合される。コピー数グリッドモデルは、許容されるコピー数状態（例えば、整数状態）を含み、腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用してパラメータ化され得る。複数のコピー数グリッドモデルにおける異なるコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化され得る。４１２では、コピー数グリッドモデルが、複数のコピー数グリッドモデルから選択され得る。上記に論じられたように、選択されたコピー数グリッドモデルは、１つ以上のコピー数グリッドモデルフィルタが、好ましくないか、又は不可能なモデルを除去するように適用され得るため、必ずしも、最も最適な適合を有するコピー数グリッドモデルであるとは限らない。それにもかかわらず、コピー数グリッドモデル選択は、全体的なモデル適合スコアに少なくとも部分的に基づき得る。４１４では、コピー数状態は、選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて、ゲノムセグメントの少なくとも一部分に対して割り当てられ得る。任意選択的に、４１６では、選択されたコピー数グリッドモデルが、例えば、電子ディスプレイのインターフェースを介して、コピー数グリッドモデル入力データと重ねられ得る。また任意選択的に、４１８では、１つ以上のゲノム遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数状態又は呼び出されたコピー数変化を示すレポートが生成され得る。レポートは、例えば、コンピュータネットワーク又はピアツーピア接続を介して、対象、ヘルスケア提供者、又はいくつかの他の第三者に送信され得る。
【0116】
いくつかの例では、開示された方法は、（ｉ）対象（例えば、がんを有することが疑われるか、又はがんを有すると決定された対象）から試料を得るステップと、（ｉｉ）試料から核酸分子（例えば、腫瘍核酸分子と非腫瘍核酸分子との混合物）を抽出するステップと、（ｉｉｉ）試料から抽出された核酸分子に１つ以上のアダプター（例えば、１つ以上の増幅プライマー、フローセルアダプター配列、基質アダプター配列、又は試料インデックス配列）をライゲーションするステップと、（ｉｖ）（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技術、非ＰＣＲ増幅技術、又は等温増幅技術を使用して）核酸分子を増幅するステップと、（ｖ）（例えば、捕捉された核酸分子の領域に相補的な領域をそれぞれ含む１つ以上の核酸分子をそれぞれ含む１つ以上のベイト分子へのハイブリダイゼーションによって）増幅された核酸分子から核酸分子を捕捉するステップと、（ｖｉ）例えば、次世代（例えば、大規模並列）シーケンサーを使用して、例えば、次世代（超並列）配列決定技術、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）技術、全エクソーム配列決定技術、標的配列決定技術、直接配列決定技術、又はサンガー配列決定技術を使用して、試料から抽出された核酸分子（又はそれに由来するライブラリプロキシ）を配列決定するステップと、（ｖｉｉ）対象（又は患者）、介護者、ヘルスケア提供者、医師、腫瘍学者、電子カルテシステム、病院、診療所、診療所、第三者支払人、保険会社、又は官公庁にレポート（例えば、電子レポート、ウェブベースのレポート、又は紙のレポート）を生成、表示、送信、及び／又は送達するステップと、のうちの１つ以上を更に含み得る。いくつかの例では、レポートは、本明細書に記載の方法からの出力を含む。いくつかの例では、レポートの全部又は一部は、オンライン又はウェブベースのヘルスケアポータルのグラフィカルユーザインターフェースに表示され得る。いくつかの例では、レポートは、コンピュータネットワーク又はピアツーピア接続を介して送信される。
【0117】
開示される方法は、様々な試料のうちのいずれかとともに使用され得る。例えば、いくつかの例では、試料は、組織生検試料、液体生検試料、又は正常対照を含み得る。いくつかの例では、試料は、液体生検試料であり得、血液、血漿、脳脊髄液、痰、便、尿、又は唾液を含み得る。いくつかの例では、試料は、液体生検試料であり得、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含み得る。いくつかの例では、試料は、液体生検試料であり得、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【0118】
いくつかの例では、試料から抽出された核酸分子は、腫瘍核酸分子と非腫瘍核酸分子との混合物を含み得る。いくつかの例では、腫瘍核酸分子は、異種組織生検試料の腫瘍部分に由来し得、非腫瘍核酸分子は、異種組織生検試料の正常部分に由来し得る。いくつかの例では、試料は、液体生検試料を含み得、腫瘍核酸分子は、液体生検試料の循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）画分に由来し得るが、非腫瘍核酸分子は、液体生検試料の非腫瘍無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）画分に由来し得る。
【0119】
いくつかの例では、開示される方法は、対象（例えば、患者）における疾患（例えば、がん）の存在を診断するために使用され得る。いくつかの例では、開示される方法は、本明細書の他の箇所で説明されるように、様々ながんのうちのいずれかの診断に適用可能であり得る。いくつかの実施態様では、疾患は、遺伝性疾患、例えば、染色体異数性（例えば、ダウン症候群、エドワーズ症候群、又はパトウ症候群）又は脆弱Ｘと関連付けられた疾患である。
【0120】
いくつかの例では、開示される方法は、疾患の処置のための臨床試験に適格である対象を識別するために使用され得る。方法は、対象を臨床試験に登録すること、及び／又は対象に処置を投与することを更に含み得る。いくつかの例では、疾患は、がんであり得る。いくつかの例では、疾患は、染色体異数性（例えば、ダウン症候群、エドワーズ症候群、又はパトウ症候群）又は脆弱Ｘと関連付けられた疾患である。
【0121】
いくつかの例では、開示される方法は、対象に対する適切な治療又は処置（例えば、がん治療又はがん処置）を選択するために使用され得る。いくつかの例では、例えば、がん治療又は処置は、ポリ（ＡＤＰ－リボース）ポリメラーゼ阻害薬（ＰＡＲＰｉ）、白金化合物、化学療法、放射線療法、標的療法（例えば、免疫療法）、外科手術、又はそれらの任意の組み合わせの使用を含み得る。
【0122】
いくつかの例では、開示される方法は、対象における疾患（例えば、がん）を治療する際に使用され得る。例えば、本明細書に開示される方法のうちのいずれかを使用して患者試料中の１つ以上の遺伝子座でＣＮＡが生じることを決定することに応答して、有効量のがん治療又はがん処置が対象に投与され得る。
【0123】
いくつかの例では、開示される方法は、対象における疾患の進行又は再発（例えば、がん又は腫瘍の進行又は再発）を監視するために使用され得る。例えば、いくつかの例では、方法は、第１の時点で対象から得られた第１の試料中のＣＮＡを検出するために使用されるとともに、第２の時点で患者から得られた第２の試料中のＣＮＡを検出するために使用され得、ＣＮＡの第１の決定及びＣＮＡの第２の決定の比較は、疾患の進行又は再発を監視することを可能にする。いくつかの例では、第１の時点は、患者が治療又は処置を投与される前に選択され、第２の時点は、対象が治療又は処置を投与された後に選択される。
【0124】
いくつかの例では、開示される方法は、臨床試験のための対象を選択するために使用され得る。例えば、患者は、本明細書に説明される方法を使用して呼び出される１つ以上の遺伝子にコピー数変化を有することに基づいて選択され得る。
【0125】
いくつかの例では、開示される方法は、例えば、呼び出されたコピー数変化（ＣＮＡ）の変化に応答して、処置用量を調整し、及び／又は異なる処置を選択することによって、対象に対する治療又は処置（例えば、がん処置又はがん治療）を調整するために使用され得る。
【0126】
いくつかの例では、開示される方法を使用して決定された、呼び出されたＣＮＡは、試料と関連付けられた予後又は診断指標として使用され得る。例えば、いくつかの例では、予後又は診断指標は、試料中の疾患（例えば、がん）の存在の指標、疾患（例えば、がん）が試料中に存在する可能性の指標、試料が由来した対象が疾患（例えば、がん）を発症することになる可能性の指標（すなわち、危険因子）、又は試料が由来した対象が特定の治療又は処置に応答することになる可能性の指標を含み得る。
【0127】
いくつかの例では、開示される方法は、特定の疾患、例えば、がんの検出、監視、危険因子の予測、又は処置の選択の一部として、対象に由来する試料中の１つ以上の遺伝子座における変異体配列の存在の識別を含むゲノムプロファイリングプロセスの一部として実装され得る。いくつかの例では、ゲノムプロファイリングのために選択される変異体パネルは、選択された遺伝子座セットにおける変異体配列の検出を含み得る。いくつかの例では、ゲノムプロファイリングのために選択される変異体パネルは、包括的ゲノムプロファイリング（ＣＧＰ）、単一のアッセイで数百の遺伝子（関連するがんバイオマーカーを含む）を評価するために使用される次世代配列決定（ＮＧＳ）アプローチを介して、いくつかの遺伝子座における変異体配列の検出を含み得る。ゲノムプロファイリングプロセスの一部として開示される方法の含有（又は対象のゲノムプロファイルの一部として呼び出されたＣＮＡに対する、開示される方法からの出力の含有）は、例えば、所与の患者試料中の１つ以上の遺伝子座におけるＣＮＡの存在を独立して確認することによって、ゲノムプロファイルに基づいて行われる、例えば、疾患検出呼び出し及び処置決定の妥当性を改善し得る。
【0128】
いくつかの例では、ゲノムプロファイルは、個人のゲノム及び／又はプロテオームにおける遺伝子（又はその変異体配列）、コピー数変異、エピジェネティック形質、タンパク質（又はその改変）、及び／又は他のバイオマーカーの存在に関する情報、並びに個人の対応する表現型形質、並びに遺伝的又はゲノム形質、表現型形質、及び環境因子の間の相互作用に関する情報を含み得る。
【0129】
いくつかの例では、対象のゲノムプロファイルは、包括的ゲノムプロファイリング（ＣＧＰ）試験、核酸配列決定に基づく試験、遺伝子発現プロファイリング試験、がんホットスポットパネル試験、ＤＮＡメチル化試験、ＤＮＡ断片化試験、ＲＮＡ断片化試験、又はそれらの任意の組み合わせからの結果を含み得る。
【0130】
いくつかの例では、方法は、生成されたゲノムプロファイルに基づいて、処置又は治療（例えば、抗がん剤、抗がん処置、又は抗がん治療）を対象に投与又は適用することを更に含み得る。抗がん剤又は抗がん処置は、がん細胞の処置に有効である化合物を指し得る。抗がん剤又は抗がん治療の例は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、天然産物、ホルモン、化学療法、放射線療法、免疫療法、外科手術、又は特定の細胞シグナル伝達経路の欠陥、例えば、ＤＮＡミスマッチ修復（ＭＭＲ）経路の欠陥を標的とするように構成された治療を含むが、これらに限定されない。
【0131】
試料
開示される方法及びシステムは、対象（例えば、患者）から収集される核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む様々な試料（本明細書では検体とも呼ばれる）のうちのいずれかとともに使用され得る。例としては、限定されるものではないが、腫瘍試料、組織試料、生検試料、血液試料（例えば、末梢全血試料）、血漿試料、血清試料、リンパ試料、唾液試料、痰試料、尿試料、婦人科液試料、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）試料、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、心嚢液試料、胸水試料、腹水（腹膜液）試料、糞便（又は便）試料、又は他の体液、分泌物、及び／若しくは排泄物試料（あるいはそれらに由来する細胞試料）が挙げられる。ある特定の例では、試料は、凍結試料又はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料であり得る。
開示される方法及びシステムは、対象（例えば、患者）から収集される核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を含む様々な試料（本明細書では検体とも呼ばれる）のうちのいずれかとともに使用され得る。例としては、限定されるものではないが、腫瘍試料、組織試料、生検試料、血液試料（例えば、末梢全血試料）、血漿試料、血清試料、リンパ試料、唾液試料、痰試料、尿試料、婦人科液試料、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）試料、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料、心嚢液試料、胸水試料、腹水（腹膜液）試料、糞便（又は便）試料、又は他の体液、分泌物、及び／若しくは排泄物試料（あるいはそれらに由来する細胞試料）が挙げられる。ある特定の例では、試料は、凍結試料又はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料であり得る。
【0132】
いくつかの例では、試料は、組織切除（例えば、外科的切除）、針生検、骨髄生検、骨髄吸引、皮膚生検、内視鏡生検、細針吸引、口腔スワブ、鼻腔スワブ、膣スワブ、又は細胞学的スミア、擦り傷、洗浄又は洗浄液（管腔洗浄液又は気管支肺胞洗浄液など）などによって収集され得る。
【0133】
いくつかの例では、試料は、液体生検試料であり、例えば、全血、血漿、血清、尿、便、痰、唾液、又は脳脊髄液を含み得る。いくつかの例では、試料は、液体生検試料であり得、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）を含み得る。いくつかの例では、試料は、液体生検試料であり得、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【0134】
いくつかの例では、試料は、１つ以上の前悪性又は悪性細胞を含み得る。本明細書で使用される場合、前悪性腫瘍とは、まだ悪性ではないが、悪性になる準備ができている細胞又は組織を指す。ある特定の例では、試料は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、又は転移性病変から取得され得る。ある特定の例では、試料は、血液悪性腫瘍又は前悪性腫瘍から取得され得る。他の例では、試料は、手術マージンからの組織又は細胞を含み得る。ある特定の例では、試料は、腫瘍浸潤リンパ球を含み得る。いくつかの例では、試料は、１つ以上の非悪性細胞を含み得る。いくつかの例では、試料は、原発性腫瘍又は転移（例えば、転移生検試料）であるか、又はその一部であり得る。いくつかの事例では、試料は、隣接部位（例えば、腫瘍に隣接する部位）と比較して、腫瘍（例えば、腫瘍細胞）のパーセントが最も高い部位（例えば、腫瘍部位）から得られ得る。いくつかの事例では、試料は、隣接部位（例えば、腫瘍に隣接する部位）と比較して、最大腫瘍病巣（例えば、顕微鏡下で視覚された際の最大数の腫瘍細胞）を有する部位（例えば、腫瘍部位）から得られ得る。
【0135】
いくつかの例では、開示される方法は、一次対照（例えば、正常組織試料）を分析することを更に含み得る。いくつかの例では、開示される方法は、一次対照が利用可能であるかどうかを決定すること、及び利用可能である場合、一次対照から対照核酸（例えば、ＤＮＡ）を単離することを更に含み得る。いくつかの例では、試料は、一次対照が利用可能ではない場合、任意の正常対照（例えば、正常隣接組織（ＮＡＴ））を含み得る。いくつかの例では、試料は、組織学的に正常な組織であり得るか、又はそれを含み得る。いくつかの例では、方法は、本明細書に説明される方法を使用して、試料、例えば、組織学的に正常な試料（例えば、外科的組織マージンから）を評価することを含む。いくつかの例では、開示される方法は、例えば、一次対照を伴わない試料中のＮＡＴからの非腫瘍組織をマクロ切開することによって、非腫瘍細胞が濃縮された部分試料を取得することを更に含み得る。いくつかの例では、開示される方法は、一次対照及びＮＡＴが利用できないと決定することと、マッチド対照なしで分析のために試料をマーキングすることとを更に含み得る。
