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特表2024-541859幹細胞の遺伝子改変による複数のＴ細胞受容体を有するＴ細胞
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-11-13
(54)【発明の名称】幹細胞の遺伝子改変による複数のＴ細胞受容体を有するＴ細胞
(51)【国際特許分類】
C12N 15/63 20060101AFI20241106BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20241106BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20241106BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20241106BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20241106BHJP
A61K 35/545 20150101ALI20241106BHJP
A61P 37/00 20060101ALI20241106BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20241106BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20241106BHJP
【ＦＩ】
C12N15/63
C12N5/0783
C12N15/62 Z
C12N15/867 Z
A61K35/17
A61K35/545
A61P37/00
A61P35/00
C12N5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2024523117
(86)(22)【出願日】2022-10-13
(85)【翻訳文提出日】2024-06-12
(86)【国際出願番号】 US2022046548
(87)【国際公開番号】W WO2023064455
(87)【国際公開日】2023-04-20
(31)【優先権主張番号】63/255,632
(32)【優先日】2021-10-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】524142703
【氏名又は名称】アッピア バイオ，インコーポレイティド
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(72)【発明者】
【氏名】チーンチュ エス．カン
(72)【発明者】
【氏名】ジェフリー スコット ウィーゾレク
(72)【発明者】
【氏名】シー ワン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087BB63
4C087BB64
4C087BB65
4C087CA04
4C087CA12
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB07
4C087ZB09
4C087ZB26
(57)【要約】
本開示は、増強された抗腫瘍表現型を有するマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成する方法を提供する。Ｔ細胞は、造血幹細胞に第１のＴＣＲを導入し、続いて第２のＴＣＲを導入することによって、造血幹細胞から作製される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔ細胞を生成する方法であって、造血幹細胞（ＨＳＣ）を、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むガンマデルタ（ｇｄ）Ｔ細胞又はインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞へとインビトロで分化させるプロセスを実施すること、及び
少なくとも第２のＴＣＲを前記ｇｄＴ細胞又はｉＮＫＴ細胞に導入して、２つの別個のＴＣＲを有するＴ細胞を生成することを含む、方法。
【請求項2】
前記少なくとも第２のＴＣＲを前記ｇｄ Ｔ細胞又はｉＮＫＴ細胞に導入後に、前記Ｔ細胞を増殖させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＨＳＣをｇｄ Ｔ細胞へと分化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記第２のＴＣＲがアルファベータ（ａｂ）ＴＣＲである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記ＨＳＣをｉＮＫＴへと分化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記第２のＴＣＲがアルファベータ（ａｂ）ＴＣＲである、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記インビトロ分化ステップが、前記第１のＴ細胞受容体をコードする１つ以上の核酸を前記ＨＳＣに導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記第２のＴＣＲを導入することが、前記第２のＴ細胞受容体をコードする１つ以上の核酸を前記ｇｄＴ細胞又はｉＮＫＴ細胞に導入することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記インビトロ分化ステップが、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び１つ以上の導入遺伝子のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上の核酸を導入することを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項10】
前記少なくとも１つ以上の導入遺伝子が、サイトカイン、チェックポイント阻害因子、トランスフォーミング増殖因子ベータシグナル伝達の阻害因子、サイトカイン放出症候群の阻害因子、神経毒性の阻害因子、又はＴ細胞をより強力にするか、疲弊若しくは拒絶の影響を受けにくくするための他のペイロードのうちの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記第１及び／又は第２のＴＣＲが、遺伝子改変ＴＣＲである、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
前記遺伝子改変ＴＣＲが、前記第１のＴＣＲと前記第２のＴＣＲとの間のＴＣＲミスペアリングを防止するための１つ以上の修飾を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記修飾が、マウス定常ドメイン、ジスルフィド架橋、及び他の二量体化ドメインのうちの１つ以上を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＨＳＣが前駆細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項15】
前記前駆細胞が多能性幹細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記インビトロプロセスが、前記Ｔ細胞をより強力にするか、疲弊又は拒絶を受けにくくするために、前記ＨＳＣ又は前駆細胞の遺伝子編集を更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項17】
前記第２のＴＣＲが、がん生殖細胞系列抗原、ウイルス抗原又は腫瘍特異的ネオ抗原に指向する、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
少なくとも第２のＴＣＲを導入する前記ステップが、複数の異なるＴＣＲを導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項19】
各異なるＴＣＲが、異なる腫瘍特異的ネオ抗原に指向する、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記ネオ抗原反応性ＴＣＲが、末梢血Ｔ細胞若しくは腫瘍浸潤リンパ球から得られるか、又はそれらに由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記第２のＴＣＲを導入するステップが、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入、又はヌクレオチド導入の非ウイルス方法論を介して、前記ｇｄ Ｔ細胞又はｉＮＫＴ細胞に１つ以上の核酸を移入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記方法が、前記第２のＴＣＲによって認識されるペプチドを担持したＨＬＡ適合又は部分適合ＰＢＭＣを用いた前記Ｔ細胞のインビトロ活性化及び増殖を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項23】
治療の方法であって、ＨＳＣを得ること；
前記ＨＳＣを、第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むガンマデルタ（ｇｄ）Ｔ細胞又はインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞へとインビトロで分化させるプロセスを実施すること；
少なくとも第２のＴＣＲを前記ｇｄＴ細胞又はｉＮＫＴ細胞に導入すること；
得られたＴ細胞を活性化して、２つの別個の機能的ＴＣＲを有するＴ細胞を生成すること；及び
前記Ｔ細胞を被験体に導入することを含み、前記少なくとも第２のＴＣＲが、前記被験体における細胞の表面に発現される疾患関連抗原に指向する、方法。
【請求項24】
前記ＨＳＣが、前記被験体から得られるか、又は前記被験体に由来する、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記ＨＳＣが同種ＨＳＣである、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
前記方法が、前記インビトロ分化ステップを実施した後、前記疾患関連抗原を標的とする１つ以上のＴＣＲを特定するデータを得ること、及び続いて、前記少なくとも第２のＴＣＲを導入するステップを実施することを更に含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、幹細胞を複数のＴ細胞受容体で遺伝子改変する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
インビトロでのＴ細胞の生成及び増殖は、がん治療を含む広範な臨床応用において有用である。例えば、臨床データは、腫瘍抗原特異的受容体を有する遺伝子改変Ｔ細胞が、一部の患者において転移性がんの退縮を引き起こすために有用であることを示す。残念ながら、全ての患者がこのような治療から恩恵を受けるわけではない。その理由の１つは、インビトロでの増殖中に、一部のＴ細胞が疲弊又は老化し、インビボでの治療効果及び持続性が制限されることである。
【発明の概要】
【0003】
本開示は、少なくとも２つの異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び／又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する多数のＴ細胞を迅速かつ効率的に生成するためのシステム及び方法を提供する。複数の異なるＴＣＲを有するＴ細胞（マルチＴＣＲ Ｔ細胞）を生成することによって、本発明の方法は、複数の異なる抗原を認識するＴ細胞を生成し、それによって、治療的処置としての該Ｔ細胞の効力を向上させることができる。同様に、本発明は、異なるＴＣＲ、又はＴＣＲとＣＡＲを共発現するＴ細胞を生成する方法であって、特異的ながん細胞標的化特性を付与する最適な表現型を細胞にもたらす、方法を提供する。
【0004】
特定の実施形態において、本開示は、幹細胞、例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）からマルチＴＣＲ Ｔ細胞を作製する方法を提供する。ＨＳＣを出発物質とすることによって、本発明のシステム及び方法は、本発明のＴ細胞の製造において幹細胞の自己再生及び細胞分化能を活用する。
【0005】
本発明の方法において幹細胞（例えば、ＨＳＣ）を使用する利点としては、その再生能と増殖能が挙げられる。同種細胞療法では、多くの場合、治療の単回用量に数十億個の細胞を必要とする。幹細胞には潜在的に無限の増殖能があるため、本発明の方法は、高品質の細胞産物を大規模に生成すること、及びこれらの産物を迅速に治療のために利用可能にすることに十分に適している。更に、幹細胞の顕著な特徴は、異なる細胞タイプへの分化能である。本開示の文脈において、分化能は、例えば、とりわけ、ナチュラルキラーＴ細胞、アルファベータＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞などを含む、広範なＴ細胞サブタイプを生成し得る細胞製造プラットフォームを提供する。
【0006】
特定の態様において、本発明の方法は、少なくとも第１のＴＣＲをコードする導入遺伝子を導入することによって、ＨＳＣから遺伝子改変Ｔ細胞を生成することを含む。ＨＳＣは、ＴＣＲを発現するＴ細胞に分化する。分化後、Ｔ細胞は、１つ以上の選択、成熟、増殖、及び／又は凍結保存ステップに供され得る。これらの前述のステップのいずれかの前又は後に、１つ以上の異なるＴＣＲ／ＣＡＲをＴ細胞に導入し（例えば、導入遺伝子の導入を介して）、それによって、複数の異なるＴＣＲ及び／又はＴＣＲとＣＡＲを有する遺伝子改変Ｔ細胞を生成することができる。
【0007】
ＨＳＣ由来のＴ細胞に所望のＴＣＲ／ＣＡＲを付加する能力は、本発明の方法にいくつかの利点を与える。例えば、本発明の特定の方法において、ＨＳＣをＴ細胞に分化させる。これらのＴ細胞は、成熟、選択、増殖、及び／又は凍結保存され得る。一般に、このプロセスのステップには合計で約２～４週間掛かる。本発明の方法を用いると、分化後のＴ細胞に、また任意選択で、選択、成熟、増殖、及び／又は凍結保存後のＴ細胞に、１つ以上の追加のＴＣＲ／ＣＡＲを導入することができる。
【0008】
分化後に追加のＴＣＲ（複数可）を加えることは、既製のＨＳＣ由来遺伝子改変Ｔ細胞を出発物質として、Ｔ細胞を、病態、例えば、がんに固有の抗原を標的とする受容体で遺伝子改変することを可能にする。これにより、単一受容体Ｔ細胞を生成するために使用される２～４週間の期間後に追加の受容体を加えることができるため、ＴＣＲ（複数可）及び／又はＣＡＲの所望の組み合わせを有するＴ細胞を生成するために必要なリードタイムを短縮することができる。
【0009】
加えて、最初のＴＣＲの後に追加のＴＣＲ（複数可）又はＣＡＲを加えることにより、本発明の方法は、導入された複数の異なる受容体を発現する間の、長期培養によるＴ細胞の転写及び表現型の変化のリスクを回避し得る。更に、分化したＴ細胞が追加を受け入れる準備ができていることにより、本発明の方法は、ＴＣＲのミスペアリングを最小限に抑えてマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成するためのより高い柔軟性をもたらす。ＴＣＲミスペアリングは、内在性又は導入ＴＣＲのα鎖又はβ鎖が、別の導入ＴＣＲのα鎖又はβ鎖と誤ってペアリングする現象である。これにより、例えば導入ＴＣＲ（複数可）の表面発現が低下する。本発明の方法を使用することによって、例えば、マウス定常ドメイン、ジスルフィド架橋などの修飾を使用して、第１の導入ＴＣＲを、第２の導入ＴＣＲとのミスペアリングの可能性が減少するように遺伝子改変することができる。あるいは、又は加えて、第１の導入ＴＣＲをガンマデルタ（γδ）ＴＣＲとし、第２の導入ＴＣＲをアルファベータ（αβ）とすることができ、これは、同様に、ミスペアリングの可能性を低減する。
【0010】
したがって、本発明は、同種の、既成の、ＨＬＡ拘束性のないＮＫＴ又はγδＴ細胞であって、凍結保存し、その後解凍して使用することができる、細胞を作製するためのプラットフォームを提供する。次いで、これらの細胞は、患者特異的な方法で、例えば、特定の病態を標的とするＣＡＲ又はＴＣＲの導入によって、更に遺伝子改変され得る。したがって、本発明の幹細胞培養物及び組成物は、無数の病態にわたる何千もの異なる患者を治療するために使用することができる。
【0011】
本発明は、遺伝子改変Ｔ細胞を生成する方法を提供する。例示的な方法は、造血幹細胞（ＨＳＣ）をインビトロで分化させて、ＨＬＡ拘束性のない第１のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む同種ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞又はインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞を生成するプロセスを実施することを含む。本方法は、少なくとも第２のＴＣＲをγδＴ細胞又はｉＮＫＴ細胞に導入して、２つの別個のＴＣＲを有するＴ細胞を生成することを更に含む。特定の態様において、第２又は追加のＴＣＲは、ＨＬＡ拘束性又は患者特異的であり得る。
【0012】
特定の態様において、本方法はまた、少なくとも第２のＴＣＲをγδＴ細胞又はｉＮＫＴ細胞に導入後に、Ｔ細胞を成熟させることを含む。
【0013】
本発明のいくつかの方法において、ＨＳＣをγδＴ細胞に分化させる。特定の態様において、第２のＴＣＲは、アルファベータ（αβ）ＴＣＲである。本発明のいくつかの方法において、ＨＳＣをｉＮＫＴに分化させる。特定の態様において、第２のＴＣＲは、アルファベータ（αβ）ＴＣＲである。
【0014】
特定の方法において、インビトロ分化ステップは、第１のＴ細胞受容体をコードする１つ以上の核酸をＨＳＣに導入することを含む。第２のＴＣＲを導入することは、第２のＴ細胞受容体をコードする１つ以上の核酸を、γδＴ細胞又はｉＮＫＴ細胞に導入することを含み得る。
【0015】
インビトロ分化ステップは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び１つ以上の導入遺伝子のうちの少なくとも１つをコードする１つ以上の核酸を導入することを更に含み得る。特定の態様において、少なくとも１つ以上の導入遺伝子は、サイトカイン、チェックポイント阻害因子、トランスフォーミング増殖因子ベータシグナル伝達の阻害因子、サイトカイン放出症候群の阻害因子、神経毒性の阻害因子、又はＴ細胞をより強力にするか、疲弊若しくは拒絶の影響を受けにくくするための他のペイロードのうちの少なくとも１つを含む。
【0016】
本発明の特定の方法において、第１及び／又は第２のＴＣＲは、遺伝子改変ＴＣＲである。特定の態様において、第１のＴＣＲは、遺伝子改変ＴＣＲである。特定の態様において、第２のＴＣＲは、遺伝子改変ＴＣＲである。本発明による遺伝子改変ＴＣＲは、第１のＴＣＲと第２のＴＣＲとの間のＴＣＲミスペアリングを防止するための１つ以上の修飾を含み得る。例示的な修飾としては、マウス定常ドメイン、ジスルフィド架橋、及び他の二量化ドメインのうちの１つ以上が挙げられる。
【0017】
特定の方法において、ＨＳＣは、多能性幹細胞などの前駆細胞に由来する。したがって、インビトロプロセスは、Ｔ細胞をより強力にするか、疲弊又は拒絶を受けにくくするために、ＨＳＣ又は前駆細胞の遺伝子編集を更に含み得る。
【0018】
例示的な方法において、第２のＴＣＲは、がん生殖細胞系列抗原、ウイルス抗原又は腫瘍特異的ネオ抗原に指向する。
【0019】
特定の態様において、少なくとも第２のＴＣＲを導入するステップは、複数の異なるＴＣＲを導入することを含む。それぞれの異なるＴＣＲは、異なる腫瘍特異的ネオ抗原に指向するものであり得る。ネオ抗原反応性ＴＣＲは、末梢血Ｔ細胞又は腫瘍浸潤リンパ球から得られるか、又はそれらに由来し得る。
【0020】
特定の例示的な方法において、第２のＴＣＲを導入するステップは、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入、又はヌクレオチド導入の非ウイルス方法論を介して、γδＴ細胞又はｉＮＫＴ細胞に１つ以上の核酸を移入することを含む。
【0021】
特定の態様において、本方法は、第２のＴＣＲによって認識されるペプチドを担持したＨＬＡ適合又は部分適合ＰＢＭＣを用いたＴ細胞のインビトロ活性化及び増殖を更に含む。
【0022】
本開示の発明はまた、本発明のマルチＴＣＲ細胞を用いた治療方法を提供する。例示的な治療方法は、ＨＳＣを得ること、及びＨＳＣをγδＴ細胞又はｉＮＫＴ細胞へとインビトロで分化させるプロセスを実施することを含み、分化Ｔ細胞は第１のＴＣＲを含む。本方法はまた、少なくとも第２のＴＣＲをγδＴ細胞又はｉＮＫＴ細胞に導入すること、及び得られたＴ細胞を成熟させて、２つの別個の機能的ＴＣＲを有するＴ細胞を生成することを含み得る。次いで、本方法は、Ｔ細胞を被験体に導入することを含み、少なくとも第２のＴＣＲは、被験体における細胞の表面に発現される疾患関連抗原に指向する。
【0023】
特定の態様において、ＨＳＣは、被験体から得られるか、又は被験体に由来する。
【0024】
例示的な方法において、本方法は、インビトロ分化ステップを実施した後、疾患関連抗原を標的とする１つ以上のＴＣＲを特定するデータを得ること、及び続いて、少なくとも第２のＴＣＲを導入するステップを実施することを更に含む。
【図面の簡単な説明】
【0025】
【図1】マルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成する方法を示す図である。
【0026】
【図2】３つの異なるプロセスによるエクスビボＴ細胞製造の段階を示す図である。
【0027】
【図3】インビトロでＴ細胞を生成する２つのプロセスの比較を示す図である。
【0028】
【図4】ＨＳＣからマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成する本発明の方法の大まかなステップを示す図である。
【0029】
【図5】ＨＳＣからマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成する本発明の方法の大まかなステップを示す図である。
【0030】
【図6】ＨＳＣからマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成する本発明の方法の大まかなステップを示す図である。
【0031】
【図7】マルチＴＣＲ Ｔ細胞を増殖／活性化させるためのＰＢＭＣ細胞株の比較を示す図である。
【0032】
【図8】抗原提示ＰＢＭＣの存在下でマルチＴＣＲ Ｔ細胞を増殖させた結果を示す図である。
【0033】
【図9】抗原提示標的細胞株の生成を示す図である。
【0034】
【図10】本発明の方法を使用して生成されたマルチＴＣＲ Ｔ細胞の細胞傷害性効力を示す図である。
【0035】
