特表 2024-541882 ｃ－Ｍｅｔに結合する抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-11-13

(54)【発明の名称】ｃ－Ｍｅｔに結合する抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/28 20060101AFI20241106BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20241106BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20241106BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20241106BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20241106BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20241106BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20241106BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20241106BHJP

【ＦＩ】

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P35/02

G01N33/574 A

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2024523760

(86)(22)【出願日】2022-11-04

(85)【翻訳文提出日】2024-06-14

(86)【国際出願番号】 CN2022129875

(87)【国際公開番号】W WO2023078391

(87)【国際公開日】2023-05-11

(31)【優先権主張番号】202111305831.6

(32)【優先日】2021-11-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】517285024

【氏名又は名称】正大天晴▲藥▼▲業▼集▲団▼股▲フン▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】甄 子朋

(72)【発明者】

【氏名】杜 秀▲貞▼

(72)【発明者】

【氏名】▲張▼ 正平

(72)【発明者】

【氏名】▲趙▼ ▲偉▼

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA05

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085CC22

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA28

4H045FA72

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、c-Metに結合する抗体及びその使用に関し、具体的には、単一可変ドメイン、抗体若しくはその抗原結合性断片、又はc-Metに結合する融合タンパク質、並びに前記産物をコードする核酸、核酸を含むベクター、ベクターを含む細胞、及びそれらを含む医薬組成物が提供され、それらの検出、薬学的及び治療的使用も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離された抗体又はその抗原結合性断片であって、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの単一可変ドメインを含み、単一可変ドメインが以下の相補性決定領域:
(a)配列番号11、8、5、14、17又は20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、
(b)配列番号12、9、6、15、18又は21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号13、10、7、16、19又は22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む、抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項2】

単一可変ドメインが、
(a)配列番号11に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号13に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、
(b)配列番号8に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、
(c)配列番号5に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号7に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、
(d)配列番号14に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、
(e)配列番号17に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号18に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、又は
(f)配列番号20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む、請求項1に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項3】

単一可変ドメインが、配列番号24、26、28、30、32、若しくは34に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
単一可変ドメインが、配列番号24、26、28、30、32、若しくは34に記載されるアミノ酸配列を含む、
請求項2に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項4】

単一可変ドメインがV_HHであり、必要に応じて、抗体又はその抗原結合性断片がキメラ性であるか又はヒト化されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項5】

ヒトIgGのFc、好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のFcを含み、必要に応じて、配列番号37、39、41、43、45、又は47に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項6】

以下の特性及び特徴:
(a)ヒトc-Met又は/及びサルc-Metに結合すること、
(b)HGF又はそのβ鎖のc-Metへの結合を遮断すること、
(c)HGF刺激によって引き起こされるc-Metリン酸化を阻害すること、
(d)腫瘍細胞に対してADCC効果を発揮すること
のうちの1つ又はいくつかを、単独で又は組み合わせて含みうる、請求項1から5のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項7】

請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含む融合タンパク質。

【請求項8】

請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、又は請求項7に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項9】

請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片又は請求項7に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。

【請求項10】

請求項9に記載の単離された核酸を含むベクター。

【請求項11】

請求項9に記載の核酸又は請求項10に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項12】

請求項1から6のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片を調製するための方法であって、請求項11に記載の宿主細胞を培養する工程、及び発現された抗体又はその抗原結合性断片を単離する工程を含み、ベクターが発現ベクターである、方法。

【請求項13】

腫瘍を有する対象を処置するための医薬を調製するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の単離された抗体若しくはその抗原結合性断片、請求項7に記載の融合タンパク質、又は請求項8に記載の医薬組成物の使用であって、好ましくは、腫瘍が、脳悪性腫瘍、頭頸部がん、肺がん、食道がん、咽頭がん、鼻腔がん、舌がん、口腔がん、甲状腺がん、皮膚がん、骨がん、軟部肉腫、骨髄腫、胃がん、胃食道接合部腺がん、乳がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、リンパ腫、胸腺がん、膀胱がん、膣がん、精巣がん、子宮がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肛門がん、乳頭がん、前立腺がん、卵巣がん、上皮細胞がん、又は血液腫瘍である、使用。

【請求項14】

試料中のc-Metを検出又は測定するための方法であって、試料を請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片と接触させる工程、及び結合複合体を検出又は測定する工程を含む方法。

【請求項15】

細胞におけるc-Metシグナル伝達を阻害するか、減少させるか又は遮断するための方法であって、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、請求項7に記載の融合タンパク質、又は請求項8に記載の医薬組成物の有効量を細胞に投与する工程を含む方法。

【請求項16】

腫瘍細胞の増殖を阻害するか又は腫瘍細胞を死滅させるための方法であって、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、請求項7に記載の融合タンパク質、又は請求項8に記載の医薬組成物の有効量を腫瘍細胞に投与する工程を含む方法。

【請求項17】

腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、請求項7に記載の融合タンパク質、又は請求項8に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む方法。

【請求項18】

腫瘍が、脳悪性腫瘍、頭頸部がん、肺がん、食道がん、咽頭がん、鼻腔がん、舌がん、口腔がん、甲状腺がん、皮膚がん、骨がん、軟部肉腫、骨髄腫、胃がん、胃食道接合部腺がん、乳がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、リンパ腫、胸腺がん、膀胱がん、膣がん、精巣がん、子宮がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肛門がん、乳頭がん、前立腺がん、卵巣がん、上皮細胞がん、又は血液腫瘍である、請求項16又は17に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、分子生物学の技術分野に関し、詳細には、c-Metに結合する抗体又はその抗原結合性断片、及びその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

c-間葉-上皮移行因子(c-Met)は、受容体型チロシンキナーゼの1つであり、50kDaの細胞外鎖(α鎖)と145kDaの膜貫通鎖(β鎖)が連結して形成されたおよそ190kDaのヘテロ二量体である。膜貫通鎖(β鎖)は、SEMAドメイン(sema相同性領域、SEMA)、PSIドメイン(プレキシンセマフォリン-インテグリン、PSI)、4つの免疫グロブリン様反復ドメイン(プレキシン及び転写因子における免疫グロブリン様領域、IPT)、膜貫通ドメイン、膜近傍ドメイン(JM)、チロシンキナーゼドメイン(TK)、及びC末端尾部領域(カルボキシル末端、CT)を含む。c-Metは細胞表面に発現される受容体であり、SEMAドメインはリガンド結合のための重要な要素の1つであり、そのリガンドである肝細胞増殖因子(HGF)の結合部位と考えられている。HGFは間葉系細胞、線維芽細胞、及び平滑筋細胞によって合成され、パラクリン機構を介してHGF/c-Metシグナルを活性化して、その生物学的機能を発揮する。

【0003】

様々な腫瘍において、c-Met及びHGFの過剰発現、並びにHGF及びc-Metによって形成されるパラクリン及びオートクリンのポジティブフィードバックループに起因して、HGF/c-Metシグナル伝達経路が異常に活性化され、腫瘍細胞の増殖、浸潤、遊走、及び血管新生が促進される。c-Met遺伝子の異常発現は、多くの種類のがん、例えば、脳悪性腫瘍、乳がん、結腸直腸がん、胃がん、頭頸部がん、肺がん、肝臓がんに存在する。c-Metに結合する免疫療法剤、例えば、抗体は、HGFのc-Metへの結合を阻害することができる。c-Metが治療標的となる可能性があることから、いくつかのc-Met標的化抗体が開発されているが、まだ限定的である。より多くの利用可能な選択肢が必要である。

【0004】

ラクダ科(Camelidae)の動物におけるIgG抗体には、4本鎖構造の従来のIgG1に加えて、軽鎖を含まない天然に存在するIgG2及びIgG3重鎖抗体(HcAb)も含まれる。重鎖抗体の単一可変領域ドメイン(V_HH)は、抗原に特異的に結合することができ、抗原に対して比較的高い親和性を有する。それらの固有性に基づいて、抗体又は抗原結合性断片の一部として使用されるV_HHドメインは、従来の抗体断片(例えば、scFv及びFab)よりも重要な利点を有する: 例えば、高い親和性で抗原に特異的に結合するために必要なドメインは1つだけである; それらは多価及び多重特異性形式に容易に変換されうる; V_HHドメインは溶解性が高く、凝集する傾向がない; V_HH分子は小さく、したがって比較的高い組織透過性を有する; V_HHは軽鎖と対になる必要がなく、したがって、二重特異性又は多重特異性抗体の形成に関して軽鎖及び重鎖のミスマッチの問題がない。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda, Md.(1991年)

【非特許文献2】Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Printing Company、1990年、1289～1329頁

【非特許文献3】Comput. Appl. Biosci.、4: 11～17頁(1988年)

【非特許文献4】J. Mol. Biol.、484 453(1970年)

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本開示は、c-Metに結合する単一可変ドメイン、抗体若しくはその抗原結合性断片、又は融合タンパク質を提供する。本開示はまた、提供される単一可変ドメインをコードする核酸、抗体若しくはその抗原結合性断片、又は融合タンパク質、ベクター、細胞、調製方法、組成物、及び使用を提供する。

【0007】

一態様では、本開示は、c-Metに結合する単離された単一可変ドメインを提供し、ここで単一可変ドメインは、配列番号24、26、28、30、32、又は34に記載されるアミノ酸配列におけるCDR1、CDR2、及びCDR3を含む。

【0008】

一態様では、本開示は、c-Metに結合する単離された単一可変ドメインを提供し、ここで単一可変ドメインは、以下の相補性決定領域を含む: (a)配列番号5、8、11、14、17、又は20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、(b)配列番号6、9、12、15、18、又は21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び(c)配列番号7、10、13、16、19、又は22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3。

【0009】

一態様では、本開示は、c-Metに結合する単離された抗体又はその抗原結合性断片を提供し、ここで抗体又はその抗原結合性断片は単一可変ドメインを含み、単一可変ドメインは、配列番号24、26、28、30、32、又は34に記載されるアミノ酸配列におけるCDR1、CDR2、及びCDR3を含む。

【0010】

一態様では、本開示は、c-Metに結合する単離された抗体又はその抗原結合性断片を提供し、ここで抗体又はその抗原結合性断片は単一可変ドメインを含み、単一可変ドメインは、以下の相補性決定領域を含む: (a)配列番号5、8、11、14、17、又は20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、(b)配列番号6、9、12、15、18、又は21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び(c)配列番号7、10、13、16、19、又は22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3。

【0011】

一態様では、本開示は、c-Metに結合する単離された抗体又はその抗原結合性断片を提供し、ここで抗体又はその抗原結合性断片は単一可変ドメインを含み、単一可変ドメインは、本開示の単一可変ドメインのうちのいずれか1つのものと同じエピトープに結合する。

【0012】

一態様では、本開示は、c-Metに結合する単離された抗体又はその抗原結合性断片を提供し、ここで抗体又はその抗原結合性断片は単一可変ドメインを含み、単一可変ドメインは、c-Metへの結合に関して、本開示の単一可変ドメインのうちのいずれか1つと競合する。

【0013】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、V_HH、好ましくは、ラクダ科動物V_HH又はヒト化V_HHである。