【0136】
いくつかの例では、組織学的に正常な組織（例えば、そうでなければ組織学的に正常な組織マージン）から得られた試料は、依然として、本明細書に説明される変異体配列などの遺伝子変化を含み得る。したがって、方法は、検出された遺伝子変化の存在に基づいて、試料を再分類することを更に含み得る。いくつかの例では、複数の試料（例えば、異なる対象からの）が同時に処理される。
【0137】
開示される方法及びシステムは、様々な組織試料（又はその疾患状態）、例えば、固形組織試料、軟組織試料、転移性病変、又は液体生検試料のうちのいずれかから抽出された核酸の分析に適用され得る。組織の例としては、限定されるものではないが、結合組織、筋肉組織、神経系組織、上皮組織、及び血液が挙げられる。組織試料は、動物又はヒト体内の器官のいずれかから収集され得る。ヒト器官の例としては、脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、甲状腺、乳腺、子宮、前立腺、大腸、小腸、膀胱、骨、皮膚等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0138】
いくつかの例では、試料から抽出された核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を含み得る。開示される方法による分析のために好適であり得るＤＮＡの例としては、限定されるものではないが、ミトコンドリアＤＮＡ又はその断片、無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、及び循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）が挙げられる。無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、アポトーシス及びネクローシス中に正常及び／又はがん細胞から放出されるＤＮＡの断片から構成され、血流中を循環し、及び／又は他の体液中に蓄積する。循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）は、血流中を循環し、及び／又は他の体液中に蓄積するがん細胞及び腫瘍から放出されるＤＮＡの断片から構成される。
【0139】
いくつかの例では、ＤＮＡは、試料から有核細胞から抽出される。いくつかの例では、試料は、例えば、試料が主に赤血球、過剰な細胞質を含有する病変細胞、又は線維症を有する組織で構成される場合、有核細胞性が低い。いくつかの例では、有核細胞性が低い試料は、ＤＮＡ抽出のために、より多くの、例えば、より大きな組織体積を必要とし得る。
【0140】
いくつかの例では、試料から抽出された核酸は、リボ核酸（ＲＮＡ）分子を含み得る。開示される方法による分析のために好適であり得るＲＮＡの例としては、限定されるものではないが、総細胞ＲＮＡ、特定の存在量のＲＮＡ配列の枯渇後の総細胞ＲＮＡ（例えば、リボソームＲＮＡ）、無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又はその断片、総ＲＮＡのポリ（Ａ）尾部ｍＲＮＡ画分、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）又はその断片、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）又はその断片、及びミトコンドリアＲＮＡ又はその断片が挙げられる。いくつかの例では、ＲＮＡは、試料から抽出され、例えば、逆転写反応を使用して相補的ＤＮＡに変換され得る。いくつかの例では、ｃＤＮＡは、ランダムプライムｃＤＮＡ合成法によって産生される。他の例では、ｃＤＮＡ合成は、オリゴ（ｄＴ）含有オリゴヌクレオチドによるプライミングによって成熟ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部で開始される。枯渇、ポリ（Ａ）濃縮、及びｃＤＮＡ合成のための方法は、当業者に周知である。
【0141】
いくつかの例では、試料は、例えば、腫瘍細胞又は腫瘍細胞核を含む、腫瘍含有量を含み得る。いくつかの例では、試料は、少なくとも５～５０％、１０～４０％、１５～２５％、又は２０～３０％の腫瘍細胞核を有する腫瘍含有量を含み得る。いくつかの例では、試料は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％の腫瘍細胞核の腫瘍含有量を含み得る。いくつかの例では、腫瘍核のパーセントは、試料中の腫瘍細胞の数を、核を有する試料中の全ての細胞の総数で除算することによって決定（例えば、計算）される。いくつかの例では、例えば、試料が肝細胞を含む肝臓試料であるとき、異なる腫瘍含有量計算が、２倍又は２倍超の核を有する肝細胞の存在、他のＤＮＡ含有量、例えば、非肝細胞、体細胞核の存在に起因して必要とされ得る。いくつかの例では、遺伝子変化、例えば、変異体配列の検出の感度、又は、例えば、マイクロサテライト不安定性の決定の感度は、試料の腫瘍含有量に依存し得る。例えば、より低い腫瘍含有量を有する試料は、所与のサイズの試料に対する検出のより低い感度を結果的にもたらし得る。
【0142】
いくつかの例では、上記のように、試料は、例えば、腫瘍からの、又は正常組織からの、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ（又はＲＮＡに由来するｃＤＮＡ）、又は両方）を含む。ある特定の例では、試料は、例えば、腫瘍又は正常組織由来の非核酸成分、例えば、細胞、タンパク質、炭水化物、又は脂質を更に含み得る。
【0143】
対象
いくつかの例では、試料は、ある条件若しくは疾患（例えば、過剰増殖性疾患又は悲がん指標）を有するか、又はある条件若しくは疾患を有すると疑われる対象（例えば、患者）から得られる（例えば、収集される）。いくつかの例では、過剰増殖性疾患は、がんである。いくつかの例では、がんは、固形腫瘍又はその転移性形態である。いくつかの例では、がんは、血液がん、例えば、白血病又はリンパ腫である。
いくつかの例では、試料は、ある条件若しくは疾患（例えば、過剰増殖性疾患又は悲がん指標）を有するか、又はある条件若しくは疾患を有すると疑われる対象（例えば、患者）から得られる（例えば、収集される）。いくつかの例では、過剰増殖性疾患は、がんである。いくつかの例では、がんは、固形腫瘍又はその転移性形態である。いくつかの例では、がんは、血液がん、例えば、白血病又はリンパ腫である。
【0144】
いくつかの例では、対象は、がんを有するか、又はがんを有するリスクがある。例えば、いくつかの例では、対象は、がん（例えば、がんを発症するためのベースラインのリスクを増加させる遺伝子変異を有すること）に対する遺伝的素因を有する。いくつかの例では、対象は、がんを発症するリスクを増加させる環境変動（例えば、放射線又は化学物質）に曝露されている。いくつかの例では、対象は、がんの発症について監視されることを必要とする。いくつかの例では、対象は、例えば、がん治療で処置された後に、がんの進行又は退縮について監視されることを必要としている。いくつかの例では、対象は、がんの再発について監視されることを必要としている。いくつかの例では、対象は、微小残存病変（ＭＲＤ）について監視されることを必要としている。いくつかの例では、対象は、がんに対して処置されていたか、又は処置されている。いくつかの例では、対象は、がん治療（又はがん処置）で処置されていない。
【0145】
いくつかの例では、対象（例えば、患者）は、１つ以上の標的療法で処置されているか、又は以前に処置されたことがある。いくつかの例では、例えば、標的療法で以前に処置されたことがある患者について、標的療法後試料（例えば、検体）が得られる（例えば、収集される）。いくつかの例では、標的療法後試料は、標的療法の完了後に得られた試料である。
【0146】
いくつかの例では、患者は、標的療法で以前に処置されていない。いくつかの例では、例えば、以前に標的療法で処置されていない患者について、試料は、切除、例えば、元の切除、又は再発後の切除（例えば、治療後の疾患再発後）。
【0147】
がん
いくつかの例では、試料は、がんを有する対象から取得される。例示的ながんとしては、限定されるものではないが、Ｂ細胞がん（例えば、多発性骨髄腫）、黒色腫、乳がん、肺がん（非小細胞肺がん又はＮＳＣＬＣなど）、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がんが含まれるが、これらに限定されない、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳又は中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮がん又は子宮内膜がん、口腔又は咽頭がん、肝がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸又は付属器がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎腺がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん、腺がん、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、結腸がん、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性細胞血症ベラ、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、軟部組織肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、髄質がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞腫、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん腫、ウィルムス腫瘍、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肝細胞がん、甲状腺がん、胃がん、頭頸部がん、小細胞がん、本態性血小板血症、アグノーゲン性骨髄性化生、高好酸球性症候群、全身性肥満細胞症、家族性高好酸球増加症、慢性好酸球性白血病、神経内分泌がん、がん様腫瘍などが挙げられる。
いくつかの例では、試料は、がんを有する対象から取得される。例示的ながんとしては、限定されるものではないが、Ｂ細胞がん（例えば、多発性骨髄腫）、黒色腫、乳がん、肺がん（非小細胞肺がん又はＮＳＣＬＣなど）、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん、膵臓がんが含まれるが、これらに限定されない、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳又は中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮がん又は子宮内膜がん、口腔又は咽頭がん、肝がん、腎臓がん、精巣がん、胆道がん、小腸又は付属器がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎腺がん、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織のがん、腺がん、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、結腸がん、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄増殖性障害（ＭＰＤ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性細胞血症ベラ、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、軟部組織肉腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、骨形成性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、髄質がん、気管支原性がん、腎細胞がん、肝細胞腫、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胚性がん腫、ウィルムス腫瘍、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、肝細胞がん、甲状腺がん、胃がん、頭頸部がん、小細胞がん、本態性血小板血症、アグノーゲン性骨髄性化生、高好酸球性症候群、全身性肥満細胞症、家族性高好酸球増加症、慢性好酸球性白血病、神経内分泌がん、がん様腫瘍などが挙げられる。
【0148】
いくつかの例では、がんは、血液悪性腫瘍（又は前悪性腫瘍）である。本明細書で使用される場合、血液悪性腫瘍は、造血又はリンパ組織の腫瘍、例えば血液、骨髄、又はリンパ節に影響を及ぼす腫瘍を指す。例示的な血液悪性腫瘍には、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、有毛細胞白血病、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、若年性骨髄単球性白血病（ＪＭＭＬ）、又は大顆粒リンパ性白血病）、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫（例えば、古典的ホジキンリンパ腫又は結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫）、菌状息肉症、非ホジキンリンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ／ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、又はマントル細胞リンパ腫）又はＴ細胞非ホジキンリンパ腫（菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、又は前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫））、原発性中枢神経系が含まれるが、これらに限定されない。
【0149】
核酸抽出及び処理
ＤＮＡ又はＲＮＡは、当業者に既知の様々な技術のうちのいずれかを使用して、組織試料、生検試料、血液試料、又は他の体液試料から抽出され得る（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０９２４２６号の実施例１、Ｔａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００９），“ＤＮＡ，ＲＮＡ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｐａｓｔ ａｎｄ Ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｔ”，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００９：５７４３９８、ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＬＥＶ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、及びｔｈｅ Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｂｕｃｃａｌ Ｓｗａｂ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ＃ＴＭ３３３，Ｊａｎｕａｒｙ １，２０１１，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。ＲＮＡ単離のためのプロトコルは、例えば、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ＃ＴＢ３５１、２００９年８月、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に開示されている。