【図11】本発明の方法を使用して生成されたマルチＴＣＲ Ｔ細胞の細胞傷害性効力を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0036】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞の臨床研究は、Ｂ細胞悪性腫瘍などの特定の病態の治療において顕著な結果を示している。しかしながら、現在、ＣＡＲ Ｔ細胞療法を含む商業的な方法は、個別の（ad hoc）生成に関連するロジスティックス及び高いコストにより、その広範な使用が制限されている自己ＣＡＲ Ｔ細胞を含む。同種ＣＡＲ Ｔ細胞療法では、患者の治療において直ちに利用可能なあらかじめ作製された細胞ストックを提供することで、自己細胞の限界に対処している。しかし、その可能性にもかかわらず、治療上有効な同種ＣＡＲ Ｔ細胞を一貫して生成する方法は確立されていない。ほとんどのプロトコルでは、例えば、少なくとも２回の活性化ステップを伴う長期間のエクスビボ培養が必要であり、これは過剰分化、Ｔ細胞の疲弊、及び／又は細胞老化を引き起こし、インビボ効力を損なう可能性がある。参照により組み込まれる、Ｊａｆａｒｚａｄｅｈ，２０２０，Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｔ Ｃｅｌｌ ｉｎ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ａｎｄ Ｗａｙｓ Ｆｏｒｗａｒｄ，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１（７０２）：１－１７を参照のこと。
【0037】
本開示は、少なくとも２つの特有なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の導入により、幹細胞（例えば、造血幹細胞）から表現型及び細胞機能が改善されたＴ細胞を製造するための信頼性の高い方法を提供する。本開示は、多数のマルチＴＣＲ Ｔ細胞を迅速かつ効率的に製造する方法を提供する。更に、製造プロセス中の異なる時点においてＴＣＲを添加することができる。したがって、本発明の特定の態様において、Ｔ細胞は造血幹細胞から作製することができ、次いで増殖、成熟、及び／又は保存のステップを受けることができる。これらのＴ細胞は、１つ以上の追加のＴＣＲを導入することができる、既製の出発点となり得る。必要に応じて、異なる患者の異なる疾患を治療するために必要な、別個の抗原を標的とする特定の追加のＴＣＲを細胞に導入することができる。
【0038】
本発明の特定の好ましい方法は、第１のＴＣＲを造血幹細胞（ＨＳＣ）に導入すること、及び該細胞をガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞又はインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞に分化させることを含む。続いて、１つ以上の異なる追加のＴＣＲをＴ細胞に導入して、少なくとも２つの別個のＴＣＲを有するＴ細胞を生成する。
【0039】
ＨＳＣをγδ又はｉＮＫＴに分化させることは、本開示の方法にいくつかの利点をもたらす。
【0040】
例えば、特定の方法は、細胞のレシピエントにおいて有害な免疫反応を起こすことなく、細胞を普遍的な既製の使用（例えば、元の細胞が得られた個体以外の個体のために調製される）に適したものにする１つ以上の特徴を有するように遺伝子改変されたインバリアントＮＫＴ細胞として機能するように幹細胞（ＨＳＣなど）を修飾することを含む。
【0041】
ｉＮＫＴ細胞は、Ｔリンパ球の小さな亜集団であり、がん治療などの既成の細胞治療に有用となるいくつかの特徴を有する。ｉＮＫＴ細胞は、腫瘍抗原及びＭＨＣ拘束性とは無関係に複数の種類のがんを標的とする顕著な能力を有する。ｉＮＫＴ細胞は糖脂質抗原を認識し、そのためＭＨＣ拘束性を有しない。ｉＮＫＴ細胞の天然リガンドはまだ完全に同定されていないが、ｉＮＫＴ細胞は多くの腫瘍組織に由来する、ある種の保存された糖脂質抗原を認識することができるようである。
【0042】
更に、ｉＮＫＴ細胞は、腫瘍細胞を標的化し、攻撃するのに有用ないくつかの機構を含む。ｉＮＫＴ細胞は刺激前において休眠状態を維持するが、刺激されると、腫瘍標的細胞を殺傷するために細胞を活性化する大量のサイトカインを迅速に生成する。更に、ｉＮＫＴ細胞誘導抗腫瘍免疫は、腫瘍抗原及びＭＨＣ拘束性とは無関係に複数の種類のがんを効果的に標的とすることができ、それによって腫瘍の免疫逃避を効果的に阻止し、腫瘍の再発の可能性を最小限に抑えることができる。
【0043】
同時に、ｉＮＫＴ細胞は、ミスマッチしたＭＨＣ分子及びタンパク質自己抗原を認識しないため、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こさない。同様に、ｉＮＫＴ細胞は、宿主対移植片（ＨｖＧ）枯渇を回避するように遺伝子改変され得る。強力な遺伝子編集ツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）システムが利用できることで、ｉＮＫＴ細胞を遺伝子組換えして、宿主免疫細胞を標的とした枯渇に抵抗性を持たせることが可能となる。ｉＮＫＴ細胞はまた、同種ＮＫ細胞殺傷に対してもともと抵抗性を有するようである。
【0044】
ｉＮＫＴ細胞はまた、がんと強い関連性を有する。ヒトにおいて、固形がんや血液がんの患者ではｉＮＫＴ細胞存在比率が減少しているが、ｉＮＫＴ細胞数の増加は予後の改善を示している。したがって、ｉＮＫＴ細胞は、本発明の方法を使用して作製される場合、導入ＴＣＲに応じて、様々な疾患の治療に有効な「既製の」細胞産物として機能し得る。複数回用量で患者への十分なｉＮＫＴ細胞の移入を可能にすることで、患者に、闘病のためにｉＮＫＴ細胞の全可能性を利用する最良の機会をもたらし得る。
【0045】
ｉＮＫＴ細胞と同様に、γδＴ細胞も成人の末梢血においてＴリンパ球の比較的小さなサブセットを形成している。γδＴ細胞は、通常、ヒト血液中のＣＤ３陽性Ｔ細胞の１％～１０％のいずれかを占める。しかしながら、ＭＨＣ分子に担持された抗原由来ペプチドを認識するαβＴＣＲを発現する従来型Ｔ細胞とは異なり、γδＴ細胞は、典型的には、抗原プロセシング及びＭＨＣ／ＨＬＡ拘束性とは無関係に標的抗原を認識する。γδＴ細胞は、適応免疫系の形質（例えば、クローン性再編成されたＴＣＲ遺伝子の発現）を共有する。同時に、γδＴ細胞は自然免疫細胞と類似しており、エフェクター機能を活性化するための抗原プロセシングの必要性がない。したがって、γδＴ細胞はＴＣＲ刺激に迅速に応答する。
【0046】
活性化γδＴ細胞は、様々な種類の固形腫瘍やその他の悪性腫瘍を溶解することができ、多くのサイトカインを生成する。ＴＣＲに加えて、γδＴ細胞はまた、追加の活性化受容体を発現し得る。例えば、γδＴ細胞は、自然免疫細胞の機能的受容体、例えば、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ３０、及び／又はＮＫｐ４４などの活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）受容体を共発現することが多く、これらは細胞傷害効果を誘発する。したがって、γδＴ細胞は、ストレスを受けた細胞及び悪性細胞を感知する、２つの独立した認識経路を有する。
【0047】
更に、末梢血から単離されたインビトロ活性化細胞は、様々な固形腫瘍及び白血病／リンパ腫細胞に対するγδＴ細胞の強力かつＨＬＡ非依存的な活性を示している。
【0048】
したがって、本開示は、造血幹細胞（ＨＳＣ）に第１のＴＣＲを導入すること、及び該細胞をガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞又はインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞に分化させることによって、幹細胞を使用してＴ細胞を生成する方法を提供する。続いて、１つ以上の異なる追加のＴＣＲをＴ細胞に導入して、少なくとも２つの別個のＴＣＲを有するＴ細胞を生成して、抗腫瘍活性が増強されたＴ細胞を生成する。
【0049】
本開示は、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）からＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、及び／又は少なくとも１つの追加の導入遺伝子を含む複数の導入遺伝子が組み込まれたＴ細胞を生成するためのシステム及び方法を更に提供する。幹細胞から生成プロセスを開始することによって、本発明のシステム及び方法は、「より若い」表現型及び増強された抗腫瘍活性を有するＴ細胞の製造のために、自己複製能及び細胞分化能を利用する。特に、本開示は、少なくとも１つのＴＣＲをコードする核酸をＣＤ３４陽性幹細胞に導入し、続いて少なくとも１つの追加のＴＣＲを導入することを提供する。複数のＴＣＲ（並びに任意選択で、任意の導入されたＣＡＲ及び追加の導入遺伝子（複数可））の複合発現により、本開示の方法を用いて生成されたＴ細胞は、がんの治療に有用な特異的がん細胞標的化特性を有する。
【0050】
図１は、本開示のマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成するための本発明の方法の全体的な概要を示す。図１に示されるように、本プロセスは、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）への第１のＴＣＲの導入から開始される。したがって、幹細胞は、Ｔ細胞、好ましくはγδＴ細胞、ｉＮＫＴ細胞に分化する。驚くべきことに、本発明者らは、第２のＴＣＲが分化したＴ細胞に導入される場合、本発明の方法は特有の柔軟性をもたらすことを発見した。示されるように、Ｔ細胞の成熟前など、製造プロセスの初期に、第２のＴＣＲを導入することができる。あるいは、Ｔ細胞の増殖前又は増殖中など、プロセスの中間点で、第２のＴＣＲを導入することができる。本明細書に開示される方法はまた、増殖後、並びに潜在的には凍結保存、活性化、及び増殖ステップ後でさえも、第２のＴＣＲを与えることを企図する。したがって、本開示の方法は、ＨＳＣから多数のＴ細胞を生成し、該細胞を培養又は凍結保存で維持し、患者の要求に応じて必要とされる第２の抗原特異的ＴＣＲを該細胞に導入することを可能にする。したがって、本開示の方法は、製造時間を短縮してマルチＴＣＲ Ｔ細胞を作製することを可能にする。
【0051】
本開示の方法及びシステムはまた、以前の方法と比較して短縮されたエクスビボ培養時間を使用して、初期Ｔ細胞、すなわち第２のＴＣＲを導入する前のＴ細胞を生成するステップを組み込んでもよい。本発明の特定の方法は、従来のＴ細胞分化方法において使用される１つ以上のエクスビボ活性化ステップを省略することによってエクスビボ培養を短縮し、これによりエクスビボ製造プロセスを最大で２～３週間短縮する。本発明の他の方法は、単一の活性化ステップを提供する。本発明の方法は、被験体への投与後に、インビボで長い活性化及び／又は増殖プロセスが起こり得ることを認識する。エクスビボ細胞培養を短縮することによって、本発明の方法では、Ｔ細胞生成中に転写及び／又は表現型の変化が起こる機会が最小限となる。更に、エクスビボ培養時間を短縮することにより、Ｔ細胞の維持に必要な高価な細胞培養消耗品の量が減少する。
【0052】
異なる態様において、本開示は、単一の活性化ステップでＴ細胞産物を作製するためのマルチステップワークフローを提供する。特定の方法は、ＨＳＣをマルチＴＣＲ Ｔ細胞へとインビトロ分化及び成熟させるステップを含むプロセスを、１つのみのインビトロＴ細胞活性化ステップで実施することを含む。得られたマルチＴＣＲ Ｔ細胞産物は、治療又は研究に使用することができる。Ｔ細胞製造の従来の方法は、少なくとも２つの別個のインビトロＴ細胞活性化ステップを必要とする。複数の活性化ステップは、一般に、複数の培地の種類、すなわち、異なる活性化因子を含有する培地を伴う。有利なことに、単一の活性化ステップによるＴ細胞の生成は、細胞培養の時間を短縮し、Ｔ細胞の疲弊に関連するマーカーの発現が少ない、より有効なＴ細胞産物を生成する。
【0053】
本発明の方法は、より少ないインビトロ細胞培養でマルチＴＣＲ Ｔ細胞産物を生成するのに有用である。インビトロ細胞培養を短縮することによって、本発明の方法は、より効果的で、含有される疲弊／機能不全Ｔ細胞がより少ないＴ細胞産物を生成する。Ｔ細胞産物は、Ｔ細胞疲弊に関与するタンパク質、例えば、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴを、２つ以上のＴ細胞活性化ステップによって生成されたＴ細胞よりも低いレベルで発現し得る。Ｔ細胞産物はまた、より高いレベルのＩＬ－２を発現し得る。
【0054】
特定の実施形態は、マルチＴＣＲ Ｔ細胞又は初期Ｔ細胞（第２のＴＣＲの導入前）を生成するためのマルチステッププロセスであって、ステップのうちの１つのみがＴ細胞活性化ステップである、マルチステッププロセスを含む。単一の活性化ステップは、活性化培地、例えば、抗体などのＴ細胞活性化試薬を含む培地中でＴ細胞を培養することによって行うことができる。
【0055】
いくつかの例において、活性化ステップは、末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）ベースの活性化を含む。ＰＭＢＣベースの活性化は、アルファ－ガラクトシルセラミド（ａＧＣ）担持ＰＢＭＣ、可溶性抗ＣＤ３／２８陽性ＰＢＭＣ、及び可溶性抗ＣＤ２／３／２８陽性ＰＢＭＣにＴ細胞を導入することを含み得る。いくつかの例において、活性化ステップは、抗原提示細胞（ａＡＰＣ）ベースのＴ細胞活性化ステップを含む。したがって、活性化ステップは、Ｔ細胞をａＡＰＣに導入することを含み得る。好ましくは、ａＡＰＣは放射線照射される。ａＡＰＣは、ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－ＣＡＲ抗原を発現する遺伝子改変Ｋ５６２細胞であり得る。ａＡＰＣは、ａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄ、及び／又はａＡＰＣ＋ＣＤ１ｄ＋／－ａＧＣであり得る。他の例において、活性化ステップは、フィーダーフリーベースのＴ細胞活性化ステップを含む。フィーダーフリーベースのＴ細胞活性化ステップは、Ｔ細胞に、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２／３／２８、ＣＤ３／２８を含む可溶性抗体を導入することを含み得る。いくつかの実施形態において、本方法は、ＩＬ－７／１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２＋２１、ＩＬ－１２、又はＩＬ－１８のうちの１つ以上を含む培養培地を含む。いくつかの実施形態において、培地はＩＬ－１５を含有する。
【0056】
特定の態様において、本発明の方法は、少なくとも第１のＴＣＲが導入された幹細胞を得るステップを含む。本方法は、幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋造血幹細胞／前駆細胞）を得ること；１つ以上の核酸（例えば、第１のＴＣＲ、及び任意選択で１つ以上の追加のＴＣＲ、ＣＡＲをコードする核酸、並びに／又は追加の導入遺伝子）を幹細胞に導入することを含み得る。第１のＴＣＲの導入後、本方法は、Ｔ細胞を生成するために幹細胞のインビトロ分化及び成熟を実施することを更に含む。図１に記載されているように、少なくとも第２のＴＣＲは、分化及び成熟ステップの間の様々な時点で導入することができる。少なくとも第２のＴＣＲの導入後、マルチＴＣＲ Ｔ細胞は、（例えば、同種療法又は研究に）使用又は保存され得る。特定の態様において、本方法は、単一のインビトロ活性化ステップを実施すること、又はインビトロ活性化ステップを実施しないことを含む。
【0057】
本発明の特定の方法は、幹細胞を得るステップを必要とする。好ましくは、細胞はＣＤ３４＋細胞である。非限定的な一実施例において、ＣＤ３４＋幹細胞は造血幹細胞／前駆細胞である。造血幹細胞又は前駆細胞は、造血と呼ばれるプロセスにおいて他の血液細胞を生み出す幹細胞である。
【0058】
造血幹細胞／前駆細胞は、健康なドナーから得ることができる。造血幹細胞／前駆細胞は、例えば、骨髄、末梢血、羊水、又は臍帯血から得ることができる。造血幹細胞／前駆細胞は、臍帯の両端をクランプし、クランプした両端の間から針で血液を吸引することによって、臍帯血から得ることができる。造血幹細胞／前駆細胞は、陽性免疫磁気分離技術を使用して臍帯血から単離することができ、クエン酸－リン酸－デキストロース（ＣＰＤ）を抗凝固剤として臍帯血に添加することができる。臍帯血から得た細胞は、凍結保存され、使用されるまで例えば摂氏－８０度の温度で保存することができる。
【0059】
本開示の方法の実施において、幹細胞を得ることは、好ましくは、造血幹細胞／前駆細胞を含む凍結保存されたＣＤ３４＋臍帯血細胞のバイアルを受け取ることを含む。凍結保存された臍帯血細胞のバイアルは、例えば、ドライアイス上の断熱容器に入れられた状態で細胞バンクから受け取ることができる。
【0060】
凍結保存された臍帯血細胞のバイアルは、当技術分野で公知の方法に従って解凍することができる。例えば、細胞バイアルを３７℃の水浴に約１～２分間入れることによって解凍することができる。いくつかの好ましい実施形態において、細胞が解凍されると、形質導入効率を高めるためにウイルスと標的細胞との共局在化を促進する試薬でプレコートされた組織培養皿に、細胞をプレーティングする。
【0061】
ＣＤ３４＋細胞は、標準的な６ウェルディッシュに、例えば、１０，０００細胞／ウェル、１５，０００細胞／ウェル、又は２０，０００細胞／ウェル、又は２５，０００細胞／ウェル、又はそれ以上でプレーティングされ得る。好ましくは、細胞は１５，０００細胞／ウェルでプレーティングされる。
【0062】
本方法は、ＣＤ３４＋幹細胞に、第１のＴＣＲ、及び任意選択で１つ以上のＣＡＲをコードする１つ以上の核酸、並びに／又は追加の導入遺伝子を導入することを更に含み得る。続いて、本方法は、少なくとも第２の別個のＴＣＲをコードする第２の核酸（複数可）を導入することを更に含み得る。いくつかの実施形態において、導入されたＴＣＲにより、がん細胞の表面に発現された特異的タンパク質を標的とすることができるＴ細胞が生成される。
【0063】
好ましい実施形態において、導入されるＴＣＲのうちの１つ以上は、ｉＮＫＴ ＴＣＲをコードする核酸によって導入される。ｉＮＫＴ ＴＣＲは、ｉＮＫＴ細胞受容体のアルファ鎖、ｉＮＫＴ細胞受容体のベータ鎖、又はその両方、のうちの１つを含み得る。好ましくは、ｉＮＫＴ細胞受容体は、幹細胞がアルファ－ガラクトシルセラミドを認識するように、幹細胞によって発現される。他の好ましい実施形態において、導入されるＴＣＲのうちの１つ以上は、デルタガンマＴ細胞ＴＣＲをコードする核酸によって導入される。ＴＣＲは、ＴＣＲのガンマ鎖、ＴＣＲのデルタ鎖、又はその両方、のうちの１つを含み得る。
【0064】
本発明の方法によって生成されるＴ細胞は、導入ＴＣＲをコードする導入遺伝子以外に、少なくとも１つの追加の導入遺伝子を発現するように遺伝子組換えされてもよい。導入遺伝子は、例えば、サイトカイン、チェックポイント阻害因子、トランスフォーミング増殖因子ベータシグナル伝達の阻害因子、サイトカイン放出症候群の阻害因子、又は神経毒性の阻害因子のうちの１つであり得る。したがって、本発明の方法は、エフェクター機能が増強されたマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成するのに有用であり得る。
【0065】
例えば、いくつかの例において、本発明の方法は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１－１５のうちの１つ以上をコードする導入遺伝子の導入によってもたらされる、改善された増殖及び持続能を有するＣＡＲ Ｔ細胞の製造に有用である。いくつかの例において、方法は、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８のうちの１つ以上をコードする導入遺伝子の導入によって、増加したＩＦＮ－ｇ生成、したがって改善されたＴ細胞ポテンシーを有するＣＡＲ Ｔ細胞を提供し得る。いくつかの例において、本発明の方法は、ＩＬ－２１を含む導入遺伝子を導入することによってナイーブＴ細胞生成を増強するのに有用である。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、例えば、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、又はサイトカイン放出症候群及び神経毒性の他のメディエーターの阻害因子を導入することによって、改善された安全性特性を有するＣＡＲ Ｔ細胞の生成を提供する。方法は、例えば、ＴＧＦ－Ｂチェックポイントの阻害因子を介して、腫瘍微小環境に対抗するのに有用なペイロードをもたらすことによって、改善された効力を有するＣＡＲ Ｔ細胞を提供し得る。
【0066】
１つ以上の核酸を幹細胞に導入することは、ウイルス形質導入法又は非ウイルス性トランスフェクションによって達成され得る。いくつかの例において、例えば、１つ以上の核酸を導入する方法は、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン／トランスポザーゼシステムを使用する非ウイルス法を含む。Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステムは、正確に定められたＤＮＡ配列を細胞の染色体に導入するように設計された合成ＤＮＡトランスポゾンを含む。このシステムは、トランスポザーゼを複数の不活性な魚類配列から復活させたＴｃ１／ｍａｒｉｎｅｒ型システムを用いる。有利なことに、非ウイルス法は、コスト削減の利点をもたらし、特定のウイルスの使用に伴うリスクを軽減することができる。しかしながら、非ウイルス法は効率の低下を伴う可能性がある。したがって、好ましい実施形態において、ウイルス形質導入によって、例えば、レトロウイルスを介して、核酸を幹細胞に導入する。
【0067】
ウイルス形質導入法は、その汎用性からよく認識されており、レンチウイルスベクターの使用を含み、該ベクターは、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に、かなりの量の核酸を形質導入するのに有用である。レンチウイルスベクターの使用は安全であると考えられ、多くの場合、長期の導入遺伝子発現をもたらす。したがって、方法１０１は、好ましくは、レンチウイルス形質導入を介して１つ以上の核酸を３４＋幹細胞に導入（１０９）する。幹細胞のレンチウイルス形質導入に関する考察については、参照により組み込まれるＪａｎｇ，２０２０，Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２７）：５４５－５５６を参照されたい。
【0068】
本発明の方法は、幹細胞に核酸を導入するためのいかなる１つのプロセス又は実験手順によっても限定されない。いくつかの例において、単一のレンチウイルスベクターが使用される。単一のレンチウイルスベクターは、ＴＣＲ、ＣＡＲ、及び追加の導入遺伝子のそれぞれをコードし得る。他の例において、少なくとも２つの別個のレンチウイルスベクターが使用され、少なくとも２つのレンチウイルスベクターの各々は、ＴＣＲ、ＣＡＲ、及び追加の導入遺伝子のうちの少なくとも１つをコードし、その結果、形質導入時に、ＴＣＲ、ＣＡＲ、及び追加の導入遺伝子の各々が幹細胞に形質導入される。更に、２つ以上のレンチウイルスベクターが使用される場合、本方法は、２つ（又はそれ以上）のレンチウイルスベクターを幹細胞に導入する時間的順序によって限定されない。ベクターは、同じ形質導入において同時に導入されてもよく、又は順次導入されてもよい。
【0069】
特定の態様において、本発明の方法は、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の、Ｔ細胞へのインビトロ分化及び成熟を含むプロセスを実施することを更に含む。