【0014】

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、キメラ性であるか又はヒト化されている。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ラクダ科の動物に由来するか又はヒト化されている。

【0015】

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、IgGのFcを含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトIgGのFc、好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のFcを含む。

【0016】

一態様では、本開示は、本開示の抗体又はその抗原結合性断片を含む融合タンパク質を提供する。

【0017】

一態様では、本開示は、本開示の抗体又はその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。

【0018】

一態様では、本開示は、本開示の抗体又はその抗原結合性断片をコードする単離された核酸を提供する。

【0019】

一態様では、本開示は、本開示の単離された核酸を含むベクターを提供する。

【0020】

一態様では、本開示は、本開示の単離された核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0021】

一態様では、本開示は、本開示の抗体又はその抗原結合性断片を調製するための方法であって、本開示の宿主細胞を培養すること、及び発現された抗体又はその抗原結合性断片を単離することを含み、ベクターが発現ベクターである、方法を提供する。

【0022】

別の態様では、本開示は、腫瘍を有する対象を処置するための医薬を調製するための、本開示の抗体又はその抗原結合性断片の使用を提供する。

【0023】

別の態様では、本開示は、腫瘍を有する対象を処置するための医薬を調製するための、本開示の融合タンパク質の使用を提供する。

【0024】

別の態様では、本開示は、腫瘍を有する対象を処置するための医薬を調製するための、本開示の医薬組成物の使用を提供する。

【0025】

別の態様では、本開示は、試料中のc-Metを検出又は測定するための方法であって、試料を本開示の抗体又はその抗原結合性断片と接触させること、及び結合複合体を検出又は測定することを含む方法を提供する。

【0026】

別の態様では、本開示は、細胞におけるc-Metシグナル伝達を阻害するか、減少させるか又は遮断するための方法であって、本開示の抗体若しくはその抗原結合性断片、融合タンパク質、又は医薬組成物の有効量を細胞に投与することを含む方法を提供する。

【0027】

別の態様では、本開示は、腫瘍細胞の増殖を阻害するか又は腫瘍細胞を死滅させるための方法であって、本開示の抗体若しくはその抗原結合性断片、融合タンパク質、又は医薬組成物の有効量を腫瘍細胞に投与することを含む方法を提供する。

【0028】

別の態様では、本開示は、腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、本開示の抗体若しくはその抗原結合性断片、融合タンパク質、又は医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0029】

【図1A】抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体のH1993細胞への結合に関するフローサイトメトリーアッセイの曲線を示す。

【図1B】抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体のMKN45細胞への結合に関するフローサイトメトリーアッセイの曲線を示す。

【図1C】抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体のKP4細胞への結合に関するフローサイトメトリーアッセイの曲線を示す。

【図1D】抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体の4MBr-5細胞への結合に関するフローサイトメトリーアッセイの曲線を示す。

【図2A】HGFのc-Metへの結合に対する抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体の遮断効果に関する競合ELISAアッセイの結果を示す。

【図2B】HGFβのc-Metへの結合に対する抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体の遮断効果に関する競合ELISAアッセイの結果を示す。

【図3】H441細胞においてHGFによって刺激されるc-Metリン酸化に対する抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体の阻害効果のアッセイ結果を示す。

【図4】抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体によるKP4細胞増殖の阻害に関するCCK8アッセイの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

定義
特に明記しない限り、本開示において使用される以下の用語は、以下の意味を有するものとする。特定の用語は、特に具体的に定義されない限り、曖昧又は不明確であると考えられるべきではなく、当技術分野におけるその一般的な意味に従って解釈されるべきである。

【0031】

「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及び多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体又は三重特異性抗体)を含むがこれらに限定されない種々の抗体構造を、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、範囲に含む。

【0032】

「抗原結合性断片」という用語は、Fab、Fab'、F(ab')₂、scFv、Fv、Fd、Fd'、単一可変ドメイン(例えば、V_HH)、及び当技術分野で公知の他の抗体断片を含む全長抗体の抗原結合機能を保持する断片、又は上記断片に基づく当技術分野で公知の任意の修飾による修飾断片を指す。

【0033】

「可変ドメイン」又は「可変領域」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体のドメインを指す。天然抗体の各可変ドメインは、4つのフレームワーク領域及び3つの相補性決定領域から本質的になる。4つの「フレームワーク領域」は、当技術分野及び本明細書で「フレームワーク領域1」又は「FR1」、「フレームワーク領域2」又は「FR2」、「フレームワーク領域3」又は「FR3」、及び「フレームワーク領域4」又は「FR4」と称される。フレームワーク領域は、当技術分野及び本明細書で「相補性決定領域1」又は「CDR1」、「相補性決定領域2」又は「CDR2」、及び「相補性決定領域3」又は「CDR3」と称される3つの相補性決定領域CDRによって分離される。したがって、可変ドメインの一般的な構造又は配列は、以下のように表すことができる: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。可変ドメインは、抗原結合部位を有することによって、抗原に対する特異性を抗体に付与する。

【0034】

「単一可変ドメイン」という用語は、他の可変ドメインと対を形成することなく、抗原エピトープに特異的に結合することができる可変ドメインを有することを指す。単一可変ドメインの抗原結合部位は、典型的には、3つのCDR(CDR1、CDR2及びCDR3)から形成され、単一のドメイン上に存在する。一部の場合には、単一可変ドメインは、それが単一の抗原結合ユニット(すなわち、単一可変ドメインから本質的になる機能的な抗原結合ユニット; このようにして、単一の抗原結合ドメインが、別の可変ドメインと相互作用することなく、機能的な抗原結合ユニットを形成することができる)を形成することができる限り、重鎖可変ドメイン(例えば、V_H)又はその好適な断片でありうる。単一可変ドメインの別の例は、ラクダ科の動物の「V_HHドメイン」であり、これはVHHドメイン、V_HH、又はVHHとしても知られる。

【0035】

「V_HHドメイン」という用語は、これらの可変ドメインを、従来の4本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン(本明細書では「V_Hドメイン」又は「V_H」と称される)及び従来の4本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン(本明細書では「V_Lドメイン」又は「V_L」と称される)と区別するために使用される。V_HHドメインは、さらなる抗原結合ドメインが関与することなく、エピトープに特異的に結合する(これは従来の4本鎖抗体のV_H又はV_Lドメインとは異なり、この場合にはエピトープは、V_L及びV_Hドメインの両方によって認識される)。V_HHドメインは、単一のドメインから形成される、小さく、安定で、効率的な抗原認識ユニットである。

【0036】

「フレームワーク領域」(FR)残基という用語は、本明細書で定義されるCDR残基以外の可変ドメインのアミノ酸残基を指す。

【0037】

「相補性決定領域」(CDR)は、「超可変領域(HVR)」とも称される。天然の4本鎖抗体は典型的には6つのCDRを含み、3つは重鎖可変領域(重鎖CDR1、重鎖CDR2、及び重鎖CDR3)にあり、3つは軽鎖可変領域(軽鎖CDR1、軽鎖CDR2、及び軽鎖CDR3)にある。重鎖抗体又は単一可変ドメインは典型的には3つのCDR(CDR1、CDR2、及びCDR3)を有する。CDR3は3つのCDRの中で最も多様であり、抗体に微細な特異性を付与する上で固有の役割を果たすと考えられている。

【0038】

現在、CDRを定義する方法は数多く存在する。Kabatスキームは、配列の可変性に基づいてCDRを定義し、最も一般的に使用されており(Elvin A. Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991年))、一方、Chothiaスキームは、構造ループの位置に基づいてCDRを定義する(Cyrus Chothiaら、Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins、J. Mol. Biol、196: 901～917頁(1987年))。KabatスキームとChothiaスキームとの折衷案であるAbMスキームは、Oxford Molecular社のAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用されている。「Contact」は、利用可能な複合体の結晶構造の解析に基づいてCDRを定義する。しかし、異なる方法及び定義に基づく同じ抗体の可変領域のCDRの境界は異なる可能性があること、すなわち、異なる方法によって定義された同じ抗体の可変領域のCDR配列は異なる可能性があることに注意する必要がある。したがって、本明細書で定義された特定のCDR配列を用いて定義される抗体に言及する場合、抗体の範囲は、他の任意の定義(例えば、IMGT、Chothia、AbM定義等のうちの1つ又は複数の組合せ)に変換されたCDR配列によって定義される抗体も範囲に含む。

【0039】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」又は「アクセプターヒトフレームワーク」という用語は、ヒト免疫グロブリンV_L又はV_Hフレームワーク配列を選択する際に最も頻繁に存在するアミノ酸残基のフレームワークを指す。一般に、ヒト免疫グロブリンV_L又はV_H配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選択される。一般に、配列のサブグループは、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda, Md.(1991年)に記載されているものである。例としては、以下が挙げられる: V_Lについては、サブグループは、Kabatら(上記と同じ出典から)によって記載されたサブグループκI、κII、κIII又はκIVでありうる。加えて、V_Hについては、サブグループは、Kabatらによって記載されたサブグループI、サブグループII又はサブグループIIIでありうる。或いは、ヒトコンセンサスフレームワーク領域は、上記の特定の残基に由来してもよく、例えば、ヒトフレームワーク残基が、ドナーフレームワーク領域配列を様々なヒトフレームワーク領域配列のセットとアラインメントさせることによって、ヒトフレームワーク領域残基のドナーフレームワーク領域に対する相同性に従って選択される場合、ヒトコンセンサスフレームワーク領域に「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、同じアミノ酸配列を含んでもよく、又は既存のアミノ酸配列多様性を含んでもよい。一部の実施形態では、既存のアミノ酸変化の数は、10若しくはそれ未満、9若しくはそれ未満、8若しくはそれ未満、7若しくはそれ未満、6若しくはそれ未満、5若しくはそれ未満、4若しくはそれ未満、3若しくはそれ未満、又は2若しくはそれ未満である。

【0040】

「Fcドメイン」又は「Fc」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Fc及びバリアントFcを含む。FcのC末端リジン(EU番号付けシステムによるLys447)は、存在しても存在しなくてもよい。

【0041】

EC₅₀という用語は、ある特定の化合物(例えば、抗体又はその抗原結合性断片)の分子の最大応答の50%である有効濃度を指す。「IC₅₀」という用語は、ある化合物(例えば、抗体又はその抗原結合性断片)の分子の最大応答の50%である阻害濃度を指す。EC₅₀及びIC₅₀は両方とも、ELISA若しくはFACSアッセイ、又は当技術分野で公知の任意の他の方法によって測定することができる。

【0042】

「K_a」又は「会合速度定数」という用語は、抗原に結合して複合体を形成する、ある特定の化合物(例えば、抗体又はその抗原結合性断片)の分子の会合速度定数を指す。「K_d」又は「解離速度定数」という用語は、複合体からのある特定の化合物(例えば、抗体又はその抗原結合性断片)の分子の解離の解離速度定数を指す。「K_D」又は「平衡解離定数」という用語は、滴定測定において平衡時に得られるか、又は解離速度定数(K_d)を会合速度定数(K_a)で除算することによって得られる値を指す。ある特定の化合物の分子と抗原との間の結合親和性は、K_a、K_d、及びK_Dを使用して表される。K_a、K_d、及びK_Dの値を決定する方法は、当技術分野で周知である。