ＤＮＡ又はＲＮＡは、当業者に既知の様々な技術のうちのいずれかを使用して、組織試料、生検試料、血液試料、又は他の体液試料から抽出され得る（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０９２４２６号の実施例１、Ｔａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００９），“ＤＮＡ，ＲＮＡ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：Ｔｈｅ Ｐａｓｔ ａｎｄ Ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｔ”，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００９：５７４３９８、ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＬＥＶ Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、及びｔｈｅ Ｍａｘｗｅｌｌ １６ Ｂｕｃｃａｌ Ｓｗａｂ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ＃ＴＭ３３３，Ｊａｎｕａｒｙ １，２０１１，Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。ＲＮＡ単離のためのプロトコルは、例えば、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ＃ＴＢ３５１、２００９年８月、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）に開示されている。
【0150】
典型的なＤＮＡ抽出手順は、例えば、（ｉ）ＤＮＡが抽出されることになる流体試料、細胞試料、又は組織試料の収集と、（ｉｉ）必要な場合、ＤＮＡ及び他の細胞質成分を放出するための細胞膜の破壊（すなわち、細胞溶解）と、（ｉｉｉ）タンパク質、脂質、及びＲＮＡを沈殿させるための濃厚塩溶液による液体試料又は溶解した試料の処置、その後の、沈殿したタンパク質、脂質、及びＲＮＡを分離するための遠心分離と、（ｉｖ）細胞膜溶解ステップ中に使用された洗剤、タンパク質、塩、又は他の試薬を除去するための上清からのＤＮＡの精製と、を含む。
【0151】
細胞膜の破壊は、様々な機械的剪断（例えば、フレンチプレス又は細針）又は超音波破壊技術を使用して実施され得る。細胞溶解ステップは、多くの場合、脂質、細胞及び核膜を溶解するための洗剤及び界面活性剤の使用を含む。いくつかの例では、溶解ステップは、タンパク質を破壊するためのプロテアーゼの使用、及び／又は試料中のＲＮＡの消化のためのＲＮａｓｅの使用を更に含み得る。
【0152】
ＤＮＡ精製のための好適な技術の例としては、限定されるものではないが、（ｉ）氷冷エタノール又はイソプロパノール中の沈殿、その後の遠心分離（例えば、酢酸ナトリウムの添加による、イオン強度を増加させることによって増強され得るＤＮＡの沈殿）と、（ｉｉ）フェノール－クロロホルム抽出、その後の、核酸を含有する水相を、変性タンパク質を含有する有機相から分離するための遠心分離と、（ｉｉｉ）核酸が緩衝液のｐＨ及び塩濃度に応じて固相（例えば、シリカ又はその他）に吸着する固相クロマトグラフィーと、が挙げられる。
【0153】
いくつかの例では、ＤＮＡに結合された細胞及びヒストンタンパク質は、プロテアーゼを添加することによって、又は酢酸ナトリウム若しくは酢酸アンモニウムでタンパク質を沈殿させることによって、あるいはＤＮＡ沈殿ステップの前のフェノール－クロロホルム混合物による抽出を通じて除去され得る。
【0154】
いくつかの例では、ＤＮＡは、様々な好適な市販のＤＮＡ抽出及び精製キットのうちのいずれかを使用して抽出され得る。例としては、限定されるものではないが、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）製のＱＩＡａｍｐ（ヒト試料からのゲノムＤＮＡの単離用）及びＤＮＡｅａｓｙ（動物又は植物試料からのゲノムＤＮＡの単離用）キット、又はＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）製のＭａｘｗｅｌｌ（登録商標）及びＲｅｌｉａＰｒｅｐ（商標）シリーズが挙げられる。
【0155】
上記のように、いくつかの例では、試料は、ホルマリン固定（ホルムアルデヒド固定、又はパラホルムアルデヒド固定）、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織調製を含み得る。例えば、ＦＦＰＥ試料は、基質、例えば、ＦＦＰＥブロックに包埋された組織試料であり得る。ホルムアルデヒド固定又はパラホルムアルデヒド固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から核酸（例えば、ＤＮＡ）を単離するための方法が、例えば、Ｃｒｏｎｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１６４（１）：３５－４２、Ｍａｓｕｄａ，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７（２２）：４４３６－４４４３、Ｓｐｅｃｈｔ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１５８（２）：４１９－４２９、Ａｍｂｉｏｎ ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＡＭ１９７５，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００８）、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＦＦＰＥ Ｐｌｕｓ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ＃ＴＭ３４９，Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１１）、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｋｉｔ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（ＯＭＥＧＡ ｂｉｏ－ｔｅｋ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ，ｐｒｏｄｕｃｔ ｎｕｍｂｅｒｓ Ｄ３３９９－００，Ｄ３３９９－０１，ａｎｄ Ｄ３３９９－０２，Ｊｕｎｅ ２００９）、並びにＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３７６２５，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２００７）に開示されている。例えば、ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ（商標）Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔは、高温でキシレンを使用してパラフィン包埋試料を可溶化し、ガラス繊維フィルタにかけて核酸を捕捉する。Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ ＦＦＰＥ Ｐｌｕｓ ＬＥＶ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔを、Ｍａｘｗｅｌｌ（登録商標）１６ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔとともに、ＦＦＰＥ組織の１から１０μｍ切片のゲノムＤＮＡを精製するために使用する。シリカクラッド常磁性粒子（ＰＭＰ）を用いてＤＮＡを精製し、低溶出容量で溶出する。Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．（登録商標）ＦＦＰＥ ＤＮＡ Ｋｉｔは、ゲノムＤＮＡの単離のためにスピンカラム及び緩衝系を使用する。ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔは、ゲノム及びミトコンドリアＤＮＡの精製にＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用する。
【0156】
いくつかの例では、開示される方法は、試料から抽出された核酸の収量値を決定又は取得することと、決定された値を参照値と比較することを更に含み得る。例えば、決定又は取得された値が参照値未満である場合、核酸は、ライブラリ構築を進める前に増幅され得る。いくつかの例では、開示される方法は、試料中の核酸断片のサイズ（又は平均サイズ）に対する値を決定又は取得することと、決定又は取得された値を、参照値、例えば、少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００塩基対（ｂｐｓ）のサイズ（又は平均サイズ）と比較することと、を更に含み得る。いくつかの例では、本明細書に説明される１つ以上のパラメータは、この決定に応答して、調整又は選択され得る。
【0157】
単離後、核酸は、典型的には、わずかにアルカリ性の緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液中、又は超純水中で溶解される。いくつかの例では、単離された核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、当業者に既知の様々な技術のうちのいずれかを使用することによって、断片化又は剪断され得る。例えば、ゲノムＤＮＡは、物理的剪断法、酵素的切断法、化学的切断法、及び当業者に周知の他の方法によって断片化され得る。ＤＮＡ剪断のための方法は、例えば、国際特許出願公開第２０１２／０９２４２６号の実施例４に説明されている。いくつかの例では、ＤＮＡ剪断法の代替法を使用して、ライブラリ調製中のライゲーションステップを回避することができる。
【0158】
ライブラリ調製
いくつかの例では、試料から単離された核酸は、ライブラリを構築するために使用され得る（例えば、本明細書に説明される核酸ライブラリ）。いくつかの例では、核酸は、上記に説明された方法のうちのいずれかを使用して断片化され、任意選択的に、鎖末端損傷の修復に供され、任意選択的に、アダプター、プライマー、及び／若しくはバーコード（例えば、増幅プライマー、配列アダプター、フローセルアダプター、基質アダプター、試料バーコード若しくはインデックス、及び／又は固有の分子識別子配列）を合成するためにライゲーションされ、サイズ選択され（例えば、分取ゲル電気泳動による）、並びに／又は増幅される（例えば、ＰＣＲ、非ＰＣＲ増幅技術、又は等温増幅技術を使用して）。いくつかの例では、断片化及びアダプターライゲーションされた核酸群は、標的配列のハイブリダイゼーションベースの選択の前に明示的なサイズ選択又は増幅なしに使用される。いくつかの例では、核酸は、当業者に周知の様々な特異的又は非－特異的核酸増幅方法のうちのいずれかによって増幅される。いくつかの例では、核酸は、例えば、ランダムプライム鎖置換増幅などの全ゲノム増幅法によって増幅される。次世代配列決定のための核酸ライブラリ調製技術の例は、例えば、ｖａｎ Ｄｉｊｋ， ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２２：１２－２０，ａｎｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａ’ｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔに説明されている。
いくつかの例では、試料から単離された核酸は、ライブラリを構築するために使用され得る（例えば、本明細書に説明される核酸ライブラリ）。いくつかの例では、核酸は、上記に説明された方法のうちのいずれかを使用して断片化され、任意選択的に、鎖末端損傷の修復に供され、任意選択的に、アダプター、プライマー、及び／若しくはバーコード（例えば、増幅プライマー、配列アダプター、フローセルアダプター、基質アダプター、試料バーコード若しくはインデックス、及び／又は固有の分子識別子配列）を合成するためにライゲーションされ、サイズ選択され（例えば、分取ゲル電気泳動による）、並びに／又は増幅される（例えば、ＰＣＲ、非ＰＣＲ増幅技術、又は等温増幅技術を使用して）。いくつかの例では、断片化及びアダプターライゲーションされた核酸群は、標的配列のハイブリダイゼーションベースの選択の前に明示的なサイズ選択又は増幅なしに使用される。いくつかの例では、核酸は、当業者に周知の様々な特異的又は非－特異的核酸増幅方法のうちのいずれかによって増幅される。いくつかの例では、核酸は、例えば、ランダムプライム鎖置換増幅などの全ゲノム増幅法によって増幅される。次世代配列決定のための核酸ライブラリ調製技術の例は、例えば、ｖａｎ Ｄｉｊｋ， ｅｔ ａｌ．（２０１４），Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２２：１２－２０，ａｎｄ Ｉｌｌｕｍｉｎａ’ｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｋｉｔに説明されている。
【0159】
いくつかの例では、結果的に得られる核酸ライブラリは、ゲノムの複雑さの全て又は実質的に全てを含み得る。この文脈における「実質的に全て」という用語は、実際には、手順の初期工程中にゲノム複雑性のいくらかの望ましくない喪失があり得る可能性を指す。本明細書に説明される方法はまた、核酸ライブラリがゲノムの一部である場合、例えば、ゲノムの複雑性が設計によって低減される場合に有用である。いくつかの例では、ゲノムの任意の選択された部分は、本明細書に説明される方法とともに使用され得る。例えば、ある特定の実施形態では、エクソーム全体又はそのサブセットが単離される。いくつかの例では、ライブラリは、少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、又は５％のゲノムＤＮＡを含み得る。いくつかの例では、ライブラリは、少なくとも９５％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、又は５％のゲノムＤＮＡを含むゲノムＤＮＡのｃＤＮＡコピーからなり得る。ある特定の例では、核酸ライブラリを生成するために使用される核酸の量は、５マイクログラム未満、１マイクログラム未満、５００ｎｇ未満、２００ｎｇ未満、１００ｎｇ未満、５０ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、５ｎｇ未満、又は１ｎｇ未満であり得る。
【0160】
いくつかの例では、ライブラリ（例えば、核酸ライブラリ）は、核酸分子の集合を含む。本明細書に説明されるように、ライブラリの核酸分子は、標的核酸分子（例えば、腫瘍核酸分子、参照核酸分子及び／又は制御核酸分子、本明細書ではそれぞれ第１、第２及び／又は第３の核酸分子とも呼ばれる）を含むことができる。ライブラリの核酸分子は、単一の対象又は個体に由来し得る。いくつかの例では、ライブラリは、２以上の対象（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０以上の対象）に由来する核酸分子を含み得る。例えば、異なる対象由来の２つ以上のライブラリは、２以上の対象由来の核酸分子を有するライブラリを形成するために組み合わせられ得る（各対象に由来する核酸分子は、任意選択的に、特定の対象に対応する固有の試料バーコードにライゲーションされる）。いくつかの例では、対象は、がん又は腫瘍を有するか、又は有するリスクがあるヒトである。
【0161】