【0070】
本明細書中に開示される細胞製造方法の利点の１つは、単一の出発物質、すなわち幹細胞から広範なＴ細胞サブタイプを生成できることにある。本発明の方法によって生成されるＴ細胞は、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞、アルファベータＴ細胞、ガンマデルタＴ細胞を含み得る。好ましい実施形態において、方法１０１は、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞を生成することを含む。インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞及びガンマデルタＴ細胞の生成は、同種細胞療法への適用のために好ましい。特に、移植片対宿主病を誘発することなく、がんを治療するための抗原特異的Ｔ細胞応答を活性化し、増殖する能力。
【0071】
したがって、本発明の方法は、幹細胞（例えば、ＨＳＣ）の、Ｔ細胞（例えば、ｉＮＫＴ又はγδＴ細胞）へのインビトロ分化及び成熟プロセスを実施することを含み得る。以下に詳細に論じられように、幹細胞のインビトロ分化及び成熟を実施することは、プロセスがその後にＴ細胞の活性化及び増殖のインビトロステップを含まないという条件で達成され得る。
【0072】
ＣＤ３４陽性細胞からＴ細胞への分化は段階的に起こり得る。第１の段階は、ＣＤ３４陽性幹細胞からＣＤ４及びＣＤ８二重陰性Ｔ細胞へのインビトロ分化を含み得る。ＣＤ３４陽性幹細胞の分化は、一般に、例えば、１～２週間の培養中に、サイトカイン及び／又はケモカインの組み合わせにＣＤ３４陽性幹細胞を導入することを含む。いくつかの例において、サイトカイン及び／又はケモカインは、市販の前駆細胞増殖サプリメント、例えばＳＴＥＭＣＥＬＬ社からＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で販売されているサプリメントによって提供され得る。インビトロプロセスを実施する実施形態は、ＣＤ４及びＣＤ８二重陰性Ｔ細胞からＣＤ４及びＣＤ８二重陽性細胞への成熟を更に含む。いくつかの例において、二重陰性細胞を成熟させることは、市販の前駆体成熟培地、例えばＳＴＥＭＣＥＬＬ社からＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で提供されている前駆体成熟培地中で細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、前駆体成熟培地中で７日間培養される。
【0073】
特定の態様において、ＣＤ３４＋幹細胞の、Ｔ細胞へのインビトロ分化及び成熟プロセスを実施することにより、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞が生成される。ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞であり得る。ナイーブＴ細胞は、一般的に、Ｌ－セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）及びＣ－Ｃケモカイン受容体７型（ＣＣＲ７）の表面発現によって特徴付けられる。いくつかの例において、活性化マーカーであるＣＤ２５、ＣＤ４４又はＣＤ６９が存在しないこと、及びメモリーＣＤ４５ＲＯアイソフォームが存在しないことである。ナイーブＴ細胞はまた、サブユニットＩＬ－７受容体アルファ、ＣＤ１２７、及び共通ガンマ鎖、ＣＤ１３２からなる機能的ＩＬ－７受容体を発現することがある。ナイーブＴ細胞は、保存のために凍結保存してもよく、同種細胞治療中に被験体に導入してもよい。特定の態様において、ナイーブＴ細胞は、第１のＴＣＲ受容体のみを含み、第２のＴＣＲ受容体は凍結保存又は同種細胞治療での使用の前／後に導入される。被験者の体内では、ナイーブＴ細胞は末梢リンパ管を通って循環し、最初の抗原刺激を待つことができる。ナイーブ細胞のＴＣＲを介して最初の刺激を受けると、細胞は、活性化、共刺激、及び接着に関連する表面分子の発現を調節し始める。これらの分子及び／又は第２の導入ＴＣＲの発現パターンを用いて、Ｔ細胞サブセットのエフェクター及び抗原経験を更に規定することができる。
【0074】
いくつかの実施形態において、ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞を、凍結保存及び／又は同種細胞療法レシピエントへの投与の前にインビトロで増殖させる。ＣＤ４陽性ＣＤ８陽性Ｔ細胞の増殖は、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２、アルファ－ガラクトシルセラミドのうちの１つ以上の存在下で細胞を培養することを含み得る。特定の態様において、Ｔ細胞を、第２のＴＣＲの導入前にインビトロで増殖させる。あるいは、Ｔ細胞を、第２のＴＣＲの導入後にインビトロで増殖させてもよい。特定の方法では、Ｔ細胞を、第２のＴＣＲの導入前及び第２のＴＣＲの導入後にインビトロで増殖させてもよい。
【0075】
本発明の特定の方法では、インビボ活性化機構を利用することで、従来の方法で使用されている、必要なインビトロ培養ステップを減少させる。２つの活性化ステップを受けることなくマルチＴＣＲ Ｔ細胞が生成され、被験体の体内に導入されると、Ｔ細胞は、例えば二次リンパ器官で樹状細胞などの適切に活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）に遭遇したときに完全に活性化される。ＡＰＣが主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子を介して適切なペプチドリガンドを提示する場合、導入ＴＣＲのうちの１つ以上によって認識される。この相互作用は、Ｔ細胞を活性化するために重要である。
【0076】
ＡＰＣによって送達される２つの他の刺激シグナルが必要な場合もある。これらのシグナルは、ＡＰＣ表面の２つの異なるリガンド、例えば、ＣＤ８０及びＣＤ８６によって、Ｔ細胞上の表面分子、例えば、ＣＤ２８へと供給され得る。活性化のために重要な他の因子としては、Ｔ細胞をエフェクターＴ細胞の様々なサブセットへの分化に誘導することに関与する因子（例えば、サイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－１２及びＴＧＦ－β））が挙げられる。活性化Ｔ細胞のＣＤ２８依存性共刺激は、活性化Ｔ細胞自体によるＩＬ－２の生成をもたらし得る。ＩＬ－２の発現に続き、ＩＣＯＳ及びＣＤ４０Ｌなどの他の調節分子に加えて、ＣＤ２５としても知られているＩＬ－２受容体の第３の成分（α鎖と呼ばれる）のアップレギュレーションも起こり得る。ＩＬ－２が高親和性受容体へ結合すると細胞増殖が促進され、ＡＰＣ、主に樹状細胞は、環境条件に応じて、様々なサイトカインを生成するか、又はＣＤ４＋Ｔリンパ球からサイトカイン生成エフェクター細胞への分化を誘導する表面タンパク質を発現する。
【0077】
図２は、ＨＳＣを出発物質とする３つのエクスビボＴ細胞製造プロセスの段階を示す。これらの図示されたプロセスは、第１のＴＣＲを導入して、ＨＳＣからＴ細胞、好ましくはｉＮＫＴ又はγδＴ細胞を生成することを含む。図１に示したように、本発明の柔軟な方法は、様々な時点で第２のＴＣＲを導入することを可能にする。
【0078】
図２において、一番上のプロセス２０３は、ＨＳＣからＴ細胞を作製するための従来のエクスビボプロセスを表す。対照的に、エクスビボプロセス２０５及び２０７は、より迅速かつより少ないステップでＴ細胞を生成するための、本発明のエクスビボプロセスで使用されるステップを示す。
【0079】
従来のプロセス２０３において、成熟Ｔ細胞は、少なくとも２つのインビトロ活性化ステップに供される。このプロセス２０３では、少なくとも３５日のエクスビボ細胞培養を必要とし、より長い培養（多くの場合、４２日を超え、多くの場合、それより長い）を必要とすることもある。
【0080】
逆に、本発明のプロセス２０５では、全てのエクスビボＴ細胞活性化ステップを省略する。したがって、本方法２０５では、わずか２１日以内にＴ細胞を生成することができる。エクスビボ活性化ステップを省略することによって、ＨＳＣを出発物質としてエクスビボ培養を使用する、Ｔ細胞を製造するためのこのプロセスは、従来のプロセス２０３よりも実質的に短い時間しか掛からない。したがって、従来のプロセス２０３に必要とされる３５～４２日以上ではなく、本発明のプロセス２０５は、わずか２１日で治療に使用可能なＴ細胞を生成することができる。
【0081】
図２は、ＨＳＣからＴ細胞を生成するための本発明の別のプロセス２０７を示す。示されるように、このプロセス２０７は、単一のエクスビボ活性化ステップを含む。したがって、本発明のこのプロセスも、ＨＳＣからＴ細胞を製造するための従来のプロセス２０３に対する改善を示す。単一の活性化ステップを使用して、Ｔ細胞を製造するための本発明の該プロセスは、約２８～３１日でマルチＴＣＲ Ｔ細胞を含む同種Ｔ細胞を生成することができる。これらの方法は、特定の活性化ステップが特定の種類のＴ細胞、ＴＣＲ、複数のＴＣＲの組み合わせ、及び／又はＴ細胞治療に対して有する利点を、従来のプロセスでシングルＴＣＲ Ｔ細胞を生成するよりも短い時間で達成することができる。例えば、単一の活性化ステップは、第２のＴＣＲが導入されたＴ細胞、第２のＴＣＲ導入後のマルチＴＣＲ Ｔ細胞、及び／又は治療的処置の一部として被験者に導入された際にＴ細胞が治療及び／又は増殖するようにプライミングされていることを確実にするために、有効な量のＴ細胞を生成するのに有用であり得る。
【0082】
図３は、インビトロでＴ細胞を生成する２つのプロセスの比較を示す。第１のプロセス（バージョン１．０）は、２つの活性化ステップを含む。二重陽性Ｔ細胞を、例えばＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２及びＩＬ－１５を含む異なる活性化培地で処理することにより達成される２ステップの活性化プロセスでは、本明細書に開示される本発明のプロセスよりも少なくとも１週間、一般にはそれ以上製造プロセスが長くなる。図３に示される第２のプロセス（バージョン２．０）は、インビトロ活性化を省略している。
【0083】
本発明の方法は、単一の活性化ステップを含み得る。単一の活性化ステップは、Ｔ細胞を、活性化試薬と共に７日以下の期間培養することを含み得る。他の実施形態において、単一の活性化ステップは、６日、５日、４日、３日、２日、又は１日以下の間、活性化培地中でＴ細胞を培養することを含む。他の実施形態において、単一の活性化ステップは、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日より長く、活性化培地中でＴ細胞を培養しないことを含む。単一の活性化ステップは、単一の種類の活性化培地でＴ細胞を培養することを含み得る。単一の種類の活性化培地は、可溶性抗体などの活性化試薬を含み得る。単一の活性化ステップは、Ｔ細胞を抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ）と共培養することを含み得る。単一の活性化ステップは、Ｔ細胞をＰＢＭＣと共培養することを含み得る。
【0084】
本発明の好ましい方法は、マルチＴＣＲ Ｔ細胞への第２のＴＣＲの導入後における活性化ステップを含む。本発明の特定の方法は、マルチＴＣＲ Ｔ細胞への第１のＴＣＲの導入後における活性化ステップを含む。本発明の特定の方法は、マルチＴＣＲ Ｔ細胞への第１及び第２のＴＣＲの導入後における活性化ステップを含む。
【0085】
本発明の方法は、造血幹細胞／前駆細胞からのＴ細胞の生成を含む。造血幹細胞／前駆細胞は、一般に、臍帯血中に見出され得るＣＤ３４＋細胞と関連している。いくつかの例において、細胞は、前駆細胞に由来し得る。いくつかの例において、細胞は、胚性幹細胞などの多能性幹細胞である。
【0086】
ＨＳＣから生成された同種ＣＡＲ Ｔ細胞は、特定の病態に対する治癒的治療アプローチを提供し得る。しかしながら、ＧＶＨＤを含むいくつかの制限がある。ＧＶＨＤは、同種細胞療法に関連する罹患率及び死亡率の多くの原因となるドナーＴ細胞媒介アロ反応性プロセスである。いくつかの臨床研究では、ドナーｉＮＫＴ細胞は病気の再発リスクを増加させることなくＧＶＨＤを予防できることが示されている。ドナーＣＡＲ ｉＮＫＴ細胞の養子移入とそれに続くインビボ活性化及び／又は増殖は、ＧＶＨＤの症状を予防又は緩和し得る。この保護効果は、アロ反応性Ｔ細胞のＴｈ２極性化及びドナー制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖によって媒介され得る。本発明の方法によって生成される同種ｉＮＫＴ細胞はＧＶＨＤを引き起こさないため、本明細書に記載される方法は、「既製の」ＣＡＲ免疫療法のための理想的なプラットフォームを提供する。
【0087】
本発明の方法は、ＴＣＲの抗原認識領域の機能的再配列を介して抗原特異性を獲得する、治療的に活性なＴ細胞を製造するのに有用である。ＴＣＲは、主要組織適合性複合体分子に結合した抗原を認識する、Ｔ細胞（又はＴリンパ球）の表面に見出される分子である。ＴＣＲは、少なくとも２つの異なるタンパク質鎖（例えば、ヘテロ二量体）から構成され得る。ほとんどの（例えば、９５％の）Ｔ細胞において、ＴＣＲはアルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖からなるが、一部の（例えば、５％の）Ｔ細胞において、ＴＣＲはガンマ（λ）鎖及びデルタ（δ）鎖からなる。このようなＴ細胞は、細胞表面ＴＣＲ分子に抗原特異性を有し、古典的ＣＤ３陽性、アルファ－ベータ（αβ）ＴＣＲ ＣＤ４陽性、ＣＤ３陰性αβＴＣＲ ＣＤ８陽性、ガンマデルタ（γδ）Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＴＫ）細胞などを含むがこれらに限定されない異なる表現型サブセットにインビボで分化し得る。更に、Ｔ細胞は、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、ターミナルエフェクターなどを含むが、これらに限定されない様々な活性化状態を更に含み得る。
【0088】
非限定的な一実施例において、Ｔ細胞は、腫瘍細胞に対して細胞傷害性を指向する１つ以上の人工ＴＣＲを発現するように遺伝子操作され得る。例えば、人工ＴＣＲのうちの１つ以上は、特異的ネオ抗原を標的とし得る。ネオ抗原は、一般に、腫瘍細胞の突然変異によって生じる腫瘍特異的抗原である。ネオ抗原はまた、ウイルス感染、選択的スプライシング、及び遺伝子再編成によって生じることもある。ネオ抗原は、一般に、正常な健常細胞では発現されない。したがって、ネオ抗原は、被験体の遺伝子改変免疫細胞が特異的に指向する理想的な標的を提供する。特定の態様において、本発明の遺伝子改変免疫細胞は、異なるネオ抗原を標的とする導入人工ＴＣＲを有する。特定の態様において、本発明は、細胞の別々の集団が、それぞれ異なるネオ抗原に指向する異なる導入ＴＣＲを有する、遺伝子改変細胞の組成物を提供する。
【0089】
特定の態様において、本発明の方法は、ＣＡＲ Ｔ細胞の製造を提供する。ＣＡＲ Ｔ細胞は、免疫療法に使用するための、人工Ｔ細胞受容体を有する遺伝子操作Ｔ細胞である。ＣＡＲ（すなわち、キメラ抗原受容体）は、例えば、レトロウイルスベクターによって促進されるコード配列の移入を介して、ＴＣＲを有する幹細胞にモノクローナル抗体の特異性を融合（graft）させるために使用され得る。ＣＡＲは、特異的タンパク質を標的とする新しい能力をＴ細胞に与えるように遺伝子改変された受容体タンパク質である。この受容体は、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能の両方を単一の受容体に兼ね備えたキメラ構造である。したがって、本発明の方法は、がん細胞をより効果的に標的化して破壊するためにがん細胞を認識する１つ以上のＣＡＲを含む組換えＴ細胞を生成することにより、免疫療法のための製品を提供する。
【0090】
本発明の方法の実施において、養子免疫療法において使用されるエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）を遺伝子改変するのに適した任意のＣＡＲを、本発明において使用することができる。本発明において使用することができるＣＡＲとしては、参照により組み込まれる、Ｋｉｍ ａｎｄ Ｃｈｏ，２０２０，Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ＣＡＲ－Ｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１０（２）：２６３に記載されているものが挙げられる。
【0091】
ＣＡＲは、一般に、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、抗原結合／認識領域／ドメインを含み得る。ＣＡＲの抗原結合ドメインは、特異的抗原、例えば、腫瘍抗原、病原体抗原（例えば、ウイルス抗原）、ＣＤ（分化抗原群）抗原に結合するのに有用である。細胞外ドメインは、新生タンパク質を小胞体に指向させるシグナルペプチドを含むこともある。シグナルペプチドは、ＣＡＲがグリコシル化され、細胞膜に固定される場合に必須であり得る。膜貫通ドメインは、膜を横切る疎水性アルファヘリックスである。膜貫通ドメインが異なれば、受容体の安定性も異なる。抗原認識後、受容体はクラスター化し、シグナルが細胞に伝達される。最もよく使われる細胞内成分は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３Ｘｉである。ＣＤ３Ｘｉは、抗原結合後、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサー領域も含むことができる。スペーサー領域は、抗原結合ドメインが抗原認識を容易にするために様々な方向に向きを変えられるように、十分に柔軟でなければならない。スペーサーは、ＩｇＧ１のヒンジ領域、又は免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域及びＣＤ３の一部であり得る。
【0092】
現在、ＣＡＲには３世代ある。第１世代ＣＡＲは、典型的には、Ｔ細胞受容体鎖の細胞質シグナル伝達ドメインと融合した膜貫通ドメインと融合した抗体由来の抗原認識ドメイン（例えば、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ））を含む。第１世代ＣＡＲは、典型的には、内在性ＴＣＲからのシグナルの主要な伝達物質であるＣＤ３ Ｘｉ鎖の細胞内ドメインを有する。第１世代ＣＡＲは、ＨＬＡを介した抗原提示とは無関係に、単一融合分子においてｄｅ ｎｏｖｏ抗原認識をもたらし、ＣＤ３Ｘｉ鎖シグナル伝達ドメインを通じてＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の活性化を引き起こすことができる。第２世代ＣＡＲは、第１世代ＣＡＲに類似しているが、ＣＤ２８又は４－１ＢＢなどの、２つの共刺激ドメインを含む。これらの細胞内シグナル伝達ドメインが関与することで、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン分泌、アポトーシスに対する抵抗性、インビボでの持続性が改善される。第３世代ＣＡＲは、ＣＤ２８－４１ＢＢ又はＣＤ２８－ＯＸ４０などの複数の共刺激ドメインを組み合わせて、Ｔ細胞活性を更に増強する。
【0093】
特定の態様において、本発明のマルチＴＣＲ Ｔ細胞を製造する方法は、１つ以上の追加の導入遺伝子、すなわち、第１の導入ＴＣＲ及び／又は第２の導入ＴＣＲに加えて導入遺伝子を導入することを含む。例えば、追加の導入遺伝子は、１つ以上のサイトカインをコードし得る。サイトカインは、インターフェロン、インターロイキン、増殖因子など、免疫系の特定の細胞によって分泌され、他の細胞に影響を与える物質に関する。特定の態様において、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、又はＩＬ－２１のうちの１つ以上をコードする導入遺伝子を細胞に導入して、Ｔ細胞の機能、効力、及び／又は抗原標的特異性を促進する。
【0094】
マルチＴＣＲ Ｔ細胞への１つ以上の導入遺伝子の導入は、Ｔ細胞増殖及び持続性（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７／１５を使用）、ＩＦＮ－ｇ生成及びＴ細胞ポテンシー（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８を使用）などの特性を改善し、ナイーブサブセットを増強する（例えば、ＩＬ－２１）、安全性を改善する（例えば、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ又はＣＲＳ及び神経毒性の他のメディエーターの阻害因子を介して）、又は腫瘍微小環境（ＴＧＦ－Ｂ、チェックポイントなど）と闘うことによって効力を改善し得る。
【0095】
例えば、ＩＬ－１２及びＩＬ－１８は、Ｔ細胞における特定のエフェクター機能の増強において主要な役割を果たす。ＩＬ－１２は、特定のＮＫ細胞及びＴリンパ球を活性化し、Ｔｈ－１型応答を誘導し、ＩＦＮ－ガンマ分泌を増加させることが知られている。ＩＬ－１２の誘導性発現は、リンパ腫、肝細胞がん、卵巣腫瘍、Ｂ１６黒色腫などの特定の病態に対するＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍能を増強し得る。ＩＬ－１８もまた、Ｔ細胞の治療可能性を改善するために使用されている。当初はＩＦＮ－ガンマの強力な誘導因子として同定されたＩＬ－１８は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞活性化並びにＴｈ－１細胞極性化に寄与する可能性がある。例えば、メソ標的化Ｔ細胞に、ＩＬ－１８をコードする導入遺伝子を供給して、ＩＦＮ－ガンマの分泌を増大させ、がん細胞を根絶することができる。更なる考察については、参照により組み込まれるＴｉａｎ，２０２０，Ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ｓｏｌｉｄ ｃａｎｃｅｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌｕｍｅ １３（５）を参照されたい。
【0096】
ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及びＩＬ－２１は、幹細胞様メモリーＴ細胞表現型の生成を促進するのに有用である。この表現型は、インビボにおけるＴ細胞の増殖及び持続性の増加をもたらし得る。いくつかの例において、ＩＬ－２をコードする導入遺伝子を細胞に導入する。ＩＬ－２を用いてＴ細胞を生成することにより、腫瘍環境で見出される条件に応答する能力が改善されたＴ細胞がもたらされ得る。例えば、ＩＬ－２を供給することは、栄養感知及び取り込みに関与するタンパク質の誘導及び生成を促進し得る。
【0097】
いくつかの実施形態において、導入される追加の導入遺伝子は、サイトカイン放出症候群の阻害因子である。サイトカイン放出症候群は、多くの場合Ｔ細胞療法に伴う、重篤で生命を脅かす可能性のある副作用に関する。サイトカイン放出症候群は、例えば、ＩＦＮ－ガンマ及びＩＬ－６を含む過剰な炎症性サイトカイン放出に起因する急速な（過剰）免疫反応として現れる。サイトカイン放出症候群に関与する多くのサイトカインは、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ経路を介して作用することが知られている。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、インビボでのＴ細胞増殖、抗腫瘍活性、及びサイトカインレベルを改善するために、ＪＡＫ経路の阻害因子を発現するＴ細胞を生成することを含む。例えば、ＩＬ－６、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ、又はＢＴＫの機能を阻害する導入遺伝子が供給され得る。更に、阻害因子は神経毒性の阻害にも有用であり得る。Ｔ細胞関連神経毒性は、多くの場合発作及び昏睡などの重篤な神経障害を引き起こす症候群である。