【0043】

「薬学的に許容される」という用語は、本明細書に記載される化合物の生物学的活性又は特性を消失させない物質、例えば、担体又は希釈剤を指す。そのような物質は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことも、それが含まれる組成物の成分のいずれかと有害な様式で相互作用することもなく、個体に投与される。

【0044】

「薬学的に許容される担体」という用語は、当業者に周知であるように、任意及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング材料、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤(例えば、抗菌剤及び抗真菌剤)、等張化剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、着香剤、色素等、並びにそれらの組合せを含む(Remington's Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Printing Company、1990年、1289～1329頁)。治療用又は医薬組成物における任意の従来の担体の使用は、それが活性成分と不適合でない限り、想定される。

【0045】

「処置すること」又は「処置」という用語は、処置された個体における疾患の自然経過を変更する試みを指し、これは予防のために、又は臨床病理の経過の間に行われる臨床介入でありうる。所望の治療効果としては、疾患の発生又は再発を予防すること、症状を緩和すること、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果を減少させること、転移を予防すること、疾患の進行速度を遅らせること、疾患状態を改善又は軽減すること、及び予後を退行させるか又は改善することが挙げられるが、これらに限定されない。

【0046】

本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、治療的利益を対象にもたらすために必要な化合物、医薬組成物、又は薬学的組合せの量を指す。

【0047】

「対象」という用語は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、及び爬虫類を含む。好ましくは、本開示による対象は、ヒトである。「患者」及び「対象」という用語は、別段の指示がない限り、互換的に使用される。

【0048】

「特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、結合が抗原に対して選択的であり、所望されないか又は非特異的である相互作用とは区別しうることを意味する。ある特定の化合物(例えば、抗体又はその抗原結合性断片)の分子の、特定の抗原決定基への結合能は、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)又は当業者に周知の他の手法、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)の手法(Biacore装置での分析)によって測定しうる。

【0049】

「単離された」という用語は、標的化合物、例えば、抗体又はその抗原結合性断片、V_HH、又は核酸が、その自然環境から単離されていることを意味する。

【0050】

配列「同一性」という用語は、一貫性としても知られる。2つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一な位置の関数であり(すなわち、パーセント同一性=同一な位置の数/位置の総数×100)、ここで、2つの配列の最適なアラインメントを生じるために導入される必要があるギャップの数及び各ギャップの長さが考慮されるべきである。以下の非限定的な例に示されるように、配列の比較及び2つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、E. Meyers及びW. Millerのアルゴリズム(Comput. Appl. Biosci.、4: 11～17頁(1988年))を使用して決定することができ、これは、ALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれており、PAM120残基加重表をギャップ長ペナルティ12及びギャップペナルティ4と共に使用する。更に、2つのアミノ酸配列のパーセント同一性は、Needleman及びWunschのアルゴリズム(J. Mol. Biol.、484 453(1970年))を使用して決定することができ、これは、GCGソフトウェアパッケージ(www.gcg.comで入手可能)のGAPプログラムに組み込まれており、Blossum 62行列又はPAM250行列を、ギャップ加重16、14、12、10、8、6又は4、及び長さ加重1、2、3、4、5又は6と共に使用する。

【0051】

本明細書で使用される場合、「約」は、特定の値について当業者によって決定される許容される誤差範囲内にあることを意味し、これは値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定システムによる制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野で習慣的に行われるように、1の又は1を上回る標準偏差内にあることを意味しうる。或いは、約は、最大で20%(すなわち、±20%)の範囲、例えば、±10%、±5%、±2%、±1%、又は±0.5%で与えられる特定の数値範囲内で変動することを意味しうる。更に、特に生物学的システム又は方法に関して、この用語は、ある特定の値の最大で1桁のオーダー、又は最大で5倍であることを意味しうる。特定の値が本開示又は特許請求の範囲において与えられる場合、別段の記載がない限り、「約」は、その特定の値について許容される誤差範囲内にあることを意味すると考えられるべきである。

【0052】

タンパク質におけるアミノ酸残基は、以下の通りに略記される:フェニルアラニンはPhe又はFであり、ロイシンはLeu又はLであり、イソロイシンはIle又はIであり、メチオニンはMet又はMであり、バリンはVal又はVであり、セリンはSer又はSであり、プロリンはPro又はPであり、トレオニンはThr又はTであり、アラニンはAla又はAであり、チロシンはTyr又はYであり、ヒスチジンはHis又はHであり、グルタミンはGln又はQであり、アスパラギンはAsn又はNであり、リジンはLys又はKであり、アスパラギン酸はAsp又はDであり、グルタミン酸はGlu又はEであり、システインはCys又はCであり、トリプトファンはTrp又はWであり、アルギニンはArg又はRであり、グリシンはGly又はGである。

【0053】

本開示の様々な態様を、以下のセクションで更に詳細に説明する。

【0054】

単一可変ドメイン
本開示は、c-Met(例えば、ヒトc-Met)に結合する、単離された単一可変ドメインを提供する。単一可変ドメインは、c-Metを標的とする薬物の開発又は薬物構築のための、より多くの利用可能な選択肢を提供する。単一可変ドメインは、いくつかの望ましい治療特性、例えば、ヒトc-Metに対する良好な親和性、リガンドHGF又はそのβ鎖のc-Metへの結合を遮断する能力、及びHGF刺激によって引き起こされるc-Metリン酸化の阻害のうちの1つ又は複数を有する。

【0055】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号24に記載される可変領域配列のうちの1つ、2つ又は3つ全てのCDRを含むc-Metに結合する。特定の一実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号24に記載される可変領域配列のCDR1、CDR2、及びCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号26に記載される可変領域配列のうちの1つ、2つ又は3つ全てのCDRを含むc-Metに結合する。特定の一実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号26に記載される可変領域配列のCDR1、CDR2、及びCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号28に記載される可変領域配列のうちの1つ、2つ又は3つ全てのCDRを含むc-Metに結合する。特定の一実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号28に記載される可変領域配列のCDR1、CDR2、及びCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号30に記載される可変領域配列のうちの1つ、2つ又は3つ全てのCDRを含むc-Metに結合する。特定の一実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号30に記載される可変領域配列のCDR1、CDR2、及びCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号32に記載される可変領域配列のうちの1つ、2つ又は3つ全てのCDRを含むc-Metに結合する。特定の一実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号32に記載される可変領域配列のCDR1、CDR2、及びCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号34に記載される可変領域配列のうちの1つ、2つ又は3つ全てのCDRを含むc-Metに結合する。特定の一実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号34に記載される可変領域配列のCDR1、CDR2、及びCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ラクダ科の動物に由来する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ヒト化されている。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、アクセプターヒトフレームワークを含む。

【0056】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、以下から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は3つ全てのCDRを含むc-Metに結合する: (a)配列番号5、8、11、14、17、又は20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、(b)配列番号6、9、12、15、18、又は21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び(c)配列番号7、10、13、16、19、又は22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、以下の相補性決定領域を含むc-Metに結合する: (a)配列番号5、8、11、14、17、又は20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、(b)配列番号6、9、12、15、18、又は21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び(c)配列番号7、10、13、16、19、又は22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ラクダ科の動物に由来する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ヒト化されている。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、アクセプターヒトフレームワークを含む。

【0057】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号5に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号7に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号8に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号11に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号13に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号14に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号17に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号18に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ラクダ科の動物に由来する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ヒト化されている。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、アクセプターヒトフレームワークを含む。

【0058】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号5に記載されるアミノ酸配列のCDR1、配列番号6に記載されるアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号7に記載されるアミノ酸配列のCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号8に記載されるアミノ酸配列のCDR1、配列番号9に記載されるアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号10に記載されるアミノ酸配列のCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号11に記載されるアミノ酸配列のCDR1、配列番号12に記載されるアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号13に記載されるアミノ酸配列のCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号14に記載されるアミノ酸配列のCDR1、配列番号15に記載されるアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号16に記載されるアミノ酸配列のCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号17に記載されるアミノ酸配列のCDR1、配列番号18に記載されるアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号19に記載されるアミノ酸配列のCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号20に記載されるアミノ酸配列のCDR1、配列番号21に記載されるアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号22に記載されるアミノ酸配列のCDR3を含むc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ラクダ科の動物に由来する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ヒト化されている。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、アクセプターヒトフレームワークを含む。

【0059】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号24、26、28、30、32、又は34に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むc-Metに結合し、必要に応じて、単一可変ドメインは、上記の特定のCDR1、CDR2、及び/又はCDR3配列を含む。

【0060】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号24に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むc-Metに結合し、単一可変ドメインは、配列番号5に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号7に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。

【0061】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号26に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むc-Metに結合し、単一可変ドメインは、配列番号8に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。

【0062】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号28に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むc-Metに結合し、単一可変ドメインは、配列番号11に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号13に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。

【0063】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号30に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むc-Metに結合し、単一可変ドメインは、配列番号14に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。

【0064】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号32に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むc-Metに結合し、単一可変ドメインは、配列番号17に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号18に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。

【0065】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号34に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含むc-Metに結合し、単一可変ドメインは、配列番号20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。

【0066】

一部の実施形態では、少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有する単一可変ドメインアミノ酸配列は、参照配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む単一可変ドメインは、c-Metに結合する能力を保持する。一部の実施形態では、合計1～18個、1～16個、1～14個、1～12個、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、又は1～2個のアミノ酸が、配列番号24、26、28、30、32、及び34から選択されるアミノ酸配列において置換され、挿入され、及び/又は欠失させられる。一部の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、CDRの外側の領域内(すなわち、FR内)に生じる。一部の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、CDR領域内、例えば、CDR1、CDR2、及びCDR3のうちの1つ、2つ、又は3つにおいて生じる。一部の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、CDR領域内及び非CDR領域内に生じる。必要に応じて、単一可変ドメインは、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号24、26、28、30、32、及び34から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0067】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号24、26、28、30、32、又は34に記載されるアミノ酸配列を含むc-Metに結合する。

【0068】

一部の実施形態では、単一可変ドメイン(上記の実施形態のいずれか、例えば、特定のCDR1、CDR2及び/又はCDR3を含む上記の単一可変ドメインを含む)は、V_HHである。一部の特定の実施形態では、V_HHは、N末端からC末端までの順に、以下の構造を有する: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

【0069】

一部の実施形態では、単一可変ドメイン(上記の実施形態のいずれか、例えば、特定のCDR1、CDR2及び/又はCDR3を含む上記の単一可変ドメインを含む)は、ヒト化V_HHである。非ヒト起源のV_HHは、元のV_HHのアミノ酸配列中の1つ又は複数のアミノ酸残基を、ヒトの従来の4本鎖抗体のV_Hドメイン中の対応する位置に存在する1つ又は複数のアミノ酸残基で置き換えることによって、「ヒト化」されうる。ヒト化は、免疫原性を低下させるために望ましい場合がある。

【0070】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、c-Metに結合し、そのアミノ酸配列は、配列番号24、26、28、30、32、又は34に記載されている。