いくつかの例では、ライブラリ（又はその一部分）は、１つ以上のサブゲノム区間を含み得る。いくつかの例では、サブゲノム区間は、単一ヌクレオチド位置、例えば、その位置の変異体が腫瘍表現型と関連付けられている（陽性又は陰性に）ヌクレオチド位置であり得る。いくつかの例では、サブゲノム区間は、２つ以上のヌクレオチド位置を含む。そのような例は、長さが少なくとも２、５、１０、５０、１００、１５０、２５０、又は２５０超のヌクレオチド位置の配列を含む。サブゲノム区間は、例えば、１つ以上の全遺伝子（又はその一部分）、１つ以上のエクソン若しくはコーディング配列（又はその一部分）、１つ以上のイントロン（又はその一部分）、１つ以上のマイクロサテライト領域（又はその一部分）、又はそれらの任意の組み合わせを含み得る。サブゲノム区間は、天然に存在する核酸分子、例えば、ゲノムＤＮＡ分子の断片の全部又は一部を含み得る。例えば、サブゲノム区間は、配列決定反応に供されるゲノムＤＮＡの断片に対応し得る。いくつかの例では、サブゲノム区間は、ゲノム供給源からの連続配列である。いくつかの例では、サブゲノム区間は、ゲノム中で連続していない配列を含み、例えば、ｃＤＮＡ中のサブゲノム区間は、スプライシングの結果として形成されたエクソン－エクソン接合部を含み得る。いくつかの例では、サブゲノム区間は、腫瘍核酸分子を含む。いくつかの例では、サブゲノム区間は、非腫瘍核酸分子を含む。
【0162】
分析のための遺伝子座の標的化
本明細書に説明される方法は、本明細書に説明されるように、例えば、ゲノム遺伝子座セット（例えば、遺伝子座又はその断片）から、対象区間セット（例えば、標的配列）を評価するための方法と組み合わせて、又はその一部として使用され得る。
本明細書に説明される方法は、本明細書に説明されるように、例えば、ゲノム遺伝子座セット（例えば、遺伝子座又はその断片）から、対象区間セット（例えば、標的配列）を評価するための方法と組み合わせて、又はその一部として使用され得る。
【0163】
いくつかの例では、開示される方法によって評価されるゲノム遺伝子座セットは、変異形態で、細胞分裂、増殖若しくは生存に対する効果と関連付けられるか、又はがん、例えば、本明細書に説明されるがんと関連付けられる、複数の、例えば、遺伝子を含む。
【0164】
いくつかの例では、開示される方法によって評価される遺伝子座セットは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、又は１００超の遺伝子座を含む。
【0165】
いくつかの例では、選択された遺伝子座（本明細書では標的遺伝子座又は標的配列とも呼ばれる）又はその断片は、対象ゲノムの非コーディング配列、コーディング配列、遺伝子内領域、又は遺伝子間領域を含む、対象区間を含み得る。例えば、対象区間は、非コーディング配列又はその断片（例えば、プロモーター配列、エンハンサー配列、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）、又はそれらの断片）、その断片のコーディング配列、エクソン配列又はその断片、イントロン配列又はその断片を含み得る。
【0166】
標的捕捉試薬
本明細書に説明される方法は、分析のための複数の特定の標的配列（例えば、遺伝子配列又はその断片）を選択及び捕捉するために、核酸ライブラリを複数の標的捕捉試薬と接触させることを含み得る。いくつかの例では、標的捕捉試薬（すなわち、標的分子に結合し、それによって、標的分子の捕捉を可能にする分子）が、分析される対象区間を選択するために使用される。例えば、標的捕捉試薬は、標的分子にハイブリダイズし（すなわち、それに相補的である）、それによって、標的核酸の捕捉を可能にし得るベイト分子、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子）であり得る。いくつかの例では、標的捕捉試薬、例えば、ベイト分子（又はベイト配列）は、捕捉オリゴヌクレオチド（又は捕捉プローブ）である。いくつかの例では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子由来のｃＤＮＡ分子、マイクロサテライトＤＮＡ配列などである。いくつかの例では、標的捕捉試薬は、標的に対する溶液相ハイブリダイゼーションに好適である。いくつかの例では、標的捕捉試薬は、標的に対する固相ハイブリダイゼーションに好適である。いくつかの例では、標的捕捉試薬は、標的に対する溶液相ハイブリダイゼーション及び固相ハイブリダイゼーションの両方に好適である。標的捕捉試薬の設計及び構築は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０２０／２３６９４１号により詳細に説明され、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に説明される方法は、分析のための複数の特定の標的配列（例えば、遺伝子配列又はその断片）を選択及び捕捉するために、核酸ライブラリを複数の標的捕捉試薬と接触させることを含み得る。いくつかの例では、標的捕捉試薬（すなわち、標的分子に結合し、それによって、標的分子の捕捉を可能にする分子）が、分析される対象区間を選択するために使用される。例えば、標的捕捉試薬は、標的分子にハイブリダイズし（すなわち、それに相補的である）、それによって、標的核酸の捕捉を可能にし得るベイト分子、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子）であり得る。いくつかの例では、標的捕捉試薬、例えば、ベイト分子（又はベイト配列）は、捕捉オリゴヌクレオチド（又は捕捉プローブ）である。いくつかの例では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＲＮＡ分子由来のｃＤＮＡ分子、マイクロサテライトＤＮＡ配列などである。いくつかの例では、標的捕捉試薬は、標的に対する溶液相ハイブリダイゼーションに好適である。いくつかの例では、標的捕捉試薬は、標的に対する固相ハイブリダイゼーションに好適である。いくつかの例では、標的捕捉試薬は、標的に対する溶液相ハイブリダイゼーション及び固相ハイブリダイゼーションの両方に好適である。標的捕捉試薬の設計及び構築は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０２０／２３６９４１号により詳細に説明され、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0167】
本明細書に説明される方法は、配列決定されることになる標的核酸分子を選択するための標的捕捉試薬の適切な選択によって、１以上の対象からの試料（例えば、がん組織検体、液体生検試料など）からの多数のゲノム遺伝子座（例えば、遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）、マイクロサテライト遺伝子座など）の最適化された配列決定を提供する。いくつかの例では、標的捕捉試薬は、特定の標的遺伝子座、例えば、特定の標的遺伝子座又はその断片にハイブリダイズし得る。いくつかの例では、標的捕捉試薬は、特定の標的遺伝子座群、例えば、特定の遺伝子座群又はその断片にハイブリダイズし得る。いくつかの例では、標的特異的及び／又は群特異的標的捕捉試薬の混合を含む複数の標的捕捉試薬が使用され得る。
【0168】
いくつかの例では、核酸配列決定のための複数の標的配列を捕捉するために核酸ライブラリと接触した複数の標的捕捉試薬（例えば、ベイトセット）中の標的捕捉試薬（例えば、ベイト分子）の数は、１０超、５０超、１００超、２００超、３００超、４００超、５００超、６００超、７００超、８００超、９００超、１，０００超、１，２５０超、１，５００超、１，７５０超、２，０００超、３，０００超、４，０００超、５，０００超、１０，０００超、２５，０００超、又は５０，０００超である。
【0169】
いくつかの例では、標的捕捉試薬配列の全長は、約７０ヌクレオチド～１０００ヌクレオチドであり得る。一例では、標的捕捉試薬の長さは、約１００～３００ヌクレオチド、１１０～２００ヌクレオチド、又は１２０～１７０ヌクレオチド長である。上記のものに加えて、約７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００及び９００ヌクレオチド長の中間オリゴヌクレオチド長が、本明細書に説明される方法で使用され得る。いくつかの実施形態では、約７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０又は２３０塩基のオリゴヌクレオチドが使用され得る。
【0170】
いくつかの例では、各標的捕捉試薬配列は、（ｉ）標的特異的捕捉配列（例えば、遺伝子座又はマイクロサテライト遺伝子座特異的相補配列）、（ｉｉ）アダプター、プライマー、バーコード、及び／又は固有の分子識別子配列、並びに（ｉｉｉ）一端若しくは両端のユニバーサルテールを含み得る。本明細書に使用される際、「標的捕捉試薬」という用語は、標的特異的標的捕捉配列又は標的特異的標的捕捉配列を含む標的捕捉試薬オリゴヌクレオチド全体を指し得る。
【0171】
いくつかの例では、標的捕捉試薬中の標的特異的捕捉配列は、約４０ヌクレオチド～１０００ヌクレオチド長である。いくつかの例では、標的特異的捕捉配列は、約７０ヌクレオチド～３００ヌクレオチド長である。いくつかの例では、標的特異的配列は、約１００ヌクレオチド～２００ヌクレオチド長である。更に他の例では、標的特異的配列は、約１２０ヌクレオチド～１７０ヌクレオチド長、典型的には１２０ヌクレオチド長である。上記のものに加えて、中間の長さ、例えば、約４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００及び９００ヌクレオチド長の標的特異的配列、並びに上記の長さの間の長さの標的特異的配列もまた、本明細書に説明される方法で使用され得る。
【0172】
いくつかの例では、標的捕捉試薬は、１つ以上の再編成を含む対象区間、例えば、ゲノム再編成を含むイントロンを選択するように設計され得る。そのような例では、標的捕捉試薬は、選択効率を高めるために反復配列がマスクされるように設計される。再編成が既知の連結配列を有するこれらの例では、相補的標的捕捉試薬を連結配列に設計して選択効率を高めることができる。
【0173】
いくつかの例では、開示される方法は、２つ以上の異なる標的カテゴリを捕捉するように設計された標的捕捉試薬の使用を含み得、各カテゴリは、異なる標的捕捉試薬設計戦略を有する。いくつかの例では、本明細書に開示される、ハイブリダイゼーションベースの捕捉方法及び標的捕捉試薬組成物は、標的配列セットの捕捉及び均質なカバレッジを提供するが、一方で、標的化された配列セットの外側のゲノム配列のカバレッジを最小化する。いくつかの例では、標的配列は、ゲノムＤＮＡのエクソーム全体又はその選択されたサブセットを含み得る。別の例では、標的配列は、大きな染色体領域（例えば、染色体腕全体）を含み得る。本明細書に開示される方法及び組成物は、複合標的核酸配列セットについて異なる配列決定深度及びカバレッジのパターンを達成するための異なる標的捕捉試薬を提供する。
【0174】
典型的には、ＤＮＡ分子が標的捕捉試薬配列として使用されるが、ＲＮＡ分子も使用することができる。いくつかの例では、ＤＮＡ分子標的捕捉試薬は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）であり得る。いくつかの例では、ＲＮＡ－ＤＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ－ＤＮＡ二重鎖よりも安定であり、したがって、潜在的により良好な核酸の捕捉を提供する。
【0175】
いくつかの例では、開示される方法は、１つ以上の核酸ライブラリから捕捉された、選択された核酸分子セット（例えば、ライブラリキャッチ）を提供することを含む。例えば、方法は、１つ又は複数の核酸ライブラリを提供することであって、各々が、１以上の対象からの１つ以上の試料から抽出された複数の核酸分子（例えば、複数の標的核酸分子及び／又は参照核酸分子）を含む、提供することと、１つ又は複数のライブラリ（例えば、溶液ベースのハイブリダイゼーション反応における）を、１、２、３、４、５、又は５つ超の複数の標的捕捉試薬（例えば、オリゴヌクレオチド標的捕捉試薬）と接触させて、複数の標的捕捉試薬／核酸分子ハイブリッドを含むハイブリダイゼーション混合物を形成することと、例えば、ハイブリダイゼーション混合物を、当該ハイブリダイゼーション混合物からの複数の標的捕捉試薬／核酸分子ハイブリッドの分離を可能にする結合実体と接触させることによって、当該複数の標的捕捉試薬／核酸分子ハイブリッドを当該ハイブリダイゼーション混合物から分離し、それによって、ライブラリキャッチ（例えば、１つ又は複数のライブラリからの選択又は濃縮された核酸分子の部分群）を提供することと、を含み得る。
【0176】
いくつかの例では、開示される方法は、ライブラリキャッチを増幅することを更に含み得る（例えば、ＰＣＲを実施することによって）。他の例では、ライブラリキャッチは、増幅されない。
【0177】
いくつかの例では、標的捕捉試薬は、必要に応じて説明書、標準、緩衝液若しくは酵素又は他の試薬を含み得るキットの一部であり得る。
【0178】
ハイブリダイゼーション条件
上記のように、本明細書に開示される方法は、ライブラリ（例えば、核酸ライブラリ）を、複数の標的捕捉試薬と接触させて、選択されたライブラリ標的核酸配列（すなわち、ライブラリキャッチ）と接触させるステップを含み得る。接触ステップは、例えば、溶液ベースのハイブリダイゼーションで行われ得る。いくつかの例では、方法は、１回以上の追加の溶液ベースのハイブリダイゼーションに関してハイブリダイゼーションステップを繰り返すことを含む。いくつかの例では、方法は、ライブラリキャッチを、同じか又は異なる標的捕捉試薬の集合との１回以上の追加の溶液ベースのハイブリダイゼーションに供することを更に含む。
上記のように、本明細書に開示される方法は、ライブラリ（例えば、核酸ライブラリ）を、複数の標的捕捉試薬と接触させて、選択されたライブラリ標的核酸配列（すなわち、ライブラリキャッチ）と接触させるステップを含み得る。接触ステップは、例えば、溶液ベースのハイブリダイゼーションで行われ得る。いくつかの例では、方法は、１回以上の追加の溶液ベースのハイブリダイゼーションに関してハイブリダイゼーションステップを繰り返すことを含む。いくつかの例では、方法は、ライブラリキャッチを、同じか又は異なる標的捕捉試薬の集合との１回以上の追加の溶液ベースのハイブリダイゼーションに供することを更に含む。
【0179】
いくつかの例では、接触ステップは、固体支持体、例えば、アレイを使用して行われる。ハイブリダイゼーションのための好適な固体支持体は、例えば、Ａｌｂｅｒｔ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４（１１）：９０３－５、Ｈｏｄｇｅｓ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３９（１２）：１５２２－７、及びＯｋｏｕ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４（１１）：９０７－９に説明されており、それらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0180】
本明細書の方法での使用に適合させることができるハイブリダイゼーション方法は、例えば、国際特許出願公開第２０１２／０９２４２６号に記載されているように、当技術分野で記載されている。複数の標的核酸に標的捕捉試薬をハイブリダイズするための方法は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０２０／２３６９４１号により詳細に説明され、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0181】
配列決定方法
本明細書に開示される方法及びシステムは、核酸を配列決定するための方法又はシステム（例えば、次世代配列決定システム）と組み合わせて、又はその一部として使用されて、試料中のサブゲノム区間内の１つ以上の遺伝子座と重複する複数の配列リードを生成し、それによって、例えば、複数の遺伝子座における遺伝子対立配列を決定し得る。本明細書で使用される「次世代配列決定」（又は「ＮＧＳ」）はまた、「超並列配列決定」とも呼ばれ得、個々の核酸分子（例えば、単一分子配列決定では）又は個々の核酸分子のクローン的に拡大されたプロキシのヌクレオチド配列をハイスループット様式（例えば、１０３、１０４、１０５又は１０５超の分子が同時に配列決定される）で決定する任意の配列決定方法を指す。