【0098】
他の例において、方法は、Ｔ細胞を生成するために使用される１つ以上の導入遺伝子をＨＳＣに導入することを含む。特定の態様において、導入遺伝子は、チェックポイント阻害因子、例えば、免疫チェックポイント阻害因子である。免疫チェックポイントは、免疫系における特定の態様の制御因子である。正常な生理学的状態において、チェックポイントは免疫系が健康な組織を維持する宿主の抗原に応答することを可能にする。がんにおいて、これらの分子は、腫瘍細胞の回避を促進する。いくつかの例において、導入遺伝子は、抗カテプシン抗体、ガレクチン－１遮断抗体及び抗ＯＸ４０アゴニスト抗体などの抗体又は抗体フラグメントをコードし得る。抗体は、分泌されるか、又は細胞の表面に発現され得る。例えば、ＰＤ１又はＰＤＬ１を標的とする抗体が分泌され得る。
【0099】
特定の態様において、導入された導入遺伝子は、トランスフォーミング増殖因子ベータの１つ以上の阻害因子を発現する。遺伝子改変細胞は、その効力を制限する不利な微小環境に直面する。環境を調節することは、Ｔ細胞の増殖、生存する能力及び／又はがん細胞を殺傷する能力を促進するのに有用であり得る。腫瘍環境内における主な阻害機構の１つは、トランスフォーミング増殖因子ベータである。したがって、本発明のいくつかの態様は、トランスフォーミング増殖因子ベータの阻害因子をコードする導入遺伝子を導入することを含む。阻害因子は、例えば、抗体又はそのフラグメントであり得る。抗体又は抗体フラグメントは、Ｔ細胞から分泌されて、トランスフォーミング増殖因子ベータの正常な機能を妨害し得る。
【0100】
本発明の特定の方法は、腫瘍微小環境のマーカーを介して固形腫瘍タイプを標的とするマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成することを含む。特定の態様において、本発明の方法は、第１のＴＣＲを導入後にＣＡＲを導入することを含む。このような方法において、ＣＡＲは、細胞の使用要件に応じて、代わりに、又は加えて導入される。したがって、本発明は、腫瘍特異的標的を必要とせずに腫瘍微小環境のマーカーを認識するために使用することができる、シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）ベースのキメラ抗原受容体を有するＣＡＲ Ｔ細胞を生成する方法を含む。本発明によるＶＨＨベースのＣＡＲ Ｔ細胞は、免疫チェックポイント受容体を介して、あるいは間質及び細胞外マトリックスマーカーを介して、腫瘍微小環境を標的とすることができ、同種免疫不全動物モデルにおいて固形腫瘍に対して有効である。
【0101】
したがって、本発明の方法は、腫瘍特異的抗原発現のない可能性がある腫瘍を標的とするＣＡＲ Ｔ細胞を作製するのに有用である。重鎖のみの抗体（ＶＨＨ又はナノボディ）の可変領域は、従来の短鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に匹敵する親和性を有する、小型で安定なラクダ科動物由来のシングルドメイン抗体フラグメントである。ＶＨＨは一般にｓｃＦｖよりも免疫原性が低く、サイズが小さいため、ｓｃＦｖが認識するエピトープとは異なるエピトープにアクセスすることができる。したがって、本発明によって提供されるＶＨＨは、ＣＡＲ Ｔ細胞において適切な抗原認識ドメインとして機能し得る。ｓｃＦｖとは異なり、ＶＨＨは、Ｖ領域ペアリングに伴う追加のフォールディング及びアセンブリステップを必要としない。ＶＨＨは、広範なリンカー最適化又は他のタイプの再フォーマットを必要とせずに表面ディスプレイを可能にする。様々なＶＨＨベースの認識ドメインをスイッチアウトする能力により、それぞれの新しい従来型抗体をｓｃＦｖに再フォーマットする必要なくアクセス可能な、高度にモジュール式のプラットフォームがもたらされる。
【0102】
多くの微小環境は、ＰＤ－Ｌ１などの阻害分子の発現を伴う。認識ドメインとしてＶＨＨ、例えば、ＰＤ－Ｌ１特異的Ｔ細胞を使用して、本発明の方法によって生成されるマルチＴＣＲ、及びＴＣＲとＣＡＲ Ｔ細胞は、腫瘍微小環境を標的とすることができる。ＰＤ－Ｌ１は、腫瘍細胞だけでなく、浸潤する骨髄系細胞やリンパ球にも広く発現している。ＰＤ－Ｌ１を認識するＣＡＲ／ＴＣＲは、免疫阻害を緩和すると同時に、腫瘍微小環境におけるＴ細胞活性化を可能にするはずである。したがって、ＰＤ－Ｌ１を標的とするＴ細胞は、腫瘍微小環境をリプログラミングし、免疫抑制シグナルを弱め、炎症を促進し得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＸｉｅ，２０１９，Ｎａｎｏｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｍｉｃｅ，ＰＮＡＳ Ａｐｒｉｌ １６，２０１９ １１６（１６）７６２４－７６３１において論じられている通りである。
【0103】
本開示の態様によれば、ＣＤ３４＋幹細胞は、第１のＴＣＲ、１つ以上の異なるＴＣＲ／ＣＡＲ、及び追加の導入遺伝子（例えば、サイトカイン）を発現するように遺伝子操作される。特定の態様において、ＴＣＲ（複数可）、ＣＡＲ（複数可）、及び／又は追加の導入遺伝子をコードする１つ以上の核酸は、レトロウイルス形質導入を使用して導入される。特定の態様において、第１のＴＣＲ及びそれに続くＴＣＲ／ＣＡＲは、レトロウイルス形質導入を使用して、製造プロセス中の異なる時点で導入される。
【0104】
培養中のヒト細胞に感染するレトロウイルスベクターと適切なパッケージングとの組み合わせは、当技術分野で公知である。好ましい実施形態において、第３世代レンチウイルスベクターが、第１のＴＣＲ及び／又は第２のＴＣＲ／ＣＡＲを導入するために使用され得る。ベクターは、好ましい抗原を標的とする抗体又は抗体フラグメントの配列を含有するｃＤＮＡ配列で遺伝子組換えされ得る。例えば、Ｃａｒｐｅｎｉｔｏ，２００８，Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｌａｒｇｅ，ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｔｕｍｏｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ ｗｉｔｈ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｒｅｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＣＤ２８ ａｎｄ ＣＤ１３７ ｄｏｍａｉｎｓ，ＰＮＡＳ，１０６（９）３３６０－３３６５；Ｌｉ，２０１７，Ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｔｏ Ｇｌｙｐｉｃａｎ－３ ｗｉｔｈ ４－１ＢＢ Ｚｅｔａ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｔｈ１ Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２８（５）：４３７－４４８；Ａｄｕｓｕｍｉｌｌｉ，２０１４，Ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＣＡＲ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｌｏｎｇ－ｌａｓｔｉｎｇ ＣＤ４－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６１（６）：１－１４；（各文献は参照により組み込まれる）に記載されている通りである。
【0105】
本開示のいくつかの態様は、ＨＳＣに複数の導入遺伝子を導入して発現させることを含む。複数の遺伝子の発現を促進するために、核酸において２Ａ配列、すなわち２Ａペプチドのコードドメインを有する導入遺伝子を分離することが有用であり得る。２Ａ自己切断ペプチド又は２Ａペプチドは、１８～２２アミノ酸長ペプチドのクラスであり、タンパク質の翻訳中にリボソームスキッピングを誘導することができる。細胞内で、２Ａペプチドのコードドメインが２つのタンパク質（例えば、ＴＣＲ及びＣＡＲ）の２つのコードドメインの間に挿入されている場合、リボソームスキッピングにより、ペプチドは独立してフォールディングした２つのタンパク質に翻訳される。
【0106】
本発明の方法は、遺伝子改変ＨＳＣを臨床応用のためのＴ細胞に形質転換するのに有用である。形質転換の方法は一般に、部分的には、第１のＴＣＲの導入による、ＨＳＣからＴ細胞への分化を含む。細胞分化は、細胞が１つの細胞タイプから別の細胞タイプへと変化するプロセスである。通常、細胞はより特殊化したタイプに変化する。ＨＳＣからＴ細胞への分化は、複数の分化段階を含み得る。第１段階として、ＣＤ３４＋細胞はＣＤ４ ＣＤ８二重陰性Ｔ細胞に分化し得る。二重陰性Ｔ細胞の生成は、造血サイトカインを含む細胞因子カクテルの存在下でのＣＤ３４＋細胞の培養によって達成することができる。カクテルは、ＳＣＦ（例えば、ｈＳＣＦ）、Ｆｌｔ３Ｌ（例えば、ｈＦｌｔ３Ｌ）、少なくとも１つのサイトカイン、及び造血特異化のためのｂＦＧＦを含み得る。サイトカインはＴｈ１サイトカインであってもよく、該サイトカインにはＩＬ－３、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－１２及びＩＬ－２１が含まれるが、これらに限定されない。細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ３１、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ４１ａ、ｃｋｉｔ、Ｎｏｔｃｈ１、ＩＬ７Ｒαの発現について、ＦＡＣＳによって免疫表現型解析することができる。
【0107】
二重陰性Ｔ細胞は、抗原非依存的成熟プロセスを介して更に分化され、機能的不活性化Ｔ細胞を生成し得る。このプロセスは、リンパ系前駆細胞増殖培地中で二重陰性Ｔ細胞を培養することを含み得る。この培地は、例えば、フィーダー細胞、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及び少なくとも１つのサイトカインを含み得る。サイトカインはＴｈ１サイトカインであってもよく、該サイトカインにはＩＬ－３、ＩＬ－１５、ＩＬ－７、ＩＬ－１２及びＩＬ－２１が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、サイトカインは細胞の生存及び／又は機能的能力を増強し得る。
【0108】
活性化及び／又は増殖ステップを受けていないマルチＴＣＲ Ｔ細胞を含むＴ細胞を含む細胞産物は、新生物、病原体感染、又は感染症の治療のため、被験体に全身的に又は直接供給することができる。一実施形態において、本発明のマルチＴＣＲ Ｔ細胞は、目的の臓器（例えば、新生物が生じた臓器）に直接注射され得る。あるいは、マルチＴＣＲ Ｔ細胞及び該細胞を含む組成物は、例えば、循環系（例えば、腫瘍血管系）への投与によって、目的の臓器に間接的に供給され得る。特定の態様において、Ｔ細胞の活性化及び増殖は、被験体への導入後にインビボで起こる。
【0109】
本発明のＴ細胞及び該細胞を含む組成物は、任意の生理学的に許容されるビヒクル中で、通常は血管内に投与され得るが、細胞が再生及び分化のための適切な部位（例えば、胸腺）を見出し得る骨又は他の好都合な部位に導入することもできる。通常、少なくとも１００，０００個の細胞、時には、１０，０００，０００，０００個以上の細胞が投与される。
【0110】
本発明の方法は、同種細胞療法で投与するための医薬組成物と組み合わせることができる細胞の組成物を提供する。本発明の治療用組成物（例えば、ＨＳＣに由来するマルチＴＣＲ Ｔ細胞を含む医薬組成物）を投与する場合、該組成物は一般に、単位用量注射可能形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で製剤化される。組成物は、治療上有効な濃度で提供され得る。治療上有効な濃度とは、治療により有益な又は所望の臨床結果に影響を及ぼすのに十分な量である。有効量は１回分以上の用量で被験体に投与され得る。治療の観点からは、有効量は、疾患の緩和、改善、安定化、回復若しくは進行の遅延、又は他の方法で疾患の病理学的結果を軽減するのに十分な量である。有効量は一般に、医師がケースバイケースで決定するものであり、当業者の技能の範囲内である。有効量を達成するための適切な投与量を決定する際、典型的にはいくつかの因子が考慮される。これらの因子としては、被験者の年齢、性別及び体重、治療される病態、病態の重篤度、並びに投与される抗原結合フラグメントの形態及び有効濃度が挙げられる。
【0111】
本発明の抗原特異的マルチＴＣＲ Ｔ細胞を使用する養子免疫療法では、１０，０００，０００～１０，０００，０００，０００の範囲の細胞用量を注入することができる。マルチＴＣＲ Ｔ細胞を被験体に投与すると、Ｔ細胞は、抗原依存性活性化プロセスを受ける場合がある。
【0112】
本開示は、細胞療法及び／又は研究のためのマルチＴＣＲ Ｔ細胞の製造方法を提供する。特定の態様において、方法は、エクスビボ細胞培養の時間を短縮することにより、マルチＴＣＲ Ｔ細胞の経済的な製造方法を提供する。特定の関連する態様において、本発明の方法は、増強された細胞傷害性効力を有するマルチＴＣＲ Ｔ細胞の製造を提供する。長期の細胞培養は、従来、特定の細胞タイプの転写及び表現型の変化を伴うものであった。培養中のＴ細胞の転写及び表現型の変化は十分明らかになっていないが、本開示は、長期培養中の細胞の意図しない変化が、観察された治療効果の低下や同種細胞で確認された製造バッチのばらつきを説明する可能性があることを認識する。例えば、Ｔ細胞の長期細胞培養は、エフェクター機能の喪失を反映する疲弊マーカーのレベルの上昇を引き起こし得る。例えば、長期培養は、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０の発現増加を伴う場合がある。更なる考察については、参照により組み込まれるＷｈｅｒｒｙ，２０１６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５（８）：４８６－４９９を参照されたい。エクスビボ製造を短縮することによって、本発明の方法は、治療上有効なＴ細胞の一貫した生成に有用である。
【0113】
したがって、一態様において、本開示は、Ｔ細胞を生成する方法を提供する。本方法は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の、マルチＴＣＲ Ｔ細胞へのインビトロ分化及び成熟を伴うプロセスを実施することを含むが、該プロセスは、第２のＴＣＲの導入の前又は後に続くマルチＴＣＲ Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖のインビトロステップを含まないという条件がある。特定の態様において、マルチＴＣＲ Ｔ細胞の活性化及び／又は増殖は、被験体への導入後にインビボで起こる。特定の態様において、活性化及び／又は増殖は、インビボ及びインビトロの両方で起こる。特定の態様において、マルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成する方法は、単一のインビトロ活性化及び／又は増殖ステップのみを含む。有利なことに、シングルＴＣＲ Ｔ細胞のみを作製する従来の方法における複数のインビトロ活性化及び／又はＴ細胞増殖ステップを省略することで、本発明の方法は、より短い時間でマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成することができ、増強された治療効力を有するＴ細胞を生成することができる。
【0114】
本発明の方法は、安全かつ有効な同種療法をもたらすのに有用である。いくつかの例において、方法は、製品の品質を確保するために、製造中の１つ以上の時点で細胞産物を特性決定することを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、第１及び／又は第２のＴＣＲの導入後にＴ細胞を分析して、Ｔ細胞によって発現される１つ以上のタンパク質を同定することを含む。１つ以上のタンパク質は、１つ以上のＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ、又はＣＤ４５ＲＡを含み得る。タンパク質は、ナイーブ幹細胞に関連するマーカーを含み得る。分析は、好ましくは、細胞表面タンパク質を分析するハイスループット法、例えば、ＦＡＣＳなどの、バルク中の個々の細胞における蛍光シグナルベースの方法を含む。本発明の特定の方法では、複数の分析ステップを使用して、第１のＴＣＲの導入、次いで第２のＴＣＲの導入を確実にする。
【0115】
オンデマンドで治療が可能であることは、同種細胞療法の１つの利点である。方法は、臨床応用前における細胞の製造を含み得るため、いくつかの好ましい方法は、Ｔ細胞を凍結保存することを含み得る。これは、マルチＴＣＲ Ｔ細胞を凍結保存することを含み得る。好ましい態様において、本発明の方法は、第１のＴＣＲの導入後にＨＳＣからＴ細胞を生成することを含む。得られたＴＣＲは必要になるまで凍結保存される。必要に応じて、特定の患者の抗原に特異的な第２のＴＣＲを保存されたＴＣＲに導入して、マルチＴＣＲを生成する。これにより、患者特異的なマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成するのに必要なリードタイムが劇的に短縮される。Ｔ細胞を凍結保存することは、該細胞が患者によって必要とされるまでの、細胞の安全かつ有効な保存に有用である。凍結保存は、細胞産物を患者に投与することができる臨床施設へ輸送するのにも有用である。いくつかの好ましい実施形態において、二重陽性Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）は、インビトロ活性化ステップを行うことなく凍結保存される。特定の態様において、第２のＴＣＲは、保存されたナイーブＴ細胞に導入される。第２のＴＣＲの導入後、細胞は、１つ以上の増殖、活性化、成熟、及び／又は保存ステップを受けることができる。
【0116】
過去１０年にわたって、免疫療法は新世代のがん治療となっている。特に、細胞ベースの細胞療法は非常に有望であることが示されている。その顕著な例が遺伝子改変養子Ｔ細胞療法であり、該療法は、特定の血液がんを効果的に標的とし、顕著な効力を有することが示されている。しかしながら、現在の治療用プロトコルのほとんどは、自己養子細胞移入からなり、患者から採取された免疫細胞が加工され、この１人の患者を治療するために使用される。このようなアプローチは、コストが掛かり、製造に手間が掛かり、必要とする全ての患者に広く送達することが困難である。本明細書に記載される方法による同種免疫細胞産物は、大規模に製造することができ、より多数の患者を治療するために容易に流通させることができるため、大きな需要がある。
【0117】
いくつかの実施形態は、複数のＴＣＲを有する遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞又は遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞の集団に関する。少なくともいくつかの場合において、遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞は、少なくとも１つの遺伝子改変Ｔ細胞受容体を含む。特定の態様において、該細胞は、２つ以上の遺伝子改変ＴＣＲを含む。あるいは、又は更に、該細胞は、内在性ＴＣＲ及び１つ以上の遺伝子改変ＴＣＲを含む。細胞に関連して論じられる任意の実施形態は、そのような細胞の集団に適用することができる。特定の実施形態において、遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞は、以下：ｉ）インバリアントアルファＴ細胞受容体コード配列の全部若しくは一部；ｉｉ）インバリアントベータＴ細胞受容体コード配列の全部若しくは一部、又はｉｉｉ）追加の導入遺伝子、のうちの１つ、２つ、及び／又は３つを含む核酸を含む。更なる実施形態において、以下：ｉ）インバリアントアルファＴＣＲの全部若しくは一部；ｉｉ）インバリアントベータＴＣＲの全部若しくは一部、及び／又はｉｉｉ）追加の導入遺伝子、をコードする配列を有する核酸を含む遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞が存在する。本発明の特定の方法において、これらのｉＮＫＴ細胞に１つ以上の追加のＴＣＲが導入される。
【0118】
特定の態様において、遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞は、増加したレベルのＮＫ活性化受容体、減少したレベルのＮＫ阻害性受容体、及び／又は増加したレベルの細胞傷害性分子を発現するように遺伝子改変される。いくつかの実施形態において、ＮＫ活性化受容体は、ＮＫＧ２Ｄ及び／又はＤＮＡＭ－１を含む。いくつかの実施形態において、細胞傷害性分子は、パーフォリン及び／又はグランザイムＢを含む。いくつかの実施形態において、阻害性受容体は、ＫＩＲを含む。増加又は減少は、健康な個体から単離された非遺伝子改変ｉＮＫＴにおける同じマーカーのレベルに対するものであり得る。更なる態様は、遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞の集団に関し、細胞の集団は、増加したレベルのＮＫ活性化受容体、減少したレベルのＮＫ阻害性受容体、及び／又は増加したレベルの細胞傷害性分子を有する。
【0119】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞は、非相同（heterologous）プロモーターの制御下にある核酸を含み、これは、該プロモーターが、核酸の転写を制御する同じゲノムプロモーターではないことを意味する。遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞は、１つ以上のコード配列を含む外来性核酸を含み、その一部又は全部が、本明細書に記載される多くの実施形態において非相同プロモーターの制御下にあることが企図される。
【0120】
特定の実施形態において、少なくとも１つのインバリアントナチュラルキラーＴ細胞受容体（ｉＮＫＴ ＴＣＲ）及び第２の導入ＴＣＲ、並びに自殺遺伝子を発現する遺伝子改変インバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞が存在し、該少なくとも１つのｉＮＫＴ ＴＣＲは、外来性核酸から、及び／又は組換え改変プロモーター領域の転写制御下にある内在性インバリアントＴＣＲ遺伝子から発現される。ｉＮＫＴ ＴＣＲは、「ＣＤ１ｄ分子によって提示される脂質抗原を認識するＴＣＲ」を指す。ｉＮＫＴ ＴＣＲは、アルファ－ＴＣＲ、ベータ－ＴＣＲ、又はその両方を含み得る。いくつかの例において、利用されるＴＣＲは、ＭＡＩＴ細胞ＴＣＲ、ＧＥＭ細胞ＴＣＲ、又はガンマ／デルタＴＣＲなどの「インバリアントＴＣＲ」のより広い群に属することができ、その結果、ＨＳＣ遺伝子改変ＭＡＩＴ細胞、ＧＥＭ細胞、又はガンマ／デルタＴ細胞がそれぞれ得られる。