【0071】

本開示はまた、本開示の単一可変ドメインのうちのいずれか1つのものと同じエピトープに結合する単一可変ドメインも提供する。一部の特定の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号24、26、28、30、32、又は34に記載されるアミノ酸配列を含む単一可変ドメインのものと同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、同じエピトープに結合する単一可変ドメインは、ラクダ科の動物に由来するか、又はヒト化されている。

【0072】

同じエピトープへの結合に基づき、当業者に公知の従来の手法を使用して、単一可変ドメインの競合的スクリーニングを実施することができる。例えば、競合試験を実施して、抗原への結合に関して互いに競合する単一可変ドメインを得ることができる。したがって、本開示はまた、c-Metへの結合に関して、本開示に記載される単一可変ドメインのいずれか1つと競合する単一可変ドメインも提供する。一部の特定の実施形態では、単一可変ドメインは、c-Metへの結合に関して、配列番号24、26、28、30、32、又は34に記載されるアミノ酸配列を含む単一可変ドメインと競合する。c-Metへの結合は、ELISA、フローサイトメトリー、若しくは表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイ、又は当技術分野で公知の任意の他の方法によって測定することができる。一部の実施形態では、c-Metへの結合に関して競合する単一可変ドメインは、ラクダ科の動物に由来するか、又はヒト化されている。

【0073】

一部の実施形態では、上記の実施形態のいずれか1つによる単一可変ドメインは、以下の特性及び特徴のうちの1つ又はいくつかを、単独で又は組み合わせて含みうる:
(i)ヒトc-Met若しくは/及びサルc-Metに結合すること、
(ii)HGF若しくはそのβ鎖のc-Metへの結合を遮断すること、又は
(iii)HGF刺激によって引き起こされるc-Metリン酸化を阻害すること。

【0074】

一部の実施形態では、単一可変ドメインはc-Metに結合する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、HGF又はそのβ鎖のc-Metへの結合を遮断する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、HGF刺激によって引き起こされるc-Metリン酸化を阻害する。

【0075】

本開示は、c-Metに結合するいくつかの例示的な単一可変ドメインを提供する。本開示によって提供される例示的な単一可変ドメインのCDR(CDR1、CDR2及びCDR3)のアミノ酸配列は、以下のTable S1(表1)に提供される。例示的な単一可変ドメインの全長アミノ酸配列は、以下のTable S2(表2)に提供される。

【0076】

【表1】

【0077】

【表2】

【0078】

抗体又はその抗原結合性断片
本開示は、c-Met(例えば、ヒトc-Met)に結合する単離された抗体又はその抗原結合性断片であって、本開示の少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含む抗体又はその抗原結合性断片を提供する。

【0079】

本開示によって提供される、c-Metに結合する抗体又はその抗原結合性断片は、いくつかの望ましい治療特性、例えば、ヒトc-Metに対する良好な親和性、リガンドHGF又はそのβ鎖のc-Metへの結合を遮断する能力、及びHGF刺激によって引き起こされるc-Metリン酸化の阻害、c-Met発現レベルが異なる細胞に対する良好な結合性能、及び腫瘍細胞の死滅のうちの1つ又は複数を有する。

【0080】

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、配列番号24に記載される可変領域配列のうちの1つ、2つ、又は3つ全てのCDRを含む。一部の特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、配列番号24に記載される可変領域配列のCDR1、CDR2、及びCDR3を含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、配列番号26に記載される可変領域配列のうちの1つ、2つ、又は3つ全てのCDRを含む。一部の特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、配列番号26に記載される可変領域配列のCDR1、CDR2、及びCDR3を含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、配列番号28に記載される可変領域配列のうちの1つ、2つ、又は3つ全てのCDRを含む。一部の特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、配列番号28に記載される可変領域配列のCDR1、CDR2、及びCDR3を含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、配列番号30に記載される可変領域配列のうちの1つ、2つ、又は3つ全てのCDRを含む。一部の特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、配列番号30に記載される可変領域配列のCDR1、CDR2、及びCDR3を含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、配列番号32に記載される可変領域配列のうちの1つ、2つ、又は3つ全てのCDRを含む。一部の特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、配列番号32に記載される可変領域配列のCDR1、CDR2、及びCDR3を含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、配列番号34に記載される可変領域配列のうちの1つ、2つ、又は3つ全てのCDRを含む。一部の特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、配列番号34に記載される可変領域配列のCDR1、CDR2、及びCDR3を含む。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ラクダ科の動物に由来する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ヒト化されている。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、アクセプターヒトフレームワークを含む。

【0081】

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、以下から選択される少なくとも1つ、少なくとも2つ、又は3つ全てのCDRを含む: (a)配列番号5、8、11、14、17、又は20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、(b)配列番号6、9、12、15、18、又は21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び(c)配列番号7、10、13、16、19、又は22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの(1つ又は複数の)単一可変ドメインを含み、ここで単一可変ドメインは、以下の相補性決定領域を含む: (a)配列番号5、8、11、14、17、又は20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、(b)配列番号6、9、12、15、18、又は21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び(c)配列番号7、10、13、16、19、又は22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ラクダ科の動物に由来する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ヒト化されている。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、アクセプターヒトフレームワークを含む。

【0082】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、(a)配列番号5に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号7に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、(b)配列番号8に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、(c)配列番号11に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号13に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、(d)配列番号14に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、(e)配列番号17に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号18に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、又は(f)配列番号20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ラクダ科の動物に由来する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ヒト化されている。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、アクセプターヒトフレームワークを含む。

【0083】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、(a)配列番号5に記載されるアミノ酸配列のCDR1、配列番号6に記載されるアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号7に記載されるアミノ酸配列のCDR3、(b)配列番号8に記載されるアミノ酸配列のCDR1、配列番号9に記載されるアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号10に記載されるアミノ酸配列のCDR3、(c)配列番号11に記載されるアミノ酸配列のCDR1、配列番号12に記載されるアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号13に記載されるアミノ酸配列のCDR3、(d)配列番号14に記載されるアミノ酸配列のCDR1、配列番号15に記載されるアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号16に記載されるアミノ酸配列のCDR3、(e)配列番号17に記載されるアミノ酸配列のCDR1、配列番号18に記載されるアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号19に記載されるアミノ酸配列のCDR3、又は(f)配列番号20に記載されるアミノ酸配列のCDR1、配列番号21に記載されるアミノ酸配列のCDR2、及び配列番号22に記載されるアミノ酸配列のCDR3を含む。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ラクダ科の動物に由来する。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、ヒト化されている。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、アクセプターヒトフレームワークを含む。

【0084】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号24、26、28、30、32、又は34に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号24、26、28、30、32、又は34に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインは、上記の特定のCDR1、CDR2、及び/又はCDR3配列を含む。

【0085】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号24に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインは、配列番号5に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号7に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。

【0086】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号26に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインは、配列番号8に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。

【0087】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号28に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインは、配列番号11に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号13に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。

【0088】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号30に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインは、配列番号14に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。

【0089】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号32に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインは、配列番号17に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号18に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。

【0090】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号34に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、単一可変ドメインは、配列番号20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3を含む。

【0091】

一部の実施形態では、少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有する単一可変ドメインアミノ酸配列は、参照配列と比較して、置換(例えば、保存的置換)、挿入、又は欠失を含み、しかし、その配列を含む単一可変ドメインを含む抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metに結合する能力を保持する。一部の実施形態では、合計1～18個、1～16個、1～14個、1～12個、1～10個、1～9個、1～8個、1～7個、1～6個、1～5個、1～4個、1～3個、又は1～2個のアミノ酸が、配列番号24、26、28、30、32、及び34から選択されるアミノ酸配列において置換され、挿入され、及び/又は欠失させられる。一部の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、CDRの外側の領域内(すなわち、FR内)に生じる。一部の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、CDR領域内、例えば、CDR1、CDR2、及びCDR3のうちの1つ、2つ、又は3つにおいて生じる。一部の実施形態では、置換、挿入又は欠失は、CDR領域内及び非CDR領域内に生じる。必要に応じて、単一可変ドメインは、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号24、26、28、30、32、及び34から選択されるアミノ酸配列を含む。

【0092】

一部の実施形態では、単一可変ドメインは、配列番号24、26、28、30、32、又は34に記載されるアミノ酸配列を含む。

【0093】

抗体又はその抗原結合性断片が2つ又はより多くの単一可変ドメインを含む場合、同一又は異なる単一可変ドメインを選択することができる。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体又は三重特異性抗体)、又は当技術分野で公知の他の構成の抗体でありうる。抗原結合性断片は、単一可変ドメインでありうる。特定の一実施形態では、抗体は単一特異性抗体である。特定の一実施形態では、抗体は二重特異性抗体である。

【0094】

一部の実施形態では、単一可変ドメイン(上記の実施形態のいずれか、例えば、特定のCDR1、CDR2及び/又はCDR3を含む上記の単一可変ドメインを含む)は、V_HHである。一部の特定の実施形態では、V_HHは、N末端からC末端までの順に、以下の構造を有する: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

【0095】

一部の実施形態では、単一可変ドメイン(上記の実施形態のいずれか、例えば、特定のCDR1、CDR2及び/又はCDR3を含む上記の単一可変ドメインを含む)は、ヒト化V_HHである。非ヒト起源のV_HHは、元のV_HHのアミノ酸配列中の1つ又は複数のアミノ酸残基を、ヒトの従来の4本鎖抗体のV_Hドメイン中の対応する位置に存在する1つ又は複数のアミノ酸残基で置き換えることによって、「ヒト化」されうる。ヒト化は、免疫原性を低下させるために望ましい場合がある。

【0096】

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ラクダ科の動物に由来する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、キメラ性である。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、IgG定常領域、好ましくはヒトIgG定常領域、より好ましくはヒトIgG1定常領域、ヒトIgG2定常領域、ヒトIgG3定常領域、又はヒトIgG4定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、IgGのFcを含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトIgGのFcを含み、好ましくは、Fcは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のFcである。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ヒト化されている。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、アクセプターヒトフレームワークを含む。

【0097】

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号37、39、41、43、45、又は47に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号37、39、41、43、45、又は47に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%の同一性を有するアミノ酸配列を含み、抗体又はその抗原結合性断片は、本開示に記載される単一可変ドメインにおける特定のCDR1、CDR2、及び/又はCDR3配列を含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号37、39、41、43、45、又は47に記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、少なくとも1つのポリペプチド鎖を含み、ここで少なくとも1つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号37、39、41、43、45、又は47に記載されている。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、2つの同一のポリペプチド鎖を含み、ここで少なくとも1つのポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、配列番号37、39、41、43、45、又は47に記載されている。

【0098】

本開示はまた、本開示の抗体又はその抗原結合性断片のいずれか1つのものと同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合性断片を提供する。一部の特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、配列番号37、39、41、43、45、又は47に記載されるアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合性断片のものと同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、同じエピトープに結合する抗体又はその抗原結合性断片は、ラクダ科の動物に由来するか、キメラ性であるか、又はヒト化されている。