本明細書に開示される方法及びシステムは、核酸を配列決定するための方法又はシステム（例えば、次世代配列決定システム）と組み合わせて、又はその一部として使用されて、試料中のサブゲノム区間内の１つ以上の遺伝子座と重複する複数の配列リードを生成し、それによって、例えば、複数の遺伝子座における遺伝子対立配列を決定し得る。本明細書で使用される「次世代配列決定」（又は「ＮＧＳ」）はまた、「超並列配列決定」とも呼ばれ得、個々の核酸分子（例えば、単一分子配列決定では）又は個々の核酸分子のクローン的に拡大されたプロキシのヌクレオチド配列をハイスループット様式（例えば、１０３、１０４、１０５又は１０５超の分子が同時に配列決定される）で決定する任意の配列決定方法を指す。
【0182】
次世代配列決定法は、当技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｅｔｚｋｅｒ、Ｍ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ１１：３１－４６に説明されている。本明細書に開示される方法及びシステムを実装するときに使用するために好適な配列決定方法の他の例は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０９２４２６号に説明されている。いくつかの例では、配列決定は、例えば、全ゲノム配列決定（ＷＧＳ）、全エクソーム配列決定、標的配列決定、又は直接配列決定を含み得る。いくつかの例では、配列決定は、例えば、サンガー配列決定を使用して実施され得る。
【0183】
開示される方法及びシステムは、Ｒｏｃｈｅ ４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｏｌｅｘａ、ＡＢＩ－ＳＯＬｉＤ、ＩＯＮ Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｅｌｉｃｏｓ、及び／又はＰｏｌｏｎａｔｏｒプラットフォームなどの、配列決定プラットフォームを使用して実装され得る。いくつかの例では、配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ配列決定を含み得る。いくつかの例では、配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ配列決定を含み得る。いくつかの例では、配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ配列決定を含み得る。試料から抽出された核酸中の多数の標的ゲノム遺伝子座を配列決定するための最適化された方法は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０２０／２３６９４１号により詳細に説明され、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0184】
ある特定の例では、開示される方法は、（ａ）複数の正常及び／若しくは腫瘍核酸分子を含むライブラリを試料から取得するステップ、（ｂ）標的核酸分子への標的捕捉試薬のハイブリダイゼーションを可能にする条件下でライブラリを１、２、３、４、５、５つ超の複数の標的捕捉試薬と同時に若しくは順次接触させ、それによって、選択された捕捉された正常及び／若しくは腫瘍核酸分子セット（すなわち、ライブラリキャッチ）を提供するステップ、（ｃ）例えば、ハイブリダイゼーション混合物を、ハイブリダイゼーション混合物からの標的捕捉試薬／核酸分子ハイブリッドの分離を可能にする結合実体と接触させることによって、核酸分子の選択されたサブセット（例えば、ライブラリキャッチ）をハイブリダイゼーション混合物から分離するステップ、（ｄ）ライブラリキャッチを配列決定して、１つ以上の対象区間（例えば、１つ以上の標的配列）と重複する複数のリード（例えば、配列リード）を、変異（又は変化）を含み得るライブラリキャッチ、例えば、体細胞変異又は生殖細胞系列変異を含む変異体配列から取得するステップ、（ｅ）本明細書の他の箇所で説明されるアラインメント方法を使用して当該配列リードをアラインメントするステップ、並びに／又は（ｆ）複数のうちの１つ以上の配列リードから対象区間内のヌクレオチド位置にヌクレオチド値を割り当てる（例えば、ベイズ法又は本明細書に説明される他の方法を使用して、例えば、変異を呼び出す）ステップのうちの１つ以上を含む。
【0185】
いくつかの例では、１つ以上の対象区間に対する配列リードを取得することは、少なくとも１、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０、少なくとも９００、少なくとも９５０、少なくとも１，０００、少なくとも１，２５０、少なくとも１，５００、少なくとも１，７５０、少なくとも２，０００、少なくとも２，２５０、少なくとも２，５００、少なくとも２，７５０、少なくとも３，０００、少なくとも３，５００、少なくとも４，０００、少なくとも４，５００、又は少なくとも５，０００の遺伝子座、例えば、ゲノム遺伝子座、遺伝子座、マイクロサテライト遺伝子座などを配列決定することを含み得る。いくつかの例では、１つ以上の対象区間に対する配列リードを取得することは、この段落に説明された範囲内の任意の数の遺伝子座、例えば、少なくとも２，８５０の遺伝子座に対する対象区間を配列決定することを含み得る。
【0186】
いくつかの例では、１つ以上の対象区間に対する配列リードを取得することは、少なくとも２０塩基、少なくとも３０塩基、少なくとも４０塩基、少なくとも５０塩基、少なくとも６０塩基、少なくとも７０塩基、少なくとも８０塩基、少なくとも９０塩基、少なくとも１００塩基、少なくとも１２０塩基、少なくとも１４０塩基、少なくとも１６０塩基、少なくとも１８０塩基、少なくとも２００塩基、少なくとも２２０塩基、少なくとも２４０塩基、少なくとも２６０塩基、少なくとも２８０塩基、少なくとも３００塩基、少なくとも３２０塩基、少なくとも３４０塩基、少なくとも３６０塩基、少なくとも３８０塩基、又は少なくとも４００塩基の配列リード長（又は平均配列リード長）を提供する配列決定方法を用いて対象区間を配列決定することを含む。いくつかの例では、１つ以上の対象区間に対する配列リードを取得することは、この段落に説明された範囲内の任意の数の塩基の配列リード長（又は平均配列リード長）、例えば、５６塩基の配列リード長（又は平均配列リード長）を提供する配列決定方法を用いて対象区間を配列決定することを含み得る。
【0187】
いくつかの例では、１つ以上の対象区間に対する配列リードを取得することは、平均で少なくとも１００×以上のカバレッジ（又は深度）で配列決定することを含み得る。いくつかの例では、１つ以上の対象区間に対する配列リードを取得することは、平均で少なくとも１００×、少なくとも１５０×、少なくとも２００×、少なくとも２５０×、少なくとも５００×、少なくとも７５０×、少なくとも１，０００×、少なくとも１，５００×、少なくとも２，０００×、少なくとも２，５００×、少なくとも３，０００×、少なくとも３，５００×、少なくとも４，０００×、少なくとも４，５００×、少なくとも５，０００×、少なくとも５，５００×、又は少なくとも６，０００×以上のカバレッジ（又は深度）で配列決定することを含み得る。いくつかの例では、１つ以上の対象区間に対する配列リードを取得することは、この段落で説明された値の範囲内の任意の値を有する平均カバレッジ（又は深度）、例えば、少なくとも１６０×で配列決定することを含み得る。
【0188】
いくつかの例では、１つ以上の対象区間に対する配列リードを取得することは、約９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超の配列決定された遺伝子座に対して、少なくとも１００×～少なくとも６，０００×の範囲の任意の値を有する平均配列決定深度で配列決定することを含む。例えば、いくつかの例では、対象区間に対するリードを取得することは、少なくとも９９％の配列決定された遺伝子座に対して少なくとも１２５×の平均配列決定深度で配列決定することを含む。別の例として、いくつかの例では、対象区間に対するリードを取得することは、少なくとも９５％の配列決定された遺伝子座に対して少なくとも４，１００×の平均配列決定深度で配列決定することを含む。
【0189】
いくつかの例では、ライブラリ中の核酸種の相対存在量は、配列決定実験によって生成されたデータ中のそれらの同族配列の出現の相対数（例えば、所与の同族配列に対する配列リードの数）をカウントすることによって推定され得る。
【0190】
いくつかの例では、開示される方法及びシステムは、本明細書に説明されるように、対象区間セット（例えば、遺伝子座）に対するヌクレオチド配列を提供する。ある特定の事例では、配列は、マッチする正常対照（例えば、野生型コントロール）、及び／又はマッチする腫瘍対照（例えば、原発性対転移性）を含む方法を使用せずに提供される。
【0191】
いくつかの例では、本明細書で使用される場合、配列決定深度のレベル（例えば、配列決定深度のＸ倍レベル）は、重複リード（例えば、ＰＣＲ重複リード）の検出及び除去の後に得られるリードの数（例えば、固有リード）を指す。他の例では、例えば、コピー数変化（ＣＮＡ）の検出を支援するために、重複リードが評価される。
【0192】
アラインメント
アラインメントは、リードをある場所、例えば、ゲノム場所又は遺伝子座とマッチングさせるプロセスである。いくつかの例では、ＮＧＳリードは、既知の参照配列（例えば、野生型配列）にアラインメントされ得る。いくつかの例では、ＮＧＳリードは、デノボアセンブリされ得る。ＮＧＳリードに対する配列アラインメントの方法は、例えば、Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００９，２７：４５５－４５７に説明されている。デノボ配列アセンブリの例は、例えばＷａｒｒｅｎ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００７，２３：５００－５０１、Ｂｕｔｌｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００８，１８：８１０－８２０、及びＺｅｒｂｉｎｏ Ｄ．Ｒ．ａｎｄ Ｂｉｒｎｅｙ Ｅ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００８，１８：８２１－８２９に説明されている。配列アラインメントの最適化は、例えば、国際特許出願公開第２０１２／０９２４２６号に記載されているように、当技術分野で説明されている。配列アラインメント方法の追加の説明が、例えば、国際特許出願公開第２０２０／２３６９４１号により詳細に説明され、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
アラインメントは、リードをある場所、例えば、ゲノム場所又は遺伝子座とマッチングさせるプロセスである。いくつかの例では、ＮＧＳリードは、既知の参照配列（例えば、野生型配列）にアラインメントされ得る。いくつかの例では、ＮＧＳリードは、デノボアセンブリされ得る。ＮＧＳリードに対する配列アラインメントの方法は、例えば、Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．ａｎｄ Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００９，２７：４５５－４５７に説明されている。デノボ配列アセンブリの例は、例えばＷａｒｒｅｎ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００７，２３：５００－５０１、Ｂｕｔｌｅｒ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００８，１８：８１０－８２０、及びＺｅｒｂｉｎｏ Ｄ．Ｒ．ａｎｄ Ｂｉｒｎｅｙ Ｅ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，２００８，１８：８２１－８２９に説明されている。配列アラインメントの最適化は、例えば、国際特許出願公開第２０１２／０９２４２６号に記載されているように、当技術分野で説明されている。配列アラインメント方法の追加の説明が、例えば、国際特許出願公開第２０２０／２３６９４１号により詳細に説明され、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0193】
ミスアラインメント（例えば、ゲノム内の不正確な場所における短いリードからの塩基対の配置）、例えば、代替対立遺伝子のリードが代替対立遺伝子リードのヒストグラムピークからシフトされ得るため、実際のがん変異の周りの配列コンテキスト（例えば、反復配列の存在）に起因するリードのミスアラインメントは、変異検出の感度の低下につながり得、変異検出の感度の低下につながり得る。ミスアラインメントを引き起こし得る配列コンテキストの他の例は、ショートタンデムリピート、散在反復配列、低複雑性領域、挿入－欠失（インデル）、及びパラログを含む。実際の変異が存在しない場合に問題のある配列状況が生じる場合、ミスアラインメントは、実際の参照ゲノム塩基配列のリードを誤った場所に配置することによって、「変異」対立遺伝子のアーチファクトのリードを導入し得る。多重遺伝子分析のための変異呼び出しアルゴリズムは、低存在量の変異に対してさえも感受性でなければならないため、配列ミスアラインメントは、偽陽性発見率を増加させ、及び／又は特異性を低下させ得る。
【0194】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法及びシステムは、複数の個別に調整されたアラインメント方法又はアルゴリズムの使用を統合して、配列決定方法、特に、多数の多様なゲノム遺伝子座における多数の多様な遺伝的事象の超並列配列決定に依存する方法で、ベース呼び出し性能を最適化し得る。いくつかの例では、開示される方法及びシステムは、１つ以上のグローバルアラインメントアルゴリズムの使用を含み得る。いくつかの例では、開示される方法及びシステムは、１つ以上のローカルアラインメントアルゴリズムの使用を含み得る。使用され得るアラインメントアルゴリズムの例としては、限定されるものではないが、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（ＢＷＡ）ソフトウェアバンドル（例えば、Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００９），“Ｆａｓｔ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｓｈｏｒｔ Ｒｅａｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ”，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５：１７５４－６０、Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｆａｓｔ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｌｏｎｇ－Ｒｅａｄ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ”，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｅｐｕｂ．ＰＭＩＤ：２００８０５０５参照）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．（１９８１），“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｍｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅｓ”，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４７（１）：１９５－１９７参照）、Ｓｔｒｉｐｅｄ Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（例えば、Ｆａｒｒａｒ （２００７），“Ｓｔｒｉｐｅｄ Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ Ｓｐｅｅｄｓ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｅｓ Ｓｉｘ Ｔｉｍｅｓ Ｏｖｅｒ Ｏｔｈｅｒ ＳＩＭＤ Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ”，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２３（２）：１５６－１６１参照）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９７０）“Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅｔｈｏｄ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｔｗｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４８（３）：４４３－５３）、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【0195】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法及びシステムはまた、配列アセンブリアルゴリズム、例えば、Ａｒａｃｈｎｅ配列決定アセンブリアルゴリズム（例えば、Ｂａｔｚｏｇｌｏｕ，ｅｔ ａｌ．（２００２），“ＡＲＡＣＨＮＥ：Ａ Ｗｈｏｌｅ－Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｈｏｔｇｕｎ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ”，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１２：１７７－１８９参照）の使用も含み得る。