【0121】
特定の実施形態において、自殺遺伝子は酵素ベースである。これは自殺遺伝子の遺伝子産物が酵素であり、自殺機能が酵素活性に依存することを意味する。１つ以上の自殺遺伝子が、単一の細胞又はクローン集団において利用され得る。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、カルボキシペプチダーゼＧ２、シトクロムＰ４５０、リナマラーゼ、ベータ－ラクタマーゼ、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、カルボキシペプチダーゼＡ、又は誘導性カスパーゼ９をコードする。米国特許第８６２８７６７号、米国特許出願公開第２０１４０３６９９７９号、米国特許第２０１４０２４２０３３号、及び米国特許第２００４００１４１９１号（これらは全て、参照によりその全体が組み込まれる）に記載されるものなどの、自殺遺伝子使用のための当技術分野における方法を用いることができる。
【0122】
更なる実施形態において、ＴＫ遺伝子はウイルスＴＫ遺伝子、すなわち、ウイルス由来のＴＫ遺伝子である。特定の実施形態において、ＴＫ遺伝子は、単純ヘルペスウイルスＴＫ遺伝子である。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子産物は基質によって活性化される。チミジンキナーゼは、ガンシクロビル、ペンシクロビル、又はそれらの誘導体によって活性化される自殺遺伝子産物である。特定の実施形態において、自殺遺伝子産物を活性化する基質は、検出されるように標識されている。いくつかの例において、基質は、イメージングのために標識され得る。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子産物は、ＴＣＲ－アルファ又はＴＣＲ－ベータの一方又は両方をコードする、同じ又は異なる核酸分子によってコードされ得る。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ｓｒ３９ＴＫ又は誘導性カスパーゼ９である。別の実施形態において、細胞は外来性自殺遺伝子を発現しない。いくつかの実施形態において、遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞は、アルファ－ガラクトシルセラミド（ａ－ＧＣ）に特異的に結合する。
【0123】
更なる実施形態において、本発明の方法によって生成されるマルチＴＣＲ Ｔ細胞は、少なくとも１つのＨＬＡ－Ｉ又はＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現がないか、又は低下したＴ細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－Ｐ分子の表面発現がないことは、個々のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ分子をコードする遺伝子を破壊することによって、又は全てのＨＬＡ－Ｉ複合体分子の共通成分であるＢ２Ｍ（ベータ２ミクログロブリン）をコードする遺伝子を破壊することによって、又は全てのＨＬＡ－ＩＩ遺伝子の発現を制御する重要な転写因子であるＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ主要組織適合性複合体トランス活性化因子）をコードする遺伝子を破壊することによって達成される。特定の実施形態において、細胞は、１つ以上のＨＬＡ－Ｉ及び／又はＨＬＡ－ＩＩ分子の表面発現がないか、又はそのような分子の発現レベルが（少なくとも）５０、６０、７０、８０、９０、１００％（又はその中から導き出せる任意の範囲）低下している。いくつかの実施形態において、ｉＮＫＴ細胞が遺伝子編集によって操作されたため、ＨＬＡ－Ｉ又はＨＬＡ－ＩＩは該細胞において発現されない。
【0124】
いくつかの実施形態において、ｉＮＫＴ細胞は、細胞に導入された１つ以上の組換えベクター又は１つ以上の組換えベクター由来の核酸配列を含む。特定の態様において、ｉＮＫＴ細胞は、製造プロセス中の異なる時点で導入された２つ以上の組換えベクターを含む。特定の実施形態において、組換えベクターは、ウイルスベクターである、又はウイルスベクターであった。更なる実施形態において、ウイルスベクターは、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、又はアデノウイルスである、又はそれらのウイルスであった。特定のウイルスベクターの核酸は、宿主ゲノム配列に組み込まれることが理解される。
【0125】
「ベクター」又は「コンストラクト」（遺伝子送達又は遺伝子導入「ビヒクル」と呼ばれることもある）は、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む高分子、分子の複合体、又はウイルス粒子を指す。ポリヌクレオチドは直鎖状分子であってもよく、環状分子であってもよい。ベクターの一般的なタイプである「プラスミド」は、染色体ＤＮＡから独立して複製することができる、染色体ＤＮＡから分離した染色体外ＤＮＡ分子である。特定の場合において、プラスミドは環状の二本鎖である。
【0126】
特定のタンパク質を「コードする」「遺伝子」、「導入遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「フラグメント」、又は「導入遺伝子」は、適切な制御配列の制御下に置かれた場合、インビトロ又はインビボで、転写され、任意選択で遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）に翻訳される核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡのいずれかの形態で存在し得る。ＤＮＡの形態で存在する場合、核酸分子は、一本鎖（すなわち、センス鎖）又は二本鎖であり得る。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドン及び３’（カルボキシ）末端の翻訳停止コドンによって決定される。遺伝子には、原核生物又は真核生物のｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物のＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列が含まれ得るが、これらに限定されない。転写終結配列は通常、遺伝子配列の３’側に位置する。
【0127】
本明細書において「細胞」という用語は、当技術分野において最も広い意味で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、外部から隔離する膜構造によって取り囲まれ、自己複製能を有し、遺伝情報及び該遺伝情報を発現する機構を有する生体を指す。本明細書中で使用される細胞は、天然に存在する細胞又は人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子組換えされた細胞など）であり得る。
【0128】
ｉＮＫＴ細胞は、マウスからヒトまで高度に保存されているアルファベータＴリンパ球の小集団である。ｉＮＫＴ細胞は、がん、感染症、アレルギー、及び自己免疫を含む多くの疾患の制御において重要な役割を果たすことが示唆されている。刺激を受けると、ｉＮＫＴ細胞は細胞集団として及び単細胞レベルでの両方で、ＩＦＮ－ガンマやＩＬ－４などのエフェクターサイトカインを迅速に大量に放出する。次いで、これらのサイトカインは、自然免疫系のナチュラルキラー細胞及び樹状細胞（ＤＣ）などの様々な免疫エフェクター細胞、並びに活性化ＤＣを介した適応免疫系のＣＤ４ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８細胞傷害性従来型アルファベータＴ細胞を活性化する。ｉＮＫＴ細胞はその特有の活性化機構により、抗原やＭＨＣ拘束性とは無関係に複数の疾患を攻撃することができ、魅力的な万能治療薬となっている。
【0129】
これまで、主にがんを標的とする一連のｉＮＫＴ細胞ベースの臨床試験が行われてきた。最近の臨床試験では、頭頸部扁平上皮がん患者において抗腫瘍免疫が促進されたことが報告され、ｉＮＫＴ細胞ベースの免疫療法の可能性を証明した。しかしながら、現在までのほとんどの臨床試験は、内在性ｉＮＫＴ細胞の直接活性化又はエクスビボ増殖に基づいているため、少数の患者に対する短期間の限られた臨床的利益しかもたらさず、十分な結果は得られていない。ヒトのｉＮＫＴ細胞は存在比率が低くばらつきが大きいこと（血中約０．０１～１％）、また活性化後に急速に枯渇することが、これらの試験の成功を阻む大きな障害になっていると考えられている。
【0130】
ｉＮＫＴ細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から遺伝子改変されている。参照により組み込まれる米国特許第８，９４５，９２２号を参照されたい。ｉＰＳ細胞は、外来性核リプログラミング因子であるＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃなどを体細胞に導入することにより作製される。残念ながら、外来性核リプログラミング因子の転写レベルは、細胞が多能性状態に移行するにつれて低下するため、安定したｉＰＳ細胞株の生産効率が低下する可能性がある。更に、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃは発がんにつながるがん遺伝子であるため、外来性核リプログラミング因子の転写がｉＰＳ細胞で再開され、ｉＰＳ細胞由来の細胞から新生物発生を引き起こす可能性がある。
【0131】
本発明の方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１７０２８３４８１（Ａ１）号及び国際特許出願第２０１９２４１４００号（それぞれ参照により組み込まれる）に論じられているように、ｉＮＫＴ細胞を生成するために使用することができる。
【0132】
一例として、いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＣＤ４／ＤＮ／ＣＤ８サブセット又はＴｈ１、Ｔｈ２、若しくはＴｈ１７サイトカインを生成するサブセットなどのｉＮＫＴ細胞のサブセットから得られる１つ以上のｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸配列を含み、二重陰性ｉＮＫＴ細胞を含むｉＮＫＴ細胞を生成する。いくつかの実施形態において、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸配列は、がん、例えば、黒色腫、腎臓がん、肺がん、前立腺がん、乳がん、リンパ腫、白血病、血液悪性腫瘍などに罹患していた、又は罹患しているドナーのｉＮＫＴ細胞から得られる。いくつかの実施形態において、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、１つのｉＮＫＴ細胞由来のＴＣＲアルファ配列と、異なるｉＮＫＴ細胞由来のＴＣＲベータ配列とを有する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ配列が得られるｉＮＫＴ細胞、及びＴＣＲベータ配列が得られるｉＮＫＴ細胞は、同じドナーから得られる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ配列が得られるｉＮＫＴ細胞のドナーは、ＴＣＲベータ配列が得られるｉＮＫＴ細胞のドナーとは異なる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ配列及び／又はＴＣＲベータ配列は、発現のためにコドン最適化される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲアルファ配列及び／又はＴＣＲベータ配列は、未改変配列によってコードされるポリペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、及び／又は切断を有するポリペプチドをコードするように改変される。いくつかの実施形態において、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、ＣＤ１ｄ上に提示されたアルファ－ガラクトシルセラミド（アルファ－ＧａｌＣｅｒ）を認識するＴ細胞受容体をコードする。いくつかの実施形態において、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子は、発現ベクターに含有される。いくつかの実施形態において、発現ベクターはレンチウイルス発現ベクターである。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、ｉＮＫＴ ＴＣＲ核酸分子でＭＩＧベクターのＩＲＥＳ－ＥＧＦＰセグメントを置換したＭＩＧベクターである。いくつかの実施形態において、発現ベクターはｐｈｉＮＫＴ－ＥＧＦＰである。
【0133】
いくつかの実施形態において、核酸は、本明細書において論じられるようなα－ＴＣＲ及び／又はβ－ＴＣＲをコードする核酸配列を含んでもよい。特定の実施形態において、１つの核酸がα－ＴＣＲ及びβ－ＴＣＲの両方をコードする。更なる実施形態において、核酸は、自殺遺伝子産物をコードする核酸配列を更に含む。いくつかの実施形態において、選択されたＣＤ３４＋細胞に導入される核酸分子は、α－ＴＣＲ、β－ＴＣＲ、及び自殺遺伝子産物をコードする。他の実施形態において、方法はまた、自殺遺伝子産物をコードする核酸を選択されたＣＤ３４＋細胞に導入することを含み、この場合、ＴＣＲ遺伝子の少なくとも１つをコードする核酸とは異なる核酸分子が自殺遺伝子産物をコードする。
【0134】
遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞及びｉＮＫＴ細胞集団を調製、作製、製造、及び使用する方法が提供される。方法は、実施形態において、以下のステップのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれ以上を含む：造血細胞を得ること；造血前駆細胞を得ること；１つ以上の造血細胞になることが可能な前駆細胞を得ること；ｉＮＫＴ細胞になることが可能な前駆細胞を得ること；１つ以上の細胞表面マーカーを使用して、混合細胞の集団から細胞を選択すること；細胞集団からＣＤ３４＋細胞を選択すること；細胞集団からＣＤ３４＋細胞を単離すること；ＣＤ３４＋細胞とＣＤ３４－細胞とを互いに分離すること；ＣＤ３４以外の又はＣＤ３４に追加した細胞表面マーカーに基づいて細胞を選択すること；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つ以上の核酸を細胞に導入すること；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードするウイルスベクターを細胞に感染させること；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする１つ以上の核酸を細胞にトランスフェクトすること；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする発現コンストラクトを細胞にトランスフェクトすること；ｉＮＫＴ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする外来性核酸を細胞のゲノムに組み込むこと；自殺遺伝子産物をコードする１つ以上の核酸を細胞に導入すること；自殺遺伝子産物をコードするウイルスベクターを細胞に感染させること；自殺遺伝子産物をコードする１つ以上の核酸を細胞にトランスフェクトすること；自殺遺伝子産物をコードする発現コンストラクトを細胞にトランスフェクトすること；自殺遺伝子産物をコードする外来性核酸を細胞のゲノムに組み込むこと；遺伝子編集のために、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸、及び／又は核酸分子を細胞に導入すること；遺伝子編集のために、１つ以上のポリペプチド及び／又は核酸分子をコードするウイルスベクターを細胞に感染させること；遺伝子編集のために、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸、及び／又は核酸分子を細胞にトランスフェクトすること；遺伝子編集のために、１つ以上のポリペプチド及び／又は核酸分子をコードする発現コンストラクトを細胞にトランスフェクトすること；遺伝子編集のために、１つ以上のポリペプチドをコードする外来性核酸、及び／又は核酸分子を組み込むこと；細胞のゲノムを編集すること；細胞のプロモーター領域を編集すること；ｉＮＫＴ ＴＣＲ遺伝子のプロモーター及び／又はエンハンサー領域を編集すること；１つ以上の遺伝子の発現を抑制すること；単離されたヒトＣＤ３４＋細胞における１つ以上のＨＬＡ－Ｉ／ＩＩ遺伝子の発現を抑制すること；遺伝子編集のために、１つ以上の核酸を細胞にトランスフェクトすること；単離又は選択された細胞を培養すること；単離又は選択された細胞を増殖させること；１つ以上の細胞表面マーカーで選択された細胞を培養すること；ｉＮＫＴ ＴＣＲを発現する単離されたＣＤ３４＋細胞を培養すること；単離されたＣＤ３４＋細胞を増殖させること；ｉＮＫＴ細胞を生成又は増殖させる条件下で細胞を培養すること；人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系において細胞を培養して、ｉＮＫＴ細胞を生成すること；無血清培地で細胞を培養すること；ＡＴＯ系において細胞を培養することであって、ＡＴＯ系が、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む３Ｄ細胞凝集体と、無血清培地とを含む、ＡＴＯ系において細胞を培養すること。一実施形態において、１つ以上のステップが除外されてもよいことが特に企図される。
【0135】
遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞を作製するために使用され得る細胞は、造血前駆幹細胞である。細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、又はそれらの組み合わせから得てもよい。本開示は、「ＨＳＣ－ｉＮＫＴ細胞」、造血幹細胞（ＨＳＣ）及び／又は造血前駆細胞（ＨＰＣ）から遺伝子改変されたインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞、並びにそれらを作製及び使用する方法を包含する。本明細書で使用される場合、「ＨＳＣ」は、ＨＳＣ、ＨＰＣ、又はＨＳＣ及びＨＰＣの両方を指すために使用される。「造血幹細胞及び前駆細胞」又は「造血前駆細胞」は、造血系列にコミットしているが、更なる造血分化が可能である細胞を指し、造血幹細胞、多能性造血幹細胞（造血芽細胞）、骨髄前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、及びリンパ系前駆細胞を含む。「造血幹細胞（ＨＳＣ）」は、骨髄系（単球及びマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、並びにリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての血液細胞タイプを生み出す多能性幹細胞である。本開示において、ＨＳＣは、「造血幹細胞及び前駆細胞」と「造血前駆細胞」の両方を指す。造血幹細胞及び造血前駆細胞は、ＣＤ３４を発現してもよく、発現しなくてもよい。造血幹細胞は、ＣＤ１３３を共発現してもよく、ＣＤ３８発現に対して陰性、ＣＤ９０に対して陽性、ＣＤ４５ＲＡに対して陰性、細胞系マーカーに対して陰性、又はそれらの組み合わせであってもよい。造血前駆細胞／前駆細胞には、ＣＤ３４（＋）／ＣＤ３８（＋）細胞及びＣＤ３４（＋）／ＣＤ４５ＲＡ（＋）／ｌｉｎ（－）ＣＤ１０＋（リンパ系共通前駆細胞）、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ｌｉｎ（－）ＣＤ１０（－）ＣＤ６２Ｌ（ｈｉ）（リンパ系刺激多能性前駆細胞）、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ｌｉｎ（－）ＣＤ１０（－）ＣＤ１２３＋（顆粒球－単球前駆細胞）、ＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ｌｉｎ（－）ＣＤ１０（－）ＣＤ１２３＋（骨髄性共通前駆細胞）、又はＣＤ３４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ｌｉｎ（－）ＣＤ１０（－）ＣＤ１２３－（巨核球－赤血球前駆細胞）が含まれる。
【0136】
特定の方法は、１つ以上の核酸を細胞に導入する前に、選択されたＣＤ３４＋細胞を培地中で培養することを含む。細胞を培養することは、選択されたＣＤ３４＋細胞を、１つ以上の増殖因子を含む培地と共にインキュベートすることを含み得る。いくつかの実施形態において、１つ以上の増殖因子は、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、及び／又はヒトトロンボポエチン（ＴＰＯ）を含む。更なる実施形態において、培地は、ｃ－ｋｉｔリガンド、ｆｌｔ－３リガンド、及びＴＰＯを含む。いくつかの実施形態において、各増殖因子、又はこれらの特定の増殖因子の、任意の及び全ての合計のいずれかに関して、１つ以上の増殖因子の濃度は約５ｎｇ／ｍＬ～約５００ｎｇ／ｍＬである。培地中における単一の増殖因子又は増殖因子の組み合わせの濃度は、約、少なくとも約、又は多くとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４１０、４２０、４２５、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４７５、４８０、４９０、５００（又は導き出せる任意の範囲）ｎｇ／ｍＬ又はｍｇ／ｍＬ以上であり得る。
【0137】