【0099】

同じエピトープへの結合に基づき、当業者に公知の従来の手法を使用して、抗体又はその抗原結合性断片の競合的スクリーニングを実施することができる。例えば、競合試験を実施して、抗原への結合に関して互いに競合する抗体又はその抗原結合性断片を得ることができる。したがって、本開示はまた、c-Metへの結合に関して、本開示に記載される抗体又はその抗原結合性断片のいずれか1つと競合する抗体又はその抗原結合性断片を提供する。一部の特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Metへの結合に関して、配列番号37、39、41、43、45、又は47に記載されるアミノ酸配列を含む抗体又はその抗原結合性断片と競合する。c-Metへの結合は、ELISA、フローサイトメトリー、若しくは表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイ、又は当技術分野で公知の任意の他の方法によって測定することができる。一部の実施形態では、c-Metへの結合に関して競合する抗体又はその抗原結合性断片は、ラクダ科の動物に由来するか、キメラ性であるか、又はヒト化されている。

【0100】

一部の実施形態では、上記の実施形態のいずれか1つによる抗体又はその抗原結合性断片は、以下の特性及び特徴のうちの1つ又はいくつかを、単独で又は組み合わせて含みうる:
(i)ヒトc-Met又は/及びサルc-Metに結合すること、
(ii)HGF又はそのβ鎖のc-Metへの結合を遮断すること、
(iii)HGF刺激によって引き起こされるc-Metリン酸化を阻害すること、
(iv)腫瘍細胞に対して抗体依存性細胞傷害(ADCC)効果を発揮すること。

【0101】

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、c-Met、例えば、サルc-Met及び/又はヒトc-Metに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、カニクイザルc-Metに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトc-Metに結合する。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトc-Metに対して以下の結合親和性(K_D)を有する: 約1E-11M～約1E-07M、約1E-10M～約1E-08M、又は約2.00E-10M～約8.25E-09Mの範囲内。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、ヒトc-Metに対して以下の結合親和性(K_D)を有する: 約1E-07M若しくはそれ未満、約1E-08M若しくはそれ未満、約8.25E-09M若しくはそれ未満、約1E-09M若しくはそれ未満、約2.00E-10M若しくはそれ未満、約1E-10M若しくはそれ未満、又は約1E-11M又はそれ未満。一部の実施形態では、本開示によって提供される抗体又はその抗原結合性断片の結合親和性K_Dは、Biacoreによって測定される。

【0102】

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、HGF又はそのβ鎖のc-Metへの結合を遮断する。

【0103】

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、HGF刺激によって引き起こされるc-Metリン酸化を阻害する。

【0104】

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合性断片は、腫瘍細胞に対してADCC効果を発揮する。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、c-Met発現性腫瘍細胞である。

【0105】

本開示は、例示的な抗体又はその抗原結合性断片、例えば、単一特異性抗体(キメラ抗体1B-3B11-Fc、1B-1B6-Fc、1B-1C7-Fc、1B-1A8-Fc、1B-1B2-Fc、及び3B-1C7-Fcを含む)を提供する。単一可変ドメインは、ヒトIgG1と融合されて、Fcを介してホモ二量体を形成する。例示的な抗体のアミノ酸配列は、以下のTable S3(表3)に提供される。

【0106】

【表3A】

【0107】

【表3B】

【0108】

融合タンパク質
本開示の単一可変ドメイン、及び抗体又はその抗原結合性断片を使用して、任意の所望の融合タンパク質を構築することができ、それによって融合タンパク質に、c-Metへの標的化結合の特性、又は単一可変ドメイン、抗体若しくはその抗原結合性断片が有する他の特性を付与することができる。したがって、本開示は、本開示の単一可変ドメイン、又は抗体若しくはその抗原結合性断片のうちの少なくとも1つ(1つ又は複数)を含む単離された融合タンパク質を提供する。

【0109】

一部の特定の実施形態では、融合タンパク質は、本開示の例示的なCDR配列、単一可変ドメイン配列、又は抗体配列、例えば、Table S1(表1)中のいずれかの単一可変ドメインにおける1つ、2つ、若しくは3つのCDR配列、Table S2(表2)中のいずれかの単一可変ドメイン配列、又はTable S3(表3)中のいずれかの抗体配列を含み、必要に応じて、融合タンパク質は、当技術分野で公知の任意の修飾(例えば、グリコシル化修飾又は化学修飾)を受けてもよい。

【0110】

融合タンパク質が2つ又はより多くの単一可変ドメインを含む場合、同一の又は異なる単一可変ドメインを選択することができる。

【0111】

医薬組成物
本開示は、本開示の抗体又はその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。本開示はまた、本開示の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供する。一部の実施形態では、1B-3B11-Fc、1B-1B6-Fc、1B-1C7-Fc、1B-1A8-Fc、1B-1B2-Fc、及び3B-1C7-Fc抗体のうちのいずれか1つ又は複数、並びに薬学的に許容される担体が、医薬組成物へと形成される。

【0112】

単離された核酸
本開示は、本開示に記載される単一可変ドメイン、又は抗体若しくはその抗原結合性断片をコードする単離された核酸を提供する。本開示はまた、本開示に記載される融合タンパク質をコードする単離された核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、単一可変ドメイン、例えば、1B-3B11-Fc、1B-1B6-Fc、1B-1C7-Fc、1B-1A8-Fc、1B-1B2-Fc、又は3B-1C7-Fcの単一可変ドメインをコードする。一部の実施形態では、核酸は、抗体又はその抗原結合性断片、例えば、1B-3B11-Fc、1B-1B6-Fc、1B-1C7-Fc、1B-1A8-Fc、1B-1B2-Fc、又は3B-1C7-Fcをコードする。

【0113】

例として、いくつかの単一可変ドメイン、抗体又はその抗原結合性断片の核酸配列を、配列表に列挙している。

【0114】

ベクター
本開示は、単離された核酸を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターはクローニングベクターであり、一部の他の実施形態では、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターは、必要に応じて、本開示に記載される単一可変ドメイン、又は抗体若しくはその抗原結合性断片を発現することができる任意の発現ベクターである。発現ベクターは、必要に応じて、本開示に記載される融合タンパク質を発現することができる任意の発現ベクターである。具体な一例として、発現ベクターはpcDNA3.1である。

【0115】

宿主細胞
本開示は、本開示に記載される核酸又はベクターを含む宿主細胞であって、単一可変ドメイン、抗体又はその抗原結合性断片をクローニング又は発現するために好適な宿主細胞を提供する。本開示はまた、本開示に記載される核酸又はベクターを含む宿主細胞であって、融合タンパク質をクローニング又は発現するために好適な宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は原核細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は真核細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞、及び単一可変ドメイン、抗体若しくはその抗原結合性断片、又は融合タンパク質を調製するために好適な他の細胞から選択される。哺乳動物細胞は、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はCHO-S細胞である。

【0116】

単一可変ドメイン、抗体若しくはその抗原結合性断片、又は融合タンパク質を調製するための方法
本開示は、単一可変ドメインを調製するための方法であって、本開示の単一可変ドメインをコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞又は宿主細胞培地から単一可変ドメインを回収することを含む方法を提供する。本開示はまた、抗体又はその抗原結合性断片を調製するための方法であって、本開示の抗体又はその抗原結合性断片をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞又は宿主細胞培地から抗体又はその抗原結合性断片を回収することを含む方法も提供する。本開示はまた、融合タンパク質を調製するための方法であって、本開示の融合タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞又は宿主細胞培地から融合タンパク質を回収することを含む方法も提供する。

【0117】

単一可変ドメイン、又は抗体若しくはその抗原結合性断片を産生させるためには、単一可変ドメイン、抗体又はその抗原結合性断片をコードする核酸を、さらなるクローニング及び/又は宿主細胞における発現のためにベクターに挿入する。融合タンパク質を産生させるためには、融合タンパク質をコードする核酸を、さらなるクローニング又は/及び宿主細胞における発現のためにベクターに挿入する。核酸は、当技術分野で公知の種々の方法、例えば、遺伝子スプライシング及び化学合成を使用して得ることができる。

【0118】

使用
本開示は、本開示の単一可変ドメイン、抗体若しくはその抗原結合性断片、又は融合タンパク質の使用を提供する。本開示はまた、本開示の医薬組成物の使用も提供する。

【0119】

本開示は、腫瘍を有する対象を処置するための医薬を調製するための、本開示の単一可変ドメインの使用を提供する。本開示はまた、腫瘍を有する対象を処置するための医薬を調製するための、本開示の抗体又はその抗原結合性断片の使用も提供する。本開示はまた、腫瘍を有する対象を処置するための医薬を調製するための、本開示の融合タンパク質の使用も提供する。本開示はまた、腫瘍を有する対象を処置するための医薬を調製するための、本開示の医薬組成物の使用も提供する。

【0120】

本開示は、試料中のc-Metを検出又は測定するための方法であって、試料を本開示の単一可変ドメイン、又は抗体若しくはその抗原結合性断片と接触させること、及び結合複合体を検出又は測定することを含む方法を提供する。本開示はまた、試料中のc-Metを検出又は測定するための方法であって、試料を本開示の融合タンパク質と接触させること、及び結合複合体を検出又は測定することを含む方法も提供する。

【0121】

本開示は、細胞におけるc-Metシグナル伝達を阻害するか、減少させるか又は遮断するための方法であって、本開示に記載される単一可変ドメイン、又は抗体若しくはその抗原結合性断片の有効量を細胞に投与することを含む方法を提供する。本開示はまた、細胞におけるc-Metシグナル伝達を阻害するか、低下させるか又は遮断するための医薬を調製するための、本開示の単一可変ドメイン、又は抗体若しくはその抗原結合性断片の使用も提供する。本開示は、細胞におけるc-Metシグナル伝達を阻害するか、低下させるか又は遮断するための方法であって、本開示の融合タンパク質の有効量を細胞に投与することを含む方法を提供する。本開示はまた、細胞におけるc-Metシグナル伝達を阻害するか、低下させるか又は遮断するための医薬を調製するための、本開示の融合タンパク質の使用も提供する。本開示は、細胞におけるc-Metシグナル伝達を阻害するか、低下させるか又は遮断するための方法であって、本開示に記載の医薬組成物の有効量を細胞に投与することを含む方法を提供する。本開示はまた、細胞におけるc-Metシグナル伝達を阻害するか、低下させるか又は遮断するための医薬を調製するための、本開示の医薬組成物の使用も提供する。一部の実施形態では、細胞は腫瘍細胞である。

【0122】

本開示は、腫瘍細胞の増殖を阻害するか又は腫瘍細胞を死滅させるための方法であって、本開示の単一可変ドメイン、又は抗体若しくはその抗原結合性断片の有効量を腫瘍細胞に投与することを含む方法を提供する。本開示はまた、腫瘍細胞の増殖を阻害するか又は腫瘍細胞を死滅させるための医薬を調製するための、単一可変ドメイン、又は抗体若しくはその抗原結合性断片の使用も提供する。本開示は、腫瘍細胞の増殖を阻害するか又は腫瘍細胞を死滅させるための方法であって、本開示の融合タンパク質の有効量を腫瘍細胞に投与することを含む方法を提供する。本開示はまた、腫瘍細胞の増殖を阻害するか又は腫瘍細胞を死滅させるための医薬を調製するための、融合タンパク質の使用も提供する。本開示は、腫瘍細胞の増殖を阻害するか又は腫瘍細胞を死滅させるための方法であって、本開示の医薬組成物の有効量を腫瘍細胞に投与することを含む方法を提供する。本開示はまた、腫瘍細胞の増殖を阻害するか又は腫瘍細胞を死滅させるための医薬を調製するための、医薬組成物の使用も提供する。