【0196】
いくつかの例では、配列リードを分析するために使用されるアラインメント方法は、異なるゲノム遺伝子座における異なる変異体（例えば、点変異、挿入、欠失など）の検出のために個別的にカスタマイズ又は調整されない。いくつかの例では、異なるゲノム遺伝子座で検出される異なる変異体の少なくともサブセットの検出のために個別的にカスタマイズ又は調整される異なるアラインメント方法がリードを分析するために使用される。いくつかの例では、異なるゲノム遺伝子座で各異なる変異体を検出するために個別的にカスタマイズ又は調整される異なるアラインメント方法がリードを分析するために使用される。いくつかの例では、調整は、（ｉ）配列決定される遺伝子座（例えば、遺伝子座、マイクロサテライト遺伝子座、又は他の対象区間）、（ｉｉ）試料と関連付けられた腫瘍タイプ、（ｉｉｉ）配列決定される変異体、又は（ｉｖ）試料若しくは対象の特徴のうちの１つ以上の関数であり得る。配列決定されるいくつかの特定の対象区間に個別に調整されるアラインメント条件の選択又は使用は、速度、感度及び特異性の最適化を可能にする。この方法は、比較的多数の多様な対象区間に対するリードのアラインメントが最適化される場合に特に有効である。いくつかの例では、方法は、再配置のために最適化されたアラインメント方法と、再配置と関連付けられていない対象区間のために最適化された他のアラインメント方法の併用を含む。
【0197】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、配列リードを分析、例えば、アラインメントするための当該アラインメント方法を選択又は使用することを更に含み、アラインメント方法は、（ｉ）腫瘍タイプ、例えば、試料中の腫瘍タイプ、（ｉｉ）配列決定される対象区間の場所（例えば、遺伝子座）、（ｉｉｉ）配列決定される対象区間内の変異体のタイプ（例えば、点変異、挿入、欠失、置換、コピー数変異（ＣＮＶ）、再編成、又は融合）、（ｉｖ）分析される部位（例えば、ヌクレオチド位置）、（ｖ）試料のタイプ（例えば、本明細書に説明される試料）、及び／又は（ｖｉ）評価される対象区間内若しくはその近くの隣接配列（例えば、対象区間内又はその近くの反復配列の存在に起因する対象区間のミスアラインメントに対する、その予想される傾向に従って）のうちの１つ以上の関数であるか、それらに応じて選択されるか、それらに対して最適化される。
【0198】
いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、面倒なリード、例えば、再編成を有するリードの迅速かつ効率的なアラインメントを可能にする。したがって、対象区間に対するリードが再編成、例えば、転座を伴うヌクレオチド位置を含むいくつかの例では、方法は、適切に調整され、以下を含むアラインメント方法を使用することを含み得る。（ｉ）リードとのアラインメントのための再配列参照配列を選択することであって、当該再配列参照配列が再配列（いくつかの例では、参照配列はゲノム再編成と同一ではない）とアラインメントする、選択すること、及び（ｉｉ）リードを当該再編成参照配列と比較、例えば、アラインメントすること。
【0199】
いくつかの例では、代替的な方法が、問題のあるリードをアラインメントするために使用され得る。これらの方法は、比較的多数の多様な対象区間に対するリードのアラインメントが最適化される場合に特に有効である。例として、試料を分析する方法は、（ｉ）第１のパラメータセットを使用するリードの比較（例えば、アラインメント比較）を実施し（例えば、第１のマッピングアルゴリズムを使用するか、又は当該第１の参照配列との比較によって）、当該リードが第１のアラインメント基準を満たす（例えば、リードが第１の参照配列で、例えば、特定の数のミスマッチ未満でアラインメントされ得る）かどうかを決定することと、（ｉｉ）当該リードが第１のアラインメント基準を満たさない場合、第２のパラメータセットを使用して第２のアラインメント比較を実施する（例えば、第２のマッピングアルゴリズムを使用するか、又は第２の参照配列との比較によって）ことと、（ｉｉｉ）任意選択的に、当該リードが第２の基準を満たす（例えば、当該リードが当該第２の参照配列で、例えば、特定の数未満のミスマッチ未満でアラインメントされ得る）かどうかを決定することであって、第２のパラメータセットが、例えば、当該第１のパラメータセットと比較して、変異体に対するリードとのアラインメント（例えば、再編成、挿入、欠失、又は転座）を結果的にもたらす可能性が高い、当該第２の参照配列の使用を含む、決定することと、を含み得る。
【0200】
いくつかの例では、開示される方法における配列データのアラインメントは、本明細書の他の箇所に説明される変異呼び出し方法と組み合わせられ得る。本明細書で論じられるように、実際の変異を検出するための感度の低下は、分析されている遺伝子又はゲノム遺伝子座（例えば、遺伝子座）の予想される変異部位の周りのアラインメントの質を（手動で又は自動化された様式で）評価することによって対処することができる。いくつかの例では、評価されることになる部位は、ヒトゲノム（例えば、ＨＧ１９ヒト参照ゲノム）又はがん変異（例えば、ＣＯＳＭＩＣ）のデータベースから得られ得る。問題があると特定された領域は、例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメントなどのより遅いがより正確なアラインメントアルゴリズムを使用するアラインメント最適化（又は再アラインメント）によって、関連する配列状況においてより良好な性能を与えるように選択されたアルゴリズムを使用して修復することができる。一般的なアラインメントアルゴリズムが問題を改善することができない場合、カスタマイズされたアラインメントアプローチが、例えば、置換を含む可能性が高い遺伝子に対する最大の異なるミスマッチペナルティパラメータの調整、特定の腫瘍タイプに共通である特定の変異タイプ（例えば、黒色腫のＣ→Ｔ）に基づいて、特定のミスマッチペナルティパラメータを調整すること、又はある特定の試料タイプ（例えば、ＦＦＰＥに共通である置換）に共通である特定の変異タイプに基づいて、特定のミスマッチペナルティパラメータを調整することによって作成され得る。
【0201】
ミスアラインメントに起因する評価された対象区間の特異性の低下（偽陽性率の増加）は、配列決定データ内の全ての変異呼び出しの手動又は自動検査によって評価され得る。ミスアラインメントに起因して偽の変異呼び出しが発生し易いことが判明した領域は、上記に論じられたアラインメント改善に供され得る。アルゴリズム的な改善策が可能でない場合、問題領域からの「変異」を標的遺伝子座のパネルから分類又はスクリーニングすることができる。
【0202】
変異呼び出し
ベース呼び出しは、配列決定デバイスの生の出力、例えば、オリゴヌクレオチド分子中のヌクレオチドの決定された配列を指す。変異呼び出しは、配列決定されている所与のヌクレオチド位置に対してヌクレオチド値、例えば、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣを選択するプロセスを指す。典型的には、位置に対する配列リード（又はベース呼び出し）は、２つ以上の値を提供することになり、例えば、いくつかのリードがＴを示すことになり、いくつかがＧを示すことになる。変異呼び出しは、正しいヌクレオチド値、例えば、それらの値のうちの１つを配列に割り当てるプロセスである。「変異」呼び出しと呼ばれるが、任意のヌクレオチド位置、例えば、変異体対立遺伝子、野生型対立遺伝子、変異体若しくは野生型として特徴付けられていない対立遺伝子に対応する位置、又は可変性を特徴としない位置にヌクレオチド値を割り当てるために適用することができる。
ベース呼び出しは、配列決定デバイスの生の出力、例えば、オリゴヌクレオチド分子中のヌクレオチドの決定された配列を指す。変異呼び出しは、配列決定されている所与のヌクレオチド位置に対してヌクレオチド値、例えば、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣを選択するプロセスを指す。典型的には、位置に対する配列リード（又はベース呼び出し）は、２つ以上の値を提供することになり、例えば、いくつかのリードがＴを示すことになり、いくつかがＧを示すことになる。変異呼び出しは、正しいヌクレオチド値、例えば、それらの値のうちの１つを配列に割り当てるプロセスである。「変異」呼び出しと呼ばれるが、任意のヌクレオチド位置、例えば、変異体対立遺伝子、野生型対立遺伝子、変異体若しくは野生型として特徴付けられていない対立遺伝子に対応する位置、又は可変性を特徴としない位置にヌクレオチド値を割り当てるために適用することができる。
【0203】
いくつかの例では、開示される方法は、特に、試料、例えば、がんを有する対象からの試料中の多数の多様なゲノム遺伝子座（例えば、遺伝子座、マイクロサテライト領域など）における多数の多様な遺伝子事象の超並列配列決定に依存する方法において、配列決定データに適用されるときの性能を最適化するために、カスタマイズ又は調整された変異呼び出しアルゴリズム又はパラメータの使用を含み得る。変異呼び出しの最適化は、例えば、国際特許出願公開第２０１２／０９２４２６号に記載されているように、当技術分野で説明されている。
【0204】
変異呼び出しのための方法は、以下のうちの１つ以上を含むことができる：参照配列内の各位置での情報に基づいて独立した呼び出しを行う（例えば、配列リードを調べること；ベース呼び出し及び品質スコアを調べること；潜在的な遺伝子型が与えられたときの観察された塩基及び品質スコアの確率を計算すること；及び遺伝子型（例えば、ベイズ則を使用する）の割り当て）；偽陽性を除去すること（例えば、深度閾値を使用して、予想よりもはるかに低い又は高い読み取り深度を有するＳＮＰを拒否する；小さいインデルに起因する偽陽性を除去するための局所再調整）；連鎖不平衡（ＬＤ）／帰属に基づく分析を実行して、呼び出しを改良すること。
【0205】
特定の遺伝子型及び位置に関連する遺伝子型尤度を計算するために使用される式は、例えば、Ｌｉ Ｈ．ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ Ｒ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２０１０；２６（５）：５８９－９５に説明されている。特定のがん型における特定の変異に対する事前の予想は、そのがん型からの試料を評価するときに使用することができる。そのような可能性は、がん変異の公開データベース、例えば、Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）、ＨＧＭＤ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ）、Ｔｈｅ ＳＮＰ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ（ＢＩＣ）及びＢｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（ＢＣＧＤ）から得ることができる。
【0206】
ＬＤ／インピュテーションベースの分析の例は、例えば、Ｂｒｏｗｎｉｎｇ，Ｂ．Ｌ．ａｎｄ Ｙｕ，Ｚ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００９，８５（６）：８４７－６１に説明されている。低カバレッジＳＮＰ呼び出し方法の例は、例えば、Ｌｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．２００９，１０：３８７－４０６に説明されている。
【0207】
アラインメント後、呼び出し方法（例えば、ベイジアン変異呼び出し方法）を使用して置換の検出が実施され得、これは、対象区間の各々の各塩基、例えば、評価される遺伝子又は他の遺伝子座のエクソンに適用され、代替対立遺伝子の存在が観察される。この方法は、変異の存在下でリードデータを観測する確率を、ベース呼び出しエラーのみの存在下でリードデータを観測する確率と比較する。この比較が変異の存在を十分に強く支持する場合、変異を呼び出すことができる。
【0208】
ベイズ変異検出手法の利点は、変異の存在確率と塩基呼び出しエラーの確率のみとの比較を、その部位における変異の存在の事前予想によって重み付けできることである。代替対立遺伝子のいくつかのリードが所与のがん型について頻繁に変異した部位で観察される場合、変異の証拠の量が通常の閾値を満たさない場合であっても、変異の存在が確実に呼び出され得る。次いで、この柔軟性を使用して、より希少な変異／より低い純度の試料の検出感度を高めるか、又は読み取りカバレッジの減少に対して試験をより堅牢にすることができる。がんにおいてゲノム中のランダムな塩基対が変異している可能性は約１ｅ－６である。例えば、典型的な多遺伝子性がんゲノムパネルの多くの部位で生じる特異的変異の可能性は、桁違いに高くなり得る。これらの尤度は、がん変異の公開データベース（例えば、ＣＯＳＭＩＣ）に由来し得る。
【0209】
インデル呼び出しは、典型的には関連する信頼スコア又は統計的証拠指標を含む、挿入又は欠失によって参照配列とは異なる配列決定データ中の塩基を見つけるプロセスである。インデル呼び出しの方法は、候補インデルを識別すること、ローカル再アラインメントによって遺伝子型尤度を計算すること、並びにＬＤベースの遺伝子型推論及び呼び出しを実施することを含み得る。典型的には、ベイズ法を使用して潜在的インデル候補を得て、次いで、これらの候補をベイズフレームワーク内の参照配列とともに試験する。
【0210】
候補インデルを生成するためのアルゴリズムは、例えば、ＭｃＫｅｎｎａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１０；２０（９）：１２９７－３０３、Ｙｅ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００９； ２５（２１）：２８６５－７１、Ｌｕｎｔｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１１；２１（６）：９３６－９、及びＬｉ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２５（１６）：２０７８－９に説明されている。