いくつかの実施形態において、細胞は、無細胞培地で培養される。特定の実施形態において、無血清培地は、外部から添加されたアスコルビン酸を更に含む。特定の実施形態において、方法は、アスコルビン酸を培地に添加することを含む。更なる実施形態において、無血清培地は、以下の外部添加成分：ＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、インターフェロン－ガンマ、インターフェロン－ラムダ、ＴＳＬＰ、チモペンチン、プレイオトロフィン、又はミッドカインのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６種全て（又はその中から導き出せる任意の範囲）を更に含む。更なる実施形態において、無血清培地は、１つ以上のビタミンを含む。いくつかの場合において、無血清培地は、以下のビタミン：ビオチン、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、塩化コリン、パントテン酸カルシウム、パントテン酸、葉酸ニコチンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、イノシトール、ビタミンＢ１２、又はこれらの塩のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２種（又はその中から導き出せる任意の範囲）を含む。特定の実施形態において、培地は、ビオチン、ＤＬアルファ酢酸トコフェロール、ＤＬアルファ－トコフェロール、ビタミンＡ、又はそれらの組み合わせ若しくは塩を含む、又は少なくとも含む。更なる実施形態において、無血清培地は、１つ以上のタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、無血清培地は、以下のタンパク質：アルブミン若しくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＢＳＡの画分、カタラーゼ、インスリン、トランスフェリン、スーパーオキシドジスムターゼ、又はそれらの組み合わせのうちの１、２、３、４、５、６、又はそれ以上（又はその中から導き出せる任意の範囲）を含む。他の実施形態において、無血清培地は、以下の化合物：コルチコステロン、Ｄ－ガラクトース、エタノールアミン、グルタチオン、Ｌ－カルニチン、リノール酸、リノレン酸、プロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、若しくはトリヨード－Ｉ－チロニン、又はそれらの組み合わせのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１種を含む。更なる実施形態において、無血清培地は、Ｂ－２７サプリメント、ゼノフリーＢ－２７サプリメント、ＧＳ２１ＴＭサプリメント、又はそれらの組み合わせを含む。更なる実施形態において、無血清培地は、アミノ酸、単糖類、及び／又は無機イオンを含む、又は更に含む。いくつかの態様において、無血清培地は、以下のアミノ酸：アルギニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、グルタミン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン、若しくはバリン、又はそれらの組み合わせのうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、若しくは１３種を含む。他の態様において、無血清培地は、以下の無機イオン：ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、窒素、若しくはリン、又はそれらの組み合わせ若しくは塩のうちの１、２、３、４、５、又は６種を含む。更なる態様において、無血清培地は、以下の元素：モリブデン、バナジウム、鉄、亜鉛、セレン、銅、若しくはマンガン、又はそれらの組み合わせのうちの１、２、３、４、５、６、若しくは７種を含む。
【0138】
いくつかの方法において、細胞は、人工胸腺オルガノイド（ＡＴＯ）系において培養される。ＡＴＯ系は、細胞の凝集体である三次元（３Ｄ）細胞凝集体を含む。特定の実施形態において、３Ｄ細胞凝集体は、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する間質細胞の選択された集団を含む。いくつかの実施形態において、３Ｄ細胞凝集体は、ＣＤ３４＋形質導入細胞を、物理的マトリックス又は足場上の間質細胞の選択された集団と混合することによって作製される。更なる実施形態において、方法は、ＣＤ３４＋形質導入細胞及び間質細胞を遠心分離して、物理的マトリックス又は足場上に配置される細胞ペレットを形成することを含む。特定の実施形態において、間質細胞は、インタクトな、部分的な、若しくは改変されたＤＬＬ１、ＤＬＬ４、ＪＡＧ１、ＪＡＧ２、又はそれらの組み合わせであるＮｏｔｃｈリガンドを発現する。更なる実施形態において、ＮｏｔｃｈリガンドはヒトＮｏｔｃｈリガンドである。他の実施形態において、ＮｏｔｃｈリガンドはヒトＤＬＬ１である。
【0139】
細胞は直ちに使用されてもよく、又は将来の使用のために保存されてもよい。特定の実施形態において、ｉＮＫＴ細胞を作製するために使用される細胞は凍結されているが、作製されたｉＮＫＴ細胞はいくつかの実施形態において凍結されてもよい。特定の態様において、細胞は、デキストロース、１つ以上の電解質、アルブミン、デキストラン、及びＤＭＳＯを含む溶液中にある。他の実施形態において、細胞は、無菌、非発熱性、及び等張性の溶液中にある。いくつかの実施形態において、遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞は造血幹細胞に由来する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞は、Ｇ－ＣＳＦ動員ＣＤ３４＋細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は、がんを有しないヒト患者の細胞に由来する。いくつかの実施形態において、細胞は内在性ＴＣＲを発現しない。
【0140】
遺伝子改変ｉＮＫＴ細胞は、患者を治療するために使用され得る。いくつかの実施形態において、方法は、１つ以上の追加の核酸を細胞集団に導入することを含み、該細胞集団は、あらかじめ凍結及び解凍されていてもよく、されていなくてもよい。この使用は、既製のｉＮＫＴ細胞を作製する利点の１つをもたらす。特定の実施形態において、１つ以上の追加の核酸は、１つ以上の治療用遺伝子産物をコードする。治療用遺伝子産物の例としては、少なくとも、１．抗原認識分子、例えばＣＡＲ（キメラ抗原受容体）及び／又はＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）；２．共刺激分子、例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＣＯＳ；及び／又は３．サイトカイン、例えばＩＬ－ｌｃｃ、ＩＬ－Ｉｂ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦ－ａ、ＴＧＦ－ｂ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ；４．転写因子、例えばＴ－ｂｅｔ、ＧＡＴＡ－３、ＲＯＲｙｔ、ＦＯＸＰ３、Ｂｃｌ－６が挙げられる。治療用抗体は、キメラ抗原受容体、一本鎖抗体、モノボディ、ヒト化抗体、二重特異性抗体、一本鎖ＦＶ抗体又はそれらの組み合わせとして含まれる。
【0141】
いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子改変細胞又は組成物を被験体に送達するための薬物送達デバイス、例えば注射器と共にパッケージングされた、本発明による１つ以上の遺伝子改変細胞又は組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、遺伝子改変細胞を培養及び／又は保存するための１つ以上の試薬と共にパッケージングされた、本発明による１つ以上の遺伝子改変細胞又は組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、細胞、例えば、ＣＡＲ及び少なくとも１つの追加の導入遺伝子を含むｉＮＫＴ細胞を活性化する１つ以上の薬剤と共にパッケージングされた、本発明による１つ以上の遺伝子改変細胞又は組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、ＯＰ９－ＤＬ１間質細胞及び／又はＭＳ５－ＤＬ４間質細胞と共にパッケージングされた、本発明による１つ以上の遺伝子改変細胞又は組成物を含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、抗原提示細胞又はＣＤ１ｄ発現人工抗原提示細胞と共にパッケージングされた、本発明による１つ以上の遺伝子改変細胞又は組成物を含むキットを提供する。
【0142】
本発明の方法は、任意の数の病態及び／又は疾患を治療するための遺伝子改変細胞を製造する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、被験体を治療する方法であって、本発明による１つ以上の遺伝子改変細胞、本発明の方法に従って作製された１つ以上の遺伝子改変細胞、本発明による１つ以上の組成物を被験体に投与することを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体は、マウス又は実験動物などの動物である。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである。いくつかの実施形態において、被験体は、がん、細菌感染、ウイルス感染、アレルギー、又は自己免疫疾患を有する。いくつかの実施形態において、がんは、黒色腫、腎臓がん、肺がん、前立腺がん、乳がん、リンパ腫、白血病、又は血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態において、被験体は、結核、ＨＩＶ、又は肝炎を有する。いくつかの実施形態において、被験体は、喘息又は湿疹を有する。いくつかの実施形態において、被験体は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、又は関節炎を有する。いくつかの実施形態において、被験体は、治療有効量の１つ以上の遺伝子改変細胞を投与される。いくつかの実施形態において、１つ以上の遺伝子改変細胞の治療有効量は、治療される被験体の体重１ｋｇ当たり約１０×１０７～約１０×１０９細胞である。いくつかの実施形態において、本方法は、１つ以上の遺伝子改変細胞の投与前、投与中、及び／又は投与後に、ｉＮＫＴ細胞を活性化する薬剤、例えば、α－ＧａｌＣｅｒ又はその塩若しくはエステル、α－ＧａｌＣｅｒ提示樹状細胞又は人工ＡＰＣを投与することを更に含む。
【0143】
「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、免疫エフェクター細胞に任意の特異性を融合させる、遺伝子改変受容体を指す。これらの受容体は、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に融合させるために使用され、そのコード配列の移入はレトロウイルスベクター又はレンチウイルスベクターによって促進される。受容体は、異なる供給源による部分から構成されるため、キメラと呼ばれる。これらの分子の最も一般的な形態は、モノクローナル抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）とＣＤ３－ゼータ膜貫通ドメイン及びエンドドメイン、ＣＤ２８若しくは４１ＢＢ細胞内ドメイン、又はそれらの組み合わせとの融合である。このような分子は、ｓｃＦｖによる標的の認識に応答してシグナルを伝達する。このようなコンストラクトの例としては、ハイブリドーマ１４ｇ２ａ由来のｓｃＦｖ（ジシアロガングリオシドＧＤ２を認識する）との融合体である１４ｇ２ａ－Ｚｅｔａがある。Ｔ細胞がこの分子を発現すると（例えば、オンコレトロウイルスベクター形質導入によって達成される）、Ｔ細胞はＧＤ２を発現する標的細胞（例えば、神経芽腫細胞）を認識し、殺傷する。悪性Ｂ細胞を標的とするために、研究者らは、Ｂ系列分子ＣＤ１９に特異的なキメラ免疫受容体を用いてＴ細胞の特異性をリダイレクトした。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域が柔軟なリンカーによって融合され、ｓｃＦｖを形成する。このｓｃＦｖの前にはシグナルペプチドがあり、新生タンパク質を小胞体に導き、その後表面発現させる（これは切断される）。柔軟なスペーサーにより、ｓｃＦｖは抗原結合を可能にするために様々な方向に向きを変えことができる。膜貫通ドメインは典型的な疎水性アルファへリックスで、通常はシグナル伝達エンドドメインの元の分子に由来し、細胞内に突出して所望のシグナルを伝達する。
【0144】
特定の態様において、本発明は、ＨＳＣからＣＡＲ Ｔ細胞を生成する方法を提供する。本方法は、ＨＳＣに第１のＴＣＲを導入して、Ｔ細胞、好ましくはガンマデルタＴ細胞又はｉＮＫＴ細胞を生成することを含み得る。続いて、Ｔ細胞にＣＡＲ又は第２のＴＣＲ及びＣＡＲを導入する。結果として、ＴＣＲ及びＣＡＲ、又はマルチＴＣＲ及びＣＡＲ細胞が生成される。
【0145】
好ましくは、ＣＡＲは、特定の腫瘍抗原に指向する。ＣＡＲが指向し得る腫瘍抗原の例としては、例えば、少なくとも５Ｔ４、８Ｈ９、ａｎｂｂインテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＥｐＣＡＭを含むＥＧＦＲファミリー、葉酸受容体－ａ、ＦＡＰ、ＦＢＰ、胎児型ＡｃｈＲ、ＦＲｃｃ、ＧＤ２、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＧＤ３、グリピカン－３（ＧＰＣ３）、Ｈｅｒ２、ＩＬ－ｌ３Ｒｃｘ２、ラムダ、ルイス－Ｙ、カッパ、ＫＤＲ、ＭＡＧＥ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃｌ、Ｍｕｃｌ６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＰ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、がん胎児性抗原、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＡＦＰ、ＣＡ－１２５、ＥＴＡ、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ、ラミニン受容体、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＢＩＮＧ－４、カルシウム活性化塩素チャネル２、Ｃｙｃｌｉｎ－Ｂｌ、９Ｄ７、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、ＳＡＰ－ｌ、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＮＹ－ＥＳＯ－ｌ／ＬＡＧＥ－ｌ、ＰＡＭＥ、ＳＳＸ－２、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１、ＧＰｌ００／ｐｍｅｌｌ７、ＴＲＰ－１／－２、Ｐ．ポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原、ｂ－カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ＭＡＲＴ－２、ＴＧＦ＾ＲＩＩ、又はＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ２）が挙げられる。ＣＡＲは、第１、第２、第３、又はそれ以上の世代のＣＡＲであり得る。ＣＡＲは、任意の２つの非同一抗原に対して二重特異的であってもよく、又は３つ以上の非同一抗原に対して特異的であってもよい。
【0146】
特定の態様において、本開示は、増強された抗腫瘍表現型を有するマルチＴＣＲ Ｔ細胞を含むＴ細胞を生成するためのシステム及び方法を提供する。特に、本開示は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、第２のＴＣＲ及び／又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む複数の導入遺伝子、並びに少なくとも１つの追加導入遺伝子で遺伝子改変された幹細胞（例えば、ＨＳＣ）からＴ細胞を作製する方法を提供する。ＨＳＣを出発物質とすることによって、本発明のシステム及び方法は、改善された抗腫瘍表現型を有するＴ細胞の製造のために、幹細胞の自己再生及び細胞分化能を利用する。特に、本開示は、第１のＴＣＲ、第２のＴＣＲ及び／又はＣＡＲ、並びに少なくとも１つの追加の導入遺伝子をコードする核酸をＣＤ３４＋幹細胞に導入することを提供する。ＴＣＲ及び／又はＴＣＲとＣＡＲの複合発現は、特異的がん細胞標的化特性を有するＴ細胞を提供するのに有用である。更に、少なくとも１つの追加の導入遺伝子を与えられたことで、本発明の方法によって生成されたＴ細胞は、標的がん細胞と接触したとき、がんの治療に有用なカーゴ（例えば、サイトカイン）を備える。
【0147】
例えば、好ましい実施形態において、本発明の方法は、レンチウイルス形質導入を介してＨＳＣに核酸を導入することを含み、これは、製造プロセス中の複数の時点で起こり得る。１つ以上の核酸の導入により、少なくとも第１のＴＣＲ、第２のＴＣＲ及び／又はＣＡＲ、並びに追加の導入遺伝子を発現するＨＳＣが得られる。追加の導入遺伝子の組み込みは、改善された機能的特性（例えば、改善された細胞増殖、持続性、安全性、及び／又は抗腫瘍活性）を有する治療用Ｔ細胞を提供するために有用である。
【0148】
１つ以上の追加の導入遺伝子は、サイトカイン、チェックポイント阻害因子、トランスフォーミング増殖因子ベータシグナル伝達の阻害因子、サイトカイン放出症候群の阻害因子、又は神経毒性の阻害因子のうちのいずれか１つ以上を含み得る。例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、又はＩＬ－２１のうちの１つ以上をコードする導入遺伝子が提供され得る。
【0149】
したがって、いくつかの例において、本発明の方法は、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１－１５のうちの１つ以上をコードする核酸を導入することによって、改善された増殖及び持続能を有するＴ細胞の製造を提供する。いくつかの例において、方法は、例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８のうちの１つ以上をコードする導入遺伝子の導入によって、増加したＩＦＮ－ｇ生成、したがって改善されたＴ細胞ポテンシーを有するＴ細胞を提供し得る。他の例において、本発明の方法は、ＩＬ－２１を含む導入遺伝子を導入することによってナイーブＴ細胞生成を増強するのに有用である。いくつかの例において、本明細書に記載される方法は、例えば、ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、又はサイトカイン放出症候群及び神経毒性の他のメディエーターの阻害因子を導入することによって、改善された安全性特性を有するＴ細胞の生成を提供する。方法は、例えば、ＴＧＦ－Ｂチェックポイントの阻害因子を介して、腫瘍微小環境に対抗するのに有用なペイロードをもたらすことによって、改善された効力を有するＣＡＲ Ｔ細胞を提供し得る。
【0150】
本発明の特定の方法は、単一のインビトロ活性化ステップを含む。いくつかの例において、Ｔ細胞は、例えば１～３日間、試薬で短時間活性化され、続いて、活性化試薬は、細胞を連続的に刺激せず、したがって細胞を疲弊させないように、培地から除去されることが多い。活性化後、活性化されたＴ細胞集団は、急速に、例えば、２４時間ごとに数が２倍に増殖し得る。増殖を促進するために、いくつかの試薬を添加してもよい。いくつかの実施形態において、本方法は、ＩＬ－７／１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２＋２１、ＩＬ－１２、又はＩＬ－１８のうちの１つ以上が添加され得る培養培地を含む。
【0151】
いくつかの例において、単一の活性化ステップは、ＰＭＢＣベースのＴ細胞活性化を含む。したがって、活性化ステップは、ａＧＣ担持ＰＢＭＣ、可溶性抗ＣＤ３／２８陽性ＰＢＭＣ、及び可溶性抗ＣＤ２／３／２８陽性ＰＢＭＣをＴ細胞（又はマルチＴＣＲ Ｔ細胞）に導入することを含み得る。いくつかの例において、活性化ステップは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベースのＴ細胞活性化ステップを含む。したがって、活性化ステップは、Ｔ細胞をＡＰＣに導入することを含み得る。ＡＰＣは、ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－ＣＡＲ－抗原を発現する遺伝子改変Ｋ５６２細胞であり得る。ＡＰＣは、ＡＰＣ＋ＣＤ１ｄ、及び／又はＡＰＣ＋ＣＤ１ｄ＋／－ａＧＣであり得る。他の例において、活性化ステップは、フィーダーフリーベースのＴ細胞活性化ステップを含む。フィーダーフリーベースのＴ細胞活性化ステップは、Ｔ細胞に、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ２／３／２８、ＣＤ３／２８を含む可溶性抗体を導入することを含み得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞活性化ステップは、活性化増殖培養培地に添加された異なるサイトカインＩＬ－７／１５、ＩＬ－２、ＩＬ－２＋２１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８の存在下でＴ細胞を培養することを含む。
【0152】
以下の実施例は、本発明の方法によって提供される、ＣＤ３４＋細胞からのＴ細胞及びマルチＴＣＲ Ｔ細胞（例えば、ｉＮＫＴ及びγδＴ細胞）を製造するための有用な例示的プロトコルを提供する。更なる実施例及び考察については、参照により組み込まれるＷＯ２０１９２４１４００Ａ１を参照されたい。
【0153】
実施例１：ＣＤ３４＋ＨＳＰＣ細胞培養及びレンチウイルス形質導入
－２日目：前刺激
１．２４ウェル非組織培養処理プレートの適当なウェル数（約１５×１０３細胞／ウェル又は０．１×１０６アリコートについて６ウェルを播種することが推奨される）を、ＰＢＳで希釈した２０μｇ／ｍＬレトロネクチン（ＲＮ）０．５ｍＬ／ウェルでコートする。１ｍｇ／ｍＬのＲＮストックアリコートは、６０マイクロリットルのアリコートで－２０℃において保存することができる。
２．室温（ＲＴ）で２時間（ｈ）インキュベートする。
３．ＲＮを吸引し、ＰＢＳで希釈した２％ＢＳＡ ０．５ｍＬ／ウェルで置換する。３０％ＢＳＡアリコートを－２０℃で保存する。
４．室温で３０分間インキュベートする。
５．吸引し、ＰＢＳ ０．５ｍＬ／ウェルで置換する。
６．標準的な手順に従ってＣＤ３４＋細胞の０．１×１０６アリコートを解凍して幹細胞培地に入れ、３００ｇで１０分間スピンする。
７．上清を吸引し、幹細胞培地に再懸濁し、血球計数器を使用して計数し、細胞計数を記録する。いくつかの例において、出願人は、０．１×１０６アリコートの細胞数は、少なすぎて信頼できないことを見出した。
８．ＣＤ３４＋細胞を幹細胞培地で０．０５×１０６細胞／ｍＬに希釈する。
９．ＲＮコートしたウェルからＰＢＳを吸引し、３００μＬ細胞／ウェル（約１５×１０３細胞／ウェル）を播種する。
１０．３７℃、５％ＣＯ２で１２～１８時間インキュベートする。
－２日目：前刺激
１．２４ウェル非組織培養処理プレートの適当なウェル数（約１５×１０３細胞／ウェル又は０．１×１０６アリコートについて６ウェルを播種することが推奨される）を、ＰＢＳで希釈した２０μｇ／ｍＬレトロネクチン（ＲＮ）０．５ｍＬ／ウェルでコートする。１ｍｇ／ｍＬのＲＮストックアリコートは、６０マイクロリットルのアリコートで－２０℃において保存することができる。
２．室温（ＲＴ）で２時間（ｈ）インキュベートする。
３．ＲＮを吸引し、ＰＢＳで希釈した２％ＢＳＡ ０．５ｍＬ／ウェルで置換する。３０％ＢＳＡアリコートを－２０℃で保存する。
４．室温で３０分間インキュベートする。
５．吸引し、ＰＢＳ ０．５ｍＬ／ウェルで置換する。
６．標準的な手順に従ってＣＤ３４＋細胞の０．１×１０６アリコートを解凍して幹細胞培地に入れ、３００ｇで１０分間スピンする。
７．上清を吸引し、幹細胞培地に再懸濁し、血球計数器を使用して計数し、細胞計数を記録する。いくつかの例において、出願人は、０．１×１０６アリコートの細胞数は、少なすぎて信頼できないことを見出した。
８．ＣＤ３４＋細胞を幹細胞培地で０．０５×１０６細胞／ｍＬに希釈する。
９．ＲＮコートしたウェルからＰＢＳを吸引し、３００μＬ細胞／ウェル（約１５×１０３細胞／ウェル）を播種する。