【0123】

本開示は、腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、本開示に記載の単一可変ドメイン、又は抗体若しくはその抗原結合性断片の治療有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。本開示はまた、腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、本開示に記載の融合タンパク質の治療有効量を対象に投与することを含む方法も提供する。本開示はまた、腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、本開示に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法も提供する。処置を必要とする対象には、疾患又は状態を有する者、並びに疾患又は状態を有する可能性があり、その目的が疾患又は状態を予防すること、遅延させること又は軽減することである者が含まれる。

【0124】

一部の実施形態では、上記の腫瘍はc-Met発現性腫瘍である。一部の実施形態では、上記の腫瘍はc-Met過剰発現性腫瘍である。一部の実施形態では、上記の腫瘍は固形腫瘍である。一部の実施形態では、上記の腫瘍は非固形腫瘍である。一部の実施形態では、上記の腫瘍は、脳悪性腫瘍、頭頸部がん、肺がん、食道がん、咽頭がん、鼻腔がん、舌がん、口腔がん、甲状腺がん、皮膚がん、骨がん、軟部肉腫、骨髄腫、胃がん、胃食道接合部腺がん、乳がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、リンパ腫、胸腺がん、膀胱がん、膣がん、精巣がん、子宮がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肛門がん、乳頭がん、前立腺がん、卵巣がん、上皮細胞がん、又は血液腫瘍である。一部の実施形態では、肺がんは非小細胞肺がんである。一部の実施形態では、脳悪性腫瘍は神経膠芽腫である。

【0125】

本開示は、以下の特定の実施形態を更に提供するが、これらは本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0126】

実施形態1. 単離された抗体又はその抗原結合性断片であって、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの単一可変ドメインを含み、単一可変ドメインが以下の相補性決定領域:
a)配列番号5、8、11、14、17、又は20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、
b)配列番号6、9、12、15、18、又は21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び
c)配列番号7、10、13、16、19、又は22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む、抗体又はその抗原結合性断片。

【0127】

実施形態2. 単一可変ドメインが、
a)配列番号5に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号7に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、
b)配列番号8に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、
c)配列番号11に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号13に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、
d)配列番号14に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、
e)配列番号17に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号18に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、又は
f)配列番号20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む、実施形態1に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【0128】

実施形態3. 単一可変ドメインが、配列番号24、26、28、30、32、又は34に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態2に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【0129】

実施形態4. 単一可変ドメインが、配列番号24、26、28、30、32、又は34に記載されるアミノ酸配列を含む、実施形態3に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【0130】

実施形態5. 単一可変ドメインがV_HHである、実施形態1～4のいずれか1つに記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【0131】

実施形態6. キメラ性であるか又はヒト化されている、実施形態1～5のいずれか1つに記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【0132】

実施形態7. ヒトIgGのFc、好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のFcを含む、実施形態1～6のいずれか1つに記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【0133】

実施形態8. 配列番号37、39、41、43、45、又は47に記載されるアミノ酸配列を含む、実施形態1～7のいずれか1つに記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【0134】

実施形態9. 以下の特性及び特徴のうちの1つ又はいくつかを、単独で又は組み合わせて含みうる、実施形態1～8のいずれか1つに記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【0135】

実施形態10. ヒトc-Met又は/及びサルc-Metに結合すること、

【0136】

実施形態11. HGF又はそのβ鎖のc-Metへの結合を遮断すること、

【0137】

実施形態12. HGF刺激によって引き起こされるc-Metリン酸化を阻害すること、

【0138】

実施形態13. 腫瘍細胞に対してADCC効果を発揮すること。

【0139】

実施形態14. 実施形態1～9のいずれか1つに記載の抗体又はその抗原結合性断片を含む融合タンパク質。

【0140】

実施形態15. 実施形態1～9のいずれか1つに記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、又は実施形態10に記載の融合タンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【0141】

実施形態16. 実施形態1～9のいずれか1つに記載の抗体若しくはその抗原結合性断片又は実施形態10に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。

【0142】

実施形態17. 実施形態12に記載の単離された核酸を含むベクター。

【0143】

実施形態18. 実施形態12に記載の核酸又は実施形態13に記載のベクターを含む宿主細胞。

【0144】

実施形態19. 実施形態1～9のいずれか1つに記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片を調製する方法であって、実施形態14に記載の宿主細胞を培養すること、及び発現された抗体又はその抗原結合性断片を単離することを含み、ベクターが発現ベクターである、方法。

【0145】

実施形態20. 腫瘍を有する対象を処置するための医薬を調製するための、実施形態1～9のいずれか1つに記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片の使用。

【0146】

実施形態21. 腫瘍を有する対象を処置するための医薬を調製するための、実施形態10に記載の融合タンパク質の使用。

【0147】

実施形態22. 腫瘍を有する対象を処置するための医薬を調製するための、実施形態11に記載の医薬組成物の使用。

【0148】

実施形態23. 腫瘍が、脳悪性腫瘍、頭頸部がん、肺がん、食道がん、咽頭がん、鼻腔がん、舌がん、口腔がん、甲状腺がん、皮膚がん、骨がん、軟部肉腫、骨髄腫、胃がん、胃食道接合部腺がん、乳がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、リンパ腫、胸腺がん、膀胱がん、膣がん、精巣がん、子宮がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肛門がん、乳頭がん、前立腺がん、卵巣がん、上皮細胞がん、又は血液腫瘍である、実施形態16～18のいずれか1つに記載の使用。

【0149】

実施形態24. 試料中のc-Metを検出又は測定するための方法であって、試料を実施形態1～9のいずれか1つに記載の抗体又はその抗原結合性断片と接触させること、及び結合複合体を検出又は測定することを含む方法。

【0150】

実施形態25. 細胞におけるc-Metシグナル伝達を阻害するか、減少させるか又は遮断する方法であって、実施形態1～9のいずれか1つに記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、実施形態10に記載の融合タンパク質、又は実施形態11に記載の医薬組成物の有効量を細胞に投与することを含む方法。

【0151】

実施形態26. 腫瘍細胞の増殖を阻害するか又は腫瘍細胞を死滅させるための方法であって、実施形態1～9のいずれか1つに記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、実施形態10に記載の融合タンパク質、又は実施形態11に記載の医薬組成物の有効量を腫瘍細胞に投与することを含む方法。

【0152】

実施形態27. 腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、実施形態1～9のいずれか1つに記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、実施形態10に記載の融合タンパク質、又は実施形態11に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与することを含む方法。

【0153】

実施形態28. 腫瘍が、脳悪性腫瘍、頭頸部がん、肺がん、食道がん、咽頭がん、鼻腔がん、舌がん、口腔がん、甲状腺がん、皮膚がん、骨がん、軟部肉腫、骨髄腫、胃がん、胃食道接合部腺がん、乳がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、リンパ腫、胸腺がん、膀胱がん、膣がん、精巣がん、子宮がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肛門がん、乳頭がん、前立腺がん、卵巣がん、上皮細胞がん、又は血液腫瘍である、実施形態22又は23に記載の方法。

【0154】

上記の発明を、明確な理解のために説明図及び例を提供することによってかなり詳細に説明してきたが、本開示の教示に照らして、添付される特許請求の範囲の趣旨又は範囲から逸脱することなく、本開示に対して特定の変更及び修正を行うことができることは、当業者には明らかであろう。以下の実施例は、例示の目的のためにのみ提供され、限定することを意図しない。当業者は、変更又は修正しても実質的に同様の結果が得られる、種々の決定的ではないパラメーターを容易に識別するであろう。

【実施例1】

【0155】

抗c-Met V_HHファージディスプレイライブラリーの構築
1.1 動物の免疫処置
組換えヒトc-Met-Fc融合タンパク質(SinoBiological社、製品カタログ番号10692-H02H)を、フロイント完全アジュバントと1:1の容積比で混合して乳化させた。まず、フタコブラクダに皮下多点注射による免疫処置を行い、続いて、不完全フロイントアジュバントと1:1の容積比で混合して乳化させた組換えヒトc-Met-Fc融合タンパク質により、ブースターとして2週間間隔で免疫処置を行った。4回目又は5回目の免疫処置後に血清を採取して、抗ヒトc-Met抗体力価に関してアッセイした。複数回の免疫処置の後に、フタコブラクダの末梢血を採取して、末梢血単核細胞(PBMC)を単離した。

【0156】

1.2 RNA抽出
TRIzol(商標)試薬を使用して、PBMC(1.1のもの)から全RNAを抽出した。抽出された全RNAの品質を、1%アガロースゲル電気泳動によって評価した。定量は、260nm及び280nmの吸光度を測定することによって行った。OD_260nm/OD_280nmの比は、1.8～2.0の間にあるはずである。

【0157】

1.3 V_HH増幅
cDNA合成キット、PrimeScript(商標)II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA社、製品カタログ番号6210A)を指示に従って使用して、全RNAをcDNAに逆転写した。ラクダ抗体の可変領域(V_HH)配列を、具体的には以下の通りに、ネステッドPCRによって増幅した: cDNAをテンプレートとして、プライマーCall001(配列番号1)及びCall002(配列番号2)を使用して、1回目のPCR増幅を行った。増幅により短い断片で得られたDNA産物を、ゲル回収キット(QIAGEN社、製品カタログ番号28706)を使用して精製した。1回目のPCRの産物をテンプレートとして用い、プライマーV-Back(配列番号3)及びV-Fwd(配列番号4)を使用して、2回目のPCR増幅を行った。増幅により得られたDNA産物は、V_HHをコードする断片であり、続いてこれをゲル回収キット(QIAGEN社、製品カタログ番号28706)を使用して精製した。
Call001(配列番号1): GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
Call002(配列番号2): GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
V-Back(配列番号3): GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
V-Fwd(配列番号4): CTAGTGCGGCCGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGT

【0158】

1.4 V_HHファージライブラリーの構築
増幅により得られたV_HHコード断片をPstI/NotIエンドヌクレアーゼで消化し、ファージミドベクターpMECS(NTCC Plasmid Vector, Strain, Cell and Gene Collection社、製品カタログ番号pMECS)に挿入して組換えベクターを構築し、続いてこれを大腸菌(Escherichia coli)TG1(Lucigen社、製品カタログ番号60502-1)に電気的に移入した。形質転換された細菌液の少量を希釈し、続いて100μg/mLアンピシリンを含む選択用プレートに適用した。コロニー計数によってライブラリー容量を計算し、100個のランダムなクローンを採取して配列決定を行い、ライブラリーの品質を評価した。残りの細菌液は、100μg/mLアンピシリンを含有する選択用プレートに適用した。細菌コロニーの菌叢をプレートから削り取り、グリセロールを添加して、ライブラリーストックとして-80℃で凍結保存した。ライブラリーストックを対数増殖期まで増幅させた。ライブラリーの増幅は、M13KO7ヘルパーファージ(New England Biolabs社、製品カタログ番号N0315S)を添加して、200rpm、28℃で一晩振盪することによって行った。細菌液を遠心分離して、上清を収集した。PEG6000/NaCl溶液(20% PEG6000(w/v)、2.5M NaCl)の上清容積の1/4を添加した。混合物を氷上で1～2時間インキュベートして、ファージを沈降させた。沈降したファージを遠心分離して収集し、PBS中に再懸濁させ、続いて20%グリセロールを添加した。この懸濁液を、V_HHファージディスプレイライブラリーとして-80℃で保存した。