【0211】
インデル呼び出し及び個体レベルの遺伝子型尤度を生成する方法としては、例えば、Ｄｉｎｄｅｌアルゴリズム（Ａｌｂｅｒｓ Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１１；２１（６）：９６１－７３）が挙げられる。例えば、ベイジアンＥＭアルゴリズムを使用して、リードを分析し、初期インデル呼び出しを行い、各候補インデルについて遺伝子型尤度を生成し、続いて、例えば、ＱＣＡＬＬ（Ｌｅ Ｓ．Ｑ．ａｎｄ Ｄｕｒｂｉｎ Ｒ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２０１１；２１（６）：９５２－６０）を使用して遺伝子型を補完することができる。インデルを観察する事前の予想などのパラメータは、インデルのサイズ又は位置に基づいて調整することができる（例えば、増加又は減少）。
【0212】
がんＤＮＡの分析のための５０％又は１００％の対立遺伝子頻度からの限られた偏差に対処する方法が開発されている。（例えば、ＳＮＶＭｉｘ －Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１０ Ｍａｒｃｈ １５；２６（６）：７３０－７３６参照。） しかしながら、本明細書に開示される方法は、１％～１００％の範囲の頻度（又は対立遺伝子画分）（すなわち、０．０１～１．０の範囲の対立遺伝子画分）、及び、特に、５０％未満のレベルの変異体対立遺伝子の存在の可能性の考慮を可能にする。このアプローチは、例えば、天然（マルチクローナル）腫瘍ＤＮＡの低純度ＦＦＰＥ試料における変異の検出に特に重要である。
【0213】
いくつかの例では、配列リードを分析するために使用される変異呼び出し方法は、異なるゲノム遺伝子座における異なる変異体の検出のために個別的にカスタマイズ又は調整されない。いくつかの例では、異なるゲノム遺伝子座で検出される異なる変異体の少なくともサブセットのために個別的にカスタマイズ又は微調整される異なる変異呼び出し方法が使用される。いくつかの例では、各異なるゲノム遺伝子座で検出される各異なる変異体のために個別的にカスタマイズ又は微調整される異なる変異呼び出し方法が使用される。カスタマイズ又は調整は、本明細書に説明される因子、例えば、試料中のがんのタイプ、配列決定される対象区間が位置する遺伝子若しくは遺伝子座、又は配列決定される変異体のうちの１つ以上に基づくことができる。配列決定される対象区間の数に対して個別的にカスタマイズ又は微調整された変異呼び出し方法のこの選択又は使用は、変異呼び出しの速度、感度、及び特異性の最適化を可能にする。
【0214】
いくつかの例では、ヌクレオチド値は、固有の変異呼び出し方法を使用してＸ個の固有の対象区間の各々のヌクレオチド位置に割り当てられ、Ｘは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも３５００、少なくとも４０００、少なくとも４５００、少なくとも５０００以上である。呼び出し方法は異なり、それによって、例えば、異なるベイズ事前値に依存することによって一意であり得る。
【0215】
いくつかの例では、当該ヌクレオチド値を割り当てることは、タイプの腫瘍における当該ヌクレオチド位置における変異体、例えば、変異を示すリードを観察する以前（例えば、文献）の期待値であるか又はそれを表す値の関数である。
【0216】
いくつかの例では、方法は、少なくとも１０、２０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１，０００個のヌクレオチド位置について当該ヌクレオチド値（例えば、変異の呼び出し）を割り当てることを含み、各割り当ては、タイプの腫瘍における前記ヌクレオチド位置における変異体、例えば変異を示すリードを観察する以前（例えば、文献）の期待値であるか又はそれを表す固有の（他の割り当ての値とは対照的な）値の関数である。
【0217】
いくつかの例では、当該ヌクレオチド値を割り当てることは、変異体が特定の頻度（例えば、１％、５％、１０％など）で試料中に存在する場合及び／又は変異体が存在しない場合（例えば、塩基呼び出しエラーのみに起因してリードにおいて観察される）、当該ヌクレオチド位置で当該変異体を示すリードを観察する確率を表す値のセットの関数である。
【0218】
いくつかの例では、本明細書に説明される変異呼び出し方法は、（ａ）当該Ｘ個の対象区間の各々におけるヌクレオチド位置について、（ｉ）タイプＸの腫瘍の当該ヌクレオチド位置における変異体、例えば、変異を示すリードを観察する以前（例えば、文献）の期待値であるか又はそれを表す第１の値と、（ｉｉ）変異体がある頻度（例えば、１％、５％、１０％など）で試料中に存在する場合、及び／又は変異体が存在しない（例えば、ベース呼び出しエラー単独に起因して、リード内で観察される）場合、当該ヌクレオチド位置で当該変異体を示すリードを観察する可能性を表す第２の値のセットと、を取得することと、（ｂ）当該値に応答して、例えば、本明細書に説明されるベイズ法によって、第１の値を使用する第２のセット内の値の間の比較を重み付けすることによって、当該ヌクレオチド位置の各々に、当該リードからのヌクレオチド値（例えば、変異を呼び出す）を割り当て、それによって、当該試料を分析することと、を含み得る。
【0219】
変異体呼び出し方法の追加の説明が、例えば、国際特許出願公開第２０２０／２３６９４１号により詳細に説明され、その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【0220】
ＣＮＡ検出及び呼び出しのためのシステム
開示される方法のうちのいずれかを実装するように設計されたシステムも本明細書に開示される。システムは、例えば、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサに通信可能に結合され、かつ命令を記憶するように構成されたメモリユニットと、を備え得、命令が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上のプロセッサで、対象からの試料から得られた複数の核酸分子と関連付けられた複数の配列リードに対する配列リードデータを受信することと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座に対する、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、ゲノムを複数のゲノムセグメントにセグメント化する（例えば、マイナー対立遺伝子カバレッジ比、メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づいて）ことと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座のうちの遺伝子座に対する、（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含む、コピー数グリッドモデル入力データを生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルをコピー数モデル入力データに適合させることと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数のコピー数グリッドモデルからコピー数グリッドモデルを選択することと、１つ以上のプロセッサを使用して、選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて、複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態を割り当てることと、を行わせる。複数のコピー数グリッドモデルにおける異なるコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化され得る。
開示される方法のうちのいずれかを実装するように設計されたシステムも本明細書に開示される。システムは、例えば、１つ以上のプロセッサと、１つ以上のプロセッサに通信可能に結合され、かつ命令を記憶するように構成されたメモリユニットと、を備え得、命令が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上のプロセッサで、対象からの試料から得られた複数の核酸分子と関連付けられた複数の配列リードに対する配列リードデータを受信することと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座に対する、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、ゲノムを複数のゲノムセグメントにセグメント化する（例えば、マイナー対立遺伝子カバレッジ比、メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づいて）ことと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座のうちの遺伝子座に対する、（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含む、コピー数グリッドモデル入力データを生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルをコピー数モデル入力データに適合させることと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数のコピー数グリッドモデルからコピー数グリッドモデルを選択することと、１つ以上のプロセッサを使用して、選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて、複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態を割り当てることと、を行わせる。複数のコピー数グリッドモデルにおける異なるコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化され得る。
【0221】
いくつかの実施態様では、システムに、選択されたコピー数グリッドモデルを選択させる命令が、システムに、各ゲノムセグメントごとに、コピー数グリッドモデル入力データの分布を決定することと、各ゲノムセグメントごとに、分布と最も近いコピー数状態との間の距離を識別することと、複数のゲノムセグメントにわたる平均距離に基づいて全体的なモデル適合スコアを決定することと、を行わせる命令を含む。
【0222】
いくつかの実施態様では、許容されるコピー数状態を、コピー数グリッドモデル入力データに適合させる命令が、システムに、初期腫瘍純度推定値及び初期腫瘍倍数性推定値に基づいて、許容されるコピー数状態を、コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、反復的に、（ａ）予備コピー数を複数のセグメントの各セグメントに割り当てることと、（ｂ）予備コピー数割り当てに基づいて、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値を決定することと、（ｃ）更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値に基づいて、許容されるコピー数をコピー数グリッドモデル入力データを再適合させることと、を行わせる命令を含む。
【0223】
いくつかの実施態様では、システムが、電子ディスプレイを更に備える。命令が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、選択されたコピー数グリッドモデルを変換されたカバレッジ比データと重ねることと、電子ディスプレイのインターフェースを使用してオーバーレイを提示することと、を行わせる命令を更に含み得る。
【0224】
いくつかの実施態様では、システムが、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上の割り当てられたコピー数状態又は合計カバレッジ比閾値に基づいて、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出させる命令を更に含む。
【0225】
いくつかの実施態様では、システムが、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上のゲノム遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する、コピー数状態又は呼び出されたコピー数変化を示すレポートを生成させる命令を更に含む。命令は、システムに、例えば、コンピュータネットワーク又はピアツーピア接続を介して、対象又はヘルスケア提供者にレポートを更に送信させ得る。
【0226】
いくつかの例では、開示されるシステムは、シーケンサー、例えば、次世代シーケンサー（超並列シーケンサーとも呼ばれる）を更に含む。次世代（又は超並列）配列決定プラットフォームの例としては、限定されるものではないが、Ｒｏｃｈｅ４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｏｌｅｘａ、ＡＢＩ－ＳＯＬｉＤ、ＩＯＮ Ｔｏｒｒｅｎｔ、又はＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ配列決定プラットフォームが挙げられる。
【0227】
いくつかの例では、開示されるシステムは、本明細書に説明される様々な試料（例えば、対象に由来する組織試料、生検試料、血液試料、又は液体生検試料）のうちのいずれかにおけるＣＮＡの呼び出しに使用され得る。
【0228】
いくつかの例では、コピー数変化を決定するために配列決定データが処理される複数の遺伝子座は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は１０超の遺伝子座を含み得る。
【0229】
いくつかの例では、核酸配列データは、４００塩基未満、３００塩基未満、２００塩基未満、１５０塩基未満、１００塩基未満、９０塩基未満、８０塩基未満、７０塩基未満、６０塩基未満、５０塩基未満、４０塩基未満、又は３０塩基未満のリード長を有する次世代配列決定技術（超並列配列決定技術とも呼ばれる）を使用して取得される。
【0230】
いくつかの例では、１つ以上の遺伝子座におけるコピー数変化の決定は、本明細書の他の箇所で説明されるように、試料が由来した対象（例えば、患者）内のがんに対する処置を選択、開始、調整、又は終了するために使用される。
【0231】
いくつかの事例では、開示されるシステムは、試料処理及びライブラリ調製ワークステーション、マイクロプレートハンドリングロボット、流体分注システム、温度制御モジュール、環境制御チャンバ、追加のデータ記憶モジュール、データ通信モジュール（例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、ＷｉＦｉ、イントラネット、又はインターネット通信ハードウェア及び関連ソフトウェア）、ディスプレイモジュール、１つ以上のローカル及び／若しくはクラウドベースのソフトウェアパッケージ（例えば、機器／システム制御ソフトウェアパッケージ、配列決定データ分析ソフトウェアパッケージ）など、又はそれらの任意の組み合わせを更に含み得る。いくつかの事例では、システムは、本明細書の他の箇所に説明されるコンピュータシステム又はコンピュータネットワークを含むか、又はその一部であり得る。
【0232】