１０．３７℃、５％ＣＯ２で１２～１８時間インキュベートする。
【0154】
－１日目：形質導入
１．濃縮レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を解凍し、穏やかにピペッティングして混合する（ボルテックスせず、再凍結しない）。
２．形質導入チューブを準備する。
ａ．ＭＯＩが１００～２００になるのに十分な量を計算し、適量のＬＶＶを１．５ｍＬチューブに移す。
ｂ．適量のＰＧＥ２を同じチューブに添加して、全培養量の最終濃度が１０ｎＭとなるようにする。
ｃ．適量のポロキサマーを同じチューブに添加して、全培養量の最終濃度が１μｇ／μＬとなるようにする。
３．形質導入チューブの内容物を適切な培養ウェルに加え、プレートを穏やかに揺り動かして混合する。
４．細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。
１．濃縮レンチウイルスベクター（ＬＶＶ）を解凍し、穏やかにピペッティングして混合する（ボルテックスせず、再凍結しない）。
２．形質導入チューブを準備する。
ａ．ＭＯＩが１００～２００になるのに十分な量を計算し、適量のＬＶＶを１．５ｍＬチューブに移す。
ｂ．適量のＰＧＥ２を同じチューブに添加して、全培養量の最終濃度が１０ｎＭとなるようにする。
ｃ．適量のポロキサマーを同じチューブに添加して、全培養量の最終濃度が１μｇ／μＬとなるようにする。
３．形質導入チューブの内容物を適切な培養ウェルに加え、プレートを穏やかに揺り動かして混合する。
４．細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートする。
【0155】
０日目：収穫
１．穏やかにピペッティングすることによって細胞を収集してプレートから取り出し、コニカルチューブに移す。
２．同量の冷Ｘ－ＶＩＶＯ－１５でウェルを洗浄して、プレートにまだ付着している細胞を取り出し、コニカルチューブに移す。
３．顕微鏡で確認し、必要に応じて冷Ｘ－ＶＩＶＯ－１５で更に洗浄して、プレートから全ての細胞を収集する。
４．３００ｇで１０分間スピンし、上清を吸引する。
５．段階２（すなわち、実施例２）に進む。
１．穏やかにピペッティングすることによって細胞を収集してプレートから取り出し、コニカルチューブに移す。
２．同量の冷Ｘ－ＶＩＶＯ－１５でウェルを洗浄して、プレートにまだ付着している細胞を取り出し、コニカルチューブに移す。
３．顕微鏡で確認し、必要に応じて冷Ｘ－ＶＩＶＯ－１５で更に洗浄して、プレートから全ての細胞を収集する。
４．３００ｇで１０分間スピンし、上清を吸引する。
５．段階２（すなわち、実施例２）に進む。
【0156】
実施例２：ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の生成；分化
０～１４日目：分化（期間：２週間）
１．１２ウェル非組織培養処理プレートの適当なウェル数（１，０００～２，０００細胞／ウェル又は１２ウェル／１５，０００細胞を播種することが推奨される）を、ＰＢＳで１：２００に希釈された、ＳＴＥＭＣＥＬＬ社からＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で提供されているリンパ系分化材料などのリンパ系分化コーティング剤（ＬＤＣＭ）１ｍＬ／ウェルでコートする。４℃で１２～１８時間インキュベートする。
２．ＬＤＣＭを吸引し、２ｍＬ／ウェルのＰＢＳを添加する。
３．段階１（すなわち、実施例１）で収集された形質導入ＣＤ３４＋細胞を、ＳＴＥＭＣＥＬＬ社からＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で販売されているリンパ系前駆細胞増殖培地などのリンパ系前駆細胞増殖培地（ＬＰＥＭ）に再懸濁する。
４．ＬＰＥＭで細胞濃度を１～２×１０３細胞／ｍＬに調整する。
５．ＬＤＣＭコートプレートからＰＢＳを吸引する。
６．ＬＣＤＭコートプレートに０．７５ｍＬ細胞／ウェルを播種する。
７．細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
８．３日目に、新しいＬＰＥＭを０．２５ｍＬ／ウェル添加し、培養を継続する。
９．７日目及び１１日目に、細胞を乱すことなく０．５ｍＬ／ウェル未満を慎重に除去し、新しいＬＰＥＭ ０．５ｍＬ／ウェルを補充する。
１０．１４日目まで培養を続ける。
１１．段階３（すなわち、実施例３）に進む。
０～１４日目：分化（期間：２週間）
１．１２ウェル非組織培養処理プレートの適当なウェル数（１，０００～２，０００細胞／ウェル又は１２ウェル／１５，０００細胞を播種することが推奨される）を、ＰＢＳで１：２００に希釈された、ＳＴＥＭＣＥＬＬ社からＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で提供されているリンパ系分化材料などのリンパ系分化コーティング剤（ＬＤＣＭ）１ｍＬ／ウェルでコートする。４℃で１２～１８時間インキュベートする。
２．ＬＤＣＭを吸引し、２ｍＬ／ウェルのＰＢＳを添加する。
３．段階１（すなわち、実施例１）で収集された形質導入ＣＤ３４＋細胞を、ＳＴＥＭＣＥＬＬ社からＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で販売されているリンパ系前駆細胞増殖培地などのリンパ系前駆細胞増殖培地（ＬＰＥＭ）に再懸濁する。
４．ＬＰＥＭで細胞濃度を１～２×１０３細胞／ｍＬに調整する。
５．ＬＤＣＭコートプレートからＰＢＳを吸引する。
６．ＬＣＤＭコートプレートに０．７５ｍＬ細胞／ウェルを播種する。
７．細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
８．３日目に、新しいＬＰＥＭを０．２５ｍＬ／ウェル添加し、培養を継続する。
９．７日目及び１１日目に、細胞を乱すことなく０．５ｍＬ／ウェル未満を慎重に除去し、新しいＬＰＥＭ ０．５ｍＬ／ウェルを補充する。
１０．１４日目まで培養を続ける。
１１．段階３（すなわち、実施例３）に進む。
【0157】
実施例３：ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の生成；成熟
１４～２１日目以降：成熟（期間：１～２週間）
１．６ウェル非組織培養処理プレートの適当なウェル数（５０～１００×１０３／ウェルを播種することが推奨される）を、ＰＢＳで１：２００に希釈したＬＤＣＭ ２ｍＬ／ウェルでコーティングする。播種前日に調製する場合は４℃で１２～１８時間、播種当日に調製する場合は３７℃で２時間インキュベートする。
２．ＬＤＣＭを吸引し、４ｍＬ／ウェルのＰＢＳを添加する。
３．１４日目に、細胞生存率カウンター（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社からＶｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲの商品名で提供されている細胞生存率カウンター）を使用して、細胞を収穫及び計数する。
ａ．穏やかにピペッティングすることによって細胞を収集してプレートから取り出し、コニカルチューブに移す。
ｂ．１ｍＬ／４ウェルの冷ＳＦＥＭ ＩＩでウェルを洗浄して、プレートにまだ付着している細胞を取り出し、コニカルチューブに移す。
ｃ．顕微鏡で確認し、必要に応じて冷ＳＦＥＭ ＩＩで更に洗浄して、プレートから細胞を収集する。
４．０．２×１０６細胞のアリコートを分取し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。
５．適量の細胞を分取して、段階３のために播種し、３００ｇで１０分間ペレット化する。
６．上清を吸引する。
７．細胞を、Ｔ細胞前駆体成熟培地（ＴＰＭＭ）、例えば、ＳＴＥＭＣＥＬＬ社からＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で提供されているＴ細胞前駆体成熟培地に、２．５～５×１０４細胞／ｍＬで再懸濁する。
８．ＬＤＣＭコートプレートからＰＢＳを吸引する。
９．２ｍＬ細胞／ウェルをＬＤＣＭコートプレートに播種する。
１０．細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
１１．残りの細胞を３００ｇで１０分間ペレット化する。
１２．残りの細胞を吸引し、適量の凍結保存溶液、例えば、ＳＴＥＭＣＥＬＬ社からＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０の商品名で販売されている凍結保存溶液に、２～５×１０６細胞／ｍＬとなるように再懸濁する。
１３．１ｍＬ／クライオバイアルに分注し、適切に（例えば、マイナス８０℃の冷凍庫で）凍結する。凍結の２４時間以内に液体窒素保存に移す。
１４．１７日目に、新しいＴＰＭＭを２ｍＬ／ウェル添加し、培養を継続する。
１５．２１日目に、ウェルの中央の細胞から１００μＬをピペッティングしてフローサイトメトリーのために試料を収集し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。
１６．ウェルの中央の細胞から更に１００μＬを収集し、細胞生存率カウンターを用いて計数する。
１７．ＴＣＲ発現が５０％超、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性発現が２０％超であり、細胞サイズが縮小している（ＨＳＣからＴ細胞への発達を示す）場合、細胞を凍結保存し、同種療法のために提供してもよく、又は任意選択で、段階４で示されるように増殖させてもよい。これらのパラメーターが満たされない場合、必要なフィード及び継代を伴って培養を継続する。２ｍＬ／ウェル未満を除去し、３～４日ごとに新しいＴＰＭＭ ２ｍＬ／ウェルを補充し、培養物がコンフルエンスに近づいたら、培養物を継代する。上記の基準が満たされるまで、この確認を２４／２５日目及び２８日目に再び行う。
１４～２１日目以降：成熟（期間：１～２週間）
１．６ウェル非組織培養処理プレートの適当なウェル数（５０～１００×１０３／ウェルを播種することが推奨される）を、ＰＢＳで１：２００に希釈したＬＤＣＭ ２ｍＬ／ウェルでコーティングする。播種前日に調製する場合は４℃で１２～１８時間、播種当日に調製する場合は３７℃で２時間インキュベートする。
２．ＬＤＣＭを吸引し、４ｍＬ／ウェルのＰＢＳを添加する。
３．１４日目に、細胞生存率カウンター（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社からＶｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲの商品名で提供されている細胞生存率カウンター）を使用して、細胞を収穫及び計数する。
ａ．穏やかにピペッティングすることによって細胞を収集してプレートから取り出し、コニカルチューブに移す。
ｂ．１ｍＬ／４ウェルの冷ＳＦＥＭ ＩＩでウェルを洗浄して、プレートにまだ付着している細胞を取り出し、コニカルチューブに移す。
ｃ．顕微鏡で確認し、必要に応じて冷ＳＦＥＭ ＩＩで更に洗浄して、プレートから細胞を収集する。
４．０．２×１０６細胞のアリコートを分取し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。
５．適量の細胞を分取して、段階３のために播種し、３００ｇで１０分間ペレット化する。
６．上清を吸引する。
７．細胞を、Ｔ細胞前駆体成熟培地（ＴＰＭＭ）、例えば、ＳＴＥＭＣＥＬＬ社からＳｔｅｍＳｐａｎの商品名で提供されているＴ細胞前駆体成熟培地に、２．５～５×１０４細胞／ｍＬで再懸濁する。
８．ＬＤＣＭコートプレートからＰＢＳを吸引する。
９．２ｍＬ細胞／ウェルをＬＤＣＭコートプレートに播種する。
１０．細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
１１．残りの細胞を３００ｇで１０分間ペレット化する。
１２．残りの細胞を吸引し、適量の凍結保存溶液、例えば、ＳＴＥＭＣＥＬＬ社からＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ１０の商品名で販売されている凍結保存溶液に、２～５×１０６細胞／ｍＬとなるように再懸濁する。
１３．１ｍＬ／クライオバイアルに分注し、適切に（例えば、マイナス８０℃の冷凍庫で）凍結する。凍結の２４時間以内に液体窒素保存に移す。
１４．１７日目に、新しいＴＰＭＭを２ｍＬ／ウェル添加し、培養を継続する。
１５．２１日目に、ウェルの中央の細胞から１００μＬをピペッティングしてフローサイトメトリーのために試料を収集し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。
１６．ウェルの中央の細胞から更に１００μＬを収集し、細胞生存率カウンターを用いて計数する。
１７．ＴＣＲ発現が５０％超、ＣＤ４／ＣＤ８二重陽性発現が２０％超であり、細胞サイズが縮小している（ＨＳＣからＴ細胞への発達を示す）場合、細胞を凍結保存し、同種療法のために提供してもよく、又は任意選択で、段階４で示されるように増殖させてもよい。これらのパラメーターが満たされない場合、必要なフィード及び継代を伴って培養を継続する。２ｍＬ／ウェル未満を除去し、３～４日ごとに新しいＴＰＭＭ ２ｍＬ／ウェルを補充し、培養物がコンフルエンスに近づいたら、培養物を継代する。上記の基準が満たされるまで、この確認を２４／２５日目及び２８日目に再び行う。
【0158】
段階４：ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の生成；任意選択の増殖：
２１～２８日目（基準が２１日目に満たされたと仮定。適宜調整する）：刺激（期間：１週間）
１．２１日目に、細胞を収穫し、細胞生存率カウンターを使用して計数する（関連するエクセルシートに計数を記録する）。
ａ．穏やかにピペッティングすることによって細胞を収集してプレートから取り出し、コニカルチューブに移す。
ｂ．４ウェル当たり２ｍＬの冷細胞増殖培地（ＥＭ）、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社からＯｐＴｍｉｚｅｒの商品名で提供されている細胞増殖培地でウェルを洗浄し、プレートにまだ付着している細胞を取り出し、コニカルチューブに移す。
ｃ．顕微鏡で確認し、必要に応じて冷ＥＭで更に洗浄して、プレートから細胞を収集する。
ｄ．０．２×１０６細胞のアリコートを分取し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。
ｅ．適量の細胞を分取して、段階４のために播種し、３００ｇで１０分間ペレット化する。
ｆ．上清を吸引する。
ｇ．２×１０６細胞／ｍＬの細胞を、１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭに再懸濁する。
２．所望の刺激方法（複数可）に応じて、以下の指示のサブセットに従う。ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度を、条件間で１×１０６ｍＬに固定する。
ａ．刺激なし
ｉ．１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭ培地で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。
ｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｂ．ＣＤ３／可溶性ＣＤ２８コート
ｉ．１．２３μｇ／ｍＬのＣＤ３でプレートを３７℃で２時間コートし、使用前にＰＢＳで洗浄する。
ｉｉ．１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭで、細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。
ｉｉｉ．可溶性ＣＤ２８を細胞懸濁液に１μｇ／ｍＬで添加する。
ｉｖ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｃ．可溶性ＣＤ３／可溶性ＣＤ２８とＰＢＭＣ
ｉ．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍し、６，０００ｒａｄで照射する。
ｉｉ．１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭに、ＰＢＭＣを再懸濁する。
ｉｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞とＰＢＭＣを１：２～３（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ＰＢＭＣ）の比率で混合し、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍＬになるようにする。
ｉｖ．可溶性ＣＤ３及び可溶性ＣＤ２８を細胞懸濁液に１μｇ／ｍＬで添加する。
ｖ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｄ．ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒの商品名で販売されている活性化剤などのＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化剤を供給する。
ｉ．１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭ培地で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。
ｉｉ．ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化剤を細胞懸濁液に２５μＬ／ｍＬで添加する。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｅ．ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒの商品名で販売されている活性化剤などのＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化剤を供給する。
ｉ．１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭで、細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。
ｉｉ．ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化剤を細胞懸濁液に２５μＬ／ｍＬで添加する。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｆ．ａＧＣ担持ＰＢＭＣ
ｉ．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍する。
ｉｉ．２μｇ／ｍＬのａＧＣを含むＥＭに１０×１０６細胞／ｍＬを再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
ｉｉｉ．ａＧＣ担持ＰＢＭＣを収集し、６，０００ｒａｄで照射した。
ｉｖ．細胞をＥＭで少なくとも２回洗浄して、未結合ａＧＣを除去する。
ｖ．１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭにＰＢＭＣを再懸濁する。
ｖｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞とＰＢＭＣを１：２～３（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ＰＢＭＣ）の比率で混合し、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍＬになるようにする。
ｖｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｇ．Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
ｉ．培養物からａＡＰＣを収集し、１０，０００ｒａｄで照射する。
ｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞とａＡＰＣを４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比率で混合し、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍＬになるようにする。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｈ．Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ－ＣＤ１ｄ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ－ＣＤ１ｄ）。
ｉ．培養物からａＡＰＣを収集し、１０，０００ｒａｄで照射する。
ｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞とａＡＰＣを４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比率で混合し、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍＬになるようにする。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｉ．ａＧＣ担持Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ－ＣＤ１ｄ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ－ＣＤ１ｄ）。
ｉ．培養物からａＡＰＣを収集する。
ｉｉ．２μｇ／ｍＬのａＧＣ（α－ＧａｌＣｅｒ Ｐｒｅｐ ＳＯＰを参照）を含むＥＭに１０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
ｉｉｉ．ａＧＣ担持ａＡＰＣを収集し、１０，０００ｒａｄで照射した。
ｉｖ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞とａＡＰＣを４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比率で混合し、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍＬになるようにする。
ｖ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
３．２４日目に、セルカウンターを使用して細胞を計数し（関連するエクセルシートに計数を記録する）、１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭを使用して細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。必要に応じて培養容器に移す。ＰＢＭＣ又はａＡＰＣを利用する場合、この時点で得られた細胞数は解釈がより困難であり得、この場合、細胞を乱すことなく培養培地の半分を慎重に除去し、１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む等量の新しいＥＭを添加する。ＰＢＭＣ又はａＡＰＣを含まない条件で希釈を必要としない場合も、この半分の培地交換を行う。