【実施例2】

【0159】

抗ヒトc-Met V_HHのスクリーニング
2.1 パニング
V_HHファージディスプレイライブラリーを固相パニングに供した。組換えc-Met-Avitage(商標)(ACRO社、製品カタログ番号MET-H82E1)を、高吸着マイクロプレート上に固定した。ブロッキングの後に、1.4で得られたファージをウェルプレートに添加して、プレートを37℃で1～2時間インキュベートした。プレートを、Tweenを含むリン酸緩衝食塩水(PBST)で10回洗浄して、非特異的に結合したファージを除去した。PBSで洗浄した後に、結合したファージをトリプシンで溶出させた。酵素を4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩(AEBSF)で中和し、溶出したファージを使用して大腸菌TG1を感染させた。増幅後にライブラリーパニングをもう1回実施した。2～3回のパニング及び濃縮の後に、回収したファージを使用して、対数増殖期にある大腸菌TG1を感染させた。この細菌を、20%(w/v)グルコース及び100μg/mLアンピシリンを含有する選択用プレートに適用した。個々のクローンを採取して培養した。イソプロピル-β-D-チオガラクトシド(IPTG)によって発現を誘導し、上清を収集した。

【0160】

2.2 陽性クローンの同定
採取したクローンを、ヒトc-Met-His(SinoBiological社、製品カタログ番号10692-H08H)に関する間接的ELISAによる陽性同定に供した。ヒトc-Met-His又は対照タンパク質であるヒトFcタンパク質(ACRO社、製品カタログ番号FCC-H5214)を高吸着マイクロプレートにコーティングし、続いてブロッキング緩衝液でブロッキングした。2.1で調製された上清を添加し、プレートを37℃で1時間インキュベートした。プレート洗浄後に、HRP結合抗HAタグ二次抗体(GenScript社、製品カタログ番号A01296)を添加した。プレートを37℃で0.5時間インキュベートした後に5回洗浄し、発色基質を添加して発色させた。波長450nm及び参照波長650nmで光吸収シグナル値を測定した。比較的高いシグナル値でヒトc-Met-Hisにのみ結合する陽性クローンを保存のために選択して、配列決定を行った。

【0161】

陽性クローン1B-1B2、1B-3B11、1B-1C7、1B-1B6、1B-1A8及び3B-1C7が、スクリーニングにより得られた。配列解析により、1B-3B11のV_HHは、配列番号23に記載されるヌクレオチド配列を有し、配列番号24に記載されるアミノ酸配列を有すること、1B-1B6のV_HHは、配列番号25に記載されるヌクレオチド配列を有し、配列番号26に記載されるアミノ酸配列を有すること、1B-1C7のV_HHは、配列番号27に記載されるヌクレオチド配列を有し、配列番号28に記載されるアミノ酸配列を有すること、1B-1A8のV_HHは、配列番号29に記載されるヌクレオチド配列を有し、配列番号30に記載されるアミノ酸配列を有すること、1B-1B2のV_HHは、配列番号31に記載されるヌクレオチド配列を有し、配列番号32に記載されるアミノ酸配列を有すること、3B-1C7のV_HHは、配列番号33に記載されるヌクレオチド配列を有し、配列番号34に記載されるアミノ酸配列を有することが示されている。

【実施例3】

【0162】

抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体の調製
3.1 V_HH-Fcキメラ抗体の調製
スクリーニングにより得られた陽性クローンのV_HH配列をヒトFc領域に連結させて、V_HH-Fcキメラ抗体を構築した。具体的には、2.2で配列決定を行ったV_HH配列を、ヒトIgG1 Fc領域を含有するpCDNA3.1真核生物発現ベクターに挿入し、Expifectamine(商標)CHO Transfection Kit一過性発現システム(Thermo Fisher Scientific社、製品カタログ番号A29129)を使用してV_HH-Fcキメラ抗体を発現させた。

【0163】

配列解析により、1B-3B11-Fcの全長は、配列番号37に記載されるアミノ酸配列を有し、配列番号36に記載されるヌクレオチド配列を有すること、1B-1B6-Fcの全長は、配列番号39に記載されるアミノ酸配列を有し、配列番号38に記載されるヌクレオチド配列を有すること、1B-1C7-Fcの全長は、配列番号41に記載されるアミノ酸配列を有し、配列番号40に記載されるヌクレオチド配列を有すること、1B-1A8-Fcの全長は、配列番号43に記載されるアミノ酸配列を有し、配列番号42に記載されるヌクレオチド配列を有すること、1B-1B2-Fcの全長は、配列番号45に記載されるアミノ酸配列を有し、配列番号44に記載されるヌクレオチド配列を有すること、3B-1C7-Fcの全長は、配列番号47に記載されるアミノ酸配列を有し、配列番号46に記載されるヌクレオチド配列を有することが示されている。

【0164】

3.2 表面プラズモン共鳴によるV_HH-Fcキメラ抗体のヒトc-Met及びカニクイザルc-Metに対する親和性の測定
抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体を、親和性に関して、生体分子相互作用分析システム(GE社、Biacore T200)を使用して試験した。抗hIgG(Fc)抗体(GE社、製品カタログ番号BR-1008-39)を、CM5センサーチップにアミノカップリングさせた。抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体をランニング緩衝液(137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄・12H₂O、1.8mM KH₂PO₄、0.05%界面活性剤P-20(w/v)、pH 7.4)で1μg/mLに希釈し、希釈液を30μL/分の流速で実験チャネルに通過させて捕捉を行った。ヒトc-Met-His(SinoBiological社、製品カタログ番号10692-H08H)又はカニクイザルc-Met-His(SinoBiological社、カタログ番号90304-C08H)をランニング緩衝液で100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM及び3.125nMに希釈し、希釈液を50μL/分の流速で通過させることによって結合を200秒間行わせた。その後に試料注入を停止することによって解離を800秒間行わせた。データシグナルをBiaControl Software 2.0によってリアルタイムで収集し、BiaEvaluation Software 2.0によって解析した。Langmuir 1:1モデルを使用してフィッティングを行い、結合速度定数K_a(1/Ms)、解離速度定数K_d(1/s)及び平衡解離定数K_D(M)を算出した。結果はTable 1(表4)に示されている。1B-1B2-Fc、1B-3B11-Fc、1B-1C7-Fc、1B-1B6-Fc、1B-1A8-Fc及び3B-1C7-Fcは全て、ヒトc-Metタンパク質に対して比較的高い親和性を有し、いずれもカニクイザルc-Metタンパク質との交差反応性を有する。

【0165】

【表4】

【実施例4】

【0166】

抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体のc-Metを発現する天然細胞株への結合
4.1 抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体の細胞への結合に関するフローサイトメトリーアッセイ
抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体の、異なるc-Met発現レベルを有する標的細胞への結合を、フローサイトメトリーによって検出した。H1993細胞(Beina Bio社、製品カタログ番号BNCC342186)は、高いc-Met発現レベルを有するヒト肺腺がん細胞株であり、MKN45細胞(Nanjing Cobioer Biosciences社、製品カタログ番号CBP60541)は、中程度のc-Met発現レベルを有するヒト胃がん細胞株であり、KP4細胞(Nanjing Cobioer Biosciences社、製品カタログ番号CBP60541)は、低いc-Met発現レベルを有するヒト膵臓がん細胞株である。2×10⁵個の標的細胞を、連続希釈した抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体(初期濃度100nMから5倍に連続希釈して7通りの濃度にした)と共に氷上で1時間インキュベートした後に、細胞を洗浄した。PE標識抗ヒトIgG Fc抗体(Jackson ImmunoResearch社、製品カタログ番号109-116-170)を添加し、混合物を氷上で0.5時間インキュベートした。細胞を洗浄し、続いてフローサイトメーター(Thermo Fisher Scientific社、Attune NXT)を使用して試験した。結果は図1A～図1C及びTable 2(表5)に示されている。1B-1B2-Fc、1B-3B11-Fc、1B-1C7-Fc、1B-1B6-Fc、1B-1A8-Fc、及び3B-1C7-Fcは全て、異なるc-Met発現レベルを有する標的細胞に対して比較的高い結合能を有する。

【0167】

【表5】

【0168】

4.2 抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体の、マカクc-Metを発現する細胞への結合に関するフローサイトメトリーアッセイ
抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体の、マカク上皮細胞4MBr-5(Shanghai Qingqi Biotechnology Development社、製品カタログ番号BFN60807362)への結合を、4.1の方法を参照することによりフローサイトメトリーによって検出した。結果は図1D及びTable 3(表6)に示されている。1B-1B2-Fc、1B-3B11-Fc、1B-1C7-Fc、1B-1B6-Fc、1B-1A8-Fc、及び3B-1C7-Fcは全て、c-Metを発現するマカク上皮細胞4MBr-5を効果的に標的化して結合することができる。

【0169】

【表6】

【実施例5】

【0170】

抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体による受容体/リガンド結合の遮断及び抗体エピトープ競合分析
5.1 抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体によるHGF及びHGFβのc-Met受容体への結合の遮断
抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体が、肝細胞増殖因子(HGF)のc-Met受容体への結合を遮断しうるか否かを、競合ELISA法によって分析した。具体的には、2μg/mLのヒトc-Met-Hisタンパク質(SinoBiological社、製品カタログ番号10692-H08H)を高吸着マイクロプレートにコーティングした後に、3%(w/v)BSAブロッキング緩衝液でブロッキングして、洗浄し、その後に80ng/mLのビオチン結合HGF(SinoBiological社、製品カタログ番号10463-HNAS)及び抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体(初期濃度100nMから5倍に連続希釈して7通りの濃度にした)を添加して、25℃で2時間インキュベートした。プレートを洗浄した後に、HRP結合ストレプトアビジン(eBioscience社、製品カタログ番号18-4100-51)を添加した。プレートを25℃で1時間インキュベートした後に5回洗浄し、TMB基質溶液(TIANGEN社、製品カタログ番号PA107)を100μL/ウェルで添加して発色させた。波長450nm及び参照波長650nmで吸光シグナル値を測定した。曲線(図2A)のフィッティングを行い、IC₅₀値(Table 4(表7))を算出した。

【0171】

同じ方法を使用して、抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体が、HGFのβ鎖(HGFβ、NP_000592.3、Val495-Ser728)のc-Met受容体への結合を遮断しうるか否かを分析した。HGFβは、配列番号35に記載されるアミノ酸配列を有する。この結果に基づいて曲線(図2B)のフィッティングを行い、IC₅₀値を算出した(Table 4(表7))。