本明細書に説明されるシステムの一部であるか、又はそのようなシステムとは独立し得る、非一時的コンピュータ可読記憶媒体は、命令を含む１つ以上のプログラムを記憶し得、命令が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上のプロセッサで、対象からの試料から得られた複数の核酸分子と関連付けられた複数の配列リードに対する配列リードデータを受信することと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座に対する、マイナー対立遺伝子カバレッジ比及びメジャー対立遺伝子カバレッジ比を生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、ゲノムを複数のゲノムセグメントにセグメント化する（例えば、マイナー対立遺伝子カバレッジ比、メジャー対立遺伝子カバレッジ比、又は総カバレッジ比に基づいて）ことと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数の遺伝子座のうちの遺伝子座に対する、（ｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との間の差、及び（ｉｉ）メジャー対立遺伝子カバレッジ比とマイナー対立遺伝子カバレッジ比との合計を含む、コピー数グリッドモデル入力データを生成することと、１つ以上のプロセッサを使用して、許容されるコピー数状態を含む複数のコピー数グリッドモデルを、変換されたカバレッジ比データ、コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、１つ以上のプロセッサを使用して、複数のコピー数グリッドモデルから、選択されたコピー数グリッドモデルを選択することと、１つ以上のプロセッサを使用して、選択されたコピー数グリッドモデルに基づいて、複数のゲノムセグメントの少なくとも一部分に対するコピー数状態を割り当てることと、を行わせる。複数のコピー数グリッドモデルにおける異なるコピー数グリッドモデルが、異なる初期腫瘍純度推定値及び腫瘍倍数性推定値を使用して初期化され得る。
【0233】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、システムに、選択されたコピー数グリッドモデルを選択させる命令が、システムに、各ゲノムセグメントごとに、コピー数グリッドモデル入力データの分布を決定することと、各ゲノムセグメントごとに、分布と最も近いコピー数状態との間の距離を識別することと、複数のゲノムセグメントにわたる平均距離に基づいて全体的なモデル適合スコアを決定することと、を行わせる命令を含む。
【0234】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、システムに、許容されるコピー数状態を、コピー数グリッドモデル入力データに適合させる命令が、システムに、初期腫瘍純度推定値及び初期腫瘍倍数性推定値に基づいて、許容されるコピー数状態を、コピー数グリッドモデル入力データに適合させることと、反復的に、（ａ）予備コピー数を複数のセグメントの各セグメントに割り当てることと、（ｂ）予備コピー数割り当てに基づいて、更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値を決定することと、（ｃ）更新された腫瘍倍数性推定値及び更新された腫瘍純度推定値に基づいて、許容されるコピー数をコピー数グリッドモデル入力データを再適合させることと、を行わせる命令を含む。
【0235】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体のいくつかの実施態様では、命令が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、選択されたコピー数グリッドモデルをコピー数グリッドモデル入力データと重ねることと、電子ディスプレイのインターフェースを使用してオーバーレイを提示することと、を行わせる命令を更に含む。
【0236】
いくつかの実施態様では、非一時的コンピュータ可読記憶媒体が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上の割り当てられたコピー数状態又は合計カバレッジ比閾値に基づいて、１つ以上の遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対するコピー数変化を呼び出させる命令を更に含む。
【0237】
いくつかの実施態様では、非一時的コンピュータ可読記憶媒体が、１つ以上のプロセッサによって実行されたとき、システムに、１つ以上のゲノム遺伝子座又は１つ以上のゲノムセグメントに対する、コピー数状態又は呼び出されたコピー数変化を示すレポートを生成させる命令を更に含む。反乱は、システムに、例えば、コンピュータネットワーク又はピアツーピア接続を介して、対象又はヘルスケア提供者にレポートを更に送信させ得る。
【0238】
コンピュータシステム及びネットワーク
図５は、一実施形態によるコンピューティングデバイス又はシステムの例を例示する。デバイス５００は、ネットワークに接続されたホストコンピュータとすることができる。デバイス５００は、クライアントコンピュータ又はサーバとすることができる。図５に示されるように、デバイス５００は、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、サーバ、又はハンドヘルド計算デバイス（携帯電子デバイス、例えば、電話又はタブレット）などの任意の好適なタイプのマイクロプロセッサベースのデバイスであり得る。デバイスは、例えば、１つ以上のプロセッサ５１０、入力デバイス５２０、出力デバイス５３０、メモリ又は記憶デバイス５４０、通信デバイス５６０、及び核酸シーケンサー５７０を含み得る。メモリ又は記憶デバイス５４０に常駐するソフトウェア５５０は、例えば、オペレーティングシステム、及び本明細書に説明される方法を実行するためのソフトウェアを含み得る。入力デバイス５２０及び出力デバイス５３０は、一般に、本明細書に記載のものに対応していてもよく、コンピュータと接続可能であってもよく、又はコンピュータと一体化していてもよい。
図５は、一実施形態によるコンピューティングデバイス又はシステムの例を例示する。デバイス５００は、ネットワークに接続されたホストコンピュータとすることができる。デバイス５００は、クライアントコンピュータ又はサーバとすることができる。図５に示されるように、デバイス５００は、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、サーバ、又はハンドヘルド計算デバイス（携帯電子デバイス、例えば、電話又はタブレット）などの任意の好適なタイプのマイクロプロセッサベースのデバイスであり得る。デバイスは、例えば、１つ以上のプロセッサ５１０、入力デバイス５２０、出力デバイス５３０、メモリ又は記憶デバイス５４０、通信デバイス５６０、及び核酸シーケンサー５７０を含み得る。メモリ又は記憶デバイス５４０に常駐するソフトウェア５５０は、例えば、オペレーティングシステム、及び本明細書に説明される方法を実行するためのソフトウェアを含み得る。入力デバイス５２０及び出力デバイス５３０は、一般に、本明細書に記載のものに対応していてもよく、コンピュータと接続可能であってもよく、又はコンピュータと一体化していてもよい。
【0239】
入力デバイス５２０は、タッチスクリーン、キーボード若しくはキーパッド、マウス、又は音声認識デバイスなどの入力を提供する任意の好適なデバイスであってもよい。出力デバイス５３０は、タッチスクリーン、触覚デバイス、又はスピーカなど、出力を提供する任意の好適なデバイスであってもよい。入力デバイス５２０及び出力デバイス５３０は、同じ又は異なるデバイスとすることができる。
【0240】
ストレージ５４０は、ストレージ（例えば、ＲＡＭ（揮発性及び不揮発性）、キャッシュ、ハードドライブ、又はリムーバブルストレージディスクを含む、電気的、磁気的、又は光学的メモリ）を提供する任意の好適なデバイスであり得る。通信デバイス５６０は、ネットワークインターフェースチップ又はデバイスなどのネットワークを介してシグナルを送受信し得る任意の好適なデバイスを含み得る。コンピュータの構成要素は、例えば、有線メディア（例えば、物理システムバス５８０、イーサネット接続、若しくは任意の他の有線転送技術）を介して、又は無線（例えば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、Ｗｉ－Ｆｉ（登録商標）、又は任意の他の無線技術）で、任意の好適な様式で接続することができる。
【0241】
ソフトウェアモジュール５５０は、ストレージ５４０に実行可能な命令として記憶され、プロセッサ５１０によって実行されることができ、例えば、オペレーティングシステム及び／又は本開示の方法の機能を具現化するプロセスを含むことができる（例えば、上記のデバイスに具現化される）。
【0242】
ソフトウェアモジュール５５０はまた、命令実行システム、装置、若しくはデバイス（例えば、本明細書に記載のもの）によって、又はそれらと接続して使用するための任意の非一時的コンピュータ可読記憶媒体内に記憶及び／又は転送することができ、命令実行システム、装置、若しくはデバイスからの、ソフトウェアに関連付けられた命令をフェッチし、命令を実行することができる。本開示の文脈において、コンピュータ可読記憶媒体は、ストレージ５４０などの任意の媒体であり得、命令実行システム、装置、若しくはデバイスによって、又はそれらと接続して使用するためのプロセスを含む若しくは記憶することができる。コンピュータ可読記憶媒体の例としては、単一の機能ユニットとして動作するハードドライブ、フラッシュドライブ、及び配信モジュールなどのメモリユニットを挙げることができる。また、本明細書に記載の様々なプロセスは、上記の実施形態及び技法に従って動作するように構成されたモジュールとして具現化され得る。更に、プロセスは別個に示され、かつ／又は説明され得るが、当業者は、上記のプロセスが他のプロセス内のルーチン又はモジュールであり得ることを理解するであろう。
【0243】
ソフトウェアモジュール５５０はまた、命令実行システム、装置、若しくは上述したものなどのデバイスによって、又はそれらと接続して使用するための任意の伝送媒体内に伝播され得、命令実行システム、装置、若しくはデバイスからの、ソフトウェアに関連付けられた命令をフェッチし、命令を実行し得る。本開示の文脈において、伝送媒体は、任意の媒体とし得、命令実行システム、装置、若しくはデバイスによって、又はそれらと接続して使用するための伝送プログラミングを通信、伝播、又は伝送し得る。伝送可読媒体は、電子、磁気、光学、電磁気、若しくは赤外線の有線又は無線伝播媒体を含み得るが、これらに限定されない。
【0244】
デバイス５００は、任意の好適なタイプの相互接続された通信システムであり得る、ネットワーク（例えば、図６に示され、及び／又は以下に説明される、ネットワーク６０４）に接続され得る。ネットワークは、任意の好適な通信プロトコルを実装し得、任意の好適なセキュリティプロトコルによって保護され得る。ネットワークは、無線ネットワーク接続（Ｔ１若しくはＴ３回線）、ケーブルネットワーク、ＤＳＬ、又は電話回線などの、ネットワークシグナルの送受信を実装し得る任意の好適な配置のネットワークリンクを含み得る。
【0245】
デバイス５００は、任意のオペレーティングシステム、例えば、ネットワーク上で動作するのに好適なオペレーティングシステムを使用して実装され得る。ソフトウェアモジュール５５０は、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ、又はＰｙｔｈｏｎなどの任意の好適なプログラミング言語で書くことができる。様々な実施形態では、本開示の機能を具現化するアプリケーションソフトウェアは、異なる構成で（例えば、クライアント／サーバ配置で、又はウェブベースのアプリケーション若しくはウェブサービスとしてのウェブブラウザを介して）展開され得る。いくつかの実施形態では、オペレーティングシステムは、１つ以上のプロセッサ、例えば、プロセッサ５１０によって実行される。
【0246】
デバイス５００は、任意の適切な核酸配列決定機器とすることができるシーケンサー５７０を更に含むことができる。
【0247】
図６は、一実施形態によるコンピューティングシステムの例を例示する。システム６００では、デバイス５００（例えば、上記に説明され、図５に例示される）は、ネットワーク６０４に接続され、これはまた、デバイス６０６にも接続されている。いくつかの実施形態では、デバイス６０６は、シーケンサーである。例示的なシーケンサーは、限定されないが、Ｒｏｃｈｅ／４５４のＧｅｎｏｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＧＳ）ＦＬＸ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／ＳｏｌｅｘａのＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＡ）、ＩｌｌｕｍｉｎａのＨｉＳｅｑ ２５００、ＨｉＳｅｑ ３０００、ＨｉＳｅｑ ４０００、及びＮｏｖａＳｅｑ ６０００配列決定システム、Ｌｉｆｅ／ＡＰＧのＳｕｐｐｏｒｔ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＳＯＬｉＤ）システム、ＰｏｌｏｎａｔｏｒのＧ．００７システム、Ｈｅｌｉｃｏｓ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓのＨｅｌｉＳｃｏｐｅ Ｇｅｎｅ配列決定システム、又はＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＰａｃＢｉｏ ＲＳシステムを含む。
【0248】
デバイス５００及び６０６は、例えば、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、仮想プライベートネットワーク（ＶＰＮ）、又はインターネットなどのネットワーク６０４を介して適切な通信インターフェースを使用して通信することができる。いくつかの実施形態では、ネットワーク６０４は、例えば、インターネット、イントラネット、仮想プライベートネットワーク、クラウドネットワーク、有線ネットワーク、又は無線ネットワークとすることができる。デバイス５００及び６０６は、イーサネット、ＩＥＥＥ８０２．１１ｂ無線などの無線又は有線通信を介して、部分的又は全体的に通信することができる。追加的に、デバイス５００及び６０６は、例えば、好適な通信インターフェースを使用して、モバイル／セルラーネットワークなどの第２のネットワークを介して通信することができる。デバイス５００と６０６との間の通信は、メールサーバ、モバイルサーバ、メディアサーバ、電話サーバなどの様々なサーバを更に含むか、それらと通信することができる。いくつかの実施形態では、デバイス５００及び７０６は、（ネットワーク６０４を介した通信の代わりに、又はそれに加えて）、例えば、イーサネット、ＩＥＥＥ８０２．１１ｂ無線などの無線又は有線通信を介して、直接通信することができる。いくつかの実施形態では、デバイス５００及び６０６は、直接接続とすることができるか、又はネットワーク（例えば、ネットワーク６０４）を介して発生することができる通信６０８を介して通信する。
【0249】
デバイス５００及び６０６のうちの一方又は全ては、一般に、本明細書に記載の様々な例にしたがってネットワーク６０４を介して情報を提供及び／又は受信するために、ローカル若しくはリモートのデータベース又は他のデータ及びコンテンツのソースからアクセスされる論理（例えば、ｈｔｔｐウェブサーバロジック）を含むか、又はデータをフォーマットするようにプログラムされる。
【0250】
以上から、開示される方法及びシステムの特定の実施態様が例示及び説明されたが、様々な修正がそれらになされ得、本明細書で企図されることが理解されるべきである。本明細書内に提供される特定の例によって本発明が限定されることも意図していない。本発明は、上述の明細書を参照して説明されたが、本明細書の好ましい実施形態の説明及び例示は、限定の意味で解釈されることを意味していない。更に、本発明の全ての態様は、様々な条件及び変数に依存する、本明細書に記載された特定の描写、構成、又は相対的割合に限定されないことを理解されたい。本発明の実施形態の形態及び詳細に置ける様々な修正が当業者にとって明らかであろう。したがって、本発明はまた、任意のそのような修正例、変形例、及び均等物も包含するものと企図される。
【図1】
【図2A-2D】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】