４．２６日目に、細胞生存率カウンターを使用して細胞を計数し（関連するエクセルシートに計数を記録する）、１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭを使用して細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。必要に応じて培養容器に移す。
５．２８日目に細胞を収穫し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌを使用して計数する（関連するエクセルシートに計数を記録する）。
ａ．０．２×１０６細胞のアリコートを分取し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。
ｂ．０．２×１０６細胞のアリコートを分取し、更なるフロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。
ｃ．１×１０６細胞のアリコートを分取し、１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭを使用して細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈し、縦断的追跡のために播種する（任意選択のステップ、細胞凍結完了後に優先）。
ｄ．残りの細胞を３００ｇで１０分間ペレット化し、上清を吸引する。
ｅ．適量の凍結保存培地に、２５～５０×１０６細胞／ｍＬとなるように再懸濁する。
ｆ．１ｍＬ／クライオバイアルに分注し、適切に凍結し、凍結の２４時間以内に液体窒素保存に移す。
２１～２８日目（基準が２１日目に満たされたと仮定。適宜調整する）：刺激（期間：１週間）
１．２１日目に、細胞を収穫し、細胞生存率カウンターを使用して計数する（関連するエクセルシートに計数を記録する）。
ａ．穏やかにピペッティングすることによって細胞を収集してプレートから取り出し、コニカルチューブに移す。
ｂ．４ウェル当たり２ｍＬの冷細胞増殖培地（ＥＭ）、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社からＯｐＴｍｉｚｅｒの商品名で提供されている細胞増殖培地でウェルを洗浄し、プレートにまだ付着している細胞を取り出し、コニカルチューブに移す。
ｃ．顕微鏡で確認し、必要に応じて冷ＥＭで更に洗浄して、プレートから細胞を収集する。
ｄ．０．２×１０６細胞のアリコートを分取し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。
ｅ．適量の細胞を分取して、段階４のために播種し、３００ｇで１０分間ペレット化する。
ｆ．上清を吸引する。
ｇ．２×１０６細胞／ｍＬの細胞を、１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭに再懸濁する。
２．所望の刺激方法（複数可）に応じて、以下の指示のサブセットに従う。ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度を、条件間で１×１０６ｍＬに固定する。
ａ．刺激なし
ｉ．１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭ培地で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。
ｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｂ．ＣＤ３／可溶性ＣＤ２８コート
ｉ．１．２３μｇ／ｍＬのＣＤ３でプレートを３７℃で２時間コートし、使用前にＰＢＳで洗浄する。
ｉｉ．１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭで、細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。
ｉｉｉ．可溶性ＣＤ２８を細胞懸濁液に１μｇ／ｍＬで添加する。
ｉｖ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｃ．可溶性ＣＤ３／可溶性ＣＤ２８とＰＢＭＣ
ｉ．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍し、６，０００ｒａｄで照射する。
ｉｉ．１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭに、ＰＢＭＣを再懸濁する。
ｉｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞とＰＢＭＣを１：２～３（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ＰＢＭＣ）の比率で混合し、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍＬになるようにする。
ｉｖ．可溶性ＣＤ３及び可溶性ＣＤ２８を細胞懸濁液に１μｇ／ｍＬで添加する。
ｖ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｄ．ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒの商品名で販売されている活性化剤などのＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化剤を供給する。
ｉ．１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭ培地で、細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。
ｉｉ．ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞活性化剤を細胞懸濁液に２５μＬ／ｍＬで添加する。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｅ．ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社からＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒの商品名で販売されている活性化剤などのＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化剤を供給する。
ｉ．１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭで、細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。
ｉｉ．ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ細胞活性化剤を細胞懸濁液に２５μＬ／ｍＬで添加する。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｆ．ａＧＣ担持ＰＢＭＣ
ｉ．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を解凍する。
ｉｉ．２μｇ／ｍＬのａＧＣを含むＥＭに１０×１０６細胞／ｍＬを再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
ｉｉｉ．ａＧＣ担持ＰＢＭＣを収集し、６，０００ｒａｄで照射した。
ｉｖ．細胞をＥＭで少なくとも２回洗浄して、未結合ａＧＣを除去する。
ｖ．１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭにＰＢＭＣを再懸濁する。
ｖｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞とＰＢＭＣを１：２～３（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ＰＢＭＣ）の比率で混合し、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍＬになるようにする。
ｖｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｇ．Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）。
ｉ．培養物からａＡＰＣを収集し、１０，０００ｒａｄで照射する。
ｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞とａＡＰＣを４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比率で混合し、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍＬになるようにする。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｈ．Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ－ＣＤ１ｄ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ－ＣＤ１ｄ）。
ｉ．培養物からａＡＰＣを収集し、１０，０００ｒａｄで照射する。
ｉｉ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞とａＡＰＣを４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比率で混合し、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍＬになるようにする。
ｉｉｉ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
ｉ．ａＧＣ担持Ｋ５６２－ＣＤ８０－ＣＤ８３－ＣＤ１３７Ｌ－Ａ２ＥＳＯ－ＣＤ１ｄ人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ－ＣＤ１ｄ）。
ｉ．培養物からａＡＰＣを収集する。
ｉｉ．２μｇ／ｍＬのａＧＣ（α－ＧａｌＣｅｒ Ｐｒｅｐ ＳＯＰを参照）を含むＥＭに１０×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
ｉｉｉ．ａＧＣ担持ａＡＰＣを収集し、１０，０００ｒａｄで照射した。
ｉｖ．ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞とａＡＰＣを４：１（ｉＮＫＴ－ＣＡＲ：ａＡＰＣ）の比率で混合し、ｉＮＫＴ－ＣＡＲ細胞の最終濃度が１×１０６細胞／ｍＬになるようにする。
ｖ．細胞を播種し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。
３．２４日目に、セルカウンターを使用して細胞を計数し（関連するエクセルシートに計数を記録する）、１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭを使用して細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。必要に応じて培養容器に移す。ＰＢＭＣ又はａＡＰＣを利用する場合、この時点で得られた細胞数は解釈がより困難であり得、この場合、細胞を乱すことなく培養培地の半分を慎重に除去し、１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含む等量の新しいＥＭを添加する。ＰＢＭＣ又はａＡＰＣを含まない条件で希釈を必要としない場合も、この半分の培地交換を行う。
４．２６日目に、細胞生存率カウンターを使用して細胞を計数し（関連するエクセルシートに計数を記録する）、１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭを使用して細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈する。必要に応じて培養容器に移す。
５．２８日目に細胞を収穫し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌを使用して計数する（関連するエクセルシートに計数を記録する）。
ａ．０．２×１０６細胞のアリコートを分取し、フロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。
ｂ．０．２×１０６細胞のアリコートを分取し、更なるフロー染色のために９６ウェルＶ底プレートに播種する。
ｃ．１×１０６細胞のアリコートを分取し、１０ｎｇ／ｍＬでＩＬ－７及びＩＬ－１５を含むＥＭを使用して細胞を１×１０６細胞／ｍＬに希釈し、縦断的追跡のために播種する（任意選択のステップ、細胞凍結完了後に優先）。
ｄ．残りの細胞を３００ｇで１０分間ペレット化し、上清を吸引する。
ｅ．適量の凍結保存培地に、２５～５０×１０６細胞／ｍＬとなるように再懸濁する。
ｆ．１ｍＬ／クライオバイアルに分注し、適切に凍結し、凍結の２４時間以内に液体窒素保存に移す。
【0159】
実施例５：ＨＳＣからのマルチＴＣＲ Ｔ細胞の生成
本実施例は、ＨＳＣからマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成するために使用される方法を提供する。これらの方法では、マルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成するために第２のＴＣＲが導入されるタイミングが異なる。しかしながら、プロトコルにおけるこの違いにもかかわらず、本実施例の各方法では、ＨＳＣを出発物質として約３０日でマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成する。更に、本実施例の全ての方法は凍結保存ステップを含んでおり、これによりマルチＴＣＲ Ｔ細胞を必要に応じて迅速に生成すること、及び／又は必要な時に使用するために保存することができる。
本実施例は、ＨＳＣからマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成するために使用される方法を提供する。これらの方法では、マルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成するために第２のＴＣＲが導入されるタイミングが異なる。しかしながら、プロトコルにおけるこの違いにもかかわらず、本実施例の各方法では、ＨＳＣを出発物質として約３０日でマルチＴＣＲ Ｔ細胞を生成する。更に、本実施例の全ての方法は凍結保存ステップを含んでおり、これによりマルチＴＣＲ Ｔ細胞を必要に応じて迅速に生成すること、及び／又は必要な時に使用するために保存することができる。
【0160】
バージョン１
本方法の第１のバージョンでは、ＨＳＣをＴ細胞（この特定の実施例ではｉＮＫＴ又はγδＴ細胞）に分化させ、その中に抗原指向性ＴＣＲを導入する。本方法のこのバージョンの大まかなステップは、図４に示される。
本方法の第１のバージョンでは、ＨＳＣをＴ細胞（この特定の実施例ではｉＮＫＴ又はγδＴ細胞）に分化させ、その中に抗原指向性ＴＣＲを導入する。本方法のこのバージョンの大まかなステップは、図４に示される。
【0161】
最初に、方法は、ＴＣＲ／ＣＡＲ Ｔ細胞を生成するために、実施例１～４に概説されるものと同じ又は類似の方法で開始される。したがって、本方法は、前刺激ステップ、形質導入ステップ、及び／又は収穫ステップを含む初期段階４０３を含み得る。この初期形質導入ステップの結果は、第１のＴＣＲをコードする核酸をＨＳＣに導入することである。ここでも、実施例１～４の方法と同様に、本方法は、導入された第１のＴＣＲを有するＨＳＣをＴ細胞（例えば、ｉＮＫＴ又はγδＴ細胞）に分化させるステップ４０５を更に含む。実施例１～４と同様に、Ｔ細胞は、成熟ステップ４０７並びに増殖及び／又は活性化ステップ４０９に供される。本実施例では、増殖後、シングルＴＣＲ Ｔ細胞を凍結保存する。凍結保存及びその後の解凍の後、Ｔ細胞は第２ラウンドの形質導入を受け、その間に第２のＴＣＲがＴ細胞に導入される。この場合、レンチウイルス形質導入を介して第２のＴＣＲを導入した。この第２のＴＣＲは、ＥＳＯがん－精巣抗原を特異的に標的とする。
【0162】
本方法の結果、ＨＳＣがｉＮＫＴ細胞又はγδＴ細胞に形質転換し、該Ｔ細胞は、ｉＮＫＴ／γδＴＣＲに加えて、がん抗原を特異的に標的とする第２のＴＣＲも発現する。
【0163】
バージョン２
本方法の第２のバージョンのステップは、図５に示される。本方法のステップは、バージョン１と同様に進行する。ただし、本方法は柔軟であるため、増殖、活性化、及び／又は凍結保存の最終ステップは、第２の抗原特異的ＴＣＲの導入後、すなわち、２１日目～３４日目の間に行われる。
本方法の第２のバージョンのステップは、図５に示される。本方法のステップは、バージョン１と同様に進行する。ただし、本方法は柔軟であるため、増殖、活性化、及び／又は凍結保存の最終ステップは、第２の抗原特異的ＴＣＲの導入後、すなわち、２１日目～３４日目の間に行われる。
【0164】
バージョン３
本方法の第３のバージョンのステップは、図６に示される。これらのステップは、先の２つの方法と同じである。したがって、本方法は、前刺激ステップ、形質導入ステップ、及び／又は収穫ステップを含む初期段階６０３を含む。本方法は、導入された第１のＴＣＲを有するＨＳＣをＴ細胞（例えば、ｉＮＫＴ又はγδＴ細胞）に分化させるための１つ以上のステップ６０５を更に含む。実施例１～４と同様に、Ｔ細胞は、成熟ステップ６０７並びに増殖及び／又は活性化ステップ６０９に供される。ただし、本方法のこのバージョンでは、第２の標的特異的ＴＣＲが、約１４日目、すなわち、Ｔ細胞成熟の前又は開始時に導入される。
本方法の第３のバージョンのステップは、図６に示される。これらのステップは、先の２つの方法と同じである。したがって、本方法は、前刺激ステップ、形質導入ステップ、及び／又は収穫ステップを含む初期段階６０３を含む。本方法は、導入された第１のＴＣＲを有するＨＳＣをＴ細胞（例えば、ｉＮＫＴ又はγδＴ細胞）に分化させるための１つ以上のステップ６０５を更に含む。実施例１～４と同様に、Ｔ細胞は、成熟ステップ６０７並びに増殖及び／又は活性化ステップ６０９に供される。ただし、本方法のこのバージョンでは、第２の標的特異的ＴＣＲが、約１４日目、すなわち、Ｔ細胞成熟の前又は開始時に導入される。
【0165】
実施例６：γδマルチＴＣＲ抗原特異的Ｔ細胞の生成
ＨＳＣを使用して、図６に示される方法で概説したステップに従ってγδＴ細胞を生成した。簡単に述べると、ＨＳＣは、γδＴＣＲを細胞に導入するレンチウイルス形質導入を受けた。細胞は分化ステップ６０５を受けた。分化後、得られたγδ（「ＧＤ－Ｔ」）Ｔ細胞は、ＥＳＯがん－精巣抗原を標的とするＴＣＲを導入する第２のレンチウイルス形質導入を受けた。
ＨＳＣを使用して、図６に示される方法で概説したステップに従ってγδＴ細胞を生成した。簡単に述べると、ＨＳＣは、γδＴＣＲを細胞に導入するレンチウイルス形質導入を受けた。細胞は分化ステップ６０５を受けた。分化後、得られたγδ（「ＧＤ－Ｔ」）Ｔ細胞は、ＥＳＯがん－精巣抗原を標的とするＴＣＲを導入する第２のレンチウイルス形質導入を受けた。
【0166】
成熟後、得られたマルチＴＣＲ Ｔ細胞（γδＴＣＲ及びＥＳＯ標的化ＴＣＲを有する）を、ＥＳＯ抗原提示（ＥＳＯｐ担持）ＨＬＡ－Ａ２ ＰＢＭＣとの接触を介して増殖／活性化した。
【0167】
特定の変型例において、ＰＢＭＣをスクリーニングして、活性化／増殖抗原を十分に高いレベルで発現しているかどうかを決定することができる。図７は、該スクリーニングの結果を示す。図では、ＰＢＭＣ株Ｄ４１０５が最も高いＨＬＡ－Ａ２発現を示した。したがって、マルチＴＣＲ Ｔ細胞を増殖させるために該株を選択した。
【0168】
図８の右パネルに示されるように、マルチＴＣＲ Ｔ細胞（ＧＤ－ＴＣＲ／ＥＳＯ－ＴＣＲ）は、ＥＳＯｐ－ＰＢＭＣとの接触により顕著な増殖を示した。対照的に、ＥＳＯ－ＴＣＲを有しない細胞（「ＮＴＤ」）は、ＰＢＣＭとの接触による増殖をほとんど示さなかった。
【0169】
マルチＴＣＲ Ｔ細胞の効力を試験するために、ＨＬＡ－Ａ２－ＥＳＯを発現する標的細胞を生成した。このような株を３つ生成した。２株はヒト卵巣がん細胞株（ＳＫＯＶ３－ｌｕｃ及びＯＶＣＡＲ３－ｌｕｃ）に由来し、１株は多発性骨髄腫患者（ＭＭ．１Ｓ－ｌｕｃ）の末梢血に由来するものであった。細胞にＥＳＯ抗原を発現させる導入遺伝子をこれらの株に形質導入した。これらの試験細胞株に関するデータを図９に示す。
【0170】
次いで、これらの細胞を使用して、マルチＴＣＲ Ｔ細胞の細胞傷害性効力及び特異性を測定した。簡単に述べると、マルチＴＣＲ Ｔ細胞を、各試験細胞株、及びＥＳＯ抗原が形質導入されていない標的細胞親株に曝露した。同様に、本発明の方法を使用して生成したが、第２のＥＳＯ特異的ＴＣＲを導入していないγδＴ細胞を、試験細胞株及び対照株に曝露した。全ての実験を繰り返したが、Ｔ細胞を、γδＴ細胞の活性化に寄与することが知られているアミノビスホスホネートゾレドロン酸（ＺＯＬ）と接触させることも追加した。図１０及び図１１は、これらのインビトロ殺傷アッセイの結果を示す。
【0171】
全ての標的細胞株にわたって、マルチＴＣＲ Ｔ細胞（ＥＳＯ特異的ＴＣＲを含む）は、シングルＴＣＲ Ｔ細胞と比較した場合、ＥＳＯ抗原発現標的細胞に対してより大きな細胞傷害効果を示した。これは、第２のＴＣＲがγδＴ細胞に適切に導入されたこと、及び該Ｔ細胞が抗原特異的細胞傷害効果を有することを裏付けている。更に、全てのＴ細胞（すなわち、γδＴ細胞及びマルチＴＣＲ Ｔ細胞）において、ＺＯＬとの接触により、Ｔ細胞の殺傷能力が増強された。これは、ＺＯＬがγδＴ細胞を活性化することが知られており、マルチＴＣＲ Ｔ細胞がγδＴＣＲを含むことから予想される。
【0172】
参照による組み込み
本開示全体を通して、特許、特許出願、特許公開、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書への参照及び引用がなされている。全てのそのような文書は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示全体を通して、特許、特許出願、特許公開、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツなどの他の文書への参照及び引用がなされている。全てのそのような文書は、全ての目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0173】
均等物
本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な変更及びその多くの更なる実施形態は、本明細書に引用される科学文献及び特許文献への参照を含む本明細書の全内容から当業者に明らかになるであろう。本明細書の主題は、その様々な実施形態及びその均等物において本発明の実施に適合させることができる重要な情報、例示及び指針を含有する。
本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な変更及びその多くの更なる実施形態は、本明細書に引用される科学文献及び特許文献への参照を含む本明細書の全内容から当業者に明らかになるであろう。本明細書の主題は、その様々な実施形態及びその均等物において本発明の実施に適合させることができる重要な情報、例示及び指針を含有する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【国際調査報告】