【0172】

この結果によれば、1B-3B11-Fc、1B-1B2-Fc、1B-1C7-Fc、1B-1B6-Fc、1B-1A8-Fc、及び3B-1C7-Fcは全て、HGFのc-Met受容体への結合を遮断することができ、1B-3B11-Fc、1B-1C7-Fc、1B-1B6-Fc、及び1B-1A8-FcはHGFβのc-Met受容体への結合を遮断することができ、1B-1B2-Fc及び3B-1C7-FcはHGFβのc-Met受容体への結合を遮断することができない。

【0173】

【表7】

【0174】

5.2 表面プラズモン共鳴による抗ヒトc-Met V_HH-Fcの異なるクローン間の競合関係の検討
生体分子相互作用システム(Fortebio社、製品カタログ番号Octet RED96)を使用して、エピトープ競合関係の分析を行った。Anti-Penta-HIS(HIS1K)センサー(Fortebio社、製品カタログ番号18-5120)を使用し、c-Met-Hisタンパク質(SinoBiological社、製品カタログ番号10692-H08H)を、ランニング緩衝液を使用して約5μg/mLに希釈した。センサーを、希釈した抗原試料中に浸漬した。結合時間を調整することによって、固定化の高さを約1nmに制御した。続いて抗原試料を第1の抗体A及び第2の抗体Bと順に相互作用させ、B抗体結合シグナルを検出して、2種の抗体が同じエピトープを認識するか否かを判定した。その結果はTable 5-1(表8)及びTable 5-2(表8)に示されている。判定基準は、60%を上回る値は2種の抗体が全く競合しないことを示し、20%～60%の間の値は2種の抗体の部分的な競合を示し(エピトープの箇所でクロスオーバーの可能性がある)、20%未満の値は2種の抗体の完全な競合を示す。自己反応シグナル(グレーの部分)が20%未満の場合はデータが有効であると判定した。

【0175】

Table 5-1(表8)におけるデータから見てとれるように、2種の抗体1B-3B11-Fc及び1B-1A8-Fcは完全に競合し、1B-3B11-Fc及び1B-1A8-Fcは他の3種の候補抗体と明らかな競合関係を有さず、それぞれ異なるエピトープに属していた。したがって、抗体1B-3B11-Fc及び1B-1B2-Fc、1B-3B11-Fc及び1B-1C7-Fc、1B-3B11-Fc及び1B-1B6-Fc、1B-1A8-Fc及び1B-1B2-Fc、1B-1A8-Fc及び1B-1C7-Fc、1B-1A8-Fc及び1B-1B6-Fc、1B-1B2-Fc及び1B-1C7-Fc、1B-1B2-Fc及び1B-1B6-Fc、並びに1B-1C7-Fc及び1B-1B6-Fcは、c-Met抗原の異なるエピトープに同時に結合することができる。

【0176】

Table 5-2(表8)におけるデータから見てとれるように、2種の抗体3B-1C7-Fc及び1B-1B2-Fcは完全に競合した。したがって、Table 5-1(表8)からのデータと組み合わせることにより、抗体1B-1A8-Fc及び3B-1C7-Fc、3B-1C7-Fc及び1B-1C7-Fc、並びに3B-1C7-Fc及び1B-1B6-Fcは、c-Met抗原の異なるエピトープに同時に結合しうることが見てとれる。

【0177】

【表8】

【実施例6】

【0178】

抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体による、H441細胞におけるc-Metリン酸化の阻害
H441細胞(Beina Bio社、製品カタログ番号BNCC292357)においてHGF刺激によって引き起こされるc-Metリン酸化に対する抗体の阻害効果を、ホスホ-c-Met(Tyr1234/1235)AlphaLISA SureFire Ultra Assay Kit(PerkinElmer社、製品カタログ番号ALSU-PC-MET-A500)を使用して検出した。供給元の指示に従ってH441細胞を採取し、96ウェルプレートに100μL/ウェル及び細胞10000個/ウェルで接種した。6～16時間のインキュベーションの後に、細胞を無血清培地中で一晩飢餓状態にした。上清を廃棄し、抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体(初期濃度1000nMから10倍に連続希釈して7通りの濃度にした)を45μL/ウェルで添加し、混合物を30分間インキュベートし、5μLのHGFを添加して15分間刺激した。上清を廃棄し、新たに調製した1×溶解緩衝液100μLを添加した。10分間のインキュベーションの後に、AlphaLISAモジュールを使用してプレートを読み取った。結果は図3及びTable 6(表9)に示されている。1B-1B2-Fc、1B-3B11-Fc、1B-1C7-Fc、1B-1B6-Fc、1B-1A8-Fc、及び3B-1C7-Fcは全て、HGF刺激によって引き起こされるH441細胞におけるc-Met下流リン酸化を効果的に阻害することができる。

【0179】

【表9】

【実施例7】

【0180】

抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体によるKP4細胞の増殖の阻害
KP4細胞の増殖に対する抗体の阻害効果を、Cell Counting Kit 8(DOJINDO Laboratories社、Lot.SH797)法を使用して検出した。具体的には、KP4細胞を96ウェル細胞培養プレートに細胞1000個/ウェルで添加し、5% CO₂二酸化炭素細胞インキュベーター内で37℃でインキュベートした。細胞を壁に接着させた後に、抗ヒトc-Met V_HH-Fcキメラ抗体(初期濃度900nMから2倍に連続希釈して7通りの濃度にした)を細胞に添加した。120時間のインキュベーションの後に、10μLのCCK-8溶液を各ウェルに添加した。1時間のインキュベーションの後に、マイクロプレートリーダーを使用して450nmでの吸光度を測定した。その結果は図4及びTable 7(表10)に示されている。1B-3B11-Fc、1B-1C7-Fc、1B-1B6-Fc、1B-1A8-Fc、及び3B-1C7-Fcは全て、KP4細胞の増殖を効果的に阻害することができる。

【0181】

細胞生存度の計算式は以下の通りである:
細胞生存度=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%
As=実験ウェルの吸光度(細胞、培地、CCK-8、及び被験抗体を含有するウェルの吸光度)、
Ab=ブランクウェルの吸光度(培地及びCCK-8を含有するウェルの吸光度)、
Ac=対照ウェルの吸光度(細胞、培地及びCCK-8を含有するウェルの吸光度)、
増殖阻害率=100%-細胞生存度

【0182】

【表10】

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2】

【図3】

【図4】

【配列表】

2024541882000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-06-20

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

単離された抗体又はその抗原結合性断片であって、c-Metに結合し、且つ少なくとも1つの単一可変ドメインを含み、単一可変ドメインが以下の相補性決定領域:
(a)配列番号11、8、5、14、17又は20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、
(b)配列番号12、9、6、15、18又は21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び
(c)配列番号13、10、7、16、19又は22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む、抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項2】

単一可変ドメインが、
(a)配列番号11に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号12に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号13に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、
(b)配列番号8に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号9に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号10に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、
(c)配列番号5に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号6に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号7に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、
(d)配列番号14に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号15に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号16に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、
(e)配列番号17に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号18に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号19に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3、又は
(f)配列番号20に記載されるアミノ酸配列を含むCDR1、配列番号21に記載されるアミノ酸配列を含むCDR2、及び配列番号22に記載されるアミノ酸配列を含むCDR3
を含む、請求項1に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項3】

単一可変ドメインが、配列番号24、26、28、30、32、若しくは34に記載されるアミノ酸配列に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又は
単一可変ドメインが、配列番号24、26、28、30、32、若しくは34に記載されるアミノ酸配列を含む、
請求項2に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項4】

単一可変ドメインがV_HHであり、必要に応じて、抗体又はその抗原結合性断片がキメラ性であるか又はヒト化されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項5】

ヒトIgGのFc、好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4のFcを含み、必要に応じて、配列番号37、39、41、43、45、又は47に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項6】

以下の特性及び特徴:
(a)ヒトc-Met又は/及びサルc-Metに結合すること、
(b)HGF又はそのβ鎖の、c-Metへの結合を遮断すること、
(c)HGF刺激によって引き起こされるc-Metリン酸化を阻害すること、
(d)腫瘍細胞に対してADCC効果を発揮すること
のうちの1つ又はいくつかを、単独で又は組み合わせて含みうる、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片。

【請求項7】

請求項1に記載の抗体又はその抗原結合性断片を含む融合タンパク質。

【請求項8】

請求項1に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。

【請求項9】

請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片又は請求項7に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。

【請求項10】

請求項9に記載の単離された核酸を含むベクター。

【請求項11】

請求項9に記載の核酸を含む宿主細胞。

【請求項12】

請求項1から3のいずれか一項に記載の単離された抗体又はその抗原結合性断片を調製するための方法であって、請求項11に記載の宿主細胞を培養する工程、及び発現された抗体又はその抗原結合性断片を単離する工程を含む、方法。

【請求項13】

腫瘍を有する対象を処置するための医薬を調製するための、請求項1から3のいずれか一項に記載の単離された抗体若しくはその抗原結合性断片、請求項7に記載の融合タンパク質、又は請求項8に記載の医薬組成物の使用であって、好ましくは、腫瘍が、脳悪性腫瘍、頭頸部がん、肺がん、食道がん、咽頭がん、鼻腔がん、舌がん、口腔がん、甲状腺がん、皮膚がん、骨がん、軟部肉腫、骨髄腫、胃がん、胃食道接合部腺がん、乳がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、リンパ腫、胸腺がん、膀胱がん、膣がん、精巣がん、子宮がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肛門がん、乳頭がん、前立腺がん、卵巣がん、上皮細胞がん、又は血液腫瘍である、使用。

【請求項14】

試料中のc-Metを検出又は測定するための方法であって、試料を請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合性断片と接触させる工程、及び結合複合体を検出又は測定する工程を含む方法。

【請求項15】

細胞におけるc-Metシグナル伝達を阻害するか、減少させるか又は遮断するための方法であって、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、請求項7に記載の融合タンパク質、又は請求項8に記載の医薬組成物の有効量を細胞に投与する工程を含む方法。

【請求項16】

腫瘍細胞の増殖を阻害するか又は腫瘍細胞を死滅させるための方法であって、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、請求項7に記載の融合タンパク質、又は請求項8に記載の医薬組成物の有効量を腫瘍細胞に投与する工程を含む方法。

【請求項17】

腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合性断片、請求項7に記載の融合タンパク質、又は請求項8に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与する工程を含む方法。

【請求項18】

腫瘍が、脳悪性腫瘍、頭頸部がん、肺がん、食道がん、咽頭がん、鼻腔がん、舌がん、口腔がん、甲状腺がん、皮膚がん、骨がん、軟部肉腫、骨髄腫、胃がん、胃食道接合部腺がん、乳がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、リンパ腫、胸腺がん、膀胱がん、膣がん、精巣がん、子宮がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、肛門がん、乳頭がん、前立腺がん、卵巣がん、上皮細胞がん、又は血液腫瘍である、請求項17に記載の方法。

【国際調査報告】